1. No category

Artículo publicado en la Revista SUIS, nº 123 (diciembre 2015).
Efectos sobre el sistema
inmunitario, eficacia y seguridad
de Imuvant como adyuvante
de Hyogen
P85360_separata_suis_hyogenOK.indd 2-3
Materiales y métodos
Estudio 1: efectos sobre la respuesta
inmunitaria humoral y celular
Se vacunaron tres grupos de 10 lechones
cada uno, seronegativos a M. hyopneumoniae, mediante una única inyección a
los 21 días de vida con tres formulaciones
Tabla 1. Formulación de las vacunas.
Grupo
Antígeno M. hyopneumoniae
Adyuvante
Control
-
No optimizado
2
+
No optimizado
3
+
Optimizado
Figura 1. Respuesta humoral y celular en los cerdos vacunados.
70
4
60
3,5
3
50
2,5
40
2
30
1,5
20
1
10
0,5
0
0
Control
ELISPOT
Grupo 2
ELISA
DTH
DTH ( mm)
La protección frente a la infección por
Mycoplasma hyopneumoniae está mediada tanto por la respuesta humoral
como por la repuesta celular del sistema
inmunitario, aunque suele revestir mayor
importancia el segundo tipo de respuesta.
Por tanto, resulta fundamental para que
una vacuna frente a M. hyopneumoniae
sea eficaz, que logre inducir una respuesta inmunitaria de tipo celular en el cerdo
además de desencadenar la producción
de anticuerpos. Los distintos adyuvantes
pueden dirigir el sistema inmunitario hacia
una respuesta de tipo Th1 (celular) o Th2
(humoral) lo cual puede ser determinado
mediante análisis celulares o serológicos.
Los lipopolisacáridos son estructuras moleculares presentes en la pared bacteriana,
para las cuales las células presentadoras
de antígeno (células dendríticas y macrófagos) tienen receptores específicos,
denominados TLR 4. La unión de estos
lipopolisacáridos bacterianos a dichos receptores, se ha comprobado que provoca
un incremento en la actividad de estas células y consecuentemente un aumento en
la respuesta inmunitaria.
El adyuvante desarrollado por Ceva para
Hyogen, vacuna para la prevención de la
enfermedad provocada por M. hyopneumoniae en ganado porcino, se denomina
Imuvant, e incluye un aceite mineral y
un lipopolisacárido (LPS) no tóxico de la
cepa J5 de Escherichia coli, que incrementa significativamente tanto la respuesta
celular como humoral al antígeno incluido en la vacuna.
El objetivo de un primer estudio fue evaluar el efecto de este adyuvante sobre la
respuesta celular y humoral en cerdos
vacunados frente a M. hyopneumoniae,
diferentes (tabla 1), el contenido antigénico de la vacuna de los grupos 2 y 3 fue
el mismo, variando la cantidad de lipopolisacáridos no tóxicos de la cepa J5 de
E. coli en una emulsión de aceite en agua.
El contenido oleoso de dichas emulsiones
también es diferente.
Se realizó una prueba de hipersensibilidad
retardada (DTH) el día 40 en la mitad de
los animales de cada grupo mediante una
inyección intradérmica de antígeno purificado de M. hyopneumoniae, como control positivo se utilizó fitohemaglutinina
y seguidamente en un segundo y tercer
estudio se evaluó tanto el efecto potenciador de la eficacia de los LPS de la cepa J5,
como la inocuidad de la vacuna en lechones de tres semanas de edad.
ELISA (EU/ml); ELISPOT (Células T/106 PBMC)
David Espigares
Técnico de Ceva Salud Animal
Grupo 3
Grupo
21/1/16 9:08
M. hyopneumoniae + aceite minerala
80
60
Porcentaje (%)
40
20
0
0
50
100
150
200
Puntuación pulmonar ponderada
M. hyopneumoniae + Imuvantb
Para realizar este estudio se dividieron cuarenta y cinco (45) lechones seronegativos
a M. hyopneumoniae en tres grupos de
15 animales cada uno y se vacunaron a las
tres semanas de vida con una sola dosis de
las preparaciones vacunales siguientes:
■■ Vacuna bacteriana frente a M. hyopneumoniae con un aceite mineral como adyuvante y sin LPS J5.
■■ Vacuna bacteriana frente a M. hyopneumoniae con Imuvant como adyuvante.
■■ Placebo.
El día 18 posvacunación se infectó experimentalmente a los animales con una cepa
virulenta de M. hyopneumoniae.
El día 46 los animales fueron sacrificados
y se puntuaron las lesiones pulmonares
observadas de acuerdo con la Farmacopea Europea. También se tomaron muestras con hisopos traqueales para realizar
una PCR cuantitativa y analizar el efecto
preventivo de la vacuna sobre la colonización por M. hyopneumoniae.
60
Porcentaje (%)
40
20
0
50
100
150
200
Puntuación pulmonar ponderada
Placeboc
80
60
40
Porcentaje (%)
7,00E+00
6,50E+00
6,00E+00
5,50E+00
5,00E+00
Conclusiones
4,50E+00
4,00E+00
3,50E+00
3,00E+00
2,50E+00
2,00E+00
n M. hyopneumoniae + aceite minerala
n M. hyopneumoniae + Imuvantb
20
0
y con un placebo como control. Además
de controlar las reacciones sistémicas y locales a las vacunas y de medir el aumento
de la temperatura corporal en diferentes
momentos, se realizaron análisis sanguíneos para determinar la concentración
de la aspartato aminotransferasa (AST)
y de la creatinquinasa (CK), ya que estas
enzimas son buenos indicadores de las
posibles lesiones tisulares causadas por la
vacunación.
Resultados
La figura 1 muestra el efecto del adyuvante sobre la respuesta inmunitaria celular y
humoral tras una única inyección.
El estudio de eficacia reveló una ventaja
clara de la formulación con Imuvant respecto a la formulación que no contenía
los LPS de la cepa J5, ya que los cerdos
vacunados con la primera formulación
Estudio 3: seguridad del adyuvante
0
50
100
150
En este estudio se vacunaron lechones seronegativos de tres semanas de edad con
tres lotes diferentes de la vacuna Hyogen
200
Puntuación pulmonar ponderada
Tabla 2. Eficacia, resultados de la puntuación de las lesiones pulmonares.
N
Media
DE
Mediana
Máx.
M. hyopneumoniae + aceite minerala
14
27,2
23,2
26
80
M. hyopneumoniae + Imuvantb
15
17,7c
28,8
10
116
Placeboc
15
43,1
41,4
27
149
Diferencia estadísticamente significativa.
a,b,c
P85360_separata_suis_hyogenOK.indd 4-5
n Placeboc
Grupo
Estudio 2: eficacia del adyuvante
80
0
vacunados y de todos los cerdos que recibieron una inyección no superó 1,5 ºC
y ningún cerdo vacunado mostró un aumento superior a 2 ºC en comparación
con el valor inicial antes de la inyección.
La determinación de la AST y de la CK no
puso de manifiesto ninguna lesión tisular
causada por la vacunación (tabla 3).
Figura 3. Valores Log10 de la PCR cuantitativa realizada con las muestras
de hisopos traqueales tras el sacrificio.
Log10 PCR cuantitativa
(PHA). El grosor de la piel se midió con
un calibrador digital sensible a la presión
(Mitutoyo, Japón) una vez transcurridas
24 horas desde la inyección intradérmica. Se tomaron muestras de sangre el día
40 de la otra mitad de los cerdos de cada
grupo para determinar la concentración
de interferón- mediante un análisis ELISPOT, y de anticuerpos mediante un análisis ELISA. Para ello se utilizó un kit IFNELISPOT (R&D, EE. UU.) y un lector
ELISPOT (CTL, EE. UU.) para cuantificar la secreción de citoquinas específicas
de antígeno por parte de los linfocitos T
estimulados in vitro. Los títulos de anticuerpos frente a M. hyopneumoniae se
determinaron mediante un ELISA indirecto desarrollado en nuestro laboratorio.
Figura 2. Distribución de la puntuación ponderada de las lesiones pulmonares.
mostraron una puntuación de las lesiones pulmonares significativamente inferior a las de los animales control que
recibieron el placebo (p=0,028). La segunda formulación que incluía tan solo
el aceite mineral también estuvo asociada con una reducción de la puntuación
de las lesiones pulmonares, pero esta
ya no fue estadísticamente significativa
(p=0,288, tabla 2 y figura 2). Los valores obtenidos en la PCR cuantitativa
mostraron exactamente la misma tendencia en relación con la disminución de
la colonización de la tráquea por la cepa
inoculada (p=0,044 y p=0,93 respectivamente [prueba de Wilcoxon para muestras independientes]; figura 3).
La evaluación del estudio de seguridad no
reveló ninguna reacción sistémica o local
importante a las vacunas. El aumento medio de la temperatura de los tres grupos
En el estudio para valorar los efectos sobre la respuesta inmunitaria humoral y
celular, se demuestra el efecto de las diferentes formulaciones de las vacunas sobre la respuesta inmunitaria celular y los
títulos de anticuerpos en suero de acuerdo
con los resultados obtenidos en la prueba de hipersensibilidad retardada (DTH),
el análisis ELISPOT (IFN- ) y el análisis
ELISA (anticuerpos frente a M. hyopneumoniae). La formulación que incluía un
adyuvante optimizado consistente en una
emulsión de aceite en agua y la cantidad
adecuada de lipopolisacáridos no tóxicos generó tras una única inyección una
potente estimulación de la respuesta inmunitaria celular y humoral en lechones
seronegativos, esta formulación fue la de
elección para su uso en Imuvant.
En los estudios de eficacia y seguridad
quedan confirmados tanto el excelente
perfil de seguridad como de eficacia del
adyuvante Imuvant, utilizado en la vacuna Hyogen, quedando demostrado su
efecto tanto en la reducción de los niveles de lesiones pulmonares provocadas
por M. hyopneumoniae, así como en la
reducción de los niveles de colonización
por M. hyopneumoniae.
Para más información contactar con:
[email protected]
Tabla 3. Concentración de AST y CK como indicadores de lesión tisular.
Grupo
AST (UI/l)
CK (UI/l)
Hyogen lote 1
41,5 ± 8,4
560 ± 279
Hyogen lote 2
45,6 ± 13,7
731 ± 333
Hyogen lote 3
49,5 ± 20,6
744 ± 571
Placebo
52,2 ± 27,0
1.233 ± 1.396
Referencias
Estudio 1: Adjuvant effect on humoral and cell mediated
immune response in pigs vaccinated against Mycoplas-
ma hyopneumoniae. Siklódi B., Tenk M., Terényi N., Tóth
I., Misák F., Benyeda J., Herczeg J., Kadra B. IPVS 2012.
Estudio 2 y 3: Imuvant TM – a novel adjuvant; efficacy
and safety properties in Hyogen vaccine. Tenk M., Kollár
A., Misák F., Ivók M., Pálmai N., Pénzes Z. - Ceva Animal
Health, Budapest, Hungary. ESPHM 2015.
21/1/16 9:08