1. No category

FLUJO DE TRABAJO DE MAPEO DE GLICANOS
COLUMNAS AGILENT ADVANCEBIO DE 1,8 μm
PARA MAPEO DE GLICANOS
En este documento, los químicos de aplicaciones de Agilent comparten sus recomendaciones
para un sistema de LC óptimo y su configuración para la caracterización de biomoléculas.
También ofrecen consejos sobre un método general de inicio e indican cómo puede optimizarse
este método para satisfacer sus objetivos específicos de separación.
Encontrará información adicional de las aplicaciones en www.agilent.com/chem/advancebio
Sistema UHPLC Agilent 1290 Infinity
Fases móviles
Eluyente A: Formiato de amonio 100 mM, pH 4,5
Eluyente B: acetonitrilo
(compatible con espectrometría de masas)
Detección (G1321B)
Detector de fluorescencia Agilent 1260 Infinity,
excitación 260 nm, emisión 430 nm, celda
de 8 µl
Los productos para mapeo de glicanos
AdvanceBio incluyen preparación de muestras,
estándares marcados y no marcados, así como
columnas de 1,8 µm y 2,7 µm.
Compartimento de la columna (G1316C)
Columnas para mapeo de glicanos
AdvanceBio, 1,8 µm, estables hasta
1200 bar
Inyección de muestra (G4226A)
Descripción
2,1 x 100 mm
2,1 x 150 mm *
Precolumnas rápidas, 2,1 mm, 1,8 µm
Referencia
858700-913
859700-913
651750-913
* Tamaño de columna inicial recomendado
Ambos gradientes proporcionan una
pendiente de 1,25 %/ml. Podría ser
necesario ajustar el punto inicial y final
para obtener la máxima resolución para
muestras que contengan diferentes tipos
de glicanos. Por ejemplo, las estructuras de
glicanos de mayor tamaño podrían requerir
un gradiente de acetonitrilo del 75 al 55 %
para conseguir resultados óptimos.
A 40 °C se consigue una mayor vida útil de la columna;
a 60 °C se consiguen picos más estrechos, pero se reduce
significativamente la vida útil de la columna. Tanto la selectividad
como la resolución podrían variar con la temperatura.
Inyección de 1 a 2 µl para conseguir la máxima resolución.
Las muestras deben primero disolverse en H2O y posteriormente
constituirse en ACN:agua 70:30. Deberá usarse un enfriador.
Bomba (G4220A)
0,5 ml/min para separaciones de alta resolución;
hasta 1,0 ml/min para alta velocidad. Los lavados
con alto contenido acuoso SIEMPRE deberán realizarse
con una velocidad de flujo reducida.
Gradiente recomendado para resolución
Tiempo
0
32
33
35
36
45
Eluyente A Eluyente B Flujo
20 %
80 %
0,5 ml/min
40 %
60 %
0,5 ml/min
80 %
20 %
0,5 ml/min
80 %
20 %
0,5 ml/min
20 %
80 %
0,5 ml/min
20 %
80 %
0,5 ml/min
Gradiente recomendado para velocidad
Tiempo
0
12
12,5
13,5
14
15
20
Eluyente A Eluyente B Flujo
25 %
75 %
1,0 ml/min
40 %
60 %
1,0 ml/min
80 %
20 %
0,5 ml/min
80 %
20 %
0,5 ml/min
25 %
75 %
0,5 ml/min
25 %
75 %
1,0 ml/min
25 %
75 %
1,0 ml/min
Escalera de dextrano marcado con 2-AB
0.2
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0
5
10
15
20
25
30
N-glicanos IgG marcados con 2-AB
Tiempo
0
32
33
35
36
45
Eluyente A
20 %
40 %
80 %
80 %
20 %
20 %
Eluyente B
80 %
60 %
20 %
20 %
80 %
80 %
Flujo
0,5 ml/min
0,5 ml/min
0,5 ml/min
0,5 ml/min
0,5 ml/min
0,5 ml/min
0.1
0.09
0.08
0.07
0.06
0
5
10
15
20
25
30
Separación de alta resolución de escalera de dextrano marcado con 2-AB (ref. 5190-6998) y
biblioteca de N-glicanos IgG humanos marcados con 2-AB (ref. 5190-6996).
2 µl
0.12
Las muestras deben prepararse mediante su disolución en agua y
posterior adición de acetonitrilo para obtener una composición
final de agua:acetonitrilo 30:70. El reducido tamaño de la columna,
2,1 x 150 mm, requiere volúmenes de inyección pequeños. La figura
de la izquierda muestra el resultado de inyectar 5 µl (picos más anchos
y se pierde resolución) en comparación con la inyección de 2 µl.
0.11
0.1
0.09
0.08
0.07
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
20
22.5
5 µl
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
20
22.5
Sobreinyección de biblioteca de N-glicanos IgG humanos marcados con 2-AB (2 µl y 5 µl).
A1F!
0.35
A2F!
0.3
0.15
NA4!
G2F!
NA2!
Tiempo
0
12
12,5
13,5
14
15
20
A3!
G0!
0.2
G1F!
G0F!
0.25
0.1
2
4
6
8
Eluyente A
25 %
40 %
80 %
80 %
25 %
25 %
25 %
Eluyente B
75 %
60 %
20 %
20 %
75 %
75 %
75 %
Flujo
1,0 ml/min
1,0 ml/min
0,5 ml/min
0,5 ml/min
0,5 ml/min
1,0 ml/min
1,0 ml/min
10
Separación de alta velocidad de N-glicanos marcados con 2-AB (asignación provisional de picos).
Formiato de amonio
㻸㼁
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
㼙㼕㼚
㻸㼁
0.4
Acetato de amonio
0.35
0.3
Agilent no se hace responsable de ningún error incluido en este
documento ni de ningún daño incidental o consecuencial relacionado
con la distribución, la aplicación o el uso de este material.
0.25
La información, las descripciones y las especificaciones de esta
publicación están sujetas a modificación sin previo aviso.
0.2
0.15
0.1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Los glicanos, como los que se encuentran en la fetuina bovina, se pueden eluir
con fases móviles de formiato de amonio o acetato de amonio.
11
㼙㼕㼚
© Agilent Technologies, Inc. 2015
Impreso en EE. UU., el 15 de agosto de 2015
Número de publicación 5991-6183ES