UNIVERSIDAD AUTONOMA CHAPINGO DEPARTAMENTO DE SUELOS CORRECCIÓN DE CLOROSIS FÉRRICA Y BALANCE IÓNICO EN JITOMATE TESIS PROFESIONAL QUE COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL TITULO DE: INGENIERO AGRÓNOMO ESPECIALISTA EN SUELOS PRESENTA JASIEL VALDIVIA SANCHEZ Chapingo, México. Abril del 2005. 1 TESIS REALIZADA POR JASIEL VALDIVIA SÁNCHEZ, BAJO LA DIRECCIÓN DEL DR. RANFERI MALDONADO TORRES Y ASESORADA POR LA DRA. MA. EDNA ÁLVAREZ SÁNCHEZ Y EL DR. GUSTAVO ALMAGUER VARGAS, HA SIDO REVISADA Y APROBADA POR EL JURADO EXAMINADOR COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL TITULO DE: INGENIERO AGRÓNOMO ESPECIALISTA EN SUELOS. JURADO: PRESIDENTE: DR. RANFERI MALDONADO TORRES SECRETARIO: DRA. MA. EDNA ALVAREZ SANCHEZ VOCAL: DR. GUSTAVO ALMAGUER VARGAS SUPLENTE: M.C. JOEL PINEDA PINEDA SUPLENTE: M.C. EDMUNDO ROBLEDO SANTOYO Chapingo, México, Abril del 2005. 2 CONTENIDO GENERAL RESUMEN ....................................................................................................................... 8 SUMMARY ....................................................................................................................... 9 IRON CHLOROSIS CORRECTION AND IONIC BALANCE IN TOMATO ...................... 9 1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 10 2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 12 2.1. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................ 12 2.2. OBJETIVO PARTICULAR ................................................................................... 12 3. HIPÓTESIS ................................................................................................................ 12 4. REVISIÓN DE LITERATURA .................................................................................... 13 4.1. FUNCIONES Y METABOLISMO DEL HIERRO .................................................. 13 4. 1. 1. Fotosistema II ............................................................................................ 14 4. 1. 2. Biodisponibilidad del Hierro .................................................................... 14 4. 2. EL HIERRO EN EL SUELO................................................................................. 15 4.2.1. Suelos Calcáreos ........................................................................................ 15 4.2.2. Mecanismos de Formación del Hierro Insoluble ...................................... 16 4.3. DINÁMICA DE ABSORCIÓN DEL HIERRO ........................................................ 17 4.3.1. Mecanismos Específicos ............................................................................ 17 4.3.2. Mecanismos No Específicos ...................................................................... 17 4.3.2.1. Estrategia I ................................................................................................ 18 4.3.2.2. Estrategia II ............................................................................................... 19 4.3.3. Transporte de Hierro Dentro de la Planta ................................................. 21 4.3.4. La Paradoja del Hierro ................................................................................ 23 4.3.5. pH Dentro de la Planta ................................................................................ 24 4.4. CAMBIOS FISIOLÓGICOS, MORFOLÓGICOS Y BIOQUÍMICOS INDUCIDOS POR DEFICIENCIA DE HIERRO ................................................................................ 24 4.4.1. Fisiológicos ................................................................................................. 25 4.4.2. Morfológicos ................................................................................................ 25 3 4.4.3. Bioquímicos ................................................................................................. 26 4.5. ASPERSIONES FOLIARES COMO ESTRATEGIA DE CORRECCIÓN DE CLOROSIS FÉRRICA ................................................................................................ 27 4.5.1. Ácido Sulfúrico ............................................................................................ 28 4.5.2. Quelatos de Hierro ...................................................................................... 28 4.5.3. Sulfato Ferroso ............................................................................................ 29 4.5.4. Ácidos Orgánicos ....................................................................................... 30 4.6.USO DE EXTRACTO DE NOPAL EN LA CORRECCIÓN DE CLOROSIS FÉRRICA .................................................................................................................... 31 4.7. EL CULTIVO DEL JITOMATE (LYCOPERSICUM SCOLENTUM MILL) ........................ 31 4.7.1. Aspectos Agronómicos .............................................................................. 31 4.7.2. Aspectos Nutrimentales ............................................................................. 32 5. MATERIALES Y MÉTODOS...................................................................................... 33 5.1. DESARROLLO EXPERIMENTAL ....................................................................... 33 5.2. EXTRACTO DE NOPAL. ..................................................................................... 33 5.3. TRATAMIENTOS. ............................................................................................... 34 5.4. VARIABLES EVALUADAS. ................................................................................ 35 5.4.1. Hierro Activo................................................................................................ 35 5.4.2. Concentración Nutrimental ........................................................................ 35 5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO .................................................................................... 36 5.6. BALANCE IÓNICO .............................................................................................. 36 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................. 37 6.1. CONCENTRACIÓN DE NITRÓGENO ................................................................ 37 6.2. CONCENTRACIÓN DE FÓSFORO ..................................................................... 40 6.3. CONCENTRACIÓN NUTRIMENTAL DE POTASIO, CALCIO Y MAGNESIO ..... 41 6.4. CONCENTRACIÓN Y ESTADO NUTRIMENTAL DEL HIERRO ......................... 45 6.5. CONCENTRACIÓN DE MANGANESO, ZINC, COBRE, BORO Y SULFATOS .. 48 6.6. RELACIONES NUTRIMENTALES ...................................................................... 53 6.7. BALANCE IÓNICO .............................................................................................. 58 7. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 59 4 8. RECOMENDACIONES .............................................................................................. 60 9. LITERATURA CITADA .............................................................................................. 61 10. ANEXOS .................................................................................................................. 73 INDICE CE CUADROS Cuadro 1. Intervalo promedio normal y nivel de deficiencia de los elementos esenciales (Maynard y Hochmutt, 1991). ......................................................................................... 32 Cuadro 2. Composición química del extracto de nopal (Maldonado, 2002). .................. 33 Cuadro 3. Productos y dosis utilizados en la preparación de los tratamientos. .............. 34 Cuadro 4. Nitrógeno total, relaciones NO3¯:N-org y contenido relativo de NO3¯ y N-org. ....................................................................................................................................... 38 Cuadro 5. Contenido de cationes y aniones inorgánicos, contenido de Nitrógeno orgánico y la excreción de iones H+, calculados con base en el procedimiento de Van Egmond y Aktas (1977). ................................................................................................. 58 INDICE DE FIGURAS Figura 1. Modelo de respuesta de las raíces a la deficiencia de hierro en dicotiledóneas y monocotiledóneas no gramíneas (estrategia 1)........................................................... 19 Figura 2. Modelo de las respuestas de las raíces a la deficiencia de hierro en pastos.. 20 Figura 3. Posible mecanismo mediante el cual el hierro es absorbido hacia el simplasto de las hojas. ................................................................................................................... 23 Figura 4. Concentración de NO3¯ y N orgánico (N-org) de acuerdo a los distintos tratamientos.................................................................................................................... 37 Figura 5. Concentración de Fósforo en hojas de jitomate de acuerdo a los diferentes tratamientos.................................................................................................................... 40 Figura 6. Efecto de los tratamientos en el contenido de potasio en hojas de jitomate. .. 41 Figura 7. Efecto de los tratamientos en el contenido de calcio en hojas de jitomate. ..... 42 5 Figura 8. Efecto de los tratamientos en el contenido de magnesio en hojas de jitomate. ....................................................................................................................................... 43 Figura 9. Efecto de los tratamientos en el contenido hierro total en hojas viejas de jitomate. .......................................................................................................................... 45 Figura 10. Efecto de los tratamientos en el contenido de Fe activo en hojas viejas en las hojas de jitomate ............................................................................................................ 46 Figura 11. Efecto de los tratamientos en el contenido de Fe activo en hojas jóvenes en las hojas de jitomate. ...................................................................................................... 47 Figura 12. Efecto de los tratamientos en el contenido manganeso en las hojas de jitomate. .......................................................................................................................... 48 Figura 13. Efecto de los tratamientos en el contenido de cobre en las hojas de jitomate. ....................................................................................................................................... 49 Figura 14. Efecto de los tratamientos en el contenido de boro en las hojas de jitomate. ....................................................................................................................................... 50 Figura 15. Efecto de los tratamientos en el contenido de zinc en las hojas de jitomate. 51 Figura 16. Efecto de los tratamientos en la absorción de SO 4= en las hojas de jitomate. ....................................................................................................................................... 52 Figura 17. Efecto de los diferentes tratamientos sobre la relación K/Ca. ....................... 53 Figura 18. Efecto de los diferentes tratamientos sobre la relación P/Fe. ....................... 54 Figura 19. Efecto de los diferentes tratamientos sobre la relación P/Zn. ....................... 55 Figura 20. Efecto de los diferentes tratamientos sobre la relación K/Zn. ....................... 56 Figura 21. Efecto de los diferentes tratamientos sobre la relación K/Fe. ....................... 56 Figura 22. Efecto de los diferentes tratamientos sobre la relación Fe/Mn. ..................... 57 INDICE DE ANEXOS Anexo 1. Prueba de medias de las variables nitratos, nitrógeno orgánico, fósforo, potasio, calcio y magnesio contenidas en las hojas de jitomate. ............................ 73 Anexo 2. Prueba de medias delas variables hierro total (Fe Tot), hierro activo en hojas jóvenes (Fe2+ J) y hierro activo en hojas viejas (Fe2+ V).......................................... 74 Anexo 3. Prueba de medias de las concentraciones de manganeso, zinc, cobre boro y sulfatos en las hojas de jitomate. ............................................................................ 75 6 Anexo 4. Prueba de medias de las relaciones nutrimentales K/Ca, P/Fe, P/Zn, K/Zn, K/Fe y Fe/Mn en hojas de jitomate. ......................................................................... 76 Anexo 5. Contenido de iones y aniones inorgánicos y nitrógeno orgánico en las hojas del jitomate, datos utilizados para el calculo de la excreción de iones H+ propuesto por Van Edmond y Aktas......................................................................................... 77 7 RESUMEN CORRECCIÓN DE CLOROSIS FÉRRICA Y BALANCE IÓNICO EN JITOMATE 1 Valdivia Sánchez J., 2Maldonado Torres R. 2Álvarez Sánchez M. E. y 3Almaguer Vargas G. La clorosis férrica es el amarillamiento de las hojas causada por niveles insuficientes del Fe2+ más que por el contenido de hierro total en las hojas. Para corregir este problema se han aplicado productos que no han sido efectivos y resultan muy costosos. Por ello con el presente trabajo se buscan alternativas para la corrección de la clorosis férrica suministrando extractos de Opuntia sp. Se aplicó foliarmente extracto de nopal solo y combinado con fuentes inorgánicas de hierro y ácido sulfúrico en plantas de jitomate. Las plantas de jitomate desarrollaron en macetas con 3 kg. de suelo calcáreo (pHH O=8.4) hasta mostrar síntomas de clorosis férrica. Posteriormente se realizaron 2 cinco aplicaciones de los productos: a). ácido sulfúrico, b).ácido sulfúrico más extracto de nopal, c).Sulfato ferroso, d).Sulfato ferroso más extracto de nopal e).Fe–EDTA), f). Extracto de nopal y g). Sulfato ferroso activado (FeSO 4 + ácidos húmicos), equiparando las dosis de Fe, mantenido en 2 mg de Fe L-1. Los resultados mostraron que el extracto de nopal contribuyó a disminuir la extrusión de protones en raíces de plantas de jitomate, así como a una mayor conversión de NO 3¯ a nitrógeno orgánico, pero no contribuyó en mejorar el contenido de Fe2+. Los tratamientos donde se aplicaron FeSO4 y FeSO4+ácidos húmicos, mostraron altas relaciones K/Ca y K/Zn, mayores contenidos de Fe2+ y disminuyeron la extrusión de H+, con respecto al testigo. Por otro lado, el sulfato ferroso más ácidos húmicos mostró ser el mejor tratamiento en la corrección de la clorosis férrica, al aumentar el contenido de Fe activo y disminuir la extrusión de protones, como respuesta a la deficiencia de hierro en la planta. Palabras clave: deficiencia de hierro, fertilizantes de hierro, suelo calcáreo, extracto vegetal. 1Tesista, Ingeniero Agrónomo Especialista en Suelos, Departamento de Suelos, U. A. Chapingo. Profesor investigador 2Departamento de Suelos y 3Departamento de Fitotecnia, U. A. Chapingo. 8 SUMMARY IRON CHLOROSIS CORRECTION AND IONIC BALANCE IN TOMATO 1 Valdivia Sánchez J., 2Maldonado Torres R. 2Álvarez Sánchez M. E. y 3Almaguer Vargas G. Iron chlorosis is the yellowing of leaves caused by low levels of iron active (Fe 2+) in plant tissue. Looking for the correction of this problem several products have been used which have a little effectiveness and are expensive. Thus in the present work alternatives for iron chlorosis using Opuntia extracts are looked for. For which extracts of Opuntia were sprayed alone and mixed with different sources of iron and sulfuric acid. Tomato plants were cultivated on pots containing 3 kg of calcareous soil (pH H2O=8.4) until symptoms of iron chlorosis were showed. Later, plants were sprayed with a) sulfuric acid; b) sulfuric acid plus Opuntia extract; c) iron sulfated; d) iron sulfated plus Opuntia extract; e) Fe-EDTA; f) Opuntia Extract; g) iron sulfated plus humic acid maintaining the same concentration of Fe in the treatments (2 mg Fe L-1). Results showed that Opuntia extract contributed to reduce the proton extrusion in roots, as well as to a greater the convertion of NO3- to organic nitrogen. Treatments with FeSO4 and FeSO4 plus humic acid showed high contents of Fe2+ in leafs and reduced the H+ extrusion respect to the control. On the other hand, the iron sulfated plus humic acid have been the best treatment for the iron chlorosis correction, because it increased the Fe2+ concentration in leaf, and reduced the proton extrusion in response to iron deficiency in tomato plants. Key words: iron deficiency, iron fertilizers, calcareous soil, vegetal extract. 1Tesista, Pasante de Ingeniero Agrónomo Especialista en Suelos, Departamento de Suelos, U. A. Chapingo. Profesor investigador 2Departamento de Suelos y 3Departamento de Fitotecnia, U. A. Chapingo. 9 1. INTRODUCCIÓN El jitomate reviste gran importancia dentro de la agricultura en México. Esta hortaliza ocupa el primer lugar en volumen producido, peso absoluto y peso relativo en las exportaciones hortícolas, representando el 16 % del total de las exportaciones agropecuarias. Su cultivo se lleva a cabo en 26 estados de la república mexicana, destacando Sinaloa y Baja California Norte (Gil, 2000). El jitomate, al igual que otros cultivos de importancia económica, se llega a cultivar en condiciones edáficas que limitan la movilidad del hierro tanto en el suelo como en la planta. La clorosis que es consecuencia de la deficiencia de hierro, es común en suelos calcáreos, con elevado pH (>8.0). Esta deficiencia no es consecuencia de la falta de hierro en el suelo, donde es uno de los elementos mas abundantes, (3.8%) sino que es producida por su baja movilidad (Lucena, 2000). En México la clorosis férrica asociada a la presencia de suelos calcáreos es un problema recurrente que se presenta en diferentes zonas productoras, ya que se estima que los suelos calcimórficos cubren un tercio de la superficie agrícola, (Flores, 1979) aproximadamente 9.59 millones de ha (Ortiz, 1990). Se tienen diversos reportes de este problema en zonas productoras de Colima (Pérez, 2002), Michoacán (Maldonado, 2001), Coahuila (Medina, 1999), Sinaloa y Chihuahua (Lee, 1998). Para tratar de corregir la clorosis férrica se han propuesto diversas estrategias, que incluyen la selección de variedades resistentes a la deficiencia de Fe, capaces de aprovechar las formas no disponibles para la mayoría de las plantas, así como la inclusión de genes que regulan los mecanismos de eficiencia; otros métodos más convencionales han sido la aplicación de fertilizantes y sustancias que mejoran la disponibilidad del hierro para la planta, como los quelatos. Los quelatos tienen la característica de ser productos de elevado precio, los cuales al ser aplicados al suelo son rápidamente inmovilizados, teniendo que repetir el 10 tratamiento cada año (Pestana, 2003), limitando su uso a cultivos de alto valor económico (Abadía et al, 2002). La aplicación de ácido sulfúrico al follaje ha demostrado ser una herramienta que no siempre es efectiva (Sahu et al., 1987; Tagliavini, 1995), en ocasiones ha demostrado aumentar la concentración de hierro en las hojas, pero sin impactar en la calidad del producto (Pestana, 2002). Pestana (2002) encontró que aplicaciones de ácidos orgánicos fueron efectivos en la corrección de clorosis férrica en durazno. Así mismo, López-Millán (2000) demostró que en plantas de remolacha aumenta la concentración de ácidos orgánicos bajo deficiencia de hierro. En otros estudios (Maldonado, 2002) se han empleado extractos de Nopal (Opuntia sp.) en aplicaciones foliares como potenciandores de la absorción de hierro en Limón mexicano, ya que el ácido málico, contenido en el extracto, actúa como quelatante natural, así como reductor del pH en el interior de la planta. El uso de extractos de nopal representa otra alternativa en la corrección de la clorosis férrica, más baratos y duraderos, con altos contenidos de ácidos orgánicos y amigables con el medio ambiente. Motivo por el cual en la presente investigación se evaluó el efecto de diferentes fuentes de hierro combinados con extracto de Opuntia en la corrección de clorosis férrica en jitomate. 11 2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVO GENERAL Generar alternativas para la corrección de clorosis férrica en jitomate mediante la aplicación de diferentes productos combinados con extracto de Opuntia. 2.2. OBJETIVO PARTICULAR Evaluar el efecto de extractos de Opuntia solo y combinado con fuentes inorgánicas de hierro en la corrección de clorosis férrica a través de los indicadores: balance iónico, contenido de hierro activo, nitrógeno total, nitrógeno orgánico y N – nítrico. 3. HIPÓTESIS Con base a los objetivos anteriores se propusieron las siguientes hipótesis: Los ácidos orgánicos contenidos en el extracto de nopal promueven una mejor absorción y/o aprovechamiento del Fe por parte de hojas de jitomate con deficiencia de hierro. La aplicación de extractos de nopal impacta positivamente en el balance iónico y nutrimental en las hojas. La aplicación de extracto de Opuntia impacta en las concentraciones relativas de nitrógeno total, nitrógeno orgánico y nitrógeno nítrico en el follaje. 12 4. REVISIÓN DE LITERATURA 4.1. FUNCIONES Y METABOLISMO DEL HIERRO El hierro es un elemento esencial en muchos procesos metabólicos de la planta. Según Lobreóaux y Briant (1997) el hierro participa en procesos como la fotosíntesis, respiración, fijación de nitrógeno, síntesis de ADN y clorofilas y en la formación de hormonas. La mayor parte se encuentra en los cloroplastos, los cuales son responsables de la fotosíntesis, donde está implicada en las reacciones redox (Rains, 1976). El resto del hierro se encuentra distribuido en el citoplasma y otros organelos en formando el grupo hemo y/o el grupo sulfuro. El hierro es cofactor de mas 139 enzimas que catalizan reacciones bioquímicas únicas e intervienen en procesos como la fotosíntesis, respiración, reducción de nitratos y sulfatos (Incide, 1998), síntesis de ADN y producción de hormonas (Vert, 2001). Entre 63 y 70.9 % del hierro se encuentra en el follaje de las plantas (Yang, 2001) formando parte o unido a proteínas de acuerdo a los siguientes grupos: a) el 9 % en proteínas como grupo hemo (citocromos, nitrato y nitrito reductasa, sulfido reductasa, catalasa y peroxidasa); b) el 19% en proteínas como grupo no hem (ferredoxina, acotinasa, nitrogenasa, complejo del tilacoide, complejos mitocondriales y 35–80 % como ferritina (como proteína de almacenamiento para evitar toxicidad) (Miller, 1984). El hierro no es parte estructural ni precursor de la clorofila, se conocen algunas reacciones en particular en las que el hierro podría estar involucrado indirectamente. La síntesis de ácido amino levunílico, precursor en la síntesis de clorofila, podría requerir hierro en forma de ferredoxina como intermediario en la cadena de transferencia de electrones y controlar la reducción e inactivación de una o más enzimas (Miller et al, 1984). El hierro también es requerido en etapas posteriores de la síntesis de porfirina, 13 así como en la degradación de la clorofila (Terry, 1995). El contenido de ferredoxina también disminuye bajo deficiencia de hierro (Huang et al, 1992). 4. 1. 1. Fotosistema II La baja concentración de hierro en las hojas causa disminuciones en la concentración de pigmentos fotosintéticos, clorofila y carotenoides en diferente medida. Las concentraciones específicamente, de pigmentos de no lutina y fotosintéticos las como xantofilas carotenoides, del ciclo y más V+A+Z (violaxantina + antheraxantina + zeaxantina) son menos afectadas que las concentraciones de clorofila, aumentan las relaciones molares luteína/clorofila a y (V+A+Z)/clorofila a, contribuyendo a una mayor disipación de excesos de luz en forma de calor en los complejos antena (Abadía et al, 2000). Como consecuencia de las bajas concentraciones de clorofilas y carotenoides la absorbancia en las hojas disminuye; sin embargo, las hojas ferro deficientes absorben más luz por unidad de clorofila que las hojas verdes, por lo que la deficiencia tiene un mayor impacto sobre la concentración de clorofila que sobre la absorción de luz. Esta baja en la concentración de clorofila no tiene impacto sobre el fotosistema II, ya que la cantidad de luz absorbida por molécula de clorofila aumenta (Abadía et al, 2000). 4. 1. 2. Biodisponibilidad del Hierro La clorosis férrica se define como al amarillamiento de las hojas jóvenes causado por la inhibición de la síntesis de clorofila en los cloroplastos, consecuencia del bajo estatus nutricional del hierro dentro de la planta. La severidad de la clorosis férrica en los cultivos está relacionada con el pH, temperatura, CaCO3, contenido de agua y la concentración de HCO3¯ en la solución del suelo (Inskeep and Bloom, 1986). Existen diversos factores asociados con la ineficiencia en el aprovechamiento del hierro, agrupados en: a) aquellos que consideran la clorosis férrica como resultado de la 14 inhibición en la absorción del hierro, como lo son la baja disponibilidad (insuficiencia en el medio, baja disponibilidad, tipo de mineral, baja superficie de absorción), disminución en la absorción (efecto amortiguador del bicarbonato (HCO3-), efecto del nitrato sobre el pH y presencia de metales pesados que puedan alterar los mecanismos de absorción) y b) aquellas que considera la ineficiencia en el uso del hierro por su inactivación como lo son la ineficiencia en la distribución del hierro (Cambios en el pH de la savia, incremento en la concentración de ácidos orgánicos y K +, pH y estado redox) (Lucena, 2000). 4. 2. EL HIERRO EN EL SUELO El hierro es un elemento relativamente abundante en el suelo, su concentración varía desde 10 000 hasta 100 000 mg kg-1 (Mitchel, 1964). En el suelo se encuentra formando parte de diversos minerales, entre los cuales se encuentran: Olivino [(Fe, Mg)2 SiO4], pirita (FeS2), goetita (FeOOH), magnetita (Fe3O4) ferrihidrita, minerales amorfos (andosoles) (Bernard, 1980), siderita (Krauskopf, 1972). La descomposición de estos minerales durante el intemperismo liberan al hierro, precipitándose como óxidos e hidróxidos (Lindsay, 1979) y compuestos más estables como carbonatos, silicatos y sulfatos (Bernard, 1980). De éstos compuestos sólo una pequeña porción se encuentra en los minerales secundarios de sílice o en formas de complejos con la materia orgánica del suelo (quelatos). Los hidróxidos se forman bajo diversas condiciones, pero su solubilidad depende principalmente del pH del suelo y del tipo de hidróxido (Lucena, 2000). 4.2.1. Suelos Calcáreos Los suelos calcáreos son aquellos que tiene contenido de CO 3 superior a 2 % (Castellanos, 2000). Este tipo de suelos se caracterizan además por su bajo contenido de materia orgánica, alto pH (7.5 – 8.5), altos niveles de bicarbonato y alta concentración de Ca2+. Todos esos factores han sido citados como la causa de la clorosis férrica, aunque no de manera directa, además de que el NO3¯ es la forma 15 exclusiva de nitrógeno en la solución del suelo debido al incremento de la nitrificación (Darrah et al, 1986). 4.2.2. Mecanismos de Formación del Hierro Insoluble La fijación del hierro en el suelo se presenta por diferentes mecanismos. El primero de ellos es el bloqueo de la superficie de adsorción de las partículas de minerales del hierro, la cual puede ser bloqueada por fósforo, coprecipitando sobre los hidróxidos de hierro (Olsen, 1972; Torrent et al, 1990). El bicarbonato es uno de los principales factores que inducen la deficiencia de hierro en suelos calcáreos (Lucena, 2000). El sistema en equilibrio del carbonato y bicarbonato da como resultado un sistema anfotérico capaz de amortiguar el pH de un amplio rango a un valor específico de pH 8.3, a presión parcial de CO2 atmosférico. En un medio con alta capacidad amortiguadora los procesos de disolución y adsorción son altamente dependientes del pH La disponibilidad del hierro en el suelo, altamente controlada por el pH, disminuye rápidamente cuando el pH esta por arriba de 4.0, cantidades muy pequeñas se encuentran a pH por arriba de 6, a menos que el hierro se encuentre complejado o quelatado. Es a pH 6.5 – 8.0 donde el Fe3+ alcanza su mínima concentración, en el intervalo 7.0 – 9.0 pH las especies más abundantes son Fe(OH)2, Fe(OH)3 y Fe(OH)4-, la totalidad de las especies inorgánicas no sobrepasan los 10 -10mol de Fe L-1 en este rango de pH. En suelos normalmente aireados la forma inorgánica más disponible para las plantas es el ión Fe3+ y la actividad de este en la solución es de 1000 veces menor por cada unidad de elevación del pH (Lindsay, 1991). Se ha corroborado que existe una menor acumulación de hierro en plantas cultivadas sobre soluciones que contienen el ión HCO3¯, donde el ritmo de respiración de las raíces es reducido en las plantas sensibles. Según Mengel y Kirkby (1982), el ión HCO3¯ perturba la absorción de hierro y su transporte dentro de la planta. Considerando 16 que la abundancia del ión HCO3¯ en el entorno de las raíces provoca una inmovilización del hierro en el interior de la planta. Desde el punto de vista termodinámico, en un sistema natural inicialmente bien aireado, el oxígeno es el primer aceptor de electrones, que puede ser reducido biológicamente a H2O (respiración), cuando el O2 está considerablemente agotado en el sistema, el próximo aceptor de electrones suele el NO3¯ y sólo cuando todo el nitrógeno es reducido a NH4+, el Fe3+ puede ser reducido a Fe2+ (Lindsay, 1979). Por lo que el nitrato es considerado otro factor que induce la clorosis férrica (Smolders, 1997). 4.3. DINÁMICA DE ABSORCIÓN DEL HIERRO La movilización del hierro en la rizósfera se puede dar a través de mecanismos específicos y no específicos (Marschner, 1995). 4.3.1. Mecanismos Específicos Los mecanismos específicos son los que no están relacionados con el estatus nutrimental del hierro en la planta, los cuales se dividen en: a) disminución en el pH inducida por las raíces como consecuencia de la absorción de cationes. b) liberación de ácidos orgánicos por las raíces. c) liberación de fotosintatos como substratos para los microorganismos de la rizósfera los cuales afectan el pH, el potencial redox y la concentración de quelatos (sideróforos). 4.3.2. Mecanismos No Específicos Los mecanismos no específicos están relacionados con el estatus nutrimental de la planta. En estos mecanismos las raíces absorben hierro a través de dos vías. En la primera el hierro puede ser llevado por las células de la rizodermis de los pelos radicales dentro del simplasto, donde es reducido (estrategia I) o es atrapado por un complejo específico (estrategia II), para ser transportado vía simplasto al interior hasta el xilema. 17 Para la absorción de hierro, así como para su liberación en el interior, las células de transferencia (transfer) están especializados en el transporte eficiente de iones a través de membranas (Landsberg, 1986). Estas células se localizan en la rizodermis y el parénquima del xilema, las cuales muestran hendiduras ricas en plasmodesmos y mitocondrias. La primera propiedad sirve para aumentar la superficie de contacto celular y facilitar los procesos de intercambio, en la segunda provee de la energía adicional para tal propósito (Stephan, 2002). 4.3.2.1. Estrategia I El conjunto de adaptaciones a la deficiencia de hierro conocido como estrategia l, característica de dicotiledones y monocotiledóneas no gramíneas, incluye cambios estructurales, morfológicos y fisiológicos a nivel de raíz, para aumentar la capacidad de absorción del hierro del suelo (Jolley et al, 1996). Los componentes que integran esta estrategia son: el marcado aumento en la actividad de las Fe3+–reductasas de la membrana plasmática, incremento en la excreción de protones en la rizósfera y el aumento en la liberación de quelatos reductores (fenoles, flavinas y ácidos orgánicos) ( Cheaney, 1972; Alcántara et al, 1991; Moog and Brügerman, 1994; Abadía et al, ,2002b), la actividad de la PEP–carboxilasa, además del desarrollo de pelos radicales y engrosamientos en las puntas de las raíces (Stephan, 2002). Otra característica de esta estrategia es que el hierro debe ser reducido de Fe 3+ a Fe2+ en la membrana plasmática por la Fe3+–reductasa antes de ser absorbido (Holden et al, 1991), para después entrar al simplasto como ión Fe2+ (Stephan, 2002). Los componentes de la estrategia I se pueden observar gráficamente en la Figura 1. 18 Dell´Orto (2002) observó en muchas especies dicotiledóneas un fuerte incremento en la actividad de las H+-ATPasa´s con una consecuente acidificación de la rizósfera, este incremento es principalmente debido a un aumento de la síntesis de la enzima. En raíces de plantas de pepino ferro deficientes encontró un fuerte desarrollo de raíces laterales cortas y puntas hinchados, una mayor extrusión de H+,, particularmente confinada a la zona suba apical de los puntos hinchados, mayor proliferación de pelos radicales y algunas modificaciones ultra estructurales en las capas externas de la raíz. Figura 1. Modelo de respuesta de las raíces a la deficiencia de hierro en dicotiledóneas y monocotiledóneas no gramíneas (estrategia 1). R= reductasa, Tr= Transportador de Fe3+; St = Bomba de H+; X= incremento en la producción y liberación de quelatos y reductores (Marschner y Römheld, 1994). 4.3.2.2. Estrategia II La adquisición de hierro en la estrategia II está restringida a los pastos. Las plantas clasificadas dentro de este conjunto de adaptaciones obtienen hierro mediante la liberación de fitosideróforos a la rizósfera y alta afinidad del transportador de la membrana con el complejo Fe3+–fitosideróforo, en las células de las raíces, facilita su entrada en ellas (Marschner y Römheld, 1994). 19 Los fitosideróforos son aminoácidos análogos al acido mugínico que se sintetizan y excretan en los ápices de las raíces. Cuando disminuye la concentración de Fe, la producción y liberación de fitosideróforos aumenta drásticamente, hasta 20 veces en plantas deficientes, acumulándose en la rizósfera para quelatar y absorber Fe 3+, sin reducción previa a través de reductores específicos en las membranas plasmáticas de la raíz (Takagi et al, 1984; Romera y De la Guardia, 1991). El mecanismo funcional de absorción del complejo Fe3+–fitosideróforo esta acoplado a protones o potasio. Ya que dentro de la planta el complejo libera al Fe mientras que el fitosideróforo se degrada o es excretado a la rizósfera, como se muestra en la Figura 2 (Mori et al, 1991). Dentro de este grupo se encuentran los pastos y gramíneas, como el maíz, este último adquiere hierro mediante la liberación y absorción específica de fitosideróforos identificado como acido 2´ - deoximugénico descrito por Mori y Nishizawa (1987). Figura 2. Modelo de las respuestas de las raíces a la deficiencia de hierro en pastos. E = Aumento en la síntesis y secreción de fitosideróforos. Tr = Translocador para Fe3+–fitosideroforos en la membrana plasmática (Marschner y Römheld, 1995). 20 4.3.3. Transporte de Hierro Dentro de la Planta Una vez que el hierro ha penetrado dentro de las raíces, éste es transportado hasta el xilema, el cual se de manera radial, en este transporte se presenta una competencia entre el transporte en el simplasto y la acumulación de hierro en la vacuola. Ya en el citoplasma, el hierro es oxidado nuevamente y acomplejado como Fe3+–citrato (Cheaney, 1989) para ser protegido, de lo contrario, podría reaccionar con las formas reducidas de oxígeno, catalizando la formación de radicales libres, las cuales pueden dañar los componentes celulares y eventualmente conducir a la muerte de la célula (Guerinot y Yi, 1994). El hierro puede ser llevado vía apoplasto a través de la red de pared celular del cortex, en el llamado espacio libre, donde está en solución acuosa con minerales del suelo y compuestos orgánicos como aminoácidos, azucares, fenoles y fitosideróforos. Este tipo de transporte conduce la concentración por difusión (Stephan, 2002). En plantas con estrategia I, este paso puede ser obstruido por un aumento en el pH de la solución apoplástica, debido a que los productos de los compuestos de hierro precipitan a altos niveles de pH (Olsen et al, 1981). Después del transporte radial a través del simplasto hacia los espacios vacíos, el hierro es liberado dentro del xilema. Los protones son bombeados dentro del apoplasto del xilema acidificando la savia resultando un pH menor de 6. Esta acidificación provee la fuerza necesaria para la conducción de los cationes por difusión (Stephan, 2002). La fuerza de flujo para el transporte a larga distancia se da mediante diferenciales de presión hidráulica entre la parte superior (hojas) y las raíces, o la generación de presión radical. La primera ocurre en respuesta a la transpiración de las hojas, la segunda puede resultar del influjo de agua en el xilema después de la liberación de iones en los espacios; la presión de raíces solo contribuye al flujo cuando la transpiración es baja. 21 En el interior del xilema el hierro es transportado como un complejo 1:1 de Fe: citrato (Tiffin, 1966), disminuyendo esta relación bajo condiciones de deficiencia de hierro (Brown et al, 1972), manteniéndose el citrato en un relativo exceso (Pich et al, 1994). El flujo en el floema funciona como una fuente de hierro para el desarrollo de las raíces y como un transportador de señales del estado nutricional de los retoños. El hierro no puede ser transportado como ión debido a que el pH del floema es mayor a 7 (Gerendás y Schurr, 1999). Esto podría conducir a la precipitación del hierro interrumpiendo el transporte inmediatamente el hierro entre en los tubos. Se asume que el hierro es transportado con quelatos o alguna otra forma protegida. La nicotinamida es el principal transportador del hierro en el interior del floema en un relación 1:1. La concentración de hierro en el floema y su paso hacia los meristemos apicales, ha sido discutida como la señal que regula los procesos de absorción del hierro (Stephan, 2002). En el follaje, el Fe3+ es reducido a Fe2+ como requisito para su absorción dentro de las células de la hoja (Figura 3). El estado nutricional de la planta no afecta este proceso (Nikolic y Römheld, 1999). Del xilema el Fe2+–dicitrato pasa al apoplasto para ser reducida en la membrana plasmática y ser distribuida mediante el complejo Fe 2+– nicotinamida a los sitios de demanda (Stephan and Scholz, 1993). 22 Figura 3. Posible mecanismo mediante el cual el hierro es absorbido hacia el simplasto de las hojas. PM= membrana plasmática. R= Reductasa en la membrana plasmática; TS= Transportador (proteína de transporte específico), (Nikolic y Römheld, 1999). 4.3.4. La Paradoja del Hierro Se considera que el ión Fe2+ es la forma de hierro activo dentro de la planta, utilizado para los diferentes procesos metabólicos en los que esta involucrado dentro de las células vegetales (Nikolic y Römheld, 1999; Stephan y Scholz, 1993). De acuerdo con Zohlen (2002) y Montás-Ramirez, (2003) el contenido de Fe2+ correlaciona mejor con la concentración de clorofila calculada con base a peso seco, que la determinación del Fe total; se concluye que la clorosis férrica es causada por niveles insuficientes del Fe 2+ más que por el contenido de hierro total (Kudachikar,1997). Morales (1998) y Kudachikar (1997) encontraron mayores cantidades de hierro total en plantas con síntomas de clorosis férrica (816 mg kg-1) que en plantas completamente verdes (760 mg kg-1), y señalan que los niveles insuficientes de Fe2+ se da más por la inmovilización de éste dentro de la planta que por el bajo contenido de hierro total. Otra explicación de este fenómeno es el llamado ‘’efecto de dilución’’ en el cual la baja concentración del hierro en hojas verdes se da por un rápido crecimiento de estas diluyendo la concentración del hierro (Häsuling, 1985). 23 4.3.5. pH Dentro de la Planta La absorción del Fe2+ en las hojas se dificulta por efecto del pH alto dentro de ellas (Abadía, 2002(a)). Nikolic y Römheld (1999) señala que a pH superiores a 6.0 se puede observar un decremento substancial en el aprovechamiento del hierro. Éste incremento del pH del apoplasto restringe la actividad de las Fe3+-reductasas y por lo tanto la absorción de Fe2+ en el citosol (Kosegarten et al., 1999; Nikolic y Römheld, 1999). González-Vallejo (2000) encontró que los valores óptimos de pH para la actividad de las Fe3+-reductasas fueron 5.5 y 5.5 – 6.0 en protoplastos aislados de mesófilo de plantas ferro deficientes y ferro suficientes, respectivamente. Valores de pH por arriba de estos pueden disminuir la actividad de las enzimas de las quelato reductasas resultando en la inmovilización y subsiguiente inactivación de una parte del hierro tomado del suelo y transportado hacia las hojas (Abadía, 2002 (a)), sin que el estatus nutrimental de la planta influya en este proceso (Nikoli y Römheld, 1999 ). Kosegarten (1999) menciona que el aumento de pH en el apoplasto es resultado de la nutrición con nitratos. Y la concentración de HCO3¯ no tiene influencia en el pH del apoplasto de las raíces (Nikoli y Römheld, 1999 ). El pH en el exterior de las ceulas es ligeramente menor en plantas ferro deficientes (pH=5.9) que en plantas sin deficiencia (pH=6.3) (López-Millán, 2000 (a)), esto como consecuencia de un aumento en la concentración de ácidos orgánicos en la savia del xilema. 4.4. CAMBIOS FISIOLÓGICOS, MORFOLÓGICOS Y BIOQUÍMICOS INDUCIDOS POR DEFICIENCIA DE HIERRO El síntoma más evidente de la deficiencia de hierro es el amarillamiento de las hojas más jóvenes de la planta. Sin embargo bajo este estrés la planta muestra una serie de cambios de tipo fisiológico, morfológico y bioquímicos, principalmente a nivel de raíz, que le permiten adaptarse mejor a la baja disponibilidad de hierro. 24 4.4.1. Fisiológicos Las hojas de plantas con deficiencia de hierro crecen casi normalmente, la replicación de cloroplastos continua a tasas normales, pero la formación de tilacoides cesa, resultando que solo haya unos cuantos tilacoides por cloroplasto (Terry, 1995). También se afecta la estructura del tilacoide, provocando que sus membranas sean mas rígidas en comparación que los de hojas sin estrés de hierro (Abadía et al, 2000). Dentro de los tilacoides la deficiencia de hierro reduce el tamaño de los complejos pigmento-proteicos encargados de captar luz (complejos antena) en el fotosistema II, reduciendo los centros de reacción y transportadores de electrones. En muchos cultivos disminuye la relación clorofila a / clorofila b bajo deficiencia de hierro (Abadía et al, 2000). Morales et al, (1991) mencionan que a muy bajos contenidos de clorofila (< 5% del valor del control) los efectos de la deficiencia de hierro sobre la fluorescencia de la clorofila fue permanente e irreversible. Para evitar estos daños bajo deficiencia de hierro aumenta el contenido de carotenoides los cuales disipan los excesos de energía, que de otra manera dañaría el aparato fotosintético (Abadía et al, 2000). Por otro lado, la planta acidifica la rizósfera mediante una bomba de protones dependiente de una ATP–asa ubicada en la membrana plasmática de la raíz (Welkie y Miller, 1993), siendo capaz de acidificar hasta una distancia de 2 mm de la superficie de la raíz, debilitando el enlace Fe-O por lo cual son disueltos los óxidos de Fe, liberando el Metal (Schwertmann, 1991; schaller, 1987). 4.4.2. Morfológicos Los cambios morfológicos visibles incluyen una disminución en el crecimiento radical e incremento en las raíces laterales (Römheld y Marchsner, 1991; Moog y Bruggermann, 1995; Pinto et al, 1998). En raíces sometidas a largos periodos de deficiencia de hierro, 25 se ha observado desarrollo de pelos radicales y engrosamiento de ápices, esto último por incremento en el tamaño de las células corticales y el número de células en la rizodermis e hipodermis (Landsberg, 1996; Wei et al, 1997), lo cual coincide, en los primeros cinco milímetros, con las zonas de reducción del Fe 3+ y expulsión de protones (Bell et al, 1998; Alcántara et al, 1991). En microscopio se ha observado la formación de células “transfer” en la epidermis de la zona de engrosamiento, que tiene como función aumentar la superficie de contacto entre la pared celular y el citoplasma (Lansberg, 1994; Schmidth y Bartels, 1996). Las células “transfer” contienen gran cantidad de mitocondrias que realizan alta actividad respiratoria y generan la energía necesaria para el transporte iónico durante la excreción de protones (Landsberg, 1994; Schikora, 2001). 4.4.3. Bioquímicos La principal reacción de las plantas a la deficiencia de hierro es el incremento en la capacidad de reducción de Fe3+, extrusión neta de protones y liberación de compuestos reductores (Brown y Jolley, 1989). Bajo deficiencia de hierro la actividad de catalazas, como ascorbato–peroxidasa, aumenta en plantas Fe-eficientes. Y las concentraciones de citrato aumentan en el xilema (Brown et al, 1972). Así mismo se observa un incremento en la concentración de ácidos orgánicos en las hojas de plantas Fe–deficientes. López-Millán (2000 (b)) encontró incrementos de 24 veces en la concentración de citrato, (de 0.2 a 4.7 mM), 14 veces en la de malato (de 2.1 a 30.2 mM) y 2 veces la de succinato (de 3.5 a 7 mM), respectivamente, con respecto a los valores encontrados en testigos. Es probable que este aumento en las concentraciones de ácidos orgánicos en las hojas se por la exportación de estos ácidos desde las raíces hacia las hojas, la cual son balanceados con el aumento en la concentraciones de cationes divalentes como Ca y Mg (López-Millán, 2001). El 98 % del contenido de aniones orgánicos en las hojas están como oxalato, citrato, malato y succinato, estos aumentan sus concentraciones bajo deficiencia de hierro, así 26 mismo las concentraciones de azucares disminuyen (López-Millán, 2000 (b) y 2001). Sin embargo, Abadía et al, (2002 (b)) indican que la acumulación de ácidos orgánicos se presenta por un aumento en la glicólisis, incrementándose la concentración de PEP debido a una mayor actividad de PEPC, originando una alta concentración de ácidos orgánicos y aumentando la fijación no fotosintética de CO 2 por efecto de la deficiencia de Fe, lo que ayuda a movilizar el Fe de la rizósfera y transportarlo dentro de la planta (Pich et al, 1994; Jones et al, 1996). También se observa una mayor actividad de genes que codifican transportadores de metales, como de Fe2+(Von Wirén, 1994), son responsables de la absorción del hierro en el interior de las raíces (Eide et al, 1996; Vert et al, 2001; Waters B. M, 2002). Otras proteínas transportadoras mencionadas no relacionadas a los IRT, designados como AtNramp1, 3 y 4, han sido implicadas in la absorción del Fe 2+ por las células epidérmicas de la raíz. AtNramp1, 3 y 4 son capaces de tomar el hierro y su expresión en plantas es inducida por deficiencia de hierro (Curie et el, 2000; Thomine et al, 2000). El gen FRO2 codifica un Fe3+-Quelato-reductasas, requerido para le generación de sustratos para los transportadores de Fe2+. Este gen se expresa solo en raíces y sus niveles de RNA mensajero son inducidos bajo deficiencia de hierro, mutaciones que propician que el FRO2 pierda funciones resulta en reducción de la actividad de Fe3+-Quelato-reductasas, clorosis y pobre desarrollo bajo poca disponibilidad de hierro (Waters et al, 2002). 4.5. ASPERSIONES FOLIARES COMO ESTRATEGIA DE CORRECCIÓN DE CLOROSIS FÉRRICA La absorción de agua y nutrientes por la hojas usualmente no es muy eficiente y no reviste mayor importancia en plantas que se desarrollan en ambientes naturales, sin embargo la aspersión foliar puede ser una manera complementaria de proveer nutrientes durante una fase critica o de restricción en el suministro de los nutrientes, además es efectivo para aliviar los efectos de fijación de nutrientes en el suelo así como 27 dificultades en la adquisición de estos debido a condiciones particulares del suelo como, por ejemplo, la inactivación del Fe en suelos calcáreos (Mengel, 2002). 4.5.1. Ácido Sulfúrico El objetivo de la aplicación de ácido sulfúrico al follaje es la resolubilización del hierro que ha sido inmovilizado dentro del apoplasto por efecto del incremento del pH (Tagliavini et al., 1995 y 2000; Rombolà et al., 2000), impactando en el aumento de la actividad de clorofilas. Posiblemente debido a una mayor actividad del Fe al disminuir el pH del apoplasto (Mengel, 1995) y/o por efecto del azufre en la biosíntesis de clorofila (Imsande, 1998). Todo esto sin impactar en la concentración del Fe total. Aplicaciones de ácido sulfúrico incrementan la concentración de Fe en hojas de naranja, con respecto del testigo (Pestana et al, 2002; Pestana et al, 2001). Esta práctica fue efectiva en la corrección de clorosis férrica en chícharo de jardín (Sahu, 1987) pero no siempre es así, puesto que aplicaciones de otros ácidos orgánicos han tenido mejores resultados con el uso de ácidos orgánicos como el ácido cítrico (Tagliavini et al. , 1995; Tagliavini et al, 2000), además de que solo es efectiva si se tiene suficiente Fe inmovilizado en el apoplasto (Mengel, 2002) teniendo un reverdecimiento de las hojas, sin embargo los parámetros de calidad del producto, como el contenido de azucares totales y acidez titulable en cítricos, no se ve mejorada con las aplicaciones de H2SO4 (Pestana et al, 2001). Tagliavini et al. (2000) menciona que las respuestas a las aspersiones foliares de ácidos pueden variar entre especies incluso entre variedades, debido a diferencias en la penetración en la cutícula de las hojas de las distintas especies (Weinbaum, 1988). 4.5.2. Quelatos de Hierro Los quelatos de iones metálicos como el hierro son aplicados normalmente al suelo, siendo en otros casos, aplicados al follaje mediante aspersiones. La desventaja en la 28 utilización de quelatos es su alto costo, pero en general, son efectivos en la corrección de clorosis férrica en las hojas. El Fe-EDDHA en aspersiones foliares fue efectivo en la corrección de clorosis en fresa (Zaiter, 1993) y cítricos (García-Laviña, 2002; Pestana et al, 2001), en estos últimos tuvieron los mejores resultados en la corrección de la clorosis, sin embargo en otros experimentos no fueron tan efectivos, por ejemplo, el Fe3+-EDDHA y el Fe2+-DTPA en durazno (Reed et al, 1988). Probablemente debido a que el Fe en los quelatos tiene carga trivalente debiendo ser reducida previa absorción en el citosol. Ésta reducción podría ser restringida si se tiene un pH alto en el apoplasto, situación que puede ocurrir en platas que se nutren exclusivamente de N en forma NO 3(Mengel, 2002). Por otro lado, productos como EDTA, DTPA y LPCA mostraron incrementos en el contenido de hierro, sin que el tipo de quelato haya influenciado en la calidad del producto (Piaggesi et al, 2002) Álvarez-Fernández et al (2004), mencionan que la aplicación foliar de quelatos de hierro en pera no proveen alguna ventaja sobre el bajo costo y beneficios ambientales que sí los tiene el uso de sales inorgánicas de Fe (FeSO4). 4.5.3. Sulfato Ferroso El sulfato ferroso es una sal muy usada en la corrección de clorosis férrica, tiene la ventaja de ser mas barata que los quelatos y generalmente tiene efectos similares a estos, incrementando las concentraciones de clorofila en las hojas, por ejemplo, en cacahuate el FeSO4 fue igual de efectivo que el Fe-EDTA y el Fe-citrato (Singh y Dayal, 1992). Sin embargo Reed et al, (1988) indican que el FeSO4 fue poco efectivo en la corrección de la clorosis férrica en uva y no fue efectivo en pera. A diferencia del ácido sulfúrico, la aplicación del FeSO 4 impacta no solo en el contenido de hierro total, activo y actividad de clorofilas sino que además mejora la calidad de la producción aumentando la concentración de azucares, acidez titulable y adelantando la floración en cítricos (García-Laviña, 2002; Pestana et al, 2001 y 2002). 29 En el FeSO4 el hierro esta en forma divalente por lo que puede atravesar el plasmalema directamente, por lo que tienen una buena disponibilidad para los procesos fisiológicos (Fox y Guerinot, 1998); sin embrago, se debe tener en cuenta que en presencia de O 2 el Fe2+ puede ser rápidamente oxidado a Fe3+, inhibiendo su efecto. 4.5.4. Ácidos Orgánicos La aplicación de ácidos orgánicos para la corrección de clorosis férrica ha demostrado ser efectiva, dependiendo de factores como la severidad de la clorosis, pH, combinaciones con otros productos (Rombolà, 2002). En el caso de hojas con clorosis severa, las aplicaciones de mezclas de ácido málico, ácido cítrico y sorbitol combinados con FeSO4, resultaron en un rápido y persistente reverdecimiento, el cual se explica por la habilidad quelatante del citrato junto con el poder reductor del ácido málico y el sorbitol suministrado a las células del mesófilo. Éste efecto relativo de los ácidos orgánicos aplicados mezclados con FeSO 4, particularmente en el caso de clorosis moderada, es probable debido un incremento en la disponibilidad del Fe hacia las ferro quelato redustasas (FCR) de las hojas (Rombolà et al, 2002). Mientras que en hojas moderadamente cloróticas el mejor efecto de reverdecimiento fue inducido por las aplicaciones de FeSO4 (Rombolà, 2002). Por otro lado, la aplicación de ácido sulfúrico y ácido cítrico fueron efectivos en el reverdecimiento en hojas Fe–deficientes de kiwi (Tagliavini et al., 1995). Cabe mencionar que la aplicaciones foliares de FeSO4 combinado con ácidos orgánicos y sorbitol causaron un mayor reverdecimiento que aplicaciones de Fe-EDTA, un quelato sintético ampliamente utilizado para aliviar la clorosis en condiciones de campo (Tagliavini y Rombolà, 2001). 30 4.6.USO DE EXTRACTO DE NOPAL EN LA CORRECCIÓN DE CLOROSIS FÉRRICA En el proceso metabólico de las cactáceas se forman diversos ácidos orgánicos, como el ácido oxálico y málico (Borrego y Burgos, 1986), acumulándose en grandes cantidades en las vacuolas de las plantas CAM (180 – 1700 mg kg-1) y citrato (475 – 4560 mg kg-1) (Azcon-Bieto y Talon, 1993). El aporte de éstos ácidos debe ser benéfico para la absorción del Fe. Considerando el poder reductor de los ácido orgánicos se ha planteado la posibilidad de controlar la clorosis férrica mediante aspersiones de extractos celulares al follaje de plantas afectadas por clorosis férricas (Maldonado et al, 2002). Al respecto, Maldonado et al (2000) haciendo aplicaciones foliares de extracto de nopal (Opuntia spp. Cetácea) tuvieron efecto en la respuesta a la absorción de Fe en hojas de limón mexicano. Por otro lado, Moreno (2004) aplicando el extracto de nopal en las raíces de limón mexicano en un sistema hidropónico cerrado, encontró que el extracto de nopal mejoro la nutrición con Fe en un medio deficiente de Hierro en la solución nutritiva. Ambos trabajos mostraron que el uso de extractos de nopal puede ser una alternativa viable en la corrección de la clorosis férrica. 4.7. EL CULTIVO DEL JITOMATE (Lycopersicum scolentum Mill) 4.7.1. Aspectos Agronómicos La planta de jitomate (Lycopersicum sculentum Mill.) pertenece a la familia de las solanáceas. Por cuya morfología es clasificada dentro del grupo de plantas según su respuesta a la deficiencia del hierro, con la estrategia I, siendo su desarrollo radical a partir de una raíz pivotante de origen seminal que crece hasta alcanzar 60 cm de profundidad, produciéndose raíces adventicias y ramificaciones secundarias (Picken et a, 1986), característica de plantas dicotiledóneas. 31 El cultivo del jitomate necesita temperaturas sensiblemente elevadas para asegurar su ciclo vegetativo y llevar sus frutos a una maduración completa, necesitando por término medio temperaturas diurnas entre 23 y 24 °C y temperaturas nocturnas de 14 °C en promedio, siendo muy sensible a heladas (Rodríguez, 1984). En cuanto a la humedad ambiental Ridriguez et al, (1984) mencionan que son preferibles humedades no superiores a 50% las cuales no deben bajar de 40 % de lo contrario se provocan deficiencia de calcio. 4.7.2. Aspectos Nutrimentales El intervalo promedio normal y los niveles de deficiencia para los elementos esenciales en hojas de jitomate se presentan en el Cuadro 1. Cuadro 1. Intervalo promedio normal y nivel de deficiencia de los elementos esenciales (Maynard y Hochmutt, 1991). Elemento Nitrógeno Fósforo Potasio Calcio Magnesio Azufre Hierro Manganeso Zinc Cobre Boro Rango normal Deficiencia -----------------------%----------------------2.0 – 3.0 < 2.0 0.2 – 0.4 < 0.2 1.5 – 2.5 < 2.2 1.0 – 2.0 < 1.0 0.25 – 0.5 < 0.25 0.3 – 0.6 < 0.3 -------------------mg kg-1------------------40 – 100 <40 30 – 100 <30 20 – 40 <20 5.0 – 10 <5.0 20 – 40 <20 32 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1. DESARROLLO EXPERIMENTAL El experimento se realizó en condiciones de invernadero, donde plantas de jitomate de 28 días de edad fueron transplantadas en macetas con 3 kg de suelo calcáreo, de pHH2O = 8.4. bajo un diseño completamente al azar. Las plantas se desarrollaron durante seis semanas después del transplante hasta que mostraron síntomas de clorosis férrica. Después se realizaron cinco aplicaciones de los tratamientos. 5.2. EXTRACTO DE NOPAL. En la preparación del extracto se utilizó nopal variedad Jade (Opuntia ficus-indica). El extracto fue preparado de cladodios cortados a las 4:00 a.m. y mantenidos en oscuridad. La cutícula fue desprendida y la pulpa fue cortada en pequeños trozos que se molieron a razón de 50 g en 200 mL de agua destilada. El extracto se mantuvo refrigerado y posteriormente se utilizó para preparar la solución que se aplicaría a las plantas. La composición nutrimental del extracto de nopal se muestra en el Cuadro 2. Cuadro 2. Composición química del extracto de nopal (Maldonado, 2002). Nopal. N P K Ca Mg Fe Mn Zn Cu Ac. málico mg L-1 Con espina. 24 17 470 27 61 2.16 0.36 1.45 0.18 2200 Sin espina. 23 23 434 34 77 1.83 0.35 1.37 0.29 1300 33 5.3. TRATAMIENTOS. Los tratamientos fueron preparados con base a los productos siguientes: a). ácido sulfúrico (H2SO4, 0.94 g cm-3), b). Sulfato ferroso (FeSO4, 21 % Fe), c). Quelato de hierro (Fe – EDTA, 12.5 % Fe), d). Extracto de nopal e). Sulfato ferroso activado (FeSO4 + ácidos húmicos, 20% Fe). Los tratamientos que incluyeron FeSO4 y FeSO4 activado se prepararon equiparando las dosis de Fe de acuerdo a la concentración en cada producto, manteniendo en 2 mg de Fe L-1. Las cantidad de productos por litro utilizadas en la preparación de los tratamientos se muestran en el Cuadro 3. Cuadro 3. Productos y dosis utilizados en la preparación de los tratamientos. Trat. Extracto de Nopal (mL/L). FeSO4 FeSO4 7H2O (g/L). Activado (g/L). H2SO4 Fe – EDTA (mmol/L) (g/L). Ex 80 ------------ ------------ ------------ ------------ SF ------------ 10. ------------ ------------ ------------ SFA ------------ ------------ 10.5 ------------ ------------ Q ------------ ------------ ------------ ------------ 15.9 AcS ------------ ------------ ------------ 0.5 ------------ SF + Ex 80 10. ------------ ------------ ------------ AcS + Ex 80 ------------ ------------ 0.5 ------------ ------------ ------------ ------------ ------------ ------------ T Ex=Extracto de nopal; SF=Sulfato Ferroso; SFA=sulfato ferrosos activado; Q=Quelato de Hierro; AcS=Ácido sulfúrico; SF+Ex = sulfato ferroso más extracto; AcS+Ex= Ácido sulfúrico mas extracto; T = Testigo. Como ya se mencionó, se hicieron cinco aplicaciones, en cada una se asperjaron 100 mL de cada tratamiento en 8 plantas de jitomate, que fueron las repeticiones. Los tratamientos se aplicaron mediante un aspesor manual adicionándoles adherentes y surfactantes para promover una mejor penetración de los productos en las hojas. Las aplicaciones se realizaron alrededor de la 8:00 am, a intervalos de 8 días. 34 5.4. VARIABLES EVALUADAS. 5.4.1. Hierro Activo Al final del experimento se determinó hierro activo (Fe 2+) en las dos primeras hojas completamente desarrolladas (hojas nuevas) y en la tercer y cuarta hoja (hojas viejas), mediante el procedimiento descrito por Katyal y Sharma (1980). 5.4.2. Concentración Nutrimental La concentración nutrimental se midió en las hojas viejas, limpias y sin daños físicos, químicos o biológicos. Las hojas se colocaron en bolsas de plástico y se mantuvieron en una hielera portátil para su conservación y traslado al laboratorio, donde se realizó su preparación y análisis. Cada muestra se lavó de acuerdo al procedimiento propuesto por Chapman (1960), y se secó a 70o C durante 48 horas en estufa con circulación forzada de aire, posteriormente se molió hasta que el material pasara por malla 20 en un molino de acero inoxidable (Etchevers, 1988). La digestión del material se realizó con H2SO4 + H2O2 y se calentó a 203 o C. El nitrógeno total fue evaluado en destilación por arrastre de vapor (Bremer, 1965) adaptado para análisis de plantas, los NO3¯ fueron determinados por el método de arrastre de vapor modificado con ácido salicílico, y mediante la diferencia de estos dos de obtuvo el nitrógeno orgánico (N-org). El fósforo se determino con el método del molibdo-vanadato. El boro por el método con azometina-h, modificado para la determinación del boro en el extracto de material vegetal (DOF, 2002). Los sulfatos fueron determinados mediante el método del cloruro de bario (Araguez R, 1986). 35 5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Las variables Fe2+ y composición del tejido foliar fueron sometidos a una prueba de comparación de medias (TUKEY = 5%), mediante el Statistic Analysis System, bajo un diseño completamente al azar. 5.6. BALANCE IÓNICO Para medir el balance iónico, los resultados de las concentraciones nutrimentales fueron expresados en miliequivalentes por cada 100 g de materia seca (meq 100 g-1), siguiendo el método propuesto por Van Egmond y Aktas (1977). Siendo que el K, Ca y Mg están principalmente presente como iones y la cantidad de cargas positivas de elementos menores y cationes orgánicos son relativamente pequeños. Por lo que la cantidad total de cargas positivas, C, es aproximadamente igual a la suma de los equivalentes K+ + Ca2+ + Mg2+. Mientras que la suma de las cargas negativas están dadas por los aniones inorgánicos (NO 3-, H2PO4- y SO4- ) y los aniones orgánicos como el citrato, malato y oxalato, por lo que la suma de carga negativa inorgánica, A, es aproximadamente equivalente a la suma NO 3- + H2PO4- + SO4-. Representado esto los equivalentes de aniones inorgánicos. El nitrógeno orgánico es determinado sustrayendo el nitrato del nitrógeno total. Ya con ésta información se tiene que para el cálculo de la excreción de iones H+ se hace de la siguiente manera: Absorción de aniones + excreción de H+ = absorciones de cationes. (NO3¯ + N-org + H2PO4¯ + SO42- + S-org) + Excreción de H+ = (K+ + Ca2+ + Mg2+). Se tiene: A + 1.054(N-org) + excreción de H+ = C. La excreción de iones H+ = (C – A) – 1.054(N-org). Cuando no se cuenta con el valor de S-org, se tiene: Excreción de iones H+ = (C – A) – (N-org). 36 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1. CONCENTRACIÓN DE NITRÓGENO Las concentraciones de nitratos (NO3¯) y nitrógeno orgánico (N-org) en las hojas de jitomate, se presentan en la Figura 4. 4.0 3.5 Nitrógeno (%) 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos NO3¯ N- org Figura 4. Concentración de NO3¯ y N orgánico (N-org) de acuerdo a los distintos tratamientos. Los diferentes tratamientos no afectaron significativamente las concentraciones de NO 3¯ y N-org (Anexo 1). Sin embargo la adición de Fe, extracto de nopal y Ácido sulfúrico favoreció el aumento en la concentración de nitrógeno, con respecto al testigo. Se puede observar que los tratamientos de extracto, quelato de hierro y sulfato ferroso fueron los más altos en NO3¯, mientras que la respuesta a la aplicación de ácido sulfúrico , ácido sulfúrico más extracto y el testigo fueron los más bajos en el contenido de NO3-. 37 Los tratamientos que promovieron concentraciones más altas fueron de N-orgánico fueron sulfato ferroso más extracto y quelato de hierro. El Cuadro 4, presenta mayor información acerca de las proporciones relativas de NO3¯ y nitrógeno orgánico (N-org) respecto del total. Los tratamientos con quelato, extracto, sulfato ferroso y sulfato ferroso más extracto promovieron la absorción de nitrógeno total. Al aplicar quelato extracto y sulfato ferroso se presentaron las mayores proporciones relativas de NO 3¯:Norg. Estos resultados indican que dichos tratamientos favorecen la absorción de nitrógeno, pero no su transformación a nitrógeno orgánico. Por otro lado, la respuesta a la aplicación de extracto combinado con ácido sulfúrico y sulfato ferroso (AcS+Ex y SF+Ex) disminuyo la relación la relación NO3¯:N-org, comparados con sus respectivos tratamientos sin extracto (SF y AcS) señalando que el extracto de nopal favoreció la conversión de NO3¯ a N-org. El testigo presentó los valores más contrastantes al tener un alto valor de N-org y el menor de NO3¯, pero también la menor cantidad de nitrógeno total. Cuadro 4. Nitrógeno total, relaciones NO3¯:N-org y contenido relativo de NO3¯ y N-org. Trat. NTot. % NO3¯:Norg % NO3¯ % Norg AcS 4.361 0.512 33.85 66.15 AcS+Ex 3.739 0.420 29.56 70.44 Ex 5.352 0.997 49.91 50.09 Q 6.172 0.833 45.45 54.55 SF 4.968 0.897 47.30 52.70 SF+Ex 5.199 0.538 34.97 65.03 SFA 4.591 0.631 38.68 61.32 T 3.127 0.376 27.33 72.67 AcS = Ácido sulfúrico, AcS+Ex = Ácido sulfúrico mas extracto de nopal, Ex = Extracto de nopal, Q = Quelato de hierro, SF = sulfato ferroso, SF+Ex = sulfato ferroso mas extracto de nopal, SFA = sulfato ferroso mas ácidos húmicos. Según Maynard y Hochmuth (1991) el contenido de nitrógeno total en las hojas estuvieron por arriba del límite de deficiencia (<3 % N), y solamente al aplicar 38 Fe – EDTA, extracto de nopal y FeSO4 + extracto se presentaron concentraciones altas (> 5 % N), mientras que la respuesta a los tratamientos con ácido sulfúrico, ácido sulfúrico más extracto, sulfato ferroso, sulfato ferroso activado y el testigo mantuvieron concentraciones adecuadas de nitrógeno total. Según Zaharieva y Römheld (1991), el nitrógeno es uno de los factores que pueden alterar el balance iónico de las plantas y por lo tanto contribuir a la eficiencia en la utilización del hierro y viceversa. 39 6.2. CONCENTRACIÓN DE FÓSFORO En la Figura 5 se observa que los tratamientos al contenido de fósforo mostraron niveles excesivos, arriba del límite adecuado (0.4 %) (Maynard y Hochmuth, 1991). Siendo el testigo, el ácido sulfúrico más extracto y el extracto los que promovieron menores concentraciones de fósforo, el resto de los tratamientos se observaron valores muy parecidos entre ellos (0.70 a 0.79). Al aplicar ácido sulfúrico más extracto (AcS+Ex) se redujo las concentración de fósforo comparado con su correspondiente tratamiento sin extracto (AcS). 0.9 Fósforo (%) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamiento Figura 5. Concentración de Fósforo en hojas de jitomate de acuerdo a los diferentes tratamientos. Tekin (1998), Rombolà (2000) y Bavaresco (2003) observaron, en diversas experimentos, que las estrategias para la corrección de clorosis férrica tienen efecto sobre el contenido de fósforo con respecto al testigo, pero no mostraron diferencias entre los tratamientos, manteniéndose dentro del rango 0.2-0.4%. Así mismo, Schachtman et al (1998) indican que el transporte del fósforo en el interior de la planta está controlado por diversos transportadores, los cuales incrementan su actividad bajo deficiencia de fósforo, pero no por la falta de Fe. Esto puede indicar que el aumento del estatus nutrimental de Fe pudo incrementar las necesidades de fósforo en las plantas. 40 6.3. CONCENTRACIÓN NUTRIMENTAL DE POTASIO, CALCIO Y MAGNESIO El efecto de los diferentes tratamientos sobre el contenido de potasio se observa en la Figura 6, los cuales afectaron significativamente (Anexo 1) el contenido de potasio, presentando mayores respuestas cuando se aplico quelato (Q) y el ácido sulfúrico (AcS). Los tratamientos que mostraron menor respuesta al contenido de potasio, calcio y magnesio fueron el extracto (Ex) y el testigo. El tratamiento de ácido sulfúrico más extracto de nopal tuvo menores valores en el contenido de calcio, potasio y magnesio que su respectivo tratamiento sin extracto (AcS). El contenido de potasio no mostró gran variación a la aplicación de sulfato ferroso, sulfato ferroso más ácidos húmicos y sulfato ferroso más extracto, manteniéndose dentro del rango adecuado (1.5 –2.5 %), según valores de referencia de Maynard y Hochmuth (1991). Así mismo, la aplicación de quelato se promovió que contenido excesivo de potasio (> 2.5 %). 3.5 3.0 Potasio (%) 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos Figura 6. Efecto de los tratamientos en el contenido de potasio en hojas de jitomate. 41 Estos resultados fueron similares a los obtenidos por Pestana (2002) en donde encontró concentraciones de potasio más altas cuando se aplicó sulfato ferroso y quelato de hierro, en árboles de naranja, respecto a los obtenidos con la aplicación de ácido sulfúrico en la misma concentración usada en el presente trabajo. En la Figura 7 se observa el efecto de los distintos tratamientos en el contenido de calcio en las hojas de jitomate, presentando diferencias significativas entre el efecto de los distintos tratamientos. Las aplicaciones de ácido sulfúrico y quelato presentaron los mayores contenidos de calcio, mientras que los tratamientos donde se aplico sulfato ferroso fueron los tres más bajos, incluso más bajos que el testigo. 5.00 Calcio (%) 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos Figura 7. Efecto de los tratamientos en el contenido de calcio en hojas de jitomate. 42 En cuanto al magnesio, como se observa en la Figura 8, no hubo diferencia significativa entre las respuestas a los diferentes tratamientos, en promedio, la concentración de magnesio se mantuvo en valores excesivos por arriba de 0.5 %. 0.70 0.60 Magnesio (%) 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos Figura 8. Efecto de los tratamientos en el contenido de magnesio en hojas de jitomate. Los contenidos de calcio (>2.0 %) y magnesio (>0.25 %) tuvieron valores considerados excesivos (Maynard y Hochmuth, 1991) en todos los tratamientos. Según Darrah et al (2003), el NO3¯ es la forma exclusiva de nitrógeno en la solución del suelo debido al incremento de la nitrificación. Esto favorece altas concentraciones de Ca y Mg, debido a que actúan como cationes acompañantes (Jaeger, 2000). Así mismo, Hamzé (1980) menciona que los contenidos de K y Ca en el tejido vegetal se incrementan proporcionalmente al contenido de CaCO3 en el suelo. Bajo deficiencia de hierro, se estimula la absorción de cationes (Van Egmond et al, 1977). Las plantas absorben mayores cantidades de potasio calcio y magnesio (LópezMillán, 2000 (b)), como respuesta al aumento de aniones orgánicos (malato y citrato), resultado de una mayor extrusión de protones (Ohwaki, 1997). Esto indica que bajo una 43 deficiente nutrición de hierro, los contenidos de K, Ca y Mg son mayores que en aquellos tratamientos donde se tuvo una mejor nutrición de hierro, indicando en consecuencia un desbalance iónico. Sin embargo los resultados de presente trabajo mostraron que los contenidos de potasio y magnesio no aumentaron con el bajo contenido de Fe2+. Ya que los tratamientos donde se aplicó hierro (SF, SFA, SFA+Ex y Q) presentaron niveles adecuados de potasio y magnesio. Estos mismos tratamientos fueron los que tuvieron mayor respuesta a los contenidos de hierro total y de Fe2+ en las hojas (Figura 9 y Figura 10). Así mismo, exceptuando las plantas asperjadas con quelato, los contenidos de calcio fueron mayores en las plantas que mostraron bajas concentraciones de Fe 2+. 44 6.4. CONCENTRACIÓN Y ESTADO NUTRIMENTAL DEL HIERRO Los tratamientos que contenían hierro mostraron (Figura 9 y Anexo 2) una mayor respuesta al contenido en hierro total en el tejido, probablemente debido a que el hierro en forma divalente puede atravesar el plasmalema más fácilmente, esto también explica la efectividad del sulfato ferrosos sobre el quelato, el cual contiene hierro en forma Fe 3+ y debe ser reducido antes de ser absorbido (Mengel, 2002). El tratamiento con ácido sulfúrico fue el menos efectivo, y la adición del extracto de nopal (AcS+Ex), no mejoró el efecto. Resultados similares fueron obtenidos por García-Laviña, et al, (2002) en perales, Pestana (2001) en cítricos y Sing and Dayal (1992) en cacahuate, donde aplicaciones de sulfato ferroso y quelatos de hierro incrementaron el contenido de hierro en hojas. Así mismo, Tagliavini et al. (2000) indican que aplicaciones foliares de sulfato ferroso y quelato de hierro tuvieron un mayor efecto en el contenido de hierro en hojas de cítricos que aplicaciones con ácido sulfúrico (0.5 mmol). 250 Fe total (mg kg -1) 200 150 100 50 0 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos Figura 9. Efecto de los tratamientos en el contenido hierro total en hojas viejas de jitomate. 45 Las mayores concentraciones de hierro activo en hojas viejas (Figura 10) fueron presentadas por sulfato ferroso más ácidos húmicos, sulfato ferroso, quelato y sulfato ferroso más extracto, en orden de importancia, mientras que el ácido sulfúrico, ácido sulfúrico más extracto, extracto y el testigo tuvieron poco efecto en la concentración de Fe2+ (<20 ppm). El contenido de Fe2+ correlaciona con la concentración de clorofila (Soleen, 2002; Montás-Ramírez, 2003). Esto puede indicar el estado nutricional de hierro dentro de la planta, el cual se vió mejorado con la aplicación de sulfato ferroso más ácidos húmicos, sulfato ferroso, quelato y sulfato ferroso más extracto. Se considera que el ión Fe2+ es la forma de hierro activo dentro de la planta, utilizado para los diferentes procesos metabólicos en los que está involucrado dentro de las células vegetales (Nikolic y Römheld, 1999; Stephan y Scholz, 1993). 120 Fe2+ (mg kg-1) 100 80 60 40 20 0 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos Figura 10. Efecto de los tratamientos en el contenido de Fe activo en hojas viejas en las hojas de jitomate 46 El hierro activo en hojas jóvenes (Figura 11) en todos los tratamientos presentó valores inferiores a los obtenidos en las hojas viejas, esto se pudo deber a una menor capacidad de reducción del Fe3+ en las hojas (De la Guardia y Alcántara, 1996), y dichas concentraciones no variaron significativamente entre tratamientos. Rombolà (2002) ha indicado que la aplicación de ácidos orgánicos combinados con FeSO 4 han tenido un incremento relativo en la disponibilidad del hierro al ser reducido por las FC-R en las hojas, debido presumiblemente a la habilidad quelatante del citrato junto con el poder reductor suministrado a las células del mesófilo, dado por el ácido málico y el sorbitol (Rombolà, 2002). Sin embargo, esto no se observó en este estudio. Por otro lado, Kosegarten et al, (1998) mencionan que el transporte a larga distancia de Fe no es eficiente, lo cual significa que la translocación de hierro desde hojas asperjadas hacia los meristemos fue muy restringido. 20 18 (Fe2+ mg kg-1) 16 14 12 10 8 6 4 2 0 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos Figura 11. Efecto de los tratamientos en el contenido de Fe activo en hojas jóvenes en las hojas de jitomate. 47 6.5. CONCENTRACIÓN DE MANGANESO, ZINC, COBRE, BORO Y SULFATOS Los diferentes tratamientos afectaron significativamente las concentraciones de manganeso, zinc, cobre y boro (Anexo 3). Las concentraciones de manganeso estuvieron dentro de un rango adecuado (30–100 mg kg-1) (Hochmuth, 1991), donde las mayores concentraciones de manganeso (750 ppm) se presentaron cuando se aplicó ácido sulfúrico, ácido sulfúrico más extracto, extracto y en el testigo. El sulfato ferroso, sulfato ferroso activado, sulfato ferroso más extracto y el quelato generaron concentraciones muy inferiores (40 – 49 mg kg-1). 100 90 Mn (mg kg-1) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos Figura 12. Efecto de los tratamientos en el contenido manganeso en las hojas de jitomate. En los presentes resultados se muestra que los tratamientos que no incluyeron hierro indujeron altas concentraciones de manganeso en las hojas(Figura 12), lo que correlaciona con bajas concentraciones de hierro (Figura 9 y Figura 10). Zaharieva y Römheld, (1991) muestran que hojas de cacahuate con mejor nutrición de hierro mostraron menores concentraciones de manganeso en hojas verdes que en hojas 48 cloróticas. Estos resultados se obtuvieron debido al antagonismo metabólico existente entre el hierro y el manganeso, los cuales compiten por las mismas posiciones en determinadas enzimas (Peroxidasa). El contenido de cobre en las hojas de jitomate mostró diferencias significativas (Anexo 3). Se observa que cuando se aplico ácido sulfúrico, ácido sulfúrico más extracto, extracto, sulfato ferroso, sulfato ferroso más extracto sulfato ferroso más ácidos húmicos y el testigo se mantuvieron a bajas concentraciones, dentro del rango 6–12 mg kg-1. A excepción de quelato, el cual incrementó significativamente la concentración de cobre (25 mg kg-1) en las hojas. Las concentraciones de cobre fueron clasificados como adecuados, pero el quelato fue por mucho el mejor tratamiento en la nutrición de éste elemento (Veliksar, 2002). El ácido sulfúrico tuvo el segundo valor mas alto dentro de los tratamientos mientras que entre el resto de los tratamientos no hubo diferencias significativas, la nutrición con hierro no afectó la concentración de cobre en las hojas. 35 30 Cu (mg kg-1) 25 20 15 10 5 0 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos Figura 13. Efecto de los tratamientos en el contenido de cobre en las hojas de jitomate. 49 En cuanto al boro mostrado en la Figura 14, se observó que con excepción del tratamiento sulfato ferroso más extracto que generó valores inferiores al testigo, el resto de los tratamientos no afectaron la concentración de éste nutriente, en promedio, la concentración vario de 2.6 – 3.4 mg kg-1. 4.0 3.5 B (mg kg-1) 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos Figura 14. Efecto de los tratamientos en el contenido de boro en las hojas de jitomate. Los tratamientos con quelato, sulfato ferroso, sulfato ferroso más extracto, ácido sulfúrico y sulfato ferroso incrementaron la concentración de zinc (Figura 15) en las hojas respecto del testigo. Estas concentraciones fueron superiores a 20 mg kg -1, valor considerado como deficiente (Maynard y Hochmunth, 1991). El resto de los tratamientos presentaron valores inferiores a este límite crítico. Pestaña et al (2001) también encontró que las aspersiones de sulfato ferroso incrementaron las concentración de zinc en hojas de naranja; sin embargo, Zaharieva y Römheld (1991) encontraron el efecto contrario en cacahuate. 50 Finalmente en la aplicación de ácido sulfúrico se incrementó la concentración de zinc, probablemente por un efecto en la disminución del pH del apoplasto aumentando la disponibilidad del zinc dentro de la planta. 40 35 Zn (mg kg-1) 30 25 20 15 10 5 0 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos Figura 15. Efecto de los tratamientos en el contenido de zinc en las hojas de jitomate. 51 Las concentraciones de SO4=, mostradas en la Figura 16, se incrementaron con la aplicación de ácido sulfúrico. Éste tratamiento fue el único que tuvo valores por encima del testigo, en tanto que las aplicaciones con extracto, sulfato ferroso, sulfato ferroso más extracto y sulfato ferroso activado indujeron concentraciones inferiores. GarcíaLaviña (2002) señala que el aumento en la disponibilidad de azufre dentro de la planta se atribuye a una mayor disponibilidad del hierro en el apoplasto de las hojas. El quelato fue el único tratamiento que mostró una respuesta acorde a los resultados de García-Laviña (2002). Por lo tanto esto se tiene que ver reflejado en los tratamientos donde se aplicó hierro. Sin embargo en los resultados obtenidos con ácido sulfúrico, ácido sulfúrico más extracto, extracto y el testigo mostraron una menor respuesta al contenido de hierro en las hojas. 250 SO4= (mg kg-1) 200 150 100 50 0 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos Figura 16. Efecto de los tratamientos en la absorción de SO4= en las hojas de jitomate. 52 6.6. RELACIONES NUTRIMENTALES Para tener una idea mas clara del efecto de los diferentes tratamientos planteados sobre el comportamiento nutricional en las plantas de jitomate cultivada sobre suelo calcáreo, se establecieron las relaciones nutrimentales K/Ca, P/Fe, P/Zn, K/Zn y K/Fe y se le aplicó la técnica estadística de análisis de varianza y prueba de medias. La relación K/Ca presentó diferencias significativas (Anexo 4), siendo el quelato y el sulfato ferroso más extracto los más altos, en tanto que el extracto y el testigo (T) fueron los que mostraron la relación más baja (Figura 17). De acuerdo a éstos resultados la relación K/Ca es mayor en aquellos tratamientos que tuvieron una mejor respuesta al contenido de Fe2+ (Figura 10). La concentración de potasio y el calcio aumentaron en el tejido vegetal a medida que la deficiencia de Fe se volvió más severa (López-Millán, 2001). Maldonado (2001) señala que a mayor alcalinidad en los suelos, la absorción de hierro disminuye y aumenta la absorción de potasio, lo que hace que se incremente la relación K/Ca, difiriendo de los resultados aquí obtenidos. 0.5 0.45 Relación K/Ca 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos Figura 17. Efecto de los diferentes tratamientos sobre la relación K/Ca. 53 La relación P/Fe, presentada en la Figura 18, mostró los mayores valores cuando se aplicó extracto, ácido sulfúrico y sulfato ferroso más ácidos húmicos. Así mismo, los tratamientos de ácido sulfúrico más extracto y el testigo mostraron los valores más bajos. Por otro lado, la concentración de fósforo no mostró diferencias entre los tratamientos (Figura 5), por lo que no muestra efecto antagónico entre fósforo y hierro. 30 25 P/Fe 20 15 10 5 0 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos Figura 18. Efecto de los diferentes tratamientos sobre la relación P/Fe. En la relación P/Zn (Figura 19) se observa que la aplicación de sulfato ferroso más ácidos húmicos fue la única que promovió una relación P/Fe por encima del testigo. En cambio la aplicación de quelato disminuyó dicha relación. Los tratamientos con extracto mejoraron la relación P/Zn. Altas concentraciones de fósforo provocaron una inhibición en las funciones metabólicas del zinc. Marschner (1995) menciona que la fertilización con fósforo provoca deficiencia de zinc en la planta, debido a tres factores a) Dilución en las hojas por el mayor desarrollo al aplicar fósforo. b) Inhibición en la absorción de 54 zinc por cationes de los fertilizantes de fósforo. c) Adsorción de zinc en el suelo por efecto de hidróxidos de hierro y aluminio y CaCO3. 180 160 Relación P/Zn 140 120 100 80 60 40 20 0 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos Figura 19. Efecto de los diferentes tratamientos sobre la relación P/Zn. La relación K/Zn ha sido utilizada como un indicador de la resistencia a la clorosis férrica, debido a que en plantas cloróticas la concentración de potasio se incrementa mientras que el nivel de zinc decrece, originando relaciones más altas (Belkhodja et al, 1998). En la Figura 20 se muestra que el sulfato ferroso tiene una alta relación K/Zn con respecto al testigo. Los tratamientos con ácido sulfúrico, ácido sulfúrico más extracto y extracto, tuvieron relaciones mas altas que el quelato, sulfato ferroso y sulfato ferroso más extracto, que son los tratamientos que contenían hierro. 55 1400 Relación K/Zn 1200 1000 800 600 400 200 0 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos Figura 20. Efecto de los diferentes tratamientos sobre la relación K/Zn. En cuanto a la relación K/Fe (Figura 21), tuvo los valores más bajos con la aplicación de Ex y en el testigo (T), y los mayores cuando se aplicó AcS y SFA, el AcS y SF mejoraron la relación cuando se combinó el extracto (AcS+Ex y SF+Ex). 250 Relación K/Fe 200 150 100 50 0 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamientos Figura 21. Efecto de los diferentes tratamientos sobre la relación K/Fe. 56 En la Figura 22 se observa que la relación Fe/Mn, fue mayor cuando se aplicó tratamientos con sulfato ferroso, sulfato ferroso activado y el quelato de hierro, mientras que los tratamientos con ácido sulfúrico, ácido sulfúrico más extracto y extracto, se promovieron las relaciones más bajas, esto como consecuencia de la relación inversa entre el Fe y el manganeso existente en las determinaciones nutrimentales, relacionado al antagonismo entre estos dos elementos. 4 Relación Fe/Mn 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Tratamiento Figura 22. Efecto de los diferentes tratamientos sobre la relación Fe/Mn. 57 6.7. BALANCE IÓNICO En el Cuadro 5 se presentan los resultados del contenido de cationes y aniones inorgánicos. Los datos se obtuvieron con base en el método establecido por Van Egmond y Aktas (1977) donde los iones se presentan en miliequivalentes por cada 100 g (meq 100 g-1) (Anexo 5). Cuadro 5. Contenido de cationes y aniones inorgánicos, contenido de Nitrógeno orgánico y la excreción de iones H+, calculados con base en el procedimiento de Van Egmond y Aktas (1977). Trat. AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T Cationes Aniones N-org H+ ---------------meq 100 g-1--------------326.9 32.8 160.3 133.9 300.3 24.5 146.3 129.5 290.6 49.1 148.9 92.6 330.5 53.9 187.0 89.5 291.9 45.8 145.5 100.6 256.8 37.2 187.8 31.8 284.1 40.7 156.4 87.0 282.6 19.1 126.2 137.2 AcS = Ácido sulfúrico, AcS+Ex = Ácido sulfúrico mas extracto de nopal, Ex = Extracto de nopal, Q = Quelato de hierro, SF = sulfato ferroso, SF+Ex = sulfato ferroso mas extracto de nopal, SFA = sulfato ferroso mas ácidos húmicos. La acidificación de la rizósfera es una de las respuestas de la planta a la deficiencia de hierro, que se da mediante la liberación de iones H + buscando hacer mas disponible el hierro, ya que al acidificar la rizósfera se incrementa la actividad del Fe (Marschner y Römheld, 1994) para su absorción por las raíces. En el Cuadro 5 se aprecia que las mayores cantidades de H + excretado se presentaron en los tratamientos que tuvieron una baja respuesta al contenido de hierro activo (Figura 10). Así también los tratamientos que mejoraron el contenido de hierro en las hojas de jitomate disminuyeron la excreción de iones H+, con excepción del tratamiento con sulfato ferroso, el cual mostró alta extrusión de protones, contrario a los resultados de los demás tratamientos, desbalance causado por su bajo contenido de nitrógeno orgánico con respecto a los demás tratamientos (Figura 4). 58 7. CONCLUSIONES Los tratamientos donde se aplicó hierro como sulfato ferroso, sulfato ferroso más ácidos húmicos y quelato de hierro, fuero los que mostraron mayor contenido de hierro activo. Las relaciones K/Ca y K/Zn fueron altas, resultado de un bajo contenido de hierro activo en las hojas viejas. Las mayores concentraciones de nitrógeno, potasio y magnesio se obtuvieron con el tratamiento con quelato, mientras que las más bajas fueron el testigo. El tratamiento con ácido sulfúrico presento las mayores concentraciones de fósforo, calcio y sulfatos, mientras que sulfato ferroso más extracto mostró la concentración más baja de calcio. El extracto de nopal disminuyó la extrusión de protones en las raíces de plantas de jitomate, y promovió una mayor conversión de NO3¯ a Nitrógeno orgánico; sin embargo, no promovió una mejor nutrición de total ni de Fe2+. El sulfato ferroso activado más ácidos húmicos fue el mejor tratamiento en la corrección de la clorosis férrica, al aumentar el contenido de Fe activo y disminuir la extrusión de protones, como respuesta a la deficiencia de hierro en la planta. 59 8. RECOMENDACIONES Realizar investigaciones sobre el uso de extractos de nopal en la corrección de clorosis férrica en otras especies, enfocándose sobre las dosis de extracto a aplicar, combinación de estos con productos que contengan Fe y la preparación y manejo de los extractos. Hacer estudios fisiológicos más detallados acerca de las respuestas de la planta a la aplicación de extractos de nopal. Hacer pruebas en campo para validar los resultados obtenidos en el presente trabajo concerniente al uso de todos los productos aquí tratados. 60 9. LITERATURA CITADA Abadía J., A. Álvarez-Fernández, F. Morales, M. Sanz and A. Abadía , 2002, Correction of Iron Chlorosis by Foliar Sprays, In: Proc. IS on Foliar Nutrition Eds. M. Tagliavini, M. Toselli, L. Bertschinger, P. Brown, D. Neilsen, M. Thalheimer, Acta Hort. 594: 115-121. Abadía J. (b), López-Millán A., Rombolà A. and Abadía A., 2002, Organic acids and Fe deficiency: a review. Plant and soil, 241: 75-86. 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NO3¯ Norg P K Ca Mg --------------------------------------------------%-------------------------------------------------AcS 1.476a 2.88a 0.2639ª 2.34ab 4.42 a 0.56 a AcS+Ex 1.105a 2.63a 0.1937abc 1.90 bcd 4.15 a b 0.53 a Ex 2.671a 2.68a 0.1762bc 1.65 cd 4.07 a b 0.54 a Q 2.805a 3.36a 0.2570ª 2.92a 4.16 a b 0.58 a SF 2.350a 2.61a 0.2371ab 2.28abc 3.83 a b 0.51 a SF+Ex 1.818a 3.38a 0.2334ab 2.25 bc 3.11 b 0.53 a SFA 1.776a 2.81a 0.2372ab 2.24 bc 3.68 a b 0.52 a T CV. DMS 0.855a 58.7 2.3093 2.27a 28.43 1.281 0.1533c 20.35 0.07 1.53 d 19.43 6.61 4.02 a b 19.02 11896 0.51 a 9.56 0.08 AcS = Ácido sulfúrico, AcS+Ex = Ácido sulfúrico mas extracto de nopal, Ex = Extracto de nopal, Q = Quelato de hierro, SF = sulfato ferroso, SF+Ex = sulfato ferroso más extracto de nopal, SFA = sulfato ferroso más ácidos húmicos, CV = coeficiente de variación, DMS = diferencia mínima significativa. Los datos con diferente letra son significativamente diferentes al 5% (Tukey). 73 Anexo 2. Prueba de medias delas variables hierro total (Fe Tot), hierro activo en hojas jóvenes (Fe2+ J) y hierro activo en hojas viejas (Fe2+ V). Trat. FeTot Fe2+ J Fe2+ V AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA 104.9b 14.81ª 17.87c 127.0b 124.5b 154.1ab 201.1ª 149.5ab 131.5ab 17.33ª 16.80ª 14.90ª 16.39ª 17.55ª 15.00a 15.31c 12.19c 54.81b 91.08ª 37.92bc 99.17ª T 115.8b 18.60a 15.31c CV. DMS 32.23 71.82 21.51 5.56 50.32 31.03 AcS = Ácido sulfúrico, AcS+Ex = Ácido sulfúrico mas extracto de nopal, Ex = Extracto de nopal, Q = Quelato de hierro, SF = sulfato ferroso, SF+Ex = sulfato ferroso más extracto de nopal, SFA = sulfato ferroso más ácidos húmicos, CV = coeficiente de variación, DMS = diferencia mínima significativa. Los datos con diferente letra son significativamente diferentes al 5% (Tukey). 74 Anexo 3. Prueba de medias de las concentraciones de manganeso, zinc, cobre boro y sulfatos en las hojas de jitomate. Mn Zn Cu B SO4= AcS 85.88ª 25.3bc 11.37b 81.801ª 205.55 AcS+Ex 87.35ª 19.0dc 10.55b 76.772ª 174.99 Ex 77.13ª 18.3dc 8.32b 66.938ab 150 Q 40.71b 34.6ª 24.77ª 78.672ª 186.11 SF 42.89b 26.8abc 8.32b 84.67a 111.11 SF+Ex 39.24b 28.7ab 10.23b 56.881b 150 SFA 47.25b 21.9bcd 8.08b 79.566ª 125.92 T 86.11ª 14.3d 6.42b 79.343ª 186.11 CV. DMS 19.41 19.63 23.76 8.89 46.51 8.17 15.06 0.72 ٭ ٭ Trat. AcS = Ácido sulfúrico, AcS+Ex = Ácido sulfúrico mas extracto de nopal, Ex = Extracto de nopal, Q = Quelato de hierro, SF = sulfato ferroso, SF+Ex = sulfato ferroso más extracto de nopal, SFA = sulfato ferroso más ácidos húmicos, CV = coeficiente de variación, DMS = diferencia mínima significativa. Los datos con diferente letra son significativamente diferentes al 5% (Tukey). 75 Anexo 4. Prueba de medias de las relaciones nutrimentales K/Ca, P/Fe, P/Zn, K/Zn, K/Fe y Fe/Mn en hojas de jitomate. Trat. K/Ca P/Fe P/Zn K/Zn K/Fe Fe/Mn AcS 0.2832abc 17.72a 110.79ª 792.38ª 118.81a 1.21c AcS+Ex 0.2382ab 10.25b 108.73ª 857.32ª 079.78ab 1.17c Ex 0.2229c 08.43b 105.46ª 799.86ª 063.53b 1.16c Q 0.3960ª 11.88ab 79.96ª 709.49ª 104.48ab 2.45ab SF 0.3183abc 10.04b 93.92ª 719.56ª 077.82ab 3.24ª SF+Ex 0.3756ab 10.62ab 87.32ª 680.24ª 079.96ab 1.95bc SFA 0.3180abc 15.01ab 138.05ª 999.45ª 111.20ª 3.25ª T CV. DMS 0.1971c 32.33 0.15 08.56b 38.93 7.34 119.26a 35.86 60.19 926.44a 30.79 397.4 067.40b 29.6 42.45 1.18c 63.95 0.9 AcS = Ácido sulfúrico, AcS+Ex = Ácido sulfúrico mas extracto de nopal, Ex = Extracto de nopal, Q = Quelato de hierro, SF = sulfato ferroso, SF+Ex = sulfato ferroso más extracto de nopal, SFA = sulfato ferroso más ácidos húmicos, CV = coeficiente de variación, DMS = diferencia mínima significativa. Los datos con diferente letra son significativamente diferentes al 5% (Tukey). 76 Anexo 5. Contenido de iones y aniones inorgánicos y nitrógeno orgánico en las hojas del jitomate, datos utilizados para el calculo de la excreción de iones H+ propuesto por Van Edmond y Aktas. Trat. NO3- N-org H2PO4- AcS AcS+Ex Ex Q SF SF+Ex SFA T 23.8 17.8 43.1 45.2 37.9 29.3 32.7 13.8 160.3 146.3 148.9 187.0 145.5 187.8 156.4 126.2 8.5 6.3 5.7 8.3 7.7 7.6 7.7 5.0 K+ meq 100g-1 59.9 48.7 42.3 74.9 58.4 57.8 57.4 39.1 Ca2+ Mg2+ SO42- 220.9 207.3 203.1 207.6 191.1 155.2 183.7 200.7 46.1 44.3 45.2 48.0 42.4 43.8 43.0 42.7 0.43 0.36 0.31 0.39 0.23 0.31 0.26 0.39 AcS = Ácido sulfúrico, AcS+Ex = Ácido sulfúrico mas extracto de nopal, Ex = Extracto de nopal, Q = Quelato de hierro, SF = sulfato ferroso, SF+Ex = sulfato ferroso más extracto de nopal, SFA = sulfato ferroso más ácidos húmicos. 77 78
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