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Virus del Papiloma Humano,
Detección y Vacunas
Dra. Marcela Lizano Soberón
Infección PERSISTENTE con
VPH como causa necesaria para el
desarrollo de CaCU
 Enfermedad de transmisión sexual
 Genoma del VPH 99% en Ca-CU
Zur Hausen, 1977; Bosch, 2002; de Villiers, 2004.
Criterios para determinar papel viral
en la carcinogénesis (zur Hausen 2001)
 Presencia regular y persistencia del respectivo DNA viral en
biopsias tumorales y líneas celulares derivadas de dichos tumores.
 Demostración de promoción de crecimiento por genes virales
específicos, en cultivos celulares o modelos animales disponibles.
 Demostración de que el fenotipo maligno depende de la expresión
contínua de oncogenes virales.
 Evidencias epidemiológicas de la infección viral como factor de
riesgo para el desarrollo del cáncer.
FACTORES
HORMONALES
VIDA
SEXUAL
STRESS
TABAQUISMO
OTROS
HPV
SISTEMA
INMUNOLOGICO
DESNUTRICION
ALTERACION DE LA
RESPUESTA INMUNE
LOCAL
FACTORES
GENETICOS
Cáncer
Cérvico
Uterino
Epidemiología del VPH
VPH de alto riesgo en el 99% de los cánceres de cérvix .
Walboomers JM et al. 1999. J Pathol. 189:12.
15-43% prevalencia de VPH en mujeres con citololgía
normal.
Orozco-Colín 2010. Int J Infect Dis. 14:1082.
Kasan et al. 2011. Eur J Obster Gynecol Reprod Biol. Jul 14.
~70% de la mujeres estarán infectadas por VPH en algún
momento de su vida. La mayor parte de estas infecciones
serán transitorias.
Koutsky et al. N Engl J Med 2002, 347:1645
El virus del papiloma humano y el cáncer
cérvico-uterino
Menos del 2%
de los individuos
infectados
Infección
VPH
persistencia
NIC 2+
invasion
Integración
Normal
Tipo de VPH/ variantes intratipo
Carga Viral
Predisposición genética
Respuesta inmune
Incidencia de infecciones por HPV, precáncer y cáncer
Lowy & Schiller. J Clin Invest. 116:1167, 2006
Relación
Relaciónevolutiva
evolutivaentre
entreVPHs
VPHs
J. Doorbar et al. / Vaccine 30S (2012) F55– F70
Papilomavirus Alpha
y asociación
con enfermedad
Doorbar J et al. / Vaccine 30S (2012) F55– F70
Genoma del VPH
Región Larga
de control
Oncogenes
Replicación
Proteínas de
la cápside
Replicación y
transcripción
Efecto de Integración del DNA viral al
genoma hospedero
X
X


 
Ciclo de vida de VPH en el epitelio cervical
Woodman CBJ et al.,Nat Rev 2007; 7:11.
Patogénesis del cáncer de cérvix
zur Hausen
Información relevante de VPH y CaCU
 La infección por VPH es muy común
 El CaCU siempre es causado por el VPH
 Tener VPH no significa que la mujer desarrollará
CaCU.
 Más del 90% de las infecciones detectadas se
eliminan en los siguientes 2 años.
 La infección con VPH de alto riesgo que persiste por
más de 4 años aumenta el riesgo al cáncer por 100x
 Los VPH se detectan prácticamente en todos los casos
de CaCU y en una proporción de sus lesiones
precursoras.
 La infección por VPH es la CAUSA NECESARIA del
cáncer de cérvix, pero NO SUFICIENTE.
 Una vacuna totalmente eficaz contra VPH16 y 18
eliminaría cerca del 70% de los cánceres de cérvix.
La estrategia completa para eliminar el cáncer involucra
la detección temprana, el tratamiento y la prevención
Prevención
Primaria
Vacunación
Intento prometedor para reducir incidencia y mortalidad de
CaCU
Secundaria
Detección oportuna del cáncer
El primer factor en el pronóstico es la detección en etapas
tempranas de la enfermedad:
- Pap
- Colposcopía
- Detección de ADN de VPH de alto riesgo
Tratamiento oportuno de lesiones premalignas
Diagnóstico molecular de VPH
 Los modelos de cultivo in vitro son poco eficaces y
costosos. Los anticuerpos carecen de valor diagnóstico.
 La detección de DNA de VPH aporta una excelente
sensibilidad que debe ser valorada cuidadosamente debido
a la ubicuidad del virus.
 Las mujeres infectadas con VPH-AR se encuentran en
mayor riesgo de desarrollar CaCU que las infectadas con
tipos de VPH de bajo riesgo.
 Manejo menos agresivo en mujeres VPH neg con
anormalidades citológicas leves o equívocas, dado que es
poco factible que progresen.
Mayor sensibilidad de detección de
LIE de alto grado
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
89.2%
96.9%
76.2%
Pap
Prueba VPH
Pap + VPH
Sensibilidad
Participantes: 995mujeres con ASCUS
Manos, M.M., et al., Identifying Women With Cervical Neoplasia.
JAMA, May 5, 1999
Sensibilidad de distintas técnicas de
detección de VPH
Hibridación
in situ
Southern blot
Sonda
directa
PCR en
tiempo real
Señal
amplificada
Toma de muestra para la detección de
VPH

La toma de muestra se obtiene de la región exoendocervical con cepillos especiales.

Se transporta al laboratorio en medio líquido (la
muestra puede ser viable dos semanas a temperatura
ambiente aunque es conveniente refrigerarla).

Puede utilizarse el mismo medio empleado en la
citología líquida.

Los estudios de toma por el propio paciente han
demostrado su eficacia.
HC2
Límite de detección: 4000–5000 HPV copies
Denature
nucleic acids
RNA:DNA
complex
antibodies
Hybridize
target DNA
with RNA
probe
Capture
RNA:DNA hybrids
onto microtiter
plate
Chemiluminescent
signal amplification
Reagent reversal modification
Tipos de VPH identificados en
HC2
La prueba de captura híbrida utiliza dos
mezclas de sondas de RNA para diferenciar
entre tipos de VPH oncogenicos y de bajo
riesgo
 Bajo riesgo
 6, 11, 42, 43, 44
 Alto riesgo
 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68
PCR
La amplificación de la secuencia
blanco es exponencial
PCR / PRIMERS CONSENSO SOBRE EL GEN L1
5’
3’
MY11/09 450 pb
150 pb
65 pb
65 pb
GP5/6+
SPF1/2
L1C1/2
Secuenciación de Productos de PCR
Blast
Métodos de genotipificación por PCR
 No todos los sistemas de tipificación brindan los
mismos resultados...
- La estandarización es crítica
 Cada sistema de primers bien validado sufre de
problemas de sensibilidad para algunos tipos virales.




MY09/11:
26, 35, 45, 52, 55, 59, 68, 73, 83
PGMY09/11: 31, 52
GP5+/6+:
53, 61
SPF10:
42, 56, 59
Detección de infecciones múltiples
LBA (Roche)
Reference
line
High
beta-globin
Low
beta-globin
Note: Research array depicted. The commercial array will have differences in probe composition and
configuration from research prototype
E6 Nested Multiplex PCR
PRIMERS
GENERALES
16
18
45
16
45
E6-E7
18
(602-666 pb)
31
PRIMERS ESPECÍFICOS
COCKTAIL 1
16,18,31,59,45
(151-457 pb)
COCKTAIL 2
33,6/11,58,52,56
(181-398 pb)
COCKTAIL 3
35,42,43,44
(163-358 pb)
COCKTAIL 4
68,39,51,66
(172-333pb)
Sotlar K. et al. J.Clin.Microbiol. 2004. 42:3176-84.
Recomendaciones para el manejo del
paciente con criterio de positividad a VPH
PAP
normal
 LIEBG
ASCUS
HPV -
PAP anual o trianual
de rutina
HPV +
colposcopía
Massad LS et al. J Low Genit Tract Dis. 2013 17:S1-S27.
Guías clínicas ASCCP 2006
Detección de VPH en mujeres
> 30 años
 Tamizaje con VPH y PAP
 Si cualquiera de las pruebas es positiva, seguir la
estrategia normal del flujograma de ascus y continuar
con el tamizaje anual.
 Si ambas pruebas son negativas, extender el intervalo
de tamizaje hasta 3 años.
Massad LS et al. J Low Genit Tract Dis. 2013 17:S1-S27.
Guías clínicas ASCCP 2006.
Prueba de DNA de VPH:
Se requiere genotipificar?
Tipificación de VPH
• Tipo: > 10% diferencias en genoma
• Subtipo: Diferencias del 10 a 2 %
• Variante:
< 2 % en secuencias codificantes (E6,E7,L1)
< 5% en secuencias no codificantes (LCR)
•
160 tipos de VPH se han clasificado de acuerdo a su nicho
ecológico, potencial oncogénico y posición filogenética
Burk RD, et al. Virology 2013;445:232–43.
Usos potenciales
 Investigación
 Prueba de curación
 Definir persistencia para manejo de citología normal en
mujeres VPH positivas
 Vigilancia en poblaciones vacunadas
Investigación
 La ausencia de tipificación en estudios epidemiológicos
asume igualdad en el espectro de genotipos de VPH:
 Ya demostrado que hay diferencias en potencial
oncogénico.
 Entre los tipos oncogénicos – existen diferentes
riesgos de progresión o persistencia?
.
. .
.
. .. . . .. . . .. . .
Carrillo García A, et al. Gynecol Oncol 2014; 134-534-539.
Carrillo García A, et al. Gynecol Oncol 2014; 134-534-539.
ASOCIACION ENTRE TIPO DE MUESTRA (CA+LIEAG VS
LIEBG) Y COMBINACION DE VPH ENTRE TODAS LAS
MUESTRAS POSITIVAS
Carrillo García A, et al. Gynecol Oncol 2014; 134-534-539.
Prueba de curación
 Confirmación de que la lesión asociada a la infección
por VPH ha sido erradicada por terapia excisional,
vacuna profiláctica, quimioterapia (enfermedad residual).
Vigilancia en poblaciones vacunadas
 Genotipificación en programas de tamizaje
seleccionados pre- y post- vacunación.
 Monitoreo del decremento temporal
anticipado en la prevalencia de VPH16/18
 Monitoreo en el incremento potencial de otros
genotipos virales.
 Evaluación de la protección cruzada
potencial de la vacuna.
Expresión de VPH en la progresión neoplásica
Detección de mRNA de VPH
El VPH que se está transcribiendo (producción
de mRNA viral) asegura que la infección es
activa.
En particular, la expresión abundante de mRNA
de E6 y E7 habla de una infección con alto riesgo
de transformación.
Vs la detección de DNA, tiene un mayor valor
predictivo positivo.
Comparación entre diferentes métodos
comerciales de detección de VPH
Método
Paciente
Detecta
persistencia
Principio
Muestra infec.
activa
No
Evita seg.
innecesario
Detecta
Genotip.
DNA/mRNA VPH
CH2
No
No
DNA
LBA
Sí
No
No
DNA
Si
PreTect HPV-proofer
Sí
Sí
Sí
mRNA
Sí
No
Debido a la sensibilidad de las pruebas moleculares la
detección de DNA de VPH no necesariamente va
acompañado del desarrollo de un proceso tumoral,
por lo que otros pruebas podrían requerirse:
1) Citología
2) Genotipificación
3) Expresión de mRNA de VPH
4) Integración de DNA viral
5) Estatus de p16 y otros marcadores celulares
6) Carga viral de VPH
Vacunas vs. VPH
Los Papilomavirus codifican 2 proteinas
estructurales
 Dos proteinas estructurales:
 L1: Cada partícula tiene 360 copias.
 L2: Cada partícula tiene 12 copias.
La proteina L1 se autoensambla de
forma tridimensional formando
“viriones” vacíos denominados
“virus-like particles (VLPs)”
Doug Lowy (NCI, USA)
Vacunas profilácticas vs VPH
Pr
Vector de Expresión
o baculovirus
L1
L1
VLPs
L2
L2
(Virus-Like particles)
Expresión y ensamblaje de L1 y L2
en células de levadura o de insecto
VLPs (Virus Like Particles)
Partículas virales VLP
 No
contienen DNA viral
 Inducen anticuerpos neutralizantes
contra tipos específicos.
 Tienen efecto protector en conejos
y perros, cuando se administran
previamente al reto con papilomavirus
de conejo y oral canino.
Breitburd et al. 1995 J Virol 69:3959.
Suzich et al. 1995 PNAS 92:11553.
(VLPs)
específicas para diferentes tipos de VPH
Vacunación
con HPVL1-VLPs
DNA que
codifica
VPH-L1
Inducción de
anticuerpos
neutralizantes
Autoensamblaje
de VLPs
Proteína L1
Transferencia génica y
expresión en modelo de
levadura
VPH de alto
riesgo
Purificación
J. Clin. Invest. 2004; 114 (4):450–462
Desarrollo de vacuna contra VPH
Más de 25 años...
2006
Registro
2002
Estudios fase III - tetravalente
2002
Estudios fase II – monovalente y tetravalente
2001
Estudios fase I - monovalente
1997
Estudios Pre-clínicos: VLP induce respuesta de Ig neutralizante
1995
Agencia Internacional de Investigación en Cáncer declara a
VPH tipos 16 y 18 como carcinógenos
VPH involucrado en transformación celular maligna
1991
Partículas similares a virus (VLP) ensambladas en levadura y células de insecto
1990s
Primeros intentos DNA desnudo - vaccinia virus - proteínas de fusión
Autoensamblaje de proteinas de cápside L1 y L2
1980s
Sospecha Correlación VPH – CACU
Annu Rev Med 2004;55:319-31
N Engl J Med 2002 ;347(21):1703-1705
Composición de las vacunas contra el VPH
GARDASIL®1
Tipos de VPH
Concentraciones
por dosis en µg
6
11
16
Cervarix®2
18
20/40/40/20
16
18
20/20
Levadura
Tecnología para
producir PPV de L1
Adyuvante
Dosis de adyuvante
Proceso de ensamblado/
reensamblado registrado
comercialmente para mayor
estabilidad
Sustrato de células
de insecto
AAHS
AS04
(Merck & Co., Inc.)
Hidróxido de aluminio +
3-desacil-monofosforil
lípido A
(MPL, Corixa/GSK)
225 µg
500 µg /50 µg
Sulfato hidroxifosfato de
aluminio amorfo
PPV = partículas parecidas a virus
1. Villa LL, Costa RLR, Petta CA y cols. Lancet Oncol. 2005;6:671–678. 2. Harper DM, Franco EL, Wheeler C y
cols. Lancet. 2004;364:1757–1765.
Eficacia de la Vacuna Cuadrivalente VPH 6,11,16 y 18
FUTURE II – Resultados
Análisis
Punto Final
N Engl J Med 2007;356:1915-27
Vacuna VPH
Placebo
Eficacia
(95% IC)
# de
Mujeres
# de
Casos
# de
Mujeres
(Tasa**)
# de
Casos
(Tasa
PP
NIC 2/3, AIS* y Cáncer
Relacionado a VPH-16 y
18
5,305
1
(<0.1)
5,260
42
(0.3)
98 %
IT
NIC 2/3, AIS* y Cáncer
Relacionado a VPH-16 y
18
6,087
83
(0.5)
6,080
148
(0.8)
44 %
IT
NIC 2/3, AIS* y Cáncer
Relacionado a cualquier
tipo de VPH
6,087
219
(1.3)
6,080
266
1.5
17%
Transudación o exudación de
anticuerpos séricos al sitio de la
infección por VPH
Schwarz TF, Oberdan L. Gynecol Oncol. 2008; 110:S1-S8
Títulos de anticuerpos anti-VPH18
inducidos por las vacunas
Las pruebas clínicas muestran que la protección continúa. Se desconoce
cuales son los niveles mínimos de anticuerpos anti-VPH 16 y 18 para
proteger contra la enf. clínica
Harper D. Prophylactic HPV vaccines: Current knowledge of impact on
gynecologic premalignancies. Discovery Medicine July 2010.
Desarrollo de NICs I AIS relacionados con
HP6,11,16,18 en población vacunada (Gardasil)
Posible generacion de
Celulas B de memoria
Joura EA, et al.Vaccine 2008, 26:6844
Modelo de estimación del impacto clínico de
la vacuna profiláctica HPV-16/18
Sin
Vacunación
120
50%
100
80
60
40
20
75%
V
A
C
U
N
A
C
I
O
N
98%
0
EDAD (AÑOS)
Goldie S et al. 2003 Int J Cancer 106:893.
Tipos de VPH: 16, 18, 31, 33 ,45, 52,58
6, 11