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CONTROLES DE CALIDAD DE LAS AFÉRESIS Y DE LA
CRIOPRESERVACIÓN
Dra. Carmen Azqueta. Responsable Técnico, Área Procesamiento Celular. Banc Sang i Teixits,
Barcelona.
Dr. Sergio Querol. Responsable Médico, Área Procesamiento Celular. Banc Sang i Teixits,
Barcelona.
El procesamiento de Células Progenitoras Hemopoyéticas (CPH) en
el laboratorio de terapia celular
Las CPH pueden obtenerse de diversas fuentes como la médula ósea, la sangre de cordón
umbilical o la sangre periférica después de movilización. A continuación nos referiremos al
procesamiento de las CPH de sangre periférica movilizada obtenidas por aféresis. El
procesamiento de las CPH incluye las siguientes etapas: transporte desde la unidad clínica
hasta el centro de procesamiento, conservación a corto término, manipulación,
criopreservación, almacenaje a largo término y transporte desde la unidad de procesamiento
a la unidad clínica donde tendrá lugar la descongelación e infusión una vez haya recibido el
tratamiento de acondicionamiento. Todo el proceso está regulado por estándares
internacionales de calidad que son unas guías de actuación, tanto en la obtención como en
el procesamiento, que garantizan la seguridad del producto (por ejemplo:
JACIE/FACT,CAT).
Almacenado en fresco y transporte
Las células deben de ser tratadas y transportadas en unas condiciones específicas para
poderlas preservar. Los parámetros más importantes que pueden incidir en este paso
previo son los siguientes: concentración celular, temperatura de transporte, almacenado
temporal en el centro y tiempo máximo hasta su manipulación. En general, se recomiendan
concentraciones celulares <200 x 106 células/mL, temperaturas refrigeradas (2º-10ºC), si el
proceso empieza más allá de las 4 horas y no se realizan manipulaciones mayores, y el
tiempo máximo hasta la criopreservación debe de ser < a las 72 horas.
En cuanto al transporte, se utilizan contenedores especiales que preservan la integridad de
la muestra en caso de accidente y que la mantienen a una temperatura constante,
dependiendo de la cantidad de acumuladores de frío que contenga. El tipo de contenedor
debe de ser específico para muestras biológicas y debe de cumplir la normativa UN3373.
Dentro del contenedor debe haber los siguientes elementos: un paquete absorbente por si
hubiera extravasación de la muestra, acumulador(es) de frío, bolsa terciaria y pinza.
Procesamiento y criopreservación
Una vez obtenida y transportada, la bolsa de aféresis se recibe en el laboratorio. Los
productos alogénicos son caracterizados y habitualmente se infunden directamente en
fresco sin más manipulación. Pero en ocasiones, si el paciente no está preparado, se
criopreservan. Los progenitores autólogos en cambio se criopreservan de forma
sistemática.1 La criopreservación es un proceso que somete a las células a temperatura muy
baja (< -150ºC), temperatura llamada criogénica. En esta situación las reacciones
bioquímicas se detienen de forma reversible y las células se pueden conservar a largo
término. No hay datos actualmente que determinen el tiempo máximo de almacenado.
Las etapas del procesamiento y criopreservación se enumeran a continuación (ver Figura 1):
1.
2.
3.
4.
5.
Transferencia de la bolsa inicial a la bolsa de centrifugación.
Desplasmatización.
Preparación de la suspensión celular después de un ajuste del volumen.
Transferencia del producto reducido a la bolsa de criopreservación.
Adición de la solución de criopreservación con anticoagulante, plasma autólogo o
albúmina y el crioprotector DMSO al 10% (vol/vol).
6. Verificación del peso final de la bolsa de criopreservación.
7. Extracción del aire residual.
8. Sellado de las bolsas.
9. Introducción y sellado de la bolsa de protección.
10. Colocación dentro del protector metálico.
11. Enfriamiento programado (normalmente a velocidades de 1 a 5 ºC hasta -120 C).
12. Almacenado en contenedores de nitrógeno líquido (LN2) a temperatura menor de 150ºC.
Figura 1. Etapas de un proceso de criopreservación
Distribución
Una vez que las células tienen la conformidad, y si el centro de trasplante está en una
localización diferente del de procesamiento, el transporte de estas células criopreservadas
se tiene que realizar de forma especial con contenedores específicos. Estos contenedores
contienen nitrógeno absorbido y conservan las muestras en vapor de nitrógeno a la
temperatura criogénica.
Infusión
Antes de la infusión de los CPH hay que descongelar la muestra. La descongelación se ha
de realizar de forma rápida. Es el proceso inverso al de la criopreservación. La célula ahora
se rehidratará. Se realiza en inmersión a 37-40ºC en agitación continuada. Se aconseja
utilizar una bolsa de plástico estéril que separe físicamente la bolsa primaria del baño
termostático.2 Actualmente hay sistemas automatizados de descongelación que controlan la
temperatura. La infusión puede dar lugar a reacciones adversas en el paciente, siendo las
más comunes las náuseas, vómitos, fiebre, taquicardia, híper o hipotensión y reacciones
alérgicas. Estas son debidas a la hiperosmolaridad, la presencia de enzimas celulares y al
propio DMSO. Para minimizar estas reacciones, el paciente se debe premedicar siguiendo
los protocolos establecidos. Hay autores que propugnan el lavado sistemático del
crioprotector del producto para minimizar el riesgo de efectos adversos.
Controles de calidad
Los controles de calidad que se realizan en un laboratorio de CPH tiene dos objetivos:
garantizar la seguridad transfusional, es decir, la valoración del riesgo de infección,
mediante los análisis microbiológicos, y la seguridad hematopoyética como análisis
predictivo de la capacidad de prendimiento midiendo la dosis celular, viabilidad celular y
capacidad proliferativa.3
El número de controles que se realizan a lo largo de un proceso puede ser variable en
función del tipo de producto y proceso. Los controles mínimos incluyen las características
del producto recogido y las del infundido. Todos los procesos deben de estar debidamente
documentados mediante registros para garantizar la trazabilidad y la seguridad. Así mismo,
el personal que interviene en un programa de estas características debe de estar
debidamente formado y capacitado.
Ante un control dudoso, el laboratorio debe de investigar las variables relacionadas y repetir
la prueba si lo cree necesario, por lo que es importante generar más de una alícuota. En el
caso de que se verifique el resultado debe ser notificado al centro de trasplante y hacer, si
fuera necesario, un aviso de biovigilancia a las autoridades pertinentes.
Seguridad transfusional
El producto a infundir debe de reunir los criterios microbiológicos que exigen las normas
legales. En el caso de que haya contaminación bacteriana se debe identificar el germen y se
debe realizar el antibiograma.
Todo el producto que se almacena debe de estar identificado para sífilis y virus: Hepatitis B,
C y virus de la inmunodeficiencia humana y otros agentes según legislaciones nacionales.
Estos productos, si son positivos, deben almacenarse de forma separada en contenedores
específicos (con bolsas secundarias y en fase vapor).
Recuento de CPH
La cuantificación del número de células se basa en el recuento celular, que se realiza
automáticamente mediante un contador hematológico. El valor que se reporta es el número
de células nucleadas totales y se expresa por kg de peso del receptor.
El contenido de CPH se evalúa mediante la determinación del antígeno de membrana CD34
por citometría de flujo, con la utilización de anticuerpos monoclonales unidos a fluorocromos.
Los marcadores que se utilizan en la evaluación de las CPH son el CD34, CD45 y el
marcador para viabilidad 7-Amino-Actinomicina-D (7AAD). La muestra se incuba con el
marcador y posteriormente se lisa para eliminar los hematíes que interferirían en la
cuantificación. La determinación de la población CD34 no es fácil ya que está representada
en un porcentaje muy pequeño. La estrategia de análisis debe de ser muy estricta y debe de
garantizar la correcta inclusión de células CD34 “verdaderas”. En este sentido, la mayoría
de los laboratorios han adoptado una estrategia de análisis siguiendo el llamado, protocolo
ISHAGE.4,5 El algoritmo es el siguiente: la población CD34 final son los eventos positivos
para el antígeno CD34 que tienen una baja expresión de CD45 y que tienen características
de tamaño/complejidad tipo linfoide. Así mismo, se ha introducido la cuantificación absoluta
del CD34 mediante un control interno (plataforma única). Son microsferas, que se conoce su
concentración, lo cual permite dar el resultado volumétricamente redundando en una
determinación más precisa. La figura 2 muestra el protocolo de determinación de células
CD34+ utilizado en nuestro laboratorio.
Viabilidad celular
Los análisis de viabilidad celular utilizan métodos que determinan la integridad de la
membrana celular. La viabilidad se puede realizar mediante tinción con colorantes como
azul tripán y la utilización de microscopia óptica convencional, o bien mediante citometría de
flujo con la utilización de 7AAD o ioduro de propidio. Todas ellas miden población no viable.
Un producto óptimo debe tener al menos un 80% de células vivas antes de ser
criopreservado.
Capacidad proliferativa
La funcionalidad celular se determina mediante cultivo clonogénico en medio semisólido con
factores de crecimiento. La utilización de kits comerciales también ha permitido cierto grado
de estandarización, aunque no llega a los niveles de la estandarización de la citometría de
flujo. En nuestro caso utilizamos metilcelulosa con factores de crecimiento: hematopoyético
como eritropoyetina, interleukina-3, G-CSF y stem cell factor. Estos componentes permiten
un crecimiento óptimo de las colonias granulocíticas macrofágicas CFU-GM, colonias
eritroides (CFU-E y BFU-E) y las colonias multilínea (CFU-GEMM). El gran inconveniente
de este test es que los resultados no se pueden dar hasta pasados 12-14 días de su
siembra, por lo que su valor como predictivo de calidad tiene sentido para la evaluación de
productos criopreservados. La mayor ventaja es que sigue teniendo un valor predictivo
sobre la velocidad de prendimiento, que es de mucho interés fundamentalmente como
control de calidad para evitar utilizar muestras que puedan comprometer la recuperación
hematológica del inóculo.6
Los datos que se reportan son el número total de unidades formadoras de colonias totales
(CFU-T) por kg de peso del paciente, o bien unidades formadoras de colonias CFU-GM por
kg de peso del paciente. Cada laboratorio debe establecer su valor de normalidad.
Figura 2. Protocolo de análisis para la determinación de CD34 por
el método ISHAGE y plataforma única con microesferas
PerfectCount.
Descripción: del protocolo:
Histograma 1: todas los eventos
y dos regiones de exclusión:
R13= microsferas
y
R12=
debris.
Histograma 2: Muestra. el % de
microsferas. M1 vs. M2 debe de
ser del 50 % (±5%).
R13
Histograma 3: Se define la
intensidad de fluorescencia de la
población CD34 +/CD45+.
R12
Histograma 4: Se muestran
todos los eventos CD45 + (R1) a
excepción de R13 y R12. Se
define además una región R9
para determinar el % de CMN y
una región R5 para determinar la
población linfoide.
R5
Histograma 5 y 6: Muestran
viabilidad celular por 7AAD, es
región
R8.
Histograma
CD45+/7AAD- e histograma
CD34+/7AAD-.
la
la
5
6
Histograma 7: Se define la
región R2. Son las células CD34+
con complejidad linfoide
Histograma 8: Las células
CD34+ que se definen en el
histograma 7 muestran baja
expresión para las CD45, región
R3.
Histograma
de linfocitos
referencia
complejidad
CD34+.
9: Define la región
(R2) en R4 como
de
tamaños
y
para las células
Histograma 10: La región R4
define las “verdaderas” CD34+ y
se autocopia del histograma 9.
Los eventos CD34+ y CD45low
que aparecen se multiplican por
las microsferas (R13) y su
concentración para determinar el
número de células CD34+ por
microlitro.
Otra manera de valorar la capacidad funcional es utilizar el concepto de eficiencia
clonogénica (CLONE). CLONE es la relación entre el número de CFU-T y el número de
células CD34+ totales (%). La CLONE es una medida de la capacidad proliferativa de la
población CPH y nos da un índice funcional de un producto. Es especialmente útil cuando se
evalúan productos criopreservados. Una disminución substancial en la CLONE puede
significar que el número de células CD34+ infundida no consiga prendimiento en los días
esperados. El uso de controles clonogénicos es especialmente recomendado cuando se
realizan procesos especiales como selecciones celulares o depleciones intensas de
productos. Su utilidad, obviamente, se circunscribe fundamentalmente a los productos
criopreservados. En los productos en fresco, la realización de estos controles puede dar
información sobre el estado del producto en retrasos o fallos primarios de prendimiento. En
general, y dada la correlación entre CD34 y CFU-totales, se establece un valor umbral de
CLONE en el 10%.
Experiencia del procesado de CPH-Aféresis en el Banc Sang i
Teixits
El laboratorio de terapia celular
En el centro de procesamiento se reciben productos de aféresis de 9 centros de obtención,
ligados con sendos programas de trasplante. El laboratorio de terapia celular tiene 3 áreas
operativas. Una, dedicada al procesamiento y criopreservación de CPH, otra al control de
calidad del producto, y finalmente un área de logística para la distribución de los productos
criopreservados.
El área de procesamiento se divide en 3 sectores: el primero es una cámara refrigerada
donde los productos son recibidos procedentes de los centros de obtención. La temperatura
de conservación es de 4ºC para aumentar la viabilidad celular en caso de que los procesos
se retrasen. El tiempo máximo admitido desde la obtención hasta la criopreservación es de
72 horas, aunque en el 85% de los casos la aféresis se criopreserva en el mismo día de la
obtención. El segundo, es el área de recepción del producto donde se inspecciona la bolsa
recibida y se revisa la documentación acompañante. Una vez registrada la donación, ésta
pasa al tercer sector, una sala de manipulación de ambiente controlado donde se procesan
los productos siguiendo las normas GMP. En nuestro caso, la sala tiene un grado ambiental
D pero en las fases abiertas de la manipulación se realiza en una cabina de flujo laminar de
grado A. En este área se realiza la reducción de volumen, la adición del crioprotector y la
congelación programada. Una vez criopreservada, las bolsas se trasladan a los
contenedores de nitrógeno para su almacenamiento a largo plazo.
El laboratorio de cualificación de producto trabaja estrechamente con el área de
procesamiento. Realizan dos tipos de pruebas, unas que acompañan al proceso, y que se
utilizan para la toma de decisiones (los análisis más habituales son el recuento de células
nucleadas, las células CD34+ y, en caso de trasplante alogénico, las células CD3+), y otras
de control de calidad donde se evalúa la capacidad hematopoyética de las CPH (aquí se
incluye viabilidad celular y las unidades formadores de colonias).
En nuestro proceso se utilizan las siguientes recomendaciones:
1.
2.
3.
4.
La temperatura de conservación es 4ºC (2º-10º).
La conservación celular después de la aféresis debe de ser <200x106 CN/mL.
La concentración celular máxima para la congelación es 600x106 CN/mL.7
La primera aféresis se criopreserva sistemáticamente en dos bolsas para no perder
el producto en caso de rotura accidental.
5. Los valores de referencia utilizados en nuestro programa son:
 Dosis umbral para trasplante autólogo: 2x106 CD34/kg.
 Dosis de referencia para trasplante alogénico: 4-6x106 CD34/kg.
 Alícuotas de CD3+ en caso de productos con exceso de CPH. Ejemplo de dosis
celulares utilizadas:
- Dosis 1: 0,01x108 CD3/kg (en caso de donante no emparentado).
- Dosis 2: 0,03 a 0,05x108 CD3/kg (en caso de donante no emparentado).
- Dosis 3: 0,1 x108 CD3/kg.
- Dosis 4: 0,3 x108 a 0,5x108 CD3/kg.
- Dosis 5: 1x108 CD3/kg.
Análisis de la actividad de 2013 y 2014
Los datos que se muestran a continuación son los referentes a la actividad desarrollada
entre los años 2013 y 2014 en nuestro laboratorio. En total se han analizado 858 productos
de aféresis, de los cuales 566 se corresponden a aféresis autólogas y 292 a aféresis
alogénicas (la mayoría con alícuotas CD3+ criopreservadas para infusión de linfocitos de
donante (ILD). En la tabla 1 se muestra las características de los donantes y pacientes, el
número de aféresis por movilización por ciclo, las volemias procesadas, el CD34 por
microlitro de sangre periférica y la concentración celular de las aféresis recepcionadas.
En la tabla 2 se muestra el rendimiento de las aféresis según sean autólogas o alogénicas y
la dosis celular resultante de cada procedimiento de aféresis:
En un análisis anterior se pudo establecer los rangos habituales según el diagnóstico. Para
ello se analizaron los siguientes grupos: mieloma múltiple (MM), leucemia mieloide aguda
(LMA), linfoma no Hodgkin (LNH), tumor sólido (TS), y linfoma de Hodgkin (LH). La cantidad
de células CD34+ cuantificadas en sangre periférica, de menor a mayor, son las siguientes
en CD34/µl: 42,1 para LNH; 62,2 para MM; 94,7 para TS, 109,6 para LH, y 335,5 para LMA.
Estas dosis dependen lógicamente del esquema de movilización. Con ello se consigue una
dosis promedio de CD34+/kg (en millones por kg) de peso del receptor, de menor a mayor,
de: 3,4 para LMA; 4,4 para LNH; 5,4 para MM; 8,8 para LH; 13,3 para TS. Esta distribución
condiciona, con el número de aféresis por ciclo necesarias en cada uno de ellos, los
fracasos de movilización.
Indicadores de calidad
El resultado del control de calidad de los productos criopreservados se muestra en la tabla
3.
Los datos utilizados para evaluar la calidad parten del análisis de la viabilidad celular inicial
que puede condicionar el producto post-descongelación. De esta manera, cifras inferiores al
95%, cuando la aféresis presenta más del 70% de CMN, predice una baja viabilidad (<70%
en el tubo control). Los productos con mayor contaminación de granulocitos presentan más
problemas de viabilidad durante el proceso y además incrementan los efectos adversos
durante la infusión8. De esta manera, un valor deseable en la obtención de CPH es la
disponibilidad de productos con % de CMN>70%.
Finalmente, el control de calidad funcional final, que incluye la criopreservación, utiliza el
porcentaje de células CD34+ que rinden colonias o CLONE como referencia.9,10 La CLONE
se basa en la correlación entre el nº de CFU totales y el número de células CD34+ totales,
que en nuestro caso tiene un coeficiente de correlación lineal, R, de 0,81. De esta manera,
hemos establecido como valor mínimo funcional de CLONE que sea mayor del 10%. Con
este dato se valida la correlación CD34 y CFUs y permite aconsejar al centro de trasplante si
la dosis de recogida tiene una alta probabilidad de prendimiento rápido. En caso que este
valor sea inferior al 10%, aconsejamos un nuevo procedimiento de aféresis, si la dosis
CD34/kg viable es límite.
Basados en ello se han establecido los indicadores de calidad para monitorizar todo el
proceso incluyendo obtención, transporte, procesamiento y criopreservación. Hemos
definido los siguientes indicadores:








% de productos con concentración de CN ≤ 200x106/mL a la recepción en el centro
de proceso.
% de productos autólogos y alogénicos de aféresis con un porcentaje ≥ 70% de
células mononucleadas (CMN).
% de productos autólogos y alogénicos con viabilidad ≥ 95% de células nucleadas
pre-criopreservación (CD45+/7AAD-).
% de productos autólogos y alogénicos con viabilidad ≥ 95% de células nucleadas
pre-criopreservación (CD34+/7AAD-).
% de recuperación de volumen criopreservado ≥ 90% y ≤ 110%.
% de viabilidad de células nucleadas en el tubo control post-descongelación ≥ 70%.
% de recuperación de células nucleadas en el tubo control post-descongelación ≥
70%.
% de productos de aféresis con eficiencia clonogénica (EC) ≥ 10% (CFU-totales en el
tubo control dividido por CD34+ criopreservadas).
En la tabla 4 se presentan los resultados de los indicadores de calidad de nuestro
laboratorio correspondiente al año 2014 a modo de ejemplo. Cualquier desviación del valor
de calidad esperado debe resultar en un análisis de las causas y su corrección. De esta
manera se pretende asegurar una calidad que permita asegurar el prendimiento rápido del
injerto en todos los casos.
Resumen
El procesamiento y criopreservación de CPH debe de estar validado en cada laboratorio y
someterse al análisis de indicadores de calidad que permitan detectar desviaciones técnicas
del proceso. Los controles de seguridad y calidad deben certificar su idoneidad para el uso
en trasplante. El valor de referencia en CPH-Aféresis es la dosis de CD34/kg disponible. La
dosis umbral debe validarse en cada programa de trasplante pero en la mayoría de los
centros se utiliza la dosis de 2x10 6 CD34/kg como referencia. El uso de controles de
viabilidad y capacidad hematopoyética pueden ayudar a tomar decisiones para minimizar
retrasos de prendimiento o fallo de implante en cada caso.
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