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INDEXACIÓN DEL GERMOPLASMA DE YUCA
LABORATORIO SANIDAD DE GERMOPLASMA
UNIDAD DE RECURSOS GENETICOS
Maritza Cuervo, Manuel Guillermo Moreno, Norma Flor, José Luis Ramírez
La organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO), entidad
que mediante programas colaborativos (acuerdos y/ó tratados) entre los gobiernos de
diferentes países del mundo, promueve el movimiento seguro de germoplasma siguiendo los
mandatos de los planes cuarentenarios de cada país, estipuló que cada material de yuca que
se distribuya desde CIAT debe estar evaluado para ciertos problemas de importancia
cuarentenaria, que básicamente son agentes causales (hongos, bacterias, virus, etc.) de
enfermedades que pueden causar grandes pérdidas economicas al cultivo. (Frison et Al.
1991)
En el caso específico de yuca Manihot esculenta Crantz el material vegetativo para intercambio
de germoplasma, es producido "in vitro"; por consiguiente las características fitosanitarias son
inspeccionadas desde el momento de selección de plantas madres durante el proceso de
introducción hasta antes de empacar los materiales para su distribución.
Para la obtención de materiales "in vitro" disponibles para distribución se realiza termoterapia y
cultivo de meristemos en el laboratorio de conservación in vitro, posteriormente en el
laboratorio de sanidad se realiza la indexación de los materiales.
Cuando el material a conservar proviene de estacas la indexación comienza con la selección
de plantas madres en el campo, cuyas raíces son examinadas para determinar la ausencia de
síntomas de la enfermedad "cuero de sapo", se seleccionan tallos de la planta y se siembran
en suelo estéril. Al mismo tiempo se realiza la prueba de injerto en un material indicador para
diagnosticar la presencia de la enfermedad de esta enfermedad. La planta a la cual se le
realizan las pruebas es enviada a la Sección de Cultivo de Tejidos para ser sometida a
termoterapia "in vivo" o "in vitro" según se requiera y obtener de los rebrotes meristemas que se
cultivan según lo establecido para la especie. Se mantiene la identidad de cada meristema y
antes de micropropagar se realiza un nuevo proceso de indexación, una vez certificada la sanidad
el material está listo para exportación (Roca et al., 1991).
El Laboratorio de Sanidad de Germoplasma (LSG) de la Unidad de Recursos Genéticos (URG)
realiza el proceso de indexación para la detección del Virus Común de la Yuca (CsCMV), Virus
X de la Yuca (CsXV) y la enfermedad del Cuero de Sapo (FSD) (Figura 1). Debido a que la
Colección de yuca está conservada bajo condiciones asépticas en que se multiplica y conserva
el material In Vitro, las probabilidades de contaminación por hongos y bacterias son casi nulas.
DESCRIPCIÓN DE ALGUNAS ENFERMEDADES VIRALES DEL CULTIVO DE LA YUCA
1.1
Mosaico Común de la Yuca
Inicialmente se reportó en el sur del Brasil. La enfermedad ha sido registrada en otros países
de Sur América y hay un reporte del Africa y otro del Asia. Tiene mayor incidencia en el Sur
del Brasil y Paraguay. No se conoce vector para esta enfermedad y su propagación en los
cultivos se atribuye a transmisión mecánica. En general la enfermedad no reviste mayor
importancia aunque su incidencia en algunas áreas hace necesario su control.
La enfermedad del mosaico común de la yuca es causada por el virus del mosaico común
perteneciente al género Potexvirus. Las hojas de la planta de yuca afectadas por CsCMD (por
sus siglas en Ingles) desarrollan síntomas de mosaico y clorosis (Calvert et al 1996). En
algunos casos, sobre algunas de las hojas afectadas se presentan manchas verdes claras y
oscuras delimitadas por las nervaduras. Los síntomas son más severos cuanto más largos
sean los periodos relativamente fríos, situación que es frecuente en zonas semitropicales de
Sur América. Bajo estas condiciones las plantas afectadas son muchas veces más enanas y
las pérdidas en el rendimiento pueden alcanzar hasta un 60 %.
Figura 1. Diagrama de flujo indexación de yuca
La eliminación de las plantas que expresan síntomas de CsCMV nos permite un control
adecuado. La mejor oportunidad para identificar y eliminar las plantas afectadas es sobre los
rebrotes, puesto que los síntomas en las hojas primarias son evidentes. Si esto no se lleva a
cabo tempranamente, las plantas deben ser marcadas y los tallos quemados después de
cosechar las raíces.
1.2
Virus X de la Yuca
Es una enfermedad asintomática producida por el virus X de la Yuca. El CSXV no produce
síntomas en las plantas infectadas, por lo que se considera de menor importancia, ya que no
ocasiona una baja considerable en los rendimientos del cultivo. Fue reportada en la zona
Norte de Colombia en 1983. Es transmitido por propagación vegetativa y por inoculación
mecánica. Este virus es detectado por medio de la técnica de ELISA.
1.3
Enfermedad del Cuero de Sapo de la yuca
La enfermedad denominada "cuero de sapo" fue reportada por primera vez, en 1971, en el
Departamento del Cauca, al sur de Colombia (Pineda, 1983). Su origen, parece ser la región
amazónica de Brasil o Colombia. Además de Colombia se ha reportado en Brasil, Costa Rica,
Panamá, Perú y Venezuela.
Entre las enfermedades de la yuca el "cuero de sapo" está considerado como una de las más
perjudiciales para el cultivo, puesto que afecta directamente la producción de raíces,
provocando pérdidas del 90% o más en el rendimiento. La expresión de síntomas es variable
de acuerdo a la temperatura y al genotipo. En algunas variedades las plantas afectadas no
presentan señales visibles en su parte aérea y, en algunos casos, hasta puede lucir sana y
vigorosa (Lozano et al 1989).
En las raíces, los síntomas varían desde muy suaves a severos, dependiendo de la edad de la
planta y de factores climáticos. Las condiciones secas o calientes tienden a inhibir el
desarrollo de los síntomas, mientras que condiciones más frescas favorecen el desarrollo de
éstos. Aún en plantas afectadas levemente, las pérdidas económicas persisten debido a la
menor acumulación de almidón. Los síntomas consisten en pequeñas fisuras longitudinales,
localizadas cerca del callo donde se originan las raíces y, posteriormente, se prolongan a lo
largo de ellas. A medida que las raicillas aumentan de diámetro, las fisuras tienden a cicatrizar,
dando a las lesiones forma de labio. La cáscara o epidermis de las raíces presenta una
apariencia corchosa que se desprende con facilidad. Según sea la severidad de los síntomas,
la profundidad y número de las lesiones aumentan hasta deformar la raíz. En general, el
sistema radical de las plantas afectadas no alcanza a tener el mismo desarrollo del que tienen
las plantas sanas; las raíces permanecen delgadas, leñosas, de cáscara gruesa y corchosa y
su contenido de almidón es muy bajo (Calvert et al, 2002)
El agente causal de la enfermedad es aun desconocido pero se ha asociado un virus del grupo
de los reovirus con esta enfermedad. La detección de la enfermedad se puede hacer mediante
el examen visual de las raíces, observándolas cuidadosamente con el fin de detectar los
síntomas característicos, ya sean de carácter leve o severo. Debido a que esta enfermedad es
fácilmente transmitida por medio de injertos esta técnica se puede utilizar como otro método de
diagnóstico (Calvert et al., 2001).
La enfermedad puede ser eliminada por medio de termoterapia y cultivo in-vitro de meristemas
(Mafla, 1984), siendo necesario que después de este proceso se realicen injertos a la variedad
Secundina para confirmar la sanidad del material.
DESCRIPCIÓN DEL PROCESO DE INDEXACIÓN EN LSG
1. Aclimatización de plántulas exvitro
Las plántulas In Vitro procedentes del Laboratorio de conservación in vitro se siembran en
invernadero, dándoles las condiciones requeridas para que la plántula se desarrolle y se
conserve en buen estado agronómico y sanitario bajo condiciones controladas, para su
posterior indexación o conservación como bonsái, según el caso de cada accesión. La forma
de siembra de estas plántulas es la siguiente:
A. En un matero plástico con capacidad de dos litros, se adicionan cuatro centímetros de
granito y sobre éste, el sustrato compuesto por una relación de 2:1 de arena y suelo
esterilizado al vapor a una temperatura de 150 oC por cuatro horas. (Figura 2 A,B).
Figura 2 A. Matero con granito
Figura 2 B. Granito y sustrato
B. Se golpea la parte inferior del tubo de ensayo con la mano para desprender el medio de
cultivo del tubo y se extrae la plántula con unas pinzas las cuales son desinfectadas en
alcohol al 70% después de su uso (Figura 3 A,B).
Figura 3 A. Desprendimiento de plántula
Figura 3 B. Sacar plántula con pinzas
C. Se lava la raíz de la plántula con agua destilada removiendo los residuos de medio de
cultivo (Figura 4 A,B).
Figura 4 A. Eliminación del agar en raíz.
Figura 4 B. Eliminación de residuos.
D. Con la base de un tubo de ensayo, se abre un hoyo en el sustrato, se introduce la plántula
y se adiciona el sustrato de forma que la planta quede firme. En caso de que la planta por
su tamaño quede inclinada, es necesario utilizar una pajilla plástica como guía o soporte
para mantenerla derecha (Figura 5 A,B,C). Es indispensable desinfectar todos los utensilios
y las manos con alcohol al 70% al pasar de una accesión a otra durante la siembra.
Figura 5A. Siembra de plántula
Figura 5B. Cubrimiento la raíz con sustrato
Foto 5C. Soporte para la plántula
E. Una vez que cada material es trasplantado, se cubre con un vaso de icopor (con orificios,
para permitir el intercambio de aire) por un periodo de tres (3) semanas, hasta que se
adapten a las nuevas condiciones ambientales del invernadero (Figura 6 A,B).
Figura 6A. Tapar con vaso de icopor
Foto 6B. Plántulas establecidas
F. La planta se mantiene en invernadero de 3 a 5 meses, hasta alcanzar un tamaño que le
permita ser utilizada como patrón para realizar el proceso de injertación (Figura 7).
Las plantas se establecen y mantienen en invernadero en condiciones adecuadas para expresión
de síntomas (20-30°C) y 2000-5000 lux de iluminación, y cuando hay tejido disponible se toman
muestras para realizar pruebas pertinentes.
Figura 7. Plantas con el tamaño esperado a 3 meses
2. Detección de la Enfermedad del Cuero de Sapo.
Esta enfermedad es fácilmente transmitida por injertos, por este motivo esta técnica es
utilizada para su diagnostico. El principio del injerto es trasmitir directamente savia, agua,
nutrientes y agentes sistémicos que se pueden encontrar por los haces vasculares de una
planta (patrón) a otra planta (injerto); teniendo en cuenta que el patrón son los materiales o
variedades que se quieren evaluar y el injerto, es la variedad Col 2063 denominada secundina
altamente susceptible a la enfermedad, donde se expresarán los síntomas de mosaico si la
enfermedad esta presente.
2.1 Procedimiento de la técnica de injerto realizada.
A. Cortar con bisturí dos esquejes del material a evaluar que contengan tres nudos y de igual
forma de la variedad indicadora secundina (injerto) teniendo en cuenta que coincida con el
diámetro del patrón (Figura 8).
Figura 8. Implementos para injertación: Cuchillas desechables, Papel parafilm, esqueje de secundina y
esqueje de material a evaluar.
B. Realizar un corte de bisel (transversal) en la parte inferior de la Secundina (Figura 9)
Figura 9. Corte bisel en la parte inferior de la secundina.
C. Realizar un corte bisel (transversal) en la parte superior de los materiales y eliminar todas
las yemas presentes, para evitar su desarrollo. En la parte inferior del material realizar un
corte cerca de la yema (Figura 10).
Figura 10. Corte bisel en la parte superior del material y eliminación de yemas.
D. Unir el esqueje del material y la secundina, fijando fuertemente con cinta parafilm para
asegurar la unión de las dos estacas. Las yemas deben quedar apuntando hacia arriba.
Figura 11. Unión del esqueje del material y la secundina.
E. Cubrir el injerto y sellar con cinta parafilm el extremo superior de la estaca del material
indicador para evitar su deshidratación (Figura 12)
Figura 12. Unión y cubrimiento del injerto con papel parafilm.
F. Depositar el injerto en un frasco de vidrio estéril utilizando como sustrato agua destilada
estéril (Figura 13).
Figura 13. Injerto depositado en frasco de vidrio estéril con su identificación.
G. Incubar en cuarto de crecimiento a temperatura entre 25 - 27 0C y un fotoperíodo de 12
horas luz y 12 horas oscuridad, cambiar el agua de los frascos cada dos a tres días.
H. Observar y registrar periódicamente la aparición de síntomas característicos de FSD
(Clorosis, enrollamiento en los bordes y mosaico) en las hojas de secundina de los
injertos. Al cabo de 45 días de incubación evaluar la presencia ó ausencia de la presencia
de mosaico en el follaje del injerto de secundina. Documentar todo los resultados como
positivos a los que desarrollen los síntomas característicos y negativo a los que no
presentan síntomas (Figura 14 A,B).
Figura 14 A. Planta enferma con síntomas de FSD
Figura 14 B. Plantas sanas sin síntomas de FSD
Adicionalmente a esta prueba en este momento se está validando una técnica molecular par la
detección de esta enfermedad.
3.
Detección de los Virus CsXV y CsCMV
Para la detección de CsCMV y CsXV se utiliza la técnica ELISA (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay), que es un método serológico rápido y eficiente para la detección de
virus. Existen varias clases de ELISA, la que se realiza en el Laboratorio de Sanidad de
Germoplasma URG para estos virus es la de doble emparedado de anticuerpos (DAS - ELISA)
(Velasco et al., 1985)
Es necesario aclarar que las gammaglobulinas utilizadas en estas pruebas fueron obtenidas
en el laboratorio de Virologia del CIAT. En todas las pruebas se utilizan controles negativos
(Plantas sanas) y positivos (plantas afectadas por cada enfermedad) mantenidas en
condiciones aisladas. La descripción de la metodología utilizada para estas pruebas se
describen en el anexo 1.
4.
Documentación de resultados.
Después de tener los datos obtenidos en las diferentes pruebas realizadas se procede a
registrar en la base de datos todos los resultados obtenidos siguiendo el siguiente
procedimiento:
A. Ingresar a la base de datos de la URG introduciendo el Nombre de Usuario y Clave
Personal, correspondiente al personal encargado, seleccionar la opción YUCA. Seleccione
el icono SANIDAD para introducir los datos de los resultados de indexación obtenidos en el
proceso (Figura 15).
1
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3
4
Figura 15. Interfase de entrada a la base de dato de la URG. 1) Selección opción YUCA.
2) Distribución, 3) Invernadero Bonsái, 4) Sanidad.
B. Introducir el número de accesión de la plántula analizada.
C. Seleccionar la casilla NOMBRE (automáticamente aparecerá en forma abreviada los
nombres de los virus de yuca) escoja la forma abreviada del virus al cual se le hizo la
prueba, de la siguiente forma: CsXV para el Virus X de la Yuca, CsCMV para el Virus del
Mosaico Común de la Yuca y FSD para el Virus Cuero de Sapo de la Yuca (Figura 16).
D. Ingresar la fecha de la obtención del resultado.
E. Ingresar el(los) resultado(s) obtenido(s) ya sean positivos o negativos de las pruebas
realizadas para CsXV, CsCMV y FSD, según el caso.
F. Ingresar en la casilla Método, el método utilizado para indexación ya sea INJERTO o RTPCR para FSD o ELISA para CsXV y CsCMV.
G. Seleccionar en la casilla Responsable, la persona encargada en realizar la indexación
H. Automáticamente el sistema da como disponible el material que tenga ingresados y
negativos los resultados para los análisis de los tres virus (CsXV, CsCMV y FSD). Las
accesiones no disponibles son todas aquellas que les hacen falta pruebas o que han
resultados positivas para alguna de ellas.
I.
Guardar los datos almacenados.
8
3
2
1
4
5
6
7
Figura 16. Interfase de SANIDAD. Proceso de introducción de resultado en el banco de datos de sanidad de yuca, datos a
introducir: 1) Numero de accesión, 2) Nombre virus, 3) Fecha de obtención de resultados, 4) Resultado obtenido (N/P), 5) Método
de indexación (Elisa / Injerto), 6) Responsable de la prueba. 7) Casilla de chequeo que indica que accesión esta disponible con un
visto bueno (√) o de lo contrario no disponible 8) Guardar
J. Enviar una copia de los resultados obtenidos al personal encargado del Banco de
Germoplasma de Yuca de URG.
K. Documentar los resultados en tablas Excel en medio magnético e impreso. Conservar una
copia física de los resultados obtenidos por el lector de ELISA para CsXV y CsCMV. Para
el caso del virus FSD una documentación fotográfica donde se puedan observar los
criterios de resultados.
Cuando el material quede disponible o aceptado para todas las pruebas se prosigue a llevar
las plantas a un invernadero específico en donde se tiene la colección Bonsái. Esta colección
se mantiene con el objetivo de tener duplicado del banco in-vitro y tener disponibilidad
inmediata de material vegetal en caso de ser requerido para trabajos de investigación.
REFERENCIAS
Calvert L. A., M. Cuervo, M.D. Ospina, C. Fauquet y B.C. Ramírez. Characterizatión of
cassava common mosaic virus and a detective RNA species. Journal of General Virology
(1996), 77, 525-530.
Calvert L., M. Cuervo, B. Pineda. 2001. Cuero de Sapo, una enfermedad que ataca la yuca.
Plegable, material para distribución.
Calvert L. y M. Cuervo. Enfermedades Vírales de la Yuca en América del Sur. Capitulo 16 de
la Obra “La Yuca en el tercer Milenio. Sistemas Modernos de Producción, procesamiento,
Utilización y Comercialización”. Producida por el CIAT y el Consorcio Latinoamericano y del
Caribe de Apoyo a la Investigación y Desarrollo de la Yuca (CLAYUCA), 2002.
Frison E.A. and E. Feliu. 1991. FAO/IBPGR Technical guidelines for the SAFE Movement of
Cassava Germplasm. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome /
International Board for plant Genetic Resources. Rome and Centro Internacional de Agricultura
Tropical.- CIAT.
Lozano, J. C. & Nolt, B. L. 1989. Pest and pathogens of cassava. Pages 174-175 in:
Plant Protection and Quarantine: Selected Pests and Pathogens of Quarantine
Significance Vol. 2 R.P. Kahn, ed., CRC Press, Pr. Inc., Boca Raton FL
Maffla, G. Roa, J.C. & Roca, W.M. 1984. Erradicación de la enfermedad cuero de sapo de la
yuca Manihot esculenta, pro medio del cultivo de meristemos. Efecto de la termoterapia, y del
tamaño del explante sobre la tasa de saneamiento. In: Perea D. & Angarita, Z.A. eds.
Congreso Nacional de Cultivo de Tejidos Vegetales, Bogotá, Colombia, 1984. Memorias.
Bogotá, U. Nacional de Colombia. Pp. 171-175.
Pineda, B., Jayasinghe, U., and Lozano, J. C. 1983. La enfermedad "Cuero de Sapo" en yuca
(Manihot esculenta, Crantz). ASIAVA 4: 10-12.
Roca W., Luis A. Mrogisnki. CIAT.1991. Cultivo de Tejidos en la Agricultura: Fundamentos y
Aplicaciones.
.
Anexo 1.
PRUEBA INMUNO-ENZIMÁTICA (ELISA) PARA
LA DETECCIÓN DE LOS VIRUS CsXV y CCMV
PROCEDIMIENTO :
1.- Diluir la gamma-globulina con el buffer de cubrimiento y agregar 100 ul de esta solución a
cada uno de los pozos de una placa de microtitulación. Incubar a 37 C durante 3-4 horas.
2.- Lavar la placa con el buffer PBS-Tween por 4 veces usando un frasco lavador o el equipo
mecanico de lavar platos de ELISA. En el lavado inicial, enjuagar los pozos y descartar el
buffer de inmediato. En los lavados siguientes, dejar el buffer de cada lavado durante 3
minutos.
3.- Macerar las muestras a probar, en una dilucion 1/10, con el buffer para muestras y agregar
100 ul de cada muestra en dos pozos diferentes y separados. Incubar a 4-6 C durante toda la
noche.
Incluir muestras de controles conocidos: sano, enfermo y además el buffer para muestras solo,
con el propósito de chequear la reacción.
4.- Lavar nuevamente la placa, de igual forma que en el paso 2, teniendo cuidado de remover
todo residuo de las muestras.
5.- Diluir la gamma-globulina marcada con la enzima (conjugado) con el buffer para el
conjugado y agregar 100 ul de la solución a cada pozo de la placa. Incubar a 37 C durante 3-4
horas.
6.- Lavar, muy bien, la placa como en el paso 2.
7.- Preparar una solución fresca de p-nitrofenil fosfato (substrato de color) a 0.6-1 mg/ml en
buffer para el substrato y agregar 100 ul en cada pozo. Incubar a temperatura ambiente
durante 20-60 minutos. La placa se puede guardar a 4-6 C durante toda la noche y leer otra
vez.
9.- Obtención de resultados:
a) Visualmente, usando preferiblemente un visor con luz.
b) Por absorbancia a 450 nm usando un espectrofotómetro. Se considera "positivo" todo
aquel valor mayor a 2 veces el valor del control sano.
Durante los períodos de incubación la placa debe cubrirse. Es importante mantener una
temperatura uniforme a través de toda la placa pare evitar los efectos de bordes
Diluciones de Gammaglobulina y conjugados utilizadas:
Virus
Virus X de la Yuca (CsXV)
Mosaico Común de la Yuca
(CsCMV)
Dilución Gamaglobulina
1/1600
1/2500
Dilución conjugado
1/1100
1/2000
REACTIVOS Y SOLUCIONES:
Todas las soluciones buffers deben guardarse a 4-6 C.
Buffer PBS (pH 7.4):
Cloruro de sodio
Fosfato de potasio monobásico
Fosfato de sodio dibasico. 12 hidratado
Cloruro de potasio
Volumen final con agua destilada
8.0 gr
0.2 gr
2.9 gr
0.2 gr
1 litro
Buffer PBS-Tween:
es buffer PBS + 0.5 ml Tween-20 por litro.
Buffer de cubrimiento (pH 9.6)
Carbonato de sodio anhidro
Bicarbonato de sodio
Azida de sodio
Volumen final con agua destilada
0.318 gr
0.586 gr
0.04 gr
200 ml.
Buffer para muestras (antigeno):
es buffer PBS-Tween conteniendo 2% polivinil-pirrolidona, P.M. 40.000(PVP-40).
Preparar fresco cada vez que se vaya a usar.
Buffer para el conjugado:
es el buffer para muestras conteniendo 0.2% de albúmina de huevo (ovalbúmina) para inhibir
las reacciones no especificas. Preparar fresco cada vez que se vaya a usar.
Buffer para el substrato (pH 9.8):
Dietanolamina
Agua destilada
Azida de sodio
pH (con HC1) 9.8
Volumen final con agua destilada
9.7 ml
80.0 ml
0.02 gr
100.0 ml