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Cárdenas Monroy C, González Andrade M,
Guevara Flores A, Lara Lemus R, Matuz Mares D,
Molina Jijón E, Torres Durán PV. Mensaje
Bioquímico, Vol. XL, 87-110, Depto. de
Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad
Nacional Autónoma de México. Cd. Universitaria,
CDMX.,MÉXICO.,(2016).
(http://bioq9c1.fmedic.unam.mx/TAB)
(ISSN-0188-137X)
EL UNIVERSO DE RNAs PEQUEÑOS EN PLANTAS: SU
VERSATILIDAD EN LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN
GENÉTICA
THE SMALL RNA UNIVERSE IN PLANTS: ITS VERSATILITY IN GENE
EXPRESSION REGULATION
Tzvetanka D. Dinkova y Vasti T. Juárez-González
Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, Universidad Nacional
Autónoma de México, 04510, Ciudad de México, México
[email protected]
Resumen
Los RNAs pequeños de plantas son moléculas de 19 a 27 nucleótidos que
se originan de precursores de RNA de cadena sencilla con estructura tallo-asa o
de doble cadena. Dos de las enzimas cruciales en su biogénesis son las proteínas
Dicer-like y Argonauta. Existen varios miembros de las familias de estas proteínas
en plantas, cuya función se ha especializado dependiendo de la clase de RNA
pequeño a la que se encuentran asociados. Las diferentes clases de RNAs
pequeños también muestran funciones especializadas a nivel post-transcripcional
(degradación de RNA y represión traduccional) o transcripcional (silenciamiento
génico por metilación de DNA). La gran versatilidad de sus funciones permite a las
plantas defenderse contra virus y transgenes, ejercer programas clave del
desarrollo y contender con diversos tipos de estrés biótico o abiótico. En este
trabajo se revisan las principales clases de RNAs pequeños, componentes de su
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MENSAJE BIOQUÍMICO, VOL. XL (2016)
biogénesis y mecanismos de regulación, así como su impacto en el desarrollo,
respuesta a estrés y aplicaciones biotecnológicas en las plantas.
Palabras clave: miRNA, siRNA, Dicer-like, Argonauta, desarrollo.
Abstract
Small RNA in plants are 19-27 nucleotide molecules derived from singlestranded hairpin-loop structured, or double-stranded RNA precursors. Dicer-like
and Argonaute are two key enzymes required for their biogenesis. Several family
members, functionally specialized depending on the small RNA class they
associate with, represent these proteins in plants. Different small RNAs also
display specialized functions at post-transcriptional (RNA degradation and
translational repression) or transcriptional (gene silencing by DNA methylation)
level. Their functional versatility accounts for anti-viral or transgene defense, key
developmental program execution, and diverse biotic or abiotic stress responses.
Here we review the main small RNA classes in plants, key components in their
biogenesis and regulatory mechanisms, as well as their impact in plant
development, stress response and biotechnological applications.
Keywords: miRNA, siRNA, Dicer-like, Argonaute, development.
¿Qué son los RNAs pequeños?
Los RNAs no codificantes de bajo peso molecular (sRNAs) se clasifican de
manera general como RNAs pequeños interferentes (siRNAs) y microRNAs
(miRNAs). La característica principal que distingue a estos dos grupos en plantas
es que la molécula precursora de los miRNAs es un transcrito de una sola cadena
que forma estructura tipo tallo-asa por apareamientos intra-moleculares, mientras
que la de los siRNAs es un RNA de doble cadena (Tabla I, [1]). También se
reporta un grupo creciente de sRNAs que aparentemente derivan de transcritos
sencillos con capacidad de formar tallo-asa, pero que no cumplen ciertas
características de los miRNAs, lo que dificulta una estricta clasificación de los
sRNAs. Aunque el origen genético de estas moléculas es diferente, varios
componentes de su ruta de biogénesis y funcionamiento se comparten (Figura 1).
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Tzvetanka D. Dinkova y Juárez-González VT
Tabla I. Clasificación de RNAs pequeños en plantas.
Clasificación acorde a Axtell, 2013 [1]. miRNA, microRNA; siRNA, RNA pequeño
interferente; hc-siRNA, siRNA heterocromático; pha-siRNA, siRNA producido en fase, tasiRNA, siRNA que actúa en trans; nat-siRNA, siRNA derivado de transcritos naturales
antisentido; dsRNA, RNA de doble cadena.
La biogénesis de sRNAs involucra a las enzimas DiCer-Like (DCL) que
producen dúplex de RNA (dsRNA) de 19-27 nucleótidos dejando 2 nt colgantes en
los extremos 3’. En plantas, este dúplex se protege de degradación mediante
metilación en el 2’OH de la ribosa terminal por una metil-transferasa Hua
ENhancer 1 (HEN1) [2]. Este intermediario es reconocido por una enzima
ArGOnauta (AGO), la cual, en compañía de otras proteínas forma un Complejo de
Silenciamiento Inducido por RNA (RISC). El duplex de sRNA debe ser separado y
sólo una de las cadenas forma parte del complejo con AGO (hebra guía), mientras
que la otra cadena es removida (hebra pasajera). La función reguladora que ejerce
RISC se basa en el reconocimiento de transcritos específicos mediante un
reconocimiento RNA-RNA perfecto o parcialmente imperfecto [3]. Algunas
subclases de sRNAs requieren para su biogénesis o función a otras enzimas como
RNA polimerasas Dependientes de RNA (RDRs), algunas proteínas de unión a
dsRNA o chaperonas [4]. Por otra parte, en plantas se han identificado múltiples
miembros para las familias DCL, AGO y RDR y se ha demostrado que las
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diferentes clases y subclases de sRNAs utilizan de manera diferencial a estas
proteínas.
Figura 1. Principales vías de biogénesis de sRNAs en plantas. A, Producción de
miRNAs. B, Producción de siRNAs secundarios en fase (pha-siRNAs y ta-siRNAs). C,
Producción de siRNAs heterocromáticos (hc-siRNAs).
microRNAs (miRNAs)
Los miRNAs derivan de precursores transcritos por la RNA polimerasa II
(pol II) a partir de los genes MIR (Figura 1A). El transcrito inicial llamado miRNA
primario (pri-miRNA), tiene cap, cola de poliA, y forma estructura secundaria.
DCL1 corta el pri-miRNA para generar un precursor más corto (pre-miRNA) con
una estructura tipo tallo-asa. El pre-miRNA es cortado nuevamente por DCL1
generando dsRNA de 21 nt, el cual es metilado por HEN1 y transportado del
núcleo al citoplasma por el exportador HASTY. En el citoplasma, el dsRNA es
separado al unirse a AGO1 o a AGO10 y una de las cadenas (miRNA*) se
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degrada. El miRNA asociado a RISC conduce al corte o represión traduccional de
sus mRNAs blanco.
siRNAs producidos en fase (pha-siRNAs)
Los siRNAs producidos en fase (pha-siRNAs) derivan de un RNA que
puede ser codificante para proteína (mRNA) o no codificante (ncRNA), el cual es
llevado a dsRNA por la acción de RDR6 y es procesado por DCL4, para generar
productos de cortes progresivos cada 21-22 nt en el dsRNA. Este tipo de corte
origina arreglos espaciados perfectos de sRNAs (sRNAs en fase). Los pha-siRNAs
son normalmente ejemplificados por la categoría de ta-siRNAs (Figura 1B)
encontrados en Arabidopsis thaliana. Sin embargo, en los últimos años los datos
obtenidos a partir de la secuenciación masiva de sRNAs en otros genomas de
plantas revelaron que diversas especies presentan una amplia variedad de phasiRNAs originados de loci que se denominaron PHAS, distintos a los loci que
originan a los ta-siRNAs [5, 6]. La ruta de biogénesis de pha-siRNAs y ta-siRNAs
es la misma.
En esta vía, un miRNA específico complementario a un transcrito maduro
(con cap y poliadenilado) provoca el corte del mismo mediante la acción de RISC
[7]. Los fragmentos generados se protegen por una proteína llamada Suppressor
of Gene Silencing 3 (SGS3), quien es reclutada por RISC, y se transcriben por
RDR6 para generar el dsRNA. tili ando este ds
como sustrato,
corta
en ase ragmentos de 2 -22 nucleótidos ue posteriormente son metilados en su
extremo 3 por HE . El t rmino en ase p ased indica ue los s
s son
generados en un arreglo secuencial, comenzando a partir de un nucleótido
especifico que fue determinado por el corte inicial del miRNA. DCL2 y DCL3
muestran redundancia parcial con DCL4 en esta vía, solo que DCL3 genera
fragmentos de 24 nulcleótidos [8].
siRNAs que actúan en trans (ta-siRNAs)
Los ta-siRNAs son un grupo particular de pha-siRNAs que fue descrito
inicialmente para Arabidopsis thaliana y que es ampliamente conservado en
plantas. Los ta-siRNAs derivan de transcritos de los loci TAS y dependen de
miRNAs específicos para generar el corte que originará posteriormente el dsRNA
(Figura 1B). miR173 unido a AGO1 reconoce a TAS1 y TAS2 en Arabidopsis
thaliana, mientras que miR390 unido a AGO7 reconoce a TAS3. Una característica
particular de los ta-si
s es ue pueden ejercer su unción en trans sobre
transcritos di erentes al original o en cis sobre el mismo precursor para amplificar
la señal [9].
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siRNAs derivados de transcritos naturales antisentido (nat-siRNAs)
Los nat-siRNA se reportaron por primera vez en estudios de tolerancia al
estrés en Arabidopsis thaliana [10]. Se ha propuesto que el precursor los natsiRNAs es una porción híbrida entre transcritos independientes formada por
complementariedad (cis-nat-siRNAs; Tabla 1). Los transcritos independientes
pueden ser originados a partir de la transcripción de las cadenas opuesta de un
mismo locus o de loci diferentes con cierta complementariedad (trans-nat-siRNAs;
Tabla 1). Solo los cis-nat-siRNAs se han identificado en plantas, mientras que los
trans-nat-siRNAs continúan siendo solo una hipótesis [1, 11]. Una vez generados
los transcritos cis-nat, uno de los cuales es producido exclusivamente bajo
condiciones de estrés, se produce la hibridación en las regiones complementarias
y una RDR puede generar un dsRNA en los sitios no apareados. El dsRNA puede
ser procesado por diferentes DCL y seguir la ruta de un siRNA canónico. Se ha
estimado que la formación de cis-nat-siRNAs puede ocurrir en alrededor del 9% de
los genes de Aabidopsis thaliana. Sin embargo, las cantidades de nat-siRNAs
observadas en estudios globales son muy bajas, lo que ha llevado a cuestionar su
presencia como grupo independiente de siRNAs [1].
siRNAs heterocromáticos (hc-siRNAs)
Este tipo de sRNAs se origina de secuencias repetidas como los elementos
transponibles (TEs) o regiones pericentroméricas (Figura 1C). La RNA Polimerasa
IV (Pol IV), específica de plantas, transcribe en estas regiones RNAs relativamente
cortos (alrededor de 40 nucleótidos) y RDR2 genera el dsRNA a partir de este
transcrito [12]. El dsRNA generado es procesado por DCL3 en fragmentos de 24
nt (hc-siRNAs) que son metilados por HEN1. Los hc-siRNAs se unen a AGO4
quien selecciona una de las cadenas (generalmente la que fue transcrita por
POLIV) como cadena guía y el complejo es reclutado a transcritos generados por
otra RNA polimerasa específica de plantas (POLV) que transcribe en la misma
región de DNA. Asociadas a los complejos RISC guiados por hc-siRNAs actúan
metiltransferasas de DNA para silenciar la transcripción en la región de secuencias
repetidas y crear un entorno de heterocromatina [13]. Este mecanismo mediado
por hc-siRNAs se denomina metilación del DNA dirigida por RNA (RdDM) y
constituye una herramienta muy importante para el control de TEs y para la
estabilidad del genoma en las plantas.
Proteínas Dicer-like y Argonauta: estructura
silenciamiento genético inducido por sRNAs.
Dicer-like
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y
función
durante
el
Tzvetanka D. Dinkova y Juárez-González VT
Para la correcta biogénesis y funcionamiento de las vías de silenciamiento
genético inducido por sRNAs en plantas es necesaria la participación de las
proteínas Dicer-like (DCL), quienes desempeñan un papel central en el
procesamiento de los precursores de sRNAs para generar dsRNAs de 21-24 nt de
longitud. Estas proteínas pertenecen a la superfamilia RNasa III cuya función
principal es el corte endonucleolítico de RNA [14]. Se clasifican dentro de la
subfamilia de enzimas Dicer cuyos miembros contienen varios dominios
característicos: dos dominios RNasa III (RNasa IIIa y RNasa IIIb), un dominio de
unión a RNA de doble cadena (dsRBD), un dominio Piwi Argonauta Zwille (PAZ) y
un dominio DExH-box Helicasa (Figura 2). En el extremo amino se encuentra el
dominio DExH-box Helicasa, altamente conservado en las proteínas Dicer, que se
ha nombrado así por la presencia de la secuencia Asp-Glu-X-His [15]. Mutaciones
en el dominio Helicasa de DCL1 en Arabidopsis thaliana (AtDCL1) mostraron su
relevancia para el procesamiento de algunos pri-miRNAs, discriminándolos de
otros dsRNAs [11]. Sin embargo, la proteína Dicer en algunos organismos como
Giardia intestinalis, carece del dominio Helicasa y es capaz de cortar y generar
productos de dsRNAs de tamaños específicos [14].
Figura 2. Modelo estructural de Dicer-like (DCL). A, Dominios característicos de DCL1 en
Arabidopsis thaliana. B, Arreglo espacial de los dominios de DCL1 para formar el centro
de procesamiento de
asa III y el dominio egla de separación entre P Z y
asaIII.
C, Ubicación del sustrato de RNA en el centro de procesamiento de DCL1.
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MENSAJE BIOQUÍMICO, VOL. XL (2016)
Para el correcto funcionamiento de las enzimas Dicer, los dominios RNasa
IIIa y RNasa IIb se pliegan para formar un dímero intramolecular con un único
centro de procesamiento que permite el corte de dos enlaces fosfodiéster en las
cadenas opuestas del dsRNA (Figura 2B y 2C). Este tipo de corte genera
productos característicos con dos nucleótidos sobresalientes en los extremos
3´OH. El centro de procesamiento de los dominios RNasa III se encuentra
separado del dominio P Z por una región conectora tipo α-hélice conocida como
el Dominio Regla. El dominio PAZ se encuentra involucrado en la unión de los
extremos 3´ del dsRNA y el posicionamiento de la molécula en el centro de
procesamiento RNasa III. Recientemente, se ha obtenido evidencia de que la
distancia entre el PAZ y el centro de procesamiento define el tamaño en los
productos de corte del dsRNA, lo cual explica por qué cada una de las proteínas
DCL en plantas genera dsRNAs con longitudes específicas. Finalmente, el
dominio dsRBD se encuentra en el extremo carboxilo terminal, adoptando una
estructura tipo binding pocket para crear una inter ase de unión entre la proteína
y el dsRNA [15].
En general, las proteínas Dicer o DCL de cada organismo conforman una
pequeña familia génica compuesta por dos, cuatro o cinco miembros. En relación
a animales y hongos, las plantas mono- y di-cotiledóneas presentan una notable
expansión de la familia DCL, reflejando una mayor versatilidad en la
implementación del silenciamiento mediante RNA en la defensa antiviral [16]. En
Arabidopsis thaliana se han identificado 4 genes correspondientes a DCL (DCL14), mientras que en el arroz (Oryza sativa) y el sorgo (Sorghum bicolor) se han
identificado 5 genes. Al igual que otras proteínas relacionadas con la biogénesis
de sRNAs, las proteínas DCL parecen ser específicas para procesar un tipo
particular de dsRNA. Analizando mutaciones múltiples y puntuales en AtDCL2,
AtDCL3 y AtDCL4 se observó que estas proteínas mantienen una relación
jerárquica dada por distintas afinidades por los diversos precursores de dsRNA
(Tabla 1). La afinidad de cada
parece depender del tama o del ds
y de
la identidad del nucleótido en la posición
del dúplex. t
procesa ds
largos sin pre erencia clara por el nucleótido del extremo , mientras ue t
3
procesa preferencialmente dsRNA cortos con extremos de adenina y uracilo [17,
18].
La organización de dominios en las proteínas DCL de plantas corresponde
a la estructura general de proteínas Dicer (Figura 1). Sin embargo, DCL1, DCL3 y
DCL4 de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, o Populus trichocarpa presentan una
duplicación del dominio dsRBD, mientras que DCL2 solo presenta un dsRBD [16].
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Esta duplicación parece tener una función importante, ya que al mutar uno de los
dominios dsRBD de AtDCL1 las plantas presentan infertilidad y defectos en la
biogénesis de la mayoría de los miRNAs [19].
Argonauta
Una vez generados los duplex de sRNAs por las proteínas DCL es
necesaria su asociación a una proteína Argonauta (AGO), quien conformará el
complejo efector del silenciamiento genético mediado por sRNAs. La familia de
proteínas AGO se identificó en plantas mediante análisis de genética reversa para
genes involucrados en el desarrollo. AGO1 de A. thaliana (AtAGO1) es el miembro
fundador, cuya mutante nula presenta fenotipos pleiomórficos, como hojas en
forma tubular parecidas a los tentáculos de un molusco argonauta, de ahí el
nombre [20]. La familia de proteínas AGO se puede dividir en el clado Argonauta,
conformado por las proteínas similares a AGO1 de A. thaliana y el clado PIWI,
cuyos miembros son homólogos a la proteína Piwi de Drosophila melanogaster y
se han identificado predominantemente en línea germinal de animales [21]. En
plantas, la familia AGO se ha expandido a lo largo de la evolución con numerosas
duplicaciones y pérdidas. En algas verdes se han identificado 3 miembros,
mientras que en musgos y plantas con flor se ha expandido a 7 y 10 o más
miembros, respectivamente [22]. Análisis filogenéticos han agrupado a las
proteínas AGO de plantas en 3 clados: el clado I está conformado por AGO1,
AGO5 y AGO10; el clado II se encuentra conformado por AGO2, AGO3 y AGO7; y
AGO4, AGO6, AGO8 y AGO9 conforman el clado III [23].
Todas las proteínas AGO se caracterizan por la presencia de los dominios
PAZ, PIWI y MID (Figura 3A), y se han identificado en todos los organismos
eucariontes, con excepción de Saccharomyces cerevisiae [24]. La organización de
los dominios catalíticos y de unión a RNA juegan un papel crucial en el
reconocimiento específico de sRNAs [25]. Mediante cristalografía de Rayos X de
AGO a apartir de Thermus thermophilus (TtAGO) y Pyrococcus furious (PfAGO) se
determinó que la proteína posee una estructura bilobular (Figura 3). El lóbulo PAZ
se encuentra compuesto por el extremo amino y el dominio PAZ, mientras que el
lóbulo PIWI se encuentra conformado por los dominios MID y PIWI. La interacción
del sRNA con AGO conforma un complejo binario, para el cual es necesario que el
dominio MID ancle el extremo 5´ del sRNA mediante un bolsillo de unión, mientras
que el dominio PAZ reconoce los 2 nucleótidos sobresalientes del extremo 3´ del
dúplex de sRNA [26, 27]. Para la selección de la cadena guía se obsreva la regla
de asimetría , donde la cadena del dúplex de s
con menor estabilidad
termodinámica en el extremo 5´ será la elegida. La identidad de los nucleótidos
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MENSAJE BIOQUÍMICO, VOL. XL (2016)
también es importante para la elección, dependiendo de cada AGO en particular.
Por ejemplo, el dominio MID de atAGO1 se encuentra asociado a miRNAs que
contienen 5´U pero también permite la unión de miRNAs con 5´C. El dominio MID
censa u tipo de s
puede cargarse en cada una de las GOs, debido a la
presencia de un asa rígida (Asa de especificidad de nucleótidos), la cual genera
puentes de hidrógeno especí icos con el mononucleótido ’ [28].
Cuando el complejo AGO/sRNA reconoce a un RNA blanco por
complementariedad, se forma el complejo ternario. En este complejo, el
apareamiento entre el RNA blanco y el sRNA comienza desde el extremo 5´del
sRNA que permanece unido al dominio MID, propiciando un cambio
conformacional en el dominio PAZ liberar el extremo 3´ del sRNA permitir la
propagación del apareamiento sRNA-RNA (Figura 3B; [26]). Este proceso se
conoce como nucleación y permite posicionar al RNA en el sitio activo del dominio
PIWI que adopta una estructura tipo RNasa-H y es el responsable de la actividad
catalítica endonucleasa de las proteínas AGO. La presencia de dos cationes
divalentes unidos al motivo DDH en el dominio PIWI (Asp-Asp-X, donde X
generalmente es un ácido aspártico o histina) propicia el corte en el RNA blanco
de sRNA. Sin embargo, aunque una AGO tenga este motivo no necesariamente
realizará el corte endonucleolítico de sus blancos, ya que tambien puede generar
la represión traduccional de sus blancos mediante mecanismos que aun no son
bien entendidos [23, 27].
Figura 3. Modelo estructural de Argonauta (AGO). A, Dominios característicos de AGO1
en Arabidopsis thaliana. PAZ y PIWI se encuentran conservados en todas las AGO,
mientras que los MID y Gly solo están presentes en algunos miembros de la familia en
plantas. B, Funcionamiento del complejo AGO-sRNA en el reconocimiento de su RNA
blanco de silenciamiento (Modificado de [29]).
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Tzvetanka D. Dinkova y Juárez-González VT
En Arabidopsis thaliana, AtAGO1 se une a la gran mayoría de los miRNAs y
pha-siRNAs, posee actividad de corte y media las funciones de estos sRNAs in
vivo. AtAGO1 y AtAGO10 se han implicado en la represión traduccional de
mRNAs blancos de miRNAs. AtAGO7 se asocia preferencialmente a un único
miRNA, miR390, quien conduce a la producción de ta-siRNAs. AtAGO4, AtAGO6 y
AtAGO9 conforman el grupo AGO4 que está relacionado a modificaciones
epigenéticas, en particular silenciamiento de transposones y secuencias repetidas
mediante la vía RdDM. Los miembros del grupo AGO4 se asocian
preferecialmente con los hc-siRNAs y su expresión varía a lo largo del desarrollo y
en distintos tejidos. Cada miembro del grupo se asocia preferencialmente a ciertos
loci del genoma y atAGO9 se ha visto involucrada en el proceso de
gametogénesis femenina, lo que sugiere una especialización de los miembros del
grupo AGO4 de Arabidopsis thaliana. Finalmente, AtAGO2 parece estar
involucrada en mecanismos de respuesta antiviral y de reparación de daño al DNA
de doble cadena (DSB) mediante la generación de sRNAs inducidos por daño al
DNA de doble cadena (diRNAs). Se ha hipotetizado que el complejo efector
AGO2/diRNA contribuye a la reparación del DNA sirviendo como proteína de
andamiaje para el reclutamiento de proteínas relacionadas con el proceso [28, 30,
31].
Mecanismos de silenciamiento por miRNAs
Inicialmente, se planteaba una clara distinción entre los niveles de
regulación ejercidos por miRNAs en plantas y animales. Sin embargo, recientes
estudios genéticos y bioquímicos demostraron que, en ambos tipos de
organismos, el silenciamiento por miRNAs puede involucrar tanto represión
traduccional como degradación de los mRNA blancos [32, 33]. Para que haya
silenciamiento es necesario que el miRNA asociado a AGO reconozca una región
complementaria en el m
blanco, denominada semilla Figura 4). Esta región
es mucho menor en extensión para miRNAs de animales (posición 2-7) que de
plantas (posición 2-13). En animales, normalmente los nucleótidos en las
posiciones 10-11 del miRNA se encuentran desapareados lo que impide que AGO
ejerza su actividad de corte sobre el mRNA, mientras que en plantas para la
mayoría de miRNAs existe apareamiento en esta región, lo que favorece el corte
sobre el mRNA (Figura 4).
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Figura 4. Mecanismos de silenciamiento mediados por miRNAs. La extensión de
complementariedad entre miRNA y RNA blanco difiere entre plantas y animales; solo en
plantas AGO promueve corte endonucleolítico del blanco de miRNA. En animales, la
proteína GW182 que interacciona con la proteína de unión a poliA (PABP) promueve tanto
la represión traduccional, como degradación del RNA por deadenilación. En plantas,
además del corte y degradación de RNA, AGO también puede promover represión
traduccional por un mecanismo aún desconocido.
El mecanismo de acción de RISC depende en gran medida de las proteínas
que interaccionan con AGO. Una proteína rica en Glicinas y Triptófanos (GW182)
se une a AGO y a otras proteínas que interrumpen el inicio de la traducción
dependiente de ’-Cap [32]. Estos complejos promueven la deadenilación del
mRNA y lo llevan a cuerpos de procesamiento (P-bodies) para degradación. En
plantas, se conoce poco sobre la interacción de AGO con proteínas que pudieran
afectar el inicio de la traducción o llevar a deadenilación el mRNA blanco de
miRNA. En estudios genéticos en Arabidopsis thaliana se ha implicado a genes
involucrados en la organización del citoesqueleto (KTN), cuerpos de
procesamiento (VCS) y a una carboxipeptidasa anclada al sistema
endomembranal (AMP1) en la inhibición de la traducción por miRNAs [34].
Asimismo, en estudios bioquímicos se ha demostrado que AGO1 y AGO10 están
involucradas en la inhibición traduccional de mRNAs blancos de miRNAs [33, 34].
En plantas no se han encontrado proteínas ortólogas a GW182, por lo que se
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Tzvetanka D. Dinkova y Juárez-González VT
piensa que la inhibición traduccional pudiera ser mediada por mecanismos
diferentes.
Control de elementos transponibles (TEs)
En plantas, los hc-siRNAs participan en el silenciamiento transcripcional de
secuencias repetidas, en particular de transposones (TEs) mediante el mecanismo
epigenético de RdDM. La acción de las RNA polimerasas específicas de plantas
Pol IV y Pol V ha sido sujeta a intensa investigación en los últimos años
estableciendo que estas enzimas son generalmente reclutadas a regiones con
cierto grado de metilación para transcribirlas y producir hc-siRNAs que servirán
para establecer un estado de heterocromatina en el promotor de los
retrotransposones [12, 35]. Se cree que Pol IV es reclutada al DNA por Sawadee
Homeodomain Homologue
HH
uien reconoce la metilación de lisina en la
histona 3 (H3K9me) y a la lisina 4 no metilada de la histona 3 (H3K4). Pol IV
también se asocia con RDR2 promoviendo la obtención de dsRNA quien será
sustrato de DCL3 para generar los hc-siRNAs de 24 nt y llevarlos a AGO4, AGO6
o AGO9 (específica de tejidos reproductivos). Recientemente se ha propuesto que
estas AGOs no son completamente redundantes, pudiendo distinguir entre hcsiRNAs dependiendo de los loci y del tejido de la planta [36]. Los hc-siRNAs de 24
nt asociados a AGO4 reconocen por complementariedad a transcritos que Pol V
genera en las mismas regiones del genoma reclutada por SU(Var)3-9 Homologue
2 (SUVH2) o SUVH9 (Figura 5). En este proceso se establece interacción entre
AGO4 y Pol V y se propone que AGO4 también recluta a la metiltransferasa de
DNA Domains Rearranged Methyltransferase 2 (DRM2) quien es capaz de
establecer metilación de novo en las citocinas en todos los contextos (CG, CHG y
CHH, donde H es A, C o T) [37].
Figura 5. Metilación de DNA dirigida por RNA (RdDM). En el modelo más aceptado para
los hc-siRNAs, elementos transponibles (TE) que muestran cierto grado de metilación
reclutan a la RNA pol IV y RNA pol V mediante SHH1 (reconoce H3K9 metilada) y
SUVH2/9 (reconoce citosina metilada), respectivamente. Las polimerasas transcriben en
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los loci de TEs, la primera para generar el precursor de hc-siRNAs (ver Figura1C), la
segunda para reclutar a los complejos hc-siRNA-AGO4 y otras proteínas como la
metiltransferasa DRM2, con el objeto de reforzar la metilación en el locus e inducir el
silenciamiento transcripcional. (Modificado de [13]).
Desde hace muchos años, se sabe que la actividad de los transposones en
plantas está sujeta a encendido y apagado en dependencia de las fases de
desarrollo y de las condiciones ambientales [38]. El mecanismo de RdDM favorece
el silenciamiento epigenético de los TEs y su herencia transgeneracional. Sin
embargo, como acabamos de describir, su establecimiento requiere de un estado
pre-metilado en el
. n TE activo, de inserción relativamente reciente en el
genoma, re uiere de metilaciones iniciales ue permitan marcarlo en el genoma
para el reconocimiento de la maquinaria RdDM. Recientemente, se ha propuesto
que sRNAs que actúan a nivel post-transcripcional (miRNAs, pha-siRNAs, tasiRNAs y otros siRNAs) de 21-22 nt o de 24 nt pueden ser los promotores de esta
metilación inicial y la conexión con el silenciamiento posteriormente establecido a
nivel transcripcional [13].
miRNAs en el desarrollo
El papel crucial de los miRNAs en el desarrollo de plantas se evidenció en
Arabidopsis thaliana mediante la observación de alteraciones fenotípicas en
mutantes de la vía de su biogénesis [4, 39]. La mutante dcl1 muestra letalidad
embrionaria indicando que la producción de miRNAs es requerida para la
viabilidad de la planta. Aunque la mutante nula ago1 es viable, la planta presenta
fenotipos drásticos en desarrollo, y una mutante doble ago1/ago10 es letal,
sugiriendo que AGO10 podría suplir de manera parcial la función de AGO1 en la
vía.
Los mRNAs blanco de varios miRNAs son factores transcripcionales que
participan en etapas particulares del desarrollo como la morfogénesis de hojas,
identidad floral, polaridad de órganos y embriogénesis. Entre los ejemplos más
conocidos se encuentran los genes SPL (Squamosa Promoter binding-Like),
blanco de la familia miR156, que regulan el cambio de la fase vegetativa a la
reproductiva, tamaño de órganos y etapas tempranas de la embriogénesis [40-42].
Los factores transcripcionales MYB y GAMYB, blanco de la familia miR159, que
participan en los procesos de floración, fertilidad masculina y germinación [43, 44],
y factores que participan en la respuesta a auxinas, blancos de varios miRNAs o
de ta-siRNAs [39]. De estos últimos, miR164 regula a factores transcripcionales de
la familia NAC (N , T
2 y
importantes para el establecimiento de
100
Tzvetanka D. Dinkova y Juárez-González VT
límites entre órganos [45], miR160 y miR167 regulan a miembros de la familia de
factores transcripcionales que actúan en respuesta a auxina (ARF) [46] y
miR165/166 tienen como blanco a factores con homodominio de cierre de leucina
(HD-ZIP) de la clase III que participan en el establecimiento de la identidad abaxial
y polaridad en las hojas [47]. Los ta-siRNAs derivados de TAS3 tienen como
blanco también a los factores ARF y regulan el desarrollo y polaridad de órganos
[48, 49]. En la floración de Arabidopsis thaliana, se ha evidenciado un papel muy
importante para miR172 cuyo blanco es APetala2 (AP2), un gen clase A del
sistema ABC que determina identidad floral, y otros genes AP2-like implicados en
el tiempo de floración [50, 51].
Mutantes que sobreexpresan cualquiera de los miRNAs involucrados en
desarrollo muestran fenotipos miméticos a las mutantes nulas o de pérdida de
función de sus genes blanco evidenciando que el papel inhibitorio de estas
moléculas es responsable de la regulación de estos genes involucrados en el
desarrollo de Arabidopsis thaliana [43, 45, 52]. Por otra parte, la expresión de
transgenes con sitos alterados de reconocimiento por los miRNAs en las mutantes
sobreexpresoras de miRNAs es capaz de restablecer el fenotipo normal de
desarrollo. Dada la relevancia que tiene el mecanismo de regulación por miRNAs,
dos de las enzimas clave de esta ruta están a su vez reguladas por miRNAs
(DCL1 por miR162; AGO1 por miR168) estableciendo una retroalimentación
negativa en la regulación de su vía de biogénesis [52, 53].
Aunque la mayoría de los estudios sobre el papel de miRNAs en desarrollo
se han realizado en la planta modelo Arabidopsis thaliana, se sabe que muchos de
estos miRNAs y los sitios complementarios en sus genes blanco se encuentran
evolutivamente conservados en las angiospermas, gimnospermas, helechos,
musgos y otras briofitas [54].
miRNAs en respuesta a estrés
Las plantas como organismos sésiles se enfrentan frecuentemente a una
variedad de condiciones ambientales adversas. Por ello han desarrollado
mecanismos sofisticados de defensa que les permiten contender con el estrés. A
la fecha, se ha demostrado la participación de diferentes miRNAs en varios tipos
de estrés en Arabidopsis thaliana y otras especies de plantas [55-57].
Curiosamente, en este caso solo algunos de los miRNAs identificados son
conservados en diversas especies de plantas, mientras que otros son
característicos solo para cierto linaje o incluso especie-específicos. Entre las
familias conservadas se encuentran miR395, miR397, miR398, miR399 y miR408.
101
MENSAJE BIOQUÍMICO, VOL. XL (2016)
Para estas familias se ha observado que también sus genes blancos propuestos o
demostrados experimentalmente se encuentran conservados entre diferentes
especies. En cambio, para las familias características de un linaje o de una
especie los genes blancos y secuencias complementarias se encuentran poco
conservados [58].
La mayor parte de los estudios se han enfocado a la identificación de
miRNAs cuya expresión varía en respuesta a un reto en particular [59]. En
Arabidopsis thaliana, un análisis de sRNAs en respuesta a deshidratación, frío,
salinidad o presencia de ácido abscísico (ABA), hormona señalizadora para
diversos tipos de estrés, encontró que, dependiendo del estrés, unos miRNAs
incrementan su expresión, mientras otros bajan [55]. Por otra parte, algunos
miRNAs pueden tener rol en múltiples tipos de estrés. Por ejemplo, miR398
modifica su expresión en déficit hídrico, déficit de cobre, infección por patógenos y
estrés por calor entre otros [59]. Sus genes blanco son la Cu/Zn Superóxido
Dismutasa 1 y 2 (CSD1, CSD2) [60], una Chaperona de Cobre para la Superóxido
dismutasa (CCS1) [61] y la subunidad V de la Citocromo c OXidasa (COX5b-1)
[62]. Las superóxido dismutasas son muy importantes para contender con el
aumento de especies reactivas de oxígeno (ROS) durante el estrés oxidativo, lo
que concuerda con la disminución de miR398 en este tipo de estrés.
mi 3
y mi
8 participan en la omeostasis de cobre y estr s ídrico,
salino o por frío [59, 63]. Los blancos de miR397 y miR408 en Arabidopsis thaliana
incluyen a transcritos que codifican para proteínas de unión a cobre como lacasas
y plantacianina [64]. Su expresión aumenta en estrés por frío y déficit de cobre.
Entre otros miRNAs relevantes en respuesta a estrés, se encuentra miR395 cuyo
blanco en Arabidopsis thaliana es la ATP sulfurilasa (APS) quien participa en el
metabolismo de sulfato [65] y miR399 que inhibe la expresión de una enzima
conjugadora de ubiquitina (UBC) y favorece la acumulación de Pi mediante la
estabilización del transportador PHO2 [66].
Muchos de los miRNAs conservados que participan en diversas etapas del
desarrollo de la planta, también se reportaron en los escrutinios de bibliotecas de
miRNAs con expresión modificada por diversos tipos de estrés. Tal es el caso de
miR156, miR159, miR172, miR168 y otros [67, 68]. Aunque para muchos otros
miRNAs involucrados en estrés, no se conoce con certeza el mecanismo de
regulación, se ha abierto el camino de exploración experimental mediante la
predicción bioinformática de genes blancos.
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Tzvetanka D. Dinkova y Juárez-González VT
Aplicaciones biotecnológicas
La versatilidad de la acción ejercida por los diferentes tipos de sRNAs en
plantas los ubica en el centro de las investigaciones básicas y aplicadas de estos
organismos. El uso de miRNAs artificiales (a-miRNAs) o ta-siRNAs sintéticos (synta-siRNAs) posibilita el estudio funcional de múltiples genes en plantas [69, 79]. Se
han desarrollado herramientas bioinformáticas confiables para su diseño con el
objeto de un apagado eficaz de los genes blanco [71]. Estas herramientas también
pueden ser utilizadas para obtener resistencia a virus en cultivos de interés
agrícola [72]. Dado el impacto que pueden tener los miRNAs en la respuesta a
diversos tipos de estrés, se ha establecido que forman parte de la respuesta
inmune de la planta y tanto miRNAs o pha-siRNAs particulares, como los
componentes de su ruta de biogénesis se consideran como bio-marcadores
potenciales para la resistencia a patógenos o estrés [73].
Por otra parte, el uso de sRNAs en el mejoramiento agrícola implica la
obtención de plantas transgénicas y la presencia de efectos colaterales propios de
la respuesta de la planta al método utilizado. De hecho, la existencia del
silenciamiento mediado por RNA fue descubierto en un intento de obtener plantas
transgénicas de Petunia sobre-expresoras de una enzima en la ruta del color
morado de las flores [74]. Es por ello que es importante estudiar el impacto que los
métodos biotecnológicos pueden tener en la respuesta de las vías de diferentes
clases sRNAs en las especies de plantas con relevancia agrícola. En este sentido,
nuestro grupo de trabajo se ha dedicado en los últimos años a investigar el papel
de los sRNAs en el proceso de embriogénesis somática de maíz [28, 75, 76].
La embriogénesis somática es un proceso alterno a la embriogénesis
cigótica donde las c lulas som ticas, bajo ciertas condiciones de inducción,
pueden generar c lulas embrionarias y regenerar plantas [77]. a embriog nesis
som tica se induce generalmente mediante un estímulo con itoreguladores ue
causan des-di erenciación de las c lulas del explante, activación de la división
celular, y cambio en el patrón de expresión gen tica Figura 6). Una vez
establecida la proliferación del tejido des-diferenciado con potencial embriogénico
(callo embriogénico), este se puede mantener por tiempo relativamente
prolongado en cultivo para posteriormente inducir la regeneración de plantas. a
embriog nesis som tica es importante en la biotecnología vegetal para la
propagación clonal de plantas con ciclo de vida largo y para la trans ormación
gen tica. En el maíz, la capacidad embriog nica parece estar limitada a la
utili ación de embriones e in lorescencias u ojas en estado meristem tico como
explante inicial y es altamente dependiente del genotipo [78].
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MENSAJE BIOQUÍMICO, VOL. XL (2016)
Figura 6. Embriogénesis somática y regeneración de plantas (ejemplificado para maíz).
Se representa esquemáticamente la inducción de tejido des-diferenciado en presencia de
fitoreguladores y oscuridad a partir de embriones inmaduros; el establecimiento y
proliferación de callos embriogénicos capaces de regenerar plantas completas retirando
los fitoreguladores y en presencia de luz y la propuesta de un rol crucial para las diversas
rutas de RNAs pequeños en plantas en los eventos moleculares que ocurren durante este
proceso.
Análisis globales o particulares de sRNAs durante las diferentes etapas de
embriogénesis somática de varias especies de plantas han encontrado expresión
diferencial de ciertos miRNAs y sus mRNA blanco demostrados o predichos [7982]. Muchos de los sRNAs regulados diferencialmente durante este proceso
corresponden a miRNAs relacionados a desarrollo o respuesta a estrés. Esto
muestra correspondencia con la reprogramación genética y los cambios
fisiológicos drásticos que tienen lugar en la inducción de callos embriogénicos y la
regeneración de plantas. Por otra parte, el principal fitoregulador utilizado en el
proceso son las auxinas, las cuales como se mencionó arriba, incluyen a varios
miRNAs y ta-siRNAs en la regulación de sus vías de señalización. La exploración
intensa del papel de los sRNAs en la embriogénesis somática tiene por objeto
relacionar su función con la capacidad embriogénica de los explantes y genotipos,
así como con la eficiencia en la regeneración de plantas [76, 82].
104
Tzvetanka D. Dinkova y Juárez-González VT
Aunque los esfuerzos se han centrado por ahora en los miRNAs, otras
clases de sRNAs como los hc-siRNAs pueden tener un papel importante en la
reprogramación epigenética y la capacidad de responder al estímulo con auxinas
[83, 84]. En este sentido, en la embriogénesis somática inducida a partir de
embriones inmaduros de la variedad sintética mexicana VS-535 (raza Tuxpeño)
hemos encontrado cambios importantes en la metilación de TEs durante la
inducción, coincidentes con cambios en la expresión de componentes de la vía
RdDM (Figura 6; [28, 85]). Una vez establecida la proliferación de callos
embriogénicos en VS-535, se presentan pocos cambios en la metilación de TEs o
en la expresión de componentes de la vía RdDM por al menos 18 meses de
subcultivo. Sin embargo, en subcultivos prolongados (2 años o más) se
observaron cambios en la metilación de ciertos TEs [85] y disminución fuerte en la
expresión de ciertos miRNAs [75]. Esto podría asociarse a las variaciones
estocásticas no deseadas que frecuentemente se observan en las plantas
regeneradas por embriogénesis somática, tanto en maíz como en otras especies
[86]. Un objetivo a futuro será determinar el tiempo óptimo de permanencia de los
callos embriogénicos en subcultivo, en dependencia del fin con que se utilizan y de
las modificaciones epigenéticas que sufren.
Conclusiones
Las plantas han jugado un papel importante en el entendimiento de la
función de los RNAs no codificantes en eucariontes. La presencia de múltiples
miembros de cada una de las familias de proteínas que participan en la biogénesis
y acción de sRNAs propicia una amplia versatilidad en los mecanismos de
regulación ejercidos por estas moléculas. Los miRNAs son componentes cruciales
de redes regulatorias en el desarrollo, respuestas a estrés, e incluso en
modificaciones epigenéticas. Los hc-siRNAs ayudan a preservar la estabilidad del
genoma y mantienen el control epigenético sobre los elementos transponibles. Los
pha-siRNAs y ta-siRNAs, a su vez controlados por miRNAs específicos, participan
en la inmunidad de las plantas, la defensa antiviral, el establecimiento de polaridad
y tamaño de órganos, así como en el control epigenético. Las tecnologías masivas
de secuenciación han revelado que hay otros sRNAs que no pueden ubicarse
dentro de los grupos mencionados y cuya función se desconoce hasta el
momento. Aún dentro de los grupos de miRNAs, pha-siRNAs y hc-siRNAs,
permanece abierto un largo camino de estudios para comprender sus funciones en
las plantas, particularmente en aquellas que representan un interés agronómico.
Asimismo, la producción biotecnológica masiva y la transformación genética de
plantas, se verán ampliamente favorecidas con el conocimiento de los
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MENSAJE BIOQUÍMICO, VOL. XL (2016)
mecanismos moleculares mediados por sRNAs que operan en el proceso de
embriogénesis somática.
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Semblanza de la Dra. Tzvetanka Dimitrova Dinkova
Estudió
la
Licenciatura
en
Bioquímica en la Facultad de Biología de
la Universidad de la Habana, Cuba.
Realizó estudios de doctorado en Ciencias
Bioquímicas en la Facultad de Química de
la UNAM y obtuvo el premio Weizmann a
la mejor tesis doctoral en Ciencias
Naturales. Posteriormente, reali ó una
estancia Posdoctoral en el departamento
de io uímica y iología
olecular de
Louisiana
State
University
Health
Sciences Center – Shreveport, LA, USA.
Actualmente trabaja como Profesor Titular
B en la Facultad de Química de la UNAM,
es Investigador Nacional Nivel I y miembro
de la Academia Mexicana de Ciencias.
Imparte varios cursos en el área de la Genética y Biología Molecular a nivel de
licenciatura y posgrado. Ha dirigido 8 tesis de licenciatura, 9 de maestría y 3 de
doctorado. Ha publicado 26 artículos de investigación y 6 capítulos en libros. Sus
publicaciones cuentan con más de 320 citas. Ha participado en numerosos
congresos nacionales e internacionales y ha sido invitada a impartir conferencias y
seminarios en diferentes foros académicos en el país y en el extranjero. Su tema
de investigación actual es la regulación de la expresión genética mediada por
factores de traducción y RNAs pequeños en los procesos del desarrollo y
respuesta a estrés en plantas.
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