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Selección de Mutantes
Mutaciones y Mutantes
Una mutación es un cambio hereditario en la secuencia de bases del ácido
nucleico genómico de un organismo.
En todas las células, este ácido nucleico es DNA bicatenario.
Una cepa que lleva este tipo de cambio se denomina un mutante.
Por definición, un mutante difiere de su cepa parental en el genotipo, es decir,
en el conjunto de genes del organismo.
Pero, además, las propiedades observables del mutante, su fenotipo, pueden
también estar alteradas en relación con la cepa parental.
Uno se refiere a este fenotipo alterado como fenotipo mutante.
Normalmente, una cepa aislada de la naturaleza se considera una cepa silvestre.
Se pueden obtener mutantes de una cepa silvestre o de una cepa derivada de
ésta, por ejemplo, de otro mutante.
Determinación del genotipo y del fenotipo
Dependiendo de la mutación, un mutante puede o no mostrar un fenotipo
diferente del de su cepa parental.
Por convención, en genética bacteriana, el genotipo de un organismo se designa
por tres letras minúsculas seguidas de una mayúscula (todas en cursiva) que
indican el gen particular implicado.
Por ejemplo, el gen hisC de Escherichia coli codifica para una proteína que se
denomina HisC.
En este caso, esta proteína (una enzima de la ruta biosintética de la histidina)
corresponde a la histidinol-fosfato aminotransferasa, que describe su actividad
enzimática.
Sin embargo, algunas proteínas, como RecA, no tienen otros otros nombres
porque sus funciones enzimáticas son difíciles de describir en pocas palabras.
Las mutaciones en el gen hisC se designan como hisC1, hisC2, y así
sucesivamente, en referencia al orden en que fueron obtenidas las cepas
mutantes.
El fenotipo de un organismo se designa por una letra mayúscula seguida de dos
letras minúsculas con una signo más o menos como superíndice para indicar la
presencia o ausencia de tal propiedad.
Por ejemplo, una cepa His+ de E. coli es capaz de sintetizar su propia histidina,
mientras que un His- no.
Las mutaciones en el gen hisC pueden conducir a un fenotipo His
función del producto del gen.
-
si eliminan la
Aislamiento de mutantes
Virtualmente, cualquier característica de un organismo puede ser cambiada por
mutación.
Sin embargo, algunas mutaciones son seleccionables, confiriendo algún tipo de
ventaja a los organismos que la poseen, mientras que otras son no
seleccionables, incluso aunque causen un cambio claro en el fenotipo de un
organismo.
Un ejemplo de mutación no seleccionable es la pérdida de color de un organismo
pigmentado (Figura 1 b).
Fig 1
Observación de varios tipos de mutantes
(b) Mutantes pigmentados y no pigmentados del hongo Aspergillus nidulans.
El tipo silvestre tiene un pigmento verdoso. Los mutantes blancos o incoloros
no producen pigmento, mientras que los mutantes amarillos no pueden
convertir el pigmento que fabrican al de color normal.
Tales colonias no tienen por lo general ventajas ni desventajas sobre las colonias
pigmentadas cuando crecen en placas de agar (puede haber una ventaja selectiva,
sin embargo, para los organismos pigmentados en la naturaleza).
Podemos detectar tales mutaciones tan sólo examinando un gran número de
colonias y buscando las «diferentes», un proceso denominado rastreo
(screening).
Nótese que el color aparente de una colonia no tiene por qué ser debido a la
producción de un pigmento.
Las colonias mutantes de Halobacterium que carecen de vesículas de gas
transmiten luz de forma diferente a las colonias silvestres y parecen ligeramente
diferentes en las placas (Fig. 1 c).
Fig. 1
c) Colonias de mutantes de una especie de Halobacterium, un miembro de
Archaea. Las colonias que aparecen blancas son del tipo silvestre. Las colonias
naranja / marrones son mutantes que han perdido las vesículas.
Las colonias sectoreadas son el resultado de las actividades mutagénicas de
elementos transponibles.
Los mutantes no seleccionables deben detectarse por rastreo de grandes
poblaciones de organismos, y los fenotipos mutados pueden no ser tan fáciles de
reconocer como la diferencia entre colonias pigmentadas y no pigmentadas.
Por una parte, una mutación seleccionable confiere al mutante una ventaja bajo
ciertas condiciones ambientales, de manera que la progenie del mutante pueda
ser capaz de superar el crecimiento de la cepa parental y reemplazada.
Un ejemplo de mutación seleccionable es la resistencia a una droga: un mutante
resistente a un antibiótico puede crecer en presencia de concentraciones de
antibiótico que inhiben o matan la cepa parental (Fig. 1 a).
Fig. 1
(a) Desarrollo de mutantes resistentes a
antibióticos dentro de la zona de inhibición de
un ensayo de antibiótico por el método de
disco.
Sin embargo, el fenotipo sensible al antibiótico no puede seleccionarse
directamelte eliminando el antibiótico del medio.
Es relativamente fácil detectar y aislar los mutantes seleccionables escogiendo
las condiciones ambientales apropiadas.
Por tanto, la selección es un instrumento genético muy poderoso que permite el
aislamiento de un solo mutante a partir de una población que contiene millones o
incluso miles de millones de organismos parentales.
Aunque el rastreo es siempre más tedioso que la selección, para ciertos tipos de
mutaciones existen métodos que permiten el rastreo de gran número de
colonias.
Por ejemplo, se pueden detectar mutantes nutricionales por la técnica de la
réplica en placa (Fig 2 a).
Fig. 2
(a) Método de la réplica en placa para la detección de mutantes nutricionales
A partir de una placa original, y con el uso de un terciopelo o filtro de papel estéril,
se hace una impresión en otra placa de agar que carezca del nutriente en cuestión.
Las colonias del tipo parental crecerán normalmente, mientras las del mutante no.
Por tanto, la incapacidad de una colonia para crecer en la placa réplica (Fig. 2 b) es
una señal de que es un mutante.
Fig. 2
(b) Mutantes nutricionales detectados por el método de la réplica en placa. La
fotografía de la izquierda muestra la placa original.
Las colonias que no aparecen en la placa replicada están marcadas con una X.
La placa réplica carecía de un nutriente (leucina) que estaba presente en la placa
original. Por tanto, las colonias marcadas con una X son auxotrofos para la
leucina.
La colonia de la placa maestra que corresponda al espacio vacío en la placa
réplica. (Fig. 2 b) puede ser recogida, purificada y caracterizada.
Un mutante nutricional que tenga un requerimiento por un factor de crecimiento
se suele denominar auxotrofo, y la cepa parental de la que deriva se denomina
prototrofo.
Por ejemplo, mutantes de Escherichia coli con fenotipo His- se llaman auxotrofos
para la histidina.
Aunque es de gran utilidad, la réplica en placa es un proceso de rastreo que
puede resultar muy laborioso para el aislamiento de mutantes.
Selección con penicilina
Un método ingenioso y ampliamente usado para aislar auxotrofos es el método de
selección con penicilina.
Por lo general, los mutantes que requieren factores de crecimiento tienen
desventajas competitivas respecto a las células parentales, y no existe un método
directo para aisladas.
Sin embargo, la penicilina mata solamente a las células que están creciendo, y si
se añade a una población que está creciendo en un medio que carece del factor de
crecimiento requerido por el mutante deseado, morirán las células parentales sin
que resulten afectadas las células del mutante que no crecen.
Así, tras una incubación preliminar en ausencia del factor de crecimiento en un
medio con penicilina, la población se lava para eliminar el antibiótico y se
transfiere a placas con el factor de crecimiento.
Entre las colonias que crecen (incluyendo algunas células silvestres que han
escapado a los efectos de la penicilina) deben encontrarse algunos mutantes
para ese factor de crecimiento.
La selección con penicilina es un tipo de selección negativa; la selección no
favorece al mutante sino que perjudica al tipo parental o silvestre.
En la Tabla 1, se indican los tipos de mutantes más comunes y los métodos para
detectados.
Tabla 1
Tipos de Mutantes
LA CONSERVACIÓN DE CEPAS MICROBIANAS
Los tres objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas
microbianas en los laboratorios de microbiología son: que el cultivo a conservar
sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de
conservación; que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 7080% de las células, y por último, que estas células permanezcan genéticamente
estables.
Los dos primeros objetivos no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce
bien la técnica microbiológica, pero el tercero puede presentar dificultades, y
este es el motivo por el cual existen varios métodos de conservación para los
microorganismos, y ninguno de ellos es de utilización general.
Vamos a resumir estos métodos agrupándolos en tres apartados, que son:
Métodos de elección o de conservación a largo plazo, métodos alternativos y
métodos restringidos.
Métodos de elección o de conservación a largo plazo.
Son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las células
microbianas, pero éstas no han muerto.
Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por evitarse la aparición de
generaciones sucesivas.
Aún así no se puede descartar algún cambio originado por el método
preparatorio en si mismo.
Los métodos de conservación pertenecientes a este grupo son dos: congelación y
liofilización.
Conservación por congelación.
Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y
se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el
agua se congela.
De esta forma, al no disponer las células de agua en forma líquida, no hay
crecimiento.
Cuando se quiere trabajar con las células así conservadas, se recuperan subiendo
la temperatura.
Este es el mejor método de conservación desde todos los puntos de vista, pero
tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales, y además existe el
peligro de que algún fallo del sistema produzca una subida no deseada de la
temperatura durante el almacenamiento.
También resulta ser el método más molesto para realizar el envío de las cepas.
Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células
conservadas por este método son los siguientes:
1.
Edad de las células: En la mayoría de los casos conviene utilizar
células maduras del inicio de la fase estacionaria de la curva de
crecimiento, pero cuando se trate de organismos que presenten en su
ciclo vital algún estado que les prepare para la resistencia a
condiciones adversas, es preferible alcanzar este estado.
Esto sucede en el caso de microorganismos que esporulan, en algunos
pleomórficos e incluso en algunos más sencillos.
2. Velocidad en la congelación y descongelación: Aunque hay programas de
congelación bien estandarizados para determinados casos o circunstancias, en
general es mejor que las variaciones de la temperatura sean rápidas, tanto para
la congelación como para la descongelación, por lo que para descongelar
conviene poner las células a 37ºC.
3. Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo más baja posible. Lo mejor
es guardar tubos cerrados o sellados, que contengan las células microbianas,
sumergidos en nitrógeno líquido, que tiene una temperatura de –195ºC, o bien en
la fase gaseosa del nitrógeno líquido, con una temperatura de –140ºC.
En el mercado existen variados tipos de armarios congeladores, de los cuales los
más aconsejables son los que alcanzan temperaturas por debajo de –70ºC.
Aquellos que sólo alcanzan temperaturas entre –20ºC y –40ºC, como ocurre con la
mayoría, no son aconsejables, entre otras cosas porque debido a la gran
concentración de solutos que existen en la suspensión celular, su punto de
congelación baja.
El daño que se produce en las células es debido a que a estas temperaturas hay
frecuentes congelaciones y descongelaciones.
Si se añade un crioprotector no iónico, como por ejemplo el glicerol, se reduce la
cantidad de hielo que se produce y se evita el aumento de la concentración iónica.
Para la conservación en armarios congeladores, las células se almacenan en
criotubos (tubos de plástico esterilizables resistentes a la congelación que cierran
herméticamente), preparando lotes de varios tubos para cada cepa a conservar y
utilizando en su totalidad un tubo para cada ocasión.
De esta manera se evita que las cepas se congelen y se descongelen varias veces.
Esto también se puede evitar empleando tubos con criobolas (bolas de tipo
abalorio que se impregnan con la solución celular a congelar), ya que para tomar
una muestra basta con emplear una o varias bolitas sin necesidad de
descongelar el resto.
Este método no se debe emplear para la conservación de microorganismos
anaerobios, como por ejemplo el género bacteriano Clostridium, ya que al estar
las células en una superficie hay un mayor contacto con el oxígeno y puede
afectarse la viabilidad.
Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del daño que
se pueda producir en las células microbianas en el momento de la congelación.
Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores, pero el
que se utiliza con más frecuencia es el glicerol, a una concentración del 15 al
20%.
También se pueden utilizar el dimetilsulfóxido, la leche descremada y
carbohidratos como glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, etc. En su elección
influye el tipo de microorganismo que se quiera conservar.
Conservación por liofilización
Tampoco se da crecimiento en las células conservadas por este método, puesto
que se les ha quitado el agua mediante la liofilización, que es un proceso
suave.
Con ello la estabilidad genética es alta, pero a veces no tanto como en la
congelación, porque la liofilización se consigue por sublimación del hielo de las
células.
Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las células y después
eliminarla mediante el vacío, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo
que acabaría afectando a la viabilidad del microorganismo.
Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores, de los que
hay muchos modelos en el mercado.
Las células microbianas así conservadas se someten a un tratamiento más
complejo que en el caso de la congelación, pues la liofilización se hace en dos
etapas y se añade la sublimación del agua a la congelación previa.
Sin embargo, este es un método muy recomendable por su comodidad para el
almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una vez conseguidos los
liófilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18ºC-20ºC), con lo cual su
envío es muy cómodo.
Los factores que hay que tener en cuenta para hacer una buena liofilización son
lógicamente los mismos que influyen en la congelación, a los que habrá que
añadir otros que surgen como consecuencia de la deshidratación.
Sin embargo, antes de pasar a explicar éstos, tenemos que hacer unas breves
consideraciones sobre los que antes hemos mencionado para el caso de la
congelación.
La congelación puede hacerse rápida o lentamente, la primera sumergiendo los
tubos en nitrógeno líquido.
Respecto a los crioprotectores, ya vimos que se pueden utilizar varios
dependiendo del tipo de microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar
glicerol, debido a su elevado punto de evaporación y a su higroscopicidad, que
provoca que los liófilos queden muy viscosos.
Tampoco es conveniente utilizar el dimetilsulfóxido, porque es algo tóxico, y al
concentrarse por la evaporación del agua puede dañar a las células microbianas.
Por lo tanto, para la liofilización se recomiendan como crioprotectores el inositol
para la mayoría de las bacterias y la leche descremada para hongos y
actinomicetos, pero para algunos microorganismos pueden ser más convenientes
otros crioprotectores, como por ejemplo el glutámico-glutamato para las
bacterias lácticas, mezclas de glucosa con caldo hígado o chopped meat (sin
carne) para bacterias anaerobias, etc.
Los nuevos factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofilización
como medio de conservación son:
1.
Tipo de microorganismo. Hay algunos microbios que no resisten la
liofilización y lógicamente serán aquellos que contengan más agua en su
interior.
Algunos hongos filamentosos, especialmente los no esporulados, no se pueden
guardar liofilizados y hay que recurrir a otros métodos.
2. Concentración celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una
concentración del orden de 108-109 células/ml en el caso de las bacterias y
algo inferior en el caso de hongos filamentosos y levaduras.
3. Temperatura durante la sublimación. Debe ser lo más baja posible, sin
subir por encima de –50ºC.
4. Grado de deshidratación alcanzado. Debe ser lo más alto posible, aunque
la concentración de solutos puede conllevar una pequeña cantidad de agua
remanente que no es perjudicial.
5. Atmósfera de oxígeno en el tubo. Las células liofilizadas se guardan en
tubos cerrados al vacío para evitar, tanto la rehidratación como la presencia de
algún gas dentro del tubo, como el oxígeno que puede dañar a las células.
6. Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante,
preferentemente a 18ºC y sin bajar de los 0ºC. Los liófilos se deben guardar
en la oscuridad.
Métodos alternativos
Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección,
bien por carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana
no resiste los tratamientos de la conservación por estos métodos.
Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo,
sino que se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de
estos métodos.
Conservación por transferencia periódica
La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo
en el que ha crecido.
Sin embargo, estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo
tubo, porque al seguir activas excretan productos tóxicos del metabolismo
que se acumulan, provocando el envejecimiento y muerte celulares, por lo
que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco.
Este es el peor método para conseguir la estabilidad genética, puesto que al
estar las células creciendo hay una alternancia de generaciones, y al cabo del
tiempo las células que se están guardando serán descendientes lejanas de las
células iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus características.
Si se va a utilizar este método es aconsejable retardar el envejecimiento y alargar
los periodos entre dos resiembras.
Esto se puede conseguir de varias maneras como por ejemplo:
• disminuyendo la cantidad de inóculo;
• rebajando la proporción de algunos nutrientes en el medio de cultivo;
• inoculando en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos, ya
que el crecimiento en presencia de oxígeno es más rápido y origina productos
generalmente tóxicos;
•y almacenando los cultivos a 4ºC-8ºC.
A veces también se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral
estéril. Con esto se consigue también evitar en la medida de lo posible la
desecación del medio de cultivo, que podría ser tóxico para las células al
aumentar su concentración.
Hay que tener en cuenta que los microorganismos muy aerobios, como por
ejemplo los hongos filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente
cerrados.
Por último, otro inconveniente que tiene la transferencia periódica es que la
contaminación de los cultivos resulta más fácil al tener que manejar los tubos a lo
largo del tiempo y también por la posibilidad de entrada de ácaros en los mismos.
Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar
estéril
Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en
diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras
y algunas bacterias.
Consiste en suspender en agua estéril unas cuantas células del cultivo que se
quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos de los anteriormente
mencionados.
En este caso la concentración celular no debe ser superior a 104-105 células/ml en
el caso de bacterias y levaduras.
Para los hongos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensión
trocitos de agar con el crecimiento del hongo.
En el caso de microorganismos marinos, la suspensión se hace en agua de mar
diluida.
Los resultados obtenidos por la CECT en la conservación de microorganismos por
este método muestran altos porcentajes de viabilidad en periodos a veces
superiores a 5 años.
La estabilidad para caracteres morfológicos y fisiológicos es buena, pero no se ha
comprobado para caracteres específicos como la virulencia, el poder
fermentativo, etc.
Métodos restringidos
En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que
es necesario recurrir a la hora de conservar grupos de microorganismos muy
determinados que no resisten bien la liofilización o la congelación, como por
ejemplo los géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc.
Los cuatro métodos que vamos a citar se basan en la paralización del crecimiento
por eliminación del agua disponible para las células.
Desecación en papel de filtro
Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann nº 3) que se impregna con
una solución muy densa de células y se deja secar al aire (en condiciones
estériles).
También es posible desecarlos por el procedimiento que se llama desecación
líquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya
habido congelación previa de las células.
El vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar que un
vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la
temperatura
disminuya demasiado, ocasionando la congelación incontrolada de las células.
Desecación en suelo, arena, silicagel, etc.
Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los
microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante bastante
tiempo por este método.
Desecación en bolitas de alginato
Éste es un procedimiento bastante eficaz. Las células se encuentran en una
matriz de alginato y la eliminación del agua se hace por tratamiento con
soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta que se
pierde un 70% de su contenido en agua.
Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados herméticamente
y a temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a –80ºC
debido al bajo contenido en agua de las células y la protección que suministra el
soporte de alginato.
Este es un método que se está utilizando incluso para la conservación de algas y
células vegetales.
Desecación en sal gorda para halobacterias
Para su conservación por este método se mezclan las células con sal y se dejan
desecar espontáneamente. Debido a la higroscopicidad de la sal, la desecación
no es total, pero las células dejan de multiplicarse por ser insuficiente el nivel de
agua disponible.
Por último, y a modo de resumen, unas consideraciones finales.
Cualquiera que haya sido el método empleado en la conservación de las cepas
microbianas, cuando éstas se recuperan para hacer nuevos lotes para su
conservación o para trabajar con ellas, se recomienda no utilizar directamente
las células que se han estado guardando, porque éstas vienen de una situación
de stress más o menos fuerte (sobre todo cuando se han conservado por
liofilización) y por lo tanto no son adecuadas para ningún tipo de prueba.
Primero habría que revitalizarlas o rejuvenecerlas sembrándolas en un medio no
selectivo, es decir, un medio que asegure lo más posible el crecimiento, y a partir
de este primer crecimiento ya se puede trabajar con ellas, cultivándolas en
medios selectivos cuando sea necesario.
Igualmente hemos de tener presente que, dada la enorme diversidad
microbiana, cada microorganismo soportará determinados métodos de
conservación mejor que otros, o será necesario tomar precauciones especiales en
su conservación.
Como ya dijimos al comienzo, no existe un método general de conservación de
los microorganismos, aunque no resulta difícil determinar el más aconsejable en
cada caso.
La mayoría de microorganismos de interés sanitario pueden conservarse a largo
plazo con los métodos generales de congelación y/o liofilización, y para periodos
cortos pueden mantenerse vivos por alguno de los métodos alternativos si se hace
en las condiciones adecuadas y bien controlados por un microbiólogo.
CRIOCONCENTRACION Y LIOFILIZACION
La Liofilización es un proceso de secado mediante sublimación que se ha
desarrollado con el fin de reducir las pérdidas de los compuestos responsables del
sabor y el aroma en los alimentos, los cuales se afectan en gran medida durante
los procesos convencionales de secado.
La liofilización involucra varias etapas:
• Congelación (y acondicionamiento en algunos casos) a bajas temperaturas
• Secado por sublimación del hielo (o del solvente congelado) del producto
congelado, generalmente a muy baja presión
• Almacenamiento del producto seco en condiciones controladas.
Generalmente, al liofilizar adecuadamente un material se puede almacenar por
períodos muy largos con reducciones muy bajas de sus características
organolépticas, físicas, químicas y biológicas.
La congelación del material
Cada producto debe congelarse de una manera tal que garantice que sufrirá
pocas alteraciones en el proceso posterior de sublimación. Se debe conocer con
precisión:
• La temperatura en la que ocurre la máxima solidificación
• La velocidad óptima de enfriamiento
• La temperatura mínima de fusión incipiente
Se busca que el producto ya congelado tenga una estructura sólida sin intersticios
en los que haya líquido concentrado para propiciar que todo el secado ocurra por
sublimación.
En los alimentos se pueden obtener distintas mezclas de estructuras luego de la
congelación que incluyen cristales de hielo, eutécticos, mezclas de eutécticos y
zonas vítreas amorfas.
Estas últimas son propiciadas por la presencia de azúcares, alcoholes, cetonas,
aldehídos y ácidos, así mismo como por las altas concentraciones de sólidos en el
producto inicial.
El secado por sublimación
El proceso de secado como tal puede ocurrir o no a bajas presiones pero en tales
condiciones es mucho mas eficiente el proceso difusivo.
El paso de hielo a vapor requiere gran cantidad de energía que suministrada en
alto vacío pues la interfase de secado se mueve hacia el interior de la muestra y
el calor tiene que atravesar capas congeladas (sistemas liofilizados en bandeja,
sin granular) o secas (en granulados), generándose un considerable riesgo de
fusión del material intersticial o quemar la superficie del producto que ya está
seco.
Cuando se realiza el secado mediante la liofilización se distinguen tres fases o
etapas que se esquematizan en la figura 11.5.
Cuando en el proceso de liofilización se comienza el calentamiento empieza a
formarse un frente de sublimación o interfase entre la capa seca y la capa
congelada de la muestra el cual avanza progresivamente, y para un determinado
instante, a una temperatura de interfase (TS) le corresponde una determinada
Presión de saturación (Pi).
La transferencia de masa ocurre por la migración de vapores a través de la capa
seca de la muestra bajo la acción de una diferencia de presión, esta transferencia
es alta cuando la diferencia de presión es grande.
Las tres fases que se distinguen son:
Fase 1: Llamada etapa conductiva
Inicialmente, por el calentamiento de la muestra, la velocidad de sublimación
crece rápidamente hasta llegar a un máximo.
El tiempo para agotar esta fase es relativamente corto; en ella se lleva a cabo la
mayor parte de remoción de agua del producto (entre un 75-90%), siendo el
mecanismo preponderante la transferencia de calor por conducción.
Fase 2: Primera etapa difusiva.
Muestra un descenso importante de la velocidad de sublimación debido a la
formación de una capa porosa de material seco que opone resistencia creciente al
flujo de calor y al vapor a medida que procede el secado.
Fase 3: Segunda etapa difusiva
La velocidad de sublimación continúa decreciendo de forma que se aproxima a
cero. Esto debido a que el calor necesario para retirar el agua ligada es mas alto
que el calor de sublimación.
Puesto que la difusividad de los aromas disminuye sensiblemente cuando la
humedad es pequeña es posible en esta etapa incrementar la temperatura de
calefacción y del producto hasta valores del orden de 50ºC, dependiendo del
material que se trate.
La curva de velocidad de sublimación de la figura 11.5, indica solo la transferencia
de masa.
Como en todo proceso de secado, coexisten los fenómenos de transferencia de
masa y calor, la curva de transferencia de calor en función del tiempo se obtiene
multiplicando la cantidad de agua sublimada por su correspondiente calor de
sublimación o desorción.
q=G(t) * HS
En la transferencia de calor y masa se combinan la acción de la temperatura y los
gradientes de presión como fuerzas impulsoras, que deben vencer las resistencias
puestas por el espesor de la muestra y sus características físicas.
El espesor es importante: mientras este es más delgado hay menor resistencia
para que el flujo de calor y masa pase a través de la muestra.
La transferencia de calor se hace por conducción - convección gaseosa y
radiación (o una combinación de ambos mecanismos) siendo esta última la
preponderante cuando se opera a muy baja presión.
Almacenamiento
Los productos liofilizados y adecuadamente empacados, pueden ser guardados
por largos periodos de tiempo ya que en buena medida retienen las propiedades
físicas, químicas, biológicas y organolépticas de sus estados frescos.
La liofilización, reduce las pérdidas de calidad debidas al deterioro por
reacciones químicas, causado por degradación enzimática y no enzimática.
Sin embargo, la oxidación de lípidos, inducida por los bajos niveles de humedad
a los que lleva el producto durante el secado, es un problema a considerar para
los productos liofilizados.
Las reacciones de oxidación de lípidos se controlan, empacando los productos
liofilizados en recipientes impermeables al oxígeno.
La degradación no enzimática es evitada por la rápida transición de alto a bajo
contenido de humedad.
El uso de rangos bajos de temperatura también evita la desnaturalización de
proteínas en los productos liofilizados.
Los productos liofilizados pueden ser reconstituidos a su forma y estructura
original por la adición de líquidos.
La mayor desventaja del proceso de liofilización es el costo de energía y el tiempo
empleado en el proceso de secado.
Nitrógeno
Es un gas totalmente inerte que lleva a cabo un efecto básico de eliminación del
oxígeno presente, con lo que imposibilita el crecimiento de los microorganismos
aerobios presentes en el medio, no así el de los llamados anaerobios.
Conservación de cepas de interés industrial
Conservación de los microorganismos importantes
La conservación de microorganismos de interés industrial es una técnica básica en
todo el proceso.
La conservación ha de estar encaminada al mantenimiento de las cepas altamente
productivas durante largos períodos de tiempo sin que se produzcan cambios
fenotípicos, especialmente en las características relacionadas con la producción
de los metabolitos secundarios de interés.
Se han desarrollado varias técnicas de conservación:
(1) el subcultivo de células activas
(2) la desecación de cultivos
(3) la liofilización
(4) la congelación mecánica (-20 ó -80ºC) y
(5) la ultracongelación en vapor de nitrógeno líquido (-156ºC) o en nitrógeno
líquido (-196ºC).
Generalmente, las tasas de supervivencia son más elevadas después de la
conservación en nitrógeno líquido que tras cualquiera de los otros métodos. En los
casos de conservación por congelación, es necesario añadir a los cultivos agentes
crioprotectores (glicerol, Di-Metil-Sulfóxido, DMSO).
Subcultivo de células activas. Métodos de disgregación de células en
placa
La disociación tisular y el subcultivo celular representan dos aplicaciones en las
que es necesario separar las células entre sí y de un sustrato manteniendo la
viabilidad celular.
Para conseguirlo es necesario romper la malla de proteínas que forman la matriz
extracelular que las mantiene unidas mediante procesos que separen las
moléculas proteicas de la matriz extracelular (por ej. secuestrando los iones calcio
que permiten la unión), o bien rompiendo proteolíticamente (mediante la acción
de proteasas) las mismas proteínas.
Generalmente los métodos empleados se pueden clasificar en tres categorias :
Mecánicos (por ejemplo cortar, picar, cribar, rascar, etc..).
En cultivos celulares se emplean con frecuencia los métodos de rascado
('scarpping') de la placa para arrancar las células adheridas.
Químicos. Generalmente se trata de la adición de soluciones en las que no hay
iones divalentes o bien de agentes quelantes de estos iones.
En cualquier caso se reduce la concentraciones de los iones que estabilizan las
uniones de las proteínas de la matriz extracelular y de éstas con los receptores
celulares.
Enzimáticos. Tratamiento del tejido o del cultivo celular con soluciones de
proteasas activas (colagenasa, dispasa, tripsina, elastasa, papaína, pronasa,
hialuronidasa, etc...)
Sin embargo en la práctica se suelen emplear técnicas que combinan dos o tres
métodos.
La elección de uno u otro procedimiento dependerá fundamentalmente de la
naturaleza y cantidad de tejido o cultivo disponible y del uso previsto de las
células obtenidas.
En la tabla (adaptada de Tabla 10.4 de Freshney "Culture of Animal Cells : a
manual of basic technique", 1989, Alan R. Liss, pp. 129) encontrarás una
clasificación de métodos de disgregación celular clasificados según una severidad
creciente.
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