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BUSQUEDA DE GENES CODIFICADORES DE LIPASAS EN UNA BIBLIOTECA
METAGENOMICA DE SUELO DE BOSQUE ALTO ANDINO MEDIANTE PCR
Andrés Anghelo Castelblanco Velandia
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar por el título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
DIRECTOR
José Salvador Montaña Lara MSc
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTADO DE CIENCIAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C.
2011
1
BUSQUEDA DE GENES CODIFICADORES DE LIPASAS EN UNA BIBLIOTECA
METAGENOMICA DE SUELO DE BOSQUE ALTO ANDINO MEDIANTE PCR
Andrés Anghelo Castelblanco Velandia
APROBADO
INGRID SCHULER Ph.D
JANETH ARIAS M. Sc
Decana académica
Directora de Carrera
BUSQUEDA DE GENES CODIFICADORES DE LIPASAS EN UNA BIBLIOTECA
METAGENOMICA DE SUELO DE BOSQUE ALTO ANDINO MEDIANTE PCR
2
Andrés Anghelo Castelblanco Velandia
APROBADO
__________________________
José Salvador Montaña MSc
Director
__________________________
Ziv Arbeli PhD
Jurado
3
4
Tabla de Contenido
1. RESUMEN………………………………………………………………………………..6
2. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………......7
3. JUSTIFICACIÓN – PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA…………………............7
4. MARCO TEÓRICO
4.1
Enzimas lipolíticas………………………………………………………………….8
4.2
Bioprospección de enzimas lipolíticas……………………………………………8
4.3
Tamizaje por secuencia………………………………………………………......10
4.4
Ambientes extremos como reservorio de enzimas…………………………......11
4.5
Antecedentes……………………………………………………………………….11
5. OBJETIVOS
5.1
5.2
Objetivo General……………………………………………………………………11
Objetivos Específicos.......................................................................................11
6. METODOLOGÍA
6.1
Optimización de la PCR………………..…………………………………………12
6.2
Tamizaje de la Biblioteca…………………………………………………………12
6.3
Clonación de bandas purificadas………………………………………………..14
6.4
Subclonación………………………………………………………………………..14
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1
Optimización de la PCR…………………………………………………………15
7.2
Tamizaje de la Biblioteca……………………………………………………….16
7.3
Subclonación……………………………………………………………………..19
8. CONCLUSIONES………………………………………………………………………...22
9. RECOMENDACIONES………………………………………………………………….22
10. REFERENCIAS…………………………………………………………………………..23
11. ANEXOS…………………………………………………………………………………..26
5
1. Resumen
Con el fín de buscar genes codificadores de lipasas, se llevó a cabo el tamizaje de una
biblioteca metagenómica de suelo de bosque alto andino (BAA) construída en el vector
fósmido PCC1-Fos utilizando una aproximación basada en secuencia. Inicialmente se
llevó a cabo la optimización de las condiciones de PCR empleando iniciadores
degenerados previamente diseñados con base en regiones conservadas de enzimas
lipolìticas caracterizadas. Para esto, se evaluaron diferentes concentraciones de ADN
molde, MgCl2 e iniciadores y varias temperaturas de anillamiento de los iniciadores. La
biblioteca metagenómica fue tamizada inicialmente con dos parejas de
oligonucleótidos a través de dos rondas de amplificación, adicionalmente a la banda
de interés (250pb) se observaron bandas de tamaños superiores hasta 1000pb lo cual
se debe al grado de degeneración de los iniciadores. Se seleccionaron bandas entre
los 250pb - 600pb y fueron purificadas y clonadas en los vectores pCR2.1 y pGEM®-T
Easy y los plásmidos recombinados fueron transformados en células de E. coli para su
posterior secuenciación. A partir de los resultados obtenidos en el tamizaje por PCR se
construyeron 3 bibliotecas de insertos pequeños y se identificaron 3 clones (ClipF1,
ClipF2, ClipF3) que mostraron actividad lipolítica en agar Luria Bertani con tributirina
1% como sustrato lipídico, después de la incubación a 4oC. Teniendo en cuenta que la
temperatura promedio registrada en el suelo del bosque alto Andino en el momento del
muestreo fue de (10oC) y que la hidrólisis del substrato ocasionada por los clones
identificados en este trabajo se evidenció luego de la incubación a baja temperatura,
se puede sugerir que los clones contienen secuencias que codifican por lipasas
adaptadas a bajas temperaturas. Se recomienda realizar análisis de las secuencias
clonadas con el fin de caracterizar los genes y ensayos de expresión adicionales.
6
2. Introducción
Las lipasas son biocatalizadores que poseen propiedades bioquímicas particulares por
lo que son ampliamente utilizadas en procesos industriales. Debido a la demanda
constante de enzimas, la bioprospección de lipasas es un tema de importancia e
interés para el sector biotecnológico. La identificación de estas enzimas estaba basada
en métodos dependientes de cultivo, los cuales presentan limitaciones ya que solo
permiten acceder a una fracción mínima de la diversidad microbiana. La
metagenómica ha surgido en la última década como una nueva alternativa para el
estudio de la diversidad y búsqueda de biomoléculas de interés biomédico e industrial.
Por tratarse de una aproximación independiente de cultivo, permite tener acceso a
toda la información genética presente en una muestra, de esta manera la
metagenómica ha permitido identificar nuevos biocatalizadores, antibióticos y
metabolitos con potencial biotecnológico.
En el presente trabajo se propone el uso de una aproximación metagenómica basada
en secuencia para identificar posibles genes que codifiquen enzimas lipolíticas en una
biblioteca metagenómica de suelo de bosque alto andino. El propósito de implementar
esta metodología es evitar los inconvenientes que se suelen presentar con los otros
métodos de tamizaje de un metagenoma, los cuales limitan la identificación de nuevos
genes que codifiquen alguna biomolécula de interés. Adicionalmente el tamizaje por
secuencia es de gran utilidad cuando se buscan nuevos miembros de proteínas
ampliamente conocidas como es el caso de las enzimas lipolíticas, de esta manera se
puede crear una colección de enzimas similares pero con diferencias en sus
propiedades biológicas para que puedan ser utilizadas en procesos industriales que
requieran condiciones específicas. El tamizaje de una biblioteca proveniente de un
ambiente extremo, permitiría identificar enzimas novedosas que posean características
catalíticas particulares y que representen alguna utilidad industrial en el futuro.
3. Justificación y Planteamiento del Problema
Las lipasas son enzimas útiles para diferentes sectores de la biotecnología, como el
farmacéutico, alimentario, ambiental, industrial y químico, por esta razón, existe una
demanda creciente por identificar nuevas enzimas lipolíticas para el desarrollo de
bioprocesos. Los métodos tradicionales de identificación de enzimas se basan en
métodos dependientes de cultivo con los cuales solo ha sido posible cultivar el <1% de
los microorganismos, limitando la identificación de nuevas biomoléculas La
metagenómica ha mostrado ser una alternativa efectiva para la identificación de
nuevas moléculas de interés (enzimas, antibióticos, anti-tumorales, etc.), debido a que
evita el sesgo del cultivo de los microorganismos y permite acceso a todo el contenido
genético presente en una muestra.
Los ambientes extremos son ecosistemas poco explorados, los cuales por sus
características físico-químicas representan una diversidad taxonómica y metabólica
particular. El estudio de estos ecosistemas ha aportado información importante
referente a biodiversidad, evolución, ciclos biogeoquímicos así como de enzimas útiles
para la industria, por esta razón la bioprospección de estos ecosistemas es importante
tanto para el sector académico como para el biotecnológico. El Bosque Alto Andino
(BAA) es un ecosistema en el que predominan bajas temperaturas (9-16°C), por lo que
es considerado un ambiente extremo psicrófilo. La diversidad en este ecosistema ha
sido poco investigada por lo que la bioprospección en este ambiente es importante
tanto para caracterizar la biodiversidad como en la identificación de enzimas con
alguna utilidad biotecnológica.
7
Con el presente trabajo se busca identificar en una biblioteca metagenómica de suelo
de BAA genes que codifiquen enzimas lipolíticas como estudio enmarcado en la
caracterización de biodiversidad y bioprospección de recursos genéticos que se está
realizando actualmente el Centro de Genómica y Bioinformática de Ambientes
Extremos (GeBiX) en el Parque Nacional de los Nevados. Para esto, se desea
implementar una estrategia metagenómica basada en secuencia mediante PCR con
iniciadores degenerados con el fin de evitar las limitaciones del tamizaje funcional.
Adicionalmente, existen numerosos reportes sobre clonación e identificación de
nuevas enzimas lipolíticas basadas en PCR, lo que demuestra que esta aproximación
es una alternativa efectiva en la identificación de nuevas enzimas.
4. Marco Teórico
4.1 Enzimas Lipolíticas
Actualmente existe una creciente demanda por identificar nuevas biomoléculas de
utilidad biotecnológica para el desarrollo de nuevos procesos o para la optimización de
los ya existentes. En el amplio repertorio de enzimas empleadas en la industria se
encuentran las lipasas, las cuales por sus propiedades bioquímicas constituyen uno de
los biocatalizadores de mayor uso e interés biotecnológico(1).
Las lipasas son enzimas ubicuas producidas por animales, plantas, y microorganismos
en general(2), que catalizan la hidrólisis de enlaces éster de los triacilglicerolesy liberan
ácidos grasos y glicerol(2). Estas se dividen en lipasas verdaderas (Triacilglicerol
hidrolasas EC 3.1.1.3) que actúan sobre sustratos de cadena larga insolubles en agua
y esterasas (Carboxilester hidrolasas EC3.1.1.) que ejercen su actividad en sustratos
de cadena corta solubles en agua (3,4). Arpigny & Jaeger en 1999 clasificaron estas
enzimas con base a su secuencia y propiedades biológicas en 8 familias, entre las
cuales la más representativa es la familia I a la cual pertenecen las lipasas verdaderas
y a esta a su vez se divide en 6 sub-familias(5). Los géneros más reportados de
microorganismos productores enzimas lipolíticas son Candida, Pseudomonas,
Burkholderia, Thermomyces, Rhizopus, Bacillus, Staphylococcus,Geobacillus,
Acinetobacter, Rasltonia(6,7,8,).
Las lipasas hacen parte de la superfamilia de las α/β hidrolasas, las cuales poseen un
dominio que se compone de una hoja β central rodeada de un numero variable de
hélices α(9), el sitio activo presenta una triada catalítica conformada por residuos de
Ser, Asp, His y poseen el motivo conservado GxSxG (la x significa cualquier amino
ácido). La Ser presente en el sitio activo se encarga de realizar el ataque nucleofílico
sobre el carbonil presente en el sustrato en la hidrólisis del enlace éster(3,4).
Bioquímicamente las lipasas se destacan por su regio y enantio-selectividad,
estabilidad en solventes orgánicos y la actividad no dependiente de cofactores(9,10).
Estas propiedades hacen que las enzimas lipolíticas sean de utilidad para la industria
ya que pueden ejercer su actividad catalítica óptima en un extenso número de
procesos que requieren condiciones específicas (1,10,11), como la elaboración de
farmacéuticos, papel, productos alimentarios, cosméticos, producción de biodiesel,
síntesis de compuestos orgánicos, detergentes, biorremediación ambiental,
tratamiento de aguas residuales y producción de biopolímeros de fácil degradación
entre otros(2,3-7,10-13).
4.2 Bioprospección de Enzimas Lipolíticas
El método tradicional de búsqueda e identificación de lipasas consiste en el
aislamiento y purificación a partir de muestras ambientales (lodos activados, compost,
suelo, sedimento, agua) (9,14) de microorganismos que tengan la capacidad degradar
sustratos lipídicos. La identificación se realiza generalmente por visualización de halos
8
de hidrólisis o por adición de un colorante (14,15). La mayoría de las lipasas reportadas
provienen de microorganismos identificados mediante metodologías dependientes de
cultivo, con las cuales se ha demostrado que solo es posible tener acceso a una
mínima fracción de la diversidad de microorganismos (<1%) (16,17) razón por la cual, es
recomendable implementar nuevas estrategias que permitan superar este
inconveniente.
Desde hace más de una década la metagenómica surgió como una alternativa para
sortear las barreras que suponen los métodos tradicionales. La metagenómica o
genómica ambiental se encarga del estudio de los genomas presentes en una
comunidad microbiana con una metodología independiente de cultivo(18), para esto, el
ADN total de una muestra ambiental es extraído y clonado con el fin de obtener una
biblioteca metagenómica la cual puede ser tamizada de diferentes formas(18). Esta
disciplina ha facilitado ampliar el conocimiento sobre la complejidad filogenética y
metabólica presente en una comunidad microbiana, permitiendo de esta forma,
elucidar nuevas estructuras, funciones e interacciones microbianas(16,19,20).
Los estudios metagenómicos tradicionalmente se han realizado desde tres enfoques
distintos: tamizaje funcional,
secuenciación en masa, y tamizaje basado en
secuencia(16,20). El primero consiste en la construcción de bibliotecas metagenómicas
y evaluación con sustratos específicos que buscan inducir la producción de enzimas o
metabolitos deseados que son evaluados visualmente, por ejemplo: por la formación
de halos de hidrólisis(21). Este enfoque ha sido el más empleado ya que permite
recuperar la secuencia completa del gen y no requiere conocimiento previo de los
genes de interés(20), sin embargo presenta varias desventajas como la dependencia
del hospedero que se emplea para la expresión. En la mayoría de estudios se emplea
Escherichia coli como sistema único de expresión; aunque esta bacteria ha mostrado
expresar una extensa diversidad de genes de diversos orígenes, se encuentra
documentado que E. coli solo está en capacidad de expresar correctamente el 40%
de los genes cloinados(22) como consecuencia de las diferencias en los sistemas de
regulación a nivel transcripcional, traduccional, post-traduccional entre E.coli y el
organismo de donde proviene el transgen(22-24). A esto se suma que en algunos casos
se presenta toxicidad por sobreexpresión del gen clonado. Adicionalmente el tiempo y
costo que demanda analizar miles de clones reduce la eficiencia y limita la aplicación
de este tipo de tamizaje(23-29).
El segundo método de análisis de un metagenoma se basa en la secuenciación
masiva de ADN metagenómico o de una biblioteca empleando marcadores
específicos(28,29). La aplicación de esa aproximación se facilita por el uso de
tecnologías de secuenciación de alto procesamiento las cuales permiten obtener
grandes cantidades de datos en corto tiempo a bajo costo y se evita la pérdida de
información de microorganismos de baja abundancia en la muestra(19,20,29). A pesar
de estas ventajas, la secuenciación en masa presenta varias limitantes que restringen
su aplicación como: la poca longitud de las lecturas generadas por las distintas
plataformas de secuenciación de segunda generación (50-250pb) que no representar
una región importante o significativa de un gen por lo que no es posible asignarle una
función. De igual manera, la mayoría de secuencias depositadas en las bases de
datos de genes y proteínas están sesgadas hacia organismos modelo y
microorganismos cultivados, los cuales no representan la totalidad de especies, genes
y rutas metabólicas, por lo tanto se dificulta la clasificación taxonómica y funcional de
las secuencias complicando el análisis de la información.(19,28,29).
9
4.3 Tamizaje por Secuencia
El tercer tipo tamizaje de un metagenoma es el basado en secuencia u homología;
este emplea técnicas basadas en PCR e hibridización(19,31). A diferencia del tamizaje
funcional no está sujetoa la expresión en un hospedero heterólogo, en cambio sí va a
depender del conocimiento previo que se tenga de las proteínas a identificar ya que a
partir de dominios o regiones conservadas se sintetizan sondas e iniciadores, por esta
razón el uso de este enfoque se recomienda cuando se desea identificar nuevos
miembros de familias de proteínas conocidas para obtener una colección de enzimas
similares pero con variaciones en sus propiedades(20,28). El tamizaje basado en PCR
en general se basa en el uso de oligonucleótidos degenerados diseñados a partir del
alineamiento múltiple de secuencias de proteínas conocidas, con los cuales se hace
una amplificación parcial del gen, este fragmento es secuenciado y a partir del mismo
se diseñan iniciadores para recuperar las secuencias corriente arriba y corriente abajo
mediante Genome walking hasta obtener el gen completo(25). Siguiendo esta
metodología se han identificado y clonado diversos tipos de genes como esterasas,
lipasas, quitinasas, xilanasas, celulasas, PKS sintetasa entre otros (16,18,25),
adicionalmente, distintos autores han propuestos diversas variantes para clonar genes
por homología como el uso de DGGE (Electroforesis en Gel de Gradiente
Denaturante) seguido de Gene walking(32), touchdown-PCR(48), PAI-PCR (Pre
Amplified Inverse-PCR)(33) y IAN-PCR (Inverse Affinity Nested-PCR) (34).
En lo que concierne a las enzimas lipolíticas, estrategias basadas en hibridización(35) y
PCR han permitido clonar exitosamente genes de lipasas en microorganismos
aislados (36-41), de ADN ambiental (42) y de bibliotecas metagenómicas (28,38,44). Para
la búsqueda de genes de enzimas lipolíticases común emplear oligonucleótidos
degenerados siguiendo el método CODEHOP (Consensus Degenerate Hybrid
Oligonucleotide Primers) el cual se basa fundamentalmente en el diseño de cebadores
con una región 3’ degenerada y una región clamp no degenerada en el extremo 5’ lo
cual estabiliza la hibridización de la región degenerada con el ADN molde durante el
anillamiento(46). Dada la baja similitud entre las lipasas, las regiones conservadas del
sitio activo y el agujero oxianión son comúnmente utilizadas para diseñar los
iniciadores(42). Con base en el principio CODEHOP se han clonado genes de lipasas y
esterasas de diversos ecosistemas(47) y de bacterias aisladas pero cuyos genes de
lipasas no habían sido caracterizados previamente(41,44).
En un estudio previo, Bell et al en 2002 a partir de un alineamiento múltiple de 70
secuencias de lipasas de las familias I diseñaron un set de iniciadores degenerados
siguiendo el principio CODEHOP con base en las secuencias conservadas del sitio
activo y el agujero oxianión. De esta manera clonaron una nueva lipasa que
posteriormente expresaron exitosamente en E. coli.(26). En otro trabajo Terahara y
colaboradores en 2010, utilizando los mismos oligonucleótidos identificaron 13 nuevas
esterasas a partir de diversas muestras ambientales, de las cuales lograron expresar 8
en un hospedero heterólogo(27). Adicionalmente Smith 2010, identificó nuevas lipasas
empleando los iniciadores diseñados por Bell et al 2002 en muestras de suelo mineral
de valle antártico(45). Estos reportes demuestran que el tamizaje por secuencia es
una alternativa efectiva que se puede implementar en la búsqueda de genes de interés
en metagenomas superando algunas limitacines que suponen los otros dos métodos
de tamizaje
Hasta la fecha más de 80 enzimas lipolíticas nuevas han sido reportadas empleando
metodologías basadas en metagenómica, varias de las cuales han aumentado el
número de miembros en cada una de las familias propuestas por Arpigny(49-52). Sin
embargo, algunas no logran ser clasificadas en ninguna de las 8 familias por lo que
algunos autores sugieren la conformación de nuevas familias y/o la reestructuración de
la clasificación(53-59).
10
4.4 Ambientes Extremos como Reservorio de Enzimas Lipolíticas
Las lipasas identificadas mediante aproximación metagenómica provienen
de
diferentes ecosistemas como suelo, agua, lodos activados, rumen, compost, manglar y
sedimentos entre otros(17,40,54,55,58,59). Adicionalmente los ambientes extremos
llamados así por condiciones físico-químicas (temperatura, salinidad, pH, radiación,
presión) extremas constituyen una fuente poco explorada de nuevos biocatalizadores
útiles para la industria. Dadas las propiedades de estos ecosistemas no todos los
microorganismos son capaces de subsistir, por lo que es usual encontrar una baja
diversidad microbiana(20), sin embargo los microorganismos extremófilos desarrollan
mecanismos que les permiten sobrevivir, adaptarse y reproducirse en estas
circunstancias. Uno de los mecanismos proviene de las enzimas, las cuales presentan
propiedades y adaptaciones particulares que les permiten tener una actividad catalítica
óptima bajo estas condiciones, esto las hace útiles para procesos industriales donde
se requieren de condiciones extremas que normalmente afectarían la actividad de una
enzima. Por esta razón la bioprospección de ambientes extremos es de gran
importancia para la biotecnología(20). Los ambientes psicrófilos como es el caso del
Parque Nacional de los Nevados se caracterizan por su baja temperatura (<16ºC)(60)y
han sido explotados recientemente en búsqueda de enzimas adaptadas a bajas
temperaturas, las cuales tienen diversas aplicaciones industriales(60,61). En el caso de
las lipasas adaptadas a frío (cold-adapted lipases) poseen una mayor flexibilidad
alrededor del sitio activo, menor número de puentes disulfuro, mayor hidrofobicidad,
menor interacciones electrostáticas, lo que hace que tengan una actividad catalítica
óptima a bajas temperaturas(10,60,61). Procesos llevados a cabo en frío representan
menos suministro de energía lo que implica menores costos de producción, así mismo
se reduce la posibilidad de contaminación(61).
4.5 Antecedentes
El Centro Colombiano de Genómica y Bioinformática de Ambientes Extremos (GeBiX)
viene realizando desde hace 3 años en el Parque Nacional de los Nevados (PNN) un
estudio con el fin de caracterizar la biodiversidad presente en los distintos ecosistemas
y adicionalmente realizar bioprospección de enzimas con utilidad industrial como
celulasas y lipasas. En un estudio previo se identificó una nueva esterasa a partir de
una biblioteca metagenómica de bosque alto andino mediante tamizaje funcional(53).
Por otro lado, en ensayos preliminares se intentó usar una aproximación por
homología para clonar genes de lipasas en cepas lipolíticas aisladas de suelo del
PNN, sin embargo no se logró amplificar satisfactoriamente una secuencia parcial de
un gen lipolítico, razón por la cual se propuso en este trabajo, optimizar las
condiciones de la PCR con el fin de utilizar esta metodología para la búsqueda de
genes codificadores de lipasas en librerías metagenómicas.
5. Objetivos
5.1 Objetivo General
Buscar genes codificadores de enzimas lipolíticas en una biblioteca metagenómica de
Bosque Alto Andino mediante un tamizaje por secuencia.
5.2 Objetivos Específicos
5.1.1 Definir las condiciones de amplificación que permitan obtener el amplicón de
interés.
5.1.2 Verificar que un producto de PCR obtenido corresponda a un gen de una
lipasa
5.1.3 Determinar la afiliación filogenética de las secuencias obtenidas
11
6. Metodología
6.1 Optimización de PCR
La optimización de la reacción de amplificación se realizó con base en el esquema
propuesto por Terahara et al 2010 (27). Los parámetros seleccionados para optimizar
en la PCR se seleccionaron según Roux(62) y Altshuler(63). Se evaluaron diferentes
adyuvantes como: DMSO, Glicerol, Betaína, BSA y DTT, diferentes concentraciones
de ADN molde, MgCl2 y oligonucleótidos, varias temperaturas de anillamiento y
números de ciclos. Las condiciones evaluadas para cada parámetro se muestran en la
tabla 1.
La optimización se llevó a cabo utilizando ADN genómico de una cepa control de
Bacilluspumilis(28) aislada del PNN que presentó actividad lipolítica en tributirina,
trioleina y tricaprilina, y con ADN plasmídico de un clon con actividad lipolítica
proveniente de una biblioteca metagenómica de suelo de bosque alto Andino (BAA) de
un estudio anterior(56).
Tabla 1. Parámetros evaluados durante la optimización de la PCR
PARAMETRO*
CONDICIONES EVALUADAS*
DMSO (%)
0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2
Glicerol (%)
1, 2, 5, 10
Betaína (M)
0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6
BSA (mg/ml)
0.5, 1, 2
DTT (mM)
0.1, 02, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2
Betaína + DTT + DMSO
1.6M, 3.2mM, 3.2%
DMSO + BSA +DTT
2%, 1mg/ml, 2mM
ADN molde (genómico y plasmídico) (ng)
5, 10, 20, 30, 50, 75, 100
Tm (ºC)
47 – 60
MgCl2 (mM)
1.5 – 5 (incrementos de 0.5)
Oligonucleótidos (µM)
0.5 - 5 (incrementos de 0.5)
Numero de ciclos
25,.30,35,40,45,50
*Los parámetros y condiciones evaluadas se tomaron de las refs. 62-65, DMSO: Dimetilsulfóxido, DTT:
Ditiotreitol, BSA: Albúmina de Suero Bovino, Tm: Temperatura de anillamiento
6.2 Tamizaje de la Biblioteca
La biblioteca metagenómica a tamizar fue construida previamente a partir de ADN de
suelo de Bosque Alto Andino el cual fue clonado en el fósmido pCC1FOS (Epicentre) e
insertado en células de E.coli Epi300. La biblioteca consta de ~22.000 clones con un
tamaño promedio de inserto de 35Kb y se encuentra almacenada en fracciones de 384
clones en el laboratorio del GeBiX de la Universidad Javeriana.
El tamizaje primario se realizó sobre 12 fracciones (nombradas de P1 a P12) cada una
conteniendo 1920 clones, que correspondes a los clones de 5 pozos de la placa. Para
12
esto 5µL de cada pozo de la placa fueron transferidos a 1mL de caldo LB
suplementado con MgSO410mM, Maltosa0.2% y Cloranfenicol 12.5ug/ml. Los cultivos
fueron incubados por 12h a 37ºC con agitación de 150rpm, luego se les adicionó 1µl
de Copy Control Fosmid Autoinduction Solution y se incubó por 6 horas más.
Posteriormente se realizó extracción de ADN del fósmido mediante lisis alcalina
siguiendo el método descrito por Sambrook et al(71). El ADN fue cuantificado en un
espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 Thermo y evaluado mediante electroforesis en
gel de agarosa al 0.8%.
Para la PCR se emplearon los iniciadores reportados por Bell y colaboradores en 2002
OXF1-ACR1, OXF1-ACR3(28) (tabla 2), el volumen de reacción fue de 25µl y la
concentración final de los reactivos fue: Green Flexi Buffer(Promega) 1X, MgCl 2 2mM,
iniciadores 4.5µM de cada uno, GoTaq® Polimerasa (Promega) 0.04U/µL y ADN
1.2ng/µl. El esquema de amplificación consistió en un ciclo de denaturación inicial a
94ºC 3min, 45 ciclos de 94ºC 30s, 52.5ºC 30s 72ºC 90s y una extensión final de 72ºC
7 minutos. Los productos de amplificación fueron visualizados en gel de agarosa al
1.5% teñido con SYBRSafe 1X. Como control positivo se utilizó ADN genómico de
B.pumilis(26) y ADN plasmídico de un clon lipolítico(53), el control negativo correspondió
a toda la mezcla de reacción pero con agua en lugar de ADN.
Tabla 2. Oligonucleótidos utilizados en el estudio
Iniciador
Secuencia
a
5’–CCYGTKGTSYTNGTNCAYGG–3’
a
5’-AGGCCNCCCAKNGARTGNSC-3’
a
5’-AGGCCRCCNTGNGARTGNSC-3’
b
5´-GTAAAACGACGGCCAG-3´
OXF1
ACR1
ACR3
M13F
M13R
b
T7 promoter
c
T3
5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´
c
5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'
5'-ATTAACCCTCACTAAAG-3'
a: Tomado de Bell et al 2002(28), b: inciadores para los vectores pGEM-T Easy/pCR2.1-TOPO, c:
Iniciadores para el vectorpBlueScript SK. Y: T o C, K: T o G, S: C o G, N: A o T o C o G,R: A o G
Los productos de amplificación fueron separados mediante electroforesis en gel de
agarosa 1,5%. Se buscó la presencia de una banda alrededor de ~250pb la cual
podría corresponder a una fracción de un gen codificador de lipasa(26). De las
fracciones que presentaron señal positiva de amplificación, se tomaron 3 al azar (P2,
P7, P11) con las cuales se realizó una segunda ronda de amplificación. Para esto,
cada fracción se diluyó y dividió en 5 partes cada una con 384 clones para un total de
15 sub-fracciones nombradas como P2a a P2e; P7a a P7e y P11a a P11e
respectivamente. Las condiciones de cultivo, extracción de ADN de fósmido y
amplificación fueron las mismas a las mencionadas anteriormente. 3 sub-fracciones
(P2d, P7e, P11b) que mostraron señal positiva, fueron diluidas y divididas en 6 partes
para obtener 18 mini-fracciones con 64 clones cada una. Las condiciones de cultivo,
método de aislamiento de ADN y condiciones de amplificación con iniciadores
degenerados se realizaron de acuerdo con la metodología descrita anteriormente.
13
6.3 Purificación de Bandas y Clonación
Un total de 12 bandas con tamaños entre 250 y 600 pb fueron seleccionadas. (6 para
los iniciadores OXF1-ACR1, 4 para OXF1-ACR3 y los 2 controles), La bandas fueron
purificadas empleando el kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) y
luego clonadas en el vector pCR®2.1-TOPO (Invitrogen) con modificaciones al
protocolo recomendado por el fabricante (Anexo). Posteriormente 3µl del producto de
ligación se transformaron en células quimiocompetentes de E.coli TOP10 mediante
choque térmico siguiendo las instrucciones del manual. La selección de clones
positivos se realizó en agar LB con ampicilina(Amp) 50µg/ml, kanacimina(Kan) 50µg/ml
y X-gal 80µg/ml.
Algunas bandas fueron clonadas en pGEM®-T Easy (Promega) con una relación
(inserto:vector) 3:1 siguiendo las indicaciones del fabricante. La transformación se
realizó por choque térmico en células quimiocompetentes de E.coli JM109. La
selección de transformantes positivos se realizó en agar LB suplementado con
Amp100µg/ml, IPTG 0.5mM y X-gal 80µg/ml. En ambos casos las cajas se incubaron por
24h. Las colonias blancas fueron seleccionas y transferidas a 5ml de caldo LB
suplementado con Amp50µg/ml, Kan 50µg/ml para los clones en pCR®2.1-TOPO® y
con Amp100µg/ml para los clones conpGEM®-T Easy, posteriormente se realizó
extracción de ADN plasmídico mediante lisis alcalina (66),
Con el fin de verificar la presencia de inserto en los clones, se llevó a cabo una
reacción de amplificación empleando los iniciadores universales M13F y M13R (tabla 2).
El esquema de amplificación consistió de 1 ciclo 94ºC 2 min, 25 ciclos 94ºC 30s, 55ºC
30s, 72ºC 30s, con una extensión final de 72ºC 7min. Los productos fueron verificados
en gel de agarosa 1.3% teñido con SYBRSafe. Adicionalmente, como segundo método
de verificación de clones se realizó restricción del ADN plasmídico empleando las
enzimas de restricción SacI (Promega) para los clones de pCR®2.1-Topo® y con RsaI
(Promega) para los clones de pGEM®-T EASY. Los productos de PCR obtenidos con
los iniciadores M13F/M13R fueron enviados a secuenciar en Macrogen (Corea del
Sur).
6.4 Subclonación
Con el fin de comprobar si las prueba de PCR con iniciadores degenerados permitió
amplificar una secuencia parcial de un gen lipolítico, las sub-fracciones P2d, P7e,
P11b fueron seleccionadas para la construcción de una biblioteca de insertos
pequeños que pudiera ser tamizada en medio LB con tributirina y así poder obtener un
clon individual que incluya el gen completo. Para esto, se realizó la extracción del ADN
de fósmido como se describió previamente. Posteriormente fue digerido con las
endonucleasas KpnI (Promega) y SacI (Promega) por 3.5 horas a 37ºC. La digestión
se verificó en gel de agarosa al 0.8% y los fragmentos localizados entre 2 y 8Kb fueron
purificados desde el gel como se describió anteriormente y 100ng de ADN purificado
fueron empleados para la subclonación. Como vector de clonación se utilizó el
plásmido Bluescript SK (Stratagene), la ligación se realizó por 12h a 4ºC con
relaciones (inserto:vector) 2:1 y 3:1,siguiendo las instrucciones del fabricante. La
transformación se llevó a cabo por choque térmico con 2µl del producto de ligación en
células quimiocompetentes de E.coli DH5α, se sembraron 100µl en agar LB con IPTG
0.5mM, X-gal 80µg/ml, Amp 100µg/ml para determinar el título de cada biblioteca. El
contenido restante fue tamizado en agar LB con IPTG 0.5mM, X-gal80µg/ml, Amp
100µg/ml, Tributirina 1%(v/v), se incubó por 48h a 37ºC y posteriormente se llevó a
4ºC por 4 días. Los clones que mostraron el mayor halo de hidrólisis fueron repicados
en caldo LB + Amp 100µg/ml, la incubación y extracción de ADN se realizó como se
14
describió previamente. Se amplificó el ADN aislado con los iniciadores T7 promoter y
T3 (tabla 2), el producto de PCR fue enviado a secuenciar en macrogen (Korea del sur).
7 Resultados y Discusión
7.1 Optimización de la PCR
Previo a realizar el tamizaje de la biblioteca fue necesario optimizar las condiciones de
amplificación ya que en ensayos preliminares no había sido posible obtener
amplicones. Los resultados obtenidos en los ensayos de optimización se presentan en
el anexo 1. Las condiciones que permitieron obtener el amplicones del tamaño
esperado fueron: MgCl2 (2 mM) oligonucleótidos (4.5 µM), ADN molde (1.2ng/µl) y el
esquema de amplificación que se muestra en la tabla 3. Las condiciones definidas en
el presente estudio difieren de las reportadas por Bell et al(26) y Terahara et al(27)
quienes con los mismos iniciadores identificaron nuevos genes codificadores de
lipasas. Si bien este perfil de amplificación permitió obtener amplicones del tamaño
esperado, también produjo bandas inespecíficas Esto era de esperarse debido al
grado de degeneración de los cebadores(63).
La concentración de MgCl2 es uno de los factores más importantes que afectan la
especificidad de la reacción, usualmente se utiliza a 1.5mM(62,63), sin embargo
teniendo en cuenta que se utilizaron iniciadores altamente degenerados fue necesario
incrementar la concentración a 2mM, con lo cual se disminuye la especificidad pero se
favorece la amplificación(63). Por su parte la concentración del ADN molde también
influye de manera importante en el éxito de una PCR, en ocasiones cuando se
adiciona en exceso (>100ng) puede inhibir la reacción, ya que el tiempo de
denaturación empleado puede no ser suficiente para separar completamente las dos
cadenas, adicionalmente se pueden formar estructuras secundarias, estos dos
eventos llevan a un anillamiento deficiente de los iniciadores por lo tanto se afecta
negativamente la amplificación(63). El exceso de ADN molde también contribuye a que
se produzca ruido de fondo (background), además si se emplea un elevado número de
ciclos en el esquema de amplificación (>35), el ADN molde junto con los amplicones
generados pueden empezar a degradarse haciendo que en el gel se vea un
degradado (smear)(63), por esta razón se estableció usar 30ng de ADN por reacción.
Con el incremento del tiempo de denaturación inicial en 1 minuto con respecto a
Terahara et al, se buscaba lograr una denaturación completa del ADN que favoreciera
el anillamiento del mayor número de iniciadores presentes en la mezcla. Por otro lado,
empleando de 25 a 40 ciclos de amplificación no se observó banda o ésta era muy
tenue, con 50 ciclos se produjo una banda intensa pero adicionalmente se presentó
bastante degradado por lo que con la reducción a 45 ciclos se redujo en lo posible el
degradado y así mismo la intensidad de bandas inespecíficas. Otro factor importante
que se modificó respecto a los otros estudios fue la temperatura de anillamiento(Tm) la
cual incide fundamentalmente en la especificidad(62,63). Cuando se emplean
iniciadores degenerados generalmente la Tm utilizada es baja (40-50ºC), esto
favorece el anillamiento de la mayor cantidad de iniciadores individuales presentes en
la mezcla. En este trabajo la Tm se incrementó en 2.5ºC con lo cual se logró reducir el
número de bandas inespecíficas sin alterar la amplificación del fragmento de interés
por lo que se logró incrementar la especificidad de la reacción.
El último parámetro modificado fue la concentración de oligonucleótidos. Si bien, a
medida que el grado de degeneración incrementa, la concentración de cada iniciador
presente en la mezcla disminuye por lo que es necesario incrementar el volumen
empleado para tratar de contrarrestar esta disminución(68,69). Los iniciadores
empleados en este estudio tienen un grado de degeneración de 512, exediendo el
grado recomendado(46,67), lo que podría favorecer el incremento de productos
15
inespecificos en la reacción. Este grado de degeneración que corresponde al total de
oligonucleótidos individuales presentes en la mezcla(67,69) significa para este caso que
la frecuencia con la que un iniciador presente en la mezcla hibrida con una secuencia
en el ADN molde disminuye de 1 a 1.95x10-3(46), razón por la cual es muy complicado
lograr obtener un solo producto de amplificación. Adicionalmente estos iniciadores al
ser diseñados con base en el sitio activo de las lipasas, el cual está presente en otras
proteínas de la superfamilia de las α/β hidrolasas como β_lactamasas podrían estar
amplificando genes distintos a los que codifican lipasas, por ejemplo el gen de
resistencia a la ampicilina presente en el vector de clonación. Por esta razón se podría
esperar la aparición de bandas inespecíficas, lo importante es que la amplicón que
predomine corresponda al tamaño esperado. Por otro lado, con la adición de
adyuvantes (BSA, DMSO, DTT, Glicerol, Betaina) a la mezcla de reacción no se
observó ningún efecto positivo en la amplificación, por lo tanto no se consideró
finalmente su uso en el momento del tamizaje de la biblioteca.
Tabla 3. Parámetros y condiciones de amplificación utilizados en este estudio.
Parámetro
Bell et al(26)
Terahara et al(27)
Este estudio
5.0
1.3
1.75
1.5
4.0
1.2
2.0
4.5
1.2
94ºC 1s
94ºC 1min
37ºC 1s
37ºC 30s
72ºC 2min20seg
72ºC 1min
35ciclos de:
95ºC 1min
50ºC 1min
94ºC 2min
50 ciclos de:
94ºC 30s
50ºC 30s
72ºC 90s
94ºC 3min
45 ciclos de:
94ºC 30s
52.5ºC 30s
72ºC 90s
72ºC 7min
72ºC 7min
MgCl2 (mM)
Iniciadores (µM)
ADN templado (ng)
Perfil de amplificación
72ºC 1min
7.2 Tamizaje de la Biblioteca
A partir de 12 fracciones cada una con 1920 clones se realizó una primera ronda de
amplificación, el patrón de bandeo con los iniciadores OXF1-ACR1 fue similar en la
mayoría de carriles, de igual manera se observó la banda de interés (~250pb) en todos
las fracciones (figura 1). Esto puede deberse al número de clones presentes en el
mismo medio, los cuales tienen inserto promedio de 35Kb lo que significa que en cada
fracción se tamizaron 67.2Mb; si se tiene en cuenta que cada gen procariota es de
aproximadamente 1Kb(70) la diversidad presente en cada fracción es muy amplia por
lo que es posible que en cada una se encuentren 1 o más genes codificadores de
lipasas.
16
1
2
1500
600
200
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
1500
600
200
Figura 1. Primera ronda de amplificación con los iniciadores OXF1-ACR1. Carriles 2-13: Fracciones
1-12 respectivamente, carril 14: control positivo B. pumilis, carril 15: control positivo Clon lipolítico,
carril 16: control negativo carriles 1 y 17: Marcador de talla molecular 100pbladder (Invitrogen). La
flecha indica una banda de ~250pb
Con respecto a los cebadores OXF1-ACR3 el patrón de bandeo fue más heterogéneo
con respecto al anterior (figura 2), a pesar de que se obtuvieron varias bandas
positivas, en la mayoría de carriles las bandas más definidas e intensas se observaron
por encima de los 250pb, las cuales probablemente no corresponden a genes de
enzimas lipolíticas. Es posible que al implementar un iniciador antisentido diferente,
este no haya encontrado una secuencia en el gen de interés donde anillar, por lo que
podría haberse unido a secuencias inespecíficas. Es importante tener en cuenta que
los oligonucleótidos empleados en este estudio fueron diseñados a partir de lipasas de
la familia I y algunos miembros de las familias II y III, por lo tanto es probable que en
la muestra se encuentren genes de las familias restantes, los cuales no van a ser
amplificados con estos cebadores.
Figura 2. Primera ronda de amplificación con los iniciadores OXF1-ACR3. Carriles 1-12: fracciones 1-12
respectivamente, carril 13 control positivo B. pumilis, carril 14: control positivo Clon lipolítico, carril 15:
control negativo carril 16: marcador de talla molecular 100pb (Invitrogen). La flecha indica una banda de
~250pb
Para la segunda ronda de amplificación se tomaron al azar las fracciones P2, P7 y
P11, cada una divida en 5 sub-fracciones para un total de 15(384 clones c/u). En esta
amplificación con los iniciadores OXF1-ACR1, se observó banda positiva en 9 carriles
(figura 3), así mismo, al igual que en la primera amplificación se observaron bandas
17
por encima de los 600pb. Sin embargo en este caso ya se observa ausencia de
amplicón en algunas muestras lo que demuestra el efecto de la dilución. Es de resaltar
que algunos carriles que provienen de distintas sub-fracciones tienen un patrón de
bandeo idéntico, esto podría sugerir la abundancia de una especie en la muestra, lo
que conlleva a que algunas secuencias se encuentren sobre representadas en la
biblioteca, sin embargo para poder confirmar esto tendría que realizarse un análisis de
biodiversidad (ej: análisis de 16S)
1 1
22
33
44
55
66
77 88
99
1010 1111 1212 13
18 1819 19
13 14 14 15 15 16 1617 17
Figura 3.Segunda ronda de amplificación con los iniciadores OXF1-ACR1. Carriles1-5 (sub-fracciones
P2a-P2e), carriles 6-10 (sub-fracciones P7a-P7e), carriles 12-16 (sub-fracciones P11a-P11e), carril 17: B.
pumilis, carril 18: clon lipolítico, carril 19: control negativo, carril 11: marcador de talla molecular: 100pb
(BioRad), La flecha roja sobre el marcador indica una banda de 200pb, la flecha en el carril 18 indica una
banda de ~250pb. Las flechas azules indican las bandas que fueron purificadas
Para los iniciadores OXF1-ACR3 el patrón de bandeo fue diverso al igual que en la
primera amplificación (figura 4), sin embargo solo se observó una banda de ~250pb en
un carril, por su parte bandas de mayor tamaño predominaron en la mayoría de
carriles. Esto resultados podrían indicar el oligonucleótido ACR3 no tiene alta
especificidad por genes de lipasas, ya que a pesar de tener un grado de degeneración
similar al de ACR1 el número de bandas presuntivas de genes de lipasas fue menor al
obtenido con ACR1, adicionalmente las bandas que predominaron fueron de tamaños
superiores a 250pb. A pesar de esto, se clonaron los amplicones de estos tamaños
(350 y 600pb) debido a que las lipasas poseen un rango de tamaño amplio (entre 20 y
más de 100KDa)(2) por lo que es posible que algunas lipasas tengan el sito activo y el
agujero oxianión más separados que los de las lipasas reportadas, si embargo para
poder confirmar esto es indispensable secuenciar el inserto y realizar el análisis
respectivo.
Adicionalmente se intentó realizar una tercera ronda de amplificación diluyendo las
sub-fraccionesen 6 partes, cada una de 64 clones pero no se obtuvo ninguna señal
positiva. Esto puede deberse a que dependiendo del inserto clonado algunos clones
pueden crecer más rápido inhibiendo así el crecimiento de otros(31), entre los cuales
pueden estar los clones que tienen el inserto de interés. Esto conlleva a que estén en
baja proporción en el medio y consecuentemente se pueden perder durante la
extracción de ADN. Algunos autores sugieren para evitar este inconveniente el uso de
medios semilíquidos adicionando compuestos gelificantes al medio como agarosa,
esto disminuye el sesgo de crecimiento de los clones con lo que se evita la posible
pérdida de alguno que pueda contener un gen de interés(31,71).
18
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
11
12 13 14 15 16 17
12
13 14
15 16
18
19
Figura 4. Segunda ronda de amplificación con los iniciadores OXF1-ACR3. carriles 1-5 (sub-fracciones
P2a-P2e), carriles 6-9,11 (sub-fracciones P7a-P7e), carriles 12-16 (sub-fracciones P11a-P11e), carril 17:
clon lipolitco, carril 18: B. pumilis, carril 19: control negativo, carril 10: marcador de talla molecular:
100pbladder (Invitrogen), la flecha en el carril 18 indica una banda de ~250pb. Las flechas azules indican
las bandas que fueron purificadas
Los resultados obtenidos en el presente estudio sugieren que la optimización de la
PCR fue adecuada ya que permitió obtener distintos amplicones que podrían
corresponder a regiones de genes de lipasas, sin embargo una mejora en el cultivo de
los clones podría incrementar la eficiencia del tamizaje. Luego de purificar y clonar las
bandas, se seleccionaron los clones positivos (colonias blancas) los cuales se
verificaron amplificando con los iniciadores universales M13F/R. Como se observa en
las figuras 5 y 6. La clonación fue exitosa excepto para un clon que inicialmente había
mostrado fenotipo blanco pero no poseía inserto. Este hecho puede explicarse por el
tiempo de incubación. Algunos autores recomiendan transferir las cajas con los clones
a frío, de esta manera colonias que inicialmente eran blancas se tornan azules, por
consiguiente se evitan los falsos positivos(66).
7.3 Subclonación
Partiendo del hecho de que las sub-fracciones P2d, P7e y P11b mostraron una banda
definida de ~250pb la cual podría corresponder a una fracción de un gen codificador
de lipasas, el ADN de estas fracciones fue extraído y subclonado en el vector
pBluescript SK para construir tres bibliotecas de insertos pequeños y buscar clones
individuales que presenten actividad lipolítica. Luego de la digestión con KpnI y SacI
los fragmentos entre 2-8kb fueron purificados, clonados en pBluescript SK y
transformados en E.coli DH5α. En la figura 7, se muestra la digestión parcial de la subfracción P2d.
19
400pb
200pb
Figura 5. Verificación de insertos clonados en pCR2.1-TOPO. Carriles 1-6,8: clones con inserto de
~425pb (250pb del producto clonado+ 175pb del vector)carril 6: clon sin inserto(falso positivo), carril 9:
control negativo, carril 10: marcador de talla molecular 100pb ladder (BioRad). Las flechas de arriba hacia
abajo indican 400pb y 200pb respectivamente.
400pb
200pb
Figura 6. Verificación de insertos clonados en pGEM T-Easy. Carriles 1,3,4: clones con inserto de ~565pb
(~350pb del producto clonado+ 215pb del vector) carril 2: cloncon inserto de ~815pb (600pb del producto
clonado + 215pb del vector)carril 5: control negativo, carril 6: marcador de talla molecular 100pb
ladder(BioRad). Las flechas de arriba hacia abajo indican 800pb y 600pb respectivamente.
Las tres bibliotecas fueron tamizadas en agar LB+Tributirina 1%(v/v) y luego de la
incubación se seleccionaron tres clones (uno de cada biblioteca) que presentaron el
mayor halo de hidrólisis. Estos clones fueron repicados individualmente y designados
como: ClipF1, ClipF2 y ClipF3.
20
Figura 7. Digestión de ADN de fósmido (P2d). Carril 1: ADN sin digerir, carril 2 y 3: ADN digerido, carril 4:
Marcador de peso molecular1kb ladder (BioRad). La flecha indica la banda de 8Kb. El recuadro muestra
la zona que se purificó
Como se observa en la figura 8 se evidenció actividad lipolítica en los tres clones, sin
embargo todos presentaron crecimiento distinto y morfología atípica, lo cual puede
deberse a características inherentes al inserto(66). Teniendo en cuenta que el sustrato
sobre el que se evidencio la hidrólisis fue tributirina la cual posee 4 átomos de carbono
en principio podría corresponder a una esterasa(4,7,14),sin embargo dado que los
oligonucleótidos empleados para la amplificación fueron diseñados con base al grupo
de las lipasas verdaderas(26) es esperaría que la enzima correspondiera a la familia I.
A
B
C
Figura 8. Clones en agar LB + tributirina 1%(v/v). A: Clon ClipF1, B: ClipF2, C:ClipF3.
Para determinar si la enzima que le confiere actividad lipolítica al clon corresponde a
una esterasa o una lipasa verdadera es necesario realizar ensayos cualitativos
(prueba de ρ_nitrofenil-esteres) y cuantitativos en sustratos lipídicos de diferentes
extensiones de átomos de carbono como caprilato (C8), decanoato (C10), palmitato
(C12) y trioleina (16) entre otros, así mismo es de vital importancia disponer de la
secuencia del gen con el fin de identificar las características propias de las lipasas
como los el pentapéptido GxSxG y la triada catalítica Ser, Asp, His presente en el sitio
activo(3,4), adicionalmente con la secuencia se puede determinar la afiliación
filogenética de la enzima para establecer si se trata de una enzima lipolítica reportada
o corresponde a una nueva.
21
Como se mencionó anteriormente, el suelo de Bosque Alto Andino es un ecosistema
psicrófilo (9-16ºC)(72), por lo que la mayoría de microorganismos que lo habitan
poseen sistemas adaptativos como enzimas que les permiten sobrevivir a bajas
temperatura(60), por lo que numerosas lipasas adaptadas a frio han sido identificadas
en distintos suelos de bajas temperaturas(10,61). De esta manera, y considerando que
el halo de hidrólisis en medio sólido fue observado después de realizar una incubación
a 4ºC, podría intuirse que la actividad lipolítica es conferida por una enzima lipolítica
adaptada a frio, sin embargo para confirmar esto en necesario realizar una
caracterización bioquímica con la enzima purificada, adicionalmente es indispensable
el análisis de la secuencia nucleotídica del gen con el fin de comparar con secuencias
de enzimas lipolíticas adaptadas a frio.
De esta manera en el presente estudio empleando una estrategia basada en
secuencia se tamizó una biblioteca metagenómica en búsqueda de genes
codificadores de lipasas. A partir del análisis por PCR se identificaron regiones de
genes presuntivos de lipasas los cuales luego de ser sublclonados permitieron obtener
clones que mostraron actividad lipolítica en medio sólido, esto sugiere que
efectivamente se trata de una enzima lipolítica lo que confirma la eficiencia de esta
aproximación metagenómica.
8. Conclusiones
8.1 Se establecieron las condiciones de PCR adecuadas para amplificar fracciones de
genes codificadores de lipasas empleando iniciadores degenerados.
8.2 Se tamizó una biblioteca metagenómica de suelo de BAA mediante un tamizaje
basado en secuencia
8.3 Se construyeron tres librerías de insertos pequeños derivadas del tamizaje por
PCR que permitieron recuperar clones individuales con actividad lipolítica.
9 Recomendaciones
9.1 Es necesario optimizar las condiciones de cultivo de los clones para incrementar
la eficiencia del tamizaje
9.2 Se debe disponer de la secuencia de los insertos de los clones con actividad
lipolítica para confirmar que se trate de un gen codificador de lipasa así mismo para
caracterizarlo y determinar su afiliación filogenética
9.3 Es necesario caracterizar bioquímicamente la enzima con el fin de establecer su
potencial uso industrial.
22
10. Referencias
1. Gang L J, Gui K Z, Jun H W, Cloning and biochemical characterization of a novel lipolytic gene from
activated sludge metagenome, and its gene product. Microbial Cell Factories 2010; 9:83
2. Guncheva M,Zhiryakova D. Catalytic properties and potential applications of Bacillus lipases. Journal of
Molecular Catalysis B: Enzymatic 2011; 68,1–21
Kourist R, Brundiek H, Bornscheuer U. Protein engineering and discovery of lipases.European Journal of Lipid
Science and Technology2010; 112, 64–74
3. LI N, Zong M. Lipases from the genus Penicillum: Production, purification, characterization and
applications. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2010; 66, 43-54
4. Gupta R, Gupta N, Rathi P.2004. Bacterial lipases: an overview of production, purification and biochemical
properties. Applied Microbiology and Biotechnology 2004; 64, 763–781
5. Arpigny J, Jaeger K. Bacterial lipolytic enzymes: classification and properties. Biochemical Journal. 1999;
343, 17-183
6. Brajesh Singh. Exploring microbial diversity for biotechnology: the way forward. Trends in Biotechnology
2009; 28(3): 111-119
7. Jaeger K, Eggert T. Lipases for biotechnology. Current Opinion in Biotechnology 2002; 13, 390–397
8. Gaur, R., Gupta, A., Khare SK. Purification and characterization of lipase from solvent tolerant
Pseudomonas aeruginosaPseA. Process Biochemistry. 2008;43 (10): 1040–1046.
9. Gilhamn D, Lehner R. Techniques to measure lipase and esterase activity in vitro. Methods 2005; 36:
139–147
10. Joseph B, Ramteke P, Thomas G. Cold active microbial lipases: Some hot issues and recent
developments. Biotechnology Advances 2008; 26, 457–470
11. Hasan F, Shah A, Hameed A. Industrial applications of microbial lipases. Enzyme and Microbial
Technology 2006; 39, 235–251
12. Yoo H, Simkhada J, Cho S, Park D, Kim S, Soeng C, Yoo J. A novel alkaline lipase from Ralstonia with
potential application in biodiesel production. Bioresource Technology 2011; 102, 6104–6111
13. Hasan F, Shah A, Javed S, Hammed A. Enzymes used in detergents: Lipases. African Journal of
Biotechnology 2010; 9(31): 4836-4844
14. Hasan F, Shah A, Hammed A. Methods for detection and characterization of lipases: A comprehensive
review. Biotechnology Advances 2009; 27, 782–798
15. Treichel H, de Oliveira D, Mazutti M, Di Luccio M, Oliveira V. A Review on Microbial Lipases Production,
Food Bioprocess Technol 2010; 3, 182–196
16. Schmeisser C, Steele H, Streit W. Metagenomics, biotechnology with non-culturable microbes. Applied
Microbiology and Biotechnology 2007; 75, 955–962
17. Amann RI, Ludwig W, Schleifer K. Phylogenetic identifica-tion and in situ detection of individual microbial
cells without cultivation. Microbiology Reviews1995; 59, 143–169.
18. Singh J, Behal A, Singla N, Joshi A, Birbian N, Singh S, Bali V, Batra N. Metagenomics: Concept,
methodology, ecological inference and recent advances. Biotechnol. J 2009; 4, 480–494
19. HikaruSuenaga. Targeted metagenomics: a high-resolution metagenomics approach for specific gene
clusters in complex microbial communities.
Environmental Microbiology 2011doi: 10.1111/j.14622920.2011.02438
20. Simon C & Daniel R. Achievements and new knowledge unraveled by metagenomic approaches Applied
Microbiology and Biotechnology 2009; 85, 265–276
21. Riesenfeld C, Schloss P, Hadelsman J. METAGENOMICS: Genomic Analysis of Microbial Communities.
Annual Review of Genetics 2004; 38, 525–52
22. Gabor EM, Alkema WB, Janssen DB: Quantifying the accessibility of the metagenome by random
expression cloning techniques. Environmental Microbiology 2004; 6, 879-886
23. Taupp M, Mewis K, Hallam S. The art and design of functional metagenómica screens. Current Opinion in
Biotechnology 2011; 22, 1–8
24. Uchiyama T, Miyazaki K. Functional metagenomics for enzyme discovery: challenges to efficient
screening. Current Opinion in Biotechnology 2009; 20, 616–622
25. Kotik Michael. Novel genes retrieved from environmental DNA by polymerase chain reaction: Current
genome-walking techniques for future metagenome applications. Journal of Biotechnology 2009;144,75–82
26. Bell PJ, Sunna A, Gibbs M, Curach N, Nevalainen H, Bergquist P. Prospecting for novel lipase genes
using PCR. Microbiology 2002;148, 2283–2291
27. Terahara T, Yamada K, Kurata S, Yokomaku T, Tsuneda S, Harayama S. Direct cloning and expression of
putative esterase genes from environmental DNA. Enzyme and Microbial Technology 2010; 47, 17–23
28. ChistoserdovaLudmila Recent progress and new challenges in metagenomics for biotechnology
Biotechnology Letters 2010; 32,1351–1359
29. Guazzaroni M, Beloqui A, Goyshin P, Ferrer M. Metagenomics as a new technological tool to gain
scientific knowledge. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2009; 25, 945–954
30. Meyer Q, Burton S, Cowan D. Subtractive hybridization magnetic bead capture: A new technique for the
recovery of full-length ORFs from the metagenomeBiotechnol. J. 2007; 2, 36–40
31. Hrvatin S, Piel J. Rapid isolation of rare clones from highly complex DNA libraries by PCR analysis of liquid
gel pools. Journal of Microbiological Methods 2007;68, 434–436
23
32. Morimoto S, Fujii T.A new approach to retrieve full lengths of functional genes from soil by PCR-DGGE
and metagenome walking. Applied Microbiology and Biotechnology2009; 83,389–396
33. Yamada K, Terahara T, Kurata S, Yokomaku T, Tsuneda S, Harayama S. Retrieval of entire genes from
environmental DNA by inverse PCR with pre-amplification of target genes using primers containing locked
nucleic acids. Environmental Microbiology 2008;10(4):978–987
34. Uchiyama T, Watanabe K. Improved inverse PCR scheme for metagenome walking. Bio Techniques 2006;
41(2):183-188
35. Kim S, Park I, Lee S, Lee Y, Yi Z, Kim C. Ahn S, Choi Y. Discovery of three novel lipase (lipA1, lipA2, and
lipA3) and lipase-specific chaperone (lipB) genes present in Acinetobacter sp. DYL129. Applied Microbiology
and Biotechnology2008; 77,1041–1051
36. Bouaziz A, Horchani H, Salem N B, Gargouri Y, Sayari A, Expression, purification of a novel alkaline
Staphylococcus xylosus lipase acting at high temperature Biochemical Engineering Journal 2011; 54, 93–102
37. Sifour M, Saeed H M, Zaghloul T, Berekaa M, Abdel-Fattah Y. Isolation of Lipase Gene of the
ThermophilicGeobacillusstearothermophilus Strain-5. Biotechnology 2010; 9 (1): 55-60
38.
Nguyena G, Thompson M, Grogan G, Bornscheuera U, Kourista R. Identification of novel esterases for
the synthesis of sterically demanding chiral alcohols by sequence-structure guided genome mining , Journal of
Molecular Catalysis B: Enzymatic 2011; 70, 88–94
39. Cai J, Xie Y, Song B, Wang Y, Zhang Z, Feng Y. Fervidobacteriumchangbaicum Lip1: identification,
cloning, and characterization of the thermophilic lipase as a new member of bacterial lipase family V. Applied
Microbiology and Biotechnology 2011; 89,1463–1473
40. Wang C, Guo R; Yu H, Jia Y. Cloning and Sequence Analysis of a Novel Cold-Adapted Lipase Gene from
Strain lip35 (Pseudomonas sp.). Agricultural Sciences in China 2008; 7(10): 1216-1221
41. Ro H, Hong H, Kho B, Kim S; Chung B. Genome-wide cloning and characterization of microbial esterases.
FEMS Microbiology Letters 2004; 233, 97–105
42. Hardeman F, Sjoling S. Metagenomic approach for the isolation of a novel low-temperature-active lipase
from uncultured bacteria of marine sediment FEMS MicrobiolEcol2007;59,524–534
43. Abdel-Fattah Y, GaballaA.Identification and over-expression of a thermostable lipase from
GeobacillusthermoleovoransToshki in Escherichia coli. Microbiological Research 2008; 163, 13-20
44. Kim H, Jung Y, Choi W, Ryu H, Oh T,Lee J. Sequence-based approach to finding functional lipases from
microbial genome databases. FEMS Microbiology Letters 2004; 235, 349–355
45. Smith Jacques. Microbial diversity and gene mining in Antarctic Dry Valley mineral soils. Tesis de
Doctorado. University of the Western Cape, Bellville. 2006
46. Rose T, Schultz E, Henikoff J, Pietrokovski S, McCallum C, Henikoff S. Consesus-degenerate hybrid
oligonucleotide primers for amplification of distantly related sequences. Nucleic Acid Research 1998;
26(7):1628-1635
47. Acevedo J P, Reyes F, Parra L, Salazar O, Andrews B, Asenjo J. Cloning of complete genes for novel
hydrolytic enzymes from Antarctic sea water bacteria by use of an improved genome walking technique.
Journal of Biotechnology 2008, 133: 277–286
48. Zheng X, Chu X, Zhang W, Wu N, Fan Y. A novel cold-adapted lipase from Acinetobacter sp. XMZ-26:
gene cloning and characterization. Applied Microbiology and Biotechnology2011; 90,971–980
49. Lammle K, Zipper H, Breuer M, Hauer B, Buta C, Brunner H, Rupp S. Identification of novel enzymes with
different hydrolytic activities by metagenome expression cloning. Journal of Biotechnology 2007;127,575–
592
50. Tao W, Lee H, Wu J, Kim N, Lee SW. Isolation and Characterization of a Familiy VII esterase derived from
alluvial Soil metagenómica library. The Journal of Microbiology 2011; 49(2):178-185
51. Yu E, Kwon M, Lee M, Oh J, Choi J, Lee Y, Song B, Hahm D, Song J. solation and characterization of
cold-active family VIII esterases from an arctic soil metagenome. Applied Microbiology and Biotechnology
2011; 90,573–581
52. Kim Y H, Kwon E J; Kim S, Jeong Y, kim J, Yun H D, kim H. Molecular cloning and characterization of a
novel family VIII alkaline esterase from a compost metagenomic library. Biochemical and Biophysical
Research Communications 2010;393, 45–49
53. Jiménez Diego. Búsqueda de genes codificadores de enzimas lipoliticas en una biblioteca metagenómica
de suelo de bosque alto andino. Tesis de Maestría. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá. Colombia. 2010
54. Liu K, Wang J, Bu D, Zhao S, McSweeney C, Yu P, Li D. Isolation and biochemical characterization of two
lipases from a metagenomic library of China Holstein cow rumen. Biochemical and Biophysical Research
Communications 2009;385, 605–611
55. Couto G, Glogauer A, Faoro H, Chubatsu L, Souza E, Pedrosa F. Isolation of a novel lipase from a
metagenómica library derived from mangrove sediment from the south Brazilian coast. Genetics and
Molecular Research 2010;9(1):514-523
56. Park Sy, Shin HJ, Kim GJ. Screening and identification of a novel esterase EstPE from a
metagenomicDNA library. The Journal of Microbiology 2011; 49(1): 7-14
57. Messaoudi A, Belguith H, Gram I, HamidaJ.Classification of EC 3.1.1.3 bacterial true lipases using
phylogenetic analysis. African Journal of Biotechnology 2010; 9(48):8243-8247
58. Liaw R, Cheng M, Wub M, Lee C. Use of metagenomic approaches to isolate lipolytic genes from
activated sludge. Bioresource Technology 2010;101, 8323–8329
24
59. Bayer S, Kunert A, Ballschmiter M, Greiner-Stoeffele T.Indication for a New Lipolytic Enzyme Family:
Isolation and Characterization of Two Esterases from a Metagenomic Library. J MolMicrobiolBiotechnol
2010;18,181–187
60. Casanueva A, Tuffin M, Cary C, Cowan D. Molecular adaptations to psychrophily: the impact of ‘omic’
technologies. Trends in Microbiology 2010;18,374–381
61. Tutino M,Prisco G, Marino F, de Pascale D.Cold-Adapted Esterases and Lipases: From Fundamentals to
Application. Protein & Peptide Letters2009;16, 1172-1180
62. Roux K H. Optimization and troubleshooting in PCR. Genome Res. 1995 4: S185-S194
63. Altshuler Michael. PCR troubleshooting the Essential Guide. PrimeraEdición. Caister Academic Press.
Norfolk, UK 2006
64. Ralser M, Querfurth R, Warnatz H, Lehrach H, Yaspo M L, Krobitsch S. An Efficiente and Economic
Enhancer Mix for PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications 347 (2006) 747–751
65. Nagai M, Yoshida A, Sato N. Additive Effects of bovine serum albumin, dthiothreitol and Glycerol on PCR.
Biochemistry and Molecular Biology International . 1998; 44 (1): 157-163
66. Sambrook J, Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. TerceraEdición. CSHL Press.2001
67. Loffert D, Seip N, Karger S, Kang J. PCR Optimization: Degenerate primers. Qiagen News 1998;2,3-6
68. Linhart C, Shamir R. The degenerate primer design problem: Theory and applications. Journal of
Computational Biology 2005; 12(4): 431-456
69. Jabado O, Palacios G, Kappor V; Hui J, Renwick N, Zhai J, Briese T, Lipkin W. Greene SCPrimer: a rapid
comprehensive tool for designing degenerate primers from multiplesequence alignments. Nucleic Acids
Research 2006; 34(22): 6605–6611
70. Kuo M C, Chou L F, Chang H. Evolution of exceptionally large genes in prokaryotes. Journal of Molecular
Evolution 2008;66(4): 333-349
71. Elsaesser R, Paysan J. Liquid gel amplification of complex plasmid libraries. Bio Techniques 2004;37,200201
72. Weng C, Hooghiemstra H, Duivenvoorden J. Response of pollen diversity to the climate-driven altitudinal
shift of vegetation in the Colombian Andes. Philosophical Transactions of the Royal Society 2007; 362, 253562
25
11. Anexos
Anexo 1. Parámetros evaluados en la optimización de la PCR
PARAMETRO
DMSO (%)
GLICEROL (%)
BETAINA (M)
BSA (mg/ml)
DTT (mM)
BETAINA+DTT+DMSO
DMSO +BSA+DTT
ADN MOLDE (ng)
MgCl2
Oligonucleótidos
Numero de Ciclos (con y
sin reamplifiación)
Condiciones
evaluadas
0.2
0.4
0.8
1.6
3.2
1
2
5
10
0.1
0.2
0.4
0.8
1.6
0.5
1
2
0.2
0.4
0.8
1.6
3.2
1.6M 3.2mM 3.2%
2% 1mg/ml2mM
5
10
20
30
50
75
100
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
25
30
35
40
45
50
Señal positiva de
amplificación
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
+
+
++
++
++
+
x
++
++
++
++
++
++
++
X
X
X
X
X
+
+
++
++
X
X
X
+
++
+
X: Ausencia de Banda, +: presencia de banda, ++: presencia de banda intensa.
26
Anexo 2. Protocolo de clonación con pCR®2.1-TOPO (modificado)
Componente
Producto de PCR
Solución de Sales
Agua milliQ
Vector TOPO®
Volumen final
Volumen (µl)
1.5
0.5
0.5
0.5
3.0
Se homogeniza la mezcla y se incuba por 20 minutos a 22ºC, posteriormente se procede a
realizar la transformación por choque térmico de acuerdo a lo sugerido por el fabricante
Anexo 3.1Preparacion Agar LB + tributirina 1% (v/v)
1. Pesar 40 g de agar LB por cada litro a preparar, disolver en agua destilada y esterilizar
a 121ºC, 15lb, 15 minutos.
2. Adicionar 1ml de tributirina por cada 100ml de medio
3. Adicionar 10µl de Triton X-100 por cada 100ml de medio
4. Homogenizar
5. Sonicar a 70ºC durante 30 minutos homogenizando periodicamente
6. Dejar enfriar, adicional antibiotico si lo requiere y servir
Anexo 3.2Composicion Medio SOC ( medio de inducción despues de la
transformación por choque termico)
Medio SOC (formula /litro)
Triptona 20g
Extracto de Levadura
5g
NaCl0.5g
1. Mezclar hasta disolver por completo los componentes y adicionar10ml de KCl 250mM
2. Ajustar el pH a 7 con NaOH 5N
3. Ajustar el volumen a 1L con agua destilada
4. Esterilizar a 121ºC, 15lb por 15 minutos
5. Dejar que la temperatura del medio baje hasta 60ºC y adicionar 18ml de solución de
glucosa 20% (p/v)
6. Adicionar 5ml de solución de MgCl2 2M
Anexo 4 Marcadores de talla empleados en el estudio
100bp (Invitrogen)
100bp (BioRad)
1Kb (BioRad)
27
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
Anexo 5. Protocolo de Extraccion de ADN Plasmídico según Sambrook 2001.
(modificado)
Inocular 2ml de caldo LB (Luria-Bertani) con el respectivo antibiotico con una
colonia bacteriana
Incubar a 37ºC de 16-18h a 150 rpm
Transferir 1.5ml del cultivo a un tubo de 1.5ml y centrifugar a maxima velocidad
por 1 minuto a 4ºC.
Descartar el sobrenadante y remover el medio restante
Resuspender completamente el pellet en 100µl de solucion de lisis I fria
mediante vortex
Adicionar 200µl de solucion de lisis II fresca. Mezclar cuidadosamente por
inversion 5 veces
Incubar en hielo por 5 minutos
Adicionar 150µl de solucion de lisis III. Mezclar cuidadosamente por inversion
5 veces
Incubar en hielo 3-5 minutos
Centrifugar a maxima velocidad por 5 minutos a 4ºC
Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo
Adicional 4µl de RNAsa (20mg/ml) e incubar por 30 minutos a 37ºC
Adicionar un volumen de fenol:cloroformo: isoamil alcohol (25:24:1), mezclar
vigorosamente y centrifugar a maxima velocidad por 3 minutos a 4ºC
Precipitar adicionando 2 volumenes de etanol absoluto
Dejar precipitando 12h a -20ºC
Centrifugar a maxima velocidad por 5 minutos
Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 500µl de etanol 70%
Centrifugar a maxima velocidad por 5 minutos
Descartar el sobrenadante y dejar los tubos en posicion invertida hasta que
todo el etanol se evapore
Resuspender en 50µl de agua milliQ
Almacenar a -20ºC
Solución de Lisis I
Glucosa 50mM
Tris-Cl (pH 8.0) 25mM
EDTA (pH 8.0) 10mM
Solución de Lisis II
NaOH 0.2N
SDS 0.1% (p/v)
Solución de Lisis III
Acetato de Potasio 5M
Ácido acético glacial
Agua
60.0ml
11.5ml
28.5ml
28