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BOTANICA
Acta Científica Venezolana, 51: 90–95, 2000
MULTIPLICACION MASIVA DEL CAFE
(Coffea arabica L. cv. Catimor) MEDIANTE CULTIVO DE
SUSPENSIONES CELULARES EMBRIOGENICAS
Luis Hermoso-Gallardo y Andrea Menéndez-Yuffá
Universidad Central de Venezuela, Facultad de Ciencias, Instituto de Biología Experimental, Centro de Botánica Tropical,
Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Apartado 47114, Los Chaguaramos, Caracas 1041A.
Recibido: 01/06/99 ; Revisado: 12/01/00 ; Aceptado: 06/06/00
RESUMEN: Las suspensiones celulares ofrecen ventajas como sistema de propagación masiva de plantas por las altas tasas de multiplicación que presentan, una mayor homogeneidad en las condiciones de cultivo y la posibilidad de automatización. En el presente estudio
se analizaron distintas condiciones experimentales para el establecimiento de suspensiones celulares embriogénicas de café (Coffea arabica L. cv. Catimor). Las condiciones óptimas para el establecimiento de suspensiones celulares embriogénicas de café consistieron en
cultivar secciones de hoja durante 12 semanas (Etapa I) en un medio sólido con las sales de Murashige y Skoog (MS), suplementado
con 2 mg/l de cinetina y 0,5 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoacético (medio 1). Bajo estas condiciones de cultivo se formó un tejido de callo
que fue transferido a medio líquido con 5 mg/l de 6-bencilaminopurina (medio 2). Después de permanecer 12 días en medio líquido con
agitación (Etapa II), los cultivos fueron tamizados y se mantuvieron en el mismo medio, renovándolo cada 8 días (Etapa III). Con el método
utilizado se logró la diferenciación de 1884 embriones en 50 ml, los cuales, una vez colocados en las condiciones para su germinación,
formaron plántulas de apariencia normal. Palabras clave: Café, embriogénesis somática, propagación clonal, suspensión celular.
MASSIVE MULTIPLICATION OF COFFEE (Coffea arabica L. cv. Catimor)
THROUGH EMBRYOGENIC CELL SUSPENSION CULTURE
ABSTRACT: Cell suspensions offer several advantages as a system for massive propagation because of the high rates of multiplication,
the higher homogeneity in the culture conditions and the possibility of automatization. In this study, different experimental conditions were
analyzed to establish embryogenic cell suspension cultures of coffee. The best conditions to establish the embryogenic cell suspension
cultures of coffee were as follows: coffee leaf sections were cultivated during 12 weeks (Stage I) in a solid medium with the Murashige and
Skoog salts, 2 mg/l kinetin and 0.5 mg/l 2,4-dichlorophenoxiacetic acid (medium 1). Under these conditions the explants formed a callus
tissue that was transferred to a liquid medium containing 5 mg/l of 6-benzylamino-purine (medium 2). After 12 days in a shaking liquid
medium (Stage II), the cultures were sieved and were maintained in the same media, which was renewed every eight days (Stage III). This
method yielded 1884 embryos in 50 ml; placing the embryos under conditions for germination yielded plantlets of normal appearance .
Key Words: Cell suspension, clonal propagation, coffee, somatic embryogenesis.
INTRODUCCION
El Café (Coffea sp.) es un rubro muy importante en el mercado agrícola internacional y también es un cultivo esencial para la economía y el consumo en Venezuela. Su
propagación in vitro se ha realizado por 2 métodos fundamentales: la embriogénesis somática y el cultivo de microesquejes, donde en corto tiempo se logra la propagación masiva de variedades selectas. Existen amplios antecedentes sobre la inducción de embriogénesis somática
en café, una revisión reciente puede encontrarse en Menéndez y García7 .
El cultivo de suspensiones celulares embriogénicas
ofrece varias ventajas en comparación con el cultivo en
medio sólido, siendo una de ellas la obtención de altos
coeficientes de multiplicación. Asímismo, durante el crecimiento en un medio líquido las células están inmersas en
el medio de cultivo y por ende expuestas a los nutrientes,
hormonas, etc., lo cual permite una mayor precisión y uniformidad en la aplicación de las diferentes condiciones de
cultivo, facilita la manipulación de las células y embriones
y permite un mejor seguimiento de su desarrollo. Adicionalmente, en las suspensiones celulares, los agregados
pro-embriónicos y embriones están usualmente separa-
Tabla 1. Composición de los medios de cultivo.
Constituyentes
M1
Sales
Piridoxina
Acido Nicotínico
Hormonas (mg/l)
Agente
solidificante (g/l)
Agua de Coco
(% V/V)
MS
1 mg/l
1 mg/l
2 KIN
0,5 2,4-D
3G
-
M2
Nombre del medio
M3
C1
D
G
MS/2 MS/2 MS/2 MS/2 MS/2
1 mg/l 1 mg/l
1 mg/l 1 mg/l
5 BAP
1 2,4-D 0,8
8 BAP ANA
7,5 A
- 7,5 A
-
-
-
-
-
CO
100
* Todos los medios contienen 100 mg/l mio-inositol, 10 mg/l tiamina y 35 mg/l cisteína.
G = gelrite, A = agar;
ANA: ácido naftaleno acético; KIN: cinetina; BAP: 6-bencilamino-purina; 2,4-D: ácido, 2,4-diclorofenoxiacético
dos unos de otros flotando libremente en el medio, por
lo que se pueden remover fácilmente y colocar en medio
sólido para la regeneración de plantas13 , haciéndose más
fácil la automatización. Zamarripa et al.16 , Bieysse et al.1 y
Noriega y Söndahl10 han realizado experimentos sobre los
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Suspensiones celulares de café
Figura 2. Embriones somáticos de café en diferentes estadios.
Figura 1. Embrión somático de café en un estadio de pocas
células, 40X.
sistemas de cultivos de células en suspensiones embriogénicas de café, encontrando que podría ser un sistema
óptimo para la propagación de este cultivo.
En la presente investigación se evaluaron diferentes tratamientos para el establecimiento y regeneración de suspensiones embriogénicas de café (Coffea arabica L. cv.
Catimor) con el fin de determinar las condiciones óptimas
para la multiplicación masiva de esta planta. Los resultados son de potencial importancia para su aplicación en
la propagación acelerada en gran escala de variedades
de interés o individuos selectos obtenidos en programas
de mejoramiento; asímismo, el sistema de suspensiones
celulares sirve como material inicial en el aislamiento de
protoplastos y para la transformación genética.
Después de la desinfección, se tomaron secciones de
hoja de 1 cm2 incluyendo la nervadura central y fueron
sembradas con el haz sobre el medio de cultivo M1 o C1
(Tabla 1). Los explantes fueron cultivados en dichos medios durante 12 semanas (Etapa I, inducción de callo), a
temperatura ambiente y en oscuridad. Mediante este tratamiento se obtuvo un tejido de callo que fue utilizado para
iniciar las suspensiones celulares.
Básicamente, los medios de cultivo utilizados estaban
constituidos por las sales de Murashige y Skoog9 completas (MS) o diluídas a la mitad (MS/2), 100 mg/l de mioinositol, 35 mg/l de L-cisteína, 10 mg/l de tiamina-HCl y
30 g/l de sacarosa; el pH de los medios se ajustó a 5,6 y
fueron esterilizados en autoclave a 120Æ C durante 15 minutos. La composición hormonal y otras variaciones en
la composición de los medios utilizados para los distintos
tratamientos y etapas se indican en la Tabla 1.
MATERIALES Y METODOS
Etapa II. Disgregación de los callos
Suspensiones celulares
El procedimiento para establecer las suspensiones celulares embriogénicas de café consistió de cuatro etapas.
Etapa I. Establecimiento in vitro de los tejidos foliares e
inducción de callo
Se utilizaron plantas adultas de café (Coffea arabica L. cv.
Catimor). Las hojas de estas plantas completamente expandidas pero no senescentes y sin lesiones fueron cosechadas y desinfectadas. El tratamiento de desinfección
consistió de un lavado con agua corriente y jabón azul, seguida de una encubación durante 15 minutos en una solución de Betadine al 10%, dos lavados con agua destilada
y 15 minutos de agitación en cloro comercial (Hipoclorito
de sodio al 5,25%) al 50%. Finalmente, la hojas fueron lavadas dos veces con agua destilada estéril para remover
el cloro.
Para iniciar las suspensiones celulares se seleccionaron
callos embriogénicos, caracterizados por presentar un color crema claro o blanco y tener consistencia no friable.
Un gramo de dichos tejidos fue inoculado en 50 ml de medio M2 (para aquellos callos iniciados en M1) o D (si el
callo fue iniciado en C1), donde se incubaron durante 12
días, en oscuridad a temperatura ambiente, bajo agitación
orbital de 110 r.p.m.
Etapa III. Multiplicación celular y diferenciación de embriones
El cultivo obtenido en la Etapa II se filtró a través de una
malla de 60 mesh, conservándose sólo las células y agregados que pasaron por el tamiz, los cuales fueron mantenidos en el mismo medio de cultivo en oscuridad, a temperatura ambiente y con agitación de 110 r.p.m. El medio
fue renovado cada 8 días.
92
Hermoso-Gallardo y Menéndez-Yuffá
Tabla 2. Resumen de los tratamientos y rendimiento en producción de embriones somáticos.
Nombre del tratamiento
T1
T2
T3
T4
Medio de iniciación
M1
M1
C1 M1
Medio de disgregación
M2 y
M2
D
CO
y diferenciación
M3
Medio de germinación de embriones
G
G
G
G
NÆ de embriones producidos en 50 ml 828a 1884b 1478c 8d
NÆ de embriones por litro|
16560 37680 29560 160
* La suspensión se mantuvo 4 semanas en M2 y luego se transfirió a medio M3
Los valores indicados corresponden al promedio de producción de embriones
después de 6 semanas de cultivo en medio líquido.
indican diferencias significativas p
a;b;c;d
Las letras diferentes
< 0,05. | Estos valores se calcularon a partir
de los valores observados (número de embriones en 50 ml), únicamente para homogeneizar las unidades con la de otros trabajos y permitir la comparación con los
Figura 3. Embriones somáticos de café diferenciados en un cultivo de células en suspensión.
Se realizaron observaciones de la morfología de las
suspensiones y sus células y se cuantificó la producción
de embriones somáticos para cada tratamiento; para ello,
todos los embriones somáticos producidos en cada tratamiento fueron contados visualmente.
Etapa IV. Germinación de embriones somáticos
Cuando los embriones somáticos se encontraban en estado de torpedo, fueron transferidos a condiciones de germinación, previamente descritas por García y Menéndez3 .
Con el fin de determinar las condiciones óptimas para el
establecimiento de las suspensiones celulares y su posterior regeneración por embriogénesis somática se ensayaron los 4 tratamientos que se resumen en la Tabla 2.
ANALISIS ESTADISTICO
La producción de embriones para cada tratamiento fue
analizada mediante un test no paramétrico ANOVA unifactorial por rangos de Kruskal-Wallis y luego se aplicó una
prueba de Duncan. Las diferencias fueron consideradas
significativas cuando p < 0,05.
DETERMINACION DE LA DENSIDAD DE INOCULO INICIAL
La densidad de inóculo inicial se determinó en ensayos
preliminares, mediante el procedimiento siguiente: 1, 5 ó
10 g de callo de 12 semanas en medio M1 fueron colocados en 50 ml de medio líquido M2 con agitación, en el
cual se mantuvieron durante 12 días para lograr su disgregación. Posteriormente, se tamizó la suspensión a través
de una malla de 60 mesh con el fin de eliminar aquellos
fragmentos de callo que no se disgregaron. Para establecer la densidad de inóculo óptima, se cuantificó la produc-
mismos.
ción de embriones. En dicho ensayo se estableció que la
densidad de inóculo óptima fue de 1 g de callo en 50 ml
de medio (20 g/l). Es importante resaltar, que aunque la
suspensión se iniciaba con 1 g en 50 ml de medio (20 g/l),
después de tamizarla quedaban aproximadamente 10 g/l,
debido a que se eliminaban los fragmentos grandes sin
disgregar, es por ello, que en la curva de crecimiento de
peso fresco la medida inicial fue de 10 g/l.
CURVA DE CRECIMIENTO DE LAS SUSPENSIONES
CELULARES
El crecimiento de las suspensiones celulares de café fue
evaluado determinando el Peso Fresco (PF), el peso seco
(PS) y mediante contaje celular. Para estimar el crecimiento, después de mantener los tejidos creciendo durante 12
semanas en medio M1, se transfirió 1 g de callo a 50 ml de
medio líquido M2, los cuales se mantuvieron con agitación
de 110 r.p.m durante 12 días. Luego, este callo fue tamizado por una malla de 60 mesh. La curva de crecimiento se
elaboró tomando muestras diarias de 1 ml de suspensión,
las cuales fueron centrifugadas a 14000 r.p.m durante 5
minutos, posteriormente se eliminó el sobrenadante y se
determinó el peso del tejido. Estas mediciones se realizaron por triplicado, determinando los pesos diariamente
durante 12 días, en la suspensión cultivada en medio M2
(Tabla 1). Las mismas muestras secadas durante 48 horas a 60Æ C, se utilizaron para determinar el peso seco. El
contaje celular se realizó en un hematocitómetro tipo Neubauer.
RESULTADOS Y DISCUSION
La etapa inicial para el establecimiento de las suspensiones celulares, consistió en la inducción de callo en medio
sólido. Los tratamientos T1, T2 y T4 coincidieron en que
la etapa de inducción de calló se llevó a cabo en el medio
Suspensiones celulares de café
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Figura 6. Incremento en el número de células de la suspensión
celular
Figura 4. Embriones somáticos en distintos estadios de diferenciación: globular (g), corazón (c) y torpedo (t).
Figura 5. Incremento en el peso fresco y seco de la suspensión
celular
M1, que contenía 0,5 mg/l de 2,4-D y 2 mg/l de cinetina, en cambio, en el tratamiento T3 se inició el callo en
un medio que contenía 1 mg/l de 2,4-D y 8 mg/l de BAP
(6-bencilamino-purina); con ambos medios (M1 y C1) se
logró una abundante formación de callo, no observándose
diferencias cualitativas ni cuantitativas en los efectos de
estos dos tipos de medio.
Cuando los callos fueron colocados en el medio de cultivo líquido, los mismos se disgregaron con gran facilidad,
originando una suspensión de alta densidad formada por
agregados de callo de color blanco-beige. El crecimiento
de las suspensiones celulares de café fue evaluado mediante tres parámetros: peso seco, peso fresco y contaje
celular; los tres métodos dieron resultados similares (Figuras 5 y 6). La suspensión celular mostró un crecimiento lineal hasta los días 9 y 10, en los cuales alcanzó la fase estacionaria; un comportamiento similar observaron Grézes
et al.4 , al medir el crecimiento en suspensiones celulares
de Coffea arabica por volumen de células empaquetadas y
por Haldimann y Brodelius5 midiendo el peso seco en suspensiones celulares de la misma especie. La misma tendencia se ha observado en la curva de crecimiento de suspensiones celulares de otras especies, tales como Platycerium coronarium6 , Solanum chnysotrichum15 , en Carya
illinoiensis2 y en Ipomoea y Daucus12 . De acuerdo a la
cinética de crecimiento observada se seleccionó el tiempo
de ocho días para la renovación del medio de cultivo, ya
que al llegar a los días 9-10, el crecimiento alcanzaba la
fase estacionaria.
El crecimiento observado es relativamente lento si se lo
compara con los resultados de Van Boxtel y Berthouly14 ,
en cuyo trabajo se observó un incremento en el peso fresco desde 20 g/l hasta 75 g/l en suspensiones celulares de
Coffea canephora, en cambio, con el tratamiento aplicado
en el presente trabajo se obtuvo un incremento del peso
fresco desde 10 g/l (que fue el inóculo inicial después de
filtrada la suspensión y el momento en el que se empezó
a medir) hasta 12,9 g/l, esta diferencia puede deberse a
las condiciones de cultivo, ya que ellos utilizaron un medio con 1-2 mg/l de 2,4-D y 1 mg/l de cinetina, en cambio
en la presente investigación el medio contenía 0,5 mg/l de
2,4-D y 2 mg/l de cinetina; otra diferencia importante es
que los datos de crecimiento reportados por Van Boxtel y
Berthouly14 fueron obtenidos con Coffea canephora y esta
investigación se llevó a cabo con la variedad Catimor que
es un híbrido cuyas características en su mayoría corresponden a la especie Coffea arabica. Esta forma de crecimiento lento en la suspensión no fue considerada como
un inconveniente del método, ya que como se verá más
adelante, el rendimiento en producción de embriones fue
bastante elevado.
El método para la medición del crecimiento merece especial atención, tal como señalan Rose y Martin12 , los
investigadores que trabajan con célula vegetales se han
confiado principalmente en cuatro medidas de crecimiento
para evaluar el desarrollo de los cultivos, como son: peso
celular fresco, volumen de células empaquetadas, número
de células y peso de células secas. En algunos casos se
94
ha indicado que las curvas de crecimiento basados en datos de una de estas medidas pueden ser interpretadas en
la misma forma que las curvas de los cultivos bacterianos,
ya que son superficialmente similares12 . El peso de células frescas y el volumen de células empaquetadas son
útiles para una evaluación rápida del desarrollo del cultivo,
pero son limitadas para estudios precisos. Consideramos
que hay dificultades en la medición del crecimiento que
son inherentes a los cultivos de células vegetales, debidas
posiblemente a su heterogeneidad, ya que están presentes distintos tipos celulares que difieren en forma, tamaño,
comportamiento de crecimiento y diferenciación. También
se encuentra heterogeneidad en la agregación de las células, ya que algunas se presentan en grupos y otras están
en forma individual. Por los motivos anteriores, en el presente estudio se trabajó con varias medidas de crecimiento, las cuales generaron curvas que en su aspecto general
fueron similares.
Al ser observada en el microscopio la suspensión presentó una composición celular heterogenea, estando formada por células aisladas o agrupadas. Las células no
embriogénicas eran relativamente grandes, con las paredes celulares delgadas y el citoplasma menos denso. Las
células embriogénicas eran más pequeñas, redondeadas,
con paredes celulares gruesas y citoplasma denso, características éstas que ya habían observado Menéndez-Yuffá
y García8 en las células no embriogénicas y embriogénicas de café creciendo en medio sólido. En la Figura 1 se
observa un embrión de pocas células constituido por células que presentan características similares a las células
embriogénicas de la suspensión.
Respecto al rendimiento evaluado según la producción
de embriones, en los distintos tratamientos utilizados (Tabla 2), la mayor producción de embriones (1884 embriones/50 ml) se obtuvo con el tratamiento T2, que consistió
en utilizar medio M1 para la inducción de callo y medio
M2 para la diferenciación de embriones somáticos; el tratamiento que siguó cercanamente en rendimiento (1478
embriones/50 ml) fue el T3, en el cual, el callo fue iniciado en medio C1 y la diferenciación de embriones se indujo en medio D; este último medio es similar al reportado
por Peña11 ; el análisis estadístico de Kruskall-Wallis indicó que las diferencias en producción de embriones entre
los cuatro tratamientos fueron estadísticamente significativas y la prueba a posteriori para comparar las medias
mostró que la producción de embriones con el tratamiento
T2 fue significativamente mayor que con el tratamiento T3.
A continuación, le siguió en rendimiento el tratamiento T1
(828 embriones/50 ml), el cual se diferenció del tratamiento T2 en que incluía un paso intermedio en el cual, después de tamizar la suspensión, ésta fue cultivada durante
4 semanas en medio M2 líquido y luego fue cambiada al
medio M3, el cual no contenía hormonas. Esta variación
redujo notablemente la producción de embriones. Por último, el tratamiento T4 originó una producción de embrio-
Hermoso-Gallardo y Menéndez-Yuffá
nes muy baja, indicando que la utilización de agua de coco como sustituto de la adición de hormonas en el medio
de diferenciación no es apropiada, sin embargo, en este
medio se logró una muy buena disgregación del callo al
pasar el tejido de medio sólido a medio líquido. En todos
los tratamientos estudiados, los embriones somáticos diferenciados comenzaron a observarse después de 6 semanas después de haber tamizado las suspensiones (Etapa
III). Los embriones se diferenciaron en forma asincrónica,
de modo que en las suspensiones celulares se encontraron siempre embriones en todos los estados de desarrollo (Figuras 2, 3 y 4). Una vez colocados en medio para
su germinación (medio G), los embriones dieron origen a
plántulas de apariencia normal, que se adaptaron exitosamente al ser transplantadas a tierra. Comparando los
resultados presentados con los obtenidos en otros trabajos, Zamarripa16 obtuvo 460000 embriones por litro a partir de suspensiones celulares de Coffea canephora y Arabusta; Noriega y Söndhal10 lograron 9000 embriones por
litro utilizando bioreactores para el cultivo de suspensiones celulares de Coffea arabica, Van Voxtel y Berthouly14
obtuvieron 120000 embriones/g de inóculo para Coffea canephora, 92300 para Arabusta y 12300 para Coffea arabica; evidentemente, los rendimientos reportados son sumamente variables, en algunos casos mayores y en otros
menores que los de la presente investigación, lo cual se
puede atribuir a la diferencia en las condiciones de cultivo y a los genotipos utilizados. Bieysse et al.1 ensayaron
distintos tratamientos sobre 8 genotipos de Coffea arabica, encontrando que las condiciones experimentales y la
variabilidad genotípica afectan la capacidad embriogénica
de dichos tejidos. Es notorio que en los trabajos realizados hasta la fecha se ha obtenido un rendimiento mayor
de embriones para la especie Coffea canephora que para
Coffea arabica.
En conclusión, la presente investigación aportó un método para la obtención de suspensiones celulares embriogénicas de café del cultivar Catimor, lo cual no había sido
reportado previamente. Estas suspensiones presentaron
altos rendimientos en producción de embriones (Figuras 3
y 4), comparables a los obtenidos en investigaciones con
otras variedades de esta planta. Por lo tanto se dispone
de un sistema para la propagación clonal masiva de este cultivar, el cual ha mostrado un buen comportamiento
agronómico en Venezuela.
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Carlos Ascanio Evanhoff de la Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela y al personal de
la Estación Experimental "Jaime Henao Jaramillo" de la
misma institución, por suministrarnos las plantas de café
’Catimor’. Al CDCH por aportar los recursos para realizar
la investigación (Proyecto NÆ 03.33.4049-97).
95
Suspensiones celulares de café
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