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XI Congreso Argentino de Virología
II Congreso Latinoamericano de Virología
IV Simposio de Virología Clínica
II Simposio de Virología Veterinaria
“Dr. José L. La Torre”
23 al 26 de junio de 2015
Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina
Libro de resúmenes
Centro de Convenciones Palais Rouge
Jerónimo Salguero 1443/49
Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina
PATROCINANTES Y AUSPICIANTES
Entidades Patrocinantes
Ministerio de Salud de la Nación
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET)
Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCYT)
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA)
European Molecular Biology Organization (EMBO)
American Society for Microbiology (ASM)
Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (INBIRS) - UBA-CONICET
Empresas Patrocinantes principales
Abbott División Molecular
Abbott División Diagnósticos
BioSystems SA
Tecnolab SA
Productos Roche S.A.Q.e I. - División Diagnóstica
WM Argentina SA
Empresas Patrocinantes
Alere Argentina
AP- Biotech SRL
Biodynamics SRL
Bioars SA
Biocientífica
Bioquímica SRL
GeneReach Biotechnology Corporation
Internegocios SA
Inbio Highway
Norces
Microlat SRL
Migliore Laclaustra SRL
Lobov Científica
Empresas Colaboradoras
Biogénesis Bagó
BD Biosciences Argentina
Invitrogen Argentina SA
Auspiciantes
Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud "Dr. Carlos G. Malbrán"
Asociación Argentina de Zoonosis (AAZ)
Asociación Bioquímica Argentina (ABA)
Asociación Médica Argentina (AMA)
Confederación Unificada de Bioquímicos de la Rep. Argentina (CUBRA)
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)
Facultad de Agronomía - UBA
Facultad de Agronomía - Universidad Nacional de la Pcia. de Buenos Aires
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
Facultad de Ciencias Médicas - UNLP
Facultad de Ciencias Veterinarias - UNLP
Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA
Federación Bioquímica de la Pcia. de Buenos Aires (FABA)
Fundación Huésped
Instituto de Cardiología y Cirugía Cardiovascular “Fundación Favaloro”
Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. César Milstein" - ex CEVAN
Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas "Dr. Julio Maiztegui" (INEVH)
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA)
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA)
Sociedad Argentina de Ginecología Infanto Juvenil (SAGIJ)
Sociedad Argentina de Infectología (SADI)
Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC)
Sociedad Argentina de Medicina Veterinaria (SOMEVE)
Sociedad Argentina de Pediatría (SAP)
Sociedad Argentina de Reumatología de la Ciudad de Buenos Aires (SAR)
Sociedad Científica Argentina (SCA)
Sociedad de Obstetricia y Ginecología de la Pcia de Bs. As. (SOGBA)
Universidad Favaloro
Universidad Nacional de La Plata (UNLP)
COMITÉ ORGANIZADOR
Presidente
Víctor Romanowski (UNLP)
Vice Presidentes
Elsa Damonte (UBA)
Juan D. Claus (UNL)
Secretaría General
Nora López (ICT Milstein)
Mauricio Carobene (INBIRS)
Cybele García (UBA)
Oscar Taboga (INTA)
Tesorería
Ana Jar (UBA)
Lucía Cavallaro (UBA)
Comisión Técnica
Mariano Pérez Filgueira (INTA)
Carolina Torres (UBA)
Maximiliano Wilda (ICT Milstein)
Alejandra Capozzo (INTA)
María Ávila (UBA)
Alejandra D'Antuono (ICT Milstein)
Andrea Mangano (Htal. Garrahan)
Elsa Baumeister (ANLIS)
Secretaría Científica
María Victoria Preciado (Htal. Gutiérrez)
Inés Zapiola (Htal. Muñiz)
Cecilia Galosi (UNLP)
Graciela Glikmann (UNQ)
Comisión Científica
Daniela Gardiol (IBR)
Guillermina Dolcini (CIVETAN)
Irene Álvarez (INTA)
Jorge Quarleri (INBIRS)
María Alejandra Picconi (ANLIS)
Marta Contigiani (UNC)
Paula Aulicino (Htal. Garrahan)
Pilar Adamo (UNC)
Silvana Levis (ANLIS)
Viviana Mbayed (UBA)
Viviana Ré (UNC)
Miguel Taborda (UNR)
Claudia Nunes Duarte Dos Santos (ICC-Fiocruz, Brasil)
María Fernanda Gutiérrez (PUJ, Colombia)
Marcelo López Lastra (PUCC, Chile)
Juan Ramón Arbiza (UR, Uruguay)
Flor Pujol (IVIC, Venezuela)
Comisión Directiva de la Sociedad Argentina de Virología
Presidente
María Victoria Preciado
Vicepresidente
Lucía V. Cavallaro
Secretaria
Oscar Taboga
Prosecretario
Andrea Mangano
Secretario de Actas
Irene Álvarez
Tesorera
Nora López
Protesorero
Cecilia Galosi
Vocal Titular 1º
Victor Romanowski
Vocal Titular 2º
Daniela Gardiol
Vocal Titular 3º
Mauricio Carobene
Vocal Titular 4º
Marta Contigiani
Vocal Suplente 1º
Elsa Baumeister
Vocal Suplente 2º
Cybele García
Vocal Suplente 3º
Silvana Levis
Vocal Suplente 4º
Inés Zapiola
Comisión Directiva de la Asociación Argentina de Microbiología
Presidente
Manuel Gómez Carrillo
Vicepresidente
Gustavo Giusiano
Secretaria
María Cecilia Freire
Prosecretario
Juan Stupka
Secretaria de actas
María I.G. Fernández
Tesorera
Paula Gagetti
Protesorero
Susana Vázquez
Vocal Titular 1º
Adriana Sucari
Vocal Titular 2º
María José Gallego
Vocal Titular 3º
María Soledad Ramírez
Vocal Titular 4º
Angel Cataldi
Vocal Suplente 1º
Lucía Cavallaro
Vocal Suplente 2º
HoracioFrade
Vocal Suplente 3º
Marina Bottiglieri
Vocal Suplente 4º
Emilce Méndez
Carta del Presidente del XI Congreso Argentino de Virología
La Sociedad Argentina de Virología (SAV), división de la Asociación Argentina de Microbiología (AAM),
tiene como objetivo promover la actividad científica en el campo de la Virología humana, veterinaria y
vegetal.
La actividad científica más importante y convocante de nuestra Sociedad es el Congreso Argentino de
Virología (CAV), que se realiza cada tres años. En el marco de dicha actividad, desde el año 1986, la
Sociedad ha promovido además la realización de Encuentros Latinoamericanos de Virólogos con el fin de
lograr la interacción e integración de especialistas de la región y fortalecer los vínculos de cooperación
entre los científicos de los diferentes países. En concordancia con esos objetivos, en esta oportunidad el XI
Congreso Argentino de Virología y el II Congreso Latinoamericano de Virología tendrán lugar en forma
conjunta entre los días 23 y 26 de junio de 2015 en la Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Tal como ha
ocurrido en ediciones anteriores, simultáneamente se desarrollarán también el IV Simposio Argentino de
Virología Clínica y el II Simposio Argentino de Virología Veterinaria.
El congreso se desarrollará en Sesiones Plenarias, Mesas Redondas, Sesiones de Presentación de
Pósters y Sesiones Interactivas de Discusión de Casos Clínicos. Los trabajos originales que se presentarán en
forma de póster fueron seleccionados por un distinguido Comité Científico. Un número importante de
prestigiosos virólogos del ámbito local e internacional participan en este evento.
El programa científico ha sido cuidadosamente diseñado, con el objeto de vincular a la Virología con
otras disciplinas, promoviendo un abordaje integrador del estado actual del conocimiento en la materia, y
su impacto en la Salud Pública, el Ambiente y sus aplicaciones en Biotecnología.
En nombre de la Comisión Organizadora agradezco la participación entusiasta de los virólogos de la
región y las importantes contribuciones de las instituciones nacionales e internacionales relacionadas con el
fomento de la ciencia, la salud y las actividades agropecuarias, como así también a las empresas
patrocinantes y el auspicio de universidades y sociedades científicas y profesionales.
DR. VICTOR ROMANOWSKI
Presidente de la Comisión Organizadora
XI Congreso Argentino de Virología
II Congreso Latinoamericano de Virología
IV Simposio Argentino de Virología Clínica
II Simposio Argentino de Virología Veterinaria
Libro de resúmenes
XI Congreso Argentino de Virología
II Congreso Latinoamericano de Virología
Conferencias plenarias
Martes 23 de junio
Miércoles 24 de junio
Sala A (Salón Pigalle - 2º piso)
Sala A (Salón Pigalle - 2º piso)
09:45 – 10:30 hs. CONFERENCIA PLENARIA INAUGURAL
09:00 – 09:45 hs. CONFERENCIA 3
Luis Villarreal. Center for Virus Research, University of California,
Irvine, EE.UU.
Frank Rösl. Instituto Alemán de Investigación sobre Cáncer (DKFZ),
Heidelberg, Alemania.
VIRUS IN HOST EVOLUTION: RETHINKING RNA QUASISPECIES AS
COOPERATIVE AND AS THE BOSS
L Villarreal
Center for Virus Research University of California, Irvine, Estados Unidos.
PAPILLOMAVIRUSES AS POTENTIAL SKIN CANCER ETIOLOGIC AGENTS:
A DEVELOPMENT OF A VLP VACCINE IN A WILD MURINE ANIMAL
MODEL
F Rosl1, S Vinzon1, E Geissler2, I Nindl3
1
German Cancer Research Center, Research Program Infection &
Cancer, Alemania. 2 Department of Surgery, Experimental Surgery
Division, University of Regensburg, Regensburg, Alemania. 3 Department
of Dermatology, Charité Berlin, Berlin, Alemania.
Viruses exist as the most numerous, ancient and dynamic of all genetic
entities thus provide a vast virosphere. They exchange genetic
information in a diffuse network with other virus and host. Although we
have long thought of them as the most selfish of genetic parasites that
appear to prey on their host, they can also become ‘one’ with their host
(symbiotic) by persisting either as genomic, defective or epigenomic
agents. We now know virus persistence is a common and conserved
situation. In this presentation I will outline how virus persistence
strongly affects host survival in the virosphere. By providing both
protection and destruction they create group states of host virus
addiction. RNA viruses were used to model quasispecies theory and the
origin of the genetic code. I re-examine quasispecies theory based on
decades of experimental virology and conclude virus quasispecies are
cooperative. Based on this foundation, I then reconsider the role of
virus derived RNA (especially stem-loop RNA) on host evolution and
argue that parasite derived non-coding RNA’s provide cooperative
regulatory (identity) networks in Eukaryotes.
17:15 – 18:00 hs. CONFERENCIA 2
Marcelo López Lastra. Laboratorio de Virología Molecular, Instituto
Milenio de Inmunología e Inmunoterapia, Centro de Investigaciones
Médicas, Escuela de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile,
Santiago, Chile.
THE ART OF WAR; VIRAL SUBVERSION OF THE HOST PROTEIN
SYNTHESIS MACHINERY.
M López-Lastra
Laboratorio de Virología Molecular, Instituto Milenio de Inmunología e
Inmunoterapia, Departamento de Infectología e Inmunología Pediátrica,
Escuela de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile, Chile.
Viruses are obligate intracellular parasites and depend on cells for their
replication. They have, however, evolved mechanisms to ensure that
their replication can be achieved in an efficient manner. The expression
of viral proteins is frequently subject to regulation at the level of protein
synthesis. The primary target of such control is normally the initiation
step of protein synthesis. Indeed, during the early stages of infection,
viral mRNAs compete with their host counterparts for the protein
synthesis machinery. To circumvent this competition viruses have
evolved diverse strategies to ensure that the host ribosomes can be
recruited selectively to the viral mRNAs. This work will highlight some of
the strategies used by viral mRNAs to subvert the host translational
machinery; special focus will be given to the mechanisms used by RNA
viruses of high medical relevance such as HIV-1.
To evaluate whether the protective effect of a vaccine against nonmelanoma skin cancer can be translated to patients, we used the
rodent Mastomys coucha that is naturally infected with Mastomys
natalensis papillomavirus (MnPV). This skin type papillomavirus induces
not only benign skin tumours, such as papillomas and
keratoacanthomas, but also squamous cell carcinomas. Here, we
examined the efficacy of a VLP-based vaccine on either previously or
newly established infections. VLPs raise a strong and long-lasting
neutralizing antibody response that confers protection even under
systemic long-term cyclosporine A treatment. Remarkably, the vaccine
completely prevents the appearance of benign as well as malignant skin
tumors. Protection involves the maintenance of a low viral load in the
skin by an antibody-dependent prevention of virus spread. Our results
provide first evidence that VLPs elicit an effective immune response in
the skin under immunocompetent and immunosuppressed conditions.
These findings provide the basis for the clinical development of potent
vaccination strategies against cutaneous HPV infections and HPVinduced tumors, especially in patients awaiting organ transplantation.
16:30 – 17:15 hs. CONFERENCIA 4
Jônatas S Abrahão. Departamento de Microbiologia, Universidade
Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil.
SAMBA VIRUS AND OTHER GIANTS: THE LARGEST AND MORE
COMPLEX VIRUSES EVER ISOLATED IN BRAZIL
J Abrahao
Universidade Federal de Minas Gerais, Laboratório de Vírus, GEPVIG.,
Brasil.
In 2003, Acanthamoeba polyphaga mimivirus (APMV) was first
described and began to impact researchers around the world, due to its
structural and genetic complexity. This virus founded the family
Mimiviridae. In recent years, several new giant viruses have been
isolated from different environments and specimens. Giant virus
research is in its initial phase and information that may arise in the
coming years may change current conceptions of life, diversity and
evolution. Thus, this presentation aims to condense the studies
conducted so far about the features and peculiarities of APMV, Samba
and other Brazilian Giant viruses, from its discovery to its clinical
relevance.
8
Libro de resúmenes
17:15 – 18:00 hs. CONFERENCIA 5
David Markovitz. Division of Infectious Diseases, Department of
Internal Medicine, University of Michigan Medical Center, Ann
Arbor, Michigan, EE.UU.
THE SECRET LIFE OF HUMAN ENDOGENOUS RETROVIRUSES
DM Markovitz, R Contreras-Galindo, MH Kaplan
University of Michigan, Estados Unidos.
Our work on Human Endogenous Retroviruses (HERVs) led to our
discovery of a previously unknown family of HERVs (termed K111) that
have spread throughout 15 centromeres in modern humans through a
process resembling homologous recombination. More recently, we
have discovered a second virus, termed K-222, which has spread among
pericentomeric sequences in distinct human chromosomes. The
sequence of the human genome is not yet complete and, importantly,
major gaps remain at the centromeric region of each chromosome. It is
unlikely that the centromere sequences are functionally indolent,
considering the fact that the centromere is responsible for the faithful
segregation of chromosomes, and destabilization of this process results
in genomic instability and aneuploidy. Therefore, the sequence of the
centromere remains a last frontier of human genomics and genetics.
The structure of each human chromosome is, however, organized by
specific alpha repeats that are distinct to the centromere of each
individual human chromosome. We are now using the sequence
information from alpha repeats and HERVs to develop molecular, qPCRbased assays capable of specifically detecting and quantifying the
centromeric material of each human chromosome. We are presently
applying this new technology to study the role of centromeres in birth
defects. In addition, the potential for centromeres to drive the
pathogenesis of cancer has, surprisingly, remained very understudied,
and our new methodology is allowing us to assess whether specific
patterns of centromeric evolution are seen in particular malignancies,
as our preliminary data would suggest. These tools can also be exploited
to begin to examine whether centromere biology might directly guide
malignant transformation. Thus, advances from our work on HERVs
have led us to apply new technologies to begin to understand the
mysteries of centromeres in health and disease.
Jueves 25 de junio
Sala A (Salón Pigalle - 2º piso)
09:00 – 09:45 hs. CONFERENCIA 6
Elina Zuñiga. Division of Biological Sciences, University of California,
San Diego, EE.UU.
ARENAVIRUSES: LETHAL PATHOGENS AND MODELS FOR CHRONIC
VIRAL INFECTIONS
E Zuniga
Division of Biology, University of California San Diego, La Jolla CA,
Estados Unidos.
Our laboratory is interested in understanding the cellular and molecular
mechanisms underlying the regulation of the immune system during
viral infections. To get advantage of the mouse genetics and available
tools we study host-pathogen interactions in a model of murine
infection with the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis
virus (LCMV). We use two distinct variants of LCMV that cause acute or
chronic infections, respectively, upon inoculation into adult mice. This
allows us to investigate the mechanisms underlying immune-regulation
in the context of transient versus persistent viral replication and to
study how arenaviruses can outcompete or be controlled by immune
responses. With such research we aim at uncovering basic principles in
immune-regulation and unlocking new strategies to attenuate
infections with chronic viruses and/or arenaviruses. Recent progress in
these areas will be presented.
Viernes 26 de junio
Sala A (Salón Pigalle - 2º piso)
09:00 – 09:45 hs. CONFERENCIA 7
Alberto Epstein. Centro Internacional de Investigación en
Infectología (CIRI), CNRS, INSERM, Francia.
USE OF HERPES SIMPLEX VIRUS TYPE 1 (HSV-1)-DERIVED AMPLICON
VECTORS FOR THE STUDY OF NORMAL AND PATHOLOGICAL
COGNITIVE FUNCTIONS.
AL Epstein
Université de Versailles Saint Quentin en Yvelines, Francia.
Amplicons are herpes simplex virus type 1 (HSV-1)-based defective
vectors carrying no viral genes, thus warranting no intrinsic toxicity for
infected cells but requiring a helper virus system to be produced in large
amounts, which should then be eliminated from the vector stocks. In
this talk we will introduce some of the theoretical and methodological
aspects of helper-free amplicon vectors production and will show how
these vectors can be used to study normal and pathological cognitive
functions in experimental animal models.
N-Methyl-D-aspartate glutamate receptors (NMDAR) are involved in the
control of synaptic plasticity and memory function. They are cationic
channel receptors that, when simultaneously activated by voltage and
ligand (glutamate) binding, open to allow calcium entry. NMDAR are
tetramers formed by two GluN1 subunits and 2 GluN2 subunits. To
study the role of hippocampal NMDAR in cognitive functions such as
learning and memory formation, we developed HSV-1-based amplicon
vectors expressing antisense RNA sequences against GluN1 to induce
down-regulation of the expression of this subunit. Following inoculation
into the CA1 layer of adult rat hippocampus, the vector induced highlevels of antisense GluN1 RNA and considerably decreased expression of
GluN1 subunit. We observed that this vector caused a significant
impairment in the performance of two different behavioural tasks, thus
indicating an involvement of hippocampal NMDAR in the control of the
cognitive functions under study.
The hippocampal formation is one of the earliest regions damaged in
Alzheimer’s disease (AD). Amyloid-beta oligomers (AβO) accumulate in
AD brains, where they target excitatory post-synaptic terminals and
trigger synapse deterioration, a mechanism likely underlying memory
loss in early-stage AD. When used to infect primary cultures of rat
hippocampal neurons, the amplicons expressing GluN1 antisense RNA
suppressed up to 90% GluN1 expression in dendritic spines and
significantly reduced the binding of exogenously added soluble AβO to
the spines. Furthermore, the amplicon-induced GluN1-knockdown
markedly reduced the neuronal oxidative stress instigated by binding of
AβO.
Therefore, our results corroborated (a) that hippocampal CA1-specific
NMDAR are directly involved in normal learning and memory processing
and (b) strongly suggest that NMDAR are required for synaptic targeting
of AβO to neurons and are at least partially responsible for their
deleterious effects.
14:30 – 15:15 hs. CONFERENCIA 8
Andrea Gamarnik. Fundación Instituto Leloir‐CONICET, Ciudad
Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
PLASTICIDAD Y ADAPTACIÓN DEL GENOMA DEL VIRUS DEL DENGUE
S Villordo, C Filomatori, A Gamarnik
Fundación Instituto Leloir-CONICET, Buenos Aires, Argentina.
El virus del dengue es un importante patógeno humano transmitido por
mosquitos. Se estiman 390 millones de infecciones anuales en el
mundo, representando una seria amenaza a los sistemas de salud.
Hasta el momento no existen vacunas ni antivirales específicos para el
control del dengue. En la naturaleza el virus debe alternar infecciones
en mosquitos y humanos. Los requerimientos y las limitaciones con las
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Libro de resúmenes
que se encuentra el virus en estos dos hospedadores son distintos y eso
ejerce una presión de selección que impacta en la estructura genética
de la población viral. Si bien es de gran importancia entender cuáles son
las barreras (a nivel molecular) que existen en la transición del virus de
un hospedador a otro, es escaso el conocimiento disponible sobre los
determinantes que limitan o facilitan el pasaje del virus del dengue
entre especies.
En este trabajo estudiamos la dinámica y evolución de estructuras de
RNA del genoma del virus del dengue en poblaciones virales adaptadas
a células humanas o de mosquito. Mediante el empleo de secuenciación
masiva de genomas de poblaciones virales descubrimos la presencia de
variantes
virales
distintas
dependiendo
del
hospedador.
Sorprendentemente las mutaciones responsables de la selección
positiva mapearon en una única estructura de RNA presente en la
región 3’ no codificante del genoma. Empleando sistemas de evolución
viral en cultivo se observaron ciclos de selección positiva y negativa de
dichas mutaciones cuando el virus pasa de un hospedador a otro. Estos
estudios revelan un nuevo mecanismo de adaptación viral y proveen
información sobre aspectos fundamentales como es la transmisión del
virus de una especia a otra.
15:15 – 16:00 hs. CONFERENCIA PLENARIA DE CIERRE: The
EMBO Keynote Lecture
Félix Rey. Unité de Virologie Structurale, Institut Pasteur, París,
Francia.
A VULNERABLE SITE ON THE DENGUE VIRUS ENVELOPE PROTEIN
SUGGESTS NEW STRATEGIES FOR VACCINE DESIGN
F Rey
Institut Pasteur, Paris, Francia.
All successful vaccines protecting against viral diseases induce
neutralizing antibodies targeting vulnerable sites at the virus surface.
Several important viruses have resisted traditional vaccine
development, and novel strategies to identify and present vulnerable
sites to the immune system as immunogens are necessary. We have
focused on dengue virus, which consists of four related viruses (dengue
viruses serotypes 1 through 4), and for which an efficient vaccine
protecting against all four serotypes simultaneously is not available.
Using
structural
studies
[Nature,
2015
Jan
12.
doi:
10.1038/nature14130], we have identified that human antibodies
belonging to a class that potently neutralizes all four serotypes [Nat
Immunol, 2015. 16(2): p. 170-177] target a conserved site at the dimer
interface of the major envelope glycoprotein E. This exposed site is
conserved because it is also the binding site of the viral glycoprotein
prM during particle morphogenesis in the infected cell. The high
heterogeneity of circulating dengue virus particles in infected
individuals, together with the instability of the E protein dimer,
contribute to the generation of antibodies targeting multiple structures,
often not relevant for neutralization, thereby diluting the elicitation of
antibodies targeting relevant sites. Based on our results, we propose
generation stabilized E dimers on a re-surfaced molecule to focus the
immune system in this particularly vulnerable site at the dimer
interface. In my presentation I will discuss these results and their
implications for vaccine design.
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Libro de resúmenes
XI Congreso Argentino de Virología
II Congreso Latinoamericano de Virología
Mesas redondas
Martes 23 de junio
Sala A (Salón Pigalle - 2º piso)
10:30 – 12:00 hs. MESA REDONDA 1: VIRUS Y EVOLUCIÓN
Coordinadores:
Rodolfo Campos. Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y
Bioquímica, Universidad de Buenos Aires (UBA), Ciudad Autónoma
de Buenos Aires, Argentina.
Manuel Gómez Carrillo. Instituto de Investigaciones Biomédicas en
Retrovirus y SIDA (INBIRS), UBA-Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Ciudad Autónoma
de Buenos Aires, Argentina.
Panelistas:
Inés Badano. Laboratorio de Biología Molecular Aplicada, Facultad
de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales de la Universidad
Nacional de Misiones, Posadas, Argentina.
Laura Mojsiejczuk. Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y
Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Ciudad Autónoma de
Buenos Aires, Argentina.
Mariano Sede. INBIRS, UBA‐CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos
Aires, Argentina.
EVOLUCIÓN DEL VIRUS PAPILOMA HUMANO (HPV) DESDE UNA
PERSPECTIVA ANTROPOLÓGICA
I Badano
Laboratorio de Biología Molecular Aplicada, Universidad Nacional de
Misiones, Argentina.
El análisis de la variación genética de secuencias virales y su
distribución geográfica permite comprender los orígenes y la dispersión
de diferentes cepas virales. Este enfoque ha sido utilizado en
enfermedades que afectan al hombre, incluyendo la fiebre amarilla, la
gripe y el VIH. Esta información permite la identificación de focos
infecciosos, el seguimiento de la infección entre pacientes, como así
también el diseño de vacunas más efectivas. Por otra parte, los estudios
de la variación genética de microorganismos que infectan al hombre
también aportan una nueva dimensión en el estudio de las migraciones
humanas. En nuestro grupo empleamos datos epidemiológicos y
filogenéticos del Virus Papiloma Humano tipo 16 (HPV16) para
contribuir al conocimiento histórico del poblamiento de la Provincia de
Misiones.
El HPV16 es un virus de ADN doble cadena de 8Kb. que pertenece a la
Familia Papillomaviridae. Su estudio reviste importancia clínica por ser
uno de los principales responsables del desarrollo de cáncer de cuello
uterino. Su principal vía de transmisión es el contacto sexual y se
encuentra en el tracto genital del 3% de la población femenina
asintomática y el 54% de los carcinomas a nivel mundial. Según la
variación de sus genomas, los HPV16 se clasifican en variantes virales
denominadas: Africanas, Europeas, Asiáticas y Asiático Americanas. La
principal hipótesis sobre su emergencia y dispersión indica que estas
variantes se habrían originado por mutación en el transcurso de los
últimos 200.000 años, acompañando el proceso de evolución y
migración de Homo sapiens Fuera de África. Estas características
vuelven al HPV16 un interesante marcador antropológico. En particular,
en poblaciones multiétnicas de Argentina, donde la distribución
geográfica ancestral de variantes Asiático Americanas ha sido afectada
por la colonización española, el tráfico de esclavos, y la inmigración de
europeos, no españoles, durante la segunda mitad del Siglo XIX y
principios del XX. Resultados preliminares de nuestro grupo indican una
prevalencia cercana al 10% de variantes Asiático Americanas y un 90%
de variantes de origen Europeo en la ciudad de Posadas, Misiones. La
datación molecular de estos linajes virales coincide con aquella
determinada mediante ADN mitocondrial en población Europea y
Amerindia (41,793 y 21,421 años respectivamente). Estos resultados
han sido interpretados como una fuerte irrupción del virus durante la
colonización española (Siglo VX) y la inmigración europea del Siglo XIX a
la región. Comprender el origen y dispersión del HPV-16 será
fundamental en la era de la vacuna.
Financiamiento: Fundación Florencio Fiorini para investigaciones
Biomédicas (2011). CONICET. CEDIT, Gobierno de Misiones (2011).
ANPCyT PICTO-UNaM 2011-106 y PICT-2012-0761.
HISTORIA EVOLUTIVA DEL VIRUS DE HEPATITIS B: ORIGEN, DINÁMICA
Y DISPERSIÓN DEL GENOTIPO F EN AMÉRICA
L Mojsiejczuk
Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad
de Buenos Aires, Argentina.
El genotipo F del virus del la hepatitis B (HBV) es considerado nativo de
América, sin embargo en la actualidad se conoce poco acerca de su
origen espacio-temporal y dispersión a lo largo del continente. El
objetivo del presente trabajo fue analizar la historia evolutiva del
Genotipo F del HBV en el continente americano. Se utilizaron
secuencias de genoma completo del genotipo F (n=215) disponibles en
GenBank para construir dos dataset: “Subgenotipo F1” y “Subgenotipos
F2-F5”, que fueron introducidos en sendos análisis de coalescencia
bayesiana implementados en el paquete BEAST v1.8.1. Se co-estimaron
la edad, mediante calibración con una tasa media de evolución de
1x10-5 sustituciones/sitio/año, y la localización más probables de los
ancestros de los grupos relevantes. Los resultados indican que la
localización más probable de los ancestros de los sgt F1 y F5 es Panamá,
de los sgt F2 y F3 es Venezuela y del sgt F4, Argentina. Se observa que
la mayoría de los linajes tuvieron una lenta dispersión en América
Central y norte de Sudamérica, mientras que los grupos F1b y F4
muestran una rápida migración hacia el sur del continente, donde se
produce la diversificación y posterior dispersión en la región.
ANÁLISIS DE LA DINÁMICA DE POBLACIONES DEL VIRUS DE LA
INMUNODEFICIENCIA HUMANA TIPO 1 (HIV‐ 1) POR SECUENCIACIÓN
DE ALTO RENDIMIENTO (UDPS)
MM Sede
INBIRS (UBA/Conicet), Argentina.
El advenimiento de nuevas técnicas de secuenciación nucleotídica,
conocidas como secuenciación de nueva generación, ha permitido la
caracterización profunda de poblaciones virales dado su alto poder
resolutivo. No obstante ello, el gran caudal de datos que puede
obtenerse conlleva un desafío al momento de su análisis, siendo esta
una limitación importante a la hora de establecer relaciones
filogenéticas basados en datos obtenidos de diferentes aislamientos.
Este escenario será analizado tomando como modelo el estudio
longitudinal del tropismo celular del virus de la inmunodeficiencia
humana (HIV) por los receptores de quimiocinas CCR5 y CXCR4 a través
del análisis de las secuencias nucleotídicas parciales del gen que
codifica para la glicoproteína gp120.
Se obtuvieron 133 muestras provenientes de 19 pacientes seguidos
durante 54 a 114 meses. Las secuencias obtenidas del proceso de
pirosecuenciación fueron sometidas a un exigente filtrado de acuerdo a
11
Libro de resúmenes
los parámetros de calidad exhibidos. El set de datos depurados arrojó
24335 secuencias, a las cuales se les determinó el tropismo
(www.genafor.org) y posteriormente se realizaron tanto análisis
filogenéticos como de diversidad y variabilidad de cuasiespecies.
Si bien se observó estructura temporal en la conformación de las
poblaciones, también pudo evidenciarse linajes evolucionando
independientemente a lo largo de la infección, indicando un escenario
complejo para la evolución de las cuasiespecies virales. Las variantes X4
estuvieron presentes en la mayoría de los pacientes, pero exhibiendo
diferencias entre los pacientes e incluso en muestras intra pacientes
tanto en la composición como en la predominancia de las
cuasiespecies.
Las variantes X4 pueden aparecer de manera independiente en
múltiples linajes a los largo de la infección por HIV. La manera en que
emergen varía entre los pacientes y pareciera depender tanto de
factores virales como del huésped. Además, el análisis sugiere que
variantes X4 en proporciones minoritarias podrían estar presentes en
estadios tempranos de la infección, mucho antes de convertirse en
dominantes.
15:45 – 17:15 hs. MESA REDONDA 2: INTERACCIÓN VIRUS
CÉLULA
Coordinadores:
Luis Scolaro. Laboratorio de Virología, Facultad de Ciencias Exactas
y Naturales, UBA, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Laura Delgui. Instituto de Histología y Embriología, IHEM‐CONICET,
Mendoza, Argentina.
Panelistas:
Diego Álvarez. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas –
CONICET (IIB‐INTECH), Universidad de San Martín, San Martín,
Argentina.
Susana Guerra García. Departamento de Medicina Preventiva y
Salud Pública y Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad
Autónoma de Madrid, Madrid, España.
María Guadalupe Martínez. Department of Cell Biology, Albert
Einstein College of Medicine, Nueva York, EE.UU.
CASCADAS DE SEÑALIZACIÓN QUE PROMUEVEN EL MOVIMIENTO
MEDIADO POR ACTINA Y LA PROPAGACIÓN DEL VIRUS VACCINIA
DE Alvarez
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, UNSAM-CONICET,
Argentina.
Los poxvirus son virus grandes, envueltos, con un genoma de DNA de
doble cadena. El virus vaccinia (VACV) es el poxvirus prototipo y se
utilizó como vacuna para la erradicación de la viruela en los años ’70.
Durante el ciclo de replicación del virus se producen dos formas
infecciosas distintas, los virus intracelulares envueltos (IEVs) y los virus
extracelulares (EVs). Los IEVs propagan la infección luego de la lisis de la
célula infectada al final del ciclo de replicación. Por su parte, los EVs
asociados a la célula (CEVs) se propagan de una célula infectada a las
células vecinas moviéndose mediante la formación de colas de actina.
La polimerización de actina depende de la activación de una cascada de
señalización que desemboca en el reclutamiento del factor promotor
de la nucleación N-WASP y del complejo nucleador de actina ARP2/3
del huésped en la cara citosólica de la membrana plasmática. Con el
objetivo de dilucidar el mecanismo molecular que controla la
polimerización de actina por debajo de los CEVs se diseñó un ensayo de
screening basado en la tecnología de RNA de interferencia (RNAi) para
identificar factores del huésped necesarios para la propagación
dependiente de actina de VACV. Utilizando este ensayo se descubrió
que la propagación viral requiere de la actividad de la formina FHOD1.
Las forminas constituyen una familia de proteínas de unión a actina con
funciones de nucleación, elongación y capping de filamentos de actina.
Utilizando microscopía de fluorescencia y video microscopía se
determinó que VACV recluta y activa a FHOD1 de manera dependiente
de la GTPasa pequeña Rac1 para promover el movimiento mediado por
actina de los CEVs. Nuestros resultados sugieren que VACV dirige la
polimerización de actina integrando las actividades de las cascadas de
señalización N-WASP/ARP2/3 y Rac1/FHOD1.
PAPEL DEL GEN 15 INDUCIDO POR INTERFERÓN (ISG15) EN LA
INFECCIÓN DE MACRÓFAGOS POR POXVIRUS
M Fernández-Escobar, B Martín-Moreno, S Guerra
Departamento de Medicina Preventiva, Salud Pública y Microbiología
de la Facultad de Medicina, Universidad Autónoma, Madrid, España.,
España.
Los macrófagos son células clave en el desencadenamiento de la
respuesta innata tras una infección viral. En respuesta a diversas
señales ambientales dichas células polarizan a fenotipo M1 o M2. Los
macrófagos en M1 se caracterizan por una gran actividad fagocítica y
por la activación de moléculas proinflamatorias que promueven la
defensa del huésped y la eliminación del tejido dañado tras una
infección. En cambio, los macrófagos M2 representan un fenotipo que
es importante en la promoción de la cicatrización de heridas, en la
remodelación de tejidos, así como la resolución de la inflamación.
Tras una infección viral se activa la expresión del gen 15 estimulado por
interferón 15 (ISG15) que codifica para una proteína encargada de
realizar una modificación postraduccional tanto en proteínas celulares
como en virales. Son múltiples los trabajos en los que se demuestra el
papel antiviral de ISG15. En nuestro laboratorio, recientemente hemos
demostrado que ISG15 es fundamental para la correcta fagocitosis de
los macrófagos, teniendo los macrófagos ISG15-/- dicha actividad
radicalmente disminuida.
En este estudio, hemos examinado la polarización de macrófagos tras
infección por el virus vaccinia (VACV) y además hemos evaluado el
papel de ISG15 en dicha polarización. Experimentos de genómica
comparativa por DNA microarrays mostraron una clara Activación de
Arginasa1 (marcador de M2) en macrófagos ISG15-/- infectados con
VACV frente a sus homólogos WT, lo que sugieren que la ausencia de
ISG15 se acompaña con un fenotipo polarización M2. Sin embargo
dichos macrófagos siempre activan un perfil de citoquinas típicamente
proinflamatorio típico de M1. Tras la infección de macrófagos por VACV
se activa la fosforilación de AKT y dicha fosforilación desaparece en los
macrófagos ISG15-/-. El tratamiento con inhibidores de dicha
fosforilación reestablece el fenotipo M2 a los macrófagos ISG15+/+
comportándose entonces de manera similar a los ISG15-/- lo que
sugiere que la polarización de los macrófagos se regula por fosforilación
de AKT de manera ISG15 dependiente.
En conclusión, nuestros resultados demuestran la polarización dinámica
de los macrófagos inducidos por VACV y sugieren que ISG15 modula la
polarización a M1 / M2. Estos datos indican cómo las modificaciones
posttraduccionales, controlan procesos con gran importancia
biomédica, como infecciones virales y los procesos inflamatorios
asociados a menudo con ellos.
MODIFICACIONES EN LA CELULA HOSPEDADORA DURANTE LA SALIDA
DE LOS ALFAVIRUS
MG Martinez1, EL Snapp2 3, GS Perumal4, FP Macaluso4, MC Kielian1
1
Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine, Bronx,
NY 10461, USA, Estados Unidos. 2 Department of Anatomy and
Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY 10461,
USA, Estados Unidos. 3 Gruss Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein
College of Medicine, Bronx, NY 10461, USA, Estados Unidos. 4 Analytical
Imaging Facility, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY 10461,
USA, Estados Unidos.
Dentro del género de los alfavirus se encuentran importantes especies
patógenas para humanos como el virus Chikungunya y los alfavirus
encefalíticos. Para la mayoría de estos virus no existen vacunas o
tratamientos antivirales. Los alfavirus son virus envueltos cuyo genoma
es ARN de polaridad positiva contenido en una nucleocápside interna
rodeada por una membrana lipídica derivada de la célula hospedadora
que contiene las glicoproteínas virales trans-membrana E2 y E1. Los
alfavirus brotan de la membrana plasmática (MP), pero se sabe muy
poco sobre el proceso y la dinámica de la salida de estos virus. Muchos
interrogantes sobre el proceso de salida de estos virus pueden ser
12
Libro de resúmenes
abordados para su estudio utilizando diferentes técnicas de
microscopía.
Con este objetivo construimos y caracterizamos distintas variantes del
alfavirus sindbis (SINV) cuyas glicoproteínas de membrana E2 se
encuentran fusionadas a distintas proteínas fluorescentes y las
utilizamos para caracterizar la salida del virus de la célula hospedadora
por microscopía, usando una combinación de microscopía del
fluorescencia de reflexión interna total, microscopía confocal y
microscopia de correlación de luz y electrónica (CLEM).
Estudios iniciales mostraron que durante la infección la glicoproteína E2
se acumula en parches en la MP y en extensiones similares a filopodios.
Ambas estructuras enriquecidas en E2 contienen todas las proteínas
estructurales de los alfavirus, colocalizan con estructuras de virus
brotando observadas por CLEM y están reducidas durante la infección
con un virus mutante que es deficiente en salida. Asimismo, la infección
viral induce una dramática reorganización del citoesqueleto de la célula
hospedadora: las fibras de estrés de actina se desarman, las adhesiones
focales y el centro de organización de microtúbulos se desorganizan. En
conjunto con estos re-arreglos del citoesqueleto, la infección viral
induce al menos dos tipos de extensiones, definidas en este trabajo en
base a su contenido de tubulina. Las extensiones que no contienen
tubulina son cortas, completamente ocupadas por partículas virales
observadas por CLEM y excluyen un marcador de membrana de
difusión libre. Esta exclusión es dependiente de la interacción de la
glicoproteína E2 con la proteína de cápside, la cual es crítica en el
proceso de salida de los alfavirus. El segundo tipo de extensiones
inducidas por la infección viral contienen tubulina y actina, son mas
largas, no tan numerosas, parecen mediar el transporte de partículas
de célula a célula y su número se encuentra reducido en células
infectadas con el virus mutante deficiente en salida.
Nuestros estudios respaldan un modelo en el cual la salida de los
alfavirus ocurre en sitios especializados de la MP e induce importantes
modificaciones del citoesqueleto. El mecanismo a través del cual la
infección viral señaliza e induce estos re-arreglos en la célula huésped
está siendo actualmente estudiado en nuestro laboratorio.
Miércoles 24 de junio
Sala A (Salón Pigalle - 2º piso)
09:45 – 11:15 hs. MESA REDONDA 3: BIOTECNOLOGÍA Y
VIROLOGÍA
Coordinadores:
Mariano Belaich. Departamento de Ciencia y Tecnología,
Universidad Nacional de Quilmes, Quilmes, Argentina.
Viviana Parreño. Instituto de Virología, Instituto Nacional de
Tecnología Agropecuaria (INTA), Castelar, Argentina.
génica es una modalidad terapéutica muy atractiva para el cáncer que
puede emplearse sola o combinada con estrategias conocidas como
quimioterapia, radioterapia y/o inmunoterapia. Los vectores
adenovirales han sido empleados extensamente en el ámbito clínico
demostrando que son vectores seguros, inclusive tras su administración
sistémica. El campo que ha tenido mayor desarrollo es el de los
adenovirus replicativos selectivos (virus oncoliticos) y, en particular,
aquellos que expresan genes inmunoestimuladores (por ej. GM-CSF).
Sin embargo, la terapia génica con adenovirus se enfrenta con muchas
dificultades tanto a nivel preclínico (falta de modelos experimentales
adecuados) como clínico (dificultades de tipo regulatorias). La
posibilidad de combinar la terapia génica adenoviral con
quimio/radioterapia no solo permite disminuir la toxicidad de estas
terapias sino que también pueden actuar de manera sinérgica para la
obtención de respuestas antitumorales. Es razonable pensar que la
terapia génica con vectores oncolíticos pueda tener un lugar en un
enfoque terapéutico multimodal para el cáncer.
VECTORES VIRALES PARA SALMONIDOS
M Cortez-San Martín
Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Biotecnología Acuícola
(CBA), Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile,
Chile.
En las últimas décadas la salmonicultura se ha desarrollado hasta
convertirse en una de las principales industrias de producción animal.
Noruega y Chile encabezan la producción seguido de países como
Escocia, Irlanda, Reino Unido, Dinamarca, Canadá y Australia. A pesar
de los grandes avances logrados en optimizar la producción, hoy en día
la industria se ve amenazada por los constantes brotes infecciosos y por
la emergencia de agentes patógenos desconocidos. Lo anterior se suma
al desconocimiento de la respuesta inmune y la ineficacia de los
tratamientos convencionales aplicados a los peces, agravando la
situación que hoy en día se vive a nivel mundial en este rubro. La gran
mayoría de avances biotecnológicos logrados hasta la fecha se basan en
la experiencia obtenida en estudio de patologías en humanos o
mamíferos siendo difíciles de aplicar a las condiciones de cultivo de
salmónidos que incluyen bajas temperaturas y elevada susceptibilidad
al estrés de los peces. El objetivo de este estudio fue desarrollar un
novedoso vector viral para salmónidos basado en la utilización de la
genética reversa del virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV) que
nuestro grupo implementó recientemente.
La modificación genética realizada al virus ISA, permitió la
incorporación en el genoma viral de la secuencia que codifica para la
proteína VP2 del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV). Los
análisis mostraron que el virus ISA recombinante conduce la expresión
de la proteína VP2 en células ASK, logrando así la producción en células
de salmón de la proteína mas inmunogénica y mas importante
estructuralmente del virus IPNV. Estos resultados sugieren el virus ISA
para ser utilizado en salmonicultura como vector viral, de la misma
forma que en mamíferos se utilizan sistemas adenovirales o lentivirales.
Panelistas:
Guillermo Mazzolini. Laboratorio de Terapia Génica, Facultad de
Ciencias Biomédicas, Universidad Austral, Buenos Aires, Argentina.
Marcelo Cortez‐San Martín. Centro de Biotecnología Acuícola,
Universidad de Santiago de Chile, Santiago, Chile.
Lorena Garaicoechea. Instituto de Virología, INTA, Castelar,
Argentina.
TERAPIA GÉNICA CON ADENOVIRUS PARA EL TRATAMIENTO DEL
CÁNCER
GD Mazzolini
Laboratorio de Terapia Génica. Facultad de Ciencias Biomédicas,
Universidad Austral, Argentina.
A pesar de los avances que se vienen realizando en la terapia contra el
cáncer como por ejemplo con el empleo de anticuerpos monoclonales
inmunoestimuladores o con terapias moleculares dirigidas, para
muchos tumores sigue siendo un desafío alcanzar respuestas clínicas
objetivas y/o incrementar la sobrevida de los pacientes. La terapia
NANOANTICUERPOS VHH CONTRA VIRUS
ROTAVIRUS Y NOROVIRUS
L Garaicoechea
Instituto de Virología, INTA, Castelar, Argentina.
GASTROENTÉRICOS:
En el año 1989 se descubrió que las llamas poseen anticuerpos que
carecen de las cadenas livianas y fueron denominados por ello
anticuerpos de cadena pesada; la porción variable de estos anticuerpos
está formada por una sola cadena polipeptídica, se llama VHH y puede
clonarse y expresarse como un fragmento monoclonal recombinante
que constituye el dominio natural más pequeño (15kDa o ~140
aminoácidos) capaz de reconocer un antígeno. Para producir
anticuerpos VHH específicos, la estrategia más utilizada ha consistido
en inmunizar una llama, luego a partir de los linfocitos circulantes
amplificar la porción variable de los anticuerpos de cadena pesada,
generar entonces una biblioteca que incluya todos los genes VHH
amplificados y por último seleccionar los VHH deseados utilizando la
tecnología de display en fagos. Los VHH son moléculas versátiles que
pueden expresarse en distintas plataformas biotecnológicas; se han
13
Libro de resúmenes
expresado VHH en E coli, levaduras, cloroplastos de tabaco, en el
sistema de expresión de baculovirus, lactobacilos y en plantas de arroz.
En el año 2008 se reportó la existencia de VHH específicos para
Rotavirus, virus causante de diarrea en niños. Estos VHH fueron los
primeros anticuerpos anti-VP6 de Rotavirus capaces de neutralizar in
vitro la infección de cepas virales con diferentes genotipos de VP7, VP4
y VP6. Por otra parte, se ha observado que la administración oral
preventiva de dichos clones previenieron la ocurrencia de diarrea en
cerdos gnotobióticos y disminuyeron el porcentaje de ratones con
diarrea y la excreción viral en el modelo de ratón lactante infectado con
RVA. Estas moléculas anti VP6 poseen la capacidad de desarmar las
partículas doble cápside de RVA y podría estar relacionada
indirectamente con la propiedad neutralizante de las moléculas. Estos
VHH también son ideales para desarrollar un método diagnóstico ya
que se encuentran dirigidos a la proteína VP6, que es la mayoritaria en
el virión y la más inmunogénica.
Por su parte, en el año 2012 se desarrollaron nanoanticuerpos VHH
específicos para Norovirus, otro patógeno viral gastroentérico. Se logró
obtener un panel de 30 anticuerpos VHH: específicos para los
genogrupos I y II y un VHH con actividad cruzada para ambos
genogrupos de Norovirus que podría utilizarse en el desarrollo de un
método diagnóstico. Algunos de los VHH lograron bloquear la unión de
las VLPs a antígenos de grupo histo-sanguíneo (HBGA), por lo que
podrían neutralizar la infección viral ya que se postula que los
Norovirus se unen a carbohidratos HBGA en etapas tempranas de la
infección. Además, recientemente se ha reportado un VHH antiNorovirus capaz de agregar y desestabilizar la estructura de la VLP. Esta
propiedad de desarmar cápsides virales fue observada en un VHH anti
Norovirus así como también en los VHH anti VP6 de Rotavirus y le
otorga a estas pequeñas moléculas propiedades promisorias para el
desarrollo de terapias antivirales contra estos patógenos.
11:45 – 13:15 hs. MESA REDONDA 4: ASPECTOS
INMUNOLÓGICOS Y MECANISMOS DE EVASIÓN A LA
RESPUESTA INMUNE DEL HOSPEDADOR
Coordinadores:
Ana Ceballos. INBIRS, UBA‐CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos
Aires, Argentina.
Alejandra Capozzo. Instituto de Virología, INTA, Castelar,
Argentina.
Panelistas:
Frank Rösl. Instituto Alemán de Investigación sobre Cáncer (DKFZ),
Heidelberg, Alemania.
Gabriela Turk. INBIRS, UBA‐CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos
Aires, Argentina.
Lourdes Arruvito. Instituto de Inmunología, Genética y
Metabolismo, Hospital de Clínicas "José de San Martín", UBA,
Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
HUMAN PAPILLOMAVIRUS INFECTION AND EVASION MECHANISMS
OF INNATE RESPONSE
B Rincon Orozco, M Niebler, F Rösl
German Cancer Research Center, Research Program Infection & Cancer,
Alemania.
Our research is aimed at understanding how infection with oncogenic
viruses modulates the immune system that critically contributes to
neoplastic development and progress. Pathogen-induced inflammation
represents highly interconnected processes within a cellular network.
The modulation of inflammatory processes in HPV-associated
malignancies is complex since it involves responses capable of allowing
viral persistence inducing progression of associated neoplastic lesions
due to modulation of the tumor microenvironment. The activation of
the innate defense represents the first response of the immune system
against HPV infection and is essential to initiate a specific and effective
long-lasting adaptive immunity. Here we have unraveled some
pathways of immune escape during HPV carcinogenesis, showing how
the virus circumvent the innate immune response of its host: this can
be mediated by counteracting interferons type I expression such as the
keratinocytes specific interferon kappa (IFN-κ) or by degrading IL-1β via
the proteasome, thereby knocking-out one key player in the activation
of both innate and adaptive immunity. In my present talk, I will discuss
different strategies how HPV can reprogram its target cell to warrant a
persistent infection, a prerequisite on the way towards cervical cancer.
RESPUESTA INMUNE ESPECÍFICA EN LA INFECCIÓN AGUDA POR HIV‐1
Y SU ASOCIACIÓN CON PROGRESIÓN A LA ENFERMEDAD.
G Turk
Instituto Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA INBIRS,
Argentina.
La respuesta T CD8+ juega un rol central en el control de la replicación
del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Sin embargo aún sigue
siendo clave la identificación y compresión de los correlatos inmunes
de protección que mejor correlacionan con el control viral. En este
sentido, la etapa aguda de la infección representa un escenario propicio
para dichos estudios. El objetivo de este trabajo fue analizar la
especificidad, funcionalidad y el fenotipo de la respuesta T CD8+ en una
cohorte de individuos recientemente infectados y su asociación con el
control de la replicación viral y de la progresión a la enfermedad. Los
resultados indicaron que, a pesar que Nef dominó la respuesta anti-HIV
durante la infección aguda/temprana, la aparición temprana de una
alta proporción de células T anti-Gag se correlacionó con una menor
progresión. Las células T CD8+ HIV-específicas polifuncionales fueron
detectadas a tiempos tempranos post-infección pero no se asociaron
con control viral. Por el contrario, se observó que los sujetos que
presentaban células T CD8+ con una mayor capacidad de mediar
actividad antiviral (VIA) en la muestra basal, presentaron set points
inmunes más elevados. Además, los niveles de VIA se correlacionaron
con la magnitud de la respuesta T CD8+ anti-Gag. A su vez, las células T
CD8+ Gag-específicas mostraron una mayor capacidad de mediar la lisis
de células infectadas (mayor capacidad de degranulación) y de
producir, de manera simultánea, INF-γ lo cual les conferiría una ventaja
para ejercer su actividad antiviral. Por otro lado, se observó que la
distribución de las subpoblaciones de memoria de las células T CD8+,
tanto totales como de las HIV-específicas, se encuentra sesgada en los
individuos recientemente infectados, pero no alcanza los niveles
dramáticos observados en los sujetos Crónicos. El análisis de la
expresión de PD-1, tanto en las células T CD8+ totales como HIVespecíficas, reveló no sólo una asociación con progresión a la
enfermedad si no también con el perfil de memoria de la población
celular T CD8+. Notablemente, se obtuvieron correlaciones directas
entre los niveles de VIA y la proporción de células T CD8+ con fenotipo
terminal, tanto en la muestra basal como a los 12 meses post-infección.
En consecuencia, se estableció una relación entre la preservación de la
ruta de diferenciación de las células T CD8+ y la funcionalidad de las
mismas. El poder descifrar la relación que existe entre las
características que definen a las células T CD8+ con los niveles de
activación inmune, el control viral y la progresión a la enfermedad en
los distintos estadíos de la infección es primordial para profundizar en
el conocimiento que se tiene de la inmunopatogénesis del virus.
Además, esta información es de suma importancia para el desarrollo de
nuevas estrategias terapéuticas frente al HIV así como en el diseño y
posterior testeo de vacunas que promuevan una respuesta beneficiosa.
CÉLULAS T REGULATORIAS EN LA INFECCIÓN PEDIÁTRICA POR VIRUS
SINCICIAL RESPIRATORIO
L Arruvito
Instituto de Inmunología, Genética y Metabolismo (INIGEM). UBACONICET. Hospital de Clínicas “José de San Martín”, Buenos Aires,
Argentina.
El virus respiratorio sincicial (VSR) es la causa más importante de
bronquiolitis infantil y un patógeno respiratorio frecuente en ancianos
e inmunodeprimidos. El 49-70% de los niños hospitalizados debido a
infección por VSR son niños menores de seis meses, indicando que la
edad muy temprana representa el factor de riesgo más importante
para el desarrollo de infección severa. Una pregunta central, relativa a
la infección pediátrica por VSR, refiere a los motivos por los cuales
14
Libro de resúmenes
mientras que la mayoría de los niños que padecen infección por VSR
sufren una enfermedad leve, del 2 al 5% de ellos padecen un cuadro
severo. ¿Cuáles son las causas que explican este comportamiento
disímil? Un segundo interrogante guarda relación con el manejo clínico
de los niños infectados: ¿qué marcadores biológicos permitirían
predecir el curso clínico de la infección? La resolución de estos dos
interrogantes afronta un principal escollo: es muy poco lo que
conocemos respecto de la etiopatogenia de la infección por VSR. La
mayoría de las observaciones han sido realizadas en modelos murinos,
que no reflejan adecuadamente el curso de la infección pediátrica por
VSR. Sin embargo, existe consenso en un punto: la respuesta inmune
contribuye, no solo a la resolución de la infección, sino también a la
inducción del daño en la vía aérea inferior.
Estudios realizados en modelos murinos han indicado que las células T
regulatorias FOXP3+ (Tregs) juegan un papel protector en el curso de la
infección, al prevenir efectos deletéreos mediados por la respuesta
inmune sobre la vía aérea inferior. Observaciones realizadas
recientemente por nuestro grupo han revelado que la infección severa
por VSR en niños menores de 1 año se asocia a una notoria depleción
de células Tregs en sangre periférica. En relación a esta observación,
cabe destacar dos aspectos. En primer lugar, la magnitud de la
depleción: los niños que requirieron internación hospitalaria mostraron
niveles de depleción mayores al 80%. Por otra parte, es interesante
destacar observaciones realizadas en otros estudios, indicando que la
infección aguda por el virus influenza A o el virus del dengue, en
individuos adultos, no se asocia a depleción periférica de células Tregs,
por el contrario, se asocia a una incrementada frecuencia de las
mismas. Estas observaciones contrastantes podrían explicarse ya sea
por un comportamiento singular de las células Tregs en el curso de la
infección por VSR, o bien por propiedades particulares de las células
Tregs en el transcurso de los primeros meses de vida.
Nuestras observaciones plantean, centralmente, dos nuevos
interrogantes. a) ¿cuáles son los mecanismos subyacentes a la
depleción de células Tregs en el transcurso de la infección pediátrica
por VSR? y b) ¿podría resultar un parámetro predictivo de utilidad la
determinación del nivel de células Tregs en sangre periférica? En la
actualidad estamos abocados a responder a estos dos interrogantes.
Jueves 25 de junio
Sala A (Salón Pigalle - 2º piso)
09:45 – 11:15 hs. MESA REDONDA 5: MECANISMOS DE
PATOGENIA
PATOGENIA DE LA INFECCIÓN CRÓNICA POR EL VIRUS DE HEPATITIS C
P Valva
Laboratorio de Biología Molecular, División Patología, Hospital de Niños
Ricardo Gutiérrez, Argentina.
La infección por HCV es una de las principales causas de enfermedad
hepática crónica caracterizada por daño celular, inflamación y fibrosis
que puede progresar a cirrosis y/o hepatocarcinoma. Hasta el
momento no se han definido claramente los mecanismos moleculares
involucrados en el daño hepático, pero tanto las reacciones mediadas
por el sistema inmunitario como el efecto directo del virus participan
en la patogénesis. Se postula que HCV gobierna la lesión hepática
mediante la regulación de la apoptosis, la esteatogénesis, la activación
de las células estrelladas hepáticas (CE) y la respuesta citotóxica.
Se ha demostrado que la respuesta inmunitaria no efectiva durante la
infección aguda es la principal causa del desarrollo de hepatitis crónica.
El microambiente inmunitario hepático está compuesto por diversos
tipos celulares (células de Kupffer, células dendríticas, NK, NKT y LTgd)
que serían importantes en la patogenia. En la infección crónica los
componentes tanto de la inmunidad innata como de la inmunidad
adaptativa son refractarios a la activación y adquieren nuevas funciones
que serían responsables del daño. Entre las posibles causas de la falla
en la respuesta inmunitaria adecuada se han propuesto: 1) la presencia
de mutantes de escape de HCV; 2) la falla en la presentación antigénica;
3) el efecto inmunosupresor de ciertas proteínas virales, 4) los defectos
en la maduración de los LT; 5) la supresión de la respuesta por linfocitos
T reguladores; y 6) el ambiente hepático tolerogénico.
La evolución natural de la infección cuando el virus se adquiere en
etapas tempranas de la vida y su progresión a largo plazo es aún tema
de debate. La severidad de la enfermedad hepática varía ampliamente
tanto en niños como en adultos; sin embargo, desde el punto de vista
histológico, la infección crónica por HCV sería más leve en niños.
Nuestros estudios sobre la patogenia de la infección crónica en niños y
adultos mostraron, mediante la cuantificación de hepatocitos
infectados, células en apoptosis y del infiltrado, que el virus, la
apoptosis y la respuesta inmunitaria están implicados en la patogenia
de la infección crónica por HCV. Sin embargo, existen diferencias
sustanciales entre los grupos respecto del papel que cada uno de los
componentes tiene en el escenario final. En niños el HCV no tendría un
efecto directo sobre los parámetros histológicos, sino que participaría
del daño hepático a través de la inducción de la apoptosis, que a su vez
contribuiría al desarrollo de la fibrosis. En cambio en adultos el
predominio de hepatocitos no infectados en apoptosis, sumado a la
asociación de ésta el infiltrado inflamatorio y la severidad de la
hepatitis podría indicar que la apoptosis no está directamente
relacionada con el virus sino que sería consecuencia de la respuesta
local generada por el sistema inmunitario ante la infección viral.
Coordinadores:
Paola Chabay. Laboratorio de Biología Molecular, División
Patología, Hospital de Niños “Ricardo Gutiérrez”, Ciudad Autónoma
de Buenos Aires, Argentina.
Ricardo Gómez. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular,
CONICET, Universidad Nacional de La Plata (UNLP), La Plata,
Argentina.
Panelistas:
Pamela Valva. Laboratorio de Biología Molecular, División
Patología, Hospital de Niños “Ricardo Gutiérrez”, Ciudad Autónoma
de Buenos Aires, Argentina.
Soledad Negrotto. Instituto de Medicina Experimental ‐ CONICET ‐
Academia Nacional de Medicina, Ciudad Autónoma de Buenos
Aires, Argentina.
Daniela Gardiol. Instituto de Biología Molecular y Celular de
Rosario, CONICET, Universidad Nacional de Rosario, Rosario,
Argentina.
ROL DE LAS PLAQUETAS EN LA PATOGÉNESIS DE LAS INFECCIONES
VIRALES
S Negrotto, M Schattner
Laboratorio de Trombosis Experimental. Instituto de Medicina
Experimental-CONICET-Academia Nacional de Medicina, Buenos Aires,
Argentina.
Las plaquetas son elementos claves en la hemostasia y la trombosis. Sin
embargo numerosas evidencias básicas y clínicas han demostrado que
también participan en el desarrollo y resolución de la respuesta
inflamatoria, en la inmunidad innata y en la defensa del huésped contra
patógenos.
La interacción entre virus y plaquetas se comenzó a estudiar hace más
de cincuenta años con el fin dilucidar los mecanismos asociados a la
disminución en el recuento plaquetario (trombocitopenia) inducido por
infecciones virales. Hoy sabemos que los mecanismos involucrados en
la trombocitopenia mediada por virus son varios incluyendo
destrucción plaquetaria inmunológica, activación y consumo
inapropiado o alteración de la megacariopoyesis. Si bien la
trombocitopenia es una complicación frecuente en varias infecciones
virales, aún no está esclarecido si este mecanismo es una estrategia
viral para evadir el sistema inmune o si es un mecanismo gatillado para
proteger al hospedador.
Los virus pueden unirse a receptores específicos de las plaqueta
produciendo alteraciones tanto en la plaqueta como en el agresor. La
interacción virus-plaquetas generalmente dispara la activación
15
Libro de resúmenes
plaquetaria y esto no solo incrementa el clearence plaquetario sino que
además colabora con la eliminación de partículas virales. Por otro lado,
durante la activación plaquetaria tiene lugar la liberación del contenido
granular y esto constituye un mecanismo de defensa ya que dichos
gránulos poseen una gran variedad de moléculas incluyendo
kinocidinas y proteínas antimicrobianas importantes para la defensa del
hospedador. Por último, la interacción plaqueta-virus promueve la
interacción con los leucocitos e induce la maduración y aumento de su
función. Sin embargo, además de estos efectos beneficiosos, las
plaquetas también pueden tener efectos deletéreos en la patogénesis
de ciertas infecciones virales. Por ejemplo, los virus pueden ser
internalizados por las plaquetas resultando en una protección contra el
sistema inmune favoreciendo la diseminación viral. Además, la
liberación de quemoquinas por parte de los gránulos alfa plaquetarios
puede facilitar la atracción de células blanco para la infección viral.
En conclusión, las plaquetas y las moléculas que liberan desde sus
gránulos pueden tener tanto efectos beneficiosos como deletéreos
sobre el hospedador convirtiendo a las plaquetas en un arma de doble
filo durante las infecciones virales. Sin embargo, aún se necesitan más
estudios para comprender la relevancia fisiopatológica de las plaquetas
en las infecciones virales para, de este modo, predecir el efecto de las
plaquetas y su posible inhibición en el transcurso de una infección viral.
MECANISMOS CONSERVADOS DE PATOGÉNESIS VIRAL: ROL DE LOS
MOTIVOS DE INTERACCIÓN PROTEICA PDZ.
D Gardiol1, M Bugnon Valdano1, F Marziali1, G Barbieri1, F Facciuto1, E
Boccardo2, AL Cavatorta1
1
Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario-CONICET, Facultad
de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de
Rosario, Argentina, Argentina. 2 Lab. Oncovirología, ICB, Ubuversidad de
San Pablo, San Pablo, Brasil, Brasil.
Los dominios PDZ (PSD95, DLG1, ZO-1) son módulos de interacción
proteica muy abundantes, que reconocen secuencias específicas de sus
partners, denominadas sitios de unión a PDZ. Dichos dominios están
presentes en proteínas que regulan la polaridad celular, las uniones
intercelulares y los mecanismos de transmisión de señales. Proteínas
derivadas de diferentes virus pueden interaccionar e interferir con la
función de proteínas PDZ, resultando en alteraciones funcionales
importantes en diversos procesos infecciosos. Así, emerge un
importante tema para el entendimiento de la patogénesis viral.
En nuestro grupo nos hemos focalizado, en primer lugar, en el estudio
de los mecanismos de oncogénesis asociados a infecciones por el virus
papiloma humano (VPH), y desde el punto de vista de la disrupción de
la polaridad. Esto último teniendo en cuenta que las oncoproteínas E6
de VPH de alto riesgo interaccionan con proteínas PDZ involucradas en
los complejos que mantienen la polaridad apicobasal. Así, hemos
identificado algunos de estos blancos celulares, como la proteína de
uniones adherentes Discs large (DLG1) y la proteína de uniones
oclusivas Partitioning defective 3 (PAR3). A través del uso de distintas
herramientas metodológicas, como el cultivo celular tradicional,
cultivos histotípicos y cultivos organotípicos tipo raft, pudimos
entender las consecuencias de dichas interacciones, E6-proteína PDZ,
en cuanto a la interferencia con la polaridad celular y los mecanismos
de transducción de señales. Dado que la pérdida de la polaridad celular
es una característica de los mecanismos carcinogénicos, los datos
obtenidos han contribuido al conocimiento de los procesos de
progresión maligna en general, y en particular aquellos asociados a
VPH. Estamos extendiendo estos estudios a proteínas derivadas de
otros virus tumorales, como el virus linfotrópico de células T humanas
tipo 1, así como a proteínas de virus de interés regional que no se
asocian a procesos cancerígenos, y que presentan la capacidad de
interaccionar con proteínas celulares que poseen dominios PDZ.
El entendimiento de la importancia de la presencia de un sitio de
interacción a proteínas PDZ en distintas proteínas virales, sus
interacciones específicas, y su participación en mecanismos comunes
de los procesos de patogénesis viral, podría servir de base para el
desarrollo de nuevas herramientas diagnósticas y terapéuticas.
11:45 – 13:15 hs. MESA REDONDA 6: VIROLOGÍA AMBIENTAL
Y ALIMENTARIA
Coordinadores:
Célia Barardi. Laboratorio de Virología Aplicada, Departamento de
Microbiología, Inmunología y Parasitología, Centro de Ciencias
Biológicas, Universidad Federal de Santa Catarina, Florianópolis,
Brasil.
Viviana Mbayed. Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y
Bioquímica, UBA, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Panelistas:
Célia Barardi. Laboratorio de Virología Aplicada, Departamento de
Microbiología, Inmunología y Parasitología, Centro de Ciencias
Biológicas, Universidad Federal de Santa Catarina, Florianópolis,
Brasil.
Andrea Quiberoni. Instituto de Lactología Industrial ‐ INLAIN
(Universidad Nacional del Litoral‐CONICET), Santa Fe, Argentina.
Rodney Colina. Laboratorio de Virología Molecular, Regional Norte,
Universidad de la República, Salto, Uruguay.
ADENOVIRUS SURVIVAL IN WATER MATRICES AND OYSTERS
G Fongaro, LA Totaro Garcia, M Rangel Pilotto, V Moresco, CR Monte
Barardi
Laboratório de Virologia Aplicada, Departamento de Microbiologia,
Imunologia e Parasitologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade
Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, Brasil.
Among the viral pathogens that contaminate aquatic matrices, the
adenoviruses are considered one of the most resistant and prevalent.
The present study aimed to evaluate the adenovirus behavior, in the
following matrices: surface freshwater, seawater, reuse water and
oysters. I) Surface Water: thermal and temporal stability of human
adenovirus-2 (HAdV-2) was studied regarding sample storage
conditions. The stability was evaluated over 230 days by cell-culture
integrated with RT-qPCR (ICC-RT-qPCR). It was found that the viral
stability decreased with increasing temperatures (-80>-20>4>22°C). The
time required to reach one log reduction in viral titers (T90) was similar
among all the storage temperatures. As conclusion, the temperature
plays a key role in viral stability indicating that, under laboratory
storage conditions, surface freshwater samples should be kept at 4°C
and at -80°C for short and long-term periods, respectively. II) Seawater:
Human recombinant adenovirus (rAdV-GFP) expressing Green
Fluorescent Protein (GFP) was used as model to study adenovirus
disinfection in seawater inside mollusks depuration tanks with and
without UV light by fluorescence microscopy. As result, rAdV-GFP
declined 99.99% after 24h and 48h with and without UV treatment
respectively, showing that the depuration tanks were effective to
inactivate adenoviruses in seawater and the UV disinfection treatment
accelerated the process. III) Oysters: The stability and depuration of
(HAdV-2) was evaluated in oysters Crassostrea gigas using plaque
assay. The viral depuration rate was measured during up to 120h using
depuration tanks supplied or not with UV light as disinfection tool.
After 24h of depuration with UV and 48h without UV, no infectious
viruses were detected. The depuration tanks were effective to
inactivate HAdV-2 and UV disinfection speeds the depuration. IV)
Reuse water: Adenovirus (human and animal) settling and survival
profile was evaluated in swine effluent from aerobic reactor (AR) and
settling tank (ST) for reuse water purposes. The experiment was
conducted in real-scale (porcine adenovirus (PAdV) as model) by qPCR
methods and in laboratory-scale (HAdV-2 as model) by ICC-RT-qPCR. In
real-scale the PAdV removal was efficient after ST application, reducing
99.9% (3log10). In laboratory-scale HAdV-2 settling in ST was positively
correlated with the solid particles settling (r² = 0.995 p<0.05), requiring
1.8 h to settle 90% (r²= 0.87). HAdV-2 post settling was evaluated in
sludge from process and not presented decay trend up to 120 h.
Adenovirus was removed in ST and was up taken to the sludge,
surviving for longer periods. In general the data warn of the need of
surveillance and implementation of efficient methods for removing
16
Libro de resúmenes
enteric viruses from water and foods matrices and suggest the use of
adenovirus as viral biomarker.
LOS BACTERIOFAGOS EN LA INDUSTRIA FERMENTATIVA DE
ALIMENTOS: AMIGOS Y ENEMIGOS
A Quiberoni
Instituto de Lactología Industrial (INLAIN, UNL-CONICET), Facultad de
Ingeniería Química, Santiago del Estero 2829, 3000 Santa Fe, Argentina.
E-mail: [email protected], Argentina.
Desde que fueron descubiertos en el año 1915, y gracias a su
versatilidad, los bacteriofagos se han convertido en una herramienta
muy apreciada para una gran diversidad de campos de investigación.
Como predadores naturales de bacterias patógenas y benéficas,
desempeñan el rol de ‘amigos’ o ‘enemigos’, respectivamente. Durante
los primeros años, fueron utilizados como alternativa para paliar las
persistentes infecciones bacterianas que diezmaban las poblaciones
mundiales. Una veintena de años más tarde, surgen como los enemigos
de las bacterias lácticas que se usan en la industria para la elaboración
de productos lácteos fermentados. Desafortunadamente, las fagos no
pueden erradicarse de los ambientes lácteos y, debido a esta ubicuidad,
los esfuerzos de tecnólogos y científicos se resignan y dirigen a su
control en lugar de su eliminación. Durante los años ’80, y gracias a la
vertiginosa evolución de la biología molecular, los fagos de bacterias
lácticas se convierten en la herramienta que permitió diseñar una
extraordinaria variedad de cultivos lácticos fagorresistentes. Sin
embargo, y debido a las fuertes restricciones reglamentarias que aún
rigen en el mundo, estas bacterias ‘ingenierizadas’ no fueron más allá
de las fabulosas colecciones de cultivos de los más famosos centros de
investigación mundiales. A comienzos del siglo XXI, y con el notable
auge de las bacterias probióticas, surgen los primeros casos de
infecciones fágicas sobre estos valiosísimos cultivos que no tienen
reemplazantes. Aún hoy, estos episodios constituyen un enorme
detrimento económico para la industria láctea, que por el momento no
cuenta con ninguna alternativa tecnológica que le permita hacer frente
a los ataques fágicos. Actualmente, y debido a la preocupante
antibiótico-multirresistencia demostrada por numerosas bacterias
patógenas, resurge el potencial de los fagos como alternativa natural
para hacerles frente. Es así que, durante los últimos años se han
multiplicado las investigaciones dirigidas a optimizar el empleo de los
fagos para el biocontrol de bacterias patógenas durante el
procesamiento/manipulación
de
alimentos,
y
para
la
prevención/tratamiento de ciertas infecciones. Finalmente, y como
herramienta que recién comienza a ser explorada, el estudio de los
CRISPRs (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ya
cuenta con resultados aplicados en la industria fermentativa de
alimentos: cultivos lácticos fagorresistentes diseñados ‘a medida’, a
través de la inducción natural de inmunidad de las bacterias, cuando
éstas se enfrentan a los fagos. Hoy se sabe que los bacteriofagos
constituyen el grupo de entidades biológicas más abundantes sobre el
planeta, superando en un orden de magnitud a las bacterias. Por esta
razón, constituyen un ‘pool’ de agentes biológicos con una
potencialidad inimaginable e inexplorada que ha contribuido, desde los
inicios de la vida, a regular naturalmente las poblaciones bacterianas.
serio riesgo de salud a nivel global. El objetivo de éste estudio fue
determinar la diversidad genética de Rotavirus A (RVA), Norovirus
Genogrupos I y II (NoV GI/GII), y Astrovirus Humanos (HAstV), en
muestras de aguas residuales de seis ciudades del litoral oeste y
noreste del Uruguay, limítrofes con Argentina y Brasil. Se colectaron
116 muestras (marzo 2011/ abril de 2013): a) Litoral oeste, ciudades de
Bella Unión, Salto, Paysandú y Fray Bentos (n=96), colectadas
quincenalmente (marzo 2011/ febrero 2012); b) Región Noreste,
ciudades de Melo y Treinta y Tres (n=20), colectadas cada dos meses
(setiembre 2011/ abril 2013). La concentración viral se realizó mediante
el método de ultracentrifugación. La extracción del ARN viral, mediante
el sistema comercial Qiagen Viral RNA®, y la síntesis del ADN copia (RT)
con la enzima SuperScript II Invitrogen ®. La reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) fueron las siguientes: a) NoV, semi-nested región
parcial de la cápside; b) HAstV, región ORF2; y c) RVA, semi-nested
multiplex genes VP4 y VP7 (WHO). Los productos de PCR fueron
secuenciados bi-direccionalmente y analizados (MEGA 6). Un total de
53% de las muestras fueron positivas para RVA (n = 61); los genotipos P
y/o G fueron determinados mediante análisis filogenético para el 61%
de las muestras positivas (n= 37) y fueron los siguientes: G1P[8] (n = 1),
G2P[4] (n = 4), G3P[8] (n = 1), G3P[3] (n = 1), G12P[8] (n = 1), G1P[X] (n
= 1), G2P[X] (n = 10), G3P[X] (n = 3), G12P[X] (n = 1), GXP[3] (n = 1) y
GXP[8] (n = 13). Se observó marcada estacionalidad en invierno. NoV
fue detectado en todas las ciudades estudiadas: 72% (n=84). 9
pertenecieron a GI, 48 a GII y 27 fueron positivas para ambos
genogrupos. Es de destacar la elevada diversidad genética identificada:
GII.2 (n=13), GII.4 (n=13), GII.13 (n=4), GII.1 (n=3), GII.6 (n=3), GII.3
(n=1), GII.17 (n=1), GI.1 (n=5), GI.4 (n=5), GI.8 (n=4), GI.3 (n=1), GI.5
(n=1) y GI.6 (n=1). Se observó un completo re-emplazo de las variantes
GII.4 New Orleans (2009) por GII.4 Sydney (2012), en 2012. No fue
observada estacionalidad en la circulación de NoV. HAstV fue detectado
en 49 % (n=57) de las muestras y 75 % (n=43) fueron secuenciadas. 54
% (n=31) pertenecieron al genotipo 1 (linaje 1a); 19 % (n=11) al
genotipo 2 (9 al linaje 2d y 2 al linaje 2c) y 2% (n=1) al genotipo 5. El
linaje 1a circuló durante todo el período, el 2d en invierno y el 2c
solamente en la ciudad de Salto, dónde se observó la mayor diversidad
genética, debido a que es un sitio turístico con arribo de personas de
distintos países o regiones del Uruguay. Éste estudio, constituye el
primer reporte en Uruguay, que ha permitido establecer la diversidad
genética viral en aguas residuales que son vertidas a ríos de gran
importancia y que pueden generar un riesgo para las distintas
poblaciones que allí conviven.
16:30 – 18:00 hs. MESA REDONDA 7: ANTIVIRALES
Coordinadores:
Viviana Castilla. Laboratorio de Virología, Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales, UBA, Ciudad Autónoma de Buenos Aires,
Argentina.
Federico Di Lello, Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y
Bioquímica, UBA, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Panelistas:
DIVERSIDAD GENETICA DE VIRUS GASTROENTERICOS EN MUESTRAS
AMBIENTALES COLECTADAS EN REGIONES LIMITROFES Y TURISTICAS
DEL URUGUAY
R Colina1, M Victoria1, F López Tort1, A Lizasoain1, L Maya1, M Castells1,
M Miagostovich2, JP Leite2, J Cristina4, M Berois3
1
Laboratorio de Virología Molecular. Regional Norte – CENUR Noroeste,
Universidad de la República. Gral. Rivera 1350. Salto, 50000, Uruguay. 2
Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental. Instituto Oswaldo
Cruz. Fundação Oswaldo Cruz. Av. Brasil 4365, Rio de Janeiro, 21040360, Brasil. 3 Sección Virología, Facultad de Ciencias, Universidad de la
República, Iguá 4225, 11400, Montevideo, Uruguay. 4 Laboratorio de
Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de
Ciencias, Universidad de la República, Iguá 4225, 11400, Montevideo,
Uruguay.
Adrián Gadano. Servicio de Hepatología, Hospital Italiano de
Buenos Aires, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Lorena Itatí Ibañez. Instituto de Ciencia y Tecnología “Dr. César
Milstein”, CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Claudia S. Sepúlveda. Laboratorio de Virología, Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales, UBA IQUIBICEN, CONICET, Ciudad
Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
La transmisión de virus entéricos entre poblaciones humanas a través
de aguas superficiales contaminadas con aguas residuales constituye un
Todos los pacientes con hepatitis crónica por HCV, naïve de
tratamiento, no respondedores a un tratamiento previo, que quieran
NUEVAS ESTRATEGIAS ANTIVIRALES CONTRA EL VIRUS DE LA
HEPATITIS C
AC Gadano
Hospital Italiano de Buenos Aires, Argentina.
17
Libro de resúmenes
ser tratados y no tengan contraindicaciones, pueden ser considerados
candidatos a recibir tratamiento. El tratamiento debe considerarse de
alta prioridad en los pacientes con alto riesgo de complicaciones
severas: en los pacientes con fibrosis avanzada (F3–F4), en receptores
de un trasplante hepático, y en pacientes que presenten
complicaciones extrahepáticas graves asociadas al HCV. Pueden
también considerarse prioritario, y está justificado, el tratamiento en
los pacientes con fibrosis moderada (F2), coinfección con HBV o HIV o
que presenten otras hepatopatías asociadas.
Los pacientes infectados por HCV-2 y 3 deben recibir tratamiento con
Peg-interferón más ribavirina (PEG-IFN+RBV) durante 24 a 48 semanas
según la respuesta virológica durante el tratamiento. Este esquema se
asocia con una tasa de respuesta viral sostenida (RVS) que oscila entre
el 69% y el 80%. Los pacientes infectados por HCV-1 reciben
tratamiento con PEG-IFN+RBV combinado con los inhibidores de
proteasa (IP) de primera generación, boceprevir (BOC) o telaprevir
(TVR). Estos tratamientos con triple terapia se asocian con una tasa de
RVS del 65% al 75%, superior a la obtenida previamente con la terapia
doble (PEG-IFN+RBV) en pacientes infectados por HCV-1 que era del
40% al 50%. El problema de la terapia triple, es la mala tolerancia por
los múltiples efectos adversos que presentan estas drogas. La aparición
de nuevos tratamientos, más efectivos y mejor tolerados, hará que en
un futuro cercano estas drogas sean paulatinamente abandonadas.
En la actualidad múltiples drogas han sido aprobadas en Europa y EEUU
para el tratamiento combinado de la hepatitis C: Sofosbuvir, un
inhibidor análogo nucleotídico de la polimerasa; Simeprevir, inhibidor
de la proteasa NS3/4A; Daclatasvir, un inhibidor de NS5A; Ledipasvir,
un inhibidor de NS5A y por último la combinación de Ombitasvir
(inhibidor de NS5A), Paritaprevir (inhibidor de proteasa) combinado
con dosis fijas de ritonavir y Dasabuvir (inhibidor no nucleósido de la
polimerasa NS5B.
La utilización de estas drogas incrementará la tasa de RVS a niveles
superiores a 90 % con un excelente pefil de seguridad. Se espera que
estas drogas estén disponibles en nuestro país en un futuro próximo.
La decisión del esquema de tratamiento a elegir va a depender de 3
factores:
• Genotipo y subtipo del virus HCV del paciente
• Severidad de la enfermedad hepática
• Si es naïve o ha sido previamente tratado
• Si es intolerante o no elegible para IFN. Estas situaciones caracterizan
la no elegibilidad para IFN:
– Enfermedades autoinmunes
– Enfermedad hepática descompensada
– Hipersensibilidad a PEG IFN
– Trastorno psiquiátrico, pulmonar o cardíaco severos
– Retinopatías severas
– Post trasplante de riñón, corazón, pulmón
– Neutropenia (neutrófilos <1500 cels/mm3), trombocitopenia
(plaquetas <90.000 cels/mm3), y/o anemia (hemoglobina < 10 mg/dl).
NANOANTICUERPOS, MOLÉCULAS PROMISORIAS PARA LA DETECCIÓN
Y LA NEUTRALIZACIÓN DE VIRUS
LI Ibañez
Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein, Argentina.
El sistema inmune de los vertebrados genera millones de moléculas de
anticuerpos que responden de manera específica a diferentes
antígenos. La alta diversidad y selectividad de los anticuerpos hace que
estas moléculas constituyan excelentes herramientas para
investigación, diagnóstico y terapéutica. Hasta 1989, se creía que todos
los anticuerpos estaban conformados por dos cadenas pesadas y dos
cadenas livianas. Pero ese año se identificó un nuevo tipo de
anticuerpo en sueros de camélidos que carecían de cadenas livianas y
de un dominio constante de la cadena pesada. A partir de la región
variable de estos anticuerpos se pueden obtener Nanoanticuerpos
(NanoAcs), que hasta el momento han sido aplicados exitosamente
tanto para la neutralización de virus como VIH, HBV, Influenza, RSV,
Rabia, FMDV, Poliovirus, Rotavirus, entre otros; como para la detección
de vaccinia, virus de Marburgo y virus Tulip X de plantas.
Los NanoAcs, por su pequeño tamaño, tienden a reconocer epítopes
únicos, poco accesibles. Se pueden producir fácilmente en
microorganismos reduciendo notablemente los costos de producción,
son muy estables a temperatura ambiente, tienen alta solubilidad en
medios acuosos y pueden modificarse por ingeniería genética para
producir moléculas con mayor afinidad, especificidad y sensibilidad.
En la presente exposición se presentarán datos obtenidos del uso de
NanoAcs para la inhibición de la infección viral provocada por virus de
Influenza y Virus Sincicial Respiratorio (RSV) en modelos in vitro e in
vivo.
En el caso de influenza, se produjeron y caracterizaron NanoAcs contra
las proteínas Hemaglutinina (HA) y Neuraminisa (NA) obtenidas de un
virus subtipo H5N1. Se observó que in vitro los NanoAcs contra HA
pueden inhibir la infección viral aún a dosis muy bajas, del orden
picomolar. Su administración intranasal de manera profiláctica,
controló de manera efectiva la replicación del virus en los pulmones de
ratones y evitó la morbilidad y la mortalidad luego del desafío letal con
el virus. La terapia con NanoAcs después del desafío redujo
fuertemente la replicación viral y aumentó la sobrevida. Los NanoAcs
contra NA demostraron inhibir efectivamente la replicación viral en
sistemas in vitro. El tratamiento profiláctico in vivo protegió contra
desafío letal, incluso cuando se utilizó una cepa resistente a oseltamivir,
un antiviral de referencia.
En el caso de RSV, se generaron NanoAcs que pudieron neutralizar RSV
in vitro de manera más eficiente que palivizumab, un anticuerpo
monoclonal comercializado para el tratamiento de infecciones con este
virus. La administración intranasal de estas moléculas protegió contra la
infección por RSV y evitó la inflamación pulmonar. El tratamiento
terapéutico después de la infección viral redujo la replicación viral y la
inflamación pulmonar.
Por lo expuesto, los NanoAcs pueden considerarse moléculas
promisorias para la prevención y el tratamiento de infecciones
provocadas por diferentes virus.
LA INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS DEL RNA VIRAL CON AGENTES
DIRIGIDOS A ENZIMAS CELULARES COMO ESTRATEGIA ANTIVIRAL
CONTRA EL VIRUS JUNÍN
CS Sepúlveda
Laboratorio de Virología, IQUIBICEN (UBA-CONICET), FCEyN, UBA,
Argentina., Argentina.
En los últimos años, la creciente emergencia de infecciones virales
representa uno de los aspectos más notorios en el campo de la salud
humana y animal. Ante este panorama, el desarrollo de compuestos
antivirales efectivos para su uso en el ser humano es un tema que ha
adquirido gran preponderancia. Sin embargo, numerosas infecciones
humanas de relevancia sanitaria incluidas dentro de las llamadas
infecciones emergentes, como las fiebres hemorrágicas (FH), están
huérfanas de quimioterapia efectiva.
Arenaviridae es la familia que contiene el mayor número de virus que
causan FH. En nuestro país, el virus Junín (JUNV) es el agente causante
de la FH argentina en la región agrícola de la pampa húmeda. La terapia
actual contra las infecciones de arenavirus incluye el tratamiento con
ribavirina, y la administración pasiva de suero de convaleciente con alto
título de anticuerpos específicos, ambas terapias presentan varios
efectos colaterales adversos.
Como una alternativa al enfoque tradicional para el desarrollo de
agentes quimioterapéuticos, en los últimos años ha comenzado a surgir
con fuerza la idea de utilizar factores celulares que participan en la
infección viral como potenciales blancos antivirales. Las ventajas de
este abordaje se basan en la obtención de drogas de amplio espectro
antiviral así como la posibilidad de evitar la aparición de la resistencia
antiviral. En contraposición, esta estrategia antiviral puede resultar en
mayor citotoxicidad, pero permite el uso de drogas ya utilizadas con
otros fines terapéuticos de las que se conoce su perfil de seguridad. En
distintos procesos de la infección con arenavirus participan numerosos
componentes celulares que representan nuevos puntos posibles de
ataque para bloquear la infección viral. Por ello se decidió estudiar la
inhibición de la síntesis del ARN viral como blanco antiviral, utilizando
compuestos dirigidos a enzimas celulares que participan en este
proceso: la enzima celular inosina monofosfato deshidrogenasa
(IMPDH) involucrada en la síntesis de novo de nucleótidos de guanosina
y dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH), que participa en la ruta
biosintética de las pirimidinas.
El ácido micofenólico (MPA) y la teriflunomida fueron evaluados como
inhibidores de la IMPDH y DHODH respectivamente. Ambos
compuestos inhibieron la multiplicación de JUNV en forma dosis
18
Libro de resúmenes
dependiente. Estudios mecanísticos demostraron que la adición de los
compuestos a células infectadas entre 1-4 h después de la adsorción
del virus causó una fuerte inhibición de la producción de virus mientras
que el tratamiento en tiempos posteriores resultó en una disminución
del efecto antiviral dependiente del tiempo. Ambos compuestos no
resultaron virucidas ni lograron inactivar al virus por pre-tratamiento de
las células. La síntesis de RNA viral fue el blanco de ambos compuestos
en el ciclo viral. La infectividad viral pudo ser restituida en presencia de
exceso de los nucleósidos correspondientes.
Viernes 26 de junio
Sala A (Salón Pigalle - 2º piso)
09:45 – 11:15 hs. MESA REDONDA 8: VIRUS VEGETALES
Coordinadores:
Mariana del Vas. Instituto de Biotecnología, INTA, Castelar,
Argentina.
María Laura García. Instituto de Biotecnología y Biología
Molecular, UNLP‐CONICET, La Plata, Argentina.
Panelistas:
Sebastián Asurmendi. Instituto de Biotecnología, INTA, Castelar,
Argentina.
Eduardo José Peña. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular,
Facultad de Ciencias Exactas, UNLP‐CONICET, La Plata, Argentina.
Ana Julia Distéfano. Instituto de Biotecnología, INTA, Castelar,
Argentina.
UN NUEVO NIVEL DE REGULACIÓN MEDIADO POR SRNAS
ENDÓGENOS QUE SE PRODUCEN ANTE LA INFECCIÓN DE PLANTAS
POR TOBAMOVIRUS
D Zavallo, G Conti, C Manacorda, A Venturuzzi, S Asurmendi
Instituto de Biotecnología, CICVyA INTA. CONICET, Argentina.
Las infecciones virales inducen profundos cambios en el metabolismo
de la planta originados en una importante modificación del
transcriptoma. Esta alteración de la expresión involucra a un gran
número de genes, tanto de aquellos que intervienen en mecanismos de
defensa y contra defensa viral como otros no relacionados que tienen
efectos secundarios. Entender estas modificaciones de forma global
nos permite alcanzar un conocimiento profundo de la interacción virusplanta y de su impacto en la planta, es decir en la producción de los
síntomas que a su vez son la principal causa de las pérdidas económicas
en los cultivos. Los RNAs pequeños (sRNAs) son reguladores de la
expresión génica, contribuyen a la integración del control genético, ya
que cada uno de ellos puede afectar múltiples RNAs o loci de DNA por
lo que podrían jugar un papel importante en los cambios
transcriptómicos producidos durante la infección. En la actualidad se
conocen distintas clases de sRNAs y aunque varían en biogénesis,
secuencia y modo de acción, la mayoría median la regulación de la
expresión de genes a través del silenciamiento génico. En base a su
origen los sRNAS se pueden dividir en dos grandes grupos: los
derivados de precursores de simple cadena con una estructura de
horquilla, cuyos representantes principales son los microRNAs
(miRNAs) y los derivados de precursores de doble cadena (RNAs
aberrantes o DNA repetitivos), representados por los RNAs pequeños
interferentes y los sRNAs heterocromáticos. Se estudió el impacto de la
infección en la población de sRNAs endógenos en Arabidopsis
utilizando dos virus relacionados con severidad contrastante: ORMV
(síntomas severos) y TMV-CG (síntomas leves) utilizando NGS. El
análisis de nuestros resultados muestra que, además de producir los
cambios en los miRNAs ya descriptos, la infección viral impacta sobre
sRNAs derivados de transposones, promotores y mRNAs. Este impacto
se verificó en los perfiles de sRNAs incluso a 2dpi cuando aún no hay
acumulación de virus en el tejido muestreado. De manera interesante,
los sRNAs endógenos se acumularon diferencialmente entre plantas
infectadas con los virus contrastantes indicando un posible rol en la
sintomatología diferencial. Luego de identificar bioinformáticamente
los posibles genes blanco de los sRNAs que se acumulan
diferencialmente ante la infección, se seleccionaron algunos de ellos
que intervienen en procesos clave tales como la regulación de la
estabilidad del RNA, la degradación de proteínas y el estrés biótico y se
verificó por qPCR que sus niveles estaban alterados por la infección
evidenciado una correlación con los niveles de sRNAs. Aunque aún se
desconoce el origen y función de estos sRNAs, nuestros resultados nos
permiten proponer la existencia de una nueva capa de regulación
mediada por sRNAs (no solo por miRNAs) que modula la interacción
planta-virus y en particular juega un rol preponderante en la
producción de síntomas.
EVOLUCIÓN EXPERIMENTAL DEL VIRUS DEL MOSAICO DEL TABACO
REVELA UN ROL DE LA DINÁMICA DE MICROTÚBULOS EN EL
TRANSPORTE DE ARNS.
EJ Peña
Instituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM), CCT - La Plata CONICET, Fac. Cs. Exactas, U.N.L.P., La Plata, Argentina.
El citoesqueleto es una red interconectada de polímeros filamentosos y
proteínas regulatorias responsable de procesos biológicos
fundamentales como división, mantenimiento de la estructura,
señalización y destino celular. Observaciones in vivo indican que el
citoesqueleto de microtúbulos (MTs) está involucrado en la
diseminación del ARN del virus del mosaico del tabaco (TMV),
sugiriendo la existencia de un mecanismo gobernado por MTs en la
localización y transporte de ARNs en plantas. Para demostrar el rol de
los MTs en las interacciones de TMV con el hospedante y entonces en
la formación y transporte de complejos ribonucleoproteicos en el
citoplasma, hemos desafiado al virus con hospedantes de Arabidopsis
thaliana tor1 y tor2, mutantes afectados en la dinámica de MTs. Luego
de realizar pasajes seriados tanto en los mutantes como en la plata
salvaje, encontramos la acumulación de mutaciones en el genoma viral
y que estas mutaciones están asociadas con un aumento de la
infectividad y acumulación viral. Controles de infección en protoplastos
indican que estos cambios no son causados por un aumento en la tasa
de replicación, indicando una mayor eficiencia para diseminar la
infección en el entorno modificado. Los resultados resaltan la
importancia de la dinámica de la red de MTs en el ensamblaje y
diseminación de complejos ribonucleoproteicos en el citoplasma celular
y el valor de la evolución experimental para identificar interacciones
biológicas complejas en organismos multicelulares.
ESTUDIO DE POLEROVIRUS DE ALGODÓN MEDIANTE EL USO DE
CLONES INFECTIVOS
AJ Distéfano
Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA-Castelar. Buenos Aires,
Argentina.
El algodón es un cultivo clave para la región del NEA. La enfermedad de
origen viral más importante del algodón en Sudamérica es la
enfermedad azul (CBD); fue reportada en la Argentina en la campaña
agrícola 1982/83 y actualmente causa importantes pérdidas en el
cultivo. Es producida por el Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) el cual
es transmitido exclusivamente por el insecto vector Aphis gossypii. Los
síntomas de CBD son enanismo, enrollamiento de las hojas con
coloración verde oscura-azulada y amarillamiento de las nervaduras.
Nuestro grupo obtuvo la secuencia completa del virus presente en
Argentina, postulando que el CLRDV debe clasificarse como una nueva
especie del género Polerovirus, familia Luteoviridae. El CLRDV posee un
genoma de RNA de simple cadena (ssRNA) positivo de 5,866 kb, está
limitado a las células acompañantes del floema de su planta huésped y
es transmitido por el áfido vector, no siendo posible su transmisión en
forma mecánica a nuevas plantas de algodón. En las campañas
algodoneras del 2009 al 2014 se detectó en la pcia. de Chaco una
virosis similar a CBD en cultivares de algodón resistentes a CLRDV,
produciendo el primer quiebre de resistencia del germoplasma. Los
síntomas se caracterizaron por enrollamiento de las hojas y
deformaciones foliares en la zona apical con aspecto "arrosetado".
Nuestro grupo secuenció el genoma completo del virus y determinó
19
Libro de resúmenes
que las proteínas codificadas por el mismo tienen una identidad de
secuencia entre el 88% y 98% con las proteínas del CLRDV. Este virus
constituye una variante virulenta del CLRDV, a la que denominamos
Cotton leafroll bushy virus (CLRBV), y produce la enfermedad azul
atípica. Para la caracterización de estos virus hemos desarrollado una
nueva estrategia de infección mediante la obtención de un clon
infectivo
de
cDNA
del
CLRDV
e
inoculación
vía
agroinfección, independizándose de la transmisión por el áfido. El clon
infectivo logró establecer la infección en plantas de algodón
susceptibles, que desarrollaron los síntomas típicos de CBD, como así
también en plantas modelo como Nicotiana benthamiana y Arabidopsis
thaliana. El sistema está siendo utilizado en el programa de
mejoramiento genético del algodón para la evaluación de plantas
resistentes al CLRDV y para el estudio de la interacción planta-virus.
Con el objetivo de estudiar cuál/es de las proteínas del CLRBV son las
responsables de la virulencia y del cambio de sintomatología,
realizamos construcciones de reemplazo de las proteínas candidatas en
el clon infectivo de la variedad CLRDV y evaluamos la infección y los
síntomas en variedades de algodón resistentes y susceptibles a CBD. El
reemplazo de la proteína de movimiento (MP) del clon infectivo del
CLRDV por la MP del CLRBV no logró quebrar la resistencia y no se
observaron diferencias en la sintomatología en las variedades
susceptibles. En consecuencia, los cambios encontrados en la MP del
CLRBV no serían los responsables por sí solos de la virulencia.
11:45 – 13:15 hs. MESA REDONDA 9: VIRUS EMERGENTES
co-circulación de diversos sub-tipos. Sin embargo en este sentido, la
información referente a la historia evolutiva y demográfica de HEV-3 en
las poblaciones humanas en el mundo, y particularmente en
Sudamérica, es muy escasa, y han sido muy pocos los intentos que han
buscado reconstruirla.
En este trabajo se pretende investigar la dinámica poblaciónal y la
historia evolutiva de HEV-3 a nivel global y particularmente se plantean
como objetivos caracterizar la emergencia de HEV en Sudamérica
identificando el origen genético y geográfico de las cepas de HEV-3
introducidas en esta región y estimar su patrón de diseminación
espacio-temporal. A su vez, aqui se indaga en la relación entre la
inferencia poblacional y las estrategias de muestreo actualmente
utilizadas.
Con este fin, se aplicó un enfoque Bayesiano basado en coalescencia a
un set de secuencias de HEV-3 con fecha y lugar de aislamiento
documentada abarcando un período de 18 años.
El análisis filogenético mostró que la diversidad genética global de HEV3 puede ser agrupada en dos clados, con un tMRCA datado en
aproximadamente 340 años, y que al menos tres introducciones
independientes del HEV-3 han ocurrido en Sudamérica. Por su parte, el
análisis bayesiano sugirió que todas las cepas Uruguayas, detectadas
entre 2010 y 2011, formaron hace unos 100 años un único clado con un
linaje europeo, y compartieron, a su vez, un ancestro común muy
reciente calculado entre 2004 y 2009. La inferencia filodinámica, por su
parte, evidenció que el tamaño poblacional de HEV habría sufrido
drásticas variaciones a partir de la segunda mitad del siglo XX. En este
sentido, y contrariamente a lo postulado en estudios previos,
proponemos que la población efectiva global de HEV-3 no está
disminuyendo, sino aumentando.
Coordinadores:
Alejandro Castello. Laboratorio de Inmunología y Virología,
Universidad Nacional de Quilmes (UNQ), Quilmes, Argentina.
Mario Lozano. LIGBCM‐AVEZ. Departamento de Ciencia y
Tecnología, UNQ, Quilmes, Argentina.
Panelistas:
Santiago Mirazo. Sección Virología, Facultad de Ciencias,
Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
Marize Pereira Miagostovich. Laboratório de Virologia Comparada
e Ambiental, Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz, Rio de Janeiro,
Brazil.
Luis Adrián Díaz. Laboratorio de arbovirus y arenavirus, Instituto
de Virología "Dr. J. M. Vanella", Facultad de Ciencias Médicas,
Universidad Nacional de Córdoba (UNC), Argentina.
HEPATITIS E EN REGIONES NO ENDÉMICAS: DE LA EMERGENCIA HACIA
UN NUEVO ORDEN.
S Mirazo1, D Mir2, G Bello2, N Ramos1, J Arbiza1
1
Sección Virología. Facultad de Ciencias. UdelaR., Uruguay. 2
Laboratorio de AIDS e Inmunología molecular. FIOCRUZ. Rio de Janeiro,
Brasil.
El virus Hepatitis E (HEV) es el agente causal de la hepatitis E aguda;
una infección de significativa morbi-mortalidad considerada endémica
en diversos países subdesarrollados en Africa y Asia. En la última
década se ha producido una emergencia de la infección en diversas
regiones desarrolladas y no endémicas, evidenciada con un constante
crecimiento en el registro de casos esporádicos de hepatitis E
adquiridos localmente en esas zonas. La infección por HEV presenta dos
claros perfiles epidemiológicos distintivos que definen regiones de bajo
y alto endemismo. El virus se trasmite principalmente por vía fecal-oral,
aunque diversas líneas de investigación han aportado profusa evidencia
que permite afirmar que la hepatitis E es, de hecho, una zoonosis,
siendo los cerdos y jabalíes los principales reservorios de HEV. Las
secuencias de HEV han sido clasificadas en 4 genotipos (1-4), cada uno
de los cuales está a su vez dividido en subtipos. Sin embargo, esta
clasificación ha sido recientemente puesta en discusión. La
epidemiología molecular de HEV en Sudamérica es muy compleja; no
existen regiones endémicas y es el genotipo 3 (HEV-3) el más
prevalente en humanos y cerdos, habiéndose demostrado además la
AGENTES DE DIARREA VIRAL DE IMPORTANCIA EN LA ERA POSTVACUNA ANTI ROTAVIRUS
MP Miagostovich, TM Fumian, MS Rocha, JM Fioretti, JA Silva, MP
Xavier, S Portes, R Assis, A Fialho, E Volotao, JPG Leite
Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental. Instituto Oswaldo
Cruz/Fiocruz. Rio de Janeiro, Brasil.
De acuerdo con La Organización Mundial de La Salud (OMS),
considerando únicamente las enfermedades diarreicas agudas
frecuentemente asociadas al consumo de agua o alimentos
contaminados, cerca de dos millones de niños menores de cinco años
de edad mueren anualmente en los países subdesarrollados. Los
rotavírus de la especie A (RVA) son los principales virus causantes de
gastroenteritis aguda (GA) en niños. Luego de la implementación de la
vacuna contra RVA en diversos países, otros virus, específicamente los
Norovirus (NoV), han sido detectados como importantes agentes
responsables por la etiología de las GA de vehiculización hídrica y
alimentar. Además de los RVA y los NoV, otros virus considerados
emergentes como los nuevos Astrovirus (MLB1), Bocavirus, Aichivirus,
Klassevirus y Sapovirus han sido asociados a casos de diarrea. Debido al
impacto actual de los NoVs en los casos esporádicos y brotes de GA en
el mundo, los estudios que involucran el desarrollo de una vacuna
contra NoVs ya se encuentran en fase II y III. Los NoV pertenecen al
género Norovirus dentro de la familia Caliciviridae y son genéticamente
clasificados en seis genogrupos (GI-GVI), siendo GI, GII y GIV los únicos
descriptos capaces de infectar humanos. Los NoV GII son los
mundialmente prevalentes, mientras que GI es detectado en baja
frecuencia y comúnmente asociado a casos asintomáticos. Los NoV GIV
son raramente detectados, relatados mayoritariamente en muestras
ambientales. Hasta el presente fueron descriptos nueve genotipos de
GI, 22 de GII y dos de GIV. El genotipo de NoV más frecuente es el GII.4,
involucrado en la mayoría de los brotes vinculados a esta enfermedad.
La capacidad evolutiva de los NoV, resultado de recombinaciones
homólogas y mutaciones puntuales, principalmente en la región
hipervariable P2, resulta en la emergencia de nuevas variantes de NoV
GII.4, responsables por el suceso de la dispersión de este virus y la
ocurrencia de brotes y epidemias de GA en el mundo. Cada 2-4 años
nuevas variantes de GII.4 emergen, substituyendo la variante anterior y
proporcionando al virus un mecanismo de escape del sistema inmune
de la población. En Brasil, datos epidemiológicos de prevalencia de los
NoV demuestran la importancia de estos virus en brotes y casos
esporádicos de GA, con reportes de amplia diversidad genética e
inclusive de la circulación de cinco variantes de GII.4 en un periodo de
20
Libro de resúmenes
ocho años. Recombinantes intergenotipos GII.7/GII.20 de NoVs
también fueron descriptos en el país. La detección y caracterización
molecular de otros virus emergentes mencionados anteriormente, así
como la primera descripción del astrovirus recientemente descripto
(MLB-1) en el estado de Rio de Janeiro apunta a la necesidad de realizar
una vigilancia laboratorial activa para determinar los diferentes agentes
etiológicos de las GA, y caracterizar los genotipos de RVA que circulan
en la era post-vacuna.
Financiamiento: IOC, CNPq, Faperj
FACTORES PROMOTORES DE LA REEMERGENCIA DE VIRUS DE LA
ENCEFALITIS DE ST. LOUIS EN EL CENTRO DE ARGENTINA
LA Diaz
Laboratorio de Arbovirus. Instituto de Virología "Dr. J. M. Vanella" //
IIByT - CONICET UNC., Argentina.
El virus St. Louis encephalitis (SLEV) es agente causal de encefalitis en el
continente americano. Asociado a epidemias sólo en los EEUU, su
comportamiento ecoepidemiológico cambió a inicios del 2000 cuando
se observó su reemergencia como patógeno neurológico humano en
Argentina y Brasil. En nuestro país, el SLEV ha provocado brotes
epidémicos de encefalitis en Córdoba (2005, 2010), Paraná (2006),
Buenos Aires (2010) y San Juan (2011). El SLEV es mantenido en la
naturaleza a través de una red de interacciones entre mosquitos
vectores del género Culex y hospedadores aviares paseriformes y
columbiformes, las cuales pueden modificarse en diferentes contextos
ambientales y geográficos. De comportamiento generalista, en la región
de Córdoba el SLEV es mantenido por mosquitos Culex
quinquefasciatus y Culex interfor y Palomas Torcazas (Zenaida
auriculata) y Torcacitas (Columbina picuí). Potencialmente, otras
especies de aves (gorriones -Passer domesticus-, hornero -Furnarius
ruffus-, benteveo -Pitangus sulphuratus-) y de mosquitos (Cx.
saltanensis, Oc. scapularis) podrían aportar al flujo viral. Entre eneromayo de 2005 una epidemia de encefalitis en humanos se registró en
Córdoba provocando 47 casos y 9 muertes. Durante el brote se aislaron
cepas del genotipo III relacionadas con cepas enzoóticas aisladas en
Santa Fe en el año 1979. Los estudios ecoepidemiológicos tendientes a
estudiar las causas de esta epidemia permitieron detectar factores que
promovieron la reemergencia del SLEV en Córdoba capital.
Los estudios retrospectivos de caracterización molecular de cepas
circulantes indicarían la introducción de cepas pertenecientes a un
nuevo genotipo no detectado antes del brote. Estudios de
caracterización biológica en aves y roedores demuestran que esta cepa
genera mayores viremias en aves (pollitos, gorriones y palomas
torcazas) y posee mayor virulencia en ratones albinos que otras cepas
circulantes en Córdoba. Estas características permiten una mayor
replicación viral, mayor transmisión y mayor probabilidad de infectar y
enfermar a humanos. Por otro lado, el estudio de la dinámica
poblacional y composición de las comunidades de mosquitos vectores
permitieron detectar un marcado aumento de las poblaciones de
mosquitos vectores Culex quinquefasciatus y Cx. interfor años previos al
brote y una dominación por estas especies de las comunidades de
mosquitos. Si bien no ha sido cuantificado, en el transcurrir de los años,
las comunidades de aves urbanas han ido cambiando hacia un
desplazamiento de poblaciones de gorriones por poblaciones de
Paloma torcaza, hospedador amplificador del SLEV. Nuestros estudios
indican que los factores promotores de la reemergencia del SLEV en la
región central de Argentina incluyen factores biológicos, virológicos y
ambientales promoviendo el incremento de las poblaciones de vectores
y hospedadores y la introducción de una cepa con mayor capacidad
virémica y patogénica.
21
Libro de resúmenes
IV Simposio de Virología Clínica
Conferencias plenarias y mesas redondas
Martes 23 de junio
Sala B (Salón Dorée - 1º piso)
10:30 – 12:00 hs. MESA REDONDA SC1: IMPACTO DE LAS
NUEVAS TECNOLOGÍAS EN LOS ALGORITMOS DIAGNÓSTICOS
Coordinadores:
María Alejandra Picconi. Servicio de Virus Oncogénicos, Instituto
Nacional de Enfermedades Infecciosas-Administración Nacional de
Laboratorios e Institutos de Salud (INEI‐ANLIS) “Dr. Carlos G.
Malbrán”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Adriana Giri. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario,
CONICET, Universidad Nacional de Rosario, Rosario, Argentina.
mujeres testeadas en el GC (Risk Ratio 4,02, 95%CI 3,44-4,71). Las tasas
de detección CIN2+ fueron 1,15% (29/2519) y 1,29% (9/698) en mujeres
con autotoma y con test convencional respectivamente, diferencia no
estadísticamente significativa. Los casos de CIN2+ por 1000 mujeres
participantes fueron 10,2 (31/3049) y 2,4 (7/2964) en el GI y el GC
respectivamente (p=0,0002).
Interpretación: la autotoma del test de VPH ofrecida por los AS es
altamente efectiva para aumentar rápidamente la participación en el
tamizaje para la detección de las lesiones precursoras del cáncer.
Financiamiento: Instituto Nacional del Cáncer (Argentina).
FRENTE AL NUEVO ESCENARIO DE LA EPIDEMIA HIV/SIDA: EL NUEVO
ALGORITMO DIAGNÓSTICO
H Salomón
Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA, CONICET,
Buenos Aires, Argentina.
Panelistas:
Silvina Arrossi. Programa Nacional de Prevención del Cáncer
Cérvico Uterino. Instituto Nacional del Cáncer, Ciudad Autónoma de
Buenos Aires, Argentina.
Horacio Salomón. INBIRS, UBA‐CONICET, Ciudad Autónoma de
Buenos Aires, Argentina.
Jorge González. Servicio de Hepatitis Virales, INEI‐ANLIS “Dr. Carlos
G. Malbrán”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
EFECTIVIDAD DE LA AUTOTOMA DEL TEST DE HPV OFRECIDO POR
AGENTES SANITARIOS DURANTE VISITAS DOMICILIARIAS PARA
AUMENTAR EL TAMIZAJE (ESTUDIO EMA): UN ESTUDIO
ALEATORIZADO POR CLUSTERS
S Arrossi1 4, L Thouyaret1, R Herrero2, A Campanera3, A Magdaleno3, M
Cuberli1, P Barletta1, R Laudi1, L Orellana1
1
Programa Nacional de Prevención del Cáncer Cérvico-uterino, Instituto
Nacional del Cáncer, Ministerio de Salud de la Nación, Argentina. 2
International Agency for Research on Cancer, 150 Cours Albert Thomas,
Lyon (69372), Francia. 3 Ministerio de Salud de la Provincia de Jujuy,
Argentina. 4 Centro de Estudios de Estado y Sociedad, CONICET, Buenos
Aires, Argentina.
Introducción: El alcance de altos niveles de cobertura del tamizaje es
uno de los principales desafíos de los programas de prevención de
cáncer cervicouterino. Este estudio se propone evaluar el efecto en la
participación en el tamizaje de la autotoma del test de VPH ofrecida por
agentes sanitarios.
Metodología: se realizó un estudio aleatorizado por clusters en la
provincia de Jujuy, Argentina. Los clusters fueron los agentes sanitarios
(AS) evaluados con buena performance que se desempeñaban en el
sistema público de salud de Jujuy en julio del año 2012. Se
randomizaron 200 AS y fueron asignados 1:1 a dos grupos: a) ofrecer
durante las visitas domiciliarias la autotoma del test de VPH (grupo de
intervención -GI- ) o b) promocionar un test convencional, es decir el
test realizado por un profesional en el centro de salud (grupo control GC-). Las mujeres elegibles tenían ≥30 años, y vivían en un hogar
visitado por un AS seleccionado. El outcome principal fue la
participación en el tamizaje, definida a nivel individual: proporción de
mujeres con un test de VPH seis meses después de la visita del AS. Los
outcomes secundarios incluyeron la tasa de detección de los CIN2+. Se
reportan los casos de CIN2+ por 1000 mujeres. El estudio está
registrado en ClinicalTrials.gov (NCT02095561).
Resultados: 94 y 97 AS en el GI y en el GC respectivamente reclutaron a
6013 mujeres. En el GI 2618/3049 (85,9%) mujeres se realizaron la
autotoma o un test convencional, comparado con 599/2964 (20,2%)
Para fines de 2013, 33,2 millones de personas [33,2 millones–37,2
millones] vivían con el HIV en todo el mundo. Las nuevas infecciones en
2013 se estimaron en 2,1 millones [1,9 millones–2,4 millones], lo que
significó un 38% menos que en 2001. El número de muertes
relacionadas con el sida sigue bajando, con 1,5 millones [1,4 millones–
1,7 millones] de personas que mueren por causas relacionadas con el
sida en 2013, un 35% por debajo del punto máximo en 2005. El
tratamiento puede prolongar radicalmente la esperanza de vida de las
personas que viven con el HIV y prevenir con eficacia la transmisión del
virus. Las infecciones por el HIV podrían no desaparecer en el futuro
inmediato, pero la epidemia de sida puede llegar a su fin en su carácter
de amenaza mundial contra la salud. Para lograr esto para el año 2030,
será necesario reducir el número de nuevas infecciones y muertes
relacionadas con el sida un 90%, en comparación con el año 2010. Por
primera vez existe un consenso mundial para lograr que el 90% de las
personas que viven con el HIV conozcan su estado serológico positivo,
que el 90% de las que lo conocen reciban tratamiento y que el 90% de
quienes se encuentran en tratamiento para el HIV logren la supresión
de la carga viral. Los objetivos 90–90–90 son aplicables a los niños y
adultos, hombres y mujeres, pobres y ricos, de todas las poblaciones —
mientras es preciso alcanzar niveles incluso más altos entre las mujeres
embarazadas. Si el mundo debe poner fin a la epidemia de sida para el
año 2030, debemos realizar unos importantes avances en los próximos
5 años. Si la respuesta es demasiado lenta, la epidemia de sida
continuará creciendo, con grandes pérdidas humanas y económicas por
una creciente demanda de terapia antirretroviral y un aumento de los
costos de prevención y tratamiento. Los modelos encomendados por
ONUSIDA confirman este resultado. Los tres objetivos principales de
este nuevo escenario son llamados o denominados 90-90-90 para el
2020: El primero de ellos es que las personas que viven con el HIV
conozcan su estado serológico, para lograr este objetivo se ha
planteado la necesidad de abordar nuevos algoritmos de diagnóstico en
los cuales se incorporan herramientas como los test rápidos, la carga
viral y recuento de células CD4 a fin de definir el diagnóstico de
infección por HIV.
HEPATITIS C: EL LABORATORIO EN LA ERA DE LOS ANTIVIRALES DE
ACCIÓN DIRECTA.
JE Gonzalez
Lab. Nacional de Referencia para Hepatitis virales. INEI ANLIS "Dr C. G.
Malbrán", Argentina.
La hepatitis C representa un problema mundial de salud pública y se
calcula que alrededor de 170 millones de individuos están infectados en
todo el mundo. A pesar de no presentar síntomas la historia natural de
la infección llevará a la cirrosis con o sin desarrollo de hepatocarcinoma
22
Libro de resúmenes
y muerte. Las alternativas terapéuticas incluyen el tratamiento con
inmunomoduladores y antivirales o como alternativa final el trasplante
hepático.
El laboratorio es una herramienta clave en su diagnóstico dado que la
mayoría de las infecciones son asintomáticas y/o subclínicas, para
muchos especialistas se trata de una “epidemia silenciosa”. La
detección de anticuerpos específicos de clase IgG es el primer marcador
a estudiar en una sospecha de infección. La detección de anticuerpos
IgM es muy poco utilizada dado su bajo título e inespecificidad en este
contexto clínico ya que el estudio y/o sospecha rara vez es agudo.
Frente a un resultado positivo de antiHCV IgG es necesario confirmarlo,
mas aún si es un hallazgo que no se condice con la clínica. Aunque
existen ensayos suplementarios de serología con péptidos linearizados
(LIA), en la práctica cotidiana directamente se confirma la infección
detectando la viremia a través de una técnica de Biología molecular
(BM). La detección de antígeno Core del virus solo o en combo con
anticuerpos permite cerrar la ventana serológica. Inclusive su
cuantificación se propone para algunos lugares donde la BM no está
disponible aunque su sensibilidad es mucho menor.
Dada la variabilidad genética que el virus presenta la determinación del
genotipo es muy útil no solo para estudios epidemiológicos sino que
además determina la duración y el tipo de tratamiento en la
enfermedad crónica.
En el tratamiento de la enfermedad crónica, el laboratorio cumple un
rol crucial dado que determina la eficacia y eficiencia del mismo. La
evolución del tratamiento, ha permitido desde los noventa hasta la
fecha pasar de menos del 15% de respuesta con el uso de Interferón
(IFN), a más del 95% gracias al uso de antivirales de acción directa
(ADD). La accesibilidad de los pacientes al tratamiento, que incluye no
solo la prescripción, implementación y seguimiento sino también y más
importante aún, el costo del mismo, es un problema mayúsculo e
irresuelto.
En los últimos años el tratamiento estándar con IFN Peguilado y
ribavirina tenia éxito en un número aceptable de pacientes pero con
bastantes efectos adversos, la incorporación de AAD de primera
generación mejoró la respuesta pero no los efectos adversos. Esto
finalmente parecería estar superado con el tratamiento con ADDs de
última generación que elimina el uso de IFN. Esto esta en continua
evolución. El monitoreo de todos estos regímenes fue acompañado
desde la BM mejorando la sensibilidad y el rango dinámico de
cuantificación, así últimamente con el uso de PCR en tiempo real es
posible no solo monitorear la respuesta sino también la eliminación del
virus que significa la cura de la enfermedad crónica.
Sala B (Salón Dorée - 1º piso)
15:45 – 16:30 hs. CONFERENCIA SC1
Mauricio Caballero. Fundación Infant, Ciudad Autónoma de Buenos
Aires, Argentina.
BRONQUIOLITIS: DEL LABORATORIO AL PACIENTE
M Caballero
Fundación Infant, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
El virus sincicial respiratorio (VSR), responsable de la bronquiolitis, es la
principal causa de hospitalización y muerte en lactantes en la Argentina.
Si bien varios factores epidemiológicos han sido asociados con
presentaciones severas de dicha infección, las variables que determinan
que dos chicos viviendo en condiciones similares tengan cursos clínicos
completamente opuestos son aun poco claras.
En este contexto, estudiamos polimorfismos en genes seleccionados en
base a su interés fisiopatológico para definir roles en la susceptibilidad
contra VSR. Nuestros hallazgos identificaron al receptor de patrón Tolllike receptor 4 (TLR4) como un componente esencial en la severidad de
la bronquiolitis. El efecto de TLR4 en los lactantes es modificado por las
concentraciones de lipopolisacárido bacteriano (LPS) en el
medioambiente de los niños. Es así que un niño que presenta un
polimorfismo en posición 299 del TLR4 (10% de la población) y ha
nacido en aéreas de clase media en Argentina con baja exposición a LPS
tiene ocho veces mas chances de desarrollar VSR severo que los niños
que carecen del polimorfismo en el mismo grupo social. Esta
susceptibilidad exagerada a la infección se asocia a un déficit de
producción de interferón-gama y un exceso de producción de
interleuquina-4 en el tracto respiratorio y abre nuevas posibilidades de
abordaje terapéutico contra un problema que hoy carece de
tratamiento efectivo.
16:30 – 18:00 hs. MESA REDONDA SC2: VIRUS RESPIRATORIOS
Coordinadores:
Elsa Baumeister. Departamento de Virología, INEI‐ANLIS “Dr. Carlos
G. Malbrán”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Guadalupe Carballal. Unidad de Virología, CEMIC, Ciudad
Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Panelistas:
Adriana Kajon. Infectious Disease Program, Lovelace Respiratory
Research Institute, Albuquerque, EE.UU.
Andrea Pontoriero. Departamento de Virología, INEI‐ANLIS “Dr.
Carlos G. Malbrán”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Marcela Echavarría. Unidad de Virología, CEMIC, Ciudad Autónoma
de Buenos Aires, Argentina.
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE INFECCIONES RESPIRATORIAS POR
ADENOVIRUS: EL VALOR DE ESTUDIOS LONGITUDINALES Y
CARACTERIZACION GENOMICA DETALLADA DE AISLAMIENTOS
CLINICOS
AE Kajon
Lovelace Respiratory Research Institute, Albuquerque, New Mexico,
Estados Unidos.
Hasta el día de hoy se han descripto 51 serotipos de adenovirus
humanos (HAdV) los cuales han sido clasificados en 6 especies, HAdV-A
– HAdV-F. La creciente utilización de secuencias genómicas y análisis
filogenético en la caracterización de aislamientos clínicos ha resultado
en la reciente definición de más de 20 nuevos “genotipos” de HAdV
designados con numerous consecutivos, 52, 53, etc. y en la creación de
una nueva especie, HAdV-G para acomodar la clasificación de HAdV52.
Desde los años 1970s, el uso de enzimas de restricción para la
caracterización genómica de adenovirus ha permitido visualizar
variabilidad genética intraserotípica y eventos de potencial relevancia
epidemiológica tales como el reemplazo de variantes genomicas o la
emergencia de nuevas variantes. El analisis de perfiles de restriccion
(electroforeticos a partir de DNA vira purificado, o virtuales generados a
partir de secuencias genómicas) es un recurso analitico sumamente
valioso para la rápida discriminación de variantes y la comparación de
cepas de virus de diverso origen geográfico o temporal.
En la practica, la amplificación y secuenciación de las regiones
hipervariables del gen del hexón es la estrategia adoptada para la
rápida identificación de adenovirus directamente en la muestra clinica o
en aislamientos. La tipificación molecular de genes de hexon y fibra han
reemplazado a la serología (neutralización e inhibición de la
hemaglutinación) en la identificación virus recombinantes intertípicos
los cuales, por lo general, presentan reactividades antigénicas
intermedias reaccionando con 2 o más antisueros de referencia.
En la presentación, y a modo de ejemplo de aplicación de las
mencionadas estrategias de caracterización de aislamientos clínicos de
adenovirus, se discutirán los resultados de estudios colaborativos
incluyendo la caracterización de cepas de HAdV7 aisladas
recientiemente de casos de infeccion respiratoria aguda severa, la
caracterización de cepas de HAdV21 aisladas en los Estados Unidos a lo
largo de 37 años de muestreo, la caracterización de cepas de HAdV4
aisladas de reclutas militares no vacunados durate los 15 años de
interrupción de protocolos de vacunación, y ejemplos de identificacion
y descripcion de nuevos “genotipos” de HAdV-D.
23
Libro de resúmenes
VIGILANCIA DE LA SUSCEPTIBILIDAD DE LAS CEPAS DE INFLUENZA A
CIRCULANTES A LOS ANTIVIRALES DISPONIBLES MEDIANTE LA
DETECCIÓN DE CAMBIOS GENOTÍPICOS DESCRIPTOS ARGENTINA
PERÍODO 2011-2014.
A Pontoriero
Centro Nacional de Influenza OPS/OMS, Laboratorio Nacional de
Referencia de Influenza y otros virus respiratorios, Servicio Virosis
Respiratorias, Departamento Virología, Instituto Nacional de
Enfermedades Infecciosas, ANLIS Malbrán, Buenos Aires, Argentina.
Introducción: Aunque las vacunas son el mejor medio de protección, los
antivirales constituyen una modalidad importante para el control de
estas infecciones. Las principales sustituciones aminoacídicas en la
neuraminidasa viral (NA) que confieren resistencia a los inhibidores de
la NA (INA) en cepas A(H1N1)pdm09 y A(H3N2) son H275Y y E119V,
respectivamente. En la actualidad la susceptibilidad de los virus
influenza a los antivirales se determina mediante estudios genotípicos
y/o fenotípicos.
Objetivos: Describir la situación de la resistencia a antivirales de las
cepas circulantes de influenza A en nuestro país y aportar información
para la recomendación del uso de estas drogas en nuestra población.
Correlacionar las características genotípicas de las cepas resistentes
identificadas localmente con cepas descriptas previamente.
Metodología: Las muestras analizadas correspondieron a pacientes
pediátricos y adultos, internados y ambulatorios con infección
respiratoria aguda baja con diagnóstico de influenza A enviadas al
Laboratorio Nacional de Referencia (LNR) por los integrantes de la Red
Nacional de Laboratorios en el período 2011-2014. Se implementaron
dos técnicas de rtRT-PCR que permiten detectar la presencia de los
cambios H275Y y E119V en cepas influenza A(H1N1)pdm09 y A(H3N2),
respectivamente. Se estudiaron mediante rtRT-PCR 2.062 muestras
A(H1N1)pdm09 para la detección del cambio H275Y: 79 en 2011, 660 en
2012, 1315 en 2013 y 8 en 2014. Además, en el 2014, se estudiaron 864
muestras A(H3N2) para la detección del cambio E119V. Se llevó a cabo
el intento de aislamiento viral en cultivos celulares y la secuenciación de
los segmentos hemaglutinina (HA) y NA viral y se construyeron árboles
de filogenia para comparar cepas resistentes detectadas en Argentina
con otras ya descriptas.
Resultados: Durante el período de estudio, la Red llevó a cabo el
diagnóstico de 275.251 muestras y 12.323 fueron positivas (4.5%). El
LNR recibió 6.434 muestras con diagnóstico de virus influenza A.
Mediante el ensayo de susceptibilidad a antivirales por rtRT-PCR se
detectó el cambio H275Y en 21 (1%) virus A(H1N1)pdm09: 2 aislados en
2011, 1 en 2012, 17 en 2.013 y 1 en 2014, la mayoría de ellos habían
sido recolectados de pacientes de sexo femenino (52%) que no habían
recibido terapia antiviral (86%). Con respecto a las cepas A(H3N2), se
detectó el cambio E119V en un único virus (0.1%) en una muestra
proveniente de una paciente inmunosuprimida que había recibido
tratamiento antiviral. El árbol de la HA viral demostró que este virus
pertenecía al grupo 3C.3 que nuclea cepas con cambios nucleotídicos
que difieren de la componente vacunal A/Texas/50/2012 (H3N2).
Conclusiones: El ensayo de susceptibilidad a oseltamivir demostró que
la prevalencia de cepas resistentes en Argentina es baja (1% para
A(H1N1)pdm09 y 0.1% para A(H3N2)), prevalencias que apoyan la
recomendación del uso de los INA en nuestro medio.
RINOVIRUS: EL NUEVO IMPACTO DE UN ANTIGUO VIRUS
M Echavarría
Unidad y Laboratorio de Virología, CEMIC, Argentina.
Los rinovirus humanos fueron descriptos en los años ´50 como los
principales agentes causales del resfrío común. Sin embargo, en los
últimos años, se los ha detectado también en cuadros de infección
respiratoria baja, en exacerbaciones de asma y de enfermedad
pulmonar obstructiva crónica. En algunos casos, las infecciones
respiratorias bajas pueden ser graves y requerir internación. Los
rinovirus pertenecen a la familia Picornaviridae, género Enterovirus y se
dividen en tres especies: A, B y C. Dada la multiplicidad de genotipos y
serotipos es difícil el diseño de vacunas. El promedio de infecciones
anuales oscila entre 2 y 5 veces al año en adultos y hasta 12 veces al año
en niños. El diagnóstico se realiza principalmente por métodos
moleculares ya que no existen anticuerpos monoclonales para realizar
una diagnóstico rápido. Si bien inicialmente se realizaba aislamiento en
cultivo, no se emplea habitualmente y además, los genotipos de la
especie C ( última descripta) no crecen en cultivo.
En un estudio en realización en nuestra institución en 1.000 niños
menores de 6 años con infección respiratoria aguda, detectamos
rinovirus en el 40 % de los casos.
El 55% presentó bronquiolitis, 13% neumonia y el 72% de los casos
requirió oxígenoterapia. La presencia de rinovirus fue un factor de
riesgo de internación (OR: 2.47). Los rinovirus circularon durante todo el
año, incluso en verano.
La genotipificación demostró la presencia de las 3 especies, siendo la A
y C las más frecuentes. Los análisis de filogenia demostraron la
circulación simultánea de distintos genotipos. Actualmente, hemos
incorporado la detección de rinovirus al diagnóstico de rutina.
Miércoles 24 de junio
Sala B (Salón Dorée - 1º piso)
09:00 – 10:30 hs. MESA REDONDA SC3: DIFICULTADES EN EL
DIAGNÓSTICO
VIROLÓGICO
EN
PACIENTES
INMUNOCOMPROMETIDOS
Coordinadores:
Lilia Mammana. Unidad de Virología, Hospital de Infecciosas "F. J.
Muñiz", Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Alfredo Martínez. Unidad de Virología, CEMIC, Ciudad Autónoma
de Buenos Aires, Argentina.
Panelistas:
Dolores Fellner. Servicio de Virus Oncogénicos, Instituto Nacional
de Enfermedades Infecciosas‐ Administración Nacional de
Laboratorios e Institutos de Salud (INEI‐ANLIS) “Dr. Carlos G.
Malbrán”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Cristina Videla. Unidad de Virología, CEMIC, Ciudad Autónoma de
Buenos Aires, Argentina.
Humberto Metta. Hospital de Infecciosas "F. J. Muñiz", Ciudad
Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
INFECCIÓN POR VIRUS EPSTEIN-BARR (EBV) EN PACIENTES
TRASPLANTADOS: HACIA UN CONSENSO EN EL DIAGNÓSTICO
ENFOCADO A LA DETECCIÓN TEMPRANA DE LOS DESÓRDENES
LINFOPROLIFERATIVOS POST-TRASPLANTE (PTLD)
D Fellner
Servicio de Virus Oncogénicos, Instituto Nacional de Enfermedades
Infecciosas-Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de
Salud (INEI-ANLIS) “Dr. Carlos G. Malbrán”, Ciudad Autónoma de Buenos
Aires, Argentina.
El virus Epstein-Barr en pacientes trasplantados induce el desarrollo de
los Desórdenes Linfoproliferativos Post-trasplante. Es un virus ubicuo,
luego de la primoinfección persiste en linfocitos B. Por ello, su detección
no es suficiente, mientras que la medición de la carga viral por métodos
de amplificación en cadena de la polimerasa (PCR) ha mostrado ser una
herramienta potencial para el diagnóstico, seguimiento y pronóstico de
las enfermedades asociadas. Actualmente, la PCR en tiempo real, se
utiliza como metodología de referencia para cuantificar EBV; sin
embargo hasta el momento no existe una estrategia “gold standard” y
cada laboratorio mide la carga de EBV con su propio sistema artesanal o
comercial. Un gran avance, lo constituyó la disponibilidad desde el año
2012, del primer estándar de referencia internacional de la
Organización Mundial de la Salud (OMS) para cuantificar EBV, que
permite expresar las cargas virales en unidades internacionales. De esta
forma las comparaciones de los resultados entre diferentes laboratorios
se hacen más válidas y harán posible la identificación de umbrales o
niveles de referencia universales que puedan utilizarse en el
diagnóstico, pronóstico y tratamiento preventivo de PTLD. No obstante,
esto no es suficiente para la estandarización, ya que también se ha
observado variabilidad en los resultados de carga viral dependiendo de
24
Libro de resúmenes
la combinación de primers y sonda, de la región genómica amplificada y
de la calibración utilizada. Por otra parte, tampoco se ha determinado
cuál es la muestra clínica óptima sobre la cual cuantificar EBV.
Inicialmente se tomó a las células mononucleares periféricas (CMP), que
contienen a los linfocitos B, como la muestra más precisa, pero se ha
demostrado que la sangre entera es igualmente eficiente para el
seguimiento de pacientes trasplantados, con las ventajas técnicas
adicionales del menor tiempo y costo al evitar los métodos de
separación de CMP. Por otra parte, si bien se ha informado que el
plasma es menos sensible con respecto a los compartimientos celulares,
algunos estudios indican una información clínica más específica en
relación a PTLD. Por lo tanto, es necesario seguir trabajando en la
búsqueda de la muestra clínica óptima, su procesamiento y
almacenamiento, así como en la determinación de la frecuencia
recomendada de monitoreo en grupos de alto y bajo riesgo de PTLD.
Con el fin de mejorar la sensibilidad y especificidad clínica, se ha
combinado la medida de la carga de EBV con otras técnicas tales como
la detección del perfil de expresión de genes virales, la identificación y
cuantificación de inmunidad celular específica y analizado el uso de
paneles de ensayos que permiten testear múltiples factores virales y
humanos. Se han realizado importantes avances en relación a la
búsqueda y estandarización de pruebas de laboratorio que permitan
una prevención más eficiente de los PTLD, aunque todavía queda
mucho por recorrer para lograr un consenso internacional.
sistema nervioso central (SNC) y periférico y las reactivaciones de las
infecciones latentes originan variadas y graves manifestaciones clínicas
en los enfermos con sida. Los cuadros clínicos más frecuentes incluyen
meningitis, meningoencefalitis, mielitis, polineuritis y cualquiera de sus
combinaciones. El diagnóstico de compromiso del SNC se confirma a
través de la punción lumbar, el examen físico, químico y citológico del
LCR y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección del
genoma de virus de la familia herpes. La utilidad clínica de la misma ha
sido fundamental para el diagnóstico de las infecciones del SNC por
virus herpes en pacientes con enfermedad HIV/SIDA a partir del
hallazgo de coinfecciones como así también la presencia de agentes
poco comunes como el HHV-6, un patógeno emergente en estos
pacientes, y su posible rol en las complicaciones neurológicas agudas o
subagudas. El virus identificado con mayor frecuencia es el
citomegalovirus. El pronóstico de estos pacientes está directamente
relacionado con un diagnóstico precoz y la terapéutica antiviral
específica y oportuna. El diagnóstico precoz seguido del tratamiento
antiherpético y la reconstitución inmunológica alcanzada con la TARGA
pueden mejorar el pronóstico de esta clase de pacientes.
10:30 – 11:15 hs CONFERENCIA SC2
Alfredo Seijo. Servicio de Zoonosis, Hospital de Infecciosas "F. J.
Muñiz", Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
DIFICULTADES EN EL DIAGNOSTICO DE CITOMEGALOVIRUS (CMV) EN
PACIENTES TRASPLANTADOS
C Videla
Laboratorio de Virología Clínica, Hospital Universitario CEMIC,
Argentina.
El Citomegalovirus (CMV) es una de las principales causas de morbilidad
y mortalidad en pacientes trasplantados tanto de órgano sólido como
de médula ósea. El gran desafío en el diagnostico de CMV es poder
diferenciar entre infección y enfermedad.
Para el diagnostico de CMV se cuenta con una amplia gama de métodos
que van desde los clásicos, como la histopatología, el cultivo viral y la
antigenemia hasta los más recientes de detección de ácidos nucleicos
(NAT). En la actualidad, el NAT es el más utilizado para detección y
cuantificación del CMV (carga viral). La carga viral en sangre es
empleada para predecir enfermedad e instaurar la terapia preventiva,
para el seguimiento del tratamiento antiviral guiando la duración del
tratamiento, señalando la aparición de cepas resistentes y
determinando el riesgo de enfermedad tardía por CMV. Debido a la alta
sensibilidad y valor predictivo negativo del NAT, este se utiliza para
descartar enfermedad por CMV. Sin embargo, los valores de corte de las
cargas virales para cada una de estas situaciones no están aún bien
definidos.
Una de las causas por la cual no existen valores de corte de carga viral
para predecir enfermedad e iniciar la terapia preventiva es la falta de
estandarización de los métodos. La introducción en el 2011 del estándar
internacional es un gran avance para poder lograr uniformar las cargas
virales y disminuir la variabilidad de resultados interlaboratorio.
La estandarización de las cargas virales permitirá una mejor
interpretación de los resultados en las diferentes situaciones
diagnosticas y así un mejor manejo de los pacientes
inmunocomprometidos.
DIFICULTADES EN EL DIAGNÓSTICO DE LAS NEUROVIROSIS EN
PACIENTES CON ENFERMEDAD VIH/SIDA
H Metta1 2
1
Jefe División VIH/sida, Hospital de Infecciosas "F. J. Muñiz", Ciudad
Autónoma de Buenos Aires, Argentina. 2 Profesor Regular Titular,
Departamento de Medicina, Orientación Enfermedades Infecciosas,
Facultad de Medicina, UBA, Argentina.
El compromiso neurológico es muy frecuente en la enfermedad
HIV/sida y se asocia con una elevada morbimortalidad. Estas
complicaciones pueden presentarse en cualquier momento de la
historia natural de la enfermedad; las infecciones oportunistas son las
causas más frecuentes del compromiso neurológico en estos pacientes.
Los virus de la familia Herpesviridae tienen un marcado tropismo por el
¿QUÉ HACEMOS LOS HOMBRES PARA QUE EMERJAN LAS
ENFERMEDADES VIRALES?
A Seijo1 2
1
Jefe del Servicio de Zoonosis del Hospital FJ Muñiz, GCBA, Argentina. 2
Director de la Maestría en Control y Prevención de las Zoonosis
(UNNOBA), Argentina.
En las últimas décadas, con escasas excepciones, las enfermedades
transmisibles que pueden considerarse estrictamente emergentes, han
sido producidas por virus, de los cuales la mayoría presenta dos
caracteres comunes: son zoonosis y además sus nichos ecológicos
originarios, se localizan en las grandes extensiones boscosas de las áreas
tropicales y subtropicales. La caracterización de emergentes, como
problema de salud pública, no puede explicarse sólo por hechos de la
biología propia de los microorganismos o por la susceptibilidad de los
potenciales enfermos. En este sentido, realizaremos un análisis sobre
factores y circunstancias que facilitan la emergencia de un virus como
problema de salud pública. Entre las causas biológicas se hará mención
a la relación factores de virulencia/memoria inmunológica, entendida
como proceso evolutivo. Por otra parte, se describirán factores que
posibilitan la emergencia, analizados desde una perspectiva social e
histórica. Estos factores, en general desencadenantes, serán
relacionados con hechos biológicos concretos. Desde este punto, se
verán como algunos paradigmas históricos y sociales, cuyos efectos
pueden ser mensurados en relación con el estrés y la mal nutrición,
pueden tener consecuencias sobre la inmunidad natural y actuar como
emergentes de enfermedades virales. Como ejemplos, se comentarán
emergencias sucedidas en el pasado, con énfasis en el Nuevo Mundo y
algunos de los sucesos contemporáneos. Entre los primeros, las
epidemias de viruela y sarampión en comunidades originarias de las
Américas y entre los hechos más recientes el espectro que transita
desde la fiebre hemorrágica Argentina, la enfermedad de Heine-Medin
el síndrome pulmonar por hantavirus hasta la enfermedad por virus
Chikungunya.
16:30 – 18:00 hs. MESA REDONDA SC4: ASEGURAMIENTO DE
LA CALIDAD EN EL LABORATORIO DE VIROLOGÍA
Coordinadores:
Eduardo Anchart. Redes Bioquímicas, Ministerio de Salud, Santa Fe,
Argentina.
Mirta Remesar. Área de Infecciones Transmisibles por Transfusión,
Hospital Garrahan, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
25
Libro de resúmenes
Panelistas:
Marcelo Rodríguez. Departamento de Parasitología, INEI‐ANLIS “Dr.
Carlos G. Malbrán”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Catalina Massa. Laboratorio de Hemoderivados, UNC, Córdoba,
Argentina.
Héctor Daniel Elías. División Gestión de Calidad de la Dirección de
Bioquímica de la Municipalidad de Rosario y Gestión de Calidad
para la Red de Laboratorios del Ministerio de Salud de Santa Fe,
Rosario, Argentina.
EVALUACIÓN DE MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN EL
LABORATORIO DE VIROLOGÍA CONSIDERACIONES PRÁCTICAS
M Rodriguez
Departamento de Parasitologia ANLIS, Argentina.
La evaluación de reactivos de diagnóstico (IVD’s) moleculares se realiza
en 3 instancias particulares,1) cuando se desarrolla un IVD “in house” y
el investigador/desarrollador se dispone estimar los parámetros de
performance (validación analítica y diagnóstica),2) cuando se incorpora
una nueva metodología al laboratorio y es necesario saber si alcanza los
parámetros de la ya implementada y 3) si el laboratorio está acreditado
y necesita dar cuenta de la performance de los IVD`s y de cómo realiza
el seguimiento de los mismos a los largo del tiempo (verificación). Se
trate de validar nuevos métodos o verificar la performance declarada,
implementar esta tarea implica planificar un proceso previo con
actividades antes de poner los IVDs en la mesada y emitir resultados de
pacientes. Algunas de estas actividades son:- definir cuales serán
considerados insumos críticos, y de cómo se producirán y lotearan para
elaborar el denominado “Lote Maestro”, cuyo objetivo es proveer un
único lote para completar la Validación Analítica y Diagnóstica y así
generar datos históricos.; -definir “la concentración” (de significancia
clínica) de controles de amplificación/calibradores (CA) y de la
estrategia de fraccionamiento, conservación y loteo (para el armado de
las futuras curva de calibración), y así evitar el “se cayó el CA”;- definir
con que CA se realizará el seguimiento de la presicion en una carta de
control;-calibrar los equipos críticos para asegurar que la impresición o
sesgo, no tenga componentes extras que sobreestimarían dichos
parámetros;-suscribirse a un Control de Evaluación Externa de la
Calidad y por último estimar parámetros de performance. Existen
numerosas guías y recomendaciones internacionales para estimar los
parámetros en forma aislada, pero no en la organización y secuencia
para estimar “conjuntamente” los mismos, de manera de poder ahorrar
tiempo y dinero. En nuestra institución desarrollamos un “protocolo
múltiple” con aplicación transversal para estimar “conjuntamente”
parámetros analíticos. : -Requisitos de calidad mínimos (Error Total
Aceptable a partir del estado del arte de los datos de validación),Repetibilidad, -Precisión Intralaboratorio,-Perfil de Precisión,Elaboración de cartas de control diario de Levey Jennings,-Linealidad,
Rango de trabajo (Límite Inferior y superior de Cuantificación),- Límite
de detección (a partir de curvas Probit o POD/LOD),-La Verificación de
Repetibilidad y Precisión Intralaboratorio,-El cálculo de La
incertidumbre expandida. La evaluación de IVD`s moleculares debe ser
conceptualizada como un proceso bien organizado que nos permita:
conocer la performance de los métodos, afirmar que los resultados del
informe de evaluación son satisfactorios con el uso previsto y dar
evidencia objetiva de la cuantificación del error del método para
asegurar así la calidad de los resultados informados.
CONTROLES VIROLÓGICOS PARA LA SEGURIDAD BIOLÓGICA EN LA
CADENA DE PRODUCCIÓN DE MEDICAMENTOS HEMODERIVADOS
C Massa
Laboratorio de Hemoderivados. UNC, Argentina.
Los medicamentos hemoderivados deben cumplir estrictos requisitos
de calidad, eficacia terapéutica y seguridad biológica. La seguridad
biológica de los productos derivados del plasma humano depende
fundamentalmente de la seguridad del plasma utilizado como materia
prima.
Las especificaciones internacionales referidas a la seguridad biológica de
los hemoderivados están dirigidas a reducir al mínimo el riesgo de
transmisión de agentes patógenos a través de la administración de los
mismos.
Las medidas dirigidas a garantizar el cumplimiento de estas
especificaciones están referidas principalmente a la adecuada selección
de los donantes de sangre o plasma, al estricto cumplimiento de las
Buenas Prácticas de Fabricación y Control (BPFyC) y a la realización de
un riguroso control, tanto en la materia prima de partida como en las
distintas etapas del proceso productivo, de marcadores virales
transmisibles por sangre y sus derivados.
Por consiguiente la seguridad biológica de los medicamentos
hemoderivados está garantizada por la aplicación de las siguientes
medidas:
Centro de Colecta de sangre y/o plasma
- Estricto cumplimiento de BPFyC en los procesos de selección,
obtención,
control,
almacenamiento
y
distribución
de
hemocomponentes.
- Control de marcadores virales en cada unidad individual de sangre o
plasma enviada a fraccionamiento proteico para obtención de
medicamentos,
Planta Industrial
- Certificación de la ejecución de los procesos operativos en los bancos
de sangre y centros de colecta de plasma. Los principales procesos
involucrados en la seguridad biológica del plasma destinado a la
elaboración de medicamentos son la selección de los donantes, la
obtención y control de la sangre y hemocomponentes y la verificación
del sistema de calidad aplicado en la institución.
- Reanálisis de marcadores virales en las unidades de plasma enviadas a
fraccionar.
- Control de marcadores virales en el pool de plasma inicial que da
origen a cada lote de producto final.
- Inclusión y validación de etapas de inactivación viral en el proceso
productivo.
- Estricto cumplimiento de BPFyC en las distintas etapas del proceso
productivo.
- Control de marcadores virales en producto final.
En función de las etapas de control y de los productos hemoderivados a
elaborar se requiere la investigación de la presencia de marcadores
virales para virus de la Inmuno Deficiencia Humana 1 y 2, virus de la
Hepatitis C, virus de la Hepatitis B y Parvo virus B19
Los métodos de detección aplicados deben responder a las exigencias
especificadas para cada etapa y deben ser validados para demostrar el
cumplimiento de requisitos de sensibilidad y especificidad.
EXPERIENCIA EN SISTEMAS DE GESTIÓN DE CALIDAD EN
LABORATORIOS DE VIROLOGÍA DEL ÁMBITO ESTATAL
HD Elías
División Gestión de Calidad de la Dirección de Bioquímica de la
Municipalidad de Rosario y Gestión de Calidad para la Red de
Laboratorios del Ministerio de Salud de Santa Fe, Rosario, Argentina.
Etapas en implementación de sistemas de gestión de calidad en
laboratorios públicos. Definición de la política, objetivos y compromisos
organizacionales, objetivos particulares. Como se trabaja en redes de
laboratorio, la generación de los consensos de trabajo, gestión de los
documentos.
Los sistemas de registros para creación de indicadores, elementos de
gestión para la mejora continua, proceso de certificación.
La gestión de equipos, mantenimientos y trazabilidad de las medidas,
Los recursos humanos capacitación según objetivos, evaluación de
desempeño, Evaluación de proveedores de productos y servicios,
procesos analíticos aseguramiento de la calidad.
26
Libro de resúmenes
II Simposio de Virología Veterinaria
“Dr. José L. La Torre”
Conferencias plenarias y mesas redondas
Jueves 25 de junio
Sala B (Salón Dorée - 1º piso)
09:00 – 10:30 hs. MESA REDONDA SV1: AVANCES EN VIRUS DE
RUMIANTES
Coordinadores:
Sandra Pérez. Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad
Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires (UNCPBA)
CIVETAN‐CONICET, Tandil, Argentina.
Carolina Ceriani. Facultad de Ciencias Veterinarias, UNCPBA
CIVETAN‐CONICET, Tandil, Argentina.
Panelistas:
Viviana Parreño. Instituto de Virología, INTA, Castelar, Argentina.
Maia Marín. Grupo de Sanidad Animal, INTA EEA Balcarce,
Argentina.
Erika González Altamiranda. INTA EEA Balcarce, Argentina.
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR Y ESTRATEGIAS DE PREVENCIÓN DE
AGENTES VIRALES CAUSANTES DE DIARREA
V Parreño
Instituto de Virologia, CICV y A, INTA., Argentina.
El síndrome de diarreas neonatal del ternero (DNT) es un problemática
de alto impacto sanitario tanto en los explotaciones de ganado de cría
como en los establecimientos lecheros. Dentro de los agentes virales
que participan en este síndrome, nuestro grupo de investigación ha
trabajado en el diagnóstico y caracterización molecular de Rotavirus,
Coronavirus y Norovirus bovino. También hemos investigado la
circulación de rotavirus en otras especies animales de interés
económico como equinos, porcinos y camélidos sudamericanos,
encontrandose variantes geneticas propias de cada especie y
marcadores moleculares del virus compartido entre especies y propios
de la región. Según resultados obtenidos en relevamientos realizados
en los últimos 20 años rotavirus grupo A bovino se encuentra
ampliamente distribuido en ambos tipos de explotaciones bovinas con
prevalencias mayores al 70%, siendo diferente la epidemiologia de la
enfermedad y variantes que circulan en rodeos de cría y de tambo.
Coronavirus bovino es un agente que se presenta asociado a diarrea
preferentemente en los rodeos lecheros. Por su parte se ha detectado
recientemente la circulación de las dos variantes de norovirus bovino
en terneros de leche. A partir de los resultados de diagnóstico se ha
trabajado en el diseño y desarrollo de vacunas y estrategias de
inmunidad pasiva para prevenir las diarreas causadas por estos
agentes, asi como en la estandarizacion de modelos animales para
controlar la potencia y eficacia de estas herramientas preventivas y
terapéuticas.
RECEPTORES TIPO TOLL Y SU RELACIÓN CON LA INFECCIÓN POR
HERPESVIRUS BOVINO TIPO 1 Y 5
M Marin
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET),
Rivadavia 1917, C1033AAJ, Buenos Aires, Argentina.
Los receptores tipo toll (TLRs) son proteínas de señalización de
transmembrana que ejercen un rol importante en la respuesta inmune
innata mediante el reconocimiento de “patrones moleculares asociados
a los patógenos”. Durante la infección microbiana estas moléculas
altamente conservadas son reconocidas por una gran variedad de
células a través de los TLRs, induciendo la producción de citoquinas
pro-inflamatorias y moléculas antimicrobianas y la estimulación de la
respuesta adaptativa. Así, los TLRs participan activamente en el
desarrollo de la respuesta innata, destinada a eliminar al
microorganismo en los primeros estadios de la enfermedad, y
constituyen el nexo entre las respuestas inmunes innata y adaptativa.
La información publicada sobre la expresión de los TLRs en la especie
bovina es escasa. Homólogos de los TLRs 1-10 humanos existen en el
bovino, sin embargo la mayoría de los trabajos sobre los TLRs bovinos
se concentra en los TLRs 2 y 4 y su asociación con la infección por
herpesvirus bovinos no ha sido esclarecida. Dicha interacción en la
infección por Herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1), fue caracterizada
basándose exclusivamente en los TLR2 y 4 que detectan proteínas
virales, revelando que la infección por BoHV-1 amplifica la expresión de
estos receptores e incrementa las respuestas pro-inflamatorias. Definir
los mecanismos que participan en dichas respuestas permitirá
identificar aquellos inhibidores o ligandos de TLRs que permitan
modular la infección con el fin de proveer nuevas herramientas que
puedan ser utilizadas en la prevención y/o tratamiento de las
enfermedades ocasionadas por los herpesvirus en el ganado. Hasta el
momento, no existían estudios que caracterizaran el papel de los TLRs
que detectan ácidos nucleicos (TLR3, 7, 8 y 9) en las infecciones por
alfaherpesvirus bovinos, como tampoco había sido investigada la
asociación de los TLRs con la infección por Herpesvirus bovino tipo 5
(BoHV-5). El BoHV-5 es el agente etiológico de la meningoencefalitis
necrotizante en terneros, causal de brotes fatales frecuentes en
Argentina y Brasil. Las investigaciones realizadas demostraron, por
primera vez, la participación de los TLR3, 7, 8 y 9 en el reconocimiento
inmune innato de BoHV. La infección por los herpesvirus bovinos ejerce
efectos variados sobre los niveles de expresión de estos TLRs en el
sistema nervioso bovino, lo cual permitió caracterizar diferencias en la
neuropatogenia de BoHV-1 y 5. Además, se identificó un agonista del
TLR7/8 con marcada actividad anti-viral que podría ser útil como
herramienta complementaria en la modulación de la infección.
Actualmente, se estudia también el rol de los TLRs en proceso de
infección respiratoria y en el mantenimiento de la latencia y/o
reactivación de BoHV, con el fin de contribuir al desarrollo de nuevas
propuestas para la prevención y control de la enfermedad en los
rodeos.
UTILIZACIÓN DE UNA TÉCNICA DE NESTED RT-PCR PARA LA
DETECCIÓN DE ANIMALES PERSISTENTEMENTE INFECTADOS CON EL
VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA (VDVB) Y MONITOREO DE
RODEOS
EA González Altamiranda1 2
1
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, Argentina. 2
EEA INTA Balcarce, Argentina.
El virus de la diarrea viral bovina (vDVB) es un patógeno que ocasiona
importantes pérdidas económicas para la industria ganadera a nivel
mundial. Tiene múltiples formas de presentación, entre las que se
incluye la infección aguda, un síndrome fatal denominado “Enfermedad
de las Mucosas” y cuadros reproductivos de infertilidad, abortos y
anomalías congénitas. Una situación relevante en la patogenia del
vDVB es el desarrollo de infecciones persistentes en animales
expuestos congénitamente al virus. Estos animales persistentemente
infectados (PI) son reservorio del virus y la principal fuente de
diseminación en la población bovina. Por este motivo, los esfuerzos
para el control deben dirigirse a la detección y eliminación de bovinos
PI del rodeo. La vacuna por sí sola es insuficiente para el control de la
infección ya que no elimina los animales portadores. El saneamiento
27
Libro de resúmenes
mediante la detección y remoción de animales PI es el procedimiento
que se utiliza en varios países de la UE, habiéndose logrado su
erradicación. La técnica “gold-estándar” para la detección de animales
PI es el aislamiento viral a partir de leucocitos; sin embargo, es
necesaria la implementación de un método más rápido y sensible que
permita, a un costo razonable, la identificación de animales portadores
infectados. Ante la creciente demanda para implementar medidas de
saneamiento eficaces que permitan controlar las infecciones por vDVB
y lograr el estatus de establecimientos libres, a partir del año 2010 se
comenzó a implementar en nuestro laboratorio la técnica nested RTPCR para la detección de animales PI. La misma fue puesta a punto para
la detección del virus en pooles de sueros, con el propósito de
optimizar el diagnóstico con una técnica rapida, confiable y altamente
sensible. La aplicación de esta técnica permite la identificación de
bovinos PI, para segregarlos del rodeo y de esta manera, eliminar la
principal fuente de infección del vDVB en los establecimientos
ganaderos. Con la ejecución de la presente propuesta se contribuye al
desarrollo socio-económico del país porque se aplica un test
diagnóstico sensible que incrementa la posibilidad de controlar una
importante infección viral, aumentando los índices productivos. Los
resultados iniciales resultaron de importancia para la posterior
validación del ensayo, evaluando la reproducibilidad de la técnica como
parámetro para determinar la precisión del mismo. Es importante
considerar que la ganadería vacuna argentina ha visto reducida su
superficie a causa de la importante expansión de la agricultura y
aunque el stock vacuno se ha mantenido a pesar de esta reducción en
su superficie, una de las consecuencias es que frecuentemente la
producción ganadera bovina en su conjunto (leche y carne) se
encuentra en condiciones sanitarias desfavorables. Está claro entonces
que contar con métodos de diagnóstico y control adecuados resulta
fundamental para una adecuada salud animal.
10:30 – 11:15 hs. CONFERENCIA SV1
Etienne Thiry. Veterinary Virology and Animal Viral Diseases,
Department of Infectious and Parasitic Diseases, Faculty of
Veterinary Medicine, University of Liège, Lieja, Bélgica.
SCHMALLENBERG VIRUS INFECTION: EUROPE IN FACE OF REPEATED
EMERGING VECTOR BORNE VIRAL DISEASES IN RUMINANTS
E Thiry
Veterinary virology, FARAH Center, Faculty of Veterinary Medicine,
University of Liège, B-4000 Liège, Bélgica.
After the severe infection with the orbivirus bluetongue virus serotype
8 in 2006, Northern Europe faced an unexpected emerging bunyavirus
infection in 2011. Although there have been already scarce reports
about bunyaviruses, except hantaviruses, in Europe, this emerging virus
was remarkable because of its extremely rapid and efficient spread
within the ruminant populations. The emergence of Schmallenberg
virus (SBV), an orthobunyavirus, was first recorded in dairy farms in
Germany (precisely in Schmallenberg town) and the Netherlands. The
associated clinical signs, hyperthermia and drop in milk production,
were not obvious. Nevertheless a metagenomic approach successfully
identified a previously unknown bunyavirus as being associated with
the disease. The virus genome was similar to sequences of various
orthobunyaviruses, namely Akabane, Aino and Shamonda viruses. As
other orthobunyaviruses, SBV is an arbovirus and is transmitted
through culicoid bites. The infection gained larger areas of Germany,
the Netherlands and Belgium and was soon after linked to abortions
and more to congenital abnormalities in ruminant foetuses, especially
of the bovine and ovine species and caprine to a lesser extent. The
clinical presentation was arthrogryposis and hydranencephaly in
newborn animals that led to severe neurological and locomotor
disorders and a rapid death of affected animals. SBV is not zoonotic and
reaches mainly ruminant species. Two main waves of clinical
manifestations were observed in 2012 and 2013 reaching more than 20
European countries. However the economic consequences of this
widespread infection remained relatively low with estimated morbidity
and mortality rates of less than 3%. An international effort made
possible the fast availability of molecular and serological diagnostic
tools. Vaccines were also quickly introduced in the market but, due to
the low impact of the disease and the absence of compensations, they
have been poorly used.
The remarkable introduction and efficient spread of this
orthobunyavirus are described. The properties of the virus and the
current knowledge of its pathogenesis are reviewed. The epidemiology
of the infection takes into account the spread via culicoids. The
situation of SBV within orthobunyaviruses as well as speculations about
its origin based on molecular phylogeny are discussed.
11:45 – 13:15 hs. MESA REDONDA SV2: VIRUS DE AFTOSA
Coordinadores:
Mariano Pérez Filgueira. Instituto de Virología, INTA, Castelar,
Argentina.
Nora Mattion. Instituto de Ciencia y Tecnología “Dr. César
Milstein”, CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Panelistas:
María Inés Gismondi. Instituto de Biotecnología, INTA, Castelar,
Argentina.
Viviana Malirat. Instituto de Ciencia y Tecnología “Dr. César
Milstein”, CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Emilio León. Instituto de Patobiología, INTA, Castelar, Argentina.
DIFERENCIAS EN LA INTERACCIÓN HOSPEDADOR-PATÓGENO EN
VARIANTES DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA SEROTIPO A
M Cacciabue1, MS García Núñez1, F Delgado2, E Carrillo1 3, MI Gismondi1
1
Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA, Argentina. 2 Instituto de
Patobiología, CICVyA, INTA, Argentina. 3 CICVyA, INTA, Argentina.
El virus de la fiebre aftosa (VFA, familia Picornaviridae, género
Aftovirus) produce una enfermedad altamente contagiosa que afecta a
animales biungulados ocasionando importantes pérdidas económicas.
Previamente se determinó que dos variantes del VFA A/Arg/01
presentaban diferencias en su virulencia en el modelo ratón, siendo
VFA-L un virus letal y VFA-NL un virus no letal.
Nuestros objetivos fueron caracterizar la patogenia de la infección en el
modelo ratón adulto C57BL/6 y estudiar la replicación de VFA-L y VFANL en distintos cultivos celulares.
Se inocularon por vía intraperitoneal grupos de 9 ratones hembras
adultas de 8 a 9 semanas con cada virus (105 UFP/ratón). A las 24 horas
postinfección (hpi) se tomaron muestras de sangre (n=9) y órganos
(hígado, bazo, cerebro, páncreas, timo; n=5) para el análisis
histopatológico y la determinación del título viral. Se controló durante 7
días el resto de los ratones por signos de enfermedad y muerte.
Ratones inoculados con VFA-NL fueron desafiados 14 días
postinoculación con 104 UFP totales de VFA-L y se monitorizó su
evolución clínica durante 7 días. Además, se determinó el tamaño y la
morfología de las placas de lisis de cada virus y se caracterizó su
cinética de crecimiento en los cultivos celulares BHK-21, PK-15, MDBK,
IBRS-2, riñón fetal bovino (RFB) y riñón ovino (RO).
Los ratones infectados con VFA-L presentaron lesiones más severas,
con edema generalizado en la cavidad abdominal y hemorragias en la
cavidad torácica. El análisis histopatológico reveló que ambos VFA
causaron lesiones severas en el páncreas, que afectaron 80% del tejido
exócrino en los animales infectados con VFA-L y 60% del mismo en
animales infectados con VFA-NL. El timo y el bazo presentaron
alteraciones apoptóticas multifocales. No se evidenció daño tisular en
hígado y en cerebro. A las 24 hpi, la viremia y el título viral por gramo
de tejido (hígado, bazo y páncreas) fueron significativamente mayores
en los animales infectados con VFA-L. Asimismo, sólo se detectó virus
infectivo en muestras de cerebro de los animales infectados con VFA-L.
Los animales inoculados inicialmente con VFA-NL y desafiados con VFAL no presentaron signos de enfermedad durante el período evaluado,
sin detectarse viremia a las 24 horas postdesafío. Por otro lado, ambos
virus presentaron cinéticas de crecimiento similares y placas de lisis de
28
Libro de resúmenes
idénticas características en células BHK-21 y RFB, en tanto no se
observó replicación en las líneas celulares MDBK, PK-15 e IBRS-2. Por el
contrario, VFA-L produjo placas de lisis de mayor diámetro y un mayor
título en células RO a las 24 y 48 hpi.
En conclusión, ambos virus producen una infección sistémica con
lesiones evidentes en el páncreas, el timo y el bazo de los ratones
afectados. La virulencia de VFA-L puede controlarse mediante
inmunización previa con VFA-NL. Las diferencias de virulencia entre
ambos virus dependen de las características de la interacción
hospedador-patógeno.
VIRUS DE AFTOSA: CEPAS CIRCULANTES EN LA REGIÓN Y SU RELACIÓN
CON LAS CEPAS INCLUIDAS EN LA FORMULACIÓN DE LAS VACUNAS.
V Malirat1, E Maradei2, C Pérez Beascoechea2, S Galdo Novo2, I Ballette2,
R D'Aloia2, C Seki1, ER Caffarena3, D Antunes3, IE Bergmann1
1
CEVAN‐ICT Dr. César Milstein, CONICET, CABA, Argentina. 2 DILABSENASA. Dirección de Laboratorios. Servicio Nacional de Calidad y
Sanidad Agroalimentaria, Martínez, Argentina. 3 PROCC. Programa de
Computacao Científica- Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil.
El virus de la fiebre aftosa es el agente causal de una de las
enfermedades más devastadora en la producción agropecuaria,
afectando a animales de pezuña hendida, como bovinos, porcinos y
ovinos. La Argentina es reconocida como país libre de fiebre aftosa por
la Organización Mundial de Sanidad Animal, con una zona donde no se
aplica la vacunación, principalmente concentrada al sur del paralelo 42,
y una región donde se vacuna sistemáticamente, por lo cual la
reintroducción de la enfermedad supone un riesgo alarmante. Existen
siete serotipos inmunológicamente distintos, O, A, C, Asia 1, SAT 1,
SAT2 y SAT3, y es conocido que la infección o vacunación con un
serotipo no confiere protección cruzada contra los otros, e inclusive
puede no proteger completamente contra otros subtipos del mismo
serotipo, por lo que las cepas incluidas en la vacuna, y también las que
componen las reservas de bancos de antígenos, se seleccionan
considerando esta característica. En Argentina las vacunas son
formuladas con cepas que, luego de estudios detallados de protección
cruzada, han probado ser eficaces contra los virus que han circulado en
el país y la región. En los últimos años, los brotes registrados en el
continente, y de los cuales existen muestras disponibles, se han
limitado a Ecuador (164 brotes del tipo O entre los años 2008-2011) y a
la re-aparición del virus tipo O en Paraguay, en el año 2011.
En este trabajo se presenta la caracterización genética, mediante el
análisis del secuenciamiento de nucleótidos de las regiones que
codifican para la proteína VP1 y la poliproteína P1, y la composición
aminoacídica deducida del mismo de estos aislamientos. Este análisis se
comparó con los perfiles antigénicos que se obtienen por la reactividad
del virus frente a un panel de anticuerpos monoclonales, con los
resultados de relaciones r1 de estos virus con respecto a la cepa
vacunal, calculados mediante ensayos de Virus Neutralización
bidimensional, y con los resultados de protección in vivo (PGP). Los
cambios genéticos que puedan haber impactado en el comportamiento
antigénico también se analizaron mediante la determinación de la
estructura 3D de la P1, establecida a través de modelado por
homología, con respecto a la cepa vacunal.
La caracterización genética mostró que los virus aislados en Ecuador y
Paraguay son molecularmente alejados del virus vacunal. Los cambios
genéticos detectados se reflejan en el perfil de reactividad con
anticuerpos monoclonales y también en las relaciones inmunogénicas
(r1), y en la protección al desafío viral. El análisis de la composición
aminoacídica y de modelaje molecular de la región que codifica para la
región que codifica a las 4 proteínas de la cápside viral (P1) mostró que
se registran cambios importantes como deleciones y sustituciones en
sitios antigénicos, localizados en las proteínas VP1, VP2 y VP3, que
podrían explicar las diferencias antigénicas encontradas así como la
disminución en la protección conferida por las vacunas.
EVALUACIÓN DE LA EFECTIVIDAD DE LAS CAMPAÑAS DE
VACUNACIÓN ANTIAFTOSA EN ARGENTINA
EA León, AM Perez, MA Stevenson, B Robiolo, N Mattion, C Seki, J La
Torre, A Torres, B Cosentino, SJ Duffy
Instituto de Patobiología, INTA, Castelar, Argentina.
La vacunación sistemática y obligatoria de los bovinos ha sido la
principal estrategia de muchos países de Sudamérica para controlar la
Fiebre Aftosa (FA). Actualmente la utilizan para prevenir las
consecuencias vinculadas a una eventual reintroducción del virus. Su
objetivo es inducir un nivel de protección en la población bovina capaz
de reducir las probabilidades de establecimiento y diseminación del
virus y facilitar su control en el caso de que los animales fuesen
expuestos al agente.
La efectividad de una campaña de vacunación depende de: a- la calidad
de la vacuna; b- la estrategia de vacunación; c- la cobertura vacunal; dla operatividad. La evaluación de la efectividad de las campañas de
vacunación es necesaria para identificar posibles fallas e implementar
medidas correctivas a tiempo.
Objetivo del estudio: evaluar la efectividad de las campañas de
vacunación anti FA en la provincia de Buenos Aires. Se diseñó un
estudio serológico a nivel ENTE de vacunación, para estimar con un
95% de confianza la prevalencia de bovinos de categoría 1 (6 a 12
meses de edad) y de categoría 2 (1 a 2 años de edad) protegidos contra
el virus de la FA. El diseño permitió también estimar la proporción de
establecimientos adecuadamente vacunados. Se tomaron 420 sueros
de bovinos de categoría 1 y 126 de categoría 2, procedentes de 42
establecimientos por ENTE.
Es estudio se realizó en la provincia de Buenos Aires los años 2004,
2007, 2008 y 2011. Participaron de manera voluntaria 39, 18, 11 y 21
ENTES respectivamente. Se analizaron más de 42000 muestras
procedentes de 3300 establecimientos.
Las muestras se analizaron por ELISA en fase líquida. Se determinaron
los títulos de anticuerpos séricos contra los tipos A2001 y O1Campos.
Se fijó una línea de corte para identificar a los animales protegidos
(títulos compatibles con el 75% de expectativa porcentual de
protección).
No se observaron diferencias significativas entre los títulos de los dos
tipos virales analizados. En términos generales se apreció un
incremento de los niveles inmunitarios a través del tiempo, así como
niveles de protección significativamente superiores en los animales de
categoría 2 con respecto a los de categoría 1.
Los resultados globales, incluyendo la totalidad de los animales y
establecimientos estudiados durante los 4 estudios fueron:
Bovinos categoría 1 protegidos: 63% (IC95%: 62%-64%)
Bovinos categoría 2 protegidos: 91% (IC95%: 90%-92%)
Establecimientos adecuadamente vacunados: 81% (IC95%: 80%-82%)
La distribución de los resultados por ENTE fue variable, con diferencias
significativas en las proporciones de animales y establecimientos
protegidos, sugiriendo deficiencias en la implementación de la
vacunación en ciertos ENTES.
Se destaca que en ENTES con similar proporción de animales protegidos
se observaron importantes diferencias en la proporción de
establecimientos protegidos.
El método propuesto resultó efectivo para la evaluación de la
efectividad de las campañas de vacunación anti FA.
Viernes 26 de junio
Sala B (Salón Dorée - 1º piso)
9:00 – 10:30 hs. MESA REDONDA SV3: EPIDEMIOLOGÍA DE
ZOONOSIS DE INTERÉS REGIONAL
Coordinadores:
María Isabel Craig. Instituto de Virología, INTA, Castelar,
Argentina.
Marcelo Peccoraro. Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias
Veterinarias, UNLP, La Plata, Argentina.
29
Libro de resúmenes
Panelistas:
Laura Tauro. Laboratorio de arbovirus y arenavirus, Instituto de
Virología “Dr. J.M. Vanella” Facultad de Ciencias Médicas, UNC,
Córdoba, Argentina.
Javier Cappuccio. Instituto de Virología, INTA, Castelar, Argentina;
Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, La Plata, Argentina.
Daniel M. Cisterna. Departamento de Virus, INEI‐ANLIS “Dr. Carlos
G. Malbrán”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
VIRUS BUNYANWERA, UN PATÓGENO EMERGENTE DE IMPORTANCIA
VETERINARIA PARA ARGENTINA
LB Tauro
Instituto de Virologia "Dr. J.M. Vanella" Facultad de Ciencias Médicas.
Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.
La mayoría de los arbovirus que poseen relevancia médica / veterinaria
pertenecen a un grupo reducido de géneros, como Orthobunyavirus
(Bunyaviridae), Flavivirus (Flaviviridae) y Alphavirus (Togaviridae). En
Argentina circulan numerosos virus pertenecientes a estos tres géneros
y para muchos de ellos aún no se conoce su potencial patógeno en
humanos y animales.
Dentro del género Orthobunyavirus se encuentra el virus Bunyamwera
(BUNV), el cual incluye 27 cepas alrededor del mundo. En toda América,
este virus merece especial atención por su potencial patógeno tanto
animales como en el hombre ya que se lo encuentra asociado a la
producción de enfermedad del Sistema Nervioso Central,
malformaciones congénitas y abortos.
En Argentina han sido recuperadas de mosquitos dos cepas de BUNV,
CbaAr426 (Córdoba, 1964-1965) y AG83-1746 (Santa Fe, 1982).
Encuestas serológicas realizadas en Argentina detectaron elevadas
prevalencias de infección para BUNV (CbaAr426) en humanos (sanos,
con síndrome neurológico y enfermedad febril indiferenciada) y en
animales domésticos y silvestres. En el año 2009 en la ciudad de
Córdoba se detectó un caso de síndrome febril en humanos por BUNV
(CbaAr426), siendo este es el primer registro para América del Sur de
enfermedad por este virus. Durante el otoño del 2013 en la provincia
de Santa Fe ocurrió el primer brote de importancia veterinaria por
BUNV en el país, donde se produjo la muerte de dos caballos con
síndrome neurológico a partir de los cuales se aislaron 2 nuevas cepas
(SFCrEq231 y SFBzEq232) de BUNV; posteriormente (Julio, 2013) en la
misma zona otra cepa de BUNV (SFAbCrEq238) fue recuperada a partir
del cerebro de un aborto equino.
La obtención del genoma completo mediante técnicas de secuenciación
de última generación (GSFLX 454 e Ion PGM torrent) de las nuevas
cepas de BUNV aisladas durante el brote y su posterior análisis
filogenético mostró que las mismas resultaron ser idénticas entre si
pero diferentes a la cepa CbaAr426 de BUNV. Estudios serológicos
detectaron anticuerpos neutralizantes contra CbaAr426 en mas del 70%
de los caballos convivientes con los equinos muertos y con la hembra
que sufrió el aborto. De acuerdo a la prueba de neutralización cruzada
la cepa CbaAr426 mostro una diferencia de 4 veces en el título de su
suero homólogo respecto a las nuevas cepas aisladas.
Estos hallazgos ponen en evidencia la circulación de nuevas cepas de
BUNV en Argentina y constituyen la primer evidencia de una posible
asociación entre la infección por BUNV y síndrome neurológico en
animales domésticos para Centro y Sudamérica. Por otra parte estos
resultados remarcan la importancia de intensificar la vigilancia
epidemiológica de BUNV para mejorar el diagnostico diferencial y así
poder determinar el verdadero agente etiológico causante de
enfermedad en animales domésticos teniendo en cuenta que en
nuestro país circulan otros virus también asociados a la producción de
síndrome neurológico en equinos.
EPIDEMIOLOGÍA DEL VIRUS DE INFLUENZA EN CERDOS EN LA
REPÚBLICA ARGENTINA. QUEDA UN LARGO CAMINO PARA RECORRER
JA Cappuccio1 2, M Dibarbora1, M D´Angelo1, V Olivera1, A Pereda1
1
Instituto de Virología, CICVyA, INTA, Argentina. 2 Facultad de Ciencias
Veterinarias, UNLP, Argentina.
La epidemiologia de la influenza porcina (IP) presenta diferencias con la
epidemiología de la infección en el hombre, algunas de ellas son:
- Diferente origen de los subtipos en países y continentes.
- La tasa de mutaciones en el cerdo es menor.
- Estudios de campo estiman un R0 de 2 a 7.
Debemos tener esto siempre presente para poder comprender mejor la
epidemiología de la IP
Situación en Argentina:
La IP en Argentina tiene un antes y después de la pandemia de 2009.
Estudios previos a los primeros casos confirmados de IP reportaron
anticuerpos contra cepas humanas o estrechamente relacionadas con
virus humanos desde el año 2002.
Granjas intensivas:
Lamentablemente, aún no se han realizado estudios epidemiológicos
profundos en relación a IP en nuestro país. Similar a lo reportado en
otros países, se considera a la IP como un problema frecuente en
cerdos de destete (afecta generalmente animales de entre 30 y 60
días), menos frecuentemente se observan signos en otras categorías.
La presentación clínica más frecuente es la endémica, reportándose
pocos cuadros epidémicos, asociados a un elevado recambio de plantel
reproductor de granjas previamente infectadas. Siendo también
frecuente la presencia de cuadros subclínicos (se detecta circulación
viral, en ausencia de signos clínicos).
La sobrevida del virus en una granja, difiere según los sistemas de
producción. En sistemas multisitios parece tener lugar mediante el
pasaje continuo entre cerdos susceptibles o el ingreso de nuevas
reproductoras. En los sistemas de único sitio hay quienes la consideran
que es una infección autolimitante. Desde el año 2010 se recibieron
muestras de 56 establecimientos porcinos para detección de virus de
influenza, 26 (46,4%) tuvieron al menos una muestra positiva. Todas las
granjas evaluadas tuvieron anticuerpos anti influenza.
Granjas pequeñas (confinadas, mixtas o a campo):
Se realizó un estudio serológico en 60 establecimientos de productores
porcinos de menos de 100 madres en las provincias de Buenos Aires,
Córdoba, Chaco, Misiones, Tucumán, Neuquén y Rio Negro. De las
mismas 44 (73%) tenían anticuerpos contra virus H1pdm y 6 (10%)
contra H3 porcino de origen humano. Al evaluarlo a nivel animal el 55%
de las cerdas y el 14% de los capones fueron positivos a H1pdm,
mientras que solo el 1,6% de las hembras y capones fueron positivos a
H3. Una sola de las granjas fue positiva por real time PCR.
Caracterización molecular de los aislamientos obtenidos en Argentina
período 2008-2014:
A la fecha se caracterizaron 44 aislamientos. El 68,8% corresponden al
subtipo H1N1pdm. El 11,3% pertenecen al subtipo H3N2 y 15,9% al
subtipo δ2 H1N1. Otros subtipos identificados fueron el δ2 H1N1 y un
recombinante H3N2.
Conclusiones:
Queda mucho trabajo por hacer para entender mejor la epidemiología
de la IP en nuestro país. El tipo y tamaño de la explotación afecta la
persistencia del virus en la granja. El uso masivo de vacunas podría
ayudar a estabilizar inmunológicamente a la población porcina.
RABIA EN MURCIÉLAGOS DE ARGENTINA
DM Cisterna
Servicio de Neurovirosis, INEI-ANLIS Malbran, Argentina.
La rabia es una enfermedad mortal prevenible mediante vacunación
producida por el virus rábico (RABV) perteneciente al género Lyssavirus
de la familia Rhabdoviridae. Se distinguen dos ciclos epidemiológicos:
urbano y selvático. La rabia urbana tiene como principal reservorio al
perro. En cambio, en la rabia silvestre intervienen varias especies
animales según el nicho ecológico; el virus permanece en su ciclo
enzoótico y tiene dos formas: la terrestre, donde intervienen una gran
variedad de mamíferos silvestres y la aérea, mantenida por los
quirópteros o murciélagos.
En Argentina, el control de la rabia canina ha puesto de manifiesto la
importancia de la rabia silvestre transmitida por murciélagos
insectívoros y hematófagos. La rabia por murciélagos insectívoros, se
extiende a lo largo de todo el país. La prevalencia en los centros
urbanos oscila entre el 3-6%, aunque estos valores pueden estar
influidos por diversos sesgos. El análisis antigénico y genético de una
colección de cepas de rabia de Argentina obtenidas de diferentes
30
Libro de resúmenes
especies de murciélagos insectívoros reveló patrones epidemiológicos
complejos caracterizados por la presencia de múltiples ciclos
endémicos mantenidos por sus reservorios. Estos ciclos son afectados
por los diversos aspectos ecológicos de los murciélagos tales como
conducta social, patrones migratorios y hábitat natural.
La rabia por murciélagos vampiros o rabia paresiante es transmitida por
el murciélago Desmodus rotundus. Es una enfermedad epidémica,
regional, focal y recurrente, cuya área endémica en Argentina abarca la
totalidad de las provincias de Misiones, Chaco y Formosa y parte de las
de Salta, Jujuy, Tucumán, Catamarca, Santiago del Estero, Santa Fe y
Corrientes. El análisis filodinámico de la estructura poblacional del virus
rábico en Argentina asociado a esta especie reveló una estructura
temporal y geográfica influida por las condiciones climáticas,
topográficas y biogeográficas.
El discernimiento de los ciclos de transmisión rábica en los que
participan estas especies es de relevancia para la identificación de áreas
de riesgo humano y animal y en la elaboración de estrategias de control
de la rabia.
posteriormente modificada mediante manipulación genética para
introducir los correspondientes marcadores antigénicos. La cepa
candidata fue posteriormente evaluada como vacuna en diferentes
ensayos de efectividad, protegiendo cerdos primo-vacunados a
diferentes tiempos post-vacunación, así como demostrando la
funcionalidad de sus marcadores antigénicos. Para finalizar, se discutirá
la factibilidad de introducir mejoras en la cepa desarrollada, tanto
como la validez y aplicabilidad de la estrategia utilizada.
11:45 – 13:15 hs. MESA REDONDA SV4: ENFERMEDADES
VIRALES EN ANIMALES DE PRODUCCIÓN NO CONVENCIONAL
Coordinadores:
Maximiliano Wilda. Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. Cesar
Milstein", CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Mariano Bacci. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad
Agroalimentaria (SENASA), Ciudad Autónoma de Buenos Aires,
Argentina.
10:30 – 11:15 hs. CONFERENCIA SV2
Manuel Borca. Plum Island Animal Disease Center, Agriculture
Research Service, United States Department of Agriculture,
Greenport, Nueva York, EE.UU.
DESARROLLO DE UNA VACUNA CONTRA LA PESTE PORCINA CLÁSICA
MEDIANTE
LA
IDENTIFICACIÓN
Y
MANIPULACIÓN
DE
DETERMINANTES GENÉTICOS DE VIRULENCIA DEL VIRUS.
M Borca
Plum Island Animal Disease Center, Agriculture Research Service, United
States Department of Agriculture, Greenport, Nueva York, Estados
Unidos.
La peste porcina clásica (PPC) es una grave enfermedad que afecta
principalmente al cerdo domestico. Debido a su importancia
epidemiológica, la enfermedad es de denuncia obligatoria. Su
presentación clínica es de gravedad variable, dependiendo en gran
medida de la cepa viral actuante. La PPC es causada por un virus
pequeño, envuelto, con un genoma compuesto por una cadena simple,
relativamente pequeña (aproximadamente 12Kb) de RNA de polaridad
positiva. El genoma codifica para una poliproteína que una vez
procesada en el citoplasma celular, da origen a 4 proteínas
estructurales y 7 no estructurales. La cápside viral está formada por una
de las proteínas estructurales, Core, mientras que las otras tres, las
glicoproteínas E0, E1 y E2 están asociadas con la envoltura. La
prevención de la enfermedad tradicionalmente se obtiene mediante la
utilización de vacunas basadas en cepas virales atenuadas. Estas
vacunas a pesar de ser altamente efectivas (protegen desde una
semana de administradas), carecen de marcadores antigénicos que
permitan diferenciar animales vacunados de aquellos infectados con
cepas virales de campo. Esta problemática demandó el desarrollo de
vacunas antigénicamente marcadas (VAM). La primera VAM se basó en
el uso de la glicoproteína E2 (que concentra la mayoría de los epitopes
inductores de anticuerpos protectores) expresada en baculovirus. La
vacuna resultó eficaz aunque la inducción de inmunidad demandaba al
menos 3 semanas. Esto desembocó en la necesidad de desarrollar VAM
utilizando cepas virales atenuadas. Esta presentación describe la
estrategia seguida en nuestro laboratorio en el desarrollo racional de
una cepa vacunal atenuada conteniendo marcadores antigénicos. La
estrategia general consistió en la identificación de marcadores
genéticos de virulencia (MGV), áreas del genoma críticas en el proceso
de patogénesis viral. Se emplearon diferentes estrategias a partir de un
clon infeccioso codificante para una cepa viral altamente virulenta,
Brescia. Se discutirán brevemente las estrategias utilizadas, incluyendo
genómica comparativa y estructural, genética funcional e interacción
proteica, y sus implicancias en términos de alteración de la virulencia
viral. La información obtenida fue utilizada para el desarrollo racional
de cepas atenuadas, algunas de ellas conteniendo combinaciones de
MGV, las que fueron evaluadas como vacunas experimentales. A partir
de la información obtenida, la cepa vacunal desarrollada fue
Panelistas:
Francisco José Reynaldi. Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias
Veterinarias, UNLP, La Plata, Argentina.
Fernando Raibenberg. Dirección de Acuicultura, Ministerio de
Agricultura, Ganadería y Pesca, Ciudad Autónoma de Buenos Aires,
Argentina.
Andrea Marcos. Dirección Nacional de Sanidad Animal, SENASA,
Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
VIRUS QUE AFECTAN A LAS ABEJAS DE ARGENTINA.
FJ Reynaldi1 2, GH Sguazza1, RS Castilla2 3, MRI Pecoraro1, CM Galosi1 3
1
Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP,
Argentina. 2 CCT - CONICET La Plata, Argentina. 3 CIC PBA, Argentina.
La producción apícola resulta una actividad agrícola primordial no solo
por la producción de miel sino también por el rol que cumplen las
abejas como polinizadores en cultivos industriales y plantas silvestres.
La polinización, asegura la reproducción sexual en la mayoría de la
plantas con flores, garantizando la sustentabilidad productiva y el
mantenimiento de la biodiversidad de la mayoría de los ecosistemas
terrestres. Desde el punto de vista económico, Argentina es un
importante productor de miel, en la actualidad, ocupa el 5º lugar como
productor mundial con 60 miles de toneladas por año.
Las abejas melíferas son susceptibles de padecer enfermedades
causadas por parásitos, hongos, bacterias y virus. También pueden
verse afectadas por diversas plagas, depredadores y factores
ambientales adversos (incluida la acción del hombre).
En 2006, comenzó a producirse a gran escala, pérdidas inexplicables de
abejas en diferentes partes del mundo, que afectaron negativamente la
producción apícola global. El fenómeno, denominado “Síndrome de
despoblamiento de las colmenas” (SDC), fue en parte responsable de la
disminución de la producción mundial de miel, y en la actualidad, el
SDC sigue siendo un problema para la producción y el comercio de
miel; particularmente en Estados Unidos y la Unión Europea, que han
sido las regiones más afectadas. En Argentina sólo se han reportado
esporádicos casos con sintomatología similar a la descripta para SDC.
En el mundo hasta el presente se han identificado 22 virus de abejas
que infectan las colonias. La mayoría de estos virus tienen un genoma
de ARN de simple cadena con polaridad positiva y son clasificados como
virus tipo Picornavirus. En Argentina, desde que se iniciaron los
estudios en el año 2008 se han detectado 7 virus; Virus Israel de la
Parálisis Aguda (IAPV), Virus de las Alas deformadas (DWV), Virus de la
Parálisis Crónica (CBPV), Virus de la Cría Ensacada (SBV), Virus de las
Celdas Reales Negras (BQCV), el Virus de la Parálisis Aguda (ABPV) y el
Virus de Kashmir (KBV). Si bien muchos de estos virus con frecuencia
existen en la colonia como infecciones latentes pueden multiplicarse
rápidamente bajo condiciones de estrés y causar enfermedad. Esto
ocurre a menudo, cuando la colonia se ve comprometida por factores
de estrés externos tales como la infestación con el ácaro Varroa
31
Libro de resúmenes
destructor, que también pueden transmitir alguno de estos virus y la
alteración de la función inmune del huésped. Ya que los efectos de la
infección viral no siempre son observables, existe un reto en el
diagnóstico y seguimiento de las infecciones por estos agentes. El
conocimiento de la incidencia y diseminación de cada uno de estos
virus en Argentina, es vital para intentar la prevención de futuras
epizootias, permitiendo un control más efectivo de estas
enfermedades.
ENFERMEDADES VIRALES DE ANIMALES ACUÁTICOS DE INTERÉS EN
ACUICULTURA.
FC Raibenberg
Dirección de Acuicultura, Subsecretaria de Pesca y Acuicultura,
Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca, Argentina.
El crecimiento sostenido de la acuicultura mundial constituye uno de
los cambios más importantes en la producción global de agroalimentos
de los últimos 50 años. Impulsada por el crecimiento demográfico, el
progresivo aumento de la demanda de pescado y mariscos (Fish food),
y la limitada capacidad de la pesca extractiva para satisfacer tal
demanda, han estimulado la rápida expansión de los cultivos de
animales acuáticos para convertir al sector acuícola, en una industria de
importancia internacional. La acuicultura figura actualmente como una
parte integral de la economía de varios países (China, India, Noruega,
Chile). Provee empleos y ha promovido el desarrollo socio económico
en regiones rurales y comunidades costeras de escasos recursos,
particularmente en Asia, aliviando la presión de la pesca tradicional
sobre la sustentabilidad de ríos, lagos, y océanos. En Argentina, si bien
la producción es de bajo volumen (4000 ton/2013), viene aumentando
(27 % interanual 2012-13).
Una gran variedad de especies de animales acuáticos se cultivan en
sistemas de mediana a alta densidad en aguas continentales y marinas
donde se ven expuestas a nuevos ambientes, en consecuencia a
potenciales nuevas enfermedades. El stress del cautiverio, las dietas
artificiales no balanceadas, y un manejo no adecuado pueden
comprometer la inmunidad de los animales acuáticos para combatir las
infecciones. Asimismo, las prácticas de cultivo intensivo pueden
favorecer la rápida propagación de las enfermedades. El prolífico
comercio internacional a través del movimiento de animales acuáticos
vivos, y sus productos que pueden estar infectados o ser portadores de
agentes virales viables, es y continúa siendo la principal causa de
dispersión de enfermedades virales. Dicho escenario constituye una
amenaza significativa para los cultivos, y las poblaciones silvestres de
todo el mundo.
Los virus de animales acuáticos de interés en acuicultura tienen
importancia debido a las pandemias y pérdidas económicas que
generan. Varios virus ARN y ADN que infectan peces, crustáceos, y
moluscos de importancia para la acuicultura han sido identificados, y
estudiados en los últimos 20 años.
En esta revisión se presenta un panorama general de los agentes
etiológicos virales que afectan los cultivos de animales acuáticos y
como los virus que producen mayor impacto constituyen un factor
limitante para la expansión de la acuicultura mundial. Además se
describe la situación particular de la Argentina y los programas de
vigilancia epidemiológica de enfermedades virales de animales
acuáticos que están vigentes y en desarrollo por parte de la autoridad
nacional competente, el Servicio Nacional de Sanidad y Calidad
Agroalimentaria SENASA en convenio de cooperación técnica con la
Dirección de Acuicultura, de la Subsecretaria de Pesca y Acuicultura, del
Ministerio de Agricultura Ganadería y Pesca de la Nación.
VIRUS EN CAMÉLIDOS SUDAMERICANOS Y CIERVOS DE PRODUCCIÓN
A Marcos
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria, Argentina.
Si bien la producción predominante en nuestro país es la producción
bovina, existen otras producciones no convencionales. Estas
producciones se caracterizan por ser de menor tamaño y estar
asociadas a alguna región del país.
En el caso de los camélidos es una producción que permite aprovechar
zonas marginales. La distribución de la producción depende de la
especie. Las vicuñas y las llamas se encuentran en el Noroeste
Argentino, principalmente en la provincia de Jujuy. La explotación de
guanacos, en cambio, se realiza en la Patagonia, en mayor cantidad en
Santa Cruz. Los productos obtenidos son la fibra y la carne, que se
comercializan a nivel local y regional.
La producción de ciervos colorados se concentra en Buenos Aires, La
Pampa y San Luis. Los productos obtenidos en su mayoría se exportan,
ya sea la carne, menudencias y otros incomestibles (por ejemplo astas).
Existen antecedentes mundiales de virus detectados en ciervos
colorados y camélidos sudamericanos de producción. Algunos de los
virus que pueden afectar a los ciervos y camélidos de producción son:
Herpesvirus, Adenovirus, Poxvirus, Picornavirus, Reovirus, Pestivirus,
Rabdovirus, Rotavirus y Coronavirus. La Fiebre Catarral Maligna
(Herpesvirus) es una de las principales enfermedades virales que
afectan a los ciervos de producción en Norteamérica. Otro Herpesvirus
que puede afectar tanto a ciervos como camélidos es el que produce la
Rinotraqueítis Infecciosa Bovina. El Adenovirus produce la Enfermedad
Hemorrágica en ciervos, detectada en Canadá, y el Poxvirus
(Parapoxvirus) que provoca enfermedad en ciervos solo ha sido
detectado en Nueva Zelanda. La Fiebre Aftosa (Picornavirus) es una
enfermedad que puede afectar a todos los animales biungulados, como
los ciervos. Hay dos enfermedades producidas por Reovirus, Lengua
Azul y Enfermedad Hemorrágica Epizoótica, la primera distribuida
mundialmente y la segunda que afecta cérvidos de Norteamérica. La
Diarrea Viral Bovina, producida por un Pestivirus, está ampliamente
distribuida en bovinos y puede afectar a ciervos y camélidos. La rabia,
producida por un Rabdovirus, se encuentra presente en la zona centronorte de nuestro país y podría afectar tanto a ciervos como camélidos.
En nuestro país existen antecedentes en camélidos de anticuerpos
contra Rotavirus, virus de la Diarrea Viral Bovina, virus de la
Rinotraqueítis Bovina Infecciosa.
Desde SENASA se han realizado monitoreos serológicos en estas
producciones. De 856 camélidos analizados entre 2010 y 2013 todos
resultaron negativos a anticuerpos contra Fiebre Aftosa ni Lengua Azul.
El 28,27% resultó positivo a anticuerpos contra Diarrea Viral Bovina. De
245 ciervos analizados entre 2008 y 2013 no se detectaron anticuerpos
contra Fiebre Aftosa, Lengua Azul ni Diarrea Viral Bovina, pero el 7%
resultaron positivos a la detección de anticuerpos contra el virus de la
Rinotraqueítis Infecciosa Bovina. Se puede suponer que la fuente de
infección serían los animales de producción convencionales.
32
Libro de resúmenes
Posters
Martes 23 de junio
Sala C (Petit Dorée - 1º piso)
13:45 - 15:15 hs.
Evolución
0008
EVIDENCIA DE RECOMBINACIÓN HOMOLOGA EN VIRUS
CHIKUNGUNYA
PE Casal1, D Chouhy1 2, EM Bolatti2, GR Perez1, EJ Stella2, AA Giri1 2
1
Área Virología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas,
Universidad Nacional de Rosario, Argentina. 2 Grupo de Virología
Humana, IBR-CONICET/Universidad Nacional de Rosario, Argentina.
El Virus Chikungunya (CHIKV; Togaviridae: Alphavirus), es un arbovirus
transmitido por mosquitos que causa fiebre aguda y dolor de las
articulaciones en los seres humanos. Recientemente, diversos brotes
endémicos de CHIKV han puesto en peligro la salud pública en
numerosas regiones geográficas del mundo, causando millones de
casos en más de 50 países. Si bien en Argentina hasta el momento no
se han registrado casos de fiebre Chikungunya autóctonos, existe un
brote epidémico que abarca numerosos países del Caribe, América
Central y Sudamérica.
En este trabajo, se analizaron las asociaciones filogenéticas de las cepas
de CHIKV depositados en la base de datos GenBank y se exploraron los
posibles eventos de recombinación en 152 aislamientos genómicos.
Mediante análisis Bayesiano se definieron los tres genotipos de CHIKV
[West African, Asian, East/Central/South African (ECSA)], y se obtuvo
una clara división del genotipo ECSA en tres subgrupos (I-II-III).
Resultados similares se obtuvieron utilizando secuencias de genomas
completos y del gen E1. Para facilitar la clasificación de CHIKV dentro
del clado ECSA aquí proponemos un valor de corte basado en la
identidad nucleotídica que se puede aplicar, ya sea en el análisis de
genomas completos, así como en el del gen E1. Sucesivamente se
exploraron posibles eventos de recombinación utilizando siete métodos
bioinformáticos (RDP, GENECONV, BootScan, MaxChi, CHIMAERA,
SIScan, 3Seq). Este análisis permitió identificar un evento
estadísticamente significativo (rango de p: 1.14x10-7 - 4.45x10-24)
situado dentro de la región codificante de la proteína no estructural 3
(nsP3). Este hallazgo se confirmó mediante la construcción de redes
filogenéticas usando el programa SplitTree (Test PHI, p = 0,004) y por el
análisis de incongruencias filogenéticas. La cepa recombinante,
KJ679578/India/2011 (ECSA III), fue aislada del suero de un paciente
visitando Calcuta (India) y deriva de cepas pertenecientes a los
subgrupos ECSA III y ECSA I. El virus recombinante carece de las
sustituciones adaptativas (primera, E1-A226V; segundas, E2-E2-K252Q y
L210Q) de CHIKV en Aedes albopictus, lo que sugiere que la cepa
KJ679578/India/2011 se ha transmitido principalmente por Aedes
aegypti. En conclusión, este estudio demuestra por primera vez a la
recombinación como un mecanismo adicional de diversidad genética en
CHIKV, y podría facilitar el proceso de transmisión inter-especies.
0058
ANALISIS DEL GENOMA COMPLETO DE UNA CEPA INUSUAL G3P[3] DE
ROTAVIRUS GRUPO A EN PACIENTE SINTOMATICA: EVIDENCIA DE
REORDENAMIENTO A PARTIR DE MULTIPLES ESPECIES
JI Degiuseppe1, IM Silveyra2, EA Reale1, JA Stupka1
1
Laboratorio de Gastroenteritis Virales. INEI ANLIS “Dr. Carlos G.
Malbrán”. CABA, Argentina. 2 Servicio de Microbiología. Hospital
"Gobernador Centeno". La Pampa, Argentina.
Los rotavirus del grupo A son los principales agentes etiológicos de
diarrea aguda en los menores de 5 años. Su genoma está compuesto
por once segmentos de RNA de doble cadena, rodeado por una triple
cápside proteica. Esta naturaleza segmentada le permite experimentar
fenómenos de reordenamiento intergénico en condiciones de
coinfección con dos o más cepas de rotavirus.
Convencionalmente, los rotavirus del grupo A se clasifican de acuerdo a
la caracterización molecular de los genes que codifican para las
proteínas de la capa externa de la cápside (VP7 y VP4, para el G y el P
tipo, respectivamente). A pesar de que hasta el momento se han
descripto 27 G y 37 P tipos, más del 90% de los rotavirus que producen
diarrea en humanos corresponde a 5 asociaciones: G1P[8], G2P[4],
G3P[8], G4P[8] y G9P[8].
En el año 2013, en el contexto de la vigilancia nacional de genotipos
circulantes de rotavirus, se detectó la asociación G3P[3] en una
paciente sintomática de 2 meses de edad en la provincia de La Pampa.
Para establecer el posible origen de esta cepa inusual, se secuenciaron
y analizaron los once segmentos genómicos de acuerdo a las
recomendaciones del Rotavirus Classification Working Group (RCWG).
La cepa estudiada presentó la constelación genómica G3P[3]-I2-R5-C2M3-A9-N2-T3-E3-H6. El genotipo G3 agrupó dentro del linaje III, a
diferencia de los G3 detectados comúnmente en humanos (linaje I). Los
análisis filogenéticos demostraron una elevada similitud global (9/11
genes) con cepas de rotavirus de origen felino/canino y,
particularmente, con una cepa detectada en un niño de pueblos
originarios de Estados Unidos. Por otra parte, dos genes (VP6 y VP1) se
relacionaron con cepas de origen bovino y de animales del orden
Artiodactyla. Es importante destacar que el genotipo R5 (gen VP1)
solamente fue detectado circulando en alpacas en Perú y en guanacos,
cabras y vacas en Argentina. Por lo tanto, para nuestro conocimiento,
este estudio constituye el primer reporte de detección de este genotipo
en humanos.
Estos resultados indican que la cepa se originó a partir de múltiples
eventos de reordenamiento entre dos o más especies animales y,
posteriormente, produjo infección sintomática en el humano.
Asimismo, al no observarse diseminación, se refuerza la hipótesis de
que este tipo de asociaciones inusuales no presenta ventajas de
adaptabilidad frente a las asociaciones más frecuentes.
Consideramos importante esta clase de estudios debido a que
contribuyen al conocimiento de la compleja dinámica evolutiva de este
enteropatógeno.
0090
EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DEL VIRUS PARAINFLUENZA HUMANO
TIPO 3, EN UN PERIODO DE 5 AÑOS (2009-2013) EN BUENOS AIRES,
ARGENTINA
S Goya, A Mistchenko, M Viegas
Laboratorio de Virología del Hospital de Niños Dr. R. Gutiérrez,
Argentina.
El virus parainfluenza humano tipo 3 (HPIV3) pertenece al género
Respirovirus, familia Paramixoviridae. Es la segunda causa de
infecciones respiratorias agudas bajas, como bronquiolitis y neumonía,
en los pacientes menores de 2 años en nuestro país, siendo superado
solo por el virus sincicial respiratorio. Tiene un genoma ARN de
polaridad negativa que codifica para 6 proteínas estructurales, entre
ellas la glicoproteína Hemaglutinina-Neuraminidasa (HN). La HN es la
proteína que presenta la mayor variabilidad de secuencia en el virus y
por eso es la escogida para la caracterización molecular de los HPIV3.
Recientemente dos autores fueron los que, en base a la variabilidad del
gen de la HN y utilizando el cálculo de distancias genéticas, clasificaron
al virus en clusters, subclusters y linajes genéticos. En este trabajo se
analizaron las muestras de pacientes de 0 a 5 años de edad,
hospitalizados con diagnóstico clínico de infección respiratoria agua
baja que fueron positivas por inmunofluorescencia para el HPIV3
correspondientes al periodo 2009-2013. Se secuenció el extremo
carboxilo terminal del gen de la HN en 89 muestras con un tamaño de
fragmento analizado de 858 nt (que corresponde a la región de mayor
variabilidad del gen). El análisis filogenético por inferencia bayesiana
mostró que todas las cepas analizadas se clasificaron dentro del cluster
C, y dentro de éste en los subclusters C1, C3 y C5; de los cuales el C3
resultó ser el predominante durante todo el período analizado. Se
definieron nuevos linajes genéticos de circulación local dentro del
subcluster C3. Se observó que no existe un patrón de circulación
definido para este virus ya que existe cocirculación de subclusters y de
linajes a nivel regional, circulación paralela de linajes en regiones
33
Libro de resúmenes
distantes del mundo y circulación actual de linajes detectados hace 10
años en nuestra región y en el mundo. Se realizó un análisis de
variabilidad y predicción de epitopes con recursos bioinformáticos y se
encontraron mutaciones no sinónimas que se ubicaron dentro de
probables epitopes B lineales. Las mismas se ubicaron en el modelo
molecular realizado a partir de secuencias obtenidas en nuestro
laboratorio y junto con evaluaciones pertinentes se confirmó que se
ubicarían en la superficie de la proteína, expuestas hacia el exterior del
virus, y susceptibles de ser reconocidas por el sistema inmune, por lo
cual podrían ser un posible mecanismo de evasión del virus. Todas
estas mutaciones no sinónimas que formarían parte de epitopes B
lineales ocurren en secuencias que clasificaron dentro de los nuevos
linajes locales descriptos en este trabajo. Por lo tanto, la información
que proporciona este trabajo a nivel local, junto con análisis de otras
partes del mundo, permitirá evaluar si la composición de la vacuna a
virus vivos y atenuados que se encuentra actualmente en ensayos de
fase clínica I será efectiva para proteger a los pacientes pediátricos
contra los virus que circulan en nuestra región.
0102
COMPARTIMENTACION DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C EN PACIENTES
CON HEPATOCARCINOMA
PS Perez1, O Galdame2, E Mullen2, B Livellara2, A Gadano2, DM
Flichman1, RH Campos1
1
Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA,
Argentina. 2 Hospital Italiano Buenos Aires, Argentina.
El virus de la Hepatitis C (HCV) posee alta variabilidad genética en cada
paciente infectado, posibilitando un comportamiento de cuasiespecies.
La infección crónica por HCV puede conducir, en última instancia, al
desarrollo de hepatocarcinoma (HCC). Esto se debe, entre otras causas,
a proteínas virales que interactúan con vías intracelulares
potencialmente oncogénicas. Entre ellas, Core se ha asociado a
transformación celular. Además, la variabilidad de la glicoproteína E2
responde a la acción del sistema inmune en el proceso de
carcinogénesis. Estudios de estas proteínas arrojaron evidencias
contradictorias sobre la existencia de compartimentación de las
poblaciones del HCV en los tejidos hepáticos tumorales (T) y no
tumorales (NT).
El objetivo de este trabajo fue evaluar la compartimentación viral en 4
pacientes con HCC infectados por HCV-1b.
Se amplificaron por RT-PCR las regiones de Core y E2 de suero, tejido
hepático T y NT de los 4 pacientes. Los amplicones fueron clonados; las
481 secuencias obtenidas se analizaron filogenéticamente por máxima
verosimilitud y se evaluó estadísticamente la compartimentación en un
marco bayesiano. Se evaluaron los patrones de aminoácidos (aa)
característicos de cada compartimento.
El análisis filogenético mostró un comportamiento particular para cada
paciente. En el caso 1, los clones de cada muestra agruparon por
separado mostrando clara compartimentación. El caso 2 fue similar,
pero un bajo número de clones resultaron entremezclados. En el caso
3, las secuencias de suero agruparon juntas; mientras que en los clones
de los tejidos se observaron 2 linajes, representados en ambos
compartimentos T y NT. Por último, en el caso 4, todos los clones se
entremezclaron, aunque se observó cierta asociacion entre aquellos del
mismo compartimento. El análisis bayesiano validó estadísticamente,
en los 4 casos y en ambas regiones, la distribución asimétrica de las
variantes virales en los compartimentos analizados. Finalmente, el
análisis de aa reveló un patrón diferencial entre tejidos T y NT en todos
los casos en la región de E2, pero sólo en los casos 1 y 2 en Core.
En conclusión, los análisis filogenético y bayesiano permitieron
demostrar la existencia de compartimentación viral en los tejidos
hepáticos T y NT. Además, el análisis de aa reveló patrones
característicos de cada compartimento hepático. Estas diferencias
podrían responder, en E2, a una acción diferencial del sistema inmune
frente a las células T y NT mientras que en Core podrían relacionarse
con la regulación de genes celulares que contribuyen a la
carcinogénesis. Si bien la situación fue distinta para cada paciente,
ambas proteínas presentaron posiciones de aa propias cuyo posterior
estudio podría contribuir al conocimiento del proceso de
carcinogénesis mediado por la infección con HCV.
0115
DINÁMICA INTRAHUÉSPED DE CEPAS DE HIV-1 CON DISTINTOS
TROPISMO POR SECUENCIACIÓN MASIVA.
MF Fernández1, M Distéfano1, J Sfalcin2, S Baquedano2, F Fay2, A
Mangano1, L Sen1, P Aulicino1
1
Laboratorio de Biología Celular y Retrovirus, Hospital de Pediatría
¨Juan P. Garrahan¨, Argentina. 2 Laboratorio CIBIC, Rosario, Argentina.
Las cepas de HIV-1 pueden caracterizarse como X4 o R5 en función de
su tropismo, que puede predecirse a partir de la secuencia del loop V3
(env) o determinarse in vitro, siendo las cepas formadoras de sincicios
(SI) las que usan CXCR4 (X4) y no formadoras de sincicios (NSI) las que
usan CCR5 (R5). La caracterización del tropismo viral ha cobrado
importancia clínica para el tratamiento con drogas bloqueantes del
CCR5 que impiden la replicación únicamente de los virus R5. En un
estudio previo, hallamos discordancia entre el fenotipo caracterizado in
vitro y la proporción de variantes X4 y R5 encontradas por clonado
molecular.
Nos propusimos caracterizar con mayor profundidad la diversidad de
las variantes de HIV-1 en un individuo infectado por transmisión
vertical utilizando la técnica de secuenciación masiva. Además,
comparamos distintos compartimentos que representan cepas virales
históricas (CMT) o circulantes (plasma) y cepas aisladas de co-cultivo.
Se amplificó un fragmento de 633pb del gen env de HIV-1 –incluyendo
105pb correspondientes a la región hipervariable loop V3- de muestras
de células mononucleares totales (CMT), plasma (P) y sobrenadante de
co-cultivo (SN) previamente estudiado fenotípicamente en tres tiempos
post-infección: t1 (SI, 9 años) t2 (NSI, 10 años) y t3 (SI, 11 años). Se
secuenciaron las cuasiespecies virales con el equipo 454 GS-FLX
(Roche). Para la predicción del tropismo viral, se analizó la secuencia
del loop V3 con la herramienta bioinformática PSSM. Las cuasiespecies
representativas se obtuvieron con el software QuRe, utilizando el
fragmento completo del env. Las relaciones filogenéticas se evaluaron
por Neighbor-Joining con el programa MEGA 6.0.
En todas las muestras excepto P3, se analizaron de 2000 a 7000
secuencias. En los 3 tiempos, se encontró predominio neto de variantes
X4 (>98%) y una mínima proporción de variantes R5 en todos los
compartimentos (P, CMT y SN). La alta frecuencia de cepas X4
encontradas en t2 fue discordante con el fenotipo NSI. En el árbol
filogenético, las secuencias del fragmento env completo no se
agruparon de acuerdo al tropismo viral en el loop V3. Sin embargo, se
observaron diferencias en la evolución de las cuasiespecies asociadas al
fenotipo viral (SI/NSI): mientras que las variantes presentes en SN de t1
y t3 fueron similares entre sí, las presentes en SN de t2 fueron
divergentes y no se encontraron representadas en muestras de P o
CMT del paciente de ningún tiempo,
Si bien en el paciente estudiado se observaron cambios en el fenotipo
del HIV-1 “in vitro” en función del tiempo de infección, éstos cambios
no fueron evidenciados en las secuencias del loop V3 (principal
determinante del tropismo viral). Sin embargo, los cambios evolutivos
en el gen env sugieren la contribución de otros determinantes
genotípicos -aún no identificados- al tropismo viral.
0131
EVOLUCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C EN UN PACIENTE
COINFECTADO CON EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA
QUE NO RESPONDE A LA TERAPIA ANTIRETROVIRAL
F Di Lello1, A Culasso1, C Parodi2, P Baré2, R Campos1, G García1
1
Cátedra de Virología, FFyB, UBA., Argentina. 2 Laboratorio de
Virología, Academia Nacional de Medicina, Argentina.
Durante la coinfección con los virus de hepatitis C (HCV) y de la
inmunodeficiencia humana (HIV), la terapia antiretroviral de gran
actividad (TARGA) puede modificar la evolución del HCV, al disminuir la
carga viral del HIV, aumentar el número de CD4 (respondedor
inmunológico) y favorecer la reconstitución del sistema inmune. Sin
embargo, en algunos individuos tratados, se ha evidenciado el aumento
del número de CD4, sin una disminución de la carga viral de HIV (no
respondedor virológico). Debido a que es limitado el conocimiento de
la evolución viral en estos individuos, el objetivo de este trabajo fue
investigar cómo la TARGA afecta la evolución molecular del HCV y
analizar su relación con la actividad del sistema inmune en un paciente
34
Libro de resúmenes
con estas características (respondedor inmunológico, no respondedor
virológico). Para ello, se realizó un estudio longitudinal donde se estimó
la presión selectiva ejercida por el sistema inmune (recuento de CD4 y
carga viral de HIV) sobre la variabilidad genética del HCV, a partir de 7
muestras de suero obtenidas en un período de 10 años. Los cambios en
las poblaciones virales del HCV fueron estudiados mediante el análisis
de diversidad (media de la distancia genética ± desvio standard) y
complejidad (entropía normalizada de Shannon) en 123 secuencias de
clones de las regiones hipervariables 1, 2 y 3.
Durante todo el seguimiento, el paciente presentó una carga viral
detectable para HIV con un valor promedio de 12589 (1659-63095)
copias/ml. La muestra basal (M1) al inicio de la TARGA, presentó el
menor recuento de CD4 (222 cel/μl), diversidad intragrupo (0,004
±0.001) y complejidad (0,27) para HCV, de todo el período en estudio.
En las cinco muestras siguientes (M2-M6), obtenidas a los 10, 48, 58, 65
y 76 meses de TARGA, el número de CD4 aumentó y permaneció
estable por encima de 500 cel/μl. En paralelo, un incremento en la
variabilidad genética de HCV se observó en los valores de diversidad de
M2, M3, M4 y M5 (0,008 ±0,002; 0,020 ±0,004; 0,017 ±0,003 y 0,014
±0,002) y complejidad (0,50; 0,73; 0.85 y 0.82), respectivamente. Al
suspender el tratamiento se obtuvo la muestra M6, en la cual
disminuyeron los valores de complejidad (0,010 ±0,003) y diversidad
(0,62). De manera similar se comportó la muestra (M7), obtenida 35
meses luego de suspendida la TARGA. Presentó una disminución de los
CD4 (300 cel/µl) y al igual que M6, una reducción en los valores de
diversidad (0,012 ±0,002) y complejidad (0,67), que también indicaría
una población viral menos heterogénea. Estos resultados fueron
soportados por el estudio de Coalescencia Bayesiana donde se observó
la menor diversidad viral en M1 y M7 (sin TARGA) y la mayor en las
muestras M2 a M6.
En conclusión, en nuestro paciente, la TARGA determinó el incremento
de los valores de CD4 y esto se correspondió con un aumento en la
diversificación viral del HCV. Esto estaría asociado a una mayor
actividad del sistema inmune, aún en presencia de una carga viral
detectable del HIV.
0182
EVOLUCIÓN DE LA PROTEÍNA LATENTE DE MEMBRANA 1 DEL VIRUS
DE EPSTEIN BARR
M Gantuz1, M Lorenzetti1, J Altcheh2, E De Matteo3, P Chabay1, MV
Preciado1
1
Laboratorio de Biología Molecular, División Patología, Hospital de
Niños R. Gutiérrez, Argentina. 2 Servicio de Parasitología y Enfermedad
de Chagas, Hospital de Niños R. Gutiérrez, Argentina. 3 División
Patología, Hospital de Niños R. Gutiérrez, Argentina.
El Virus de Epstein Barr (EBV) es un gamaherpesvirus linfotrópico,
agente etiológico de la Mononucleosis infecciosa (MNI), asociado a
diversas neoplasias. La Proteína Latente de Membrana 1 (LMP1) es la
proteína viral con mayor capacidad oncogénica, simula al receptor
celular CD40 constitutivamente activo de una forma independiente de
ligando, para estimular múltiples vías de señalización promoviendo así
el crecimiento y la transformación celular e inhibición de la apoptosis.
LMP1 es una de las proteínas del EBV con mayor variabilidad genómica,
incluso la intra-individuo fue comparable con la observada en la
infección inicial por ciertos ARN virus como West Nile Virus o HIV. Las
causas por las cuales el EBV contribuye a la patogénesis de diferentes
procesos neoplásicos están aún en discusión, la identificación de
variantes específicas de LMP1 asociadas a tumores aportaría algunas
respuestas a este interrogante. El objetivo fue estudiar la diversidad y
evolución de las variantes de LMP1 circulantes en Argentina y
determinar su asociación a neoplasias en pacientes pediátricos. En
muestras pediátricas EBV+ (20 de sangre periférica de MNI, 27 biopsias
ganglionares de linfomas y 14 de hiperplasia reactiva), se amplificó el
gen BNLF1 (proteína LMP1) completo por PCR anidada. Se realizó la
reconstrucción filogenética por Máxima Verosimilitud (PhyML)
incluyendo aislamientos de GenBank. La fecha de toma de muestra
(desde 1972 a 2013) se utilizó como tiempo de calibración para inferir
la tasa de evolución y el tACMR utilizando BEAST 2.0. La Selección
Molecular se analizó con HyPhy en el servidor web Datamonkey. Se
identificó un grupo de aislamientos mayoritario (47,54%) relacionado a
la variante Raji, que resultó de circulación predominante en nuestra
región y en menor medida otras variantes previamente descriptas
como B95.8, Alaskan y China2. No se observó asociación entre las
variantes filogenéticas y alguna de las condiciones patológicas
estudiadas, dado que las mismas se distribuyeron uniformemente entre
los grupos con condición benigna, maligna y portadores sanos. El
análisis filogeográfico incluyendo aislamientos de otras regiones del
mundo mostró una estructura compleja en la cual algunas variantes
mostraron distribución global y otras restringida a una región, como la
variante argentina y las asiáticas. En cuanto a la evolución de LMP1, se
observó una tasa acelerada en comparación a lo esperado para virus
ADN, 1,394 x 10-4 subs/sitio/año (0,658-2,276 x 10-4 subs/sitio/año,
95% HPD), pero fue concordante con observaciones previas para ciertas
proteínas de latencia de EBV. La edad estimada para el tACMR fue de
575 años. Se evidenció presión de selección sobre codones específicos
tanto positiva como negativa sugiriendo que podría estar involucrado
en la alta tasa de sustitución calculada. El análisis de variantes de LMP1
identificó una nueva variante de circulación en nuestra región y
confirmó el alto grado de variación descripto para esta proteína.
0215
DISEÑO DE UN ENSAYO IN VITRO PARA LA EVALUACIÓN DEL FITNESS
DE VARIANTES VIRALES DEL HBV. APLICACIÓN AL ESTUDIO DE
MUTACIONES ASOCIADAS AL PROCESO DE SEROCONVERSIÓN DEL
HBEAG DURANTE LA INFECCIÓN CRÓNICA.
I Sevic, MM González López Ledesma, DM Flichman, RH Campos
Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad
de Buenos Aires, Argentina.
El virus de hepatitis B (HBV) es un agente etiológico de enfermedad
aguda y crónica con amplia distribución mundial. La infección crónica
por HBV está asociada con patologías hepáticas severas como cirrosis y
hepatocarcinoma. Durante el curso de la infección, el HBV evoluciona
desde una etapa con elevada replicación viral, altos niveles de enzimas
hepáticas y presencia del antígeno e (HBeAg) hacia una etapa de bajo
nivel de replicación viral, enzimas hepáticas bajas/normales y presencia
de anticuerpos antiHBe. La seroconversión de HBeAg a antiHBe está
vinculada con la progresión de la patología hepática y puede detectarse
a nivel molecular por la presencia de mutaciones en las regiones del
promotor basal del core (BCP) y del precore (pC). La fijación de dichas
mutaciones sería consecuencia de una ventaja comparativa (aumento
de fitness) que permitiría el desplazamiento de la población viral
salvaje.
El objetivo de este trabajo fue desarrollar un sistema experimental que
permita evaluar el fitness relativo del HBV a nivel celular.
Se obtuvieron los clones de genoma completo de HBV: a. Mutante BCP
con las mutaciones 1753C-1762T-1764A-1766T (BCPmut), b. Mutante
pC con la mutación 1896A (pCmut) o c. Cepa Salvaje sin estas
mutaciones (HBVcs); 10-20 clones por muestra. Se transfectaron células
Huh7 con una relación 50%-50% de clones BCPmut o pCmut con HBVcs.
El sobrenadante que contiene la progenie viral fue cosechado a las 96
hs postransfección, el ADN viral fue extraído y amplificado por PCR. El
producto de amplificación fue clonado y se analizó la frecuencia de
cada variante en la progenie viral. Las frecuencias se compararon
utilizando el test de Student.
La frecuencia de clones BCPmut en la progenie (60,87±15,32%) fue
significativamente mayor que la de HBVcs (39,13±15,32%) (p=0.045).
Por otro lado, la diferencia en la frecuencia entre clones pCmut
(47,50±10,07%) y HBVcs (52,50±10,07%) no fue significativa (p=0,49).
En conclusión, se desarrolló un ensayo que permite evaluar el fitness
relativo del HBV a nivel celular. Esta herramienta permitirá caracterizar
biológicamente las mutantes que emergen durante el curso de la
infección crónica por HBV. Los resultados obtenidos sugieren que las
BCPmut tienen una diferencia a nivel replicativo que implicaría una
ventaja comparativa respecto de la cepa salvaje a nivel celular (mayor
fitness). Mientras que la fijación de las mutaciones en el pC sería
consecuencia de una ventaja de los virus mutados a nivel del individuo
(igual fitness), lo que podría estar relacionado con su interacción con el
sistema inmune del hospedador.
35
Libro de resúmenes
0228
EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR Y DIVERSIDAD GENÉTICA DEL VIRUS DE
LA HEPATITIS B EN MAR DEL PLATA
MC Torres1, E Civetta2, C D'Amico3, L Barbini1
1
Cátedra de Microbiología Clínica. Departamento de Química, FCEyN,
UNMdP., Argentina. 2 Unidad de Hepatología y Alcoholismo del HIGA
Dr. O. Alende., Argentina. 3 Unidad de Hepatología del Centro de
Especialidades Médicas Ambulatorias., Argentina.
Introducción: El virus de la hepatitis B (HBV) causa enfermedades
hepáticas, incluyendo hepatitis agudas, crónicas, cirrosis y
hepatocarcinoma. Se clasifica en diferentes genotipos (gts) con distinta
distribución geográfica. Los estudios moleculares de los genomas
contribuyen a comprender el estado epidemiológico actual en distintas
localidades y permiten inferir si las infecciones por ciertos genotipos se
encuentran en estado estacionario o en expansión.
Objetivo: Describir la epidemiología molecular y la diversidad genética
del HBV a nivel local en la ciudad de Mar del Plata.
Metodología: Se estudiaron muestras de 56 pacientes infectados por
HBV, consultantes en centros de salud pública de la ciudad. Se
secuenciaron y analizaron filogenéticamente dos regiones del genoma:
gen S y la región entre el gen X, BCP y PC. Se realizó un análisis
Bayesiano de coalescencia para estimar la dinámica poblacional y el
ancestro común más cercano (tMRCA) del subgt más prevalente (F1b).
Se analizó la presencia de mutaciones de relevancia clínica.
Resultados: Del análisis filogenético del gen S, se obtuvo la siguiente
prevalencia de gts: 80% F1b, 9% A2, 7% D3 y 2% D1. Una muestra
resultó un recombinante F4/D2. El punto de recombinación se ubicaría
en ORF-X. Para el subgt más prevalente en esta muestra (F1b), del
análisis de coalescencia Bayesiano, se estimó que el tMRCA sería de
aproximadamente 14,4 años, situando al nodo más ancestral en 1998 y
que la mayoría de los eventos de diversificación habrían ocurrido a
partir del 2000. Por otro lado, se encontraron mutaciones de
importancia clínica en las muestras analizadas. Un 20% gt F1b, un 2%
A2, un 2% D1 y un 2% D3, presentaron las sustituciones A1762T y
G1764A en el BCP, asociadas a disminución en la expresión de HBeAg.
Una muestra gt D3 presentó la sustitución G1896A en el PC, resultante
en un codón de stop, que confiere el fenotipo HBeAg negativo. Un 13%
(2 F1b, 3 D3 y 1 A2) presentó mutaciones en el inmunodeterminante
"a" del HBsAg, asociadas a escape a la vacuna. En el dominio RT de la
polimerasa se hallaron mutaciones en un 52% de las muestras (16 F1b,
4 A2, 3 D3 y 1 D1), ninguna de ellas previamente reportada asociada a
la resistencia a los antivirales.
Conclusiones: La alta prevalencia de gt F1b resulta característica de Mar
del Plata. Los análisis filogenéticos y de coalescencia mostraron que el
sgt F1b, autóctono de Latinoamérica, habría llegado a Mar del Plata por
los procesos migratorios recientes, desplazando a los gt del “viejo
mundo” (A y D), presentes desde antes en la ciudad, y sería el
responsable de las nuevas infecciones por HBV a nivel local. Los virus
circulantes en la ciudad también presentan mutaciones de relevancia
clínica, a ser consideradas en las estrategias de diagnóstico, prevención
y tratamiento del HBV circulante en la ciudad.
0262
FILODINAMIA DE ECHOVIRUS 30 ASOCIADO A MENINGITIS ASÉPTICA
EN ARGENTINA
C Lema1, C Torres2, D Girard1, DM Cisterna1, J Cello3, MC Freire1
1
Servicio de Neurovirosis, INEI-ANLIS- Dr. Carlos G. Malbrán, Argentina.
2
Cátedra de Virología, FFyB, UBA, Argentina. 3 Center for Infectious
Diseases, School of Medicine, Stony Brook University, Estados Unidos.
El enterovirus humano (HEV) Echovirus 30 (E30) es un importante
agente causal de meningitis aséptica, con patrón epidémico
caracterizado por el desplazamiento temporal de diferentes linajes. Es
un virus ARN, y su genoma evoluciona por mutación puntual y
recombinación. La recombinación (región 3Dpol) se correlaciona con la
divergencia en la proteína VP1. El objetivo de este trabajo fue estudiar
el patrón filodinámico de E30 que circuló en Argentina durante 19982012; y analizar su variación debido a la recombinación.
Se buscó HEV en casos de meningoencefalitis (ME) de probable
etiología viral por RT-PCR y aislamiento viral en células RD (5188
muestras). Los E30 se identificaron por secuenciación de la región que
codifica para la proteína VP1 y 3Dpol de los HEV aislados.
Las secuencias de E30 se estudiaron mediante análisis filogenéticos y
filodinámicos. Para la determinación de los linajes de E30 se analizaron
79 cepas de E30 junto con 858 disponibles en GenBank. La
recombinación se estudió mediante análisis filogenéticos con cepas de
referencias de todos los serotipos de HEV. El patrón filodinámico global
y de los linajes con muestras de Argentina se estudió mediante análisis
de coalescencia con el programa BEAST. Se detectaron 1926 HEV en
5188 casos de ME. De 393 HEV aislados, 132 cepas fueron E30,
obtenidas desde 114 líquidos cefalorraquídeos y 18 heces. Los años
1998, 2003-2004, 2007 y 2011-2012 mostraron alta circulación viral. La
reconstrucción filogenética mostró 8 grupos monofiléticos (linajes A-H),
cada uno con subgrupos, y asociación temporal. Los linajes A, C, D, E y F
presentaron una amplia distribución mundial (3 o más continentes),
mientras que los linajes B, G y H mostraron una distribución más
acotada (1 o 2 continentes). En Argentina y América del Sur sólo
circularon los linajes E y F. El análisis de coalescencia de E30 mostró que
el ancestro común más reciente comenzó a diversificarse en 1934 con
una tasa de sustitución de 4,5 x10-3s/s/y. El ancestro más probable del
linaje E se ubicaría en EEUU en 1991 y la del linaje F en Países Bajos en
1993. Se detectaron 12 recombinantes (todas de la especie B), 8 del
linaje E y 4 del F. Los eventos de recombinación serían más frecuentes
en el linaje E, que a su vez presentó una estructura más diversa en la
región VP1 que el linaje F. Todas las recombinantes fueron
monofiléticas con respecto al agrupamiento en VP1, esto muestra una
estrecha relación genética de las cepas estudiadas entre ambas
regiones (genes estructurales y no estructurales).
Este es el primer estudio filodinámico de E30 con cepas de nuestra
región. Los linajes E y F se distribuyeron mundialmente en un corto
período de tiempo, lo que sugiere que podrían presentar alguna
ventaja evolutiva con respecto a los otros linajes con diversificación
igualmente reciente que no lograron esta amplia distribución, y
también con respecto a linajes más antiguos, ya que necesitaron menor
tiempo para establecerse como los más importantes.
0268
ANÁLISIS DE LA VARIACIÓN DE LAS POBLACIONES DEL VIRUS
SINCICIAL RESPIRATORIO (HRSV) EN PACIENTES QUE SUFRIERON
INFECCIÓN RESPIRATORIA PROLONGADA O REINFECCIÓN UTILIZANDO
NUEVAS TECNOLOGÍAS
M Viegas1 2, S Goya1, AS Mistchenko1 3
1
Laboratorio de Virología, Hospital de Niños "Dr. Ricardo Gutiérrez",
Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. 2 Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas, CONICET, Argentina. 3 Comisión
de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires, CIC,
Argentina.
El HRSV es una de las principales causas de infección respiratoria aguda
baja (IRAB) severa en niños en todo el mundo. La población susceptible
son los menores de cinco años, siendo los bebés menores de seis meses
los que sufren infecciones más severas. Una de las características
distintivas del HRSV es que se producen reinfecciones durante toda la
vida. En ese sentido, numerosos estudios sobre aislamientos clínicos
han demostrado una gran variación genética y antigénica, la cual
surgiría como respuesta a la presión de selección inmune.
El objetivo de este trabajo fue estudiar las características genéticas de
las poblaciones virales que infectaron a pacientes hospitalizados por
IRAB prolongada o reinfección entre los brotes epidémicos 2011 a
2013. Se analizó el gen de G, glicoproteína más variable, en muestras
consecutivas de aspirados nasofaríngeos, mediante el clonado y
secuenciación por Sanger (CSS), y por secuenciación con equipos de
nueva generación (NGS). Además, se analizó el impacto en la población
general de nuevas variantes genéticas detectadas.
A partir de los sets de datos obtenidos por NGS y por CSS se
reconstruyeron los haplotipos virales por alineamiento con cepas de
referencia utilizando QuRe, Vphaser y PredictHaplo. Para analizar la
dinámica de las poblaciones virales encontradas dentro y entre
muestras y para determinar asociaciones con cepas que circularon local
y globalmente se realizaron análisis filogenéticos por inferencia
bayesiana (MrBayes) y se calcularon las distancias genéticas (dist.) de
las poblaciones (MEGA v6).
36
Libro de resúmenes
La profundidad para los diferentes set de datos obtenidos por NGS fue
entre 8000X y 25000X, mientras que por CSS fue 30X, mostrando la
potencialidad de la tecnología de NGS para este tipo de análisis.
Entre los pacientes analizados, dos presentaban una fuerte
inmunosupresión. Como consecuencia, los haplotipos virales
encontrados en la primera y en la segunda muestra y la secuencia
directa obtenida de cada muestra se asociaron en el mismo clado
genético. La dist. máxima entre las variantes fue baja (0.38%),
sugiriendo una infección prolongada.
De los pacientes inmunocompetentes, uno albergaba en su primer
muestra un solo haplotipo asociado con una cepa con duplicación de
72-nt que emergió en 2011. Nueve días después, albergaba dos
haplotipos semejantes al primero y 50 días después de la primer
muestra, presentaba al menos 4 tipos de haplotipos algunos asociados
con el de la primera muestra y otros con cepas que circularon
localmente en ese momento, sugiriendo infección prolongada y
reinfección. El valor de dist. máxima fue de 3.96%. Otro paciente, sufrió
su primer IRAB en diciembre del 2011 y su segunda en el brote de 2012.
Los haplotipos virales encontrados entre ambas muestras fueron
completamente diferentes, sugiriendo reinfección.
Estos resultados muestran que diferentes condiciones inmunes de los
pacientes podrían ser utilizados por el virus para generar reservorios y
así explorar toda su plasticidad genética.
0275
IDENTIFICACIÓN DE UN NUEVO SUBGENOTIPO DEL VIRUS DE
HEPATITIS B GENOTIPO F A PARTIR DE MUESTRAS DE PACIENTES CON
INFECCIÓN CRÓNICA DE ARGENTINA.
LN Mojsiejczuk1, C Torres1, V Re2, MB Pisano2, HA Fainboin3, OA
Galdame4, RH Campos1, DM Flichman1
1
Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad
de Buenos Aires, Argentina. 2 Instituto de Virología “Dr. Vanella”.
Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina. 3 Unidad de Hepatopatías Infecciosas, Hospital F. J. Muñiz,
Argentina. 4 Sección Hepatología, Hospital Italiano, Argentina.
El virus de la hepatitis B (HBV) se clasifica en ocho genotipos (A-H) en
base al análisis de distancias genéticas entre secuencias de genoma
viral completo. El genotipo F, considerado originario de los pueblos
nativos americanos, es uno de los más prevalente de Argentina y hasta
la actualidad se ha clasificado en cinco subgenotipos (sgt) denominados
F1 a F5. El objetivo de este trabajo fue realizar una caracterización y
análisis evolutivo de seis genomas completos del HBV genotipo F. Tres
de ellos fueron aislados de pacientes residentes en la Ciudad de Buenos
Aires y, los restantes, en la Provincia de Córdoba. Las secuencias, junto
a referencias obtenidas de GenBank, fueron alineadas (ClustalX v2.1) y
editadas (BioEdit v7.1.3.0). El posible origen recombinante de las
secuencias se evaluó con el programa Simplot v3.5.1. Se realizó un
análisis filogenético por el método de Máxima Verosimilitud (PhyML
v3.0), se calcularon las distancias genéticas entre grupos (MEGA6) y se
llevó a cabo un análisis de coalescencia por metodología bayesiana
(paquete BEAST v1.7.5). Como resultado del análisis filogenético, se
observó que los seis aislamientos formaron un grupo monofilético
dentro del genotipo F, con alto soporte estadístico, pero separado de
los demás sgt descriptos hasta el momento. Las distancias genéticas
calculadas entre el nuevo grupo y secuencias de referencia del genotipo
F se encontraron entre el 4,03 %, respecto al sgt más cercano: el F4, y
6,20% en relación al sgt F1. A lo largo del genoma, las seis secuencias
presentaron 19 posiciones nucleotídicas únicas y características, no
observadas en los demás sgt. En los cuatro marcos abiertos de lectura
que presenta el genoma de HBV, dichas sustituciones generan 12
cambios por codones sinónimos y 11 no sinónimos. En base a estos
últimos, se puede establecer un patrón de aminoácidos únicos y
característicos del nuevo grupo: sp254L, sp271K, sp314P, rt21I, rt132D,
rt261E, rt277R, rh743R y rh807L en la polimerasa viral, 91N en PreS1 y
47S en la proteína X. Por otra parte, el análisis de coalescencia situó al
ancestro común más reciente (ACMR) del nuevo grupo en el año 1030
d.C. [HPD95%=1386-480 d.C.], con una diversificación entre los años
1100 a 1430, lo que coincide con el período de expansión poblacional
de los demás sgt reconocidos del genotipo F. Dadas las actuales
recomendaciones para la clasificación del HBV que asigna como nuevo
subgenotipo a un grupo monofilético, con soporte estadístico y con
distancia genética entre 4.0 y 7.5% con los grupos anteriormente
reportados, se propone que los seis genomas descriptos en este trabajo
componen un nuevo sgt del HBV: el sgt F6. La identificación de nuevos
subgenotipos permite profundizar los conocimientos sobre la historia
evolutiva del HBV, así como clarificar la relación entre los
(sub)genotipos virales y la historia natural de la infección.
0285
ANALISIS DE COALESCENCIA DE LOS VIRUS DENGUE 3 DETECTADOS EN
BUENOS AIRES EN 2007
E Tittarelli1 2, PR Barrero1 2, M Viegas1 2, AS Mistchenko1 3
1
Laboratorio de Virología, Hospital de Niños "Dr. Ricardo Gutiérrez",
Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. 2 Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas, CONICET, Argentina. 3 Comisión
de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires, CIC,
Argentina.
El virus del dengue (DENV) pertenece a la familia Flaviviridae y se
clasifica en cuatro serotipos (DENV1-4) sub-divididos en genotipos, los
cuales no presentan inmunidad cruzada. Posee un genoma RNA simple
cadena de polaridad positiva que codifica para tres proteínas
estructurales (cápside, membrana y envoltura) y siete proteínas no
estructurales.
El DENV es el agente causal de la enfermedad del dengue, un grave
problema de salud pública dado que su incidencia se encuentra en
abrupto crecimiento a nivel mundial. En la Argentina, la mayoría de los
brotes tuvieron su origen en países vecinos. En la Ciudad de Buenos
Aires, se reportaron casos importados de DENV1, DENV2 y DENV3, y
por primera vez en el 2009 se reportaron casos de transmisión local de
DENV1.
Puntualmente, durante el 2007, 35 casos de DENV3 fueron confirmados
en el Laboratorio de Virología del Hospital de Niños “Dr. Ricardo
Gutiérrez”. Si bien los pacientes residían en la Ciudad de Buenos Aires,
declararon historia de viaje reciente a Brasil o Paraguay.
En este trabajo, se realizará un análisis filogenético y de coalescencia de
las secuencias de DENV3 del año 2007 obtenidas en nuestro laboratorio
y su relación con secuencias de DENV3 del resto del mundo disponibles
en bases de datos.
Se obtuvo la secuencia que codifica para las proteínas estructurales
(2413 nt.) de 13 DENV3 aislados en nuestro laboratorio. Las mismas se
genotipificaron mediante métodos Bayesianos, utilizando el gen de la
envoltura (nt. 935-2413). Se realizaron análisis de coalescencia
mediante el paquete BEAST, utilizando la secuencia que codifica para
todas las proteínas estructurales (nt. 95-2413). En cada caso, se evaluó
el modelo evolutivo apropiado mediante jModelTest.
Filogenéticamente, detectamos que todas las muestras analizadas
corresponden al genotipo III de DENV3. A partir del análisis de
coalescencia del genotipo, el ancestro común más reciente dataría
aproximadamente en 1973 (95%HPD 1968-1978). La tasa media de
sustitución de nucleótidos sería de 9,93E-4 sustituciones/sitio/año
(95%HPD 8,21E-4─1,2E-3). Evaluando la reconstrucción demográfica, el
tamaño poblacional resultó constante desde el origen hasta 1997
donde se observó un abrupto crecimiento poblacional que duró hasta
aproximadamente el año 2006, probablemente relacionado con la reemergencia de DENV3 genotipo III en América Latina reportado
previamente. A partir del análisis del árbol de máxima credibilidad de
los clados, se observó que el ancestro común a todas nuestras
secuencias dataría en 1996. Además, las secuencias obtenidas en
nuestro laboratorio se agruparon en dos clados separados, uno
asociado con secuencias reportadas de Paraguay-2007 y el otro con
secuencias de Brasil-2007. Esta observación se encontró en
concordancia con el origen de viaje declarado de los pacientes.
Este estudio, junto con análisis filogeográficos, contribuirá al
conocimiento de las características evolutivas y de dispersión del
DENV3 genotipo III a nivel global.
37
Libro de resúmenes
0343
EVOLUCIÓN MOLECULAR Y EPIDEMIOLOGÍA (2005-2011) DEL VIRUS
DE LA HEPATITIS C EN URUGUAY
M Castells1, G Bello2, S Ifrán3, S Pereyra3, S Boschi3, R Uriarte3, J
Cristina4, R Colina1
1
CENUR Noroeste - Universidad de la República, Uruguay. 2 Instituto
Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, Brasil. 3 Asociación Española Primera de
Socorros Mutuos, Uruguay. 4 Facultad de Ciencias - Universidad de la
República, Uruguay.
Mundialmente más de 170 millones de personas están crónicamente
infectadas con el virus de la hepatitis C (VHC) y cada año mueren cerca
de 500 mil personas por enfermedades relacionadas con este virus.
Recientemente, VHC fue reclasificado en siete genotipos y 67 subtipos.
Algunos subtipos como 1a, 1b y 3a se han convertido en epidémicos
como resultado de nuevas rutas de transmisión parenteral y son
responsables de la mayoría de las infecciones por VHC en los países
occidentales. El subtipo 1a ha sido subcategorizado en dos clados
separados. Estudios recientes basados en el análisis de la región NS5B
del genoma, revelaron que la epidemia de VHC tanto en Argentina
como en Brasil está caracterizada por múltiples introducciones de los
subtipos 1a, 1b y 3a del virus a estos países, seguido de dispersión local
de estos subtipos. No hay información acerca de los genotipos
circulando en Uruguay, así como tampoco de su historia evolutiva ni
demográfica. Para obtener esta información, realizamos la extracción
del ARN de 247 muestras de pacientes positivos para VHC por serología
provenientes de la Asociación Española Primera de Socorros Mutuos
entre los años 2005 y 2011. Luego por transcripción reversa, reacción
en cadena de la polimerasa semi anidada y secuenciación, obtuvimos
204 secuencias. De estas 204 secuencias 104 (51,0%) fueron subtipo 1a,
52 (25,5%) subtipo 3a, 35 (17,2%) subtipo 1b, 9 (4,4%) subtipo 2c, 3
(1,5%) subtipo 2b y 1 (0,5%) subtipo 2j. Las secuencias del subtipo 1a se
distribuyeron dentro de ambos clados descritos por Pickett y
colaboradores. Cuatro clados locales del VHC fueron hallados, 3 dentro
del subtipo 1a y uno dentro del subtipo 3a. Además, la epidemia en
Uruguay ha sido dirigida por múltiples introducciones de los subtipos
1a, 1b y 3a y por la diseminación local de algunas cepas específicas
uruguayas. La historia evolutiva y la historia demográfica de los
principales clados de dispersión local así como de los principales
subtipos circulando en Uruguay fue reconstruida utilizando tasas de
evolución previamente estimadas. Este es el primer trabajo exhaustivo
acerca de la epidemiología molecular y la historia evolutiva del VHC en
Uruguay.
Replicación y estructura
0007
LA SÍNTESIS DE LA VERSIÓN PROCESADA Y NO PROCESADA DE LA
PROTEÍNA BÁSICA DE DEDOS DE ZINC (HBZ), DEL VIRUS DE LA
LEUCEMIA DE LINFOCITOS T HUMANOS DE TIPO 1 (HTLV-1) ES
REGULADA A NIVEL TRADUCCIONAL.
CJ Cáceres1 2, E Olivares1, J Angulo1, K Pino1, E Castillo1, M López-Lastra1
1
Laboratorio de Virologia Molecular, Centro de Investigaciones
medicas, Escuela de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile,
Chile. 2 Programa de Doctorado en Ciencias mención microbiología,
Universidad de Chile/Universidad de Santiago, Santiago., Chile.
El virus de la leucemia de linfocitos T humanos de tipo 1 (HTLV-1)
sintetiza una población de RNAs mensajeros (mRNAs) antisentidos con
respecto al genoma, los cuales codifican para la proteína básica de
dedos de Zinc (HBZ). HBZ es fundamental para la patogenia asociada a
HTLV-1, y es detectada en todos los pacientes que desarrollan la
patología mediada por HTLV-1. En este estudio se evaluó el mecanismo
de inicio de la síntesis de proteína de los dos mRNAs que codifican para
HBZ. Uno de estos mRNA sufre un procesamiento por splicing
generando una versión procesada de la proteína HBZ (SpHBZ) y el otro,
es utilizado directamente para generar la versión no procesada de HBZ
(UsHBZ). Ambos mRNAs difieren significativamente solo en la región 5’
no traducida (UTR). Se ha descrito que los niveles de mRNA de ambas
versiones es similar en células infectadas, sin embargo, los niveles de
proteína generada a partir del mRNA SpHBZ, son mayores en relación a
los niveles de proteína generada a partir del mRNA UsHBZ. Para
estudiar este fenómeno, se generaron construcciones monocistronicas
en las cuales el 5’UTR de SpHBZ y UsHBZ fue fusionado rio arriba al gen
de la luciferasa de luciérnaga (FLuc). Los resultados muestran que en
lisado de reticulocito de conejo (RRL), la región 5’UTR de SpHBZ exhibe
una mayor eficiencia traduccional en relación a la región 5’UTR de
UsHBZ y dicho efecto no es explicable por diferencias en la estabilidad
de los mRNAs. El efecto observado fue confirmado mediante ensayos
de marcaje metabólico. Resultados similares son observados en un
contexto ex-vivo, donde la eficiencia traduccional de SpHBZ es superior
con respecto a UsHBZ. Ensayos de qRT-PCR a partir de RNA total
extraído descartan un efecto a nivel transcripcional. La eficiencia
traduccional diferencial no es explicable por una competencia entre
ambos mRNAs por factores celulares. Se evaluó la posibilidad de que el
5’UTR de SpHBZ posea un sitio interno de entrada a ribosomas (IRES).
Los resultados muestran que el 5’UTR de SpHBZ, pero no el de UsHBZ,
es capaz de mediar la síntesis del segundo cistrón de un mRNA
bicistrónico tanto in-vitro como ex-vivo. Se estableció además que la
síntesis de FLuc a partir del mRNA bicistrónico no es explicable por
presencia de promotores crípticos ni por variantes de splicing en un
contexto ex-vivo. Por tanto este estudio muestra la existencia de un
IRES en la región 5’UTR del mRNA de SpHBZ de HTLV-1.
Trabajo financiado por el proyecto Fondecyt 1130270 y el proyecto
P09/016-F de la Iniciativa Científica Milenio del Ministerio de Economía,
Fomento y Turismo. C. Joaquín Cáceres es financiado por una beca
CONICYT para estudios doctorales
0034
DOMINIOS ESTRUCTURALES DEL 5’UTR DE RNA MENSAJERO
COMPLETO DE HIV-1 INFLUENCIAN EL INICIO DE LA SÍNTESIS DE
PROTEÍNAS CAP-DEPENDIENTE
F Carvajal1 3, M Vallejos1, E Olivares1, BA Walters2, MI Hertz2, CJ
Cáceres1, N Contreras1, K Pino1, SR Thompson2, M López-Lastra1
1
Laboratorio de Virología Molecular, Instituto Milenio de Inmunología e
Inmunoterapia, Departamento de Infectología e Inmunología
Pediátrica, Escuela de Medicina, Pontificia Universidad Católica de
Chile, Marcoleta 391, Santiago, Chile. 2 Department of Microbiology,
University of Alabama at Birmingham, Birmingham AL, Estados Unidos.
3
Programa de Doctorado en Ciencias Biológicas, mención Genética
Molecular y Microbiología, Facultad de ciencias Biológicas, Pontificia
Universidad Católica de Chile, Chile.
La región 5’ no traducida (5’UTR) del RNA genómico del virus de la
inmunodeficiencia humana de tipo 1 (HIV-1) es una región
multifuncional que posee una estructura secundaria/terciaria
altamente conservada, la cual regula múltiples etapas del ciclo
replicativo viral. Los elementos funcionales incluyen la región de transactivación (TAR), la señal de poliadenilción (PolyA), el sitio de unión del
partidor de la transcripción reversa (PBS), el sitio de inicio de la
dimerización del genoma (DIS), el dador mayor de splicing (SD), y la
señal de empaquetamiento (Psi). La región 5’UTR del mRNA de HIV-1
contiene además un sitio interno de entrada al ribosoma (HIV-1 IRES),
el cual dirige el inicio de la traducción bajo condiciones celulares que
inhiben el inicio de la traducción dependiente de cap. Este estudio
proporciona nuevas evidencias sobre el mecanismo molecular usado
por el HIV-1 IRES, durante el reclutamiento de la maquinaria de síntesis
de proteínas del hospedero. En este trabajo se demuestra que el HIV-1
IRES depende de la proteína ribosomal 25 (RPS25) para su
funcionamiento, y muestra que este IRES es insensible a la droga
edeína. Esto último sugiere que el HIV-1 IRES recluta la subunidad
ribosomal 40S directamente sobre el codón de inicio, sin requerir de
scanning ribosomal. En este trabajo también se explora el impacto de
mutaciones en el 5’UTR sobre la actividad IRES. Los resultados sugieren
que el HIV-1 IRES posee una naturaleza modular, y que los dominios
estructurales PBS, DIS y SD contribuyen a la actividad IRES. En conjunto,
estos hallazgos dan luces sobre el mecanismo utilizado por el HIV-1
IRES para el reclutamiento de la maquinaria de síntesis de proteínas del
hospedero.
38
Libro de resúmenes
0076
LA INFECCION CON EL VIRUS JUNIN ACTIVA LA VIA DE LA AUTOFAGIA
JS Roldán1, LR Delgui2, NA Candurra1
1
IQUIBICEN, Dpto. de Química Biológica, FCEyN, UBA, Argentina. 2
IHEM, UNC-CONICET, Mendoza, Argentina.
Autofagia es un proceso degradativo conservado en mamíferos que
cumple una función fundamental en el mantenimiento de la
homeostasis celular a través de la eliminación de proteínas y organelas
dañadas. El proceso inicia con la formación de vesículas de doble
membrana, denominadas autofagosomas, que luego se fusionan con
lisosomas donde ocurre la degradación enzimática. Este proceso tiene,
además, un papel protagónico en la protección de la invasión viral en
las células. Sin embargo, algunos agentes virales han desarrollado
estrategias para utilizar esta vía durante su ciclo de replicación. El virus
Junín (JUNV) pertenece al clado B de la familia Arenaviridae. Es el
agente etiológico de la fiebre hemorrágica Argentina, una enfermedad
endemo-epidémica que afecta a una gran parte de la población
Argentina. En este trabajo, analizamos la participación de la vía
autofágica durante la infección por el JUNV en una línea celular
humana. Utilizamos la proteína LC3 como marcador de la modulación
de la vía luego de la infección. LC3 es una proteína citoplasmática (LC3I) que se asocia a la membrana de las vesículas (LC3-II) luego de
inducción de la vía. Cuando se observa en el microscopio de
fluorescencia, las vesículas conteniendo la proteína LC3-II se ven como
un puntillado verde. Observamos que las células sobreexpresando
EGFP-LC3 e infectadas con el JUNV mostraron un aumento en el
número de células positivas para autofagia de manera similar a las
tratadas con medio de ayuno o con Bafilomicina A1, los cuales inducen
la formación o acumulación de autofagosomas, respectivamente.
También monitoreamos la conversión de LC3-I (citosólica) a LC3-II
(asociada a autofagosomas) mediante Western blot, detectando niveles
similares de LC3-II en las células infectadas y en células tratadas con
medio de ayuno. Por otro lado, el pre-tratamiento de las células con
rapamicina (un inductor de la autofagia) o con medio de ayuno durante
2 hs incrementaron el número de células infectadas, mientras que el
pre-tratamiento con wortmanina (un inhibidor de la vía) disminuyó
dicho parámetro. Por último, analizamos la capacidad de replicación del
JUNV en células MEF fenotipo salvaje (wt) y MEF carentes del gen Atg5
(gen estructural de la vía, esencial para la activación de la misma),
observando que en aquellas células que carecen del gen Atg5, se
obtuvo una menor infectividad y un menor número de células
infectadas. Por último, analizamos los niveles de LC3-II en células MEF
wt y observamos mayor acumulación de LC3-II en las células infectadas
respecto de las mismas células sin infectar, confirmando que el virus
induce la activación de la autofagia. Estos resultados nos permiten
concluir que la infección por el JUNV activa la vía de la autofagia y que
dicha vía es empleada para su replicación.
0089
LOS RETROVIRUS MLV Y HIV-1 UTILIZAN DIFERENTES COMPONENTES
DEL COMPLEJO DINEINA CITOPLASMÁTICO PARA SU TRANSPORTE
RETROGRADO EN EL CITOPLASMA DE LA CÉLULA HOSPEDERA.
G Arriagada1 2, T Opazo1, F Barraza1, T Schwenke1 2, R Valle-Tenney1, A
Garcés1
1
Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Biológicas,
Universidad Andres Bello sede Viña del Mar, Chile. 2 Núcleo Milenio
Biología de Enfermedades Neuropsiquiátricas., Chile.
Introducción
En las etapas tempranas de la infección, luego de la entrada a la célula,
los retrovirus necesitan llegar al núcleo para poder integrar su genoma
en el genoma de la célula hospedera. Debido a la alta densidad del
citoplasma celular es poco probable que puedan difundir, es por eso
que se ha postulado que los virus, en general, utilizan el transporte
activo a través del citoesqueleto, para alcanzar sus sitios de replicación.
En el caso particular de los retrovirus se ha propuesto que utilizarían las
distintas proteínas motoras asociada a microtúbulos como dineinas y
kinesinas. Buscando proteínas celulares que se asociaran al virus de la
leucemia murina (MLV) a tiempos tempranos de infección,
encontramos que miembros del complejo de dineina citoplasmático se
asocian al complejo de preintegración de MLV. Es por esto que
decidimos evaluar el rol de estos complejos proteicos en la infección
por MLV y por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1).
Objetivos
Analizar el rol de las distintas proteínas que conforman el complejo de
dineina citoplasmático en la infección por los virus MLV en células
murinas y HIV-1 en células humanas.
Metodología
Células murinas NIH3T3 y células humanas TE761 fueron transducidas
con vectores lentivirales codificantes para shRNA dirigidos contra las
distintas proteínas que conforman el complejo de dineina
citoplasmático. Una vez seleccionadas las células por resistencia al
antibiótico puromicina, se infectaron con virus reporteros luciferasa y
se comparó la respuesta del reportero en células control no-silenciadas
y en aquellas silenciadas para cada una de las cadenas.
Resultados
Nuestros resultados indican que la proteína DYNLT3 es necesaria en las
etapas tempranas de infección de HIV-1. En el caso de MLV, las
proteínas DYNLRB2 y DYNLT1 tienen un rol en las etapas tempranas de
la infección, en un punto posterior a la transcripción reversa y anterior
a la entrada al núcleo.
Conclusiones
Nuestros resultados sugieren que las cadenas livianas del complejo
dineina citoplasmático son importantes para la infección de ambos
retrovirus, y que se utilizarían de forma diferencial. Actualmente nos
estamos enfocando en determinar si existe una interacción directa
entre las proteínas virales y las cadenas livianas del complejo dineina.
0094
EL SUBDOMINIO IIID DEL IRES DEL VIRUS DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C
UNE Y PARTICIPA EN EL REMODELAMIENTO DE LA SUBUNIDAD
RIBOSOMAL 40S EUCARIONTE.
J Angulo1, J Deforges2, N Chamond2, N Ulryck2, M López-Lastra1, B
Sargueil2
1
Laboratorio de Virología Molecular, Instituto Milenio de Inmunología e
Inmunoterapia (IMII), Centro de Investigaciones Médicas, Escuela de
Medicina, División de Pediatría, Pontificia Universidad Católica de Chile,
Santiago, Chile. 2 Laboratoire de Cristallographie et RMN Biologiques –
CNRS UMR8015, Université Paris Descartes, Paris, Francia.
El inicio de la traducción del RNA mensajero (mRNA) del virus de la
hepatitis C (HCV) es dependiente de un sitio interno de entrada a
ribosomas (IRES). El IRES de HCV es una estructura de RNA compuesta
por 3 dominios, II, III y IV. El reclutamiento de la subunidad ribosomal
40S al IRES de HCV ocurre en ausencia de factores de inicio. Se ha
propuesto que este proceso es mediado parcialmente por interacciones
del tipo Watson-Crick entre tres pares de bases C-G consecutivas entre
el loop de la hélice 26 del rRNA 18S (nucleótidos 1116-1118) y el
subdominio IIId del IRES (nucleótidos 266-268). En este estudio se
utilizó la tecnología de “Selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by
primer Extensión” (SHAPE) para determinar los sitios de unión directa
entre el IRES de HCV y los nucleótidos 981-1187 del rRNA 18S. Como
control negativo se utilizó una mutante del subdominio IIId,
denominada variante G266A/G268U, previamente descrita en nuestro
laboratorio. Esta variante, en la cual no se altera la estructura global del
IRES, no exhibe actividad traduccional al no unir la subunidad ribosomal
40S. Los resultados muestran protección de los nucleótidos 1021-1023,
1027, 1057-1058, 1080, 1112-1118, 1130, 1178 del rRNA y mayor
reactividad en las posiciones 990, 1012, 1124, 1146. Estos resultados
sugieren que pueden existir más sitios de interacción directa entre el
rRNA 18S y el IRES de HCV. Alternativamente, los datos sugieren un
remodelamiento estructural de la subunidad ribosomal 40S posterior a
su unión al IRES. Esta observación confirma de manera experimental
que el apareamiento de bases mRNA-rRNA no está restringido sólo a
procariontes y que es esencial para el reclutamiento de la subunidad
pequeña eucariótica sobre el IRES de HCV. Estos resultados sugieren
por tanto que la interacción entre el rRNA y el loop IIId del IRES de HCV
representa un potencial blanco terapéutico.
Financiamiento: PICS #5283 – L.I.A - CNRS; Iniciativa Científica Milenio
del Ministerio de Economía, Fomento y Turismo: Proyecto P09/016-F;
Fondecyt 1130357.
39
Libro de resúmenes
0116
ENTRADA DEL VIRUS JUNIN DEPENDIENTE DE LA LECTINA DC-SIGN
MB Forlenza1, JS Roldán1, MG Martinez2, SM Cordo1, NA Candurra1
1
IQUIBICEN, FCEN, UBA, CONICET, Argentina. 2 Albert Einstein School of
Medicine, Estados Unidos.
La entrada de algunos virus y su diseminación pueden ser mediadas por
lectinas de tipo c como DC-SIGN, miembro de una familia de receptores
que reconoce estructuras de carbohidratos presentes en patógenos. En
trabajos previos, proporcionamos evidencia de que hDC-SIGN reconoce
e internaliza el arenavirus del nuevo mundo Junín (JUNV), agente
etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, que presenta en su
envoltura proteínas altamente glicosiladas. En este trabajo nos
proponemos proporcionar más evidencia de la especificidad de la
interacción y caracterizar las primeras etapas de la entrada mediada
por DC-SIGN. Para esto, infectamos cultivos de células NHI3T3 y
NIH3T3-hDC-SIGN en presencia de EGTA. Se observó inhibición de la
multiplicación sólo en cultivos que expresan la lectina humana. Para
analizar los componentes moleculares de la lectina implicados en la
internalización, las células NIH3T3 se transfectaron con plásmidos de
expresión que codifican para la construcción salvaje o mutantes de
motivos citoplasmáticos conservados de la lectina: dileucina (LL), y el
grupo triácido (EEE) que se cree que regulan la unión y el tráfico
intracelular respectivamente. Nuestros resultados mostraron que la
presencia de las mutaciones LL y EEE interfiere con el aumento de
infección. Para evaluar la forma de entrada, a través de la lectina,
utilizamos compuestos que bloquean específicamente diferentes vías
de entrada. Nuestros resultados mostraron inhibición significativa de la
infección con dynasore (DYN); que inhibe la endocitosis dependiente de
dinamina II, clorpromazina (CZ), que inhibe la endocitosis dependiente
de clatrina y metil-B-ciclodextrina (MBCD) que inhibe la endocitosis
dependiente colesterol. Para determinar los componentes celulares
implicados, las células fueron transfectadas transitoriamente con
plásmidos que codifican proteínas dominantes negativas implicadas en
la endocitosis. Observamos que la infección con JUNV depende EPS15 y
dinamina-2, ambos implicados en la endocitosis mediada por clatrina.
Se estudió el rol de los microfilamentos y microtúbulos durante la
infección temprana del virus. Sólo se obtuvo inhibición de la infección
durante los tratamientos con latruculinA, un compuesto que
interrumpe la dinámica de los microfilamentos corticales y
citoplasmáticos mientras que utilizando citochalasina D, que sólo afecta
a los microfilamentos citoplasmáticas no mostró un efecto inhibitorio
sobre la multiplicación de JUNV. En contraste, los fármacos que alteran
los microtúbulos no mostraron afectar la multiplicación de JUNV.
Concluyendo, nuestros resultados demuestran que JUNV interactúa
específicamente con hDC-SIGN y que la vía de entrada prefencial
involucrado es la endocitosis mediada por clatrina con dependencia del
colesterol y filamentos de actina corticales.
0132
CARACTERIZACIÓN DEL COMPLEJO DE PRE-INTEGRACIÓN DEL VIRUS
DE LA LEUCEMIA MURINA (MLV) EN CÉLULAS HUMANAS.
ML Acevedo, F García, J Saldias, O León
Programa de Virología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de
Chile, Chile.
El virus de la leucemia murina (MLV) es un retrovirus utilizado como
vector en terapia génica que puede producir activación de oncogenes
durante su integración en el genoma de la célula hospedera, por lo que
el conocimiento de las etapas del ciclo replicativo y la interacción con el
hospedero son fundamentales.
Durante el ciclo replicativo de MLV, después de la entrada del virus a la
célula, se produce la transcripción reversa de su genoma de ssRNA
hacia dsDNA mediante el complejo de transcripción reversa (RTC), una
vez formado el DNA viral, el complejo cambia hacia complejo de
preintegración (PIC) formado por proteínas virales y celulares que
desplazan y protegen el genoma viral por el citoplasma que, luego de la
mitosis, entra al núcleo, permitiendo su integración. Escasa información
existe acerca del PIC de MLV, por lo que proponemos su
caracterización.
Se generó el pseudotipo viral mediante transfección de tres plásmidos
en la línea celular 293T, el sobrenadante que contiene el virus fue
concentrado y utilizado para transducir células 293T. Mediante PCR
cuantitativo se realizó una cinética de formación del PIC en el
citoplasma, una cinética de integración viral y se analizó la actividad de
los PIC citoplasmático.
Se observó que la máxima concentración del PIC en el citoplasma se
obtiene a las 16 horas post-transducción, resultados que están acorde a
la cinética de integración, donde el máximo se observa a las 24 horas.
Sin embargo, el PIC citoplasmático no fue activo, sugiriendo que la
conformación de proteínas del PIC en el núcleo son esenciales para la
función de la integrasa, proteína viral que cataliza la integración.
Luego se analizó la estabilidad del PIC citoplasmático en solución, por lo
que se transducieron células 293T por 16 horas las que fueron tratadas
con y sin entrecruzamiento in vivo con DSG durante 30 minutos. Las
células se rompieron por lisis hipotónica, el extracto citoplasmático se
cargó en una cromatografía de sepharose CL-4B y los complejos se
purificaron mediante inmunopreciptación utilizando la resina de NHSagarose unida al anticuerpo anti-capside, proteína que conforma parte
del PIC. Mediante el análisis de western blot se observó los tamaños de
los productos obtenidos. Los complejos unidos a la cápside sin
entrecruzamiento mayoritariamente tuvieron un tamaño aproximado
de 30 y 60 KDa mientras que aquellos tratados con DSG se observó
principalmente complejos de aproximadamente 60, 100 y mayores a
130 KDa. Sugiriendo que las metodologías de purificación utilizadas
podrían mantener indemne la conformación del PIC para lograr su
purificación.
Financiado por Proyecto Fondecyt 11121411 y U-Inicia 11/08.
0156
ROL DE LA ACTIVACIÓN DE ERK EN DIFERENTES ETAPAS DE LA
MULTIPLICACIÓN DEL VIRUS JUNÍN EN CULTIVOS CELULARES
JE Brunetti, VM Quintana, LA Scolaro, V Castilla
Laboratorio de Virología, Departamento de Química Biológica, Facultad
de Ciencias Exactas y Naturales, UBA, Argentina.
En trabajos previos hemos demostrado que la infección con el
arenavirus Junín (JUNV), agente etiológico de la Fiebre Hemorrágica
Argentina, provoca la activación de la vía de señalización celular
Raf/MEK/ERK en cultivos celulares de distinto origen. Asimismo,
determinamos que el compuesto U0126, inhibidor específico de la vía
de ERK, inhibe la multiplicación de JUNV, mientras que el tratamiento
con el éster miristato acetato de forbol (PMA), activador de la vía,
promueve la multiplicación viral. El objetivo de este trabajo fue
investigar cuál es el rol de la activación de ERK en la multiplicación de
JUNV.
En primer lugar, se examinó la cinética de activación de ERK en cultivos
de células Vero infectadas con JUNV o JUNV inactivado con luz UV. El
análisis por western blot (WB) de los niveles de p-ERK detectados a
diferentes tiempos post-infección (p.i.) mostró que el virus infeccioso
induce una activación temprana de ERK en los primeros minutos de la
infección y una tardía a partir de las 7 h p.i. Por el contrario, el virus
inactivado produjo sólo la fosforilación temprana de ERK.
Por otra parte, se analizó la activación ERK en células Vero tratadas con
clorpromazina (CZ), inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina, e
infectadas con JUNV. La inhibición de la internalización viral provocada
por CZ produjo una marcada disminución, detectada por WB, de los
niveles de p-ERK y de la nucleoproteína viral N internalizada detectada
a 1 h p.i.
Para establecer si la entrada del virus a la célula requería de la
fosforilación temprana de ERK, células Vero se infectaron con JUNV a 4
°C y luego los cultivos se incubaron a 37°C en presencia de U0126 o
PMA. La cuantificación del virus internalizado a distintos tiempos p.i.
mostró que U0126 no afecta la cinética ni la cantidad de virus
internalizado; sin embargo PMA provocó un incremento significativo de
la internalización de viriones.
Con el objeto de evaluar el efecto de U0126 sobre la síntesis de
proteínas virales en un único ciclo de multiplicación, este compuesto se
agregó a distintos tiempos p.i. en células Vero infectadas con JUNV y a
las 14 h p.i. se cuantificó el rendimiento viral por UFP y la síntesis de N
por WB. La adición temprana de U0126 provocó una marcada inhibición
de la síntesis de N mientras que los títulos virales se redujeron de
manera significativa aún en aquellos cultivos tratados con U0126
durante las últimas 4 h de la infección.
40
Libro de resúmenes
En conclusión, JUNV induce la activación bifásica de ERK: la activación
temprana es consecuencia de la internalización viral, mientras que la
activación tardía depende la multiplicación viral. Asimismo, la
activación temprana de ERK no sería indispensable para la entrada de
JUNV. La caracterización del modo de acción de U0126 permitió
determinar que este compuesto no afecta la entrada del virus pero sí
inhibe la síntesis de proteínas y las etapas tardías de la multiplicación
viral.
0166
DESARROLLO DE VIRUS RECOMBINANTES PARA ESTUDIAR LA
ENTRADA DEL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA A LA CÉLULA
HUÉSPED
F Merwaiss, C Czibener, DE Alvarez
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, UNSAM-CONICET,
Argentina.
El virus de la dirrea viral bovina (BVDV) es un pestivirus patógeno del
ganado vacuno cercanamente relacionado al virus de la hepatitis C
dentro de la familia Flaviviridae de virus de RNA simple cadena de
polaridad positiva. La cubierta del virus está compuesta por una
membrana lipídica y las glicoproteínas estructurales E1 y E2 que
median la entrada del virus a la célula huésped. La entrada de BVDV ha
sido estudiada empleando métodos de virología tradicionales basados
en la cuantificación de la unión del virus a la célula o de la
susceptibilidad a la infección. De acuerdo con estos estudios, BVDV
entra a la célula utilizando la endocitosis dependiente de clatrina
mediada por la unión del virus a receptores específicos del huésped. La
fusión de membranas permite que el virus libere el genoma de RNA al
citoplasma para iniciar un ciclo de replicación. Distintos trabajos
sugieren que la entrada de BVDV a la célula huésped requiere de la
interacción del virus con receptores y co-receptores aún no
identificados en una secuencia de pasos poco estudiados a nivel
molecular. Nuestro objetivo es comprender cuáles son las interacciones
huésped-patógeno que median la entrada de BVDV a la célula huésped.
Utilizando genética inversa para manipular el genoma del virus
desarrollamos nuevas herramientas que nos permitirán estudiar el
detalle molecular del proceso de entrada. Se construyó el virus
recombinante BVDV/BAP-E2, que expresa una versión de E2 fusionada
en su extremo amino terminal al péptido aceptor de biotina (BAP) para
permitir la marcación sitio específica de la partícula viral. Nuestros
resultados indican que la fusión de BAP a E2 no interfiere con la función
de la glicoproteína de envoltura. BAP es el sitio blanco para la unión de
biotina mediada por la enzima biotin-ligasa BirA de Escherichia coli. La
infección de células que expresan establemente BirA con BVDV/BAP-E2
permitirá recuperar del sobrenadante de infección partículas virales
marcadas con biotina en su superficie. Esta estrategia de marcación
puede usarse para unir sondas fluorescentes a E2 permitiendo seguir
partículas virales individuales por microscopía de fluorescencia.
Además se construyó el virus BVDV/GFP, que expresa la proteína verde
fluorescente (GFP) en el contexto del genoma de RNA del virus. Con el
fin de asegurar su correcto procesamiento, se insertó GFP fusionada en
su extremo carboxilo terminal a la autoproteasa 2A del virus de aftosa
(FMDV2A) entre la proteasa de BVDV Npro y la proteína de cápside C.
Utilizando BVDV/GFP, pueden identificarse las células infectadas por el
virus mediante la detección de GFP. Estos virus recombinantes servirán
como herramientas para la caracterización de nuevos factores del
huésped receptores y co-receptores de entrada de BVDV y para el
estudio molecular de la interacción de partículas virales individuales
con estos factores.
0171
CONSTRUCCIÓN DE UN REPLICÓN PARA EL VIRUS DE LA FIEBRE
AFTOSA Y ANÁLISIS DE LA REGION N-TERMINAL DE 3A EN LA
REPLICACIÓN/TRANSCRIPCIÓN
CM Lotufo, M Wilda, AN Giraldez, PR Grigera, NM Mattion
ICT Milstein - CONICET, Argentina.
Introducción
La fiebre aftosa es una enfermedad vesicular aguda que afecta a
animales rumiantes biungulados, de amplio rango de huesped y rápida
propagación. El agente causal es el virus de la fiebre aftosa (VFA), un
virus no envuelto con genoma ARN de polaridad positiva perteneciente
a la familia Picornaviridae. El genoma del VFA codifica para 4 proteínas
estructurales y 8 proteínas no estructurales, entre estás últimas se
encuentra la proteína 3A de 153 aa de longitud. Esta posee un dominio
hidrofóbico N-terminal (aa 25-44) y un dominio hidrofóbico
transmembrana (aa 57-76). Se cree que 3A juega un papel relevante en
la síntesis del ARN y en el anclaje a membranas intracelulares del
complejo replicativo, como también en el grado de virulencia y rango
de huésped del VFA.
Objetivos
Generar por medio de genética reversa, un replicón que pueda ser
usado en laboratorios de seguridad mínima y permita el estudio de los
componentes de la replicación y transcripción viral, de las proteínas no
estructurales, así como de las regiones 3´ y 5´ no codificantes.
Identificar en 3A dominios involucrados en la replicación/transcripción
a través de mutaciones generadas en el replicón sobre el
correspondiente gen.
Metodologías
Se diseñó y construyó un replicón plasmídico basado en una copia de
ADN del genoma completo del VFA de la cepa O1/Campos, en el cual se
le reemplazaron las proteínas capsidales por el gen reportero de la
luciferasa de luciérnaga (pRep), bajo regulación del promotor de la
polimerasa del fago T7 (T7pol). Como control de la actividad replicativa
de pRep, se construyó un replicón defectivo del mismo por medio de
una deleción de 1 nt la cual genera un transcripto no funcional (pRepD).
Para la medición de la actividad luciferasa del replicón y su control
células BHK-21 se cotransfectaron con los plásmdos pRep o pRepD
junto con los plásmidos que expresan T7 polimerasa y luciferasa renila
(normalizador). Se obtuvieron lisados celulares a 8,16 y 24 hs posttransfección (pt) y la actividad luciferasa (luciérnaga y renilla) de los
mismos se midió utilizando el Dual-Luciferase Assay System™
(Promega) con un luminómetro BioTek FLx800. Para el estudio de 3A se
realizaron deleciones sobre pRep en la región que codifica para el
extremo N terminal, resultando las mutantes: p∆6-11, p∆6-17 y p∆6-23
fueron evaluadas utilizando la misma metodología junto con pRep y su
control pRepD a 16hs pt.
Resultados
Se logró la construcción del Replicón del VFA O1/Campos con capacidad
de trascripción/replicación medible a través de la actividad luciferasa,
obteniéndose la mayor actividad a las 16hs. Las mutantes p∆6-11 y
p∆6-17 presentaron actividades de luciferasa similares a pRep,
planteando que la región comprendida entre los aa 6 a 17 de 3A no
sería necesaria para la funcionalidad del mismo. Por el contrario, p∆623 presentó una disminución en dicha actividad, sugiriendo que los aa
18 a 23 de 3A podría estar involurados en los eventos de
replicación/transcripción.
0210
MÚLTIPLES REGIONES CODIFICANTES Y NO CODIFICANTES DEL
GENOMA DE LOS BACULOVIRUS ACTUARÍAN COMO ORÍGENES DE
REPLICACIÓN
SAB Miele, MV Nugnes, CS Cerrudo, CN Parsza, DL Mengual Gómez, PD
Ghiringhelli, MN Belaich
Laboratorio de Ingeniería Genética y Biología Celular y Molecular -Área
Virosis de Insectos-, Universidad Nacional de Quilmes, Argentina.
Los baculovirus son un grupo de patógenos de lepidópteros,
himenópteros y dípteros con numerosas especies distribuidas por todo
el planeta. Se caracterizan por presentar un genoma grande de dsDNA
circular (80-180 kpb), y en función del hospedador que parasitan, su
carga genética y morfología se clasifican en 4 géneros:
Alphabaculovirus,
Betabaculovirus,
Gammabaculovirus
y
Deltabaculovirus. El gran interés por esta familia viral radica en sus
numerosas aplicaciones biotecnológicas, que incluyen el control
biológico de plagas agrícolas, la expresión de proteínas recombinantes,
o la vehiculización de genes terapéuticos en mamíferos, entre otras. Y
en muchos de estos usos, los genomas baculovirales deben ser
alterados. Por ello, el conocimiento acabado de las funciones génicas
esenciales y auxiliares se transforma en un foco de investigación central
para expandir y optimizar los usos derivados de estos virus de insectos.
Entre tales funciones se encuentra la replicación del genoma viral y el
41
Libro de resúmenes
reconocimiento de cuáles secuencias participan como puntos de inicio
de la síntesis de DNA.
Considerando lo anterior, se eligió al nucleopoliedrovirus múltiple de
Anticarsia gemmatalis (AgMNPV) y a la línea ceular UFL-Ag-286 como
modelo de estudio para identificar y caracterizar los orígenes de
replicación (ORI) en baculovirus. Para ello, en primer lugar se realizó un
estudio de la cinética de replicación genómica durante 30 horas
mediante PCR en tiempo real, dónde se identificaron 4 fases: una inicial
de 5 horas sin progreso de síntesis de DNA; una etapa exponencial de
11 horas; una fase intermedia de 6 horas sin incremento significativo de
DNA viral; y por último, otra etapa exponencial de síntesis. Una vez
conocida la temporalidad de la replicación, se procedió a la búsqueda
de secuencias ORI. Para ello, se construyó una biblioteca genómica de
AgMNPV en bacterias (insertos de entre 500-2.000 pb); y luego, todos
las construcciones genéticas derivadas fueron transfectadas en células
UFL-Ag-286, a las cuales también se las infectó con el virus. Pasado un
período de incubación que involucrara las 4 fases antes identificadas, se
recuperaron los plásmidos, se los trató con la endonucleasa DpnI para
eliminar el DNA molde no replicado en las células eucariotas, y se
transformaron bacterias competentes. Del análisis de estos nuevos
clones pudieron identificarse 8 porciones codificantes y 8 no
codificantes del genoma baculoviral que pudieron replicar a las
construcciones por la acción transactivadora de la maquinaria viral. Un
posterior análisis bioinformático sobre las secuencias pudo mostrar que
la característica común de todas las regiones recuperadas fue la
existencia de palíndromos dispuestos en un patrón particular,
posibilitando en consecuencia generar una estructura secundaria
conservada, similar a la que se puede predecir en otras especies
baculovirales, que probablemente sea la responsable de la captura de
la maquinaria de replicación.
0319
EFECTO DE LA DELECIÓN DEL GEN AC109 DEL BACULOVIRUS ACMNPV
EN SU INTERACCIÓN CON CÉLULAS DE MAMÍFERO
V Alfonso1 2, S Amalfi1, GS Costa Navarro1, MG López1 2, O Taboga1 2
1
Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA, Argentina. 2 CONICET,
Argentina.
Los baculovirus son patógenos de insectos utilizados en el control
biológico de plagas y como vectores de expresión de proteínas
heterólogas en cultivos de células de insecto y en larvas de
lepidópteros. Además, se estudia su utilización en terapia génica, como
vacunas e inmunomoduladores en mamíferos, pues son capaces de
ingresar en estas células pero no de replicar en ellas. La proteína Ac109
de Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus es esencial
para la replicación viral en insectos. Nuestros trabajos previos han
descripto que es una proteína localizada en la nucleocápside y han
mostrado su relevancia en los procesos de envoltura y oclusión de los
viriones en el núcleo celular y en la llegada de las nucleocápsides a los
núcleos de nuevas células infectadas. Con el objeto de determinar si
Ac109 está involucrada en la interacción de los baculovirus con las
células de mamífero, se evaluó la presencia de DNA viral en citoplasma
y núcleo utilizando virus defectivos para esta proteína. Se construyeron
baculovirus ac109 knockout (KO) que además contenían el gen de la
proteína verde fluorescente eGFP bajo la regulación del promotor
citoplasmático T7 o del promotor de la β actina de pollo activo en el
núcleo de las células de mamífero, se evaluó la integridad de los
viriones a través de la presencia y proporción de las proteínas
mayoritarias GP64 y VP39 y se analizó la fluorescencia en células de
mamífero tras la infección con cantidades equivalentes de virus salvajes
y KO. La cantidad de células que mostraron la presencia de DNA viral en
el citoplasma o en núcleo disminuyó dos órdenes de magnitud cuando
los viriones no poseían Ac109 en su estructura. Dado que la integridad
de la envoltura de los viriones nos permite asumir que la entrada de los
virus a las células no está alterada, estos resultados muestran que el
desensamblado de las nucleocápsides y liberación del genoma en
ambos comportamientos podría verse afectado, mientras que, a
diferencia de lo observado en células de insecto, la entrada de las
nucleocápsides en el núcleo no parece estar impedida.
0352
OBTENCIÓN DE UN CLON INFECCIOSO PARA EL ARENAVIRUS
TACARIBE
S Foscaldi, ME Loureiro, C Marotte, A D’Antuono, N Lopez
Centro de Virología Animal (CEVAN)-Instituto de Ciencia y Tecnología
“Dr. Cesar Milstein”, CONICET, Argentina.
La familia Arenaviridae incluye virus productores de fiebres
hemorrágicas en humanos, tales como el virus Junin, así como virus no
patógenos como el virus Tacaribe (TCRV), prototipo de los arenavirus
del Nuevo Mundo. TCRV es un virus envuelto, cuyo genoma está
constituido por dos segmentos de ARN de cadena simple (llamados S y
L). Ambos segmentos usan una estrategia “ambisentido” para codificar
dos proteínas: la nucleoproteína (NP) y el precursor (GPC) de las
glicoproteínas de envoltura en el ARN S; la ARN polimerasa viral (L) y la
proteína Z, esencial para la morfogénesis viral, en el ARN L. Las
proteínas NP y L son necesarias y suficientes para sostener la
transcripción y replicación del genoma viral.
En este trabajo hemos generado un sistema de genética reversa para la
obtención de TCRV infeccioso a partir de plásmidos transfectados en
células de mamífero. En primer lugar, se construyeron los plásmidos
pSag y pLagWT que expresan, respectivamente, la copia
complementaria completa del ARN S y del ARN L de TCRV bajo el
control del promotor de la ARN polimerasa del fago T7 (T7Pol).
Construimos además dos plásmido derivados del pSag, denominados
pSagGFP y pSagCherry, que contienen el gen de la proteína
fluorescente GFP o mCherry en remplazo del gen GPC o NP,
respectivamente. También se generó un plásmido control, pLag_pol(-),
que contiene dos cambios puntuales en el ORF de L que inhiben su
actividad polimerasa.
Para evaluar estas construcciones se emplearon células BHK-T7, que
expresan la T7Pol en forma constitutiva. Las células fueron
transfectadas con distintas cantidades de los plásmidos pSag GFP o
pSagCherry junto con pLagWT. Se evaluó paralelamente el efecto de la
adición a la mezcla de transfección de los plásmidos pNP y/o pL, que
expresan las proteínas NP y L, respectivamente. Los resultados
mostraron la acumulación de la correspondiente proteína fluorescente
(GFP o mCherry) en las células cotransfectadas con pLagWT. Además, la
adición de pL resultó en un incremento de la señal fluorescente. En
contraste, como se esperaba, no se detectó fluorescencia en las células
cotransfectadas con pLag_pol(-). Estos resultados indicaron que el ARN
transcripto a partir de los plásmidos pSagGFP o pSagCherry fue
efectivamente transcripto y replicado. Con el fin de obtener virus
infeccioso, células BHK-T7 fueron transfectadas con las cantidades y
proporciones óptimas de los plásmidos pSag, pLagWT y pL
determinadas previamente. La titulación de los sobrenadantes celulares
colectados luego de 72 hs de incubación, indicó la presencia de 102
pfu/ml de TCRV infeccioso. Luego de 4 pasajes de los sobrenadantes en
células BHK, se logró amplificar el stock viral obteniéndose un titulo de
106 PFU/ml. La generación de TCRV recombinante constituye una
valiosa herramienta para el estudio de diversos aspectos de la biología
de los arenavirus a nivel molecular, en el contexto de una autentica
infección.
0358
MODULACIÓN DE LA TRADUCCIÓN DE LOS ARN MENSAJEROS DEL
VIRUS TACARIBE MEDIADA POR LA REGIÓN 3’ NO CODIFICANTE
S Foscaldi, A D’Antuono, N Lopez
Centro de Virología Animal (CEVAN)-Instituto de Ciencia y Tecnología
“Dr. Cesar Milstein”, CONICET, Argentina.
Los ARNm del virus Tacaribe (TCRV), perteneciente a la flia.
Arenaviridae, poseen estructura cap en el extremo 5’. Poseen además
regiones 5’ y 3’ no codificantes (UTR) y, a diferencia de la mayoría de
los ARNm celulares, carecen de cola de poli(A) en el extremo 3’. Dentro
de la región 3’ UTR, presentan una secuencia de 40 nucleótidos que
podría adoptar una estructura secundaria muy estable de tipo hairpin.
Utilizando transcriptos sintéticos que contienen estructura cap,
codifican para el gen Firefly Luciferasa (FLUC), y que son análogos a uno
de los ARNm virales (el ARNm de la Nucleoproteína -NP-), demostramos
previamente que la integridad de la región 3’ UTR es requerida para la
traducción de los ARNm virales. En este trabajo, se analizó la
42
Libro de resúmenes
contribución de la estructura y la secuencia de dicha región en este
proceso. Para tal fin, se evaluó la eficiencia de traducción de
transcriptos sintéticos, con deleciones, inserciones o substituciones en
la región 3’ UTR, luego de la transfección de células en cultivo. El
reemplazo de la secuencia hairpin por una secuencia que podría
plegarse para formar una estructura de menor estabilidad resultó en un
aumento de la actividad FLUC de hasta 40% respecto al control;
mientras que la inserción de un segundo hairpin en el extremo 3’ del
ARNm la redujo en un 30%. La substitución de la totalidad de la región
3’ UTR por una secuencia de igual longitud, sin estructura secundaria
predicha, cuadriplicó los valores de actividad FLUC y su reemplazo por
una cola de poli(A) produjo valores de actividad FLUC que llegaron a
1400% respecto a los valores promedio del control. Por otra parte, se
investigó también la dependencia del factor celular de iniciación eIF4G
así como la contribución de la proteína viral NP. La cotransfección del
ARN sintético con un plásmido que expresa la proteasa 2A de
enterovirus resultó en el clivaje de eIF4G, determinado por Western
blot, y en la reducción de la actividad FLUC en un 50% respecto al
control. En contraste, la presencia de NP no modificó la eficiencia de
traducción del ARNm salvaje. Estos resultados, junto con la observación
que la ausencia del cap reduce 100 veces la eficiencia de traducción del
transcripto salvaje, sugieren que: 1) la traducción de los ARNm es
dependiente de cap y del factor celular eIF4G; 2) la proteína viral NP no
desempeñaría un rol en la traducción; 3) la estructura hairpin es un
elemento modulador de la eficiencia de traducción de los ARNm virales.
0412
ROL DE LAS ESTRUCTURAS DE ARN DURANTE LA ADAPTACIÓN A
HUMANOS Y MOSQUITOS
C Filomatori, S Villordo, A Gamarnik
Fundación Instituto Leloir-CONICET, Buenos Aires, Argentina.
El virus de dengue es un patógeno humano transmitido por mosquitos
para el cual no existen tratamientos antivirales efectivos. En este
trabajo hemos investigado la relevancia de las regiones no codificantes
del genoma del virus del dengue durante la adaptación viral. Mediante
ensayos de evolución in-vitro y el empleo de tecnologías de
secuenciación de nueva generación hemos podido detectar una
secuencia del extremo 3’ del ARN viral que está sometida a fuerzas de
selección opuestas durante la adaptación del virus a células de
humanos y mosquitos. El empleo de técnicas de mapeo químico y
ensayos del fitness viral nos permitió determinar que esta región
contiene una estructura de ARN duplicada que necesita adaptarse
cuando el virus pasa de humanos a mosquitos. Durante la infección de
la célula huésped, se produce la acumulación de fragmentos de ARN
subgenómicos (ARNsf) derivados del extremo 3’ UTR de los Flavivirus.
Estos fragmentos se originarían por degradación incompleta de las
moléculas del genoma por acción una exoribonucleasa celular, la cual
se detiene en estructuras rígidas de ARN al inicio del 3’UTR. Puesto que
durante la adaptación al hospedador se seleccionan virus con
modificaciones en estructuras que podrían estar directamente
asociadas a la acumulación de los fragmentos subgenómicos,
estudiamos el patrón de ARNsf en virus adaptados a células de humano
y mosquito. Este abordaje nos ha permitido determinar que existe una
correlación entre la mejora del fitness viral y cambios cualitativos del
perfil de ARNsf durante la adaptación al hospedador. Con la realización
de este trabajo hemos generado nuevos conocimientos sobre la
biología de la transmisión del virus que podrán ser útiles para el
desarrollo de nuevas estrategias antivirales.
0414
REQUERIMIENTO DIFERENCIAL DE ESTRUCTURAS DE ARN PARA LA
REPLICACIÓN DEL VIRUS DEL DENGUE EN DISTINTOS HOSPEDADORES
L De Borba, SM Villordo, NG Iglesias, CV Filomatori, LG Gebhard, AV
Gamarnik
Laboratorio de Virología Molecular, Fundación Instituto Leloir-CONICET,
Argentina.
El virus del dengue (DENV) es un miembro de la familia Flaviviridae, que
incluye otros patógenos importantes, como el virus de la fiebre amarilla
(YFV), el virus del Nilo Occidental (WNV), el virus de la encefalitis de
Saint Louis (SLEV) y el virus de la encefalitis japonesa (JEV). El genoma
del DENV es una molécula de ARN, simple cadena y polaridad positiva
que contiene un único marco abierto de lectura flanqueado por
regiones muy estructuradas, 5’ y 3’ no traducidas (UTRs). Elementos de
ARN situados dentro de estas regiones son responsables de la iniciación
de la traducción y la replicación del genoma. El genoma del DENV es
una molécula dinámica que adopta conformaciones alternativas,
lineales y circulares, que son necesarias para la replicación del ARN viral
y el equilibrio entre estas formas del genoma es crucial para la
infectividad del virus. Recientemente, identificamos una estructura de
ARN en la región codificante de la proteína de cápside, a la que
llamamos C1, que facilita la circularización del genoma viral. Este
proceso esta mediado por interacciones ARN-ARN de larga distancia
por complementariedad de bases entre la secuencia conservada C1 y
una secuencia del 3’UTR contenida en una estructura llamada dumbbell
1 (DB1). Empleando genética reversa junto con estudios bioquímicos
pudimos demostrar que dichas interacciones de larga distancia
aumentan la eficiencia de replicación del ARN viral. En todos los
serotipos de DENV, la estructura DB1 se encuentra duplicada (DB2). Si
bien anteriormente se ha postulado que ambos DBs serían necesarios
para una replicación viral eficiente, aún se desconoce cómo funcionan
en forma individual. Debido a que nuestros estudios recientes le
asignan un rol específico a secuencias del DB1, nos propusimos
extender el análisis al DB2. Utilizando un clon infeccioso del DENV2 que
codifica para una luciferasa como reportero, diseñamos deleciones de
cada uno de los DBs o incorporamos mutaciones que alteren la
estructura de los mismos. Las moléculas de ARN viral fueron
transfectadas en células de mosquito y de mamífero crecidas en cultivo
y la replicación fue evaluada a distintos tiempos por medio de actividad
luciferasa. Los resultados indican que la deleción del DB1 disminuye
notablemente la replicación viral, corroborando la importancia de su
presencia para la interacción de larga distancia con la secuencia C1 de
cápside. Por otro lado, la deleción del DB2 aumentó más de 10 veces la
replicación viral en células de mosquito C6/36, sugiriendo que esta
estructura modula negativamente la replicación en dichas células.
Sorprendentemente el virus con la deleción del DB2 infectó y replicó en
células de mamífero a niveles comparables al virus parental. Estos
resultados resaltan un requerimiento diferencial de estructuras de ARN
del 3’UTR para la replicación del DENV en células de mosquito y
mamífero.
0415
ESTUDIO DE LOS REQUERIMIENTOS DE LA PROTEÍNA DE CÁPSIDE DEL
VIRUS DEL DENGUE PARA LA ENCAPSIDACIÓN Y EL DESNUDAMIENTO
DEL VIRUS
L Byk, NG Iglesias, MM Samsa, AV Gamarnik
Laboratorio de Virología Molecular, Fundación Instituto Leloir-CONICET,
Buenos Aires,, Argentina.
El virus del dengue (DENV) es el patógeno viral humano transmitido por
mosquito de mayor importancia a nivel mundial, infectando a más de
400 millones de personas cada año. Es un virus envuelto con un
genoma a RNA simple cadena de polaridad positiva de
aproximadamente 11 Kb. Contiene un solo marco abierto de lectura el
cual es traducido en una poliproteína que es procesada co y posttraduccionalmente dando lugar a 10 proteínas, 3 de las cuales son
estructurales: cápside, prM y E.
El virus ingresa a la célula hospedadora por un mecanismo de
endocitosis mediada por receptor, el cual involucra la unión de E a un
receptor celular. Luego de la internalización, la fusión de la membrana
viral con la membrana endosomal permite la liberación de la
nucleocápside al citoplasma. El desnudamiento viral involucra la
disociación de la cápside del RNA. Por otro lado durante la
morfogénesis de las nuevas partículas virales la proteína de cápside
debe asociarse al RNA para formar la nueva nucleocápside. Los
procesos de desnudamiento y encapsidación, que involucran ambos a
la proteína de cápside y al genoma viral, ocurren por mecanismos aún
desconocidos.
La proteína de cápside posee un peso molecular de 12 kDa, es
altamente básica y forma un homodímero en solución. Cada monómero
está formado por cuatro alfa hélices y los primeros 20 aminoácidos no
poseen estructura definida en solución.
43
Libro de resúmenes
En este trabajo examinamos los determinantes de la proteína de
cápside del virus del dengue necesarios para la encapsidación y el
desnudamiento. Un análisis mutacional sistemático utilizando un
sistema de virus reportero indicó que se requiere la presencia de
aminoácidos básicos en el extremo amino terminal y en el centro de la
alfa hélice 4 para la formación de partículas infectivas. A partir de estos
estudios elaboramos un modelo de interacción cápside-RNA.
Por otro lado se identificaron aminoácidos específicos que redujeron
levemente la producción de partículas virales pero que afectaron
drásticamente la infectividad viral. De esta forma identificamos
requerimientos específicos que nos permiten disociar los procesos de
encapsidación y desnudamiento. Por último, pudimos detectar y
estudiar la cinética de degradación de la proteína C que ingresa a la
célula durante la infección. Nuestros resultados indican que tanto C
como el genoma viral son degradados luego de la internalización, y que
la degradación de C es dependiente de la actividad del proteosoma.
0416
LA PROTEÍNA NS5 DEL VIRUS DEL DENGUE 2 ALTERA EL SPLICING
CELULAR DURANTE LA INFECCIÓN
FA De Maio1, G Risso2, NG Iglesias1, P Shah3, N Krogan3, R Andino3, A
Srebrow2, AV Gamarnik1
1
Laboratorio de Virología Molecular, Fundación Instituto Leloir –
CONICET, Argentina. 2 Laboratorio de Fisiología y Biología Molecular,
FCEyN UBA – CONICET., Argentina. 3 University of California, San
Francisco, Estados Unidos.
El virus del dengue posee un genoma de ARN simple cadena de
polaridad positiva el cual codifica un único marco abierto de lectura. El
ARN viral es traducido en una poliproteína precursora de 10 proteínas
virales. La proteína NS5 es la de mayor tamaño (105 kDa), con un
dominio metiltransferasa y otro ARN polimerasa dependiente de ARN,
siendo fundamental para la replicación viral. Con el objetivo de
identificar proteínas celulares que interaccionan con NS5 durante la
infección, se abordó un proyecto de proteómica. Para esto se
desarrolló un virus recombinante que expresa NS5 fusionada a un
péptido de purificación Strep-tag. Esto permite la recuperación de la
proteína viral formando parte de complejos proteicos nativos en el
contexto de una infección. Utilizando como herramienta este virus
modificado, se infectaron líneas celulares humanas y se procedió luego
a analizar por espectrometría de masa las proteínas recuperadas. Se
identificaron así más de 50 proteínas celulares con interacción
específica a NS5 durante la infección. Entre estas se observó la
presencia de componentes del spliceosoma, destacándose entre ellos
varios factores que integran la ribonucleoproteína denominada
complejo U5. Estos hallazgos fueron validados por estudios de
interacción de NS5 sobre-expresada con componentes específicos del
spliceosoma por medio de co-precipitaciones.
Con el fin de indagar sobre un posible efecto de la infección viral sobre
el splicing celular, analizamos en células no infectadas e infectadas una
serie de eventos de splicing alternativo de distintos genes por una
estrategia de PCR que permite detectar las distintas formas resultantes
de este proceso (inclusión o exclusión de un determinado exón en el
ARN mensajero maduro). Mediante esta técnica determinamos que la
infección viral tiene un claro efecto sobre la abundancia relativa de las
isoformas analizadas. En vista de estos hallazgos, estudiamos el efecto
directo de la proteína NS5 sobre eventos de splicing por medio de la
sobre-expresión de la proteína fuera del contexto de la infección. Para
ello transfectamos un vector de expresión de NS5 conjuntamente con
plásmidos portando “minigenes”, construcciones utilizadas como
reporteras de splicing. Los resultados de estos ensayos mostraron un
importante efecto de NS5 alterando la relación de isoformas en el
sistema usado. Por último, para estudiar la relevancia que la interacción
NS5-spliceosoma pudiera tener para la replicación viral, decidimos
realizar ensayos de RNA de interferencia para componentes del
spliceosoma
identificados
como
interactores
de
NS5.
Interesantemente, se observó que al interferir ciertos factores del
complejo U5 se produjo un incremento significativo en la replicación
viral.
Los resultados obtenidos indican que el virus del dengue altera el
patrón de splicing en células humanas infectadas, por un mecanismo
que involucra a la proteína NS5 y que probablemente esto de lugar a un
estado celular más favorable para la replicación viral.
0417
LA PROTEÍNA NS3 DEL VIRUS DEL DENGUE DESEMPEÑA UN ROL
ESENCIAL EN LA PRODUCCIÓN DE PARTÍCULAS VIRALES INFECTIVAS
LG Gebhard, NG Iglesias, LA Byk, FA De Maio, AV Gamarnik
Laboratorio de Virología Molecular, Fundación Instituto Leloir-IIBBA
CONICET, Argentina.
La proteína no estructural 3 (NS3) del virus del dengue (DENV) es una
proteína multifuncional (69 kDa) que contiene las actividades de serinproteasa, ARN-helicasa y NTPasa. Estas actividades enzimáticas son
esenciales para la replicación viral. Su dominio de proteasa (residuos 1
al 169) escinde la poliproteína viral en múltiples sitios. Su dominio
helicasa/NTPasa (residuos 179 al 618) asiste a la ARN-polimerasa viral
en la síntesis y amplificación del genoma viral. Estos dominios
funcionales y estructurales están unidos a través de una región
interdominio de 9 residuos de aminoácidos.
Se ha implicado al dominio helicasa de la NS3 del virus de la fiebre
amarilla (YFV), que al igual que DENV pertenece a la familia Flaviviridae,
en desempeñar un papel en el ensamblado de las partículas virales,
aunque su función en este proceso es hasta ahora desconocida.
Para determinar el papel de la NS3 del DENV en la formación de las
partículas virales, se utilizó genética inversa para llevar a cabo una
mutagénesis de barrido por alaninas en la secuencia de la NS3 de un
clon infeccioso del DENV. Para este estudio también se utilizó un virus
monocistrónico reportero que expresa luciferasa. Teniendo en cuenta
la estructura cristalográfica conocida de la NS3, se obtuvieron 30
mutantes del DENV con cambios en residuos superficiales situados en
los dominios de proteasa, helicasa, y la región interdominio. De
acuerdo a los niveles de expresión del gen de luciferasa en células
transfectadas con el virus reportero, algunos mutantes mostraron
defectos moderados o severos en la replicación viral. Otros mutantes
fueron capaces de replicarse y producir virus infecciosos tan
eficientemente como el virus original. Notablemente, ciertos mutantes
replicaron de manera eficiente, con niveles de expresión de proteínas y
ARN virales similares al virus original, pero tuvieron graves defectos e
incluso impedimentos en la producción de partículas infectivas. De esta
manera se identificaron ciertos residuos situados en los dominios de
proteasa, helicasa y la región interdominio de la NS3 que son esenciales
para el ensamblaje del virión y, consecuentemente, para la producción
de partículas infecciosas del DENV tanto en células de mamífero como
de mosquito.
En este trabajo se estableció que el ensamblado del virus del dengue y
la producción de partículas infecciosas son procesos sensibles a
mutaciones puntuales en residuos superficiales que no afectan las
actividades enzimáticas de la proteína NS3 y que los dominios de
proteasa, helicasa y la región interdominio de la NS3 están involucrados
en estos procesos.
Virus en plantas
0018
ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN IN VIVO DE LA PROTEÍNA SUPRESORA
DE SILENCIAMIENTO P0 DEL COTTON LEAFROLL DWARF VIRUS CON
PROTEÍNAS DEL HOSPEDANTE
VC Delfosse1, YC Agrofoglio1, MF Casse2, HE Hopp1, I Bonacic Kresic2, V
Ziegler-Graff3, AJ Distéfano1
1
Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA-Castelar, Argentina. 2 EEA
Roque Sáenz Peña, INTA-Chaco, Argentina. 3 Institute de Biologie
Moléculaire des Plantes (IBMP), Strasbourg, Francia.
El algodón es un cultivo regional clave en el NEA. La “enfermedad azul”
del algodón fue reportada en la Argentina durante la campaña agrícola
1982/83 y actualmente causa importantes pérdidas en el cultivo si no
se implementan medidas adecuadas de control. La enfermedad es
producida por el Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) y el virus es
transmitido por el pulgón del algodón Aphid gossypii Glover. El CLRDV
pertenece al género Polerovirus de la familia Luteoviridae, posee un
44
Libro de resúmenes
genoma de RNA simple cadena positiva (5,866 kb) que codifica para un
total de seis proteínas. Nuestro grupo ha demostrado recientemente
que la proteína P0CLRDV posee actividad supresora del mecanismo de
silenciamiento génico. Según lo reportado para la proteína P0 del
polerovirus Turnip yellow virus, P0 interacciona con el sistema SCFubiquitin ligase y media la degradación de la proteína AGO1 de la vía de
silenciamiento de la planta. Además, estos estudios indican que dicha
interacción ocurre a través del dominio F-Box (LPXXL/IX10-13P) de la
proteína P0.
Con el objetivo de determinar si la proteína P0CLRDV interacciona con el
sistema SCF-ubiquitin ligase se evaluó, mediante la técnica de doble
hibrido en levaduras, la interacción de P0CLRDV con las proteínas ASK de
Arabidopsis thaliana y sus correspondientes ortólogos en Nicotiana
benthamiana (SKP) y en su hospedador natural Gossipium hirsutum
(GSK). Además, se evaluaron dichas interacciones en mutantes de
P0CLRDV en el dominio F-Box (P0CLRDV-Box), con el objetivo de determinar
la implicancia de dicho dominio en el mecanismo de acción de P0CLRDV.
Los resultados indicaron que P0CLRDV es capaz de interaccionar con SKP
de N. benthamiana y GSK de G. hirsutum pero no fue posible
determinar su interacción con ASK de A. thaliana mediante la técnica
utilizada. Por otra parte P0CLRDV-Box perdió la capacidad de
interaccionar con SKP. Estos resultados muestran que el mecanismo de
acción de P0CLRDV se encuentra conservado respecto de otros P0
previamente caracterizados y que el dominio F-Box es indispensable
para que ocurra dicha interacción. Nuestros resultados representan un
avance en la comprensión de la función de P0CLRDV como factor de
patogenicidad del CLRDV.
0065
CARACTERIZACIÓN DE LA PROTEÍNA SUPRESORA DE SILENCIAMIENTO
Y DE MOVIMIENTO VIRAL DE UNA VARIANTE VIRULENTA DEL COTTON
LEAFROLL DWARF VIRUS
YC Agrofoglio1, VC Delfosse1, MF Casse2, HE Hopp1, I Bonacic Kresic2, AJ
Distéfano1
1
Instituto de Biotecnología, INTA Castelar, Argentina. 2 EEA Saénz Peña,
INTA Chaco, Argentina.
El algodón es un cultivo regional económicamente clave en el NEA. En
las campañas 2009/10/11/12 se detectó una virosis en cultivares de
algodón resistentes al Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV, género
Polerovirus), agente causal de la enfermedad azul, produciendo el
primer quiebre de resistencia del germoplasma local. Este nuevo virus
fue secuenciado completamente y se determinó que las proteínas
codificadas por el mismo tienen una identidad de secuencia con las
proteínas codificadas por el CLRDV que varía del 88% al 98%. Debido a
que la proteína P0 de esta variante del CLRDV posee menos de 90% de
identidad con respecto a la proteína P0 del CLRDV, postulamos a este
virus como una nueva especie dentro del género Polerovirus, a la que
denominamos Cotton leafroll bushy virus (CLRBV).
Nos propusimos determinar cuál/es de las proteínas del CLRBV son las
responsables del sobrepaso de la resistencia en las variedades de
algodón locales. Se seleccionaron para el estudio las proteínas P0 y P4.
P0 es la proteína que presenta el menor valor de identidad con
respecto al CLRDV (88%), además de ser una proteína descripta para
otros virus de la familia como determinante de patogenicidad y
supresor de silenciamiento génico. La proteína P4, es la proteína
responsable del movimiento del virus de célula a célula, presenta varios
cambios de aminoácidos con respecto al CLRDV (95% de identidad) y
esta descripto para otros virus que pequeñas variaciones en la proteína
de movimiento son responsables del quiebre del germoplasma
resistente.
Se demostró que la proteína P0 del CLRBV no posee actividad supresora
de silenciamiento local ni sistémico, a diferencia de lo observado con la
proteína P0 del CLRDV que sí posee actividad supresora de
silenciamiento local. Esto se debe, posiblemente, a una mutación
encontrada en el dominio F-Box, como fue demostrado para otros virus
del mismo género.
Se realizaron construcciones de reemplazos de las proteínas candidatas
en el clon infectivo de la variedad CLRDV y fueron evaluadas en
infecciones controladas en el invernáculo utilizando variedades de
algodón resistentes y susceptibles a enfermedad azul.
Las plantas con resistencia a CLRDV fueron infectadas con el clon
infectivo del CLRDV con su proteína de movimiento reemplazada por la
del CLRBV. Este virus no logró quebrar la resistencia y las plantas no se
infectaron, al igual que ocurre con el CLRDV. Por otro lado, las
variedades susceptibles que fueron infectadas con ambos virus no
mostraron diferencias con respecto a la sintomatología.
Los cambios aminoacídicos encontrados en la MP de CLRBV no serían
los responsables por sí solos del quiebre de la resistencia y de la distinta
sintomatología observada en las plantas de algodón.
0203
CARACTERIZACIÓN DEL PERFIL DE SIRNAS DERIVADOS DEL GENOMA
DEL VIRUS DEL MAL DE RÍO CUARTO EN PLANTAS DE TRIGO
INFECTADAS UTILIZANDO SECUENCIACIÓN DE ALTO RENDIMIENTO
LA de Haro1, A Dumón2, MF Mattio2, E Argüello Caro2, G Llauger1, D
Zavallo1, S Asurmendi1, G Truol2, M del Vas1
1
Instituto de Biotecnología, CICVyA, CNIA, INTA, Argentina. 2 Instituto
de Patología Vegetal, CIAP, INTA, Argentina.
El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causa la
enfermedad más importante del maíz en la Argentina. El virus replica
tanto en gramíneas como en insectos de la familia Delphacidae que
actúan como vectores. Su genoma está compuesto por 10 segmentos
de dsRNA que codifican para 13 proteínas.
El silenciamiento génico mediado por RNA es un mecanismo
generalizado de defensa contra infecciones virales y bacterianas que da
lugar a RNAs de 21 a 24 nt que se denominan ARNs pequeños
interferentes o siRNAs. Durante el desarrollo de una infección viral, el
silenciamiento se desencadena a partir de estructuras de dsRNA que se
producen durante la replicación que dan lugar a siRNAs derivados del
genoma viral (vsiRNAs). Luego, proteínas de tipo AGO se unen a
vsiRNAs formando complejos RISC capaces de reconocer de manera
específica de secuencia a moléculas blanco de mRNA promoviendo su
degradación o la represión de su traducción.
En el presente trabajo, se infectaron plántulas de trigo con MRCV
utilizando su vector natural (Delphacodes kuscheli) en condiciones
controladas de invernáculo (dos réplicas de n = 164). Se colectaron
muestras de hojas superiores a la hoja infectada a los 12 y 21 días post
transmisión (dpt) y se cuantificó la carga viral por RT-qPCR. Se extrajo
RNA enriquecido en RNAs pequeños a de pooles de 3 plantas con carga
viral similar y se secuenciaron utilizando el equipo HiSeq 1500 (Illumina,
INDEAR). Luego del recorte de adaptadores y filtrado por calidad se
obtuvieron en promedio 23 millones de lecturas limpias por muestra.
En primer lugar se mapearon las secuencias obtenidas al genoma viral
utilizando el programa CLC Genomics Workbench. Entre ellas
dominaron las lecturas de 21 y 22 nt que se distribuyeron de manera
heterogénea entre los 10 segmentos. Un promedio de 230 mil lecturas
(~1,7%) mapearon a los 12 dpt mientras que 1,9 millones (~5,2%) lo
hicieron a 21 dpt. A partir de todas las secuencias virales se reconstruyó
el genoma correspondiente al aislamiento de MRCV utilizado.
Se analizó el número de lecturas por cadena y por segmento,
obteniéndose perfiles diferenciales según los dpt. Se observó una
acumulación y distribución de vsiRNAs característica para cada
segmento, posiblemente debida a diferencias en los niveles de
expresión de cada uno de ellos y/o a la presencia de estructuras
secundarias. Finalmente, se estudió si aquellas regiones del genoma
viral en las que mapearon un número inusitadamente alto de lecturas
(hot spots) son capaces de plegarse sobre sí mismas dando lugar a
estructuras secundarias locales de dsRNA que podrían desencadenar
silenciamiento de manera preferencial. En particular, se observó una
alta cantidad de vsiRNAs que mapean sobre los extremos 5´ y 3´ de los
segmentos 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 y 10.
Este trabajo representa el primer estudio de RNAs pequeños virales
para Mal de Río Cuarto, y según nuestro conocimiento, la primera
secuenciación de RNAs pequeños en plantas de trigo infectadas con
virus.
45
Libro de resúmenes
0312
ANÁLISIS DE INFECCIONES MIXTAS DE BEGOMOVIRUS EN TOMATE Y
PIMIENTO EN INVERNADERO MEDIANTE LA TÉCNICA DE ROLLING
CIRCLE
AMPLIFICATION-RESTRICTION
FRAGMENT
LENGTH
POLYMORPHISM (RCA-RFLP)
VA Bornancini, CG Vaghi Medina, D Ducasse, PM López Lambertini
Instituto de Patología Vegetal, CIAP-INTA, Argentina.
El género Begomovirus (Familia Geminiviridae) agrupa virus que
ocasionan severas pérdidas económicas en el cultivo de tomate y
pimiento en nuestro país y a nivel mundial. Son virus con genoma de
DNA simple cadena empaquetado en partículas gemelas, transmitidos
por mosca blanca (Bemisia tabaci). Particularmente en Argentina
hemos identificado 7 especies de begomovirus y la presencia de
infecciones mixtas en tomate. En el presente trabajo nuestro objetivo
fue estimar la diversidad de begomovirus en tomate y pimiento
involucrados en infecciones mixtas mediante RCA-RFLP en localidades
productoras (Pichanal, Orán, Yuto y Lules) del noroeste argentino
(NOA). Para ello se analizaron mediante la técnica de PCR-Multiplex 101
muestras de pimiento y 117 de tomate. A partir de las muestras
positivas (52 de pimiento y 59 de tomate) se amplificaron mediante
RCA los genomas completos de begomovirus. Cada producto de
amplificación fue digerido con ApaI, BamHI, PstI y XhoI y sembrado en
geles de agarosa al 1,2% obteniéndose 4 patrones polimórficos de
restricción para cada muestra, a partir de los cuales quedó conformado
un patrón de restricción combinado (PRC). Se obtuvieron un total de 58
PRC de los cuales correspondieron 34 PRC para tomate y 24 PRC para
pimiento y solo 4 de estos patrones fueron compartidos entre ambos
cultivos. La cantidad de PRC registrados en un mismo invernadero
osciló entre 1-4 para pimiento y 1-11 para tomate. La elevada cantidad
de PRC registrados permite inferir una gran diversidad de especies de
begomovirus y la presencia de distintos begomovirus involucrados en
infecciones mixtas en plantas que se encuentran en un invernadero.
Cabe destacar que mediante el presente trabajo se confirma la
presencia de infecciones mixtas de begomovirus en pimiento en
nuestro país. Debido a los resultados obtenidos se alerta sobre la
ineficiencia de seleccionar medidas de control basadas en resistencia a
un begomovirus en particular, ya que el escenario es mucho más
complejo.
0314
RECONSTRUCCIÓN DE HAPLOTIPOS DEL GENOMA COMPLETO DEL
VIRUS DEL MOSAICO ESTRIADO DEL TRIGO (WHEAT STREAK MOSAIC
VIRUS, WSMV) A PARTIR DE SECUENCIAS GENERADAS POR TÉCNICAS
DE NUEVA GENERACIÓN (NEXT-GENERATION SEQUENCING)
V Alemandri, PM López Lambertini, G Truol
IPAVE-CIAP-INTA, Argentina.
El virus del mosaico estriado del trigo o Wheat streak mosaic virus
(WSMV) es la especie tipo del género Tritimovirus en la familia
Potyviridae. WSMV es el agente causal de una de las enfermedades
virales más importantes en ese cereal. Está constituido por un
segmento de ssRNA sentido positivo de aproximadamente 9384
nucleótidos, el cual es traducido como una única poliproteína, con una
organización de su genoma similar a los Potyvirus. WSMV se encuentra
en plantas infectadas como poblaciones heterogéneas de variantes
genéticas no idénticas pero si relacionas entre sí. Las técnicas de
secuenciación de nueva generación (next-generation sequencing, NGS)
permiten realizar estudios con nuevos enfoques sobre la diversidad de
poblaciones virales dentro de su hospedante. El objetivo de este
trabajo fue obtener la reconstrucción de haplotipos del genoma
completo del WSMV y su frecuencia a partir de secuencias generadas
por pirosecuenciación (tecnología 454, Roche) en plantas de trigo y
otras gramíneas infectadas. Se diseñaron iniciadores y se ajustaron
todos los parámetros de la reacción de RT-PCR para la amplificación del
genoma completo del virus. Los productos de amplificación de 13
aislamientos del WSMV de diferentes regiones productoras del país se
aislaron de gel de agarosa y se secuenciaron mediante 454/Roche GS
FLX (INDEAR). Las lecturas obtenidas fueron sometidas a una serie de
pasos de pre-procesamiento utilizando la herramienta FlexBar y el
paquete estadístico R. Los mismo implicaron eliminación de
adaptadores, separación por barcode y filtrado según criterios de
calidad. Se emplearon las siguientes cuatro herramientas de
ensamblado para la reconstrucción de haplotipos virales de genoma
completo a partir de secuencias generadas por técnicas NGS: QuasQ,
QuRe, QuasiRecomb y PredictHaplo. Se logró la reconstrucción de
haplotipos, y la estimación de su frecuencia, del genoma completo de
todos los aislados de virus con tres de los ensambladores, con la
excepción de QuRe, el cual solo reconstruyó haplotipos parciales de
longitudes menores. Se observó diferencias en el número y frecuencia
de haplotipos tanto entre los aislados virales estudiados, como entre
diferentes programas utilizados. La herramienta PredictHaplo estimó
menor número de haplotipos para todos los aislados virales (entre 1 y
4), a diferencia de QuasQ y QuasiRecomb, los cuales se mostraron
menos conservadores (entre 3 y 10000). La diferencia en el número y
frecuencia de haplotipos de cada muestra observada entre los
diferentes programas, donde solo comparten una tendencia las
muestras con mayor número de haplotipos, es un buen debate. Los
resultados obtenidos en este trabajo permitirán contribuir a una mejor
comprensión de la diversidad genética intra-hospedante del WSMV y
aportarán conocimientos para el manejo de esta enfermedad en el
cultivo de trigo.
0332
DESCRIPCIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DE UN AISLAMIENTO
COLOMBIANO DEL VIRUS DE LA RAYA NECRÓTICA DEL FIQUE
GP Barrera Cubillos1, MN Belaich2
1
CORPOICA, Colombia. 2 Universidad Nacional de Quilmes, Argentina.
El fique (Furcraea spp.) comprende a un conjunto de especies de agave
muy cultivados en las zonas alto-andinas de la América tropical. Su
valor comercial radica en la alta calidad de las fibras que producen sus
hojas, aptas para su uso en diversas cadenas industriales, aunque
también son empleadas por los pueblos originarios para la producción
de artesanías, expresando así su valor cultural. Por otro lado, cumple
un rol social dado que se promueve su siembra en reemplazo de otros
vegetales cuyo cultivo es ilícito. Su distribución en Colombia comprende
principalmente a los Departamentos Cauca, Nariño, Santander,
Antioquia y Boyacá, caracterizándose por su desarrollo en territorios
relativamente secos y atemperados por la acción de la altura. Y dado el
rol destacado que quiere otorgársele a este vegetal, se está trabajando
en pos de describir los factores que entorpecen su desarrollo para
propender a su mejor explotación. Por ejemplo, una de las principales
causas que afectan la productividad es la enfermedad de la Macana
producida por el virus de la raya necrótica (Furcraea Necrotic Streak
Virus o FNSV). Este patógeno se encuentra distribuido por toda el área
productiva de Colombia, y posiblemente sea propagado por algunas
especies de hongos que actuarían como vectores. Considerando esta
situación, es importante describir biológicamente al virus y desarrollar
estrategias diagnósticas que posibiliten el control de su dispersión,
como así también diseñar aproximaciones terapéuticas que puedan
servir en la mejora de la sanidad de los cultivos vigentes, dado que el
potencial productor de fibra se da años después de la siembra del
vegetal.
En el Departamento Nariño se tomaron muestras de plantas de fique
con sintomatología de la enfermedad de la Macana, a partir de las
cuales se aislaron partículas virales que fueron caracterizadas mediante
microscopia electrónica. Posteriormente, se aisló el material genético
de RNA simple cadena y polaridad positiva, el cual se retro-transcribió
in vitro utilizándose para ello primers diseñados ad hoc basados en una
única secuencia disponible. Mediante clonado molecular de los
productos, secuenciación automática por Sanger y RACE 5´ y 3´ se
completó la secuencia genómica. Su análisis bioinformático permitió
identificar las regiones codificantes y clasificar a este virus dentro de la
Familia Tombusviridae. Por otro lado y como una primera aproximación
para su control y potencial erradicación, se inició con el desarrollo de
una estrategia basada en PCR para colaborar en el diagnóstico y
seguimiento de la dispersión de este patógeno en las zonas
colombianas productoras de Fique.
46
Libro de resúmenes
0338
ESTUDIO DE LA ALTERACIÓN DEL PROCESAMIENTO Y ACUMULACIÓN
DEL MICRORNA-156 EN PLANTAS DE CITRUS CINENSIS (NARANJO
DULCE) INFECTADAS CON CITRUS PSOROSIS VIRUS
FE* Marmisollé1, CA* Reyes1, E Ocolotobiche1, A Bazzini2, S Asurmendi3,
ML Garcia1
1
Instituto de Biotecnología y Biología Molecular, CCT-La Plata, CONICET
– UNLP, La Plata, Buenos Aires, Argentina. 2 Department of Genetics,
Yale University School of Medicine, New Haven, CT 06510, Estados
Unidos. 3 Instituto de Biotecnología, CICVyA-INTA, Hurlingham, Buenos
Aires, Argentina.
* Ambos autores contribuyeron de igual manera en este trabajo.
Citrus psorosis virus (CPsV) es el miembro tipo del género Ophiovirus,
familia Ophiovoridae. Su genoma consiste de tres RNAs de simple
cadena de polaridad negativa que codifican para cuatro proteínas: la
RNA polimerasa RNA dependiente (280K) la proteína de movimiento
(MP), la proteína de cápside (CP) y una pequeña proteína (24K) cuya
función se desconoce. Los microRNAs (miRNAs) juegan un rol muy
importante en la regulación del desarrollo de la planta. Estudios
recientes realizados en plantas y animales han sugerido que los virus
pueden interferir con la regulación de genes del huésped mediada por
miRNAs a través de diferentes estrategias. Los miRNAs pueden ser
afectados por la infección viral a nivel transcripcional o
postranscripcional esta última pudiendo involucrar el procesamiento, la
acumulación o la actividad de los miRNAs de la planta.
Plantas de naranja dulce (Citrus sinensis (L.) Osbeck) fueron infectadas
con CPsV y se observó una desregulación en la acumulación de un
grupo de miRNAs conservados de la planta. Los niveles de las especies
maduras de los miRNAs en las muestras de tejido infectado, evaluadas
por Northern blot, disminuyeron respecto a las muestras sanas y se
registró además un aumento concomitante de sus transcriptos targets
(analizados por RT-qPCR). En particular el miR156 y sus targets SPLs
(Squamosa Transcription Factors) fueron de los más afectados. Los
precursores e intermediarios de procesamiento de dicho miRNA fueron
también analizados mediante ensayos de Northern blot y corroborados
por ensayos de RT-qPCR. Las muestras de tejido infectadas mostraron
un aumento de la acumulación de los precursores no procesados (premiRNAs) respecto de las sanas. En particular se observó que el premiR156 de 143 nt se procesa mediante un mecanismo del tipo loop to
base de dos cortes que también fue confirmado por modelaje
bioinformático de las secuencia de los 7 miembros de la familia de
precursores del miR156. Mediante Northern blots se detectaron los
productos de ambos cortes. El primer corte produce dos especies
intermediarias; una de 41 nt que constituye el loop principal y dos de
51 nt que incluyen los dos brazos del tallo principal y la secuencia
madura. El segundo corte libera la especie madura. En las muestras
infectadas la acumulación de estos intermediarios se encuentra
reducida concomitantemente con el mencionado aumento en los
precursores no procesados.
Los resultados obtenidos nos permiten proponer la existencia de una
asociación entre alguna o varias de las proteínas y/o RNAs virales y los
precursores de miRNAs, que impediría el normal procesamiento de los
mismos por la maquinaria de silenciamiento.
0345
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y FILODINÁMICA DEL VIRUS DE LA
TRISTEZA DE LOS CÍTRICOS
MJ Benítez1, A Bertalmío2, L Rubio2, F Rivas2, D Maeso2, R Colina1
1
Universidad de la República, CENUR Noroeste, Salto, Uruguay. 2
Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, Uruguay.
Desde que apareció hace dos siglos atrás, la enfermedad conocida
como Tristeza, es la enfermedad viral más devastadora de la industria
citrícola a nivel mundial. Su agente etiológico, el Virus de la Tristeza de
los Cítricos (CTV), es transmitido por injertos de material vegetal
infectado o por insectos vectores como el áfido Toxoptera citricida. La
existencia de variantes genéticas del virus con diversos grados de
severidad, han sido reportadas en todas las áreas citrícolas afectadas.
La caracterización de aislados de CTV puede proveer información
epidemiológica importante que puede ser de gran utilidad para el
control de la enfermedad. En el Uruguay, no existen datos moleculares,
que reflejen las variantes genéticas circulantes en el país. De esta
manera nos propusimos realizar en el presente estudio el diagnóstico y
caracterización de CTV mediante el uso de técnicas moleculares.
En el presente estudio se implementa, por primera vez en Uruguay, un
método de detección del genoma de CTV por RT-PCR en tiempo real
con química TaqMan que constituye un herramienta rápida, confiable y
precisa. Esta herramienta permitirá el procesamiento de un gran
número de muestras lo que puede ser de gran utilidad tanto para los
productores como para las entidades de vigilancia sanitaria. También
constituye el primer estudio de caracterización molecular y
reconstrucción filogenética de las variantes genéticas que circulan en el
país, basado en el análisis de la secuencia completa de los genes p25,
p20 y p23 amplificados por RT-PCR. Por último, se logró conocer la
composición poblacional de los distintos aislados utilizando como
metodología la clonación.
Los resultados mostraron que CTV presenta una gran diversidad
genética, observando la presencia de cuatro linajes co-circulantes con
distinta prevalencia, tres de ellos previamente descritos (VT, T3 y T36) y
el cuarto identificado en este trabajo. Este nuevo clado (NC) se
encuentra conformado por aislados de diversas partes del mundo
incluyendo Uruguay, Argentina y Brasil. También se detectó la
presencia de un aislado recombinante, procedente de un evento de
recombinación entre los aislados T36 y NZ-M16, hecho altamente
descrito en la historia de CTV. Por último, mediante análisis de
coalescencia, se logró datar el ancestro común más reciente del nuevo
linaje, así como también calcular la tasa de evolución del mismo. Se
logró también modelar el comportamiento de la población de este
linaje a lo largo de la historia, desde su origen al presente, identificando
eventos que explican las fluctuaciones ocurridas por el tamaño de la
población del virus en el tiempo.
Estos resultados son de gran importancia para el monitoreo del virus en
el país y para la implementación de planes de control a largo plazo. A su
vez, cabe destacar que son resultados pioneros en el país, los que
brindan información del estado de situación de este agente tan
importante para la industria citrícola nacional.
0371
FILOGEOGRAFÍA DEL TOMATO YELLOW VEIN STREAK VIRUS EN
AMÉRICA DEL SUR
CG Vaghi Medina, PM López Lambertini
Instituto de Patología Vegetal (IPAVE), CIAP-INTA, Argentina.
Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV) es la especie de begomovirus
(Familia Geminiviridae) prevalente en las regiones productoras de
tomate para consumo en Argentina. El ToYVSV también infecta
pimiento y papa. Los síntomas que ocasionan son clorosis, moteado y
disminución de la hoja. Puede ocasionar grandes pérdidas económicas
dependiendo del cultivar y el momento de infección. Los begomovirus
del Nuevo Mundo poseen dos componentes genómicos denominados
DNA-A y DNA-B. El DNA-A tiene 5 genes (Rep-AC1, TrAP-AC2, REn-AC3,
CP-AV1). En este estudio se aplicó análisis filogeográfico del gen AV1 de
aislamientos de Argentina, Brasil y Chile. Se clonó y secuenció 10
componentes genómicos DNA-A completos de ToYVSV de diferentes
regiones productoras de Argentina. Las secuencias del gen AV1 se
alinearon con MUSCLE y se determinó el modelo de evolución
molecular con el jModeltest. El análisis filogeográfico fue llevado a cabo
con el programa BEAST v1.7.5 calibrando el reloj molecular con el año
de recolección. Se realizaron análisis continuos con las combinaciones
de modelos de coalescencia, relojes moleculares, distintos modelos
demográficos y el modelo de evolución molecular TIM1+G. Las cadenas
de Markov se corrieron hasta convergencia. Las combinaciones de
modelos de coalescencia y demográficos se compararon cada uno ellos
estimando los likelihood marginales y el método AICM (Akaike
Information Criterium Markov-Montecarlo) utilizando el Tracer. El
modelo de coalescencia que más se ajusta al set de datos utilizado es el
Cauchy con reloj molecular relajado lognormal y modelo de expansión
demográfica lognormal. La tasa de sustitución nucleotídica calculada
fue 9.8x10-3/s/s/a, la dispersión del ToYVSV se dio a una tasa de 164
km/año y edad del ancestro común más cercano fue de 29.28 años. En
los inicios de la década del 80, el ToYVSV, se encontraba en el sur de
Brasil cerca de localidad de Silveira Martins. No fue sino hasta
47
Libro de resúmenes
aproximadamente el año 2002, casi 20 años después, que se produjo la
migración hacia Argentina, más precisamente a la provincia de
Misiones en las cercanías de la localidad de Albardón. Fue desde este
punto donde comenzó una expansión más veloz que dio origen a los
aislamientos encontrados en las provincias de San Juan y Córdoba en
Argentina y en la localidad de Paty do Alferes, Brasil aproximadamente
en el 2005. La llegada del virus a los cultivos de tomate en las provincias
de Buenos Aires, Corrientes y Salta fue alrededor de 5 años después
(2010). El último movimiento fue probablemente en el 2012 en el cual
cruzó la barrera geográfica de La Cordillera de Los Andes llegando al
norte de Chile en las cercanías de la localidad de Arica en el Valle de
Azapa.
Sala D (Salón Rodin - 2º piso)
13:45 - 15:15 hs.
Epidemiología
0009
DISTRIBUCIÓN DE TIPOS DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO EN
PACIENTES JÓVENES MEXICANAS
E Rodriguez-Zitlalpopoca1 2, E Carreón1, C Lara1, ML Cedillo1 2
1
Centro de Detección Biomolecular. Vicerrectoría de Investigación y
Estudios de Posgrado. Benemérita Universidad Autónoma de Puebla,
Puebla, México. 2 Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas.
Instituto de Ciencias. Benemérita Universidad Autónoma de Puebla,
Puebla, México.
Introducción
El Virus del Papiloma Humano (VPH) es el principal causante de cáncer
cervicouterino. Los genotipos 16 y 18 son los principalmente asociados
con esta enfermedad. Los genotipos 6 y 11 están relacionados con la
aparición de verrugas genitales o condilomas que raramente llegan a
desarrollar cáncer.
Objetivo
El propósito de este estudio fue determinar cuáles genotipos son
frecuentes entre mujeres jóvenes mexicanas las cuales no han sido
vacunas contra VPH.
Metodología
Se tomaron ciento cuarenta y cuatro muestras de exudados cervicales
en mujeres de 18 a 26 años de edad que no han sido vacunas, estas
pacientes acudieron al laboratorio durante el año 2014. Firmaron una
carta de consentimiento informado y un aviso de confidencialidad.
Obtención del ADN con kit de extracción viral. Tipificación por
microarreglos de ADN con kit HPV Type 3.5 (Chipron). La secuenciación
de algunas muestras fue realizada para evaluar la especificidad del
ensayo de microarreglo, para secuenciar se utilizó el método de Sanger.
Resultados
Cincuenta y ocho (40%) mujeres fueron positivas a VPH de las cuales 35
presenta más de un genotipo. Dos mujeres tuvieron siete genotipos
diferentes. La distribución de los genotipos fue la siguiente: genotipo
91 (8%), 90 y 52 (7%), 42 y 56 (6%), 16 (5%), 18 (0.75%), 6 (1.5%) y 11
(0%). Otros genotipos fueron detectados con menor porcentaje que el
tipo 16. Una muestra no pudo ser genotipificada por microarreglos se
secuencio y se identificó como el tipo 89.
Conclusiones
Algunas niñas en México entre los 9-12 años son vacunadas, pero estas
vacunas solo son efectivas contra los tipos 06, 11, 16 y 18, pero esos
genotipos presentan una baja incidencia en el grupo de mujeres
jóvenes mexicanas de nuestro estudio. Con el diagnóstico molecular de
VPH y la genotipificación se pretende evaluar la distribución de esta
infección para poder desarrollar una nueva vacuna.
0029
ROL ENDÉMICO DE LOS CALICIVIRUS EN LA GASTROENTERITIS AGUDA
INFANTIL. ESTUDIO MULTICÉNTRICO.
K Gomes1, A Zurschmitten2, MF Haddad2, P Cortes3, S Ferreyra3, HF
Mina3, C Roldan4, D Amoedo4, L Ayala5, ML Cacace5, J Stupka1
1
INEI-ANLIS Dr "Carlos G. Malbrán", Argentina. 2 Hospital de Area Junín
de los Andes, Argentina. 3 Hospital Pediátrico "Del niño Jesús",
Argentina. 4 Hospital de Pediatria S.A.M.I.C "Prof. Dr. Juan Garrahan",
Argentina. 5 Hospital "San Vicente de Paul", Argentina.
Los síntomas principales de una gastroenteritis son diarrea, nauseas y
vómitos, siendo la deshidratación la principal causa de internación y
muerte por diarrea aguda (DA). La DA es una de las causas principales
de morbi mortalidad en países en desarrollo donde se estima que
alrededor de tres millones de niños fallecen por año por esta causa en
todo el mundo. En Argentina se reporta anualmente alrededor de
medio millón de casos de DA en niños menores de 5 años, donde es
conocida la importancia de los agentes virales como causantes de dicha
patologìa. Así se ha demostrado que en nuestro país aproximadamente
el 18% en pacientes ambulatorios y el 30 % en pacientes internados por
DA, el agente causal fue Rotavirus (RV). Sin embargo, resultados
obtenidos a partir de la vigilancia de Diarreas por Unidades Centinela
muestran que existe aproximadamente un rango de 40 a 60 % de casos
de DA en niños sin diagnóstico etiológico conocido, reforzando la
necesidad de ampliar el espectro de búsqueda de otros agentes.
Norovirus (NV) y Sapovirus (SV) conocidos con el nombre genérico de
calicivirus (CV), pertenecen a la familia Caliciviridae donde NV es la
principal causa de brotes de gastroenteritis aguda (GA) epidémica. En
nuestro país se reportó que NV fue detectado en el 87% de brotes de
GA no bacteriana. El objetivo de este trabajo es determinar el rol de CV
en la DA en niños menores de 5 años como así también determinar su
prevalencia y estacionalidad. Para ello se realizó la búsqueda de CV
mediante técnicas de biología molecular en 326 muestras de materia
fecal. Las mismas provinieron de niños menores de 5 años con DA
atendidos en cuatro centros hospitalarios ubicados en diversas regiones
de nuestro país (Neuquén, Córdoba, Salta y CABA) que fueron
internados o consultaron en forma ambulatoria durante el período
comprendido entre diciembre de 2011 y noviembre de 2012. De las 326
muestras analizadas, 116 (35%) arrojaron un resultado positivo. De este
total, en 104 (89%) se detectó NV, en 10 (9%) SV y en 1 (1%) ambos
virus. Del total de pacientes estudiados, 131 (40,2%) debieron ser
internados. En 58 de ellos (44%) se detectaron NV y SV (91% y 9%
respectivamente) mientras que en pacientes ambulatorios, se
detectaron NV y SV en 55 casos (89% y 11% respectivamente). La
mayorìa de los casos positivos fueron detectados durante los meses
fríos del año. Se destaca la alta prevalencia de NV encontrada en casos
de DA infantil, con niveles de positividad similares a RV, quien es
considerado el principal enteropatógeno durante la primera infancia.
Por otro lado se observó que la diarrea por CV muestra un patrón
estacional en coincidencia a lo reportado en otras regiones del mundo.
El incremento en el espectro de búsqueda de agentes virales, permitirá
profundizar en el conocimiento etiológico de la DA, lo que llevará al uso
racional de los recursos disponibles contribuyendo en la
implementación de medidas de control y prevención a nivel nacional.
0036
PREVALENCIA DE HEPATITIS VIRALES EN PERSONAS ATENDIDAS EN EL
CENTRO DE PREVENCIÓN, ASESORAMIENTO Y TESTEO EN HIV Y SÍFILIS
(CEPAT) DEL CENTRO E. CONI, MENDOZA, ARGENTINA.
N Martínez1 2, S Bontti1 2, C González Arra1 2, D Delgado1 2, M Campero2,
S Salvarredi2, C Sanz2, M Luna2, B Damiani3, V Bittar4, C Espul5, C
Salomón1 2
1
Laboratorio de Referencia de Enfermedades Transmisibles, Centro E.
Coni, Mendoza, Argentina. 2 CePAT, Centro E. Coni, Mendoza,
Argentina. 3 Laboratorio de Análisis Clínicos, Centro E. Coni, Mendoza.,
Argentina. 4 Programa Provincial de SIDA, Mendoza, Argentina. 5
Programa Provincial de Hepatitis Virales, Mendoza, Argentina.
Introducción: El testeo de hepatitis virales en población en riesgo
resulta estratégico para conocer su situación epidemiológica e
implementar medidas de prevención y tratamiento. Debido a que estas
infecciones comparten vías de transmisión con HIV y Treponema
pallidum, el centro de prevención, asesoramiento y testeo para HIV y
sífilis (CePAT) en el que se desarrolla el presente trabajo, incluyó el
ofrecimiento del testeo de estas patologías, desde el año 2.012.
48
Libro de resúmenes
Objetivo: Determinar y analizar la prevalencia de hepatitis virales en la
población atendida en un CePAT, tras dos años de la implementación
del testeo voluntario de estas infecciones.
Metodología: Entre agosto/2.012 y diciembre/2.014 se testearon 2.275
personas: 1.459 hombres y 816 mujeres, edad media de 32 ±10 años y
rango de 11 a 80 años. Los sueros fueron analizados por métodos de
enzimoinmunoanálisis (EIA) para antiHBc, antiHCV y antiHAV IgG. Las
muestras con resultados reactivos para antiHBc fueron testeadas para
HBsAg por EIA. Se determinaron las prevalencias de las hepatitis virales
y se analizaron en función de variables edad/sexo.
Resultados: La prevalencia de antiHAV fue de 63,52% (1.445/2.275), sin
diferencias significativas respecto al sexo. El mayor porcentaje de
personas susceptibles se detectó en menores de 30 años (47,44%),
disminuyendo progresivamente con la edad.
La prevalencia de antiHBc fue de 9,23% (210/2.275), significativamente
mayor en hombres (12,13%) que en mujeres (4,04%), (p<0,001);
aumentó gradualmente con la edad (desde 1,37% en < de 20 años,
hasta 18% en > de 60 años). De estos pacientes 7,62% (16/210)
presentaron HBsAg reactivo.
La prevalencia hallada de antiHCV fue de 0,53% (12/2.275). Los
pacientes con resultado reactivo fueron 7 hombres y 5 mujeres, con
edad media de 36 ±9 años y rango de 22 a 49 años.
Conclusiones: El testeo voluntario de hepatitis virales permitió el
asesoramiento personalizado en base a los resultados de la serología
específica de cada paciente.
La vacunación para prevenir la hepatitis A, incorporada al calendario de
vacunación en el año 2.004, produjo una reducción de la circulación del
virus con un aumento de adultos jóvenes susceptibles. En la población
estudiada, casi el 50% de las personas menores de 30 años resultaron
susceptibles a contraerla. La vacunación en estos casos puede constituir
una buena estrategia de prevención.
El aumento de la prevalencia de antiHBc con la edad, evidencia la
circulación del virus de hepatitis B en la población estudiada. El acceso
universal a la vacuna, implementado desde el año 2.012, podría
determinar una disminución de la prevalencia en todos los grupos
etários.
La hepatitis C es una enfermedad con alta tasa de cronicidad y
disponibilidad de tratamiento, por lo tanto, pese a que la prevalencia
determinada fue de 0,53%, es muy importante su detección temprana.
Analizar las prevalencias en la población, es punto de partida para
implementar y evaluar estrategias futuras.
0054
CARACTERIZACIÓN ANTIGÉNICA Y GENÓMICA DE LOS VIRUS
INFLUENZA CIRCULANTES EN LA ERA POST-PANDEMIA 2010-2014 EN
ARGENTINA
E Benedetti, M Avaro, A Czech, M Russo, A Pontoriero, A Campos, N
Periolo, E Baumeister
Centro Nacional de Influenza OPS/OMS, Laboratorio Nacional de
Referencia de Influenza y otros virus respiratorios. Servicio Virosis
Respiratorias, Departamento Virología, Instituto Nacional de
Enfermedades Infecciosas, ANLIS Malbrán, Buenos Aires, Argentina.
La gripe estacional causa epidemias en humanos afectando al 5-20% de
la población mundial cada año y genera demanda importante de los
servicios de salud, afectando especialmente a grupos de riesgo. Al
mismo tiempo posee un potencial pandémico. Influenza tipo A se
clasifica según las características de los 18 subtipos de hemaglutinina
(HA) y los 11 de neuraminidasa (NA) conocidos. Influenza tipo B se
divide en dos linajes Yamagata (B-Y) y Victoria (B-V). Los objetivos de
este trabajo fueron conocer el patrón de circulación de los tipos y
subtipos de influenza que circularon en nuestro país después de la
introducción de la cepa A(H1N1)pdm09 en 2009 y establecer las
relaciones antigénicas y genómicas con virus de otras latitudes y los
presentes en las fórmulas vacunales del período 2010-2014. El Centro
Nacional de Influenza (CNI) de la OMS localizado en el INEI-ANLIS en
Buenos Aires conduce la vigilancia virológica, es cabecera y coordina la
Red Nacional de Laboratorios de Influenza y otros virus respiratorios
(RNLIVR) en un marco mundial. La RNLIVR procesó 344.057 muestras
para detección de virus respiratorios en los años 2010-2014, identificó
16.040 muestras positivas para influenza, remitió al CNI 8.256 para
caracterización viral. Se intento el aislamiento en células MDCK y
MDCK-SIAT, la subtipificación por rtRT-PCR usando primers y sondas
desarrollados por los CDC, la caracterización antigénica por IHA, la
caracterización genómica secuenciando las HA y NA y construyendo
árboles de filogenia. En las 5 temporadas, se detectó circulación del
virus de enero a diciembre, con mayor actividad entre las semanas 20 y
35, excepto en 2012 que se presento una demora de 10 semanas. En
todo el período los dos tipos y los dos subtipos A(H1N1)pdm09 y
A(H3N2) fueron detectados. En 2010 la circulación de A(H1N1)pdm09,
sorpresivamente, fue baja. Aumentó en las temporadas siguientes
llegando a ser el subtipo prevalente en 2013 y volviendo a caer en
2014. Las secuencias de HA estudiadas agrupan a los virus de
A(H1N1)pdm09 en grupos genéticos diferentes respecto de los
identificados en la pandemia de 2009 pero antigénicamente
relacionados con la cepa vacunal que continúa sin modificaciones.
Influenza A(H3N2) mantuvo una fuerte circulación en todos los años,
antigénica y genomicamente en 2010, 2011 y 2013 fueron similares a
las cepas incluidas en las fórmulas vacunales, no así en 2012. En 2014 la
mayoría estuvieron antigénicamente relacionados con el componente
vacunal pero con diferencias genómicas. Los virus B analizados en 2010
fueron B-V, en 2012 comenzó a cocircular con el B-Y; por lo que se
cambia en la vacuna el B-V a B-Y para ambos Hemisferios. En 2013 y
2014 se mantiene la cocirculación de ambos linajes con mayor
proporción de B-Y. La vigilancia de los virus de influenza en Argentina es
una herramienta que ha permitido la detección precoz de nuevos virus
y tener una concordancia superior al 80 % entre las cepas circulantes y
las vacunales.
0059
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LAS CEPAS CIRCULANTES DE ROTAVIRUS
GRUPO A EN ARGENTINA, 2004-2013
JI Degiuseppe, EA Reale, JA Stupka, RNVLGV
Laboratorio de Gastroenteritis Virales. INEI ANLIS “Dr. Carlos G.
Malbrán”. CABA, Argentina.
Rotavirus del grupo A es el responsable del 30-40% de los casos de
diarrea aguda en los menores de 5 años. A nivel mundial, causa
aproximadamente 450.000 muertes por año, principalmente en los
países en desarrollo.
La caracterización clásica de los rotavirus del grupo A consiste en la
tipificación molecular de los genes que codifican para las proteínas
externas de la cápside VP7 (G tipo) y VP4 (P tipo).
A pesar de que hasta el momento se han descripto 27 G y 37 P tipos, los
estudios de vigilancia epidemiológica indican que los genotipos G1-4,
G9, P[4] y P[8] son aquellos que se detectan más frecuentemente.
Asimismo, 5 asociaciones de G y P tipos se consideran entre las más
comunes (> 90%) mundialmente: G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8] y
G9P[8]. Esta distribución no es homogénea entre los países
desarrollados y los países en desarrollo. En estos últimos,
eventualmente se detectan emergencias de genotipos infrecuentes
(G5, G8 y G12), con distintas prevalencias.
El objetivo de este estudio es describir la diversidad genética de las
cepas circulantes de rotavirus grupo A en Argentina, durante el período
2004-2013.
La caracterización molecular se llevó a cabo mediante la extracción del
ARN viral de las muestras de materia fecal positivas para rotavirus que
se remitieron al Laboratorio Nacional de Referencia desde diversos
laboratorios del país, en el marco de la vigilancia nacional.
Posteriormente, se realizó una RT-PCR nested multiplex, de acuerdo a
protocolos convencionales.
En el período estudiado, se caracterizaron 3.240 cepas de rotavirus del
grupo A. Las asociaciones más frecuentemente detectadas en forma
global fueron el G3P[8] y el G2P[4] (27,5 y 25,6%, respectivamente).
Asimismo, se observó una elevada variabilidad en la prevalencia de los
genotipos anualmente. Se destaca la emergencia de las asociaciones
G9P[8] (2004-2006), G12P[8] (2008-2009) y G3P[8] (2009-2011), todas
ellas en elevada frecuencia. El genotipo G1P[8], estimado como el más
prevalente a nivel mundial, mostró una tendencia descendente hasta el
año 2013, en que se detectó con moderada frecuencia. Las 5
asociaciones de G/P tipo consideradas comunes representaron más del
80% de las cepas circulantes, valor que asciende al 90% si se incluyen
las cepas G12P[8]. Con respecto a las asociaciones menos frecuentes,
se observó la emergencia de cepas G3P[6] (aproximadamente 7%) en
49
Libro de resúmenes
los años 2011-2012. Las infecciones mixtas representaron menos del
2% de las muestras analizadas.
En el contexto de la reciente introducción de la vacuna anti rotavirus en
nuestro país (2015), este estudio constituye la descripción del escenario
prevacunal. Se considera necesario continuar con esta clase de
estrategias de vigilancia epidemiológica, a nivel nacional, para permitir
evaluar en qué medida la circulación viral se relaciona con la eficacia
vacunal, así como el posible efecto de estas vacunas sobre la ecología
del virus.
0061
EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DEL VIRUS DE HEPATITIS D EN
DIFERENTES POBLACIONES DE ARGENTINA
G Pataccini1, C Berini1, ML Cuestas3, EA Gentile3, AI Castillo3, W
Pedrozo4, R Malán4, JR Oubiña3, VL Mathet3, MM Biglione1, CM Delfino1
3
1
Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (INBIRS,
UBA-CONICET), Argentina. 3 Instituto de Investigaciones en
Microbiología y Parasitología Médica (IMPAM, UBA-CONICET),
Argentina. 4 Laboratorio de Calificación Biológica del Banco de Sangre
Tejidos y Biológicos. Ministerio de Salud Pública de Misiones.,
Argentina.
Introducción: el virus de hepatitis D (HDV) requiere del virus de
hepatitis B (HBV) para su ensamblaje y secreción. Por este motivo, la
infección por HDV sólo puede ocurrir en presencia del HBV; ya sea en
eventos de coinfección o sobreinfección. Ambos tipos de infecciones,
incrementan el riesgo de desarrollar hepatitis fulminante, cirrosis y/o
hepatocarcinoma celular. Se estima que alrededor de un 5% de los
portadores crónicos del HBV, tiene evidencia serológica de haber
estado expuestos al HDV. Se observa una alta prevalencia de infección
por este virus en el centro de África, Cuenca Amazónica, región
Mediterránea, Oriente Medio y algunas partes de Asia. En Argentina, la
prevalencia serológica oscila alrededor del 0,7%-5,7% al evaluarse
muestras séricas de hemodonantes, pacientes con enfermedad
hepática e individuos coinfectados con HIV-1. Además, nuestro grupo
ha descripto esta infección en donantes de sangre y amerindios del
noreste. En esta última población, la presencia del HDV fue detectada
mediante transcripción inversa (RT) - nested-PCR (n-PCR) en individuos
con infección oculta por HBV (OBI: HBsAg sérico indetectable ) y ELISA
no reactivo para anticuerpos (Acs) anti-HDV. Objetivo: evaluar la
presencia de la infección por HDV en diferentes poblaciones con
distintos marcadores serológicos de infección para el HBV.
Metodología: se analizaron un total de 232 muestras de plasma de
diferentes poblaciones: usuarios de drogas inyectables (UDIs; n=35);
pacientes HTLV-1 y 2 (pHTLV; n=14) y donantes de sangre (DS; n=183)
que eran reactivos para distintos marcadores serológicos de infección
por HBV (HBsAg y/ó Acs totales anti-HBc). A todas las muestras se le
realizó el diagnóstico serológico de la infección por HDV mediante
ELISA (Acs anti-HDV total, Abbott). A un total de 68 muestras que se
encontraban disponibles (35 UDIs, 14 pHTLV y 19 DS) se les realizó la
extracción del RNA y una región nucleotídica que codifica una parte del
antígeno delta del HDV fue amplificada mediante RT-n-PCR. Resultados:
la prevalencia para Acs anti-HDV fue del 14,3% (2/14) en pHTLV y del
7,1% (13/183) en DS. En UDIs no se detectó muestra reactiva alguna
para Acs anti-HDV. Por RT-n-PCR, 2 muestras resultaron positivas para
HDV (1 UDIs y 1 pHTLV-1), aunque ambas fueron no reactivas para Acs
anti-HDV. Conclusiones: estos resultados confirman la circulación del
HDV en las poblaciones estudiadas y sienta precedentes sobre la
importancia de seguir investigando esta infección en otras poblaciones.
Además, se demuestra la infección en casos no reactivos para Acs antiHDV por ELISA, lo cual resalta la importancia de realizar el diagnostico
serológico y molecular en forma conjunta ante la sospecha de infección
por HDV.
0062
NUEVOS CASOS DE HEPATITIS D EN PACIENTES CON HBSAG REACTIVO
E INFECCIÓN OCULTA POR VIRUS DE HEPATITIS B EN ARGENTINA
CM Delfino1 2, G Pataccini1, E Outon3, G García3, N Dieguez3, M Cicero3, S
Castro3, C Berini1, ML Cuestas2, EA Gentile2, AI Castillo2, JR Oubiña2, VL
Mathet2, MM Biglione1
1
Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (INBIRS,
UBA-CONICET), Argentina. 2 Instituto de Investigaciones en
Microbiología y Parasitología Médica (IMPAM, UBA-CONICET),
Argentina. 3 Laboratorio de Virología del Hospital Interzonal General de
Agudos "Dr. Pedro Fiorito", Argentina.
Introducción: el virus de hepatitis D (HDV) fue descubierto en un grupo
de pacientes italianos con infección crónica por el virus de hepatitis B
(HBV). Los autores describieron un antígeno asociado a un genoma de
ARN pequeño que utilizaba las proteínas de envoltura del HBV para
formar su virión, es por este motivo que la infección por HDV sólo
puede ocurrir en presencia del HBV; ya sea en eventos de coinfección o
sobreinfección. Ambos tipos de infecciones incrementan el riesgo de
desarrollar hepatitis fulminante, cirrosis y/o hepatocarcinoma celular.
Se estima que alrededor de un 5% de los portadores crónicos del HBV,
tiene evidencia serológica de haber estado expuesto al HDV. Las guías
de diagnóstico sugieren que todo paciente con HBsAg reactivo debería
ser testeado para evaluar la presencia de anticuerpos (Acs) anti-HDV.
Nuestro grupo ha descripto esta infección en donantes de sangre y
amerindios del noreste de nuestro país. En esta última población, la
presencia del HDV fue observada mediante transcripción inversa (RT)nested-PCR (n-PCR) en individuos con infección oculta por el HBV (OBI;
HBsAg no reactivo) y ELISA no reactivo para Acs anti-HDV. Objetivo:
evaluar la presencia de infección por HDV en una población hospitalaria
con diferentes marcadores serológicos del HBV. Metodología: se
analizaron 19 muestras de plasma de individuos reactivos para el HBV
(13 con Acs totales anti-HBc solamente y 6 con Acs totales anti-HBc y
HBsAg) que estuvieron internados por diferentes patologías en el
Hospital Interzonal General de Agudos “Dr. Pedro Fiorito”, Avellaneda,
Pcia de Buenos Aires. Todas las muestras fueron analizadas por ELISA
para Acs anti-HDV totales (Abbott). Luego de la extracción del RNA del
HDV, una región nucleotídica que codifica una parte del antígeno delta
fue amplificada mediante RT-nPCR. Asimismo, se realizó la extracción
del DNA-HBV y se amplifico por PCR y n-PCR las regiones S y
Precore/Core, respectivamente. Resultados: del total, 3 muestras (M13,
M14 y M17) resultaron positivas por RT-n-PCR para el HDV. De ellas, la
M17 resultó reactiva para Acs anti-HDV con una prevalencia del 5.3%
(1/19). La misma presentaba marcadores de OBI, mientras que M13 y
M14 exhibían reactividad para HBsAg y Acs anti-HBc. Además, en la
M14 se amplificó la región S del HBV. Conclusiones: estos resultados
nuevamente confirman infección por el HDV en casos de OBI y la
circulación de dicho virus en nuestra población. Estos datos muestran la
importancia de la realización adicional del diagnóstico molecular con el
objeto de evitar un sub-diagnóstico y conocer la real prevalencia de
esta infección. En base a estos hallazgos, se propone reevaluar el actual
algoritmo diagnóstico del HDV internacionalmente vigente.
0063
PREVALENCIA DEL VIRUS DE HEPATITIS E Y COINFECCIONES VIRALES
EN MUJERES EMBARAZADAS Y PACIENTES CON HEPATOGRAMA
ALTERADO DEL HOSPITAL INTERZONAL SAN JUAN DE DIOS DE LA
CIUDAD DE LA PLATA, ARGENTINA
R Ercole1, C Crespi1, MM Biglione2, CM Delfino2
1
Hospital Interzonal Especializado de Agudos y Cronicos (HIEAyC) “San
Juan de Dios” de La Plata, Argentina. 2 Instituto de Investigaciones
Biomédicas en Retrovirus y SIDA (INBIRS, UBA-CONICET), Argentina.
Introducción: Según la Organización Mundial de la Salud cada año se
registra 20 millones de casos de infección por el virus de hepatitis E
(HEV) y las principales causas de los decesos se deben a hepatitis
fulminantes y encefalopatía hepática. Se transmite principalmente por
vía fecal-oral, transfusiones de sangre infectada o transmisión vertical
por vía intrauterina, observándose una mayor prevalencia en países de
Asia, África y Latinoamérica. La tasa de mortalidad es baja (0,5 al 4%)
pero se incrementa al 30% en mujeres embarazadas por inducir en
éstas, insuficiencia hepática aguda más fácilmente. Sin embargo,
estudios serológicos indican que una parte considerable de individuos
de países desarrollados también presentan anticuerpos (Acs) anti-HEV.
En los últimos años, se ha diagnosticado infección crónica por el HEV en
pacientes inmunosuprimidos por trasplante de órganos y en pacientes
coinfectados con HIV-1 que presentan un estado avanzado de la
inmunodeficiencia. En Argentina se reportaron prevalencias entre 0,15
50
Libro de resúmenes
a 6,6% en pacientes pediátricos, donantes de sangre e individuos
infectados con HIV-1. Objetivo: determinar la prevalencia de infección
por HEV y evaluar la presencia de otras coinfecciones virales en una
población hospitalaria de la ciudad de La Plata, Buenos Aires.
Metodología: se analizaron un total de 89 muestras de plasma del
Hospital Interzonal Especializado de Agudos y Crónicos “San Juan de
Dios” de la ciudad de La Plata, Argentina (HIEAyC): 82 de mujeres
embarazadas (ME) que concurrieron para realizarse estudios de rutina
y 7 de pacientes con hepatograma alterado (PHA; 5 internados y 2
ambulatorios). Para el diagnóstico se utilizaron dos kits de Elisa
comerciales de Diapro Diagnostic (uno para detectar IgM, y otro
IgG+M). Se evaluó la presencia de coinfecciones por ensayos
comerciales (Abott, Architect) para los virus de hepatitis A (HAV), B
(HBV), C (HCV), D (HDV) y HIV. Resultados: del total, 3 casos
presentaron Acs anti-HEV IgM con una prevalencia para la infección
aguda del 3.4%, 2 (2.4%) eran ME y 1 (14.3%) PHA. Por otro lado, 4
casos resultaron reactivos para Acs anti-HEV IgG con una prevalencia
final del 4.5%, 2 (28.6%) fueron ME y 2 (2.4%) PHA. Una de ellas fue
reactiva para ambos ensayos. Todas las muestras Acs anti-HEV reactivas
(n=6) estaban coinfectadas, 5 HAV, 1 HBV y 1 HIV. En cuanto a las
muestras no reactivas (n=83), 65 tenían HAV, 2 HBV, 1 HCV y 1 HIV.
Conclusiones: En este estudio se demuestra por primera vez, la
circulación de HEV en una población de mujeres embarazadas de
Argentina y en pacientes diagnosticados para otras infecciones virales
con una alta prevalencia de confección HEV-HAV. Estos datos plantean
la necesidad de sospechar la infección de HEV y realizar el diagnóstico
en individuos infectados por HAV y poblaciones sanas con factores de
riesgo para esta infección.
0070
PROPUESTA DE DETECCIÓN COMBINADA DE PICOBIRNAVIRUS,
ENTEROVIRUS Y POLIOMAVIRUS JC COMO INDICADORES DE
CONTAMINACIÓN VIRAL DE AGUAS SUPERFICIALES. ESTUDIO DE
CASO: EMBALSE SAN ROQUE, PROVINCIA DE CÓRDOBA
G Masachessi*, CA Mateos*, LJ Ferreyra, MO Giordano, LC Martinez, V
Prez, PA Barril, V Ré, JV Pavan, SV Nates
Instituto de Virología Dr. J.M. Vanella, Facultad de Ciencia Médicas,
Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba Argentina, Argentina.
*Ambos autores aportaron de igual manera al trabajo
El vertido de aguas residuales sin tratamiento previo o
ineficientemente tratadas, es la principal fuente de contaminación fecal
de recursos hídricos. Como consecuencia, el agua superficial recibe
grandes concentraciones de virus entéricos, constituyendose en fuente
potencial de transmisión de virus a población expuesta. Las normas
vigentes de calidad microbiológica de aguas se basan en la medición de
indicadores bacterianos de contaminación fecal (coliformes fecales,
enterococos y E. coli), pero su medición puede no correlacionarse con
la presencia y carga viral. Por este motivo se hace necesario el diseño
de una estrategia que permita predecir y reducir el riesgo de infección
viral asociado con la contaminación fecal de las aguas superficiales.
Objetivo: Diseñar una estrategia para identificar contaminación viral y
origen de especie de fuente de contaminación en aguas superficiales,
tomando como caso de estudio al Embalse San Roque de la Provincia
de Córdoba.
MyM: Muestreo piloto de aguas (n = 16); período Noviembre 2011Septiembre 2012 en dos puntos centrales representativos del Dique
San Roque, Centro (C) y Toma (T). Se determinó la carga de coliformes
fecales, enterococos y E. coli. Posteriormente las muestras fueron
concentradas y analizadas para detectar enterovirus viable (EV)
mediante inoculación en células Hep-2 e inmunofluorescencia
(indicador de viabilidad viral); RT-PCR para la detección de genoma de
picobirnavirus (PBV) (posible indicador de contaminación fecal); y RTPCR/PCR para la detección de genoma de Astrovirus humano (HAstV) y
virus JC (JCV) (posibles indicadores de fuente origen de contaminación
humana).
Resultados: La frecuencia de EV, PBV, HAstV y JCV en el total de
muestras (n=16), fue del 68,75%, 62,5%, 56,25% y 56,25%
respectivamente, detectandose siempre uno o más de los virus
estudiados en ambos puntos de muestreo. El análisis mensual de
detección viral (C+T) mostró la presencia de PBV, EV y JCV en el 100%
de los meses y HAstV en el 75%, con tendencia estacional en meses
fríos.
Se detectaron cargas bacterianas dentro de los niveles guía en el
93,75% de las muestras (n=16); de estos el 100% resultó positivo para
la detección de virus.
Se determinó una excelente correlación (r=0,96) de cargas bacteriana
entre los tres indicadores legislados.
Conclusión: Se propone para el monitoreo viral de aguas del San Roque
a la detección combinada de PBV, EV y JCV (virus independientes de
fluctuaciones estacionales), en ambos puntos de muestreo, en
muestras con calidad bacteriológica dentro de los valores guias,
seleccionando para determinar carga bacteriana indistintamente a uno
de los indicadores legislados. Esto informa sobre presencia de virus,
viabilidad viral y participación de fuente humana en la contaminación
viral.
La estrategia deberá ser validada en otros cuerpos de agua a los fines
de proponer los virus detectados como indicadores de polución viral de
aguas recreacionales.
0075
ANALISIS CUANTITATIVO DE RIESGO DE INFECCIÓN POR ROTAVIRUS
EN AGUAS SUPERFICIALES DE LA PROVINCIA DE CÓRDOBA
VE Prez, PR Cuadrado, PI Gil, MO Giordano, LC Martinez, G Masachessi,
CA Mateos, VE Ré, JV Paván, SV Nates, PA Barril
Instituto de Virología Dr. JM Vanella - Laboratorio de Gastroenteritis
Virales y Sarampión - FCM - UNC, Argentina.
La contaminación fecal de aguas superficiales es un problema que
impacta directamente en la salud humana, a través de la transmisión
hídrica de microorganismos entéricos patógenos a población expuesta.
El objetivo del presente estudio fue 1) Evaluar el nivel de
contaminación viral de los Ríos Suquía, Xanaes y un punto central del
Embalse San Roque de la provincia de Córdoba, mediante la detección
de enterovirus viable (EV) y genoma de rotavirus (RV) y 2) Estimar el
riesgo de infección por RV por contacto con estas aguas. Es de destacar,
que las aguas en estudio son utilizadas por la población local con fines
recreacionales y de riego. Se realizó un muestreo anual en ambos ríos y
en un punto central del Embalse, se determinó la presencia de
coliformes fecales y totales; y posteriormente las muestras fueron
concentradas y analizadas mediante: i) inoculación en células Hep-2 e
inmunofluorescencia para la identificación de EV viable ii) RT-nestedPCR y qPCR para la detección y cuantificación de RV y iii) análisis
cuantitativo de riesgo microbiológico para estimar el riesgo de infección
por RV. La contaminación fecal del Suquía fue considerable,
detectándose cargas de bacterias coliformes que exceden los límites
establecidos para calidad microbiológica de aguas recreacionales en
todo su recorrido; por el contrario el Xanaes exhibió generalmente
cargas de coliformes con valores aceptables y el Embalse siempre bajo
los niveles guía. Se detectó EV viable en una frecuencia del 78.6% en el
Suquía, 82% en el Embalse y 87.5% en el Xanaes. A su vez, genoma de
RV fue detectado en todo el Río Suquía y Embalse San Roque en
concentraciones que variaron en un rango de 1.9x103-8.6x106 cg/L
(media 5.7x105 cg/L); en el Río Xanaes solo se detectó en un 18.7%, en
concentraciones de 0-3x106 cg/L (media 8.5 cg/L). Concentraciones
significativamente más altas de RV fueron detectadas en el Xanaes
durante la estación húmeda (primavera-verano), a diferencia del Suquía
y el Embalse que no revelaron variaciones estacionales significativas. Se
determinó un riesgo de infección con RV alto (>0.91) tanto en puntos
de muestreo con cargas bacterianas elevadas como en aquellos con
concentraciones aceptables. Los resultados obtenidos muestran que la
detección de virus es un evento frecuente en aguas superficiales de
Córdoba, sugiriendo que la población expuesta a estas aguas está en
riesgo de infección por virus entéricos. La presencia viral en las aguas
superficiales no se refleja en los niveles de bacterias indicadoras, por lo
tanto el monitoreo viral debería ser incluido en la determinación de la
calidad microbiológica de las aguas. Según nuestros conocimientos
estos son los primeros resultados de análisis de riesgo y viabilidad viral
en aguas recreacionales y de riego en Argentina. Los hallazgos de este
estudio serían el primer aporte para Argentina para implementar
políticas públicas dirigidas a mejorar las condiciones sanitarias en el
área urbana.
51
Libro de resúmenes
0078
CIRCULACION DE LOS VIRUS PARAINFLUENZA HUMANOS DURANTE EL
PERIODO 2011-2014
MV Cabassi, MJ Palau, AS Fallesen, A Vera, C Vescina
Sala de Microbiología. HIAEP “Sor María Ludovica”, Argentina.
INTRODUCCION: Los virus parainfluenza humanos (VPIh) se dividen
genética y antigénicamente en 4 tipos. Los tipos 1 al 3 son agentes
causales de infección respiratoria en niños.
OBJETIVOS: Establecer la importancia de los VPIh como agentes
causales de infección respiratoria viral, describir su variación según
semanas epidemiológicas (SE) y la distribución por grupo de edad en
pacientes internados en la institución durante el período 2011-2014.
METODOLOGIA: Se procesaron 10023 muestras respiratorias de
pacientes pediátricos internados, entre enero de 2011 y diciembre de
2014. En todas ellas, se realizó coloración de Inmunofluorescencia
Directa para VPIh-1, VPIh-2 y VPIh-3 y otros virus respiratorios (Virus
Sincicial Respiratorio, Influenza A y B, Adenovirus y Metapneumovirus).
RESULTADOS: De las 10023 muestras procesadas 3285 resultaron
positivas para al menos uno de los virus estudiados. El VPIh-1, VPIh-2 y
VPIh-3 representaron el 1,6%, 0,5% y 7,3% respectivamente.
Tabla 1: Características de la circulación de VPIh en el período 20112014
Positivos en
menores de 1 año
Pico de
Circulación
hallado
10
8 (80%)
SE 43
13
8 (61,5%)
-
2013
2
1
-
2014
28
9 (32%)
SE 12 a 14
2011
11
6 (54%)
-
2012
5
4 (80%)
-
2013
-
-
-
2014
1
-
-
2011
104
78 (75%)
SE 32 a 49
2012
76
52 (68%)
SE 37 a 52
2013
60
45 (75%)
SE 20 a 32
2014
108
79 (73%)
SE 38 a 47
Virus
Estudiado
Año
Total de
positivos
VPIh-1
2011
2012
VPIh-2
VPIh-3
CONCLUSIONES: Los VPIh representaron un porcentaje considerable de
las infecciones respiratorias virales en el período analizado. Entre ellos,
el VPIh-3 fue el detectado con mayor frecuencia. Tal como se reporta
en la literatura, el mayor número de infecciones por VPIh-3 ocurrió en
los menores de un año. El patrón estacional encontrado también
coincide con el descripto, presentando el pico de circulación durante la
primavera. En el año 2013 ocurrió un corrimiento del pico de
circulación hacia el período invernal.
La baja circulación de VPIh-1 y 2 durante los años estudiados no
permitió establecer un patrón estacional y etario claro.
0083
EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE HTLV-1 EN INDIVIDUOS INFECTADOS
CON DIFERENTES MANIFESTACIONES CLÍNICAS
M Pineda1, A Mangano1, MB Bouzas2, M Remesar3, P Aulicino1, L
Mammana2, L Sen1, M Golemba1
1
1Lab. de Biología Celular y Retrovirus- CONICET, Hospital Garrahan,
Buenos Aires, Argentina. 2 Unidad de Virología, Hospital Muñiz, Buenos
Aires, Argentina. 3 Servicio de Hemoterapia, Hospital Garrahan, Buenos
Aires, Argentina.
El HTLV-1 es el agente etiológico de la leucemia/linfoma de células T del
adulto (ATLL) y de la paraparesia espástica tropical (TSP). El mismo se
clasifica en 7 subtipos (a-g) siendo el más prevalente el Cosmopolita (a)
el cual se subdivide en 5 subgrupos: Transcontinental (A), Japonés (B),
África Occidental (C), Norte de África (D) y Perú (E). En el subgrupo A se
han descripto diferentes clados entre ellos el clado Latinoamericano α y
β, y el clado sudafricano A. El objetivo de este trabajo fue estudiar la
situación epidemiológica molecular de HTLV-1 en residentes de
Argentina y establecer su relación con las características clínicas de los
mismos.
Se analizaron 23 muestras de pacientes infectados con HTLV-1. Las
características clínicas de los pacientes y su procedencia fueron: 18
asintomáticos [10 procedentes de Argentina (6 Bs As, 2 Jujuy, 1
Tucumán y 1 sin dato), 2 de Bolivia, 2 de Paraguay, 4 Perú], y 4
sintomáticos procedentes de Bs As) de los cuales 3 tenían ATLL y 1 TSP.
El análisis filogenético se realizó por Maximum Likelihood a partir de un
fragmento de 672 bp del LTR.
A partir del árbol filogenético se observó que todas las muestras
pertenecían al subtipo Cosmopolita (a): 1 agrupaba en el subgrupo
japonés (B) -perteneciente a un individuo de Bs As-, y 22 en el subgrupo
Transcontinental (A). De ellas, 1 agrupó en el clado Latinoamericano α
que correspondía a un individuo de Bolivia; 15 agruparon en el clado
Latinoamericano β procedentes de distintas regiones geográficas (9
Argentina, 2 Perú, 2 Paraguay, 1 Bolivia), 3 pertenecían al clado
sudafricano A (1 Perú y 2 Bs As) y 3 muestras no agruparon en ningún
clado previamente descripto (1 Jujuy, 1 Bs As y 1 Perú). De los 4
pacientes con síntomas: los 3 casos de ATLL pertenecían al subtipo aA:
2 del clado Latinoamericano β y uno sin agrupamiento. El paciente con
TSP pertenecía al suptipo aA clado sudafricano A y su madre también
pertenecía a este clado aunque no presentó síntomas.
En conclusión: la mayoría de las cepas de HTLV-1 pertenecieron al
subtipo aA, el mayor contribuyente a la circulación del virus en países
de América del Sur. En un sólo caso fue subtipo HTLV-1aB a pesar de
que no tenía vínculos epidemiológicos con Japoneses. Aunque la
clasificación filogenética del HTLV-1 se ha asociado con el origen
geográfico de los individuos infectados, en nuestro estudio
encontramos una alta frecuencia de cepas procedentes de Argentina y
Perú (26%) no vinculadas al clado Latinoamericano. Su introducción y
circulación en América del Sur podría ser un fenómeno reciente. No se
halló ninguna relación entre los análisis filogenéticos y las
características clínicas de los pacientes.
0099
ANALISIS DE VARIANTES DE HPV-16 Y BACKGROUND GENÉTICO DEL
HOSPEDADOR EN EL DESARROLLO DE LESIONES DE CUELLO DE ÚTERO
EN LA PROVINCIA DE MISIONES
DJ Sanabria1, ME Totaro1, TG Schurr2, DJ Liotta1, RH Campos3, I Badano1
1
Laboratorio de Biología Molecular Aplicada. Facultad de Ciencias
Exactas, Químicas y Naturales. Universidad Nacional de Misiones,
Argentina. 2 Department of Anthropology, University of Pennsylvania.,
Estados Unidos. 3 Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y
Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina.
Los Virus Papiloma Humano tipo-16 (HPV16) pueden ser clasificados en
variantes genéticas denominadas: Africanas (Af), Europeas (E), Asiáticas
(As) y Asiático-Americanas (AA). Estas variantes habrían surgido por
mutación durante el establecimiento de los principales grupos étnicos
humanos, con una datación molecular estimada de aprox 119000 años
(Af) y 20000 años (AA). En este contexto, algunos autores han
propuesto que las infecciones por HPV16 podrían tener un desenlace
diferente en el desarrollo de lesiones de cuello de útero según el
background genético de su hospedador. Esta situación podría ser
importante en poblaciones multiétnicas de Argentina, donde la
distribución geográfica ancestral de variantes AA ha sido afectada por
la colonización española (Siglo XV), el tráfico de esclavos, y la
inmigración de europeos, no españoles, de fines del S.XIX y principios
del XX.
El objetivo de este trabajo fue evaluar la existencia de asociación entre
el origen geográfico de la variante, el linaje mitocondrial de la paciente
(ADNmt Amerindio, Europeo o Africano) y el desarrollo de lesiones de
cuello uterino en una muestra de mujeres de la Provincia de Misiones.
Métodos: Se analizaron 48 muestras de ADN positivas para la infección
por HPV16 de mujeres no-aborígenes residentes de Posadas, Misiones.
Las variantes virales fueron determinadas por secuenciación de 364pb
de la LCR viral y el background genético humano mediante
secuenciación de 575pb de la HVS-1 del ADNmt. Para el análisis
estadístico de asociación los resultados se dicotomizaron como (i)
Presencia/Ausencia de lesión de cuello uterino (≥L-SIL) y, (ii) origen
52
Libro de resúmenes
virus-hospedador coincidente (AA-Am o EE-E o Af-Af) /no coincidente
(AA-E; AA-Af; EE–Af). Para el cálculo de Odds Ratio, se definió como
categoría de referencia la ausencia de lesiones y el origen
virus/hospedador coincidente.
Resultados: El análisis de ADNmt indicó un 50% de componente
Amerindio, 42% Europeo y 8% Africano en la muestra. Por otra parte, el
análisis de variantes de HPV16 indicó un 96% de linajes Europeos y 4%
Asiático-Americanos. Al combinar ambos marcadores, los orígenes del
virus-hospedador no fueron coincidentes en el 58,3% (28/48) de las
muestras, sin embargo no se encontraron diferencias significativas
entre esta variable y el desarrollo de lesiones (OR=1,1; IC95% 0,3 – 4,9).
Conclusión: El perfil genético de la población mostró un patrón trihíbrido con un componente principal Amerindio y una fuerte irrupción
europea viral. No se encontró relación entre el origen geográfico de las
variantes, el ADNmt de la paciente y el desarrollo de lesiones de cuello
uterino. A pesar de nuestro pequeño n, estos resultados coinciden con
otros reportados para Costa Rica, Brasil y Colombia, contribuyendo al
conocimiento de los patrones de dispersión viral en esta población.
Financiamiento: Fundación Florencio Fiorini para investigaciones
Biomédicas (2011). CEDIT, Gob de Misiones (2011). ANPCyT, PICTOUNaM 2011-106, PICT-2012-0761. CONICET.
0105
LOS VIRUS PAPILOMA HUMANO CUTÁNEOS (HPVC) SON MUY
FRECUENTES
EN
LA
PIEL
SANA
DE
INDIVIDUOS
INMUNOCOMPETENTES.
RM Correa1, M Coringrato2, MC Colucci1, L Olivares2, S Vladimirsky1, LV
Alonio1, MA Picconi1
1
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS "Dr. Malbrán".,
Argentina. 2 Hospital de Infecciosas " Dr. F. Muñiz"., Argentina.
El cáncer cutáneo no melanoma (CCNM) es el segundo cáncer más
frecuente en población caucásica. Su etiología se vincula con la
exposición solar, aunque también se ha postulado a la infección con
ciertos tipos de virus papiloma humano cutáneos (HPVc) como un cofactor. Los HPVc muestran gran heterogeneidad, distribuyéndose en
todos los géneros descriptos (alfa, beta, gama, mu y nu).
El objetivo fue conocer la frecuencia de la infección por HPVc en piel
sana de individuos inmunocompetentes e identificar los genotipos
virales presentes.
Se analizaron 209 muestras de hisopados tomados de la piel sana de la
frente, de individuos que concurrieron a los servicios de Dermatología
de los hospitales Muñiz y Argerich y de personal del Instituto Malbrán
que se ofreció voluntariamente. Para cada participante, se completó
una ficha epidemiológica con datos sobre edad, sexo, exposición solar,
tipo de piel y se les solicitó la firma del consentimiento informado. La
integridad del ADN se verificó por PCR para el gen de la β -globina
humana. La detección y tipificación viral se realizó por dos PCR
genéricas combinadas con hibridación reversa (PCR-RLB) con
oligosondas tipo-específicas que permitieron identificar 35 tipos de
HPVc: 5 tipos del género alfa (HPV 2,3,7,10 y 27); 25 tipos del género
beta (HPV 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 36, 37, 38,
47, 49, 75, 76, 80, 92, 93 y 96) y 5 tipos del género gama (HPV 4, 48, 50,
60 y 65).
El 82,8 % (173/209) de las muestras resultó apta para el estudio, siendo
el DNA de HPV detectado en 86,1 % (149/173); en ellas pudo
identificarse al menos un tipo viral del género alfa en 15,4% (23/149),
del género beta en 91,3% (136/149) y del género gama en 13,4%
(20/149). Los genotipos más frecuentemente encontrados, en orden
decreciente, fueron los HPVs 20, 12, 23, 5, 8, 17, 14, 24, 9 y 15. Hubo un
75,2 % (112/149) de muestras portadoras de infecciones múltiples (con
dos, tres, cuatro o más genotipos).
Los datos obtenidos confirman que la piel sana de la mayoría de los
individuos inmunocompetentes está infectada con al menos un tipo de
HPVc. El hecho de detectar predominio de los tipos virales del género
beta, al igual que se encuentra en los CCNM, reafirma que el potencial
oncogénico de estos virus estaría restringido a un rol de co-factor,
siendo el estado inmune del hospedador y la exposición solar, los
principales factores determinantes.
( Trabajo subsidiado por la Agencia Nacional de Promoción Científica y
Tecnológica, PICTO 0158)
0114
ANÁLISIS DE 2 GENOMAS COMPLETOS DEL HBV DEL GENOTIPO E
AISLADOS DE PACIENTES CON Y SIN INMUNIZACIÓN ACTIVA.
N Eguibar1, P Perazzo1, C Lezama2, K Fuat3, EA Gentile1, AI Castillo1, C
Delfino1, VL Mathet1, ML Cuestas1, JR Oubiña1
1
Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica
(IMPAM; UBA-CONICET), Facultad de Medicina, Universidad de Buenos
Aires, Argentina., Argentina. 2 Unidad 4 de Hepatología, Hospital de
Niños “Ricardo Gutiérrez”, Buenos Aires, Argentina., Argentina. 3
Department of Clinical Molecular Informative Medicine, Nagoya City
University Graduate School of Medical Sciences, Kawasumi, Nagoya,
Japan, Japón.
En nuestro laboratorio, se documentó por 1ra. vez la circulación en
Argentina de 2 cepas del HBV del genotipo E provenientes de 2
pacientes pediátricas hermanastras (M, inmunizada contra la hepatitis
B al nacer, y K, sin inmunización específica previa), ambas cursando una
hepatitis crónica y sin tratamiento antiviral. El objetivo de este trabajo
fue analizar el genoma completo de dichos aislamientos mediante la
secuenciación nucleotídica de amplicones obtenidos por PCR. Se
observaron las 4 características genéticas comunes a todas las cepas
del genotipo E actualmente depositadas en el GenBank: a) una deleción
de 3 nucleótidos en la región 5´de del dominio pre-S1 de la proteína L
HBsAg; b) el motivo LSWTVPLEW entre los residuos 3-11 de dicho
dominio; c) el subtipo serológico ayw4; y d) la sustitución A3095G que
genera la introducción adicional de un codón de iniciación de la
traducción (M83) en el dominio pre-S1, dentro de la región (solapada)
D del promotor de pre-S2. Entre los aislamientos del genotipo E, dicha
región, se encuentra habitualmente flanqueada por una secuencia de
Kozak 5´GGCATGC3´ que regula la eficiencia del inicio de la traducción,
al contener G en la posición -3 y C en la posición +4. Sin embargo, se
observó que los genomas de los aislamientos M y K poseen una G en la
posición -3 pero una A en +4, lo cual podría afectar la traducción de la
proteína M HBsAg. Ambas muestras (M y K) exhibieron dentro de la
proteína L HBsAg las sustituciones Y195S y A264D, detectándose sólo
en M la mutación Q177H. Se detectó la mutación R152I en el Core del
aislamiento M. En la proteína X de los aislamientos M y K del HBV, se
evidenció la sustitución W87R. Con respecto a la Polimerasa viral sólo
se observó la sustitución rtY221F en ambas muestras, asociada a la
resistencia al adefovir. En la proteína S del HBV se evidenciaron las
sustituciones T57I, S59N, L209V y R215L (epítope para LTCD4+) en
ambas muestras. En la muestra M se detectó mediante clonado
molecular, la cocirculación de las variantes G145 y G145R (mutante de
escape a los anticuerpos neutralizantes anti-HBs más frecuentemente
documentada a nivel mundial) mientras que en K se observó la
presencia de una población viral mixta con fenotipos D144 y D144A
(otra mutante de escape). Dado que el genotipo E es el que presenta el
determinante “a” más divergente entre todos los descriptos, sería
relevante estudiar la eficacia de las vacunas contra el HBV actualmente
comercializadas (preparadas en occidente con HBsAg del genotipo A,
subtipo adw) para proteger frente a la infección con genotipo E. Esta
característica, junto a la emergencia de mutantes de escape S, ha
promovido la reciente evaluación de dicha vacuna contra el HBV en
países donde dicho genotipo prevalece. Por lo expuesto, la
caracterización del genoma completo de los 2 aislamientos del
genotipo E del HBV en Argentina tiene importantes implicancias en la
patogénesis, la epidemiología y la profilaxis contra la hepatitis B.
0117
ESTUDIO PILOTO DE VIGILANCIA AMBIENTAL DE POLIOVIRUS COMO
PARTE DE LA VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA DE LAS PARALISIS
FLACIDAS AGUDAS EN VENEZUELA.
M Saavedra1, D Tsortouktzidis1, W Betancourt2
1
Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel", Venezuela. 2 Instituto
Venezolano de Investigaciones Cientificas, Venezuela.
En Venezuela se aplica la vacuna oral de polio (VOP) en los programas
de inmunización rutinaria. En los últimos años se han observado brotes
epidémicos de poliomielitis causados por poliovirus derivados de la
vacuna (PVDV). Estas cepas han revertido a la forma neurovirulenta por
mutaciones genómicas que ocurren tras la replicación prolongada del
virus en pacientes con inmunodeficiencias primarias. Estos casos
53
Libro de resúmenes
representan una amenaza en la erradicación de la poliomielitis. El
Instituto Nacional Higiene “Rafael Rangel” es el encargado de realizar la
vigilancia epidemiológica de las parálisis flácidas agudas (PFA) en
Venezuela, notificando para el año 2014, 70 casos de PFA asociados con
Enterovirus No Polio con una tasa de positividad del 6%, sin evidencia
de circulación de poliovirus. En función de fortalecer la vigilancia de la
PFA en Venezuela se realizó el primer estudio de vigilancia ambiental
de poliovirus en colaboración con el Instituto Venezolano de
Investigaciones Científicas.
Objetivo: Implementar la vigilancia ambiental de poliovirus para el
fortalecimiento de la vigilancia epidemiológica de las parálisis flácidas
agudas en Venezuela, en apoyo a la vigilancia global de poliovirus.
Metodología: Durante tres meses continuos se captaron muestras de
aguas en colectores marginales, quebradas impactadas con descargas
municipales y un rio canalizado (Rio Guaire) que recibe 11000 L/s de
aguas residuales no tratadas del área metropolitana de Caracas. Para la
concentración de los virus se utilizó filtración con membranas
electronegativas seguido por ultrafiltración rápida (Centriprep®). El
concentrado se inoculó en células de Rabdomiosarcoma humano (RD) y
células L recombinantes de ratón que expresan el receptor para
poliovirus (L20B). La identificación de poliovirus y la diferenciación
intratipica se llevó a cabo por métodos de amplificación molecular en
tiempo real (rRT-PCR) desarrollados por los Centros para el Control y
Prevención de Enfermedades Infecciosas (CDC, Atlanta, EEUU). Estos
ensayos forman parte del algoritmo estándar de la OMS en la Red de
Laboratorios Global de Polio.
Resultados: Se identificaron cepas de origen vacunal en 9 muestras que
correspondieron a 5 poliovirus Sabin, 3 poliovirus Sabin-Discordantes
(PVDV) y una mezcla de Sabin con Sabin- Discordante (PVDV).
Asimismo, se detectó en 6 muestras enterovirus no polio, mientras que
el virus polio salvaje no se detectó en ninguna de las muestras.
Conclusiones: Se confirma la ausencia de poliovirus salvajes en el área y
tiempo estudiado. La vigilancia ambiental es una herramienta sensible
para investigar la circulación de poliovirus en Venezuela, asimismo
suministra una medida indirecta de la cobertura de vacunación en el
país. Estrategias adicionales de caracterización de los aislamientos
ambientales de poliovirus por secuenciación genómica permitirían
consolidar la vigilancia ambiental y epidemiológica de poliovirus,
fortaleciendo de esta manera la vigilancia de PFA en el país.
0119
PREVALENCIA Y CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA DEL HERPESVIRUS
HUMANO TIPO 8 (HHV-8) EN ARGENTINA: ASOCIACIÓN CON LA
ANCESTRALIDAD DE LA POBLACIÓN
ML Hulaniuk1, H García Rivello2, E Mocetti2, V Volonteri2, D Kohan3, B
Elsner3, E Frangi4, S Bartoli5, L Fortuny6, L Burgos Pratx6, A Frías7, O
Torres7, F Nuñez6, D Corach8, M Caputo8, J Trinks9
1
Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental (ICBME),
Hospital Italiano de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina. 2 Servicio de
Anatomía Patológica, Hospital Italiano de Buenos Aires, Buenos Aires,
Argentina. 3 Centro Privado de Patología, Buenos Aires, Argentina. 4
Servicio de Laboratorio Central, Hospital Italiano de Buenos Aires,
Buenos Aires, Argentina. 5 Servicio de Medicina Transfusional, Hospital
“Pablo Soria”, San Salvador de Jujuy, Jujuy, Argentina. 6 Servicio de
Medicina Transfusional, Hospital Italiano de Buenos Aires, Buenos Aires,
Argentina. 7 Servicio de Medicina Transfusional, Hospital Materno
Infantil “Ramón Sardá”, Buenos Aires, Argentina. 8 Servicio de Huellas
Digitales Genéticas (SHDG), Facultad de Farmacia y Bioquímica,
Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires; Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Buenos Aires,
Argentina. 9 Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental
(ICBME), Hospital Italiano de Buenos Aires, Buenos Aires; Consejo
Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Buenos
Aires, Argentina.
El HHV-8 ha sido postulado como un marcador de migraciones
humanas ancestrales. Su prevalencia varía a nivel mundial con una
distribución geográfica y étnica caracterizada por 6 subtipos virales (AF) y valores de seroprevalencia elevados en poblaciones africanas y
nativo americanas. Sin embargo, es escasa la información respecto a su
epidemiología molecular así como a la relación que posee con la
composición étnica diversa de la población argentina. Por lo tanto, el
objetivo de este trabajo fue estudiar la prevalencia y la caracterización
genotípica del HHV-8 en Argentina determinando posibles asociaciones
con la ancestralidad de la población.
La prevalencia del HHV-8 se estableció mediante amplificación parcial
del ORF-26 en 667 muestras de ADN de donantes de sangre: argentinos
(Buenos Aires=200 y noroeste [NOA]=106) e inmigrantes
(bolivianos=187, paraguayos=98 y peruanos=76). En 319 muestras
elegidas al azar, se analizaron los haplogrupos de los linajes maternos y
paternos (ADNmt e Y-SNPs) para la determinación de la composición
étnica. Por otro lado, se recolectaron 22 muestras de ADN extraídas de
pacientes con enfermedades atribuibles al HHV-8 para la
caracterización genotípica viral mediante análisis filogenético del ORFK1. Luego, se determinó la composición étnica de los linajes maternos y
paternos. El análisis estadístico se realizó por test de Fisher y Chicuadrado.
La prevalencia del HHV-8 fue mayor en el NOA (24,5%) en comparación
con Paraguay (7,1%), Perú (6,6%), Buenos Aires (3,5%) y Bolivia (3,2%)
(p<0,001); detectándose una mayor frecuencia en los individuos del
NOA mayores de 30 años al comparar con los otros grupos (p<0,04).
Asimismo, se detectó un mayor riesgo de infección en Buenos Aires
entre los menores de 30 años (p<0,05) y un posible riesgo aumentado
en los bolivianos de sexo masculino (p=0,05). Se observaron diferencias
significativas en la composición étnica de las poblaciones estudiadas. La
prevalencia de haplogrupos maternos y paternos nativo americanos fue
menor en Buenos Aires en comparación con los otros grupos (p<0,01).
Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas al analizar la
relación entre la prevalencia del HHV-8 y la ancestralidad de la
población.
El ORF-K1 pudo ser amplificado en 59,1% (13/22) de las muestras de los
pacientes, detectándose los subtipos europeos A (53,8%) y C (46,2%). El
análisis de la ancestralidad reveló que sólo 18,2% de las muestras
presentaron haplogrupos maternos y paternos nativo americanos.
En conclusión, éste es el primer estudio en reportar una prevalencia
elevada del HHV-8 en donantes de sangre del NOA. Si bien, la
distribución heterogénea de la frecuencia del genoma viral en
poblaciones sudamericanas no estaría asociada a la ancestralidad de la
población (quizás a ciertas conductas o factores de riesgo), los subtipos
circulantes del HHV-8 detectados -hasta el momento-se
correlacionarían con el origen y la composición étnica de la población
residente en Argentina.
0133
CIRCULACIÓN ENDEMOEPIDÉMICA DE BOCAPARVOVIRUS PRIMATE 1
EN CÓRDOBA: ESTUDIO DE 7 AÑOS EN NIÑOS HOSPITALIZADOS CON
INFECCIÓN RESPIRATORIA AGUDA BAJA Y MANIFESTACIOENS
CLÍNICAS EN PACIENTES SIN COINFECCIÓN NI COMORBILIDADES.
AL Marchesi1, NS Wasinger1, A Cardozo Tomás1, LM Ghietto1, L
Eguizábal2 3, R Bracciaforte1, D Quiroga2, LB Moreno2 3, MP Adamo1
1
Instituto de Virología "Dr. J. M. Vanella", Universidad Nacional de
Córdoba, Argentina. 2 Cátedra de Clínica Pediátrica, Facultad de
Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 3
Hospital de Niños de la Santísima Trinidad de Córdoba, Argentina.
El Bocaparvovirus primate 1 (Bocavirus humano, HBoV) es un virus
respiratorio. Trabajos previos en Córdoba han registrado su presencia
en pacientes con infección respiratoria aguda (IRA), con prevalencias
variables entre 23% y 6%. Sin embargo, en la práctica médica no se
realizan ensayos diagnósticos de rutina para identificar al HBoV debido
a que no se conoce su significancia como responsable de enfermedad
grave. A fin de aportar datos sobre la circulación local de HBoV, en este
estudio descriptivo retrospectivo reportamos la frecuencia del virus en
pacientes pediátricos internados con IRA baja durante 7 años
consecutivos y analizamos las manifestaciones clínicas de pacientes
previamente sanos con monoinfección por HBoV. Se incluyeron niños
menores de 5 años de edad hospitalizados por IRA baja desde la
semana epidemiológica 13 a la 36 (otoño-invierno) de cada año del
período 2007-2013. Las muestras clínicas fueron secreciones
respiratorias y se determinó la presencia de genoma viral por PCR. Se
analizaron los datos demográficos y clínico-radiológicos de pacientes
HBoV-positivos sin coinfección viral o bacteriana demostrada
(diagnóstico hospitalario) ni comorbilidad previa. Del total de 1.605
pacientes estudiados, 239 resultaron HBoV-positivos (14,9%). Las
54
Libro de resúmenes
prevalencias en cada semestre fueron: 13/81 (16%) en 2007, 9/33
(27,3%) en 2008, 59/223 (26,5%) en 2009, 26/125 (20,8%) en 2010,
12/215 (5,6%) en 2011, 42/322 (13%) en 2012, y 78/606 (12,9%) en
2013. La distribución de casos HBoV-positivos por año muestra una
tendencia con dos picos de mayor magnitud, uno en el invierno de
2009 (semanas epidemiológicas 33-36) y otro hacia fin de otoño de
2013 (semanas 25-28). Entre los pacientes HBoV-positivos, 203 (84,9%)
fueron menores de 1 año. Se analizó la presentación clínica de 34
pacientes monoinfectados por HBoV sin comorbilidades previas: la
edad mediana fue 6 meses; en promedio estuvieron hospitalizados 6
días (rango: 1-25) y en 19 pacientes (56%) el evento de internación
correspondió al primer episodio de IRA baja; 22 pacientes (65%)
requirieron oxígeno pero sólo 2 (6%) asistencia respiratoria mecánica;
25 pacientes (74%) recibieron antibióticos y 13 (38%) otro tratamiento
(sintomático o antiviral). Los síntomas más frecuentes fueron sibilancias
(68%), fiebre (58%), tos (53%) y rinitis (29%). Los exámenes de
radiografía de tórax mostraron infiltrado intersticial en 13/34 pacientes
(38%), infiltrado intersticio-alveolar en 9 (26%), atrapamiento aéreo en
2 (6%) e infiltrado alveolar en 3 (9%), en tanto sólo 3 (9%) tuvieron
imagen normal. Bronquiolitis fue el principal diagnóstico (21/34, 62%),
seguido de neumonía (11/34, 32%). Ninguno falleció. Conclusiones:
HBoV es un agente respiratorio frecuente en lactantes con enfermedad
del tracto respiratorio bajo, con circulación tipo endemoepidémica. La
infección en pacientes sin comorbilidad previa, se asocia con
bronquiolitis y, en menor medida, neumonía, con buena evolución y sin
complicaciones al alta.
0134
DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE POLIOMAVIRUS HUMANOS EN
MUESTRAS DE AGUA Y EFLUENTES EN ARGENTINA
M Barrios1, MD Blanco Fernández1, RV Cammarata1, DM Cisterna2 VA
Mbayed1, C Torres1
1
Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad
de Buenos Aires, Argentina. 2 Servicio de Neurovirosis, INEI-ANLIS "Dr.
Carlos G. Malbrán", Argentina.
Introducción
En los últimos años, a los ya conocidos poliomavirus JC (JCPyV) y BK
(BKPyV) se sumó la descripción de nuevos poliomavirus humanos, entre
los que se encuentran el Merkel-Cell (MCPyV), Malawi (MWPyV) y
poliomavirus humano 6 (H6PyV). Estos virus establecerían infecciones
persistentes y presentarían manifestaciones clínicas en poblaciones
específicas, como individuos con inmunosupresión.
Objetivo
Detectar y caracterizar poliomavirus humanos a partir de muestras de
agua de río y efluentes cloacales provenientes de la Ciudad de Buenos
Aires y del conurbano bonaerense.
Materiales y métodos
Se obtuvieron muestras de agua del Río Matanza–Riachuelo en los
períodos 2005-2006 (n=25) y 2012 (n=20) y muestras de aguas cloacales
colectadas a la entrada de plantas de tratamientos del área
metropolitana y conurbano durante 2011 y 2013 (n=24). Las muestras
de río se concentraron por adsorción-elusión en membranas con carga
negativa y las muestras de efluentes cloacales, por ultracentrifugación.
La detección se realizó con PCRs genéricas y específicas dirigidas hacia
una región genética parcial que codifica para las proteínas VP2/VP1. La
caracterización se realizó por secuenciación y análisis filogenético del
gen que codifica para la proteína VP1.
Resultados
En el período 2005-2006, se detectó poliomavirus humanos en el 80,0
% de las muestras, la mayor detección se observó para MCPyV (52,0 %),
seguido por BKPyV (40,0 %), JCPyV (20,0 %) y MWPyV (4,0 %). En el
período 2012, la detección alcanzó el 85,0 % de las muestras de río, con
presencia de JCPyV (85,0 %), BKPyV (75,0 %), MCPyV (25,0 %) y H6PyV
(25,0 %). Por último, se detectó poliomavirus en el 91,7 % de las
muestras de efluentes cloacales, con presencia de BKPyV (87,5 %),
JCPyV (83,0 %), MCPyV (8,3 %) y H6PyV (4,2 %). La caracterización
molecular indicó la coexistencia de distintos genotipos y variantes
genéticas, sobre todo en efluentes cloacales. Para JCPyV, se observó la
presencia de genotipo 2A, y minoritariamente, genotipo 3A. Los virus
BKPyV caracterizados correspondieron a los subtipos Ib1, Ib2 y II. Las
secuencias del virus MCPyV (únicas secuencias de Argentina) formaron
un grupo monofilético y agruparon con la única secuencia de América
del Sur disponible hasta el momento.
Conclusiones
La presencia de contaminación viral de origen humano en aguas
superficiales despierta preocupación por su potencial rol como fuente
de infecciones virales y enfatizaría la necesidad de establecer controles
virológicos entre los estándares de calidad de aguas. Por otro lado, el
alto nivel de detección y de diversidad de los poliomavirus hallados a
partir de la vigilancia ambiental, que involucró incluso la caracterización
de virus no descriptos previamente en Argentina o en América del Sur,
refuerza la utilidad de esta estrategia para describir la epidemiología
viral en población general, sobre todo de aquellos virus por cuyas
infecciones no se consulta a un servicio asistencial de salud en forma
rutinaria.
0136
RELEVANCIA DE LA MUESTRA DE AGUAS RESIDUALES EN ESTUDIOS
EPIDEMIOLÓGICOS Y EVOLUTIVOS DEL ROTAVIRUS GRUPO A.
M Mandile1, L Lewezuk1, M Argüelles1, D Cisterna2, G Glikmann1, A
Castello1
1
Laboratorio de Inmunología y Virología, Universidad Nacional de
Quilmes, Argentina. 2 Servicio de Neurovirosis, Instituto Nacional de
Enfermedades Infecciosas, ANLIS Dr. Carlos G Malbran, Argentina.
Los Rotavirus del grupo A (RVA) son el agente etiológico más
importante de gastroenteritis en niños menores de dos años. Se estima
que anualmente mueren ~450.000 niños menores a 5 años y es la
principal causa de consulta médica e internación por diarrea aguda. Las
tasas de infección por RVA no se relacionan con el nivel
socioeconómico, afectando por igual a niños independientemente de
su condición social. Sin embargo, el 90% de las muertes ocurren en
regiones necesitadas. Se estima que debido a condiciones precarias de
vivienda y difícil acceso a centros de salud. Desde el año 2006 se
licenciaron en Argentina dos vacunas contra RVA, una monovalente
(RV1), compuesta por una cepa atenuada G1P[8], y otra pentavalente
(RV5), mezcla de reasociantes bovino-humana. Muchos países de
Latinoamérica han introducido alguna de estas vacunas a sus
calendarios de inmunización, siendo Argentina uno de los últimos en
sumarse al incorporar RV1 a su calendario. Tanto en la era pre como en
la postvacunal, es de suma importancia saber cuáles son las cepas
circulantes de este virus. En nuestro laboratorio se lleva a cabo la
vigilancia de genotipos de RVA desde hace casi 20 años. Estos estudios,
apoyados por la caracterización por secuenciamiento, permiten
obtener información útil sobre las cepas prevalentes, detectar cepas
emergentes o reemergentes, la fluctuación de las mismas y las posibles
modificaciones por la introducción vacunas. Estos estudios se han
realizado utilizando muestras clínicas (MC) de hospitales de Gran
Buenos Aires y Capital Federal, sin embargo desde hace algunos años se
ha empezado a utilizar y evaluar muestras ambientales (MA) como
herramienta de vigilancia.
El objetivo de este trabajo es comparar genotipos y secuencias de RVA
en MA y MC durante el período septiembre de 2010-Marzo de 2012
con el fin de contribuir a la validación de la MA como herramienta para
la vigilancia epidemiológica.
Se encontró que existe correlación de genotipos dominantes entre
ambos muestras, siendo G2 el más abundante (40% en MA y 75% en
MC). El análisis de secuencias sugiere identidad entre ambas lo cual
avala el estudio de MA para la identificación y caracterización de las
cepas de RVA relevantes de cada pico epidémico. Sin embargo se ha
observado mayor diversidad de genotipos en MA lo cual sugiere que,
además de detectarse las cepas dominantes responsables de las
presentaciones clínicas, se detectan también cepas excretadas por
individuos infectados en forma asintomática y casos leves que no
concurren a centros de salud.
Los resultados de este trabajo sugieren válida la utilización de MA como
una herramienta práctica epidemiológica. Además, la posibilidad de
identificar y caracterizar un rango más amplio de cepas excretadas
genera un panorama más completo de los genes circulantes lo cual es
muy útil en estudios evolutivos. Adicionalmente, la posibilidad de
identificar cepas vacunales y sus derivados abre una vía para el estudio
de la evolución de éstas en la población.
55
Libro de resúmenes
0138
GENOTIPOS DE VIRUS PAPILOMA HUMANO (VPH) CIRCULANTES EN
MUESTRAS DE TAMIZAJE, EN EL MARCO DEL PROYECTO DE
EVALUACIÓN DE LA MODALIDAD AUTOTOMA (EMA) EN LA
PROVINCIA DE JUJUY.
JV González1, G Lapiedra2, O Marin2, A Campanera3, R Laudi4, S Arrossi5,
MA Picconi1
1
Servicio Virus Oncogénicos, Instituto Nacional de Enfermedades
Infecciosas-ANLIS “Dr. Malbrán”, CABA, Argentina. 2 Hospital Provincial
“Pablo Soria”, S.S. de Jujuy, Argentina. 3 Ministerio de Salud de la
Provincia de Jujuy, S.S. de Jujuy, Argentina. 4 Programa Nacional de
Prevención del Cáncer Cérvico Uterino, Instituto Nacional del Cáncer,
CABA., Argentina. 5 Centro de Estudios de Estado y Sociedad (CEDES,
CONICET), CABA, Argentina.
Introducción: El VPH es la infección de transmisión sexual más común,
siendo la infección persistente por virus de alto riesgo la causa
necesaria para el desarrollo del cáncer cervicouterino (CC). En 2011, el
Programa Nacional de Prevención de Cáncer Cervicouterino (PNPCC)
del Ministerio de Salud de la Nación, implementó en Jujuy la prueba de
VPH por captura híbrida (VPH-CH2) como método de tamizaje primario
para mujeres mayores de 30 años. Esta prueba detecta ADN de 13 tipos
de VPH de alto riesgo oncogénico (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,
58, 59, y 68) en células del cuello uterino. Su efectividad para reducir la
incidencia y mortalidad por CC ha sido comprobada científicamente,
con una sensibilidad superior a la del PAP (alrededor del 90%). Una
alternativa a la toma de muestra convencional realizada por un
profesional, es la autotoma; en esta estrategia, es la propia mujer la
que toma su muestra en su domicilio, preservando su intimidad y
privacidad. En 2012, el PNPCC inició en Jujuy el estudio EMA para
evaluar la autotoma para disminuir las barreras del acceso al tamizaje
virológico y aumentar la cobertura.
Objetivo: Determinar los genotipos de VPH circulantes en mujeres
participantes del estudio EMA.
Metodología: Se incluyó un subgrupo de 231 mujeres cuyas muestras
de células cérvico-vaginales habían resultado positivas para VPH de alto
riesgo por la prueba de CH2. El material remanente luego de haber
realizado esta prueba, fue diluido y se usó directamente para la
genotipificación viral. Esta se llevó a cabo mediante una reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) combinada con una posterior hibridación
reversa que permite identificar 32 tipos de VPH, en un solo ensayo
(validada según OMS). La aptitud de las muestras se evaluó mediante
una PCR para el gen de HLA (control interno).
Resultados: De las 231 muestras recibidas, 227 resultaron aptas para el
estudio. La detección del VPH fue del 91,2%, correspondiendo el 41,6%
a infecciones múltiples.
Los tipos virales más frecuentemente detectados fueron: VPH16
(19,2%), VPH 39 (12,1%), VPH 31 (11,6%), VPH 51 (10,1%), VPH 52 y
VPH 53 (8,7%)y VPH 18 (8,2%), siendo el porcentaje del resto de los
tipos virales menor a 8%.
Conclusión: El estudio brinda los primeros datos de circulación de
genotipos de VPH en mujeres mayores de 30 años en la provincia de
Jujuy, aprovechando muestras previamente procesadas para el
tamizaje virológico.
0143
CIRCULACIÓN DE ROTAVIRUS GRUPO A EN CERDOS DE ARGENTINA
CG Vega1, M Bok1, MF Jabif2, N Fermentini2, J Cappuccio1, M Dibárbora1,
H Piscitelli3, N Aznar4, F Bessone3, A Wigdorovitz1, V Parreño1
1
Instituto de Virología, CICVyA, INTA, Argentina. 2 Vetanco S.A.,
Argentina. 3 EEA Marcos Juárez, INTA, Argentina. 4 Instituto de
Patobiología, CICVyA, INTA, Argentina.
En todo el mundo, la diarrea neonatal es endémica y constituye un
importante problema sanitario de las explotaciones porcinas. En la cría
intensiva, las diarreas neonatales resultan en pérdidas económicas
directas e indirectas. Existen múltiples agentes infecciosos involucrados
aunque lo más frecuente son las coinfecciones. Rotavirus es
responsable de cuadros de diarrea en neonatos de múltiples especies
animales. Este virus se ha detectado en todos los países donde existe
producción porcina. Es ubicuo en el ambiente de las granjas y se
considera una infección hiperendémica. En general, sólo afecta a
lechones (<40 días). Rotavirus se clasifica en grupos, de los cuales el
Grupo A (RVA) es el más importante epidemiológicamente. A su vez,
este grupo se subclasifica en G y P genotipos según la variación
genética de las proteínas VP7 (glicoproteína, G) y VP4 (proteasa
sensible, P). En porcinos, los G tipos más frecuentes en el mundo son
G3, G4, G5, G9 y G11 combinados con P[6], P[7], P[13] y P[19]. En
estudios previos se ha reportado la circulación de los genotipos G5P[7],
G4P[6], G8P[6] y G6P[1] en cerdos de Argentina. Existe una fuerte
relación filogenética entre cepas de RVA circulantes en niños y cerdos.
El objetivo del presente trabajo fue caracterizar las cepas de RVA
circulantes porcinos de nuestro país durante un período de dos años.
Se colectaron un total de 280 muestras de material fecal e hisopados
rectales de lechones con y sin diarrea. Las mismas procedieron de 21
establecimientos (industriales y de cría familiar) ubicados en 8
provincias y se tomaron entre agosto de 2013 y diciembre de 2014. Las
muestras fueron analizadas por ELISA para la detección de RVA,
secuenciándose las positivas para determinar las cepas. Se detectó la
presencia de RVA en 57% de los establecimientos analizados, con
incidencias de entre 6% y 67%, en lechones con y sin sintomatología
diarreica. Las muestras positivas correspondieron a granjas de Buenos
Aires, Córdoba, Santa Fe, La Pampa y Neuquén. El análisis molecular de
las mismas reveló la presencia del genotipo G5P[7] como el
predominante. Este genotipo ha sido detectado previamente en
nuestro país así como en muchas otras regiones del mundo y está
incluido en las vacunas que se comercializan en otros países. Se
observó la presencia del genotipo G4, típicamente americano, con
fuerte asociación filogenética con cepas circulantes en niños de nuestro
país lo que resalta la importancia de la vigilancia epidemiológica de este
agente viral dado su potencial zoonótico. Por otro lado, se encontraron
dos muestras independientes procedentes de Buenos Aires y de La
Pampa genotipificadas como G3P[13], una de ellas perteneciente a una
explotación familiar. El análisis filogenético de las cepas P[13] revela
que se encuentran relacionadas con cepas de Canadá, Brasil y Australia.
Esta combinación genotípica es rara y su hallazgo en este estudio
constituyen el primer reporte de circulación de G3P[13] en cerdos de
nuestro país.
0159
VIRUS HERPES ASOCIADO AL SARCOMA DE KAPOSI, GENOTIPOS
BASADOS EN POLIMORFISMOS DEL ORF26
CL Pérez, MI Tous, MC Colucci, C Rovito
Servicio Cultivo de Tejidos- Departamento Virología INEI-ANLIS Dr Carlos
G Malbrán, Argentina.
La secuencia de ADN más usada para detectar el virus herpes asociado
al sarcoma de Kaposi (KSHV) en muestras clínicas por PCR es ORF26,
cuyo fragmento KS330 sirvió para identificar el virus en 1994. Esta PCR
da resultados positivos en muestras de todas las formas clínicas de
Sarcoma de Kaposi (SK): clásico (SKC), iatrogénico (SKI), asociado a SIDA
(SKE) y afro-endémico-, linfoma primario de efusión (PEL) y enfermedad
multicéntrica Castleman (EMC). Esta región contiene varios
polimorfismos que agrupan en patrones distintivos conocidos como
subtipos o genotipos correlacionados con la etnia y la geografía, y no
con una enfermedad determinada. En un principio se asignaron
genotipos en base al fragmento de 330pb evaluando 8 polimorfismos.
La ampliación del análisis a todo el ORF26 (965pb) permite examinar 38
sitios según los cuales se describen los subtipos actuales: A/C, J y K,
predominantes en Europa, Estados Unidos y Asia-, B, Q y R en África
subsahariana y D, en Polinesia.
Con el objetivo de detectar genotipos de KSHV y evaluar la utilización el
fragmento generado en la PCR diagnóstica del virus, se estudiaron
muestras clínicas de 22 pacientes de Argentina con EMC (n=1), PEL
(n=1), SKC (n=5), SKI (n=2) y SKE (n=12) y un donante de órgano (DO).
Se diseñaron primers que franquean 606pb del ORF26. Los amplicones
se secuenciaron y alinearon con la cepa de referencia BCBL-R (subtipo
A/C) y se compararon con cepas de todos los subtipos con el programa
BioEdit.
Resultados: en la tabla se detallan polimorfismos y subtipos en la
población estudiada. Los puntos representan identidad con la cepa de
referencia BCBL-R.
56
Libro de resúmenes
Polimorfismos (24/606pb)
111111111 1 11111111111
Estado clínico 9 9 9
0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 3 4 4 4 5 5 Subtipo
(Nº de
389
3 3 4 4 5 8 8 9 0 2 3 3 5 0 9 9 1 6 9 1 2 (n total)
pacientes) 5 1 4
236955643 2 29864712040
SKE(n=3)
SKC(n=3)
SKI(n=2)
PEL(n=1)
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A/C (n=9)
SKE(n=4)
SKC(n=1)
DO(n=1)
. C . A . . . T . . . . G C . . . . . . . . . . J (n=6)
SKE(n=1)
. C . A . . . . . . . . G C . . . . . . . . . . B (n=1)
SKE(n=1)
. . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . D (n=1)
SKE(n=1)
SKC(n=4)
. C . . . . . . . T . . . C . . . . . . . T . . R ó K (n=5)
Se observó predominancia de los subtipos euro-asiático A/C y J (n=9 y 6
respectivamente). El subtipo B (africano) encontrado era eperable
porque hay reportes en países de la región (Brasil). El hallazgo del
subtipo D (Polinesia), fue inesperado. Las cepas de los 3 pacientes con
SKE y los 4 con SKC, podrían pertenecer al subtipo R o al K, ya que
comparten los polimorfismos en las bases analizadas, para
diferenciarlas se debe incluir la posición 1684 (CxA), que será nuestro
próximo objetivo a estudiar. No se observó asociación entre genotipos
y estado clínico. El fragmento utilizado fue útil para genotipificar el 88%
de las cepas.
0163
PREVALENCIA DE LOS GENOTIPOS DE VIRUS PAPILOMA HUMANO
(VPH) EN MUJERES ADOLESCENTES: UN PRIMER PASO HACIA LA
VIGILANCIA DE LA INFECCIÓN EN LA ARGENTINA.
JV Gonzalez1, JA Basiletti1, GD Deluca2, DJ Liotta3, AM Suarez4, N Katz5, A
Giurgiovich6, C Vizzotti5, MA Picconi1
1
Servicio Virus Oncogénicos, Instituto Nacional de Enfermedades
Infecciosas-ANLIS “Dr. Malbrán”, CABA, Argentina. 2 Facultad de
Medicina, Universidad Nacional del Nordeste, Argentina. 3 Laboratorio
de Biología Molecular Aplicada, Facultad de Ciencias Exactas, Químicas
y Naturales, Universidad Nacional de Misiones, Argentina. 4 Facultad de
Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumán,
Argentina. 5 Dirección Nacional de Control de Enfermedades
Inmunoprevenibles, Ministerio de Salud de la Nación., Argentina. 6
Hospital “Evita Pueblo”, Berazategui, Pcia. de Buenos Aires., Argentina.
La infección persistente por VPH es causa necesaria para el desarrollo
del cáncer cérvico-uterino. Alrededor de 40 tipos virales infectan las
mucosas anogenitales; entre ellos los VPH de bajo riesgo los VPH 6, 11,
42, 43 y 44, entre otros, comúnmente presentes en las lesiones
benignas con mínimo riesgo de progresión maligna; y VPH de alto
riesgo los VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82,
los cuales, pueden conducir a la transformación neoplásica. El
Ministerio de Salud de la Nación, a través de la Dirección Nacional de
Control de Enfermedades Inmunoprevenibles ha introducido en 2011 la
vacuna contra los VPH tipos 16 y 18 en el Calendario Nacional de
Vacunación, para niñas de 11 años. El Laboratorio Nacional de
Referencia de VPH comenzó la vigilancia virológica para conocer el
impacto de esta intervención, siendo las adolescentes el blanco más
temprano para dicha evaluación.
Objetivo: Determinar la prevalencia basal tipo-específica de VPH en
adolescentes (15-16 años) sexualmente activas, no cubiertas por la
Dirección Nacional de Vacunación contra VPH, concurrentes a seis
hospitales públicos (3 de CABA, 1 de Berazategui, 1de Sgo. del Estero y
1 de Misiones).
Metodologia: Durante el 2014 se realizaron talleres de entrenamiento
con los centros participantes y se distribuyeron Manuales de
Procedimiento a fin de unificar los criterios aplicados a cada una de las
etapas. Se invitó a las adolescentes a participar en el estudio; luego de
haber leído y firmado el consentimiento informado, se tomaron
muestras de células cérvico-vaginales empleando cepillo y medio de
transporte validado para este fin (STM, Qiagen). El ADN se purificó
utilizando una plataforma robótica (QIAcube). La detección y
tipificación de VPH se realizó mediante una reacción en cadena de la
polimerasa combinada con una posterior hibridación reversa que
permite identificar 36 tipos de VPH, en un solo ensayo (validada según
OMS).
Resultados: A Febrero de 2015, se recolectaron 550 muestras; en un
subgrupo de 350 muestras, se completó la detección y tipificación de
VPH. Casi la totalidad de las muestras (99,7%) fueron aptas para el
estudio. Los resultados mostraron una prevalencia genérica de VPH de
55,4%, correspondiendo el 64,4% a infecciones múltiples. Los tipos
virales más frecuentemente detectados fueron: VPH42 (23,7%), VPH16
(22,2%), VPH52 (16,0%), VPH51 (15,5%), VPH58 (14,9%), VPH 56
(13,4%), VPH53 (12,9%), VPH31 (11,9%), VPH 66 (10,3%), VPH6 y VPH39
(9.8%), VPH18 (9,3%), siendo el porcentaje del resto de los tipos virales
menor a 8%.
Conclusión: El estudio brinda los primeros datos sobre la prevalencia de
los distintos tipos de VPH en las adolescentes de 15-16 años
sexualmente activas, que no recibieron la vacuna, constituyendo la
línea basal de prevalencia tipo-específica contra la cual comparar las
mediciones post-vacunales. La alta prevalencia detectada se asocia con
la edad de inicio de relaciones sexuales, principal vía de contacto con el
virus.
0165
BROTE DE PAROTIDITIS POR GENOTIPO G EN ARGENTINA
R Bonaventura, L Martínez, DM Cisterna, MC Freire
Servicio de Neurovirosis, INEI- ANLIS "Carlos G. Malbrán", Argentina.
La parotiditis es una enfermedad caracterizada por la tumefacción de
las glándulas salivales especialmente las parótidas. El espectro de la
enfermedad varía desde una infección subclínica a meningoencefalitis,
sordera y orquitis, la severidad aumenta con la edad. El agente causal
más frecuente es el virus de la fiebre urliana (virus de la parotiditis), el
cual es un virus ARN, envuelto, de polaridad negativa y pertenece a la
Flia. Paramixoviridade, sub-familia Paramixorivinae. Es una enfermedad
prevenible mediante el uso de la vacuna triple viral que está incluída en
el Calendario Nacional de Inmunizaciones desde 1998, existen tres
cepas vacunales disponibles: Urabe, L-Zagreb y Jeryl Lynn. Por otra
parte, están descriptos 13 genotipos denominados de A-N que se
definen sobre la base del gen que codifica la proteína hidrófobica
pequeña (SH) según las recomendaciones de la OMS (Boletín
epidemiológico, Junio 2012). El objetivo de este estudio fue caracterizar
un brote de parotiditis ocurrido entre junio de 2014 y febrero de 2015
que se hizo extensivo a todo el país.
Se recibieron muestras de 13 provincias de 211 pacientes saliva(n=203),
orina(n=62), y LCR(n=6). Las mismas fueron estudiadas mediante RTPCR en tiempo real para Parotiditis para el diagnóstico y para su
tipificación por RT-PCR anidada y posterior secuenciación del gen SH
completo. El 67% tenían entre 10 y 25 años (rango 8 meses-75 años),
mediana 17 años. El 58% fueron varones y el 52% estaba vacunado (1 a
3 dosis), no se contó con los datos de vacunación del 33% de los
pacientes. Veintiséis (12%) casos presentaron complicaciones, siendo
orquitis la de mayor frecuencia (n=10). Se diagnosticaron 101 (48%)
casos positivos, tres de ellos padecían síntomas neurológicos y 15 otro
tipo de complicaciones. Se secuenciaron 93 cepas (92%) las que en su
totalidad pertenecían al genotipo G.
En 2012 ocurrió un brote de parotiditis en Argentina en adultos jóvenes
no vacunados de una comunidad cerrada (aspirantes de Gendarmería y
Prefectura) identificándose al genotipo K como agente causal. A
diferencia de aquél, este brote se extendió a todo el país, la población
afectada fue más joven y el 52% estaba vacunado. Recientemente se
han descrito brotes de parotiditis por genotipo G en población
vacunada en EEUU, España, Canadá, Reino Unido y Holanda, se plantea
que los factores que pueden contribuir a la emergencia de estos brotes
son múltiples, entre otros, una cobertura inferior a la óptima y una
protección insuficiente por parte de la vacuna. Por estas razones es
fundamental, además de continuar con una buena cobertura de
vacunación, contar con datos bien documentados de los casos o
campañas en las que se utiliza Doble Viral (en la que el componente
parotídeo está ausente) en lugar de Triple y qué cepa vacunal se
emplea en éste último caso. Por otra parte, es importante continuar
57
Libro de resúmenes
con la vigilancia laboratorial para establecer cuáles son los genotipos de
parotiditis circulantes en Argentina.
0169
FRECUENCIA DE BOCAVIRUS EN NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS DE LA
PROVINCIA DEL CHACO: ANÁLISIS DEL AÑO 2014
GD Deluca1, MC Urquijo1, C Passarella1, HM Marín2
1
Laboratorio de Aplicaciones Moleculares, Argentina. 2 Área de Biología
Molecular. Instituto de Medicina -Regional - UNNE, Argentina.
Introducción: La infección respiratoria aguda (IRA) es la patología más
frecuente a lo largo de la vida del ser humano y es la causa más común
de morbilidad y mortalidad en niños menores de 5 años, generando un
aumento importante de las consultas externas y las hospitalizaciones
en el periodo invernal. Los diagnósticos más frecuentes son la
Neumonía e Influenza, seguidas de Bronquitis y Bronquiolitis. El
Bocavirus humano (hBoV), descubierto en 2005, puede causar distintas
afecciones del arbol respiratorio, particularmente en la población
señalada, sin embargo, es escasa la información epidemiológica sobre
este agente en el norte argentino. Objetivo: estudiar la frecuencia y
estacionalidad de las infecciones por hBoV en la Provincia del Chaco.
Materiales y métodos: Se evaluaron 488 aspirados nasofaríngeos (ANF)
de niños con IRA ingresados a un laboratorio privado de Resistencia
Chaco. Los ácidos nucleicos se extrajeron con kit de columnas Roche y
la retrotranscripción se realizó en dos pasos con enzima MMLV
IMPROM de Promega. Para la detección viral se utilizó PCR en tiempo
real con sondas de hidrólisis (Taqman) y con mix de reacción KAPA en
un equipo ECO de Illumina. Paralelamente, y con la misma
metodología, se evaluaron otros 7 agentes respiratorios a fin de
establecer la proporción de infecciones mixtas del hBoV. Resultados: Se
obtuvo una frecuencia de 7.4% de hBoV en el total de 488 muestras
analizadas. El período de mayor presencia viral fue el de JunioSeptiembre, en el que se detectó el 77.8% del total de casos positivos
de la serie. El 94% de positividad se observó en pacientes menores de 2
años, con una frecuencia mayor en niños de 6-18 meses de vida, los
cuales totalizaron el 72.2% (28/36 muestras) de los casos. En cuanto a
las infecciones mixtas (se evaluaron el Virus Sinc. Resp., Adenovirus,
Influenza A y B, Parainfluenza 1,2 y3, Rinovirus y My. pneuoniae), las
más frecuentes fueron la de hBoV+Rinovirus con una frecuencia del
11.1% (4/36 muestras) y la de hBoV+Vir. Sinc. Resp. en un 19.4% (7/36
muestras). Discusión: Este es el primer proyecto en el norte argentino
que contempla la evaluación sistemática de la frecuencia de hBoV. Sin
dudas, los estudios epidemiológicos y el diagnóstico de las patologías
respiratorias de origen vírico han dado un giro rotundo a partir del
desarrollo de las metodologías moleculares de detección genómica.
Hace no más de 15 años las infecciones virales del tracto respiratorio
eran frecuentemente diagnosticadas sólo por la clínica, y al no contar
éstas con tratamiento específico, no se veía la necesidad médica de
profundizar en el diagnóstico etiológico. Los “nuevos virus” deben
evaluarse epidemiológicamente con las mejores herramientas técnicas
disponibles a fin de establecer fehacientemente las pautas de
prevención y tratamientos adecuados. Este primer informe muestra
claramente que el hBoV no es un agente poco frecuente en nuestra
población pediátrica de menores de 2 años.
0179
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE VIRUS ORF EN CAPRINOS DE
ARGENTINA
A Peralta1 2, JF MIcheloud3, L Alvarez1 4, GA Konig1 2, C Robles4
1
CONICET, Argentina. 2 Instituto de Biotecnología INTA-Castelar,
Argentina. 3 Área de Sanidad Animal-IIACS Leales/INTA-Salta,
Argentina. 4 Grupo Salud Animal INTA-Bariloche, Argentina.
El Ectima Contagioso (EC) es una enfermedad zoonótica causada por el
virus Orf (ORFV), de amplia distribución mundial, que afecta
principalmente a ovinos y caprinos. ORFV es un virus epiteliotrópico
que produce comúnmente lesiones en labios, mucosa oral y nasal y
ubres. Las lesiones son dolorosas y pueden producir anorexia e
inanición, que conducen a un deterioro de la condición corporal de los
animales. Históricamente, el diagnóstico presuntivo de la infección se
ha realizado a través de la observación del cuadro clínico, y la
confirmación mediante el aislamiento viral a partir de las escaras y
observación de la partícula viral mediante microscopía electrónica. En
la actualidad, el método de diagnóstico aceptado mundialmente es la
detección e identificación del ADN viral mediante la amplificación de
secuencias específicas utilizando la técnica de PCR.
Hasta el momento, de los brotes de EC descriptos en Argentina, sólo
fueron caracterizados a nivel molecular dos aislamientos de ORFV
procedentes de ovinos.
El objetivo de este trabajo es identificar y caracterizar molecularmente
el virus Orf en dos brotes en caprinos de Argentina, ocurridos en 2014.
A partir de dos poblaciones de cabras con síntomas clínicos de EC, se
colectaron muestras de las lesiones de 5 caprinos de la provincia de Río
Negro y muestras de 2 caprinos de la provincia de Salta. En el caso de
Patagonia el brote se originó al ingresar caprinos Criollos de la provincia
del Neuquén, posiblemente portadores asintomáticos del virus, en un
hato de caprinos Angora de la provincia de Río Negro. Los animales
afectados, principalmente cabras preñadas o lactando, presentaban
lesiones en ubres, boca y rodete coronario de miembros anteriores y
posteriores. En el caso del brote de Salta, las lesiones aunque severas,
se restringieron a la boca. En este caso la incidencia fue baja y sólo
fueron afectados seis individuos adultos que habían ingresado a la
majada unos 20 días previos al brote.
Con el fin de detectar el ADN viral, se realizó una PCR diagnóstica para
ORFV (ORF045) sobre el ADN extraído de las muestras. De los 7
animales evaluados, sólo dos dieron positivo. A fin de aumentar la
sensibilidad diagnóstica, las muestras fueron sometidas a una PCR
semi-anidada cuyo templado es el gen ORF011. El resultado de este
ensayo elevó a 5 el número de animales con diagnóstico de EC
confirmado por PCR (tres caprinos de Río Negro y dos de Salta).
Luego se procedió a la amplificación de genes que permiten realizar
estudios filogenéticos entre aislamientos. Las secuencias obtenidas
para los brotes de Río Negro y de Salta fueron comparadas entre sí y
con las dos cepas conocidas de ORFV aislados de ovejas en Argentina.
Este trabajo constituye la primera confirmación de brotes de EC en
caprinos por PCR y presenta la primera caracterización molecular de
virus Orf de caprinos en Argentina e incrementa el conocimiento a nivel
molecular de las cepas de ORFV que circulan en nuestro país.
0185
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE LA INFECCIÓN CERVICAL POR VIRUS
DE PAPILOMA HUMANO (HPV) EN LA CIUDAD DE VIEDMA
DF di Pratula1, JA Basiletti2, MA Picconi2
1
Hospital Regional Artemides Zatti, Argentina. 2 Servicio Virus
Oncogénicos, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas – ANLIS
Dr. Carlos G. Malbrán., Argentina.
Introducción: La infección genital por virus papiloma humano (HPV) es
la enfermedad de transmisión sexual más común a nivel mundial, está
demostrado que el cáncer cérvico-uterino (CCU) es consecuencia de la
infección persistente por ciertos genotipos de alto riesgo oncogénicos.
Objetivo: Identificar los genotipos de HPV circulantes en las mujeres
concurrentes al Hospital Regional Artemides Zatti de la ciudad de
Viedma.
Metodología: el diseño fue observacional descriptivo de corte
transversal. Se estudiaron pacientes concurrentes al Servicio de
Ginecología, que aceptaron participar y firmaron el consentimiento
informado. Se completó una ficha y se procedió a tomar las muestras
para la citología por Papanicolau (Pap) y el estudio virológico. Para el
análisis estadístico se utilizó Epi-Info y se calcularon asociaciones entre
las distintas variables y la infección por HPV con intervalos de confianza
del 95%.
La detección del HPV se hizo con la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) con cebadores consenso MY09/11; luego, las muestras positivas
fueron tipificadas mediante una PCR-PGMY utilizando primers
biotinilados, seguida de una hibridación reversa en línea sobre una
membrana de nylon con oligosondas tipo-específicas correspondientes
a 32 tipos virales (PCR-RLB). Se utilizó como control interno una PCR del
gen de beta-globina humana.
Resultados: Se incluyeron 160 muestras cérvico-vaginales (en fresco) y
14 biopsias (fijadas). Todas las muestras de células fueron aptas para el
estudio, 6 biopsias fueron descartadas por no amplificar el control
interno. Se procesaron 168 muestras totales con citología
58
Libro de resúmenes
correspondiente a: Normal (N-SIL): 109; Células escamosas de
significado indeterminado (ASCUS): 12; Lesión intraepitelial de células
escamosas de bajo grado (L-SIL): 16; Lesión intraepitelial de células
escamosas de alto grado (H-SIL): 28 y CCU: 3. El 46% (77/168) de las
muestras fueron positivas para HPV, con predominio en mujeres
menores de 30 años (55/91, 60%). El virus se pudo detectar en el 23%
de las citologías normales y en más del 81% de las lesiones. El 86%
(66/77) de las pacientes estaban infectadas con un HPV-AR, siendo el
HPV 16 el tipo viral más frecuente en todas las categorías citológicas
(45%; 35/77). Se detectaron infecciones múltiples en el 51% de las
pacientes (39/77).
Conclusiones: Este estudio aporta los primeros datos sobre la
prevalencia de la infección por HPV y la distribución de los distintos
genotipos en Viedma; sus valores concuerdan con los hallados en
trabajos previos (nacionales e internacionales). La mayor positividad
para HPV en mujeres más jóvenes se vincula con la alta exposición viral
durante el inicio de la actividad sexual, asociada a la adquisición de
infecciones mayoritariamente transitorias; sin embargo, el predominio
de HPV-AR aumentaría el riesgo de persistencia y potencial desarrollo
de lesiones graves. La información aportada puede contribuir al control
de la enfermedad y a la vigilancia posvacunal.
0191
EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE PARVOVIRUS HUMANO B19 EN
ARGENTINA. RESULTADOS PRELIMINARES
JM Marengo, CA Gonzalez, AM Alonso
Servicio de Virosis Congénitas, Perinatales y de Transmisión Sexual.
Departamento de Virología. INEI-ANLIS “Carlos G. Malbrán”, Argentina.
La infección por Parvovirus Humano B19 (B19V) está asociada a un
amplio rango de patologías como: exantema (quinta enfermedad),
artralgias, hidropesía fetal, pérdida fetal, anemia crónica y crisis
aplásica, según la población afectada. B19V es miembro de la familia
Parvoviridae, subfamilia Parvovirinae, género Eritroparvovirus, especie
Primate erythroparvovirus 1. Su genoma se compone de una cadena
simple de DNA de 5592 nucleótidos organizado en dos principales
marcos abiertos de lectura (ORF`s). El primero codifica para la proteína
no estructural (NS1) implicada en la replicación viral y en la
transcripción del genoma, y el segundo ORF para las proteínas
estructurales VP1 y VP2. Actualmente están descriptos tres genotipos y
cuatro subtipos, genotipo 1a, 1b, 2, 3a y 3b, que presentan entre 10 -14
% de divergencia nucleotídica en base a VP1-VP2. El genotipo 1 es el
prevalente en el mundo. El genotipo 2 se ha detectado en Europa,
EEUU y Brasil en un número reducido. El genotipo 3 predomina en el
oeste de África, habiéndose reportado en los últimos años limitados
casos en Europa y Brasil.
El objetivo de este trabajo es determinar los genotipos de B19V
circulantes en nuestro país.
Se estudiaron 31 muestras que fueron positivas para el diagnóstico
B19V, en diversas matrices (líquido amniótico, sangre seca en tarjeta de
pesquisa neonatal y suero). Estas muestras correspondieron a
pacientes con diversas patologías: exantemas (n=13), hidropesías
fetales (n=10), crisis aplásicas (n=4), anemias crónicas (n=4) derivadas
de diversos centros de salud del país para su diagnóstico en nuestro
laboratorio. Se extrajo el ADN, a partir del cual se realizó una PCR
anidada que amplifica un fragmento de 696 pb correspondiente a la
región VP1-VP2. Los amplicones resultantes fueron secuenciados y
alineados con cepas de referencia del Genbank. El árbol filogenético
obtenido con 1000 réplicas de soporte, fue creado utilizando el método
UPGMA a partir de una matriz de distancia (método p-distancia), en la
plataforma MEGA.
Del análisis realizado resultó que las 31 muestras correspondían al
genotipo 1a con una divergencia nucleotídica entre el 0.3%-0.5%. Esto
demuestra la circulación del genotipo 1a en nuestro país. Estos
resultados preliminares sobre genotipos circulantes de B19V en
Argentina coinciden con los obtenidos en Brasil, Chile, América del
Norte y Europa. Para contribuir al conocimiento de la epidemiología de
B19V es necesario profundizar la búsqueda de B19V y ampliar su
análisis.
0212
ACCIDENTES LABORALES CON POTENCIAL RIESGO BIOLÓGICO EN LA
GUARDIA MÉDICA DE UN HOSPITAL PÚBLICO DE TERCER NIVEL DE
ATENCIÓN.
R Huanca1, L Perreta2, N Lebensohn1 2, L Di Tullio1 2, L Vietti2, L Valenti1,
O Di Paolo1, M Pires1, N Quaglia1
1
Area Tecnología y Salud Pública- Fac. Cs Bioq y Farm-Universidad
Nacional de Rosario, Argentina. 2 Hospital Provincial del CentenarioRosario, Argentina.
Entre los trabajadores de la salud, médicos y enfermeros lideran la
exposición a accidentes con potencial riesgo biológico. Los patógenos
más frecuentes causales de las infecciones asociadas al trabajo son los
virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de hepatitis B (VHB) y
el virus de hepatitis C (VHC). El Hospital Provincial del Centenario (HPC)
es un hospital público de 3° nivel de atención y referencia en la
Provincia de Santa Fe. En este, el Servicio de Guardia Médica (GM),
exhibe características propias presentando un plantel asistencial
conformado por médicos de planta, médicos graduados recientemente
en formación bajo el sistema de Medicato, y enfermeros. Objetivo:
caracterizar los accidentes laborales con riesgo biológico para VIH, VHB
y VBC en médicos y enfermeros de la GM del HPC de la Ciudad de
Rosario, Santa Fe y valorar la tasa de incidencia (TI) de los mismos en
ambos grupos de trabajadores. Metodología: estudio de cohortes
retrospectivo entre los años 2009 a 2013 realizado a partir del
relevamiento de la información obtenida de las fichas epidemiológicas
de denuncia obligatoria de accidentes laborales con riesgo biológico
asentadas en el Centro de Tecnología y Salud Pública (Fac Cs Bioq y
Farm, UNR- HPC) en donde se realizan las determinaciones bioquímicas
para el seguimiento serológico de los virus mencionados. Se realizó el
estudio estadístico descriptivo. Se valoró la razón de TI, para lo cual se
calcularon las personas-horas trabajadas en los cinco años relevados.
Resultados: Del total de áreas asistenciales del HPC la GM dio cuenta
del 34,1% (IC95%: 26,2-42,6%) de los accidentes (n=138) reportados
durante los años estudiados. El 69,8% (53,9-82,8%) de los accidentes
(n=43) fueron cortes o punciones con material contaminado con
sangre. El resto correspondió a salpicaduras que involucraban fluidos
biológicos. El 88,1% (74,4- 96,0%) de los trabajadores que registraron
accidentes (n=42) tenía menos que 30 años, con una mediana de 25
años. La mediana de antigüedad fue de 0,42 años. Del total de
accidentes reportados (n=43), el 90,7% aconteció en médicos (77,997,4%). Razón de TI (med/enf) = 6,34 (IC95%= 2,26- 17,73).
Conclusiones: El Servicio de GM del HPC se evidencia particularmente
vulnerable ante los accidentes ocupacionales. Son los trabajadores
médicos quienes presentan una mayor tasa de accidentes en relación
con los enfermeros. Resultan considerablemente más afectados los
profesionales jóvenes y aquellos con escasa antigüedad. La práctica
médica es un factor de riesgo para la adquisición de las infecciones por
VIH, VHB y VHC, resultando imperioso extremar medidas de
concientización, profilaxis mediante vacunación para VHB y prevención
de accidentes laborales.
0219
IMPROVEMENT OF THE SURVEILLANCE SYSTEM FOR ARBOVIRUSES IN
THE CITY OF RIO DE JANEIRO, BRAZIL.
RM Campos1, D Cadar2, MS Ribeiro3, LLR Santos1, MDF de Meneses1, JL
da Silva3, AS dos Reis3, MCD Giordano3, J Schmidt-Chanasit2, DF
Ferreira1
1
Departament of Virology, Institute of Microbiology Paulo de Góes,
UFRJ, Rio de Janeiro; RJ, Brasil. 2 WHO Collaborating Centre for
Arbovirus and Haemorrhagic Fever Reference and Research, Bernhard
Nocht Institute for Tropical Medicine, Hamburg, Alemania. 3 Noel Nutels
Central Laboratory (LACEN-RJ), Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Arthropod-borne viruses (arboviruses) may cause human disease,
ranging from mild febrile illness to encephalitis and death. Most of the
characterized human pathogenic arbovirus species belong mainly to 3
families: Togaviridae, Flaviviridae, and Bunyaviridae. During the last
decade several countries worldwide have been facing the burden of
introduction and re-introduction of arboviruses such as dengue virus
(DENV), chikungunya virus, Japanese encephalitis virus, and West Nile
virus in urban areas. Arboviruses-are a very diverse group. In Brazil,
59
Libro de resúmenes
DENV is the most important arbovirus causing hundreds of deaths
annually. The city of Rio de Janeiro is an important tourist destination.
Thus, it has been playing an important role on arbovirus introduction
into Brazil. The last DENV epidemic in the state of Rio de Janeiro was
caused by co-circulation of DENV serotypes 4 and 1 and the number of
cases reached 213.058. Many questions remain unanswered regarding
the factors that influence the DENV outbreaks. The ecology of vectors,
seasonal variation, abundance of infected mosquito females and the
movement of vectors between human modified environment and
urban forest may influence the course of DENV epidemics. The present
work represents an observational ecologic study of the circulating
arboviruses in vectors. Six areas were chosen in the city of Rio de
Janeiro and Nova Iguaçu, as trapping sites of adult mosquitoes using BG
Sentinel® traps and aspirators. After morphological species
identification on chilled tables mosquitoes were pooled according to
species and homogenized. Extracted RNA from homogenized mosquito
pools was screened by RT-PCR for flaviviruses, alphaviruses,
phleboviruses and orthobunyaviruses. After 12 months of continuous
trapping 22,202 and 52,000 mosquitoes were collected in the cities of
Rio de Janeiro and Nova Iguaçú, repectively. Flavivirus RNA was
detected in 01 pool from Rio and 13 pools from Nova Iguacu,
respectively. Sanger sequencing of the amplicons demonstrated the
presence of different genotypes of DENV serotype 4 and DENV
serotype 2 respectively. Our findings may provide a solid base to
determine the underlying causes of the seasonal fluctuations of DENV
activity and the relative abundance of the mosquito vector species. This
information can be used as a basis for vector control programs and
might provide an early warning of the presence of DENV in the state of
Rio de Janeiro.
0220
ANÁLISIS POR SECUENCIACIÓN MASIVA DE MUESTRAS FECALES DE
NIÑOS CON GASTROENTERITIS AGUDA REVELAN ELEVADA
DIVERSIDAD GENÉTICA DE NOROVIRUS Y SAPOVIRUS EN PARAGUAY.
ME Galeano1, SM Gabaglio1, M Martínez1, G Russomando1, GI Parra1 2
1
Departamento de Biología Molecular y Biotecnología, IICS, UNA,
Asunción, Paraguay. 2 Dirección actual: Caliciviruses Section, Laboratory
of Infectious Diseases, NIAID, NIH, Bethesda, Estados Unidos.
Introducción:
En Paraguay, la gastroenteritis aguda es una de las causas más
importantes de morbilidad y mortalidad en niños menores de 5 años de
edad: siendo los rotavirus los agentes causales más frecuentes. Los
norovirus y los sapovirus pertenecen a la familia Caliciviridae, y han
sido identificados como los principales causantes de brotes de diarrea
aguda a nivel mundial; sin embargo, en Paraguay han sido hasta el
momento poco estudiados. Con el objeto de determinar la presencia de
potenciales nuevos virus asociados con la gastroenteritis aguda,
analizamos por Next Generation Sequencing un set de muestras fecales
del Departamento Central, Paraguay. En este trabajo analizamos los
calicivirus detectados.
Métodos:
Se seleccionó un set de muestras fecales (n=118) de niños paraguayos
con gastroenteritis aguda no bacteriana colectadas durante los años
2004-2005; que fueron negativas para rotavirus y norovirus por
técnicas moleculares convencionales. Las lecturas colectadas por Next
Generation Sequencing, correspondientes a norovirus y sapovirus,
fueron comparadas con una base de datos de genomas de referencia
para ensamblar los genomas detectados y analizar la filogenia de los
mismos.
Resultados:
En base a los datos analizados, fue posible ensamblar seis genomas
pertenecientes a la familia Caliciviridae: cinco norovirus (GII.4=3,
GII.3=1 y GII.17=1) y un sapovirus (GV.1). Las tres cepas de norovirus
GII.4 se agruparon en el cluster Farmington Hills, correspondiente a
cepas pandémicas de los años 2002-2005. Los residuos aminoacídicos
de la cápside de las cepas paraguayas no presentaron diferencias con la
cepa Farmington Hills, excepto una que presentó mutaciones en el
epítopo E. Se detectaron dos cepas de norovirus recombinantes:
Py36_40 (GII.P21/GII.3) y Py116_119 (GII.Pe/GII.17). Según el análisis
filogenético del gen de la proteína de la cápside (VP1), la cepa Py36_40
fue similar a otras GII.3 de inicios de los 2000s. Sin embargo, el gen de
la polimerasa viral (RdRp) agrupó con cepas recombinantes GII.P21 de
Francia y Sudáfrica. Por otro lado, fue analizado el gen de la polimerasa
de la cepa Py116_119, que agrupó con los de cepas recombinantes
GII.Pe/GII.4; mientras que su gen de la VP1 agrupó con cepas GII.17 de
Río Grande del Sur, Brasil del año 2005. El sapovirus detectado agrupó
con las cepas de referencia GV.1, junto a otras GV.1 del mundo.
Conclusiones:
Este trabajo presenta los primeros genomas completos de calicivirus
circulantes en Paraguay. Se detectó la circulación de cepas de norovirus
recombinantes intergenotipo y de virus asociados al genotipo
pandémico GII.4; así como la presencia del genotipo GV.1
correspondiente al género Sapovirus, correspondiente al primer
reporte para el Paraguay.
0233
ACEPTABILIDAD DEL TEST RÁPIDO PARA HIV. EXPERIENCIA DURANTE
UN ESTUDIO DE PREVALENCIA EN POBLACIONES EN MÁS ALTO
RIESGO (PEMAR) DE ARGENTINA.
A Duran1, D Rossi2, R Marone3, L Gallo Vaulet4, M Rodriguez Fermepín4,
R Casco5, G Orellano6, M Romero7, C Petracca8, E Benedetti9, MM
Avila10, H Salomón10, MA Pando10
1
Coordinacion SIDA, Ministerio de Salud, Buenos Aires, Argentina. 2
Intercambios AC, Buenos Aires, Argentina. 3 Nexo AC, Buenos Aires,
Argentina. 4 Laboratorio de Inmunología y Virología Clínica, Hospital de
Clínicas “José de San Martín”, Facultad de Farmacia y Bioquímica,
Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina. 5 Programa de
Enfermedades de Transmisión Sexual (PETS), Hospital de Clínicas José
de San Martín, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina. 6
Asociación de Mujeres Meretrices de Argentina (AMMAR), Buenos
Aires, Argentina. 7 Asociación de Travestis Transexuales y Transgéneros
de Argentina (ATTTA), Buenos Aires,, Argentina. 8 Programa de VIH-sida
e ITS, Municipalidad de San Martín, San Martín, Provincia de Buenos
Aires, Argentina. 9 Hospital en Red Especializado en Salud Mental y
Adicciones (ex CENARESO), Buenos Aires, Argentina. 10 Instituto de
Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (INBIRS), Buenos Aires,
Argentina.
Introducción: Las recomendaciones de los organismos internacionales
enfatizan la importancia de encarar el control de la epidemia de
HIV/SIDA con programas de prevención focalizados en el acceso al
diagnóstico y la inclusión de las personas afectadas al sistema de salud.
Como primer paso para lograr este objetivo la DSyETS del Ministerio de
Salud de la Nación ha incluido el test rápido de HIV en el algoritmo
diagnóstico. Objetivo: estimar la prevalencia de infección por HIV y
Treponema pallidum en población en más alto riesgo (PEMAR):
hombres que tienen sexo con hombres (HSH), mujeres trans, usuarios
de drogas (UD) y trabajadoras sexuales mujeres (TS) utilizando
algoritmos diagnósticos que incluyen test rápidos. Metodología: Se
realizó un muestreo por conveniencia. Todos los participantes pasaron
por tres etapas para realizarse los test rápidos de HIV y T. pallidum
(Alere Determine): entrevista inicial, realización de los test rápidos y
entrega de resultados. A los 15 días se realizó la entrega de resultados
confirmatorios (ELISA, Carga Viral y CD4). El proyecto incluyó una
primera etapa de capacitación técnica en el uso del test rápido en las
instituciones participantes. Resultados: Se incorporaron al estudio un
total de 1517 participantes (1015 HSH, 78 TS, 165 mujeres trans y 259
UD) entre septiembre del 2013 y mayo del 2014. La prevalencia de
infección por HIV en HSH fue 11,5% (IC 95% 9,5-13,5), en TS 5,1% (IC
95% 1,4-12,6), en mujeres trans 31,5% (IC 95% 24,1-38,9), en UD 3,5%
(IC 95% 1,1-5,9). En relación a la prevalencia de infección por T.
pallidum, en HSH fue 17,7% (IC 95% 15,2-20,0), en TS 14,1% (IC 95%
5,7-22,5), en mujeres trans 47,3% (IC 95% 39,3-55,2) y en UD 7,7% (IC
95% 4,3-11,2). El 99,5% de los participantes reportó que el
procedimiento del test rápido le pareció “Bueno” o “Muy Bueno”. Un
22% de los individuos incluidos en el estudio nunca se habían realizado
el diagnóstico de HIV, sin embargo 3,2% de ellos nunca retiraron el
resultado, llegando esta frecuencia a valores más elevados en los UD
(8,6%) y las mujeres trans (10,6%). Un 55,7% de los participantes se
habían realizado el test de HIV en el último año. El 57,9% de los
participantes con infección por HIV tenían menos de 500 células T
CD4/µl al momento del diagnóstico. Conclusiones: Si bien en Argentina
el diagnóstico y tratamiento de la infección por HIV es libre,
60
Libro de resúmenes
confidencial y gratuito, uno de los mayores problemas que se ha
observado es la demora en llegar al diagnóstico. Este problema se
evidencia en el alto porcentaje de individuos que son diagnosticados en
estadios avanzados de la infección, situación que desfavorece su
evolución y favorece la diseminación de la infección a otros individuos.
En este proyecto se realizó por primera vez en el país un estudio
epidemiológico para evaluar prevalencia de infección por HIV y T.
pallidum en PEMAR utilizando un algoritmo diagnóstico que incluye el
test rápido, destacándose la excelente aceptabilidad.
0244
DETECCION DE NUEVAS VARIANTES CIRCULANTES DEL VIRUS DE LA
HEPATITIS A EN LA ARGENTINA
NR Altabert1, MS Munne1, SN Vladimirsky1, SS Soto1, LO Otegui1, LS
Brajterman1, M Frías Céspedes2, P Barbero2, A Ubaldi3, JE Gonzalez1
1
Laboratorio Nacional de Referencia para Hepatitis Virales-INEI -ANLIS,
Argentina. 2 División Epidemiología. Ministerio de Salud de la Provincia
de Córdoba, Argentina. 3 Dirección de Promoción y Prevención en Salud.
Ministerio de Salud de la Provincia de Santa Fe, Argentina.
INTRODUCCION
Con la implemetación de la vacunación universal contra el virus de la
hepatitis A con una dosis en niños de 1 año de edad en junio de 2005, la
incidencia de la enfermedad disminuyó drásticamente. Hasta el
momento no se ha detectado la introducción de subgenotipos
diferentes a los detectados antes de la vacunación, siendo el
subgenotipo IA el único caracterizado en variantes adquiridas
localmente. Sin embargo, en este contexto de vigilancia intensificada
por tratarse de una infección inmunoprevenible y el cambio de las
condiciones epidemiológicas, es posible la detección de nuevas
variantes circulantes.
OBJETIVO
Caracterización molecular de nuevas variantes detectadas en el marco
de la vigilancia intensificada de Hepatitis A que se realiza en la
Argentina.
MATERIALES Y METODOS
Muestras de dos pacientes diagnosticados con serología positiva para
anticuerpos anti HAV-IgM por métodos comerciales derivadas para su
estudio al Laboratorio Nacional de Referencia para Hepatitis Virales.
Paciente 1: Suero y materia fecal de un paciente 25 años, no vacunado,
estudiante de Ciencias Agrarias, residente en la ciudad de Rosario con
antecedente de viaje a Totoras, provincia de Sante Fe, donde refiere el
consumo de agua de pozo en febrero de 2014.
Paciente 2: Materia fecal de una paciente de 32 años, no vacunada, de
profesión antropóloga forense, residente el la ciudad de Córdoba con
antecedentes de viaje a Africa, Chad en junio de 2014.
En ambos casos, se realizó una RT- nested PCR con primers dirigidos a
diferentes regiones genómicas del HAV. Los productos de PCR fueron
secuenciados y analizados con programas filogenéticos.
RESULTADOS
Paciente 1: Se obtuvieron diferentes regiones genómicas VP1/2A, VP3
en las cuales se descartó eventos de recombinación entre el
subgenotipo IA y IB. Un fragmento de 294 bases de la región VP1/2A
agrupa con variantes de España y muestras ambientales de Argentina
que recientemente fueran propuestas como un nuevo subgenotipo IC.
Paciente 2: Se obtuvo un fragmento de 349 bases de la región VP1/2A
con una identidad a nivel nucleotídico del 98% con variantes
caracterizadas en Francia de casos importados del oeste de Africa,
designadas con el subgenotipo IIA.
CONCLUSIONES
A partir del oportuno estudio epidemiológico se pudo detectar la
primer variante correspondiente al subgenotipo IC en una muestra
clínica y la primer variante importada perteneciente al subgenotipo IIA.
Con el cambio de endemicidad, los individuos susceptibles permiten la
introducción de nuevos genotipos y variantes no caracterizadas hasta el
momento, revelando un cambio en su epidemiología. La vigilancia a
través de la caracterización molecular es indispensable para estudiar y
comprender los cambios en el patrón de circulación y tomar medidas
para el control y la prevención de la infección por el virus de la Hepatitis
A.
0247
CIRCULACIÓN DE GENOTIPOS DE CITOMEGALOVIRUS EN POBLACION
PEDIATRICA EN ARGENTINA
CA Gonzalez, JM Marengo, AM Alonso
Servicio de Virosis Congénitas, Perinatales y de Transmisión Sexual.
Departamento de Virología. INEI-ANLIS “Carlos G. Malbrán”, Argentina.
La infección por Citomegalovirus (CMV) es la infección viral congénita
más frecuente. La misma puede afectar el desarrollo fetal y
embrionario, y dar como consecuencia muerte fetal, retraso del
crecimiento intrauterino (RCIU), hidrops, sepsis neonatal, microcefalia
o hidrocefalia y coriorretinitis entre los hallazgos más patognomónicos.
Uno de los genes más estudiados de CMV es UL55 que expresa la
glicoproteína B (gB). Esta proteína es el mayor componente de la
envoltura viral, induce una fuerte respuesta de anticuerpos
neutralizantes, y juega un rol importante en la infectividad y la
propagación célula a célula. Al estudiar muestras clínicas sobre la base
del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP)
se identificaron variantes genómicas únicas: gB1-gB4. Se postula que
los distintos genotipos podrían correlacionarse con el tropismo y la
patogenia viral.
El objetivo de este trabajo es caracterizar los genotipos gB circulantes
en una población pediátrica en la Argentina, su correlación según se
trate de una infección congénita (IC) o perinatal (IP) y su relación con la
patogenia viral.
Se estudiaron pacientes pediátricos (n=95), con IC (n=44), con IP (n=9) y
en los restantes no pudo ser determinado el momento de la infección
(n=42). Las edades oscilaron entre los 5 días de vida y los 4 años de
edad.
El ADN viral purificado de los aislamientos y amplificado con cebadores
específicos para la región gB (UL55) que produce un fragmento de 305
bp, fue digerido con las enzimas HinfI y RsaI.
Los genotipos obtenidos presentaron la siguiente distribución: gB1: 39
(41%), seguido de gB3: 28 (29,50%), gB2: 22 (23,20%) y gB4: 6 (6,30%).
Los genotipos predominantes en las IC fueron gB1 (18/44) y gB2 (14/44)
seguidos de gB3 (9/44) y gB4 (3/44). En la IP correspondió a gB1 (5/9),
gB3 (3/9) y gB4 (1/9). Se observó la ausencia de gB2 en dicha infección.
En los casos que no se determinó el momento de la infección (ND) los
resultados fueron: gB1 y gB3 (16/42) en igual proporción, gB2 (8/42) y
gB4 (2/42).
En el análisis considerando las patologías se observó que en los casos
de trastornos del sistema nervioso central (SNC) (n=33) la circulación
predominante fue de gB1 (48,48%) seguida de gB2 (30,30%). En cambio
en ausencia del trastorno (n=62) la presencia de gB1 y gB3 fueron
iguales (37,10%) y la de gB2 (19,35%). En los casos que presentaron
RCIU (n=22), bajo peso para la edad gestacional (n=20) y anemia (n=24)
el predominio fue de gB1 y gB3, no observándose diferencias en la
distribución de gB cuando se consideraron otras manifestaciones como
hepatoesplenomegalia, ictericia, prematurez y petequias. Cuando se
relacionó la IP con los trastornos del SNC el único genotipo presente
fue gB1 (2/2).
En este trabajo se observó que el genotipo gB1 es el prevalente en la
población pediátrica estudiada de nuestro país y que el gB4 es el menos
frecuente. Este último se logró detectar luego de incrementar el
número de casos de 30 a 95.
0252
EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE METAPNEUMOVIRUS HUMANO EN
NIÑOS Y ADULTOS INTERNADOS POR INFECCIÓN RESPIRATORIA
AGUDA DURANTE EL AÑO 2012 EN CÓRDOBA, ARGENTINA.
PE Rodríguez, JA Cámara, A Cámara
Instituto de Virología "Dr. J. M. Vanella". Facultad de Ciencias Médicas.
UNC, Argentina.
Metapneumovirus humano (MPVh) es un importante agente causal de
infecciones respiratorias agudas (IRA) descubierto en el año 2001 por
van den Hoogen. Representa una de las principales causas de
morbimortalidad en niños y adultos. En Córdoba fue detectado por
primera vez en el año 2011 en niños con una prevalencia del 4% por
medio de Inmunofluorescencia directa (IFD).
61
Libro de resúmenes
Objetivo: determinar por medio de la técnica RT-PCR la circulación de
MPVh en niños y adultos internados por IRA durante el 2012 en
distintos hospitales de la ciudad de Córdoba.
Doscientas diecinueve muestras de secreciones nasofaríngeas de
pacientes de 0- 67 años de edad, se procesaron para la extracción de
ARN y se detectó una región del gen N de MPVh (199pb) por medio de
RT-PCR convencional, adaptada de Bouscambert- Duchamp (2005).
Previamente estas muestras habían sido analizadas para otros virus
respiratorios por medio de IFD.
De las 219 muestras testeadas (200 <14 años y 19 >15 años), el 35,61%
(78/219) resultaron positivas para MPVh. El 21,91% (48/78) se presentó
en monoinfección y el 13,69% en coinfección, 28/30 con VRS y 2/30 con
Influenza B. Las detecciones se encontraron desde marzo a noviembre y
el pico de casos positivos se registró entre julio y agosto. MPVh fue
encontrado tanto en niños como en adultos: <1 año: 57; 1-4 años: 5; 514 años: 6; 15-59: 9; ≥ 60 años: 1. En los casos de monoinfección los
síntomas asociados más frecuentes fueron presencia de mucosidad,
fiebre y tos y la infección se relacionó con bronquiolitis, síndrome de
dificultad respiratoria y exacerbación del asma.
Los resultados indican prevalencias mayores a lo reportado (5-15%)
aunque algunos autores han encontrado hasta un 30%. Como describe
la bibliografía la circulación del virus se da hacia finales de invierno
continuando hasta los meses de primavera. En este análisis la mayoría
de las detecciones se encuentran en los menores de 5 años, debido a
que en este estudio ha sido el grupo que presentó mayores
internaciones. Además se sabe que presentan mayor riesgo de
infección por MPVh y gravedad luego de Virus Respiratorio Sincicial. Se
comunica por primera vez la detección de casos en adultos en la ciudad
de Córdoba. Presentan enfermedad tipo influenza (ETI), con una
prevalencia de entre 5-25% principalmente en adultos mayores con
enfermedades de base e inmunocomprometidos. En este estudio el
paciente mayor de 60 años presentaba diabetes, mientras que el resto
de los adultos jóvenes y mayores no padecían enfermedades de base y
la infección se asocio con una ETI.
Consideramos que con estos nuevos aportes, es de suma importancia la
implementación de búsqueda rutinaria de este agente tanto en niños
como en adultos que en casos de tener enfermedades de base o
complicaciones la infección es más severa.
0259
ROTAVIRUS COMO AGENTE CAUSANTE DE SOBREINFECCION EN
PACIENTES
PEDIATRICOS
INTERNADOS
POR
INFECCIONES
RESPIRATORIAS AGUDAS DE ETIOLOGIA VIRAL
SS Marchiano, MM Campora, MA Sanchez, MA Taborda
Laboratorio de Diagnóstico Virológico, Cátedra de Virología,
Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y
Farmacéuticas, UNR, Rosario, Argentina.
INTRODUCCION: las Infecciones Respiratorias Agudas (IRA) y las
Gastroenteritis Agudas (GEA) son las principales causas de
morbimortalidad infantil en el mundo y están asociadas a un
importante numero de internaciones. Los agentes etiológicos
predominantes de estas patologías son los virus: Virus Respiratorio
Sincicial para las IRA y Rotavirus grupo A (RV-A) para las GEA. En
Argentina se necesita trabajar más en la epidemiología de los GEA de
origen viral con el fin de implementar estrategias para el control de
estas enfermedades.
OBJETIVO: Documentar los resultados de un análisis retrospectivo de
los pacientes internados con diagnóstico de IRA que presentaron
sobreinfecciones por RV-A durante su internación.
MATERIALES Y METODOS: Se analizaron muestras de materia fecal de
pacientes internados en salas de neonatología y pediatría del Hospital
Provincial del Centenario durante el periodo comprendido entre enero
2010 y diciembre 2014. Las muestras fueron analizadas por métodos de
Inmunocromatografia “RIDA QUICK Rotavirus” R-biopharm. En aquellos
pacientes cuyas muestras fueron positivas para Rotavirus se busco
motivo y fecha de ingreso al hospital encontrándose la IRA como
principal causa de internación.
RESULTADOS: En 2010 se procesaron 25 muestras de materia fecal (MF)
de las cuales 9 (36%) fueron positivas. En 2011 se procesaron 38
muestras de las cuales 22 (58%) fueron positivas. En 2012 se
procesaron 32 muestras de las cuales 10 (31%) fueron positivas. En
2013 se procesaron 38 muestras de las cuales 13 (34%) fueron positivas
y en 2014 se procesaron 52 muestras de las cuales 22 (42%) fueron
positivas. De las 76 muestras positivas para RV-A, se encontraron 22
(29%) que fueron diagnosticadas con GEA luego de que los pacientes
fueron internados por complicaciones de una IRA de etiología viral.
CONCLUSIONES: El mayor porcentaje de positividad de RV-A coincidió
con el pico estacional de VRS, sospechándose sobreinfecciones
intrahospitalarias de los pacientes que fueron internados por IRA. Estos
datos se podrían reforzar si aumentara la búsqueda de agentes virales
como causa de GEA. El análisis de nuestros datos también pone en
evidencia la necesidad de continuar trabajando con las medidas de
higiene en el manejo de los pacientes hospitalizados debido a la alta
transmisibilidad de estos virus.
0260
VIGILANCIA DE POLIOVIRUS EN ARGENTINA DURANTE EL PERÍODO
1996-2010
C Lema1, D Girard1, L Martínez1, DM Cisterna1, J Cello2, J Stupka1 4, M
Caparelli3, MC Freire1
1
Servicio de Neurovirosis, INEI-ANLIS- Dr. Carlos G. Malbrán, Argentina.
2
Center for Infectious Diseases, School of Medicine, Stony Brook
University, Estados Unidos. 3 PRONACEI, Ministerio de Salud de la
Nación, Argentina. 4 Servicio de Gastroenteritis virales, INEI-ANLIS- Dr.
Carlos G. Malbrán, Argentina.
La campaña mundial para erradicar la poliomielitis comandada por la
OMS con el uso de la vacuna oral a virus atenuados Sabin (OPV)
disminuyó drásticamente el número de casos a 359 en 7 países en
2014. Los efectos adversos de la OPV son poliomielitis paralítica
asociada a la vacuna (PPAV) y a los poliovirus derivados de la vacuna
(VDPV). Los VDPV son virus con 6 y 10 nucleótidos diferentes (según el
serotipo), en la región P1 del genoma (VP1), con respecto a la cepa
Sabin. Para lograr la erradicación se deben eliminar los reservorios de
PV salvaje y dejar de usar la OPV, fuente constante de virus Sabin y
VDPV. La circulación de poliovirus (PV) se controla a través de la
vigilancia de pacientes con parálisis aguda fláccida (PAF) menores a 15
años. El principal reservorio y transmisores de PV son los niños
menores a 5 años de edad.
En este estudio, se analizó la prevalencia de PV Sabin a partir de
materia fecal (MF) en pacientes con PAF y niños menores de 5 años con
diarrea (D) entre 1996 y 2010 en Argentina. Se estudiaron 6784 MF:
4982 de D y 1802 de PAF, por cultivo celular y métodos moleculares
(RT-PCR y secuenciación) siguiendo los protocolos de la OMS.
Se encontraron 224 PV Sabin en el período estudiado en 20 provincias:
49 y 175 cepas a partir de 39 y 134 casos de D y PAF, respectivamente.
Se observó diferencia estadísticamente significativa: entre las tasas de
detección de PV de D y PAF (0.5 y 6.7% respectivamente) y entre los PV
aislados de pacientes menores (85/173) y mayores (14/173) a 1 año de
edad. La tasas de aislamiento por serotipo y patología fue la siguiente:
Sabin1: 0.3 y 1.9%; Sabin2: 0.4 y 3.7%; y Sabin3: 0.3 y 4.0 % para D y
PAF respectivamente. La búsqueda de VDPV por RT-PCR mostró 22
posibles VDPV: 2 tipo 1 y 20 tipo 2. De ellos solo uno se confirmó como
tal por secuenciación. Además se detectó otro VDPV directamente por
secuenciación sin RT-PCR. Ambos eran casos de PAF, tipo 1, de los años
1998 y 2009.
Argentina se encuentra libre de PV salvaje desde 1984. La vacuna
utilizada en el calendario nacional es la OPV y se aplica a los 2, 4, 6 y 18
meses de edad. La elevada tasa de aislamiento de virus Sabin y VDPVs
en los pacientes con PAF reflejaría la introducción de cepas vacunales
por el uso de OPV. Se confirmó la presencia de PV vacunal en la
población y el posible riesgo epidemiológico que implica, ya que podría
generar la circulación sostenida de cepas virales neurovirulentas.
Además, los datos sugieren que la búsqueda de PV en fuentes no
convencionales no aporta información adicional a la obtenida por la
vigilancia de PAF y no justificaría su implementación como método
complementario para determinar la presencia de PV en la población.
Los pacientes con asilamiento de PV y parálisis (transitoria o no)
sugerirían que la misma podría ser producida por la OPV, lo que sería
otro efecto no deseado. El cambio a un esquema secuencial IPV-OPV de
vacunación es necesario para evitar los PPAV, VDPV y circulación de
cepas vacunales.
62
Libro de resúmenes
0261
ANALISIS Y DESCRIPCION DE RESULTADOS DE INFECCIONES
RESPIRATORIAS VIRALES EN UN PERÍODO DE 5 AÑOS EN HOSPITALES
PROVINCIALES DE ROSARIO, SANTA FE.
MA Sanchez, MM Campora, SS Marchiano, MA Taborda
Laboratorio de Diagnóstico Virológico, Cátedra de Virología,
Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y
Farmacéuticas, UNR, Rosario, Argentina.
Las infecciones respiratorias agudas (IRA) son la primera causa de
morbilidad en la infancia en el mundo. La investigación epidemiológica
es fundamental para conocer los agentes involucrados, su impacto en
los sistemas de salud y para el desarrollo de estrategias de prevención,
tratamiento y formulación de vacunas.
Nuestro objetivo fue analizar los resultados obtenidos del estudio de
paneles virales en pacientes pediátricos internados en los hospitales
Provincial del Centenario y de Niños Zona Norte en el período enero
2010-diciembre 2014.
Se estudiaron 1755 aspirados nasofaríngeos (ANF) de pacientes
internados en salas de neonatología y pediatría con sospecha de IRA
durante el período mencionado y con un tiempo de evolución de la
sintomatología de hasta 5 días. Las muestras remitidas fueron
analizadas por Inmunofluorescencia Directa mediante “Respiratory DFA
Viral Screening & Identification Kit” LIGHT DIAGNOSTICS-Millipore para
la detección cualitativa de: Adenovirus, Virus Sincicial Respiratorio
(VRS), Virus Influenza A y B, Virus Parainfluenza 1, 2 y 3.
En función de la época del año, las muestras se procesaron de 2
maneras diferentes: durante los períodos donde se esperaba baja
frecuencia de resultados positivos se utilizó el reactivo de Screening, las
muestras positivas fueron posteriormente analizadas con panel de
identificación. En los meses donde se esperaba mayor frecuencia de
resultados positivos se trabajó directamente con anticuerpos
monoclonales específicos para los siete virus. Esta forma de trabajo nos
permitió eficientizar el uso de los insumos de los que disponemos.
En 2010 se estudiaron 282 muestras de las cuales 69 (24%) fueron
positivas. En 2011 se estudiaron 388 muestras de las cuales 72 (21.3%)
fueron positivas. En 2012 se estudiaron 317 muestras de las cuales 116
(36.6%) fueron positivas. En 2013 se estudiaron 319 de las cuales 117
(36.6%) fueron positivas. En el 2014 se estudiaron 499 muestras de las
cuales 182 (36.5%) fueron positivas. En todas las muestras de screening
positivos se logró identificar el agente viral. Durante los años
estudiados se observó un franco predominio de VRS con picos de
aparición promediando las semanas epidemiológicas 23 y 28,
coincidente con lo notificado por el Sistema Nacional de Vigilancia
Epidemiológica por Laboratorios de Argentina (SIVILA).
Los datos analizados demuestran un aumento en la solicitud de
búsqueda de agentes virales en el diagnostico diferencial de IRA. El
mayor número de muestras positivas puede deberse a una mejora de la
etapa pre-analítica (momento y forma de obtención de la muestra) y a
un aumento de la vigilancia virológica por parte del sistema de salud.
Este aumento en la demanda conlleva a la necesidad de optimizar los
recursos humanos y económicos. Proponemos intensificar el sistema de
redes de laboratorios que ya esta en marcha.
0264
PREVALENCIA DE VIRUS WEST NILE Y SAINT LOUIS EN ALOUATTA
CARAYA DEL NORDESTE DE CORRIENTES, ARGENTINA.
GI Oria1, L Spinsanti2, MM Kowalewzki3, M Raño3, GE Zunino4, OS
Stechina5, MS Contigiani2, M Stein5
1
Instituto de Medicina Regional-Facultad de Medicina-UNNE,
Argentina. 2 Laboratorio de Arbovirus- Instituto de Virología “Dr. J.M.
Vanella”- Fac. Cs. Médicas- UNC., Argentina. 3 Estación Biológica
Corrientes. (MACN BR –CONICET) Corrientes, Argentina. 4 Universidad
Nacional de General Sarmiento- Buenos Aires., Argentina. 5 Instituto de
Medicina Regional-UNNE, Argentina.
En la Argentina habitan cinco especies autóctonas de monos, entre
ellos los aulladores negros y dorados (Alouatta caraya). Estos primates
son susceptibles a la infección por Flavivirus, pudiendo actuar como
centinelas de algunas enfermedades. Diferentes estudios han
reportado la presencia de los virus de Encefalitis de San Luis (SLE), y
Nilo Occidental (WN) en A. caraya, en algunas provincias del Noreste
argentino (NEA). El objetivo del trabajo fue conocer la seroprevalencia
de estos virus en monos que viven en ambientes próximos a áreas
urbanas. Los primates fueron capturados empleando dardos con
anestésicos. Se registró el peso, medida, edad de cada individuo y se
tomó una muestra de sangre por vía femoral. Las muestras tomadas
corresponden a capturas en los meses de septiembre de 2010 (N=2) en
la localidad de Itatí (27° 16´16´´S, 58° 15´40´´W), octubre de 2010 (N=4)
en el INTA Sombrerito (27° 39´45´´S, 58° 47´07´´W) y noviembre de
2012 (N=19) en Estación Biológica Corrientes (MACN-CONICET) en San
Cayetano (27° 30´S, 58° 41´W), sin recaptura. La mayoría de los
ejemplares (19/25) correspondió a monos adultos con edades
superiores a los 4 años. De las muestras obtenidas 11/25
correspondieron a hembras. Se detectaron anticuerpos neutralizantes
contra los virus WN y SLE, mediante la técnica de neutralización con
células Vero C76. La seroprevalencia general para Flavivirus fue de 32%,
y de esos el 50 % (4/8) correspondió a virus WN y 37,5 % (3/8) a SLE.
Una sola muestra de suero fue positiva para ambos virus. Cuatro de las
muestras positivas correspondieron a ejemplares adultos, 3 a
subadultos y 1 juvenil. Sólo una de las muestras positivas correspondió
a un adulto capturado en el 2010, las restantes, a sueros obtenidos de
capturas realizadas en el 2012. Los resultados obtenidos muestran la
co-circulación de los virus SLE y WN en la provincia de Corrientes, en
poblaciones de Alouatta caraya. Estudios de seroprevalencia para estos
virus en humanos realizados en el 2007 en Corrientes ya alertaban
sobre su circulación. Durante el año 2010 algunos de los investigadores
de este grupo de trabajo, obtienen prevalencias de 10,2% y 19,81%
para SLE y WN respectivamente de sueros de primates capturados en
localidades cercanas a las nombradas en el presente trabajo. A partir de
esta investigación surge la necesidad de continuar y profundizar
estudios que permitan revelar los ciclos de transmisión de estos virus
en el nordeste de Argentina, teniendo en cuenta que se confirma A.
caraya como huésped susceptible de los mismos y por otro lado el
alerta hacia las autoridades sanitarias ya que podemos pensar que la
circulación también es reciente dado que fueron detectados en
ejemplares juveniles.
0286
VIGILANCIA DE LOS VIRUS SARAMPION Y RUBEOLA EN LA REPÚBLICA
ARGENTINA: ACTIVIDAD DEL LABORATORIO NACIONAL DE
REFERENCIA, PERIODO 2012-2014
N Periolo1, M Avaro1, E Macias Machicado1, F Pardon1, E Benedetti1, A
Czech1, A Pontoriero1, M Russo1, A Campos1, F Bruggesser2, G Elbert2, C
Vizzotti2, E Baumeister1
1
Laboratorio Nacional de Referencia de Sarampión - Rubéola, Servicio
Virosis Respiratorias, INEI-ANLIS “C. G. Malbran”., Argentina. 2 Dirección
Nacional de Control de Enfermedades Inmunoprevenibles del Ministerio
de Salud, Argentina.
Introducción: El sarampión (S) y la rubéola (R) son enfermedades
febriles exantemáticas (EFE) causadas por virus de ARN, perteneciente
a la familia de los Paramixovirus en el caso del S y a la familia Togavirus
para el virus de la R, Además la infección intrautero por R puede
acarrear el desarrollo del síndrome de rubéola congénito (SRC). Gracias
a las elevadas coberturas de vacunación que se mantienen en forma
continua y a la vigilancia epidemiológica, en nuestro país no se
registran casos autóctonos de S desde el año 2000 ni de R y SRC desde
el 2009. En 2012 el Laboratorio Nacional de Referencia de Sarampión–
Rubéola (LNRSR) alcanza la acreditación para la OPS/OMS. En diciembre
de 2013 Argentina certificó ante la OPS la eliminación de la circulación
endémica de S y R. El LNRSR en conjunto con la Dirección Nacional de
Control de Enfermedades Inmunoprevenibles (DiNaCEI) del Ministerio
de Salud Nacional trabajan para mantener activos los mecanismos de
prevención, alerta temprana y de intervención inmediata ante la
presencia de casos sospechosos. Objetivos: Describir y analizar los
resultados de laboratorio de la vigilancia para S y R obtenidos en el
LNRSR. Metodología: Las muestras de casos sospechosos de S y R
fueron derivadas al LNRSR para su confirmación desde diferentes
regiones del país. El diagnóstico de laboratorio se realiza mediante la
detección de anticuerpos IgM y recuperación del ARN viral de muestras
de orina y secreciones respiratorias. La detección del ARN viral se
realizó mediante RT-PCR Real Time. El estudio del genotipo se realizó
utilizando el kit distribuido por los Centros para el Control y Prevención
63
Libro de resúmenes
de Enfermedades (CDC) secuenciando las proteínas N del S y E1 del R.
Resultados: En los últimos tres años se estudiaron, en el LNRSR, 348
casos sospechosos de EFE (76 casos en 2012, 108 en 2013 y 168 en
2014) y 172 casos sospechosos de SRC. No se confirmó ningún caso de
SRC. En 11 muestras se determinó la presencia de genoma viral para el
virus de S, en dos de ellas se confirmó la importación de los genotipos
D4 (2012) y D8 (2014) acompañados de serología positiva. El resto
correspondieron a casos asociados a la vacunación reciente. Se
detectaron dos casos importados de R, uno correspondiente al
genotipo 2B. Conclusiones: Nuestro país en conjunto con los países de
las Américas se encuentran en proceso de lograr la eliminación del S y
la R, sin embargo, en otros continentes, estas enfermedades son
endémicas y continúan siendo una amenaza. Por lo cual, un caso
importado constituye un evento con gran repercusión en la salud
pública del país y la Región, generando demanda de recursos para el
estudio de los contactos y las acciones de bloqueo vacunal. Sostener
altas coberturas de vacunación, fortalecer la vigilancia epidemiológica y
confirmar la ausencia de circulación viral son los pilares para mantener
los objetivos de los programas de eliminación y control.
0299
ANALISIS DE POLIMORFISMOS DE LA PROTEINA TAX DEL VIRUS
LINFOTROPICO T HUMANO TIPO 1 (HTLV-1) EN CASOS POSITIVOS DE
ARGENTINA
JP Salido1, ME Eirin2, CB Cánepa1, G Pataccini1, M Ruggieri1, S Fraile1, M
Carobene1, MM Biglione1, C Berini1
1
Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (INBIRS),
UBA-CONICET, Argentina. 2 Laboratorio de Tuberculosis Bovina,
Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA-Castelar, Argentina.
El HTLV-1 es el agente etiológico de la Leucemia/Linfoma a Células T del
Adulto (ATL) y de la Mielopatía asociada al HTLV-1 (HAM/TSP). La
proteína Tax es un factor viral crítico para la activación genómica, la
expresión de genes virales, como así también para la transformación
celular. El objetivo de este estudio consistió en analizar la presencia de
polimorfismos nucleotídicos en Tax en casos HTLV-1 positivos
provenientes de diferentes regiones de la República Argentina. Se
analizaró un total de 85 muestras, 10 de ellas pertenecientes a
individuos Kollas de Jujuy y 75 residentes de la provincia de Buenos
Aires (BA). Estas últimas incluyeron 54 muestras de individuos
asintomáticos y 21 de pacientes de servicios de hematología y
neurología. A partir del ADN obtenido de CMSP se realizó la
amplificación del gen tax mediante una hemi-nested-PCR (1058pb), la
misma fue secuenciada, editada y alineada. Como secuencia de
referencia se usó la ATK-1. Las secuencias nucleotídicas fueron luego
traducidas a aminoácidos y a partir de ellas se identificaron mutaciones
no sinónimas en los dominios funcionales de la proteína. Se detectaron
mutaciones puntuales en todas las secuencias analizadas. La variación
media de la de los Kollas fue de 5,2 ± 0,5, semejante a la de los
portadores asintomáticos residentes de BA (6,2 ± 1,5) y
significativamente menor que la de individuos con patología (6,9 ± 2;
p>0,05). Las mutaciones detectadas se registraron en los dominios de
localización nuclear; LZR (Leucine Zipper Region); de dimerización y
activación de NF-kB; en la señal de exportación nuclear, entre otras, en
individuos asintomáticos y con patologías. En secuencias obtenidas de
Kollas de Jujuy se encontraron dos polimorfismos (T7914C and C7982T),
ausentes en las de BA, sin impacto en la estructura aminoacídica de la
proteína. Además, se hallaron dos mutaciones (A221V y F304N)
presentes tanto en las secuencias de los Kollas como en las de los
residentes de BA. La primera en los dominios de dimerización y de
activación del factor celular NF-kB de la región central de la proteína, y
la segunda en el extremo carboxi-terminal, en una región a la cual no se
le han asignado función por el momento. Si bien no se puede
establecer asociación entre mutaciones determinadas y patologías,
estos resultados corroboraron la presencia de diferentes polimorfismos
en la proteína Tax posiblemente, alguna de ellas relacionadas con el
origen étnico.
0301
PRIMERA CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL VIRUS SINCITIAL
RESPIRATORIO EN LA PROVINCIA DE CORRIENTES EN LOS AÑOS 2013
Y 2014.
N Ruiz Diaz1 2, G Andino1 2, J Benegui1, M Coceres1, J Espinoza1
1
Laboratorio Central de Redes y Programas. Ministerio de Salud Pública
de la Provincia de Corrientes, Argentina. 2 Cátedra “Virología Clínica”
Carrera de Bioquímica. FaCENA. UNNE., Argentina.
Resumen
Las infecciones respiratorias por Virus sincitial respiratorio (RSV)
constituyen un problema en salud, ya que representan la primera causa
de internación en los meses de invierno con una elevada
morbimortalidad en niños menores de 5 años. Se presenta
generalmente como una bronquiolitis, cuya gravedad puede depender
del huésped, del virus y/o ambiente.
Objetivo: El objetivo del estudio fue confirmar por primera vez la
circulación de los subtipos A y B del RSV, en niños menores de 5 años
hospitalizados durante los años 2013 y 2014, en la provincia de
Corrientes.
Materiales y métodos: se realizó un estudio descriptivo retrospectivo,
en el que se analizaron 100 ARN (50 correspondientes a cada periodo
analizado) extraídos por columna comercial de muestras de aspirados e
hisopados nasofaríngeos, de niños hospitalizados entre 0 a 5 años
previamente positivos por IFD, correspondientes a los años 2013 y
2014. Los ARN fueron mantenidos a – 70° C hasta su procesamiento y
fueron analizadas por la técnica de RT-PCR en tiempo real múltiplex
para los subtipos A y B, estandarizado en el laboratorio Virología
molecular.
Resultados: La frecuencia del VRS por inmunofluorescencia
directa(IFD), fue del 47% y 27%, para una población de niños menores
de 5 años, durante 2013 y 2014 respectivamente.
Analizando en forma individual cada periodo, de las 50 muestras
estudiadas por la técnica molecular se hallaron para el 2013, 40 (80%)
muestras positivas para el subtipo A y 9 (18%) para el subtipo B, no
observándose infección mixta para este periodo. Para 2014, 37 (74%)
fueron positivas para el subtipo B y 8 (16%) para el subtipo A;
observándose la presencia de ambos subtipos en 4 pacientes. Dos
muestras resultaron negativas, una en cada periodo.
Conclusión: los datos arrojados por el presente trabajo permiten
confirmar por primera vez la circulación de los subtipos A y B, en
población pediátrica menor a 5 años, en la provincia de Corrientes. Si
bien la cohorte estudiada es acotada a un pequeño número de
muestras, esto permitió demostrar por medio del análisis molecular
que los subtipos A y B del RSV cocircularon durante el período
analizado, encontrándose una mayor prevalencia del subtipo A sobre el
B en el año 2013, de forma inversa en el 2014, percibiéndose además
en este ultimo la presencia de infecciones mixtas.
El presente estudio pretende sentar las bases de la epidemiología
molecular de VRS, entendiendo que la misma contribuye a un mejor
conocimiento de la circulación del mismo y permite establecer
parámetros de importancia, dándole un rol fundamental al laboratorio
de Virología en la vigilancia molecular en la provincia.
Es preciso realizar nuevos estudios con poblaciones más grandes, con el
fin de determinar si existen diferencias estadísticamente significativas
en cuanto a la severidad de la infección y la edad de los pacientes,
debidas a los subtipos A y B.
0309
DISTRIBUCION DE GENOTIPOS DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO
EN MUJERES CON DIAGNOSTICO CITOLOGICO DE ATIPIAS ESCAMOSAS
DE SIGNIFICADO INDETERMINADO (ASC-US)
SL Gomez1, JP Sanchez Lancheros1, LT Ortiz Velasquez1, ML Guerrero
Caicedo1, J Amaya2, LP Diaz1, H Vargas1
1
Laboratorio de Salud Publica- Secretaria de Salud de Bogota,
Colombia. 2 Hospital de Engativa, Colombia.
INTRODUCCIÓN. ASC-US no establece un diagnóstico determinante
frente a la patología cervical pero pone en evidencia, algunos cambios
transitorios del epitelio entre ellos la infección por Virus de Papiloma
Humano (VPH) que pueden potencializar la evolución a lesiones
intraepiteliales y cáncer. OBJETIVO: Establecer el perfil epidemiológico
64
Libro de resúmenes
de la infección genital por Virus del Papiloma Humano (VPH) en un
grupo de mujeres con diagnóstico de ASC-US de Bogotá. MATERIALES Y
MÉTODOS: fueron tamizados por Linear Array 200 frotis de mujeres
(17-63 años) con diagnóstico de ASC-US remitidas a valoración
colposcópica captados por un hospital de la red pública de Bogotá
durante el 2014. RESULTADOS: Prevalencia global de VPH 70%
(140/200), 57% (80/140) infecciones múltiples, 47%, 16% y 37%
infección tipos VPH alto, bajo y mixtos (alto-bajo) riesgo
respectivamente. Los tipos de VPH de mayor prevalencia en el estudio
fueron: ¨VPH16 (26,4%); VPH53 (16,4%), VPH52 (13,6%); VPH58
(12,9%); VPH59 (12,1%). CONCLUSIÓN: Carcaterización epidemiológica
de los tipos de VPH en mujeres con ASC-US permite el establecimiento
de algoritmos unificados asociados a la atención integral de la patología
cervical de igual forma permite el fortalecimiento del programa de
atención y control de cáncer cervical.
0313
ESTUDIO DE LA INFECCIÓN PERSISTENTE DE PAPILOMAVIRUS
HUMANOS CON TROPISMO CUTÁNEO EN INDIVIDUOS SANOS DE LA
CIUDAD DE ROSARIO, SANTA FE, ARGENTINA.
D Chouhy1 2, EM Bolatti1, PE Casal2, EJ Stella1, AA Giri1 2
1
Instituto de Biología Celular y Molecular de Rosario CONICET,
Argentina. 2 Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas
Universidad Nacional de Rosario, Argentina.
Los papilomavirus (PV) son virus pequeños y sin envoltura que se
encuentran asociados a infecciones de epitelios mucosos y cutáneos de
una amplia variedad de especies de reptiles, aves y mamíferos. Hasta el
momento se han identificado y secuenciado completamente 204 tipos
de PV que infectan epitelios en humanos (HPV). Además, existen más
de 200 potenciales tipos nuevos de HPV (tipos potenciales), en su
mayoría en piel, de los que sólo se conoce un pequeño fragmento de su
genoma y se ignoran las implicancias clínicas de sus infecciones. Los
HPV cutaneotrópicos presentan mayor heterogeneidad genética que
los mucosotrópicos y están distribuidos en 5 géneros diferentes (α-, β-,
γ-, µ- y η-PV) en la familia Papillomaviridae. La epidemiología de sus
infecciones es poco entendida, existiendo pocos estudios de
persistencia de la infección de HPV en epitelios cutáneos descriptos en
la bibliografía, tanto en lesiones como en piel sana y ninguno se ha
realizado hasta ahora en Argentina. Con el fin de determinar las
características de la infección por HPV en piel sana en relación a los
niveles de exposición UV, se analizó el estado de infección por HPV en
un área de piel expuesta a la luz solar (frente) de 78 individuos sanos
(edad media: 39 años rango etario: 23-63 años, 55 mujeres y 23
hombres) durante 1 año. Se tomaron 3 muestras con hisopo por
voluntario (total de muestras): al inicio de la primavera, al final del
verano y al final del invierno. La presencia y tipo de HPV se determinó
mediante “PCR de gota colgante” con 2 sistemas de cebadores
diferentes: FAP y CUT-EXTED. El 90% (70/78) de la personas resultó
positiva para HPV en al menos una de las muestras y con al menos uno
de los dos sistemas. El 67% (52/78) de los voluntarios fueron positivos
para HPV al inicio de la primavera, pero ésta positividad disminuyó al
final del verano e invierno con un 51% (40/78) y un 54% de voluntarios
positivos para HPV, respectivamente. El 52% (43/78) de los voluntarios
resultaron positivos en al menos dos de los períodos analizados. Sólo 8
de los 78 voluntarios fueron negativos para la infección por HPV en las
tres muestras mientras que la mayoría (90%) estuvo infectado con uno
o más tipos de HPV durante el período de estudio. Este resultado
demuestra que los HPV pueden propagarse fácilmente entre los
individuos y causar infecciones sin inducir ningún daño en el tejido.
Utilizando la técnica de PCR altamente sensible para fragmentos largos,
se amplificó y caracterizó el genoma completo de uno de los nuevos
tipos potenciales identificados en este estudio. El nuevo virus (EP01)
comparte un 85% de identidad nucleotídica en el ORF L1 con el HPV173 (γ-1) y ha sido enviado al International Human Papillomavirus
Reference Center (Karolinska Institute, Estocolmo, Suecia) para su
confirmación y denominación oficial. El descubrimiento de nuevos HPV
expande el conocimiento sobre la diversidad, evolución e implicancias
clínicas de la familia Papillomaviridae.
0329
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE VIRUS RESPIRATORIOS EN BOGOTA
A TRAVÉS DE LA VIGILANCIA CENTINELA DE ENFERMEDAD
RESPIRATORIA AGUDA, UNA MIRADA DESDE 2010.
L Gómez1, L Díaz1, A Díaz1, Y Gónzalez1, M Díaz1, P Arce2, H Vargas1
1
Grupo de Laboratorio de Salud Pública. Secretaría de Salud de Bogotá,
Colombia. 2 Vigilancia Salud Pública. Secretaría de Salud de Bogotá,
Colombia.
INTRODUCCIÓN. Actualmente se realiza la estrategia de vigilancia
epidemiológica tipo centinela en Infección Respiratoria Aguda, para
detección de virus. El desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico
como son las pruebas moleculares, permite identificar con mayor
sensiblidad los virus de notificación obligatoria y la detección de nuevos
virus. Este estudio buscó identificar los 7 virus de notificación
obligatoria y los llamados emergentes como Metapneumovirus,
Bocavirus, Rinovirus y Coronavirus, entre otros que se han reportado a
nivel mundial estan involucrados en casos de IRA, teniendo en cuenta
que en Bogotá- Colombia no se tiene conocimiento de su circulación.
OBJETIVO. Establecer el perfil epidemiológico de los virus respiratorios,
por medio de nuevas metodologías diagnósticas durante tres años del
programa de vigilancia centinela para Infección Respiratoria Aguda.
MATERIALES Y MÉTODOS. Estudio descriptivo retrospectivo, con
análisis de muestras de los años 2010, 2012 y 2014, recibidas por
medio de la estrategia de vigilancia centinela, con criterios de caso para
Infección Respiratoria Aguda Grave. RESULTADOS. 925 muestras fueron
analizadas, el mayor porcentaje fue del año 2010 con 434 (46,9%). El
25,6% de las muestras fueron negativas (n=237), mientras la
positividad se observó en el 74,3% (n=688). Los virus de notificación
obligatoria por las nuevas técnicas fueron detectados en el 81,2%
(n=559), de las muestras y los virus emergentes en el 41,2% (n=284). El
34,3% (n=236) se presentaron como coinfecciones. El virus de
notificación más frecuente fue el Sincitial Respiratorio A en el 31,2%
(n=215), de los emergentes ocupa el Bocavirus el primer lugar con
22,3% (n=154). Las semanas 14, 19 y 15, evidenciaron la mayor
positividad para los años 2010, 2012 y 2014, respectivamente.
CONCLUSIONES. El seguimiento en los tres años permitió identificar el
comportamiento de los virus respiratorios para la implementación de
nuesvas estrategias de manejo de la infección respiratoria en el distrito.
0331
CORREDOR ENDÉMICO DE VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO EN NIÑOS
MENORES DE 5 AÑOS
L López, P Miceli, E Langan, I Mirayes, C Aranda
Hospital General de Agudos "Dr. Carlos G. Durand", Argentina.
Introducción: Un corredor endémico es una herramienta de vigilancia
epidemiológica. Constituye una representación gráfica de la incidencia
actual sobre la histórica y permite detectar precozmente cifras
anormales de casos de la enfermedad en estudio. La infección por virus
sincicial respiratorio (VSR) puede ser vigilada por esta metodología ya
que es una entidad endémica, de incubación breve y evolución aguda.
Es la causa más importante de enfermedad del tracto respiratorio en
infantes y niños. A la edad de 5 años la mayoría de los niños ha
experimentado infección por este virus al menos una vez en la vida.
Objetivos: Confeccionar el corredor endémico semanal de infección
respiratoria aguda baja (IRAB) por virus sincicial respiratorio en niños
de 0 a 5 años de edad internados en nuestra institución en el período
2007 a 2013. Determinar el patrón de presentación de VSR en 2014.
Metodología: Se realizó un estudio epidemiológico descriptivo. Se
incluyeron 3541 muestras de secreciones respiratorias de niños
menores de 5 años internados por IRAB entre 01/01/2007 y
31/12/2014.
Para
el
diagnóstico
virológico
se
utilizó
inmunofluorescencia directa e indirecta. Los resultados se volcaron en
la planilla de Notificación Agrupada del SIVILA semanalmente y se
exportaron a un archivo de Excel. De acuerdo con la metodología
descripta por Bortman para la elaboración de corredores endémicos, se
calcularon tasas de incidencia, media geométrica, desvío estándar e
intervalo de confianza de 95%, y se confeccionaron los gráficos de áreas
que definen 4 zonas: éxito, seguridad, alarma y epidemia o brote.
Resultados: El promedio del porcentaje de detección de virus
respiratorios para el período fue 40,7% (33.5 - 47.6%). El 66.7% (56.8 –
65
Libro de resúmenes
75.4%) de los positivos correspondió a VSR. Se confeccionó el corredor
endémico de VSR que presentó patrón epidémico estacional con mayor
actividad entre las semanas epidemiológicas (SE) 17 a 33. En 2014 la
incidencia de VSR transcurrió mayormente por zona de alarma y se
mantuvo dentro de los rangos de fluctuación normal. Se detectó
circulación viral desde la SE 8 hasta la 40. A partir de la SE 15 se observó
un incremento gradual de casos hasta la semana 23 en que se registró
el máximo, superando la zona de seguridad del canal endémico.
Conclusión: La circulación de VSR para 2014 pudo ser vigilada a nivel
local en tiempo real. Contar con un corredor endémico confeccionado
con la población de nuestro hospital permite identificar
tempranamente posibles brotes e implementar medidas de prevención
y control en el área de influencia y en el ambiente hospitalario.
0336
EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE LA INFECCIÓN DE PAPILOMAVIRUS
HUMANOS EN LESIONES DE LA MUCOSA ORAL/NASAL
EJ Stella1, EM Bolatti1, D Chouhy1 2, PE Casal2, G Rulloni3, AL Nocito4, AA
Giri1 2
1
Instituto de Biología Celular y Molecular de Rosario CONICET,
Argentina. 2 Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas
Universidad Nacional de Rosario, Argentina. 3 Servicio de
Otorrinolaringología, Hospital Provincial del Centenario, Argentina. 4
Cátedra de Anatomía Patológica, Facultad de Ciencias Médicas (UNR),
Argentina.
Los papilomavirus humanos (HPVs) son un grupo heterogéneo de virus
sin envoltura y con genoma de ADN doble hebra circular de
aproximadamente 8 kpb. Hasta el momento se han caracterizado más
de 200 tipos de HPVs, distribuidos en 5 géneros diferentes (α-, β-, γ-, µy η-PV) en la familia Papillomaviridae. Un grupo de ellos vinculados a
infecciones de mucosas (α-PV) son considerados los agentes causantes
de canceres cervicales, anogenitales y orofaríngeos. Se asume que los
HPV reflejan el tropismo tisular de donde fueron aislados
originalmente. Sin embargo, estudios recientes demuestran que la
cavidad oral contiene un amplio espectro de tipos de los géneros β-PV y
γ-PV que originalmente fueron considerados cutaneotrópicos. Nos
propusimos conocer la epidemiología de la mucosa oral y respiratoria
de pacientes con lesiones benignas y malignas con el sistema L1HPVPCR
que combina la amplificación con cebadores MY09/11, hibridación
líquida con sondas específicas para 16 HPV mucosos y detección
colorimétrica. Para ello se reclutaron 65 pacientes (edad media: 45
años; rango: 3-76 años; 51 hombres y 14 mujeres) que concurrieron al
Servicio de Otorrinolaringología del Hospital Provincial del Centenario
por presentar lesiones en la cavidad oral/nasal (cuerdas vocales, fosas
nasales, amígdalas, laringe). La prevalencia de la infección por HPV fue
del 26% (17/65). El tipo más prevalente fue el HPV-6 (6/65), seguido
por los tipos 16, 18 y 35 (2/65 cada uno). Las biopsias fueron agrupadas
según el diagnóstico histológico en 4 categorías: A) procesos
inflamatorios negativos para neoplasias, B) presencia de coilocitos y
displasia, C) carcinomas in situ e infiltrantes y D) lesiones malignas no
epiteliales. La mayor frecuencia de infección por HPV se encontró en la
categoría B (4/5, 80%), seguida por la C (6/25, 24%) y la A (7/31, 23%).
La categoría D fue negativa para HPV en los 4 pacientes incluidos.
En conclusión, la concordancia obtenida entre la metodología
molecular y la histología confirma el rol de la infección con ciertos tipos
en el desarrollo de patologías tradicionalmente asociadas al virus. En
contraste, el desarrollo de neoplasias malignas (C) podría estar
relacionado a la exposición a otros factores de riesgo (alcohol y/o
tabaco). Se encuentran en curso los experimentos con otros cebadores
para identificar un mayor espectro de tipos de HPV para hacer un
análisis exhaustivo de la epidemiología de HPV en mucosa oral/nasal.
0346
DETECCION Y CARACTERIZACION MOLECULAR DE AICHIVIRUS A
PARTIR DE AGUAS RESIDUALES VOLCADAS SIN TRATAMIENTO AL RIO
URUGUAY, URUGUAY
LFL Tort1, L Burutarán1, M Victoria1, M García1, A Lizasoain1, M
Miagostovich2, JPG Leite2, R Colina2
1
Laboratorio de Virología Molecular, Regional Norte, CENUR Litoral
Norte, Universidad de la República, Salto, Uruguay. 2 Laboratorio de
Virología Comparada y Ambiental, Instituto Oswaldo Cruz (FIOCRUZ),
Rio de Janeiro, Brasil.
Los Aichivirus (AiV) pertenecen al género Kobuvirus, de la família
Picovirnaviridae, y se han descrito tres genotipos de AiV capaces de
infectar humanos: A, B y C. AiV es un virus entérico humano con una
prevalencia global entre 0,9 y 4,1% en casos esporádicos de
gastroenteritis, y también ha sido detectado en aguas superficiales
ambientales. El objetivo del presente estudio fue evaluar la
contaminación con AiV de aguas residuales que son descargadas al Rio
Uruguay sin tratamiento previo. Con este propósito, fueron realizadas
colectas quincenales de Marzo del 2011 Febrero del 2012 en cuatro
ciudades uruguayas localizadas en el litoral noroeste del país (n = 96):
Bella Unión, Salto, Paysandú y Fray Bentos. Las muestras fueron
concentradas por un método de ultracentrifugación, para luego realizar
la extracción de ARN del concentrado viral, y a partir del ARN extraído
fue realizada una RT-PCR anidada direccionada a la región 3CD del
genoma de AiV. Las muestras positivas por RT-PCR fueron
secuenciadas, y a partir de las mismas fue realizado un análisis
filogenético para determinar el genotipo de AiV. Fue observada una
gran diseminación de AiV en las muestras de aguas residuales
analizadas, con una positividad de 57,3%, siendo detectado en una alta
prevalencia en las cuatro ciudades analizadas. No se detectó una
estacionalidad marcada, sin embargo, fue observada una positividad
mayor en las estaciones más frías de año (otoño e invierno). El análisis
filogenético mostró que todas las muestras analizadas pertenecieron al
genotipo B. El presente estudio representa la primera detección de AiV
en nuestro país; y muestra un potencial riesgo de infección con este
virus de las poblaciones localizadas sobre el Rio a través de: i)
actividades recreacionales (deportes acuáticos, zonas de playa, pesca,
etc), ii) riego de frutas y vegetales, así como iii) el consumo de agua del
Rio Uruguay, al cual son vertidas estas aguas residuales sin previo
tratamiento.
0351
DISTRIBUCIÓN TEMPORAL DE LOS SEROTIPOS DEL VIRUS DENGUE
(DENV) EN UN AREA HIPERENDÉMICA DE COLOMBIA DEL 2001 AL
2012.
A Bonelo, J Gonzalez, L Osorio, B Parra
Universidad del Valle, Colombia.
Introducción: La infección por virus dengue (DENV) es la arbovirosis
más frecuente en el mundo. Existen 4 serotipos del DENV, y la
circulación simultánea de ellos en una región aumenta el riesgo de
gravedad asociada a la ocurrencia de infecciones secundarias. La ciudad
de Cali, al suroccidente colombiano, es una zona hiperendemica para
dengue, con un aumento marcado en el numero de casos en la ultima
década y epidemias importantes en el 2002, 2009-2010 y 2013.
Objetivos: El objetivo del estudio fué describir la cronología de
circulación de los serotipos de DENV en Cali y su relación con la
incidencia de casos, desde el 2001 a 2012.
Métdología: Se estimó la frecuencia de cada uno de los serotipos virales
por mes y año en 381 casos de la enfermedad, confirmados por RT-PCR
o aislamiento viral. La información se obtuvo retrospectivamente de
estudios en sujetos con sindrome febril sospechosos de dengue. La
frecuencia de circulación de cada serotipo por mes se expresó como un
porcentaje del total de aislamientos del mismo serotipo para el año
correspondiente. La incidencia de dengue se obtuvo del sistema de
vigilancia en salud pública de la ciudad.
Resultados: Se obtuvieron aislamientos desde noviembre del 2001
hasta diciembre de 2012, exceptuando el 2003, 2009 y 2011. En el 2001
y 2002 predominó DENV-4 (57.6% y 47.1%) y en menor proporción
DENV-2 seguido por DENV1. En 2004 se identificó por primera vez
después de 30 años, el DENV-3 (77.8%), el cual desplazó en frecuencia
al DENV-4 y se mantuvo por tres años consecutivos hasta el 2006 como
el serotipo más frecuentemente aislado. DENV-1 se identificó
excepcionalmente desde Mayo del 2002 hasta mayo del 2005. En el
2007, año de baja incidencia de dengue, circularon todos los 4 serotipos
en una proporción similar. En 2008 y los dos primeros meses del 2010
se identificó casi exclusivamente DENV-1 y el resto del año se aisló
DENV-2 y DENV-4; siendo éste un periodo epidémico. Para 2012, el
66
Libro de resúmenes
serotipo predominante y casi exclusivo fué DENV2 (87.9%), el cual no
tuvo predominio en ningun año de la década anterior.
Conclusiones: En conclusión, del 2001 a 2012 circularon los 4 serotipos
de DENV, con circulación anual simultanea de 2 o más. Sin embargo,
uno solo de los serotipos fue el predominante por periodos continuos
de dos a tres años. La secuencia de los serotipos más frecuentes fue
DENV-4, seguido de DENV-3, luego DENV- 1 y finalmente DENV-2.
Basados en estos resultados, se esperaria que en los años siguientes al
2012 los serotipos predominantes fueran DEN-4 o DENV-3. Las
epidemias con mayor numero de casos en Cali hasta el 2012 coinciden
con la circulación de los serotipos DENV-4 (epidemia 2002), DENV-1
(epidemia 2009-2010). Este ultimo brote, fue precedido por un periodo
de 4 a 5 años de mínima circulacion del DENV-1, serotipo responsable
de la epidemia. La ocurrencia de epidemias podría ser explicada por la
acumulación de susceptibles a un serotipo del DENV.
0357
PREVALENCIA HISTORICA DE LA INFECCION GENITAL POR VIRUS DEL
PAPILOMA HUMANO (VPH) EN MUJERES ATENDIDAS POR EL
PROGRAMA DE PROMOCION Y PREVENCION DE CANCER DE CUELLO
UTERINO EN BOGOTA-COLOMBIA
H Vargas1, SL Gomez1, LP Diaz1, D Rodriguez-Hernandez1, E Teusaba2, S
Salamanca3, P Arce5 6, L Torres de la Hoz5
1
Laboratorio de Salud Publica-Secretaria de Salud de Bogota-Colombia,
Colombia. 2 Laboratorio PATOLAB LTDA. Clinica de la Mujer, Colombia. 3
GINESALUD IPS, Colombia. 5 Coordinacion del Programa Distrital
Ampliado de Inmunizaciones-Secretaria de Salud de Bogota, Colombia. 6
Subdireccion de Vigilancia Epidemiologica. Secretaria de Salud de
Bogota, Colombia.
Introducción En Colombia, el ministerio de salud incluyo dentro del
programa ampliado de inmunizaciones la vacuna cuadrivalente con el
VPH en agosto del 2012 para niñas escolarizadas de 9 a 20 años y no
escolarizadas de 9 a 17 años. Por otro lado, los sistemas de detección
del Virus del Papiloma Humano (VPH) capaces de identificar la
presencia de alguno de los tipos virales, ha permitido la caracterizacion
epidemiologica de los tipos de VPH que circulan en mujeres
sexualmente activas que le permite a instituciones rectoras de salud
diseñar indicadores epidemiologicos de seguimiento y/o fortalecer
estrategias asociadas a la prevención y control de la patología cervical a
nivel local. Objetivo: Establecer la prevalencia histórica de la infección
genital por VPH y su posible asociación con ciertos factores de riesgo en
muestras embebidas en parafina (MEP) de mujeres con histología
confirmada de lesión intraepitelial escamosa de alto grado (LIE-AG) y
cáncer cervical (CC) diagnosticadas en Bogota durante el 2010-2014.
Materiales y métodos: En este estudio descriptivo-retrospectivo fueron
analizadas, las muestras embebidas en parafina de 2092 mujeres de
régimen vinculado y subsidiado con diagnostico confirmado de lesión
intraepitelial escamosa de alto grado (LIE-AG) y cáncer cervical (CC) las
cuales fueron diagnosticadas en el Laboratorio Centralizado de
Citopatología Cervical de Bogota y el Laboratorio de Patologia-Patolab.
La extraccion de ADN se realizó usando el Kit QIAamp DNA FEPE Tissue
Kit (Qiagen) y luego se procedió a la amplificación, hibridación y
revelado de los 37 tipos de VPH usando la técnica Linear Array (Roche).
Resultados: La prevalencia puntual de la infección por VPH fue del
34,5% (n=721) entre todas las muestras analizadas, identificándose 37
genotipos diferentes de VPH, de los cuales 14 fueron de alto riesgo (16,
18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68) y 23 de bajo riesgo (6,
11, 26, 40, 42, 53, 54, 55, 61, 62, 64, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83,
84, IS39 y CP6108). La distribución general de los genotipos más
frecuentes en mujeres positivas para VPH de alto riesgo fue VPH 16
(43%), VPH 58 (13%), VPH 52 (11,4%), VPH 31 (8,9%) y VPH 18 (8,3%) y
en el caso de los genotipos de VPH de bajo riesgo fue VPH 53 (8,2%),
VPH 61 (3,6%), VPH 6 (3,2%), VPH 70 y VPH 62 cada uno con 2,9%. En
cuanto al régimen de afiliación, en las pacientes evaluadas el 2,9%
pertenecen al Contributivo, el 38,9% al Subsidiado y el 52,3% al
Vinculado, el 5,9% restante no presentó dato de afiliación. Conclusion:
Con la información obtenida se logró establecer los tipos de VPH
presentes en la población femenina del Distrito Capital antes y despues
de la introduccion masiva de la vacuna de VPH en Bogota.
0382
EVIDENCIA DE LA CIRCULACION DEL VIRUS DE LA HEPATITIS A Y DEL
VIRUS DE LA HEPATITIS E EN MUESTRAS AMBIENTALES EN EL
DEPARTAMENTO DE ANTIOQUIA, COLOMBIA
PA Baez1, CM Jaramillo1, L Arismendi2, JC Rendón1, F Cortés-Mancera1 3,
M Toro1, D Pelaez4, MM González5, F Molina2, MC Navas1
1
Grupo de Gastrohepatología, Universidad de Antioquia, Medellín,
Colombia. 2 GAIA, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia,
Colombia. 3 Grupo de Investigación e Innovación Biomédica GI2B,
Instituto Tecnológico Metropolitano, Medellín, Colombia. 4 Instituto
Nacional de Salud, Bogotá D.C, Colombia. 5 Universidad del Quindío,
Armenia, Colombia.
La hepatitis viral de transmisión entérica es una causa importante de
morbilidad y mortalidad a nivel global. Colombia presenta un patrón de
endemicidad intermedia para la infección por el Virus de la Hepatitis A
(VHA). Con respecto a la epidemiología de la infección por Virus de la
Hepatitis E (VHE) en el país, la información disponible es muy limitada.
Se planteó un estudio con el fin de determinar la presencia de VHA y
VHE y los genotipos circulantes en muestras de agua de 9 municipios
del departamento de Antioquia, Noroccidente de Colombia.
De Diciembre/2012 a Mayo/2013 se realizó un muestreo seriado (3
muestras) de la fuente principal de abastecimiento del acueducto (AA)
y de los sitios de descarga de agua residual (AR) de cada municipio. Las
muestras se obtuvieron en periodos con diferente grado de
pluviosidad.
Las muestras fueron concentradas por filtración/ultrafiltración
tangencial (AA) y por las técnicas de Polietilenglicol y floculación con
leche descremada (AR). Luego se realizó extracción del ARN viral y se
amplificó por RT-PCR la región VP3-VP1 de VHA para detección y por
nRT-PCR la región VP1-2B para genotipificación. La detección y
genotipificación de VHE se realizó mediante amplificación por nRT-PCR
de la región ORF2/3.
Durante el primer muestreo se detectó el genoma del VHA en AA del
corregimiento Nutibara (quebrada La Golondrina) y del municipio de
Puerto Berrío (río Magdalena); en AR el VHA se detectó en Arboletes,
Zaragoza y Venecia. Este hallazgo coincidió con el reporte casos de
hepatitis A en el mismo periodo en 4 de estos municipios. En el
segundo muestreo, solo 1 espécimen fue positivo (AR en Frontino),
municipio que también tuvo reporte de caso de hepatitis A en este
periodo. Todos los especímenes del 3er muestreo fueron negativos por
RT-PCR. Mediante el análisis de las secuencias (MEGA 5.2) se identificó
el genotipo IA de VHA en 4 muestras.
El genoma del VHE fue detectado en las muestras de AA de los
municipios de Granada, Zaragoza y Puerto Berrío (1er muestreo); San
Pedro de los Milagros, Granada y Frontino (2do muestreo) y Girardota,
vereda San Andrés, (3er muestreo). En las muestras de AR se detectó el
VHE en San Pedro de Los Milagros, Venecia y Cisneros (primer
muestreo); Zaragoza y San Pedro de Los Milagros (tercer muestreo). El
genotipo 3 del VHE fue identificado en 3 de las muestras de AR (MEGA
5.2).
La presencia del VHA en AA implica un riesgo de infección para las
comunidades sin planta de potabilización, como es el caso del
corregimiento de Nutibara. Se reporta por primera vez la circulación del
genotipo IA/VHA en muestras ambientales en Antioquia.
El VHE genotipo 3 ha sido reportado previamente en pacientes en
Medellín; este genotipo se ha relacionado con casos de zoonosis en
Latino América y en países industrializados. Es de anotar que Antioquia
es el principal productor de ganado porcino en Colombia, y en
particular los municipios de San Pedro de Los Milagros y Cisneros.
0383
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR Y ANÁLISIS GENETICO DE POXVIRUS EN
LESIONES DE PIEL DE BALLENA FRANCA AUSTRAL, EUBALAENA
AUSTRALIS
C Fiorito1 2, CA Palacios3 4, MD Golemba5, A Bratanich3, M Bertellotti1, D
Lombardo2
1
Centro Nacional Patagónico, CONICET, Puerto Madryn, Chubut,
Argentina. 2 Laboratorio de Histología, Facultad de Ciencias
Veterinarias, Universidad de Buenos Aires, Argentina. 3 Laboratorio de
Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos
Aires, Argentina. 4 Centro de Virología Animal, Instituto de Ciencia y
67
Libro de resúmenes
Tecnología Dr. Cesar Milstein, CONICET, Buenos Aires, Argentina. 5
Laboratorio de Biología Celular y Retrovirus, Hospital de Pediatría
S.A.M.I.C. "Prof. Dr. Juan P. Garrahan", Buenos Aires, Argentina.
Enfermedades ocasionadas por infecciones con diferentes patógenos,
incluyendo poxvirus, son indicadoras de la salud de cetáceos. Distintos
trabajos realizados sobre la ballena franca austral (Eubalaena australis)
estudiada en Península Valdés, muestran una variedad de lesiones
epiteliales de etiología desconocida, y el número de estas lesiones ha
ido en aumento en lo últimos años. Con el objetivo de analizar las
causas de estas lesiones, se tomaron muestras de ballenas muertas.
Durante las campañas de muestreo realizadas en el año 2012 y 2013,
dos de los individuos analizados, uno joven y otro adulto, presentaban
lesiones circulares, caracterizadas por un área circunscripta por un
borde elevado de piel. Las lesiones se caracterizaron histológicamente,
observando microvesículas y células vacuoladas presentes en el estrato
intermedio, junto con hiperplasia del estrato externo, acompañado de
cuerpos de inclusión en el citoplasma de células epiteliales. Por medio
de
microscopía
electrónica,
se
observaron
agregados
intracitoplasmáticos de viriones con una morfología compatible con
poxvirus. Estas muestras fueron procesadas para la extracción de ADN,
a fin de realizar la caracterización molecular de poxvirus de cetáceos
(CPV). Para esto, se amplificaron por PCR fragmentos de ADN
polimerasa y ADN topoisomerasa I de CPV, y como control un
fragmento de la ADN polimerasa de parapoxvirus. Molecularmente se
confirmó la presencia de CPV, y el análisis filogenético muestra que los
virus detectados en ballena franca austral pertenecen al grupo CPV del
tipo 2 (CPV-2). Este es el primer reporte que confirma la presencia de
infecciones ocasionadas por CPV-2 en ballena franca austral. La
presencia de infecciones ocasionadas por poxvirus puede ser uno de los
indicadores que asocian, problemas de salud en estos cetáceos, con a la
degradación del medioambiente por actividades antropogénicas.
0385
CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE VIRUS DE INFLUENZA A H1N1PDM
CIRCULANTES EN URUGUAY MEDIANTE SECUENCIACIÓN MASIVA
V Comas1, M Soñora1, A Fajardo1, P Moreno1, M Moratorio2, J Cristina1
1
Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones
Nucleares, Facultad de Ciencias (UDELAR). Iguá 4225, 11400
Montevideo, Uruguay. 2 Laboratorio de Poblaciones virales y
patogénesis, Departamento de Virología, Instituto Pasteur. 25 Rue du
Docteur Roux, 75015 Paris, Francia.
La gripe es una enfermedad de gran trascendencia a nivel de salud
pública, ya que es la principal causa de muerte por infecciones
respiratorias en humanos, presentando tasas de mortalidad anual de
entre 250 a 500 mil casos a nivel mundial. El agente etiológico de esta
enfermedad es el virus de la influenza A (VIA), virus perteneciente a la
familia Orthomixoviridae. Como la mayoría de los virus cuyo genoma
está compuesto por ARN estos virus presentan elevadas tasas de
mutación, por lo que estos virus circulan como complejas poblaciones
virales constituidas por múltiples variantes genéticamente
relacionadas, denominadas cuasiespecies. Esta característica le permite
al virus evolucionar y adaptarse a nuevos ambientes y hospederos,
representando blancos móviles para la intervención terapéutica,
evolucionando hacia la resistencia a vacunas y drogas antivirales. La
caracterización de las variantes epidémicas, debido a cambios en HA y
NA, es de suma importancia a la hora de la formulación vacunal, así
como para la vigilancia de cepas resistentes a drogas antivirales.
El objetivo del presente trabajo es profundizar en la vigilancia de las
cepas H1N1pdm que circularon en nuestro país entre los años 2009 y
2013, realizando una detallada caracterización de la diversidad
poblacional mediante secuenciación masiva y evaluar la relación de
éstas con la cepa vacunal así como posibles marcadores de resistencia a
los antivirales.
Con este fin se analizaron 25 muestras de pacientes positivos para VIA
H1N1pdm (5 del año 2009 y 15 del año 2011 y 5 del año 2013). Se
realizó la extracción del ARN y se amplificaron por RT-PCR los genes HA
y NA. Los productos fueron purificados y secuenciados para su
identificación y posteriores análisis filogenéticos. Posteriormente se
utilizarón 18 de estos amplicones (9 HA y 9 NA) y se realizó la
secuenciación masiva en la plataforma MiSeq de Illumina y posterior
análisis con el pipeline Viral Variance Analysis (ViVan).
Los análisis filogenéticos para ambos genes mostraron una relación
genética distante entre la cepa vacunal y las cepas analizadas para
todos los años estudiados. Asimismo, difirieron de la cepa vacunal en
varias posiciones aminoacídicas. La mayoría de éstas sustituciones se
localizaron en la superficie de las proteínas y para el caso de NA, las
mismas no interfieren con el sitio activo de la enzima. Si bien en las
secuencias consenso no se identificaron marcadores de resistencia a los
antivirales actuales, los datos de secuenciación masiva permitieron la
identificación de variantes minoritarias para algunos de estos
marcadores en cinco de las nueve muestras analizadas. Además los
datos mostraron una gran diversidad en distintas posiciones
relacionadas a epítopes de superficie. La continua vigilancia de las
cepas circulantes a través de métodos de secuenciado profundo es de
suma importancia para identificar variantes minoritarias que podrían
poseer la capacidad de emerger frente a diferentes presiones
selectivas.
0386
VARIABILIDAD GENETICA DE LAS REGIONES NS3 Y NS5B DEL GENOMA
DE HEPATITIS C EN PACIENTES URUGUAYOS: SU IMPORTANCIA A LA
HORA DE LA UTILIZACIÓN DE DROGAS ANTIVIRALES DIRECTAS
N Echeverria1, G Betancour1, S Boschi2, R Uriarte2, J Cristina1, P Moreno1
1
Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones
Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República Oriental
del Uruguay, Uruguay. 2 Laboratorio de Biología Molecular, Asociación
Española Primera de Socorros mutuos, Montevideo, Uruguay.
La infección por el virus de la hepatitis C (VHC) es una de las principales
causas de trasplante hepático, debido principalmente a su capacidad de
generar una infección crónica que puede derivar en hepatocarcinoma.
Para aquellos pacientes que no resuelven la infección aguda, existen
tratamientos antivirales indirectos que desafortunadamente no son
100% efectivos (bi-terapia con interferón-α-pegilado y ribavirina). A lo
largo de los años se han desarrollado antivirales de acción directa
(DAAs) que actúan a nivel de alguna proteína específica del virus. La
mayoría de estas drogas se encuentran dirigidas a la serín-proteasa
viral (NS3) o a la polimerasa viral (NS5B) y se administran con la terapia
dual. Concomitantemente con el desarrollo de estos fármacos, y
teniendo en cuenta la velocidad evolutiva de los virus cuyo genoma
está compuesto por ARN (como el VHC), se han ido generando
mutaciones que generan resistencia a estos nuevos antivirales. Cabe
destacar que de los DAAs aprobados en otros países del mundo
(telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofosbuvir), únicamente el
telaprevir ha sido aprobado en Uruguay, pero actualmente el Fondo
Nacional de Recursos financia únicamente la bi-terapia.
El presente estudio consistió en la identificación de nuevas variantes y
de variantes ya asociadas a resistencia a los DAAs en las regiones que
codifican para la proteasa y para la polimerasa viral en 16 pacientes
uruguayos infectados con VHC, que no han sido previamente tratados
con este tipo de drogas. Asimismo se realizaron estudios filogenéticos
con cada región analizada. Se empleó el método de máxima
verosimilitud utilizando los modelos evolutivos T92+G+I (polimerasa) y
GTR+G+I (proteasa).
Los resultados obtenidos muestran que de los 16 pacientes 13 se
encuentran infectados con VHC de genotipo 1 (9 subtipo 1a y 3 subtipo
1b) y 4 con el genotipo 3 (subtipo 3a). El estudio realizado a nivel de la
secuencia de NS3 evidenció la presencia, en dos pacientes infectados
con el genotipo 1a, de las sustituciones Q80K y Q80L. Estas mutaciones
confieren resistencia al simeprevir, en mayor o menor grado. Fueron
identificadas además, variantes no reportadas previamente cuya
implicancia en la respuesta al tratamiento aún resta ser dilucidada. De
las variadas sustituciones asociadas con resistencia a inhibidores de la
polimerasa, ninguna fue detectada en los aislamientos estudiados (si
bien hay regiones no abarcadas en nuestro estudio). Sin embargo, en
varias de las muestras se hallaron las sustituciones D244N y Q309R,
comúnmente asociadas con una respuesta virológica sostenida en
pacientes tratados con la bi-terapia clásica. La identificación de
variantes de NS3 y NS5B resistentes a las DAAs (previo al tratamiento
con éstas) podría ser de gran utilidad a la hora de identificar a aquellos
individuos con menor probabilidad de responder favorablemente a
68
Libro de resúmenes
dicha terapia pudiendo ser seleccionados más apropiadamente para
terapias antivirales alternativas o futuras.
0387
ANALISIS FILOGENETICOS DE CEPAS DE NOROVIRUS DETECTADAS EN
URUGUAY
REVELAN
LA
CIRCULACIÓN
DE
VARIANTES
RECOMBINANTES GII.P7/GII.6
A Fajardo1, F López-Tort2, M Victoria2, TM Fumian3, MP Miagostovich3,
JPG Leite3, J Cristina1, R Colina2
1
Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones
Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Igua 4225,
11400, Montevideo, Uruguay. 2 Laboratorio de Virología Molecular.
Regional Norte, Universidad de la Republica, Gral. Rivera 1350, 50000,
Salto, Uruguay. 3 Laboratorio de Virología Comparada e Ambiental,
Instituto Oswaldo Cruz, Ministerio da Saude, Avenida Brasil, 4365 – Pav.
Helio & Peggy Pereira, 21040-360 Manguinhos, Rio de Janeiro, Brasil.
Los norovirus (NoV) son unos de los principales agentes etiológicos
responsables de brotes de gastroenteritis aguda (GA) en todo el
mundo. Distintos genotipos de NoV han sido asociados con diferentes
patrones de transmisión y gravedad de la enfermedad en los seres
humanos. Es por ello que resulta importante identificar genéticamente
los diferentes genotipos de NoV que circulan en una región particular.
Sin embargo, la genotipificación se ha convertido en un importante
desafío debido a la alta frecuencia de eventos de recombinación que
ocurren principalmente en la región de solapamiento de los marcos
abiertos de lectura ORF1/ORF2. Esto resulta en el surgimiento de
variantes cuyas regiones codificantes para la polimerasa y la cápside
derivan cepas parenterales de diferentes genotipos. Teniendo esto en
cuenta, se obtuvieron secuencias conteniendo la región de
solapamiento ORF1/ORF2 de diferentes cepas de NoV obtenidas de
pacientes con uruguayos con GA. Se realizaron diferentes abordajes in
silico con el objetivo de investigar la posible presencia de variantes
recombinantes.
El objetivo del presente trabajo es Investigar la presencia de presuntos
eventos de recombinación en poblaciones de NoV circulantes en
pacientes uruguayos con GA.
Con el fin de cumplir con los objetivos planteados, se aisló el ARN a
partir de 3 muestras de diarrea y 3 de vómito obtenidas de diferentes
pacientes con GA residentes en la ciudad de Salto, Uruguay, que
previamente fueron diagnosticados como positivos para NoV. Se
amplificó mediante RT-PCR la región solapante ORF1/ORF2. Se
realizaron árboles filogenéticos de máxima verosimilitud para ambas
regiones codificantes con el fin de genotipificar cada variante.
Asimismo, las secuencias obtenidas fueron analizadas con el Norovirus
Genotyping Tool. Las incongruencias filogenéticas observadas fueron
analizadas con abordajes bioinformáticos implementados en los
programas SplitsTree, SimPlot y Recombination Detection Program con
el fin de investigar la posible ocurrencia de eventos de recombinación.
Este estudio evidencia la presencia de eventos de recombinación en
cuatro de las seis cepas analizadas para las que el gen de la polimerasa
corresponde al genotipo GII.P7 mientras que la región codificante de la
cápside pertenece al genotipo GII.6. Se trata del primer reporte de
variantes recombinantes GII.P7/GII.6 en las Américas. Asimismo, su
frecuencia relativa indica que estas
variantes circulan naturalmente entre poblaciones de NoV en esta
región del noroeste de Uruguay.
0388
ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN Y VARIABILIDAD GENÉTICA DE
RETROVIRUS ENDÓGENOS HUMANOS EN LEUCEMIA LINFOIDE
CRÓNICA
S Fischer1, N Echeverria1, G Moratorio1, G Dighiero2, J Cristina1, P
Oppezzo2, P Moreno1
1
Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones
Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República Oriental
del Uruguay, Uruguay. 2 Unidad de Proteínas Recombinantes, Institut
Pasteur de Montevideo, Uruguay.
Los retrovirus endógenos humanos (HERVs) son remanentes genéticos
de infecciones retrovirales ancestrales de la línea germinal que han sido
transmitidos de generación en generación hasta nuestros días.
Alrededor del 8% de nuestro genoma está constituido por este tipo de
elementos. HERV-K (HML-2) es la familia de retrovirus endógenos más
joven en el genoma humano y por lo tanto la más preservada
genéticamente. Varias evidencias reportan un aumento de expresión
tanto a nivel transcripcional como traduccional de diferentes genes
pertenecientes a los HERVs (gag, env, np9, rec, etc) en una gran
variedad de cánceres entre los cuales se encuentran leucemias y
linfomas.
El presente trabajo se plantea como objetivo central, estudiar la posible
relación entre la expresión de los genes np9 y gag de HERV-K en la
patología hemato-oncológica Leucemia Linfoide Crónica (LLC).
Con el fin de cumplir con estos objetivos, se recolectaron 25 muestras
de sangre periférica de pacientes con LLC (14 indolentes y 11
progresores) y 6 muestras provenientes de donantes sanos. Se realizó
la separación de células mononucleares mediante el método del Ficoll
Hypaque, extracción de ARN (trizol) y posteriormente se realizó la
transcripción reversa. La cuantificación relativa de los genes de HERV-K,
np9 y gag, fue realizada mediante PCR a tiempo real y posterior cálculo
del 2E-delta delta Ct. Se realizó además una PCR convencional con el fin
de amplificar la secuencia completa del gen np9 de HERV-K de 4
muestras de donantes sanos y 10 muestras de ADNc de pacientes con
LLC. Los productos de amplificación fueron purificados, enviados para
su secuenciación y posteriormente las secuencias fueron editadas y
analizadas utilizando el programa Seq Man y MEGA versión 5.0,
respectivamente.
Los resultados de este trabajo reportan que la actividad transcripcional
del gen np9 de HERV-K se encuentra sobre-expresada (al menos cinco
veces más) en el 75% de las muestras analizadas de pacientes con LLC al
ser comparadas con muestras provenientes de donantes sanos. Por
otro lado el estudio del nivel de expresión del gen gag de HERV-K
evidenció que solo un 33% de los pacientes con LLC expresaron este
gen al menos dos veces más en comparación a los donantes sanos.
Tanto en el caso del análisis de np9 como el de gag se observó una gran
variabilidad entre los pacientes de LLC analizados, no observándose una
diferencia significativa entre los subgrupos de pacientes LLC idolentes y
progresores.
Con respecto al estudio de la variabilidad genética en esta región, los
resultados muestran un alto grado de conservación en la secuencia del
gen que codifica para la proteína Np9 en las diferentes muestras
amplificadas. Se identificaron dos posibles polimorfismos y tres sitios
nucleotídicos donde se observaron mutaciones puntuales.
Este trabajo representa el primer reporte de la sobreexpresión del
oncogén np9 de HERV-K en sangre periférica de pacientes con LLC.
0389
DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE POLIOMAVIRUS JC
EN AGUAS RESIDUALES EN SANTIAGO, CHILE
J Levican, A Gaggero
Programa de Virología, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de
Medicina, Universidad de Chile, Chile.
Introducción. Poliomavirus JC (PyVJC) es un virus DNA sin manto, que
se encuentra ampliamente distribuido en humanos. Habitualmente la
infección cursa de manera asintomática y persistente, afectando el
tejido renal, pudiendo reactivarse lo que lleva a la excreción de virus en
la orina. Su gran resistencia ante diversas condiciones físico-químicas,
hace de PyVJC un buen marcador de contaminación humana en
diversas muestras ambientales. Además, debido a su alta estabilidad
genética combinada con un mecanismo de transmisión, principalmente
intrafamiliar, hace de PyVJC una novedosa aproximación para trazar
migraciones humanas. Recientemente se ha detectado PyVJC en aguas
residuales urbanas en distintas localidades geográficas y los análisis
filogenéticos de secuencias nucleotídicas, constituyen un buen enfoque
para estudiar la composición de la etnia de una región en particular.
Este estudio tiene como objetivo determinar la circulación de PyVJC en
aguas de plantas de tratamiento de aguas residuales en la ciudad de
Santiago, Chile. Metodología. Muestras de aguas residuales crudas y
tratadas, fueron recolectadas mensualmente durante un año y
analizadas para detectar PyVJC usando PCR en tiempo real (qPCR). Las
muestras positivas fueron amplificadas con partidores específicos,
dirigidos a la región IG PyVJC de 610 pb y los productos de PCR fueron
69
Libro de resúmenes
clonados y secuenciados. Las secuencias nucleotídicas resultantes, se
utilizaron para el análisis filogenético usando el software MEGA 5.05.
Resultados. PyVJC fue detectado en un 80,56% de las muestras en un
rango de 5,84x103 y <1 copias genómicas (CG)/ml. El número de CG fue
de al menos 1 orden de magnitud mayor en las aguas residuales crudas
con respecto a las tratadas. Las muestras positivas se detectaron
durante todo el año y no se observó estacionalidad. El análisis
filogenético indica que los aislados de PyVJC detectados agrupan
principalmente con el genotipo asiático 2 (A/C). Conclusiones. Nuestro
estudio indica la presencia de PyVJC, siendo la detección molecular en
aguas residuales una aproximación factible para monitorear polución
humana. La presencia del genotipo asiático, concuerda con estudios
antropológicos anteriores e indica un fuerte componente étnico nativo
americano en la parte sur de América.
Miércoles 24 de junio
Sala C (Petit Dorée - 1º piso)
14:30 - 16:00 hs.
Virología clínica
0019
DETECCIÓN Y GENOTIPIFICACIÓN DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO
EN MUJERES SIN LESIÓN CERVICAL
GB Jorda1 2, A Wegert2, J Mosmann3, ML Lopez2, C Cuffini3
1
Universidad Nacional de Misiones, Argentina. 2 Instituto de Previsión
Social, Argentina. 3 Instituto de Virología Dr J.M. Vanella. Universidad
Nacional de Córdoba, Argentina.
El virus del papiloma humano (HPV) es el agente etiológico de
infecciones genitales más frecuente. Se describieron alrededor de 100
genotipos de HPV, aproximadamente 40 infectan la mucosa genital. La
mayoría de las infecciones, aun las producidas por los tipos de HPV de
alto riesgo (con o sin anomalías citológicas), son transitorias,
autolimitadas y no dejan secuelas oncopatogénicas. Sin embargo, los
HPV pueden generar una infección persistente en una proporción
minoritaria y causar cáncer cérvico uterino.
El objetivo fue establecer la prevalencia de la infección genital por el
HPV y determinar los distintos genotipos de HPV en mujeres de edad
fértil, que concurren al laboratorio del Instituto de Previsión Social de
Misiones (IPSM) con solicitud de estudio de exudado vaginal.
Se estudiaron 505 mujeres (r = 15- 49 años), durante Enero 2012 Mayo 2013. Se tomó una muestra endocervical y se colocó en PBS pH
7,2, luego se realizó la extracción en forma manual con un equipo
comercial. Se utilizó un control interno que amplifica el gen de la beta
actina para evaluar la calidad de la muestra y/o la presencia de
inhibidores. Para la detección del HPV por PCR se utilizó el protocolo de
Mannos y cols. Se amplificó un fragmento de 450 pb del genoma viral
perteneciente al fragmento L1 mediante los primers MY 11 y MY 09. El
genotipo de HPV se determinó por el polimorfismo de la longitud de los
fragmentos de restricción. Se requirió el consentimiento de las mujeres
participantes. Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS
versión 15.
Del total de mujeres estudiadas 155 resultaron infectadas con el virus
del papiloma humano (30,7 %). Se tipificaron 73 muestras. Los
genotipos encontrados fueron: 6(11%), 11(5,5%), 16(35,6%), 18(2,7%),
31(8,2%), 33(2,7%), 35(1,4%), 45(1,4%), 53(2,7%), 57(1,4%), 58(11%),
59(2,7%), 61(11%), 66(2,7%) y 68(1,4%).
La edad media de las mujeres HPV positivas fue de 27,4 ±7,9 años. Se
observó asociación entre HPV y el mayor número de parejas (p=0,045).
No hubo diferencias significativas entre la presencia de HPV y la
sintomatología, el rango etario, el uso de profiláctico y la edad de inicio
de las relaciones sexuales.
Estos resultados aportan datos sobre la importancia de la
implementación del estudio de HPV en nuestra región, debido a que la
prevalencia detectada es alta, al igual que el porcentaje de genotipos
oncogénicos de los cuales sólo dos de ellos están incluídos en la vacuna.
Aunque, es posible que las infecciones por HPV detectadas en las
jóvenes sean transitorias, se recalca que son mujeres que acudieron al
laboratorio por un estudio de exudado vaginal, sin considerar una
lesión cervical o un estudio de PAP. Cabe destacar también la
importancia de hacer un seguimiento de las pacientes mayores de
treinta años que presentan cepas oncogénicas, para la prevención de
las lesiones del cuello uterino y para la vigilancia epidemiológica de
dichos genotipos en esta provincia.
0020
IMPACTO CLÍNICO DE LA COINFECCIÓN POR RINOVIRUS Y SINCICIAL
RESPIRATORIO EN NIÑOS CON INFECCIÓN RESPIRATORIA AGUDA
DN Marcone1, G Carballal1, C Ricarte1, F Poletta1, C Videla1, J Ekstrom1,
A Ellis1 2, SM Vidaurreta1, M Echavarria1
1
Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas (CEMIC)
Hospital Universitario, Argentina. 2 Sanatorio Mater Dei, Argentina.
70
Libro de resúmenes
Los virus respiratorios son la causa principal de infección respiratoria
aguda (IRA) en niños, representando la mayoría de las consultas
médicas e internación. El virus sincicial respiratorio (RSV) es uno de los
más frecuentes en niños con IRA; sin embargo, los rinovirus (HRV) son
una causa común y subestimada de IRA grave.
OBJETIVOS
Determinar la frecuencia viral en niños internados y ambulatorios con
IRA.
Tipificar los virus más frecuentes.
Determinar el riesgo asociado a la coinfección viral.
METODOS
Se
obtuvieron
aspirados
(internados)
e
hisopados
nasofaríngeos (ambulatorios) de 876 niños <6 años con IRA y menos de
5 días de evolución (1/6/08-31/12/11). Se registraron datos
demográficos y clínicos. Criterios de exclusión: cardiopatías,
enfermedad pulmonar crónica, enfermedades genéticas o metabólicas,
inmunodeficiencias.
Las muestras se estudiaron por IFI para RSV, adenovirus (AdV),
influenza A y B (FluA, FluB), parainfluenza (PIV) 1, 2, 3 y
metapneumovirus (HMPV) y por RT-PCR en tiempo real para HRV.
Los RSV se tipificaron con anticuerpos monoclonales y los HRV por
secuenciación de la región parcial VP4/VP2 y análisis de filogenia con
cepas de referencia.
Se realizó un análisis bivariado para identificar factores de riesgo
asociados a internación.
RESULTADOS
Se obtuvo un diagnóstico viral positivo en 73,4% niños con IRA. HRV
fueron los virus más frecuentes seguidos por RSV.
Tabla. Detección viral [n(%)] en 876 niños con IRA (2008-2011).
Total
HRV RSV HMPV AdV FluA FluB PIV
positivos
Internados
n=579
463 (80)
265
(46)
168
(29)
46 (8)
Ambulatorios
180 (61)
n=297
86
(29)
39
(13)
18 (6) 6 (2)
12
(4)
13
(4)
19
(6)
351
(40)
207
(24)
64 (7)
(25
(3)
29
(3)
17
(2)
29
(3)
Total n=876
643 (73)
19
(3)
17
10
4 (1)
(3)
(2)
Se detectó 9% de coinfecciones virales siendo HRV-RSV la más
frecuente.
La detección de RSV o HRV se identificó como un factor de riesgo
asociado a internación: OR: 3,67 (IC95%: 2,29-5,87) y OR: 2,77 (IC95%:
1,91-4,01), respectivamente. Sin embargo, la coinfección RSV-HRV
presentó un riesgo mucho mayor: OR: 12,44 (IC95%: 3,51-44,14).
Se identificó RSV-A en 94% y RSV-B en 6% de las muestras. Los HRV-A y
HRV-C fueron las especies más frecuentes (55% y 43%) y sólo 2% de
HRV-B; se identificaron 30 genotipos diferentes de HRV.
Los niños internados presentaron IRA baja [bronquiolitis (70%) y
neumonía (15%)]. Los ambulatorios tuvieron IRA baja [bronquiolitis
(39%), neumonía (6%) y bronquitis (5%)] y alta (50%).
CONCLUSIONES
HRV y RSV fueron los virus más frecuentes en niños con IRA.
Todas las especies de HRV y los tipos de RSV se detectaron circulando
en Buenos Aires durante 2008-2011.
La coinfección HRV-RSV presentó un riesgo 4 veces mayor asociado a
internación que la infección simple.
La incorporación de métodos moleculares para la identificación de
coinfecciones virales contribuirá a un mejor manejo clínico y medidas
de control de infecciones.
0022
INCIDENCIA DE INFECCIONES RESPIRATORIAS VIRALES EN NIÑOS
INTERNADOS Y AMBULATORIOS MENORES DE 6 AÑOS Y SUS COSTOS
ASOCIADOS
DN Marcone1, LO Durand2, E Azziz-Baumgartner2, SM Vidaurreta1, J
Ekstrom1, G Carballal1, M Echavarria1
1
Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas (CEMIC)
Hospital Universitario, Argentina. 2 Centro para el Control y Prevención
de Enfermedades (CDC), Estados Unidos.
Introducción
Los datos sobre incidencia de infecciones respiratorias agudas (IRA)
virales en niños y los costos asociados son de gran utilidad para
asesorar a los organismos de Salud Pública a establecer medidas de
control y futuras intervenciones.
Sin embargo, en países de medio y bajos recursos estos datos son muy
limitados dada la dificultad en obtener denominadores poblacionales
para el cálculo de incidencia.
Metodología
Durante 2008–2010, se estudiaron 1,800 niños <6 años para identificar
aquellos que requirieron internación o que realizaron una consulta en
sala de urgencias con signos o síntomas de IRA (rinorrea, tos,
sibilancias, taquipnea, tiraje o cianosis, etc). Las muestras de
secreciones respiratorias se estudiaron por IFI para los virus sincicial
respiratorio (RSV), influenza, parainfluenza, adenovirus, y
metapneumovirus y por RT-PCR en tiempo real para rinovirus.
Para estimar la incidencia anual de IRA en niños internados, se dividió el
número de niños de CEMIC con IRA, por el número total de niños
afiliados a CEMIC en 2008, 2009 y 2010. Se utilizó un modelo
multiplicador para estimar la incidencia en sala de urgencias, dado que
no se contó con los recursos económicos suficientes para enrolar a
todos los niños con IRA que consultaron en sala de urgencias. Todas las
tasas estimadas se estratificaron por grupos etarios (<6 meses, 6-23
meses y 2-5 años).
Se examinaron los archivos administrativos de los niños internados con
IRA para determinar los costos asociados.
Resultados
La incidencia de infección por RSV (24/1000 niños/año),
metapneumovirus e influenza (8/1000 niños/año, ambos) fue mayor en
los niños internados <6 meses y disminuyó al incrementarse la edad. En
contraste, la incidencia de rinovirus fue mayor (12/1000 niños/año) en
los niños de 6-23 meses de edad, y disminuyó en el resto de los grupos.
En la sala de urgencias, la incidencia de los virus respiratorios cada
1,000 niños/año fue de: 459 para rinovirus, 352 para RSV; 185 para
influenza, 177 para parainfluenza, 130 para metapneumovirus y 73
para adenovirus.
La mediana de días de internación fue de 3 días y la mediana del costo
total de internación estimado fue de $2000 (rango intercuartil $1375–
3000). El 50% del mismo comprendió a los costos de habitación, 13% a
consumibles, 12% a procedimientos diagnósticos, 10% a medicamentos
y 6% a consultas con especialistas.
Conclusiones
Nuestro estudio indica que los virus respiratorios, en particular
rinovirus, RSV, metapneumovirus e influenza se asocian a cuadros
graves en niños con infección respiratoria aguda y causan una carga
económica sustancial al sistema de salud.
El desarrollo de vacunas para RSV, metapneumovirus y rinovirus
permitirían en un futuro próximo reducir el impacto de estos virus en
Pediatría.
0026
ESTUDIO DE LA DEGENERACIÓN NEURONAL EN LA INFECCIÓN CON EL
VIRUS SAINT LOUIS ENCEPHALITIS
ME Rivarola1, S de Olmos2, LB Tauro1, C Caula4, L Spinsanti1, A Gruppi3,
MS Contigiani1
1
Laboratorio de Arbovirus. Instituto de Virología “Dr. J. M. Vanella”.
Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina. 2 Laboratorio de Neuroanatomía e histología experimental
Instituto de Investigaciones “Mercedes y Martín Ferreyra”., Argentina. 3
Inmunología. Departamento de Bioquímica Clínica. Facultad de Ciencias
Químicas. Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 4 Facultad de
Ciencias Químicas. Universidad Católica de Córdoba, Argentina.
El virus St. Louis encephalitis (SLEV, Flavivirus, Flaviviridae) es un
arbovirus ampliamente distribuido en América. En Sudamérica ha
emergido como un patógeno del sistema nervioso central causando
brotes de encefalitis tanto en Argentina como en Brasil. La detección de
casos de infección humana por SLEV en la ciudad de Córdoba, sumado a
los antecedentes de seroprevalencia en distintas provincias argentinas,
es un signo de alerta para intensificar su investigación. Estudios
realizados en nuestro laboratorio en modelo murino, indican que la
cepa virulenta CbaAr-4005 (aislada en un brote epidémico ocurrido en
71
Libro de resúmenes
Córdoba, 2005) es capaz de ingresar y replicar a nivel del SNC. El
objetivo de este trabajo es analizar y estudiar los fenómenos de
degeneración neuronal desencadenados en la infección por esta cepa
epidémica, en el cerebro de ratones con y sin signos neurológicos. Cada
animal se inoculó en la región dorsal con 3000 u.f.p./ml. A los 8 y 11días
post-infección (con y sin síntomas neurológicos respectivamente) todos
los animales fueron sacrificados y perfundidos. Se realizaron cortes
sagitales (40um) y frontales (25um) que fueron sometidos a las técnicas
de tinción Amino-Cupro-Argéntica, Nissl, Fluor Jade-B y Tunel. Se
identificaron distintos tipos de degeneración neuronal (apoptosis,
degeneración neuronal terminal, degeneración somatodendrítica y
degeneración de fibras) y se evaluaron las distintas áreas cerebrales
afectadas. Finalmente para confirmar la infección en el SNC se realizó
una inmunofluorescencia indirecta que detecta la proteína E de
envoltura viral. Si bien en ambos modelos encontramos los mismos
tipos de degeneración neuronal, el nivel de daño cerebral fue
marcadamente superior en los animales sacrificados al día 11 postinfección. En los animales asintomáticos las regiones del bulbo
olfatorio, del claustrum endopiriforme dorsal, de la corteza piriforme y
de la comisura anterior fueron las regiones cerebrales más afectadas,
mientras que en los animales sintomáticos las principales áreas fueron
corteza motora, cerebelo y cuerpo estriado. Estos resultados sugieren
que la neuro-invasión podría iniciarse en la corteza piriforme y zonas
aledañas para luego diseminarse al resto del SNC y que las áreas
afectadas podrían correlacionarse con los síntomas neurológicos
observados. Estos resultados amplian el conocimiento de la neuropatogénesis inducida por este flavivirus que resulta crucial para el
futuro desarrollo de terapias enfocadas en mitigar las complicaciones
neurológicas en aquellos pacientes susceptibles.
0028
TRASTORNOS NEUROLÓGICOS EN GRUPOS FAMILIARES INFECTADOS
CON HTLV-1 EN EL NOROESTE ARGENTINO
E Maturano1, C Remondegui2, R Gastaldello1, G Barbas3, G Lamas2, M
Balangero1, G Castro1, R Otsuki4, A Paulo Vicente4, S Gallego1
1
Instituto de Virología “Dr J.M. Vanella”, Facultad de Ciencias Médicas,
Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 2 Servicio de Infectología
& Medicina Tropical, Hospital San Roque, San Salvador de Jujuy,
Argentina. 3 Laboratorio Central, Ministerio de Salud de la provincia de
Córdoba, Argentina. 4 Laboratorio de Genética Molecular de
Microorganismos, Fundación Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Río de Janeiro,
Brasil.
El noroeste argentino muestra una articulación compleja de
condiciones ambientales propias de las regiones tropicales y andinas de
Sudamérica las cuales se conjugan con diferentes características
socioculturales, étnicas, laborales, alimentarias y familiares que
favorecen la presencia de neuropatías, entre ellas, las asociadas a
infección por HTLV-1/2, más conocida como Paraparesia Espástica
Tropical (PET).
A partir de un registro de pacientes infectados con HTLV-1/2, fueron
valorados 29 casos índices y 180 convivientes residentes en la provincia
de Jujuy. Previo consentimiento informado, extracción de sangre y
confección de fichas clínico-epidemiológicas, estas personas (91
varones y 118 mujeres) fueron sometidas a exámenes médicos y de
laboratorio para investigar la presencia de neuropatía y eventual
infección viral.
La detección de anticuerpos anti HTLV-1/2 mediante pruebas de
tamizaje y confirmación arrojó 119 seropositivos, todos tipificados
como HTLV-1 por Nested-PCR, determinando una prevalencia de
infección intrafamiliar del 56,94%.
De los 119 positivos, 65 eran mujeres de entre 2 y 83 años (media 31,71
años; DE 23,38) y 54 varones de entre 1 y 76 años (media 34,00 años;
DE 20,68 años), con trastornos neurológicos en grado variable.
Los cuadros más floridos se presentaron en mujeres, y si bien se
reconocieron manifestaciones neurológicas en todos los grupos
etáreos, la mayor gravedad se verificó en las personas ancianas.
El análisis multivariado de los 119 infectados permitió construir tres
perfiles sindrómicos:
a. Asintomáticos: 32/119 (26,89%).
b. Con escasa sintomatolgía (hiporreflexia aquileana, síndrome
cerebeloso, déficit de pares craneales, nistagmus e hiposensibilidad
vibratoria): 12/119 (10,08%).
c. Con abundante sintomatología (lumbociatalgia, trastornos sensitivos,
debilidad proximal de miembros inferiores, temblor, impotencia y/o
pérdida de la libido, hiperreflexia de miembros inferiores, atrofia
muscular y disfunción vesical): 75/119 (63,03%).
Dado el conocimiento sobre la existencia de neuropatías de diversa
etiología similares a PET, el correcto diagnóstico e interpretación del
cuadro asociado a HTLV en el noroeste argentino requiere, además de
considerar la infección, la clínica y semiología, evaluar la existencia de
neuropatías de origen no infeccioso (error tipo 1). En tal sentido, la
presencia de convivientes afectados por HTLV-1, especialmente
mujeres; el amamantamiento prolongado; la existencia de grupos
étnicos descendientes de pobladores originarios; la persistencia de
prácticas endogámicas, la pobreza con marcado déficit nutricional,
etilismo, exposición a contaminantes con potencialidad neurotoxica:
As, Pb, Cd, Cr, Li, agroquímicos, etc., exigen una interpretación médica
integral de los cuadros observados y el hallazgo de marcadores con
valor diagnóstico, pronóstico y terapéutico.
0033
RINOVIRUS EN INFECCIONES RESPIRATORIAS BAJAS EN NEONATOS
PREMATUROS CON PATOLOGÍAS DE BASE
M Echavarria, DN Marcone, M Irañeta, Y Rubies, MB Falbo, SM
Vidaurreta, G Carballal
Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas (CEMIC) Hospital
Universitario, Argentina.
Introducción
Los rinovirus (HRV) pueden causar infecciones respiratorias agudas
(IRA) bajas y un incremento en la morbilidad, que se puede observar en
recién nacidos que permanecen en neonatología debido a su patología
de base. La duración y evolución de la infección puede variar de
acuerdo al hospedador.
Objetivos
Determinar la duración de las infecciones por HRV en infantes
prematuros con patologías de base.
Determinar la potencial transmisión nosocomial de HRV mediante
genotipificación.
Metodología
Se evaluaron 3 infantes internados en terapia intensiva neonatal
debido a sus patologías de base, y que desarrollaron IRA. Se obtuvieron
aspirados nasofaríngeos al inicio de los síntomas y semanalmente
durante el curso de la infección. Se realizó diagnóstico viral y
bacteriano. La detección de HRV se realizó por RT-PCR en tiempo real.
Para la tipificación de los HRV se realizaron análisis de filogenia
utilizando la región parcial codificante VP4/VP2.
Resultados
Los primeros 2 casos fueron gemelos prematuros internados con
displasia broncoplulmonar y ductus. Uno de ellos (LS) fue el caso inicial:
un infante de 2 meses que desarrolló tos, taquipnea, sibilancias y tiraje.
Tuvo diagnóstico positivo para HRV, y negativo para bacterias y otros
virus respiratorios. Su hermano gemelo (LP) internado a su lado,
desarrolló la misma sintomatología respiratoria 72 hs. después,
también con un diagnóstico de HRV positivo. La condición clínica de
ambos se deterioró significativamente durante la infección por HRV.
El paciente LS permaneció con clínica respiratoria y positivo para HRV
durante 17 días mientras que su gemelo LP permaneció con clínica
respiratoria y positivo para HRV por 28 días.
Durante este período, un tercer recién nacido prematuro (TI), con una
enfermedad genética, desarrolló taquipnea y tiraje a los 8 días de su
nacimiento. Se obtuvo un diagnóstico positivo para HRV,
permaneciendo con sintomatología y PCR positiva por 28 días.
En todos los pacientes se implementó aislamiento de contacto hasta
que la PCR de HRV fuera negativa.
El análisis filogenético reveló que los 2 primeros casos fueron HRV
especie C (C43 y C1, respectivamente) mientras que el paciente TI tuvo
HRV especie A63.
Luego de una prolongada internación, los 3 pacientes recibieron el alta.
Tres meses después, el paciente LP desarrolló una nueva IRA por HRV,
genotipo A103.
72
Libro de resúmenes
Una semana después del alta, el paciente TI también desarrolló una
nueva infección por HRV, genotipificado como A75.
Conclusiones
Los HRV pueden causar IRA baja grave en infantes prematuros con
patologías de base.
Los infantes pueden sufrir infecciones sucesivas por diferentes especies
y genotipos de HRV.
Este estudio confirma la gran diversidad genética de HRV circulando
simultáneamente.
La infección por HRV y su detección por PCR tuvo una duración de 17 a
28 días en estos prematuros con patologías de base.
La transmisión nosocomial podría descartarse debido a que diferentes
especies y genotipos de HRV se detectaron en estos pacientes.
0048
MAYOR SENSIBILIDAD EN DETECTAR VARIANTES X4 DEL HIV-1 EN
MUESTRAS TRIPLICADAS DE PACIENTES INFECTADOS
MD Golemba, P Aulicino, A Mangano, L Sen
Laboratorio de Biología Celular y Retrovirus. Hospital de Pediatría Dr.
Juan P Garrahan, Argentina.
Para que el tratamiento antiviral con antagonistas CCR5 sea efectivo, es
necesario establecer la ausencia de variantes X4. Aunque aún se
encuentra en debate, actualmente se recomienda el análisis genotípico
por triplicado para incrementar la probabilidad de detección de
variantes minoritarias X4.
El objetivo del trabajo es evaluar si la determinación por triplicado
aumenta la sensibilidad de detectar variantes X4 en pacientes
pediátricos.
Se secuenció por triplicado el Loop-V3 del gen env de 32 pacientes
infectados por transmisión vertical (27 en primoinfección sin
tratamiento antirretroviral y 5 mayores de 12 años de infección con
tratamiento prolongado). Se determinó el tropismo mediante el
algoritmo Geno2Pheno (G2P). El resultado obtenido por el G2P es un
valor cuantitativo definido como False Positive Rate (FPR). A menor
valor de FPR mayor es la probabilidad de detección de variantes X4. En
este trabajo se utilizaron 3 puntos de cortes (FPR 5,75%, 10% y 20%)
para determinar el tropismo viral. Cuando el valor de FPR se encuentra
por debajo del punto de corte, la variante del tropismo va a ser
considerada como X4.
El tropismo viral de cada paciente se determinó con el menor valor de
FPR de las 3 replicas. Con un FPR<5,75% en el 16% (5/32) de los casos se
detectaron variantes X4. Se sumaron 2 casos con variantes X4 con un
FPR<10% (22%, 7/32) y con un FPR<20% aumentaron al 53% (17/32). Los 5
pacientes con valores de FPR<5,75% presentaron en la posición 25 del
Loop-V3 aminoácidos (aa) básicos (Lisina o Arginina) marcadores
característicos de variantes X4. Previamente se ha reportado que una
elevada carga neta positiva en la secuencia de aa del Loop-V3 se
encuentra relacionada con variantes X4. Nosotros hallamos que las
variantes X4 presentaron significativamente mayor carga neta positiva
con un FPR<5,75% (mediana "Md"= 7; 5,5-8,5) y FPR<10% (Md= 6; 5,0-8,0)
comparadas a las secuencias R5 (Md= 5; 5,0-6,0) y (md= 5; 5,0-5,5),
respectivamente. Sin embargo, esta asociación no se observó con el
FPR<20% (MdX4= 5 (5,0-7,0) y MdR5= 5 (5,0-6,0)).
Cuando se compararon los 27 pacientes con infección aguda con los 5
crónicos, se observó una mayor proporción de variantes X4 en los
crónicos. De acuerdo al FPR<5,75% 3/5 pacientes crónicos presentaron
variantes X4, con un FPR<10% las variantes X4 se hallaron en 4/5 casos y
con un FPR<20% 5/5 pacientes.
Las secuencias de aa en el Loop-V3 por triplicado fueron idénticas en 21
pacientes. De los 11 casos con diferencia entre sus réplicas, 2 pacientes
crónicos tuvieron discrepancia en el tropismo con distantes valores de
FPR. En estos casos, las secuencias X4 presentaron valores de FPR<2% y
las secuencias R5 presentaron valores de FPR>25%. Los aislamientos
virales en estos dos pacientes fueron inductores de sincicios (variantes
X4) en el ensayo fenotípico en células MT2.
Nuestro trabajo demuestra que la determinación del tropismo por
triplicado a partir de provirus del HIV aumentó la posibilidad de
detectar variantes X4.
0050
VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE ROTAVIRUS EN UN HOSPITAL
PEDIÁTRICO
MJ Palau1, MV Cabassi1, S Fallesen1, A Vera1, JI Degiuseppe2, C Vescina1
1
Sala de Microbiología. HIAEP “Sor María Ludovica”. La Plata,
Argentina. 2 Laboratorio de Gastroenteritis Virales. INEI-ANLIS “Dr.
Carlos G. Malbrán”. CABA, Argentina.
Introducción. Rotavirus es el agente etiológico más importante de
gastroenteritis aguda en la primera infancia. En Argentina, se estima
que este enteropatógeno causa alrededor de 150.000 casos, 15.000
internaciones y alrededor de 30 muertes anuales en menores de 5 años
de edad. Con el fin de reducir la carga de enfermedad por diarrea
aguda asociada a rotavirus se incorporó la vacuna monovalente G1P[8]
al Calendario Nacional de Vacunación a partir del 1 de enero de 2015.
Objetivo. Determinar la frecuencia, estacionalidad, distribución por
grupos de edad y diversidad de genotipos circulantes de rotavirus en
pacientes que asistieron a la institución en el año 2014.
Metodología. Se analizaron muestras de materia fecal con solicitud
para la detección de rotavirus (RV) en pacientes internados y
ambulatorios durante el año 2014. La búsqueda de antígenos virales se
realizó con el kit ProSpecTTM Rotavirus Microplate Assay (Oxoid). Una
fracción representativa de las muestras positivas fue enviada al
Laboratorio Nacional de Referencia para el estudio de los genotipos
circulantes, mediante técnicas de RT-PCR nested multiplex de los genes
que codifican para las proteínas VP7 y VP4 (G y P tipo,
respectivamente).
Resultados. De las 898 muestras analizadas, 104 (11,6%) resultaron
positivas para RV. Se obtuvo una prevalencia de 9,8% en pacientes
ambulatorios y de 12,2% en pacientes internados.
La población con mayor cantidad de muestras testeadas correspondió a
la de menores de 1 año (n=388), la cual a su vez presentó el mayor
porcentaje de muestras positivas (17%).
El 73% de las muestras positivas pertenecieron al periodo comprendido
entre las semanas epidemiológicas (SE) 18 a 29, que se corresponden
con los meses de mayo, junio y julio.
Se caracterizaron molecularmente 59 muestras de materia fecal, de las
cuales la asociación de G/P tipo más prevalente fue G1P[8] (88%). En
menor proporción se hallaron G12P[8] (6,8%), G9P[8] (3,4%) y G2P[4]
(1,7%).
Conclusiones. La vigilancia epidemiológica de las diarreas agudas por
rotavirus es muy importante en pediatría. En nuestro estudio, la mayor
prevalencia de detección se observó en los menores de un año, en
coincidencia con lo descripto en la literatura. El patrón estacional de la
enfermedad se corresponde con una mayor actividad en los meses de
otoño e invierno, como se ha observado en años anteriores y en el
resto del país.
Es importante destacar la alta prevalencia de la asociación G1P[8],
debido a que no se había descripto su detección en elevada frecuencia
desde el año 2003. Asimismo, en el contexto de introducción de la
vacuna monovalente, es de vital importancia continuar con la vigilancia
epidemiológica, no sólo para estudiar la eficacia de la vacunación sino
también para conocer los efectos de la misma sobre la circulación viral.
0056
UTILIDAD DE LOS MARCADORES MOLECULARES PARA EL
DIAGNOSTICO Y SEGUIMIENTO DE LA INFECCION POR HBV
S Blanco1, M Balangero1 2, H Carrizo1, S Gallego1 2
1
Fundación Banco Central de Sangre, Argentina. 2 Instituto de Virología
"Dr. J. M. Vanella", FCM, UNC., Argentina.
En la infección por el virus HBV, los ANTI HBs son los anticuerpos que
neutralizarían la capacidad infectiva del HBV, sin embargo, se ha
documentado la transmisión por transfusión sanguínea de un portador
de infección oculta por HBV (OBI) con ANTI HBs a receptores
inmunocompetentes, demostrando la limitante capacidad neutralizante
de los ANTI HBs en algunos casos. Además, se han documentado casos
de personas con niveles detectables de ANTI HBs en infecciones
hepáticas crónicas. Los casos de OBI requieren el empleo de
metodologías moleculares de gran sensibilidad y especificidad para su
diagnóstico, ya que se definen como infecciones con niveles muy bajos
de DNA HBV (< 200 UI/mL), sin AgHBs detectable y con o sin presencia
73
Libro de resúmenes
de anticuerpos contra HBV. Otros casos que revisten gran interés y
desafìan el rol protector de los ANTI HBs son las HBV mutantes, las
cuales carecen de la región antigénica contra la cual este anticuerpo
esta dirigido.
Se presenta a continuación la evolución de los marcadores serológicos y
virológicos en el seguimiento de dos donantes de sangre, en los cuales
se detectó la infección por HBV con la técnica de amplificación de
ácidos nucleicos (NAT), como único marcador de infección al momento
de la donación.
El donante 1 era NAT positivo para HBV como único marcador de
infección con una carga viral (CV) de 294 UI/mL. El DNA se negativizó a
los 27 días post-donación, momento en que apareció el anticuerpo
ANTI CORE. A los 35 días dió positivo el ANTI HBs (77,3UI/mL) pero el
DNA de HBV nuevamente fue detectable en ese momento por técnicas
de NAT, con una CV de 27,1 UI/mL. Luego, el donante discontinuó los
controles.
El Donante 2 fue NAT HBV positivo al momento de la donación con una
CV no cuantificable. A los 19 días post-donación se detectó AgHBs, ANTI
CORE y NAT HBV con una CV de 6,160 UI/mL. A los 39 días postdonación tenía AgHBs No Reactivo y se detectó ANTI CORE, IgM CORE,
ANTI HBe, ANTI HBs (142 UI/mL) y ADN HBV con una CV de 47UI/mL. A
los 54 días post-donación no se detectó más el DNA HBV.
Nuestros resultados muestran como en el seguimiento de ambos
individuos infectados persisten el DNA viral con los anticuerpos ANTI
HBs y corroboran la necesidad de utilizar técnicas altamente sensibles
de detección de DNA viral en el algoritmo de diagnóstico, a los fines de
descartar una infección por HBV, aún en presencia de anticuerpos ANTI
HBs.
Si bien el ANTI HBS ha sido descripto como el marcador de protección
definitivo frente al HBV, los avances en la biología molecular permiten
cuestionar el rol protectivo del mismo, su interpretación en el
algorritmo de diagnóstico e indican la necesidad de evaluar sus
implicancias clínicas.
El presente trabajo aporta información que apoya la necesidad de
reveer los algoritmos diagnósticos tradicionales y la sensibilidad de las
metodologías empleadas en el diagnóstico y seguimiento de la
infección por HBV.
0057
MARCADORES VIROLÓGICOS EN INFECCIÓN OCULTA POR EL VIRUS DE
LA HEPATITIS B (HBV)
S Blanco1, H Carrizo1, S Gallego1 2
1 Fundación Banco Central de Sangre, Argentina. 2 Instituto de
Virología "Dr. J. M. Vanella", FCM, UNC., Argentina.
La latencia del genoma de HBV en ausencia de AgHBs detectable ha
sido definida como casos de infección oculta por HBV (OBI). Estas
infecciones se caracterizan por la presencia de DNA viral en hígado y
niveles detectables o no de DNA viral en sangre (carga viral <200
IU/mL), sin niveles detectables de antígeno de superficie (AgHBs), con o
sin anticuerpos contra el antígeno CORE (ANTI CORE) o anticuerpos
contra el AgHBs (ANTI HBs). Los casos falsos de OBI se definen como
aquellos en que los niveles de ADN HBV son comparables a los
detectados en otras fases de la infección. La visión general es que,
luego de la infección por HBV hay individuos que, tras la negativización
del AgHBs habrían resuelto la infección, pero estos individuos podrían
ser en realidad portadores de infección oculta por HBV, los cuales
teniendo niveles detectables de DNA viral, constituyen una fuente de
transmisión del HBV. Se presenta el estudio de marcadores virológicos
para HBV en donantes de sangre con infección confirmada.
En el periodo Noviembre 2009 a Junio 2014, se estudiaron en la
Fundación Banco Central de Sangre 114.432 muestras de donantes de
sangre para HBV por técnicas serológicas y moleculares (NAT). En el
tamizaje molecular resultaron positivos por NAT 0,045% (52/114.432).
De las muestras positivas por NAT, 6/52 (11,5%) presentaron perfiles
virológicos compatibles con OBI al momento de la donación.
Ag HBs Ag HBe
Anti
CORE
IgM
CORE
Anti
HBe
Anti
HBs
NAT
CARGA
VIRAL
Donante
1*1
NO
NO
NO
NO
NO
NO
REACTIVO
REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO
294
UI/mL
Donante
2
2*
NO
REACTIVO
N/R
REACTIVO
NO
NO
REACTIVO
REACTIVO
REACTIVO
REACTIVO
< 29
UI/mL
Donante
3*1
NO
REACTIVO
N/R
REACTIVO
NO
NO
REACTIVO
REACTIVO
REACTIVO
REACTIVO
< 29
UI/mL
Donante
2
4*
NO
NO
NO
NO
NO
REACTIVO
REACTIVO
REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO
REACTIVO
< 29
UI/mL
Donante
5
NO
NO
NO
NO
REACTIVO
REACTIVO
REACTIVO
REACTIVO REACTIVO
REACTIVO
REACTIVO
< 29
UI/mL
Donante
3
6*
NO
NO
NO
NO
NO
NO
REACTIVO
REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO
99
UI/mL
*1 Donantes con infección demostrada por seguimiento.
*2 Donantes 2 y 4 con resultados de Carga viral de 6,2 UI/mL y 12
UI/mL respectivamente, por debajo del límite de cuantificación.
*3 Muestra Positiva para amplificación de la región core/precore
(pC/BCP).
Estos resultados muestran como gracias a las técnicas de NAT fue
posible detectar en el banco de sangre un 11,5% de OBI entre los
donantes con infección por HBV confirmada. Las técnicas de
amplificacion de ácidos nucleicos (NAT) tienen alta sensibilidad y
especificidad y, por ello, son actualmente empleadas en bancos de
sangre para evitar la transmisión mediante productos sanguíneos. Estas
técnicas, por su mayor sensibilidad, serían herramientas más eficientes
que las técnicas de cuantificación de ácidos nucleicos (carga viral),
actualmente disponibles en nuestro medio, para el diagnóstico de
infección oculta por HBV.
0064
DIAGNÓSTICO DE MENINGOENCEFALITIS VIRALES UTILIZANDO UNA
TÉCNICA DE BIOLOGÍA MOLECULAR
L Badaloni, MJ Palau, MV Cabassi, S Fallesen, P Lagoa, RS Oderiz, MR
Agosti, C Vescina
HIAEP Sor María Ludovica, Argentina.
Introducción. Los virus son la causa principal de meningoencefalitis a
líquido cefalorraquídeo (LCR) claro y encefalitis. El diagnóstico
virológico específico es importante debido a que permite indicar un
tratamiento oportuno en el caso de etiología herpética, evitar el uso
inadecuado de antibióticos y establecer la etiología enteroviral de
evolución favorable y autolimitada.
Objetivo. Conocer la etiología de meningoencefalitis a LCR claro y
encefalitis, en niños internados, utilizando la técnica de reacción en
cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR).
Metodología. Se analizaron 86 muestras de LCR de pacientes
pediátricos (0-17 años) con diagnóstico de meningoencefalitis a LCR
claro y encefalitis, internados en nuestra institución, en el período
septiembre de 2013 a diciembre de 2014.
Se realizó RT-PCR (Q – Alert Nanogen) para la determinación de virus
Herpes Simplex (HVS) I y II, Enterovirus (EV) y Citomegalovirus (CMV),
según solicitud médica. Se analizaron la edad, las formas de
presentación clínica y las características del LCR.
Resultados. De las 71 muestras de LCR procesadas para detección de
EV, 28 resultaron positivas (39,4%). La determinación de HVS I y II se
realizó en 54 muestras, resultando positivas sólo dos para HVS II. CMV
se investigó en 8 muestras que resultaron negativas.
El 50% de los niños con diagnóstico de meningoencefalitis por EV
presentó una edad igual o superior a los 6 años (n=14), mientras que el
grupo de niños menores de un año de edad abarcó un 43% (n= 12). De
estos últimos, 6 presentaban 1 mes de vida.
Las manifestaciones clínicas que predominaron fueron: fiebre (100 %) y
signos de irritación meníngea (89 %).
El LCR estaba alterado en el 94% de los casos: 86% presentaban
celularidad entre 10 y 600/ul con predominio mononuclear en el 67%
de las muestras. El valor de proteinorraquia presentó un rango entre
0,25 -1,30 g/L y la glucorraquia fue menor a 0,62 g/L.
Conclusiones. La incorporación de la RT-PCR al laboratorio de
microbiología permite realizar un diagnóstico temprano de los agentes
74
Libro de resúmenes
más frecuentes de la meningoencefalitis viral. En nuestra población, EV
fue el principal agente etiológico de meningoencefalitis a LCR claro.
Disponer del diagnóstico virológico rápido, evita el uso inadecuado de
antibióticos y antivirales y disminuye los días de internación en la
mayoría de los casos.
0068
ESTUDIO DE INTERCOMPARACIÓN INTERLABORATORIO PARA
EVALUAR LA CALIDAD DEL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE VIRUS
INFLUENZA A Y B EN LOS LABORATORIOS DE LA RED NACIONAL DE
INFLUENZA Y OTROS VIRUS RESPIRATORIOS
A Czech, M Avaro, E Benedetti, M Russo, A Pontoriero, A Campos, N
Periolo, E Baumeister
Centro Nacional de Influenza OPS/OMS, Laboratorio Nacional de
Referencia de influenza y otros virus respiratorios, Servicio Virosis
Respiratorias, Departamento Virología, Instituto Nacional de
Enfermedades Infecciosas, ANLIS Malbrán, Argentina.
Se realizó un estudio de intercomparación entre los Laboratorios de la
Red Nacional de influenza y otros virus respiratorios (RNIVR) para
evaluar su desempeño en el diagnóstico de influenza A y B por RTPCR
en tiempo real (rtRTPCR) o de punto final (fRTPCR) en casos de
infección respiratoria aguda. El Laboratorio Nacional de Referencia de
influenza y otros virus respiratorios produjo un panel de muestras
incógnitas (PMI) a partir de cepas de referencia de influenza que se
amplificaron en células MDCK. Se extrajo ARN de distintas diluciones de
los stocks virales y se realizó la detección del gen M del virus influenza
A y del gen M del virus influenza B por rtRT-PCR. Se ajustaron diluciones
de los stocks para obtener CTs de 25, 30 y 35. Posteriormente se
cuantificaron frente a estándares internacionales por rtRT-PCR por
triplicado.
El PMI estaba compuesto por 6 muestras incógnitas (M): M1:
B/Brisbane/60/08
32copias/µl(cp/µl),
M2:
A/Argentina/17/09
(H1N1)pdm09
7,0x103cp/µl,
M3:
Negativa(PBS),
M4:
A/Argentina/17/09(H1N1)pdm09
2,32x102cp/µl,
M5:
2
A/NewYork/55/04(H3N2) 1,92x10 cp/µl, M6: A/NewYork/55/04(H3N2)
4,1x103cp/µl. Se extrajo el ARN de 40 tubos de cada M. Se mezclaron y
homogenizaron los 40 extractos de ARN de cada M y se alicuotaron de
a 50µl por vial. Se precipitó y desecó el ARN de cada uno de los tubos
del PMI. Tres tubos de cada M se reconstituyeron con 50µl de agua de
calidad biología molecular y se procesaron por rtRT-PCR determinando
el CT promedio de cada una.
El PMI y las indicaciones para la reconstitución de las M, se repartió a
33 laboratorios de la RNIVR involucrando a 19 provincias y CABA. No
disponen de capacidad de detectar el genoma del virus influenza B 3
laboratorios. 32 laboratorios entregaron los resultados del panel a
término informando el CT y la interpretación de cada M. Los
participantes que utilizan rtRTPCR(30) reportaron 100% de resultados
correctos para M1, M2, M3 y M4 y 96,7% para M5 y M6. El 100 % de los
laboratorios que utilizan fRTPCR(2) reportaron resultados correctos
para M2, M3, M4 y M5 y el 50% para M6. Todos los laboratorios fueron
capaces de identificar correctamente la cepa de influenza
A(H1N1)pdm09 y la de virus influenza B. Alrededor del 6% tuvieron
dificultades en la detección de la cepa de virus influenza A(H3N2). Las
posibles causas de errores pudieron ser fallas en la reconstitución del
PMI, degradación del ARN en la desecación o mala interpretación de los
resultados en cada laboratorio. Los resultados obtenidos indican que el
país dispone de una red de laboratorios de vigilancia nacional con una
sensibilidad adecuada para la detección del virus influenza, que
garantiza la calidad de diagnóstico de las muestras respiratorias que se
procesan anualmente. La RNIVR proporciona al país información
epidemiológica al día, contribuyendo a la decisión anual de la vacuna
contra la influenza y detección temprana de nuevas variantes virales
que podrían surgir causando epidemias o brotes con potencial
pandémico.
0091
POLIMORFISMOS GENÉTICOS DEL HOSPEDERO SE ASOCIAN CON LA
SEVERIDAD DE LA PATOLOGÍA INDUCIDA POR EL VIRUS ANDES.
J Angulo1, K Pino1, N Echeverría-Chagas2, C Marco3, C MartínezValdebenito3, H Galeno4, E Villagra4, L Vera4, N Lagos4, N Becerra4, J
Mora4, A Bermúdez5, M Cárcamo5, J Díaz5, JF Miquel6, M Ferrés3, M
López-Lastra1
1
Laboratorio de Virología Molecular, Instituto Milenio de Inmunología e
Inmunoterapia (IMII), Centro de Investigaciones Médicas, Escuela de
Medicina, División de Pediatría, Pontificia Universidad Católica de Chile,
Santiago, Chile. 2 Laboratorio de Virología Molecular, Centro de
Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad de la
República, Montevideo, Uruguay. 3 Laboratorio de Infectología, Centro
de Investigaciones Médicas, Escuela de Medicina, División de Pediatría,
Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile. 4
Subdepartamento de Virología Clínica, Departamento Laboratorio
Biomédico Nacional y de Referencia, Instituto de Salud Pública de Chile,
Santiago, Chile. 5 Departamento de Asuntos Científicos, Instituto de
Salud Pública de Chile, Santiago, Chile. 6 Departamento de
Gastroenterología, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad
Católica de Chile, Santiago, Chile.
El virus Andes (ANDV) es el agente etiológico del síndrome
cardiopulmonar por Hantavirus (HCPS) en Chile. En este trabajo se
evaluó si los polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) rs12979860 y
rs8099917, asociados a una expresión diferencial de IFN-λ, y el SNP
rs1800629 asociado a una expresión diferencial de TNF-α, podrían
asociarse con la severidad de la patología inducida por ANDV. En este
estudio se analizó las frecuencias alélicas para estos SNPs en 238
pacientes infectados con ANDV (60,4% de los casos reportados entre
los años 2006-2014). Los resultados muestran una asociación
significativa entre la presencia del alelo menor en su estado
homocigoto (TT para el rs12979860 y GG para el rs8099917) y una
patología leve, mientras que el estado heterocigoto o homocigoto para
el alelo mayor (CT/CC ó TG/TT, respectivamente) se asocian con una
patología grave. El SNP rs1800629, no mostró diferencias en las
frecuencias alélicas entre individuos controles y pacientes infectados
con ANDV, ni tampoco existe una asociación entre los distintos
genotipos (AA/GA/AA) y la severidad de la patología asociada a ANDV.
En conclusión, este estudio sugiere que los polimorfismos rs12979860 y
rs8099917 pueden ser utilizados como marcadores moleculares de la
progresión de la enfermedad asociada con ANDV en pacientes chilenos.
Financiamiento: Iniciativa Científica Milenio del Ministerio de
Economía, Fomento y Turismo: Proyecto P09/016-F.
0140
IMPLICANCIA DEL GENOTIPO DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B EN LA
REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL ANTÍGENO E EN LA INFECCIÓN
CRÓNICA
M Speroni1, L Tadey2, S Fernández Giuliano2, L Mammana2, MB Bouzas2,
RH Campos1, D Flichman1
1
Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica UBA,
Argentina. 2 Unidad de Virologia Hospital F.J. Muñiz, Argentina.
INTRODUCCIÓN
La infección por el virus de la hepatitis B (HBV) es uno de los principales
problemas mundiales de Salud Pública, se estima que un tercio de la
población - 2 mil millones de personas - ha estado expuesta al HBV y
alrededor de 400 millones permanecen infectados crónicamente. Se
reconocen en la actualidad 10 genotipos denominados de la A a la J y
varios subgenotipos (sgt).
El antígeno e (HBeAg) del HBV es una proteína considerada inductora
de la tolerancia viral, favoreciendo la persistencia de la infección;
Además, la carga viral de HBV en suero durante la etapa HBeAg positiva
es significativamente mayor que en la etapa anti-HBe. Por lo tanto, la
expresión del HBeAg se asocia al establecimiento de infecciones
crónicas y a una mayor probabilidad de transmisión. La seroconversión
del HBeAg ha sido reconocida como un evento importante en la historia
natural de la infección crónica, confiriendo un resultado clínico
favorable cuando la misma es temprana, y asociándose a una evolución
más severa cuando es tardía. En los últimos años, se ha incrementado
la información que sugiere que la progresión de la infección crónica, el
75
Libro de resúmenes
cuadro clínico inicial, y la respuesta al tratamiento antiviral, pueden
variar dependiendo del genotipo del HBV. Sin embargo, la implicancia
de los genotipos de HBV en la progresión de la infección es aún motivo
de controversia. Asimismo, no hay información sobre la implicancia de
los genotipos de HBV en la expresión del HBeAg.
OBJETIVO
Caracterizar la relación entre los niveles de HBeAg y de carga viral en
pacientes crónicamente infectados por diferentes genotipos de HBV.
METODOLOGIA
Se determinó el genotipo viral por secuenciación, los niveles de HBeAg
(Architect HBeAg EIA, Abbott Laboratories) y la carga viral (COBAS
TaqMan HBV, Roche), en 29 pacientes HBeAg positivos, infectados
crónicamente por HBV.
RESULTADOS
La distribución de genotipos fue: A2: 34,5%, F1b: 34,5%, F4: 17.2%,
otros: 13.8%. Los niveles de HBeAg fueron significativamente mayores
en los pacientes infectados con el sgt F1b que en aquellos infectados
con el sgt A2 o el sgt F4; mientras que no se observaron diferencias
significativas en los niveles de HBV-ADN entre los genotipos.
n
A2
F1b
F4
10
10
5
p
HBeAg (S/CO) 1025,3 ± 682,6 1641,4 ± 445,8 859,8 ± 781,6 0,031
HBV-ADN
(Log10 UI/ml)
8,73 ± 0,37
8,85 ± 0,53
8,75 ± 0,55
ns
CONCLUSIONES
En el presente estudio se observaron diferencias en los niveles de
HBeAg de acuerdo al genotipo de HBV lo cual podría tener implicancias
en la progresión de la infección crónica. Asimismo, no se halló
correlación entre los niveles de HBeAg y carga viral como ha sido
previamente reportado, sugiriendo una regulación independiente de la
transcripción de los mensajeros correspondientes.
0155
APOPTOSIS DE NEUTRÓFILOS EN LA INFECCIÓN ASINTOMÁTICA POR
EL VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA
PM Cooke1, C Caula1, E Rivarola2, MA Orsilles1
1
Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Católica de Córdoba,
Argentina. 2 Instituto de Virología Dr. J.M. Vanella, Facultad de
Medicina, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.
Los neutrófilos pueden ser reclutados a sitios de infección viral y
participar en la defensa inmune innata antiviral. El objetivo del
presente estudio fue evaluar el nivel de apoptosis y la expresión de
antígenos de superficie en neutrófilos de pacientes con infección
asintomática por Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) sin
tratamiento antirretroviral (TAR). Se incluyeron 32 pacientes con
infección por VIH sin TAR y 45 con TAR. Como grupo control, se
incluyeron 45 sujetos sanos. El nivel de apoptosis de neutrófilos de
sangre periférica se evaluó por citomorfología y por citometría de flujo.
La expresión de los antígenos de superficie CD62L y CD16 de neutrófilos
se determinó mediante citometría de flujo. En pacientes sin TAR se
detectó un aumento de la apoptosis inicial respecto a pacientes con
TAR y controles sanos (6.8% ± 1.7; 2.3% ± 0.5; 1.5% ± 0.3
respectivamente. Controles sanos vs VIH sin TAR: p˂0.001; VIH con TAR
vs VIH sin TAR: p˂0.01). No hubo diferencia significativa entre los
grupos respecto al nivel de apoptosis tardía. No se encontró diferencia
en el porcentaje de neutrófilos CD11b+/CD62L+ entre pacientes VIH
seropositivos y controles sanos. Sin embargo, se evidenció una
disminución del porcentaje de neutrófilos CD11b+/CD16+ en los
pacientes VIH+ con y sin TAR, con respecto a los controles. En
conclusión, en individuos con infección asintomática por VIH sin TAR se
evidencia una susceptibilidad incrementada a la apoptosis de los
neutrófilos que parece estar relacionada con la replicación viral; la
disminución de expresión de CD16 en los neutrófilos podría estar
relacionada a la apoptosis inicial de los mismos. Estas alteraciones
podrían comprometer los mecanismos de defensa contra la infección y
la modulación de la respuesta inmune contra el VIH.
0160
ACTIVACIÓN DE LINAJES CELULARES B Y T EN PACIENTES CON
SÍNDROME PULMONAR POR HANTAVIRUS.
AA Iglesias1, M García2, CM Bellomo1, A Bruno3, MT Córdoba3, M
Ciancaglini1, PJ Padula1, MC Sasiain2, LP Shierloh2, VP Martinez1
1
Laboratorio Nacional de Referencia para Hantavirus – Servicio Biología
molecular – INEI-ANLIS “Dr. C. G. Malbrán” - CABA, Argentina. 2
Laboratorio de inmunología de enfermedades respiratorias - IMEX –
Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires- CABA, Argentina. 3
Laboratorio de Enfermedades Tropicales – Hospital San Antonio de Paul
– Salta, Argentina.
INTRODUCCION
El origen de la patogenia del Síndrome Pulmonar por Hantavirus (SPH)
estaría mediado por mecanismos inmunopatogénicos. Hallazgos
contradictorios han sugerido que en la respuesta celular existe un
balance delicado entre la protección y la inmunopatogenia. Los
hallazgos hematológicos diferenciales en pacientes con SPH en fase
aguda incluyen trombocitopenia, hemoconcentración, leucocitosis
neutrofílica-desplazada hacia a la izquierda (inmaduros) y presencia de
linfocitos atípicos (inmunoblastos) en frotis de sangre periférica.
OBJETIVOS
Realizar análisis del fenotipo de leucocitos circulantes mediante
citometría de flujo en pacientes con SPH para detectar linajes celulares
específicos potencialmente involucrados en la inmunopatogenia del
SPH.
METODOLOGIA
Participaron de forma voluntaria 15 pacientes confirmados para SPH,
16 con cuadros clínicos compatibles (SPH negativos) y 6 personas sanas.
La carga viral se determinó por RT-PCR en tiempo real y la
caracterización genética viral por RT-PCR y secuenciación nucleotídica.
Fenotipificación celular: las subpoblaciones celulares se analizaron
cualitativa y cuantitativamente por citometría de flujo.
RESULTADOS
Todas las muestras positivas para SPH por serología (N=23, 15
pacientes) fueron confirmadas por RT-PCR. El promedio de días desde
el inicio de los síntomas hasta la toma de muestra fue 9 para muestras
agudas y 20 para convalecientes (rangos 3-14 y 8-42). La carga viral fue
similar en todas las muestras (CT medio 25,5; rango: 23,8-26,1),
independientemente del genotipo viral y del tiempo de evolución, a
excepción de un paciente de 2 años de edad cuya carga viral fue muy
baja (CT>36). Se confirmó un aumento significativo en el número de
leucocitos y en la proporción de linfocitos, en particular linfocitos T,
mostrando una inversión de la relación CD4/CD8, la cual fue más
marcada en las muestras más tempranas. Se identificaron poblaciones
de inmunoblastos circulantes como eventos FSC/SSCalto
significativamente aumentadas en pacientes con SPH comparado con
donantes sanos (p<0,001) o pacientes seronegativos para SPH (p<0,01).
En los pacientes con SPH, los inmunoblastos circulantes están
constituidos por linfoblastos T CD4+ y CD8+ T activados y en menor
medida por plasmoblastos CD19+/CD38hi diferenciados a partir de
células B. Contrariamente, las células NK (CD56+/CD16+/CD3-) y T
Gamma/Delta no contribuyen significativamente a esta población
reactiva. En pacientes convalecientes (N=4) las poblaciones de
inmunoblastos de T y B se encontraron retraídas a niveles normales.
CONCLUSIONES
Se observó un aumento de la respuesta celular, principalmente de T
CD8+, en todos los pacientes de SPH.
La presencia de inmunoblastos reveló activación de células B y T
durante la fase aguda de la enfermedad.
Al momento del alta médica (>20 días desde el inicio) no se observó
clarificación viral y la proporción de células T CD8+ no disminuyó a
valores normales como si se reportó en infecciones con virus Puumala.
0177
ESTUDIO DE LAS MUTACIONES DE LOS GENES E6 Y LCR DEL VIRUS
PAPILOMA
HUMANO
16;
DETECTADO
EN
MUESTRAS
ENDOCERVICALES DE LA CIUDAD DE CÓRDOBA.
C Cuffini1, J Mosmann1, A Lucca2, M Monetti1, M Frutos1, A Kiguen1, R
Venezuela1
1
Laboratorio de Clamidias y Virus Papiloma Humano, Instituto de
Virología “Dr. J.M. Vanella”, Facultad de Ciencias Médicas; Universidad
76
Libro de resúmenes
Nacional de Córdoba. E-mail: [email protected], Argentina. 2
Fundación para el Progreso de la Medicina. Córdoba, Argentina.
Los Virus Papiloma Humano (VPH) están asociados etiológicamente con
el carcinoma cervical. El genotipo 16 es el más frecuentemente
detectado en la mayoría de las neoplasias de cérvix.
En el análisis de la región LCR del VPH 16, se identifican cuatro
variantes: Europea (E), en la cual se distinguen Europea prototipo (Ep) y
Europea asiática (Ea); Asiática-Americana (AA) y Africanas (AF-1 y AF-2);
ésta es la región más variable del genoma viral.
Algunos autores han demostrado que la existencia de mutaciones
puntuales en las secuencias de E6 y LCR tendría relación con la
progresión a una lesión de mayor grado.
En mujeres de la ciudad de Córdoba; también se detectó al VPH 16
como el más frecuente; entre los genotipos de alto riesgo, sin embargo,
se desconocen las variantes circulantes y las mutaciones asociadas a
carcinogénesis; por esta razón el objetivo del trabajo fue, estudiar
filogenéticamente secuencias de VPH 16 de muestras de endocervix
con lesiones intraepiteliales de diferentes grados, de la provincia de
Córdoba, con la finalidad de distinguir los linajes circulantes y analizar la
presencia de mutaciones relacionadas a los procesos malignos.
Se estudiaron 23 muestras de pacientes positivos para VPH 16. Las
muestras fueron analizadas por PCR para las regiones L1, E6 y LCR y
luego secuenciadas.
El análisis filogenético de E6 y LCR fue construido por Maximun
Likelihood (PhyML software), con parámetros sugeridos por
JModelTest3.7.
Este análisis determinó que el 92% de las muestras pertenecen a la
variante E (61% Ep y 31% Ea), el 4% a la variante AF-1 y el 4% restante a
AF-2. El alto porcentaje de variante europea estaría en concordancia
con los patrones de migración humana, ya que Argentina presentó una
fuerte inmigración europea en las primeras décadas del siglo XX.
La mutación más frecuentemente detectada en la región LCR fue
G7521A, en el 70% de las muestras, la cual afecta al sitio de unión del
factor de transcripción YY1 (represor responsable de silenciar la
transcripción del promotor de E6), pudiendo contribuir a la
carcinogénesis.
En la región E6 la mutación más frecuente fue T350G (L83V) detectada
en el 61% de las muestras, asociada al incremento del riesgo de una
infección persistente. Notablemente, ambas mutaciones fueron
halladas, en su mayoría, en lesiones de bajo grado, podríamos inferir
que dichas lesiones tienen un riesgo mayor de avanzar a la malignidad.
Estos resultados son los primeros aportes en el campo de la
epidemiología molecular del VPH 16 en pacientes de Córdoba, los
cuales enfatizan la importancia del estudio de las diferentes variantes y
la detección de las mutaciones asociadas con el desarrollo de procesos
carcinogénicos.
Apoyo económico: PIO2010-MincytCba. 2011-2013. Ref. Res. MINCYT
Cba. Nº170/2011.
0186
EFECTO DE LA INFECCIÓN CON VIRUS SAINT LOUIS ENCEPHALITIS
SOBRE LA VIABILIDAD Y FENOTIPO DE MONOCITOS HUMANOS
C Caula1, PM Cooke1, ME Rivarola2, MA Orsilles1, M Contigiani2, LI
Spinsanti2
1
Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Católica de Córdoba.,
Argentina. 2 Instituto de Virología “Dr. J.M. Vanella”, Facultad de
Medicina. Universidad Nacional de Córdoba., Argentina.
El virus St.Louis encephalitis (SLEV, Flavivirus, Flaviviridae) es un virus
transmitido por mosquitos que puede provocar en humanos
manifestaciones clínicas tales como cefalea febril, meningitis y
encefalitis según el daño de la célula nerviosa. En Argentina es
endémico y se han aislado cepas a partir de humanos, roedores, y
mosquitos. Si bien, para otros flavivirus, se ha demostrado que la
patogenicidad deriva de la capacidad de infectar, replicar y finalmente
matar células inmunes, no existen estudios previos en cuanto a la
relación del SLEV con monocitos. Éstas, son células fagocíticas de la
inmunidad innata, que pueden tener un rol dual, ya sea eliminando al
virus o convertiéndose en su reservorio si son susceptibles a su
replicación. Nuestro objetivo fue determinar la capacidad de dos cepas
del SLEV para infectar y replicar en monocitos humanos y evaluar los
efectos sobre su fenotipo y viabilidad. Se infectaron células U937, de
linaje mieloide, con las cepas CbaAr-4005 y 78V-6507 (aisladas de
mosquitos) a una MOI= 1 (índice de multiplicidad de infección) y se
analizaron del día 1 a 5 post infección (pi). La infección se demostró por
inmunofluorescencia y el nivel de replicación viral como una estimación
de la carga viral mediante qRT-PCR. La expresión de marcadores de
linaje y activación (CD14 y HLA-DR) y viabilidad celular se midieron por
citometría de flujo. Desde el día 4 pi, se evidenció diferencia
significativa entre la infección por CbaAr-4005 respecto a 78V-6507,
tanto en el porcentaje (%) de células infectadas (día 4pi 84±7,8
vs.17,3±1,4 p=0,03 y día 5pi 93,3±1,8 vs 10±1,7 p=0,0001,
respectivamente) como en el número de copias de cDNA viral (día 4pi
827000±18000 vs. 260000±12583 p=0,001 y día 5pi 1525000±25000 vs
224500±6500 p=0,0004, respectivamente). En los días 4 y 5 pi de la
infección por CbaAr-4005 respecto al control negativo, se evidenció
disminución significativa en el % de células viables (48±10 vs 88±13 p=
0,02 y 38±9,7 vs 82±13 p= 0,03, respectivamente), aumento en el
porcentaje de células CD14+ (34,7±10,9 vs 4,2±3 p= 0,01 y 31,5±16,8 vs
11,7±8,5 p= 0,02, respectivamente) y en el día 5pi aumento en la
expresión de HLA-DR (281±8,5 vs 68±32,3 p= 0,01). En conclusión, estos
resultados demuestran que ambas cepas infectan y replican en
monocitos humanos, pero con diferencia cuantitativa importante. La
infección de estas células por SLEV podría tener efectos profundos en
sus propiedades funcionales y comprometer el desarrollo de la
inmunidad celular y humoral contra el virus. Lo demostrado para SLEV
CbaAr-4005 podría estar relacionado con la patogenicidad de esta cepa
y explicar, en parte, su mayor virulencia y su comportamiento
epidemiológico.
0187
INFECCION POR VIRUS EPSTEIN BARR EN PACIENTES TRASPLANTADOS
HEPATICOS
MD Borgnia, D Viale, M Dip, A Bosaleh, ME Venuta, A Lencina, A Nuñez,
C Hernandéz
Hospital de Pediatría "Dr. Juan P. Garrahan", Argentina.
Introducción: La Infección por Virus Epstein Barr (I-VEB) es una causa
significativa de morbimortalidad en pacientes pediátricos trasplantados
hepáticos. La misma se presenta como una enfermedad continua desde
una infección sintomática hasta un síndrome linfoproliferativo
postrasplante (PTLD) confirmado histológicamente.
Objetivo: Describir el manejo y los resultados obtenidos en los
pacientes con I-VEB, diagnosticados por PCR en Tiempo Real, tratados
con basiliximab + tacrolimus.
Metodología: Estudio descriptivo, retrospectivo de pacientes
pediátricos trasplantados hepáticos entre noviembre 2009 y diciembre
2012 en nuestra institución. Se excluyeron retrasplantes (n=10) y
fallecidos dentro del mes (n=1). El tiempo de seguimiento fue de 21,5
meses (3,6-40,1 m). El monitoreo de las cargas virales fue semanal
durante los primeros 3 meses, mensual desde los 4 meses hasta el año
y trimestral luego del año postrasplante. Los resultados se expresaron
en copias por ml de sangre y su correspondiente logaritmo. Se
consideraron que variaciones de 0,5 logaritmos entre muestras serán
cambios clínicamente significativos. Los pacientes con al menos dos
cargas de VEB superiores a 4.000 copias/ml en ascenso o una mayor a
16.000 copias/ml y hepatograma normal se controlaron bajando la
inmunosupresión. Se consideraron portadores crónicos a aquellos
pacientes con más de 16.000 copias/ml durante al menos 6 meses.
Resultados: Se analizaron 80 pacientes. La edad media al trasplante fue
1 año (r: 0,5-17a). Treinta y un niños desarrollaron I-VEB (38,7%)
detectada por PCR, con o sin progresión a PTLD, a una mediana de 2,7
meses (0,2-29 m) postrasplante. El tiempo de seguimiento fue de 21,5
meses (3,6 – 40,1 m). El 61,3% (19/31) de los pacientes eran de alto
riesgo serológico(D+/R-o R menor de 2 años) y el 64,5% (20/31)
presentó rechazo agudo. De estos últimos el 60% lo hizo antes de la IVEB(12/20). El 54,8% fue portador crónico (17/31). Cuatro pacientes
desarrollaron PTLD (global: 5%, I-VEB: 12.9%). La tasa de supervivencia
global fue 95% (77/80) y en I-VEB fue 93,5% (29/31). Sólo una muerte
fue relacionada con PTLD(1/4).
Conclusión: El monitoreo con carga viral e inmunomodulación
preventiva es una estrategia de manejo que ha permitido disminuir la
enfermedad por VEB y PTLD. Sin embargo, la tasa de rechazo agudo en
77
Libro de resúmenes
I-VEB fue superior a la media. El rechazo podría actuar como un factor
de riesgo para el desarrollo de I-VEB o ser consecuencia de la reducción
de la inmunosupresión utilizada para el control de la I-VEB. Los
menores de 1 año y el alto riesgo serológico son factores
determinantes para el desarrollo de I-VEB.
0192
DIAGNÓSTICO DE CITOMEGALOVIRUS CONGÉNITO A TRAVÉS DE LA
DETECCIÓN GENÓMICA EN TARJETAS DE PESQUISA NEONATAL
DURANTE EL 2014 EN EL HOSPITAL GARRAHAN
D Viale, MD Borgnia, AD Núñez, A Lencina, MP Ochoa, O Jiménez, C
Hernández
Hospital de Pediatría "Dr. Juan P. Garrahan", Argentina.
La infección por Citomegalovirus (CMV) durante la gestación puede
transmitirse de la madre al feto resultando en una infección congénita.
La infección congénita ocurre en un 0,2 a 2,2% de todos los nacidos
vivos. El diagnóstico de la misma se realiza por detección del virus en
saliva u orina durante las dos primeras semanas de vida por cultivo o
técnicas de biología molecular. Si se efectúa más tarde y se detecta, ya
no puede asegurarse que se trate de una infección congénita, sino que
la presencia del virus puede deberse a una infección perinatal. Para
confirmar se puede recurrir a una muestra que siempre se toma dentro
de la primera semana de vida: la gota de sangre seca recolectada sobre
la tarjeta de pesquisa neonatal. Esta sangre se analiza por técnicas de
amplificación de ácidos nucleicos y su positividad confirma la infección
intrauterina.
El propósito del estudio es describir la experiencia del Laboratorio de
Virología del Servicio de Microbiología del Hospital de Pediatría “Dr. J.
P. Garrahan” con esta metodología durante el año 2014.
Durante el 2014 se analizaron 22 tarjetas de pesquisa neonatal
correspondientes a 22 pacientes con sospecha de infección congénita
por CMV mediante la detección genómica del virus por reacción en
cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR-RT) desarrollada en
nuestro servicio, incluyendo controles negativos y detección del gen de
la β globina humana como control interno de cada reacción. Los
pacientes estudiados tenían signos y/o síntomas compatibles con
infección congénita y en 14 de ellos se había realizado la detección viral
en orina previamente por PCR-RT. Las muestras de orina se enviaron en
promedio 86 días después del nacimiento.
En 10 de esas 14 muestras de orina se detectó genoma viral, pero la
infección congénita se corroboró en 3 casos por detección en la tarjeta
de pesquisa. Las 4 orinas negativas coincidieron con tarjetas negativas.
Se recibieron 8 tarjetas sin muestras de orina previas, de las cuales 2
resultaron positivas, conformando un total de 5 infecciones congénitas
detectadas.
La detección genómica en las tarjetas de pesquisa neonatal resultó útil
en los casos en los que el paciente ya había superado las dos semanas
de vida al momento de recolección de la orina, permitiendo discriminar
entre infección congénita y perinatal. Las tarjetas se conservan por
largo tiempo, se obtienen de todos los recién nacidos, y se puede
acceder a ellas de manera sencilla, por lo cual pueden utilizarse para
múltiples propósitos, entre ellos, la detección retrospectiva del CMV en
sangre y la confirmación de la transmisión intrauterina del virus.
0196
UTILIZACION DE CARTAS DE CONTROL PARA LA MEJORA CONTINUA
EN TECNICAS DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS IN HOUSE
PARA VIRUS HIV, HCV Y HBV
E Gareca, MF Freytes, L Canavesio, A Ahumada
Laboratorio de Hemoderivados Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina.
Introducción
Las cartas de control se utilizan para seguir el desarrollo de los procesos
de producción e identificar posibles inestabilidades y circunstancias
anómalas. Este tipo de análisis permite controlar los procesos para
asegurarse de que funcionan correctamente. En nuestro Laboratorio,
esta metodología se implementó para técnicas NAT in house y nos
permitieron tomar acciones para detectar y ajustar distintas variables
que afectan directamente la performance del ensayo y mejorar el
desempeño logrando mayor eficacia y eficiencia del proceso.
Objetivo
Aplicar herramientas de control de calidad que permitan tener
conocimiento del estado de todo el proceso.
Utilizar cartas de control para conocer la influencia de las variables de
cada etapa, detectar las causas que modifiquen el desempeño
(inhibiciones) contribuyendo a la gestión del control de proceso
conformando una tarea pro‐activa y permanente con el fin de asegurar
la calidad del resultado.
Metodología
Técnica in house para detección de AN virales HBV-MULIPLEX (HCVHIV):
Extracción en columnas/retro-transcripción/amplificación PCRNESTED/revelado.
Control interno: agregado como control de eficiencia de la reacción a
través del cual se calcula el porcentaje de inhibiciones.
Cartas control: Gráficos del porcentaje de inhibición por ensayo vs
tiempo. Se dividieron 518 ensayos en cuatro periodos.
Resultados
Periodo 1: 148 ensayos con 26% inhibición promedio para HCV.
Periodo 2: 81 ensayos con 29 % inhibición promedio para HCV.
Periodo 3: 225 ensayos con 8% de inhibición promedio para HCV, 17%
para MULTIPLEX, 10% HBV.
Periodo 4: 64 ensayos con 11% de inhibición promedio para MULTIPLEX
y 4% excluyendo muestras contaminadas, 3% de inhibición promedio
para HBV y 2% excluyendo muestras contaminadas.
Conclusiones
Identificación de causas: En los períodos 1 y 2 se relacionó con variables
propias de la técnica como reactivos, controles, fraccionamiento y
almacenamiento de los mismos y condiciones ambientales de las salas
de trabajo con los altos porcentajes de inhibición.
Mejora del proceso: En el periodo 3 se incorporan nuevos ensayos, se
realizaron mejoras en las variables mencionadas observándose una
notable disminución de los porcentajes de inhibición.
Seguimiento y estabilización: En el periodo 4 se logra la eliminación de
las causas que afectaban al proceso con mejoras edilicias importantes
lo que se evidencian con inhibiciones menores al 5%.
El diseño y aplicación de cartas de control nos permiten detectar y
prevenir las variables críticas que afectan significativamente la calidad
del proceso, mejorando el desempeño y una gestión optima de
procesos y recursos.
0206
EVIDENCIAS DE INFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E (HEV) EN
INDIVIDUOS INMUNOSUPRIMIDOS DE CÓRDOBA, ARGENTINA.
MB Pisano1, J Debes2, MG Martínez Wassaf3, M Lotto1, H Coseano4, LG
Marianelli5, N Frassone5, MB Isa1, MS Contigiani1, D Balderramo4, VE Ré1
1
Instituto de Virología "Dr. Vanella", Facultad de Ciencias Médicas,
Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 2 Universidad de
Minnesota, Minneapolis, USA, Estados Unidos. 3 Laboratorio de
Virología y Biología Molecular, LACE, Argentina. 4 Hospital Privado,
Córdoba, Argentina. 5 Hospital Rawson, Córdoba, Argentina.
El virus de la hepatitis E (HEV) causa hepatitis aguda de transmisión
entérica en escenarios epidémicos. En áreas de circulación endémica, la
mayoría de las infecciones son asintomáticas, con casos agudos
esporádicos, con la excepción de pacientes embarazadas, que pueden
presentar hepatitis fulminante. Algunos reportes sugieren mayor
prevalencia de HEV en inmunosuprimidos. Así, en varios países del
mundo se han reportado casos de hepatitis crónica por HEV en dicha
población, incluyendo transplantados de órganos sólidos y pacientes
HIV (+). En Argentina poco se conoce acerca de la circulación de HEV.
En el área Metropolitana se ha reportado una prevalencia de 1,8% en
donantes de sangre y 6,6% en individuos HIV (+). En Córdoba, el valor
de prevalencia de infección por este virus es de 4,4% en población
general, pero no existen estudios acerca de la circulación del mismo en
individuos con inmunosupresión.
El objetivo de este trabajo fue investigar la evidencia de infección por
HEV en individuos HIV (+) y hemodializados de Córdoba.
Para ello, se realizó la determinación de IgG e IgM anti-HEV (EIA,
Diapro, Milan), y la amplificación del ARN viral por RT-Nested PCR de la
78
Libro de resúmenes
región genómica ORF2 en sueros obtenidos de individuos HIV (+) (20092010, n=95) y hemodializados pre-transplante renal (2014, n=83) que
concurrieron a centros de salud de Córdoba.
Del total de muestras analizadas, 16 resultaron positivas para la
detección de IgG (8,99%): 8 correspondientes a individuos HIV (+)
(8/95; 8,4%), y 8 a pacientes hemodializados (8/83; 9,6%). De éstas, se
detectó IgM en 3 pacientes: 2 HIV (+) y 1 dializado. Solo 1 muestra,
correspondiente a un individuo HIV (+) con síntomas de vómitos y
diarrea, resultó positiva por PCR, con IgG (-) e IgM (-). En pacientes HIV
(+), la prevalencia de HEV estuvo relacionada al conteo de células CD4,
ya que la misma fue de 18% (5/27) en pacientes con media de valor de
CD4 de 43 cel/mm3, mientras que en el subgrupo con media de valor
de CD4 de 543 cel/mm3, la prevalencia fue de 4,4% (3/68) (p=0.03).
Los resultados muestran los primeros datos de circulación de HEV en
individuos adultos inmunosuprimidos de Córdoba y aportan nuevas
evidencias de la mayor prevalencia hallada en este grupo respecto de la
población adulta sana de la misma región, especialmente asociada a
individuos con bajos niveles de CD4. La presencia de IgM y ARN viral
daría cuenta de infecciones agudas por este virus. Los hallazgos
obtenidos enfatizan la necesidad de expandir el conocimiento clínico y
epidemiológico local de HEV en estas poblaciones, así como profundizar
en la identificación de factores de riesgo para la infección crónica.
0216
FRECUENCIA DE DETECCION DE ENTEROVIRUS Y HERPESVIRUS
HUMANOS EN LIQUIDO CEFALO RAQUIDEO DE PACIENTES
PEDIATRICOS DE LA CIUDAD DE CORDOBA CON SOSPECHA DE
ENCEFALITIS VIRAL
V Nader, SL Grutadauria, L Jares, R de Elías, OI Kiener
Laboratorio de Elías y Kiener SRL - Sanatorio Allende, Argentina.
Los virus son agentes causales frecuentes tanto de encefalitis como de
meningitis. Un diagnóstico certero y rápido es siempre beneficioso,
tanto para establecer la terapia adecuada (en el caso de Herpes Simple)
como para evitar el uso de medicamentos y gastos de hospitalización
en infecciones por enterovirus, así como para establecer la etiología del
cuadro clínico. En este estudio retrospectivo se reporta la frecuencia de
detección de enterovirus y herpesvirus humanos en una población
pediátrica. Se analizaron 96 muestras de líquido céfalo raquídeo
remitidas por el Servicio de Neurología del Sanatorio Allende, entre
Abril de 2013 y Enero de 2015 pertenecientes a pacientes menores de
11 años con sospecha de encefalitis de origen viral. Las muestras fueron
conservadas a -70ºC y procesadas usando el reactivo Entherpex
(Genómica, Coslada, España) que consiste en una RT-PCR múltiple que
permite la determinación simultánea de los 8 herpesvirus humanos y
enterovirus (Coxsackie, Echovirus y Polio). La reacción incluye un
control interno de amplificación. La detección se realiza por medio de
un microarray de baja densidad con lectura e interpretación
automatizadas. El 22.1% de las muestras procesadas fueron positivas
(23/96) para alguno de los agentes estudiados. Las frecuencias de
detección y cantidad de casos positivos fueron:
Herpes Herpes
Virus
Varicela Citomégalo
Herpes Herpes Herpes
Enterovirus Simple Simple
EpsteinZoster
Virus
6
7
8
1
2
Barr
50.0%
4.2%
8.3%
4.2%
4.2%
4.2%
12
1
2
1
1
1
12.5% 16.7% 0.0%
3
4
0222
COINFECCIÓN DE VIRUS DENGUE Y CHIKUNGUNYA EN VENEZUELA,
ENTRE JULIO 2014 Y ENERO 2015.
D Guerrero, D Morón, D Arteaga, R Hernández
Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel", Venezuela.
La fiebre de dengue, es causada por el flavivirus dengue (VD) el cual
consta de cuatro serotipos perteneciente a la familia Flaviviridae, es la
arbovirosis más prevalente en el trópico y regiones subtropicales, en la
cual se ubica Venezuela. La fiebre por Chikungunya, es causada por el
virus Chikungunya (CHIKV), un alfavirus de la familia Togaviridae,
presente en África, Asia y recientemente en América. Tanto VD como
CHIKV son transmitidas a los humanos principalmente por el mosquito
Aedes aegypti. En ambas enfermedades la sintomatología
frecuentemente encontrada incluye: fiebre, erupciones, artralgias,
mialgias, cefalea, fatiga.
El objetivo de este estudio consiste en reportar los hallazgos de
coinfección de VD y CHIKV en muestras de pacientes sintomáticos
provenientes de diferentes regiones de Venezuela entre julio 2014 y
enero 2015 procesadas en el Instituto Nacional de Higiene “Rafael
Rangel” evaluando aspectos clínicos y epidemiológicos.
En el marco del brote de CHIKV en Venezuela y aplicación de
diagnóstico diferencial de VD, se procesaron 121 muestras agudas de
casos notificados, como sospecha de fiebre Chikungunya según la
definición de casos, contenidas en la Clasificación Internacional de
Enfermedades (CIE-10 A 92.0). Para la detección de VD y CHIKV se
empleó la técnica de RT-PCR en tiempo real (RT-PCRTR), siguiendo el
protocolo del CDC de Atlanta del año 2010, y considerando las
recomendaciones de la OMS/OPS del año 2011.
Se encontraron 5 casos de coinfección VD y CHIKV en muestras de
pacientes, todos de la región centro-costera del país. Los serotipos de
dengue identificados fueron: VD-4 (3), VD-1 y VD-3 (1). 3 pacientes de
sexo masculino y 2 femeninos, tres de ellos adultos jóvenes, un lactante
menor y un anciano. Los signos y síntomas más frecuentes fueron
fiebre, artralgias y erupción.
Como parte de la confirmación del brote epidémico ocurrido en
Venezuela en el año 2014 de fiebre Chikungunya, a un número
importante de muestras de pacientes sintomáticos provenientes de
diferentes regiones del país, se les realizó diagnóstico diferencial para
VD encontrándose 5 casos de coinfección. Este hallazgo se podría
explicar por la amplia distribución de vector Aedes aegypti en el país y
con la probable implicación del Aedes albopictus en la transmisión de
estos agentes virales, considerando además la condición de
hiperendémica de VD en Venezuela. Estas condiciones son propicias
para la ocurrencia de coinfecciones por VD y CHIKV. El alcance que
tienes este tipo de estudio es enfatizar la importancia que tienen las
medidas de control sobre el vector en la prevención de estas
enfermedades, así como aportar información relevante para el manejo
clínico del paciente.
0224
COMPARACIÓN DE DOS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS EN SANGRE SECA EN PAPEL DE FILTRO PARA
DIAGNÓSTICO DE INFECCIÓN CONGÉNITA POR CITOMEGALOVIRUS
C Theaux, M Hunt, C Aranda
Hospital General de Agudos Dr. Carlos G. Durand, Argentina.
0
El agente causal más frecuentemente encontrado en esta población fue
enterovirus. En dos casos se detectaron coinfecciones: uno con HSV 1 y
HSV 2 y otro HSV6 y HSV 7. La metodología es de utilidad para
satisfacer la demanda diagnóstica del cuerpo médico. Adicionalmente
permite la detección de agentes virales no comúnmente considerados
como probables causantes de encefalitis (Herpes 6 y herpes 7),
posibilitando establecer la causa del cuadro clínico en pacientes que a
menudo quedaban sin un diagnóstico etiológico.
Introducción: La infección congénita por Citomegalovirus (CMV) es
generalmente asintomática al nacimiento, y se manifiesta clínicamente
meses o años después. La detección de ADN de CMV en sangre seca en
papel de filtro (DBS) obtenida al nacer se acepta para su diagnóstico
retrospectivo por su prolongada conservación. Existen diversos
protocolos de diferente sensibilidad para la extracción de ácidos
nucleicos (AN) en DBS.
Objetivos: Comparar dos protocolos de extracción de AN a partir de
muestras de DBS para la determinación de CMV por PCR real time
(qPCR).
Materiales y métodos: Se obtuvieron muestras de sangre entera (SE)
de 9 donantes sanos; de cada una se tomó una alícuota y se le adicionó
una alícuota (spiking) de estándar de CMV 1.106 copias/ul. En 3 de las
muestras se cuantificó en este punto la concentración real de CMV por
qPCR. Por cada mezcla de SE + CMV se llenó una tarjeta de papel de
79
Libro de resúmenes
filtro (50 ul/círculo). Se dejaron secar 24 hs a temperatura ambiente, y
luego se realizaron los dos protocolos de extracción de ácidos
nucleicos, A y B.
Protocolo A (adaptado de de Vries et al.): Incluye el agregado de
Bacteria lysis buffer y una incubación overnight.
Protocolo B (propuesto por el fabricante): Incluye el agregado de agua
destilada y una incubación de 2 hs a 56°C.
En ambos se continuó con el protocolo de extracción High Pure Viral
Nucleic Acid Kit (Roche). Con los extractos de AN obtenidos se
realizaron qPCR para CMV y se obtuvo la concentración en DBS.
significativa (p<0,05). En los pacientes de los que se dispuso de
múltiples muestras de seguimiento, las curvas de las CV detectadas en
CMP y SE mostraron una tendencia semejante y diferente al plasma.
CONCLUSIONES: Las muestras de CMP y SE tienden a comportarse en
forma semejante para la determinación de la carga de EBV. El plasma
mostró el menor rendimiento analítico. Dadas las ventajas de
procesamiento y desempeño, la SE sería la muestra de elección para
determinar la carga de EBV en pacientes trasplantados, si bien faltaría
analizar su utilidad clínica en relación al desarrollo de PTLD.
Resultados:
0235
FRECUENCIA Y VARIACIÓN TEMPORAL DE GENOTIPOS DE HEPATITIS C
EN PACIENTES REGISTRADOS EN LAS UNIDADES CENTINELA PARA
HEPATITIS VIRALES, 2007-2014
SN Vladimirsky1, RED de U. Centinela para HV2, SS Soto1, NR Altabert1,
LO Otegui Mares1, LS Brajterman1, MS Munne1, JE Gonzalez1
1
Laboratorio Nacional de Referencia para Hepatitis Virales-INEI -ANLIS
"C. G. Malbrán", Argentina. 2 Ver listado completo en:
www.hepatitisviral, Argentina.
Concentración Concentración Concentración Concentración
teórica en S.E. cuantificada en DBS protocolo A DBS protocolo B
(cop/ml)
SE (cop/ml)
(cop/ml)
(cop/ml)
1
1.107
Inferido* 1. 106
2,76 . 104
6,55 . 105
2
1.10
7
Inferido* 1. 10
6
1,66 . 10
5
1,69 . 105
3
1.10
7
Inferido* 1. 10
6
9,92 . 10
4
1,15 . 105
4
1.107
Inferido* 1. 106
2,33 . 105
6,43 . 105
5
1.10
7
6
4
4,13 . 105
6
1.107
3,33 . 104
3,67 . 105
3
6,20 . 105
7
8
9
Inferido* 1. 10
Inferido* 1. 106
1,11 . 10
7
1,11 . 10
7
1,11 . 10
7
4,09 . 10
2,54 . 10
6
5,64 . 10
2,15 . 10
6
No detectable
2,12 . 10
6
3,70 . 10
3
2,17 . 105
3,02 . 105
(*) Inferido a partir de las concentraciones cuantificadas por qPCR en
muestras 7, 8 y 9.
Conclusiones: La recuperación fue mayor con el protocolo B. Además, B
presenta mayor practicidad, estabilidad y es más económico siendo por
lo tanto el método de elección. Se requeriría en una próxima etapa la
evaluación del protocolo B con muestras positivas de pacientes con
CMV.
0234
COMPARACIÓN DE LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE VIRUS
EPSTEIN-BARR (EBV) MEDIDA EN DISTINTAS MUESTRAS DE SANGRE
PERIFÉRICA DE PACIENTES PEDIÁTRICOS TRASPLANTADOS
MD Fellner1, KA Durand1, S Nuñez1, MD Borgnia2, D Viale2, ME Venuta2,
LV Alonio1, MA Picconi1
1
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas Carlos G. Malbrán,
Argentina. 2 Hospital de Pediatría Prof. Dr. J. P. Garrahan, Argentina.
La infección por EBV en pacientes trasplantados (Tx) se asocia al
desarrollo de PTLD. Su detección temprana es crítica ya que una
intervención terapéutica oportuna permite evitar el estadío irreversible
de linfoma. Se ha demostrado que niveles elevados de ADN de EBV
preceden al desarrollo de PTLD, por lo que la carga viral (CV) se utiliza
como marcador de riesgo. Diferentes muestras clínicas (células
mononucleres periféricas, CMP; sangre entera, SE; plasma, PL) se
emplean para cuantificar EBV; sin embargo, todavía no hay consenso
sobre cuál sería la óptima de acuerdo a sus ventajas de procesamiento,
desempeño analítico y utilidad clínica.
OBJETIVO: comparar las cargas de EBV en diferentes muestras clínicas
de pacientes trasplantados pediátricos.
MATERIALES Y MÉTODOS: Se estudiaron 155 muestras pareadas de
células mononucleares periféricas (CMP), sangre entera (SE) y plasma
(PL), provenientes de 93 pacientes trasplantados. Se determinó la carga
viral utilizando un método artesanal de PCR en tiempo real,
desarrollado y validado en nuestro laboratorio, que amplifica un
fragmento de 73 pb del gen que codifica EBNA-1. Los datos se
analizaron con el programa WinPEPI ETC, versión 2.56.
RESULTADOS: La CV fue detectable en el 84,5%, 73,5% y 30,1% de las
muestras de CMP, SE y PL, respectivamente, observándose una menor
sensibilidad en plasma con respecto a CMP (p<0,05) y SE (P< 0,05). Se
observaron resultados discordantes de detección en el 14,8% de CMP
vs SE, 45,8% de SE vs PL y 55,8% de CMP vs PL. Las cargas virales que
fueron cuantificables en CMP y SE mostraron una correlación
Introducción:
En Hepatitis C la duración del tratamiento, las tasas de curación y la
necesidad de interferón y ribavirina como adyuvante en la era de los
antivirales de acción directa continúa siendo dependiente en parte del
subgenotipo viral. Se han publicado varias revisiones que reportan la
prevalencia relativa de los genotipos a nivel global que incluyen a la
Argentina, pero estas revisiones no muestran la variabilidad dentro del
país, las modificaciones temporales en los últimos años, ni la asociación
de los genotipos con los factores de riesgo.
Las Unidades Centinela para Hepatitis Virales (UC) registran
información clínica, epidemiológica y demográfica de pacientes con
Hepatitis Virales en un software “at hoc”, que incluye el registro de
genotipos y subtipos de HCV.
Objetivo:
Analizar la distribución de genotipos y subtipos del virus de la Hepatitis
C, los factores de riesgo asociados y la tendencia temporal en casos de
Hepatitis C registrados en el software de UC en el período enero 2007setiembre 2014
Métodos:
La base de datos del software de UC fue analizada usando herramientas
descriptivas e inferenciales de Excel y SPSS.
Se analizaron las variables: Genotipo (Gt), Sub-Genotipo (sGt), edad
(>40, <=40), sexo, consumo de drogas intravenosas (DEV), condición
frente al HIV, cirugía (Cr) y transfusión. Para el análisis temporal se
consideró el período 2007-2010 frente a 2011-2014. Se consideró
estadísticamente significativo p valor < a 0.01.
Resultados:
17 de 27 UC habilitadas para la carga registraron 365 Gt. 6 UC cargaron
28 ó más casos.
Gt1 fue el más prevalente: 66% -22%sGt 1a 43% sGt 1b-, seguido por Gt
2 21%, Gt 3 12% y Gt 4 1%.
La prevalencia de Gt 2 en la UC de la ciudad de Córdoba fue de 42 %,
mientras que en las otras UC que registraron 28 casos ó más varió entre
0% y 28%.
sGt1a (en relación a sGt 1b) estuvo asociado con (OR, IC 95%): edad
<=40 (4.37, 2.31-8.24), sexo masculino (2.37, 1.34-4.15), DEV (3.70,
1.59-8.62) HIV+ (8.18, 2.59-25.8), Cr (0.41, 0.22-0.77). En el análisis
multivariado permanecen asociados: edad <=40 (3.50, 1.75-7.00) y HIV+
(5.89, 1.69-20.47)
La frecuencia de Gt 2 disminuyó a partir de 2011: 25% vs 13%. Aunque
sin significación estadística, Gt 3 aumentó a partir de 2011: 10% vs 16%.
Gt2 es más frecuente en mayores de 40 años.
Conclusiones:
En esta serie Gt 1 es el más prevalente. En Córdoba la frecuencia
relativa de Gt 2 es mayor que en la otras UC.
La frecuencia de Gt 2 está en disminución.
Como se describió previamente, el sGt 1a es más frecuente en
pacientes más jóvenes.
Estos resultados son consistentes con que el sGt 1a emergió
posteriormente al sGt 1b y por lo tanto es más frecuentemente
encontrado en individuos jóvenes y con factores de riesgo asociados a
80
Libro de resúmenes
conductas, tales como el consumo de drogas endovenosas y la
condición de HIV positivo.
0241
COMPARACIÓN DE ENSAYOS DE PCR EN TIEMPO REAL COMERCIAL Y
ARTESANAL PARA LA DETERMINACIÓN DE LA CARGA DE VIRUS
EPSTEIN-BARR (EBV) EN SANGRE ENTERA
MD Fellner1, KA Durand1, S Nuñez1, MD Borgnia2, D Viale2, ME Venuta2,
LV Alonio1, MA Picconi1
1
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas Carlos G. Malbrán,
Argentina. 2 Hospital de Pediatría Prof. Dr. J. P. Garrahan, Argentina.
El monitoreo de la carga viral es útil en el diagnóstico y seguimiento de
enfermedades asociadas al virus Epstein-Barr (EBV), como los
desórdenes linfoproliferativos post-trasplante (PTLD). En la actualidad
no hay todavía consenso sobre la estrategia metodológica óptima para
medir la carga de EBV. Se han descripto una amplia diversidad de
ensayos que utilizan distintos métodos de PCR (tipo de PCR
cuantitativa, comerciales o artesanales, fragmento viral amplificado),
tipos y cantidad de muestra clínica a analizar, controles para
estandarizar los ensayos, expresión de los resultados, entre otros. Todo
esto hace que sea difícil comparar los datos publicados, así como
extrapolar los valores de referencia de un laboratorio a otro.
OBJETIVO: comparar las cargas de EBV determinadas con un método
artesanal y otro comercial sobre sangre entera de pacientes pediátricos
trasplantados.
MATERIALES Y MÉTODOS: Se estudiaron 157 muestras de sangre entera
(SE) de pacientes pediátricos trasplantados. Se determinó la carga viral
utilizando un método artesanal de PCR en tiempo real, desarrollado y
validado en nuestro laboratorio, que amplifica un fragmento de 73 pb
del gen que codifica EBNA-1, y uno comercial (Nanogen) que amplifica
otro fragmento del mismo gen. Los datos se analizaron con el programa
WinPEPI ETC, versión 2.56.
RESULTADOS: La CV fue detectable en el 73,9% y 70,7% de las muestras
de SE medidas con el método artesanal y comercial, respectivamente,
demostrando una sensibilidad semejante (P> 0,05). Se observaron
resultados discordantes en la detección del 15,9% de los casos, siendo
el 60,0% de estas muestras detectadas por el método artesanal y el
40,0% por el comercial (p>0,05). Las cargas virales cuantificables por
ambos métodos mostraron una correlación significativa (p<0,05). Los
resultados de CV obtenidos con el método artesanal resultaron en
promedio 0,86 log mayores que con el método comercial, el 82,2%
mostró una diferencia mayor a 0,5 log.
CONCLUSIONES: Los métodos analizados (artesanal y comercial) se
comportaron de forma semejante para medir la carga de EBV en
muestras de sangre entera. Sería deseable que ambos métodos fueran
calibrados con el estándar internacional actualmente disponible, lo que
permitiría medir valores absolutos y mejorar su aplicación clínica.
0243
ENTEROVIRUS EN LCR DE INFANTES URUGUAYOS
L Garcia Aguirre1 2, E Hernández1
1
Laboratorio de Biología Molecular. Dpto de Patología Clínica. Centro
Hospitalario Pereira Rossell. Administración de Servicios de Salud del
Estado (ASSE), Uruguay. 2 Laboratorio de Virología Molecular. CIN.
Facultad de Ciencias. Udelar, Uruguay.
INTRODUCCION: Los virus del género Enterovirus son miembros de la
familia Picornaviridae, y presentan un genoma ARN+, de 7500 bases.
Infectan humanos y animales provocando diversas enfermedades, que
pueden ser desde asintomáticas a mortales. EV 71 y EV 68 han sido
relacionados en los últimos años con cuadros graves de meningitis
aséptica y alteraciones respiratorias en niños, respectivamente. Se
clasifican en polio y no-polio, siendo estos últimos de amplia
distribución en la infancia. Los Enterovirus son los agentes causales de
neurovirosis mas frecuentemente encontrados en Pediatría en nuestro
hospital.
OBJETIVOS: Tipificar los Enterovirus no-polio causantes de neurovirosis
en niños que consultaron en el Centro Hospitalario Pereira Rossell
(CHPR) en el período 2012-2014.
MATERIALES: Se cultivaron 72 muestras de líquido cefalorraquídeo
(LCR) en células RD proporcionadas por la Dra. María Cecilia Freire del
Instituto Dr. Malbrán de Buenos Aires. Se realizaron 3 pasajes y se
extrajeron los ácidos nucleicos del sobrenadante del cultivo. Se realizó
una transcripción reversa y amplificación por PCR (Onestep, Qiagen) del
gen de la proteína de la cápside viral, VP1. Se secuenciaron los
productos de PCR y se alinearon con las cepas de referencia de
Enterovirus. Se realizó un análisis filogenético de las cepas que
determinó el genotipo de las mismas. Se analizaron los parámetros
citoquímicos de los LCR: proteinorraquia, glucorraquia, lactato y
células.
RESULTADOS: Se obtuvieron 18 secuencias de Enterovirus que
correspondieron a 9 genotipos diferentes: CV-B1, CV-B3, CV-B5, E3, E5,
E6, E11, E13 y E18, pertenecientes a la especie de Enterovirus Humanos
del grupo B (HEV-B). No se observaron cepas de EV71 ni EV68.
Las cepas E11 se concentraron en los meses de abril-junio, a diferencia
de las demás cepas que se distribuyeron en los meses de noviembremarzo. Todos los casos en los que se detectó E11 tenían menos de 2
meses de vida, presentaron un cuadro de fiebre sin foco y el cuadro se
resolvió sin secuelas.
La mayoría de los niños afectados por las restantes cepas también
fueron menores de 2 meses. Los parámetros citoquímicos del LCR
fueron normales en el 40% de los pacientes. La proteinorraquia fue el
parámetro más sensible.
CONCLUSIONES:
En la población estudiada, las neurovirosis fueron causadas por los
genotipos CV-B1, CV-B3, CV-B5, E3, E5, E6, E11, E13 y E18 que no
conformaron un brote en el período estudiado. No se detectaron EV71
ni EV68. Las cepas de E11 se concentraron al final del período
estacional esperado. Los parámetros citoquímicos del LCR pueden ser
totalmente normales en casos de neurovirosis de niños pequeños.
0266
INFECCIÓN POR VIRUS JC EN RECEPTORES DE TRASPLANTE RENAL
E Frangi, H Diaz de Arce, BI Livellara, JM Oyhamburu
Servicio de Biología Molecular, Laboratorio Central, Hospital Italiano de
Buenos Aires., Argentina.
El virus JC (JCV) es un virus DNA miembro de la familia Polyomaviridae,
con elevadas tasas de seroprevalencia, que establece infección de bajo
nivel o latente en células derivadas de la médula ósea y del tracto renourinario. Si bien la reactivación de otro Polyomavirus humano, el virus
BK (BKV), es común en receptores de trasplante renal y, se asocia con
nefropatía y otras enfermedades del tracto urinario, relativamente
pocos estudios han sido publicados con relación a la replicación de JCV
en pacientes trasplantados renales, solo o en co-infección con BKV y los
mismos exhiben resultados contradictorios. El objetivo de este estudio
fue investigar la replicación de polyomavirus JCV sólo y en co-infección
con BKV en el tracto urinario de receptores de trasplante renal.
Se colectaron muestras de orina de adultos receptores de trasplante
renal atendidos en el Hospital Italiano de Buenos Aires que fueron
monitoreados prospectivamente durante el período de un año a
intervalos variables aproximados de tres meses. El ADN total fue
extraído usando el MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I
(Roche Diagnostics GmbH, Germany). La detección de ADN se realizó
por PCR en tiempo real con LightMix Kit Polyomaviruses JC and BK (TIB
MOLBIOL GmbH, Berlin, Germany) en el instrumento LightCycler 480
(Roche, Germany).
Las características demográficas de la población evaluada
correspondieron a 128 y 200 pacientes femeninos y masculinos
respectivamente, con una media de edad de 35 años. Los
inmunosupresores más ampliamente usados fueron tacrolimus,
ciclosporina y ácido micofenólico. La media del número de muestras de
orina obtenida por paciente durante el curso del estudio fue de 3
(rango de 1 a 7); con 665 muestras de orina analizadas en total. El
estudio mostró las siguientes tasas de infección: sólo JCV 73/328
(22,3%); sólo BKV 96/328 (29,3%); ambos, JCV/BKV 9/328 (2,7%),
negativos 150/328 (45,7%). Los pacientes con infección activa por JCV
mostraron una carga viral media de log 4.2 copias/mL de orina,
intervalo (log 1.8 a mayores de log 7). En todos los pacientes que
mostraron infección por JCV el virus fue detectado en el 100% de las
muestras de orina colectadas durante el curso del estudio.
81
Libro de resúmenes
Este estudio mostró una elevada tasa de infección, con un rango
medio-alto de cargas virales en orina de JCV en receptores de
trasplante renal. En particular, resultó interesante la persistencia de la
infección por JCV, que lejos de ser transitoria, se extendió a todo el
período evaluado en la totalidad de los pacientes detectados positivos.
Este estudio brinda resultados que contribuyen a sustentar el potencial
patogénico del poliomavirus JC en receptores de trasplante renal.
Considerando que el tamizaje de la replicación viral es una herramienta
crucial en la identificación de pacientes trasplantados en riesgo de
desarrollar nefropatía, recomendamos realizar monitoreo de la
infección por el virus JC durante al menos un año luego de realizado el
trasplante.
0278
IMPLEMENTACION DE TÉCNICAS MOLECULARES PARA LA
AMPLIACIÓN DEL DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS
AGUDAS BAJAS EN PACIENTES PEDIÁTRICOS
LE Valinotto1 2, E Tittarelli1 2, S Goya1, MI Natale1, SB Lusso1, MA
Marques1, J Cipelli1, PR Barrero1 2, M Viegas1 2, AS Mistchenko1 3
1
Laboratorio de Virología Hospital de Niños “Ricardo Gutiérrez”,
Argentina. 2 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas,
Argentina. 3 Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de
Buenos Aires, Argentina.
Actualmente la inmunofluorescencia (IF) permite determinar la
etiología viral del 40% de las infecciones respiratorias agudas bajas
(IRAB). El análisis del impacto de los virus respiratorios en su conjunto
requiere incorporar métodos moleculares, tales como PCR en tiempo
real (qPCR), que posibilitan aumentar el número de agentes detectados
así como hallar virus en bajo número de copias y en infecciones
múltiples.
Los objetivos fueron ampliar la detección de virus asociados a IRAB en
niños utilizando protocolos de detección por qPCR; evaluar sensibilidad,
especificidad y reproducibilidad de qPCR frente IF y definir un algoritmo
de progresión de complejidad de los métodos de diagnóstico
convencionales y moleculares para la detección de virus respiratorios.
Se analizaron aspirados nasofaríngeos (ANF) de niños hospitalizados en
instituciones de CABA por IRAB durante un período de 30 meses
corridos. Se utilizó la técnica de IF para detectar virus sincicial
respiratorio (RSV); adenovirus (AdV); parainfluenza (PIV) 1, 2 y 3;
influenza (INF) A y B, y protocolos de qPCR para detectar y cuantificar
RSV, AdV, PIV1, PIV2, PIV3; INFA H1N1 y H3N2 e INFB, rinovirus y
enterovirus (PER); bocavirus (BoV) y coronavirus (CoV). Se construyeron
controles sintéticos con los que se realizaron curvas de calibración para
evaluar la eficiencia y la sensibilidad en valores absolutos y relativos al
número de células presentes en la muestra.
Con los protocolos de qPCR seleccionados se analizaron 200 muestras
al azar entre la población de aproximadamente 12000 ANF analizados
por IF en el período de estudio. El número de casos detectados por
qPCR para cada virus fue considerablemente mayor que la detección
por IF. Se determinó la sensibilidad de IF para la detección de RSV,
INFB, INFA H3N2 y AdV, siendo mayor a: 5, 15, 3 y 20 copias/célula,
respectivamente. Para el caso de PIV3 e INFA H1N1 no se encontró
relación entre la carga viral y la capacidad de detección por IF.
Además, por qPCR se detectaron ácidos nucleicos (AN) de MPV; PER;
BoV y CoV (en 8, 51, 37 y 2 muestras respectivamente). Todo lo
mencionado anteriormente incrementó el porcentaje de positividad del
66% al 90% de las muestras analizadas, permitiendo otorgar un
diagnóstico virológico a un mayor número de pacientes.
Adicionalmente, en el 53% de las muestras analizadas se detectaron AN
de múltiples virus (hasta 6 en la misma muestra).
Este estudio permitió correlacionar carga viral con la capacidad de
detección por IF, ampliar el número de virus detectados y detectar
coinfecciones. A partir de este proyecto se puso en marcha la detección
molecular de rutina tanto cuali- como cuantitativa de virus respiratorios
en nuestro laboratorio ya que permitió definir un algoritmo para el
diagnóstico de virus respiratorios. Además, el uso rutinario de qPCR
proveerá la información necesaria que permitirá asociar el número de
copias detectado con la enfermedad, portación, excreción y
transmisión viral.
0279
DETECCIÓN MOLECULAR DEL VIRUS PAPILOMA HUMANO DE ALTO
RIESGO ONCOGÉNICO EN EL SEGUIMIENTO DE MUJERES TRATADAS
POR LESIÓN ESCAMOSA INTRAEPITELIAL. LABORATORIO CENTRAL DE
SALUD PÚBLICA. PRIMEROS RESULTADOS.
ML Bobadilla1, V Villagra1, ME Zorrilla1, P Pratt1, G Roscher2, F Franco2
1
Laboratorio Central de Salud Publica, Paraguay. 2 Hospital San Pablo,
Paraguay.
El cáncer de cuello uterino (CCU) es la primera causa de muerte por
cáncer en mujeres en países en vías de desarrollo. En Paraguay la
incidencia es superior que en países vecinos; 34,2 por 100.000 mujeres,
con tasa de mortalidad de 15,7 por 100.000 mujeres. La infección
persistente por el virus papiloma humano (VPH) es factor necesario en
lesiones intraepiteliales escamosas (SIL) y CCU que se tratan con el
procedimiento de escisión electroquirúrgica de lazo (LEEP), crioterapia
y conización existiendo posibilidad de recidiva o de desarrollar CCU. La
citología cervicovaginal es el método mayormente utilizado para
detectar el CCU y el uso combinado de la citología con el test de
detección de ADN viral a los seis meses post-tratamiento aumenta la
efectividad para identificar mujeres tratadas con riesgo de desarrollar
SIL residual y recidivas. El objetivo de este estudio descriptivo de corte
transverso fue describir la frecuencia de VPH-AR en mujeres tratadas 6
meses antes de la toma de muestra para VPH por SIL en el Servicio de
Patología Cervical del Hospital San Pablo de enero a diciembre de 2014.
Los estudios citológicos fueron clasificados según Bethesda 2001. Se
utilizó el sistema Cobas 4800 HPV Test (Roche) para la detección
individual de genotipos de VPH 16 y 18, y un pool de 12 VPH-AR (31, 33,
35, 39, 45, 51, 56, 58, 59, 66 y 68). Se incluyeron 80 pacientes para
control post tratamiento por SIL. La edad de las mujeres fue de 34 ±
12,4 años. El inicio de las relaciones sexuales fue de 18 ± 7,4 años y el
47% con más de una pareja sexual. El uso de anticonceptivos
hormonales fue referido por el 15,7% y se declararon fumadoras 2,4 %.
Previo al tratamiento, el 81% (65/80) presentó diagnóstico confirmado
de SIL de bajo grado (LSIL) y el 19 %(15/80) de SIL de alto grado (HSIL).
Se detectó VPH-AR en un 7,5% (6/80) de las pacientes tratadas por SIL,
3/6 con diagnóstico previo de LSIL y 3/6 con diagnóstico previo de HSIL.
Se identificó el VPH-16 en 3/6 de los casos positivos. En Paraguay existe
alta incidencia de lesiones pre-neoplásicas y CCU siendo un problema
de salud pública. La detección de VPH-AR por el sistema Cobas 4800 en
mujeres tratadas por SIL mostró 93% de negativización de la infección
por VHP-AR en el control post tratamiento comparable con trabajos
previos en la región y en nuestro país hecho de gran importancia, ya
que se demuestra, por medio de este test la efectividad del tratamiento
médico establecido. La detección de ADN de VPH-AR que identifique
separadamente los genotipos 16 y 18 podría contribuir a identificar
grupos de mujeres quienes podrían recibir un seguimiento más
cercano. Por su relevancia clínica, la prueba del VPH optimiza el
seguimiento post-tratamiento y conduce a la selección eficiente de un
subgrupo en riesgo de una lesión invasora. Una prueba de VPH negativa
post-tratamiento tiene valor predictivo negativo de casi el 100%, lo que
permite aumentar el intervalo de tiempo en un seguimiento de rutina.
0290
LESION LIQUENOIDE ORAL. REPORTE DE CASO CLÍNICO
RF Venezuela1, A Talavera2, AX Kiguen1, R Panico2, JP Mosmann1, R
Ferreyra de Prato3, C Cuffini1
1
Instituto de Virologia "Dr. J. M. Vanella " FCM-UNC, Argentina. 2
Cátedra de Estomatología "A" Facultad de Odontología UNC, Argentina.
3
Cátedra de Anatomia Patológica de la Facultad de Odontología UNC,
Argentina.
La Lesión Liquenoide Oral (LLO) es un Desorden Potencialmente
Maligno mucocutáneo crónico, de carácter inflamatorio y etiología
desconocida. La LLO es de ubicación unilateral e histopatológicamente
presenta displasia epitelial y un mayor potencial de malignización que
el Liquen Plano Oral (LPO). El principal inconveniente en el manejo de
este tipo de lesiones es su naturaleza crónica con periodos de actividad
y remisión.
Se presenta un caso clínico de LLO de 7 años de evolución. Paciente
femenino, que concurrió en el año 2008, a la Fac. de Odontología-UNC
refiriendo dolor de lengua. Durante la anamnesis no presentaba
82
Libro de resúmenes
factores de riesgo convencionales (tabaco, alcohol), pero sí otros de
orden general: hipertensión arterial, desordenes emocionales y
factores locales irritativos, mecánicos traumáticos físicos y químicos. En
el análisis clínico estomatológico se observaron múltiples lesiones en el
lado izquierdo de la lengua (manchas blancas, rojas, queratosis y
erosiones) con características citopatológicas de grado III con displasia
moderada, el diagnóstico histopatológico fue compatible con LLO con
coilocitos y displasia epitelial moderada.
Se implementó tratamiento interdisciplinario: local (odontoestomatológico y fonoaudiológico) para actuar sobre los factores
irritativos y general (médico-psicológico) para estabilizar presión
arterial y estado emocional.
Se realizaron biopsias de control en el año 2009 y 2011, con los mismos
resultados histopatológicos que 2008. Sin embargo, no se detectó la
presencia de Virus Papiloma Humano (VPH) por PCR en ninguna de las
muestras.
En el año 2013; se observó una reactivación de la enfermedad, por lo
que se obtuvo una cuarta biopsia. Se diagnosticó Leucoplasia Verrugosa
Proliferativa con displasia grave. Por biología molecular se detectó la
presencia de VPH genotipos 6, 16 y 53. Luego de consultas
interdisciplinarias se indica la administración de vacuna tetravalente
para VPH y se deriva al Servicio de Cabeza y Cuello para extirpación
completa de las lesiones. Se confirmó el diagnóstico de Carcinoma
escamoso mínimamente invasor con márgenes libres. Al cabo de seis
meses, la paciente presentaba pequeñas lesiones compatibles con la
infección de VPH. Por este motivo, se realizó tratamiento local con
ácido tricloroacético e inmunomodulador hasta remisión. En su último
control (Marzo 2015) hay remisión clínica total de las lesiones.
Este caso nos permite inferir que la evolución de las LLO podría verse
condicionado por el genotipo de VPH detectado. Debido a que se trata
de una patología muy dinámica y agresiva requiere de controles clínicos
frecuentes y ante la presencia de cualquier cambio realizar citología
exfoliativa y biopsia, a los fines de diagnosticar precozmente una
posible transformación maligna y su tratamiento debe ser abordado de
una manera interdisciplinaria y multiterapeutica.
0291
LA ESTIMACIÓN DEL LIMITE DE DETECCION EN MÉTODOS
MOLECULARES DE DIAGNOSTICO VIROLÓGICO. DIFERENCIAS EN LA
APLICACIÓN DE LOS MODELOS PROBIT Y POD/LOD
M Rodriguez1, L Irazu1, N Bueno1, R Bonaventura2, A Mariotti2, MC
Freire2
1
INEI ANLIS "Carlos G Malbran", Argentina. 2 Servicio Neurovirosis
ANLIS "Carlos G Malbran", Argentina.
La estimación del límite de detección (LoD), antiguamente denominado
Sensibilidad Analítica, es un parámetro de Validación Analítica, y es
parte componente de la “calidad analítica” de un reactivo de
diagnóstico (IVD), en la practica del diagnóstico molecular de
enfermedades virales, se interpreta erróneamente como parámetro de
“calidad diagnóstica”, pero no necesariamente es reflejo de los
parámetros de performance diagnóstica (Sensibilidad Diagnóstica
Relativa, entre otros). El cálculo de LoD tienen un error asociado a: la
variabilidad a concentraciones cercanas al blanco, el tipo de modelo y
diseño experimental utilizado, ambos dependientes del número de
repeticiones por nivel de concentración y de la cantidad de niveles de
concentración ensayados. Este error se refleja en la amplitud del
intervalo de confianza del 95%(AM IC95) y generalmente no es
declarado por los laboratorios comerciales en los insertos. Nuestro
objetivo consistió en estimar el LoD con los modelos PROBIT y
POD/LOD para un IVD “in house” de diagnóstico de Virus BK (BKV),
utilizando tres diseños experimentales, con el fin de describir las
diferencias obtenidas con ambos modelos. Se utilizó un método de
cuantificación de virus BK “in house”real time PCR, desarrollado en el
Servicio de Neurovirosis, para la obtención de los calibradores se
expresó un plásmido de ADN, y se prepararon muestras con 13 niveles
de concentración entre 1x108 y 3 copias ADN /reacción. Las mismas se
ensayaron por 20 días. Los diseños utilizaron distinto número de
repeticiones: 40, 30 y 20 replicados en total por nivel de concentración.
Se estimó el LoD 95% modelo Probit con el programa SPSS V17 y con el
Modelo POD /LOD utilizando POD/LOD calculation programe V6
obteniendose los siguientes resultados:
Límite de
detección
(copias /
reacción)
Modelo1
(N:40)
Modelo 2
(N:20)
Modelo3
(N:10)
límite
límite
Amplitud
inferior superior
del IC95%
del IC 95% del IC 95%
Probit
45.02
28.80
98.54
69.74
POD/LOD
32.57
25.47
41.64
16.18
Probit
40.50
22.67
159.78
137.11
POD/LOD
29.60
20.98
41.76
20.79
Probit
52.16
24.11
679.30
655.19
POD/LOD
34.97
21.66
56.47
34.81
Cuando el número de réplicas disminuye, la AMIC95 se incrementan
para ambos modelos. Para 10 réplicas el LoD Probit, fue de 52
copias/reaccion AM IC95: 655 copias/reacción y solo 34.81 copias/
reacción para POD/LOD. Se observan diferencias del orden de 1 log
para AM IC95 por Probit entre 40 y 10 replicados, 69.74 y 655.19
respectivamente. Dependiendo del modelo y del diseño experimental
utilizado, la estimación de LoD varía, y su ponderación debería ser
realizada considerando la amplitud del IC 95.
0292
DESAFÍOS DIAGNÓSTICOS DE LAS MENINGOENCEFALITIS VIRALES EN
LA PROVINCIA DE CÓRDOBA
MG Barbás, GM Castro, MP Sosa, MJ Sosa, M Borda, A Cudola
Laboratorio Central de la provincia de Córdoba, Argentina.
El Sistema Nervioso Central (SNC) es susceptible a infecciones por
diversos agentes tales como virus, bacterias, hongos y parásitos.
Diferentes virus están asociados con las infecciones del SNC. Su
frecuencia varía anualmente, varía según el grupo etario, depende de
los programas de vacunación instaurados y de la exposición a
reservorios animales o vectores, entre otros factores. Las
meningoencefalitis son enfermedades sujetas a notificación obligatoria
desde 1960 (Ley Nº 15.465) y a partir de 1994, se implementó el
Sistema de Vigilancia Intensificada para meningoencefalitis. En
Córdoba, el Laboratorio Central del Ministerio de Salud, es el
laboratorio de Referencia provincial, trabajando coordinadamente con
el área de epidemiología y los centros de salud. Desde 2010 realiza el
diagnóstico virológico de todos los casos con sospecha de
meningoencefalitis de origen viral.
El objetivo de este estudio es determinar la incidencia de los principales
agentes virales productores de meningoencefalitis en la provincia de
Córdoba, durante el período 2010-2013.
Se estudiaron un total de 821 muestras de LCR correspondientes a
pacientes con sospecha de meningoencefalitis viral. Mediante la
Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR) se detectaron los siguientes
agentes virales: Herpes Simplex 1 y 2 (HSV-1/2), Citolmegalovirus
(CMV), Varicela Zóster (VVZ), Epstein Barr (EBV), todos ellos en/sobre
plataforma LightCycler® 2.0 - Roche; Enterovirus (protocolo I. Casas et
al. - J. of Vir. Meth. 66:39-50-1997) y Flavivirus (SLEV: Hull et al.-Diagn.
Microb. Infect. Dis. 62(3):272-279-2008 y WNV: Lanciotti et al.-J. of Clin.
Mic. 38(11):4066-4071-2000).
En el período 2010-2011, se estudiaron un total de 158 pacientes (61%
niños y 39% adultos). En un 5% (8) de los pacientes analizados se
detectó alguno de los agentes virales estudiados: 6 muestras
pediátricas positivas para HSV y 2 muestras de adultos positivas para
HSV y CMV respectivamente.
Durante el período 2012-2013, se estudiaron un total de 663 pacientes
(51% niños y 49% adultos). El 15% (100) resultó positivo para alguno de
los agentes virales estudiados. De estos, el 22% (74) correspondieron a
muestras pediátricas: 70 Enterovirus, 2 HSV-2, 1 VVZ, 1 CMV y 8% (26)
muestras de adultos: 13 Enterovirus, 6 HSV-1/2, 5 CMV y 2 EBV.
En referencia al diagnóstico de Flavivirus, durante dicho período, se
estudiaron 213 muestras de LCR para la detección de anticuerpos de
tipo IgM anti-Flavivirus (MAC-ELISA), 153 adultos y 60 niños. De ellas,
7% resultaron reactivas para IgM anti-Flavivirus.
83
Libro de resúmenes
En el presente estudio, los principales agentes etiológicos detectados
fueron Enterovirus y HSV, tanto en niños como en adultos. Conocer
estos datos, es fundamental para la vigilancia de meningoencefalitis, su
notificación y diagnóstico diferencial y para permitir, no sólo la
oportuna implementación de las medidas de control, sino también para
poder tomar medidas de salud pública adecuadas, de acuerdo a la
situación epidemiológica local.
0300
EFECTO DE LOS ERITROCITOS SOBRE LA PRODUCCIÓN VIRAL EN
MACRÓFAGOS DERIVADOS DE MONOCITOS INFECTADOS CON EL
VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA TIPO 1.
L Fazzi, CG Cevallos, RD Rabinovich, MM Ávila
Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida, (INBIRS),
Universidad de Buenos Aires /CONICET, Buenos Aires, Argentina.,
Argentina.
Nuestro grupo y otros autores han demostrado en pacientes infectados
con el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1, por sus
siglas en ingles) que una fracción importante del virus circulante se
encuentra unido a eritrocitos (HIV-E). Además, in-vitro se observó que
el HIV-E podría mantener su infectividad intacta. Durante el proceso de
clearence en el hígado y bazo los eritrocitos (E) entran en estrecho
contacto con macrófagos residentes, lo que daría un ambiente
adecuado para la infección de estas células. Así el HIV-E puede ser de
importancia en la formación y alimentación de estos reservorios.
Una vez que se establece la infección en éstos macrófagos y ante un
nuevo contacto con los E hay una interacción entre los receptores de
membrana de los E y el virus que está brotando. Estudios previos de
nuestro grupo demostraron que en cultivos de macrófagos derivados
de monocitos (MDM) la presencia de E aumenta la cantidad de virus en
el sobrenadante del cultivo de manera significativa. Por lo tanto, el
siguiente trabajo se centra en la cinética de producción de MDM
infectados con HIV-1 en presencia y ausencia de E.
Para el estudio se utilizaron MDM obtenidos de dadores sanos
infectados con HIV-1 de cepa BaL y eritrocitos purificados con Dextran.
Al día 14 post-infección los MDM se incubaron a distintos tiempos (5,
15, 30 y 60 minutos) con E o RPMI como control. La producción viral del
los MDM se evaluó midiendo antígeno p24. La producción total de los
MDM en presencia de E se toma como la sumatoria de la medición de
Agp24 en el sobrenadante más el asociado a E.
Al analizar la cinética de producción viral de los MDM en el cultivo sin E,
el punto de mayor producción viral se observó a los 30 minutos con una
caída significativa de la misma a los 60 minutos. En cambio, en
presencia de E el punto máximo de producción total se observó a los 15
minutos y no se observó una caída en la producción en los siguientes
puntos medidos. Cuando se comparó la producción viral en presencia
vs. ausencia de E, la máxima diferencia (6 veces mayor) se observó a los
15 minutos (p= 0.035).
Al calcular el porcentaje de virus que se une al E luego de ser liberado
de los MDM se observó que a los 15 minutos éste es 69.7% del total
coincidiendo así, el máximo porcentaje de HIV-E con el de mayor
producción viral.
De este modo los resultados destacan el impacto de los E en la cinética
de la replicación viral de los MDM. La mayor cantidad de HIV-1
detectado en los tiempos más tempranos sugeriría que ante el contacto
con los E se facilita la liberación del virus por parte de los MDM. Por lo
tanto, los E cumplirían un rol más que importante en la patogénesis del
HIV en condiciones fisiológicas como lo es la presencia de E.
0307
INFECCIONES SECUNDARIAS POR VIRUS DENGUE EN BUENOS AIRES
DURANTE EL AÑO 2009
E Tittarelli1 2, PR Barrero1 2, MC Alvarez López1, AS Mistchenko1 3, LE
Valinotto1 2
1
Laboratorio de Virología, Hospital de Niños "Dr. Ricardo Gutiérrez",
Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. 2 Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas, CONICET, Argentina. 3 Comisión
de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires, CIC,
Argentina.
El dengue es un grave problema de salud pública dado que su
incidencia se encuentra en abrupto crecimiento a nivel mundial. El virus
del dengue (DENV) se clasifica en cuatro serotipos sub-divididos en
genotipos, los cuales no confieren inmunidad cruzada. Según se cree, la
inmunidad contra un serotipo incrementa el riesgo de una enfermedad
más severa en caso de infectarse con otro serotipo. En el Área
Metropolitana de Buenos Aires, el mayor número de casos de DENV se
reportó en el año 2009 cuando la transmisión local se detectó por
primera vez.
El objetivo de este trabajo es comprobar la existencia de infecciones
secundarias por virus dengue en un área no endémica y comparar la
carga viral en pacientes con infección primaria y secundaria por DENV.
Se utilizaron muestras de suero de pacientes con diagnóstico clínico de
sospecha de dengue que fueron remitidas al Laboratorio de Virología.
Se confirmó el diagnóstico de DENV mediante cultivo celular, PCR o
detección de anticuerpos IgM anti-dengue según los días desde el
comienzo de la fiebre. Las muestras con DENV confirmado fueron
evaluadas para discriminar infecciones primarias de secundarias
mediante ensayos serológicos. Se midieron las cargas virales presentes
en infecciones primarias y secundarias de pacientes en fase aguda
mediante qRT-PCR. Se realizaron estudios estadísticos evaluando
diversos factores que podrían correlacionarse con las diferencias en las
cargas virales de infecciones primarias y secundarias.
De las 761 muestras de suero evaluadas, se confirmaron un total de
229 casos (109 mujeres y 120 hombres) de DENV-1 dentro de los cuales
se halló un 22,7% de infecciones secundarias. Las infecciones
secundarias correspondieron a 23 mujeres y 29 hombres, con una edad
media de 38,4 años (9-77 años).
Del total de casos DENV-1 confirmados, se evaluaron las cargas virales
de 65 muestras de pacientes en periodo virémico, correspondientes a
49 infecciones primarias y 16 infecciones secundarias. No se detectaron
diferencias estadísticamente significativas entre las cargas virales de
infecciones primarias y secundarias.
Hemos detectado un alto porcentaje de infecciones secundarias en un
área no endémica. Este hallazgo podría estar relacionado con las
características socio-demográficas del grupo en estudio o estar
indicando la posible circulación críptica del virus causando infecciones
inaparentes. Son necesarios estudios que permitan elucidar la
prevalencia de anticuerpos anti-DENV entre residentes del Área
Metropolitana de Buenos Aires, ya que resultarán de gran utilidad para
el sistema de salud en el manejo de pacientes en riesgo de sufrir
infecciones secundarias de DENV en futuros brotes.
0308
ANÁLISIS DE LA CIRCULACIÓN DE CORONAVIRUS EN NIÑOS
INTERNADOS CON INFECCIÓN RESPIRATORIA AGUDA
ML Minassian1, M Avaro2, G Cabral1, E Baumeister2
1
Hospital Nacional Prof. A. Posadas, Argentina. 2 INEI-ANLIS Carlos
Malbrán, Argentina.
Las infecciones respiratorias agudas (IRA) son una importante causa de
morbi-mortalidad en niños. La mayoría son causadas por virus pero un
gran número queda sin diagnóstico. El rol de Coronavirus (HCoV) está
siendo reconsiderado. Es imperioso evaluar su significado clínico.
OBJETIVO
Documentar la circulación de HCoV en niños con IRA internados y
analizar sus características clínicas y epidemiológicas. Identificar los
diferentes tipos de HCoVs.
METODOLOGÍA
En 1206 aspirados nasofaríngeos (ANF) de pacientes con IRA ≤14 años
(mediana: 1año) tomados entre las SE 1 y 48 de 2013 con resultado
negativo por inmunofluorescencia directa para virus Sincicial
respiratorio, Adenovirus, Parainfluenza, Metapneumovirus e Influenza
A y B (Virus respiratorios clásicos o VRC), se realizó PCR multiplex para
HCoV, Rinovirus (RV), Enterovirus, Bocavirus (Coiras et al. 2004). Las
muestras positivas para HCoV fueron testeadas para los VRC por PCR en
tiempo real (CDC 2011). Los HCoV detectados fueron tipificados
mediante PCR en tiempo real desarrollada por CDC (2011). Se
compararon datos clínicos y epidemiológicos de niños con HCoV con los
de la población pediátrica internada con IRA en 2013. (Test χ2 y
estadístico Z, p<0,05)
84
Libro de resúmenes
RESULTADOS
Se detectaron 64 HCoV, 22 como único agente y 42 con otros virus
respiratorios. La codetección más fecuente fue RV-HCoV (26). La mayor
circulación se observó entre julio y octubre con pico en septiembre.
HCoV-OC43 fue el más frecuente (42), luego HCoV-229E (10) y HCoVNL63 (1). En 2 pacientes se codetectó HCoV-OC43/HCoV-229E y en 9 no
se pudo tipificar con la metodología empleada. La presentación clínica
fue 26 IRA alta, 17 Bronquiolitis (BQ) y 14 Neumonías (NMN). La
proporción de pacientes con IRA alta es mayor que en la población total
(p<0,001), en cambio la de BQ fue menor (p<0,05), no evidenciándose
diferencias de proporciones en las NMN. En 41 pacientes se observaron
comorbilidades con mayor proporción de inmunosuprimidos (IS) (26)
que en la población total (p<0,001). La mediana de días de internación
fue 10; 28 pacientes requirieron O2, en menor proporción que la
población total (p<0,05). No se observaron diferencias en las variables
estudiadas entre los tipos de HCoV ni en infección única vs mixta.
CONCLUSIONES
Se documentó la circulación de HCoV en 6% de pacientes con IRA sin
diagnóstico para VRC, predominando la codetección, siendo más
frecuente con RV. El tipo de HCoV circulante preponderante fue el
HCoV-OC43. El pico de detección fue en septiembre a diferencia de la
mayoría de los VRC. La presentación clínica más frecuente fue IRA alta.
En IS el riesgo de infección por HCoV fue 5 veces mayor. La elevada
prevalencia de los HCoV-OC43 y HCoV-229E asociados a casos de IRA
alta en la población estudiada están de acuerdo con hallazgos previos
en los que se los asocia a la producción del resfrío común junto a los
RV. Debería considerarse la búsqueda de HCoV en pacientes con IRA e
IS con hallazgos negativos para los VRC.
0315
LA FALLA PREVIA A INTERFERÓN NO ALTERA LA FRECUENCIA DE
VARIANTES DE RESISTENCIA A INHIBIDORES DE NS3 Y NS5B EN
PACIENTES COINFECTADOS POR HIV/HCV
MM Sede, NL Laufer, M Parra, JF Quarleri
INBIRS (UBA/Conicet), Argentina.
Introducción: Desde el año 2011 el tratamiento de la infección crónica
por HCV incluye drogas de acción directa (DAA, de sus siglas en inglés)
en combinación con interferón pegilado (peg-INF) y ribavirina (RBV) y
posteriormente en esquemas libres de interferón. Las terapias basadas
en INF inducen la actividad citotóxica de los linfocitos T dirigida contra
los epitopes derivados de la polimerasa (NS5B) y proteasa (NS3) de
HCV. Este aumento de la presión inmunológica puede favorecer la
selección de variantes capaces de evadir la respuesta inmune.
Asimismo, estas variantes virales pueden estar asociadas a resistencia a
las DAA (RAVs)
Objetivo: Analizar la dinámica de RAVs asociadas a inhibidores de
proteasa y polimerasa de HCV que puedan afectar futuros tratamientos
en pacientes coinfectados por HCV/HIV con fallo previo a terapia
basada en INF.
Materiales y Métodos: Se extrajo ARN de muestras de 18 pacientes
coinfectados por genotipo 1a de HCV. Las muestras fueron tomadas
previo y durante (24hs y semanas 4, 12, 24) el tratamiento con peg-INF
y RBV. Se realizó secuenciación ultraprofunda (454 FLX, Roche) sobre
los productos de NS3 y NS5B obtenidos a partir de la RT-nested PCR.
Dos medidas de diversidad genética fueron utilizadas para comparar las
poblaciones virales: diversidad nucleotídica (π) y el estadídtico D de
Tajima.
Resultados: De la población en estudio, el análisis de secuencias
nucleotídicas implicó un total de 63674 para NS3 y 48127 para NS5B.
Tanto en NS3 como en NS5B se detectaron RAVs en muy baja
frecuencia (< 5%) en muestras de todos los individuos pero en general
su presencia no fue constante durante el seguimiento. Sólo en una
muestra de dos pacientes se observaron variantes mayoritarias
exhibiendo la Q80R/K/L (asociada a resistencia a simeprevir) y la A421V
(asociado a resistencia a baclabuvir). Se obtuvieron valores negativos
estadísticamente significativos para el estadístico D en ambas regiones,
pero no se observaron diferencias significativas entre las muestras de
los distintos tiempos como tampoco para los valores de π.
Conclusiones: La falla a una terapia previa con peg-INF/RBV no se
asoció con un aumento de la frecuencia de RAVs que afectan a drogas
que actúan a nivel de NS3 o NS5B. Los valores obtenidos para π y D
podrían asociarse al exceso de polimorfismos en baja frecuencia, los
cuales a su vez ocasionalmente podrían portar RAVs. Sin embargo son
seleccionados negativamente y en consecuencia fluctúan a baja
frecuencia e incluso desaparecen, lo cual concuerda con el
comportamiento observado para las RAVs en ausencia de presión de
selección por las drogas antivirales de acción directa.
0318
VALOR DE LA CARGA VIRAL PARA EBV EN LÍQUIDO
CEFALORRAQUÍDEO EN PACIENTES HIV/SIDA CON LESIÓN OCUPANTE
DE ESPACIO CEREBRAL
L Mammana1, L Tadey1, A Tkach1, A Del Portillo2, D Della Paolera2, M
Corti2, MB Bouzas1
1
Unidad Virologia. Hospital F J Muñiz. CABA., Argentina. 2 División B,
HIV/sida, Hospital de Infecciosas F. J. Muñiz. CABA, Argentina.
En pacientes infectados con HIV y lesión ocupante de espacio (LOE)
cerebral el principal diagnostico presuntivo es toxoplasmosis, siendo el
linfoma primario de sistema nervioso central (LPSNC) un diagnóstico
diferencial. En el 75- 100% de los pacientes con HIV/SIDA y LPSNC se
detecta ADN-EBV en líquido cefalorraquídeo (LCR), sin embargo no es
utilizado como único marcador diagnóstico dado que pueden
encontrarse niveles elevados de ADN-EBV en pacientes sin LPSNC. Ha
sido reportado que cargas virales de EBV (CV-EBV) en LCR superiores a
10000 copias/ml (c/ml) mejoran la especificidad y el valor predictivo
positivo para el diagnostico de LPSNC. Objetivo: Analizar los valores de
CV-EBV en LCR en una serie de pacientes con enfermedad HIV/SIDA y
LOE cerebral en función de su evolución clínica. Métodos: Se revisaron
retrospectivamente las historias clínicas de pacientes internados con
LOE, cuya CV-EBV resultó cuantificable en LCR. Se consignaron los
siguientes datos: sexo, edad, nivel de CD4, tratamiento, tiempo desde
el diagnóstico de HIV, diagnóstico presuntivo, presencia de LOE
cerebral en las neuroimágenes, diagnóstico de coinfecciones en SNC,
CV-EBV en LCR y evolución clínica. Se seleccionaron 8 pacientes que no
presentaron detección simultánea de otro agente en LCR y en 5
pacientes se constató su evolución. En 7/8 pacientes se estudió una
muestra y en una 3 muestras consecutivas con un mes de diferencia. La
CV- EBV se realizó con el kit (EBV Q-PCR (Alert, Elitech) cuyo target de
amplificación es EBNA-1, sensibilidad analítica 10 copias/reacción y
rango lineal de cuantificación: 300-30000000 de copias/ml. La
extracción de ADN se realizó con columnas (Zymo Research) a partir de
200 uL de LCR. Resultados: De los 8 pacientes, 5 fueron de sexo
masculino, la mediana de edad fue de 44 años (rango:18-59) y la
mediana de CD4 de 84 células/ul (rango:25-116). Ningún paciente se
encontraba bajo tratamiento antirretroviral. El 50% de los pacientes
presentaron diagnóstico tardío de HIV y el diagnostico presuntivo fue
toxoplasmosis en el 63%. En los 7 pacientes con una sola muestra la
mediana de CV-EBV fue 1320 c/ml, 3,1 log10 (rango:514-57292 c/ml,
2.71-4.76 log10), en 4 de ellos el diagnóstico presuntivo fue
toxoplasmosis cerebral y 2/4 fallecieron con CV-EBV de 602 y 57293
c/ml a pesar del tratamiento empírico para toxoplasmosis. La paciente
con tres muestras consecutivas presentó un aumento de la CV-EBV de
894 a 36114 c/ml (2.95-4.56 log10) y obitó. Conclusiones: Si bien la
toxoplasmosis cerebral es el principal diagnóstico presuntivo en
pacientes con HIV/SIDA y LOE, en este estudio un 60% de los pacientes
evolucionó desfavorablemente y falleció a pesar del tratamiento
empírico antiparasitario. Los valores de CV-EBV resultaron superiores a
10000 c/ml en el 50% de los pacientes, lo cual podría sugerir un
diagnostico de LPSNC, hasta la realizacion de la biopsia estereotáctica y
el estudio histopatológico definitivo.
0339
CIRCULACIÓN DE NUEVOS AGENTES VIRALES DETECTADOS POR
BIOLOGÍA MOLECULAR EN PACIENTES INTERNADOS CON INFECCIÓN
RESPIRATORIA
S Zunino, V Acosta, ML Minassian, E Bardossy, G Cabral
Hospital Nacional Prof. A. Posadas, Argentina.
Las Infecciones respiratorias agudas (IRAS) virales son la primera causa
de mortalidad infantil. Con la detección de virus respiratorios
clásicos(VRC):
Sincicial
respiratorio(RSV),
Adenovirus(ADV),
85
Libro de resúmenes
Parainfluenza(PI), Metapneumovirus(MPV) e Influenza A y B(FA/FB) por
inmunofluorescencia(IF) quedan sin diagnostico 1600(67%) pacientes
anualmente en nuestro hospital. La PCR permitió la detección de otros
virus
respiratorios(OVR):
Coronavirus(HCoV),
Rinovirus(RV),
Enterovirus(EV), Bocavirus(BoV). No hay datos de circulación de estos
agentes virales en Argentina
Objetivos:
Disminuir el número de pacientes sin detección viral con el uso de
biología molecular y la búsqueda de nuevos virus
Definir la circulación de VRC y OVR detectados por PCR en pacientes
con IRA internados durante 2013 en nuestro hospital
Materiales y métodos:
De 2285 aspirados nasofaríngeos(ANF) de pacientes pediátricos
internados con IRA recibidos en 2013 se analizaron 478 obtenidos por
muestreo aleatorio estratificado por mes, edad, género, y comorbilidad
(α: 5%). Se testearon por IF(OXOID) y PCR en tiempo real(PCR)(CDC
2011) para los VRC y por PCR multiplex(M-PCR)(Coiraset al. 2004) para
los OVR.
Resultados:
La detección viral por IF alcanzó 31 % anual. Agregando PCR para Flu A
y B a los negativos por IF se llegó al 34%. Utilizando PCR para los VRC se
alcanza el 51% anual. Incorporando M-PCR para OVR se detectó
genoma viral en el 82% de las muestras del 2013. En cuanto a la
circulación viral por detección de genoma se obtuvieron los siguientes
resultados por virus: RSV desde el mes 4 hasta el 10 con un pico en los
meses 6 y 7 que tuvo un máximo de 58%; ADV se detectó durante todo
el año(promedio:7% mensual) con un pico en los meses 1 y 2 de 16%.;
PI-1 circula hacia el final del año llegando a un 13% en diciembre y PI-3
tuvo una detección sostenida, sin picos aparentes, con un promedio de
6%; MPV se detectó en curva bimodal con picos en marzo(13%) y
julio(15%); FA se detectó desde 5 hasta el 10 con un máximo en
junio(12%); FB se detectó 2% en septiembre.
La circulación de OVR fue: RV de forma constante durante todo el año
con máximos en el mes 3(75%) y 11(65,5%) y un mínimo en el 6(29%);
BoV también se detectó de forma constante desde el mes 2 hasta el 12
en un promedio de 8% y un máximo en enero(32%); EV de detectó de
forma contante(promedio: 4% por mes) y CoV desde el mes 4 hasta el
12 con un máximo de 12% en abril y en septiembre(10%).
Conclusión:
Los perfiles de circulación viral son específicos de cada virus. En los
meses cálidos RV, BoV y ADV son los virus más frecuentes. RV tuvo un
perfil de circulación opuesto a RSV. Los OVR están presentes en 59% de
las muestras. Debería investigarse RV y BoV en primavera-verano. Se
incrementó la detección de virus en las IRA en un 50% usando PCR para
VRC y en un 61% con la búsqueda de OVR por M-PCR. Se logró
disminuir el número de pacientes sin detección viral con el uso de
biología molecular y la búsqueda de nuevos virus a sólo un 18%
0354
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL VIRUS PAPILOMA HUMANO EN
CUELLO UTERINO Y ANO DE TRABAJADORAS SEXUALES DE
PARAGUAY, PERIODO 2012-2013
A Valenzuela1, L Mendoza1, P Mongelos1, G Gimenez1, MI Rodríguez1, G
Medina4, A Castro1, W Castro1, M Páez1, E Kasamatsu1, JV Gonzalez2, JA
Baseletti2, G Aguilar3, Z Suarez3, R Valdez3, G Deluca5, MA Picconi2
1
Departamento de Salud Pública, Instituto de Investigaciones en
Ciencias de la Salud, Universidad Nacional de Asunción, Paraguay,
Paraguay. 2 Servicio de Virus Oncogénicos, Instituto Nacional de
Enfermedades Infecciosas (INEI), “Dr. Malbrán” Administración
Nacional de Laboratorios e Instituto de Salud (ANLIS), Buenos Aires,
Argentina., Argentina. 3 Programa Nacional de Control del Sida
(Pronasida), Ministerio de Salud Pública y Bienestar Social, Asunción,
Paraguay, Paraguay. 4 Hospital de Clínicas, Facultad de Ciencias
Médicas, Universidad Nacional de Asunción, Paraguay, Paraguay. 5
Facultad de Medicina, Universidad Nacional del Nordeste, Corrientes,
Argentina., Argentina.
Los virus papiloma humano de alto riesgo oncogénico (HR-HPV) son los
agentes etiológicos del cáncer de cuello uterino y ano. Las mujeres
trabajadoras sexuales (MTS) constituyen un grupo de riesgo para la
adquisición de HPV. Este estudio tuvo como objetivo caracterizar
molecularmente al HPV en MTS provenientes de la ciudad de Asunción,
y los departamentos de Central, Amambay y Caaguazú periodo
2012/2013.
Este estudio transversal analítico incluyó 144 mujeres integrantes de la
asociación de trabajadoras sexuales Unidas en la Esperanza, que
aceptaron participar a través de un consentimiento informado. Se
completó una ficha y se procedió a la tomar muestras de células
exfoliadas de cérvix y ano, para la citología y el estudio virológico.
Los tipos de HPV fueron detectados por PCR PGMY09/11 y PCR
BSGP5+/6+ seguida de hibridación reversa. La frecuencia de HPV y HRHPV detectada fue del 50% y 40,9% en cuello uterino y del 56% y 36,1%
en ano. El HPV 16 fue el más frecuente en ambos sitios. Seguido del
HPV 16 en cuello uterino fueron detectados HPV 52 (11,1%), HPV 26
(5,5%), HPV 31 y HPV 45 (4,9 % cada uno) y en ano HPV 53 (8,3%), HPV
52 y HPV 66 (6,2% cada uno), HPV 44 y 45 (5,5 % cada uno). Se observó
una asociación altamente significativa entre la presencia de infección
por HPV o HR-HPV en cuello uterino y en ano, con valores de
p˂0,00001. El 1,4% de las mujeres presentó citología anormal en cuello
uterino y el 8,3% en ano. Estos resultados sugieren que MTS HR-HPV
positivas constituyen un grupo que debe ser controlado
frecuentemente en ambos sitios a fin de identificar infección viral
persistente y prevenir el desarrollo de lesiones.
0356
CITOMEGALOVIRUS EN PACIENTES PEDIÁTRICOS SOMETIDOS A
TRASPLANTE DE MÉDULA ÓSEA.
E López-Montanero1, M Aray-Andrade1, N Cajas-Flores1, E Frías2, B
Maldonado2
1
Universidad Espíritu Santo-Ecuador, Ecuador. 2 Solca, GuayaquilEcuador, Ecuador.
Introducción: El Citomegalovirus (CMV) pertenece a la familia de los
herpesvirus, su distribución es a nivel mundial, en todas las
localizaciones geográficas y en todos los grupos socioeconómicos, tiene
alta prevalencia debido al uso de inmunosupresores en pacientes
pediátricos trasplantados de médula ósea, hígado y riñón. En un
estudio en Uruguay el 63% de los pacientes pediátricos con trasplante
alogénico de progenitores hematopoyéticos presentaron reactivación
de CMV (Dufort, 2014); Uribe en el 2010 encontró que el 30% de los
pacientes pediátricos dentro del primer año post trasplante hepático
desarrollaron infección por CMV. El 24,26% de los pacientes infantiles
con trasplante renales desarrollan CMV (Fijo-López-Viota, 2013). Los
niños portadores de leucemia y linfoma también son susceptibles a
infecciones graves por CMV, sin embargo la prevalencia de esta
infección es variable entre los estudios realizados en diversos países,
debido a múltiples factores como raza, tipo de trasplante, método de
detección viral utilizado, tratamiento inmunosupresor y estatus
serológico de donante y receptor (Díaz-Betancur, 2012).
Citomegalovirus tiene alta prevalencia en pacientes con trasplante de
células hematopoyéticas, riñón e hígado, siendo una de las
complicaciones pos-trasplante, a pesar de todas las medidas y
esfuerzos que se realizan, que van dirigidos a la detección, diagnóstico
y tratamiento precoz de la enfermedad, esto incrementa el riesgo de
morbi-mortalidad (Boeckh, 2003; Pergam, 2012). El objetivo de este
estudio es evaluar la prevalencia de CMV en niños sometidos a
trasplante de médula ósea.
Metodología: Estudio retrospectivo, comparativo y transversal. Se
determinó la carga viral por Reacción en Cadena de la Polimerasa en
Tiempo Real (PCR-TR) en muestras de plasma recolectadas desde el
2009 hasta 2012 en niños que recibieron trasplante de médula ósea en
el Hospital de la Sociedad de Lucha contra el cáncer de la ciudad de
Guayaquil, Ecuador.
Resultados: De 38 pacientes sometidos a trasplante de médula ósea
analizados, se obtuvo 5 resultados positivos (13,2%) con CMV por PCRTR, de los cuales el 80% son niñas y el 20% niños con una edad
promedio de 7,2 años. Los pacientes que fueron trasplantados a causa
de leucemia linfoblástica aguda y linfoma leucemizado a leucemia
linfoblástica aguda son los que tuvieron resultados positivos por
infección activa por citomegalovirus con un 80 % (n=4) y 20 % (n =1).
Conclusiones: En este estudio el porcentaje de resultados positivos
para CMV fue bajo en comparación a lo observado en trasplante de
hígado y riñón. Entre los factores de riesgo para CMV determinados en
esta investigación es el sexo femenino con edad promedio de 9 años, lo
86
Libro de resúmenes
que difiere con otras publicaciones donde el mayor riesgo es sexo
masculino de edad inferior. La PCR-TR es una técnica de diagnóstico útil
para la detección precoz de la enfermedad.
0360
DETERMINACIÓN DE VIRUS RESPIRATORIOS POR MÉTODOS
MOLECULARES EN PACIENTES PEDIÁTRICOS CON INFECCIÓN
RESPIRATORIA AGUDA INTERNADOS EN HOSPITAL POSADAS
V Acosta, ML Minassian, S Zunino, G Cabral
Hospital Prof. A. Posadas, Argentina.
Los virus respiratorios son la principal causa de infección respiratoria
aguda (IRA) en pediatría. La PCR mejoró el diagnóstico de virus
respiratorios clásicos (VRC) -Sincicial respiratorio, Adenovirus,
Parainfluenza, Metapneumovirus e Influenza A y B- y permitió además
la detección de otros virus respiratorios (OVR) -Coronavirus, Rinovirus,
Enterovirus y Bocavirus- evidenciándose un alto número de
codetecciones. La información respecto de la importancia de la
codetección es escasa y contradictoria.
Objetivos
Comparar indicadores de gravedad en pacientes con detección única y
múltiple de VRC y en pacientes con VRC y OVR. Definir la utilidad de la
detección de OVR.
Materiales y Métodos
Se analizaron 400 ANF de niños (mediana de edad: 9 meses) internados
con IRA obtenidos por muestreo aleatorio estratificado por mes, edad,
género, y comorbilidad, de 2285 recibidos en 2013 (α:5%). Las muestras
fueron testeadas por PCR en tiempo real (CDC 2011) para los VRC y por
PCR multiplex (Coiras et al. 2004) para los OVR. Se registraron datos
clínicos y epidemiológicos de cada paciente.
Resultados
El 56% de las muestras presentó al menos un VRC (codetecciones: 7%).
Al adicionar la PCR para OVR la detección aumentó a un 84%
(codetecciones: 33%). De 216 muestras positivas para OVR,105 (48%)
fueron positivas para VRC.
Se observó una mayor proporción de neumonías en pacientes con VR C
con respecto a los que presentaban OVR (p=0.0001). En los pacientes
con OVR fue mayor la proporción de IRA alta que en niños con VRC
(p=0.0001). La proporción de IRA alta y Bronquiolitis fue mayor en
pacientes con OVR que en los negativos (p<0,005). No se observaron
diferencias en la presentación clínica entre los niños con detección
única y múltiple de VRC ni entre pacientes con VRC y aquellos con VRC
más OVR.
Al analizar las variables requerimiento de O2 (RO2), de cuidados
intensivos, presencia de comorbilidades y días de internación, hubo
diferencias significativas de RO2 y presencia de comorbilidades
(p<0.005) entre pacientes con VRC y pacientes con OVR. También se
observaron diferencias entre pacientes con OVR y pacientes con
resultado negativo en lo que respecta a RO2 (p<0.05) y la presencia de
comorbilidad respiratoria (p<0.05). No se observaron diferencias
significativas en estas variables entre pacientes con detección única y
múltiple de VRC ni entre pacientes con detección de VRC y VRC más
OVR.
Conclusiones
Las IRA con múltiples VRC no presentaron mayor gravedad que las
infecciones únicas. Tampoco si los VRC estaban asociados a OVR. En
cambio presentaron mayores indicadores de gravedad los pacientes
con detección de VRC que aquellos con OVR, y a su vez estos últimos
respecto a los pacientes con resultado negativo. Si bien agregando la
PCR para OVR disminuye el % de negativos, el 48% de las muestras
presentan codetección VRC-OVR. Teniendo en cuenta esto y la mayor
gravedad de los pacientes con VRC, la detección de OVR sería relevante
en los pacientes con resultado negativo para VRC.
0361
AUMENTO DE LA SENSIBILIDAD EN LA CUANTIFICACIÓN DE ADN DE
HIV-1 EN CÉLULAS MONONUCLEARES TOTALES POR PCR EN TIEMPO
REAL ANIDADA
M Moragas, P Aulicino, L Sen, A Mangano
Laboratorio de Biología Celular y Retrovirus, Hospital de Pediatría "Prof.
Juan P. Garrahan", Argentina.
La terapia antirretroviral combinada (ARVc) contra el HIV-1 ha
mejorado notablemente la eficacia en el control del virus circulante en
plasma. Sin embargo, existen formas de ADN viral intracelular (proviral
y episomal) que se hallan en muy baja frecuencia en distintos tipos
celulares y constituyen los reservorios virales, principal obstáculo en la
erradicación del HIV-1. Por este motivo, es importante contar con
técnicas de elevada sensibilidad y especificidad para la cuantificación
del ADN intracelular total de HIV-1 (ADNt HIV).
El objetivo del trabajo fue desarrollar una metodología altamente
sensible basada en PCR en tiempo real anidada para la cuantificación
del ADNt HIV.
La técnica consiste en dos rondas de amplificación por PCR. En la
primera se amplifica una región del LTR/Gag, y dicho producto se utiliza
como molde para una segunda ronda de amplificación mediante PCR en
tiempo real. Los cuatro cebadores (dos por ronda) y la sonda fueron
diseñados basados en los subtipos B, F y B/F del HIV-1. El número de
células totales por reacción se cuantificó mediante la amplificación, en
paralelo, de un fragmento de b-globina. Se desarrolló un vector que
porta la región LTR/Gag y el fragmento de b-globina para la realización
de la curva estándar.
La técnica de PCR en tiempo real de dos rondas de amplificación
presentó un límite de cuantificación mayor en comparación al obtenido
mediante una única ronda de amplificación: 8 copias/106 CMT y 50
copias/106 CMT, respectivamente. La especificidad fue del 100%
analizando, por triplicado y en dos ensayos independientes, 2 pooles de
ADN genómico de individuos no infectados (10 muestras/pool). El
coeficiente de correlación de la curva estándar fue 0,99, por lo que la
primera ronda de amplificación no influye en la linealidad de dicha
curva. El desvío estándar promedio del ciclo umbral intra-ensayo
incluyendo todos los puntos de la curva, fue de 0,14 ± 0,11 ciclos,
demostrando una alta reproducibilidad.
Por otra parte, se estudiaron 57 muestras de niños HIV-1 positivos con
seguimiento clínico en el Hospital Garrahan: 22 muestras fueron
tomadas antes (pre) y 35 luego (post) del ARVc. Del total de muestras
se lograron cuantificar 52 (91%), mientras que solo en 5 (9%) muestras
(1 muestra pre ARVc y 4 post ARVc) no se detectó ADNt HIV. Por otro
lado, de 21 muestras que presentaron cargas virales plasmáticas
inferiores al límite de cuantificación (34 copias ARN/ml plasma) se logró
cuantificar el ADNt HIV en 19 (90%).
La técnica de PCR en tiempo real anidada desarrollada para la
cuantificación de ADNt HIV resultó ser altamente sensible y
reproducible. De este modo, fue posible cuantificar más del 90% de las
muestras estudiadas, conservándose esta tendencia aún en muestras
que presentaban cargas virales indetectables. Este desarrollo permitirá
disponer de un parámetro más para analizar con mayor profundidad y
con fines terapéuticos, el comportamiento del HIV-1 en aquellos
pacientes que suprimen la carga viral plasmática.
0364
PREVALENCIA DE VIRUS BK UTILIZANDO TÉCNICA DE REAL TIME PCR
EN PACIENTES CON TRASPLANTE RENAL DE LA PROVINCIA DE
CORRIENTES, ARGENTINA.
CC Ortowski1, VA Flores1, LA Ferrini1, MF Ferrini1, A Aguerre2, MS
Maurich2, S Soto1
1
Laboratorio Central de Corrientes, Argentina. 2 Instituto de Cardiología
de Corrientes, Argentina.
Introducción: El virus BK es un poliomavirus. Su infección ocurre en la
infancia, generalmente, en forma asintomática o con síntomas
respiratorios leves, pero puede permanecer latente, en el tracto
urogenital, especialmente en riñón. En pacientes con trasplante renal,
la inmunosupresión permite que el virus BK se replique en el injerto,
ocasionando Nefropatía, responsable de disfunción del injerto renal en
pacientes trasplantados. La pérdida de injerto puede ocurrir en 10- 80%
de los casos de nefropatía. Estos porcentajes son menores en aquellos
centros donde se realiza una vigilancia periódica de infección por virus
BK y se instituye un tratamiento precoz. Objetivo: conocer el grado de
prevalencia de virus BK en muestras de orina y plasma en pacientes
receptores de trasplante renal en un periodo de 6 meses.
Metodología: El trabajo incluyó muestras de plasma y orina de 100
receptores de trasplante renal, sin signos clínicos de infección renal o
nefropatía al momento de realizar el estudio, de un único Centro de
87
Libro de resúmenes
Trasplante Renal, que ingresaron al laboratorio en un periodo de 6
meses. Se realizó la extracción de ADN con columna comercial. Para la
técnica de qPCR (RealTime) cualitativa se trabajó con primer y sonda
que reconocen el gen VP-1 (Randhawa, 2004), siguiendo las
especificaciones propuestas por el autor. Para la técnica de qPCR
cuantitativa se trabajó con kit comercial BKV Q-PCR Alert Kit NANOGEN,
siguiendo las instrucciones del comerciante. Se registró el CT de cada
una de las determinaciones realizadas por ambos métodos y se calculó
la carga viral en Genomas Equivalentes / mililitro (GE/mL) del método
cuantitativo. Cada muestra se procesó con ambas metodologías y se
correlacionaron los CT registrados, los cuales fueron comparables entre
sí con mínimas diferencias. Resultados: La prevalencia del virus BK en
nuestros pacientes en las muestras de orina fue de 32% y en las
muestras de plasma fue de 8%. El mismo porcentaje de positividad por
virus BK se encontró en un estudio realizado por este grupo en el año
2010. A pesar de encontrar una frecuencia elevada de virus BK en orina,
solo el 2% del total de pacientes presentó valores de carga viral
superior a 10 7 GE/ml, valor que se asocia con nefropatía por BK. Las 8
muestras de plasma con viremia correspondían a pacientes con virurias
de más de 10 5 GE/ml. De estos 8 pacientes, solo 1 presentó carga viral
en plasma superior a 10 4 GE/ml; valor que se asocia con nefropatía por
BK. Del seguimiento de los 2 pacientes que presentaron viruria con
carga viral significativa se observó un descenso de la misma.
Conclusiones: Estos resultados demuestran la utilidad de Real time PCR
para un diagnóstico precoz y certero permitiendo así evitar los efectos
indeseables que puede llegar a generar la pérdida del injerto a causa de
la infección producida por virus BK. Permitiendo así a los médicos
definir conductas terapéuticas y posterior seguimiento de los
pacientes.
0365
EVALUACIÓN DE LA LA CARGA VIRAL Y PROVIRAL EN NIÑOS
INFECTADOS CON HIV-1 ANTES Y DESPUÉS DEL INICIO DE
TRATAMIENTO ANTIRRETROVIRAL COMBINADO
M Moragas1, P Aulicino1, D Mecikovsky2, R Bologna2, L Sen1, A
Mangano1
1
Laboratorio de Biología Celular y Retrovirus, Hospital de Pediatría
"Prof. Juan P. Garrahan", Argentina. 2 Servicio de Infectología y
Epidemiología, Hospital de Pediatría "Prof. Juan P. Garrahan",
Argentina.
La carga viral en plasma (CV) y el recuento de células T CD4+ son los
parámetros bioquímicos más efectivos para el monitoreo de la
infección por HIV-1. Sin embargo, estos parámetros no reflejan el
comportamiento de las formas de ADN viral intracelulares (carga
proviral -CpV) que constituyen los reservorios del HIV-1.
El objetivo del trabajo fue cuantificar la CpV y evaluar su correlación
con la CV en niños infectados con HIV-1 antes y luego del inicio de
tratamiento antirretroviral combinado (ARVc).
Se estudiaron 21 niños con seguimiento clínico en el Hospital Garrahan
desde el año 2008 hasta el 2013. En la totalidad de los pacientes se
cuantificó los niveles de CpV y CV plasmática antes del inicio del ARVc
(pre-ARVc). De ellos, en 17 se cuantificaron dichos niveles luego de 18 ±
6 meses de iniciado el tratamiento ARVc (post-ARVc) que incluía
zidovudina, lamivudina y lopinar/ritonavir. La cuantificación del ADN
viral se realizó mediante un ensayo de PCR en tiempo real desarrollado
en el laboratorio, cuya sensibilidad es de 8 copias/106 células
mononucleares totales (CMT). La CV plasmática se midió utilizando el
kit comercial COBAS Taqman HIV-1 test v2.0 (límite de cuantificación=
34 copias ARN HIV-1/ml de plasma).
La mediana de carga viral pre-ARVc fue 5,7 (IQR 5,2 - 6,1) log10 copias
ARN/ml, y post-ARVc de 1,7 (IQR 1,7 - 2,2) log10 copias ARN/ml. La
mediana de CpV pre-ARVc fue de 1204 (IQR 346,8 – 2182,0) copias/106
CMT, mientras que post-ARVc fue de 164,2 (IQR 63,9 – 359,3)
copias/106 CMT. Esto muestra una importante reducción en los niveles
de ambas variables, siendo esta del 70% en CV y del 86% en CpV. No se
observó una correlación entre la CV y CPV previo al inicio de ARVc (r= 0,11, P>0,5). Sin embargo, psot- ARVc hubo una correlación positiva
entre dichas variables (r=0,49, P<0,05). De los 17 niños estudiados postARVc, 14 (78%) lograron la supresión virológica (CV<400 copias/ml) con
una mediana de CpV de 110 (IQR 63,25 - 1026) copias/106 CMT,
mientras que en los 4 (22%) pacientes sin supresión virológica la
mediana de CpV fue de 308,4 (IQR 239,6-370,4) copias/106 CMT.
Nuestros resultados demuestran que no hay una correlación entre el
comportamiento del virus circulante en plasma y aquellas formas de
ADN del virus que se encuentran dentro de las células antes del inicio
de ARVc. Esto podría deberse a distintos factores, entre los cuales es
importante resaltar el gran recambio de las células blanco del HIV-1
durante la infección aguda. Sin embargo, luego de 18 meses de
tratamiento ARVc, además de observarse una considerable disminución
en la CV y CpV como era de esperar, el comportamiento entre ambas
variables fue directamente proporcional. Este comportamiento podría
deberse al impacto positivo del tratamiento ARVc en el control de la
viremia plasmática, como así también en el establecimiento del virus
dentro de las células blanco.
0367
SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA EN LA GRAVEDAD DE LA INFECCIÓN POR
VIRUS RESPIRATORIO SINCICIAL EN LACTANTES CHILENOS.
S Ampuero, L Lizama, F Núñez, D Silva, A Pinto, C Mellado, V Luchsinger,
A Gaggero, C Larrañaga
Programa de Virología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de
Chile, Santiago, Chile.
El virus respiratorio sincicial (VRS) es el principal agente de bronquiolitis
en lactantes. El 0,5% desarrollará una infección grave. La mayoría de los
lactantes hospitalizados no tienen factores de riesgo conocidos. Se han
planteado factores genéticos asociados a enfermedad grave por VRS;
entre ellos los polimorfismos de un nucleótido (SNPs) en genes de
respuesta inmune. Nuestro objetivo fue evaluar la asociación de 18
SNPs con la gravedad de la primoinfección por VRS en lactantes
chilenos.
Se obtuvieron muestras de aspirado nasofaríngeo y sangre de 212
lactantes menores de 6 meses de edad, previamente sanos, durante las
epidemias del 2005-2007 y 2010-2011. Según la gravedad clínica de la
infección, se clasificaron en graves (96), moderados (62) o leves (54). En
el grupo grave, 34 lactantes recibieron ventilación mecánica (VM). El
diagnóstico de VRS se confirmó mediante transcripción inversa-PCR
tiempo real. Los SNPs estudiados en los distintos genes fueron:
rs721917, SPD; rs2243639, SPD; rs1060826, NOS2A; rs1921622, IL1RL1;
rs2274064, NCF2; rs1800925, IL13; rs20541, IL13; rs4986790, TLR4;
rs4986791, TLR4; rs11096957, TLR10; rs2251746, FCER1A; rs1800872,
IL10; rs1800795, IL6; rs10735810, VDR; rs643070, IFNA13; rs11688,
JUN; rs10757212, IFNA5; rs2069885, IL9. La detección de los alelos se
realizó mediante PCR-High Resolution Melting y el análisis estadístico
mediante Unphased y test de Armitage, (Odds Ratio: OR).
Seis de los SNPs presentaron asociación significativa con la gravedad de
la infección. El genotipo T/C del rs721917 fue más frecuente en
pacientes graves, y el genotipo C/C en leves. La presencia del alelo T
aumenta el riesgo. En el rs1921622, la frecuencia del heterocigoto G/A
fue mayor en pacientes graves, donde el alelo A constituyó el factor de
riesgo (OR: 2,5). El alelo T del rs2274064 se asoció a riesgo al comparar
graves frente a leves con moderados (OR: 1,6), la presencia del
genotipo T/T aumenta el riesgo a 2,8. En el rs1800872, el genotipo T/T
fue más frecuente en graves con VM y el genotipo C/C en graves sin
VM, siendo el alelo A de riesgo (OR: 2,8).
Las frecuencias alélicas y genotípicas de los SNPs rs1060826 NOS2A y
rs1800795 IL6, fueron significativamente diferentes entre graves y
leves. El alelo G de rs1060826 se asoció a riesgo (OR: 2,0) y el genotipo
G/G fue más frecuente en graves y A/A en leves. También, el alelo C de
rs1800795 fue un alelo de riesgo (OR: 2,1), así como el genotipo C/G.
En la combinación de los SNPs se detectaron haplotipos de gravedad.
Dentro de los más significativos (p<0,005) se encontraron:
T/C(rs721917)–G/A(rs1921622),
OR:6,6;
G/A(rs1060826)–
G/C(rs1800795), OR:3,9; G/A(rs1921622)–G/C(rs1800795), OR:12;
C/A(rs1800872)–G/C(rs1800795),
OR:15,6;
T/C(rs721917)–
G/A(rs1060826)–G/A(rs1921622),
OR:4,75;
G/A(rs1921622)–
C/A(rs1800872)–G/C(rs1800795), OR:5,4e11.
La determinación de marcadores genéticos asociados a riesgo,
permitiría el manejo oportuno de enfermedad grave por VRS.
Proyecto FONDEF CA13I10003.
88
Libro de resúmenes
0368
DETECCION DE VIH EN MUESTRAS DE SANGRE SECA, RECOLECTADAS
SOBRE TARJETAS DE PAPEL DE FILTRO, EN UNA POBLACION DE
ADULTOS EN EL HOSPITAL ITALIANO DE BUENOS AIRES.
D Arrigo, P Schneider, M Aragone, M De Cristofano, J Oyhamburu, F
Seoane, B Livellara
Hospital Italiano, Argentina.
Introducción: Habitualmente la detección de Anticuerpos(Ac) /
Antígenos(Ag) para VIH se realiza sobre muestras de plasma y/o suero.
La implementación de la recolección de gotas de sangre sobre papel de
filtro (GSPF, Dried Blood spot en inglés) resulta una buena alternativa
por la simplicidad en su método de obtención, conservación y
posibilidades de transporte.
Objetivo: Validar el empleo de GSPF como muestra adecuada para
detectar la infección por VIH y establecer el valor optimo de corte.
Metodología: Estudio prospectivo transversal que se llevó a cabo en el
Hospital Italiano de Buenos Aires desde Mayo a Noviembre 2013. Se
analizaron 218 muestras pareadas (GSPF y plasma) para la detección de
VIH Ag/Ac; 149 Positivas y 69 negativas. La técnica utilizada fue CMIA
Architect de Abbott. Los valores obtenidos con las GSPF fueron
comparados con los obtenidos sobre las muestras de plasma. El cálculo
del valor óptimo de corte, se realizó utilizando un programa estadístico
predictivo para el análisis de la curva ROC.
Resultados:
Sensibilidad y especificidad estimada, basada en el valor de corte del
GSPF S/CO.
Valor de corte
0.20
0.32
0.34
0.40
0.50
Sensibilidad
95.9
90.6
88.6
87.9
85.2
Especificidad
79.7
95.7
100
100
100
De acuerdo a los datos obtenidos por el análisis de la curva ROC el valor
de corte sugerido es 0.20 S/CO con una sensibilidad del 95.9% y una
especificidad del 79.7%.
Conclusiones: La GSPF ofrece una buena opción para el screening de
VIH cuando existen dificultades técnicas para la toma de plasma o
suero, fundamentalmente en pacientes que se encuentren alejados de
centros diagnósticos y para estudios epidemiológicos en grandes
extensiones geográficas y/o poblaciones de bajos recursos. El empleo
de GSPF simplifica la toma de muestra, reduce el volumen de sangre
necesario, ofrece una mayor estabilidad durante su conservación y
transporte. Se plantea incrementar el empleo del GSPF validando esta
metodología de muestreo para otros marcadores virales
0374
VALIDACION DEL SISTEMA HPV DIRECT FLOW CHIP- EBRID PARA LA
DETECCION Y TIPIFICACION DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO
(HPV).
B Livellara2, H Díaz de Arce Landa2, E Mocetti1, J Oyhamburu2
1
Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Italiano de Buenos Aires,
Argentina. 2 Servicio de Laboratorio del Hospital Italiano de Buenos
Aires, Argentina.
INTRODUCCIÓN: Las seis posibles aplicaciones clínicas de ensayos
basados en detección y tipificación de ADN para HPV son: aclasificación “triage” de mujeres con anomalías citológicas equívocas o
de bajo grado; b- seguimiento de mujeres con resultados anómalos en
el tamizaje que son negativos en la colposcopia / biopsia; c- predicción
del resultado de la terapia después del tratamiento de neoplasia
intraepitelial cervical (CIN); d- tamizaje o cribado primario de ADN del
HPV, solo o en combinación con una prueba de Papanicolaou, para
detectar precursores de cáncer cervical; e- obtener información valiosa
en la persistencia de ciertos tipos de VPH; f- investigaciones de tipo
específico de HPV, tanto regionales como de país, para proporcionar el
impacto global de la vacunación contra el HPV.
OBJETIVO: Validación del sistema HPV Direct Flow CHIP para la
detección y tipificación del virus del papiloma humano
METODOLOGIA: Para el análisis se utilizó un set de 15 muestras,
representativas de diferentes orígenes, genotipos y patologías, de una
población de pacientes del Hospital Italiano de Buenos Aires y cinco
muestras de referencia recibidas como parte de un “Prociency Survey”
del CAP Se comparó la técnica de secuenciación con HPV Direct Flow
CHIP. Este ensayo permite la tipificación de 36 genotipos clasificados
como de alto riesgo (16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59,
66, 68, 73 y 82) o bajo riesgo ( 6, 11, 40, 42, 44, 54, 55, 61, 62, 67, 69,
70, 71, 72, 81, 84 y 89). Estudios analíticos: Determinación del Límite de
detección y precisión Intra e Interensayo. Asimismo se evaluó la
sensibilidad y especificidad clínica sobre un panel de 16 muestras
considerando los estudios citológicos e histopatológicos.
RESULTADOS: De las 20 muestras evaluadas 6 resultaron negativas por
ambas metodologías con un 100% de especificidad diagnóstica, lo que
coincide con el alto valor predictivo negativo reportado. Las 14
muestras resultaron positivas por ambas metodologías. El límite de
detección: 10 copias por reacción, con una precisión del 100% intra e
inter-ensayo. Los datos citológicos e histológicos aportados por
médicos especialistas en Patología demostraron una sensibilidad y
especificidad clínica del 100% para lesiones de alto grado y carcinoma.
CONCLUSIONES: No hubo diferencias en cuanto al genotipo de alto
riesgo mayoritario presente en cada espécimen evaluado. En 5
muestras se observaron diferencias en cuanto al número de genotipos
detectados por ambos ensayos. Este hecho se explica debido a que el el
HPV Direct Flow CHIP es capaz de detectar todas las variantes
presentes en la muestra mientras que la secuenciación, si bien es
considerada estándar de oro, no es capaz de resolver muestras con
presencia de varios genotipos de HPV, brindando un resultado con el
genotipo mayoritario con frecuencia electroferogramas complejos que
son informados como HPV positivo no tipificable.
Sala D (Salón Rodin - 2º piso)
14:30 - 16:00 hs.
Biotecnología
0040
EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA ESTRUCTURAL DE CÁPSIDE VP6 DE
ROTAVIRUS HUMANO A EN EL SISTEMA BACULOVIRUS-CÉLULAS DE
INSECTO.
FC Raibenberg1, OR Pérez1, R Jurado1, AV Peralta2
1
Servicio de Vacuna antirrábica, Instituto Nacional de Producción de
Biológicos INPB, Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de
Salud, ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán,”, Argentina. 2 CONICET, Argentina.
Los rotavirus humanos grupo A (RV HA) son la causa más común de
gastroenteritis aguda en niños menores de 5 años. Se estima que más
de 450.000 niños mueren por esta enfermedad cada año a nivel
mundial. Las infecciones por RV HA continúan generando costos
directos significativos para los sistemas de salud. El uso de pruebas
diagnosticas comerciales de origen importado constituye una carga
económica considerable para estos sistemas en países en desarrollo. El
ensayo ELISA es la metodología de uso principal en el diagnóstico de RV
HA. El Servicio de Vacuna Antirrábica del INPB ANLIS Malbrán desarrolló
un ensayo diagnóstico ELISA para la detección de rotavirus A en heces,
de producción nacional que permitiría mejorar el acceso, a esta
tecnología diagnóstica. Con el fin de optimizar y complementar la
elaboración de los componentes del ensayo ELISA, se propuso la
producción local de la proteína estructural de cápside VP6 de RV HA
para su aplicación como antígeno control positivo del mencionado
diagnóstico.
Para expresar la proteína estructural de cápside VP6 humana A se
empleo el sistema de expresión baculovirus-células de insecto. La
secuencia completa del segmento 6 de RV HA que codifica para la
proteína VP6 se aisló por RT-PCR y se subclonó en el vector donante
pFastBac™1 del sistema Bac-to-Bac. Este sistema proveyó una manera
rápida y sencilla para la generación de baculovirus Autographa
californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV)
recombinantes AcVP6RVHA. La proteína VP6 recombinante se expresó
en altos niveles en células de insecto en cultivo. El análisis por SDS-
89
Libro de resúmenes
PAGE confirmó que posee un peso molecular de ~ 44 kD y que presenta
la misma movilidad que la proteína VP6 de rotavirus de simio SA11 de
referencia. La inmunodetección por western blot con un anticuerpo
policlonal anti RV HA y la evaluación mediante el ensayo ELISA, para la
detección de antígeno de rotavirus A en heces, corroboraron que la VP6
humana A recombinante producida en el presente estudio conserva su
capacidad antigénica.
Adicionalmente se realizó un estudio complementario para evaluar la
posibilidad de producir partículas similares a virus, VLPs 2/6 quiméricas
cuyo resultado demostró que cuando ambas proteínas estructurales de
cápside de rotavirus son coexpresadas a través de la co infección de
células Sf9 con los baculovirus recombinantes AcVP2SA11 y
AcVP6RVHA, la proteína VP2 SA11 de simio es capaz de interactuar con
la proteína VP6 humana A formando VLPs 2/6 quiméricas de doble capa
que se autoensamblan intracelularmente y que pueden ser purificadas
a partir de sobrenadantes de cultivos de células Sf9 co infectados.
Este trabajo demuestra que es factible producir localmente la proteína
estructural de cápside VP6 de rotavirus humano A, a partir de
aislamientos de Argentina usando el sistema de expresión baculoviruscélulas de insecto.
0049
EXPRESIÓN DE LA GLICOPROTEÍNA DEL VIRUS DE LA RABIA EN PICHIA
PASTORIS
LD Picotto1, GH Sguazza2, CM Galosi2 4, SF Cavalitto1 3, MR Pecoraro2
1
CONICET, Argentina. 2 Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias
Veterinarias, UNLP, Argentina. 3 Facultad de Ciencias Exactas, UNLP,
Argentina. 4 CIC, Pcia Bs As, Argentina.
La rabia es una zoonosis causada por un virus de la familia
Rhabdoviridae que afecta a animales domésticos y salvajes, y
mayormente se propaga al humano mediante mordeduras de perros
infectados. La prevención de la rabia humana puede lograrse mediante
vacunación masiva y control de perros callejeros. En Argentina, la
elaboración de vacunas contra la rabia se hace en ratones lactantes y
en cultivo celular, y tienen un gran riesgo operativo al manipular un
virus altamente peligroso. La proteína más antigénica del virus es la
glicoproteína G de la envoltura, por lo que una alternativa de
producción, para evitar el inconveniente mencionado anteriormente,
sería obtener la glicoproteína utilizando un sistema heterólogo como
Pichia pastoris, ya que es seguro, fácil de manipular y capaz de realizar
modificaciones post traduccionales similares a las realizadas en
eucariotas superiores.
El objetivo de este trabajo fue expresar la glicoproteína del virus de la
rabia en Pichia pastoris.
El inicio del trabajo consistió en una extracción del ARN viral a partir de
la cepa vacunal CVS que sirvió como molde para amplificar, por RT-PCR
con primers específicos, la secuencia nucleotídica que codifica para la
glicoproteína. La RT-PCR se chequeó mediante una electroforesis en gel
de agarosa. El producto de amplificación fue ligado al vector
pCRTOPO2.1. La ligación se comprobó por PCR con primers específicos
para la región M13, observándose la banda esperada en una
electroforesis en gel de agarosa. Posteriormente se sub-clonó el gen
dentro del vector pPIC9, con el inserto colocado bajo el control del
promotor AOX1 (inducible por metanol) y fusionado a una secuencia de
exportación capaz de secretar la proteína al medio de cultivo. La
construcción se chequeó por PCR con primers específicos para el gen
AOX1, arrojando la banda esperada por electroforesis en gel de
agarosa. El plásmido obtenido fue linealizado enzimáticamente y
transformado en Pichia pastoris GS115. Las colonias recombinantes
fueron visibles en medio selectivo. La transformación fue confirmada
por PCR con primers específicos para el gen AOX1 arrojando las bandas
esperadas. Finalmente, se secuenció el gen clonado y se hizo el análisis
de secuencia para corroborar su identidad frente a una base de datos,
mostrando una homología de secuencia superior al 99%.
Se realizaron cultivos en pequeña escala tomándose muestras de
sobrenadante para evaluar la expresión de la glicoproteína. Se midió el
nivel de expresión mediante Western Blot, observándose la banda
correspondiente a la glicoproteína.
Conclusión: Los resultados obtenidos confirman que el gen que codifica
para la glicoproteína antigénica del virus de la rabia fue exitosamente
clonado y expresado en el sistema de expresión P. pastoris. Este
resultado nos permite seguir avanzando en el desarrollo de una vacuna
para la profilaxis de esta enfermedad que sea segura, barata y efectiva.
0077
ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DE STOCKS DE VIRIONES BROTADOS DE
BACULOVIRUS CONGELADOS EN MEDIOS LIBRES DE SUERO
I Eberhardt, GA Micheloud, VV Gioria, JD Claus
Laboratorio de Virología, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas,
Universidad Nacional del Litoral, Argentina.
Los baculovirus (familia Baculoviridae) son virus específicos de
artrópodos cuyo ciclo replicativo se caracteriza por generar dos
progenies diferentes: los viriones ocluídos (OVs), que quedan retenidos
en los cuerpos de oclusión (OBs), y los viriones brotados (BVs). Los BVs
no sólo son empleados como stocks para la infección de cultivos
celulares destinados a la producción de OBs insecticidas, sino que
también se utilizan como vectores para la expresión de proteínas
recombinantes, producción de pseudo-partículas virales y terapia
génica, entre otras aplicaciones biotecnológicas. Por lo tanto, existe
interés académico e industrial en establecer protocolos optimizados
para la producción y almacenamiento de stocks de BVs, principalmente
en medios libres de suero por razones económicas y regulatorias. El
congelamiento a -80°C es un procedimiento bien establecido para la
preservación de los stocks de BVs producidos en medios
suplementados con suero, pero la escasa información disponible indica
que el congelamiento a la misma temperatura de los stocks producidos
en medios libres de suero provoca una reducción muy significativa de la
infectividad, cuya causa no ha sido aún establecida. Fue objetivo de
este trabajo investigar la estabilidad de la actividad infecciosa de stocks
de BVs del Virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Anticarsia
gemmatalis (AgMNPV) congelados a -80°C en medios libres de suero
suplementados con micromulsiones lipídicas. Los resultados obtenidos
demuestran que los stocks de AgMNPV producidos y almacenados en
distintos medios libres de suero, comerciales y no comerciales, reducen
su título infeccioso entre 48% y 91% luego de un ciclo de congelado de
6 meses a -80°C. Mediante ensayos factoriales se determinó que la
causa de tal pérdida de actividad infectiva en los stocks congelados
radica en la presencia de microemulsiones lipídicas en la composición
de los medios de cultivo libres de suero para células de insecto.
Además, se identificó a un componente de dichas microemulsiones, el
Polisorbato 80, como responsable principal del efecto inactivante.
Imágenes de microscopia electrónica de transmisión mostraron daños
estructurales que afectaron principalmente la envoltura de los BVs
congelados en medios suplementados con microemulsiones lipídicas,
que son compatibles con las propiedades surfactantes del Polisorbato
80. Esta información puede ser útil para mejorar la composición de los
medios de cultivo libres de suero de células de insecto, como así
también para optimizar los procedimientos de preservación de stocks
de BVs por congelación a temperaturas ultra-bajas.
0087
DESARROLLO DE UN ADENOVIRUS RECOMBINANTE NO REPLICATIVO
COMO CONTROL INTERNO DE PROCESOS DE VIROLOGÍA AMBIENTAL
Y ALIMENTARIA
MD Blanco Fernandez1, OA Taboga2, VA Mbayed1
1
Catedra de Virología, FFyB, UBA, Argentina. 2 Instituto de Virología,
INTA Castelar, Argentina.
Debido a su alta infectividad, persistencia en el medio y tolerancia a
tratamientos, los virus entéricos humanos son uno de los principales
agentes causales de enfermedades asociadas al consumo de alimentos
o aguas contaminados. La detección de estos virus en aguas y alimentos
se basa en la concentración y/o elusión de los virus desde matrices
sólidas o líquidas seguidas de técnicas moleculares para la detección de
ácidos nucleicos. No existe todavía un consenso acerca de los
protocolos a utilizar y la metodología desarrollada hasta el momento
presenta una alta variabilidad intra e interlaboratorios. A su vez, la
presencia de inhibidores en muestras ambientales y alimentos
interfiere en la detección y cuantificación de los virus presentes, lo que
hace necesaria la inclusión de controles internos virales que permitan
90
Libro de resúmenes
evaluar integralmente los diferentes procesos de la Virología ambiental
y de alimentos.
El objetivo del trabajo fue generar adenovirus recombinantes no
replicativos como controles internos de amplificación de genomas
virales y de procesos de Virología ambiental y alimentaria.
Se sintetizaron químicamente 2 construcciones con las regiones
genómicas apropiadas para la detección por PCR cuantitativa en tiempo
real [(q)PCR] de virus humanos que pueden encontrarse en el
ambiente. Una representa a virus con genoma ARN (enterovirus, virus
de hepatitis A, norovirus, virus de hepatitis E y rotavirus) y la otra
representa a virus con genoma ADN (adenovirus y poliomavirus). La
región de amplificación de cada virus se diseñó manteniendo el
tamaño, el porcentaje de GC y los sitios de hibridación cebadores de los
virus nativos pero modificando la secuencia interna de
complementariedad con sondas específicas.
Para la generación de partículas virales, se utilizó un vector basado en
adenovirus (CellBiolabsRAPAd® AdenoviralExpressionSystem). Las dos
construcciones se clonaron en el vector pacA5K-NpA y se
cotransfectaron junto a un vector “helper” (pacAd5 9.2-100) en células
HEK 293A utilizando un agente de transfección de polímeros catiónicos
(X-tremeGENE 9, Roche). La progenie viral obtenida se amplificó en esta
misma línea celular, que aporta la región genómica E1 que no está
incluida en el vector viral para impedir su replicación. Los stocks virales
generados se cuantificaron utilizando ensayos de dilución de punto
final, alcanzándose títulos en el orden de 109 TCID50/ml.
El adenovirus control obtenido en este trabajo permitirá la evaluación
de metodología aplicada a la detección de virus en agua y alimentos, así
como la eficiencia de extracción de ácidos nucleicos y de las (q)PCRs de
los virus entéricos incluidos en el diseño. Además, podrá incorporarse
de rutina a las muestras reales evaluadas para controlar la performance
de los procesos.
0125
ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DE VIRIONES BROTADOS DEL VIRUS DE
LA POLIEDROSIS NUCLEAR MÚLTIPLE DE ANTICARSIA GEMMATALIS
(AGMNPV) EN UN MEDIO DE CULTIVO LIBRE DE SUERO Y DE
COMPONENTES DE ORIGEN ANIMAL.
MF Legascue, GA Micheloud, VV Gioria, JD Claus
Laboratorio de Virología. Facultad de Bioquímica y Cs. Biológicas.
Universidad Nacional del Litoral, Argentina.
Introducción
Los baculovirus son virus específicos de artrópodos. Durante su
replicación se producen dos progenies: los viriones brotados (BVs) y los
viriones ocluidos (OVs). Contrariamente a la elevada estabilidad de los
stocks virales conservados en los medios de cultivo suplementados con
suero fetal bovino (SFB) se ha demostrado que, los BVs producidos en
cultivos libres de éste suplemento, y congelados a -80° C, pierden hasta
un 90% de su infectividad al cabo del primer descongelado. En el
laboratorio se diseñó un medio de cultivo libre de SFB, y de todo
componente de origen animal (UNL-9), que permite la proliferación de
la línea celular UFLAg-286 y la replicación del AgMNPV. En función de
éstos antecedentes, se propone estudiar la estabilidad de los BVs del
AgMNPV en el medio UNL-9 a distintas temperaturas de
almacenamiento.
Objetivos
Evaluar el efecto del proceso de congelado y descongelado sobre el
título de un stock de BVs, del AgMNPV producido en el medio UNL-9,
cuando la muestra se conserva a -80ºC.
Estudiar la estabilidad en el tiempo de un stock viral del AgMNPV
almacenado a 4ºC.
Metodología
Se utilizaron cultivos de la línea celular UFLAg-286 adaptada a los
medios UNL-9 y UNL-8 suplementado con 10% de SFB y stocks virales
producidos en ambos cultivos, cuyos títulos fueron calculados por el
método de dilución límite y punto final.
a) Se evaluó el efecto del congelado y descongelado sobre la
infectividad de los stocks virales. Los títulos fueron determinados antes
del congelado y después del descongelado, el que fue llevado a cabo de
manera rápida en un baño de agua a 37ºC y lenta en un baño de hielo.
b) Se titularon mensualmente, alícuotas de ambos stocks virales
conservados a 4ºC.
Resultados
A una temperatura de conservación de -80ºC, los mayores porcentajes
de inactivación viral fueron registrados en los stocks producidos en las
células adaptadas al cultivo en UNL-9. El medio de almacenamiento
libre de suero fue el factor que ejerció un efecto negativo
estadísticamente significativo sobre la estabilidad viral. En cambio, la
forma de descongelado y la asociación entre el tipo de medio de cultivo
y descongelado de los stocks sólo estuvo asociado a un ligero efecto
negativo, no significativo. Por otra parte, no se registraron cambios en
los valores de los títulos virales cuando los stocks fueron conservados a
4ºC.
Conclusión
El proceso de congelado y descongelado, de los stocks de BVs
almacenados en el medio de cultivo UNL-9 a -80°C, afectó
significativamente el título viral. Por el contrario, el valor del título de
los BVs producidos en los mismos cultivos no fue modificado cuando las
muestras no fueron congeladas. Como futuro trabajo se propone, el
estudio de la conservación de los stocks virales en nitrógeno líquido y a
-80°C, utilizando contenedores que permitan un descenso lento de la
temperatura, a fin de determinar si la velocidad de congelado influye
sobre la estabilidad de los BVs.
0178
VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA TIPO 1 (HIV-1):
OBTENCIÓN DE LA PROTEÍNA P24 RECOMBINANTE EN ESCHERICHIA
COLI Y EVALUACIÓN DE SU REACTIVIDAD INMUNOLÓGICA
MA Zak1, TA Teodoroff1, GS Braidot1, A Edelstein2
1
INEI-ANLIS "Dr. Carlos G. Malbrán", Argentina. 2 UOCCB-ANLIS "Dr.
Carlos G. Malbrán", Argentina.
El presente trabajo se desarrolló en el marco de una línea de
producción local de blancos moleculares que puedan ser utilizados
como materiales de referencia y/o para el diseño de herramientas
metodológicas aplicables al diagnóstico e investigación de la infección
por HIV.
Los objetivos fueron obtener la proteína p24 del HIV-1 en forma
recombinante (p24r) en E. coli, diseñar un ensayo que permita evaluar
su reactividad inmunológica y realizar un estudio comparativo de la
capacidad de detección de anticuerpos anti p24 del HIV-1 entre el
ensayo diseñado y un método confirmatorio comercial en línea (LIA).
A partir del ARN viral extraído de cepas circulantes en el país, se
optimizó la amplificación de la región codificante para la p24 del HIV-1
utilizando cebadores diseñados en base a una secuencia consenso
entre las correspondientes a cepas de la región publicadas en Genbank.
Se seleccionó el fragmento más representativo por análisis filogenético
de nucleótidos y homología de aminoácidos utilizando secuencias de
referencia de subtipos de HIV-1 y se clonó en el vector pRSET A para
originar la p24r fusionada a una cola de histidinas (HIStag). Luego de la
amplificación y purificación del vector recombinante en E. coli JM 109,
se transformó la cepa E. coli BL21 (DE3) pLysS por electroporación y se
confirmó la presencia del inserto de interés en las bacterias
seleccionadas por PCR de colonias y secuenciación. Se indujo la
expresión proteica y en alícuotas sonicadas del cultivo se observó la
mayor expresión a las 11 hs posinducción y que la p24r se localizó
principalmente en la fracción insoluble. La purificación de la p24r se
realizó en condiciones desnaturalizantes por cromatografía de afinidad
de metales. La proteína purificada se cuantificó (3,26 mg/200 ml de
cultivo) y se confirmó su identidad por estimación del peso molecular y
la reactividad frente a anticuerpos monoclonales específicos anti-HIStag
y anti-p24 de HIV-1. Para profundizar la evaluación de su reactividad
inmunológica, se analizaron plasmas de pacientes HIV positivos y de
controles negativos, ya caracterizados por LIA, por medio de un ensayo
de puntos diseñado y optimizado en el laboratorio. Este método fue
capaz de discriminar la presencia y la ausencia de anticuerpos anti p24
en las muestras de plasma: reacción de color franca en el 100% (30/30)
de las muestras que presentaron banda positiva para p24 (2+ a 4+) en
el LIA, no presentando reacción de color franca en ninguna de las 14
muestras cuyas bandas de p24 resultaron negativas en el LIA (10 de
pacientes HIV negativos y 4 de pacientes HIV positivos), observándose
así una buena correlación en la capacidad de detección de estos
anticuerpos entre ambos métodos.
91
Libro de resúmenes
De esta manera, se estandarizó la obtención homogénea y biosegura de
la p24r desnaturalizada de HIV-1 en un sistema de expresión procariota
en pequeña escala manteniendo su capacidad de reaccionar
inmunológicamente frente a los anticuerpos dirigidos contra la proteína
salvaje.
0211
USO DE INOSINAS EN PRIMERS GENERALISTAS PARA APLICACIONES
DE PCR EN ESTUDIOS POBLACIONALES DE VIRUS: EL CASO DE LOS
GENES PIFS Y BACULOVIRUS.
CS Turco, MN Belaich, PD Ghiringhelli
Laboratorio de Ingeniería Genética y Biología Celular y Molecular - Área
Virosis de Insectos, Universidad Nacional de Quilmes, Argentina.
Los baculovirus son patógenos virales con genomas dsDNA que infectan
lepidópteros, himenópteros y dípteros, siendo explotados
biotecnológicamente por sus interesantes propiedades biológicas. Una
de las aplicaciones más destacadas es su uso en el control biológico de
plagas, ya que poseen gran virulencia, posibilidad de generar epizootias
y alta especificidad hacia el hospedador donde multiplican. Se han
descripto decenas de especies, las cuales se clasifican en 4 géneros:
Alphabaculovirus (subdividido en Grupos I y II), Betabaculovirus,
Gammabaculovirus y Deltabaculovirus. Una particularidad que los
destaca es la ocurrencia de dos fenotipos durante el ciclo infectivo: los
viriones brotantes (BVs), de aparición temprana y asociados con la
infección sistémica; y los viriones derivados de los cuerpos de oclusión
(ODVs), de aparición tardía y vinculados directamente con la infección
primaria. Los ODVs infectan con alta especificidad las células
intestinales del hospedador susceptible, gracias a la presencia de
proteínas virales localizadas en la envoltura que se denominan PIFs (Per
os Infectivity Factors). Cabe señalarse que los 7 genes que las codifican
se encuentran en todos los genomas baculovirales analizados hasta la
fecha, revelando su rol esencial en la infección. Por esta cuestión, y por
ser el complejo proteico encargado del reconocimiento inicial al
hospedador, surge como atractivo el diseño de estrategias
experimentales que asistan en la realización de estudios poblacionales
sobre baculovirus.
En función de lo anterior, se diseñaron pares de primers para PCR con
el objetivo de recuperar fragmentos internos de todos los genes pifs de
cualquier alpha- y betabaculovirus, los miembros más abundantes de
Baculoviridae. Para ello, se realizaron alineamientos múltiples de las
secuencias nucleotídicas correspondientes, generándose en
consecuencia tres conjuntos de primers para cada pif: uno para
alphabaculovirus de Grupo I; otro para los ortólogos de Grupo II; y el
restante para betabaculovirus. Dada la alta variabilidad secuencial en
estos genes, se incorporaron en los oligonucleótidos inosinas en lugar
de ambigüedades con el fin reducir el tamaño poblacional.
Posteriormente, se realizó la puesta a punto de los ensayos de PCR para
cada juego de primers, utilizando como moldes distintos genomas
virales (AgMNPV, AcMNPV, RanuMNPV, DijuMNPV, SfMNPV, SeMNPV,
EpapGV y CpGV), algunos con secuencias completas y otros no. Así, se
lograron optimizar condiciones exitosas de reacción donde se pudo
corroborar la identidad de los productos de amplificación mediante su
clonado molecular y posterior secuenciación. También, se realizaron
inferencias filogenéticas que mostraron resultados similares a los
realizados con genomas completos, mostrando en consecuencia la
utilidad de la estrategia como primera aproximación en la clasificación
de un baculovirus, o como metodología para correlacionar el rango de
hospedador con las secuencias que portan en sus genomas.
0214
VECTORES BACULOVIRALES COMBINADOS: EXPOSICIÓN SUPERFICIAL
DE ANTÍGENOS Y TRANSDUCCIÓN DE GENES PARA LA PREVENCIÓN DE
LA FIEBRE HEMORRÁGICA ARGENTINA.
ML Pidre, M Sapir, S Haase, AE Ure, RM Gómez, V Romanowski
Instituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM, UNLP-CONICET),
Facultad de Ciencias Exactas, UNLP. Calle 115 y 49, (1900) La Plata,
Argentina.
Los baculovirus son virus envueltos cuyo genoma consiste en una
molécula de DNA doble hebra de entre 80 kpb hasta 180kpb. La
estrategia de baculovirus display apunta a la obtención de memoria
inmunológica dependiente de baculovirus y se basa principalmente en
la exposición de uno o más epítopes de interés en la forma de un
polipéptido quimérico fusionado a la proteína transmembrana
mayoritaria de los viriones brotantes, GP64. Con algunas
modificaciones esta estrategia permite expresar los genes
seleccionados en células de mamíferos utilizando a los baculovirus
recombinantes (recBVs) como vehículos de transducción, permitiendo
la generación de una respuesta celular específica, además de humoral.
De allí nuestro interés en desarrollar un sistema de este tipo para el
abordaje de la prevención de la fiebre hemorrágica argentina (FHA).
Inicialmente se amplificó el gen completo de gp64 por PCR y se clonó el
producto de amplificación en el vector pCR4-TOPO. Se modificó el gen
de gp64 por PCR con el objetivo de incorporar sitios de clonado en el
marco de lectura de la glicoproteína. Con el fin de desarrollar un
sistema rápido y versátil para la obtención de recBVs, se utilizó como
material de partida el vector de transferencia pBAcPak9 del sistema de
recombinación bAcGOZA. En ese contexto, se clonó el gen modificado
de gp64 en dicho vector de transferencia. El vector resultante fue
denominado pBAcDis. Asimismo, se amplificó por PCR la secuencia
completa de la subunidad G1 de la glicoproteína de superficie del virus
Junín (JUNV). De forma complementaria, se realizó un análisis
bioinformático para predecir los sitios de interacción de la subunidad
G1 de JUNV con su receptor y utilizar ese fragmento como posible
inmunógeno. Posteriormente se obtuvo por PCR el fragmento de 120
pb (G1PD) predicho in silico. Finalmente, los fragmentos
correspondientes a G1 y G1PD fueron clonados en el vector de
transferencia generado anteriormente.
Además, se utilizaron dos construcciones adicionales constituidas por el
ORF completo de la glicoproteína GPC de JUNV clonada en el vector
pBAcPak9, bajo el control del promotor de la poliedrina baculoviral y
bajo el control del promotor del gen ie1 de citomegalovirus
respectivamente.
A continuación, se co-transfectó el DNA del bácmido bAcGOZA y las
construcciones plasmídicas mencionadas como complejos formados
con lípidos catiónicos. De este modo se obtuvieron los recBVs y se
confirmó por PCR la incorporación de los genes heterólogos.
Posteriormente, se infectaron células de insecto High Five o células de
mamífero Vero (según corresponda) con los recBVs y se evidenció la
expresión de las proteínas recombinantes por SDS-PAGE, western blot,
ELISA, inmunofluorescencia y citometría de flujo.
La obtención de estos recombinantes permitirá en el corto y mediano
plazo la utilización de los mismos como vectores de vacunación de
modelos animales con el objetivo de desarrollar una alternativa a la
vacuna ya existente contra la FHA.
0218
DESARROLLO DE UN SISTEMA BASADO EN PCR DE TIEMPO REAL PARA
LA DETECCIÓN Y SEROTIPIFICACIÓN DEL VIRUS DENGUE
HL Urán Landaburu1, DL Mengual Gómez2, PD Ghiringhelli1, M Bilen1
1
Universidad Nacional de Quilmes, Laboratorio de Ing. Genética y
Biología Celular y Molecular, Argentina. 2 Productos Bio-Lógicos S.A,
Argentina.
La fiebre del Dengue es una enfermedad endémica en Sudamérica. En
2014 se han confirmado, según datos de la Organización Panamericana
de la Saud, más de 600.000 casos tan solo en Argentina, Brasil,
Paraguay, Chile y Uruguay.
El agente etiológico de la fiebre del Dengue es un virus perteneciente a
la familia Flavivirdae conocido como Virus Dengue. Éste presenta 4
serotipos distintos.
En Argentina, las metodologías de diagnóstico más utilizadas se basan
en ensayos serológicos, cultivo celular en células C6/36, o análisis
molecular mediante RT-PCR. El empleo de metodologías de PCR en
tiempo real para la detección del Dengue, tiene una aplicación limitada
en los centros de salud de nuestro país debido a los altos costos de los
reactivos y el equipamiento necesario.
Este trabajo presenta el desarrollo de un sistema de detección basado
en qPCR, donde se utilizaron primers y sondas de diseño original y
componentes de reacción producidos localmente.
Los primers y sondas utilizadas fueron diseñados a partir de un análisis
bioinformático exhaustivo, contemplando 80-90 secuencias de
92
Libro de resúmenes
genomas completos de cada serotipo viral, en el que se detectaron
potenciales regiones de interés para ensayos moleculares. Se utilizó
esta información para generar oligonucleótidos consenso y serotipoespecíficos. A su vez, se generaron clones de cDNA de cada serotipo
viral correspondientes a las regiones reconocidas como blanco. Dichos
clones fueron utilizados como molde de PCR durante el subsiguiente
proceso de evaluación de la especificidad, sensibilidad y estabilidad del
sistema. Por otro lado, para evaluar la eficiencia general, se comparó la
mezcla de reacción contra otros productos comerciales.
Como resultado de este trabajo se destaca la obtención de un sistema
optimizado para la detección y sero-tipificación del virus Dengue,
utilizando una mezcla de reacción diseñada ad hoc y valiéndose de
componentes originales y producidos localmente. El sistema mostró un
100% de especificidad de serotipo y una sensibilidad suficiente para la
detección de 10-100 moléculas blanco. Adicionalmente, las pruebas de
estabilidad mostraron que la mezcla de reacción desarrollada conserva
sus propiedades hasta 6 meses (almacenada a -20ºC) y los análisis
comparativos resultaron satisfactorios, presentando una eficiencia
comparable a la obtenida con otros productos comerciales.
0223
CARACTERIZACIÓN DE UN AISLAMIENTO ARGENTINO DEL
GRANULOVIRUS DE SPODOPTERA FRUGIPERDA, SFGV
KB Sabalette1, J Niz2, R Salvador2, A Sciocco-Cap2, V Romanowski1, ML
Ferrelli1
1
Instituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM-UNLP-CONICET),
Argentina. 2 Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola - INTA
Hurlingham, Argentina.
La oruga militar tardía, Spodoptera frugiperda, es una plaga importante
del cultivo de maíz en nuestro país y resto de América. Una de las
estrategias utilizadas para su control, además del uso de insecticidas
químicos, ha sido la utilización de maíz transgénico que expresa la
toxina Cry 1F (maíz Bt). Recientemente se han informado casos de
resistencia en Brasil y Puerto Rico. Una alternativa para el control de
esta plaga surge del uso de baculovirus, una familia de virus específicos
de insectos. El nucleopoliedrovirus SfMNPV (género Alfabaculovirus) y
el granulovirus SfGV (género Betabaculovirus) solo infectan S.
frugiperda. Diferentes aislamientos de SfMNPV han sido probados con
éxito como bioinsecticidas mientras que SfGV podría ejercer una acción
sinérgica con alfabaculovirus. Existen escasos reportes sobre SfGV, y
recientemente se dio a conocer el primer genoma de un aislamiento de
este virus, aislado en Colombia. En este trabajo, nos propusimos
caracterizar un aislamiento de SfGV autóctono (SfGV-ARG) (Castelar,
Buenos Aires) conservado en la colección del IMYZA y compararlo con
otros aislamientos del virus.
El SfGV-AR fue amplificado en larvas de S. frugiperda de cuarto estadio.
A partir de un macerado de larvas muertas, se purificaron los cuerpos
de oclusión (OB). Se realizó un SDS PAGE para analizar el perfil proteico
de los OBs. Además se extrajo su DNA, el que se utilizó como molde
para PCRs y para digestión con enzimas de restricción. Se amplificaron
regiones de los genes de granulina, lef-8 y lef-9 con primers
degenerados de la familia Baculoviridae. Los fragmentos de PCR se
purificaron a partir de gel de agarosa y se secuenciaron. Las secuencias
obtenidas fueron analizadas por blastn y se utilizaron para comparar
con las de otros baculovirus mediante análisis filogenético. Se realizó el
análisis del patrón de restricción de DNA con las enzimas EcoRI, BamHI,
HindIII y BglII.
El perfil proteico por SDS-PAGE mostró la presencia de una proteína
mayoritaria de los OBs en aproximadamente 29 kDa, lo que concuerda
con el peso molecular de las granulinas de todos los GVs. Las secuencias
parciales obtenidas se analizadas por blastn, obteniendo un alto
porcentaje de identidad (>98%) con las secuencias de otros
aislamientos de SfGV. Luego estas se utilizaron para realizar
alineamientos con sus homólogas del género Betabaculovirus. Los
alineamientos concatenados se utilizaron para analizar las distancias
por el modelo Kimura-2-parameter que confirmó que nuestro
aislamiento se trata de la especie SfGV. Además se analizó la filogenia
por Minumum Evolution y Maximum Likelihood lo que permitió
relacionar a SfGV-ARG con el resto de los betabaculovirus, indicando
que el más cercano evolutivamente es el aislamiento SfGV A12-4. El
análisis de restricción permitió estimar el tamaño del genoma en 136
Kpb.
La caracterización de este granulovirus tanto a nivel molecular como
biológico nos permitirá evaluarlo para su uso en el control biológico de
plagas.
0231
CONSTRUCCIÓN DE BIBLIOTECAS DE ANTICUERPOS DE DOMINIO
ÚNICO DERIVADOS DE CAMÉLIDOS (VHH O NANOANTICUERPOS) Y
OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA LA CEPA A24/CRUZEIRO DEL
VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA
V Grippo, J De Nicola, J Bozzo, N Mattion
Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein, Argentina.
Introducción. La Fiebre Aftosa plantea necesidades importantes no
satisfechas que exigen enfoques innovadores. Debido a sus
propiedades únicas en comparación con los anticuerpos
convencionales, los Nano-anticuerpos o VHH han revolucionado el
campo de los anticuerpos monoclonales y presentan un gran potencial
en el desarrollo de nuevos métodos diagnósticos más sensibles y
específicos. Esto se debe a que los VHHs permiten fijar una mayor
densidad de anticuerpos incrementando la sensibilidad en el
diagnóstico al detectar concentraciones significativamente menores de
un antígeno. Por esta razón, el presente trabajo tiene como objetivo
obtener y producir Nano-anticuerpos contra la cepa A24/CRUZEIRO del
virus de la Fiebre Aftosa para ser utilizados en la innovación y mejora
del diagnóstico de esta infección viral.
Metodología y resultados. Para lograr tal objetivo, dos llamas (Lama
glama) fueron inmunizadas 3 veces cada 2 semanas con la cepa
A24/CRUZEIRO (SENASA). Se comprobó la inducción de una alta
respuesta inmune por ELISA en fase líquida, el título fue menor a 1.10
para el suero pre-inmune y alcanzó después de las inmunizaciones un
valor de 3.70 y 4.55 para la llama S y B, respectivamente. A partir de la
sangre total periférica de estas llamas inmunizadas, se preparó ARN
total y se sintetizó el ADNc. En una primera PCR, se amplificaron las
regiones variables de cadenas pesadas tanto de anticuerpos
convencionales (VH, producto de 900bp) como de anticuerpos de
cadena única (VHH, producto de 700bp). En una segunda PCR, se
amplificó solo el repertorio de VHH (400bp) y se introdujeron los sitios
de restricción para su posterior clonado. Los fragmentos VHH fueron
clonados en el vector pHEN4 y tales construcciones se electroporaron
en la cepa E. coli TG1 obteniéndose 2 bibliotecas inmunes de Nanoanticuerpos. En ambos casos, su tamaño fue mayor a 107 ufc/ug y el
porcentaje de clones con inserto completo determinado por “colonyPCR” fue superior a 92%. Luego, se procedió al rastreo de las
bibliotecas aprovechando la afinidad de los fagos que expresan los VHH
por la cepa A24/CRUZEIRO. Después de la segunda ronda de selección,
se obtuvieron fagos expresando en su superficie los VHHs que
reconocieron a la cepa en ELISA de fagos policlonal y monoclonal. La
diversidad de los clones fue analizada por digestión enzimática con
HinfI y posterior secuenciación. Luego, se indujo la expresión de los
VHHs en forma soluble a partir de los clones seleccionados y se
confirmó la reactividad específica de los anticuerpos solubles contra la
cepa A24/CRUZEIRO por ELISA en fase líquida.
Conclusiones. Este trabajo presenta la primera obtención y
caracterización de Nano-anticuerpos contra la cepa A24/CRUZEIRO del
virus de la Fiebre Aftosa, lo cual constituye una herramienta innovadora
como base para el desarrollo y mejora del diagnóstico de esta infección
viral.
0232
BÚSQUEDA DE PATRONES PARA LA IDENTIFICACIÓN DE SEÑALES DE
LOCALIZACIÓN NUCLEAR EN PROTEOMAS DE BACULOVIRUS.
CS Cerrudo, SAB Miele, MN Belaich, PD Ghiringhelli
LIGBCM-AVI, Universidad Nacional de Quilmes, Argentina.
Los baculovirus son virus de insectos con genoma de DNA circular doble
cadena de 80 a 180 kpb, ampliamente estudiados por sus múltiples
aplicaciones biotecnológicas. Previamente en nuestro laboratorio se
identificaron 37 genes esenciales (core genes), con ortólogos en 74
genomas baculovirales completamente secuenciados, de entre más de
93
Libro de resúmenes
800 existentes en la familia. Persiguiendo objetivos similares, en este
trabajo se pretende comenzar con predicciones proteómicas.
En distintos estudios se han identificado y caracterizado potenciales
Señales de Localización Nuclear (NLS, por sus siglas en inglés) en
proteínas baculovirales, principalmente en Autographa californica
MNPV (AcMNPV). Sin embargo, las NLS caracterizadas no han sido
identificadas en las proteínas ortólogas de las otras especies. En este
sentido, el objetivo final del trabajo es disponer de patrones
formulados de acuerdo a reglas sintácticas estándar (por ej. del tipo
PROSITE), perfiles numéricos o modelos de Markov que permitan
identificar NLSs en proteomas baculovirales novedosos. En la búsqueda
de un patrón secuencial genérico hemos analizado el subconjunto del
proteoma baculoviral cuyos miembros desarrollan funciones dentro del
núcleo y tienen alguna NLS con caracterización experimental. El trabajo
se ha desarrollado en un esquema iterativo, donde las NLS de las
proteínas Polh, BV/ODV-C42, IE1, LEF-3, LEF-11, DNApol (caracterizadas
en AcMNPV), y BM47 (caracterizada en Bombyx mori NPV) fueron
enriquecidas con las secuencias correspondientes al resto de los
baculovirus. Mediante el PSI-BLAST se recuperaron las secuencias
aminoacídicas correspondientes a cada grupo de proteínas a partir de
los proteomas de los 74 genomas completos (2014). Para cada
subconjunto se realizó un alineamiento múltiple utilizando el PSICoffee. Luego de una verificación y corrección manual se
confeccionaron patrones tipo PROSITE que permitieron detectar las NLS
de las 7 proteínas mencionadas en los proteomas de los diferentes
Baculovirus (ejemplos en Tabla I). El empleo de dichos patrones en
proteomas novedosos permitirá la asignación tentativa de
función/funciones a las proteínas teóricas identificadas, las cuales
podrán ser evaluadas experimentalmente a posteriori. De este modo,
se avanza en la propuesta de herramientas predictivas para la
caracterización de nuevos genomas baculovirales.
Tabla I.
Proteína NLS original
Patrón NLS
Polh
32
[KN]-[RK]-[KRQT]-[KREH]
BV/ODVC42
357
K-[RK]-[KRVTALYNFCS]-[KR]
IE1
KRKK35
KRKK360
Alfabaculovirus: H-[HYFV]-[VMIL]-[FLY][NASKRV]-[ILM]-[SNKVIG]-[NKRSTP]-[TSNVLGC][NSTGI]-R-[RK]
534 537 538
K, R, R
Betabaculovirus: H-[AISTMN]-[EVN]-[TV][VTSM]-[KR]-[LHF]-[IV]-[ILM]-[RK]-Y-[IV]-[LMVI][EQS]-[RGS]-R
0239
PRODUCCIÓN Y EVALUACIÓN DE ANTICUERPOS IGY DE GALLINA ANTIIGG DE BOVINO CONJUGADOS A PEROXIDASA DE SOJA
GD Asenzo1, G Gutiérrez1, G Levin2, L Bracco2, V Parreño1, K Trono1, MV
Miranda2, A Wigdorovitz1
1
Instituto de Virología, CICVyA, INTA Castelar, Argentina. 2 Depto. de
Microbiología, Inmunología y Biotecnología, FFyB, UBA., Argentina.
Introducción: Los anticuerpos conjugados a peroxidasa son utilizados
rutinariamente en diagnóstico. Su producción es sencilla, sin embargo
es necesario el sangrado de animales para la obtención de los
anticuerpos y disponer de la enzima en cantidad y bajo costo para su
marcación. Para superar estas limitaciones, nos planteamos producir
anticuerpos IgY anti-IgG bovino (H+L) a partir de yema de huevo y
purificar peroxidasa a partir de la cáscara de soja (SbP), para finalmente
conjugar estas moléculas.
Metodología: Se hiperinmunizaron gallinas de raza Brown Nick con IgG
bovina durante 2 meses. Se comprobó la respuesta inmune en los
animales. Se recolectaron los huevos, se separó la yema y se extrajo la
fase soluble de la yema por dilución en H2O y congelación. Se precipitó
la IgY con sulfato de amonio y se purificaron los anticuerpos específicos
por cromatografِía de afinidad a IgG bovina. Paralelamente, se purificó
la SbP por cromatografía de intercambio iónico y de interacción
hidrofóbica. Se conjugó la IgY a la SbP por medio de una reacción con
periodato de sodio y una vez obtenido el conjugado IgY-SbP, se lo tituló
en el ELISA indirecto para Leucosis Bovina Enzoótica (LBE), ensayo ya
estandarizado en nuestro Instituto, en diluciones seriadas; para de esta
manera analizar su performance. Por último, se analizaron muestras de
campo utilizando un conjugado comercial y el producido en nuestro
laboratorio.
Resultados: Se logró obtener por medio de una hiperinmunización de
gallinas un título de anticuerpos IgY anti-IgG de bovino con una dilución
1/262000 a punto final del suero. Se obtuvo un rendimiento de 2 mg de
IgY específica por huevo. Se puso a punto la conjugación de esta IgY con
la SbP, usando 160 mM NaIO4 para la oxidación de la enzima y 100 mM
de NaBH4 para el bloqueo de la reacción. Se comprobó la marcación de
la inmunoglobulina en una placa de ELISA sensibilizada con IgG de
bovino. Se analizó la eficiencia de la marcación por medio de un SDSPAGE. El conjugado alcanzó una dilución de uso 1/1000 en el ELISA para
LBE. La comparación estadística de los resultados utilizando muestras
de campo mostró que el conjugado IgY-SbP tuvo un comportamiento
semejante al conjugado comercial.
Conclusiones: Se logró estandarizar el protocolo de marcación de las
IgY. Se alcanzó una eficiencia de marcación y un título de uso
comparable a las observadas en anticuerpos marcados con peroxidasa
comercial. Se consiguió realizar el primer lote de anticuerpos
conjugados IgY de gallina anti-IgG de bovino. Se empleó este reactivo
en el ELISA estandarizado de LBE con resultados promisorios. Estos
resultados positivos son un aliento para la evaluación del conjugado en
otros métodos de diagnóstico en que se use anticuerpos anti-IgG
bovina conjugado a peroxidasa. En un primer ensayo realizado con este
reactivo, se obtuvo una performance aceptable para el uso en el
laboratorio.
0251
DESARROLLO DE VHH RECOMBINANTES CONTRA NOROVIRUS PARA
ELABORAR UN MÉTODO DIAGNÓSTICO
A Aguilar1, L Garaicoechea1, M Bok1, G Canziani3, K Bok2, K Green2, V
Parreño1
1
Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria, Argentina. 2 National
Institute of Health, Estados Unidos. 3 Instituto Leloir, Argentina.
Norovirus genera brotes pandémicos de gastroenteritis en humanos de
todas las edades, llegando a ocasionar miles de muertes por año. El
cuadro clínico incluye vómitos, fiebre, calambres abdominales y diarrea
aguda. En la actualidad es difícil encontrar un método de diagnóstico
antigénico rápido y con aceptable sensibilidad. Los anticuerpos
recombinantes VHH son moléculas de 15KDa que por su pequeño
tamaño y por estar formados por una sola cadena polipeptídica poseen
características diferenciales a los anticuerpos convencionales. En
nuestro grupo de trabajo realizamos dos bibliotecas de genes VHH
específicas para Norovirus de los genotipos GI.1 y GII.4. A partir de
estas seleccionamos VHH específicos para cada genotipo.
Con el objetivo de obtener VHH que sean útiles para realizar un test
diagnóstico se evaluó las capacidades de cruzamiento de los VHH
seleccionadas con cepas de distintos genotipos, pero de igual
genogrupo. A continuación, se realizó el mapeo epitópico de un
anticuerpo VHH que mostró actividad cruzada y se determinaron sus
afinidades por Resonancia Plasmática de Superficie empleando un
equipo biosensor. Por otro lado, con el objetivo de seleccionar
anticuerpos que crucen entre ambos genogrupos se realizó la técnica
de biopaneo sobre las bibliotecas de VHH utilizando en el proceso de
selección VLPs (partículas de virus vacías) del genotipo GI.1 y GII.4 en
forma secuencial.
Como resultado se observaron, por técnica de ELISA, distintos grados
de cruzamiento de los VHH con cepas pertenecientes a distintos
genotipos. Los VHH específicos para el genotipo GI.1 mostraron alta
afinidad, en el orden nanomolar, pero no lograron reconocer todos los
genotipos testeados. Por su parte, uno de los nanoanticuerpos que
reconoció al genotipo GII.4 mostró cruzamiento con las VLPs de todos
los genotipos ensayados dentro del genogrupo GII. Este mismo VHH
presentó elevada afinidad por VLPs del genotipo GII.4, con una KD de
40 picomolar y reconoció un epítope lineal ubicado en el dominio P de
VP1, entre los aminoácidos 517 y 528, según los resultados del mapeo
epitópico. A su vez, de aquellos biopaneos secuenciales con VLPs de
distinto genogrupo, se logró obtener un nanoanticuerpo VHH con
capacidad de reconocer simultáneamente cepas de los genogrupos GI y
GII.
94
Libro de resúmenes
En base a estos resultados, concluimos que los anticuerpos VHH poseen
un elevado potencial para diseñar una herramienta diagnóstica para la
detección de Norovirus, gracias a su elevada afinidad, especificidad y a
su vez capacidad de entrecruzamiento entre distintos genogrupos.
Actualmente se están realizando estructuras multiméricas de estos
VHH con el objetivo de aumentar el grado de entrecruzamiento y la
afinidad por los antígenos.
0297
OPTIMIZACIÓN DE LA INCLUSIÓN DE PROTEÍNAS DE INTERÉS EN
CUERPOS DE OCLUSIÓN DE BACULOVIRUS
MG López1 2, HM Pallarés1, V Alfonso1 2, O Taboga1 2
1
Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA Castelar, Argentina. 2
CONICET, Argentina.
Los baculovirus son virus de insectos usados principalmente en el
control biológico de plagas y la expresión de proteínas recombinantes.
La característica de estos virus de generar estructuras de resistencia
llamadas cuerpos de oclusión (OBs o poliedros) conformados
mayoritariamente por la proteína poliedrina (POLH), los hace
especialmente atractivos desde el punto de vista biotecnológico.
El objetivo de este trabajo consiste en desarrollar un método de
obtención de poliedros quiméricos mediante fusiones traduccionales
entre poliedrina y proteínas de interés, de manera de producir altos
rendimientos de proteínas recombinantes fácilmente purificables a
bajo costo, en un sistema eucariota. Para ello se diseñaron y obtuvieron
baculovirus que expresan las fusiones POLHpprGFP o ΔPOLHpprGFP,
siendo ppr un sitio de clivaje para la proteasa PreScission (GE), POLH la
proteína poliedrina completa y ΔPOLH, el fragmento comprendido
entre los aminoácidos 19 a 110 de poliedrina. Para aumentar la
probabilidad de formación de poliedros que incorporan proteínas, se
coexpresó una copia adicional del gen poliedrina salvaje. Se ensayaron
distintas condiciones de infección aportando esa copia en cis (en el
genoma del baculovirus, polh+) o en trans (aportada por líneas
celulares que expresan polh). Así, se determinó que la mayor
proporción de poliedros fluorescentes se obtiene cuando se infectan
líneas trans-empaquetadoras con el baculovirus AcPOLHpprGFP de
genotipo polh+. En particular, la línea que mostró mayor producción de
poliedros quiméricos al ser infectada fue la Sf9POLHmut, que expresa
una copia de poliedrina mutada en el residuo de aminoácido 44 que
genera poliedros de mayor tamaño y con escasa oclusión viral. Las
infecciones con el baculovirus AcΔPOLHpprGFP incorporaron solo
trazas de la fusión. Los poliedros quiméricos obtenidos bajo las
condiciones de infección mencionadas fueron aislados en base a su
insolubilidad a pH neutro y alto coeficiente de sedimentación y
analizados en su composición de manera cualitativa por Western blot,
demostrando la presencia de la proteína quimérica y escasa presencia
de viriones ocluidos. La proteína GFP quimérica presente en los
poliedros disueltos con Na2CO3 fue eficientemente reconocida en
ensayos de ELISA, demostrando que la fusión a poliedrina no afectó su
reconocimiento inmunológico. Asimismo, los poliedros disueltos
tratados con la proteasa PreScission dieron altos rendimientos de
proteína GFP soluble. En conjunto, estos resultados alientan el
potencial uso de este sistema como herramienta de expresión y
purificación de antígenos de interés en el sistema baculovirus.
0321
DESTINO DEL GENOMA DE LOS BACULOVIRUS EN LA INFECCIÓN DE
CÉLULAS NO INMUNES DE MAMÍFERO
S Amalfi1 3, GN Molina1 2, E Tavarone1 2, O Taboga1 2, V Alfonso1 2
1
Instituto de Biotecnología, CICVyA INTA, Argentina. 2 CONICET,
Argentina. 3 ANPCyT, Argentina.
Los baculovirus son virus que infectan insectos, con aplicaciones
biotecnológicas que incluyen la producción de proteínas recombinantes
y el control biológico de plagas. La infección de células de mamífero con
baculovirus es no productiva, lo que ha permitido su utilización en el
delivery de genes y el desarrollo de vacunas de nueva generación.
Además, en los últimos años se han descripto las propiedades
antivirales y adyuvantes de los baculovirus. Los cambios fenotípicos que
sufren las células de mamífero tras la infección con estos virus no han
sido lo suficientemente estudiados, siendo la respuesta inmune innata
el efecto más frecuentemente encontrado. Se ha demostrado la
importancia del receptor TLR-9 como inductor de esta respuesta en
células dendríticas; sin embargo, también ha sido descripta la
producción de interferones de tipo I (IFN-I) por vías independientes de
este receptor en células no inmunes. Los mecanismos inductores de la
síntesis de IFN-I en células no inmunes de mamíferos en respuesta a
infecciones virales están mediados por la detección de ácidos nucleicos
no propios en el citoplasma, a través de la participación de moléculas
como RIG-I, MAD5 y STING. En este marco, nuestro objetivo general es
estudiar el impacto de los ácidos nucleicos de los baculovirus en la
generación de un estado antiviral en células no inmunes infectadas. En
particular, nos proponemos evaluar la presencia y proporción de ADN
viral en el citoplasma de células de mamífero no inmunes respecto del
ADN que alcanza el núcleo. Para ello, construimos baculovirus
recombinantes y realizamos ensayos de infección en células BHK
evaluando la expresión de genes reporteros a partir de promotores
reconocidos por las maquinarias transcripcionales nuclear o
citoplasmática de células de mamífero, aportada en este último caso en
trans por coinfección con un virus Vaccinia-T7ARNpol. Los resultados
mostraron que la proporción de genomas baculovirales disponibles
para ser transcriptos en el citoplasma es mucho mayor que el ADN viral
que llega al núcleo y puede ser templado para la expresión de genes.
Así, la elevada cantidad de ADN baculoviral presente en el citoplasma
de las células no inmunes puede impactar en receptores de ácidos
nucleicos en forma directa o a través de su transcripción
citoplasmática, dando lugar a la producción de interferones de tipo I en
respuesta a la infección por baculovirus. Conocer el destino mayoritario
del ADN baculoviral en células de mamífero permitirá el diseño de las
estrategias más convenientes para la manipulación del genoma del
virus con el fin de modificar la respuesta de las células a la infección.
0323
ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LA HEMAGLUTININA DEL VIRUS DEL
SARAMPIÓN EN UN SISTEMA DE GENERACIÓN DE VLPS IMPULSADO
POR LA PROTEÍNA Z DEL VIRUS JUNÍN
AF De Ganzó1, AL Belizan2, CS Borio1, MS Collado1, MH Argüelles2, SE
Goñi1, ML Lozano1
1
Laboratorio de Ingeniería Genética y Biología Celular y Molecular
(LIGBCM), Área de Virosis Emergentes y Zoonóticas (AVEZ), Instituto de
Microbiología Básica y Aplicada (IMBA), DtoCyT, Universidad Nacional
de Quilmes, Bernal, Argentina., Argentina. 2 Laboratorio de Inmunología
y Virología (LIV), Instituto de Microbiología Básica y Aplicada (IMBA),
DtoCyT, Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.,
Argentina.
La proteína Z de los arenavirus presenta tres dominios principales: una
región amino terminal que contiene la señal para la modificación por
miristoilación y anclaje a membrana; un dominio RING central y una
región carboxilo terminal en la cual se identificaron dominios tardíos
(LD, Late Domains) altamente conservados en proteínas matriz virales.
Los LD poseen la capacidad de interaccionar con componentes de la
maquinaria celular de direccionamiento proteico vacuolar que median
el tránsito endosomal, e iniciar el proceso de brotación viral. Esta
capacidad de dirigir el proceso de brotación es autónoma incluso en
ausencia de otras proteínas del virión, siendo útil para generar
partículas tipo virales (VLPs, Virus-Like Particles). Las VLPs son de
utilidad como herramienta biotecnológica debido a su estructura y
morfología: están formadas por proteínas estructurales con capacidad
de autoensamblarse e imitar la estructura viral, carecen de infectividad
al no poseer genoma y son capaces de brotar de manera autónoma.
Asimismo, las VLPs derivadas de virus envueltos se presentan como una
alternativa segura y eficiente para vehiculizar antígenos de naturaleza
proteica. En trabajos previos en nuestro laboratorio se ha demostrado
que la proteína Z del virus Junín fusionada a la proteína fluorescente
verde (GFP, Green Fluorescent Protein) conserva la capacidad de
brotación autónoma en sistemas de expresión eucariota (mamíferos e
insectos) y que las VLPs producidas estimulan una respuesta inmune en
ratones inoculados.
Las construcciones diseñadas en este trabajo incluyen el clonado de las
proteínas Z y la hemaglutinina del virus del sarampión (HA) en vectores
individuales, una fusión entre ambas en un único plásmido y el clonado
95
Libro de resúmenes
del ectodominio de la HA (ETD-HA) en un vector presentador de
antígenos en proceso de diseño en nuestro laboratorio. Luego de los
ensayos de transfección y co-transfección transitoria, se sometieron las
monocapas de cultivo a ensayos de inmunodetección con anticuerpos
específicos a fin de evaluar la expresión de las diferentes variantes.
Además, para comprobar la capacidad de este sistema de generar VLPs
quiméricas, se ultracentrifugó el sobrenadante de cultivo y se
sometieron las diferentes muestras a ensayos de inmunodetección con
anticuerpos específicos idénticos a los utilizados en las monocapas
respectivas.
Estos ensayos dieron como resultado la detección de diferentes
proteínas heterólogas conteniendo Z y HA, tanto en las monocapas de
cultivos como en los sobrenadantes.
Los resultados preliminares confirmarían que la capacidad de la
proteína Z de dirigir el proceso de brotación se conserva aún en
fusiones proteicas que incluyen no solo eGFP sino también proteínas
virales con propiedades antigénicas y, sumados a ensayos de
inmunización exitosos en animales de laboratorio, permitirían iniciar el
desarrollo de una herramienta biotecnológica para ensayar la
vehiculización de antígenos de importancia epidemiológica.
0324
ANÁLISIS DE LA SEÑAL DE MIRISTOILACIÓN DE LA PROTEÍNA Z DEL
VIRUS JUNÍN EN CÉLULAS DE INSECTO.
CS Borio2, CS Turco1, MF Bilen1, ME Lozano2
1
Universidad Nacional de Quilmes - LIGBCM-AVI, Argentina. 2
Universidad Nacional de Quilmes - LIGBCM-AVEZ, Argentina.
La proteína Z del virus Junín posee en su extremo N-terminal una señal
consenso, conservada en los miembros de toda la familia Arenaviridae,
para la adición de un ácido mirístico en la glicina de la posición 2 de la
proteína. Esta modificación postraduccional localiza a la proteína Z en la
membrana plasmática de la célula, donde ejerce su función impulsora
de la brotación de la partícula viral. En células de mamífero se ha
demostrado que la sola expresión de la proteína Z es capaz de producir
partículas tipo virales (VLPs), las cuales poseen potencial biotecnológico
como plataforma de presentación de antígenos. En consecuencia, es de
interés el estudio de la producción de estas VLPs en sistemas
técnicamente más simples y comercialmente más aptos, como es el
caso de células de insecto, ampliamente utilizadas en la industria
farmacéutica.
En función de lo anteriormente expuesto, en este trabajo se estudió la
capacidad del sistema de células de insecto, de reconocer la señal de
miristoilación presente en la proteína Z del virus Junín, con el fin de
generar un sistema de producción de VPLs fusionadas a antígenos
específicos.
Para esto, se construyeron virus recombinantes de AcMNPV
conteniendo el gen que codifica para la proteína Z, la misma fusionada
a GFP (ZGFP), y dos mutantes en las cuales la glicina de la posición 2 fue
reemplazada por alanina. Para ello se realizaron los clonados
correspondientes utilizando el sistema Bac to Bac. Una vez confirmado
el genotipo de cada virus, se evaluó la expresión de las proteínas antes
mencionadas, infectando células sf9 y hi5 con los viriones brotantes,
correspondientes a cada versión viral. Se analizaron las células
mediante microscopia de fluorescencia y la expresión de las proteínas
mediante inmunodetección. Por otro lado, se evaluó la capacidad de
producir VLPs derivadas de la expresión de Z en células de insecto, a
partir de las versiones virales construidas.
Fue posible detectar la expresión de Z y ZGFP junto con sus versiones
mutantes y se detectó una distribución celular diferencial de las
proteínas expresadas conteniendo las mutaciones. Para el caso de la
infección con los viriones conteniendo la proteína Z wild type, se
detectó una distribución localizada principalmente en la membrana
plasmática de las células infectadas, mientras que para el caso de la
mutante, la fluorescencia se encontró distribuida inespecíficamente en
toda la célula. Esta observación indica la importancia de la glicina 2 en
el direccionamiento de la proteína Z en la célula, y permite presuponer
que las células de insectos también estarían reconociendo esta
secuencia como señal para el direccionamiento específico de Z.
Por otro lado, se detectaron VLPs a partir de la expresión de Z y ZGFP
en el sobrenadante de células infectadas. Estos resultados dan indicio
de la enorme potencialidad del sistema basado en la proteína Z - células
de insecto como plataforma de producción de VLPs para fines
biotecnológicos.
0330
DESARROLLO DE UNA PLATAFORMA BIOTECNOLÓGICA PARA LA
PRODUCCIÓN DE INTERFERÓN FELINO EN INSECTOS
MB Arregui, AM Targovnik, O Cascone, MV Miranda
Nanobiotec (UBA-CONICET), Cátedra de Biotecnología, FFyB, UBA,
Argentina.
El interferón felino (FeIFN) es una citoquina que se aplica en la industria
veterinaria para el tratamiento y prevención de enfermedades virales y
neoplasias de origen felino y canino. Estas citoquinas no se
comercializan en nuestro país. El FeIFN-α consiste en una proteína de
171 aminoácidos con un sitio potencial de N-glicosilación. Esta proteína
fue expresada en diversos sistemas sin embargo, los mayores niveles de
expresión de FeIFN-α han sido obtenidos utilizando el sistema
baculovirus. Esta proteína es comercializada en el mercado Europeo
bajo el nombre de Virbagen Omega. Se ha demostrado la eficacia del
tratamiento con FeIFN-α para mejorar la sintomatología y prolongar la
supervivencia de los animales infectados con diversos virus felinos
resultando más efectivo a largo plazo que el tratamiento con interferón
alfa humano. Por otro lado el FeIFN-β es una proteína de 165
aminoácidos con cuatro sitios potenciales de N-glicosilación. El FeIFN-β
no ha sido expresado en ningún sistema con anterioridad y todo lo que
se conoce es por similitud con interferones de especies asociadas. Es
sabido que los INF-α e INF-β presentan diferentes mecanismos de
acción y pueden ser utilizados para distintos tratamientos.
El objetivo del trabajo fue obtener FeIFN-α y el FeIFN-β a partir de
cultivos celulares de Sf9 como plataforma para el posterior escalado en
larvas autóctonas. Se analizaron sus perfiles de expresión y sus
actividades antivirales.
Se construyeron dos baculovirus recombinante donde el gen de FeIFNα y el FeIFN-β, con sus respectivos péptidos de secreción, fueron
clonados bajo el promotor de poliedrina. Para la producción del FeIFN
en cultivo, se utilizó una línea celular de insectos, Sf9, adaptada al
medio SF900 con 1% SFB. Se estudió la cinética de expresión a
diferentes multiplicidades de infección (MOI) y se evaluó la actividad
antiviral de dichos sobrenadantes por titulación a punto final sobre la
línea celular de origen felino CRFK infectadas con el virus VSV.
Tras optimizar las condiciones, los máximos niveles de expresión de
FeIFN-α se lograron a los 4 días post infección a partir de células Sf9
infectadas a una MOI de 1. Bajo las condiciones seleccionadas se
obtuvo 1,28x106 UI/ml. La proteína presento un peso molecular
aproximado de 25 kDa con similares características a la comercial.
Por otro lado los máximos niveles de expresión de FeIFN-β se
obtuvieron a los 3 dpi a partir de células Sf9 infectadas a una MOI de
0,5 Bajo las condiciones seleccionadas se obtuvo 2x105 UI/ml. La
proteína presentó un PM aproximado de 23 kDa.
Estos resultados demuestran que los péptidos señales perteneciente a
cada uno de los FeIFN fueron reconocidos eficientemente por el
sistema baculovirus/células de insecto. Los resultados obtenidos
alientan el desarrollo de una plataforma biotecnológica para la
producción de interferones de uso veterinario basada en larvas de R.
nu.
0337
EXPRESIÓN DE UN ANTÍGENO DEL VIRUS DEL DENGUE EN CÉLULAS Y
LARVAS DE INSECTOS FUSIONADO A HIDROFOBINA PARA SU
PURIFICACIÓN DIRECTA EN SISTEMAS DE DOS FASES ACUOSAS
ME Smith, AM Targovnik, MV Miranda, J Rodriguez Talou
Instituto Nanobiotec (UBA-CONICET). Cátedra de Biotecnología, FFyB,
UBA, Argentina.
Introducción
El virus del Dengue pertenece al género Flavivirus y su genoma codifica
para 3 proteínas estructurales. De ellas, la proteína de la Envoltura es la
más abundante e inmunogénica. Su Dominio III (DomIII) contiene
epitopes que generan anticuerpos neutralizantes serotipo específicos.
Las hidrofobinas (HFB) son proteínas anfifílicas producidas por hongos
filamentosos. Han sido descriptas como eficientes tags para la
96
Libro de resúmenes
purificación de proteínas recombinantes por sistemas de dos fases
acuosas (ATPS) basados en surfactantes no iónicos. Además, permiten
la inmovilización de manera orientada de los antígenos fusionados a
ellas en soportes sólidos empleados en kits de diagnóstico.
El objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión y purificación de
DomIII fusionado a HFB en el sistema baculovirus/células de insecto.
Esta proteína posee una potencial aplicación biotecnológica orientada
hacia el desarrollo de una vacuna y kits diagnósticos.
Metodología
Se construyó un vector de transferencia clonando la secuencia
codificante del DomIII fusionado a HFB en el plásmido pAcGP67-B. Por
cotransfección de este vector con el ADN viral BaculoGoldTM Bright
(Pharmingen) en la línea celular Sf9 se obtuvieron los baculovirus
recombinantes. Se infectaron cultivos de células Sf9 con el baculovirus
recombinante y se evaluó la cinética de expresión con 2 multiplicidades
de infección (MOI 0.5 y 2). Luego se evaluó la purificación de DomIIIHFB por ATPS ensayando tres concentraciones de Tritón X-114: 2%, 5%
y 8%. Por otro lado, se llevó a cabo la expresión de la proteína
recombinante en larvas de Rachiplusia nu y se evaluó su purificación
por ATPS. En todos los casos la detección y análisis de las proteínas
recombinantes se llevó a cabo por SDS-PAGE y Western Blot.
Resultados
Se logró obtener un baculovirus recombinante para la expresión de
DomIII-HFB. Se evaluó la expresión en la línea celular Sf9 y se vio que la
proteína era mayormente liberada al medio de cultivo. En este sistema
las condiciones óptimas de expresión fueron con MOI 0,5 y cosecha a
los 2 días postinfección. Por medio de ATPS se logró purificar
parcialmente DomIII-HFB desde el medio de cultivo. Los mejores
resultados se obtuvieron utilizando una concentración de Tritón X-114
del 2%. Se evaluó la expresión de DomIII-HFB en larvas de Rachiplusia
nu obteniéndose altos niveles de expresión y se logró purificar
parcialmente la proteína por ATPS.
Conclusiones
Los resultados expuestos en el presente trabajo indican que el sistema
de expresión baculovirus/células de insecto resulta adecuado para la
producción de antígenos del virus del Dengue como proteínas
fusionadas a HFB, permitiendo de esta manera su purificación por
medio de sistemas de dos fases acuosas de manera fácil y económica.
La expresión en larvas demostró ser un sistema adecuado para el
escalado de este proceso.
0341
DISEÑO Y EVALUACIÓN PRELIMINAR DE UNA METODOLOGÍA DE
MUTAGÉNESIS INSERCIONAL PARA ESTUDIOS DE GENÓMICA
FUNCIONAL EN VIRUS CON GENOMAS GRANDES DE ADN DOBLE
CADENA
MJ Garavaglia, JA Simonin, MN Belaich, PD Ghiringhelli
Universidad Nacional de Quilmes, Argentina.
Los virus con genomas grandes de ADN doble cadena conforman un
grupo que contiene a numerosas familias, entre las cuales pueden
mencionarse Herpesviridae, Baculoviridae, Iridoviridae, Adenoviridae y
Poxviridae. Una característica común de estos patógenos es su gran
contenido génico, el cual a su vez suele ser variable cuando se
comparan especies emparentadas. De hecho los baculovirus, parásitos
de insectos de amplia distribución mundial y con numerosas
aplicaciones biotecnológicas, poseen genomas circulares de entre 80 y
180 kpb mostrando regiones codificantes compartidas y otras tantas
únicas de miembros particulares. La situación relativa al alto número de
genes y su contenido diferencial entre especies hace que los estudios
de genómica funcional sean complejos, y usualmente, involucren
mutaciones direccionadas mediante procedimientos de recombinación
homóloga con tediosos pasos de selección. Ante este escenario una
metodología de mutagénesis insercional al azar podría acelerar los
tiempos, además de incrementar los alcances de las investigaciones
centradas en la comprensión de la información contenida en este tipo
de genomas virales.
Para propender a lo anterior, existen secuencias naturales que pueden
ser la base de la herramienta. Por ejemplo, los transposones de clase II
suelen presentar una genética simple que controla su movilidad.
Incluso, pueden ser de-construidos y modificados para utilizarlos en
procedimientos de transgénesis. Y en particular, piggybac es un
elemento móvil ampliamente utilizado para introducir mutaciones por
interrupción. Por ello, se decidió desarrollar una herramienta de
mutagénesis insercional basada en el transposón mencionado que
transforme a los genomas circulares de ADN viral en megaplásmidos de
Escherichia coli, utilizándose un aislamiento propio obtenido de líneas
celulares de insecto. A partir del mismo y mediante procedimientos
tradicionales de clonado molecular, se recuperaron los brazos
conteniendo las terminales invertidas, que luego se utilizaron para
construir un casete de inserción (ADN donante) incluyendo un gen
indicador (que expresa GFP), una resistencia a antibiótico bacteriano y
un origen de replicación plasmídico de bajo número de copias (miniF).
En tanto, se generó una construcción genética con sintaxis eucariota
para producir la transposasa piggybac in vivo (ADN colaborador); y
también, se logró la expresión recombinante de dicha proteína en
bacterias para su potencial empleo in vitro. La funcionalidad de cada
componente de la herramienta fue evaluada individualmente, así como
su utilidad colectiva en forma preliminar (in vivo e in vitro) utilizando
genomas de baculovirus como blanco de las inserciones.
0359
GENERACIÓN DE UNA LÍNEA CELULAR TRANSGÉNICA QUE EXPRESA EL
GEN ESENCIAL 1629 DEL BACULOVIRUS DE ANTICARSIA GEMMATALIS
CON PROYECCIÓN AL DESARROLLO DE UN SISTEMA DE
RECOMBINACIÓN CON ALTA EFICIENCIA
ML Fabre, S Haase, ML Ferrelli, ML Pidre, V Romanowski
Instituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM) UNLP-CONICET,
Argentina.
Introducción
El virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Anticarsia gemmatalis
(AgMNPV) ha sido utilizado con éxito en paises con climas cálidos para
el control biológico de la oruga de las leguminosas, una plaga que
ocasiona pérdidas en el cultivo de soja y otras leguminosas. Sin
embargo, su velocidad de acción lenta en climas templados limita su
aplicación en otros países como Argentina. Una herramienta que
permite el mejoramiento de las propiedades insecticidas de los
baculovirus consiste en la ingeniería genética de sus genomas,
usualmente basada en la recombinación homóloga entre el virus y un
vector de transferencia apropiado. La frecuencia de recombinación es
muy baja y por eso la proporción de virus recombinantes suele ser
menor al 1%, el aislamiento de virus modificados resulta muy laborioso
y demanda mucho tiempo. Por esto, se han desarrollado sistemas de
selección que permiten aumentar la proporción de virus
recombinantes, algunos de ellos basados en la generación de virus
deficientes en genes esenciales, incapaces de subsistir en células
infectadas, que recuperan el gen eliminado al recombinar con un vector
de transferencia. Para comenzar a abordar la generación de un sistema
de recombinación de alta eficiencia para AgMNPV, se desarrolló una
línea celular que permitirá el mantenimiento de un virus AgMNPV
deficiente en el gen esencial 1629.
Métodología
Se construyó un vector plasmídico para la generación de la línea celular
transgénica que exprese constitutivamente el gen 1629, basado en el
vector de selección pIB/V5-His. Se transfectaron células High Five con
esta construcción y se aislaron clones de células transgénicas mediante
un procedimiento de dilución terminal. La línea celular obtenida fue
infectada con un bácmido de AcMNPV (virus de la poliedrosis múltiple
de Autographa califormica) deficiente en el gen 1629. Finalmente, se
evaluó la producción de virus brotantes del bácmido en estas células
infectando una línea celular (XXL-GFP) que posee un gen indicador bajo
un promotor viral tardío.
Resultados
Se desarrolló la línea celular High Five-1629Ag que permite expresa el
gen 1629 constitutivamente. Para analizar la complementación
funcional de la línea transgénica, se infectaron, en una línea tituladora
(XXL-GFP), los sobrenadantes de las células High Five-1629Ag y High
Five, previamente transfectadas con el bácmido. Se observó
fluorescencia sólo con el sobrenadante de High Five-1629Ag, indicando
que el bácmido sólo puede formar viriones brotantes funcionales en
estas células. Para la eliminar parte del gen 1629 de AgMNPV se
cotransfectó el DNA genómico de este virus con un plásmido de
97
Libro de resúmenes
transferencia. La recombinación homóloga entre ambos se verificó por
la expresión de un gen indicador del vector (GFP).
Conclusiones
La línea celular transgénica generada permitió la complementación de
un bácmido deficiente en el gen 1629 y podría utilizarse asímismo para
el mantenimiento de un AgMNPV con una deleción en este gen.
0413
EVALUACIÓN DE ESQUEMAS DE INMUNIZACIÓN DE RATONES CON EL
VIRUS DIMINUTO DEL RATÓN (MVM)
AS Maiza, GS Gamboa, MA Mariani, MC Saavedra, AM Ambrosio
Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas Dr. Julio I.
Maiztegui. Monteagudo 2510. 2700 Pergamino. Buenos Aires,
Argentina.
0375
ESTUDIO DE LAS PROTEÍNAS DE LARVAS DE RACHIPLUSIA NU
INFECTADAS CON BACULOVIRUS RECOMBINANTE A TRAVÉS DE GELES
2-DE PARA EL DESARROLLO RACIONAL DE PROCESOS DE
PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
AM Targovnik1, MB Arregui1, M Fogar2, FJ Wolman1, O Cascone1, MV
Miranda1
1
Nanobiotec (UBA-CONICET), Cátedra de Biotecnología, FFyB, UBA,
Argentina. 2 3INTA EEA Sáenz Peña, Laboratorio de Entomología, Chaco,
Argentina, Argentina.
La calidad microbiológica es una condición indispensable en los
animales utilizados en investigaciones biomédicas y veterinarias para
arribar a resultados finales confiables y reproducibles. Entre los
contaminantes virales mas frecuentes en ratones se encuentran los
parvovirus murinos. Estos tienen un importante efecto deletéreo en los
estudios científicos de investigación debido a la ausencia de
manifestaciones clínicas de la enfermedad y a la ausencia de lesiones
histopatológicas en ratones natural o experimentalmente infectados.
Además, desencadenan efectos inmunomoduladores tanto in vivo
como in vitro.
El virus Diminuto de Ratón (MVM, Género Parvovirus; Familia
Parvoviridae) es un contaminante común de líneas de cultivos celulares,
tejidos y otros materiales biológicos de origen murino. Su elevada
estabilidad en el medio ambiente potencia su efecto nocivo y justifica
aun más su búsqueda mediante métodos apropiados en las colonias de
ratones haciendo crítica su identificación para poder minimizar el
impacto en las investigaciones científicas.
El objetivo del presente trabajo fue evaluar los líquidos inmunes (suero
y líquido ascítico) de ratón obtenidos mediante diferentes esquemas de
inmunización con el virus MVM (ATCC VR-1346), para ser utilizados
como controles positivos en pruebas serológicas destinadas a la
detección de este agente.
Para la obtención de suero inmune fueron inoculados por vía intranasal
(IN) grupos de cinco ratones adultos (Mus musculus, cepa CD1,
exocriados, SPF) variando las DICT 50 / ml del virus MVM y sus
respectivos controles normales. El día 21 post inoculación, los animales
fueron anestesiados y sangrados por punción intracardiaca. Los sueros
individuales fueron separados, fraccionados y conservados a – 40ºC.
Igual esquema se siguió para la obtención de líquido ascítico inmune
(LAI). En el día 21 se les inyectó por vía intraperitoneal la ascitis
resultante de la inoculación de ratones SPF con sarcoma 180 (ATCC TIB
66). Se cosecharon los LAI el día 32.
La respuesta de anticuerpos para cada esquema de inmunización fue
evaluada por pruebas de Inmunofluorescencia Indirecta (ifi) y ELISA. En
sueros se detectaron por ifi anticuerpos específicos con títulos entre 32
y 128 mientras en los LAI entre 32 y 64. Por la técnica de ELISA los
títulos en suero fueron entre 1600 y 6400 mientras que los resultados
en LAI entre 200 y 800. Los títulos obtenidos son los que resultaron de
una única inoculación del agente viral.
Se concluye que los diferentes esquemas evaluados de inmunización de
ratones con virus MVM permitieron el desarrollo de anticuerpos
específicos en suero y en LAI, siendo óptimo el resultante de una sola
inoculación IN con una DICT 50 / ml equivalente a 104 de la cepa viral
original. Los líquidos inmunes (suero y líquido ascítico) de ratón anti
MVM desarrollados resultaron eficaces para ser utilizados como
controles positivos en pruebas serológicas para la detección de MVM.
La expresión de proteínas recombinantes en el sistema
baculovirus/células de insecto es cada vez más utilizado. Para aquellos
productos que no tienen alto valor de mercado, cabe la posibilidad de
utilizar directamente los insectos vivos como “biofábricas”. Las especies
susceptibles a baculovirus pertenecen a la familia Noctuidae que
corresponden a mariposas de hábitos nocturnos como ser R. nu. El
sistema está limitado para su utilización en la producción de proteínas
de interés comercial dado el escaso conocimiento sobre el downstream
processing de proteínas recombinantes a partir de extractos larvales.
Cuando se trata con muestras complejas como en este caso es crítico el
diseño de esquemas de purificación que involucren un número
reducido de etapas y establecer las condiciones óptimas de cada una de
ellas para lograr un alto grado de purificación y rendimiento del
producto. Cuando se trata de establecer métodos generales en
sistemas no estudiados en profundidad, es necesario describir el
proteoma del huésped (proteínas contaminantes del proceso).
El objetivo de este trabajo es analizar a través de geles 2-DE, el perfil
proteico de extractos larvales no infectados e infectados con
baculovirus recombinante, con el fin de identificar los principales
contaminantes virales y del huésped.
Las larvas de R. nu fueron criadas y alimentadas con dietas artificiales
hasta alcanzar el 4º estadio donde fueron infectadas con baculovirus
recombínate que expresaba el gen de Interferón Beta felino. Las larvas
fueron cosechadas a los 3 días post infección y homogeneizadas. Los
homogenatos fueron centrifugados a 14000 rpm durante 10 minutos a
4 °C y filtrados con un papel Whatman grado 1. Las muestras fueron
analizadas a través de geles 2-DE seguido, en el caso que
correspondiera, de Western Blot con anticuerpos específicos anti
extracto total de larva. Los geles fueron analizados a través del
software ImageMaster 2D platinum 6.0 (GE Healthcare).
A través de geles 2-D se pudo evidenciar una clara diferencia del perfil
proteico de la larva infectada respecto de la larva control. Se
detectaron alrededor de 50% menos número de spots en la larva
infectada demostrando un proceso de silenciamiento y
redireccionamiento de la maquinaria de transcripción por parte del
virus. Los puntos isoeléctricos de los spots se ubicaron alrededor de
todo el gradiente de pH (3-10) presentando una mayor densidad de
proteínas a pesos moleculares superiores 20 kDa. Mediante Western
Blot con anticuerpos específicos anti larva, se pudo detectar 47
proteínas inmunogénicas en la larva infectada respecto a 69 proteínas
inmunogénicas en la larva control, todas proteínas de tendencia básicas
y peso molecular superior a 26 kDa.
Este conocimiento de las propiedades fisicoquímicas de las proteínas
del huésped de expresión posibilitaría el desarrollo futuro de procesos
de dowmstream in silico permitiendo predecir desde un principio el
grado de complejidad del proceso.
Vacunas e inmunidad
0010
LA CITOTOXICIDAD MEDIADA POR ANTICUERPOS EN LA INFECCIÓN
POR HIV NO GENERA PROTECCIÓN DURANTE EL PRIMER AÑO DE
INFECCIÓN Y SU MAGNITUD DECAE EN PRESENCIA DE IGA GP-120
ESPECIFICA
MJ Ruiz1, YA Ghiglione1, J Falivene1, ME Socías2, NL Laufer1 3, CA
Trifone1, P Cahn2 3, O Sued2 3, MM Gherardi1, H Salomon1, AM
Rodriguez1, G Turk1
1
Instituto Nacional de Investigaciones Biomédicas en retrovirus y SIDA
(INBIRS), Facultad de Medicina, UBA-CONICET, Argentina. 2 Fundación
Huésped, Argentina. 3 Hospital Juan A. Fernández, Unidad
Enfermedades Infecciosas, Argentina.
98
Libro de resúmenes
El rol de la citotoxicidad mediada por anticuerpos (ADCC) en la
infección natural por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) es
controversial, y los factores que determinan una mejor o peor
respuesta ADCC son aun desconocidos
Objetivo: Evaluar la capacidad de los anticuerpos (abs) específicos antiHIV presentes en el plasma de los pacientes reclutados de mediar
ADCC. Determinar el título de abs IgG e IgA anti-gp120 en dichos
pacientes con el fin de evaluar su relación con la magnitud de la
respuesta ADCC.
Metodología: Se utilizó plasma de 20 sujetos HIV+ cursando la infección
primaria (PHI) recolectado antes de los primeros seis meses post
infección (muestra basal) y al año; de 10 sujetos crónicos “naïve” de
tratamiento antirretroviral y de 7 Elite Controllers (EC). A los PHI se los
dividió en dos subgrupos dependiendo si su recuento de CD4 caía por
debajo de 350 cel/l (PHI < 350) o no (PHI >350 cel/l) durante el
primer año post infección. El porcentaje de ADCC se determinó
incubando células CEM-NKR recubiertas con la proteína gp120BAL,
previamente teñidas con CFSE (indicador de viabilidad) y PKH-26
(colorante de membrana), con distintas diluciones de suero inactivado
de los sujetos HIV+ y células efectoras (PBMC de dadores sanos). El
análisis se realizó por citometría de flujo. La presencia de abs IgG e IgA
específicos anti-gp120 se evaluó por ELISA. En un subgrupo de
pacientes, el plasma se depletó de IgA por inmunoprecipitación. Los
datos se analizaron por métodos estadísticos no paramétricos.
Resultados: La actividad ADCC (titulo > 1000) fue documentada en el
80% de las muestras basales y en el 100% de las muestras obtenidas a
los 12 meses post infección. De manera similar, en todos los pacientes
crónicos se documentó un título de ADCC > 1000 y ≥10,000 en EC. Se
observó un mayor % de ADCC (%ADCC) al año respecto de la muestra
basal (mediana 24% versus 12.85%, p=0.0003), pero no se observaron
diferencias entre crónicos versus EC. Al comparar la respuesta ADCC
entre PHI<350 y PHI>350 no se observaron diferencias
estadísticamente significativas. Tampoco se observaron correlaciones
entre el %ADCC basal y la carga viral plasmática ni con el recuento de
células CD4 tanto basal como al año. La relación IgG/IgA se correlaciono
de manera directa con el %ADCC al año en pacientes PHI (r= 0.6997
p=0.0053). Más aún, el %ADCC fue significativamente mayor en plasma
depletado en IgA, comparado con el sin depletar en los individuos
evaluados.
Conclusiones: Aunque los abs capaces de mediar ADCC surgen
tempranamente durante la infección por HIV, la magnitud de la
respuesta no se asoció a la tasa de progresión a la enfermedad. Más
aun, la correlación directa entre IgG/IgA y %ADCC, junto con el mayor
%ADCC observado en el plasma depletado respecto del sin depletar,
refuerzan la hipótesis de que los abs IgA interferirían con la magnitud
ejercida por IgG. Estos resultados podrían contribuir al desarrollo
racional de vacunas específicas.
0015
OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE VIRUS VACCINIA
ANKARA MODIFICADO QUE EXPRESAN LA PROTEÍNA F DEL VIRUS
RESPIRATORIO SINCICIAL BOVINO.
A Ferella1, MJ Dus Santos1, M Mozgovoj1, G Calamante2, MP Del Médico
Zajac2
1
Instituto de Virología, CICVyA, INTA Castelar, Argentina. 2 Instituto de
Biotecnología, CICVyA, INTA Castelar, Argentina.
El virus respiratorio sincicial bovino (bRSV) es una de las principales
causas de neumonías en terneros de temprana edad a nivel mundial. Si
bien hay disponibles en el mercado numerosas vacunas
convencionales, existe una demanda creciente en cuanto al desarrollo
de vacunas de nueva generación, más eficientes, capaces de inducir
una respuesta inmune duradera en el tiempo. Una estrategia novedosa
en el desarrollo de vacunas que permiten mejorar la inmunidad es el
empleo de vectores virales que expresen proteínas inmunorelevantes,
como el virus vaccinia Ankara modificado (MVA), ampliamente utilizado
para el desarrollo de vacunas seguras y efectivas para humanos y en
medicina veterinaria. Además, con el propósito de obtener vectores
optimizados basados en MVA recientemente hemos obtenido y
caracterizado un vector que carece del gen codificante de la proteína
de unión a IL-18 (MVAd008) y observamos un aumento en la respuesta
celular T CD4+ y CD8+ respecto del vector viral convencional en
ratones. Estos resultados sugieren que el vector optimizado MVAd008
constituye una interesante herramienta a utilizar al momento de
diseñar vacunas de nueva generación.
El objetivo de nuestro trabajo consistió en la obtención de un MVAd008
recombinante que exprese la proteína F de bRSV.
Se seleccionó la proteína F de bRSV como antígeno de interés por ser la
principal inductora de inmunidad protectora. Por otra parte, dado el
gran tamaño del genoma de los poxvirus se descarta la manipulación
directa del ADN y los virus recombinantes se obtienen por
recombinación homóloga entre el genoma del virus y un vector de
transferencia (VT) que porta el gen de interés flanqueado por regiones
genómicas que serán el blanco de inserción. Para la obtención del MVA
recombinante se subclonó direccionalmente la secuencia codificante de
la proteína F en el VT-Mtk-GUS río abajo del promotor poxviral. Este
vector contiene además un cassette para la expresión de la enzima
beta-glucuronidasa (GUS) y secuencias flanqueantes correspondientes
al gen MVA086R (sitio blanco de recombinación). La identidad del gen
de interés se confirmó por secuenciación. Se transfectaron cultivos de
fibroblastos de embrión de pollo previamente infectados con MVAd008
con el VT-Mtk-F y los virus recombinantes se aislaron por su capacidad
de formar placas de lisis azules en presencia del sustrato de la enzima
GUS (X-Gluc). La presencia y expresión de la secuencia codificante de la
proteína F se confirmó mediante amplificación por PCR y RT-PCR,
respectivamente.
En este trabajo se obtuvieron virus MVA recombinantes que expresan
la proteína F del virus respiratorio sincicial bovino. Su capacidad
inmunogénica y protectora se evaluará en el modelo murino.
0037
OBTENCIÓN DE VECTORES NO REPLICATIVOS PARA LA EXPRESIÓN IN
VIVO DE LA GLICOPORTEÍNA DEL VIRUS RÁBICO.
D Garanzini1, MP Del Médico Zajac1 2, O Pérez3, G Calamante2
1
CONICET, Argentina. 2 Inst. de Biotecnología CICVyA INTA, Argentina. 3
INPB-ANLIS, Argentina.
La rabia es una enfermedad zoonótica de evolución aguda,
habitualmente mortal. Es causada por el virus de la rabia (RV) el cual se
transmite entre algunas especies de sangre caliente y el hombre. La
vacunación periódica y masiva es la forma de prevención más eficaz.
Las vacunas que se utilizan en nuestro país están basadas en virus
rábico inactivado (producidas por amplificación viral en sustratos
celulares), que si bien son efectivas, presentan ciertas desventajas por
la composición indefinida del antígeno, manipulación de grandes
cantidades del patógeno en las plantas de producción, necesidad de
estricta cadena de frío y la dificultad para diferenciar animales
infectados de vacunados. Estos inconvenientes se pueden superar
desarrollando vacunas biotecnológicas basadas en microorganismos
vivos o vacunas génicas, diseñadas racionalmente para que sean
seguras y efectivas para la prevención de enfermedades infecciosas. Se
ha reportado la utilización de vectores virales (replicativos o no) para la
expresión de la glicoproteína (RG) del virus rábico, principal antígeno
responsable de inducir inmunidad protectora en el hospedador. En
particular, los vectores basados en poxvirus y adenovirus ofrecen
numerosas ventajas para el desarrollo de vacunas: estabilidad (física y
genética), administración por diferentes vías, inducción de respuestas
inmunes humorales y celulares protectoras e inmunidad duradera.
Además, se utilizan combinados en esquemas de inmunización
heterólogos.
El objetivo de este trabajo es obtener y caracterizar molecularmente
vectores que porten y expresen la secuencia codificante de la
glicoproteína de RV basados en virus vaccinia Ankara modificado
(MVA), adenovirus (AdHu5) y vacuna génica (plásmido pCI-Neo).
Para obtener el adenovirus que exprese la glicoproteína de RV se utilizó
la tecnología de clonado Gateway® (Life-Technologies). Se amplificó por
PCR el gen RG, se clonó en el vector pCR™8/GW/TOPO® (vector de
entrada) y se introdujo en el vector de destino (pAd/CMV/V5 DEST™)
por recombinación sitio específica. El vector pAd-RG se transfectó en
células 293A y se identificó el virus recombinante por la presencia de
efecto citopático. Para obtener el virus MVA-RG se clonó el gen RG en
el vector de transferencia (VT) VT-Mtk-GUS (obtenido previamente en
nuestro laboratorio) y se transfectaron fibroblastos de embrión de
pollo previamente infectados con MVA. Los virus recombinantes se
99
Libro de resúmenes
aislaron por su capacidad de formar placas de lisis azules en presencia
del sustrato de la enzima GUS (X-Gluc). Además, el gen RG se clonó
direccionalmente en el vector pCI-Neo río abajo del promotor de CMV.
La presencia y expresión del gen de interés se confirmó en células
infectadas o transfectadas con cada uno de los vectores mediante PCR
y Western blot, respectivamente.
En este trabajo se obtuvieron los vectores recombinantes MVA-RG, AdRG y pCI-RG. La inmunogenicidad y eficacia de estos vectores se
evaluará solos o combinados en el modelo murino.
0066
VIRUS-LIKE PARTICLES DEL VIRUS DE LA RABIA INDUCEN LA
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES Y GENERAN
PROTECCIÓN EN ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
D Fontana1, M Echeverrigaray2, R Kratje2, C Prieto1
1
Laboratorio de Desarrollo Biotecnológico, Facultad de Bioquímica y
Ciencias Biológicas, UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL, Argentina. 2
Laboratorio de Cultivos Celulares, Facultad de Bioquímica y Ciencias
Biológicas, UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL, Argentina.
INTRODUCCIÓN
La rabia es una de las enfermedades infecciosas más letales del mundo,
con una mortalidad cercana al 100%. Si bien actualmente hay
disponibles vacunas para rabia, existe la necesidad de desarrollar
vacunas de nueva generación, eficaces y económicas para dicha
enfermedad. Durante las últimas décadas, las partículas pseudovirales
(VLPs, Virus-Like Particles), por sus características inmunogénicas y
bioseguridad, han cobrado gran relevancia en el desarrollo de vacunas.
En trabajos previos, nuestro grupo demostró el desarrollo de VLPs para
rabia (RV-VLPs) y logró su caracterización fisicoquímica, observándose
partículas circulares, envueltas, con un diámetro hidrodinámico
promedio de 64 nm y con glicoproteína G (principal antígeno del virus)
asociada a su membrana.
El objetivo del presente trabajo fue estudiar las propiedades
inmunogénicas de dichas RV-VLPs, específicamente analizando su
capacidad de inducir anticuerpos neutralizantes y de generar
protección en animales de experimentación.
METODOLOGÍA Y RESULTADOS
RV-VLPs producidas en células HEK293 y purificadas por
ultracentrifugación fueron utilizadas en un plan de inmunización en el
que ratones Balb/c fueron inyectados por vía intramuscular, con dos
dosis separadas por 7 días y utilizando vacunas antirrábicas comerciales
de uso humano y veterinario como controles. Se evaluó el título de
anticuerpos específicos y los resultados obtenidos demostraron que las
VLPs fueron capaces de generar una respuesta inmune humoral
comparable a la obtenida para las vacunas comerciales.
Luego, se llevó a cabo la detección de anticuerpos neutralizantes
mediante un ensayo de inhibición de la transducción por parte de
lentivirus recombinantes pseudotipados con la glicoproteína del virus
de la rabia. En este ensayo, los anticuerpos con capacidad neutralizante
presentes en los sueros inhiben la transducción de vectores lentivirales
codificantes de GFP (Green fluorescent protein). Los resultados
demostraron que las VLPs son capaces de inducir la producción de
anticuerpos neutralizantes y que, además, lo hacen en una forma
similar a las vacunas comerciales, en estas condiciones de
experimentación.
Finalmente, y para confirmar que las RV-VLPs son capaces de generar
una respuesta inmune protectiva, se llevó a cabo el ensayo de potencia
de referencia para la vacuna antirrábica (NIH potency test). En este
ensayo, grupos de ratones son inmunizados con diluciones de la vacuna
a evaluar y de una vacuna de referencia, y luego son enfrentados con el
virus de la rabia activo. Se obtuvo un valor de 1,5 UI/ml de potencia de
vacuna antirrábica, demostrando de esta forma que las RV-VLPs
producidas no sólo son capaces de conferir protección a los animales
vacunados, sino que también alcanzan los requerimientos mínimos de
potencia para la vacuna veterinaria. Estos resultados confirman que
estas RV-VLPs constituyen un candidato vacunal apto y más ventajoso
para la rabia.
0069
OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE VIRUS FOWLPOX
RECOMBINANTES QUE EXPRESAN LA PROTEÍNA VP2 DEL VIRUS DE LA
BURSITIS INFECCIOSA
CR Federico1, FA Zanetti1, G Calamante2
1
CONICET, Argentina. 2 Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTACastelar, Argentina.
El virus fowlpox (FWPV) es el avipoxvirus mejor estudiado y
caracterizado, posee un genoma de ADN doble cadena y se lo utiliza
como vector de expresión en el desarrollo de vacunas de nueva
generación contra enfermedades aviares. La enfermedad de Gumboro
es causada por el virus de la bursitis infecciosa (IBDV) y produce
importantes pérdidas económicas en la industria avícola. Dicho virus
produce una depleción de los linfocitos B que maduran en la bolsa de
Fabricio causando una enfermedad aguda y muy contagiosa que
provoca inmunosupresión y alta mortalidad en pollos jóvenes. La
proteína VP2 de IBDV ha sido ampliamente estudiada por ser la más
inmunogénica e inducir respuestas inmunes protectoras.
En base a esto, el objetivo general del trabajo consistió en obtener y
caracterizar molecularmente virus fowlpox recombinantes que
expresen la proteína VP2 de IBDV.
Debido a que el tamaño del genoma de los poxvirus impide la
manipulación directa del ADN, se utilizan vectores de transferencia (VT)
con secuencias genéticas que permiten la recombinación homóloga con
el virus salvaje. Mediante amplificación por PCR se obtuvieron dos
regiones homólogas, que serán el sitio blanco de recombinación y
corresponden a las posiciones 1321-1619 y 1676-1970 del gen FPV030,
el cual no es esencial para la replicación viral in vitro. Los amplicones
obtenidos se clonaron direccionalmente en pBlueScript. Luego, entre
ambas regiones, se introdujeron secuencialmente construcciones
genéticas que comprenden: a) el promotor temprano pE/L y b) un
cassette para la expresión del gen marcador uidA (codifica para la
enzima beta-glucuronidasa bacteriana, GUS). El plásmido así obtenido
constituye el VT universal en el cual se clonó la región codificante de la
proteína VP2 de IBDV río abajo del promotor pE/L. Este VT se transfectó
en cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo previamente
infectados con una cepa vacunal de FWPV y se incubó hasta la aparición
de efecto citopático. Posteriormente, el aislamiento de los virus
recombinantes se realizó por clonado de las partículas infectivas bajo
agar por su capacidad de formar placas de lisis azules en presencia de
X-Gluc, sustrato de la enzima GUS. De esta forma, se obtuvo un stock
viral puro y se confirmó la presencia de la región codificante del gen
vp2 mediante PCR. Para corroborar la expresión del gen se realizó una
RT-PCR detectándose el ARN mensajero de VP2 a las 24hs postinfección. Adicionalmente, se evidenció la expresión de la proteína VP2
madura a las 24hs/48hs post-infección mediante un western blot,
utilizando un anticuerpo anti-VP2 producido en conejo.
De esta manera, en el presente trabajo se logró obtener FWPV
recombinantes que expresan la proteína VP2 de IBDV. Las perspectivas
a futuro incluyen evaluar su inmunogenicidad y eficacia en pollos libres
de patógenos específicos, para su posible uso como vacuna de nueva
generación contra la enfermedad de la bursitis infecciosa.
0071
EL VECTOR VIRAL MVA-GDS ADMINISTRADO POR VÍA INTRANASAL
INDUCE UNA RESPUESTA INMUNE LOCAL EN RATONES Y CONFIERE
PROTECCIÓN FRENTE AL DESAFÍO CON BOHV-1 EN CONEJOS
MP Del Medico Zajac1 2, FA Zanetti2, MS Esusy1, CR Federico1 2, AR
Valera4, O Zabal3, G Calamante1
1
Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA, Argentina. 2 CONICET,
Argentina. 3 Instituto de Virología, CICVyA, INTA, Argentina. 4 Cátedra
de Virología, Fac. C. Veterinarias, UNLP, Argentina.
El herpesvirus bovino 1 (BoHV-1) es un patógeno que causa infecciones
respiratorias y genitales y es el principal agente etiológico del complejo
respiratorio bovino (CRB). Las pérdidas económicas que ocasiona son
debidas al tratamiento del CRB, a la pérdida de peso, a la baja
performance reproductiva y a abortos. La infección con BoHV-1 está
distribuida mundialmente y en Argentina es endémica. Si bien existen
disponibles vacunas tradicionales atenuadas e inactivadas, presentan
limitaciones respecto de su seguridad y eficacia. El virus vaccinia Ankara
100
Libro de resúmenes
modificado (MVA) es ampliamente utilizado como vehículo para
vacunas humanas y veterinarias dado su perfil de alta seguridad e
inmunogenicidad. En este contexto, cobra gran relevancia el desarrollo
de vacunas seguras y eficaces contra BoHV-1, que además permitan
diferenciar animales vacunados de infectados. Previamente, en nuestro
laboratorio, se obtuvo el virus MVA-gDs que codifica para la versión
secretada de la glicoproteína D de BoHV-1. La administración de MVAgDs por vía intranasal en combinación con la toxina colérica, indujo
anticuerpos anti-gD en mucosas y en suero de ratones. Además, su
administración por vía intramuscular confirió buenos niveles de
protección frente al desafío con BoHV-1 en conejos.
El objetivo de este trabajo fue estudiar la inmunogenicidad y eficacia
del vector MVA-gDs administrado por vía intranasal sin el agregado de
adyuvante de mucosas en dos modelos animales.
Para ello se inmunizaron ratones BALB/c por vía intranasal con los virus
MVA-gDs o MVA no recombinante. Se aplicaron dos dosis separadas 21
días y a los 14 días post revacunación, se sacrificaron los ratones, se
obtuvieron lavados nasales y broncopulmonares y muestras de suero.
Por otro lado, se inocularon conejos por vía intranasal con MVA, MVAgDs o buffer TMN. Se aplicaron dos dosis separadas por dos semanas y
a los 14 días, los animales fueron desafiados por vía intranasal con
BoHV-1. Se tomaron hisopados nasales luego del desafío para medir
excreción viral. La presencia de anticuerpos anti-gD analizó por ELISA.
Se observó que los ratones inmunizados con dos dosis de MVA-gDs
presentan niveles de IgA anti-gD en lavados nasales y
broncopulmonares significativamente mayores que el grupo
inmunizado con MVA (p<0.016 y p<0.051 respectivamente). Además, se
detectó una fuerte respuesta sistémica en el grupo MVA-gDs. Por otro
lado, luego del desafío con BoHV-1, los conejos inmunizados con MVA o
TMN excretaron virus por 6/7 días con un pico máximo de excreción de
2.5 y 2.3 logDICT50/ml respectivamente. Por su parte, los conejos
inmunizados con MVA-gDs presentaron un período de excreción viral
menor (4 días) y redujeron el título del pico máximo de excreción (1.4
logDICT50/ml).
La administración del vector MVA-gDs por vía intranasal sin el agregado
de adyuvante de mucosas es capaz de inducir respuesta humoral de
mucosas y sistémica en ratones y de conferir protección parcial frente
al desafío con BoHV-1 en conejos.
0103
DISEÑO DE UNA VERSIÓN RECOMBINANTE DE LA GLICOPROTEÍNA DE
ENVOLTURA E2 UNIDA A BIOTINA COMO VACUNA MARCADORA
CONTRA EL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA
F Merwaiss1, M Trotta2, D Alvarez1, A Capozzo3
1
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, UNSAM-CONICET,
Argentina. 2 INTA, Instituto de Virología, Centro de Investigaciones en
Ciencias Veterinarias y Agronómicas, Argentina. 3 Consejo Nacional de
Investigaciones Científico y Técnicas (CONICET)., Argentina.
El virus de la diarrea viral bovina (BVDV) es un patógeno del ganado
vacuno que pertenece al género pestivirus de la familia Flaviviridae de
virus de RNA de simple cadena. La infección por BVDV es altamente
prevalente en la Argentina provocando pérdidas económicas para la
industria lechera y ganadera. Actualmente se administran en campo
vacunas a virus inactivado con resultados dispares en el control de la
infección por BVDV. La glicoproteína de envoltura E2 de BVDV es
inmunodominante en el animal infectado y produce una respuesta
inmune con anticuerpos neutralizantes contra BVDV. Por este motivo
E2 es el antígeno ideal para el desarrollo de vacunas a subunidad. Con
el objetivo de generar una nueva versión recombinante de E2 que sirva
como vacuna marcadora permitiendo diferenciar animales infectados
de vacunados, se desarrolló un sistema de expresión eucariota para
producir una versión soluble de E2 acoplada a biotina (E2-biotina). La
unión sitio-específica de biotina se acopló a la síntesis de E2 a través de
la co-expresión en células eucariotas de la proteína E2 fusionada en su
extremo N-terminal a un péptido aceptor de biotina (BAP) de 15
aminoácidos y de la proteína ligasa de biotina BirA de Escherichia. coli,
que reconoce específicamente a BAP para unir covalentemente una
molécula de biotina a un residuo lisina del péptido. E2-biotina se
purificó del sobrenadante de células en cultivo mediante cromatografía
de afinidad. Utilizando ensayos de inhibición del efecto citopático en
células en cultivo, demostramos que E2-biotina inhibe eficientemente
la infección por BVDV sugiriendo que la proteína recombinante es
funcional. Con el fin de evaluar la inmunogenicidad de E2-biotina se
realizó una prueba de vacunación en bovinos. Los animales fueron
inmunizados en dos dosis con E2-biotina o con la proteína
recombinante sin biotina. Se presentarán los resultados de ensayos de
seroneutralización y el diseño de una prueba adecuada para diferenciar
animales vacunados de animales infectados basada en la detección de
BAP-biotina.
0106
EVALUACION DE UNA VACUNA ALTERNATIVA CONTRA LA GRIPE.
“DISPLAY” EN LA SUPERFICIE DE BACULOVIRUS DE LA PORCION
EXTRA-CITOPLASMATICA DE LA PROTEINA MATRIX 2 (M2E) PROTEGE
CONTRA EL DESAFIO CON INFLUENZA.
LA Boado1, P Alvarez1, O Taboga2, N Mattion1
1
Centro de Virología Animal, ICT-Milstein, CONICET, Argentina. 2
Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA, Castelar, Argentina.
Introducción: La gripe es una de las enfermedades virales respiratorias
agudas con mayor impacto sobre la población humana y la vacunación
es el método más efectivo para prevenirla. Sin embargo, la falta de
cobertura heterosubtípica de las vacunas en uso es un serio problema
potencial para la sanidad humana. El surgimiento de una cepa de alta
virulencia podría convertirse en un problema muy grave. Por esta
razón, es de interés de nuestro laboratorio, la generación de una
vacuna del tipo “universal” contra la gripe. Es decir, una vacuna que
genere una respuesta inmune “cross-protectora” contra distintas cepas
del virus. Hace años se identificaron a la nucleoproteína (NP) y a la
proteína Matrix 2 (M2) como blancos principales de la inmunidad
cruzada. Para el presente trabajo, se eligió como antígeno el péptido
extra-citoplasmático de la proteína Matrix 2 (M2e), demostrado ya, que
genera una respuesta inmune cross-protectora. Para vehiculizar este
antígeno se utilizó el sistema baculovirus (Bv) exponiendo en las
membranas de las partículas virales el péptido de interés. Este sistema
de “display” en superficie permitiría presentar este antígeno al sistema
inmune de una manera similar a su presentación en una infección
natural. Objetivo: Evaluar la capacidad protectora del “display” en la
superficie de Bv de una copia de M2e como fusión a la proteína gp64
(principal glicoproteína de membrana de Bv). Metodología: Para
generar el sistema de “display”, se clonó la secuencia codificante de
M2e entre el péptido señal y la secuencia madura de la gp64 en el
vector de transferencia, obteniendo así el vector pVLSUP1-M2e. Se
obtuvieron Bvs recombinantes (rBv) por transfección de células de
insecto Sf9 con el vector pVLSUP1-M2e y el reactivo BaculoGold™.
También se generaron partículas de Bv wild type (Bv-wt) para ser
utilizados como control. Se inocularon grupos de 3 a 5 ratones Balb/c
con tres dosis cada 21 días con rBv formulados con y sin adyuvantes (se
utilizaron hidróxido de aluminio o adyuvante de Freund completo). A
los 21 días posteriores a la tercera dosis, los ratones se desafiaron con 5
DL50 de virus de influenza adaptado a ratón. Se tomaron registros
diarios de peso para cada grupo. Resultados: El mayor índice de
protección al desafío se obtuvo para el grupo de ratones vacunados con
partículas de Bv que expresan en la membrana el péptido M2e sin
adyuvante (protección del 60%). Cuando se formularon las partículas
virales recombinantes, tanto con hidróxido de aluminio como con
adyuvante de Freund, la protección fue de solamente un 20% de los
animales desafiados. La inoculación con Bv-wt no presentó protección
para ningún grupo. Conclusiones: El ensayo de desafío en animales
inmunizados con las construcciones generadas demostró que es posible
lograr protección contra influenza utilizando este sistema
convirtiéndolo, de esta manera, en una alternativa interesante para el
desarrollo de vacunas universales contra influenza.
0123
ESTUDIO DE LA BIODISTRIBUCION ESPACIO-TEMPORAL DEL VIRUS
VACCINIA ANKARA MODIFICADO EN POLLOS
R Cardona1 2, D Garanzini2, E Gómez1 2, G Calamante1
1
Inst. de Biotecnologia-INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina.
En la búsqueda de vacunas alternativas para el sector avícola los virus
vaccinia Ankara modificado (MVA) serían excelentes candidatos porque
101
Libro de resúmenes
han sido evaluados exitosamente como vacunas para la prevención de
enfermedades de interés en salud humana (malaria, SIDA, tuberculosis)
y sanidad animal (rabia, lengua azul y tuberculosis bovina). Los MVA
recombinantes son incapaces de replicar en la mayoría de las células de
mamífero y en el laboratorio se amplifican en cultivos primarios de
embrión de pollo. Si bien existen reportes en los que se analizó la
expresión in vivo de luciferasa a partir de vectores basados en cepas
atenuadas MVA y NYVAC del virus vaccinia en ratones; donde se
observó la expresión del transgen hasta las 24 o 72 horas post
inmunización (hpi), respectivamente; no existen datos sobre su
capacidad replicativa en aves. Previamente en nuestro laboratorio
evaluamos la presencia del genoma de MVA en pollos a tiempos cortos
y pudimos detectarlo en el sitio de inmunización en una sola ave a las
24 hpi.
El objetivo de este trabajo fue evaluar la distribución in vivo de la cepa
atenuada MVA a las 16, 24 y 72 hpi en pollos.
Para ello, se inocularon aves de 11 días de edad (5 aves por grupo) con
virus MVA (1,4 x 107 UFP conteniendo 0,25% v/v de tinta china) por vía
intramuscular en la pata y se sacrificaron a las 16; 24 y 72 hpi. Además
se incluyó un grupo de 5 aves inmunizadas con PBS las cuales fueron
sacrificadas a las 24 hpi (grupo control negativo). A los diferentes
tiempos se tomaron muestras de músculo inyectado (identificado por la
presencia de tinta china), hígado, bazo y bolsa de Fabricio. Los tejidos
se procesaron en nitrógeno líquido y el ADN fue purificado utilizando el
kit QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) siguiendo las indicaciones del
fabricante. Se realizaron dos reacciones de amplificación por PCR para
detectar la presencia del genoma viral o celular utilizando
oligonucleótidos específicos para el gen MVA157 o el gen aviar
codificante de la enzima gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (gapdh),
respectivamente.
Primeramente, comprobamos la integridad del ADN purificado
mediante visualización en geles de agarosa teñidos con bromuro de
etidio. Luego, se realizaron las amplificaciones por PCR. En todas las
muestras fue posible amplificar el gen aviar gapdh indicando la
ausencia de inhibidores para la reacción de PCR. El genoma viral
(amplicon de 318 pb correspondiente al gen MVA157) fue detectado
solo en el sitio de inoculación a las 16 hpi en 3 de las 5 aves
inmunizadas. En cambio, no fue posible detectar el genoma de MVA en
otros tejidos ni a las 24 o 72 hpi.
Los resultados obtenidos sugieren que MVA no replicaría en el sitio de
inoculación ni se diseminaría a los otros órganos analizados. Este
trabajo aporta evidencias sobre la seguridad del uso de vectores
basados en MVA para el desarrollo de vacunas aviares.
0124
OBTENCION Y CARACTERIZACION DE ADENOVIRUS HUMANDO TIPO 5
RECOMBINANTES QUE EXPRESA LA PROTEINA VP2 DE LA BURSITIS
INFECCIOSA.
R Cardona1 2, G Calamante1
1
Inst. de Biotecnologia-INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina.
En nuestro laboratorio trabajamos en la búsqueda de vacunas basadas
en vectores virales no replicativos que sean seguras y efectivas para la
prevención de la enfermedad de Gumboro, causada por el virus de la
bursitis infecciosa (IBDV). La proteína estructural VP2 contiene los
principales epitopes conformacionales inductores de anticuerpos
neutralizantes en el hospedador y es el antígeno de elección para el
desarrollo de vacunas biotecnológicas. Para generar respuestas
inmunes potentes y de gran avidez se utilizan estrategias de
inmunización prime-boost que se basan en la inoculación secuencial de
inmunógenos basados en diferentes vectores (inmunización
heteróloga). En particular, los poxvirus se utilizaron exitosamente
combinados con otros inmunógenos basados en adenovirus.
Previamente, demostramos que la inmunización del virus canarypox
recombinante que expresa la proteína VP2 (CNPV-VP2) induce una
respuesta inmune específica con presencia de anticuerpos
seroneutralizantes de IBDV luego de 2 o 3 inoculaciones. El objetivo de
este trabajo fue obtener y caracterizar adenovirus recombinantes, no
replicativos, que expresen la proteína VP2 de IBDV para utilizarlo como
inmunógenos en esquemas de inmunización prime-boost combinados
con CNPV-VP2.
En este trabajo se utilizó el plásmido pAd/CMV/V5-DEST (Life
Technologies) que es un vector destino adaptado para usar la
Tecnología Gateway® donde la expresión del gen de interés está
regulada por el promotor del citomegalovirus.
La secuencia codificante de la proteína VP2 se amplificó por PCR
utilizando oligonucleótidos específicos, se clonó en el vector
pCR8/GW/TOPO/TA (vector de entrada). La orientación e identidad del
inserto se confirmó por secuenciación. Luego, el gen de interés se
introdujo en el vector destino mediante recombinación sitio específico.
El vector final pAd-VP2, se linealizó por tratamiento con la enzima de
restricción Pac I y se utilizaron diferentes cantidades (2; 5; 10 o 20 ug)
para transfectar cultivos de células 293A con el lípido catiónico
Lipofectamine reagent. Las células 293A aportan en trans las proteínas
E1a y E1b requeridas para generar los adenovirus recombinantes.
A los 10 días se observó el efecto citopático (ECP) característico de
adenovirus. Se amplificaron los stocks virales que presentaban mayor
ECP, pero no fue posible detectar el gen de interés mediante PCR.
Luego se determinó, se trataba de una población de adenovirus salvaje
(RCA) posiblemente obtenido por recombinación con los genes E1
presentes en las células 293A. Se realizaron nuevas transfecciones
utilizando Lipofectamine 2000 y menor cantidad de vector, se observó
CPE a los 7 días, se amplificó el stock viral, se confirmó la presencia y
expresión del gen codificante de la proteína VP2.
El virus recombinante obtenido, será utilizado en experimentos de
prime-boost para la evaluación de nuevos candidatos vacunales contra
la enfermedad de Gumboro.
0137
EL SEMEN POTENCIA LA MEMORIA INMUNOLÓGICA EN LA RESPUESTA
CONTRA HSV-2
A Varese, F Remes Lenicov, G Ernst, A Merlotti, G Duette, P Pereyra
Gerber, J Rubione, E Dantas, F Erra Díaz, JR Geffner, A Ceballos
Instituto Nacional de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA
(INBIRS), Facultad de Medicina, UBA-CONICET, Argentina.
El semen es el principal vector de una amplia gama de enfermedades
de transmisión sexual. Además, es capaz de inducir acciones
inmunosupresoras que favorecen la tolerancia alo-reactiva a antígenos
paternos, evitando el rechazo fetal luego de la implantación. Nuestra
hipótesis es que el semen, más allá de ser un vehículo de agentes
infecciosos, tiene la capacidad de modular la respuesta inmune contra
patógenos de transmisión sexual.
Con el objetivo de evaluar la modulación de la respuesta inmune
femenina frente a un agente infeccioso, ensayamos un modelo murino
de vacunación intravaginal de HSV-2.
Hembras Balb/c fueron vacunadas con HSV-2 inactivado (1x104 UFP)
por vía intravaginal en presencia o ausencia del fluido que contienen las
vesículas seminales (VS), extraído de machos singeneicos. Un mes
después fueron desafiadas por la misma vía con una dosis letal de HSV2 (3x106 UFP). La producción viral se evaluó en la mucosa vaginal por
inmunohistoquímica. Tanto en lavados vaginales, como en células
recuperadas de ganglios ilíacos y mucosa genital se evaluó la
producción de citoquinas por ELISA, y el número de células productoras
de IFN-γ por ELISpot. La expresión de IFN-α, IFN-β, TGF-β, IL-10, FOXP3,
CCL2, CCL5, CXCL9 y CXCL10 se midió por RT-qPCR. Se evaluó la
expresión de CD3, CD8, CD4, CD11c, y DX5 (NK), y la medida de
proliferación celular (pérdida de CFSE) por citometría de flujo. Los
títulos de IgG e IgA en fluidos vaginales e IgG en suero se cuantificaron
por ELISA.
Los ratones vacunados en presencia de VS mostraron una supervivencia
del 90% vs 10% en el grupo control (n=20 p<0,001), y un menor
progreso de la enfermedad (n=20 p<0,001). En el sitio de infección se
observó una mayor proporción de células T CD8+, y un aumento de IFNγ en lavados vaginales al día 3 post-desafío (pd) (n=20 p<0,01). Siete
días pd observamos un aumento significativo en la producción de IFN-γ,
TNF-α, IL-6 e IL-17A, acompañado por una disminución de IL-10 en la
mucosa vaginal (n=20 p<0,01).
En los ganglios drenantes, 3 días pd, observamos aumentada la
expresión de CXCL9 (n=10 p<0,001), mayor número de células por
ganglio, e incrementada la proporción de células T CD8+ (n=10 p<0,05).
Observamos, además, que las células T CD4+ y T CD8+ presentaron
mayor capacidad proliferativa (n=10 MFI 23.727 vs 17.200; p<0,01) y un
102
Libro de resúmenes
aumento en la producción de IFN-γ (n=10 p<0,05) frente estímulos
específicos.
No observamos diferencias significativas en el título de IgG e IgA.
Por otro lado, evaluamos la respuesta inmune a tiempos tempranos
post-vacunación (48 hs), observando que el grupo VS presentó ganglios
drenantes de mayor peso y un aumento en la producción de IFN-γ e IL6 (n=10 p<0,001); y observamos un aumento en el número de células
NK en la mucosa vaginal.
Nuestros resultados sugieren que la presencia de VS durante la
vacunación promueve una respuesta inflamatoria temprana,
potenciando la subsecuente respuesta T específica de memoria contra
HSV-2, y la protección mediada por IFN-γ.
0164
CLONADO Y EXPRESIÓN DE DISTINTAS PROTEÍNAS DEL VIRUS
DISTEMPER CANINO PARA SU EVENTUAL USO COMO INMUNÓGENOS
DE NUEVA GENERACIÓN
C Romanutti, M Gallo Calderón, L Keller, J La Torre
ICT Milstein, Argentina.
Introducción. El Virus Distemper Canino (VDC), miembro del género
Morbillivirus, familia Paramyxoviridae, es altamente contagioso y de
distribución mundial. Afecta a animales de compañía y a distintas
especies silvestres susceptibles. Durante la década del 60, se
desarrollaron vacunas atenuadas que junto con la aplicación de
medidas preventivas, lograron controlar la enfermedad, pero
recientemente se han registrado a nivel mundial y en Argentina un
aumento de casos de DC tanto en animales vacunados como en no
vacunados. Debido a la falta de actualización de las cepas atenuadas
presentes en las vacunas comerciales, y al ser el VDC un virus con
genoma a ARN, que presenta una alta tasa de mutación (10-3/10-5),
provoca la aparición de cepas emergentes pobremente protegidas por
los anticuerpos vacunales. Es por estos motivos que el objetivo
propuesto en este trabajo, apunta al desarrollo de inmunógenos
recombinantes, de nueva generación, para lograr un mejor y efectivo
control de la enfermedad.
Metodología. Mediante técnicas de ingeniería genética se clonaron los
genes codificantes para la proteína de Fusión (F), la Hemaglutinina (H) y
la Nucleoproteína (NP) viral de distintas cepas de VDC en el vector pCIneo bajo el promotor de Citomegalovirus. Luego el ADN de estos
vectores se transfectó en células BSR y a las 24 y 48 horas post
transfección (hpt), se evaluó la expresión de las proteínas
recombinantes por Western Blot (WB). Por otro lado, el gen de la NP se
clonó en un vector de expresión procariota (pRSET-B). Luego de
transformar bacterias BL21 se realizaron ensayos de inducción a
distintos tiempos, para definir el tiempo óptimo de producción de la
proteína recombinante.
Resultados. Se pudo demostrar la expresión de las proteínas F, H y NP
en células de mamíferos transfectadas con los distintos vectores y
cosechadas a las 48 hpt. Por otro lado, se demostró la expresión de la
NP mediante SDS-PAGE y su identidad fue confirmada por WB. El mayor
nivel de expresión se obtuvo a las 5 h post inducción, tanto en la
fracción insoluble como en el sobrenadante.
Conclusiones. Se lograron expresar las proteínas F, H y NP del VDC en
sistemas de expresión eucariotas y procariotas. Se espera poner a
punto los ensayos de purificación de la NP a partir del sobrenadante de
cultivos inducidos utilizando columnas de afinidad a Ni2+, para
posteriormente ser utilizada como inmunógeno a proteína
recombinante. Por otro lado, se espera obtener plásmidos libres de
LPS, los cuales serán utilizados como posibles vacunas a ADN.
Posteriormente, con los inmunógenos desarrollados, se inmunizarán
ratones y se evaluará la capacidad de dichas vacunas para otorgar
protección a través de ensayos de seroneutralización.
0188
GENERACION DE VACUNAS ALTERNATIVAS CONTRA LA GRIPE
UTILIZANDO VECTORES VIRALES HETEROLOGOS. “DISPLAY” EN LA
SUPERFICIE DE BACULOVIRUS DE 4 COPIAS DE LA PORCION EXTRACITOPLASMATICA DE LA PROTEINA MATRIX 2 (M2E).
JM Morales1, P Molinari2, LA Boado1, N Mattion1, O Taboga2, P Alvarez1
1
Centro de Virología Animal, ICT-Milstein, CONICET, Buenos Aires,
Argentina., Argentina. 2 Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA,
Castelar, Buenos Aires, Argentina., Argentina.
Introducción: La falta de cobertura heterosubtípica de las vacunas en
uso para el control de la influenza humana es un serio problema
potencial dado el tiempo prolongado del sistema de producción actual
para generar una vacuna contra una nueva cepa. El surgimiento de una
cepa de alta virulencia podría convertirse en un problema muy grave.
Por esta razón, es de interés de nuestro laboratorio, la generación de
una vacuna del tipo “universal” contra la gripe. Es decir, una vacuna
que genere una respuesta inmune “cross-protectora” contra distintas
cepas del virus y que, por lo tanto, no requiera de una actualización
anual. Con este objetivo se eligió como antígeno el péptido extracitoplasmático de la proteína Matrix 2 (M2e) ya que se ha demostrado,
que la inmunización con este péptido genera una respuesta inmune
protectora contra el virus de influenza (VI). Además, dado que este
péptido se encuentra altamente conservado entre las distintas cepas de
influenza A, la respuesta generada es, en la mayoría de los casos, crossprotectora. Así también, trabajos previos de nuestro laboratorio
demostraron la capacidad protectora del “display” en la superficie de
baculovirus (Bv) de 1 copia de M2e como fusión a la proteína gp64
(principal glicoproteína de membrana de Bv). Objetivo: Dado que se ha
demostrado que la inmunización con más de una copia del péptido
M2e aumenta significativamente la respuesta obtenida, en este trabajo
decidimos evaluar la capacidad inmunogénica de un péptido
conteniendo 4 copias en tandem de M2e también vehiculizado en la
superficie de Bv. A diferencia de lo realizado en el trabajo anterior, en
este caso el péptido fue fusionado a la secuencia de anclaje en
membrana de la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular
(VSV) y no a la gp64, ya que la fusión a esta secuencia permite el
“display” en la superficie de los viriones no solo en los polos de las
partículas, como ocurre con las fusiones a gp64, sino también en los
laterales de la misma. Metodología: Para generar el sistema de
“display” en la superficie de Bv, utilizamos un vector conteniendo el
péptido señal de gp64 y la región de anclaje de VSV mencionada
previamente. Para obtener los Bv recombinantes se utilizó el sistema
“Bac to Bac” (Invitrogen) de acuerdo a las especificaciones del
fabricante. Resultados: En el presente trabajo se diseñó un
oligonucleótido sintético conteniendo 4 copias de M2e y éste fue
clonado en el vector detallado previamente. Se obtuvieron los
bácmidos recombinantes y se transfectaron células de insecto con
estos bácmidos. Se obtuvieron Bv recombinantes que incorpararon el
péptido 4M2e. Conclusión: Se produjeron stocks purificados de estos
virus recombinantes los que serán utilizados, en la etapa siguiente, para
la inmunización de ratones y evaluar, así, la capacidad protectora de
esta vacuna contra el desafío con virus de influenza.
0195
ENSAYO DE BACULOVIRUS COMO POTENCIAL INMUNOMODULADOR
PARA VACUNAS AVIARES
MS Lucero1 2, E Gómez1 2, S Chimeno Zoth1 2, JM Carballeda1 2, M
Richetta1 3, MJ Gravisaco1, A Berinstein1 2
1
Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA, Argentina. 2 CONICET,
Argentina. 3 ANPCyT, Argentina.
El Virus de la Bursitis Infecciosa (IBDV) es el agente etiológico de una
enfermedad altamente contagiosa e inmunosupresora que afecta
pollos jóvenes causando importantes pérdidas económicas en la
industria avícola. La proteína de cápside VP2 ha sido utilizada para el
desarrollo de vacunas a subunidad en diversos sistemas heterólogos
como alternativa a las vacunas tradicionales basadas en virus vivoatenuado o inactivado. No obstante, dichas vacunas presentan la
desventaja de ser pobres inmunógenos siendo de vital importancia la
utilización de adyuvantes para generar protección efectiva y respuesta
inmune de memoria. Se ha observado que los baculovirus (BV) tienen
potentes propiedades inmunomoduladoras promoviendo respuestas
adaptativas humorales y celulares contra antígenos coadministrados,
evitando las reacciones adversas causadas por los adyuvantes
convencionales. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la
capacidad adyuvante del BV al ser coadministrado junto con VP2
producido en plantas. Para ello, se inmunizaron por vía intramuscular
103
Libro de resúmenes
pollos libres de patógenos específicos de 21 días con extracto de planta
conteniendo 7,5 ug de VP2 solo o adyuvado con adyuvante de Freund o
con BV (107 UFP). Los controles negativos recibieron BV solo o PBS. A
los 14 días post inyección (dpi) se administró una dosis refuerzo. Los
animales fueron sangrados a 0, 8, 14, 17 y 23 dpi y los sueros fueron
analizados para determinar la presencia de anticuerpos específicos
contra VP2. Diez días después del refuerzo los pollos fueron desafiados
per os con 500 µl del virus LZD (6934 TCID50/ml) y al cabo de 5 días
fueron sacrificados. Se extrajeron las bursas y se procesaron para su
observación histológica y para el aislamiento de linfocitos y posterior
análisis por citometría de flujo. Los pollos inoculados con el extracto de
planta conteniendo VP2, adyuvado o no, desarrollaron una respuesta
humoral de altos títulos, mientras que los grupos negativos no
presentaron anticuerpos contra IBDV. Adicionalmente, las bursas de los
animales vacunados con VP2 mostraron una morfología normal y
presentaron una menor infiltración de linfocitos T comparadas con los
grupos control, luego del desafío viral.
En suma, estos resultados demuestran que, en las condiciones de
nuestro ensayo, la coadministración intramuscular de baculovirus, no
logró potenciar la respuesta inmune. Esto podría deberse a una
necesidad de que el antígeno y el baculovirus estén juntos físicamente
y sean procesados por el mismo endosoma. Por esta razón,
actualmente estamos trabajando en la construcción de un baculovirus
que exprese a VP2 en su envoltura para ser evaluado como
inmunógeno recombinante alternativo. Por otro lado, el extracto de
planta conteniendo VP2 es capaz de despertar una respuesta inmune
sin la necesidad de adyuvantes adicionales; sin embargo, no podemos
descartar el beneficio del agregado de adyuvantes no sólo para la
magnitud de la respuesta sino también para su duración en el tiempo.
0199
EVALUACIÓN DE LA INMUNOGENICIDAD DE ANTÍGENOS
RECOMBINANTES DERIVADOS DE LA HEMAGLUTININA DEL VIRUS DE
INFLUENZA EQUINA PARA USO COMO VACUNAS UNIVERSALES
C Caldevilla, Y Paredes Rojas, LI Ibañez, N Mattion
ICT Milstein, Argentina.
Las vacunas convencionales contra influenza equina estimulan una
fuerte respuesta inmune humoral frente a glicoproteínas de superficie,
en particular la hemaglutinina (HA). Sin embargo, el virus sufre
continuos cambios aminoacídicos en los dominios reconocidos por los
anticuerpos, que provocan que los virus escapen a la neutralización y
que las vacunas no generen respuestas cruzadas contra diferentes
cepas. Numerosos trabajos han reportado la existencia de epitopes
altamente conservados en la región del tallo de la HA, que pueden ser
utilizados para mejorar la respuesta inmune cruzada. Con el fin de
generar vacunas que provean dicha protección, diseñamos dos
inmunógenos basados dominios conservados de la HA de un virus
equino aislado en Argentina. El primero es una proteína recombinante
(ΔHAp), el segundo es una secuencia de nucleótidos clonada en
vectores aptos para la generación de vacunas a ADN (ΔHAe). La
inmunogenicidad de ambos antígenos fue evaluada mediante
diferentes protocolos de inmunización.
La secuencia que codifica para ΔHAp fue clonada en el vector pET22b,
se transformó en E.coli y la proteína recombinante fue purificada a
partir de cuerpos de inclusión. La secuencia ΔHAe fue clonada en varios
vectores que fueron transfectados en células HEK 293T para su análisis.
La correcta expresión de las proteínas fue determinada mediante
Western blot. Se establecieron cinco esquemas de inmunización en
ratones BALB/c y se realizaron 2 inmunizaciones con un intervalo de 15
días. El grupo 1 recibió dosis de 50 g/ratón de ADN por vía IM. El
grupo 2 recibió dosis de 10 g de proteína recombinante en adyuvante
incompleto de Freund por vía IP. Los animales del grupo 3 recibieron
una dosis de ADN y un refuerzo con proteína recombinante. El grupo 4
recibió una inmunización inicial con proteína y luego un refuerzo con
ADN. El grupo 5 se utilizó como grupo control no vacunado. Todos los
sueros se evaluaron para determinar la presencia de anticuerpos antiHA mediante ELISA ya sea en placas cubiertas por proteína o virus.
Cuando se analizaron los títulos de anticuerpos en placas cubiertas con
proteína recombinante, se observó que los animales que recibieron
sólo ADN generaron bajos títulos y los vacunados con proteína
mostraron los títulos más altos. En las inoculaciones combinadas de
ambos antígenos, la respuesta inmune sólo mejoró cuando el refuerzo
se realizó con proteína. Cuando los sueros se analizaron en placas
cubiertas con virus, se observó mejor respuesta a la inmunización con
proteína cuando el virus pertenecía al mismo grupo filogenético. Sin
embargo la respuesta frente a virus pertenecientes a diferentes grupos
filogenético fue mejor en el caso de inmunizar con ADN.
Las proteínas se expresaron correctamente en sistemas procarióticos y
eucarióticos. El esquema que mostró mayores títulos de anticuerpos
fue el basado en proteína recombinante, en el caso de analizar
respuesta homotípica, y en ADN en el caso de analizar respuesta
heterotípica.
0202
OBTENCIÓN DE UN ANTISUERO ESPECÍFICO PARA LA DETECCIÓN DE
LA PROTEÍNA ESTRUCTURAL VP2 DEL VIRUS DE LA BURSITIS
INFECCIOSA
M Richetta1 2, E Gómez1 3, MS Lucero1 3, G Calamante1, A Berinstein1 3
1
Instituto de Biotecnología - INTA Castelar, Argentina. 2 ANPCyT,
Argentina. 3 CONICET, Argentina.
La Bursitis Infecciosa es una patología que tiene gran impacto
económico en la producción avícola. Su agente causal, el virus de la
Bursitis Infecciosa (IBDV), ha sido ampliamente estudiado y
caracterizado, determinándose que la proteína viral de cápside VP2 es
el principal antígeno capaz de inducir una respuesta inmune humoral
protectora. En nuestro laboratorio se desarrollan vacunas
biotecnológicas contra IBDV, que poseen a la proteína VP2 como
componente principal. En este contexto, es fundamental la
disponibilidad de una herramienta molecular que permita detectar
específicamente la presencia de la proteína VP2 expresada a partir de
diversos sistemas. Previamente, en nuestro grupo se expresó y
optimizó la purificación de la proteína VP2 recombinante (VP2r) en
bacterias. El objetivo del presente trabajo fue obtener y evaluar la
utilidad de un antisuero policlonal específico para la detección de la
proteína VP2 de IBDV.
Se partió de un cultivo bacteriano (500 ml) que se creció con agitación
hasta alcanzar la fase de crecimiento exponencial (OD600 = 0,5), se
indujo la expresión de VP2r por el agregado de IPTG (0,5 mM) y las
bacterias se colectaron por centrifugación 1 hora post inducción. El
total del pellet bacteriano se procesó usando el método optimizado.
Brevemente, la purificación se realizó en dos etapas: 1) mediante
columnas de afinidad con Ni-NTA agarosa (la proteína VP2r posee un
tracto de seis histidinas en el extremo N-terminal) y, 2) electroforesis
en PAGE-SDS y electroelución. El rendimiento total fue de 1,5 mg de
proteína VP2r pura. Para la obtención del antisuero la proteína VP2r
pura (0,5 mg/dosis) se formuló con adyuvante de Freund, se inmunizó
intramuscularmente (día 0 y 21) un conejo y a distintos tiempos se
realizaron sangrías exploratorias para detectar la presencia de
anticuerpos específicos contra VP2r por Western blot. Además, para
evaluar la utilidad del suero anti-VP2 se realizaron ensayos de Western
blot contra extractos proteicos provenientes de plantas de tabaco
agroinfiltradas (GV3101/pBINPLUS-VP2) y de cultivos celulares
infectados con IBDV o con poxvirus recombinantes que expresan VP2.
Luego de una o dos inmunizaciones fue posible detectar la presencia de
anticuerpos específicos contra VP2r hasta diluciones del suero 1/800 y
1/8000, respectivamente.
Además, el suero anti-VP2 permitió la detección específica de la
proteína de interés a partir de sistemas de expresión utilizados en el
desarrollo de vacunas biotecnológicas: plantas y poxvirus (MVA y
FWPV) recombinantes. Finalmente, la proteína VP2 fue también
detectada en el contexto de la infección de IBDV en cultivos celulares o
en aves (en homogenatos de bolsa de Fabricio).
En conclusión, se obtuvo un antisuero específico (de alto título) contra
la proteína VP2 de IBDV que constituye una herramienta de suma
utilidad para el trabajo en nuestro laboratorio y para la detección de
IBDV en muestras biológicas.
104
Libro de resúmenes
0230
EFECTO ANTIVIRAL DE BACULOVIRUS EN POLLOS. EVALUACIÓN DE
DIFERENTES RUTAS Y ESQUEMAS DE INOCULACIÓN.
S Chimeno Zoth1 2, JM Carballeda1 2, MS Lucero1 2, E Gómez1 2, M
Richetta1 3, MJ Gravisaco1, A Berinstein1 2
1
Instituto de Biotecnología-INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina. 3
ANPCyT, Argentina.
Los Baculovirus (BVs) son virus a ADN que infectan insectos y han sido
utilizados como bioinsecticidas y como sistemas productores de
proteínas foráneas. Existen diversos reportes que demuestran que los
BVs tienen además una potente actividad adyuvante sobre el sistema
inmune de mamíferos y estudios recientes de nuestro grupo indican
que esta propiedad también se comprueba para aves. El Virus de la
Bursitis Infecciosa (IBDV) es un agente endémico en la mayoría de las
regiones productoras avícolas, que causa una enfermedad
inmunosupresora aguda, sumamente contagiosa de pollos. El objetivo
de este trabajo fue estudiar el efecto antiviral de BV contra IBDV,
considerando diferentes esquemas y rutas de inoculación. Pollos SPF
White Leghorn de 28 días fueron inoculados por vía endovenosa con
108 ufp de BV Autographa californica nuclear polyhedrosis virus 3 horas
antes o 3 horas después de recibir una dosis oral (2x103 TCID50) de una
cepa intermedia de IBDV con sus correspondientes controles. Con la
intención de explorar otra ruta de inoculación, se realizó un segundo
ensayo en el que los pollos se inocularon por vía intranasal con 1,7x107
ufp en cada narina de BV, 3 hs antes de la infección con IBDV. En ambos
experimentos, los animales fueron sacrificados a 5 dpi y se procesaron
las bursas para la extracción de ARN (medición de citoquinas por RT
PCR en tiempo real) y para aislamiento de linfocitos (análisis por
citometría de flujo). Otra porción de cada bursa fue conservada para
aislamiento viral. Los resultados mostraron que la administración de BV
3 horas después de la inoculación de IBDV produce importantes
cambios en el efecto que IBDV causa en la bursa. Mientras la infección
induce infiltración de linfocitos T, la inoculación de BV disminuye este
evento. También pudimos observar una disminución en la expresión de
IL-6 e IFNγ y una inhibición de la replicación viral en la bursa. El
tratamiento con BV previo a IBDV también atenuó los efectos de la
infección pero los resultados no fueron tan concluyentes como en el
tratamiento post IBDV. Por último, la administración intranasal de BV
indujo una fuerte respuesta inflamatoria y, al menos en las condiciones
evaluadas en nuestro ensayo, no logró disminuir la replicación de IBDV.
Los resultados obtenidos demuestran la capacidad antiviral de
baculovirus en pollos y promueven la profundización de los estudios
para definir las dosis y rutas de inoculación apropiadas para lograr el
efecto deseado.
0238
VEDEVAX®: PRIMERA VACUNA A SUBUNIDAD RECOMBINANTE
REGISTRADA CONTRA EL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA
D Bellido1, A Pecora2, MS Perez Aguirreburualde2, MM Vena3, MJ Dus
Santos2, JA Escribano4, A Wigdorovitz2
1
Vetanco SA, Argentina. 2 Instituto de Virología, INTA Castelar,
Argentina. 3 Incuinta, Argentina. 4 Algenex, España.
El virus de la diarrea viral bovina (VDVB) es un virus que causa
importantes pérdidas económicas al sistema agropecuario, debido a
diversos factores como son, la constante circulación de virus en todos
los sistemas productivos, la variedad de síntomas que los animales
infectados pueden presentar (abortos, malformaciones, cuadros
respiratorios, enfermedad de las mucosas) y a las dificultades que
presenta el control de la diseminación viral. Una de las herramientas
más utilizadas para controlar a éste y otros agentes infecciosos, es la
vacunación de los animales susceptibles. En el caso del VDVB, las
vacunas suelen tener dificultades para generar respuestas inmunes
efectivas y duraderas, debido, principalmente, a que la producción a
escala industrial del VDVB no logra alcanzar altos títulos virales. Para
subsanar esta dificultad, Vetanco SA junto con Algenex se asociaron al
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) y decidieron
generar una vacuna a subunidad basada en la proteína
inmunodominante del virus, la glicoproteína E2, fusionada a un
anticuerpo de simple cadena (APCH), que tiene la capacidad de dirigir
los antígenos a células presentadoras del sistema inmune.
Para la expresión de la proteína de fusión APCH-E2, se escogió el
sistema de Baculovirus Recombinante. El antígeno se expresó en el
sobrenadante de cultivo con niveles de 2 (± 0,5) mg/lt de cultivo. Una
vez obtenido el antígeno, la vacuna se formuló en adyuvante oleoso,
utilizando 1,5 ug de APCH-E2 por dosis.
La generación de la vacuna se realizó siguiendo todas las indicaciones
del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA),
de acuerdo a las normativas internacionales y bajo GMP. Se realizaron
los bancos Maestro y de Trabajo tanto de las células SF9 como del
baculovirus APCH-E2, con sus respectivos controles: cariotipos,
certificado de libre de virus adventicios y micoplasma, identidad de
secuencia, pureza y viabilidad. La producción del antígeno se realizó de
manera controlada al igual que la formulación de la vacuna.
La vacuna APCH-E2 se evaluó en 16 bovinos (8 controles y 8 tratados),
obteniendo títulos neutralizantes mayores a 3 (60 dpv). Estos animales,
a su vez, lograron mantener niveles de anticuerpos neutralizantes
superiores a 2, por al menos, un período de 12 meses. La vacuna fue
evaluada en el modelo cobayo sugerido por la autoridad sanitaria para
el control de la inmunogenidad de vacunas virales bovinas. Se
obtuvieron títulos neutralizantes que superaron en un 96% el sitio de
corte establecido.
Estos resultados permitieron generar un dossier que fue presentado
ante el SENASA, el cual fue posteriormente aprobado. Actualmente, se
está produciendo la primera serie control, por lo que Vedevax se
convierte en la primera vacuna a subunidad recombinante en bovinos
aprobada para su comercialización en el país.
0242
ANÁLISIS DE IMPACTO DE UNA CEPA ATENUADA DEL VIRUS DE LA
LEUCOSIS BOVINA
M Sowul1, G Gutiérrez2 3, I Alvarez2 3, D Franco4, A Vilor5, JP Jaworski2 3,
N Gillet6, L Calvinho7, L Willems6, K Trono2
1
DEyAR-DNSA-SENASA, Argentina. 2 Instituto de Virologia, CICVyA,
INTA, Argentina. 3 CONICET, Argentina. 4 Campo Experimental de
Animales de Producción, CICVyA, INTA, Argentina. 5 Establecimiento La
Pia, Marcos Paz, Argentina. 6 University of Liège (ULg), Bélgica. 7 EEA
Rafaela, INTA, Argentina.
En nuestro país, más del 80% de los bovinos de tambo están infectados
con el Virus de la leucosis bovina (BLV), contra el cual no existe ningún
sistema de prevención o tratamiento disponible. Entre ellos, el 10%
muere cada año como consecuencia de lesiones neoplásicas del
sistema linfático (linfosarcomas). El propósito integral de nuestro grupo
de trabajo consiste en contribuir en la maduración de un sistema
profiláctico para prevenir la transmisión de la infección. El sistema se
basa en el uso de una cepa viral atenuada por modificación genética
que, si bien es infectiva y capaz de provocar una respuesta inmune,
posee baja capacidad replicativa y reducido potencial patogénico. La
idea central consiste en infectar al hospedador con un competidor
discapacitado para replicar, enfermar y contagiar, pero que le permita
resistir el desafío natural presente en el campo. Las características
candidatas de la cepa atenuada han sido previamente identificadas,
analizadas y confirmadas en ensayos in vivo. En este trabajo se
realizaron análisis de la seguridad asociada al uso de la cepa, con el
propósito de definir el impacto sobre el hospedador natural y/o el
efecto potencial sobre los posibles consumidores de productos
provenientes de animales inoculados con la cepa modificada.
Los ensayos de infectividad in vivo mostraron que la transferencia de 1
ml de sangre fresca de un animal infectado con la cepa vacunal, no
provoca la infección en terneros receptores susceptibles (n = 6). En
cambio, la transferencia de 100 ul de sangre de un bovino infectado
natural de alta carga proviral, así como 1 ml de sangre de un bovino
infectado natural con baja carga proviral, fueron capaces de provocar la
infección en terneros receptores (4/4 y 3/7, respectivamente).
Complementariamente, la leche proveniente de 10 animales infectados
con la cepa vacunal no presentó evidencia de provirus, ni tampoco de
infectividad (0/7) cuando el pellet de células viables proveniente de 50
ml de leche fresca fue inoculado en corderos receptores susceptibles (2
por muestra). Además, los terneros nacidos de madres infectadas con
cepa atenuada mostraron presencia de anticuerpos específicos en
sangre. Ninguno presentó evidencia de infección perinatal (0/21).
105
Libro de resúmenes
Los resultados de este trabajo agregan información que permitirá
evaluar el producto que se utilizaría potencialmente en un sistema
profiláctico y colaborar con las autoridades sanitarias en la actividad
desregulatoria asociada a los microorganismos modificados. La
propuesta integral futura consiste en analizar el peligro que encierra el
uso de la cepa y evaluar los riesgos asociados a dicho peligro con el
objetivo final de gestionar instancias de intervención adecuadas para
reducirlo a niveles insignificantes, para lo cual se realizarán ensayos de
validación de la inactivación viral por tratamiento térmico y ensayos de
equivalencia sustancial de leche proveniente de animales infectados
con la cepa vacunal.
0257
EXPRESIÓN DE LA GLICOPROTEÍNA J DEL VIRUS DE
LARINGOTRAQUEITIS INFECCIOSA AVIAR EN LA ENVOLTURA VIRAL DE
BACULOVIRUS Y SU CAPACIDAD DE ACTIVACIÓN DE PBMCS DE AVES.
S Morales, J Bendezú, W Medina, L Choque, A Figueroa, A Montalvan,
M Fernández
Farvet SAC., Laboratorio de Biotecnología Molecular y Genómica.
Panamericana Sur N° 766 Km 198.5, Chincha Alta, Ica, Perú.
El virus de laringotraqueitis infecciosa aviar (ILTV, siglas en inglés) es el
agente causante de pérdidas económicas en la industria avícola
mundial. ILTV, subfamilia alphaherpesviridae, causa reducción en la
producción de huevos así como desórdenes agudos en el tracto
respiratorio de pollos que conllevan a la muerte por asfixia. El
desarrollo de nuevas vacunas que confieran una mayor protección de la
respuesta inmune es necesario para evitar la diseminación de los focos
de infección causados por ILTV. La glicoproteína J (gpJ) representa el
principal antígeno presente en la envoltura viral de ILTV y está
relacionado a procesos de invasión. Debido a éstas características, gpJ
ha sido seleccionado como un potencial candidato a vacuna.
Se obtuvo un baculovirus recombinante que exprese en su membrana
viral la gpJ fusionada a la proteína Dsred2 (Bv-gpJ). Mediante ensayos
de Western blot utilizando anticuerpos anti his se detectó la presencia
de la gpJ en membranas de células de insecto a los días 1 y 2 postinfección utilizando MOIs de 1, 5 y 20. Se utilizó el Bv –gpJ y baculovirus
wild- type para infectar células de insecto que luego de fueron lisadas y
sus membranas utilizadas como antígenos para ensayos de ELISA
indirecto con sueros de aves infectadas experimentalmente con ILTV,
estos ensayos confirmaron la presencia de gpJ en las células de insecto
infectadas.
El sobrenadante de las células infectadas fueron concentrandas por
filtración tangencial (10 veces), seguido de un paso de
ultracentrifugación en sucrosa (10 veces) para obtener Bv-gpJ
concentrado. Este concentrado fue utilizado para ensayos de
seroneutralización con sueros de aves infectadas con ILTV así como
sueros de pollos libres de patógenos (SPF, siglas en inglés) en células
insecto. No se detectó fluorescencia a los 7 días post-infección en los
sueros de aves infectadas hasta la dilución 1/16 demostrando así la
posible exposición de gpJ en la membrana viral de baculovirus y su
reconocimiento por anticuerpos presentes en el suero. Además, los Bv
concentrados fueron utilizados para ensayos de transducción en células
mononucleares periféricas sanguíneas (PBMCs, siglas en inglés) de
aves. Se determinó una relación lineal entre la dosis de baculovirus
modificados utilizados para transducir PBMCs (expresados en MOIs)
con la producción de IL-12 (pg/ml) y la expresión de MHC-2 en la
superficie de los PBMCs (1.5 veces).
Una vacuna es óptima si es capaz de evocar una respuesta inmune
primaria frente al agente extraño, para este caso la producción de IL12
y PBMCs expresando MHC-2 es un indicio de la activación de los
PBMCs, lo que indica que Bv-gpJ es capaz de estimular la respuesta
immune innata del ave. Futuros ensayos son necesarios para
corroborar su potencial como vacuna.
0263
VIPERINA, UN FACTOR DE RESTRICCIÓN EN LA INFECCIÓN CON EL
ARENAVIRUS JUNÍN
J Peña Cárcamo1, C Sobarzo2, V Guazzone2, S Cordo1, C García1
1
Laboratorio de Estrategias Antivirales, Departamento de Química
Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de
Buenos Aires. IQUIBICEN-CONICET, Argentina. 2 Instituto
Investigaciones Biomédicas (INBIOMED) UBA-CONICET, Argentina.
de
La respuesta inmune innata es la primera línea de defensa contra los
patógenos. El principal receptor de reconocimiento de patrones que
sensa la entrada de RNA viral de cadena simple en el citoplasma celular
es la proteína RIG-I. Su activación induce la producción de interferón
(IFN), y en consecuencia la síntesis de genes estimulados por IFN (ISGs)
que bloquean distintas etapas del ciclo de replicación viral. Viperina
(VIP) es una proteína reportada como factor de restricción viral y cuya
expresión es inducida por IFN. Nuestro objetivo es la caracterización de
factores de restricción viral en las infecciones con virus Junín (JUNV),
agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina. En el presente
trabajo se evaluó la respuesta de IFN y el rol de VIP durante la infección
con JUNV en la línea celular humana HepG2. JUNV es un arenavirus
envuelto con genoma fragmentado de RNA simple cadena que posee
una estrategia de expresión ambisentido. El fragmento L codifica la RNA
polimerasa RNA dependiente y la proteína Z; mientras que el
fragmento S codifica la proteína de la nucleocápside N y el complejo
glicoproteico.
En primer lugar se analizó la activación de RIG-I frente a la infección con
JUNV. Los resultados de PCR cuantitativa mostraron que este sensor
responde a la presencia del virus en la célula. Luego, se analizaron los
niveles relativos de mRNAs de VIP, y se observó un aumento de estos
mRNAs tanto a las 24 como a las 48 h post infección (p.i.). Asimismo, se
evaluó por inmunofluorescencia la expresión de VIP en células HepG2
infectadas. Las imágenes mostraron una expresión de VIP a las 24 h p.i.,
sin embargo no se observó expresión de esta proteína a las 48 h p.i.
Posteriormente, se transfectaron células con siRNAs específicos para
VIP y luego se infectaron con JUNV. Los niveles de mRNAs virales fueron
10 veces más abundantes en las células donde la expresión de VIP
estaba reducida por los siRNAs.
Por otro lado, está reportado que en estructuras celulares llamadas
Lipid Droplets (LDs), VIP colocaliza con complejos de replicación viral.
Interesantemente, estas estructuras se vieron aumentadas en número
y tamaño en células infectadas con JUNV. El siguiente paso fue evaluar
por microscopía confocal la posible localización de las proteínas de
JUNV en estas estructuras lipídicas. Para esto las células fueron
infectadas y a las 48 h p.i. se revelaron los antígenos virales, y se
visualizaron los LDs con una sonda específica fluorescente. Se observó
la localización de la proteína N de JUNV en los LDs de las células HepG2.
La localización celular de las proteínas virales en LDs y la expresión de
VIP en estas células, podría sugerir interacciones a nivel de estas
estructuras, confirmando un posible rol antiviral de VIP en la infección
con arenavirus.
El estudio de estos factores antivirales celulares permitirá ampliar
nuestro conocimiento sobre los mecanismos replicativos y al mismo
tiempo aportará información para el diseño de estrategias antivirales.
0288
LOS ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES DIRIGIDOS CONTRA GP64 NO
AFECTAN LA INDUCCIÓN DE RESPUESTA INMUNE INNATA NI LA
INDUCCIÓN DE ESTADO ANTIVIRAL PERO SI LA RESPUESTA
CITOTÓXICA ESPECÍFICA PARA EL ANTÍGENO TRANSPORTADO EN LA
CÁPSIDE DEL BACULOVIRUS.
P Molinari1, G Molina1, E Tavarone1, S García-Nuñez2, G Moron3, O
Taboga1
1
INTA-CONICET, Argentina. 2 INTA, Argentina. 3 CIBICI-CONICET,
Argentina.
Los baculovirus (BV) son una familia de virus que infectan artrópodos.
Los BV tienen fuertes propiedades adyuvantes, promoviendo
respuestas humorales y celulares contra antígenos coadministrados, la
maduración de células dendríticas (CD) y la producción de mediadores
inflamatorios. Estudios previos realizados por nuestro grupo
demostraron que los BV inducen un estado antiviral que otorga
protección frente a un desafío letal de FMDV en el modelo murino y
que el transporte de un antígeno en la cápside (“capsid display”) de los
BV permite la inducción de una fuerte respuesta citotóxica antígeno
específica in vivo.
Para avanzar en la utilización de este vector vacunal, ya sea para
estrategias de prime-boost o para la vacunación con antígenos
106
Libro de resúmenes
diferentes, es importante conocer el efecto de la respuesta inmune
contra el carrier (BV) en el impacto en la respuesta innata y en la
inducción de una primo respuesta.
En este trabajo se estudió el impacto de los baculovirus en la respuesta
innata y en la respuesta citotóxica específica contra el antigeno
transportado en la cápside en un escenario en el que existe una
respuesta inmune específica previa contra el BV.
Para evaluar el efecto sobre la respuesta inmune innata, se realizaron
ensayos en los que se incubaron BV con sueros de ratones inmunizados
previamente con BV (in vitro) o se inyectaron BV en ratones
previamente inyectados con BV (in vivo). Ambos ensayos mostraron
que la respuesta inmune innata contra la segunda inyección de BV no
se vio afectada por la respuesta inmune humoral previa, medida como
la inducción de IL6 e IFNg y de un estado antiviral efectivo contra
FMDV.
Para evaluar el efecto en la respuesta citotóxica específica contra un
antígeno transportado en la cápside (BV/OVA), se inmunizaron ratones
con BV o se preincubaron viriones BV/OVA con un suero policlonal anti
BV o el anticuerpo monoclonal V1 dirigido contra la glicoproteína de
superficie GP64 y se evaluó la inducción de linfocitos T CD8 citotóxicos
específicos contra OVA mediante un ensayo de citotoxicidad in vivo. En
los ratones inmunizados con BVOVA se obtuvo un 90 % de lisis
específica, mientras que en los inmunizados con BVOVA previamente
inmunizados con BV, con BVOVA neutralizados con Mab o
preincubados con el suero anti BV, se obtuvieron porcentajes de lisis
entre 0 y 10%.
En conjunto, la inducción de la respuesta inmune innata por los BV no
se ve afectada en un escenario de respuesta humoral preexistente,
mientras que la respuesta citotóxica específica contra el antígeno
transportado OVA sí se ve afectada, siendo los anticuerpos
neutralizantes responsables de dicha inhibición.
0293
DESARROLLO DE UNA PLATAFORMA PARA LA PRODUCCIÓN DE
VACUNAS VIRALES. CASO: VACUNA ANTIRRÁBICA PARA HUMANOS
CA Palacios1 2, AV De Nichilo1, OP Larghi3, AD Parola1 2
1
Fundación Pablo Cassará, Saladillo 2452, Buenos Aires, Argentina. 2
Instituto de Ciencias y Tecnología Dr. César Milstein – CONICET.
Saladillo 2468, Buenos Aires, Argentina. 3 Laboratorio Pablo Cassará,
Carhué 1096, Buenos Aires, Argentina.
La rabia es una zoonosis aguda ocasionada por virus del genero
Lyssavirus, siendo letal en casi el 100% de los casos. Infecciones con el
virus rábico causan al menos 55.000 muertes anuales en el mundo,
aunque en el mismo período más de 15 millones de personas reciben
tratamiento con vacunas antirrábicas. En nuestro país aún se producen
vacunas para humanos a partir de cerebro de ratón y de rata lactantes,
a pesar de haber sido desaconsejadas por la OMS desde 1984. Los
avances en los sistemas de cultivos de células para la propagación de
virus han llevado a un gran incremento en el desarrollo de vacunas
virales. En particular, Vero es la línea celular continua con mayor
aceptación por las autoridades regulatorias para la producción de
vacunas para humanos. La misma ha sido utilizada por más de 30 años
para la producción de vacunas contra poliovirus y el virus de la rabia y
más recientemente para vacunas contra rotavirus, viruela, influenza,
hepatitis A y encefalitis Japonesa. Establecer una plataforma de
producción de vacunas virales para su uso en humanos es de gran
interés para la industria nacional, permitiendo abrir un camino que
pueda abastecer en un futuro, el mercado de vacunas local y regional.
En este sentido, el objetivo del siguiente trabajo ha sido establecer una
plataforma de cultivos celulares en un biorreactor a escala piloto, la
puesta a punto de un proceso de producción del antígeno rábico, y el
desarrollo de metodologías analíticas para control de proceso y de
calidad. En este trabajo se muestran los resultados obtenidos en lotes
pilotos, donde inicialmente se cultivaron células Vero sobre
microesferas alcanzando una densidad de 2,5 - 3,5 x 106 células/ml. Las
células se obtuvieron de un banco maestro de células Vero (CCL 81
ATCC) con controles de esterilidad e identidad celular (por secuencia y
perfil de isoenzimas). El desarrollo del cultivo se monitoreó por
recuento de núcleos, y se realizó un seguimiento de metabolitos
(glucosa y lactato). Las células Vero se infectaron con la cepa Pitman
Moore del virus rábico a una multiplicidad de infección de 0,1 y se
monitoreó el avance de la infección cualitativamente por medio de
inmunofluorescencia y estado del cultivo, y cuantitativamente por
medio de contenido de glicoproteína viral. La productividad mínima de
los procesos pilotos fue de 12.000 dosis de vacuna antirrábica para
humanos (previo a su purificación) y 30.000 dosis de vacuna para
animales. Es importante destacar que la plataforma de cultivo de
células Vero desarrollada en nuestro laboratorio, puede ser empleada
en el futuro para propagar otros virus o vectores virales como agentes
vacunales, tanto de interés veterinario como de medicina humana.
0294
ESTABLECIMIENTO DE LA ESPECIFICACIÓN INTERNA DE SUERO
HIPERINMUNE DE CONEJO ANTI VIRUS JUNIN PARA LOS ENSAYOS IN
VITRO E IN VIVO DE LIBERACIÓN DE LA VACUNA CANDID # 1.
J Chale, G Gamboa, A Maiza, A Bottale, S Fossa, L Riera
Instituto Nacional de Enfermedades Virales Huamans “Dr. Julio I.
Maiztegui” – INEVH – ANLIS, Argentina.
El suero hiperinmune anti virus Junin es un reactivo biológico que se
utiliza en el control de calidad de la vacuna Candid # 1 en los ensayos
de liberación de lote que fueron establecidos por el desarrollador de la
vacuna y declarados ante la Autoridad Regulatoria Nacional. Los
ensayos que involucran la utilización del suero son: identidad de la
vacuna Candid # 1, seguridad en cultivos celulares y seguridad en
animales. El objetivo del presente trabajo fue estandarizar los títulos de
anticuerpos específicos del suero hiperinmune obtenido en conejos
para su utilización en ensayos in vivo e in vitro de control de calidad de
la vacuna Candid # 1 mediante el estudio de parámetros de calidad. El
ensayo consiste en la medición de anticuerpos neutralizantes por
reducción de placas lisis en células Vero C76. Los parámetros
estudiados para caracterizar el suero fueron: precisión intermedia y
linealidad. Para los mismos se utilizó virus Junin de referencia (VR) Cepa
Candid # 1, y distintos lotes de suero hiperinmune. La linealidad se
estableció a partir de 12 determinaciones realizadas en distintas
diluciones 1:500, 1:1000, 1:2000 de distintos lotes de suero y para la
precisión intermedia se realizaron 22 determinaciones con distintas
muestras de lotes de VR, distintos lotes de suero, a distintos horarios y
distintos analistas. Se calculó la incertidumbre expandida (U) a partir
del desvío estándar obtenido en el ensayo de precisión intermedia.
Ambos materiales biológicos aportan una variabilidad al método que
resulta necesario conocer y controlar. El grado de heterogeneidad es
evidenciado por el coeficiente de variación (CV=5.0 %) obtenido en la
prueba de precisión intermedia. El ensayo demostró un
comportamiento lineal para distintas diluciones del suero (R2= 0.9793).
Luego de la validación de la metodología, se calculó la U asociada a la
expresión del resultado del título de suero y de esta forma se logró
establecer la especificación del suero para el uso previsto. El título
promedio obtenido fue de 3 unidades logarítmicas (1000) por lo que
incorporando la U calculada (0.30 unidades logarítmicas) se establece la
especificación en (3 +/- 0.30) para el título de suero: de 500 a 2000. Los
antisueros estudiados que son utilizados además para ensayos de
seguridad en animales y cultivos celulares, han demostrado poseer el
título de anticuerpos suficiente para neutralizar el virus vacunal y no
provocar interferencias en los ensayos de seguridad en sustratos
biológicos susceptibles a la cepa Candid # 1 como son los ratones
lactantes y las células Vero. La estandarización realizada reviste una
gran importancia ya que el reactivo en estudio produce un fuerte
impacto en la consistencia de los resultados de los ensayos de control
de calidad.
0302
ESTUDIO DE LA CAPACIDAD INMUNOESTIMULATORIA DE LOS
BACULOVIRUS DERIVADOS DE CUERPOS DE OCLUSIÓN EN EL MODELO
MURINO
GN Molina1 2, O Taboga1 2, P Molinari1 2
1
CONICET, Argentina. 2 Inst. Biotecnología, INTA, Castelar, Argentina.
Los baculovirus son virus que infectan principalmente insectos. Su ciclo
de vida es bifásico, con dos tipos de viriones: los virus derivados de
cuerpos de oclusión (ODV) incluídos en la matriz de los poliedros y los
107
Libro de resúmenes
virus brotados (BV). Aunque sus nucleocápsides son prácticamente
idénticas, difieren en el origen y la composición de sus envolturas.
Aunque incapaces de replicar en células de mamífero, los BV son
utilizados para transducir construcciones génicas y para el desarrollo de
vacunas debido a los efectos que producen en el sistema inmune.
Estudios previos realizados por nuestro grupo demostraron que el
transporte de un antígeno en la cápside de los BV permite la inducción
de una fuerte respuesta citotóxica antígeno específica in vivo. Sin
embargo, en una segunda inoculación, estos efectos se ven alterados
debido a la inmunidad previa específica contra el vector.
Dado que los ODV poseen los mismos patrones moleculares asociados a
patógenos que los BV pero distinta envoltura, es posible que impacten
en el sistema inmune innato de mamíferos sin verse afectados por la
respuesta inmune humoral preexistente. Por esta razón, el objetivo del
presente trabajo fue evaluar la capacidad inmunoestimulatoria de los
cuerpos de oclusión y los ODV.
Para estudiar el impacto en el sistema inmune innato, se inocularon
ratones C57 BL/6 por vía intravenosa con ODV y poliedros y, como
controles, BV, poliedrina y PBS. A las 6 horas fueron sangrados a blanco
y se realizó el dosaje de citoquinas mediante ELISA. A pesar de que los
BV indujeron altos valores de IL-6, IL-12 e IFN-γ, la inoculación de ODV o
poliedros resultó en niveles significativamente menores (p<0,05),
siendo similares a los basales del control con PBS.
Con el fin de estudiar la interacción de células dendríticas derivadas de
médula ósea murina (BM-DC) con ODV o con poliedros, se realizaron
ensayos de inmunomicroscopía confocal incubándolos a 37°C. Se
detectó la presencia de ODV (mediante anticuerpo α-vp39) dentro de
estas células colocalizando con marcadores de endosomas tardíos y
lisosomas y se observó que a las 24 hs los poliedros habían sido
fagocitados pero no disueltos.
Para evaluar la capacidad de los ODV de inducir la maduración de BMDC, se incubaron estas células durante 18 hs en distintas condiciones
con ODV y, como controles, BV, LPS, poliedrina y medio de cultivo. Se
evaluó el aumento de marcadores de maduración fenotípica (CD86 y
MHCII) en células CD11c+ mediante marcación con anticuerpos y
análisis por citometría de flujo y se cuantificaron por ELISA los niveles
de IL-6 secretada al sobrenadante. Los ODV no tuvieron la capacidad de
los BV para inducir la maduración de BM-DC en cuanto a expresión de
marcadores ni en producción de IL-6.
Los resultados obtenidos indican que los ODV de AcMNPV, así como los
poliedros enteros, no estimulan la secreción de citoquinas en ratones y,
a pesar de ser capaces de ingresar a compartimentos acídicos dentro de
las BM-DC, tampoco inducen su maduración.
0304
VÍA DE PRESENTACIÓN ANTIGÉNICA DE LOS BACULOVIRUS EN
CÉLULAS DENDRÍTICAS MURINAS
P Molinari1, I Cebrián2, G Morón3, LS Mayorga2, O Taboga1
1
INTA-CONICET, Argentina. 2 IHEM-CONICET, Argentina. 3 CIBICICONICET, Argentina.
Los baculovirus (BV) son una familia de virus que infectan artrópodos.
Son virus envueltos a ADN doble cadena y patógenos para los insectos.
Los BV tienen fuertes propiedades adyuvantes en mamíferos,
promoviendo respuestas humorales y celulares contra antígenos
coadministrados. Asimismo, estimulan la maduración de células
dendríticas (DC) y la producción de mediadores inflamatorios. Estudios
previos realizados por nuestro grupo demostraron que el transporte de
un antígeno en la cápside de los BV induce una fuerte respuesta
citotóxica antígeno específica in vivo. Sin embargo, dicha respuesta no
se desencadena cuando el antígeno es transportado en la superficie del
BV.
Para entender el mecanismo de presentación del antígeno modelo
ovoalbúmina (OVA) expresado en la cápside de los BV, se estudió el
tráfico intracelular de BV-OVA en DCs mediante inmunofluorescencia y
análisis por microscopía confocal y electrónica.
Los estudios realizados permitieron demostrar que BV-OVA alcanza
compartimentos endosomales una hora post-infección. Además, se
determinó que las proteínas mayoritarias de la envoltura (GP64) y de la
cápside (VP39) permanecen juntas hasta las 3 horas de infección, para
luego desasociarse. Por otro lado, se observó un reclutamiento
temprano (1 hora post-infección) de moléculas MHCI a los
compartimentos BVs+. También se estudió la colocalización del virus
con marcadores del retículo endoplasmático y lisosomas. Finalmente,
mediante microscopía electrónica se pudo visualizar al virus en las
diferentes instancias de infección de las DC, es decir, en membrana
plasmática, compartimentos intracelulares y en el citoplasma.
Los resultados obtenidos hasta el momento sugieren que los BV
ingresan íntegros a compartimentos subcelulares de las DC, y tras un
proceso de acidificación mediado por vesículas lisosomales, la cápside
viral alcanza el citoplasma.
0310
PRESENTACIÓN ANTIGENICA EN BACULOVIRUS: LA LOCALIZACIÓN Y
ESTRATEGIA DE PRESENTACIÓN DETERMINAN EL TIPO DE RESPUESTA
CONTRA EL ANTÍGENO VECTORIZADO
E Tavarone1 2, S Amalfi1, P Molinari1 2, O Taboga1 2
1
Instituto de Biotecnologia, INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina.
En la búsqueda de estrategias de presentación de antígenos
heterólogos y para montar respuestas humorales o celulares,
modulando y adyuvando adecuadamente cada tipo de respuesta, los
baculovirus (BV) están siendo estudiados como vectores vacunales con
resultados promisorios. Desde hace algunos años diversos grupos de
investigación exploraron diferentes sistemas de presentación
antigénica utilizando el BV AcNPV mediante la expresión de
polipéptidos en la superficie de viriones brotados (peplomérica como
fusiones a la glicoproteína GP64 o distribuida en toda la superficie viral
por fusión a porciones de la proteína G del virus de la estomatitis
vesicular, VSV) o por síntesis de novo de los antígenos heterólogos
mediante transducción de células de mamífero. Recientemente nuestro
grupo desarrolló la estrategia de presentación cruzada de antígenos por
fusión a la proteína de cápside VP39 (presentación en nucleocápside)
para la generación de respuestas de tipo citotóxico. Si bien las distintas
estrategias seguidas por diferentes autores mostraron ser eficaces para
despertar respuestas inmunes, la individualidad de cada análisis no
permite comparar las respuestas generadas. Así, el objetivo de este
trabajo fue contrastar vis a vis las diferentes estrategias de
presentación antes mencionadas. Para esto se construyeron y
caracterizaron BV que transportan el antígeno modelo ovoalbúmina
(OVA) fusionado a los dominios de transmembrana y citosólico (CTD) de
la proteína G de VSV (BV OVAsd), a la glicoproteína baculoviral Gp64
(BV OVAsup), a la proteína de cápside VP39 (BV OVAcap) o lo
transcriben a partir del promotor mamífero CAG (BV OVAcag). Tras su
caracterización molecular, se inocularon ratones BALB/c con 3 dosis de
1x108 ufp de BVs por vía IP y 1x107 ufp de BVs por vía IM, con
intervalos de dos semanas, se evaluó la respuesta humoral anti OVA
mediante ELISA directo y se analizó el perfil de IgG generado. Sólo los
grupos BV OVAsd y OVAsup generaron anticuerpos específicos. El grupo
BV OVAsd mostro un nivel de respuesta muy superior al grupo OVAsup
y un perfil IgG tipo 2a. Por otro lado, la respuesta celular fue
determinada mediante un ensayo de citotoxicidad in vivo tras la
inoculación de ratones C57BL/6 con una única dosis de 5x107 ufp de
BVs por vía IV, siendo el grupo BV OVAcd el que mostró mayor
porcentaje de citotoxicidad (96,6% vs 12,3% para OVAsup y menos del
3% para el resto).
Los resultados obtenidos en este trabajo nos permitieron concluir que
las estrategias de presentación en la superficie son más adecuadas para
la inducción de respuestas humorales (siendo más eficiente la
distribución en toda la superficie que la distribución peplomérica y
fuertemente perfilada al tipo Th1) mientras que la presentación
cruzada de OVA transportada en la cápside resultó más adecuada para
despertar respuesta citotóxica.
0340
DELECIÓN DE GENES INMUNOMODULADORES DEL GENOMA DE MVA:
EFECTO SOBRE SU INMUNOGENICIDAD
MP Holgado1, CA Maeto1, J Falivene1, MP del Médico-Zacaj2, G
Calamante2, MM Gherardi1
1
Instituto INBIRS, UBA-CONICET, Buenos Aires, Argentina. 2 Instituto de
Biotecnología – CICVyA - INTA Castelar, Buenos Aires, Argentina.
108
Libro de resúmenes
El virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) aún conserva genes
relacionados con la evasión de la respuesta inmune del huésped.
Previamente, nuestro grupo reportó la optimización del potencial
vacunal de este vector al cual se le había delecionado el gen C12L, que
codifica para una proteína de unión a IL-18. En este trabajo analizamos
la inmunogenicidad del vector MVA luego de la deleción dos genes
virales: el A44L, implicado en la síntesis de hormonas esteroideas, y el
A46R, que inhibe la señalización de receptores Toll (MVAΔA44L-A46R:
MVAd). Como así también el análisis de las tres deleciones en
simultáneo (MVAΔC12L/ΔA44L-A46R: MVAt).
Para ello, ratones C57BL/6 fueron inmunizados por vía intramuscular
con el virus salvaje (MVAwt) o los virus delecionados (ΔMVAs).
Evaluamos la respuesta celular T frente a epitopes del virus Vaccinia a
los 7 y 45 días post-inmunización (dpi), correspondientes a las etapas
de respuesta aguda y de memoria, respectivamente, en bazo y ganglios
ilíacos. La proporción de células productoras de IFNγ e IL-2 se evaluó
mediante ELISPOT y la producción de citoquinas a través de ELISA. El
porcentaje de células T-CD8 citotóxicas se analizó por citometría de
flujo, mediante la expresión de CD107, y la proliferación específica de
las distintas subpoblaciones de células T de memoria mediante
marcación con CFSE y la expresión de CD44 y CD62L. Para estudiar la
respuesta innata inducida por el virus, se inmunizaron ratones con el
MVAwt y el MVAt, y se evaluó por ELISA el patrón de citoquinas
producido entre las 0 y 30 horas post-inoculación (hpi).
A los 7 dpi, los ΔMVAs indujeron un aumento significativo en el número
de T-CD8 y CD4 productoras de IFNγ específicas contra Vaccinia en
comparación al MVAwt, como así también en el número de T-CD8
productoras de IL-2. Este incremento, también se observó a los 45 dpi.
El porcentaje de T-CD8 de memoria que proliferó luego de la
estimulación fue mayor en el grupo inmunizado con MVAt (6%) que en
el MVAwt (3%), obteniéndose resultados similares en la población TCD4 (7% vs 1% respectivamente). Dentro de las células que
proliferaron, el MVAt indujo una mayor proporción de células de
memoria central (TCM: 37%) y de memoria efectora (TEM: 25%) versus
el MVAwt (TCM: 20%,TEM: 11%). Resultados similares se obtuvieron
para la población T-CD4 (TCM: 37%,TEM: 16% vs TCM: 8%,TEM: 2%
respectivamente). Sumado a esto, los ∆MVAs indujeron mayor
porcentaje de T-CD8 específicas bifuncionales productoras de IFNγ y
con capacidad citotóxica. Al analizar la respuesta innata observamos
que el MVAt produjo mayores niveles de IFNγ e IL-12 a las 20 y 30 hpi
en comparación al MVAwt.
La deleción simultánea de genes específicos del genoma de MVA, cuyas
funciones se encuentran inter-relacionadas, compone una estrategia
apropiada para aumentar el potencial vacunal de este vector, creando
una herramienta útil y versátil, para ser utilizada en el desarrollo de
vacunas frente a infecciones tales como HIV, Malaria y Tuberculosis.
0350
LA PROTEÍNA DE LA LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA ES UN FACTOR DE
RESTRICCIÓN CONTRA EL VIRUS DENGUE
F Giovannoni, EB Damonte, CC García
Laboratorio de Virología, Departamento de Química Biológica, Facultad
de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires,
Argentina.
La inmunidad intrínseca está basada en factores celulares de restricción
que son expresados de manera constitutiva, estableciendo así, un
mecanismo de defensa inmediato frente a infecciones virales. La
proteína de la leucemia promielocítica (PML, también llamada TRIM19)
es un factor de restricción que también puede ser inducido por
interferón (IFN). PML interactúa con más de cien proteínas celulares,
formando estructuras nucleares discretas conocidas como Nuclear
Bodies (NBs). En múltiples familias de virus se han identificado
proteínas capaces de interaccionar con PML y, por lo tanto, afectar a
los PML-NBs como una estrategia para evadir la respuesta celular
antiviral. Dada la ausencia de agentes antivirales y vacunas efectivas
contra el virus dengue (DENV), resulta de gran importancia conocer
aquellos factores involucrados en la respuesta celular antiviral para ser
tenidos en cuenta en posibles desarrollos de agentes farmacológicos.
En nuestro trabajo, se propuso investigar la actividad de PML frente al
serotipo 2 de DENV (DENV-2) en la línea celular humana A549. El
silenciamiento de PML por medio de siRNAs causó un aumento de 0,76
log en la producción de partículas virales a las 24 h post infección (p.i).
Análogamente, su sobreexpresión causó una disminución de 1,6 log.
Estos resultados fueron corroborados por cuantificación de la expresión
de antígeno viral a través de inmunofluorescencia. Posteriormente, se
evaluó el efecto de la infección con DENV-2 sobre el patrón nuclear de
los PML-NBs al ser visualizados por inmunofluorescencia. Las imágenes
revelaron una disminución del número de PML-NBs por núcleo
observados a tiempos tardíos p.i. Estos resultados sugieren que la
infección con DENV-2 altera a los PML-NBs. Por otro lado, células
vecinas a las infectadas mostraron un aumento significativo en el
número y tamaño de PML-NBs encontrados por célula. Para estudiar en
mayor detalle si este fenómeno estaba relacionado con la liberación de
IFN por parte de células infectadas, se cuantificó por RT-PCR en tiempo
real el nivel de expresión de genes involucrados en su vía de
señalización. Estos ensayos revelaron un aumento significativo en la
expresión relativa de IL-6 e IFN-β, entre otros. En particular, la
expresión relativa de PML aumentó hasta 5000 veces ante la infección
con DENV-2. Interesantemente, estos efectos se vieron disminuidos en
células A549 tratadas con un inhibidor de la vía JAK/STAT y en células
Vero (deficientes para la producción de IFN). Esto demuestra que la
actividad antiviral intrínseca de PML es independiente de IFN, aunque
su efecto es potenciado por esta molécula.
En resumen, nuestro trabajo constituye la primera evidencia de la
contribución de PML a la respuesta antiviral celular contra DENV-2.
Serán necesarios otros estudios para determinar el mecanismo
molecular detrás de esta actividad.
0380
ADMINISTRACION INTRANASAL DE UNA VACUNA DE INFLUENZA
FORMULADA CON LA NUCLEOPROTEINA VIRAL Y EL ADYUVANTE C-DIAMP PROTEGE A RATONES CONTRA LA INFECCIÓN VIRAL
MV Sanchez1, T Ebensen2, D Cargnelutti1, K Schulze1, E Scodeller1, CA
Guzmán2
1
Instituto de Medicina y Biología Experimental de Cuyo (IMBECU) CCTMendoza, Argentina. 2 Helmhotz Centre for Infection Research.
Braunschweig, Alemania.
El virus de influenza tiene la capacidad de provocar epidemias anuales y
pandemias, con un alto impacto en la salud mundial en términos de
morbilidad y mortalidad. Actualmente existe una crítica necesidad de
vacunas de influenza de rápida disponibilidad capaces de proteger
contra cepas de virus constantemente emergentes. Una de las
propuestas, es el desarrollo de vacunas universales utilizando antígenos
conservados del virus, que induzcan respuestas celulares y humorales
vigorosas capaces de actuar en el portal de la entrada de este
patógeno.
En este estudio evaluamos las respuestas inmunes humorales y
celulares y la eficacia protectora de una vacuna intranasal formulada
con un antígeno viral recombinante conservado, la nucleoproteína
(NPr) co-administrada con el adyuvante bis-(3 ',5')-adenosina
monofosfato ciclico dimérico (c-di-AMP).
Metodología: La NPr del virus A/PR/8/34 (H1N1),se sintetizó y purificó
mediante columnas de afinidad e intercambio iónico. Ratones BALB/c
(n=5), fueron inmunizados en los días 0 y 21 por vía i.n.. Los ratones
recibieron NPr sola o co-administrada con c-di-AMP (PCT/EP
2006010693), además se incluyó un grupo control negativo (PBS). Para
la evaluación de la respuesta inmune humoral, se determinaron los
títulos de IgG total y subtipos en suero, e IgA en lavados mucosales.
Para la evaluación de la respuesta inmune celular, suspensión de
esplenocitos fueron obtenidos y cultivados para realizar ensayos de
proliferación celular y ensayos de ELISPOTs para determinar las células
productoras de IL-17, IFN-γ, IL-2, IL-4. En el día 60, los ratones
inmunizados (n=6) fueron infectados con una dosis sub-letal del virus
de influenza A/PuertoRico/8/34 (H1N1) y observados y pesados
diariamente durante 2 semanas en busca de signos de morbilidad.
Resultados: El título de IgG total obtenido en ratones inmunizados con
NPr/c-di-AMP demostró un fuerte incremento (972800),al igual que los
títulos de IgG subtipos, IgG1 (1.33x106) e IgG2a (2.86x106), comparado
con la inmunización sin adyuvante. Los esplenocitos de los ratones
inmunizados con NPr/c-di-AMP mostraron una muy buena proliferación
después de la re-estimulación con concentraciones crecientes de NP
(Indice de estimulación=6). El análisis de ELISPOTs indicó que la
109
Libro de resúmenes
formulación NPr/c-di-AMP es capaz de estimular la producción de IL17,IFN-γ, IL-2 e IL-4, dirigiendo la respuesta predominantemente hacia
un perfil Th1/Th17. Con respecto al análisis del desafío viral, ratones
inmunizados con NPr/c-di-AMP no sufrieron pérdida de peso durante la
infección mientras que ratones inmunizados con NPr y PBS, mostraron
una pérdida de peso del 10 y 12 % respectivamente.
Este estudio demuestra que la administración intranasal de la
formulación NPr/c-di-AMP puede ser considerada como una
prometedora vacuna universal, la cual es capaz de estimular fuertes
respuestas inmunes humorales a nivel sistémico y local y fuertes
respuestas inmunes celulares, capaces de proteger a ratones de la
infección viral.
Jueves 25 de junio
Sala C (Petit Dorée - 1º piso)
14:30 - 16:00 hs.
Virología veterinaria
0017
CIRCULACIÓN DEL VIRUS DE INFLUENZA PORCINA EN PEQUEÑOS
PRODUCTORES DE LA ARGENTINA
M Dibarbora1, JA Cappuccio1, M D´Angelo1, N Aznar2, F Bessone3, H
Piscitelli3, A Pereda2
1
Instituto de Virología, CICVyA, INTA Castelar, Argentina. 2 Instituto de
Patobiología, CICVyA, INTA Castelar, Argentina. 3 EEA-INTA Marcos
Juarez, Argentina.
La infección por el virus de influenza A (AIV) es considerada endémica
en la población porcina Argentina, siendo los subtipos predominantes
el pandémico H1N1 (pH1) y el H3N2 cluster II (H3II). Sin embargo, estos
estudios fueron realizados principalmente en granjas porcinas de más
de 100 madres. Este estrato de granjas representa apenas el 1,47% del
total de explotaciones porcinas del país. Sin embargo, el 98,53% de los
establecimientos lo componen productores pequeños de menos de 100
madres, o familiares. El objetivo de este trabajo fue determinar la
circulación de AIV en pequeños productores y productores familiares
de cerdos.
Se realizó un muestreo sesgado en las provincias de Misiones,
Tucumán, Chaco, Buenos Aires, Córdoba, Neuquén y Río Negro. Se
caracterizaron los establecimientos según número de madres en dos
categorías: establecimientos de menos de 50 madres (Tucumán, Chaco,
Misiones, Río Negro y Neuquén) y los que poseen entre 50 a 100
madres (Buenos Aires y Córdoba). Se tomaron muestras de sangre de
hembras adultas/padrillos y de capones (según disponibilidad) e
hisopados nasales de animales con signos compatibles al momento del
muestreo. Se realizó un ensayo de inhibición de la hemaglutinación
contra subtipos predominantes en Argentina (pH1 y H3II). Se
consideraron títulos de 1/40 o mayores como positivos y granja positiva
aquella con al menos un animal positivo. El diagnóstico molecular fue
realizado por Real Time PCR a partir de los hisopados nasales.
Los estudios serológicos demuestran una mayor circulación de AIV en
establecimientos de entre 50 a 100 madres, tanto del subtipo pH1
como del subtipo H3II. Cabe destacar, que ambas categorías
presentaron un bajo porcentaje (<20%) de establecimientos positivos a
H3II. En la categoría de <50 madres, se procesaron 22 hisopos (4
pooles), todos negativos por Real Time PCR. En la categoría 50 a 100
madres, se procesaron 31 hisopos (7 pooles) siendo solo uno,
perteneciente a una sola granja, positivo a influenza por Real Time PCR.
% animales
Tipo de
(positivos/total)
establecimientos
positivos pH1
%
establecimientos
(positivos/total)
positivos pH1
% animales
(positivos/total)
positivos H3II
%
establecimientos
(positivos/total)
positivos H3II
50 a 100 madres
39.06
(150/384)
93.1
(27/29)
2.08
(8/384)
17.24
(5/29)
< 50 madres
32.35
(77/238)
60.71
(17/28)
0.42
(1/238)
3.57
(1/28)
La circulación de AIV es mayor en los establecimientos más grandes y
tecnificados, esto podría estar asociado a la mayor densidad animal por
m3, al uso de sistemas confinados, número de establecimientos
cercanos, el ciclo productivo completo, la compra de reproductores,
entre otros. Si bien los resultados obtenidos no son extrapolables a
otras granjas por el tipo de muestreo, este estudio demuestra que
existe circulación de AIV en pequeños productores. Existe una mayor
circulación del subtipo pH1 que podría asociarse a su mayor circulación
en humanos.
110
Libro de resúmenes
0023
ADAPTACIÓN DE UN VIRUS DE INFLUENZA A SUBTIPO H4N2
ARGENTINO PROVENIENTE DE AVES SILVESTRES ACUÁTICAS (ANAS
VERSICOLOR) A AVES DOMÉSTICAS (GALLUS GALLUS DOMESTICUS)
LM Ferreri, V Olivera, M Dangelo, AJ Pereda
Laboratorio de Aves y Porcinos, CNIA Instituto Nacional de Tecnología
Agropecuaria, Castelar, Argentina.
El virus de influenza A subtipo H4N2 utilizado en este trabajo ha sido
aislado de un pato capuchino (Anas versicolor) en el año 2011 bajo el
marco de un estudio de prospección de aves acuáticas en el territorio
nacional. Se ha descripto, en pocas oportunidades, la capacidad de este
subtipo de infectar patos domésticos, codornices y otras aves de corral.
Con el objetivo de estudiar la capacidad de este aislamiento autóctono
de infectar aves de corral, se prosiguió a la infección de un grupo de
nueve pollos de 21 días de edad. Los mismos fueron inoculados por vía
ocular, nasal e intratraqueal con 1x106 TCID50/animal. Los animales
fueron evaluados clinicamente y se cuantificó la carga viral mediante
Real Time PCR. Si bien estos animales presentaban valores de Ct de
alrededor de 30 al segundo día post infección, éste declinaba
abruptamente al tercer día para luego desaparecer al cuarto. A partir
de este resultado se decidió evaluar la capacidad del virus de infectar,
en principio, células de riñón de embrión de pollo (REP). Estas
permitirían la exposición del virus a tejidos del modelo a adaptar, sin la
presión de selección del sistema inmune del modelo in vivo y de esta
manera comenzar a seleccionar las variantes con capacidad de
replicación en dichos tejidos. Se realizaron seis pasajes en REP, de
forma tal de ir pasando la muestra del pocillo mas diluido que aún
mostraba efecto citopático. De forma progresiva se alcanzó un título de
6.3x107 TCID50/ml. Luego se realizaron cinco pasajes en pollos de tres
días de edad. Al tercer día post infección los animales fueron
sacrificados y se maceraron los pulmones de los mismos. Se observó un
incremento en la capacidad replicativa en el cuarto y quinto pasaje por
Real Time PCR. En el quinto pasaje se decidió también hisopar
traquealmente a los animales para evaluar la capacidad de excreción. Al
quinto pasaje el virus demostró no sólo tener una mayor capacidad
replicativa en pulmón sino también capacidad de ser excretado tanto al
tercer como al cuarto día post infección. Como resultado de este
estudio, se logró la adaptación del virus H4N2 argentino al modelo de
pollo, pudiendo replicar y excretarse en este. Así mismo en este estudio
se evaluarán los cambios necesarios para dicha adaptación en las
proteínas de superficie, hemaglutinina y neuraminidasa, las cuales son
responsables del reconocimiento de glico-receptores asociados a la
entrada y salida del virus de la célula.
0031
DISTRIBUCIÓN DE HERPESVIRUS BOVINO TIPO 1 (BOHV-1) Y TIPO 5
(BOHV-5) EN EL SISTEMA RESPIRATORIO DE BOVINOS
EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS
M Marin1, S Quintana2, M Leunda3, S Pérez1, A Odeón3
1
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET),
Rivadavia 1917, C1033AAJ, Buenos Aires, Argentina. 2 Instituto de
Análisis Fares Taie, Rivadavia 3331, (7600) Mar del Plata, Buenos Aires,
Argentina. 3 Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA),
Estación Experimental Agropecuaria Balcarce, Ruta 226 Km 73.5 (7620),
Balcarce, Buenos Aires, Argentina.
La información disponible acerca del comportamiento de diferentes
alfaherpesvirus con respecto a la invasión del hospedador en los sitios
de replicación primaria es escasa. El objetivo de este trabajo fue
determinar la distribución viral en el aparato respiratorio de bovinos
infectados experimentalmente con Herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1)
y tipo 5 (BoHV-5) durante la infección aguda, latencia y reactivación
viral. Terneros de 1 año de edad se inocularon por vía intranasal con la
cepa Cooper de BoHV-1 o la cepa 97/613 de BoHV-5. Grupo 1 (Infección
aguda): dos grupos de 2 terneros inoculados con 106.3 DICC50/ml de
cada virus; eutanasia: 6 días post-infección (dpi). Grupo 2 (Latencia):
dos grupos de 2 terneros inoculados con 103 DICC50/ml; eutanasia: 24
dpi. Grupo 3 (Reactivación): dos grupos de 2 terneros inoculados con
103 DICC50/ml y tratados con dexametasona (DEX) a los 21 dpi;
eutanasia: 25 dpi. Grupo 4 (Control): 2 animales no infectados; un
ternero recibió DEX. En la necropsia, se tomaron muestras de ganglios
retrofaríngeos, bronquiales y mediastínicos, epitelio de mucosa nasal,
tráquea y bronquios y lóbulos pulmonares apical, medio y
diafragmático. Se extrajo el ADN total de las muestras con kit comercial
(Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) y la detección del genoma viral se
realizó mediante PCR en Tiempo Real con análisis por High Resolution
Melting de acuerdo a Marin et al. (2014). El ADN de BoHV-1 fue
detectado en 12/18 muestras de terneros infectados agudamente. Las
distintas muestras evaluadas resultaron positivas, con excepción de los
ganglios mediastínicos. Durante la latencia, el genoma de BoHV-1 se
detectó en 2/18 muestras correspondientes a ganglios bronquiales y
epitelio traqueal y durante la reactivación viral en 4/18 muestras
correspondientes a epitelio de mucosa nasal y tráquea y lóbulo
diafragmático del pulmón. El ADN de BoHV-5 fue detectado en 7/18
muestras de terneros infectados agudamente, incluyendo ganglios
retrofaríngeos y mediastínicos y epitelio de mucosa nasal, tráquea y
bronquios. Durante la latencia o reactivación viral, el ADN de BoHV-5 se
detectó sólo en 1/18 muestras, correspondiente a ganglios bronquiales
o retrofaríngeos, respectivamente. El ADN viral no se detectó en
ninguna de las 18 muestras de animales no infectados. El ADN de
BoHV-1 exhibió una amplia distribución en el sistema respiratorio
bovino. Como era de esperar, la distribución de BoHV-5 fue más
restringida, alcanzando sólo el tracto respiratorio superior. Estos
resultados enfatizan la participación de estos tejidos en el síndrome
respiratorio causado principalmente por BoHV-1. Luego de la infección
primaria, BoHV-1 y BoHV-5 muestran características biológicas similares
y por lo tanto necesitan ser considerados en conjunto para el control de
la infección por BoHV. Los hallazgos de este estudio contribuyen al
conocimiento y comprensión de la distribución tisular de ambos virus y
la difusión de los alfaherpesvirus bovinos en el sistema respiratorio.
0035
MAPEO DEL SITIO DE UNIÓN DEL ANTICUERPO MONOCLONAL MAB
3H7 A LA PROTEÍNA NO ESTRUCTURAL 3A DEL VIRUS DE LA FIEBRE
AFTOSA (VFA)
CM Lotufo, M Wilda, C Seki, NM Mattion, PR Grigera
Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. Cesar Milstein, Argentina.
Introducción: La fiebre aftosa (FA), causada por el virus de fiebre aftosa
(VFA), familia Picornaviridae, es una enfermedad altamente contagiosa
y con potencial para generar graves pérdidas económicas en la
industria ganadera de animales rumiantes biungulados. La campaña
sanitaria de control del VFA implementada en la Argentina (2000-2002),
fue enormemente asistida por el test 3ABC-ELISA que detecta
anticuerpos reactivos, elaborado nuestro instituto, y utilizado para
asistir a la autoridad sanitaria local y regional hasta la actualidad.
El genoma del VFA codifica para 4 proteínas estructurales y 8 proteínas
no estructurales (NS) todas producidas intracelularmente, y expuestas
al sistema inmune del animal. Entre las NS se encuentra la proteína 3A,
que se cree juega un papel relevante en la síntesis del ARN viral a través
del anclaje del complejo replicativo a membranas intracelulares y está
directamente relacionada con el grado de virulencia del VFA. La
secuencia de 3A también corresponde al N-terminal de la proteína
3ABC recombinante utilizada por nuestro laboratorio como
inmunógeno para generar el MAb3H7, reactivo clave en el desarrollo
del test 3ABC-ELISA utilizado para diferenciar animales infectados de
vacunados.
Objetivo: Nos proponemos mapear el sitio de unión de MAb3H7 a la
proteína 3A con precisión de 5-10 aa y utilizar péptidos conteniendo la
secuencia del epítope para diversos estudios básicos y aplicados. Entre
ellos, el diseño de un 3ABC-ELISA de competencia optimizado en su
sensibilidad para detectar actividad anti-3ABC en suero de animales.
Metodologías y Resultados: Mapeo de las secuencias reactivas con
MAb3H7: se clonó el segmento 3ABC, el cual contiene una mutación
puntual en el sitio activo de proteasa que neutraliza la actividad
autoprocesadora de 3ABC, en el vector de expresión pET-30A. Se
realizaron 7 deleciones secuenciales en el extremo 3' del gen 3ABC
utilizando PCR con primers específicos. Los fragmentos fueron clonados
en pET-30A y expresados en E.coli BL21. Los correspondientes lisados
de expresión fueron evaluados en paralelo por inmunoblot (Western
Blot) utilizando como referencia un anticuerpo monoclonal antiproteína 3C, para normalizar los niveles de expresión y el anticuerpo
monoclonal MAb3H7, para diferenciar secuencias reactivas y no
111
Libro de resúmenes
reactivas. Los resultados muestran con claridad que el Mab3H7 es solo
capaz de unirse a la secuencia completa de 3ABC y a ninguno de los
fragmentos de 3ABC secuencialmente deletados en su N terminal.
Conclusión: Se concluye que el epítope específico reactivo con MAb3H7
mapea en los primeros 20 aa de la proteina 3A. Estos corresponden a la
secuencia NH2-ISIPSQKSVLYFLIEKGQH-COOH. Al momento de este
informe se esta testeando la actividad de MAb3H7 contra los peptidos
3Apep1 (SIPSQKSVL), 3Apep2 (QKSVLYFLI) y 3Apep3 (YFLIEKGQH)
contenidos en la secuencia mencionada con el objeto de precisar el
epítope y definir la secuencia a ser usada en un test de ELISA-3ABC de
competencia mencionado.
0043
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA PROTEÍNA DE LA CAPSIDE DEL
VIRUS DE ARTRITIS ENCEFALITIS CAPRINA DETECTADO EN CABRAS DE
ARGENTINA.
CJ Panei1 4, A Dellarupe2 4, ML Gos2 4, GE Metz1 4, MS Serena1 4, A Larsen3,
CM Galosi1 5, MG Echeverría1 4
1
Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP,
Argentina. 2 Laboratorio de Inmunoparasitología, Facultad de Ciencias
Veterinarias, UNLP, Argentina. 3 Cátedra de Inmunología, Facultad de
Ciencias Veterinarias, UNLP, Argentina. 4 CONICET, Argentina. 5 CIC, Pcia
Bs As, Argentina.
El ELISA y la inmunodifusíon en gel de agar (IDGA) son las técnicas
mayormente utilizadas para el diagnóstico de anticuerpos contra el
virus de la artritis encefalitis caprina (CAEV) y del virus de maedi visna
(MVV). Estas técnicas utilizan como antígenos aquellos producidos con
proteínas nativas y también con proteínas recombinantes obtenidas
por aislamientos de cabras u ovejas de diferentes regiones o países,
debido a que ambas cepas están genética y antigénicamente
relacionadas. El gen GAG codifica entre otras proteínas a la proteína de
la capside viral (CA), siendo estas proteínas junto con las proteínas
producidas por el gen ENV (gp de superficie, SU y gp de
transmembrana, TM) la más inmunogénicas. La proteína de la CA es el
primer antígeno reconocido por el sistema inmune de los animales y
demostró tener reacción cruzada para la detección de CAEV como del
MVV. La heterogeneidad antigénica de la CA podría resultar en una
falta de sensibilidad si los animales fueron infectados con cepas
diferentes a las que son empleadas en la producción de los equipos de
diagnóstico. El objetivo de este trabajo fue caracterizar la proteína de la
CA del CAEV obtenido de cabras en Argentina evaluando la
composición aminoacidica de las regiones más inmunodominantes de
la misma. Se extrajo sangre de cuatro cabras sin anticoagulante para la
obtención de suero para detectar anticuerpos por IDGA y con
anticoagulante para la extracción de ADN. Se amplifico un segmento
del gen GAG que codifica para la proteína de la CA con cebadores
específicos que corroboran la positividad obtenida previamente por
IDGA. Las secuencias nucleotídicas fueron alineadas y traducidas a sus
respectivos aminoácidos con el programa Bioedit. Con el programa
MEGA 4, se llevó a cabo el análisis filogenético donde se observó el
agrupamiento en otro cluster comparadas con aislamientos en otros
países (GeneBank numero: CAEV: M33677; AY900630; AGH08193 y
MVV: AAA17520). El cambio más significativo estuvo en el epítope de la
región más inmunodominante del segmento C-terminal de la proteína
donde una lisina fue sustituida por acido glutámico en las cuatro
secuencias de Argentina. La caracterización de la proteína de la CA es
altamente interesante para el desarrollo de equipos de diagnóstico en
nuestro país con la inclusión de cepas locales, lo que permitiría
probablemente aumentar la sensibilidad y especificidad en el
diagnóstico de estas virosis.
0044
EL HERPESVIRUS EQUINO 1 INTERFIERE CON LA APOPTOSIS EN
CÉLULAS INFECTADAS
MR Scrochi1 2 5, ME Bravi1 7, NA Fuentealba1 5, EJ Gimeno3 5, EL Portiansky3
5
, CG Barbeito2 3 5, CN Zanuzzi2 5, CI Muglia4 5, CM Galosi1 6
1
Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP,
Argentina. 2 Cátedra de Histología y Embriología, Facultad de Ciencias
Veterinarias, UNLP, Argentina. 3 Cátedra de Patología General, Facultad
de Ciencias Veterinarias, UNLP, Argentina. 4 IIFP, Facultad Ciencias
Exactas, UNLP, Argentina. 5 CONICET, Argentina.
Argentina. 7 FONCYT, Argentina.
6
CIC, Pcia Bs As,
El Herpesvirus equino 1 (EHV-1) produce signos respiratorios,
nerviosos, aborto y síndrome neonatal en equinos, causando
importantes pérdidas económicas. En las células la muerte por
apoptosis actúa como un mecanismo de protección celular frente a la
infección debido a que es un proceso programado con la finalidad de
eliminar aquellas células potencialmente peligrosas para el organismo.
En otros alphaherpesvirus, se han identificado acciones implicadas con
la modulación de la apoptosis, sin embargo ésto no fue aún estudiado
en el EHV-1. El objetivo de este trabajo fue evaluar en cultivos de
células equinas, el efecto modulatorio sobre la apoptosis, del EHV-1
durante su ciclo de replicación. Se utilizaron células de cultivo primario
de riñón equino crecidas con Medio Mínimo Esencial suplementado con
glutamina, antibióticos y 10% de suero fetal bovino, infectadas con la
cepa AR8 (MOI=10) y recolectadas a las 3, 9, y 18 hs posinfección (pi).
Simultáneamente se realizaron controles de inducción a la apoptosis
(incubación con sorbitol 1M durante 1 h a 37 °C) y controles negativos
(sin tratamiento). La evaluación se realizó mediante tinción con
bromuro de etidio y naranja de acridina (BE/NA), para la observación de
compactación y fragmentación nuclear; Anexina V/ioduro de propidio
por citometría de flujo para la detección de la exteriorización de
fosfatidilserina; medición de actividad de caspasa 3 mediante
incubación de los lisados celulares con el sustrato fluoregénico
específico y determinación de cambios ultraestructurales por
microscopía electrónica de transmisión (MET). El análisis por BE/NA
determinó que a lo largo de todo el ciclo de replicación viral, el índice
de apoptosis fue significativamente menor en los grupos infectados
respecto al control positivo de la misma. El análisis de la exteriorización
de fosfatidilserina reveló que a las 3 y 9 hs pi el porcentaje de
marcación en los grupos infectados fue significativamente menor
respecto al grupo 18 hs pi y al control positivo de apoptosis. La
evaluación de la actividad de caspasa 3 reveló, en la totalidad de los
grupos infectados, valores significativamente menores respecto del
control positivo de apoptosis. Por MET se confirmó la presencia de
partículas virales y cambios ultraestructurales característicos del
proceso apoptótico. Resultados similares fueron encontrados con
experiencias en células heterólogas (MDBK). Se concluye que la
infección por EHV-1 interfiere con la muerte por apoptosis en las
células infectadas durante su ciclo de replicación viral, estrategia
utilizada por el virus para asegurar su ciclo de vida.
0046
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL SEGMENTO GENÓMICO 3 DE
VIRUS DE INFLUENZA EQUINA DETECTADOS EN LA ARGENTINA
C Olguin Perglione1, L Ferreri1, S Tordoya1, S Miño1, M Barrandeguy1 2
1
Instituto de Virología, CICVyA, INTA Castelar, Buenos Aires, Argentina.
2
Escuela de Veterinaria, Universidad del Salvador, Buenos Aires,
Argentina.
El segmento 3 del genoma del virus de Influenza A (PA) produce un
ARNm que codifica una subunidad del complejo ARN polimerasa
dependiente de ARN. Análisis filogenéticos previos de este segmento
del virus de Influenza equina (VIE) H3N8 demostraron que ha
evolucionado en 12 clados distintos.
Adicionalmente, este segmento genómico codifica una segunda
proteína denominada PA-X. Esta proteína posee 252 aminoácidos (aa) y
su región N-terminal de 191 aa, deriva del ORF-O, mientras que la
región C-terminal, de 61 aa, deriva del ORF-X, al cual se accede por un
desplazamiento del marco de lectura ribosomal. Algunas cepas de
Influenza A poseen codones de stop prematuros en el ORF-X,
originando proteínas truncadas. Una mutación en la posición +20 del
ORF-X presente en algunas cepas VIE H3N8 genera un codón de stop
produciéndose una proteína de 220 aa.
El objetivo del presente trabajo es evaluar las características
moleculares y filogenéticas del segmento genómico 3 de los VIE H3N8
detectados en la Argentina.
Se amplificó y secuenció parcialmente el segmento 3 (900 nt) de 22 VIE
H3N8 detectados en la Argentina entre 1993 y 2012. Las secuencias
obtenidas fueron editadas con el programa BioEdit 7.0.9.0 y alineadas
con CLUSTAL_X v.2. El análisis filogenético se realizó mediante el
112
Libro de resúmenes
método de Máxima Verosimilitud (MV) utilizando el programa PhyML.
El modelo de sustitución de nucleótidos más adecuado fue
seleccionado con el programa jModeltest 2.1.6. La secuencia deducida
de aminoácidos se obtuvo con el programa BioEdit 7.0.9.0.
El análisis filogenético demostró que las cepas aisladas en la Argentina
entre 1993 y 2005 (n=15) forman un grupo monofilético distinto de los
12 clados descriptos previamente, denominado Sudamericano mientras
que las cepas detectadas en el año 2012 (n=8) agrupan dentro del
Florida clado 1 detectado también en otras regiones del mundo.
La secuencia deducida de aminoácidos de la PA-X reveló un
polimorfismo en las cepas circulantes entre 1997 y 2005 (n=9). La
presencia de un codón de stop prematuro de la posición +30 del ORF-X
debida a una mutación de nucleótidos sin sentido CGA (Arginina) por
TGA (Stop), resulta en una proteína más pequeña de 230 aa. Las cepas
aisladas entre 1993 y 1995 y las del año 2012 (n=13) presentan la
proteína PA-X completa de 252 aa.
Las cepas detectadas en la Argentina durante el periodo 1993-2005 se
agrupan en un clado único: Clado Sudamericano, indicando que existió
circulación regional, sin introducción de virus de otras regiones,
durante ese período. Por el contrario, los virus detectados en el año
2012 se agrupan con los del Florida clado 1, demostrando la
introducción de una cepa diferente de virus, probablemente debido al
movimiento internacional de caballos con fines de competencia o
reproducción.
Si bien han sido descriptas mutaciones en el ORF-X que generan
codones de stop, la mutación en la posición +30 detectada en algunas
cepas Argentinas, no había sido observada previamente.
0047
ANÁLISIS FILOGENETICO Y FILODINAMICO DE CEPAS DE VIRUS DE
INFLUENZA EQUINA (H3N8) CIRCULANTES EN ARGENTINA EN LOS
ULTIMOS 30 AÑOS
C Olguin Perglione1, MD Golemba2, M Barrandeguy1 3
1
Instituto de Virología, CICVyA, INTA Castelar, Buenos Aires, Argentina.
2
Hospital de Pediatría S.A.M.I.C. "Prof. Dr. Juan P. Garrahan", Buenos
Aires, Argentina. 3 Escuela de Veterinaria, Universidad del Salvador,
Buenos Aires, Argentina.
La Influenza equina es producida por el virus de Influenza A subtipo
H3N8. Debido a su rápida diseminación, es considerada la enfermedad
respiratoria de mayor importancia económica en equinos. Análisis
filogenéticos demostraron que el virus de Influenza equina (VIE) H3N8
ha evolucionado en 12 clados diferentes desde su primera detección en
1963.
Objetivo: Estimar el origen y diversificación genética de los VIE H3N8
detectados en Argentina en los últimos 30 años.
Se secuenció el gen completo de la Hemaglutinina (HA) de 19 VIE H3N8
detectados en Argentina entre 1993 y 2012. Las secuencias obtenidas
fueron analizadas por métodos filogenéticos junto a secuencias de
Argentina previamente publicadas y 143 secuencias de referencia
obtenidas del “Influenza Research Database”. El tiempo del ancestro
común más reciente (tMRCA) y la historia demográfica se estimaron
mediante análisis de coalescencia.
El análisis filogenético reveló la existencia de dos grupos adicionales a
los 12 grupos descriptos previamente: Sudamericano clado 1 (SA1) y 2
(SA2). Los VIE H3N8 circulantes en Argentina durante el período 19852012 se agruparon en 4 clados independientes de distinto origen. Los
VIE que circularon en el año 1985 (n=2) junto a un virus aislado en Chile
en el mismo año forman un clado denominado grupo VIII, cuyo origen
no pudo ser estimado. Los virus detectados entre 1993-1996 (n=5)
forman un grupo monofilético denominado SA1, cuya secuencia
ancestral es una cepa de Kentucky de 1992. Las cepas detectadas entre
1997 y 2005 (n=8) junto a una cepa aislada en Chile en el año 2006
forman el sublinaje SA2. El origen de este grupo podría ser una cepa de
California de 1997 o de Kentucky de 1994. Por último, los virus
detectados en el año 2012 (n=6) se agrupan con los de Florida clado 1 y
su origen podría ser una cepa de Florida del 2011. Para el grupo VIII el
tMRCA fue estimado en 1984, mientras que para los grupos SA 1, 2 y
Florida clado 1 fue en 1992, 1997 y 2011 respectivamente. La dinámica
poblacional obtenida con 143 secuencias de referencia y 21 argentinas
hasta el año 2005 fue similar a la descripta previamente,
manteniéndose constante, excepto entre 1981 y 1988 que se observó
una disminución en la diversidad genética. En el año 2006, se observó
un aumento pronunciado de la diversidad genética relativa, seguido de
una leve disminución en 2007 que se hizo más intensa en 2009.
El origen polifilético de las secuencias de Argentina sugiere que los
brotes ocurridos en el país en los últimos 30 años han sido producto de
múltiples introducciones del virus, probablemente a través de caballos
subclínicamente infectados, provenientes de distintas regiones del
mundo. El aumento de la diversidad genética observada en 2006 podría
deberse a la co-circulación de cepas de linajes diferentes, mientras que
la abrupta disminución de la diversidad genética observada a partir del
año 2009 podría estar relacionada con la inclusión de cepas del linaje
Florida clado 2 en las vacunas.
0052
CARACTERISTICAS DIAGNOSTICAS DE UN ELISA DUAL “IN HOUSE”
PARA EL CONTROL EPIDEMIOLOGICO DE LA LEUCOSIS ENZOOTICA
BOVINA
A Larsen1, S Corva2, CJ Panei3, A Valera4, E Mortola1
1
Cátedra de Inmunología Veterinaria, Fac. de Cs. Veterinarias UNLP,
Argentina. 2 Curso de Epidemiología Básica, Fac. de Cs. Veterinarias
UNLP, Argentina. 3 CONICET, Argentina. 4 Cátedra de Virología, Fac, de
Cs. Veterinarias UNLP, Argentina.
La Leucosis Enzootica Bovina (LEB) se caracteriza por un largo periodo
de latencia, sin viremia detectable aunque los animales infectados
presentan una respuesta humoral persistente, dirigida hacia las dos
proteínas estructurales más inmunogénicas del virus: gp51 y p24. A la
fecha no existe un relevamiento integral que arroje un valor de
prevalencia representativo y real de la situación epidemiológica en
nuestro país. Para tal fin, se hace necesario contar con herramientas de
diagnóstico cada vez más sensibles, específicas y económicamente
factibles de realizar en grandes poblaciones de animales. Este trabajo
tiene como objetivo evaluar el potencial diagnóstico de las proteínas
recombinantes gp51y p24 del virus de la leucosis bovina en conjunto,
como antígeno diagnóstico para un ensayo de ELISA indirecto,
siguiendo las directivas del Manual de Pruebas de Diagnóstico y
Vacunas para los Animales Terrestres (OIE, 2009). Para determinar la
performance de nuestro ELISA dual se buscó definir la sensibilidad (SD)
y especificidad (ED) diagnostica de la misma, para esto contamos con
un grupo de individuos correctamente clasificados en su estatus
sanitario por una prueba de referencia. En nuestro estudio se
analizaron un total de 92 sueros. El análisis estadístico (Stata SE 11 y
TG-ROC) arrojó el valor de sueros correctamente clasificados más alto
en 92.39%. Para el valor de corte de 0.3 la sensibilidad fue de 95.35% y
la especificidad del 89.80%. Para el valor de corte de 0.5 la sensibilidad
fue de 88.37% y la especificidad del 95.35%. El coeficiente de
Repetibilidad fue del 12%. Del análisis de los resultados podemos
concluir que nuestro ELISA dual podría ser considerado como una
alternativa válida a las pruebas existentes para el diagnóstico de LEB.
Sin embargo se deberían analizar un mayor número de muestras para
convalidar los valores preliminares obtenidos en este estudio y darle
robustez a esta sugerencia.
0079
VARIABILIDAD GENÉTICA DEL VIRUS DE LA LEUCOSIS BOVINA EN
GANADO LECHERO HOLSTEIN DE ANTIOQUIA, COLOMBIA.
C Úsuga Monroy, A López Herrera
Grupo Biodiversidad y Genética Molecular “BIOGEM”, Departamento de
Producción Animal, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional
de Colombia, Sede Medellín., Colombia.
El Virus de la Leucosis Bovina (BLV) es un retrovirus inmunosupresor
que afecta principalmente al ganado de leche, se caracteriza por ser de
alta morbilidad y está ampliamente distribuido en el mundo. La célula
blanco de BLV son los linfocitos B en los cuales integra su genoma
infectando a los bovinos de por vida. Las técnicas moleculares y
herramientas bioinformáticas han permitido aislar el genoma del virus y
caracterizarlo dentro de 8 genotipos. El gen env viral codifica para la
proteína de superficie gp51 que hace parte de la envoltura del virus,
este gen está altamente conservado por lo cual se ha usado para
realizar análisis filogenéticos. El objetivo de este trabajo fue identificar
113
Libro de resúmenes
el nivel de variabilidad genética del BLV que está circulando en los
hatos lecheros del departamento de Antioquia, Colombia. Se extrajo el
DNA de 500 vacas Holstein pertenecientes a diferentes municipios del
departamento de Antioquia, Colombia (Bello, Belmira, Entrerrios,
Medellín, San Pedro). Se realizó una PCR anidada para amplificar un
fragmento de 444 pb del gen env y se encontró una prevalencia
molecular del 44%. El producto de la PCR fue de ocho aislamientos que
se enviaron a secuenciar, los municipios de Belmira y Medellín
contaban con doble muestra secuenciada. Las secuencias nucleotídicas
de las muestras fueron comparadas con 27 secuencias del gen env viral
pertenecientes a diferentes regiones geográficas las cuales están
registradas en el GeneBank. El análisis filogenético se realizó por medio
del algoritmo de distancia Neighbor Joining (NJ) con el programa
MEGA® V6. Se encontraron dos genotipos circulantes en el
departamento de Antioquia, el genotipo más frecuente fue el 1 para
todos los municipios evaluados y las muestras de Colombia se
agruparon con secuencias de USA, Argentina y Japón; de otro lado una
de las 2 muestras del municipio de Belmira fue clasificada como
genotipo 3 y se agrupo con muestras de USA de este genotipo. El
análisis filogenético permitió establecer la diversidad genética del BLV
en el departamento de Antioquia, indicando que dicha diversidad es
alta ya que dentro de un mismo municipio se pueden encontrar
diferentes genotipos. El genotipo que circula con mayor frecuencia es el
1, sin embargo esta es solo una aproximación ya que más hatos deben
ser evaluados para elucidar con mayor precisión la variabilidad genética
del BLV en Colombia.
0080
CARACTERIZACIÓN HISTOLÓGICA Y MOLECULAR DE LA INFECCIÓN
POR EL VIRUS DE LA HEPATITIS E EN CERDOS BENEFICIADOS EN
ANTIOQUIA, COLOMBIA.
A López-Herrera1, J Forero1, JE Parra1, G Correa1, B Rodríguez2, LA
Gutiérrez3
1
Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, Colombia. 2
Universidad de Antioquia, Colombia. 3 Universidad Pontificia
Bolivariana, Colombia.
El virus de la Hepatitis E es un virus zoonótico del cual el cerdo es
considerado uno de sus reservorios principales. En cerdos la infección
se presenta de forma asintomática, pero pueden presentarse lesiones
hepáticas inflamatorias leves a moderadas, con infiltración de linfocitos
y degeneración vacuolar. En diferentes paises se ha reportado
evidencia serológica y molecular de la presencia del VHE en cerdos en
edad de beneficio y en hígados comercializados en expendios de carne.
Con el objetivo de describir las características moleculares e
histológicas de la infección en cerdos colombianos, se analizaron 300
muestras de hígados provenientes de las principales plantas de
beneficio de Antioquia, principal departamento productor de carne de
Cerdo de Colombia, y se sometieron a evaluación histológica,
inmunohistoquímica y de detección del genoma del VHE. El análisis
histológico mostró que el 59.67% de los cerdos presentaban hepatitis
de interfase y el 43.67% presentaban lesiones en grado 2. El 37.28% y
23.69% de las muestras de hígados fueron positivas para la detección
del genoma de VHE por PCR anidada del ORF1 y el ORF2
respectivamente; y el 41.41% fue positivo para la detección del
antígeno ORF3 por inmunohistoquímica. Se observó una asociación
estadísticamente significativa entre la presencia de lesiones hepáticas y
la detección del genoma viral, pero no para la detección del antígeno
ORF3 por inmunohistoquímica. La presencia del genoma viral y de
antígenos del VHE en hígados de cerdos en edad de beneficio sugiere
un riesgo tanto para la salud pública como para la inocuidad en la
cadena de producción. Es importante realizar investigaciones futuras
para determinar el efecto de la infección con VHE y de las lesiones
hepáticas en los cerdos con relación a los parámetros productivos en
estos animales
0084
CAMBIOS MOLECULARES A NIVEL DE LA RESPUESTA INMUNE LOCAL
ANTE LA INFECCIÓN EXPERIMENTAL POR HERPESVIRUS EQUINO 1 EN
EL MODELO RATÓN BALB/C.
ME Bravi1 7, GH Sguazza1, MR Scrochi1 2 4, NA Fuentealba1 4, F Nishida3, L
Orsini Delgado4 6, P Smaldini4 6, G Docena4 6, CG Barbeito2 3 4, CI Muglia4
6
, CN Zanuzzi2 3 4, CM Galosi1 5
1
Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad
Nacional de La Plata, Argentina. 2 Cátedra Histología y Embriología,
FCV, UNLP., Argentina. 3 Cátedra de Patología General. Laboratorio de
Análisis de Imágenes, FCV, UNLP., Argentina. 4 CONICET, Argentina. 5
CIC Pcia de Buenos Aires, Argentina. 6 Instituto de Estudios
Inmunológicos y Fisiopatológicos, Facultad Ciencias Exactas, UNLP,
Argentina. 7 FONCyT, Argentina.
El Herpesvirus equino 1 (EHV-1) es un patógeno endémico que genera
pérdidas económicas en la industria hípica. Produce signos
respiratorios, nerviosos, abortos y síndrome neonatal. Si bien aún no
han sido dilucidados todos los aspectos sobre la patogenia del aborto,
esta presentación requiere del establecimiento de una fase virémica
que permita la llegada del virus al útero. Como se ha demostrado en
otros procesos infecciosos, nuestra hipótesis es que la infección
modifica el perfil de citoquinas uterinas hacia un predominio de
aquellas que pueden determinar la interrupción de la preñez. La
mayoría de las investigaciones relacionadas con el aborto por EHV-1
han sido realizadas utilizando el modelo murino BALB/c, que permite
obtener datos completos, comparables y extrapolables al equino.
El objetivo de este trabajo fue analizar cambios a nivel de la respuesta
inmune local en úteros al día 3 posinfección (tiempo seleccionado
según ensayos previos en los que hemos estandarizado el momento
óptimo para los análisis histopatológicos, inmunohistoquímicos y
moleculares) que podrían intervenir en la interrupción de la gestación
en hembras desafiadas con el virus por vía intranasal. Todos los
estudios del presente trabajo se realizaron comparativamente con
ratonas controles inoculadas con medio de cultivo. Se cuantificó
además el ARNm, por PCR en tiempo real (qPCR), de los genes que
codifican para IL-10, TNF e IFN-γ utilizando primers específicos/SYBR
green. Por ELISA (IFN-γ e IL13) y por Citometría de Flujo (CBA, Becton
Dickinson) (TNF) se midieron los niveles de expresión de las proteínas
producidas. Para la realización de estas últimas técnicas las muestras se
homogenizaron y se trataron con inhibidor de proteasas. En la
necropsia se observó que el número de unidades fetoplacentarias en
los animales infectados fue menor que la media para la cepa utilizada
pudiendo indicar el suceso del aborto. La cuantificación relativa por
qPCR expresada como 2-∆∆Ct (cantidades en número de veces con
respecto al calibrador de βactina) indicó diferencias del grupo infectado
respecto al control, para los genes amplificados. La diferencia de
expresión de las citoquinas, analizada por la prueba de T de Student
indicó diferencias significativas. Se concluye que hay un aumento de
TNF que indica un fuerte incremento de respuesta Th1 y aumento de
IFN-γ que concuerda con una infección viral. Además el aumento
moderado de IL-10, de respuesta Th2 y tolerogénica, podría atribuirse a
una respuesta para restaurar el balance homeostático ante la infección.
Este estudio fue financiado por el FONCYT (PICT 2011-1123), CIC Pcia.
de Bs As y Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional de
La Plata (Proyecto 11V221).
0085
VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA DE LAS PRINCIPALES VIROSIS QUE
AFECTAN A LAS POBLACIONES DE CERDOS SILVESTRES (SUS SCROFA)
EN DISTINTAS ZONAS DE LA REPÚBLICA ARGENTINA
MS Serena1 10, MC Artuso2, A Pérez3, MG Echeverría1 10, Y Laksman3, G
Arocena2, D Pereyra2, E Escobar2, HR Sanguinetti4, C Zenobi4, MF
Suarez5, RT Debenedetti5, A Marcos6, P Borras6, G Castresana7, P Rojas7,
M Monterubbianesi6, J Grant8, B Carpinetti9
1
CONICET, Argentina. 2 Departamento de Biología Molecular-DILABSENASA, Argentina. 3 Departamento de Enfermedades Porcinas DILABSENASA, Argentina. 4 Departamento de Patología DILAB-SENASA,
Argentina. 5 Departamento de Enfermedades Exóticas DILAB-SENASA,
Argentina. 6 Programa de Porcinos DNSA-SENASA, Argentina. 7
Dirección de Áreas Naturales Protegidas, Organismo Provincial para el
Desarrollo Sostenible de la Provincia de Buenos Aires, Argentina. 8
114
Libro de resúmenes
Centro Regional Buenos Aires Sur, SENASA, Argentina. 9 Instituto de
Ciencias Sociales y Administración - Universidad Nacional Arturo
Jauretche, Argentina. 10 Cátedra de Virología FCV-UNLP, Argentina.
La población de cerdos salvajes en Argentina ha aumentado
considerablemente en los últimos tiempos. El jabalí es una de las
especies de la fauna de mayor relevancia sanitaria para la salud del
hombre y de los animales domésticos debido a su amplia distribución
geográfica y su abundancia creciente. Está reconocido que actúan como
reservorios móviles de una serie de enfermedades. Entre las
enfermedades reportadas se encuentran la Brucelosis, Enfermedad de
Aujeszky (EA), Peste Porcina Clásica (PPC), Peste Porcina Africana (PPA),
Triquinellosis y Tuberculosis.
El objetivo de este trabajo fue evaluar la presencia y distribución de las
principales virosis de origen porcino y la determinación de los agentes
actuantes en cerdos silvestres de la Bahía de Samborombón en Buenos
Aires, Quemú Quemú en La Pampa y Villa Huidobro en Córdoba.
Durante 2013 y 2014 se tomaron muestras de 157 jabalíes y cerdos
silvestres. La modalidad de obtención de las muestras fue diferente
según la zona, en Bahía de Samborombón se realizó la captura de los
animales y en Quemú Quemú y Villa Huidobro se realizó la toma de
muestras en torneos de caza. Durante el 2014 se extrajeron las cabezas
de los animales para la identificación en el laboratorio del virus de la EA
a partir de cerebro, ganglio trigémino, bulbo olfatorio y tonsila. Las
muestras de suero fueron analizadas para la búsqueda de anticuerpos
contra el Virus del Síndrome Respiratorio Reproductivo Porcino -PRRSV(ELISA), PPC (ELISA), PPA (ELISA), Fiebre aftosa (VIAA) y EA (ELISA y VN).
Las muestras de cerebro fueron procesadas para el aislamiento viral
utilizando células RK13 y las muestras de tonsila y bulbo olfatorio
fueron procesadas para identificar el mismo agente por PCR.
El 100 % de los animales analizados resultaron negativos a las pruebas
serológicas para PRRS, PPC, PPA y Fiebre aftosa. Mientras que para el
caso de la EA 62 animales resultaron con serología positiva, lo que
representa un 39,49 %. Hasta el momento, las muestras de cerebro de
8 animales de un total de 23 muestras colectadas fueron procesadas
para el aislamiento viral; luego de siete días de incubación no se
observó efecto citopatogénico compatible con el virus sobre las células
inoculadas. Por la técnica de PCR se identificaron 13 muestras positivas.
Este estudio es el primero que analiza el estado sanitario de los cerdos
salvajes con respecto a las principales virosis que afectan a los porcinos.
Teniendo en cuenta que estos animales representan un peligro
sanitario para la salud del hombre y de los animales domésticos y que
el impacto económico de las enfermedades que los afectan es muy
importante, deben ser contemplados dentro de los planes sanitarios
llevados a cabo por las distintas agencias del estado. Los resultados
obtenidos aportan al sistema de vigilancia y alerta temprana los
elementos necesarios para evaluar, a futuro, los riesgos que podría
representar para la producción animal las poblaciones de cerdos
silvestres como reservorio de distintas enfermedades que afectan a la
actividad.
0093
ACTIVACIÓN DE CASPASAS POR EL VIRUS DE ARTERITIS EQUINA EN
CÉLULAS RK13
GE Metz1, I Galindo2, MM Abeyá1, MG Echeverría1, C Alonso2
1
Virología. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional de
La Plata. La Plata-Buenos Aires, Argentina., Argentina. 2 : Laboratorio
interacción virus-célula. Dpto. de Biotecnología, Instituto Nacional de
Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria. Madrid, España.,
España.
La activación del mecanismo de apoptosis durante la infección del virus
de arteritis equina (VAE) ha sido demostrada in vitro en cultivos
celulares. Se ha encontrado activación de caspasas, degradación del
ADN genómico y demás indicadores moleculares tanto en cultivos de
células Vero y Baby Hamster Kidney 21(BHK21). Mientras que la vía
intrínseca de apoptosis (caspasa 9) ha sido detectada en ambas líneas
celulares, la detección de la caspasa 8 indicativa de la vía extrínseca,
solo ha sido detectada en células Vero.
La línea celular Rabbit Kidney 13 (RK13) es otra línea celular de elección
para los ensayos in vitro con este virus y en la cual no existen reportes
sobre la activación de la apoptosis. Esta línea celular es uno de los
modelos celulares más utilizados tanto para el aislamiento viral como
para el diagnóstico serológico mediante la técnica de neutralización
viral, por lo cual es de nuestro interés estudiar y caracterizar el
mecanismo de apoptosis en este modelo celular.
El objetivo de nuestro trabajo es analizar si existe activación de la
apoptosis en esta línea celular debida a la infección viral, empleando la
caspasa 3 efectora como indicadora de este proceso. Para ello, una
monocapa de células RK13 fue infectada con el virus de arteritis equina
utilizando una multiplicidad de infección (MOI) inicial de 0,1 y un
tiempo de infección (TOI) de 24 horas (h). Empleando un kit comercial
fluorimétrico (Sigma) y un control positivo de activación de caspasa 3
inducido con Staurosporina comercial, nuestro análisis reveló un
incremento del doble respecto al mock y de la mitad respecto al control
positivo en el cultivo infectado con el VAE.
Una vez corroborada la activación de la caspasa 3, se estudió el efecto
de diferentes MOI (0,1, 0,25, 0,5, 1, y 5) a igual TOI (24 h). En este
ensayo se detectó un aumento de los niveles de caspasa al aumentar la
MOI alcanzando valores 2,5 veces superior al control empleando
MOI=5.
Para realizar una cinética de activación de caspasa 3 a distintos tiempos
(4 h, 6 h, 16 h, 24 h, 48 h y 72 h), se seleccionaron las MOI de 0.25 y 1.
Para la MOI de 0.25 se detectaron niveles significativos de caspasa a las
24 h con un pico de activación a las 48 h; mientras que para una MOI de
1, los primeros indicios de activación fueron a las 16 h y el pico máximo
a las 24 h postinfección.
A fin de determinar si existe activación de la vía extrínseca en esta línea
celular, se usó un kit comercial colorimétrico (Biovisión) para detectar
caspasa 8. Utilizando el inhibidor del proteosoma MG132 como control
positivo de inducción, y condiciones de experimentación de MOI=1 y
TOI =24 h, se logró determinar la activación de esta caspasa en el
cultivo de células RK13 tras la infección por el VAE.
En este trabajo se logró establecer la activación del mecanismo de
apoptosis mediante la detección de la caspasa 3, así como la activación
de la vía extrínseca (caspasa 8) en la infección experimental de células
RK13 con el virus de arteritis equina.
0095
PRESENCIA DE VARIANTE GENÉTICA DEL VIRUS BRONQUITIS
INFECCIOSA EN CUADROS DE ALTA MORTALIDAD DE AVES
COMERCIALES EN EL CENTRO-ESTE DE ENTRE RIOS
FS Vera1, HA Gamero2, M Plano2, MV Terrera3, CI Balette3, M Fabeiro3,
MF Rojas1
1
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Estación Experimental
Agropecuaria Concepción del Uruguay., Argentina. 2 Empresa Granja
Tres Arroyos, Argentina. 3 Servicio Nacional de Sanidad y Calidad
Agroalimentaria. Dirección de Laboratorio Animal., Argentina.
La Bronquitis infecciosa aviar (BIA) es una enfermedad altamente
contagiosa que ocasiona cuantiosas pérdidas económicas por aumento
de la mortalidad y alteración en los indicadores productivos. Es
producida por un Coronavirus. Al igual que muchos otros virus ARN,
tiene una alta tasa de error durante la transcripción de sus genomas
(Lai y Cavanagh, 1997), circunstancia que favorece la presentación de
variantes virales. La enfermedad presenta una distribución mundial. Se
informó por primera vez en Argentina en 1965 (Polero B. J. y Smitsaart
T. 1965) y en el año 2009 se realizó la caracterización genética de
diferentes aislamientos locales (Rimondi et al. 2009). A fines del año
2012 un incremento de la incidencia de la enfermedad en la región
centro-este (CE) de Entre Ríos, con alta mortalidad en lotes de aves
vacunadas con cepas tipo Massachusett y Connecticut demando la
investigación de presencia de variantes genéticas que ocasionan dicho
cuadro. El objetivo del presente trabajo es caracterizar
genotípicamente virus de Bronquitis infecciosa presentes en cuadro de
alta mortalidad. La presencia del virus de Bronquitis infecciosa (IBV) en
brotes de la enfermedad ha sido confirmada a través de pruebas de RTPCR, y la caracterización genotípica se realizó por análisis filogenético
de la región hipervariable del gen S del virus. En el estudio se
incluyeron un pool de órganos de aves enfermas como muestra de los
establecimientos afectados y pertenecientes a diferentes empresas que
comparten la región problema. De un total de 64 muestras tomadas y
confirmadas por técnicas moleculares, se logró secuenciar 58
aislamientos genómicos. El análisis filogenético muestra que el 98% de
115
Libro de resúmenes
los aislamientos resultaron agrupar en el cluster A, soportados con un
valor de bootstrap de 97. Este cluster presenta como cepa de
referencia a los aislamientos chinos denominados Q1, J2 y T3 (variantes
de IBV). En tanto, el 2% restante agrupo con cepas vacunales del tipo
Connecticut, soportados con un valor de bootstrap de 88 (según la
clasificación realizada por Rimondi et al., 2009). Conclusión: Se ha
logrado caracterizar genéticamente aislamientos genómicos
provenientes de brotes de BIA de la región CE de Entre Rios. Dicha
caracterización resulto en la emergencia de virus variante
genéticamente relacionado con aislamientos del tipo Q1, cepa
involucrada en otros países con brotes de la enfermedad con alta
mortalidad (Yihai Jiang et al. 2001, López et al. 2006).
0097
DETECCIÓN DE VIRUS QUE AFECTAN A LAS ABEJAS DURANTE EL
PERIODO 2009-2014
RS Castilla1, FJ Reynaldi1 2, GH Sguazza1, MRI Pecoraro1, CM Galosi1 3
1
Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP,
Argentina. 2 CCT-CONICET La Plata, Argentina. 3 CIC, Pcia Bs As,
Argentina.
Históricamente, la República Argentina siempre ha ocupado los
primeros puestos tanto en la producción como en la exportación
mundial de miel, con una producción media anual de 70.000 toneladas,
de la cual se exporta alrededor del 95% por un valor aproximado de 110
millones de dólares. Las abejas (Apis mellifera), son afectadas por una
gran cantidad de enfermedades infecciosas incluyendo virus, bacterias,
hongos, protozoos y nematodos, que impactan sobre la producción de
miel ya que reducen la población de las colonias infectadas. En los
últimos 50 años se han aislado, caracterizado y descrito más de 18
virus, la mayoría son virus ARN de simple cadena positiva, comúnmente
denominados Picorna-like virus. Estos virus presentan una distribución
cosmopolita, habiéndose detectado en todos los continentes. Estudios
previos realizados en nuestro país han evidenciado la presencia de
diversos virus: el Virus Israel de la Parálisis Aguda (IAPV) que causa
sintomatología neurológica caracterizado por abejas temblorosas, el
Virus de las Alas deformadas (DWV) que genera malformaciones en las
alas de las abejas, el Virus de la Parálisis Crónica (CBPV) que provoca
problemas neurológicos, el Virus de la Cría Ensacada (SBV), que ataca a
las larvas de las abejas deteniendo su desarrollo en estado de pupa, el
Virus de las Celdas Reales Negras (BQCV) con sintomatología similar a
SBV pero exclusiva de celdas reales de abejas reinas y el Virus de la
Parálisis Aguda (ABPV) que presenta sintomatología neurológica.
El objetivo de este trabajo fue el de estudiar la presencia de estos virus
en colmenas de producción en las principales regiones apícolas de la
República Argentina (Zona de Buenos Aires, Zona Centro, Zona del
Litoral y Zona Patagónica) en el periodo 2009-2014, utilizando una
técnica de multiplex RT-PCR previamente desarrollada en nuestro
laboratorio.
Los resultados obtenidos indicaron que DWV fue virus con mayor
presencia en las muestras procesadas (19.75%), seguido por IAPV
(12.89%), SBV (12.60%), BQCV (8.32%), CBPV (6.03%) y ABPV (3.53%).
Se evidenció una notoria fluctuación en la frecuencia de aparición de
ciertos virus de un año a otro.
Se encontró una menor presencia viral en algunos años,
probablemente debida a un control más eficaz del acaro Varroa
destructor, que ha sido reportado como uno de los principales vectores
para ciertos virus de abejas especialmente DWV. Es importante
destacar que el alto porcentaje de DWV hallado, aun en colmenas
asintomáticas, podría constituir un serio problema de producción ya
que este virus ha sido relacionado con el Síndrome de Despoblamiento
de Colmenas.
Estos resultados amplían los conocimientos relacionados a las
enfermedades virales que afectan la producción apícola y junto con
otros estudios que se están desarrollando en nuestro laboratorio, se
determinará el verdadero impacto sanitario que tienen estos virus con
el fin de generar medidas de control que puedan evitar pérdidas
económicas en la producción.
0100
ANÁLISIS PRELIMINAR DE LAS PROPIEDADES INMUNOGÉNICAS DE LA
PROTEÍNA DE FUSIÓN Y LA HEMAGLUTININA DEL VIRUS DE
DISTEMPER CANINO OBTENIDAS EN FORMA RECOMBINANTE EN LA
LEVADURA PICHIA PASTORIS
MA Tizzano1, GH Sguazza1, NA Fuentealba1 2, LD Picotto2, CM Galosi1 3,
MRI Pecoraro1
1
Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP,
Argentina. 2 CCT-CONICET La Plata, Argentina. 3 CIC, Pcia Bs As,
Argentina.
El virus de Distemper canino (CDV), un morbillivirus de la familia
Paramixoviridae, produce infecciones agudas y frecuentemente
mortales en todos los miembros de las familias Canidae, Mustelidae,
Procyonidae y en grandes felinos. La enfermedad se controla por
vacunación con vacunas inactivadas, atenuadas o modificadas
genéticamente. Los componentes antigénicos más importantes son dos
glicoproteínas que se encuentran en la superficie del virión, la
hemoaglutinina (H) y la proteína de fusión (F). La función de la H es la
de producir la unión del virus con el receptor que se encuentra en la
membrana plasmática celular. La proteína F media la fusión del virus
con la célula huésped o entre una célula infectada y sus adyacentes
favoreciendo así la diseminación del mismo. Estudios in vivo
demostraron que los anticuerpos (Ac) contra proteína F y proteína H
son de suma importancia en la prevención de la diseminación de la
infección y en el desarrollo de la enfermedad, por lo se las considera
como uno de los componentes principales en la formulación de la
vacuna. El objetivo de este trabajo fue el de evaluar la capacidad
inmunogénica de la proteínas H y la F expresadas en la levadura
P.pastoris, para su posible utilización en el diagnóstico o la prevención
del CDV. Para la expresión de H y F, se clonaron los fragmentos de PCR
homónimos en el vector de expresión pPIC9. Los genes H y F quedaron
bajo el promotor Aox1 y fusionados a una secuencia de exportación.
Con los plásmidos obtenidos pPIC9-H y pPIC9-F se transformaron las
levaduras P.pastoris GS115. Luego se seleccionaron los clones
recombinantes y se realizaron ensayos de expresión en cultivos líquidos
tipo “batch”. La expresión de la proteínas H y F recombinantes (Hrec y
Frec) en las levaduras, se chequeó por SDS PAGE / Western blot
utilizando un suero policlonal para su detección. Posteriormente las
proteínas recombinante expresadas y exportadas al medio de cultivo,
se purificaron por precipitación selectiva con NH4SO4. A continuación
se inocularon en ratones Balb/c solas y combinadas. Se realizaron 3
inoculaciones por vía intramuscular, utilizando Specol como adyuvante
para la primera inoculación. La producción de Ac específicos contra
Hrec y Frec se evidenció por western blot, para lo cual se utilizaron
células VERO infectadas con CDV. Posteriormente se realizaron ensayos
de virus neutralización con los sueros específicos obtenidos para
determinar su capacidad de neutralizante in vitro.
Los resultados obtenidos demostraron que la Hrec y Frec fueron
sintetizadas y exportadas al medio de cultivo. Cabe destacar además
que fueron reconocidas específicamente por el Ac policlonal utilizado.
Además, al ser inoculadas en ratones, indujeron anticuerpos que
reconocieron específicamente a proteína homónima de origen viral.
Por otra parte esos anticuerpos obtenidos fueron capaces de
neutralizar al virus in vitro
0101
DETECCIÓN DE ANIMALES PERSISTENTEMENTE INFECTADOS CON EL
VIRUS DE LA DIAREA BOVINA EN SUERO MEDIANTE UN METODO
SEROLÓGICO DE ALTO RENDIMIENTO
M Trotta1, M Lavoria1, ME Quintana2, D Malacari1, F Gonzalez1, N
Cardoso2, A Capozzo2
1
INTA, Instituto de Virología, Centro de Investigaciones en Ciencias
Veterinarias y Agronómicas., Argentina. 2 Consejo Nacional de
Investigaciones Científico y Técnicas (CONICET)., Argentina.
El virus de la diarrea viral bovina (VDVB) es uno de los patógenos más
comunes de los bovinos en el mundo que ocasiona considerables
pérdidas económicas en la industria ganadera. Una de las claves en el
control del VDVB es la identificación y eliminación de los animales
persistentemente infectados (PI), que son inmunotolerantes al virus y
mantienen su circulación en los rodeos. Los animales PI se diagnostican
116
Libro de resúmenes
por ausencia de anticuerpos séricos anti-VDVB y presencia de antígeno
en sangre mediante aislamiento viral, detección de genoma (RT-PCR), o
identificación de antígenos virales por ELISA (en células sanguíneas o
epitelio auricular). Sin embargo, la muestra mayormente remitida a
laboratorios de diagnóstico nacionales es suero, donde los antígenos
virales se encuentran en baja concentración, siendo prácticamente
indetectables por estas técnicas.
Nuestro objetivo ha sido desarrollar una metodología altamente
sensible y específica para la detección de animales PI basada en FALELISA (Filtration Assisted Luminometric ELISA). Esta plataforma utiliza
placas con base de filtro de polivinilidenofluoruro a las que se fija un
anticuerpo anti- VDVB. Las muestras son filtradas por vacío a través de
los pocillos donde la captura retiene los antígenos virales y se descartan
los contaminantes que pueden interferir con las reacciones de
detección. Se pueden filtrar 50ml de muestra por pocillo, por lo que se
detecta virus aunque esté en baja concentración y en volúmenes
grandes de muestra. La presencia de antígeno viral se revela con un
monoclonal anti-VDVB conjugado con peroxidasa y luminol, lo que
incrementa la sensibilidad. Se establecieron las condiciones de captura
y revelado. Mediante diluciones de stocks virales se calculó el límite de
detección de la técnica, siendo 100 veces más sensible que los ELISAs
comerciales. La sensibilidad resultó equivalente al contaminar
experimentalmente muestras de suero con cantidades conocidas de
antígeno viral. Resultados preliminares utilizando muestras pareadas de
suero, sangre entera y epitelio auricular indican que el FAL-ELISA puede
detectar antígeno viral en todas estas muestras con alta sensibilidad,
siendo más eficiente con suero bovino. Actualmente, se está realizando
la validación del ensayo. Esta técnica posibilita una detección rápida y
eficaz de animales PI, permitiendo realizar relevamientos en los rodeos
utilizando pool de sueros, facilitando el manejo sanitario y por ende, el
control de la enfermedad.
0122
ANÁLISIS DE TRANSCRIPTOS DEL GEN ASOCIADO A LA LATENCIA EN
HERPESVIRUS BOVINO TIPO 5
CA Silvestro, AC Bratanich
Facultad de Ciencias Veterinarias - UBA, Argentina.
Herpesvirus bovino tipo 1 y 5 (BoHV-1 y BoHV-5) son alfa-herpesvirus
que afectan la industria ganadera y se caracterizan por generar latencia
en ganglios sensoriales. El gen Relacionado a la Latencia (LR) es el único
transcripto hallado en BoHV-1 durante la latencia, y posee acción
antiapoptótica durante la infección aguda y la reactivación pero se
desconoce si LR5 comparte esta función acción. En BoHV-1 esta
actividad esta mediada por un producto del LR de 180 aminoácidos
(ORF-2). En todas las cepas de BoHV-5 secuenciadas hasta el momento
ORF-2 sólo comparte 52 aminoácidos con la versión del tipo 1 debido a
una señal de stop.
El objetivo de este trabajo fue el estudio de los transcriptos producidos
durante la infección lítica en BoHV-5. Para ello se infectaron células
MDBK con la cepa 663 de BoHV-5 (MOI 1) de las cuales se extrajo ARN
con Trizol 24 horas después. Previo tratamiento del ARN con RQ1
DNAsa (Invitrogen) para eliminar el ADN contaminante, se realizo una
reacción de RT-PCR con el kit One Step (Qiagen) y primers diseñados
específicamente para detectar transcriptos con y sin splicing (según
datos de secuenciación). Para la retrotranscripción se utilizo el cebador
reverso
específico
P2
(GGGTGGTGTTTCTCGACACCTCGGA).
Posteriormente, se hizo una primera ronda de amplificación con los
cebadores P1 (AGGCTGGGGGTCGCAAATACGCGGT) y el mismo reverso
P2; y por último una segunda ronda de amplificación para aumentar la
cantidad del producto específico con el cebador forward (P1A:
CGGCCCGAGAGTTAAGTATGC) y P2 como reverso.
Se logró la amplificación de dos productos, uno de 250 pares de bases y
otro de 450 pares de bases que fueron purificados y secuenciados. Las
secuencias obtenidas muestran intrones de entre 800 y 1000 pares de
bases que sugirieren la edición alternativa del mensajero del LR para la
generación de distintos productos de fusión entre ORF-1 y ORF-2. Uno
de ellos se origina con el marco de lectura del ORF-2 y continúa con el
del ORF-1 al eliminarse la señal de stop del ORF-2 contenida en el
intrón. Esto originaría una proteína de fusión con el extremo
aminoterminal correspondiente al ORF-2 y el carboxilo terminal
correspondiente al ORF-1.
Otros grupos de trabajo han hallado también varios productos a partir
del LR de BoHV-1, alguno de los cuales generan una proteína de fusión
entre ORF-2 y ORF-1 similar a la hallada en BoHV-5. Estos productos
podrían poseer una capacidad antiapoptótica distinta a la conocida
para el ORF-2 de BoHV-1 ya que si bien poseen el mismo extremo
amino terminal, el carboxilo, donde reside esta función, es diferente.
0142
COMPARACIÓN DE LA CINÉTICA DE REPLICACIÓN DE CEPAS DE
HERPESVIRUS BOVINO 4 AISLADAS EN ARGENTINA, EN LÍNEAS
CELULARES DE DIFERENTE ORIGEN
P Morán1, S Pérez2, D Rensetti1, A Odeón3, A Verna3
1
FCV - UNCPBA, Argentina. 2 FCV- UNCPBA - CIVETAN, Argentina. 3 INTA
Balcarce, Argentina.
El herpesvirus bovino tipo 4 (BoHV-4) ha sido aislado de bovinos con
presentaciones clínicas variadas y de animales aparentemente sanos en
diferentes partes del mundo; se lo asocia principalmente con
infecciones del tracto reproductivo en bovinos y puede infectar
diferentes especies tanto in vivo como in vitro, incluyendo líneas
celulares de origen humano. A partir de sus primeros aislamientos se
consideraron dos prototipos: el americano (tipo DN599) y el europeo
(tipo Movar). En Argentina, el BoHV-4 se aisló y caracterizó en el año
2007 en muestras de mucus cérvico-vaginal (MCV) de vacas que
presentaron cuadros de aborto, obteniéndose hasta el momento más
de 40 aislamientos. La variabilidad genómica de estos aislamientos
determinó la existencia de un nuevo prototipo en Argentina (Genotipo
3). El objetivo de este trabajo fue evaluar y comparar la cinética de
replicación de tres cepas de BoHV-4, filogenéticamente diferentes, in
vitro en tres líneas celulares de diferente origen. Estas cepas se aislaron
en el Servicio de Diagnóstico Veterinario del INTA Balcarce, de MCV de
vacas que abortaron. Se utilizaron cultivos celulares de origen bovino
(MDBK), de simio (VERO) y de humano (HeLa) a una concentración de 5
x 104 células/ml en placas de 24 pocillos. Los cultivos se infectaron con
las cepas 263, 365 y 435 a una multiplicidad de infección de 0.1, y se
incubaron a 37 ᵒC con 5% de CO2. Los sobrenadantes se recolectaron a
las 24, 48, 72, 96 y 120 h pos-infección (pi), realizándose la observación
del efecto citopatico (ECP) y registro fotográfico de las monocapas. Los
ensayos se realizaron por triplicado incluyéndose controles negativos
de cada uno de los cultivos celulares utilizados. El título viral se
determinó por el método de titulación a punto final sobre células
MDBK y se expresó como TCID50. Los resultados se analizaron
estadísticamente mediante ANOVA/Test de Tukey. Los títulos de las
cepas 263 y 435 fueron significativamente mayores (p < 0,05) en los
cultivos de MDBK con respecto a HeLa y VERO. La replicación de la cepa
365 fue significativamente menor (p < 0,05) en los cultivos de HeLa y no
se observaron diferencias (p > 0,05) en MDBK y VERO.
Coincidentemente con las diferencias en la cinética de replicación, el
inicio de ECP se evidenció a las 24 h pi solamente en la línea MDBK
infectadas con las cepas 263 y 435. A las 48 h pi se observó ECP en
todos los cultivos excepto en las monocapas de HeLa infectadas con la
cepa 365. A las 72 h pi todas las monocapas presentaron ECP marcado,
excepto la línea HeLa infectada con la cepa 365, donde el ECP fue leve.
Estos resultados demuestran que la dinámica replicativa de cepas
filogenéticamente divergentes pueden variar en relación a las células
infectadas y aportan información sobre el comportamiento biológico de
este virus, lo cual constituye un aspecto importante para el diseño de
experimentos in vivo e in vitro.
0144
ROL DE LOS RECEPTORES TIPO TOLL EN LA ENCEFALITIS OCASIONADA
POR HERPESVIRUS BOVINO TIPO 1 Y 5.
D Rensetti1, M Marin2, S Quintana3, P Morán1, A Odeón4, S Pérez5
1
FCV-UNCPBA, Argentina. 2 CONICET-INTA BALCARCE, Argentina. 3
INSTITUTO FARES TAIE, Argentina. 4 INTA BALCARCE, Argentina. 5 FCVUNCPBA CIVETAN, Argentina.
El herpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5) y el herpesvirus bovino tipo 1
(BoHV-1) son alfa-herpesvirus estrechamente relacionados. El BoHV-5
es el agente causal de meningoencefalitis necrotizante no supurativa en
terneros y, ocasionalmente, el BoHV-1 también puede causar
117
Libro de resúmenes
encefalitis en bovinos. Los mecanismos responsables de la
neuropatogenia de estos virus aún no han sido esclarecidos. En muchas
infecciones virales una respuesta inmune inadecuada o exacerbada
puede ocasionar alteraciones patológicas. Se ha descripto que en
ciertos casos la respuesta inflamatoria mediada por los receptores tipo
“toll” (TLRs) durante la infección viral puede resultar en daño tisular. En
otros casos, la deficiencia o alteración en el nivel de expresión de estos
receptores también ha sido asociada con el desarrollo de enfermedad.
Los TLRs son proteínas de señalización de transmembrana que ejercen
un rol importante en la respuesta inmune innata mediante el
reconocimiento de “patrones moleculares asociados a los patógenos”
(PAMPs). Los TLR3, 7, 8 y 9 están involucrados en la inmunidad contra
las infecciones virales, y los mismos reconocen patrones moleculares
basados en oligonucleótidos de ARN o ADN microbiano. El objetivo de
este estudio fue analizar el nivel de expresión de los TLRs en el sistema
nervioso central (SNC) durante la infección aguda de terneros
infectados experimentalmente con BoHV-1 y BoHV-5 y en terneros sin
infectar. Los terneros fueron inoculados intranasalmente con BoHV1(n=2) o BoHV-5 (n=2) (106.3 DICC50/ml) y un ternero permaneció
como control. La eutanasia se realizó a los 6 días post-infección y se
recolectaron muestras de cerebro, incluyendo corteza olfatoria, corteza
frontal y posterior y de médula espinal. Las muestras se analizaron
mediante Q-RT-PCR. Los resultados obtenidos revelan un incremento
significativo (p<0,05) en los niveles de expresión de TLR3 y TLR7 en
todas las área del SNC de terneros infectados con BoHV-1 y BoHV-5 con
respecto a los terneros no infectados, excepto para el TLR7 en corteza
posterior de terneros infectados con BoHV-1, donde no se detectaron
diferencias (p>0,05). En la infección aguda por BoHV-1 se observó un
aumento significativo (p<0,05) de la expresión de TLR8 en corteza
olfatoria y médula cervical mientras que para BoHV-5 estas diferencias
se hallaron en corteza posterior y médula cervical (p<0,05). Los niveles
de TLR9 no difirieron significativamente (p>0,05) con respecto al
control, excepto para la zona de corteza frontal donde se detectó una
disminución (p<0,05) en el nivel de expresión durante la infección
aguda por BoHV-1. A partir de estos resultados es posible inferir que el
TLR3 y el TLR7 podrían estar involucrados en el desarrollo de encefalitis
en bovinos infectados con BoHV-1 y BoHV-5.
0148
EVOLUCIÓN DEL PARVOVIRUS CANINO: LA CEPA 2C CONTINÚA
SIENDO PREVALENTE EN LA POBLACIÓN CANINA DE ARGENTINA
MB Gallo Calderon1, C Romanutti1, M Wilda1, A D'Antuono1, L Keller2, M
Bucci3, MN Giacomodonato4, NM Mattion1, JL La Torre1
1
ICT Milstein, Argentina. 2 Fundación de Estudios en Virología Animal
(FEVAN), Argentina. 3 UNSAM, Argentina. 4 IMPAM (UBA-CONICET),
Argentina.
Introducción: El Parvovirus Canino (PVC) provoca gastroenteritis
hemorrágicas severas con altas tasas de morbilidad y mortalidad en
perros. El virus, el cual es altamente contagioso, se libera en grandes
cantidades y es sumamente resistente en el medio ambiente. El PVC
invade el tejido linfoide de la región bucofaríngea y los ganglios
linfáticos mesentéricos, provocando inmunosupresión e infecciones
secundarias.
Desde su aislamiento en 1978, el PVC ha sufrido cambios antigénicos.
Las variantes antigénicas, PVC-2a y PVC-2b, reemplazaron
secuencialmente a la cepa original PVC-2 y se encuentran en distintas
proporciones en las poblaciones caninas de todo el mundo. La última
variante en aparecer, en el año 2000, fue la denominada PVC-2c, que
tiene una sustitución aminoacídica de un ácido Aspártico (Asp) por un
ácido Glutámico (Glu) en la posición 426, localizada en el sitio
antigénico más importante de la proteína de la cápside VP2.
Objetivo: Analizar la presencia de las diferentes cepas de PVC en la
población canina argentina.
Metodología: Entre los años 2010 y 2013, fueron remitidas a nuestro
laboratorio, 93 muestras (hisopos rectales) de perros sospechados de
infección por PVC. Luego de la extracción del ADN, se amplificó por PCR
un fragmento de 583 pares de bases del gen VP2, y en algunos casos
(N=6), se amplificó el gen completo VP2.
Resultados: Cuarenta y un muestras (44% del total) resultaron positivas
para PVC. Un análisis posterior, por secuenciamiento directo de los
productos de PCR obtenidos, mostró que 37 muestras (90,2%) fueron
caracterizadas como PVC-2c, 4 muestras (9,8%) fueron identificadas
como PVC-2a, mientras que la cepa PVC-2b no fue detectada. De
acuerdo con estos resultados, la PVC-2c sigue siendo la cepa
predominante en Argentina.
También se observó que el 65% de las cepas PVC-2c argentinas posee
una Alanina en lugar de una Treonina en la posición 440 (Thr440Ala);
esta mutación está ausente en las cuatro cepas PVC-2a detectadas en
este trabajo.
El clonado y el análisis de la secuencia del gen completo de la VP2, de
dos cepas representativas PVC-2c de este estudio (Arg 100 del 2012 y
Arg 107 del 2013), mostró que las secuencias aminoacídicas fueron
similares a las secuencias PVC-2c locales, previamente reportadas entre
el año 2008 y 2010. Por otro lado, el análisis filogenético del gen
completo de cepas PVC-2a argentinas, mostró que eran genéticamente
más cercanas a un aislamiento local PVC-2a del 2003 y a una cepa PVC2a Sudafricana, que a cualquiera de las PVC-2a recientemente
detectadas en Uruguay (2011).
Conclusiones: Los resultados obtenidos en este trabajo, junto con los
reportados en Uruguay; sugieren que, a pesar de la proximidad
geográfica entre ambos países, las cepas salvajes de PVC siguieron
diferentes vías evolutivas en cada país, lo que resulta en la prevalencia
de diferentes cepas, en poblaciones caninas relacionadas. Para
comprender la evolución del PVC, son necesarios estudios
epidemiológicos continuos.
0158
DETECCIÓN DE ROTAVIRUS EN EL GANADO VACUNO Y
TRABAJADORES RURALES DE LA PROVINCIA DE LA RIOJA.
A Spano Cruz1, P Castillo1, V Cuffia1, A Rivero1, N Moreno1, A Grasselli2,
JC Amaya1 3, L Sabini4, P Cordoba1
1
Instituto Universitario de Ciencias de la Salud de Fundación Barceló.
Sede La Rioja, Argentina. 2 Secretaria de Ganaderia de la Provincia de La
Rioja, Argentina. 3 Direccion de Zoonosis de la Provincia de La Rioja,
Argentina. 4 Universidad Nacional de Rio Cuarto, Argentina.
Rotavirus es un virus desnudo perteneciente a la Familia Reoviridae.
Presenta su genoma dispuesto en 11 segmentos por lo que puede
presentar un rearreglo de segmentos con otras especies. Produce
diarrea en terneros menores de un año y en niños. Nuestro objetivo fue
estudiar la presencia de rotavirus en vacuno y en trabajadores rurales
de dos sectores de la Provincia para conocemos la importancia de
rotavirus bovino en la produccion ganadera de la provincia y la
interrelacion de especie que podria haber con los trabajadores rurales.
Se estudiaron 102 muestras de materia fecal de terneros menores de 2
años con diarrea y 20 muestras de materia fecal de empleados rurales
sin diarrea entre Mayo del 2013 - Mayo 2014 en dos regiones de la
provincia. Las regiones estudiadas son Patquia, a 70 km de la capital, y
Famatina, a 231 km de la capital. La detección de Rotavirus fue
realizada por Inmunocromatografia (IC) Rota/Adeno screen dipstick
(Microgen Bioproducts) para la detección del Grupo A y por
electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para el Grupo C. Las
muestras positivas son amplificadas en el gen 9 por RT-PCR para su
secuenciación en Macrogen Korea.
Tres muestras vacunas fueron positivas correspondiente al 2,94 % del
total. Una de ellas fue positiva por PAGE, presentando un patrón corto,
pero negativa por IC confirmando un rotavirus del Grupo C. El ternero
tenía 6 meses pertenecientes a la zona de Famatina. Las otras dos
muestras positivas fueron rotavirus del grupo A. En este momento las
tres muestras están siendo enviadas para su secuenciación. Ninguna de
las muestras de los empleados rurales fue positiva.
Los resultados muestran que rotavirus bovino del grupo A y C circulan
en el ganado Riojano produciendo diarrea aunque con menos
importancia que en otras regiones de Argentina. Los rotavirus
detectados requieren aun su secuenciación para confirmar que no
existe una relación Interespecie.
0168
BACTERIÓFAGOS LÍTICOS PARA EL BIOCONTROL DE LA TIFOSIS AVIAR
H Barrios1, X Ortiz1 2, MI Gismondi1 3
118
Libro de resúmenes
1
Universidad Nacional de Luján, Argentina. 2 Comisión de
Investigaciones Científicas (CIC), Argentina. 3 Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Argentina.
La tifosis aviar (TA) causada por Salmonella enterica subespecie
enterica serovar Gallinarum biotipo Gallinarum (SG) afecta a las aves de
postura y se transmite rápidamente por vía horizontal y vertical. En
avicultura, para controlar esta enfermedad se utilizan antibióticos, pero
su uso está restringido por la aparición de cepas resistentes con riesgos
para la salud pública. Los bacteriófagos líticos muestran un uso
potencial como biocontroladores de SG tanto en las aves como en el
ambiente de las granjas donde es frecuente el uso de desinfectantes
que podrían afectar la actividad bactericida del fago.
El objetivo de este trabajo fue estudiar un bacteriófago aislado a partir
de las heces de una gallina enferma de TA, evaluando la estabilidad
frente a desinfectantes de uso común en avicultura y determinando su
especificidad viral. Para la evaluación de la actividad lítica, el fago se
incubó con distintas diluciones de yodo, lavandina, creolina, CID 20® y
amonio, a 37°C, 2 horas. Posteriormente, alícuotas de cada suspensión
desinfectante/fago (DF) se mezclaron con 103 UFC de SG y 2.5 ml de
agar nutritivo semisólido; la mezcla se volcó inmediatamente sobre
placas con agar nutritivo, que se incubaron a 37°C, 4 horas. Se
determinó el número de calvas cada 30 minutos. Las mezclas DF se
guardaron a temperatura ambiente y a la semana se repitió el ensayo.
Cuando se utilizó la mezcla DF preparada en el momento, el
crecimiento bacteriano fue inhibido por la presencia del antiséptico e
impidió advertir la actividad del fago. Sin embargo, cuando se utilizó la
suspensión DF preparada 7 días antes, los desinfectantes disminuyeron
su poder antimicrobiano permitiendo el crecimiento en césped de
bacterias y la formación de placas de lisis. El número de placas
registradas no difirió al del control con fago solo, en tanto se
observaron diferencias en el tamaño de las calvas, que fueron más
grandes cuando se utilizaron los desinfectantes creolina, CID 20® y
amonio. Para determinar la especificidad viral se utilizaron 2 cepas de
SG y 17 cepas de S. Enteritidis (SE) obtenidas de granjas de pollos
parrilleros, y 5 cepas de Salmonella spp., obtenidas de granjas de
gallinas ponedoras. Se infectaron las distintas cepas bacterianas con el
fago en placas de agar nutritivo y se determinó la lisis celular luego de
una incubación a 37°C toda la noche. El fago produjo lisis total o parcial
de las dos cepas de SG, mientras que en 5 cepas de SE se observó lisis
total y en 8 de ellas la lisis fue parcial. No hubo actividad lítica en las 4
cepas de SE restantes. Con respecto a las cepas de Salmonella spp.
aisladas en las granjas de gallinas ponedoras, sólo 1 evidenció lisis
parcial.
Estos resultados demuestran que la actividad lítica del fago no es
afectada por la presencia de desinfectantes de uso en avicultura y su
especificidad para actuar sobre SG.
El efecto del fago sobre SE podría deberse a la similitud antigénica que
existe entre SG y SE.
0175
EL CITOESQUELETO DE ACTINA Y SU RELACIÓN CON EL MECANISMO
DE INTERNALIZACIÓN DEL VIRUS DE LA BURSITIS INFECCIOSA AVIAR
MC Gimenez1 4, JF Rodríguez2, MI Colombo1 4, LR Delgui1 3
1
Instituto de Histología y Embriología Mendoza(UNCuyo-CONICET),
Mendoza, Argentina. 2 Centro Nacional de Biotecnología-CSIC, Madrid,
España. 3 Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UNCuyo, Mendoza,
Argentina. 4 Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Juan
Agustín Maza, Mendoza, Argentina.
El Virus de la Bursitis Infecciosa Aviar(IBDV), miembro de la familia
Birnaviridae, es el agente etiológico de la Enfermedad de Gumboro,
infección inmunosupresora que afecta a individuos jóvenes del género
Gallus gallus ocasionando graves pérdidas económicas en la industria
avícola.
Al inicio del ciclo de replicación, la mayoría de los agentes virales son
internalizados en la célula hospedadora mediante la vía endocítica. El
citoesqueleto de actina es un regulador clave de ciertas rutas
endocíticas, siendo la dinámica de polimerización y despolimerización
de los microfilamentos de actina un evento que subyace la formación
de proyecciones de la membrana plasmática características de las vías
endocíticas dependientes de actina. Diversos virus son capaces de
alterar la homeostasis del citoesqueleto de actina durante su
internalización en las células.
El objetivo de nuestro trabajo de investigación consistió en estudiar el
papel del citoesqueleto de actina y sus proteínas reguladoras, las
GTPasas Rho, en la internalización de IBDV.
Empleamos los agentes despolimerizantes del citoesqueleto de actina
Citocalasina D y Latrunculina B para estudiar su efecto en la
internalización de IBDV. Determinamos el porcentaje de células
infectadas mediante microscopía confocal y los niveles de la proteína
viral VP3 mediante Western blot luego de infectar las células pretratadas con los agentes. Realizamos estudios ultraestructurales
mediante microscopía electrónica de trasmisión para estudiar la
morfología de la internalización viral, tanto en células con el
citoesqueleto íntegro como en aquellas pre-tratadas con los agentes. A
su vez, utilizando microscopia confocal, analizamos la alteración en el
citoesqueleto de actina asociada al proceso de internalización viral.
Finalmente, sobreexpresamos versiones mutantes dominante-negativa
de las proteínas reguladores del citoesqueleto de actina Rho A, Rac-1 y
Cdc42 y analizamos su efecto sobre la entrada del virus en las células
transfectadas.
Hemos observado que el pre-tratamiento de las células con Citocalasina
D y Latrunculina B afecta drásticamente la internalización de IBDV.
Además, comprobamos que el citoesqueleto de actina resulta
totalmente desorganizado de forma transciente durante la
internalización, revirtiendo luego de esta. Por otro lado, la
sobreexpresión de las proteínas mutantes dominante-negativas de Rho
A y Rac-1 afectaron negativamente la infección de IBDV. El conjunto de
datos obtenidos ha permitido demostrar el importante papel de los
filamentos de actina y de sus proteínas reguladoras, las GTPasas Rac-1 y
Rho A, durante el proceso de internalización de IBDV. A su vez, hemos
demostrado que la internalización de IBDV conlleva la completa
desorganización del citoesqueleto de actina. En conclusión, estos
resultados apoyan a la vía macropinocítica, proceso endocítico
altamente dependiente del citoesqueleto de actina, como la principal
involucrada en la entrada de IBDV en las células.
0181
OBSERVACIÓN
DE
CAMBIOS
MORFOLÓGICOS
NUCLEARES
COMPATIBLES CON APOPTOSIS EN CULTIVOS CELULARES INFECTADOS
CON HERPESVIRUS BOVINO TIPO 1 Y 5.
D Rensetti1, P Morán1, M Marin2, A Verna2, A Odeón5, S Pérez4
1
FCV-UNCPBA, Argentina. 2 INTA BALCARCE-CONICET, Argentina. 4 FCVUNCPBA-CIVETAN, Argentina. 5 INTA BALCARCE, Argentina.
El herpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5) es un alfa-herpesvirus que
produce meningoencefalitis necrotizante no supurativa en terneros. El
herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) causa trastornos respiratorios,
reproductivos y abortos. Ocasionalmente, BoHV-1 puede causar
encefalitis en bovinos. El ciclo infeccioso de los herpesvirus se
caracteriza por estadios de infección aguda, latencia y reactivación. El
gen relacionado a la latencia (gen LR) del BoHV-1 es esencial para el
establecimiento y mantenimiento de la latencia viral. Una de sus
propiedades biológicas más estudiadas es su capacidad de inhibir la
muerte celular programada (apoptosis). Los herpesvirus pueden inducir
apoptosis durante la etapa de infección aguda para promover la
diseminación de la progenie viral, o inhibir la apoptosis para preservar
el pool de células latentemente infectadas. Las regiones codificante y
regulatorias del gen LR del BoHV-5 difieren marcadamente de las del
gen LR de BoHV-1, por lo cual es posible que sus propiedades biológicas
también difieran. En este estudio se utilizó la tinción con 4',6-diamino2-fenilindol (DAPI) para evaluar los cambios morfológicos nucleares
característicos de la apoptosis (condensación de la cromatina y
fragmentación nuclear) en líneas celulares (MDBK, BHK-21 y BT)
infectadas con las cepas A663 (BoHV-5b), 97-613 (BoHV-5a) y Cooper
(BoHV-1.1) a una multiplicidad de infección de 0.1, sobre monocapas
preformadas, en placas de 6 pocillos. Como controles de inducción de
apoptosis se utilizó la micotoxina deoxinivalenol (DON) y DMSO al 2%. A
las 24 horas post-infección (hpi) las células se lavaron, fijaron y tiñeron
con DAPI. La morfología nuclear se observó con microscopio de
fluorescencia. Se registraron de 3 a 6 campos visuales, se determinó el
porcentaje de células apoptóticas y se evaluó mediante ANOVA/Test de
Tukey. El porcentaje de apoptosis en MDBK infectadas con cualquiera
119
Libro de resúmenes
de las cepas fue significativamente superior (p<0,05) con respecto a las
MDBK sin infectar, aunque no se registraron diferencias entre BoHV-1 y
las cepas de BoHV-5 (p>0,05). En BHK-21, sólo se detectaron diferencias
significativas (p<0,05) en el porcentaje de apoptosis luego de la
infección con la cepa 97-613 (BoHV-5) y la cepa Cooper de BoHV-1 con
respecto al control. En BT, el porcentaje de apoptosis fue
significativamente superior (p<0,05) para todas las cepas con respecto
al control. Además, el porcentaje de apoptosis inducido por la cepa
Cooper de BoHV-1 fue significativamente superior (p<0,05) con
respecto a ambas cepas de BoHV-5. Estos resultados demuestran que la
inducción de cambios nucleares indicativos de apoptosis por alfaherpesvirus bovinos son dependientes del tipo celular. BoHV-1 tendría
mayor capacidad de inducir apoptosis que BoHV-5, al menos luego de
24 hpi en BT. Conocer los detalles de la interacción virus/célula
permitirá discernir algunas de las diferencias en la patogenia de ambos
herpesvirus.
0201
CARACTERIZACIÓN ANTIGENICA Y CIRCULACIÓN DE CORONAVIRUS
BOVINO EN ARGENTINA DURANTE EL PERIODO 2011-2014
M Bok1, D Rodriguez1, A Badaracco1, S Miño1, C Vega1, L Saif2, V
Parreño1
1
Instituto de Virología, INTA Castelar, Argentina. 2 FAHRP, The Ohio
State University, Estados Unidos.
Coronavirus bovino (CoVB) es un agente causal en el síndrome de la
Diarrea Neonatal del Ternero (DNT) siendo responsable de grandes
pérdidas económicas a nivel mundial. CoVB es un virus ARN simple
cadena no segmentado que pertenece al género Betacoronavirus
dentro de la subfamilia Coronavirinae, familia Coronaviridae, orden
Nidovirales. La glicoproteina structural S de CoV es la responsable en la
union al receptor y en la inducción de anticuerpos (Acs) neutralizantes,
es la más pleomórfica entre las cepas de CoV y es utilizada para la
caracterización molecular de los aislamientos. La proteína S consiste en
dos subunidades, S1 y S2. La proteína S1 es útil para estudiar la
variabilidad y evolución de CoV. Este trabajo describe la circulación de
CoVB en Argentina en los últimos cuatro años y compara molecular y
antigénicamente la cepa de referencia Mebus con las cepas circulantes
en Argentina. Durante 2011-2014 ingresaron 2016 muestras de materia
fecal para diagnóstico de DNT que fueron analizas por ELISA
detectándose 22 muestras positivas a CoVB (1.09%) correspondiendo al
10,87% de los brotes (10/92). El 0.1% (2/2016) de las muestras y el
7.61% (7/92) de los brotes positivos a CoVB también fueron positivos a
Rotavirus A. Los brotes positivos a CoVB pertenecían a rodeos de
tambo de las provincias de Bueno Aires, Santa Fe y Córdoba y un rodeo
de cría de la provincia de Buenos Aires. Se eligieron muestras
representativas de cada explotación y provincia de las cuales se
amplificó una porción de la proteína S por RT-PCR correspondiente a los
nucleótidos 1167-2075 del dominio S1 y nucleótidos 2058-2730 del
dominio S2. El análisis filogenético (Neighbor-joining) de las secuencias
obtenidas en conjunto con cepas de CoVB argentinas de años
anteriores y cepas disponibles en GenBank indico que las cepas
argentinas detectadas en este periodo se agrupan tanto a nivel
nucleotídico como aminoacídico junto con cepas de Italia y Dinamarca y
alejadas de la cepa de Referencia Mebus utilizada en las vacunas para
DNT existentes en el mercado argentino. Para estudiar si estas
diferencias de aminoácidos se traducen en diferencias antigénicas, se
realizó un ensayo de neutralización cruzada, en el cual Acs de yema de
huevo (IgY) y sueros de cobayos y gallinas específicos contra la cepa de
referencia Mebus y una cepa local adaptada a cultivo celular Arg95 se
enfrentaron a la cepa viral homóloga o a la heteróloga y se observó que
los títulos de Acs neutralizantes de la IgY anti Mebus y anti Arg95 eran
iguales para ambas cepas virales (32768 y 8192, respectivamente) al
igual que los títulos de Acs neutralizantes en el suero de las gallinas (
8192 y 512, respectivamente) y en los sueros de cobayos ( 128 para
ambos virus). Estos resultados confirman que a pesar de las diferencias
observadas, existe un único serogrupo entre los CoVB y que vacunas
que contengan la cepa Mebus en su formulación serían una
herramienta eficaz para la prevención de la diarrea CoVB.
0209
DINÁMICA NATURAL DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA LEUCOSIS
BOVINA: ¿PERMANECE EN TODOS LOS ANIMALES EN FORMA
ESTABLE?
I Alvarez1 2, G Gutiérrez1 2, F Rondelli4, K Trono1
1
Instituto de Virología, INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina. 4
Cátedra de Inmunología. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad
Nacional de Rosario, Argentina.
La infección natural con el virus de la leucosis bovina (BLV) alcanza
niveles heterogéneos in vivo. En los rodeos con altas tasas de
endemicidad, como la mayoría de los tambos de altos niveles
productivos, alrededor del 40% de los animales poseen una alta carga
proviral en sangre con más del 1% de glóbulos blancos circulantes
infectados, según datos obtenidos en distintos estudios transversales.
Una alternativa para el control de esta infección, consiste en la
reducción de los niveles de carga proviral a nivel predial con el
propósito final de reducir la transmisión entre animales susceptibles.
Este concepto sería válido siempre y cuando el individuo infectado
pudiera controlar en forma permanente los niveles bajos de infección.
En este trabajo se evaluaron animales naturalmente infectados con BLV
con el fin de establecer la dinámica de la infección a lo largo del tiempo
en situación de campo. Se analizó la carga proviral de 7 vacas de tambo
infectadas naturalmente, durante un período de un año, entre dos
partos sucesivos. Asimismo, se analizó la presencia de material genético
viral (ARN) en las muestras tomadas, con el objeto de detectar
potenciales momentos de expresión viral activa. Los resultados indican
que la carga proviral en sangre entera puede modificarse a lo largo del
ciclo productivo. Cuatro de los 7 animales presentaron variaciones de
hasta 5 veces entre dos puntos consecutivos, y 1 de los 7 animales en
estudio, presentó fluctuaciones de alrededor de 40 veces. Asimismo, la
detección de ARN viral en sangre en 2 de los animales en estudio,
correspondiente a 2 genes diferentes de BLV, sugiere la presencia de
picos de re-activación viral.
0225
PRIMER AISLAMIENTO DE HERPES VIRUS BOVINO TIPO 1 EN
PATAGONIA ARGENTINA
R Apóstolo1, S Maidana2 3, J Mellado1, JP Martínez4, M Raso1, SA
Romera2 3, C Robles5
1
Estación Experimental Agroforestal INTA Esquel, Argentina. 2 Instituto
de Virología, CICVyA, INTA Castelar, Argentina. 3 Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y Tecnológicas, Argentina. 4 Agencia de
Extensión Rural INTA Trevelin, Argentina. 5 Estación Experimental
Agropecuaria INTA Bariloche, Argentina.
El Herpesvirus Bovino tipo 1 (BoHV1) afecta naturalmente al bovino y
puede generar diversas manifestaciones clínicas como rinotraqueítis,
vulvovaginitis y balanopostitis pustular infecciosa, conjuntivitis, aborto,
enteritis y encefalitis.
La distribución de la infección es mundial. En la Patagonia argentina, un
estudio previo realizado en bovinos de 47 crianceros de la comunidad
Millaín Currical, en la provincia de Neuquén, revelo una prevalencia
serológica del 53,4% y en la zona noroeste de la provincia de Chubut,
en un estudio realizado en 83 rodeos de cría se detectó un 50% de los
establecimientos positivos con una seroprevalencia a nivel individual
del 52,3%. A partir de esta información y teniendo en cuenta la
ocurrencia en Patagonia de eventos que afectan la salud bovina que
podrían corresponderse con los cuadros producidos por el BoHV1, se
llevó a cabo un estudio durante un brote de rinitis y conjuntivitis en
terneros alojados en una recría a corral en el Valle 16 de Octubre, al
noroeste de la provincia de Chubut, durante el invierno de 2013 a fin de
intentar el aislamiento de BoHV1.
El lote estaba conformado por 88 terneros de raza Hereford, Aberdeen
Angus y sus cruzas, todos provenientes del mismo campo de cría y
estaban en confinamiento desde el destete, en mayo de 2013, con
aproximadamente 6 meses de edad.
A mediados de junio de ese año se detectaron 3 terneros con epifora. A
comienzos de julio, se detectaron otros 22 terneros con conjuntivitis de
tipo serosa y purulenta, 5 de estos presentaban además secreción nasal
serosa y 5 presentaban sólo secreción nasal serosa. Se tomaron en total
11 muestras de secreciones oculares y nasales de animales con
120
Libro de resúmenes
secreciones de tipo serosa. Todos los animales con síntomas fueron
tratados con tilmicosina (10 mg/Kg peso vivo).
Las muestras se tomaron utilizando hisopos de dracón estériles. Una
vez colectada la muestra, los hisopos se colocaron en tubos
conteniendo medio de transporte MEM-E suplementado con
antibióticos y antifúngicos y conservados en nitrógeno líquido hasta su
procesamiento.
Las muestras fueron inoculadas sobre monocapas de células MDBK y
observadas diariamente. Se realizaron tres pasajes ciegos para
confirmar las muestras negativas. A partir de sobrenadante de cultivo
de las monocapas que presentaron efecto citopático se realizó la
extracción de material genético viral mediante el uso de kit comercial.
Luego se realizó una PCR multiplex diferencial entre BoHV1/5 para
tipificar los aislamientos.
Se lograron aislar y confirmar por PCR 10 BoHV1. Uno obtenido de la
mucosa ocular correspondiente al inicio del brote en junio y 5 de la
mucosa nasal y 4 de la mucosa ocular del brote del mes de julio.
Este trabajo confirma los trabajos previos de evidencia serológica de
BoHV1 y constituye el primer aislamiento de BoHV1 en ganado bovino
en la Patagonia argentina.
0227
EL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA INFECTA A LAS CÉLULAS
DENDRÍTICAS BOVINAS DERIVADAS DE MONOCITOS A TRAVÉS DE UN
MECANISMO MEDIADO POR LA GLICOPROTEÍNA E2
NP Cardoso, ME Quintana, DA Malacari, FC Mansilla, AV Capozzo
INTA, Instituto de Virología, Centro de Investigaciones en Ciencias
Veterinarias y Agronómicas. Buenos Aires, Argentina.
La infección viral de las células presentadoras de antígeno puede tener
un impacto devastador en el sistema inmunológico, favoreciendo el
estado de inmunosupresión. En estudios previos demostramos que el
virus de la diarrea viral bovina (VDVB), un virus que causa
inmunosupresión y que presenta afinidad por células del sistema
inmune, es capaz de infectar eficientemente a las células dendríticas
bovinas. El objetivo de este trabajo fue estudiar la cinética de
crecimiento viral y mecanismo de entrada del VDVB en células
dendríticas diferenciadas de monocitos bovinos (moDC). Observamos
que el VDVB infecta las moDC con una cinética acelerada en
comparación con células MDBK, con producción de nuevas partículas
virales entre las 3 y 6 horas post-infección (hpi). Estudios de
fluorescencia mostraron que el virus ingresa rápidamente a las moDC.
Dado que la glicoproteína E2 media la entrada del virus a MDBK y es
una glicoproteína con alto contenido de manosa evaluamos si el virus
usaría los receptores de manosa de las moDC y/o las vías fagocíticas
mediadas o no por receptores Fc. Las moDC fueron pre-incubadas con
EDTA, un polímero de manosa (mannan) o con proteína E2 truncada
recombinante purificada (rtE2). Por otro lado el inóculo viral fue preincubado con anticuerpos anti-E2 de distintas especies y sueros
normales. A las 0, 18 y 24 hpi se recogieron los sobrenadantes para la
titulación en células MDBK y los pellets fueron procesados para
detectar traducción (ELISA para proteína NS3). El pre-tratamiento de
Mo-DC con mannan o EDTA no bloqueó la entrada del virus a las moDC
mientras que la pre-incubación con concentraciones crecientes de rtE2
redujo el rendimiento viral. Todos los sueros anti-E2 bloquearon
completamente la infección de las moDC, mientras que los sueros
normales no interfirieron. Resultados preliminares utilizando un
anticuerpo monoclonal anti-CD46 indican que esta proteína no sería el
receptor que usa el virus. Concluimos que el VDVB infecta
eficientemente a las moDC utilizando un mecanismo mediado por la
glicoproteína E2.
0237
ESTUDIO DE LA APOPTOSIS INDUCIDA POR EL VIRUS DE LA BURSITIS
INFECCIOSA, EL ROL DE LA PROTEÍNA NO ESTRUCTURAL VP5 EN ESTE
PROCESO Y SU LOCALIZACIÓN SUBCELULAR.
JM Carballeda1 2, G Maroniche2 4, S Chimeno Zoth1 2, MS Lucero1 2, M
Richetta1 3, E Gómez1 2, MJ Gravisaco1, A Berinstein1 2
1
Instituto de Biotecnología-INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina. 3
ANPCyT, Argentina. 4 Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad
Nacional de Mar del Plata, Argentina.
El virus de la bursitis infecciosa (IBDV) pertenece a la familia
Birnaviridae. Es un virus desnudo y su cápside posee geometría
icosaédrica. Provoca inmunosupresión en pollos, sobre todo jóvenes.
Posee un genoma de ARN doble cadena bisegmentado. El segmento
pequeño codifica para una ARN polimerasa dependiente de ARN, la
proteína VP1, mientras que el segmento mayor codifica para las
proteínas de cápside VP2, VP3 y la proteasa viral VP4. Un marco de
lectura superpuesto codifica para la proteína VP5 cuyo rol respecto a la
apoptosis es muy discutido. En cuanto a su localización, por métodos
bioinformáticos, se ha señalado que es una proteína de transmembrana
que exhibe hacia el espacio extracelular la región C-terminal. El objetivo
del presente trabajo fue determinar la capacidad de IBDV de inducir
apoptosis en distintos tipos celulares y determinar el papel de VP5 en
este proceso. Por otro lado, fue objetivo también ampliar los
conocimientos acerca de la localización subcelular de esta proteína a
través de distintos programas bioinformáticos y del análisis in vivo en
células transfectadas con fusiones de genes de proteínas fluorescentes
al gen de VP5. Los resultados obtenidos demostraron que si bien IBDV
es capaz de inducir apoptosis tanto en la bursa de Fabricio (órgano
blanco del virus) de animales inoculados como en células provenientes
de fibroblastos de ave, no es capaz de hacerlo en la línea celular DT-40,
derivada de linfocitos B de pollo. Incluso en esta última, la infección con
IBDV reduce la activación del efector apoptótico Caspasa 3. Asimismo,
VP5 es capaz de reducir la cantidad de mensajero de Caspasa 3 en
células transfectadas. Respecto a su localización subcelular, al utilizar
diferentes programas disponibles para el análisis in silico, observamos
discrepancias entre los resultados obtenidos, no pudiendo caracterizar
a VP5 consistentemente por esta metodología. Sin embargo, mediante
estudios in vivo logramos determinar que VP5, si bien se encuentra en
la membrana plasmática de las células transfectadas, no es una
proteína de transmembrana ya que no expone ningún dominio hacia el
exterior de la célula.
0249
EXPRESIÓN DE TNF-α Y TNFRII EN BOVINOS INFECTADOS CON EL
VIRUS DE LA LEUCOSIS BOVINA QUE DESARROLLAN ALTA O BAJA
CARGA PROVIRAL.
MV Nieto Farías, PA Lendez, MC Ceriani, GL Dolcini
Laboratorio de Virología-Facultad de Ciencias Veterinarias (FCV),
CIVETAN (Centro de Investigación Veterinaria de Tandil)-CONICET,
Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires
(UNCPBA), Tandil, Argentina, Argentina.
Introducción: El virus de la leucosis bovina (BLV) es un retrovirus
causante de una enfermedad linfoproliferativa que afecta al ganado
bovino. El desarrollo de los perfiles de infección de alta carga proviral
(ACPV) o de baja carga proviral (BCPV) estaría relacionado a factores
genéticos e inmunológicos. El TNF-α tiene un importante rol en la
respuesta inmune; sus acciones están relacionadas a la expresión de
sus receptores TNFRI y RII: induciendo la apoptosis o estimulando la
proliferación celular, respectivamente, aunque no de manera
excluyente. En la infección por BLV, postulamos que los animales con
ACPV son menos eficientes para eliminar los linfocitos infectados que
los animales de BCPV; este fenómeno estaría regulado en parte por el
mecanismo apoptótico y por un desbalance en la expresión de los
receptores para TNF-α.
Objetivo: Cuantificar la expresión de ARNm de TNF-α y TNFRII en
animales de ACPV, BCPV o negativos para BLV.
Metodología: Se extrajeron muestras de sangre entera de animales
negativos y positivos para BLV. Se determinó el estatus infeccioso por
ELISA y la carga proviral por PCR en tiempo real. Se seleccionaron 11
animales de ACPV, 8 de BCPV y 3 negativos. Se les extrajo 60 ml de
sangre y se obtuvo el buffy coat mediante la lisis de los glóbulos rojos
con cloruro de amonio. Por otro lado, se seleccionaron 3 animales de
ACPV y 3 animales de BCPV, se les extrajo 60 ml de sangre y se
obtuvieron los PBMC mediante gradiente de Ficoll. Estas células fueron
cultivadas por 24 hs en presencia de rTNF-α. La expresión de ARNm
para TNF-α y TNFRII se analizó mediante la metodología de
cuantificación relativa por PCR en tiempo real, utilizando SybrGreen y
amplificando GAPDH como gen endógeno. Los resultados de expresión
fueron analizados con REST© (Relative Expression Software Tool) 2009.
121
Libro de resúmenes
Resultados: Se evidenció una mayor expresión de ARNm de TNF-α y de
TNFRII en los PBMC de los animales positivos para BLV con respecto a
los negativos. No se encontraron diferencias significativas en la
expresión de dichos genes entre los animales positivos con diferentes
perfiles de infección. Se observó una mayor expresión de TNFRII en los
PBMC de animales de BCPV estimulados con rTNF-α con respecto a los
animales de ACPV. Esta diferencia no se observó para el gen de TNF-α.
Conclusiones: En animales con perfiles de infección por BLV ya
establecidos, la expresión de TNF-α y TNFRII fue similar. Restaría
analizar el balance de expresión de ambos receptores para TNF-α, RI y
RII, y su relación con la apoptosis o proliferación celular.
0250
EVIDENCIA DE LA PRESENCIA DE ADN DE VIRUS DE LEUCOSIS BOVINA
EN TEJIDO MAMARIO HUMANO.
PA Lendez1, MV Nieto Farías1, GC Buehring2, HM Shen2, GL Dolcini1, MC
Ceriani1
1
Laboratorio de Virología-Facultad de Ciencias Veterinarias (FCV),
CIVETAN (Centro de Investigación Veterinaria de Tandil)-CONICET,
Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires
(UNCPBA), Tandil., Argentina. 2 The School of Public Health, University
of California, Berkeley, California, Estados Unidos.
Introducción: El virus de leucosis bovina (BLV) es un deltaretrovirus
cuyo huésped natural es el ganado bovino, con una prevalencia de más
del 90% en los tambos de nuestro país. Ocasiona grandes pérdidas
económicas por la reposición de animales que desarrollan
linfosarcoma. Además de las regiones genómicas características de los
retrovirus, los deltaretrovirus poseen una región adicional que codifica
para una proteína transactivante, Tax. Infecta linfocitos B- CD5+, pero
se han encontrado mayor cantidad de DNA y proteínas virales en tejido
mamario que en los linfocitos B. Se ha propuesto que este virus podría
estar asociado con el cáncer de mama en humanos. Estudios previos en
otros países demostraron la presencia de anticuerpos anti-p24 en suero
de pacientes voluntarios y la presencia de ADN viral en cortes
histológicos de tumores de mama humanos.
Objetivo: Determinar la presencia de ADN viral en cortes histológicos
provenientes de cirugías mamarias en nuestro país.
Materiales y métodos: Se seleccionaron 25 cortes histológicos
provenientes de cirugías mamarias humanas, sin resguardo de edad ni
patología. Para la detección del ADN de BLV se utilizó la técnica de in
situ-PCR amplificando una región del gen tax y el producto de PCR se
detectó por un ensayo de inmunoperoxidasa. Todos los ensayos se
realizaron en paralelo con sus respectivos controles negativos.
Resultados: En 12 de los 25 cortes analizados se encontraron
secuencias genómicas del BLV.
Conclusión: Una de las vías de transmisión del BLV en bovinos es a
través del calostro y la leche. Esta es la primera evidencia de la
detección de ADN de BLV en tumores mamarios humanos en nuestro
país. Se necesitan hacer estudios más profundos y con mayor número
de casos para poder determinar su potencial zoonótico.
0254
CARACTERIZACIÓN DE UNA CEPA DE CAMPO DEL VIRUS DE LA
DIARREA VIRAL BOVINA, GENOTIPO 2, UTILIZANDO EL MODELO DE
TERNERO PRIVADO DE CALOSTRO.
DA Malacari1, A Pecora1, AC Odeón2, AV Capozzo1
1
INTA, Inst. de Virología, Argentina. 2 INTA, EEA Balcarce, Argentina.
El virus de la diarrea viral bovina (VDVB) genotipo 2 biotipo nocitopatogénico ha causado altas tasas de mortalidad en los últimos
años en rodeos bovinos de diferentes partes del mundo. La presencia
de este genotipo en nuestro país ha sido reportada en varias ocasiones.
El objetivo del presente trabajo fue caracterizar la virulencia de un
aislamiento del VDVB-2 argentino tanto in vitro como in vivo, en
comparación con una cepa de alta virulencia de referencia del mismo
genotipo y biotipo (NY-93). Se evaluó la inducción de apoptosis por
infección de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) in vitro
y se analizaron las secuencias correspondientes al extremo 5´UTR para
identificar marcadores moleculares de virulencia. Estos ensayos
clasificaron a la cepa local como de baja virulencia. Se realizaron
posteriormente infecciones experimentales en dos grupos de 4
terneros privados de calostro (TPC) con ambas cepas (instilación nasal;
5.106 DICT50) y se analizaron parámetros fisiológicos, clínicos,
inmunológicos y virológicos. Ambas cepas causaron signos entéricos,
con hemorragia para NY-93. Los terneros infectados con NY-93
sufrieron una reducción porcentual de leucocitos promedio del 78,4%,
mientras que la reducción fue de un 68,55% para los infectados con la
cepa local. Se observó una mayor temperatura rectal en los TPC
infectados con la cepa NY-93 (42,1˚C) en comparación con los
infectados con la cepa local (41,3˚C; diferencias significativas p<0,05).
La duración de la hipertermia también fue mayor para NY-93. No se
detectaron diferencias en cuanto a la viremia (medida por qRT-PCR)
pero si en la duración de la misma, que fue de entre 14 - 17 días para
NY-93 y de entre 8 - 10 días para la cepa local. Los TPC desarrollaron
anticuerpos neutralizantes y anticuerpos contra la proteína NS3
después de 3 semanas post-infección demostrando el nivel de
inmunosupresión causado por la infección con cepas no
citopatogénicas del VDVB. Las dos cepas redujeron la capacidad
proliferativa de las CMSP frente al estímulo con Concanavalina-A; el
efecto fue observado durante los primeros 10 días post infección para
la cepa local y por más de 18 días para NY-93. Los TPC infectados
desarrollaron una respuesta antiinflamatoria que se manifestó con un
incremento del ARN mensajero para el factor de transcripción FoxP3 en
CMSP, característico de la inducción de las células T reguladoras.
Hemos podido reproducir la infección en el modelo TPC y evidenciar
diferencias entre dos cepas de diferente virulencia. La evaluación
realizada permitió caracterizar in vitro e in vivo la cepa aislada del VDVB
tipo 2 biotipo no citopatogénico y clasificarla como una cepa de baja
virulencia.
0267
PERFIL DE LECHES INDIVIDUALES Y DE TANQUE DE UN TAMBO
NATURALMENTE INFECTADO CON BLV
NG Porta1 2, JP Jaworski1 2, G Gutierrez1 2, I Alvarez1 2, KG Trono1
1
Instituto de Virologia, CICVyA, INTA Castelar, Argentina. 2 CONICET,
Argentina.
La infección con el Virus de la Leucosis Bovina (BLV) está instalada en el
rodeo lechero de Argentina, con una endemicidad de más del 80% en
las zonas de intensa producción. Alrededor del 10% de los animales
infectados muere como consecuencia de lesiones neoplásicas del
sistema linfático. Los hallazgos de estudios previos sugieren que la
transmisión de sangre no sería el único modo de contagio. Nuestros
estudios muestran una prevalencia aproximada del 50% antes del
primer parto y del contacto con animales adultos infectados. Las
infecciones podrían establecerse por consumo de calostro, por
contacto con los animales nacidos infectados y/o por consumo de leche
durante los primeros 60 días de vida, cuando se alimentan de leche
fresca del tambo. El hecho de que productores que controlan la
iatrogenia y calostran a sus terneros en forma artificial con banco de
calostro de vacas no infectadas, y que continúan la crianza con leche
fresca de tanque, posean alrededor del 40% de animales jóvenes con
BLV, sugiere que la infección por consumo de leche sería un punto
significativo en la transmisión. El objetivo de este trabajo es obtener
mayores conocimientos acerca de este último punto.
Se analizaron muestras individuales de leche (n=45) y muestras de
leche de tanque (n=28) procedentes de animales naturalmente
infectados de un tambo comercial.
Los resultados muestran una amplia distribución de anticuerpos y carga
proviral en las leches individuales. Aunque existe una correlación
positiva entre anticuerpos en leche y sangre, así como entre
anticuerpos en leche y carga proviral en sangre, no se observó una
correlación entre la carga proviral en leche individual y el nivel de
anticuerpos. En la leche de tanque del ordeñe diario, las muestras
presentan un nivel de anticuerpos cercano al valor de la media
aritmética de las muestras individuales (titulo = 1:32). Si bien,
aproximadamente la mitad de las muestras individuales de leche con
un título de anticuerpos igual a 1:32 no evidencia carga proviral
detectable, el 80% de las leches de tanque posee cargas provirales
detectables.
Nuestra interpretación de los resultados obtenidos es que los terneros
de tambo se encuentran en una situación de modificación del equilibrio
122
Libro de resúmenes
natural, ya que todos consumen 2 litros por día de leche de tanque
durante 60 días, y por lo tanto la misma oferta de anticuerpos y
virus/provirus. Esto es diferente de lo que recibirían de su propia madre
en caso de la crianza natural al pie, no sólo en el ámbito nutricional sino
en el específico relacionado con el BLV. Como consecuencia probable,
los que presenten menores niveles de inmunidad calostral estarían en
situación de desventaja frente a la infección oral potencial provocada
por la leche y necesitarían mayor potencial neutralizante en la misma,
para poder detener la infección por consumo.
0287
EVALUACIÓN DE LA CERTEZA DE DIFERENTES TÉCNICAS SEROLÓGICAS
PARA LA MEDICIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA PROTEÍNAS
CAPSIDALES DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA EN SUEROS BUBALINOS
JM Sala1, MV Trotta2, R Pereyra2, M Pérez Filgueira2, SG Caspe1, AV
Capozzo2
1 INTA. Estación Experimental Mercedes Corrientes, Argentina. 2 INTA.
CICVyA. Instituto de Virología., Argentina.
El búfalo es considerado un reservorio del virus de la fiebre aftosa en
estado portador, siendo capaz de transmitir la enfermedad por
contacto directo. La producción bubalina en Argentina ha ido en
constante crecimiento en los últimos años, principalmente en zonas
marginales, como la Mesopotamia Argentina, lo que implica un alto
riego por la condición de esta zona como área de frontera con países
limítrofes endémicos desde los cuales puede ingresar la enfermedad al
país. Nuestro objetivo fue evaluar la precisión de diferentes métodos
serológicos, tradicionales y novedosos, para determinar los niveles de
anticuerpos protectores contra el virus de la fiebre aftosa en sueros de
búfalos vacunados y no vacunados con la vacuna oficial contra fiebre
aftosa. Se utilizaron 94 sueros de búfalos de los cuáles 27 tenían títulos
seroneutralizantes inferiores a 1,6 para la cepa O1 Campos y 64 tenían
títulos superiores a este valor. Este título es el establecido como punto
de corte para estimar una protección del 75%. Los sueros fueron
evaluados mediante la técnica de ELISA en fase líquida (FL-ELISA) que es
tradicionalmente utiliza para determinar protección en bovinos y cuyos
resultados correlacionan con los títulos seroneutralizantes para esta
especie. Se ensayó la misma técnica revelando con anticuerpos
monoclonales (FL-ELISA/Mabs) o con suero hiperinmune de cobayo (FLELISA/SHI). Además se desarrollaron un ELISA indirecto (IE) y un ELISA
de avidez (EA) de dilución única y se establecieron los puntos de corte
mediante un análisis ROC. Los resultados obtenidos por ELISA-FL no
correlacionaron con los de seroneturalización viral (SNV). Identificamos
numerosos sueros de alto título por SNV que eran negativos en ELISAFL. Tomando con estándar de oro el ensayo de seroneturalización viral
(SNV), calculamos sensibilidad y especificad de cada técnica. Los ELISAsFL y el IE presentaron una sensibilidad superior al 90% pero una
especificidad que no superó el 56% (valor obtenido por el IE). Por el
contrario, el ELISA de avidez fue altamente sensible (90%) aunque su
especificidad fue baja (56%). Estos resultados muestran que, a
diferencia de lo que se observa en bovinos, los sueros bubalinos no
pueden ser evaluados únicamente por FL-ELISA ya que muchos de los
animales positivos serían clasificados como negativos. Sin embargo, si
se combinan dos técnicas en paralelo, por ejemplo los dos ELISAs de
dilución única, se podría alcanzar una certeza diagnóstica del 92%,
aumentando la sensibilidad y especificidad a valores superiores al 90%.
Esto permitiría obtener los mismos resultados que con el ensayo de
seroneutralización viral pero corriendo 40 sueros en una sola placa,
obteniéndose el resultado en 6 horas de trabajo, y sin trabajar en
condiciones de bioseguridad. Este es el primer trabajo que analiza la
certeza diagnóstica de ensayos tradicionales y novedosos para el
diagnóstico indirecto de protección contra el virus de la fiebre aftosa en
búfalos.
0298
ESTUDIO COMPARADO DE MÉTODOS COMPUTACIONALES PARA LA
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA INTERACCIÓN ENTRE EL VIRUS
DE LA FIEBRE AFTOSA Y RECEPTORES CELULARES DE TIPO INTEGRINA.
R Marrero1, G König1 2
1
Laboratorio de Virus Animales, Instituto de Biotecnología, CICVyA,
INTA Castelar, Argentina. 2 Consejo Nacional de Investigaciones
Científicas y Tecnológicas (CONICET), Argentina.
El Virus de la Fiebre Aftosa (VFA) pertenece al grupo de los picornavirus
y es el agente etiológico de una enfermedad de alto impacto agroeconómico. El reconocimiento y unión entre las partículas virales y las
células hospedadoras ocurre mediante la interacción entre el
denominado motivo RGD de la proteína viral 1 y las integrinas celulares.
Dicho motivo se encuentra en el sitio A (SA) y posee una conformación
funcional específica en dicha interacción. Esta es la principal
conformación reconocida por el sistema inmune del hospedador. En el
presente trabajo hemos realizado un análisis computacional-estructural
de todas las posiciones aminoacídicas del SA (sitio antigénico
inmunodominante) de VFA y caracterizado su aporte en la interacción
con integrinas de células BHK-21 e integrinas bovinas.
Nuestro objetivo es estudiar mediante diferentes análisis
computacionales, la influencia de mutaciones aminoacídicas puntuales
en el SA de VFA en la interacción con su receptor natural y realizar una
prospección del espacio de secuencia tolerado en dicha interface de
interacción con las integrinas. En este sentido, desarrollamos modelos
de la estructura atómica de integrinas como la αVβ3 de células BHK-21,
mediante programas que basan la construcción del modelo atómico en
homólogos estructurales (Phyre2) o mediante el llamado abordaje de
“primeros principios” o ab initio (i-Tasser). La información de
secuencias de integrinas y estructuras atómicas homologas provinieron
de bases de datos públicas. Posteriormente, se modelizó la estructura
cuaternaria y ajustó la interacción de estas integrinas con un péptido
representativo del SA de VFA mediante programas de ajuste
conformacional de la cadenas peptídica y de las cadenas laterales de los
aminoácidos (flexPepDock). Los modelos atómicos de los complejos de
interacción obtenidos, fueron el dato de entrada para programas como
FoldX u otros programas basados en el paquete Rosetta (Backrub), los
cuales realizan propiamente el modelado de las mutaciones puntuales
en el SA y determinan la estabilidad energética o la energía de
interacción de los complejos.
Nuestros resultados computacionales expresados como categorías de
interacción, concuerdan con resultados publicados, provenientes de
experimentos funcionales in vitro de inhibición de la infección de VFA
en células BHK-21. En resumen, nuestros datos in silico coinciden en la
relevancia de residuos como ARG y ASP del motivo RGD así como de las
residuos R+1 y R+4 en el sitio A, y muestran (sumado a estudio
computacionales previos de interacción del sitio A con anticuerpos) que
los actuales programas computacionales de uso libre son una opción
factible para el estudio de estos fenómenos de interacción y para asistir
el diseño racional de antígenos vacunales.
0306
CONSTRUCCION DE UN HERPESVIRUS BOVINO TIPO 5 DELECIONADO
EN EL GEN RELACIONADO A LA LATENCIA (LR)
CA Silvestro, AC Bratanich
Facultad de Ciencias Veterinarias - UBA, Argentina.
Herpesvirus bovino tipo 1 y 5 (BoHV-1 y BoHV-5) son alfa-herpesvirus
que afectan la industria ganadera y se caracterizan por generar latencia
en ganglios sensoriales. El gen Relacionado a la Latencia (LR) es el único
transcripto hallado en BoHV-1 durante la latencia, y posee acción
antiapoptótica durante la infección aguda y la reactivación. Sin
embargo, se desconoce si posee igual acción en BoHV-5. Para evaluarlo
se construyó un BoHV-5 delecionado en el promotor mínimo del gen LR
para anular su expresión sin alterar la expresión del gen bICP0
codificado en su cadena opuesta. Para facilitar la detección de los virus
recombinantes se utilizo el gen reportero de la proteína verde
fluorescente (GFP). En una primera etapa, se amplificó el gen de GFP a
partir del plásmido eGFP-C1 usando cebadores específicos conteniendo
sitios de restricción para facilitar los clonados posteriores (EcoRV y
HindIII en GFP for, y sitios XbaI y SspI en GFPrev. El amplicón de 1570
pares de bases fue clonado en pGem T-Easy. A partir de construcciones
previamente realizadas con el gen LR, se extrajeron dos fragmentos
flanqueantes al promotor de LR5 para utilizar como sitios de
recombinación que fueron clonados en ambos extremos del gen
reportero. El vector recombinante se purificó, secuenció y se transfectó
123
Libro de resúmenes
en células CRFK para probar la integridad y funcionalidad de la GFP que
codifica. Posteriormente se co-transfectaron células CRFK con 5ug del
plásmido recombinante purificado linealizado y 10ug de ADN de BoHV5 cepa A663. Veinticuatro horas más tarde se transfirieron las células a
placas de 35mm y se cubrió con medio de crecimiento adicionado con
metilcelulosa 1x. Cuando se evidenciaron placas de lisis, se procedió al
aislamiento de las que presentaban expresión de GFP en la totalidad de
sus células y se infectó una nueva monocapa. Se realizaron 6 plaqueos
sucesivos similares al anterior para la purificación del clon infeccioso
recombinante. Los extremos de recombinación se secuenciaron para
corroborar la correcta integración de la GFP y la ausencia de las 500
pares de bases correspondientes al promotor de LR se confirmó por
PCR. Estudios para verificar la ausencia del transcriptos a partir del gen
de LR están en desarrollo. En los primeros ensayos en células MDBK con
el virus recombinante se observó morfología típica a una infección por
herpesvirus. Ensayos de cinética de crecimiento y tamaño de placa
están en progreso. Este virus permitirá realizar ensayos para evaluar
características del gen LR, entre ellas su rol en la apoptosis durante la
infección lítica, establecimiento de latencia y reactivación.
0326
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE RECOMBINANTES NATURALES
ENTRE HERPESVIRUS BOVINO 1 Y 5 (BOHV1 Y BOHV5)
SS Maidana1 2 3, MI Craig2, A Mauroy4, E Thiry4, SA Romera1 2 3
1
CONICET, Argentina. 2 INTA, Argentina. 3 Universidad de Moron,
Argentina. 4 Universidad de Liege, Bélgica.
La subfamilia Alfaherpesvirinae agrupa agentes virales de importancia
médica y económica tanto en el hombre como en los animales. La gran
diversidad en esta subfamilia lleva a considerar a los mecanismos de
recombinación como responsables de la diversidad favoreciendo la
adquisición de propiedades “nuevas” en una cepa viral. Uno de los
tipos de recombinación es la homóloga que se basa en un alto grado de
similitud genética. Aunque también, se reportó recombinación
interespecífica en condiciones experimentales, con un bajo nivel de
homología como BoHV1 y BoHV5. En Argentina se ha demostrado la cocirculación de algunos de los alfaherpesvirus de rumiantes como el
BoHV1/5. Si bien se han obtenido y caracterizado recombinantes in
vitro entre estas especies virales aún no se han hallado recombinantes
naturales. Nuestro grupo ha reportado la circulación en Argentina de 2
de los tres subtipos de BoHV5, los subtipo “b” y “a”, siendo este último
el más prevalente. Los 3 aislamientos de subtipo “b” al ser analizados
por filogenia basada en algunos genes, mostraron agrupamientos
diferentes, ciertas regiones del genoma se agrupan con BoHV5 y otras
con BoHV1, sugiriendo que estos virus podrían ser recombinantes
naturales. Surge entonces como objetivo caracterizar molecularmente
los virus donde se identificaron zonas genómicas foráneas en un
determinado fondo genético y hallar los sitios de recombinación. Para
la determinación del background genético se usó la estrategia de
amplificación por PCR de fragmentos de genes a lo largo de todo el
genoma y secuenciación de los mismos para localizar el o los puntos de
recombinación. Los oligonucleótidos fueron diseñados en base a las
secuencias disponibles en GenBank. Las secuencias nucleotídicas fueron
editadas y analizadas con el BioEdit version 7.0.5.3. Los alineamientos
se realizaron Clustal W. MEGA 5.0 software. Y finalmente las secuencias
nucleotídicas de los diferentes fragmentos génicos fueron
concatenados, alineados y sometidos a los programas RDP4 y Simplot.
Se hallaron dos puntos de recombinación en la región única larga
dentro del marco de lectura del gen UL27. Un punto de recombinación
abarca desde el nt 56578 al 56586 y el otro desde el nt 58848 al 58855
(basándonos en el genoma de BoHV5 NC_005261.2) observándose un
fragmento de recombinación de 2273 pb con 100% de identidad con el
genoma de BoHV1.2b. El resto del genoma fue analizado amplificando
fragmentos de 5 genes de la región UL (UL53, UL44, UL42, UL22 y UL10)
y US (US8 y US6) resultando en un 100% de identidad nt con el genoma
de BoHV5a.
Los resultados demuestran que es posible la recombinación homóloga
natural entre BoHV1y BoHV5 observándose en los 3 aislamientos de
campo de BoHV5b reportados hasta el momento el mismo evento de
recombinación.
0328
CARACTERIZACIÓN DE INFECCIÓN, TRANSMISIÓN Y SUSCEPTIBILIDAD
DEL AISLAMIENTO ARGENTINO DE BUHV1 EN BÚFALOS Y BOVINOS
SS Maidana1 2 3, F Delgado2, L Vagnoni2, A Mauroy4, E Thiry4, SA Romera1
235
1
CONICET, Argentina. 2 INTA, Argentina. 3 Universidad de Moron,
Argentina. 4 Universidad de Liege, Bélgica. 5 Universidad del Salvador,
Argentina.
En la República Argentina, la explotación ganadera ocupa un lugar
preponderante de la economía nacional. Gran porcentaje de las
pérdidas que tienen lugar en la ganadería son debidas a la incidencia de
enfermedades infecciosas ya sea de origen viral, bacteriano, o
parasitario. En las últimas décadas se inició una intensa búsqueda de
nuevas alternativas de producción de carnes no tradicionales en
sistemas naturales o silvestres (búfalos, ciervos, llamas y la tradicional
explotación de cabras). La producción de búfalo ha crecido en los
últimos años principalmente en el NEA y centro de nuestro país por lo
que resultó de interés determinar la circulación de virus de importancia
económica en rodeos bubalinos y evaluar su patogenia en estudios
controlados de infección. El objetivo de este trabajo fue estudiar el
comportamiento in vivo de uno de los aislamientos bubalinos
previamente obtenidos de un animal asintomático mediante pruebas
experimentales de infección y transmisión a bovinos vírgenes.
Dos bovinos y dos búfalos, de 6 meses, se infectaron por aerosolización
intranasal con el aislamiento de BuHV1 (20287N) argentino
previamente reportado. Además, dos bovinos centinela no recibieron
virus, pero fueron alojados con los búfalos infectados para evaluar la
transmisión horizontal. Después de la infección se registró excreción
viral y los signos clínicos. Se realizó el examen histopatológico de
diferentes tejidos y se analizó el establecimiento de latencia en los
ganglios trigémino y tonsilas amplificando con la técnica de multiplex
PCR-REA. La respuesta humoral se evaluó mediante seroneutralización
y ELISA.
Los búfalos inoculados experimentalmente se infectaron y mostraron
excreción viral intermitente entre 2 y 18 días post infección (dpi) con un
título máximo de log104.75 TCID50 / ml. Se observó una rinitis
moderada entre los días 2 y 20 dpi e hipertermia a los 2 dpi. Los
bovinos infectados experimentalmente con BuHV1 mostraron niveles
de excreción (106 DICT50/ml y 105 DICT50/ml a los días 2 y 6
respectivamente) y un período de excreción similares a los observados
en las infecciones con herpesvirus bovino. Se detectaron anticuerpos
séricos 2.2 (log10) tanto en búfalos como en bovinos infectados
experimentalmente 1.2 y 0.9 (log10) a los 21 dpi e IgA e IgG1 en los
bovinos sentinelas a los 7 días después del contacto. También en el
grupo centinela se detectó ADN viral en el ganglio trigémino y se
observaron lesiones histopatológicas en diferentes tejidos.
En conclusión, este estudio muestra que la patogenicidad de BuHV1 en
búfalos fue similar a las provocadas por otros alfaherpesvirus en su
hospedador natural. También se demostró que los bovinos son
susceptibles de infección con BuHV1 tanto por infección experimental
como por contacto con búfalos infectados.
0349
DINÁMICA DE LA EVOLUCIÓN VIRAL DE LAS CEPAS DE SEROTIPO A DEL
VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA DURANTE LA EPIDEMIA 2000-2002.
MM Götte1 2, AM Perez2, C Perez3, GA König1 2
1
Inta Castelar, Argentina. 2 Conicet, Argentina. 3 SENASA, Coordinación
de Laboratorio Animal, Argentina.
Introducción
La Fiebre Aftosa es una enfermedad viral altamente contagiosa.
Durante los años 2000-2002 se produjo en Argentina la epidemia más
grande de las últimas décadas, en la misma estuvieron involucradas dos
cepas virales del serotipo A, identificadas como A2000 y A2001,
distantes filogenéticamente.
Objetivo
Se estudió la dinámica de las cepas A2000 y A2001 con el objetivo de
determinar posibles focos de introducción de la enfermedad y las
relaciones filogenéticas y filogeográficas de los brotes secuenciados y la
dinámica de la epidemia a nivel nacional.
Metodología
124
Libro de resúmenes
Durante la epidemia 2000-2002 en Argentina, se produjeron múltiples
brotes en todo el país, los cuales se muestrearon a nivel nacional, de
manera proporcional a la cantidad de brotes ocurridos en cada mes y
región, durante la fase de crecimiento exponencial de los brotes del
virus. El genoma viral se amplificó por RT-PCR y luego se secuenció por
el método de Sanger, obteniéndose en promedio, 4 lecturas de cada
una de las posiciones en estudio. El ensamblado de los contigs se
realizó, con el programa “Codon Code Aligner”. Las secuencias
consenso se alinearon con el programa “BioEdit”. Se realizaron
filogenias con los parámetros en default para hacer un reconocimiento
inicial de la filogenia, luego se determinó el modelo molecular que
mejor ajusta a los datos por medio del JMODEL test utilizando el AIC.
Las filogenias se realizaron con “MEGA 5.05” por distintos métodos,
distancias(Neighbor Joining), máxima parsimonia, y máxima
verosimilitud. El fragmento de genoma analizado es de
aproximadamente 2,2Kb, corresponde a la región completa que
codifica para las proteínas estructurales (P1).
Resultados y Discusión
Se logró una buena cobertura muestral a lo largo de la fase de
crecimiento exponencial de los brotes de la epidemia. Incluso, en los
meses en los cuales se produjo el reemplazo de la cepa A2000 por la
A2001 se generaron más secuencias con el objetivo de determinar la
dinámica evolutiva de ambas cepas. En total se generaron 98 nuevas
secuencias y se sumaron al análisis 25 secuencias obtenidas en otro
estudio de nuestro laboratorio.
En la filogenia obtenida se observa una completa separación de ambas
cepas en clados totalmente independientes que probablemente
correspondan a distintos focos de introducción de la enfermedad. A su
vez, la cepa A2001 se puede categorizar en 3 subgrupos que muestran
una tendencia a la asociación temporoespacial, aunque no exclusiva ya
que se observa superposición de los grupos en ambas variables.
En conclusión, la separación genética entre ambas cepas, se ve
reafirmada en este trabajo, mientras que dentro del clado de la cepa
A2001 se marca una tendencia a la diferenciación en subgrupos que en
parte se superponen durante el proceso de reemplazo de los mismos
en la fase de crecimiento exponencial de la epidemia.
0363
EVOLUCIÓN GENÓMICA DE PARVOVIRUS CANINO EN URUGUAY
S Grecco, L Calleros, A Marandino, L Francia, V Casabone, Y Panzera, R
Pérez
Sección Genética Evolutiva, Departamento de Biología Animal, Instituto
de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Uruguay.
El parvovirus canino de tipo 2 (CPV) es un virus autónomo de ADN
simple hebra de polaridad negativa de 5,2 kb. Su genoma codifica
proteínas de cápside (VP1 y VP2) y no-estructurales (NS1 y NS2). Este
virus genera la parvovirosis canina, una de las enfermedades
infecciosas más comunes en canes de entre seis y doce semanas de
edad, caracterizada por cuadros graves de gastroenteritis hemorrágica
y alta tasa de mortalidad. Actualmente existen tres variantes de CPV
distribuidas mundialmente en distinta proporción y con diferentes
características genéticas, no existiendo una explicación clara de los
mecanismos que generan y mantienen la variabilidad en las distintas
poblaciones caninas. La clasificación de las variantes se basa en el
aminoácido presente en la posición 426 de la proteína VP2: Asn (2a),
Asp (2b) y Glu (2c). En Uruguay, cepas CPV-2c de origen europeo fueron
prevalentes durante 2006-2010. A mediados del 2010, la población
canina uruguaya fue invadida por una cepa CPV-2a de origen asiático.
Está cepa 2a difieren en varias posiciones del genoma de la variante 2c,
posiblemente como consecuencia de su diferente origen geográfico. El
hecho que se encuentren circulando variantes muy divergentes en la
población canina de nuestro país, permite analizar su dinámica
poblacional y la existencia de eventos de co-infección y recombinación.
En este trabajo se analizaron muestras fecales de perros con síntomas
presuntivos de parvovirosis canina obtenidas durante el 2012 a 2014 en
Uruguay. Para la clasificación se utilizó un sistema de PCR-RFLP que
distingue rápidamente las variantes 2c. Se amplificó el genoma
completo de algunas cepas de distintas regiones del país utilizando un
protocolo de long-PCR diseñado en nuestro laboratorio. La mayoría de
las muestras pertenecieron a la variante 2a, indicando que esta
variante ha desplazado casi completamente a la variante 2c en nuestro
territorio. La secuenciación del genoma confirmó que ambas variantes
presentan diferencias nucleotídicas y aminoacídicas en los genes NS y
VP. Se detectó una cepa recombinante entre una variante 2a y una 2c.
A pesar de su corta historia evolutiva debido a su reciente surgimiento,
CPV es un virus de gran variabilidad y capacidad dispersiva que lo
convierte en un interesante modelo evolutivo. Los resultados indican
que Uruguay presenta un escenario epidemiológico único caracterizado
por dos eventos de invasión y reemplazo por cepas que se originaron
en diferentes continentes.
0370
PRIMERA CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE CEPAS DE CAMPO
URUGUAYAS DEL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA
L Maya1, R Puentes2, R Colina1
1
Regional Norte- CENUR Litoral Norte, UdelaR, Uruguay. 2 Facultad de
Veterinaria, UdelaR, Uruguay.
El virus de la Diarrea viral Bovina (BVDV) es un virus económicamente
importante siendo una de las causas más importantes de desórdenes
reproductivos en bovinos a nivel mundial. Este virus además tiene gran
impacto a nivel productivo dado que causa otros tipos de afecciones
clínicas como ser desordenes gastrointestinales, distrés respiratorio,
inmunodepresión y enfermedad de las mucosas. El BVDV es un virus
envuelto de genoma de ARN simple hebra de polaridad positiva de 12.5
Kb de longitud con un único marco abierto de lectura (ORF) que
codifica para una única poliproteína que luego de la traducción es
procesada por proteasas virales y celulares para dar lugar a las
proteínas estructurales y no- estructurales del virión. En los extremos 5'
y 3' del genoma se encuentran las regiones no traducidas (UTR), 5' UTR
y 3' UTR, respectivamente.
En base al análisis filogenético de la 5’UTR y la proteasa viral Npro de
BVDV se han reconocido 2 genotipos virales: BVDV-1 que se subdivide
en 20 subtipos virales BVDV-1a-t; y BVDV-2 que se subdivide en 3
subtipos, BVDV-2a-c. Hace pocos años se empezó a detectar un nuevo
genotipo de BVDV denominado BVDV-3 del cual se han descripto 3
subtipos BVDV-3a-c.
En la región se han detectado los 3 genotipos de BVDV. En Brasil se han
descrito los subtipos BVDV-1a, 1b, 1d, BVDV-2b y BVDV-3. En Argentina
se ha reportado la circulación únicamente del BVDV-1, y de sus
subtipos 1a, 1b y 1c.
En Uruguay se sospecha que BVDV es un problema importante a nivel
reproductivo y productivo, y solo el 3% de los productores realiza la
vacunación ya que no es obligatoria en Uruguay. BVDV fue detectado
por primera vez en 1996 mediante inmunohistoquímica. El único
estudio publicado en BVDV en Uruguay es serológico con muestras del
2000-2001 y reveló 100% de BVDV en todos los rodeos del país, y una
prevalencia de 67% promedio en los rodeos.
Con el objetivo de actualizar los datos sobre la incidencia de BVDV y
cuales genotipos y subtipos de BVDV circulan en Uruguay, durante el
año 2014 387 animales no vacunados de 14 establecimientos con
animales con sintomatología clínica característica de la infección por
BVDV provenientes de diferentes puntos de Uruguay fueron escogidos
de manera aleatoria para ser testeados mediante ELISA indirecto y de
captura. De las 388 muestras analizadas, 77% (298/387) fueron
positivas a anticuerpos y 2.8% (11/387) fueron positivas al antígeno
mediante ELISA. La genotipificación de estas muestras mediante el
análisis filogenético con la 5’UTR y la región de la Npro con cepas
representativas de BVDV-1, BVDV-2 y BVDV-3 obtenidas de la base de
datos del Genbank reveló que 9 muestras son del subtipo BVDV-1a, 1
del BVDV-1i de BVDV-1; y 1 muestra del subtipo BVDV-2b de BVDV-2.
Estos resultados que dan a conocer por primera vez en nuestro país la
circulación los genotipos BVDV-1 y BVDV-2 brindan información
preliminar para dar el puntapié inicial para realizar planes de
contingencia contra este virus.
0373
SUSCEPTIBILIDAD DE CULTIVOS PRIMARIOS DE TIROIDES AL VIRUS DE
LA FIEBRE AFTOSA Y SU RELACIÓN CON LA EXPRESIÓN EN SUPERFICIE
DE LA INTEGRINA ALFA-V BETA-6
JM Schammas1, SV Di Giacomo1, DO Bucafusco1 2, JF Pega1 2, AV
Capozzo1 2, O Zábal1, M Perez Filgueira1 2
125
Libro de resúmenes
1
Instituto de Virología, CICVyA, INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina.
El virus de la fiebre aftosa (VFA) es capaz de utilizar integrinas de la
familia αv para el ingreso a las células de sus huéspedes naturales. En
particular, αvβ3 y αvβ6 parecen jugar un rol importante en la
patogenia, siendo αvβ6 la posible vía de entrada principal en bovinos.
Actualmente, la línea celular BHK-21 se utiliza de manera estándar para
el aislamiento y propagación de VFA, así como para la producción de
antígeno vacunal. Sin embargo, esta línea establecida presenta baja
permisividad, y por lo tanto baja sensibilidad, a la replicación viral
cuando el virus es aislado desde huéspedes naturales, tal como ocurre
en los brotes a campo. A su vez, la replicación del virus en BHK-21
selecciona variantes que utilizan una vía secundaria de entrada, a
través de receptores de heparán sulfato, perdiendo al mismo tiempo la
capacidad de infectar a los huéspedes naturales.
El cultivo primario de tiroides bovina ha demostrado ser uno de los de
mayor sensibilidad y con mayor espectro de susceptibilidad para los
diferentes serotipos, aunque su producción resulta costosa y, por ser
un cultivo primario, posee baja repetitividad. Más aún, la propagación
de estos cultivos y su pasaje consecutivo con el fin de establecer líneas
celulares, trae como consecuencia una rápida y marcada caída de la
susceptibilidad a la infección por VFA. En este trabajo se buscó estudiar
la posible relación entre la expresión en membrana de la integrina αvβ6
y la pérdida de susceptibilidad en los primeros pasajes a partir de un
cultivo primario de tiroides para la cepa O1/Campos de VFA. Para ello
se desarrolló una metodología de cuantificación de la integrina αvβ6,
basada en citometría de flujo para determinar sus patrones de
expresión. Con esta técnica se caracterizaron los perfiles de las subpoblaciones celulares presentes en los cultivos de tiroides bovina, así
como en distintas líneas celulares establecidas (BHK-21, LFBK,
LFBKαvβ6, CHO-K1). Esta herramienta fue también utilizada para
cuantificar la expresión de esta integrina en pasajes consecutivos de
cultivos primarios de tiroides. Los resultados permitieron demostrar
que la pérdida de sensibilidad a muy tempranos pasajes de un cultivo
de tiroides bovina se ve acompañada de la pérdida de la expresión del
receptor celular αvβ6. También en base a su expresión se pudo
identificar una población de células de potencial estirpe epitelial que
son capaces de expresar la integrina, lo cual puede constituir una
herramienta valiosa para la evaluación y, por tanto, de mejora de los
cultivos de tiroides bovina producidos. Los resultados en su conjunto
sugieren que esta integrina jugaría un rol importante en la sensibilidad
de una línea celular, aunque no exclusivo, por lo que es probable que
otras integrinas de la familia αv puedan contribuir para determinar más
acabadamente el perfil de susceptibilidad al VFA de los cultivos
celulares.
0376
EVALUACIÓN DE LA PROTECCIÓN CRUZADA DE CEPAS VACUNALES
DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA FRENTE A CEPAS HETERÓLOGAS EN
BOVINOS
SV Di Giacomo1, DO Bucafusco1 2, JM Schammas1, JF Pega1 2, DA
Malacari1, K Guevara3, S Cardillo3, A Fernández Acevedo3, C Pérez
Beascoechea4, E Maradei4, AV Capozzo1 2, M Perez Filgueira1 2
1
Instituto de Virología, CICVyA, INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina.
3
Biogénesis-Bagó S.A., Argentina. 4 DILAB, SENASA, Argentina.
La amplia diversidad antigénica del virus de la fiebre aftosa (VFA) puede
dificultar la aplicación de estrategias vacunales durante la aparición de
un brote debido a la escasa la protección cruzada entre diferentes
cepas, aún dentro de un mismo serotipo. Por esta razón, es esencial
conocer los mecanismos y variables para la generación de protección
heteróloga. Para este trabajo se formularon 3 vacunas experimentales
en adyuvante oleoso: monovalente de la cepa A24/Cruzeiro (40
ug/dosis, vacuna A), monovalente de la cepa A24/Cruzeiro (10 ug/dosis,
vacuna B), y trivalente (vacuna T) con las cepas A24/Cruzeiro (10
ug/dosis), O1/Campos (20 ug/dosis) y C3/Indaial (10 ug/dosis). Con
estas vacunas se inmunizaron grupos de bovinos (n=5) y se generaron 4
grupos experimentales A: el grupo 1 recibió una dosis de la vacuna A, el
grupo 2 una dosis de la vacuna B, el 3 una dosis de la vacuna T y el
grupo 4, dos dosis de la vacuna A (a los 0 y 15 días post-vacunación,
dpv). Dos bovinos no se vacunaron y funcionaron como grupo testigo.
Todos los grupos (y los animales testigo) fueron infectados a los 30 dpv
con la cepa heteróloga A/Arg/2001 (10e4 DICT50% por vía IDL) y se
verificó la aparición de vesículas en las patas a los 7 días post-infección
(dpi). Se tomaron muestras de suero y sangre a distintos tiempos antes
y después del desafío viral, y se midieron diferentes parámetros de la
inmunidad inducida y de la patogenia. Mientras que ambos testigos se
enfermaron, ninguno de los animales del grupo 3 y 4 mostraron signos
de la enfermedad a los 7 dpi. Los grupos con una dosis de vacuna
monovalente mostraron 1 (grupo 1) y 2 bovinos (grupo 2) con lesiones
y síntomas de la enfermedad, aunque en forma menos severa y más
retrasada que los testigos. Comparativamente, los síntomas fueron más
severos en los testigos, seguidos por los del grupo 2 y los del grupo 1.
También es interesante marcar que a pesar de poseer igual masa
antigénica total (40 ug/dosis), los animales inmunizados con la vacuna T
(grupo 3) no mostraron síntomas de la enfermedad, por lo que es
probable que la mayor variedad antigénica favorezca la protección
contra cepas heterólogas no incluidas en la vacuna. Las respuestas
cruzadas de Ac fueron más restringidas inter-serotipo que intraserotipo y las de IFN-γ heterólogas se vieron más limitadas para el
serotipo O. A su vez, la vacuna trivalente fue la de mayor promedio de
producción de IFN-γ contra la cepa heteróloga. Por último, es
interesante marcar que los porcentajes de avidez de los sueros a 30 dpv
contra la cepa heteróloga mostraron mejor correlación con la
protección al desafío que los títulos de Ac medidos a ese tiempo por
ELISA contra la cepa A/Arg/2001. En conjunto, estos resultados
indicarían que la mayor masa antigénica puede mejorar la protección
cruzada pero también la multivalencia y que es necesario considerar
otros aspectos de la inmunidad, además de los títulos totales por ELISA,
para valorar adecuadamente la protección heteróloga.
Sala D (Salón Rodin - 2º piso)
14:30 - 16:00 hs.
Antivirales
0032
ACTIVIDAD ANTIVIRAL DE LOS CARRAGENANOS FRENTE A LA
INFECCIÓN DE DENGUE SEROTIPO 3 EN CÉLULAS DE MAMÍFERO
LE Piccini, V Castilla, EB Damonte
Laboratorio de Virología, Departamento de Química Biológica, Facultad
de Ciencias Exactas y Naturales, UBA - IQUIBICEN, CONICET, Argentina.
El virus del dengue (DENV) es un arbovirus perteneciente a la familia
Flaviviridae, transmitido al hombre por los mosquitos Aedes aegypti y
Aedes albopictus. Los cuatro serotipos de DENV (DENV1-4) son
causantes de una enfermedad febril aguda, benigna y auto-limitada
(fiebre del dengue), o de formas clínicas más severas y potencialmente
letales (fiebre hemorrágica de dengue y síndrome de shock por
dengue). Actualmente urge la necesidad del desarrollo de agentes
antivirales para la quimioterapia, ya que no se dispone de vacunas ni de
drogas específicas. La entrada viral se presenta como una alternativa
atractiva para la intervención terapéutica, ya que bloquearía el
comienzo de la infección. Estudios previos han demostrado que los
polisacáridos sulfatados interfieren en la interacción receptorglicoproteína E viral. Dentro de este grupo, los carragenanos aislados
de algas marinas presentaron una potente actividad antiviral frente a
los serotipos DENV-2 y DENV-3 en células Vero y HepG2 mientras que
no inhibieron la multiplicación de DENV-1.
El objetivo del presente trabajo fue extender el estudio del mecanismo
de acción de los carragenanos lambda y iota sobre la infección de
DENV-3 en células Vero y A549. Ambos carragenanos presentaron
actividad antiviral contra DENV-3 en los dos tipos celulares, con valores
de concentración efectiva 50% de 0,5-0,7 µg/ml, determinados
mediante ensayos de inhibición del rendimiento viral. También se
observó una inhibición del orden del 90% en el número de células que
expresan la glicoproteína viral por inmunofluorescencia indirecta. La
ausencia de citotoxicidad sobre ambas células hasta la máxima
concentración probada de 1000 µg/ml, medida por el método
colorimétrico del MTT, confirió a estos polisacáridos un alto índice de
selectividad. La actividad antiviral de los carragenanos fue dependiente
126
Libro de resúmenes
del tiempo de adición del compuesto no registrándose significativa
reducción en el número de placas cuando se agregaron después de 1 h
post-infección. Por lo tanto, se decidió evaluar su efecto sobre las
etapas iniciales de adsorción e internalización viral. Se observó
inhibición de la multiplicación viral en células Vero y A549 cuando los
compuestos sólo estuvieron presentes durante el período de adsorción
viral a 4°C o durante la posterior internalización a 37°C. En conclusión,
la acción antiviral de ambos carragenanos tanto en células Vero como
en células A549 afectó las etapas tempranas del ciclo de multiplicación
viral, probablemente por interferencia en la interacción de la
glicoproteína viral con los residuos de heparan sulfato de
proteoglicanos de la superficie celular, molécula propuesta como
receptor inicial en la infección con DENV.
0145
DISEÑO Y EVALUACIÓN DE MICROARN ARTIFICIALES PARA EL
SILENCIAMIENTO DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA
AP Currá, MI Gismondi, S Asurmendi, O Taboga
Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA, Argentina.
La fiebre aftosa es una enfermedad viral altamente contagiosa que
afecta animales biungulados y que causa grandes pérdidas económicas.
El agente etiológico es el virus de la fiebre aftosa (VFA), un pequeño
virus compuesto por una cápside icosaédrica que alberga una molécula
única de ARN de cadena simple y polaridad positiva.
Las vacunas actuales contra VFA están basadas en virus inactivado
químicamente y son muy efectivas para el control y la erradicación de
la enfermedad, aunque presentan el riesgo de incorrecta inactivación o
escape desde las plantas productoras. Además, requieren al menos 7
días para conferir protección. Por lo tanto, resulta de interés desarrollar
estrategias antivirales alternativas, entre las que se ha propuesto la
tecnología de interferencia de ARN (ARNi). La ARNi es un proceso de
silenciamiento génico postranscripcional en eucariotas, inducido por
pequeñas moléculas de ARN complementarias al gen silenciado. Entre
ellas se encuentran los microARN (miR), que están codificados en el
genoma celular. El empleo de miR artificiales (amiR) diseñados para
reconocer secuencias no endógenas constituye una herramienta segura
y eficiente para el silenciamiento de ARN de interés.
En el marco del desarrollo de una estrategia antiviral contra VFA
mediada por amiR, en este trabajo se propuso la expresión constitutiva
de amiR dirigidos contra la región 3D de VFA y su evaluación frente a la
infección viral. Se determinó experimentalmente la estructura
secundaria de la región 3D mediante hSHAPE y se realizó una
predicción in silico utilizando el programa RNAxs para la selección de 7
secuencias blanco de amiR. Se construyeron vectores de expresión de
amiR complementarios a cada una de esas regiones, que se utilizaron
en experimentos de transfección transitoria y estable en células BHK-21
para evaluar su actividad de silenciamiento frente a la infección con
VFA mediante la cuantificación del tamaño y el número de las placas de
lisis. En 5 de 7 líneas celulares establemente transformadas, el
diámetro de las placas de lisis obtenidas fue significativamente menor
al observado en células control. Además, en 2 de 7 líneas celulares se
observó una reducción del número de placas de lisis.
Estos resultados sugieren que la región 3D es un blanco apropiado para
el silenciamiento de VFA mediante amiR y que su expresión constitutiva
en cultivos celulares afecta la replicación viral.
0152
EL POLOXÁMERO PLURONIC® F127: ¿UN NUEVO ALIADO PARA EL
TRATAMIENTO ANTIVIRAL CONTRA EL VIRUS HEPATITIS C?
EA Gentile1, ML Cuestas1, CM Delfino1 2, AI Castillo1, N Eguibar1, P
Perazzo1, JR Oubiña1, VL Mathet1
1
Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica
(IMPAM, UBA-CONICET), Facultad de Medicina, UBA, Argentina. 2
Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida (INBIRS,
UBA-CONICET), Facultad de Medicina, UBA, Argentina.
La OMS estima que existen aproximadamente 170 millones de personas
crónicamente infectadas con el virus hepatitis C (HCV) a nivel mundial y
que más de 350.000 mueren cada año producto de patologías
hepáticas asociadas con este virus. En la actualidad el tratamiento de la
hepatitis C crónica consiste en la administración combinada de
interferón-α pegilado, ribavirina y/o un inhibidor de proteasa.
Desafortunadamente, esta terapia no se encuentra disponible a nivel
global, es costosa, presenta generalmente una gran cantidad de efectos
adversos que dificultan la adherencia del paciente a la misma, y la
respuesta es dependiente del genotipo viral. Es por estas razones que
existe en la actualidad una intensa búsqueda de nuevas drogas antiHCV o de nuevas estrategias terapéuticas -como el targeting hepáticoque sean capaces de reducir los efectos adversos y mejorar la eficiencia
de la terapéutica actual. Los poloxámeros o Pluronics® son copolímeros
anfifílicos compuestos por bloques hidrofílicos de óxido de polietileno
(PEO) y bloques hidrofóbicos de óxido de polipropileno (PPO) que se
ordenan en una estructura lineal, PEO-PPO-PEO, siendo utilizados para
mejorar la solubilidad y estabilidad de numerosas drogas dado su
acción surfactante. De hecho, muchos de estos compuestos, como el
poloxámero F127, fueron aprobados por la FDA para su uso como
excipientes de numerosas formulaciones medicamentosas y
dispositivos biomédicos. No obstante, en los últimos años, se fueron
acumulando evidencias que demuestran que estos compuestos no
debieran ser generalmente reconocidos como seguros (en inglés, GRAS)
dado que afectan numerosas vías de transducción de señales, incluidas
las de las MAPK y aquellas en las que interviene NF-kB. El objetivo del
presente trabajo fue evaluar la actividad antiviral del F127, lo que
podría constituir una nueva estrategia para optimizar la terapéutica
contra el HCV. Para ello, se emplearon dos replicones del HCV subgenotipo 1b derivados de la línea celular Huh7.5, uno con genoma
completo (FL) y otro subgenómico (SG), que sólo expresa las proteínas
no estructurales del virus. Dichos sistemas de replicación in vitro del
HCV fueron incubados con F127 a la concentración más alta no
citotóxica (1%) determinada mediante citometría de flujo utilizando
anexina V-FITC/IP e hipodiploidía. Subsiguientemente, se determinó la
carga viral en el sobrenadante de las células a diferentes tiempos (24,
72 y 96 h) mediante RT-PCR en tiempo real. Se determinó que el F127
es capaz de inhibir la replicación del replicón FL generando una
disminución en los niveles de HCV-ARN cercana al 80% (n=3; p<0,05) a
las 24 h, que persiste al menos por 96 h. Dicha disminución también fue
observada en el sistema de replicación SG (n=3; p<0,05). Es necesario
implementar estudios exhaustivos tanto en modelos experimentales in
vitro como animales para evaluar la eventual aplicación de este
compuesto en el tratamiento de pacientes que padecen hepatitis C
crónica.
0154
LAS POLOXAMINAS O TETRONICS®: UN NUEVO UNIVERSO DE
COMPUESTOS PARA EL TRATAMIENTO ANTIVIRAL CONTRA EL VIRUS
HEPATITIS C
EA Gentile1, ML Cuestas1, AI Castillo1, CM Delfino1 2, P Perazzo1, N
Eguibar1, JR Oubiña1, VL Mathet1
1
Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica
(IMPAM, UBA-CONICET), Facultad de Medicina, UBA, Argentina. 2
Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida (INBIRS,
UBA-CONICET), Facultad de Medicina, UBA, Argentina.
La hepatitis C crónica es un serio problema de la salud pública mundial,
ya que afecta a aproximadamente 170 millones de personas y puede
evolucionar a la cirrosis y al hepatocarcinoma celular. El tratamiento
antiviral más utilizado en las 2 últimas décadas consistió en la
administración de interferón-α pegilado combinado con ribavirina. Esta
terapia tiene muy baja eficacia (40% en los casos asociados al genotipo
1b), es costosa, genotipo-dependiente y presenta numerosos efectos
adversos, lo que dificulta la adherencia del paciente. Con el objeto de
optimizar la terapéutica antiviral, actualmente se están realizando
múltiples esfuerzos para aumentar el arsenal de fármacos anti-HCV
eficaces mediante la síntesis de nuevas drogas. Las poloxaminas o
Tetronics® son co-polímeros en bloque de óxido de polietileno (PEO) y
de óxido de polipropileno (PPO) ramificados que presentan un grupo
etilén-diamino central que les confiere la capacidad de aceptar
protones a pH fisiológico. Más aún, estas moléculas exhiben una gran
diversidad estructural -en lo que respecta a tamaños y balances
hidrofílicos-lipofílicoslo
que
favorece
su
uso
como
nanotransportadores de numerosas drogas, principalmente del tipo de
las micelas poliméricas, aumentando de esta manera la solubilidad –y
127
Libro de resúmenes
por ende, la biodisponibilidad- de numerosos fármacos. El objetivo del
presente estudio fue evaluar la capacidad anti-HCV de las poloxaminas
T304, T904, T1107 y T1301 como una estrategia novedosa, viable y de
bajo costo para intentar mejorar la terapéutica de la hepatitis C crónica.
Para ello se utilizó un sistema de replicación in vitro derivado de la línea
celular Huh7.5 conteniendo el genoma completo (FL) del HCV subgenotipo 1b, internacionalmente empleado para el análisis de la
actividad de drogas anti-HCV. Se determinó la concentración más alta
no citotóxica de cada una de las poloxaminas mediante la medición de
apoptosis celular/necrosis utilizando citometría de flujo para anexina VFITC/IP e hipodiploidía. Se colocó en el medio de cultivo del replicón
cada una de las poloxaminas en la concentración correspondiente y se
evaluó a las 24 h la capacidad de las mismas de inhibir la replicación
viral mediante la medición de los niveles de HCV-ARN en los
sobrenadantes de dichos cultivos mediante RT-PCR en tiempo real. Los
ensayos se realizaron por triplicado y se consideró significativo un
p<0,05. Todas las poloxaminas a las concentraciones ensayadas (T304
1%, T904 0,01%, T1107 0,1 % y T1301 0,01%) fueron capaces de inhibir
en al menos un 50% la replicación del HCV. Este estudio aporta la
primera evidencia en la que se demuestra la actividad antiviral de esta
familia de moléculas. En conclusión, las poloxaminas podrían constituir
una nueva plataforma nanotecnológica como adyuvantes para mejorar
la eficacia de la farmacoterapia actualmente empleada en el
tratamiento de pacientes con hepatitis C crónica a costos mucho más
accesibles.
0157
NANOANTICUERPOS VHH ANTI-VP6 DISMINUYEN LA EXCRECIÓN
VIRAL Y LA SEVERIDAD DE LA INFECCIÓN POR ROTAVIRUS A
L Maffey, CG Vega, L Garaicoechea, V Parreño
Instituto de Virología, CICVyA, INTA-Castelar, Argentina.
Los Rotavirus Grupo A (RVA) causan cada año 453.000 muertes de
niños menores de 5 años, la mayoría de las cuales ocurren en países
pobres. Se evaluó la eficacia de dos clones de nanoanticuerpos VHH
anti-VP6 -2KD1 y 3B2- para la prevenir y tratar la diarrea por RVA en un
modelo de ratón lactante. Ensayo de Prevención: los ratones recibieron
una dosis diaria de VHH desde los 4 días de vida, por 7 días: Grupo G1
2KD1+3B2 (80 µg c/u), G2 2KD1+3B2 (100 µg c/u), G3 no tratado. Al día
5 fueron inoculados con RVA murino (EcW) 2 horas post tratamiento.
Se evaluó presencia de diarrea por RVA. Los ratones se sacrificaron
secuencialmente de 1-7 días post-inoculación (dpi) tomándose
muestras de intestino y suero. Los grupos pre-tratados redujeron
significativamente la carga viral en intestino (p=0,009) y heces
(p=0,006) y la duración de la diarrea (p=0,008) respecto del grupo no
tratado. Ensayo de Tratamiento: los lactantes fueron inoculados a los 4
dias de vida y recibieron el tratamiento con VHH entre 1 y 7 dpi: G4
2KD1+3B2 (80 µg c/u), G5 2KD1+3B2 (100 µg c/u), G6 3B2 (200 µg ), G7
2KD1 (200 µg ), G8 no tratado. La administración terapéutica de cada
uno de los clones de VHH o la combinación de ambos redujo
significativamente la carga viral en intestino (p= 0,02) y heces
(p=0,007), respecto del control no tratado. Sin embargo, dado que se
trataba de ratones pre- desafiados, el tratamiento no logró modificar el
curso de la diarrea. Un último grupo fue inoculado al cuarto día de vida
y tratado desde los 2 dpi (al momento de inicio de la diarrea) para
evaluar el efecto del inicio del tratamiento: G9 2KD1 (200 µg, 2dpi). El
tiempo de administracion la primer dosis no interfirio en el efecto
protector observado frente a la excrecion viral (G7 vs. G9). Con
respecto a la respuesta inmune, todos los grupos tratados
seroconviriteron frente a RVA, mostrando elevados niveles de
anticuerpos anti-RVA IgA en intestino e IgG en suero, aunque menores
que los del grupo no tratado, coincidentemente con infecciones menos
severas. Los resultados obtenidos sugieren que la terapia con VHH sería
una herramienta de prevención muy efectiva y una potencial opción
terapéutica contra la diarrea asociada a RVA.
0167
DERIVADOS DE BENZIMIDAZOL INHIBIDORES DE LA ENTRADA DEL
VIRUS DE LA DIARREA BOVINA A LA CÉLULA HUÉSPED POR
INTERACCION CON LA GLICOPROTEINA DE ENVOLTURA E2
MJ Pascual1, F Merwaiss1, E Leal2, M Bollini2, DE Alvarez1
1
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, UNSAM-CONICET,
Argentina. 2 Departamento de Química Orgánica, Facultad de Farmacia
y Bioquímica-UBA, Argentina.
El virus de la diarrea viral bovina (BVDV) es un patógeno del ganado
vacuno. La infección con BVDV reduce la productividad causando
pérdidas económicas para la industria ganadera. La partícula viral
comprende una membrana lipídica asociada a dos glicoproteínas de
envoltura E1 y E2, que rodean a la nucleocápside que contiene el
genoma de RNA del virus. E2 cumple un rol fundamental para la
entrada del virus a la célula huésped dado que interacciona con
receptores en la superficie de la célula que median la endocitosis de la
partícula viral, y es esencial en la fusión de la envoltura del virus con la
membrana del endosoma en medio ácido para liberar el genoma de
RNA en el citoplasma de la célula infectada. La reciente determinación
de su estructura cristalina reveló que E2 no es una proteína de fusión
canónica abriendo nuevas perspectivas en el estudio del mecanismo
molecular de la entrada de BVDV. El objetivo de este trabajo es usar E2
como blanco de pequeñas moléculas para inhibir la entrada de BVDV y
determinar las bases moleculares de su mecanismo de acción. Para este
fin se empleó el diseño guiado por computadoras para identificar
compuestos líderes que interaccionan con E2 in silico y se realizó luego
un screening de actividad antiviral mediante ensayos de reducción del
efecto citopático en células en cultivo. Como resultado se identificó un
derivado de benzimidazol con actividad antiviral en el rango
micromolar que además no presentaba un efecto citotóxico sobre
células MDBK. Con el fin de evaluar en qué etapa de la infección
(adsorción, entrada ó replicación) actuaba este compuesto se
realizaron ensayos de tiempo de adición. Se observó que el número de
focos de infección disminuye cuando el compuesto se agrega luego de
la adsorción sugiriendo que la inhibición ocurre durante la entrada. Por
otra parte se realizó un ensayo de selección de virus resistentes
mediante pasajes seriados de BVDV en presencia de concentraciones
crecientes del compuesto y se secuenció la región que codifica para E2
con el fin de identificar las mutaciones que confieren resistencia
antiviral y determinar el blanco molecular del compuesto. Finalmente,
se estudió la interacción directa de este compuesto con E2 usando un
ensayo de espectrometría de fluorescencia para medir la unión del
compuesto a una versión recombinante de la glicoproteína E2 en
solución. Nuestros resultados indican que el derivado de benzimidazol
inhibe la entrada de BVDV a la célula huésped a través de la unión a E2
bloqueando presumiblemente el paso de la fusión de la envoltura viral
con la membrana endosomal.
0183
EFFECT OF NATURAL PRODUCTS DERIVATIVE FROM SCHINUS
TEREBINTHIFOLIUS AND PUNICA GRANATUM ON ARBOVIRUS
REPLICATION
MDF de Meneses1, TS Salles1 4, RM Campos1, CM Malnero2, IE
Bergmann2, V Malirat2, RM Kuster3, MRS da Silva4, DF Ferreira1
1
Laboratório de Interação Vírus Célula, Departamento de Virologia,
Instituto Microbiologia Prof. Paulo de Góes. Centro de Ciência e Saúde,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Rio de Janeiro, Brasil. 2
Centro de Virologia Animal, Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. Cesar
Milstein (ICT Milstein/CONICET), Buenos Aires, Argentina. 3 Núcleo de
Pesquisas de Produtos Naturais, Centro de Ciências da Saúde, UFRJ, Rio
de Janeiro, Brasil. 4 LAMMP, Departamento de Bioquímica, Instituto de
Química, Centro Tecnológico, UFRJ, Rio de Janeiro, Brasil.
Many human diseases are caused by arboviruses, the symptoms can
range from mild febrile illness to encephalitis and death. Recently,
American continent has been facing the burden of introduction and reintroduction of arboviruses such as Dengue virus (DENV), Chikungunya
virus, Japanese encephalitis virus, and West Nile virus in urban areas.
Most of the pathogenic arbovirus species belong mainly to 3 families:
Togaviridae, Flaviviridae, and Bunyaviridae. Mayaro virus (MAYV)
belongs to the genus Alphavirus, Togaviridae family, which causes a
disease presenting symptoms similar to the classic dengue fever and
was used as Alphavirus prototype. The Brazilian popular medicine
explores the anti-inflamatory properties of substances extracted from
the plants Schinus terebinthifolius (mastic) and Punica granatum
(Pomegranate). In this work we present studies on the antiviral effect
128
Libro de resúmenes
of these substances against MAYV and DENV. The toxicity of these
substances in Vero cells was tested by the incorporation of neutral red
after 24h of treatment. The CC50 of each substance was determined:
242, 315, 102 and 5000 µg/ml in acetate (mastic), flavonoids 1 and 2
(mastic), oil of Mastic, respectively, and 590 and 442 µg/ml for Crude
Extract and Acetate of Pomegranate, respectively. Afterwards, tests for
evaluation of antiviral effect were carried out. Cells were infected for 1
h with MAYV using a multiplicity of infection of 0.1, and treated for 24h
with increasing concentrations of the substances. Viral yield, quantified
by TCID50 method, demonstrated antiviral activity. The IC50 of each
substance was determined by a dose response graph, and values
obtained were: 4,3; 4,5; 14 and 830 µg/ml in acetate mastic, flavonoids
1 and 2 (mastic), oil of Mastic, respectively, and 12 and 30 µg/ml for
Crude Extract and Acetate of Pomegranate, respectively. The selectivity
index (ratio CC50/IC50), was determined rendering values > 7 for all
substances. We also tested the substances for virucide properties,
adsorption
impairment,
by
means
of
pretreatment,
immunofluorescence and transmission electron microscopy (TEM). Our
results showed more than 95% virucidal effect for the mastic acetate
and flavonoids partitions and for the Crude Extract of pomegranate.
Mastic oil 22%, and pomegranate acetate did not present virucidal
effect. We observed similar inhibition obtained in the virucidal test in
immunofluorescence images. Damage in viral particles treated with the
substances was also observed in the TEM images obtained. The
proteomic analysis of the infection of MAYV showed differences in the
expression of secreted proteins during infection and treatment with
flavonoid 1. We conclude that some of the partitions in our substances
act directly on the virus particle. These results will be compared to the
activity of these substances on DENV, of the Flavivirus genus belonging
to Flaviviridae family.
0198
NUEVAS TIOSEMICARBAZONAS DERIVADAS DE 1-INDANONAS CON
ACTIVIDAD ANTIVIRAL FRENTE AL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL
BOVINA
M Fabiani1, EF Castro1, MC Soraires Santacruz2, LM Finkielsztein2, LV
Cavallaro1
1
Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad
de Buenos Aires, Argentina. 2 Cátedra de Química Medicinal, Facultad
de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina.
El Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV) es el prototipo del género
Pestivirus. Las infecciones por BVDV se distribuyen globalmente y
causan serios problemas en la industria ganadera. La tiosemicarbazona
(TSC) de la 5,6-dimetoxi-1-indanona (compuesto líder) fue identificado
como un potente inhibidor no nucleosídico de la ARN polimerasa de
BVDV.
Con el objetivo de encontrar derivados de mayor potencia, se
sintetizaron trece nuevas TSCs: nueve TSCs N4-sustituídas con grupos
arilo (N4-TSCs), de las cuales tres derivan de la 1-indanona y seis de la
5,6-dimetoxi-1-indanona; y cuatro TSCs con distintos sustituyentes
sobre el anillo aromático del núcleo indánico.
El propósito de este trabajo fue evaluar la actividad antiviral in vitro
frente a BVDV de estos nuevos derivados, y analizar en forma
preliminar su relación estructura-actividad (REA). Los compuestos más
activos, además, fueron evaluados frente a mutantes de BVDV
resistentes al compuesto líder (BVDV-TSCr).
La citotoxicidad de los compuestos fue medida por el método de
MTS/PMS y la actividad antiviral contra BVDV-1 (NADL) fue evaluada
por el método de reducción de UFP en células MDBK. Se determinó la
concentración citotóxica 50% (CC50) y la concentración efectiva 50%
(CE50) a partir de las respectivas curvas dosis-respuesta.
De las N4-TSCs, sólo las derivadas de la 5,6-dimetoxi-1-indanona
resultaron activas. Esto confirma la importancia de los grupos metoxilo
en las posiciones 5 y 6 para la actividad anti-BVDV. Se observó, además,
que la naturaleza de los sustituyentes en la posición 4 sobre el grupo
arilo en N4 incide sobre la actividad de los derivados: aquellos con
sustituyentes atractores de electrones resultaron más activos. Entre
ellos, el derivado con un grupo nitro (NO2) en dicha posición
(compuesto 8), resultó ser casi seis veces más activo que el compuesto
líder (CE50= 0,7±0,3 y 3,8±0,4 µM, respectivamente). Ninguna de las N4TSCs presentó citotoxicidad a la concentración de 10 µM, máxima
concentración que pudo ser evaluada debido a su solubilidad en medio
acuoso.
Entre las TSCs no sustituídas en N4, sólo la TSC de la 6-nitro-1-indanona
(compuesto 11) presentó una actividad antiviral similar a la del
compuesto líder. Los compuestos de esta serie poseen una solubilidad
en medio acuoso similar a la del compuesto líder, y los valores de CC50
obtenidos variaron desde 50 µM hasta mayores a 100 µM.
Las variantes BVDV-TSCr resultaron así mismo altamente resistentes al
compuesto 8, pero menos resistentes al compuesto 11. Se realizarán
estudios adicionales para determinar la CE50 del compuesto 11 frente a
las variantes BVDV-TSCr, así como estudios de docking molecular para
identificar las interacciones moleculares que se establecen entre los
nuevos derivados activos y la polimerasa viral y que permitan explicar
este comportamiento diferencial.
0200
ACTIVIDAD ANTIVIRAL DE COMPUESTOS DITERPENOIDES NATURALES
Y SEMI-SINTÉTICOS SOBRE LA REPLICACIÓN DE ADENOVIRUS IN
VITRO.
E Petrera1, JE Bidart1, MW Pertino2, G Schmeda-Hirschmann2, LE Alché1
1
Laboratorio de Virología. Depto. Química Biológica. IQUIBICEN. FCEyN.
UBA, Argentina. 2 Instituto de Química de Recursos Naturales.
Universidad de Talca, Chile.
Los Adenovirus (AdV) humanos se asocian tanto con infecciones
esporádicas como con brotes en la comunidad afectando tanto a niños
de corta edad como a adultos. Las manifestaciones clínicas
comprenden infecciones tales como la fiebre faringo-conjuntival,
neumonía, queratoconjuntivitis epidémica, cistitis, gastroenteritis,
meningoencefalitis, hepatitis, miocarditis y la enfermedad fatal
diseminada en pacientes inmunocomprometidos. Los serotipos AdV 1,
2, 5 y 6 son los causantes más comunes de las infecciones del tracto
superior y fiebre faringo-conjuntival en niños pequeños. Hasta el
momento no existe una terapia preventiva ni una terapia antiviral
específica contra los AdV aprobada para su uso clínico.
En nuestro laboratorio de Virología estudiamos la actividad antiviral de
compuestos de origen natural y de síntesis. Recientemente hemos
comenzado a trabajar con diterpenoides: jatrofolonas aisladas de raíces
de Jatropha isabelii y sus derivados sintéticos, y con acido carnósico
aislado de hojas de Rosmarinus officinalis L. del cual se han sintetizado
distintos derivados. Hemos encontrado que la jatrofolona natural 2A, la
jatrofolona semi-sintética 5B y el derivado 9C del acido carnósico
presentan una potente actividad antiviral contra HSV-1 en células Vero.
Considerando la urgencia por encontrar nuevas moléculas con acción
antiviral, nos propusimos estudiar la actividad antiviral de los
compuestos 2A, 5B y 9C contra AdV. Primeramente estudiamos la
citotoxicidad de los compuestos en células de carcinoma de pulmón
humano (A549) y comprobamos que la toxicidad es baja, obteniéndose
valores de CC50 de 381,7μM, >400 μM y 246,9 μM para los compuestos
2A, 5B y 9C respectivamente. Para estudiar la actividad antiviral in vitro,
las células A549 se infectaron con el serotipo AdV5 y se trataron
durante 24 hs con los compuestos en concentraciones no citotóxicas.
En todos los ensayos utilizamos el antiviral Rivabirina como control
positivo. Mediante la técnica de inhibición del rendimiento viral
utilizando una mi de 0,1 obtuvimos los siguientes valores de CE50: 50
μM, 43,5 μM y 50,2 μM para los compuestos 2A, 5B y 9C
respectivamente. Con los correspondientes IS de 7,6; >9,2 y 4,9
respectivamente. Mediante el método de punto final determinando la
acción citopática producida por el virus y utilizando una mi de 0,25,
establecimos valores de CE50 menores: 11,3 μM; 6,25 μM y 18,8 μM
para 2A, 5B y 9C respectivamente. Además, se corroboró la inhibición
de la propagación del virus por la acción de los compuestos mediante la
realización de una inmunofluorescencia indirecta contra las proteínas
E1A y hexón de AdV. Ensayos de agregado y remoción del compuesto
5B a distintos tiempos revelan que la acción antiviral estaría
ejerciéndose en una etapa tardía, luego de las 7 hs pi.
Estos resultados indican que la jatrofolona natural 2A, la jatrofolona
semi-sintética 5B y el derivado 9C del acido carnósico presentan
actividad antiviral contra AdV5 en células A549.
129
Libro de resúmenes
0236
EVALUACION DE COMPUESTOS ANTIVIRALES CONTRA HERPES VIRUS
EQUINO 3
MA Vissani1, MS Tordoya1, O Zabal1 2, E Thiry3, M Barrandeguy1 2
1
Instituto de Virología, CICVyA, INTA-Castelar, CC25, 1712 Castelar,
Buenos Aires, Argentina. 2 Escuela de Veterinaria, Universidad del
Salvador, Pilar, Buenos Aires, Argentina. 3 Veterinary Virology and
Animal Viral Diseases, Department of Infectious and Parasitic Diseases,
Faculty of Veterinary Medicine, University of Liege, B-4000 Liege,
Bélgica.
Herpes virus equino 3 (HVE-3), es el agente causal del Exantema Coital
Equino (ECE), infección venérea altamente contagiosa, caracterizada
clínicamente por la formación de pápulas, vesículas, pústulas y úlceras
en los genitales externos de yeguas y padrillos. Si bien segregar de la
reproducción a las yeguas que presentan lesiones típicas de ECE
disminuye la posibilidad de contagio, la existencia de animales
latentemente infectados, en los que el virus se reactiva y se excreta en
forma subclínica, evidencia la necesidad de contar con otras
alternativas de prevención.
El objetivo de este trabajo fue evaluar la eficacia de los compuestos
antivirales, ganciclovir, cidofovir y aciclovir para reducir y/o inhibir la
replicación de HVE-3 in vitro.
Se determinó el número y el tamaño de placas de lisis inducidas por la
infección con HVE-3 en cultivos celulares en presencia y ausencia de
concentraciones seriadas (0 a 100 µg/ml) de los compuestos antivirales
mencionados, para determinar la concentración que reduce en un 50%
la infección viral (CE50%). De acuerdo a estos resultados, se
seleccionaron tres concentraciones para cada compuesto y se
cuantificó la producción viral en presencia de los compuestos a
distintos tiempos post infección mediante PCR en tiempo real. Como
control, se cuantificó la producción de virus en ausencia de los
compuestos.
La CE50% de ganciclovir para reducir el número y el tamaño de placas
de lisis fue de 0,04 y 0,15 µg/ml, respectivamente. Se observó que con
una concentración de 0,05 µg/ml se obtuvo un 55% de inhibición de la
producción de HVE-3 a las 48 h y 96% a las 72 h. El 100% de inhibición a
las 72 h se obtuvo con el uso de 0,5 µg/ml.
Cidofovir redujo el número y el tamaño de placas con una CE50% de
5,19 y 1,85 µg/ml, respectivamente, y con la utilización de 2 µg/ml se
logró un 98% de inhibición de la producción de HVE-3 a las 48 h y 100%
a las 72 h.
Por último, aciclovir redujo el número y tamaño de placas con una
CE50% de 12,91 y 6,29 µg/ml respectivamente. Se observó que con la
utilización de 5 µg/ml se obtuvo un 65% de inhibición de la producción
de HVE-3 a las 48 h y 95% a las 72 h. El 100% de inhibición a las 72 h se
logró con una concentración de 20 µg/ml. Los tres compuestos
inhibieron la replicación de HVE-3 in vitro. Ganciclovir resultó ser el
compuesto más potente seguido por cidofovir, y aclicovir. Se están
llevando a cabo ensayos in vitro para evaluar estos compuestos frente a
distintas cepas de campo. Posteriormente, se seleccionará el
compuesto más adecuado para su aplicación a campo, el que será
evaluado en yeguas infectadas experimentalmente.
0253
ESPECIE VEGETAL AUTÓCTONA DEMUESTRA ACTIVIDAD ANTIVIRAL IN
VITRO.
ML Mugas1, BS Konigheim2, L Rojas3, JJ Aguilar2, MJ Joseau3, MS
Contigiani2, SC Núñez Montoya1
1
IMBIV, CONICET. Farmacognosia, Dpto. Farmacia, Fac. Cs. Químicas,
UNC., Argentina. 2 Instituto de Virología “Dr. J M Vanella”, Fac. Cs.
Médicas, UNC., Argentina. 3 Fac. Cs. Agropecuarias, UNC., Argentina.
A fin de ofrecer alternativas terapéuticas a virosis emergentes y reemergentes, muchas de las cuales no poseen un tratamiento
farmacológico o disponen de una terapéutica que no es ideal en
términos de eficacia y seguridad, nuestro grupo viene desarrollando
una línea de investigación, abocada a la búsqueda de potenciales
compuestos antivirales a partir de especies vegetales nativas de
Argentina. Así, comenzamos el estudio de Galium latoramosum Clos.
(Rubiaceae), planta usada popularmente como tintórea, abortiva y
anticonceptiva. En esta oportunidad, evaluamos el efecto antiviral in
vitro de extractos de diferente polaridad, sobre los virus Herpes
Simplex Tipo 1 (HSV-1), West Nile (WNV) y Encefalitis de Saint Louis
(SLEV). A su vez, determinamos la composición química de los extractos
estudiados.
Mediante un aparato Soxhlet, las raíces desecadas y molidas se
extrajeron con benceno (Ben), seguido por acetato de etilo (AcOEt),
etanol (EtOH) y agua (Ac). Los ensayos biológicos in vitro (citotoxicidad
y actividad antiviral) se llevaron a cabo sobre células Vero, empleando
la metodología de captación de Rojo Neutro. A partir de las curvas de
viabilidad celular vs. concentración de cada extracto, se determinó la
concentración que afecta al 20 % y al 50% de las células (Concentración
subtóxica y Concentración citotóxica 50, respectivamente), y la máxima
concentración no citotóxica (MCNC). Para evaluar la actividad antiviral,
se eligieron 7 concentraciones ≤ a la MCNC. Los resultados se graficaron
como porcentaje de inhibición de virus (%I) vs. concentración,
estimándose la que inhibe el 50% del efecto provocado por la
replicación viral en las células huésped (Concentración efectiva 50). La
caracterización química de los extractos se realizó por Cromatografía
Líquida de Alta Presión, asociado a espectrometría de masa (HPLC-MS),
utilizando testigos para lograr la identificación de los compuestos.
Los resultados obtenidos demostraron que ninguno de los extractos fue
activo sobre WNV y SLEV, en tanto que el HSV-I fue inhibido entre un
99,63 y 78,88 % por los extractos AcOEt y EtOH respectivamente, a su
MCNC. A través del análisis por HPLC-MS determinamos que ambos
extractos contienen mayoritariamente Lucidina-primeverosido; una
antraquinona glicosilada que podría ser la responsable de la actividad
observada en los extractos, ya que las antraquinonas constituyen una
familia de compuestos naturales con diversas bioactividades in vitro,
incluyendo efecto antiviral. Es por ello que, en función de estos
resultados, se prevé obtener el compuesto puro a fin de determinar si
es el responsable del efecto exhibido por estos extractos.
0256
ACTIVIDAD ANTIVIRAL DE ALCALOIDES FRENTE AL VIRUS DENGUE
TIPO 2
VM Quintana1, JE Brunetti1, MA Ponce1, EB Damonte1 2, V Castilla1
1
Laboratorio de Virología, Departamento de Química Biológica,
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires,
Argentina. 2 IQUIBICEN, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales,
Universidad de Buenos Aires, Argentina.
El desarrollo de agentes antivirales para hacer frente a la infección por
virus dengue (DENV) resulta prioritario dado que hasta el momento no
se dispone de vacunas ni antivirales específicos para este virus. En
trabajos previos hemos reportado la actividad antiviral de alcaloides
como las beta-carbolinas, naturales y sintéticas, frente a DENV.
Asimismo, se ha descripto que el alcaloide anisomicina presenta
actividad antimicrobiana y modula vías de señalización celular
implicadas en la replicación de DENV. El objetivo de este trabajo fue
analizar el modo de acción antiviral de la beta-carbolina 9Nmetilharmina, obtenida por síntesis química, y de la anisomicina frente
a DENV-2 en cultivos de células Vero.
La actividad citotóxica de los compuestos se evaluó por el método de
MTS y la actividad antiviral mediante ensayos de inhibición de
rendimiento viral. A partir de estos ensayos, se calculó el índice de
selectividad para cada compuesto obteniéndose valores de 56,2 y 171,8
para 9N-metilharmina y anisomicina, respectivamente. A las máximas
concentraciones ensayadas, 9N-metilharmina y anisomicina provocaron
una inhibición del rendimiento viral, medido a las 48 h post-infección
(p.i.), del 90% y 99,9%, respectivamente. Además, se demostró la
capacidad inhibitoria de los compuestos sobre la cantidad de células
que expresaban proteína viral a las 48 h p.i. mediante ensayos de
inmunofluorescencia. Para ambos compuestos, el tratamiento de las
células en forma previa a la infección no afectó la multiplicación viral.
En el caso de la 9N-metilharmina su actividad antiviral resultó
independiente de la multiplicidad de infección utilizada y la presencia
de este compuesto durante el periodo de adsorción-internalización
viral no provocó alteraciones en la producción de virus. Asimismo, se
comprobó que la síntesis de RNA viral, analizada por Q-PCR a las 6 y 24
h p.i., no se vio afectada por el tratamiento con 9N-metilharmina. Se
realizó también un ensayo de adición de compuesto a distintos tiempos
y a las 24 h p.i. se observó que el título de virus asociado a células no
130
Libro de resúmenes
presentaba diferencias con el control sin tratar, mientras que sí se
detectó una reducción significativa (90%) del título de virus liberado al
medio extracelular aun en aquellos cultivos en los cuales el compuesto
se agregó en forma tardía (8 h p.i.). Por el contrario, en el caso de la
anisomicina, el agregado del compuesto hasta las 8 h p.i provocó una
reducción significativa tanto del título de virus asociado a células como
del virus extracelular.
En conclusión, 9N-metilharmina inhibe la liberación de las partículas
virales infecciosas al medio extracelular, afectando la propagación de la
infección. Por su parte, la anisomicina resultó ser un inhibidor más
potente y selectivo frente a DENV-2 que el compuesto 9N-metilharmina
y a diferencia de este último, la anisomicina bloquearía alguna etapa
tardía del ciclo de multiplicación evitando la formación de las partículas
virales infecciosas.
0277
CARACTERIZACIÓN DE NANOANTICUERPOS CONTRA LA PROTEÍNA HA
DEL VIRUS DE INFLUENZA A H1N1
J Baztarrica1, E Barbieri1, L Garaicoechea1, M Puntel1, E Baumeister2, A
Wigdorovitz1, V Parreño1
1
Instituto de Virología, INTA Castelar, Argentina. 2 Instituto Nacional de
Enfermedades Infecciosas ANLIS, Malbran, Argentina.
Influenza tipo A es un virus de la familia Orthomyxoviridae de genoma a
ARN, de 8 segmentos. Debido al rápido cambio genético y reasociación
del genoma viral segmentado, las cepas virales evolucionan
continuamente y se hace necesaria la actualización de la formulación
de las vacunas para la producción. En la Argentina, la pandemia H1N1
del año 2009 generó 1.390.566 personas infectadas y 617 muertes
reportadas. A pesar de la disponibilidad de vacunas y drogas antivirales, los efectos profilácticos y terapéuticos permanecen
incompletos. Esto se debe, en parte, al tiempo transcurrido entre que
se detecta una cepa emergente y se produce una vacuna eficaz frente a
dicha cepa. Esto impide contar con las herramientas para una
protección inmediata para su aplicación en pacientes de alto riesgo, es
por esto que en este trabajo estamos presentando la posibilidad de
utilizar nano-anticuerpos contra una región conservada de la
hemaglutinina del Virus.
Los nano-anticuerpos (VHHs) son moléculas de un solo dominio,
derivadas de anticuerpos de tamaño (15kD) presente en la naturaleza
capaz de reconocer a un antígeno y son de muy alta afinidad,
especificidad, estabilidad, y solubilidad. Debido a la carencia de la
porción Fc típicamente encontrada en las inmunoglobulinas, estos
anticuerpos no desencadenan respuestas celulares tóxicas o mediadas
por complemento. Además, su pequeño tamaño y similitud con las
inmunoglobulinas humanas los hace poco reactivos y aptos para su
administración en la mucosa del tracto respiratorio.
En el laboratorio de INCUINTA se han generado VHHs a partir de la
inmunización de una llama con una vacuna trivalente conteniendo
cepas de influenza tipo A H1N1, H3N2, y una cepa de tipo B. Por
biopaneo, se seleccionaron 37 clones de VHHs, de los cuales 22
reconocen por ELISA de fagos a la proteína recombinante HA0 de la
cepa viral H1N1 A/Puerto Rico 1934 y 15 reconocen al virus
correspondiente
a
un
aislamiento
argentino
(H1N1
A/Argentina/017/2009). La caracterización por secuenciación de los
clones determinó que tres de los VHH (A5A.1, D81.1, D91.2) poseerían
un doble puente disulfuro en el domino CDR3, lo cual redundaría en
una mayor estabilidad de los mismos. Asimismo, se observó que 5 de
los 37 anticuerpos poseen actividad neutralizante in vitro frente a la
cepa A/Argentina/017/2009. Por otro lado, el clon G41.2 inhibe la
hemoaglutinación por esta misma cepa.
Los resultados mencionados indican que cinco clones son candidatos
para su utilización tanto en la profilaxis y tratamiento de la infección,
para lo cual se realizará la evaluación in vivo en un modelo murino,
como también para el desarrollo de un kit diagnóstico.
0295
GENERACIÓN DE UNA BIBLIOTECA DE NANOANTICUERPOS PARA LA
OBTENCIÓN DE MOLÉCULAS NEUTRALIZANTES DEL VIRUS DE
INFLUENZA Y LA DETECCIÓN DE VIRUS DEL DENGUE.
Y, Paredes Rojas1, C, Caldevilla1, D, Riva2, N, Mattion1, C, García2, I,
Ibañez1
1
Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Miltein. CONICET,
Argentina. 2 Laboratorio de Estrategias Antivirales, Departamento de
Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales,
Universidad de Buenos Aires. IQUIBICEN-CONICET, Argentina.
En 1993 una observación sorprendente informó de la existencia de
anticuerpos no convencionales en miembros de la familia Camelidae.
Estos anticuerpos carecían de la cadena liviana y de un dominio
constante de la cadena pesada. Cuando se expresó el único dominio
variable, que recibió el nombre de Nanoanticuerpo (NanoAc), se
observó que el mismo conservaba una fuerte especificidad y afinidad
hacia el antígeno; era soluble en medio acuoso y resistente a varios pHs
y temperaturas; podía reconocer epítopes poco accesibles; se
expresaba fácilmente en microorganismos y podía ser modificado
mediante técnicas de ingeniería genética para mejorar sus propiedades.
Hasta el momento se ha reportado el uso exitoso de NanoAcs para
inhibir y detectar varios tipos de virus como VIH, HBV, Influenza, RSV,
Rabia, FMDV, Poliovirus, Rotavirus, vaccinia, entre otros. En este
trabajo reportamos los resultados de la construcción de una biblioteca
de NanoAcs contra la región del tallo de la proteína HA del virus de
influenza y de la proteína E del virus del Dengue (DENV).
Dos llamas fueron inmunizadas con cinco inmunizaciones de 50 g de
proteína HA recombinante de influenza, de los subtipos H5N1 y H3N8, y
100 g de virus del Dengue purificado e inactivado de los serotipos
DENV-1 (cepa HW); DENV-2 (cepa NGC), DENV-3 (cepa
Philippines/H87/1956) y DENV-4 (aislamiento 8124). La respuesta de
anticuerpos de los isotipos IgG1, IgG2 e IgG3 se determinó luego de
cada inmunización utilizando anticuerpos específicos mediante la
técnica de ELISA. Una vez alcanzada una buena respuesta inmune, los
animales fueron sangrados y se extrajo ARN de los linfocitos aislados.
Se preparó ADNc y se realizaron dos PCR para clonar los genes de
inmunoglobulinas, la última con oligonucleótidos que permitieron ligar
los fragmentos obtenidos en el vector fagémido pHEN4. Bacterias TG1
fueron transformadas con la ligación y se obtuvo una biblioteca
representativa del repertorio de genes de cada llama.
Los resultados de los ELISAs indicaron que ambas llamas fueron
efectivamente inmunizadas. La respuesta inmune fue elevada contra
los cuatro serotipos de DENV. La respuesta contra HA de influenza fue
menor, por lo que fueron necesarias nuevas inmunizaciones. Las PCRs
realizadas para clonar el repertorio de genes permitieron obtener
inicialmente bandas correspondientes a las regiones variables de los
anticuerpos convencionales y no convencionales. La segunda PCR
permitió aislar únicamente los fragmentos provenientes de los
anticuerpos no convencionales, que son los que dan lugar a los
NanoAcs. Posteriormente, se prepararon bacterias TG1 competentes de
alta eficiencia que permitieron generar una biblioteca de genes de
inmunoglobulinas. Bacterias conteniendo los vectores fagémidos serán
infectadas con un fago helper para producir fagos que expresen los
NanoAcs. Mediante un procedimiento de biopanning se espera
seleccionar NanoAcs que tengan propiedades de unión específica
contra las proteínas inoculadas.
0347
BIOACTIVIDAD DE EXTRACTOS ETANOLICOS DE TAGETES MINUTA L.
(ASTERACEAE) SOBRE ARBOVIRUS DE IMPORTANCIA MEDICOVETERINARIO.
F Martinez1, Y Massuh2, J Aguilar1, L Cussa1, M Ojeda2, M Contigiani1, B
Konigheim1
1
Instituto de Virología Dr. J. M. Vanella- Facultad de Ciencias Médicas –
UNC., Argentina. 2 Cátedra de Genética, Facultad de Ciencias
Agropecuaria –UNC, Argentina.
Tagetes minuta L. (Asteraceae) popularmente conocida como "Suico",
es una hierba aromática anual con distribución cosmopolita, abundante
en Córdoba. Su aceite esencial (AE) es utilizado en medicina popular
principalmente como antimicrobiano. Preliminarmente determinamos
131
Libro de resúmenes
que extractos de esta especie tuvieron actividad virucida sobre los
arbovirus West Nile (WNV) y Encefalitis Equina Venezolana (VEEV). Por
ello, nos propusimos evaluar la capacidad antiviral para determinar si
dichos extractos actúan luego de la etapa de penetración.
Se utilizaron extractos etanólicos obtenidos a partir de material vegetal
seco de partes aéreas de T. minuta, obtenido de tres poblaciones
diferentes seleccionadas y domesticadas (PI, P2 y P3). La concentración
subtóxica (CC20) de cada extracto se obtuvo por análisis de regresión
logística (R2>0.9) a partir de las curvas de viabilidad celular vs.
concentración, utilizando el método de captación de Rojo Neutro. La
actividad antiviral se evaluó mediante el método de reducción de
unidades formadoras de placa (UFP). Monocapas de células Vero
fueron infectadas con 100 UFP de cada virus y luego de 1hora de
incubación a 37ºC, se colocaron por triplicado concentraciones
decrecientes de cada extracto a partir de la CC20, incubándose
nuevamente durante 3-5 días a 37°C y 5% CO2. Se incluyeron controles
de células, virus y extractos (n=4). Los valores de CC20 obtenidos
fueron de 83, 64 y 34µg/ml para P1, P2 y P3 respectivamente. En
cuanto a la evaluación de la actividad antiviral, se determino que
ninguno de los extractos fue capaz de inhibir a los virus WN y EEV. Bajo
estas circunstancias y por los resultados obtenidos previamente donde
P1 tuvo actividad virucida sobre ambos virus (82%I, WNV y 50%I VEEV),
P2 solo sobre VEEV (50%I) y P3 no fue activo para ninguno de los virus
evaluados, podemos inferir que la inhibición de la infección viral se da
en las etapas tempranas del ciclo de replicación, cuando el virus aun no
ha ingresado a la célula huésped.
Por otro lado, anteriormente demostramos que los AE
correspondientes a P1 y P2 fueron ricos en E-Ocimenona (72-60 %) y
Ocimeno, este último en mayor proporción en P2 (15%). Por su parte, el
AE correspondiente a P3 fue el único que presento Dihidrotagetona y
en proporción equivalente a la E-Ocimenona (30-32%). Por lo tanto, los
resultados obtenidos sugieren que, T. minuta tendría compuestos con
baja citotoxicidad y potenciales propiedades virucidas, y considerando
la composición química del AE, la presencia de E-Ocimenona en
porcentajes mayores al 50% sería importante para la actividad virucida.
Lo cual justifica futuros estudios biológicos para evaluar en detalle las
etapas tempranas de replicación como así también, valorar la
bioactividad de E-Ocimenona compuesto mayoritario presente en P1,
ya que este extracto resulto ser el más activo y menos citotóxico.
0348
EVALUACIÓN DE PLANTAS MEXICANAS CON ACTIVIDAD SOBRE EL
VIRUS DE INFLUENZA
F Domínguez1, L Márquez1, D Moreno2, F Ferrreres2, G Santos1
1
Centro de Investigación Biomédica de Oriente, IMSS, México. 2 CEBASCSIC, Department of Food Science and Technology, España.
Las infecciones virales juegan un papel importante en las enfermedades
humanas, y los brotes recientes en el advenimiento de la globalización
y la facilidad de los viajes han subrayado su prevención como un tema
crítico en la protección de la salud pública. A pesar de los progresos
realizados en materia de inmunización y desarrollo de medicamentos,
muchos virus carecen de vacunas preventivas y terapias antivirales
eficaces, que a menudo son acosados por la generación de mutantes.
La aparición de variantes resistentes a los fármacos de virus de
influenza ha conducido a una necesidad de identificar agentes
antivirales nuevos y eficaces. Por lo tanto, la identificación de nuevas
moléculas antivirales es de importancia crítica. Las plantas medicinales
y sus productos naturales purificados proporcionan una fuente para el
desarrollo de fármacos antivirales. El objetivo de este estudio fue
identificar y evaluar la actividad inhibitoria sobre el virus de influenza
de diversos extractos crudos y fraccionados de plantas que contaban
con antecedentes etnobotánicos,. Se evaluaron extractos de diferentes
especies de los géneros Croton, Pinus, Geraniu, Justicia y Lippia sobre la
inhibición de la enzima neuraminidasa del virus de la influenza AH1N1
porcino (A/Swine/Mexico/UNAM/2009). En la fase inicial, los ensayos in
vitro de inhibición se realizaron en conjunto con la detección de
citotoxicidad vía MTT, en células MDCK. De todos los extractos crudos,
dos de ellos mostraron actividad antiviral, Croton spp y Pinnus spp
inhibiendo la actividad enzimática de la neuraminidasa viral. Se llevó a
cabo el fraccionamiento químico de los extractos crudos y se repitieron
las pruebas, obteniéndose cuatro fracciones activas en total. Vía
HPLC/MS se determinaron los compuestos activos. Tres flavonoides
fueron aislados de Croton y Pinus, mostrando actividades de inhibición
de la neuraminidasa con valores de IC50 que oscilaron entre 0.9 y 55
μM. La actividad in vitro contra el virus influenza de flavonoides 1 al 3
fueron evaluadas usando cepas del virus AH1N1 porcino
(A/Swine/Mexico/UNAM/2009). De los compuestos, el flavonoide
rutina exhibió la más potente actividad inhibitoria, con valores de IC50
de 0.9 μM sobre neuraminidasa, CC50 280 µM, índice selectivo (SI) =
5,8. En contraste, vitexina y kaempferitrina exhibieron valores de IC50
de 32 μM y 55 μM.
0362
ESTUDIO DEL MECANISMO DE ACCIÓN DE LA EUPARINA FRENTE A
POLIOVIRUS. ANÁLISIS DE VARIANTES RESISTENTES Y DEPENDIENTES.
MF Visintini Jaime1, S López1, V Martino2, RH Campos1, LV Muschietti2,
LV Cavallaro1
1
Cátedra de Virología. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad
de Buenos Aires, Argentina. 2 Cátedra de Farmacognosia. Facultad de
Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires, Argentina.
La euparina es un benzofurano natural con actividad antiviral selectiva
frente a los tres tipos de poliovirus humano (PV). El estudio preliminar
del mecanismo de acción, demostró que la euparina ejercía su acción
en la primera hora del ciclo de replicación de PV-2.
El objetivo de este trabajo fue profundizar el estudio del mecanismo de
acción y determinar la etapa el blanco molecular en PV-2. Se evaluó el
efecto de la euparina en la adsorción mediante el ensayo de centros
infecciosos y en la penetración con el agregado de euparina a distintos
tiempos infectando con un stock PV-2 fotosensible. Además, se
seleccionaron 25 clones capaces de crecer en presencia de euparina.
Una vez caracterizados fenotípicamente se seleccionaron 3 clones
resistentes y 1 clon dependiente para su caracterización biológica y
molecular que se amplificaron en presencia de euparina luego de 3
pasos de clonado biológico; obteniéndose las poblaciones PV-2-D13, R17, -D19,-R21. Se realizó la secuenciación de la región de las proteínas
de la cápside (VP1-VP4).
Los resultados obtenidos descartaron la acción de la euparina en la
adsorción y confirmaron su acción en los primeros 20 min post
adsorción, en tiempos compatibles con la penetración y/o
desnudamiento. La caracterización fenotípica de susceptibilidad frente
a euparina demostró que de los 25 clones seleccionados, 8 de ellos
eran sensibles, 14 resistentes y 3 dependientes.
La secuenciación genómica detectó a nivel molecular la presencia de
una o dos mutaciones puntuales en la región secuenciada, que
significaron cambios de aminoácidos en las proteínas VP1 y VP2, para
las variantes resistentes; mientras que para las variantes dependientes
los cambios se localizaron en VP3 y VP1.
Con el objetivo de caracterizar la dependencia, se evaluó la capacidad
de replicación de la variante PV-2-D19 en función de la concentración
de euparina. Se observó que a una concentración de 5 µM se alcanzó el
máximo número de placas virales. Además, se evaluó si la euparina era
capaz de proteger a PV de la acción de altas temperaturas sobre la
población wt y PV-2-D19. Se demostró un efecto protector de la
euparina sobre el wt a 48°C y para la variante PV-2-D19, se observó una
protección solamente a 37 °C. A 48°C, se confirmó una extrema
labilidad a la acción del calor para la dicha variante.
En conclusión, los resultados obtenidos, permitieron concluir que la
euparina se comporta en forma similar a los denominados inhibidores
de cápside. Estos compuestos se unen al bolsillo hidrofóbico localizado
debajo del “canyon”, en la superficie de la cápside viral, desplazando
lípido natural denominado “pocket factor”. La unión de la euparina le
otorga rigidez a la cápside viral y en consecuencia no se producirían los
cambios conformacionales necesarios en la cápside requeridos para la
penetración y liberación del genoma viral en el citoplasma celular.
0381
B. ADOLESCENTIS, PROBIOTICO CON ACTIVIDAD ANTIVIRAL CONTRA
EL ROTAVIRUS
MF Gutierrez, JC Ulloa, K Fernandez, S Salas, J López, F Vélez, N Olaya
Grupo de Enfermedades Infecciosas - Virología, Pontificia Universidad
Javeriana. Bogotá, Colombia.
132
Libro de resúmenes
El Rotavirus es la mayor causa de gastroenteritis en niños menores de
cinco años a nivel mundial y aunque existen medidas preventivas como
la vacunación y tratamientos como la rehidratación, el mundo se
encuentra en constante búsqueda de medidas alternativas como el uso
de probióticos para el control de éste patógeno. Por este motivo, en
este trabajo se buscó determinar la capacidad que tienen 4 bacterias
probióticas
(Lactobacillus
casei,
Lactobacillus
fermentum,
Bifidobacterium adolescentis y Bifidobacterium bifidum) para disminuir
la infección in vitro por Rotavirus.
Para desarrollar el proyecto, el efecto antiviral de estos probióticos se
evaluó con tres estrategias: 1) la bacteria completa y viable, 2) los
metabolitos primarios extraídos del cultivo bacteriano en medio MRS,
3) Extractos proteicos obtenidos de las bacterias por medio de
sonicación en presencia de lizosima y de Lauryl Sarcosil. La actividad
contra rotavirus se visualizó por medio de la disminución in vitro de la
infección, y sobre la producción de calcio intracelular por parte la
proteína no estructural NSP4. Las técnicas de cuantificación de la
disminución de la infección por el virus en las células MA104, fueron
citometría de flujo e inmunocitoquímica.
Como resultados relevantes se tuvo que de las 4 bacterias estudiadas
solamente B. adolescentis logró un efecto antiviral contra rotavirus por
los 3 mecanismos evaluados, el cual estuvo relacionado con interferir
directamente con el virus antes de ingresar a la célula, también se
observó que los extractos proteicos de estas bacterias interactúan con
los receptores HSC70 e integrina β3 de las células suceptibles a la
infección por Rotavirus, inhibiendo la adherencia viral, y a nivel
intracelular, sus metabolitos fueron capaces de generar una
disminución de la cantidad de proteína NSP4 y la cantidad de calcio
intracelular, producidos a partir de la infección por rotavirus.
Con los resultados obtenidos se concluyó que el Bifidobacterium
adolescentis disminuye la infección por Rotavirus afectando la entrada
del virus a la célula blanco a través de la adhesión de extractos
proteicos bacterianos y/o metabolitos primarios a moléculas receptoras
del virus como la HSC70 e integrina β3 e igualmente produce una
disminución de la enterotoxina NSP4 regulando la producción del calcio
intracelular.
Patogenia y oncogénesis
0025
CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DE VARIANTES DE LA PROTEÍNA X DEL
VIRUS DE LA HEPATITIS B DE DISTINTOS SUBGENOTIPOS EN
HEPATOCITOS HUMANOS
M Elizalde1, RH Campos1, L Barbini1 2
1
Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad
de Buenos Aires, Argentina. 2 Cátedra Microbiología Clínica, Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Mar del Plata,
Argentina.
Introducción: La proteína X del virus de la hepatitis B (HBV-X) está
asociada a la patogénesis durante la infección crónica. Las mutaciones
BCP afectan a HBV-X en los aminoácidos (aa) 130-131 y se desconoce el
rol de las mismas en relación a su actividad biológica. Existe la
necesidad de caracterizar a los subgenotipos (sgts) más prevalentes en
nuestra región.
Objetivos: Estudiar el efecto de la presencia de distintas duplas
aminoacídicas en 130-131 de HBV-X sobre su capacidad de inducir la
apoptosis y/o la autofagia en hepatocitos humanos.
Metodología: Se utilizaron tres líneas celulares de hepatoma (HepG2,
Hep3B y Huh-7) con expresión transiente de HBV-X, sgts F1b y F4, wild
type (wt, KV) y mutada (mut, MI). La viabilidad celular se cuantificó por
tinción con Azul Tripán. La apoptosis se detectó por laddering de DNA y
tinción con naranja de acridina-bromuro de etidio (NA-BE). Se estudió
la expresión de proteínas anti (Bcl-2, Bcl-X) y pro-apoptóticas (Bax) por
Western Blot. La autofagia se analizó mediante la detección de vacuolas
autofágicas y conversión de LC3 por Western Blot.
Resultados: La expresión de ambas formas de HBV-X (sgts F1b y F4)
aumentó significativamente la mortalidad en las tres líneas celulares
estudiadas. Se detectó laddering de DNA en las células transfectadas
con las variantes de HBV-X (wt y mut) de ambos sgts. La tinción con NABE reveló una disminución en el porcentaje de células viables y un
aumento en la cantidad de células apoptóticas (apoptosis temprana y
tardía) para las 3 líneas celulares, que expresaban HBV-X wt y mut, de
ambos sgts. Al estudiar las proteínas regulatorias de la familia de Bcl-2,
se observó una disminución en los niveles de expresión de Bax y un
aumento de Bcl-X en las células transfectadas con las HBV-X wt y mut,
de ambos sgts. La proteína anti-apoptótica Bcl-2 disminuyó su
expresión en las células Hep3B y Huh-7 transfectadas con las HBV-X wt
y mut, de ambos sgts. Sin embargo, en las HepG2 su expresión
aumentó en las células que expresaban las dos formas de HBV-X del sgt
F1b y disminuyó para las HBV-X del sgt F4. Además, al estudiar la
autofagia, se observó que la expresión de ambas formas de HBV-X
indujo tanto la formación de vacuolas autofágicas como la disminución
de los niveles de LC3-I, por formación de LC3-II de menor peso
molecular.
Conclusiones: Las distintas variantes de HBV-X estudiadas inducen la
apoptosis de hepatocitos humanos y modulan de manera diferencial la
expresión de las proteínas de la familia de Bcl-2. Estas HBV-X también
tienen la capacidad de desencadenar la autofagia de los hepatocitos.
Estos resultados describen algunos de los mecanismos moleculares
mediante los cuales distintas variantes de HBV-X contribuyen a la
patogenia en el hígado infectado. Además, aportan en la
caracterización biológica y molecular del genotipo F, autóctono
latinoamericano, responsable de la mayoría de las hepatitis crónicas B
en nuestra región.
0041
EL LINFOMA DIFUSO A GRANDES CÉLULAS B EPSTEIN BARR POSITIVO
EN ARGENTINA: ROL DEL VIRUS EN LA PATOGÉNESIS, COMPOSICIÓN Y
FUNCIONALIDAD DEL MICROAMBIENTE TUMORAL
M Cohen1, A Vistarop1, E De Matteo2, M Narbaitz3, F Matrebian3, MV
Preciado1, P Chabay1
1
Laboratorio de Biología Molecular, División Patología, Hospital de
Niños R. Gutiérrez, Argentina. 2 División Patología, Hospital de Niños R.
Gutiérrez, Argentina. 3 División Patología, Instituto de Investigaciones
Hematológicas Mariano R. Castex, Academia Nacional de Medicina,
Argentina.
El virus de Epstein Barr (EBV) es un virus oncogénico de distribución
mundial que posee dos ciclos de infección: lítico y latente. En
Argentina, la infección primaria ocurre tempranamente y suele ser
subclínica. El virus infecta los linfocitos B de memoria de por vida, y
está relacionado al desarrollo de linfomas. El linfoma difuso a grandes
células B (LDGCB) es el más frecuente en adultos. La clasificación de la
OMS en 2008 incluyó una nueva entidad provisoria, el LDGCB EBV+ del
adulto mayor, en pacientes ≥50 años inmunocompetentes, aunque se
observó en algunos pacientes jóvenes. La participación del virus en esta
entidad estaría relacionada con la disminución en la respuesta de
linfocitos T inherente al envejecimiento (inmunosenescencia) que
permite la proliferación de linfocitos B infectados. Fue descripta en
otros linfomas la interacción del EBV con el microambiente tumoral,
que modificaría ciertas poblaciones celulares y la expresión de
citoquinas.
Nuestro objetivo fue determinar la participación del virus de EBV en la
patogénesis del LDGCB en pacientes de todas las edades nuestro país, y
además caracterizar el microambiente tumoral a fin de determinar si la
presencia del virus afecta su composición y funcionalidad.
Se analizaron 102 casos de LDGCB que incluían: 52 pacientes adultos
≥50 años, 24 <50 años y 26 pediátricos. Se realizó hibridación in situ
(HIS) para EBERs, e inmunohistoquímica (IHQ) para EBNA2, EBNA3A,
LMP1, LMP2A y BMRF1. Se determinó la expresión relativa de genes
virales de latencia (EBNA1, EBNA2, EBNA3C, LMP1 y LMP2A) y líticos
(BZLF1, BHRF1 y BLLF1) mediante PCR en tiempo real. Se caracterizó el
microambiente tumoral mediante IHQ para CD4, CD8, Foxp3, GrB y PD1 junto con la expresión relativa de IL-10, TGFβ, IFNγ y CCL20.
Finalmente, se compararon casos EBV+ y - y se correlacionaron con los
datos clínicos.
Establecimos un valor de corte del 20% de células tumorales EBERs+
para definir los casos como LDGCB EBV+. Determinamos que la
frecuencia del LDGCB EBV+ en nuestro país coincide con lo descripto
para poblaciones de Asia y Latinoamérica. El perfil de latencia II/III
junto con genes y antígenos líticos predominó en nuestra serie. En
particular, los casos EBV+ tuvieron un aumento significativo en la
población de células citotóxicas efectoras GrB+ y una tendencia a
133
Libro de resúmenes
mayor recuento de LT CD8+. La presencia del marcador inhibitorio PD1, de IL-10 y TGFβ fueron características de los LDGCB, independiente
de la presencia del virus. Finalmente, observamos una tendencia a una
menor sobrevida en los casos EBV+ respecto de los EBV-.
El desarrollo del LDGCB aún en ausencia de EBV indica que el proceso
de linfomagénesis sería multifactorial, involucrando genes virales,
factores del hospedador e incluso ambientales. Sin embargo, en el
LDGCB EBV+, el EBV cumpliría un rol en su patogénesis no solo en los
casos ≥50 años, sino en un amplio rango etario. Este hallazgo avala la
sugerencia de revisión del criterio de edad definido por la OMS.
0088
ESTUDIO DE LAS CARACTERISTICAS DE LA INFECCION POR EL VIRUS
EPSTEIN-BARR EN PORTADORES RECIENTES PEDIATRICOS
A Vistarop1, M Cohen1, E De Mateo2, MV Preciado1, P Chabay1
1
Laboratorio de Biología Molecular, División Patología, Hospital de
Niños R. Gutiérrez, Argentina. 2 División Patología, Hospital de Niños R.
Gutiérrez, Argentina, Argentina.
Introduccion. La amígdala, sitio de ingreso del virus de Epstein Barr
(EBV), está constituida por un epitelio, una región interfolicular(IF) y
centros germinales(CG). Durante la primoinfección, el EBV atraviesa el
epitelio e infecta linfocitos B (LB) subepiteliales (SubEp) con expresión
de todas sus proteínas de latencia (LIII), para luego suprimirla hasta su
silenciamiento en LB memoria. Existen 2 teorías de infección estudiadas
en adultos, infección de LBmemoria o de LBnaive. En Argentina la
primoinfección es subclínica y en niños pequeños, por lo tanto esta
población representa un nicho biológico interesante.
Objetivo. Caracterizar en amígdalas de pacientes pediátricos la
expresión de antígenos virales, su localización histológica y la
subpoblación de LB infectados.
Metodología. Se estudiaron 90 pacientes pediátricos con
amigdalectomía (2-14años). En biopsias fijadas en formol e incluídas en
parafina se determinó la presencia del genoma viral por PCR, su
localización y perfil de latencia por hibridación in situ (HIS) para EBERs
(RNA codificados por EBV) e inmunohistoquímica para proteínas virales
LMP1 y 2A, EBNA2 y 3A, y BMRF1. Se realizaron dobles marcaciones
para EBERs e IgD y/o CD27. Se determinó la carga viral (QV) por PCR en
tiempo real.
Resultados. Se detectó la presencia de EBV en 29/90 casos por PCR e
HIS. Los 29 casos presentaron en linfocitos expresión de antígenos de
latencia de membrana LMP1 (29/29) y 2A (19/29), antígenos nucleares
EBNA2 (19/29) y 3A (10/29) y del antígeno lítico BMRF1 (5/29). La
media de edad fue menor en el grupo con LB SubEp.LMP1+ comparado
con LB NoSubEp.LMP1+(3vs.6 años; p=0,04 testM-W) y en el grupo con
LIII SupEp con respecto al LIII NoSubEp (5vs.9,5 años; p=0,02 testM-W).
La media de edad fue mayor en los casos con marcación de antígenos
virales (excepto LMP1) en células epiteliales (6vs.4,5 años; p=0,04
testM-W). Al analizar comparativamente la expresión conjunta de
antígenos (IF-SubEp, IF, IF-SubEp-CG e IF-CG), se observó una
tendenciaal aumento de la media de edad, de 3, 4, 5 y 9años
respectivamente (p=0,07;testK-W). Las QV fueron mayores en los casos
con LB SubEp.LMP1+(p=0,04; testM-W), mientras que bajas cargas se
observaron al analizar las 4 localizaciones, en los casos con marcación
en CG (p=0,02; testM-W). La mayoría de los casos presentan marcación
EBERS+/IgD+(p=0.002;testc2) y LIII (11/15).
Conclusión. Los pacientes estudiados son portadores recientes del virus
ya que prevalece la LIII. En niños de corta edad, el EBV se localizaría en
linfocitos de la región SubEp acompañado de alta QV, mientras que a
mayores edades predomina la localización en CG, con menor QV y
presencia del EBV en células epiteliales. Esto indicaría que el virusen el
transcurso de la infección accede a LB SubEp, atraviesa la región IF y
eventualmente ingresa a CG. La presencia del virus en LBnaive y la
ausencia de ciertos antígenos virales en CG indica que los modelos de
infección propuestos no serían mutuamente excluyentes.
0112
EFECTO DE LA PROTEÍNA CORE DEL VIRUS HEPATITIS C (HCV) SOBRE
LA REGULACIÓN DE LA APOPTOSIS, LA PROLIFERACIÓN Y LA
INMORTALIZACIÓN CELULAR
N Eguibar, P Perazzo, EA Gentile, AI Castillo, C Delfino, VL Mathet, ML
Cuestas, JR Oubiña
Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica
(IMPAM, UBA-CONICET), Facultad de Medicina, UBA, Argentina,
Argentina.
El HCV ha sido clasificado en 7 genotipos y múltiples subtipos según el
porcentaje de identidad nucleotídica. Se desconoce si la infección por el
subtipo 2c tiene un curso evolutivo diferente a la de los más estudiados
1a, 1b (los más prevalentes a nivel mundial) y 4. El subtipo 2c ha sido
detectado principalmente en algunos países de Europa y África y en
algunos de América incluyendo Argentina. Su prevalencia es
significativa en algunas provincias del país, tales como Córdoba y
Buenos Aires.
Dentro de la región codificante del genoma viral, el gen core contiene la
secuencia más conservada entre los diferentes aislamientos y genotipos
del HCV, lo que sugiere una importante función biológica. Se han
documentado diversas actividades funcionales de dicha proteína viral,
incluyendo la encapsidación del RNA viral, la regulación de promotores
celulares, las interacciones con proteínas celulares, la promoción del
crecimiento celular e inmortalización, la inducción del hepatocarcinoma
celular en ratones transgénicos, un rol inmuno-regulador y un
controvertido –y aún no definitivamente establecido- papel regulador
de la apoptosis.
El objetivo del presente trabajo fue estudiar comparativamente los
efectos de la expresión de la proteína Core de los subtipos 1b y 2c del
HCV sobre los niveles de expresión de diversas proteínas involucradas
en la apoptosis, proliferación celular e inmortalización. Para ello se
expresó transitoriamente y en modo independiente la proteína Core de
ambos subtipos en células Huh7 y se analizó mediante Western blot con
anticuerpos específicos el efecto de la misma sobre las proteínas
tanquirasa (activadora de la telomerasa), cIAP1 y cIAP2 (inhibidoras de
la apoptosis), procaspasa 3 (ejecutora apoptótica), ganquirina
(reguladora anti-apoptótica del ciclo celular) y c-Myc. A las 48 horas de
expresión transitoria de la proteína Core de los genotipos 1b o 2c del
HCV se produjo una disminución significativa (p < 0,05) de la expresión
de tanquirasa (0,5 ± 0,1 y 0,3 ± 0,1, respectivamente), cIAP1 (0,5 ± 0,04
y 0,7 ± 0,1, respectivamente) y procaspasa 3 (0,7 ± 0,05 y 0,2 ± 0,03,
respectivamente) pero solamente el subtipo 2c indujo una disminución
significativa de ganquirina (0,6 ± 0,2). No se observaron efectos
estadísticamente significativos sobre la expresión de cIAP2 y c-Myc. El
valor de los controles se designó arbitrariamente como 1.
Los resultados obtenidos sugieren que la expresión transitoria de los
subtipos 1b y 2c de la proteína Core del HCV desempeñan in vitro un rol
proapoptótico, lo que podría tener importantes implicancias en la
patogénesis de la infección natural por HCV. En el modelo experimental
utilizado, dicho efecto fue -en algunos casos- genotipo-dependiente,
dado que -en general- el mismo fue observado sobre la proteínas
regulatorias / efectoras de la apoptosis / inmortalización celular más
acentuadamente en las células que expresaron Core del subtipo 2c.
0113
EFECTO DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA CORE DEL VIRUS
HEPATITIS C (HCV) EN EL DESARROLLO DE INSULINO-RESISTENCIA
P Perazzo, N Eguibar, AI Castillo, C Delfino, EA Gentile, VL Mathet, ML
Cuestas, JR Oubiña
Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica
(IMPAM, UBA-CONICET), Facultad de Medicina, UBA, Argentina.,
Argentina.
La proteína Core del virus hepatitis C (HCV) es un componente de la
nucleocápside y cumple un papel importante en la patogénesis viral.
Numerosos estudios epidemiológicos y experimentales sugieren que la
infección crónica con HCV estaría asociada a insulino-resistencia y por
ende, al desarrollo de diabetes tipo 2. Dichos efectos fueron
observados fundamentalmente con la proteína Core del genotipo 1b
del HCV. Cabe destacar que la intolerancia a la glucosa posee un efecto
negativo respecto a la tasa de respuesta virológica sostenida a los
134
Libro de resúmenes
antivirales empleados en la terapéutica actual de los pacientes con
hepatitis C crónica, constituyendo además un factor de riesgo para el
desarrollo del hepatocarcinoma celular. La circulación del genotipo 2c
en nuestro país es de especial relevancia ya que desde el punto de vista
patogénico se ignora si éste se asocia a un comportamiento biológico
diferente respecto al de los genotipos 1a y 1b –los más prevalentes a
nivel mundial- dada la significativa distancia filogenética entre ambos.
El objetivo del presente trabajo fue analizar y comparar el efecto de la
expresión de la proteína Core de los genotipos 1b y 2c del HCV en el
desarrollo de insulino-resistencia. Para llevar a cabo este objetivo, se
utilizó un modelo de expresión transitoria de la proteína Core
(genotipos 1b y 2c) en células Huh7. Transcurridas 48 h posttransfección, se evaluaron los niveles de expresión de IRS (insulin
receptor substrate)-1 e IRS-2 mediante Western blot. Cabe destacar
que IRS-1 e IRS-2 regulan la vía de expresión en la superficie
hepatocitaria del transportador 4 de glucosa (Glut-4), imprescindible
para captar la glucosa circulante. En otros términos, IRS-1 e IRS-2
regulan la glucemia e insulinemia. De acuerdo a los resultados
obtenidos, la expresión transitoria de las proteínas Core de los
genotipos 1b y 2c del HCV durante 48 h en células Huh7 produjo una
disminución estadísticamente significativa (p < 0,05) en los niveles de
expresión de las proteínas IRS-1 (0,6 ± 0,05 y 0,4 ± 0,04,
respectivamente) e IRS-2 (0,5 ± 0,05 y 0,4 ± 0,1, respectivamente). El
valor de la expresión de los controles se designó arbitrariamente como
1.
Estos resultados aportan las primeras evidencias del rol de la proteína
Core del genotipo 2c en el desarrollo de insulino-resistencia. Futuros
estudios deberán llevarse a cabo con el objetivo de evaluar si la
disminución de la expresión de IRS-1 y -2 son atribuibles a un eventual
efecto de represión transcripcional sobre sus respectivos promotores o
a una (ya postulada) degradación proteica en el proteasoma.
0149
ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA DISCS LARGE EN
LESIONES INTRAEPITELIALES ESCAMOSAS DE CUELLO UTERINO Y SU
SIGNIFICADO PRONÓSTICO EN LA EVOLUCIÓN DE LA PATOLOGÍA.
AL Cavatorta1, A Di Gregorio2, M Cabral2, M Bugnon Valdano1, F
Marziali1, G Barbieri1, J Cittadini2, AL Nocito3, D Gardiol1
1
Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario-CONICET, Facultad
de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de
Rosario, Argentina. 2 Sección de Oncología Pelviana del Servicio de
Ginecología, Hospital Provincial del Centenario, Rosario, Argentina. 3
Cátedra de Anatomía y Fisiología Patológicas, Facultad de Ciencias
Médicas, Universidad Nacional de Rosario, Argentina.
La infección por papilomavirus humanos (VPH) de alto riesgo es el
evento clave en el desarrollo de los carcinomas de cuello de útero y de
las lesiones neoplásicas precursoras (SIL). El cáncer cervical invasor está
precedido por un espectro progresivo de anormalidades del epitelio
cervical. Este proceso es reversible y la mayoría de las infecciones por
VPH son transitorias, lo que conduce a la eliminación de manera
espontánea de la infección e incluso a la regresión de las lesiones
precursoras. Una premisa fundamental para determinar el tratamiento
o el seguimiento de mujeres con SIL de bajo grado (LSIL) es el riesgo de
una probable progresión a lesiones de mayor severidad (HSIL), y
eventualmente, cáncer invasor. Así, es trascendente encontrar
biomarcadores para predecir la evolución de tales lesiones, y que
contribuyan a la prevención y definición de terapias adecuadas. De esta
manera, resulta interesante identificar si variaciones en el nivel de
expresión de las proteínas celulares blanco de la oncoproteína E6 de
VPH pueden ser utilizadas como biomarcadores histológicos. Por ello,
nos propusimos analizar como probable marcador de progresión
durante el desarrollo oncogénico asociado a VPH, la expresión
diferencial del oncosupresor Discs large (DLG1), una de las proteínas
blanco de E6 que participa en la regulación de la proliferación y de la
polaridad celular. En estudios previos por inmunohistoquímica (IHQ)
demostramos que, para LSIL existen dos arquetipos de marcación
diferentes para DLG1. En uno de ellos, la expresión y distribución de
DLG1 son similares a lo observado en tejidos normales. El otro
subgrupo de biopsias de LSIL presenta un arquetipo semejante al de
HSIL, con una sobre expresión de DLG1 muy marcada a lo largo de todo
el epitelio. Por ello, y dada las características de DLG1, y su probable
participación tanto en procesos oncosupresores como oncogénicos, es
interesante conocer si estos distintos patrones de expresión pueden
asociarse a una progresión y/o regresión diferencial de las lesiones LSIL.
Hemos analizado biopsias de cuello uterino de mujeres que
presentaban diagnóstico de LSIL (N=30), por IHC usando anticuerpos
contra la proteína DLG1. Los resultados obtenidos han sido
relacionados con el seguimiento clínico de las pacientes durante 24
meses, para establecer su valor para predecir la progresión o regresión
de la lesión. De manera interesante, nuestros resultados indican que
aquellas muestras con patrones tipo normales (N=23) corresponden a
pacientes que según el análisis de las historias clínica y seguimiento,
regresaron sus lesiones. En cambio aquellas con marcación intensa
(N=4) fueron las pacientes que mostraron una progresión en la
severidad de las lesiones. Luego de aplicar el test exacto de Fisher se
concluye que existe una asociación significativa (p<0.00001) entre
expresión de DLG1 y la evolución de la lesión. Estos resultados son
alentadores, y actualmente estamos completando estos estudios
ampliando el número de muestras a analizar con el fin de determinar
efectivamente si el patrón de expresión de DLG1 podría utilizarse como
un biomarcador de progresión de lesiones cervicales.
0150
REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS DE POLARIDAD
CELULAR DURANTE INFECCIONES DEL VIRUS DEL PAPILLOMA
HUMANO
M Bugnon Valdano1, AL Cavatorta1, F Marziali1, G Barbieri1, F Facciuto1,
E Boccardo2, D Gardiol1
1
IBR/CONICET - Virología, Fac. Cs. Bioq. y Farm, UNR, Argentina. 2 Lab.
Oncovirología, ICB, USP, Brasil.
La polaridad de celular está determinada por una distribución
asimétrica y muy regulada de proteínas y lípidos asociados a
membrana. La pérdida de dicha polaridad y la consecuente alteración
de las uniones celulares son características de los procesos
carcinógenos. Por eso, estamos interesados en estudiar los diferentes
mecanismos que regulan la expresión de proteínas de polaridad,
considerando especialmente los procesos neoplásicos asociados a
infecciones del virus del papiloma humano (VPH). Los VPH infectan
epitelios de una gran variedad de sitios anatómicos, y se clasifican
como de bajo o alto riesgo oncogénico, según las manifestaciones
clínicas asociadas.
Entre los blancos celulares de VPH se cuentan a varias proteínas PDZ de
polaridad, incluyendo a la proteína Disc Large (DLG1), que tiene
funciones tanto estructurales como de señalización. La expresión de
DLG1 está alterada en diversos tumores, y en particular en el cáncer
cervical, siendo los VPH de alto riesgo oncogénico agentes etiológicos
de dicha patología.
Para estudiar los mecanismos precisos involucrados en la regulación de
DLG1 durante los procesos neoplásicos asociados a VPH, en el presente
trabajo generamos cultivos organotípicos tipo RAFT, que reproducen el
proceso de diferenciación epitelial in vitro, y que por tanto constituyen
herramientas muy útiles para el estudio de mecanismos asociados a
infecciones por virus epiteliotrópicos, como el VPH. En particular,
desarrollamos cultivos RAFT a partir de queratinocitos primarios
expresando las proteínas E7 y E6/E7 de VPH18 (de alto riesgo) y de
VPH11 (de bajo riesgo). Corroboramos la expresión de los
correspondientes transcriptos virales en los cultivos RAFT generados
mediante la metodología de RT-PCR. Luego, analizamos la expresión de
DLG1 en cada caso, mediante las técnicas de Western Blot (WB) e
Inmunohistoquímica (IHQ). Los resultados mostraron que la expresión
de DLG1 es desregulada en los cultivos expresando E7 y E6/E7 de
VPH18 y de VPH11. En particular, encontramos un aumento en los
niveles de expresión de la proteína celular y un cambio en su
distribución ante la expresión de las proteínas virales. Observamos en
todos los casos una redistribución de DLG1 hacia el citoplasma.
Específicamente para el caso de los cultivos expresando proteínas de
VPH 18, encontramos una evidente pérdida de DLG1 a nivel de los
bordes celulares, y siendo esto aún más marcado para el caso de los
cultivos expresando E6/E7 de VPH18.
Más aún, mediante cultivo celular tradicional y WB, observamos que la
expresión exógena en células de la línea 293 de las proteínas virales E7
y E6/E7 (de VPH 18 y VPH 11) también genera un aumento en los
135
Libro de resúmenes
niveles de expresión de DLG1. En conjunto, hemos analizado la
expresión de proteínas celulares blanco de VPH en un contexto que
asemeja a las infecciones virales. Estos datos sugieren que las proteínas
virales podrí