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BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Capítulo 18. Técnicas en biología celular y molecular
Capítulo 18
Técnicas en biología celular y
molecular
18.1
18.2
18.3
18.4
18.5
18.6
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18.7
18.8
18.9
18.10
18.11
18.12
18.13
18.14
18.15
18.16
18.17
18.18
El microscopio óptico
Microscopia electrónica de transmisión
Microscopia electrónica de barrido y microscopia de fuerza atómica
Uso de radioisótopos
Cultivo celular
Fraccionamiento del contenido de una célula mediante centrifugación
diferencial
Aislamiento, purificación y fraccionamiento de proteínas
Identificación de la estructura de proteínas y complejos
multisubunitarios
Fraccionamiento de ácidos nucleicos
Hibridación de ácido nucleico
Síntesis química de DNA
Tecnología de DNA recombinante
Amplificación enzimática de DNA por PCR
Secuenciación de DNA
Genotecas de DNA
Transferencia de DNA a células eucariotas y embriones
de mamífero
Determinación de la función de los genes eucariotas
por eliminación o desactivación (silenciamiento)
génica
Uso de anticuerpos
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Capítulo 18. Técnicas en biología celular y molecular
Figura 18.1 Diagrama de un corte a través de un microscopio óptico compuesto, es decir, un
microscopio que tiene lentes tanto de objetivo como oculares.
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Capítulo 18. Técnicas en biología celular y molecular
Figura 18.2 Trayectos que siguen los
rayos de luz que forman la imagen de
la muestra y los que forman la luz de
fondo del campo. Los rayos de luz de la
muestra se enfocan en la retina,
mientras que los rayos del fondo están
fuera de foco, con lo que se produce un
campo brillante difuso. Como se
explica en el texto, el poder de
resolución de una lente del objetivo es
proporcional al seno del ángulo α. Las
lentes con mayor poder de resolución
tienen longitudes focales más cortas, lo
que significa que la muestra se sitúa
más cerca de la lente del objetivo
cuando se enfoca.
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Figura 18.3 Magnificación contra resolución. La transición de (a) a (b) proporciona al
observador una mayor magnificación y resolución, mientras que la transición de (b) a (c) sólo
produce una mayor magnificación (magnificación vacía). De hecho la calidad de la imagen se
deteriora conforme la magnificación vacía aumenta.
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Figura 18.4 El poder de resolución del ojo. Ilustración de la relación entre la estimulación de
los fotorreceptores individuales (izquierda) y la imagen que se percibiría (derecha). El diagrama
ilustra el valor de que la imagen caiga en un área lo bastante grande de la retina.
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Figura 18.5 La tinción de Feulgen. Este procedimiento de tinción es específico para el DNA,
como lo indica la localización del pigmento en los cromosomas en esta célula de la punta de la
raíz de cebolla que estaba en la metafase de la mitosis al momento que se fijó. (Por Ed Reschke.)
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Figura 18.6 Comparación de células vistas
con diferentes tipos de microscopios
ópticos. Micrografías ópticas de un protista
ciliado tal como se observa en un campo
brillante (a), con contraste de fase (b) y con
óptica de contraste por interferencia
diferencial (DIC) (o de Nomarski) (c). El
organismo apenas es visible con la
iluminación de campo brillante, pero se ve
con claridad en la microscopia con contraste
de fase y con DIC. (Micrografías por M.I. Walker/
Photo Researchers, Inc.)
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Figura 18.7 Uso de variantes de GFP para seguir las interacciones dinámicas entre neuronas y sus células
blanco in vivo. (a) Porción de cerebro de un ratón con dos neuronas fluorescentes de colores diferentes.
Los ratones se obtienen mediante el apareamiento de animales transgénicos cuyas neuronas se marcan
con una u otra proteína fluorescente. (b) Micrografía con fluorescencia de porciones de dos neuronas, una
marcada con YFP y otra marcada con CFP. Las flechas indican dos uniones neuromusculares distintas en
dos fibras musculares diferentes en las que la rama axonal marcada con YFP venció a la rama marcada con
CFP. La tercera unión está inervada con el axón marcado con CFP en ausencia de competencia. (a: Cortesía de
N. Kasthuri y J. W. Lichtman, Washington University School of Medicine; b: reimpresa con autorización de Narayanan Kasthrui y Jeff W.
Lichtman, Nature 424:429, 2003, fig. 4a.Reimpresa con autorización de Macmillan Publishers Ltd.)
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Figura 18.8 Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). Este esquema muestra un ejemplo del
uso de la tecnología FRET para seguir el cambio en la conformación de una proteína (PKG) después de la unión con
cGMP. Las dos proteínas pequeñas fluorescentes con forma de barril [CFP intensificada (ECFP) y YFP intensificada
(EYFP)], se muestran en su color fluorescente. En ausencia de cGMP, la excitación de ECFP con luz de 440 nm produjo la
emisión de luz de 480 nm de la proteína fluorescente. Después de la unión con cGMP, un cambio en la conformación
en PKG aproxima lo suficiente las dos proteínas fluorescentes para que la FRET ocurra. Como resultado, la excitación
del donador de ECFP con luz de 440 nm produce la transferencia de energía al receptor de EYFP y la emisión de luz de
535 nm del receptor. Las versiones intensificadas de estas proteínas tienen mayor intensidad de fluorescencia y tienden
a ser más estables que las moléculas proteínicas originales. (Tomada de Moritoshi Sato y Yoshio Umezawa, Analytical
Chemistry 72:5924, 2000. © 2000 American Chemical Society.)
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Figura 18.9 Microscopia de fluorescencia
confocal con exploración láser. (a) Los trayectos
de la luz en un microscopio de fluorescencia
confocal. La luz de longitud de onda corta (azul)
proviene de una fuente láser, pasa por una
abertura diminuta y se refleja en un espejo
dicroico (un tipo de espejo que refleja ciertas
longitudes de onda y transmite otras) hacia una
lente del objetivo y se enfoca en una mancha en
el plano de la muestra. Los fluorocromos de la
muestra absorben la luz incidente y emiten luz
de mayor longitud de onda, la cual puede pasar
por el espejo dicroico y enfocarse en un plano
que contiene una abertura puntual. Luego, la luz
pasa a un tubo fotomultiplicador que amplifica la
señal y la transmite a una computadora, la cual
forma una imagen procesada digitalizada.
Cualquier rayo de luz emitido por arriba o debajo
del plano óptico de la muestra no pasa por la
abertura diminuta, por lo que no contribuye a la
formación de la imagen. Este diagrama muestra
la iluminación de un solo punto en la muestra.
Distintos sitios de la muestra se iluminan
mediante un proceso de barrido con láser. El
diámetro de la abertura puntual es ajustable.
Mientras menor sea la abertura, es más delgado
el corte óptico y mayor la resolución, pero la
señal es menos intensa.
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Figura 18.9 Microscopia de fluorescencia confocal con exploración láser. (Continuación) (b)
Micrografías con fluorescencia confocal de tres cortes ópticos separados, cada uno de 0.3 μm
de grosor, de un núcleo de levadura teñido con dos anticuerpos con marca fluorescente
distinta. El anticuerpo fluorescente rojo tiñó el DNA dentro del núcleo y el anticuerpo
fluorescente verde tiñó una proteína de unión con el telómero que se localiza en la periferia del
núcleo. (a: tomada de Thierry Laroche y Susan M. Gasser, Cell 75:543, 1993, Cell por Cell Press.
Reimpresa con autorización de Cell Press en el formato de reproducción como libro de texto,
vía copyright Clearance Center.)
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Figura 18.10 Superación del límite de resolución del microscopio óptico. (a) Micrografía de fluorescencia
convencional de una porción de una célula cultivada de mamífero con microtúbulos marcados en verde y las vesículas
cubiertas con clatrina en rojo. Con este nivel de magnificación, la imagen se ve difusa. Además, la superposición entre
las dos marcas fluorescentes produce un color naranja, que sugiere que ambas estructuras están interconectadas. (b)
Micrografía STORM de “súper resolución” de un campo similar que muestra los microtúbulos y las vesículas cubiertas
con clatrina con buena resolución y separados entre sí. (c) Vista magnificada de una porción de la imagen b. (Los
comentarios de esta técnica de súper resolución y otras más se localizan en Nature 459:638, 2009; Ann, Rev. Biochem.
78:993, 2009; Cell 143:1047, 2010; J. Cell Biol. 190:165, 2010; y J. Cell Sci. 124: 1607, 2011.) (Tomada de Mark Bates et
al., cortesía de Xiaowei Zhuang, Science 317:1752, 2007; © 2007. Reimpresa con autorización de AAAS.)
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Capítulo 18. Técnicas en biología celular y molecular
Figura 18.11 Comparación entre la información obtenida en las imágenes tomadas con un
microscopio óptico y uno electrónico con una magnificación comparable de 4 500 veces el tamaño
real. (a) Fotografía del tejido muscular esquelético que se impregnó en plástico, se cortó a 1 μm y se
fotografió con un microscopio óptico con una lente del objetivo para aceite de inmersión. (b) Corte
adyacente al empleado para la parte a que se cortó a 0.025 μm y se examinó al microscopio electrónico
con una magnificación comparable a la imagen en a. La imagen resultante presenta un aumento de dos
a uno en la resolución. Nótese la diferencia en los detalles de las miofibrillas musculares, las
mitocondrias y el eritrocito contenido en el capilar. Mientras que el microscopio óptico no puede
proporcionar ninguna información adicional a la de a, es posible que el microscopio electrónico brinde
mucha más información; por ejemplo, puede producir imágenes de la estructura de membranas
individuales dentro de una pequeña porción de una de las mitocondrias (como en la fig. 5.22). (Cortesía
de Douglas E. Kelly y M. A. Cahill.)
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Figura 18.12 Comparación del sistema de lentes de un microscopio óptico y uno electrónico.
(Reimpresa con autorización de Alan W. Agar, Principles and Practice of Electron Microscope Operation, Elsevier/NorthHolland, 1974. Con autorización de Elsevier Ltd.)
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Figura 18.13 Preparación de una muestra para observación en el microscopio electrónico.
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Figura 18.14 Ejemplos de muestras con tinción negativa y sombras metálicas. Micrografía
electrónica de un virus cascabel de tabaco después de la tinción negativa con fosfotungstato de
potasio (a) o proyección de sombra con cromo (b). (Cortesía de M. K. Corbett.)
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Figura 18.15 Procedimiento utilizado para la proyección de sombras por medio de contraste
en el microscopio electrónico. A menudo este procedimiento se emplea para visualizar
partículas pequeñas, como los virus que se muestran en la figura previa. Con frecuencia las
moléculas de DNA y RNA se hacen visibles por una modificación de este procedimiento que se
conoce como formación de sombras rotatorias, en el que el metal se evapora en un ángulo muy
bajo mientras se gira la muestra.
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Figura 18.16 Procedimiento para la
formación de réplicas por criofractura como
se describe en el texto. El procedimiento de
congelación y grabado es un paso opcional
en el que una capa delgada de hielo que
cubre la muestra se evapora para revelar
información adicional de la estructura de la
superficie de la muestra fracturada.
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Figura 18.17 Réplica de una célula de raíz de cebolla por criofratura que muestra la envoltura
nuclear (N.E.) con sus poros nucleares (N.P.), el aparato de Golgi (G), una vacuola citoplásmica
(V) y la pared celular (C.W.). (Cortesía de Daniel Branton, Harvard University.)
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Figura 18.18 Grabado profundo.
Micrografía electrónica de axonemas
ciliares del protozoario Tetrahymena.
Los axonemas se fijaron, congelaron y
fracturaron, el agua congelada de la
superficie del bloque fracturado se
evaporó, lo que dejó una porción de
los axonemas en relieve, tal como se
visualiza en esta réplica metálica. La
flecha indica una hilera distintiva de
brazos de dineína. (Tomada de Ursula W.
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Goodenough y John E. Heuser, J. Cell Biol.
95:800, 1982, fig. 3, fotografía de la derecha.
Reimpresa con autorización de the Rockefeller
University Press.)
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Figura 18.19 Microscopia electrónica de barrido. Micrografías electrónicas de barrido de (a)
un bacteriófago T4 (X275 000) y (b) la cabeza de un insecto (X40). (a: tomada de A.N. Broers, B.J.
Panessa, y J.F. Gennaro, Science 189:635, 1975; © 1975. Reimpresa con permiso de AAAS; b: por cortesía de H.F.
Howden y L.E.C. Ling.)
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Figura 18.20 Microscopia de fuerza atómica de alta velocidad. El esquema señala los elementos básicos de HS-AFM. El operador
“coloca” la muestra en un componente (el piezoactuador) unido a la platina del microscopio (no se muestra). Las señales
provenientes del actuador hacen que el segmento voladizo oscile hacia arriba y abajo, de modo que de manera intermitente el
extremo del AFM contacta la muestra a medida que rastrea la superficie de ella. Las fuerzas que surgen entre la muestra y el
extremo del AFM originan deflexiones del extremo, que son detectadas por un haz láser que es reflejado fuera de la superficie
trasera del extremo del AFM. Los movimientos de la posición del rayo láser, que reflejan diferencias topográficas en toda la
superficie de la muestra, son identificados por un detector de posición, y tal información se utiliza para “elaborar” una imagen de la
muestra. La sucesión de imágenes basadas en AFM, propias del movimiento de la molécula de miosina V que se señala en la figura
9.52 fue “filmada” a razón de 7 cuadros por segundo. (Tomada de C. Veigel y C.P. Schmidt, Nature Revs. Mol. Cell Biol. 12:166,
2011; copyright 2011. Nature Reviews Molecular Cell Biology by Nature Publishing Group. Reimpreso con autorización de Nature
Publishing Group en el formato de reproducción como libro de texto de copyright Clearance Center.)
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Figura 18.21 Pasos seguidos durante la
realización de una autoradiografía con
microscopio corriente.
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Figura 18.22 Comparación de la morfología de células que crecen en cultivos 2D y en cultivos 3D. (a) Fibroblasto
humano que crece en un sustrato plano cubierto con fibronectina en un cultivo 2D asume una forma muy aplanada con
lamelipodios anchos. Las adhesiones que contienen integrina se ven blancas. (b) El mismo tipo de célula cultivada en
una matriz 3D asume una conformación fusiforme no aplanada. La matriz de fibronectina extracelular aparece en azul.
La barra equivale a 10 μm. (Tomada de Edna Cukierman, Cell 130:603, 2007, fig. 1, reimpresa con autorización de
Elsevier. Por cortesía de Kenneth M. Yamada, National Institute of Dental and Craniofacial Research, Nih.)
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Figura 18.23 Purificación de fracciones subcelulares por centrifugación de equilibrio con
gradiente de densidad. En este ejemplo particular, el medio se compone de un gradiente de
densidad continuo de sacarosa y los distintos organelos se sedimentan hasta que llegan a un
sitio en el tubo igual a su propia densidad, donde forman bandas. La pastilla de 20 000 g se
obtiene como se muestra en la figura 8.5.
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Figura 18.24 Cromatografía por intercambio iónico. Separación de dos proteínas mediante
DEAE-celulosa. En este caso, una resina de intercambio con carga positiva se usa para unirse
con la proteína con mayor carga negativa.
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Figura 18.25 Cromatografía de filtración en gel. Separación de tres proteínas globulares con
diferente masa molecular, como se describe en el texto. Entre las proteínas con forma básica
similar, las moléculas más grandes se eliminan antes que las pequeñas.
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Figura 18.26 Cromatografía por afinidad. (a) Representación esquemática de las perlas de
agarosa cubiertas con las que sólo puede combinarse una proteína específica. (b) Pasos del
procedimiento cromatográfico.
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Figura 18.27 Uso del sistema de dos híbridos de
levaduras. Esta prueba para la interacción entre dos
proteínas depende de que una célula sea capaz de
reunir dos partes de un factor de transcripción. (a) Las
dos partes del factor de transcripción (el dominio para
unión con DNA y el dominio de activación), se ven
aquí conforme el factor de transcripción se une con el
promotor de un gen (lacZ) que codifica la
galactosidasa β. (b) En este caso, una célula de
levadura sintetizó el dominio para unión con DNA del
factor de transcripción unido con una proteína X
“carnada”. Este complejo no puede activar la
transcripción. (c) En este caso, una célula de levadura
sintetizó el dominio de activación del factor de
transcripción unido con una proteína Y desconocida
“pescada”. Este complejo no puede activar la
transcripción. (d) Una célula de levadura sintetizó las
proteínas X y Y, lo que reconstituye un factor de
transcripción completo y permite la expresión de lacZ,
que es fácil de detectar. (e) Si el segundo DNA codificó
una proteína, por ejemplo, Z, que no pudo unirse con
X, la expresión del gen reportero no se habría
detectado.
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Figura 18.28 Electroforesis en gel de
poliacrilamida. Las muestras de proteína
suelen disolverse en una solución de
sacarosa cuya densidad impide que la
muestra se mezcle con el amortiguador y
luego se carga en los pozos con una pipeta
fina como se muestra en el paso 1. En el
paso 2 se aplica una corriente directa al gel,
lo que ocasiona que las proteínas se muevan
en la poliacrilamida en carriles paralelos.
Cuando se realiza en el detergente SDS,
como casi siempre sucede, las proteínas se
mueven como bandas a velocidades
inversamente proporcionales a su masa
molecular. Una vez que la electroforesis se
completa, el gel se retira del marco de vidrio
y se tiñe en una charola (paso 3).
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Figura 18.29 Electroforesis bidimensional en gel. Gel de poliacrilamida bidimensional de
proteínas cromosómicas no histonas de la célula HeLa marcadas con [35S]metionina. Con esta
técnica pueden resolverse más de mil proteínas diferentes. (Tomada de J. L. Peterson y E. H. McConkey,
J. Biol. Chem. 251:550, 1976. © 1976 The american Society for Biochemistry and Molecular Biology.)
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Figura 18.30 Principios de operación de un espectrómetro de masa. (Tomada de J. E. Brady, J. Russell
y J. R. Holum, Chemistry 3era. ed.; copyright © 2000, John Wiley and Sons, Inc. Reimpresa con autorización de John
Wiley and Sons, Inc.)
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Figura 18.31 Análisis por difracción de rayos X. Diagrama de la difracción de rayos X por
átomos de un plano de un cristal en una placa fotográfica. La serie ordenada de los rayos
dentro del cristal produce una serie repetitiva de ondas circulares superpuestas que se
dispersan e intersectan la película. Como sucede con la difracción de la luz visible, las ondas
forman un patrón de interferencia que refuerzan unas a otras en algunos puntos de la película
y se cancelan entre sí en otros puntos.
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Figura 18.32 Distribución de densidad electrónica de una pequeña molécula orgánica
(dicetopiperacina) calculada con varios niveles de resolución. Con la resolución más baja (a)
sólo puede distinguirse la naturaleza anular, mientras que la resolución más alta (d) revela la
densidad electrónica alrededor de cada átomo (indicada por las líneas de contorno circular).
(Modificada de D. Hodgkin. Reimpresa con autorización de Nature 188:445, 1960; copyright 1960, Nature by Nature
Publishing Group. Reimpresa con autorización de Nature Publishing Group en el formato de reproducción como libro
de texto, de copyright Clearance Center.)
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Figura 18.33 La combinación de datos de
microscopia electrónica y cristalografía de
rayos X proporciona información sobre inter
acciones entre proteínas y sobre la
estructura de complejos multisubunitarios.
La reconstrucción basada en micrografías
electrónicas de un filamento de actina-ADF
se muestra en gris. Las estructuras obtenidas
por cristalografía de rayos X de alta
resolución de monómeros individuales de
actina (rojo) y moléculas de ADF (verde) se
ajustaron en la estructura determinada por
EM, con menor resolución. (Tomada de Edward
H. Egelman, University of Virginia, J. Cell Biol. 163:1059,
2003 fig. 2a. Reimpresa con autorización de the
Rockefeller University Press.)
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Figura 18.34 Separación de fragmentos de restricción
de DNA por electroforesis en gel. (a) El DNA se incuba
con una enzima de restricción, que lo corta en
fragmentos (pág. 764). La mezcla de fragmentos se
introduce en una ranura o foso en una placa de agarosa
y se aplica corriente eléctrica. Las moléculas de DNA
con carga negativa emigran hacia el electrodo positivo y
se separan por tamaño. (b) Todos los fragmentos de
DNA que están presentes en un gel pueden revelarse
mediante la inmersión del gel en una solución de
bromuro de etidio para luego observar el gel con luz
ultravioleta. (B:Phillipe Plailly/Science Photo
Library/Photo Researchers, Inc.)
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Figura 18.35 Técnicas de sedimentación de ácido nucleico. (a) Separación de moléculas de DNA de diferente tamaño
por la velocidad de sedimentación. El gradiente de densidad de la sacarosa se establece dentro del tubo (paso 1) al
permitir que una solución de sacarosa de concentración cada vez mayor drene por la pared del tubo. Una vez que el
gradiente se forma, la muestra se coloca con cuidado en la parte alta del gradiente (pasos 2 y 3), y el tubo se somete a
centrifugación (p. ej., 50 000 rpm durante 5 h) como se ilustra en el paso 4. Las moléculas de DNA se separan con base
en su tamaño (paso 5). (b) Separación de las moléculas de DNA por sedimentación de equilibrio con base en las
diferencias en la composición. La muestra de DNA se mezcla con la solución de CsCl (paso 1) y se somete a
centrifugación prolongada (p. ej., 50 000 rpm durante 72 h). El gradiente de CsCl se forma durante la centrifugación
(paso 2) y las moléculas de DNA forman bandas en regiones de densidad equivalente (paso 3).
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Figura 18.35 Técnicas de sedimentación de ácido nucleico. (Continuación) (c) El tubo del
experimento b se punciona y se permite que el contenido gotee a tubos sucesivos, lo que
fracciona el contenido del tubo. Se mide la absorbancia de la solución en cada fracción y se
grafica como se muestra.
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Figura 18.36 Identificación de la localización de fragmentos de DNA específicos en un gel por el método Southern
blot. Como se describe en la figura, los fragmentos fraccionados de DNA se desnaturalizan y transfieren a una
membrana de nitrocelulosa, que se incuba con sondas de DNA (o RNA) con marca radiactiva o fluorescente. El sitio de
los fragmentos hibridados se conoce autoradiográficamente (o con microscopia si las sondas fueron marcadas con
tinción fluorescente). Durante el procedimiento de transferencia (blotting), la acción capilar atrae el amortiguador
hacia arriba a las toallas de papel. Conforme el amortiguador se mueve por el gel electroforético, disuelve los
fragmentos de DNA y los transfiere a la superficie de la membrana adyacente.
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Figura 18.37 Construcción de un mapa de
restricción del genoma circular pequeño del
virus tumoral de DNA del polioma. (a)
Autorradiografías de fragmentos de DNA
marcados con 32P que se sometieron a
electroforesis en gel. El gel del lado
izquierdo muestra el patrón de los
fragmentos de DNA obtenidos después de la
digestión completa del genoma de polioma
con la enzima HpaII. Para determinar cómo
se reúnen estos ocho fragmentos para
conformar el genoma intacto es necesario
tratar el DNA de tal manera que se genere
superposición de fragmentos que puede
producirse mediante el tratamiento del
genoma intacto con una segunda enzima
que divide la molécula en sitios diferentes o
por el tratamiento del genoma con la misma
enzima en condiciones distintas en las que el
DNA no se digiera por completo como
sucedió en el gel de la izquierda. Las dos
muestras de la derecha representan
ejemplos de digestiones parciales del
genoma del polioma con HpaII. El gel central
muestra los fragmentos generados por la
digestión parcial del DNA circular súper
helicoidal y el gel de la derecha muestra los
fragmentos HpaII formados después que el
genoma circular se convierte en una
molécula lineal por acción de EcoR1 (una
enzima que sólo hace un corte en el círculo).
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Figura 18.37 Construcción de un mapa de restricción del genoma circular pequeño del virus
tumoral de DNA del polioma. (Continuación) (b) Mapa de restricción del genoma de polioma
alineado con base en la división hecha con HpaII. Se ilustran los ocho fragmentos de la
digestión completa junto con el DNA en la parte superior. Los fragmentos superpuestos de la
digestión parcial se muestran en su disposición ordenada por debajo del mapa. (Los fragmentos
L y M migran al fondo del gel en la parte a, lado derecho.) (Tomada de Beverly E. Griffin, Mike Fried y
Allison Cowie, Proc. Nat´l. Acad. Sci. U.S.A. 71:2078, 1974.)
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Capítulo 18. Técnicas en biología celular y molecular
Figura 18.38 Formación de una molécula
de DNA recombinante. En este ejemplo
una preparación de plásmidos bacterianos
se trata con una enzima de restricción que
hace un solo corte dentro de cada
plásmido bacteriano. Dicha enzima se
utiliza para fragmentar una preparación
de DNA genómico humano en pequeños
fragmentos. Como se trataron con la
misma enzima de restricción, el DNA del
plásmido dividido y los fragmentos de
DNA humano tienen extremos
adherentes. Cuando estas dos
poblaciones se incuban juntas, las dos
moléculas de DNA se unen en forma
covalente entre sí y luego se sellan
también en forma covalente con la ligasa
de DNA, para formar una molécula de
DNA recombinante.
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Figura 18.39 Ejemplo de clonación de DNA
con plásmidos bacterianos. El DNA se extrae
de células humanas, se fragmenta con EcoR1
y los fragmentos se insertan en una población
de plásmidos bacterianos. Se cuenta con
técnicas para prevenir la formación de
plásmidos que carecen del inserto de DNA
ajeno. Una vez que la célula bacteriana captó
un plásmido recombinante del medio, la
célula da origen a una colonia de células que
contienen la molécula de DNA recombinante.
En este ejemplo la mayor parte de las
bacterias contiene DNA de eucariotas con
función desconocida (marcados como ?),
mientras que uno contiene una porción del
DNA que codifica RNA ribosómico y otro
contiene DNA que codifica insulina.
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Figura 18.40 Localización de una colonia bacteriana que
contiene una secuencia deseada de DNA por réplica en placa
e hibridación in situ. (a) Una vez que las células bacterianas
se colocaron en placas en medios de cultivo y que
proliferaron, la caja se invierte sobre un trozo de papel filtro y
se permite que algunas de las células de cada colonia se
adsorban al papel. Se inoculan placas de cultivo vacías al
presionarlas contra el papel filtro a fin de reproducir réplicas
de las placas. (b) procedimiento para revisar las células de una
placa de cultivo en busca de las colonias que contengan el
DNA recombinante de interés. Los cultivos se pueden
“rastrear” con sondas marcadas con elementos radiactivos o
fluorescentes. Una vez que las colonias relevantes se
identifican, las células pueden retirarse de la placa original y
cultivarse por separado para obtener grandes cantidades de
los fragmentos buscados de DNA.
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Figura 18.41 Separación del DNA del plásmido del cromosoma bacteriano principal mediante
centrifugación de equilibrio con CsCl. Puede verse que este tubo de centrifugación contiene dos
bandas, una de DNA del plásmido que tiene un segmento de DNA ajeno que se clonó dentro de las
bacterias y la otra contiene DNA cromosómico de estas mismas bacterias. Los dos tipos de DNA se
separaron durante la centrifugación (fig. 18.35b). El investigador retira el DNA del tubo con aguja y
jeringa. El DNA del tubo se hace visible con el compuesto de unión al DNA bromuro de etidio, que
produce fluorescencia bajo luz ultravioleta. (Ted Speigel/© Corbis.)
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Figura 18.42 Protocolo para la clonación de
fragmentos de DNA eucariota en un fago
lambda. Los pasos se describen en el texto.
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Figura 18.43 Reacción en
cadena de la polimerasa
(PCR). Como se explica en el
texto, el procedimiento
emplea la polimerasa de
DNA resistente al calor, cuya
actividad no se elimina
cuando la temperatura se
eleva para separar dos
cadenas de la doble hélice.
Con cada ciclo de
duplicación, las cadenas se
separan, los segmentos de
flanqueo (cebadores) se
unen con los extremos de la
región seleccionada y la
polimerasa copia el
segmento intermedio.
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Figura 18.44 Secuenciación de DNA. (a)
Pasos básicos en la identificación de la
secuencia de un pequeño fragmento
hipotético mediante la técnica de SangerCoulson (didesoxi), como se describen en el
texto. (b) Carriles de gel en que las
moléculas hijas con marca fluorescente se
separaron. El color de la banda se
determina por la identidad del
didesoxinucleótido en el extremo 3’ de la
cadena de DNA. (c) La secuencia de
nucleótidos en la cadena plantilla se
interpreta en una computadora que “lee”
de abajo hacia arriba en el gel, usando
como entrada la intensidad y la longitud de
onda de la luz fluorescente. La
computadora genera un
“electroferograma” que muestra la
intensidad y el color de la fluorescencia
detectada, junto con la interpretación de la
secuencia de DNA. (b,c: tomada de Leroy
Hood y David Galas, Nature 421:445, 2003,
fig. 1c y 1d. reimpresas con autorización de
Macmillan Publishers Ltd.)
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Figura 18.45 Síntesis de cDNA para
clonación en un plásmido. (a) En este
método de formación de cDNA, un cebador
corto poli(dT) se une con el poli(A) de cada
mRNA que se transcribe por acción de la
transcriptasa inversa (que necesita el
cebador para iniciar la síntesis de DNA). Una
vez que el híbrido DNA-RNA se forma, se
producen muescas en el RNA mediante la
RNAasa H y se agrega la DNA polimerasa I
para digerir el RNA y sustituir el DNA, justo
como ocurre durante la replicación de DNA
en una célula bacteriana (pág. 557).
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Figura 18.45 Síntesis de cDNA para
clonación en un plásmido.
(Continuación) (b) Para preparar
cDNA de extremos romos para la
clonación se agregan un pequeño
fragmento de poli(G) a los extremos
3’ del cDNA y un segmento
complementario de poli(C) a los
extremos 3’ del DNA plásmido. Los
dos DNA se mezclan y se permite que
formen recombinantes, que se sellan
y usan para transformar las células
bacterianas en las que se clonan.
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Figura 18.46 Microinyección de DNA en el núcleo de un huevo de ratón recién fertilizado. El
huevo se mantiene en su sitio con una pipeta de succión que se muestra a la derecha, mientras
que la pipeta de inyección que penetra el huevo se muestra a la izquierda. (Tomada de Thomas E.
Wagner, et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 78:6377, 1981.)
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Figura 18.47 Ratones transgénicos. Esta fotografía muestra un par de hermanos de la misma
camada a las 10 semanas de edad. El ratón más grande se desarrolló de un huevo inyectado
con DNA que contenía el gen de la hormona de crecimiento de la rata, que se colocó en
dirección 3’ del promotor de metalotioneína. El ratón más grande pesa 44 g; el más pequeño,
el testigo no inyectado, pesa 29 g. El gen GH de rata se transmitió a los descendientes que
también crecieron más que los testigos. (Cortesía de Ralph L. Brinster, de un trabajo publicado en R. D.
Palmiter, et al., Nature, 300:611, 1982. Reimpresa con autorización de Macmillan Publishers Ltd.)
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Figura 18.48 Formación de plantas
transgénicas con el plásmido Ti. El transgén se
incluye en el DNA del plásmido Ti, que se
reintroduce en la bacteria hospedadora. Las
bacterias que contienen el plásmido
recombinante se usan luego para transformar
células vegetales, en este caso las células del
meristemo en el extremo superior de una
punta disectada de la raíz. Los brotes
transformados se transfieren a un medio de
selección, donde desarrollan raíces. Las
plantas enraizadas pueden transferirse a tierra.
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Figura 18.49 Formación de ratones con
inactivación génica. Los pasos se describen
en el texto.
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Figura 18.50 Determinación de la función génica por
RNA interferente. La figura muestra una galería de
imágenes por inmunofluorescencia de células cultivadas
de Drosophila que se incubaron con varios siRNA de
cadena doble. Las células mostradas se acumularon en
metafase por un tratamiento separado que bloqueó el
avance hacia la anafase. Durante el estudio se
examinaron más de 4 millones de células. Fue posible
someter a detección a una gran cantidad de células
mediante la selección computarizada de las imágenes
de células que estuvieran en metafase para luego elegir
y ensamblar las imágenes en paneles como el que se
muestra en esta fotografía. Así, podía buscarse la
presencia de husos mitóticos anormales, ya fuera por
observadores humanos o por análisis computarizado
con programas diseñados para detectar características
específicas de un huso anormal. (Un estudio de mayor
tamaño del mismo tipo se publicó en Nature 464:721,
2010.) (Por Cortesía de Gohta Goshima y Ronald D.
Vale.)
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Figura 18.51 Determinación de la función génica por interferencia del RNA. (Izquierda) Una
célula de mamífero cultivada no tratada en la metafase de la mitosis. (Derecha) El mismo tipo
de célula se trató con un dsRNA de 21 nucleótidos diseñado para inducir la destrucción de los
mRNA que codifican la cinasa Aurora B, una proteína participante en el punto de comprobación
del huso en metafase. Los cromosomas de esta célula se encuentran adyacentes al huso
mitótico, lo que sugiere la ausencia de interacciones entre el cinetocoro y el microtúbulo.
(Tomada de Claire Ditchfield et al., J. Cell Biol. 161:276, 2003, fig. 8d. Reimpresa con autorización de the Rockefeller
University Press.)
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Figura 18.52 Formación de anticuerpos
monoclonales. Los pasos se describen en el
texto. El medio HAT se llama así porque
contiene hipoxantina, aminopterina y
timidina. Este medio permite el crecimiento
de las células con una fosforribosilo
transferasa de hipoxantina- guanina
(HGPRT), pero no apoya el crecimiento de
células que carecen de esta enzima, como
las células de mieloma múltiple sin fusionar
que se usaron en este procedimiento.
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