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Biotechnology
PO-01 Análisis del estrés oxidativo y de la activación de caspasa-9
por citometría de flujo, en células HeLa tratadas con antitumorales
Roberto Pariente(1,2), Javier Espino(1,2), Pilar Torralbo Jiménez(1),
Rosa Carrillo del Cacho(1), Idoia Haut Antolín(1), Alberto Álvarez Barrientos(1)
Servicio de Técnicas Aplicadas a las Biociencias. (2)Departamento de Fisiología
Animal. Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura, Badajoz.
(1)
El proceso de apoptosis de muerte celular se puede activar canónicamente, por dos vías, la extrínseca a través de receptor y la intrínseca, que implica la pérdida del potencial de membrana mitocondrial, la salida del
citocromo c y la formación del apoptosoma con Apaf-1 y dATP.
El apoptosoma activa la caspasa 9 y se desencadena el proceso de activación de enzimas que lleva a la
rotura del ADN por la endonucleasa inespecífica. La pérdida del potencial de membrana mitocondrial y la
consiguiente activación de la apoptosis, suele venir precedida por un aumento del estrés oxidativo celular.
En el caso de tumores, la inducción del estrés oxidativo mediante el uso de moléculas específicas, es el
mecanismo preponderante en el desencadenamiento de la muerte celular. Por ello, es una necesidad el desarrollo de técnicas que estudien el modo de acción de los antitumorales de forma rápida y precisa. Pare ello
hemos desarrollado un protocolo por citometría de flujo utilizando el MACSQuant VYB como plataforma. El
MACSQuant VYB está equipado con un láser amarillo (561nm) que permite excitar perfectamente fluorocromos como la ficoeritrina o el rojo Texas. De esta forma, utilizamos el diacetato de dihidro-diclorofluoresceína
(DCFH) para analizar el estrés oxidativo inducido por el antitumoral, que se excita a 488nm y emite a 525 nm.
Un ligando de la caspasa 9 activada conjugado a sulforodamina.
La sulforodamina se excita a 550 nm y emite a 580 nm, por lo que es excitada óptimamente por el láser de
561 nm del VYB. Por otro lado, utilizamos el Hoechst 33258 que puede ser excitado a 405nm y emite a 450
nm, para detectarlas células necróticas y apoptóticas tardías. De esta forma, utilizando los 3 láseres del VYB
disminuimos los problemas de interferencia de emisiones de fluorescencia y permite relaizar el análisis muy
rápido y con confianza. De esta forma, analizamos el efecto antitumoral del cisplatino, el 5-fluouracilo y la
melatonina como antioxidante. Los resultados muestran cómo se puede relacionar el estrés oxidativo, con la
aparición de la caspasa 9 activa y la muerte celular inducida por los antitumorales.
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Biotechnology
PO-02 Estudio de la muerte celular de linfocitos inducida por el estrés en
trucha, usando el potencial de membrana mitocondrial como marcador
Héctor J. Pula(1,2), Pilar Torralbo Jiménez(1), Rosa Carrillo del Cacho(1),
Yolanda González Martín(1), A.B. Perales Casildo(1), Alberto Álvarez Barrientos(1)
Servicio de Técnicas Aplicadas a las Biociencias, Universidad de Extremadura.
Centro de Acuicultura Vegas del Guadiana, Badajoz.
(1)
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El análisis de la viabilidad y del contaje absoluto de las diferentes poblaciones sanguíneas es importante a la
hora de entender el efecto del estrés y la enfermedad en peces. Las técnicas rutinarias de contaje leucocitario
en sangre de mamíferos, implican la lisis de los eritrocitos.
La presencia de eritrocitos nucleados en la sangre de peces impide la aplicación de las técnicas usadas en
sangre de mamíferos con citometría de flujo. Generalmente, se utilizan técnicas microscópicas más complicadas de preparación, tediosas y que implican un mayor tiempo para la obtención del resultado. A pesar de que
desde el año 2003 (Inoue et al, 2003) existen referencias utilizando la citometría de flujo para realizar contajes
celulares en la sangre de peces, esta técnica sigue siendo poco utilizada, a pesar de sus evidentes ventajas.
La detección del grado de estrés de los peces es un parámetro muy importante para detectar disminuciones
de producción piscifactorías.
Aquí presentamos la utilización de la citometría de flujo para detectar el efecto que el estrés puede tener en
la viabilidad de las poblaciones sanguíneas y establecer un parámetro rápido y fiable para obtener el grado de
estrés que han sufrido los animales. Para ello, utilizamos un fluorocromo que mide el potencial de membrana
mitocondrial que es capaz de diferenciar las poblaciones leucocitarias de los eritrocitos (Inoue et al, 2003).
Nosotros utilizamos TMRM que es un catión lipofílico que tiñe casi selectivamente la membrana mitocondrial. El TMRM emite fluorescencia a una longitud de onda de 573 nm al ser excitado a 549 nm. Utilizamos
un citómetro de flujo MACSQuant VYB equipado con un láser que emite a 561nm que permite aumentar la
sensibilidad de la detección. De esta forma, podemos discriminar las diferentes poblaciones leucocitarias de
trucha (linfocitos y trombocitos, neutrófilos, basófilos y monocitos) y detectar cómo afecta el estrés de forma
diferencial. Además, la capacidad de contaje directo del MACSquant, permite obtener el resultado de forma
instantánea. Se ha estudiado el efecto del calor y la manipulación, comprobándose que el efecto sobre la viabilidad es específico de población.
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Biotechnology
PO-03 8-color FCM protocol for immune-monitoring of polyfunctional
cytomegalovirus-specific cellular immune responses and CMV recurrence in
liver transplantation for chronic hepatitis C virus infection
Ângela Carvalho-Gomes(1,2), Victoria Aguilera(1,2), Carmina Pallarés(1),
Martín Prieto(1,2), Marina Berenguer(1,2,3), F. Xavier López-Labrador(4,5)
Servicio de Hepatología y Trasplante Hepático, Hospital Universitari
La Fe, Valencia. (2)CIBERehd, Instituto de Salud Carlos III, Madrid.
(3)
Department of Medicine, Universitat de Valencia. (4)Virology Laboratory,
Genomics and Health Area, Fisabio-Salud Pública, Conselleria de Sanitat, Valencia.
(5)
CiberEsp, Instituto de Salud Carlos III, Madrid.
(1)
Introduction: There are few studies available quantifying cytomegalovirus (CMV) CMV-specific T cell-mediated immunity in the context of liver transplantation (LT), particularly for LT due to end-stage chronic hepatitis
C virus (HCV) infection. It is not clear if CMV-specific T-cell responses could result in an inadequate control
of HCV replication post-transplantation. Among T-cell functional assays, Intracellular cytokine staining (ICS)
allows detection of polyfunctional T-cells simultaneously secreting several cytokines. We aimed at developing
a reliable ICS FCM protocol for immune-monitoring of CMV-specific T-cell responses and their polyfunctional
activity after LT.
Methods: PBMCs isolated from LT recipients with recurrent HCV infection were tested for different stimulation conditions, including different CMV peptide pools (pp65, IE-1, IE-2), presence of co-stimulation antibodies
CD28/49d, use of live-dead stain, CD107a, and CD69 as activation marker. PBMCs were stained for CD3, CD4,
CD8 and CD69, and thereafter for intracellular IFNg and TNFa. Finally, cells were washed, fixed and stored at
4ºC until acquisition on a FacsCantoII flow cytometer (BD-biosciences). T lymphocytes with mono-, bi- and
tri-functional profiles were identified using FlowJo software (TreeStar).
Results: CMV-specific CD4+ and CD8+ T-cell responses were easily detected, suggesting enough sensitivity
for monitoring immune-reconstitution after LT. CMV-specific CD4+ and CD8+ T-cell responses were detectable
to all peptide pools (pp65, IE-1, and IE-2). The assay discriminated well CMV-specific T-cells producing single
cytokines (from 1% up to >40% of CD4+ or CD8+ T-cell populations) as well as polyfunctional subpopulations,
in particular CD8+IFNg+CD107a+ and CD8+ TNFa+CD107a+. Although the benefit of co-stimulation antibodies CD28/49d was not very clear, use of live-dead stain plus CD69-gating significantly enhanced the results.
Conclusion: We developed and 8-color FCM protocol for immune-monitoring of CMV-specific T-cell responses
and their polyfunctional activity after liver transplantation. This assay can be used to evaluate the role of the
CMV-specific T-cell response with (i) the control of CMV reactivation, and (ii) with the outcome of recurrent
hepatitis C infection after LT.
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Microbiology
PO-04 Efectos a corto plazo del herbicida atrazina sobre la microalga
Chlamydomonas reinhardtii
Marta Esperanza, Marta Seoane, Carmen Rioboo, Concepción Herrero, Ángeles Cid
Laboratorio de Microbiología, Departamento de Biología Celular y Molecular.
Universidad A Coruña.
Introducción: La atrazina, debido a su uso generalizado como herbicida, es uno de los contaminantes orgánicos más frecuentes en los suelos agrícolas y en las aguas subterráneas y de superficie. Debido a su alta
persistencia y toxicidad este biocida ha sido recientemente incluido en la lista de sustancias prioritarias de la
Directiva Marco del Agua (DMA) de la Comisión Europea (Directiva 2013/39/CE) como una nueva sustancia
peligrosa en los medios acuáticos de la Unión Europea. Por lo tanto, parece necesario evaluar los riesgos
ambientales de la atrazina, incluyendo sus efectos sobre los organismos no diana, como son las microalgas,
principales productores primarios de los sistemas acuáticos.
La finalidad de este estudio es profundizar en el conocimiento de la citotoxicidad de este herbicida en células
de C. reinhardtii después de 3 h de exposición a concentraciones crecientes de atrazina.
Material y métodos: Se establecieron cultivos control, libres de pesticida, y cultivos expuestos a diferentes
concentraciones de atrazina en condiciones de luz y temperatura controladas. Las concentraciones de atrazina
utilizadas se corresponden con valores que oscilan entre una EC50 y una EC90 a 96 horas para el crecimiento
(0,25; 0,5 y 1 µM). Utilizando diferentes protocolos de citometría de flujo (CMF) se cuantificó el efecto de dicho herbicida sobre diferentes parámetros: viabilidad celular, autofluorescencia de la clorofila a (como medida
de la actividad fotosintética), actividad esterasa inespecífica (como medida de la actividad metabólica de la
célula), niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) y potencial de membrana mitocondrial.
Resultados: Los resultados obtenidos reflejan que la atrazina provoca daños en las células de C. reinhardtii a
todos los niveles analizados, siendo el daño más severo en los cultivos expuestos a las concentraciones más
altas del herbicida. La atrazina provocó un descenso de la autofluorescencia de la clorofila a y de la actividad
metabólica, un incremento de la producción de ROS y una hiperpolarización de la membrana mitocondrial.
Sin embargo, la viabilidad celular no se vio afectada significativamente (p > 0,05) con respecto al control en
ninguna de las concentraciones ensayadas, siendo el porcentaje de células viables siempre superior al 98%.
Conclusiones: A pesar de los cambios observados a nivel celular, los resultados sugieren que las células,
después de 3 horas de exposición a estos niveles de atrazina, son capaces de superar el estrés producido y
mantener su viabilidad celular, por lo que muestran una gran adaptabilidad a las condiciones adversas.
Agradecimientos: Este trabajo fue llevado a cabo gracias al proyecto financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad de España (CGL2010-15993/BOS). M. Esperanza tiene un contracto predoctoral de la
Xunta de Galicia (12C).
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Microbiology
PO-05 Functional characterization of liposomal amphotericin B action
by flow cytometry
Rita Teixeira-santos(1), Elisabete Ricardo(1), Susana G. Guerreiro(2,3),
Sofia Costa de Oliveira(1,4), Acácio G. Rodrigues(1,4,5), Cidália Pina Vaz(1,4,6)
Department of Microbiology, Faculty of Medicine, University of Porto, Porto.
Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, University of Porto. (3)Center for
Neurosciences and Cell Biology, University of Coimbra. (4)Center for Research in Health
Technologies and Information Systems, Faculty of Medicine, University of Porto.
(5)
Burn Unit, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Hospital S. João, Porto.
(6)
Department of Microbiology, Hospital S. João, Porto.
(1)
(2)
Introduction: Amphotericin B (AmB) belongs to polyene drug class and exhibits a broad-spectrum fungicidal
activity. Thus, it represents an important therapeutic option for the treatment of systemic fungal infections. For
decades, the prevailing mechanism of action credited to AmB involved binding to ergosterol and formation of
pore-like structures. However, recently other mechanisms of action have been proposed. Flow cytometry (FC)
has been shown to be an excellent tool to evaluate drug cellular lesions. FC was used to study impairment of
a wide range of cellular physiological parameters following AmB exposure, in order to clarify its effect.
Material and methods: Cellular parameters related to fungal cell viability such as (i) membrane polarization,
(ii) cell metabolic activity, (iii) generation of oxygen-reactive species (ROS), (iv) DNA damage and (v) membrane
damage, were quantitatively evaluated by flow cytometry, using Candida albicans. Briefly, cells suspension
were treated with liposomal- AmB (L-AmB) 3 mg/L for 24 hours. After 1, 3, 6 and 24 h of incubation, yeast
cells were stained with distinct fluorescent probes with specific cellular affinities. For the study of membrane
polarization evaluation and metabolic activity, DiBAC3 and cFDA markers were used, respectively. The generation of (ROS) was assessed using DCFH-DA; DNA damage was assessed using TUNEL staining. The cellular
membrane integrity was assessed using propidium iodide (PI) staining. Stained cells were analyzed in a FACSCalibur cytometer (BD Biosciences, Sydney, Australia).
Results: Treatment of yeast cells with L-AmB 3 mg/L resulted in a time-dependent increase of depolarized
cells. Regarding metabolic activity, it increased soon after 1h of incubation; however, after 3h of incubation it
decreased along the time. After 6 h, L-AmB exposure led to intracellular accumulation of ROS, associated with
oxidative damage, thus possibly involved in induced programmed cell death. Following exposure to L-AmB 3
mg/L, TUNEL-positive cells increased over time, indicating apoptotic-like DNA-fragmentation. Interestingly,
only after 24h PI uptake was observed, but just in about 50% of the cells treated with L-AmB, suggesting
membrane damage.
Conclusion: Our results demonstrate that yeast cells exposed to L-AmB firstly develop alterations in membrane potential and metabolic activity, and ultimately die following induction of programmed cell death and
necrosis.
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Solid tumors
PO-06 Estudio combinado, citológico y del inmunofenotipo, en el diagnóstico
de tumores no hematológicos cd56+. Análisis de 3 casos
Mª Helena Bañas, Sara Suárez-Varela, Raúl Siguenza, Nuria Bermejo, Fátima Ibáñez,
Ignacio Casas, Francisco de Asís Pérez Leal, Juan Miguel Bergua
Servicio de Hematología, Hospital San Pedro de Alcántara, Cáceres.
Introducción: El marcador CD56 (molécula de adhesión neural), se emplea de forma habitual en el diagnóstico hematológico de diferentes hemopatías por citometría de flujo (CMF), principalmente de origen en células
natural killer (NK). Sin embargo, también puede ser útil en la detección de tumores neuroendocrinos junto a
la ausencia de expresión de CD45. Nuestro objetivo es describir los casos de 3 pacientes (ptes) con características clínico-biológicas similares y cuyos datos, analizados de forma integrada, nos permitieron establecer
con rapidez el origen no hematológico del tumor.
Material y métodos: Las muestras fueron remitidas a nuestro laboratorio en el año 2014 con la sospecha
de infiltración tumoral. Todos eran fumadores y presentaban masa pulmonar y adenopatías mediastínicas (2
ptes) en el estudio radiológico. Se obtuvieron por punción aspirado con aguja fina (PAAF) de las adenopatías
mediastínicas o de la masa. En 1 pte se estudió también la médula ósea por trombopenia. El primer paso fue
la observación al microscopio de las muestras, que nos orientó para la selección del panel de anticuerpos
(Ac) por CMF. En general, aplicamos una combinación de Ac marcados con fluorocromos en 6 colores para el
estudio de subpoblaciones linfocitarias, que incluía CD45, Ac de línea B (CD19, CD20, kappa, lambda, CD38),
T (CD3, CD4, CD8) y NK (CD56). Todas las muestras fueron adquiridas en un citómetro FACSCanto II y analizadas con el software FACSDiva.
Resultados: En los 3 casos la morfología fue similar: células blásticas de mediano-pequeño tamaño y aspecto
linfoide, a veces con tendencia a la cohesión y con imágenes de hemofagocitosis. Podía sugerir infiltración
por linfoma pero el IF mostraba una población CD45-/CD56+ sin marcadores de línea B ni T. Los datos clínicos,
citológicos y el IF se interpretaron de forma conjunta para dar el diagnóstico más probable de CA microcítico
de pulmón, que fue confirmado en todos los casos por estudio histopatológico. En 1 pte, la invasión medular
simuló un cuadro leucémico y fue diagnosticado de carcinocitemia.
Conclusión: La detección por CMF de un IF CD56+/CD45-, en ausencia de marcadores de línea hematológicos, junto con una clínica y una morfología compatibles, hace muy probable el diagnóstico de tumor neuroendocrino.
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Solid tumors
PO-07 Análisis de subtipos de macrófagos mediante citometría de flujo en
meningiomas
María Gonzalez-Tablas(1,2), Patrícia Domingues(1,3), Álvaro Otero(4), David Miranda(4),
Laura Ruiz(4), Daniel Pascual(4), Pablo Sousa(4), Jesús María Gonçalves(4), María Celeste
Lopes(4), Alberto Orfao(1), María Dolores Tabernero(1,2)
Centro de Investigación del Cáncer (CIC-IBMCC, CSIC/USAL, IBSAL) y Departamento
de Medicina, Universidad de Salamanca. (2)Instituto de Estudios de Ciencias de la
Salud de Castilla y León (IECSCYL-IBSAL) y Laboratorio de Investigación, Hospital
Universitario de Salamanca. (3)Centro de Neurociencias y Biología Celular y Facultad de
Farmacia, Universidad de Coimbra. (4)Servicio de Neurocirugía, Hospital Universitario de
Salamanca.
(1)
Introducción: Los meningiomas presentan infiltración de distintos tipos de células inmunes principalmente
células presentadoras de antígenos (CPA). El propósito del estudio fue analizar distintas combinaciones de anticuerpos monoclonales (AcMo) que permitieran identificar las células de origen mieloide monocito-macrófago
y caracterizar los distintos subtipos de macrófagos existentes en meningiomas mediante citometría de flujo
(CMF), analizando la polarización hacia macrófagos M1 y/o M2.
Métodos: Mediante CMF multiparamétrica se analizaron tres combinaciones diferentes AcMo: primero en
23 muestras de tejido tumoral de meningiomas se analizaron los siguientes AcMo: CD45–PO / HLA-DR–
PerCPcy5.5 / CD14–APC-H7 / CD16–Pecy7 / CD33–PE. En un subgrupo de tumores (n=11), se incluyeron
además de los marcadores anteriormente descritos, CD44 y CD206, y finalmente en otro subgrupo de tumores se marcaron las muestras tumorales con varios AcMo para identificar macrófagos M1: NOS, TLR2, TLR4,
CD300e, SLAN, CCR2, CCR7 y para macrófagos M2: CD163, ARG1 y CD206.
Resultados: En los tumores analizados, sistemáticamente se detectó una media 82% de CPA del células presentadoras de antígenos HLA-DR+CD14+CD45+CD16-/+CD33-/+ siendo el 79% células DR+CD14+CD33-/+.
La segunda combinación de anticuerpos mostro la utilidad del uso de CD44 en la distinción de subpoblaciones
de monocitos y macrófagos, y positividad heterogénea para CD206 in 10/11 meningiomas. Finalmente, se
amplió el panel de AcMo para diferenciar macrófagos M1 y M2. Este panel mostró una media de CPA de 90%,
siendo el 58% células DR+CD14+ siendo heterogénea la positividad para macrófagos M1 y M2.
Conclusión: La combinación de AcMo HLA-DR, CD14, CD16, CD33 es insuficiente para identificar los subtipos de CPA, siendo de utilidad la inclusión de otros marcadores que ayuden a diferenciar el fenotipo antitumoral (M1) o anti-inflamatorio (M2) de los macrófagos en meningiomas, como son CD44 y CD206. Además
es necesario el análisis de un mayor número de tumores para establecer la utilidad de los marcadores NOS,
CCR7, CCR2 y ARG1.
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Hematology
PO-08 Rentabilidad del test de hemoglobinuria paroxística nocturna
por citometría de flujo en un hospital de tercer nivel
J. Viedma, A. Lemes, S. de la Iglesia, D. Fiallo, T. Molero
Servicio de Hematología y Hemoterapia, Hospital Universitario
de Gran Canaria Doctor Negrín, Las Palmas de Gran Canaria
Introducción: El diagnóstico de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN) parte de una sospecha clínica
que se confirma por técnicas citofloroméricas (CF). Mediante este método se determina la clona, su tamaño y
se utiliza asimismo para el seguimiento de la enfermedad. Las distintas guías y recomendaciones de expertos
valoran en que patología relacionada con la HPN (trombosis no explicadas, fallo medular, anemia hemolítica
Coombs negativa, hemoglobinuria) se debe realizar el test de despistaje por CF. El objetivo del presente estudio fue analizar en número de test para screening de HPN, en que patologías concomitantes se realizó y
valorar su eficacia clínica en nuestro servicio.
Material y métodos: Revisamos los test de HPN realizados desde enero de 2012 hasta diciembre de 2014,
en las poblaciones de sangre periférica en monocitos y polimorfonucleares (PMN). Para ello se utilizo un citómetro Navios de Beckman Coulter y seis colores con el panel FLAER FITC/CD64PE/CD45ECD/CD14PECy7/
CD15APC/ CD16APC-750. Se adquirieron 100.000 eventos y se analizaron los CD15 y CD64 en ventana para
separar las poblaciones de PMN y monocitos respectivamente. La sensibilidad alcanzó el 0.1%. En clonas
inferiores al 5% se recomendó repetir el test para confirmación.
Resultados: En el periodo de tiempo mencionado se solicitaron 63 pruebas, de las que 30 (48.3%) fueron
por trombosis venosa profunda; 12 (19%) por citopenias; 3 (4.7%) por HPN diagnosticadas por otros métodos; 9 (14.2%) en anemia aplásica; 12 (19%) en citopenias; 3 (4.7%) en anemia hemolítica Coombs negativo;
2 (3.1%) en Síndrome Mielodisplásico (SMD) hipoplásico; 2 (3.1%) por ferropenia con trombocitopenia y 1
(1.6%) hemoglobinuria. Se realizaron así mismo 6 pruebas adicionales en el seguimiento de HPN previamente diagnosticadas por CF. El 100% de los estudios fueron solicitados desde el Servicio de Hematología. Se
encontró una nueva clona HPN en 3 de los casos estudiados (4.7%): 1 Anemia Aplásica; 1 HPN y 1 SMD. No
hallamos clona en ninguno de los estudios solicitados por trombosis venosa profunda (con estudio de hemolisis normal y sin citopenias). Las clonas encontradas oscilaron entre el 1% y el 90%
Conclusión: La rentabilidad de la realización del test HPN fue escasa en nuestra serie si bien similar a las
encontradas en otros centros de nuestra Comunidad Autónoma. Pensamos que se debería solicitar la prueba
desde servicios ajenos al de Hematología como Digestivo y Medicina Interna, con el fin de no dilatar el diagnóstico y tratamiento ante una sospecha principalmente de trombosis en lugares no habituales, que son la
causa más frecuente de muerte en esta enfermedad.
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Hematology
PO-09 Hairy cell leukemia’s identity. A challenge for the forward scattered
analyser
A. Lemes, S. de la Iglesia, D. Fiallo, J. Viedma, A. Díaz*, T. Molero
Servicio de Hematología y Hemoterapia, Hospital Universitario de Gran Canaria
Doctor Negrín, Las Palmas de Gran Canaria. *Estudiante de 4º año de Medicina,
Universidad de Las Palmas de Gran Canaria
Screening rutinario de Tricoleucemia por los datos de dispersión de luz de un autoanalizador hematológico
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Hematology
PO-10 Selección de anticuerpos determinantes para el estudio
de la enfermedad mínima residual en mieloma múltiple
M.S. Noya, L. García, M.F. López Fernández
Servicio de Hematología y Hemoterapia, Complejo Hospitalario Universitario A Coruña
Introducción: El fenotipo de la plasmática clonal es heterogéneo y carece de un perfil único. Esto hace que
la citometría de flujo multiparamétrica sea fundamental en el estudio de las gammapatías monoclonales y de
EMR en MM. Está por definir el tubo ideal para EMR.
Material y métodos: Se estudiaron en 96 pacientes, las aberrancias fenotípicas de las plasmáticas con un
panel de 2 tubos y 8 colores, utilizando un FACS Canto II BD con el objetivo de encontrar aquellos más determinantes para EMR: CD38, CD138, CD19, CD45, CD56, K/L cit, CD81, CD27, CD28, CD117, CD20. En 27 se
estudió CD200. 72 eran MM, 16 MGUS, 2 amiloidosis y 3 leucemias.
Resultados:
Aberrancia
N pacientes (%)
K/L clonal
95(99)
CD45-95 (99)
CD19-91 (95)
CD81-78 (81)
CD200+ (n=27)
22(81.5)
CD56+67(69.8)
CD117+ (n=76)
42(55.2)
CD28+51(53)
CD27-45(46.8)
CD20+
14 (14.5)
Según los datos de la tabla, además de las cadenas ligeras, CD19, CD45, CD81, el CD56 fue el más frecuente,
así como CD200. Pero, los 5 casos CD19+ también eran CD81+ y solo 1 CD56+. CD27 – en 2. CD200 fue +
en 22/27 casos, pero ya eran aberrantes: 18 eran CD56+, 13 CD28+ y CD27 – en 11. Por tanto CD200 discriminó poco, ya que si CD56- el CD27 también fue- en 3/ 4. CD56 fue + en 67 y – en 29: en estos casos fue CD28
+el más útil (15), seguido de CD27- (12). CD117 y CD200 fueron + en la mitad de los casos CD56 – analizados. Si
CD56 – y CD27+ el más útil fue CD28+ (10/17) y CD117+ (7/14). A su vez, el CD117 fue + en 42/76 y se asoció
a CD56+ (30) CD28 (22) y CD27 (10). Cuando CD56 fue- (12 casos) nuevamente CD28 fue + en la mitad.
Conclusión: Es indiscutible la utilidad de CD19, CD56 y cadenas ligeras. Encontramos hasta un 19% de CD81
het. CD27- fue menos frecuente que en otras series, pero fue útil en CD19+ (50%) y si CD56-. El CD200 fue +
en 81.5% (n=27), pero se asoció a CD56+ y si éste es negativo, CD27 también, por lo que no lo encontramos
discriminatorio. En cambio, CD117 y CD28 fueron muy útiles cuando CD56- y CD27+. Por ello, sugerimos la
presencia de CD27, CD117 y CD28 en el estudio de EMR.
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Hematology
PO-11 Correlación de los resultados de poblaciones linfocitarias obtenidos
mediantem el nuevo citómetro Aquios y Navios
Javier Gómez Arbonés, Montserrat Teixidó Amorós,
Miguel Angel Gallart Blanco, Florencia di Bernardo
Universidad de Lleida, Departamento de Medicina.
Laboratorio Clínico ICS Lleida, Hospital Universitario Arnau de Vilanova, Lleida.
Institut de Recerca Biomèdica de Lleida (Irblleida)
Introducción: Aquios (Beckman Coulter) es un citómetro de flujo automático para la determinación de de células CD3+, CD4+, CD8+, CD19+ y NK con procesamiento y lectura desatendido. En el pasado congreso de
la SIC presentamos la evaluación del prototipo inicial de Aquios que resultó excelente, si bien, la versión definitivamente comercializada de Aquios incorpora mejoras sobre el prototipo inicialmente evaluado y presenta
unos algoritmos optimizados para la identificación y recuento de las subpoblaciones linfocitarias.
Material y métodos: Hemos estudiado la correlación de los resultados de la determinación de poblaciones
linfocitarias (células/µL) de muestras remitidas al laboratorio clínico y analizadas mediante la versión actual de
Aquios y Navios (contaje de valores absolutos mediante bolitas fluorescentes). También hemos analizado la
correlación de células CD4+ obtenidas mediante Aquios y por doble plataforma (Navios y hemocitómetro). Se
han considerado los resultados de las muestras auto-validadas por Aquios sin intervención de operador y los
correspondientes resultados obtenidos por los procedimientos rutinarios de nuestro laboratorio.
Resultados: El estudio de correlación de las 127 muestras entre Aquios y Navios se mostró excelente para
la concentración de linfocitos CD3+, CD3+/CD4+, CD3+/CD8+, CD3-/CD19+ y CD3-/CD56+/CD16+, con un
coeficiente R de 0.982, 0.988, 0.982, 0.945 y 0.971; las pendientes de las rectas de regresión (variable dependiente: valores de Navios) fueron de 0.96 (IC 95%: 0.93-0.99), 1.05 (1.02-1.08), 0.88 (0.85-0.91), 1.04 (0.97-1.10)
y 0.95 (0.91-0.99). La correlación de los resultados de CD4/CD8 fue de R=0.989 con una pendiente de 1.01
(0.99-1.04). Por lo que respecta a la correlación con los resultados con doble plataforma para la concentración
de linfocitos CD3+/CD4+, obtuvimos un coeficiente R de 0.989, con una pendiente de las rectas de regresión
de 1.10 (1.08-1.13).
Conclusión: Las correlaciones entre los valores de las subpoblaciones linfocitarias obtenidos por Aquios y
Navios es excelente y no hay diferencias clínicamente significativas entre ellos.
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Posters
Hematology
PO-12 Correlación diagnóstica entre el estudio de muestras biológicas por
citometría de flujo multiparamétrica versus anatomía patológica en nuestro
centro
S. Almela Rambla, E. Mas Esteve, E. Viciano Delíbano, M. Mas Esteve,
A.F. Arbeláez Olivar, M. Gimeno Brosel, L. Serrano Picazo, A. Gascón Buj,
J. Clavel Pía, R. García Boyero, A. Blanquer Cots, M. Guinot Martínez,
T. Gozalbo Gascó,G. Cañigral Ferrando
Servicio de Hematología y Hemoterapia, Hospital Universitario General de Castellón
Introducción: La CMF es una herramienta para el diagnóstico y clasificación de las neoplasias hematológicas
en muestras de sangre periférica y médula ósea. Puede emplearse para el diagnóstico de otras muestras con
células en suspensión, permitiendo el análisis de antígenos y sus aberrancias.
Objetivo: Correlacionar diagnóstico AP/CMF en pacientes con sospecha de neoplasia hematológica.
Material y métodos: Estudio retrospectivo de muestras de tejidos por CMF vs AP. Periodo de estudio: Desde
el 01/01/12 al 31/12/14. Número de muestras: 64.Tipo de muestra: Adenopatía, líquido biológico, biopsia ósea,
bazo, biopsia cerebral, BAG, PAAF… Procesado de la muestra: En fresco. Se improntan para tinción con MayGrümwald Giemsa y se obtiene una suspensión celular para estudio por CMF. Paneles de análisis por CMF:
Paneles validados por Euroflow (tubo LST, tubo SLPC-T, tubo SLPC-B). FACSCANTO II. Estadísticos: SPSS
22.0. Definición de acierto: Correlación positiva entre la conclusión del análisis CMF y las conclusiones de AP.
Resultados: De las 64 muestras, 2 fueron excluídas por ausencia de celularidad valorable. De las 62 muestras
restantes, existe una correlación positiva respecto a la anatomía patológica en 43 de ellas (12 no patológicas,
31 patológicas (24 para LNH, 7 para neoplasias no hematológicas) y una discordancia en 19 de ellas (6 LH, 9
LNH y 3 otros diagnósticos). En las disonancias CMF/AP se aprecian 6 casos de LH donde no se objetiva población linfocitaria B o T clonal con el panel de screening pero, por los hallazgos morfológicos correlacionarían
con LH. Todo ello arroja los siguientes estadísticos globales: S 65% E 90% VPP 97% VPN 40%. Si se excluyesen los LH del análisis la técnica resultaría con: S 76% E 90% VPP 97% VPN 50%.
Conclusiones: La CMF es una técnica con una elevada E y un alto VPP. Se debería trabajar para aumentar la
S de la técnica. Favorecería la detección de los LH, y así el aumento de la S, la presencia de marcadores monoclonales específicos.La CMF de muestras biológicas es una herramienta válida para el análisis de muestras
patológicas y no patológicas. El diagnóstico hematológico siempre debe de ser integrado: citomorfología,
CMF y citogenética (biología molecular/FISH). La CMF es una técnica que apoya el diagnóstico AP, pero no
debe sustituirlo.
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Hematology
PO-13 Leucemia prolinfocítica T: paciente con inmunofenotipo aberrante
M.S. Noya, M.T. Fernández, T. Torrado, F. Salido, M.G. Vázquez, M.F. López Fernández
Servicio de Hematología y Hemoterapia,
Complejo Hospitalario Universitario A Coruña
Introducción: La leucemia prolinfocítica T (LPT)es un síndrome linfoproliferativo crónico generalmente agresivo, que puede cursar con linfocitosis marcada, hepatoesplenomegalia, adenopatías e infiltrados cutáneos y
que suele presentar una morfología (prolinfocitos) e inmunofenotipo bastante característicos aunque se han
descrito casos atípicos: CD45+ (como se esperaría en una neoplasia de células T maduras), marcadores de
células pan-T (CD2, CD5, CD7 y CD3) y, generalmente CD4+.
Presentación: Varón de 63 años sin antecedentes de interés remitido por hallazgo de una linfocitosis (40.03
x 109/L) con morfología compatible con prolinfocitos. No refería sintomatología B, a la exploración : hepatomegalia 6cm. Se realiza inmunofenotipo en sangre, utilizando un FACS CANTO II BD y con un panel de 8
fluorescencias adaptado del panel propuesto por el grupo Euroflow. Se detectó una población aberrante, homogénea, que representaba aproximadamente el 84% de la celularidad, correspondiente a células linfoides T,
de pequeño tamaño y complejidad que expresaban CD3+ citoplasmático (CD3 sup negativo), CD4++, CD5+,
CD7+, CD2+ más débil, CD26+, CD27+, CD28+, CTL1 cyt+, TCR alfabeta+ intracit (negativo superficie) y
CD52+. Esta población era negativa para CD45, CD8, CD45Ro, CD10, marcadores de inmadurez (CD34, TdT,
CD99, CD1a, CD117, CD38, CD123), antígenos de activación (CD25, HLA-DR) y marcadores de citotoxicidad
(CD56, CD57, CD11c, CD94, perforina). En la médula la infiltración era del 68%. Se informó como LP T a la
espera del resto de pruebas. En el estudio citogenético se detectó Inversión del cromosoma 14 y trisomía
del cromosoma 8.
Conclusión: El caso clínico presentado corresponde al de un paciente con clínica y analítica , incluida morfología y genética, compatibles con LP T, pero el inmunofenotipo presentaba pérdida aberrante de CD45 y CD3
superficie, que hizo plantear incluso el diagnóstico diferencial con una leucemia aguda linfoblástica T. El resto
del fenotipo es bastante típico. Solo hemos encontrado un caso similar publicado en la literatura, por lo que
nos parece interesante reportarlo.
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Hematology
PO-14 Casos clínicos de manifestación extramedular de mieloma múltiple
en ganglio linfático y lavado broncoalveolar
Mercedes Rey Rey, Larraitz Aragón Irusquieta,
M.ª del Carmen Cipitria Arnáiz, Pilar Echániz Aizpuru
Servicio de Inmunología, Laboratorio de Inmunología, Hospital de Donostia
El mieloma múltiple (MM) extramedularo extraóseo es una presentación poco frecuente de dicha enfermedad
(3-5% de las neoplasias de células plasmáticas), que surge en localizaciones diferentes de la médula ósea
(habitualmente en el tracto respiratorio superior, pero puede aparecer en otras localizaciones como nódulos
linfáticos).
Esta presentación es más agresiva que el MM, siendo resistente a la terapia convencional anti-mieloma. En
esta comunicación presentamos dos casos de manifestación extramedular de MM: una paciente de 72 años
con antecedentes de neoplasia de mama y mieloma múltiple, con recaída en forma de plasmocitoma extramedular en ganglio linfático, y una paciente de 52 años con manifestación del mieloma en tráquea y BAL.
PO-15 Caso clínico de coexistencia de linfoma del manto y leucemia linfática
crónica en un paciente hematológico
Larraitz Aragón Irusquieta, Mercedes Rey Rey, Pilar García Martínez,
Pilar Echániz Aizpuru
Servicio de Inmunología, Laboratorio de Inmunología,Hospital de Donostia
La coexistencia de linfoma del manto y leucemia linfática crónica en pacientes de Hematología es un fenómeno muy poco frecuente, siendo muy escasos los casos documentados en la literatura. Para estos casos se
ha acuñado el término de “linfoma compuesto”, que describe la coexistencia en un mismo sitio anatómico de
ambos procesos. Sin embargo, este término no es aplicable a nuestro paciente, ya que el linfoma del manto
y la leucemia linfática crónica se observaron en diferentes tipos de muestras.
PO-16 ¿Leucemia de linfocitos grandes granulares o expansión clonal de
linfocitos T no citotóxica? A propósito de un caso y revisión de la literatura
D.V. Fiallo(1), A. Lemes(1), M.T. Gómez-Casares(1), A. López(2), J. Ciudad(2),
M. Limeres(3), J. Viedma(1), C. Rodríguez(1), M. Perera(1), T. Molero(1)
(1)
Servicio de Hematología y Hemoterapia. (2)Servicio de Citometría,Centro Investigación
del Cancer, Salamanca. (3)Servicio de Anatomía Patológica. Hospital Universitario de
Gran Canaria Doctor Negrín. Las Palmas de Gran Canaria
Leucemia de linfocitos grandes granulares y la dificultad de establecer una clonalidad certera
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Hematology
PO-17 ¿Es útil la citometría de flujo en el estudio de los síndromes
mielodisplásicos?
Beatriz Álvarez, F. Ataulfo González, Jesús Villarrubia, Luz Conejo, Javier García, María
Medrano, Juan M. Alonso, Raquel Guillén, Fernando Cava
Laboratorio Central de la Comunidad de Madrid. Hospital Clínico
San Carlos, Madrid. Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid
Introducción: Inicialmente la aplicación de la citometría de flujo (CMF) en los síndromes mielodisplásicos
(SMD) quedaba relegada a la cuantificación de los precursores mieloides y la identificación de la línea pero el
avance tecnológico de la CMF y el mayor conocimiento de las alteraciones fenotípicas descritas en los SMD
han provocado un incremento en su aplicación como apoyo diagnóstico en los SMD. La OMS del 2008 ya
incluye a la CMF dentro de las recomendaciones para el estudio de los SMD. A este respecto, el grupo internacional ELNet IMDS-Flow publicó unas guías para la incorporación de la citometría de flujo en el diagnóstico
y clasificación de los SMD describiendo unos requerimientos mínimos para análisis mediante citometría de
flujo de los SMD. En este estudio se pretende valorar la utilidad de la CMF en el estudio de los SMD en la
rutina del laboratorio clínico.
Material y métodos: Se presenta el caso de 3 médulas óseas y 1 sangre periférica de pacientes remitidos
a estudio de SMD. En todos los casos se realizó un marcaje directo de 8 colores con los antígenos CD16,
CD13, CD34, CD33, CD117, CD45 y HLA-DR (BD Biosciences) mientras que en uno de los casos se estudió
además la expresión de CD235a, CD36 y CD71 (BD Biosciences). La adquisición de las células se realizó en
un citómetro de flujo de BD FACSCanto II (BD Biosciences) y el análisis de los datos de realizó con el programa Infinicyt (Cytognos).
Resultados: El estudio inmunofenotípico en los casos remitidos para el estudio de SMD resultó de utilidad
en todos ellos aportando información complementaria a la citogenética/FISH y al estudio citomofológico formando parte del diagnóstico integrado de la enfermedad.
Conclusiones: La citometría de flujo aporta información de utilidad para el clínico en el diagnóstico de los
síndromes mielodisplásicos debiéndose destacar que alteraciones fenotípicas aisladas no han de considerarse significativas y que ha de formar parte del diagnóstico integrado del SMD. Además la CMF puede resultar
de utilidad no sólo en el diagnóstico, si no también, en la subclasificación, grupos de riesgo y monitorización
de la enfermedad.
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Hematology
PO-18 Tetraspanin expression profile in multiple myeloma cells and its
association with β1 integrins (CD29)
Cristina Martín Martín, Eulalia Rodríguez Martín,
Luisa María Villar Guimerans, Javier Coll Martí, Ernesto Roldán Santiago
Servicio de Inmunología, Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid
Introduction: Multiple myeloma (MM) is a malignant plasma cell disease. An understanding of the interactions between malignant PCs and Bone marrow (BM) microenvironment is essential to design a rational
disease treatment. Tetraspanins modulate a variety of fundamental biological processes such adhesion and
migration by functioning as organizers of multimolecular membrane complexes, especially with CD29. We aim
to define the expression of tetraspanins in these neoplastic cells and their association to integrins, as they
have been previously described as prognostic markers in other neoplastic conditions.
Patients and methods: BM aspirates from 48 patients with monoclonal gammopathy (8 MGUS, 21 new MM
and 19 treated MM) and 8 patients without haematological disorders were obtained. Cells were always stained with monoclonal antibodies (mAb) against CD38 and CD56 and/or CD19 in order to differentiate malignant
form normal PCs. In addition, mAb against beta 1 integrin CD29 (MAR4 clone) or its alpha 4 chain (CD49d)
were combined with mAb against tetraspanins (CD9, CD37, CD63, CD81 or CD151).
Results: All normal and neoplastic PCs expressed similar levels of CD63 and none expressed CD37. CD9 and
CD151 were expressed at very variable levels in normal or malignant PCs. In contrast, in a wide majority of
MM cases, malignant PCs showed a loss of CD81 antigen compared with normal BM PCs. More importantly,
we show that underexpression of CD81 was accompanied by a significant decrease in the surface levels of
CD29 and CD49d. This relationship is not observed with the other tetraspanins. Finally, no significant differences in the expression of tetraspanins among the different types of monoclonal gammopathy were found.
Conclusions: In relation to the tetraspanins studied, only the loss of CD81 can be used as aberrant marker to
define a plasma cell tumor. Moreover, the clear association between CD81 and CD29 levels suggests that this
tetraspanin could modulate integrin function.
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Hematology
PO-19 Rentabilidad diagnóstica de HPN en pacientes con trombosis
Juan Viedma, Melania Moreno, Angelina Lemes, Ignacia Balda,
Dolly Fiallo, Silvia de la Iglesia, Teresa Molero
Servicios de Hematología, Bioquímica y Medicina Preventiva,
Hospital Universitario de Gran Canaria Doctor Negrín, Las Palmas de Gran Canaria
Introducción: La Hemoglobinuria ParoxísticaNocturna (HPN) es una rara enfermedad clonal asociada a hemólisis crónica intravascular y activación plaquetaria que provoca trombosis, insuficiencia renal y, en general, un
empeoramiento de la calidad de vida. Por estos hechos y el interés actual de la enfermedad por una nueva
alternativa terapéutica que mejora el pronóstico de estos pacientes, se genera una tendencia a considerar
HPN en todo paciente joven con trombosis sin causa justificante.
Objetivo: Nuestro objetivo es estudiar la rentabilidad diagnóstica del despistaje de HPN en pacientes menores de 55 años que presentaron un episodio de trombosis venosa o arterial sin factor desencadenante previo.
Pacientes, material y método: Estudio prospectivo y secuencial de pacientes menores de 55 años que
sufrieron un episodio trombótico y cuyos datos han sido recogidos en una base de datos de nuestra Unidad
desde marzo/2014 hasta la actualidad. Se incluyeron pacientes sin factores desencadenantes de trombosis,
independientemente de los factores predisponentes (tabaco, HTA, DM, obesidad, trombofilia, dislipemia,
toma de ACHO). Aparte se recogió el territorio donde se produjo la trombosis. Se completó con despistaje de
trombofilia congénita y adquirida. Se realizó estudio de hemólisis con determinación de niveles de haptoglobina y otros parámetros bioquímicos relacionados con hemólisis intravascular, así como identificación de clona
HPN por Acs monoclonales por citometría de flujo (FlaerFITC/ CD64PE/ CD45ECD) CD14PCy7/ CD15APC/
CD16APC-AF750).
Resultados: El grupo de estudio se compone actualmente de 28 pacientes (14 varones y 14 mujeres) con
edad media de 42 años del evento trombótico. En ningún paciente se objetivó datos de hemólisis, con una
media de haptoglobina de 128.4 (45.6-298) ni se identificó clona HPN. De todos los pacientes 9 (32%) no presentaba factores de riesgo trombótico. Sólo 2 (7%) de ellos padeció la trombosis en territorio arterial. De todas las trombosis, 24 (85.71%) correspondían a territorio venoso profundo en MMII y/o embolismo pulmonar
Conclusión: De nuestro estudio, si bien se compone de un reducido tamaño muestral, se concluye que el
despistaje de HPN en pacientes con trombosis en territorio venoso profundo en MMII y/o embolismo pulmonar sin factor desencadenante no resulta rentable. Esta rentabilidad no se modifica si se tiene en cuenta
la ausencia de factores predisponentes (32% de ellos no los tenían). Sin embargo, son pocos los pacientes
incluidos en nuestra base que padecieron evento trombótico fuera de la localización mencionada o evento arterial (solo 14%). Considerando que el perfil de trombosis que se ha descrito en HPN incluye territorio arterial
y territorios venosos atípicos, deberá plantearse la posibilidad de descartar esta patología en pacientes con
este perfil de trombosis. Para ello será necesario una colaboración estrecha así como una actualización de la
HPN en aquellos servicios que tratan con este tipo de eventos.
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Hematology
PO-20 Prevalence of immunophenotypic markers in patients
with multiple myeloma into staging III
Fabiane Spagnol Pedrazzani(1), Ana Luiza Carvalho da Silva(2),
Mariela Granero Farias(1), Priscila Aparecida Correa Freitas(1),
Marcelo Ferreira Paiva(3), Ana Paula Alegretti(1), Diogo Andre Pilger(2)
Unidade de Diagnóstico Personalizado. (2)Unidade de Hematologia.
Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brasil. (3) Faculdade de Farmácia,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brasil
(1)
Introduction: Multiple Myeloma (MM) is a clonal plasma cell proliferative disorder. Currently, multiparameter
flow cytometry (MFC) is essential in MM diagnosis, because it provides plasma cells characterization and
prognostic indication. Some markers such CD28, CD117, CD56, CD81 and CD27 have demonstrated prognostic implications.
Objectives: To analyze the frequency of prognostic markers by MFC in the staging III to MM according to Durie-Salmon (D&S). Methods: Were included 26 patients (17 men) classified into stage IIIA (15) and IIIB who had
diagnosis of MM in an Academical Hospital at 2014 to 2015. The analysis was performed by MFC on bone marrow samples using a MFC FACSCanto II (BD, San Jose, CA, USA). The antibody panels included were CD19,
CD38, CD117, CD28, CD27, CD56, CD45, CD81, Kappa and Lambda, conjugated with FITC, PE, PERCP, APC
and APC-H7 fluorochromes. The patients included were those classified into staging III according to DurieSalmon’s classification for MM. The statistical analysis was performed by a descriptive analysis and Qui-square
test to correlate categorical variables. It was used SPSS 22.0 and considered a p-value <0.05 as significant.
Results: The most prevalent markers were positive to CD56 (68%), CD27 (84%), CD28 (64%) and CD117
(64%), followed by cytoplasmatic Kappa (60%), CD81 (28%), CD45 (24%) and negative to CD19 (96%). There
wasn’t association between the immunophenotypic markers and the staging groups found.
Conclusions: MM is often difficult to diagnose and the patients are usually identified in advanced stage disease. Our patients, in the staging III for MM, showed frequencies of CD56 positive and CD19 negative similar to
those found in the study of Rawstron et al (2008), although we have found higher prevalence of CD28, CD117,
CD27 markers. This study will continue in order to evaluate a larger number of patients and analyze also the
staging I and II.
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Hematology
PO-21 Análisis de las poblaciones leucocitarias circulantes en pacientes
con trombocitopenia inmune primaria y su asociación con la respuesta
al tratamiento con eltrombopag
Elena Blanco(1), Mónica Ospina(1), Martín Pérez-Andrés(1), José María Bastida(2),
Tomás José González López(3), Ignacio Criado(1), Luzalba Sanoja(1), Daniela Damasceno(1),
Alba Torres(1), Julia Almeida(1), José Ramón González-Porras(2), Alberto Orfao(1)
Departamento de Medicina, Servicio de Citometría, Centro de Investigación del Cáncer
(Ibmcc-Csic/Usal) y Universidad de Salamanca. (2)Servicio de Hematología, Hospital
Universitario de Salamanca-Ibsal. (3)Servicio de Hematología, Hospital Universitario de
Burgos
(1)
Introducción: Recientes estudios sugieren que el tratamiento con agonistas del receptor de la trombopoyetina
podría no solo estimular la producción de plaquetas en pacientes con trombocitopenia inmune primaria (TIP)
sino además tener un efecto inmunoregulador.
Material y métodos: Se estudiaron muestras de SP de 8 pacientes con TIP, al inicio del tratamiento con Eltrombopag, a los 14 y a los 28 días postratamiento, así como 8 donantes sanos, por citometría de flujo, con las
combinaciones de anticuerpos monoclonales:
i) CD27/CD45/smIgD-CD8/CD56-CD16/smIgM-CD4/CD19-TCRγδ/CD3/CD45RA
ii) CD27/IgM/CD24/CD19/smIgG3-smIgG2/smIgA1-smsIgA2/smIgG1-smIgG2/smIgD/CD21/smIgA1-smIgG4/
CD38
iii)CD27/CD4/CD8/CD25/CD28/CD39/TCRgd/ CD127/CD45RA.
Resultados: Al iniciar el tratamiento, los pacientes de TIP presentaban números absolutos significativamente
disminuidos de monocitos (434±130 vs 722±174 cél/µL; p=0,02), monocitos CD16++ (34±26vs 115±62 cél/µL;
p=0,003) y células dendríticas linfoplasmocitoides (3,9±4,9 vs 12,1±4,9 cél/µL; p=0,006), así como de linfocitos
T naïve CD4+ y CD8+ (173±188 vs 499±270 y 51,6±53 vs161±114 cél/µL; p=0,02, respectivamente), TCRγδ
(34,1±31, vs 92,7±61,3 cél/µL; p=0,02), y en el ratio CD4+/CD8+ (1,5±1,2 vs 2,7±0,5 cél/µL; p=0,01) respecto
a los controles. No se observaron diferencias en el número de linfocitos B circulantes totales por estadio madurativo (inmaduras, naïve, memoria, células plasmáticas y linfocitos B CD24++/CD38- reguladores -Breg-), o por
isotipo.
Todos los pacientes respondieron a eltrombopag (plaquetas > 100x109/L) . Tras 14 días de tratamiento se observó un aumento en el número absoluto de monocitos (434±130 vs 629±205 cél/µL; p=0,01), y monocitos
CD16++ (33,9±25,8 vs 75,9±48,8 cél/µL; p=0,05), aunque aún disminuidos respecto al grupo control (p<0,05).
Además, se observó un incremento de las NK (219±119 vs 335±194 cél/µL; p=0,02) y células Breg (2,9±3,3
vs 3,5±3,2 cél/µL; p=0,03), y un descenso en el número de células B naïve (94±87 vs 72±74 cél/µL; p=0,02),
respecto al comienzo del estudio, pero no respecto a los controles (p>0.05). Por el contrario, no se observaron
cambios en el compartimento T o en las células dendríticas plasmocitoides.
Los cambios observados en monocitos, monocitos CD16+ y células NK respecto al control, se mantuvo a los
28 días. El compartimento de células Breg continuó expandiéndose, siendo significativamente mayor respecto
a lo observado a los 14 días (3,9±2,7 vs 3,5±3,2 cél/µL; p=0,04). Además, se observó un descenso significativo
en el número absoluto de células B de memoria (42,2±27,6 cél/µL vs 73,87±59,2; p=0,04) a expensas de una
disminución en el número de células de memoria IgMD+ (14,8±8,2 cél/µL vs 29,2±27,8; p=0,02) tras 28 días de
tratamiento respecto al control. Por el contrario no se observaron cambios en el compartimento T.
Conclusión: El tratamiento con Eltrombopag produce un rápido aumento de monocitos, macrófagos y células
NK, detectable a los 14 días de empezar el tratamiento. Aunque se observan algunos cambios en el compartimento B que afectan a las células B CD24++/CD38-, y a la distribución de los isotipos, es necesario un seguimiento a más largo plazo para confirmar el efecto inmunoregulador de Eltrombopag.
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Immunology
PO-22 Comparación de ensayos para determinar la citotoxicidad
de células NK mediante citometría de flujo
J. Irure Ventura(1), C. Santacruz llata(2), M. López Hoyos(1,2), D. San Segundo Arribas(1,2)
Servicio de Inmunología. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla-Idival.
Unidad de Citometría y Separación Celular. Idival
(1)
(2)
Introduction: La citotoxicidad de las células NK se ha estudiado habitualmente con métodos radiactivos
mediante la liberación de Cr51. Sin embargo, la utilización de radioisótopos está en desuso hasta casi su
extinción. Actualmente se han reincorporando nuevas tecnologías capaces de detectar la citotoxicidad libre
de radioisótopos mediante la detección de moléculas por citometría de flujo (CF). En el presente trabajo se
compara un test comercial y otro descrito en la literatura basados en la expresión de CD107a(1) para la determinación de la función citotóxica de las células NK mediante CF.
Material y Métodos: Se estudiaron 20 muestras de sujetos sanos. Tras separación por gradiente de Ficoll se
aislaron las células mononucleares (PBMCs) y se testó la citotoxicidad mediante el kit comercial (NKTEST®,
GLYCOTOPE Biotechnology) siguiendo las instruciones del fabricante y mediante el procedimiento descrito
por Bryceson YT et al.(1). Básicamente, en PBMCs incubados con células K562 durante 2 horas, se valoró la
degranulación de las células NK mediante el marcaje con CD107a.
Resultados: El kit comercial aconseja la realización de 3 ratios (NK/diana) de (50/1; 25/1 y 12/1) además de
añadir IL-2 para aumentar la sensibilidad del test. Los coeficientes de correlación de cada uno de los ratios con
los datos obtenidos con el método(1) fueron r=0.529, r=0.695 y r=0.614, respectivamente, obteniendose una
mejor correlación a un ratio de (25/1), p=0.006. Posteriormente se calculó el área bajo la curva (AUC) tomando
como referencia al método(1). Las curvas ROC para el ratio (25/1) sin IL-2 y tras la adición de ésta, mostraron un
AUC de 0,9439 y 0,8367, respectivamente.
Conclusiones: Ambos métodos basados en CF para el estudio de la citotoxicidad de células NK han demostrado ser lo suficientemente sensibles y proporcionan resultados comparables como para ser implantados en
la rutina de los laboratorios de inmunología clínica.
Referencias. 1. Methods Mol Biol. 2010;612:335-52
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Immunology
PO-23 Alterations in distinct subpopulations of circulating innate immune
cells from alcoholic patients evaluated by flow cytometry
Marileia Chaves Andrade(1,2), Juan E. Viñuela Roldán(1),
Alba García Villafranca(3), Carmen Vidal(4), Arturo González Quintela(3)
Laboratory of Immunology, CHUS, Santiago de Compostela University, Santiago
de Compostela. (2)Pathophysiology Department, CCBS, Universidade Estadual de
Montes Claros, Montes Claros, Brazil. (3)Servicio de Alergología, CHUS, Santiago de
Compostela University, Santiago de Compostela. (4)Internal Medicine Department,
CHUS, Santiago de Compostela University, Santiago de Compostela
(1)
Introduction: Alcoholic Hepatitis (AH), an inflammatory and progressive disease, is one of the major causes
of mortality in the world. The involvement of different cellular subsets of innate immune system and their
contribution to the liver damage is still unknown. We investigated some peripheral blood subsets focusing in
monocytes, dendritic cells (DC), myeloid-derived suppressor cells (MDSC), natural killer cells (NK) and NKT
cells in patients with (AH) or without liver disease (AWLD) in comparison to healthy individuals.
Material and Methods: We evaluated by multiparametric four-color flow cytometry (FACsCalibur), in age and
sex-matched 23 alcoholic patients (14 and 9, from AWLD and AH groups, respectively) and 10 healthy subjects, the percentage of classic (CD14+CD16-), intermediate (CD14+CD16+) and inflammatory circulating monocytes (CD14-CD16+); total DC and their subsets, phenotypically identified as precursor (CD11c+CD123+),
myeloid (CD11c+CD123-) and lymphoid cells (CD11c-CD123+); MDSC (CD11b+CD33+HLA-DRLow), total circulating NK cells (CD3-CD56+); total NKT cells (CD3+CD56+CD16+/-), and their subpopulations named NKT
1 (CD3+CD16+CD56-), NKT 2 (CD3+CD16-CD56+ ) and NKT 3 (CD3+CD16+D56+).
Results: AH patients presents an increase in the percentage of circulating inflammatory monocytes (13±4)
in comparison to AWLD patients (7 ±4) and healthy individuals (4±2), but in the other hand, both patients
group showed an increase in the percentage of total monocytes CCR5+ (AWLD:11±3;AH:36±3) in comparison to controls (6±3), being more pronounced in AH group. Was observed a marked decrease in the percentage of total DC in both patients group (AWLD:0.7±0.2;AH:0.3±0.05) in comparison to controls (1.2±0.5).
The precursor DC was the subset more affected in AH patients. An increase in the ratio myeloid/lymphoid
DC subsets was also evidenced. Both alcoholic groups showed a decrease in the percentage of circulating
NKT cells markedly associated with NKT 2 subpopulation (AWLD:5.5±2;AH:3.2±0.9), in comparison to control group (12.7±1.5). In turn, was observed a significant increase in the percentage of circulating MDSC
(AWLD:2.8±0.8;AH:3.6±0.5) in comparison to healthy controls (0.76±0.05). Interestingly, in AWLD patients,
the alterations in the circulating precursor DC subset and NKT cells were correlated, positive and negatively,
respectively, with increasing time without ingesting alcohol.
Conclusions: The preliminary results show that alcohol consumption have an impact in the percentage of
circulating innate immune cells, affecting mainly DC, myeloid suppressor cells and selectively one subset
of NKT cells, being more pronounced in patients AH patients. Additionally, in AWLD patients, stop drinking
alcohol had a beneficial effect on DC and NKT cells, opening perspectives to investigate potential biological
markers of prognosis.
22
Posters
Immunology
PO-24 Changes in minoritary peripheral B and T cell subsets are detected
early after starting fingolimod treatment in relapsing-remitting multiple sclerosis
patients. A 12 months follow-up
Aina Teniente Serra(1), José Vicente Hervás(2), Bibiana Quirant Sánchez(1),
M.ª José Mansilla(1), Marco A. Fernández(3), Laia Grau López(2), Cristina Ramo Tello(2),
Eva Martínez Cáceres(1)
Immunology Division. (2)Multiple Sclerosis Unit, Germans Trias i Pujol University
Hospital and Research Institute, Universitat Autònoma de Barcelona, Focis Center
of Excellence. (3)Flow Cytometry Facility, Germans Trias i Pujol Research Institute,
Barcelona
(1)
Fingolimod is an oral treatment for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS) that interferes with the sphingosine-1-phosphate receptor-1 leading to the entrapment of lymphocytes in lymphatic nodes.
Aim: Determine the long-term effect of fingolimod on minor lymphocyte subpopulations in peripheral blood of
RRMS patients.
Material and methods: Longitudinal study of whole blood samples of 13 relapsing-remitting MS patients
before and after (+1,+3,+6,+9,+12) months of treatment, using 8-color multiparametric flow-cytometry (FACSCantoII, BD Biosciences).
Results: Fingolimod treatment reduced lymphocyte counts from month +1 until end of follow-up (basal: 1728 ±
520 vs +1m:511 ± 224 cells/µl, p < 0.001) with an important reduction in the percentage of naïve T cells (CD4+:
basal:33.34±12.05 vs +1m:11.78 ± 8.42%; CD8+: basal: 38.21 ± 16.63 vs +1 m: 4.72 ± 4.82%, p<0.001). In
contrast, no significant changes in the percentage of central memory, early and late effector memory and
effector cells (TEMRA) were found. Interestingly, a correlation between Th17 and Tregs, in percentages and
counts, (r=0.79 and r=0.89, respectively) was observed, resulting in a maintenance of the balance Th17/Treg
during the follow-up.
Although the percentage of total B cells decreased (basal: 10.86 ± 8.43 vs +1 m: 4.62 ± 1.81%, p < 0.001), no
changes were found in relative levels of naïve, unswitched and switched memory B cells. An increase in the
percentage of CD24hiCD38hi transitional B cells, from month +3 until end of follow-up (basal: 7.02 ± 3.99 vs +
3 m: 22.68 ±1 1.35%,p = 0.006) was observed.
Conclusions: Fingolimod treatment induces an important decrease of lymphocyte counts as well as changes
in relative percentages of minor lymphocyte subpopulations in peripheral blood of RRMS patients already in
the first month and maintained until month +12.
The correlation between Th17 and Treg cells might explain the beneficial effect of fingolimod in MS, although
deserves further investigation.
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Immunology
PO-25 Experiencia del Complejo Hospitalario Universitario Insular Materno
Infantil respecto a la variación de subpoblaciones linfocitarias en pacientes con EM
tratados con fingolimod
Alexandre Bosch Martínez(1), Mª Isabel González Henríquez(1),
Olga Montes Ares(1), Alberto Torio Ruiz(1), Miguel Hervás García(2)
Unidad de Inmunología. (2)Servicio de Neurología, Complejo Hospitalario Universitario
Insular Materno Infantil, Las Palmas de Gran Canaria, Las Palmas
(1)
Introducción: El Fingolimod (FTY720) es un modulador del receptor esfingosina-1-fosfato (S1P), empleado como
tratamiento para reducir eventos inflamatorios en el Sistema Nervioso Central (SNC) en pacientes con Esclerosis
Múltiple remitente-recurrente (EM), cuyo resultado es la retención selectiva y reversible de las subpoblaciones
celulares que expresen el receptor CCR7 (células B y células T vírgenes y de memoria) en los órganos linfoides
secundarios. Se reduce así la circulación de linfocitos autorreactivos y evita su infiltración en el SNC. Con el objetivo de evaluar el efecto del FTY720 en la distribución de las subpoblaciones linfocitarias de pacientes con EM,
se realiza un estudio mediante citometría de flujo definiendo cuáles son las responsables de la linfopenia que se
produce en sangre periférica.
Material y Métodos: El estudio consta de 17 pacientes diagnosticados de EM en tratamiento con FTY720 (0.5mg)
remitidos por el Servicio de Neurología. Se realizó un marcaje en superficie de las subpoblaciones linfocitarias
con dos combinaciones de anticuerpos (CD45-FITC, CD4-RD1, CD8-ECD y CD3-PC5) y (CD45-FITC, CD56-RD1,
CD19-ECD y CD3-PC5), adquiridas en un citómetro de flujo (Cytomics FC500, Beckman Coulter) y analizadas en
CXP Software.
Resultados: Tras el comienzo del tratamiento los pacientes presentan una rápida disminución de aquellas subpoblaciones que expresan CCR7, (células B (CD19+) y T (CD3+)) en el caso de estas últimas, las principales responsables de dicho descenso son las células T cooperadoras (CD3+CD4+), por el contrario no se aprecia variación en
los valores de células T citotóxicas (CD3+CD8+). Respecto a las células Natural Killer (CD3-CD56+), los porcentajes desde la primera dosis aumentan, como también lo hacen los de las células NKT (CD3+CD56+), consecuencia
de la disminución de los porcentajes de B y T.
Conclusión: Los resultados obtenidos se corresponden y confirman lo descrito por la bibliografía. El FTY720
provoca un rápido descenso del recuento linfocitario en sangre periférica y una inversión del cociente CD4/CD8
mientras preserva funciones inmunes. Estas variaciones se mantienen estables a lo largo del tratamiento.
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Immunology
PO-26 BM-MSC strongly inhibit cytokine production by naïve, memory
and effector CD4+ and CD8+ T cells from rheumatoid arthritis patients,
independently of disease activity status
Mónia Pedrosa(1,2), Cátia Duarte(3), Paula Laranjeira(1), Joana Gomes(1,4),
Tânia Ribeiro(5), Francisco Santos(5), Brígida Antunes(5), Susana Pedreiro(1), António
Martinho(1), Margarida Fardilha(2), Hélder Trindade(1), José António Pereira da Silva(3),
Artur Paiva(1)
Portuguese Institute for Blood and Transplantation, Coimbra. (2)Signal Transduction
Laboratory, Center of Cellular Biology, Sacs and Department of Biology,
University of Aveiro. (3)Rheumatology Department of University Hospital Center
of Coimbra. (4)Qopna, Department of Chemistry, University of Aveiro.
(5)
CellB Advanced Therapeutics, Cantanhede, Portugal
(1)
Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease characterized by autoimmune activation with selfreactive T cells playing a decisive role in the disease process. Despite of the progresses achieved by drugs that
block pro-inflammatory cytokines, but still more than 1/3 of patients do not respond adequately to treatment.
To overcome this limitation, mesenchymal stromal cells (MSC) based therapies have been recently explored.
MSC are a population of adult non-hematopoietic stem cells with homing capability and which possess the
ability of modulating the function of immune cells.
The aim of this study was to investigate how MSC influence the expression of cytokines by peripheral blood
(PB) T cells from RA patients.
To this purpose we co-cultured PB mononuclear cells (MNC) from 12 RA patients and 8 healthy individuals
with bone marrow (BM)-MSC, during 20 hours in a ratio of 2:1 (MNC:BM-MSC). Then, to induce cytokine
production by T cells, we added PMA plus ionomycin to the cell culture, for 4 hours. The frequency of CD4+
and CD8+ T cells producing cytokines (IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-17 and IL-9), distributed among the different
functional compartments, was measured by flow cytometry. Moreover, IL-4, IL-10, TGF-β and CTLA-4 mRNA
expression was assessed in purified CD4+ and CD8+ T cells.
BM-MSC clearly induced a decrease in the frequency of CD4+ and CD8+ T cells producing pro-inflammatory
cytokines in all functional compartments and in both groups under study. However, the intensity of inhibition
varied with the cytokine and the T cell functional compartment. Regarding the mRNA expression of cytokines,
the presence of BM-MSC induced their increase in CD4+ T cells for both groups, although in a lower extent
in RA patients. Likewise, an augment of mRNA levels of the abovementioned molecules was detected in the
presence of BM-MSC, which was more pronounced among RA patients; except for IL-4, whose expression
decreased in both groups.
Our data show that BM-MSC effectively inhibit pro-inflammatory cytokines production by CD4+ and CD8+
T cells in all functional compartments and increase the mRNA expression of anti-inflammatory molecules in
both T cell populations. These results support the potential utility of BM-MSC in the treatment of autoimmune
diseases.
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PO-27 Immunomodulatory effect of human bone marrow-derived
mesenchymal stromal cells in peripheral blood monocytes subpopulations and
myeloid dendritic cells in rheumatoid arthritis
Joana Gomes, Cátia Duarte, Paula Laranjeira, Mónia Pedrosa, Tânia Ribeiro, Francisco
Santos, Brígida Antunes, Susana Pedreiro, António Martinho, Rosário Domingues,
Hélder Trindade, José António Pereira da Silva, Artur Paiva
Portuguese Institute for Blood and Transplantation Qopna, Department of Chemistry,
University of Aveiro, Rheumatology Department of University Hospital Center
of Coimbra, Signal Transduction Laboratory, Center of Cellular Biology, Sacs and
Departament of Biology, University of Aveiro, Cell2B Advanced Therapeutics
Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic and autoimmune disease that leads to joint destruction, subsequent to
immune cell infiltration in the synovial membrane, including myeloid dendritic cells (mDC) and monocytes. These cells have the ability to produce cytokines, creating a proinflammatory environment.The immunosuppressive
potential of mesenchymal stromal cells (MSC) makes them an attractive therapeutic approach for autoimmune
diseases. The present study aimed to investigate the influence of bone marrow (BM)-derived MSC on peripheral
blood monocyte subpopulations and mDC from rheumatoid arthritis patients.
For this purpose, BM-MSC from healthy adults were co-cultured with peripheral blood mononuclear cells
(MNC) from 12 patients with RA and 6 healthy individuals, in a ratio of 2:1 (MNC:BM-MSC), during 20 hours.
Cells were subsequently stimulated with LPS and IFNγ during 6 hours, with or without BM-MSC depletion prior
to stimulation.
The frequency of classical, non-classical and intermediate monocytes and mDC expressing TNF-α, MIP-1β,
CCR7 and CD83 was evaluated by flow cytometry. IL-1β, CXCL10, CXCL9, CCL5 and CCL3 mRNA expression
was measured after purification of all cell populations.
Our results showed that BM-MSC effectively inhibit TNF-α and MIP-1β expression in all monocyte subpopulations and mDC. However, the degree of inhibition was greater for TNF-α. CCR7 and CD83 expression decreased
for all cell populations under study from RA patients. Remarkably, for RA intermediate monocytes, the degree
of inhibition of CCR7 expression was negatively correlated to the disease activity score, as BM-MSC displayed
a weaker inhibitory effect over patients with higher score. Concerning to IL-1β mRNA expression, BM-MSCderived inhibition was efficient for all monocyte subpopulations, while the mRNA expression of CXCL10 and
CXCL9 was inhibited only in classical monocytes. Interestingly, a decrease of CXCL9 mRNA expression in nonclassical monocytes occurred when BM-MSC were depleted. Moreover, BM-MSC decreased CCL5 and CCL3
mRNA levels in non-classical monocytes.
This study shows that BM-MSC induce a decreased expression of inflammatory mediators by monocytes and
mDC from RA patients, supporting that BM-MSC-based therapies may be a valuable approach for this disease.
26
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Immunology
PO-28 Subpopulações de monócitos e de célula dendríticas na artrite
reumatóide
Maria Inácio(1), Sofia Vale(2), Cátia Duarte(3), António Martinho(1),
Hélder Trindade(1), Susana Pedreiro(1), José António Pereira Silva(3), Artur Paiva(1)
Área Transplantação, Instituto Português do Sangue e da Transplantação.
Departamento de Química, Universidade de Aveiro.
(3)
Serviço de Reumatologia, Centro Hospitalar da Universidade de Coimbra
(1)
(2)
A Artrite Reumatóide (AR) é uma doença auto-imune caraterizada por uma inflamação na membrana sinovial,
levando consequentemente à destruição da cartilagem e do osso e a várias complicações sistémicas. Os
monócitos e as células dendríticas (DC) migram para o local da inflamação, onde são responsáveis pela apresentação de antigénios às células T e pela libertação de várias citocinas pró-inflamatórias, que contribuem para
a inflamação observada na AR.
Os objectivos deste trabalho foram quantificar e caracterizar funcionalmente as diferentes subpopulações de
monócitos (clássicos, intermédios/HLA-DR+, intermédios/HLA-DR++ e não clássicos) e das DC mielóides
(mDC) e plasmacitóides (pDC) do sangue periférico de doentes com AR e num grupo controlo.
Estudaram-se 23 doentes com AR (17 do sexo feminino e 6 sexo masculino) em vários estádios de atividade
da doença e 21 amostras de indivíduos saudáveis, 14 do sexo feminino e 4 sexo masculino. As populações de
monócitos e de DC foram quantificadas por citometria de fluxo, com base na seguinte combinação de anticorpos monoclonais:CD16/CD45/CD68/CD300e/CD14/CD33/CD123/HLADR. Posteriormente as várias subpopulações celulares foram separadas por cell sorting, para estudo da expressão génica de IL-10, IL-12p35, TNFa,
e de CX3CR1, por RT-PCR.
No grupo de doente observou-se uma diminuição significativa do número absoluto e frequência de monócitos
não clássicos, de mDC e de pDC e uma diminuição da frequência de monócitos intermédios/HLA-DR+. Do
ponto de vista fenotípico, observou-se um aumento da expressão de CD14 em todas as subpopulações de
monócitos, de CD300e nos monócitos clássicos, intermédios HLA-DR++, não clássicos e nas mDC, de CD68
nos monócitos intermédios/HLA-DR++ e nos não clássicos e de CD123 nas pDC. O estudo da expressão genética revelou, no grupo com AR, um aumento significativo da expressão de IL-10 nos monócitos clássicos e
nas duas subpopulações de monócitos intermédios; de IL-12p35 e de TNFα nos monócitos intermédios/HLADR+ e uma diminuição da expressão de CX3CR1 nos monócitos clássicos e não clássicos quando comparado
com o grupo controlo.
Os resultados obtidos sugerem alterações numéricas, fenotípicas e funcionais nas diferentes subpopulações
de monócitos e de DC na AR, reforçando o envolvimento destas células na fisiopatologia desta doença.
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Immunology
PO-29 Utilidad del test de activación de basófilos para la valoración
de la relevancia clínica de IgE específica a profilinas en sospecha de alergia al látex
I. Magriz Tascón(1), C. Cámara Hijón(1), A. Rodríguez Trabado(2), E. Madany(1),
J.A. García-Trujillo(1), S. Romero Chala(1), I. Tovar García(1), L.F. Fernández Pereira(1)
Unidad de Inmunología, Complejo Hospitalario de Cáceres.
Unidad de Alergología, Hospital Ciudad de Coria, Coria (Cáceres)
(1)
(2)
Introducción: Las profilinas, una de la principales proteínas presentes en látex, muestran una gran homología
y reactividad cruzada incluso entre especies de plantas filogenéticamente alejadas (gramíneas, frutas cítricas,
melón, plátano y tomate). Discriminar entre dicha reactividad cruzada y una relevancia clínica real es una de las
indicaciones en las que el test de activación de basófilos (TAB) ha demostrado clara utilidad.
Presentamos el caso de una mujer de 41 años con síntomas de prurito óculo- nasal, estornudos y congestión en
primavera, acompañados de disnea y tos no productiva con esfuerzos físicos que ceden con el reposo. Prurito
faríngeo autolimitado con la ingesta de todas las frutas, así como con el tomate crudo. Además, refiere erupción
papulosa y eritematosa en dorso de manos a la media hora del contacto con guantes de látex y goma, que no le
sucede con guantes de vinilo.
Material y métodos: Pruebas cutáneas en prick e IgE específica (IgEs), así como el test de uso con guantes de
látex. Para el TAB se realizó dosis curva-respuesta con antígeno de látex (ALK-Abelló) desde 100 ng/ml a 2000 ng/
ml. Protocolo de marcaje utilizado fue CD63 FITC/ CD203c PE con lisis y lavado posterior (Optilyse C). Adquisición
en un citómetro FC500 con software MXP y posterior análisis con software Kaluza (reactivos, equipos y software
de citometría de Beckman Coulter).
Resultados: Prick test positivos para gramíneas y olivo, profilina de phleum, platanus acerifolia, melón y tomate.
IgE total 159 KU/L. IgEs positiva para látex (1.33 KU/L), rHer b8 (8.02 KU/L), rPhl p12 (5.69 KU/L), rPhl p1 (27 KU/L),
ole 1 (0.63 KU/L), sandía (3.62 KU/L) y tomate (5.56 KU/L). Tanto el prick test como el test de uso con látex fueron
negativos. En cambio el TAB fue positivo para latex desde la concentración más baja estudiada (100 ng/ml) llegando a alcanzar el plateau de activación máxima (80%) a partir de 1000 ng/ml.
Conclusión: Por lo tanto, se diagnosticó a la paciente de rinoconjutivitis y asma bronquial por alergia a gramíneas,
síndrome de alergia oral a frutas y alergia al látex. El diagnóstico de alergia al látex se pudo establecer por el TAB,
ya que el resto de pruebas funcionales (prick y test de uso fueron negativas) siendo la única prueba que demostró
funcionalidad y no reactividad cruzada sin relevancia clínica.
28
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Immunology
PO-30 Valor diagnóstico de la citometría de flujo en la enfermedad celíaca
Laura Sánchez Muñoz(1), José Mario T. Morgado(1), Juan Ruiz Martín(2), Julio Valle(3)
Instituto de Estudios de Mastocitosis de Castilla-La Mancha.
Servicios de Anatomía Patológica y (3)Digestivo, Complejo Hospitalario
de Toledo
(1)
(2)
Introducción y objetivos: La enfermedad celiaca (EC) es una intolerancia permanente a los componentes del
gluten de la dieta que cursa con una alteración de la mucosa del intestino delgado, generalmente reversible al
excluir el gluten de la dieta. La patogenia del proceso es inmunitaria y se han descrito alteraciones constantes
en las poblaciones de los linfocitos intraepiteliales intestinales (LIE). El objetivo de este trabajo es evaluar la
utilidad del estudio de las subpoblaciones de LIEs mediante citometría de flujo (CF) en el diagnóstico de la EC.
Material y métodos: Se incluyeron en el estudio 330 pacientes con sospecha de EC. En todos ellos se determinaron los niveles de Ac anti-tTG y se realizó una gastroscopia con toma de seis biopsias de duodeno
descendente para estudios histológicos e inmunofenotípicos. Tras la desepitelización de las muestras de biopsia duodenal, se analizó la distribución de los LIE por CF multiparamétrica, mediante el marcaje de las células
individualizadas con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos. El diagnóstico de EC se basó
en la presencia de serología positiva junto con cambios compatibles en las biopsias duodenales. En los casos
dudosos se consideró diagnóstico de EC la respuesta clínica y serológica a la dieta sin gluten.
Resultados: La sensibilidad y especificidad del estudio histológico fue del 90% (85-94%) y 98% (95-100%),
respectivamente, mientras para el estudio inmunofenotípico fue del 92% (88-96%) y 97% (94-100%), respectivamente. Considerando como compatible con EC los casos con al menos uno de los estudios compatible,
obtuvimos una sensibilidad de 99% (97-100%) y una especificidad de 95% (91-98%). La menor especificidad
del criterio combinado en comparación con la de cada prueba por separado es compensada por la mayor sensibilidad resultando ser capaz de detectar virtualmente el 100% de los casos con enfermedad celíaca.
Conclusión: El uso combinado de la CF y la histología en el diagnóstico de la EC, incrementa la sensibilidad
en el diagnóstico de EC. Nuestros resultados apoyan el inmunofenotipaje rutinario de LIE por CF en todos los
casos de sospecha de EC.
29
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Immunology
PO-31 CD26 subpopulations of central and effector memory T cells exhibit
different susceptibility to cell death
D. Silva(1), M. Jesus(2), I. Silva(2), J. Loureiro(3), H. Trindade(2), A. Paiva(2)
Faculty of Science and Tecnology, University of Coimbra.
Blood and Transplantation Center of Coimbra, Portuguese Institute
of the Blood and Transplantation, Coimbra. (3)District Hospital of Figueira da Foz
(1)
(2)
CD26 is expressed by most cell types and is involved in signaling pathways, apoptosis and in the regulation of
immune responses. The precise function of CD26 varies among different cell types. In T cells, CD26 acts as a
costimulatory molecule and is known to regulate apoptosis, often being associated with enhanced protection
against cell death. CD26 expression varies among the different T cell subsets, differentiation stages and activation status. Furthermore, memory T cells that differ in the levels of CD26 expression display different responses
to stimulus, suggesting further subdivisions of that subset. Hence, the main goal of this study was to characterize different central or effector memory T cell subsets based on CD26 expression.
Peripheral blood samples were collected from healthy donors. Quantification and characterization of naïve
(CD45RA+CD27+), central memory (CD45RA-CD27+), effector memory (CD45RA-CD27-) and effector
(CD45RA+CD27-) CD4+ and CD8+ T cells, as well as the expression of CD26, BCl2 and CD95, within each cell
subpopulation, was performed by 8-color flow cytometry with the following combinations: BCl2-FITC or CD26FITC/ /CD26-PE or CD95-PE/CD4-PB/CD8-V500/CD27-PC5/CD45RA-PC7/CD28-APC/CD3-APC-H7.
With this strategy CD4 or CD8 central and effector memory T cells were subdivided in 3 other subpopulations
based on the differential expression of CD26: CD26high, CD26int and CD26dim/neg.
Among central or effector memory CD4 T cells, we observed a higher percentage of CD26int and similar frequencies of CD26high and CD26 dim/neg.. These three subpopulations had similar frequencies among central
memory CD8 T cells, while effector memory CD8 T cells were mostly CD26 dim/neg.
Regarding central or effector memory CD4 T cells, CD26high subpopulation had the highest expression of
CD95, followed by CD26int and CD26dim/neg. The opposite was observed for BCl2, although in a lower extension. The same pattern of expression was also observed for central memory CD8 T cells.
Our preliminary results suggest a differential CD26 expression, particularly among central memory T cells, subdividing this subset in 3, which exhibit a different susceptibility to cell death. It will be important to understand
if the number of these T cell subsets varies in inflammatory conditions, such as autoimmune diseases.
30