XI Congreso Argentino de Virología II Congreso Latinoamericano de Virología IV Simposio de Virología Clínica II Simposio de Virología Veterinaria “Dr. José L. La Torre” 23 al 26 de junio de 2015 Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina Libro de resúmenes Centro de Convenciones Palais Rouge Jerónimo Salguero 1443/49 Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina PATROCINANTES Y AUSPICIANTES Entidades Patrocinantes Ministerio de Salud de la Nación Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET) Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCYT) Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) European Molecular Biology Organization (EMBO) American Society for Microbiology (ASM) Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (INBIRS) - UBA-CONICET Empresas Patrocinantes principales Abbott División Molecular Abbott División Diagnósticos BioSystems SA Tecnolab SA Productos Roche S.A.Q.e I. - División Diagnóstica WM Argentina SA Empresas Patrocinantes Alere Argentina AP- Biotech SRL Biodynamics SRL Bioars SA Biocientífica Bioquímica SRL GeneReach Biotechnology Corporation Internegocios SA Inbio Highway Norces Microlat SRL Migliore Laclaustra SRL Lobov Científica Empresas Colaboradoras Biogénesis Bagó BD Biosciences Argentina Invitrogen Argentina SA Auspiciantes Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud "Dr. Carlos G. Malbrán" Asociación Argentina de Zoonosis (AAZ) Asociación Bioquímica Argentina (ABA) Asociación Médica Argentina (AMA) Confederación Unificada de Bioquímicos de la Rep. Argentina (CUBRA) Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) Facultad de Agronomía - UBA Facultad de Agronomía - Universidad Nacional de la Pcia. de Buenos Aires Facultad de Ciencias Exactas - UNLP Facultad de Ciencias Médicas - UNLP Facultad de Ciencias Veterinarias - UNLP Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA Federación Bioquímica de la Pcia. de Buenos Aires (FABA) Fundación Huésped Instituto de Cardiología y Cirugía Cardiovascular “Fundación Favaloro” Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. César Milstein" - ex CEVAN Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas "Dr. Julio Maiztegui" (INEVH) Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA) Sociedad Argentina de Ginecología Infanto Juvenil (SAGIJ) Sociedad Argentina de Infectología (SADI) Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC) Sociedad Argentina de Medicina Veterinaria (SOMEVE) Sociedad Argentina de Pediatría (SAP) Sociedad Argentina de Reumatología de la Ciudad de Buenos Aires (SAR) Sociedad Científica Argentina (SCA) Sociedad de Obstetricia y Ginecología de la Pcia de Bs. As. (SOGBA) Universidad Favaloro Universidad Nacional de La Plata (UNLP) COMITÉ ORGANIZADOR Presidente Víctor Romanowski (UNLP) Vice Presidentes Elsa Damonte (UBA) Juan D. Claus (UNL) Secretaría General Nora López (ICT Milstein) Mauricio Carobene (INBIRS) Cybele García (UBA) Oscar Taboga (INTA) Tesorería Ana Jar (UBA) Lucía Cavallaro (UBA) Comisión Técnica Mariano Pérez Filgueira (INTA) Carolina Torres (UBA) Maximiliano Wilda (ICT Milstein) Alejandra Capozzo (INTA) María Ávila (UBA) Alejandra D'Antuono (ICT Milstein) Andrea Mangano (Htal. Garrahan) Elsa Baumeister (ANLIS) Secretaría Científica María Victoria Preciado (Htal. Gutiérrez) Inés Zapiola (Htal. Muñiz) Cecilia Galosi (UNLP) Graciela Glikmann (UNQ) Comisión Científica Daniela Gardiol (IBR) Guillermina Dolcini (CIVETAN) Irene Álvarez (INTA) Jorge Quarleri (INBIRS) María Alejandra Picconi (ANLIS) Marta Contigiani (UNC) Paula Aulicino (Htal. Garrahan) Pilar Adamo (UNC) Silvana Levis (ANLIS) Viviana Mbayed (UBA) Viviana Ré (UNC) Miguel Taborda (UNR) Claudia Nunes Duarte Dos Santos (ICC-Fiocruz, Brasil) María Fernanda Gutiérrez (PUJ, Colombia) Marcelo López Lastra (PUCC, Chile) Juan Ramón Arbiza (UR, Uruguay) Flor Pujol (IVIC, Venezuela) Comisión Directiva de la Sociedad Argentina de Virología Presidente María Victoria Preciado Vicepresidente Lucía V. Cavallaro Secretaria Oscar Taboga Prosecretario Andrea Mangano Secretario de Actas Irene Álvarez Tesorera Nora López Protesorero Cecilia Galosi Vocal Titular 1º Victor Romanowski Vocal Titular 2º Daniela Gardiol Vocal Titular 3º Mauricio Carobene Vocal Titular 4º Marta Contigiani Vocal Suplente 1º Elsa Baumeister Vocal Suplente 2º Cybele García Vocal Suplente 3º Silvana Levis Vocal Suplente 4º Inés Zapiola Comisión Directiva de la Asociación Argentina de Microbiología Presidente Manuel Gómez Carrillo Vicepresidente Gustavo Giusiano Secretaria María Cecilia Freire Prosecretario Juan Stupka Secretaria de actas María I.G. Fernández Tesorera Paula Gagetti Protesorero Susana Vázquez Vocal Titular 1º Adriana Sucari Vocal Titular 2º María José Gallego Vocal Titular 3º María Soledad Ramírez Vocal Titular 4º Angel Cataldi Vocal Suplente 1º Lucía Cavallaro Vocal Suplente 2º HoracioFrade Vocal Suplente 3º Marina Bottiglieri Vocal Suplente 4º Emilce Méndez Carta del Presidente del XI Congreso Argentino de Virología La Sociedad Argentina de Virología (SAV), división de la Asociación Argentina de Microbiología (AAM), tiene como objetivo promover la actividad científica en el campo de la Virología humana, veterinaria y vegetal. La actividad científica más importante y convocante de nuestra Sociedad es el Congreso Argentino de Virología (CAV), que se realiza cada tres años. En el marco de dicha actividad, desde el año 1986, la Sociedad ha promovido además la realización de Encuentros Latinoamericanos de Virólogos con el fin de lograr la interacción e integración de especialistas de la región y fortalecer los vínculos de cooperación entre los científicos de los diferentes países. En concordancia con esos objetivos, en esta oportunidad el XI Congreso Argentino de Virología y el II Congreso Latinoamericano de Virología tendrán lugar en forma conjunta entre los días 23 y 26 de junio de 2015 en la Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Tal como ha ocurrido en ediciones anteriores, simultáneamente se desarrollarán también el IV Simposio Argentino de Virología Clínica y el II Simposio Argentino de Virología Veterinaria. El congreso se desarrollará en Sesiones Plenarias, Mesas Redondas, Sesiones de Presentación de Pósters y Sesiones Interactivas de Discusión de Casos Clínicos. Los trabajos originales que se presentarán en forma de póster fueron seleccionados por un distinguido Comité Científico. Un número importante de prestigiosos virólogos del ámbito local e internacional participan en este evento. El programa científico ha sido cuidadosamente diseñado, con el objeto de vincular a la Virología con otras disciplinas, promoviendo un abordaje integrador del estado actual del conocimiento en la materia, y su impacto en la Salud Pública, el Ambiente y sus aplicaciones en Biotecnología. En nombre de la Comisión Organizadora agradezco la participación entusiasta de los virólogos de la región y las importantes contribuciones de las instituciones nacionales e internacionales relacionadas con el fomento de la ciencia, la salud y las actividades agropecuarias, como así también a las empresas patrocinantes y el auspicio de universidades y sociedades científicas y profesionales. DR. VICTOR ROMANOWSKI Presidente de la Comisión Organizadora XI Congreso Argentino de Virología II Congreso Latinoamericano de Virología IV Simposio Argentino de Virología Clínica II Simposio Argentino de Virología Veterinaria Libro de resúmenes XI Congreso Argentino de Virología II Congreso Latinoamericano de Virología Conferencias plenarias Martes 23 de junio Miércoles 24 de junio Sala A (Salón Pigalle - 2º piso) Sala A (Salón Pigalle - 2º piso) 09:45 – 10:30 hs. CONFERENCIA PLENARIA INAUGURAL 09:00 – 09:45 hs. CONFERENCIA 3 Luis Villarreal. Center for Virus Research, University of California, Irvine, EE.UU. Frank Rösl. Instituto Alemán de Investigación sobre Cáncer (DKFZ), Heidelberg, Alemania. VIRUS IN HOST EVOLUTION: RETHINKING RNA QUASISPECIES AS COOPERATIVE AND AS THE BOSS L Villarreal Center for Virus Research University of California, Irvine, Estados Unidos. PAPILLOMAVIRUSES AS POTENTIAL SKIN CANCER ETIOLOGIC AGENTS: A DEVELOPMENT OF A VLP VACCINE IN A WILD MURINE ANIMAL MODEL F Rosl1, S Vinzon1, E Geissler2, I Nindl3 1 German Cancer Research Center, Research Program Infection & Cancer, Alemania. 2 Department of Surgery, Experimental Surgery Division, University of Regensburg, Regensburg, Alemania. 3 Department of Dermatology, Charité Berlin, Berlin, Alemania. Viruses exist as the most numerous, ancient and dynamic of all genetic entities thus provide a vast virosphere. They exchange genetic information in a diffuse network with other virus and host. Although we have long thought of them as the most selfish of genetic parasites that appear to prey on their host, they can also become ‘one’ with their host (symbiotic) by persisting either as genomic, defective or epigenomic agents. We now know virus persistence is a common and conserved situation. In this presentation I will outline how virus persistence strongly affects host survival in the virosphere. By providing both protection and destruction they create group states of host virus addiction. RNA viruses were used to model quasispecies theory and the origin of the genetic code. I re-examine quasispecies theory based on decades of experimental virology and conclude virus quasispecies are cooperative. Based on this foundation, I then reconsider the role of virus derived RNA (especially stem-loop RNA) on host evolution and argue that parasite derived non-coding RNA’s provide cooperative regulatory (identity) networks in Eukaryotes. 17:15 – 18:00 hs. CONFERENCIA 2 Marcelo López Lastra. Laboratorio de Virología Molecular, Instituto Milenio de Inmunología e Inmunoterapia, Centro de Investigaciones Médicas, Escuela de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile. THE ART OF WAR; VIRAL SUBVERSION OF THE HOST PROTEIN SYNTHESIS MACHINERY. M López-Lastra Laboratorio de Virología Molecular, Instituto Milenio de Inmunología e Inmunoterapia, Departamento de Infectología e Inmunología Pediátrica, Escuela de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile, Chile. Viruses are obligate intracellular parasites and depend on cells for their replication. They have, however, evolved mechanisms to ensure that their replication can be achieved in an efficient manner. The expression of viral proteins is frequently subject to regulation at the level of protein synthesis. The primary target of such control is normally the initiation step of protein synthesis. Indeed, during the early stages of infection, viral mRNAs compete with their host counterparts for the protein synthesis machinery. To circumvent this competition viruses have evolved diverse strategies to ensure that the host ribosomes can be recruited selectively to the viral mRNAs. This work will highlight some of the strategies used by viral mRNAs to subvert the host translational machinery; special focus will be given to the mechanisms used by RNA viruses of high medical relevance such as HIV-1. To evaluate whether the protective effect of a vaccine against nonmelanoma skin cancer can be translated to patients, we used the rodent Mastomys coucha that is naturally infected with Mastomys natalensis papillomavirus (MnPV). This skin type papillomavirus induces not only benign skin tumours, such as papillomas and keratoacanthomas, but also squamous cell carcinomas. Here, we examined the efficacy of a VLP-based vaccine on either previously or newly established infections. VLPs raise a strong and long-lasting neutralizing antibody response that confers protection even under systemic long-term cyclosporine A treatment. Remarkably, the vaccine completely prevents the appearance of benign as well as malignant skin tumors. Protection involves the maintenance of a low viral load in the skin by an antibody-dependent prevention of virus spread. Our results provide first evidence that VLPs elicit an effective immune response in the skin under immunocompetent and immunosuppressed conditions. These findings provide the basis for the clinical development of potent vaccination strategies against cutaneous HPV infections and HPVinduced tumors, especially in patients awaiting organ transplantation. 16:30 – 17:15 hs. CONFERENCIA 4 Jônatas S Abrahão. Departamento de Microbiologia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil. SAMBA VIRUS AND OTHER GIANTS: THE LARGEST AND MORE COMPLEX VIRUSES EVER ISOLATED IN BRAZIL J Abrahao Universidade Federal de Minas Gerais, Laboratório de Vírus, GEPVIG., Brasil. In 2003, Acanthamoeba polyphaga mimivirus (APMV) was first described and began to impact researchers around the world, due to its structural and genetic complexity. This virus founded the family Mimiviridae. In recent years, several new giant viruses have been isolated from different environments and specimens. Giant virus research is in its initial phase and information that may arise in the coming years may change current conceptions of life, diversity and evolution. Thus, this presentation aims to condense the studies conducted so far about the features and peculiarities of APMV, Samba and other Brazilian Giant viruses, from its discovery to its clinical relevance. 8 Libro de resúmenes 17:15 – 18:00 hs. CONFERENCIA 5 David Markovitz. Division of Infectious Diseases, Department of Internal Medicine, University of Michigan Medical Center, Ann Arbor, Michigan, EE.UU. THE SECRET LIFE OF HUMAN ENDOGENOUS RETROVIRUSES DM Markovitz, R Contreras-Galindo, MH Kaplan University of Michigan, Estados Unidos. Our work on Human Endogenous Retroviruses (HERVs) led to our discovery of a previously unknown family of HERVs (termed K111) that have spread throughout 15 centromeres in modern humans through a process resembling homologous recombination. More recently, we have discovered a second virus, termed K-222, which has spread among pericentomeric sequences in distinct human chromosomes. The sequence of the human genome is not yet complete and, importantly, major gaps remain at the centromeric region of each chromosome. It is unlikely that the centromere sequences are functionally indolent, considering the fact that the centromere is responsible for the faithful segregation of chromosomes, and destabilization of this process results in genomic instability and aneuploidy. Therefore, the sequence of the centromere remains a last frontier of human genomics and genetics. The structure of each human chromosome is, however, organized by specific alpha repeats that are distinct to the centromere of each individual human chromosome. We are now using the sequence information from alpha repeats and HERVs to develop molecular, qPCRbased assays capable of specifically detecting and quantifying the centromeric material of each human chromosome. We are presently applying this new technology to study the role of centromeres in birth defects. In addition, the potential for centromeres to drive the pathogenesis of cancer has, surprisingly, remained very understudied, and our new methodology is allowing us to assess whether specific patterns of centromeric evolution are seen in particular malignancies, as our preliminary data would suggest. These tools can also be exploited to begin to examine whether centromere biology might directly guide malignant transformation. Thus, advances from our work on HERVs have led us to apply new technologies to begin to understand the mysteries of centromeres in health and disease. Jueves 25 de junio Sala A (Salón Pigalle - 2º piso) 09:00 – 09:45 hs. CONFERENCIA 6 Elina Zuñiga. Division of Biological Sciences, University of California, San Diego, EE.UU. ARENAVIRUSES: LETHAL PATHOGENS AND MODELS FOR CHRONIC VIRAL INFECTIONS E Zuniga Division of Biology, University of California San Diego, La Jolla CA, Estados Unidos. Our laboratory is interested in understanding the cellular and molecular mechanisms underlying the regulation of the immune system during viral infections. To get advantage of the mouse genetics and available tools we study host-pathogen interactions in a model of murine infection with the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV). We use two distinct variants of LCMV that cause acute or chronic infections, respectively, upon inoculation into adult mice. This allows us to investigate the mechanisms underlying immune-regulation in the context of transient versus persistent viral replication and to study how arenaviruses can outcompete or be controlled by immune responses. With such research we aim at uncovering basic principles in immune-regulation and unlocking new strategies to attenuate infections with chronic viruses and/or arenaviruses. Recent progress in these areas will be presented. Viernes 26 de junio Sala A (Salón Pigalle - 2º piso) 09:00 – 09:45 hs. CONFERENCIA 7 Alberto Epstein. Centro Internacional de Investigación en Infectología (CIRI), CNRS, INSERM, Francia. USE OF HERPES SIMPLEX VIRUS TYPE 1 (HSV-1)-DERIVED AMPLICON VECTORS FOR THE STUDY OF NORMAL AND PATHOLOGICAL COGNITIVE FUNCTIONS. AL Epstein Université de Versailles Saint Quentin en Yvelines, Francia. Amplicons are herpes simplex virus type 1 (HSV-1)-based defective vectors carrying no viral genes, thus warranting no intrinsic toxicity for infected cells but requiring a helper virus system to be produced in large amounts, which should then be eliminated from the vector stocks. In this talk we will introduce some of the theoretical and methodological aspects of helper-free amplicon vectors production and will show how these vectors can be used to study normal and pathological cognitive functions in experimental animal models. N-Methyl-D-aspartate glutamate receptors (NMDAR) are involved in the control of synaptic plasticity and memory function. They are cationic channel receptors that, when simultaneously activated by voltage and ligand (glutamate) binding, open to allow calcium entry. NMDAR are tetramers formed by two GluN1 subunits and 2 GluN2 subunits. To study the role of hippocampal NMDAR in cognitive functions such as learning and memory formation, we developed HSV-1-based amplicon vectors expressing antisense RNA sequences against GluN1 to induce down-regulation of the expression of this subunit. Following inoculation into the CA1 layer of adult rat hippocampus, the vector induced highlevels of antisense GluN1 RNA and considerably decreased expression of GluN1 subunit. We observed that this vector caused a significant impairment in the performance of two different behavioural tasks, thus indicating an involvement of hippocampal NMDAR in the control of the cognitive functions under study. The hippocampal formation is one of the earliest regions damaged in Alzheimer’s disease (AD). Amyloid-beta oligomers (AβO) accumulate in AD brains, where they target excitatory post-synaptic terminals and trigger synapse deterioration, a mechanism likely underlying memory loss in early-stage AD. When used to infect primary cultures of rat hippocampal neurons, the amplicons expressing GluN1 antisense RNA suppressed up to 90% GluN1 expression in dendritic spines and significantly reduced the binding of exogenously added soluble AβO to the spines. Furthermore, the amplicon-induced GluN1-knockdown markedly reduced the neuronal oxidative stress instigated by binding of AβO. Therefore, our results corroborated (a) that hippocampal CA1-specific NMDAR are directly involved in normal learning and memory processing and (b) strongly suggest that NMDAR are required for synaptic targeting of AβO to neurons and are at least partially responsible for their deleterious effects. 14:30 – 15:15 hs. CONFERENCIA 8 Andrea Gamarnik. Fundación Instituto Leloir‐CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. PLASTICIDAD Y ADAPTACIÓN DEL GENOMA DEL VIRUS DEL DENGUE S Villordo, C Filomatori, A Gamarnik Fundación Instituto Leloir-CONICET, Buenos Aires, Argentina. El virus del dengue es un importante patógeno humano transmitido por mosquitos. Se estiman 390 millones de infecciones anuales en el mundo, representando una seria amenaza a los sistemas de salud. Hasta el momento no existen vacunas ni antivirales específicos para el control del dengue. En la naturaleza el virus debe alternar infecciones en mosquitos y humanos. Los requerimientos y las limitaciones con las 9 Libro de resúmenes que se encuentra el virus en estos dos hospedadores son distintos y eso ejerce una presión de selección que impacta en la estructura genética de la población viral. Si bien es de gran importancia entender cuáles son las barreras (a nivel molecular) que existen en la transición del virus de un hospedador a otro, es escaso el conocimiento disponible sobre los determinantes que limitan o facilitan el pasaje del virus del dengue entre especies. En este trabajo estudiamos la dinámica y evolución de estructuras de RNA del genoma del virus del dengue en poblaciones virales adaptadas a células humanas o de mosquito. Mediante el empleo de secuenciación masiva de genomas de poblaciones virales descubrimos la presencia de variantes virales distintas dependiendo del hospedador. Sorprendentemente las mutaciones responsables de la selección positiva mapearon en una única estructura de RNA presente en la región 3’ no codificante del genoma. Empleando sistemas de evolución viral en cultivo se observaron ciclos de selección positiva y negativa de dichas mutaciones cuando el virus pasa de un hospedador a otro. Estos estudios revelan un nuevo mecanismo de adaptación viral y proveen información sobre aspectos fundamentales como es la transmisión del virus de una especia a otra. 15:15 – 16:00 hs. CONFERENCIA PLENARIA DE CIERRE: The EMBO Keynote Lecture Félix Rey. Unité de Virologie Structurale, Institut Pasteur, París, Francia. A VULNERABLE SITE ON THE DENGUE VIRUS ENVELOPE PROTEIN SUGGESTS NEW STRATEGIES FOR VACCINE DESIGN F Rey Institut Pasteur, Paris, Francia. All successful vaccines protecting against viral diseases induce neutralizing antibodies targeting vulnerable sites at the virus surface. Several important viruses have resisted traditional vaccine development, and novel strategies to identify and present vulnerable sites to the immune system as immunogens are necessary. We have focused on dengue virus, which consists of four related viruses (dengue viruses serotypes 1 through 4), and for which an efficient vaccine protecting against all four serotypes simultaneously is not available. Using structural studies [Nature, 2015 Jan 12. doi: 10.1038/nature14130], we have identified that human antibodies belonging to a class that potently neutralizes all four serotypes [Nat Immunol, 2015. 16(2): p. 170-177] target a conserved site at the dimer interface of the major envelope glycoprotein E. This exposed site is conserved because it is also the binding site of the viral glycoprotein prM during particle morphogenesis in the infected cell. The high heterogeneity of circulating dengue virus particles in infected individuals, together with the instability of the E protein dimer, contribute to the generation of antibodies targeting multiple structures, often not relevant for neutralization, thereby diluting the elicitation of antibodies targeting relevant sites. Based on our results, we propose generation stabilized E dimers on a re-surfaced molecule to focus the immune system in this particularly vulnerable site at the dimer interface. In my presentation I will discuss these results and their implications for vaccine design. 10 Libro de resúmenes XI Congreso Argentino de Virología II Congreso Latinoamericano de Virología Mesas redondas Martes 23 de junio Sala A (Salón Pigalle - 2º piso) 10:30 – 12:00 hs. MESA REDONDA 1: VIRUS Y EVOLUCIÓN Coordinadores: Rodolfo Campos. Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires (UBA), Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Manuel Gómez Carrillo. Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (INBIRS), UBA-Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Panelistas: Inés Badano. Laboratorio de Biología Molecular Aplicada, Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales de la Universidad Nacional de Misiones, Posadas, Argentina. Laura Mojsiejczuk. Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Mariano Sede. INBIRS, UBA‐CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. EVOLUCIÓN DEL VIRUS PAPILOMA HUMANO (HPV) DESDE UNA PERSPECTIVA ANTROPOLÓGICA I Badano Laboratorio de Biología Molecular Aplicada, Universidad Nacional de Misiones, Argentina. El análisis de la variación genética de secuencias virales y su distribución geográfica permite comprender los orígenes y la dispersión de diferentes cepas virales. Este enfoque ha sido utilizado en enfermedades que afectan al hombre, incluyendo la fiebre amarilla, la gripe y el VIH. Esta información permite la identificación de focos infecciosos, el seguimiento de la infección entre pacientes, como así también el diseño de vacunas más efectivas. Por otra parte, los estudios de la variación genética de microorganismos que infectan al hombre también aportan una nueva dimensión en el estudio de las migraciones humanas. En nuestro grupo empleamos datos epidemiológicos y filogenéticos del Virus Papiloma Humano tipo 16 (HPV16) para contribuir al conocimiento histórico del poblamiento de la Provincia de Misiones. El HPV16 es un virus de ADN doble cadena de 8Kb. que pertenece a la Familia Papillomaviridae. Su estudio reviste importancia clínica por ser uno de los principales responsables del desarrollo de cáncer de cuello uterino. Su principal vía de transmisión es el contacto sexual y se encuentra en el tracto genital del 3% de la población femenina asintomática y el 54% de los carcinomas a nivel mundial. Según la variación de sus genomas, los HPV16 se clasifican en variantes virales denominadas: Africanas, Europeas, Asiáticas y Asiático Americanas. La principal hipótesis sobre su emergencia y dispersión indica que estas variantes se habrían originado por mutación en el transcurso de los últimos 200.000 años, acompañando el proceso de evolución y migración de Homo sapiens Fuera de África. Estas características vuelven al HPV16 un interesante marcador antropológico. En particular, en poblaciones multiétnicas de Argentina, donde la distribución geográfica ancestral de variantes Asiático Americanas ha sido afectada por la colonización española, el tráfico de esclavos, y la inmigración de europeos, no españoles, durante la segunda mitad del Siglo XIX y principios del XX. Resultados preliminares de nuestro grupo indican una prevalencia cercana al 10% de variantes Asiático Americanas y un 90% de variantes de origen Europeo en la ciudad de Posadas, Misiones. La datación molecular de estos linajes virales coincide con aquella determinada mediante ADN mitocondrial en población Europea y Amerindia (41,793 y 21,421 años respectivamente). Estos resultados han sido interpretados como una fuerte irrupción del virus durante la colonización española (Siglo VX) y la inmigración europea del Siglo XIX a la región. Comprender el origen y dispersión del HPV-16 será fundamental en la era de la vacuna. Financiamiento: Fundación Florencio Fiorini para investigaciones Biomédicas (2011). CONICET. CEDIT, Gobierno de Misiones (2011). ANPCyT PICTO-UNaM 2011-106 y PICT-2012-0761. HISTORIA EVOLUTIVA DEL VIRUS DE HEPATITIS B: ORIGEN, DINÁMICA Y DISPERSIÓN DEL GENOTIPO F EN AMÉRICA L Mojsiejczuk Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. El genotipo F del virus del la hepatitis B (HBV) es considerado nativo de América, sin embargo en la actualidad se conoce poco acerca de su origen espacio-temporal y dispersión a lo largo del continente. El objetivo del presente trabajo fue analizar la historia evolutiva del Genotipo F del HBV en el continente americano. Se utilizaron secuencias de genoma completo del genotipo F (n=215) disponibles en GenBank para construir dos dataset: “Subgenotipo F1” y “Subgenotipos F2-F5”, que fueron introducidos en sendos análisis de coalescencia bayesiana implementados en el paquete BEAST v1.8.1. Se co-estimaron la edad, mediante calibración con una tasa media de evolución de 1x10-5 sustituciones/sitio/año, y la localización más probables de los ancestros de los grupos relevantes. Los resultados indican que la localización más probable de los ancestros de los sgt F1 y F5 es Panamá, de los sgt F2 y F3 es Venezuela y del sgt F4, Argentina. Se observa que la mayoría de los linajes tuvieron una lenta dispersión en América Central y norte de Sudamérica, mientras que los grupos F1b y F4 muestran una rápida migración hacia el sur del continente, donde se produce la diversificación y posterior dispersión en la región. ANÁLISIS DE LA DINÁMICA DE POBLACIONES DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA TIPO 1 (HIV‐ 1) POR SECUENCIACIÓN DE ALTO RENDIMIENTO (UDPS) MM Sede INBIRS (UBA/Conicet), Argentina. El advenimiento de nuevas técnicas de secuenciación nucleotídica, conocidas como secuenciación de nueva generación, ha permitido la caracterización profunda de poblaciones virales dado su alto poder resolutivo. No obstante ello, el gran caudal de datos que puede obtenerse conlleva un desafío al momento de su análisis, siendo esta una limitación importante a la hora de establecer relaciones filogenéticas basados en datos obtenidos de diferentes aislamientos. Este escenario será analizado tomando como modelo el estudio longitudinal del tropismo celular del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) por los receptores de quimiocinas CCR5 y CXCR4 a través del análisis de las secuencias nucleotídicas parciales del gen que codifica para la glicoproteína gp120. Se obtuvieron 133 muestras provenientes de 19 pacientes seguidos durante 54 a 114 meses. Las secuencias obtenidas del proceso de pirosecuenciación fueron sometidas a un exigente filtrado de acuerdo a 11 Libro de resúmenes los parámetros de calidad exhibidos. El set de datos depurados arrojó 24335 secuencias, a las cuales se les determinó el tropismo (www.genafor.org) y posteriormente se realizaron tanto análisis filogenéticos como de diversidad y variabilidad de cuasiespecies. Si bien se observó estructura temporal en la conformación de las poblaciones, también pudo evidenciarse linajes evolucionando independientemente a lo largo de la infección, indicando un escenario complejo para la evolución de las cuasiespecies virales. Las variantes X4 estuvieron presentes en la mayoría de los pacientes, pero exhibiendo diferencias entre los pacientes e incluso en muestras intra pacientes tanto en la composición como en la predominancia de las cuasiespecies. Las variantes X4 pueden aparecer de manera independiente en múltiples linajes a los largo de la infección por HIV. La manera en que emergen varía entre los pacientes y pareciera depender tanto de factores virales como del huésped. Además, el análisis sugiere que variantes X4 en proporciones minoritarias podrían estar presentes en estadios tempranos de la infección, mucho antes de convertirse en dominantes. 15:45 – 17:15 hs. MESA REDONDA 2: INTERACCIÓN VIRUS CÉLULA Coordinadores: Luis Scolaro. Laboratorio de Virología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Laura Delgui. Instituto de Histología y Embriología, IHEM‐CONICET, Mendoza, Argentina. Panelistas: Diego Álvarez. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas – CONICET (IIB‐INTECH), Universidad de San Martín, San Martín, Argentina. Susana Guerra García. Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública y Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, España. María Guadalupe Martínez. Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine, Nueva York, EE.UU. CASCADAS DE SEÑALIZACIÓN QUE PROMUEVEN EL MOVIMIENTO MEDIADO POR ACTINA Y LA PROPAGACIÓN DEL VIRUS VACCINIA DE Alvarez Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, UNSAM-CONICET, Argentina. Los poxvirus son virus grandes, envueltos, con un genoma de DNA de doble cadena. El virus vaccinia (VACV) es el poxvirus prototipo y se utilizó como vacuna para la erradicación de la viruela en los años ’70. Durante el ciclo de replicación del virus se producen dos formas infecciosas distintas, los virus intracelulares envueltos (IEVs) y los virus extracelulares (EVs). Los IEVs propagan la infección luego de la lisis de la célula infectada al final del ciclo de replicación. Por su parte, los EVs asociados a la célula (CEVs) se propagan de una célula infectada a las células vecinas moviéndose mediante la formación de colas de actina. La polimerización de actina depende de la activación de una cascada de señalización que desemboca en el reclutamiento del factor promotor de la nucleación N-WASP y del complejo nucleador de actina ARP2/3 del huésped en la cara citosólica de la membrana plasmática. Con el objetivo de dilucidar el mecanismo molecular que controla la polimerización de actina por debajo de los CEVs se diseñó un ensayo de screening basado en la tecnología de RNA de interferencia (RNAi) para identificar factores del huésped necesarios para la propagación dependiente de actina de VACV. Utilizando este ensayo se descubrió que la propagación viral requiere de la actividad de la formina FHOD1. Las forminas constituyen una familia de proteínas de unión a actina con funciones de nucleación, elongación y capping de filamentos de actina. Utilizando microscopía de fluorescencia y video microscopía se determinó que VACV recluta y activa a FHOD1 de manera dependiente de la GTPasa pequeña Rac1 para promover el movimiento mediado por actina de los CEVs. Nuestros resultados sugieren que VACV dirige la polimerización de actina integrando las actividades de las cascadas de señalización N-WASP/ARP2/3 y Rac1/FHOD1. PAPEL DEL GEN 15 INDUCIDO POR INTERFERÓN (ISG15) EN LA INFECCIÓN DE MACRÓFAGOS POR POXVIRUS M Fernández-Escobar, B Martín-Moreno, S Guerra Departamento de Medicina Preventiva, Salud Pública y Microbiología de la Facultad de Medicina, Universidad Autónoma, Madrid, España., España. Los macrófagos son células clave en el desencadenamiento de la respuesta innata tras una infección viral. En respuesta a diversas señales ambientales dichas células polarizan a fenotipo M1 o M2. Los macrófagos en M1 se caracterizan por una gran actividad fagocítica y por la activación de moléculas proinflamatorias que promueven la defensa del huésped y la eliminación del tejido dañado tras una infección. En cambio, los macrófagos M2 representan un fenotipo que es importante en la promoción de la cicatrización de heridas, en la remodelación de tejidos, así como la resolución de la inflamación. Tras una infección viral se activa la expresión del gen 15 estimulado por interferón 15 (ISG15) que codifica para una proteína encargada de realizar una modificación postraduccional tanto en proteínas celulares como en virales. Son múltiples los trabajos en los que se demuestra el papel antiviral de ISG15. En nuestro laboratorio, recientemente hemos demostrado que ISG15 es fundamental para la correcta fagocitosis de los macrófagos, teniendo los macrófagos ISG15-/- dicha actividad radicalmente disminuida. En este estudio, hemos examinado la polarización de macrófagos tras infección por el virus vaccinia (VACV) y además hemos evaluado el papel de ISG15 en dicha polarización. Experimentos de genómica comparativa por DNA microarrays mostraron una clara Activación de Arginasa1 (marcador de M2) en macrófagos ISG15-/- infectados con VACV frente a sus homólogos WT, lo que sugieren que la ausencia de ISG15 se acompaña con un fenotipo polarización M2. Sin embargo dichos macrófagos siempre activan un perfil de citoquinas típicamente proinflamatorio típico de M1. Tras la infección de macrófagos por VACV se activa la fosforilación de AKT y dicha fosforilación desaparece en los macrófagos ISG15-/-. El tratamiento con inhibidores de dicha fosforilación reestablece el fenotipo M2 a los macrófagos ISG15+/+ comportándose entonces de manera similar a los ISG15-/- lo que sugiere que la polarización de los macrófagos se regula por fosforilación de AKT de manera ISG15 dependiente. En conclusión, nuestros resultados demuestran la polarización dinámica de los macrófagos inducidos por VACV y sugieren que ISG15 modula la polarización a M1 / M2. Estos datos indican cómo las modificaciones posttraduccionales, controlan procesos con gran importancia biomédica, como infecciones virales y los procesos inflamatorios asociados a menudo con ellos. MODIFICACIONES EN LA CELULA HOSPEDADORA DURANTE LA SALIDA DE LOS ALFAVIRUS MG Martinez1, EL Snapp2 3, GS Perumal4, FP Macaluso4, MC Kielian1 1 Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY 10461, USA, Estados Unidos. 2 Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY 10461, USA, Estados Unidos. 3 Gruss Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY 10461, USA, Estados Unidos. 4 Analytical Imaging Facility, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY 10461, USA, Estados Unidos. Dentro del género de los alfavirus se encuentran importantes especies patógenas para humanos como el virus Chikungunya y los alfavirus encefalíticos. Para la mayoría de estos virus no existen vacunas o tratamientos antivirales. Los alfavirus son virus envueltos cuyo genoma es ARN de polaridad positiva contenido en una nucleocápside interna rodeada por una membrana lipídica derivada de la célula hospedadora que contiene las glicoproteínas virales trans-membrana E2 y E1. Los alfavirus brotan de la membrana plasmática (MP), pero se sabe muy poco sobre el proceso y la dinámica de la salida de estos virus. Muchos interrogantes sobre el proceso de salida de estos virus pueden ser 12 Libro de resúmenes abordados para su estudio utilizando diferentes técnicas de microscopía. Con este objetivo construimos y caracterizamos distintas variantes del alfavirus sindbis (SINV) cuyas glicoproteínas de membrana E2 se encuentran fusionadas a distintas proteínas fluorescentes y las utilizamos para caracterizar la salida del virus de la célula hospedadora por microscopía, usando una combinación de microscopía del fluorescencia de reflexión interna total, microscopía confocal y microscopia de correlación de luz y electrónica (CLEM). Estudios iniciales mostraron que durante la infección la glicoproteína E2 se acumula en parches en la MP y en extensiones similares a filopodios. Ambas estructuras enriquecidas en E2 contienen todas las proteínas estructurales de los alfavirus, colocalizan con estructuras de virus brotando observadas por CLEM y están reducidas durante la infección con un virus mutante que es deficiente en salida. Asimismo, la infección viral induce una dramática reorganización del citoesqueleto de la célula hospedadora: las fibras de estrés de actina se desarman, las adhesiones focales y el centro de organización de microtúbulos se desorganizan. En conjunto con estos re-arreglos del citoesqueleto, la infección viral induce al menos dos tipos de extensiones, definidas en este trabajo en base a su contenido de tubulina. Las extensiones que no contienen tubulina son cortas, completamente ocupadas por partículas virales observadas por CLEM y excluyen un marcador de membrana de difusión libre. Esta exclusión es dependiente de la interacción de la glicoproteína E2 con la proteína de cápside, la cual es crítica en el proceso de salida de los alfavirus. El segundo tipo de extensiones inducidas por la infección viral contienen tubulina y actina, son mas largas, no tan numerosas, parecen mediar el transporte de partículas de célula a célula y su número se encuentra reducido en células infectadas con el virus mutante deficiente en salida. Nuestros estudios respaldan un modelo en el cual la salida de los alfavirus ocurre en sitios especializados de la MP e induce importantes modificaciones del citoesqueleto. El mecanismo a través del cual la infección viral señaliza e induce estos re-arreglos en la célula huésped está siendo actualmente estudiado en nuestro laboratorio. Miércoles 24 de junio Sala A (Salón Pigalle - 2º piso) 09:45 – 11:15 hs. MESA REDONDA 3: BIOTECNOLOGÍA Y VIROLOGÍA Coordinadores: Mariano Belaich. Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes, Quilmes, Argentina. Viviana Parreño. Instituto de Virología, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Castelar, Argentina. génica es una modalidad terapéutica muy atractiva para el cáncer que puede emplearse sola o combinada con estrategias conocidas como quimioterapia, radioterapia y/o inmunoterapia. Los vectores adenovirales han sido empleados extensamente en el ámbito clínico demostrando que son vectores seguros, inclusive tras su administración sistémica. El campo que ha tenido mayor desarrollo es el de los adenovirus replicativos selectivos (virus oncoliticos) y, en particular, aquellos que expresan genes inmunoestimuladores (por ej. GM-CSF). Sin embargo, la terapia génica con adenovirus se enfrenta con muchas dificultades tanto a nivel preclínico (falta de modelos experimentales adecuados) como clínico (dificultades de tipo regulatorias). La posibilidad de combinar la terapia génica adenoviral con quimio/radioterapia no solo permite disminuir la toxicidad de estas terapias sino que también pueden actuar de manera sinérgica para la obtención de respuestas antitumorales. Es razonable pensar que la terapia génica con vectores oncolíticos pueda tener un lugar en un enfoque terapéutico multimodal para el cáncer. VECTORES VIRALES PARA SALMONIDOS M Cortez-San Martín Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Biotecnología Acuícola (CBA), Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile, Chile. En las últimas décadas la salmonicultura se ha desarrollado hasta convertirse en una de las principales industrias de producción animal. Noruega y Chile encabezan la producción seguido de países como Escocia, Irlanda, Reino Unido, Dinamarca, Canadá y Australia. A pesar de los grandes avances logrados en optimizar la producción, hoy en día la industria se ve amenazada por los constantes brotes infecciosos y por la emergencia de agentes patógenos desconocidos. Lo anterior se suma al desconocimiento de la respuesta inmune y la ineficacia de los tratamientos convencionales aplicados a los peces, agravando la situación que hoy en día se vive a nivel mundial en este rubro. La gran mayoría de avances biotecnológicos logrados hasta la fecha se basan en la experiencia obtenida en estudio de patologías en humanos o mamíferos siendo difíciles de aplicar a las condiciones de cultivo de salmónidos que incluyen bajas temperaturas y elevada susceptibilidad al estrés de los peces. El objetivo de este estudio fue desarrollar un novedoso vector viral para salmónidos basado en la utilización de la genética reversa del virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV) que nuestro grupo implementó recientemente. La modificación genética realizada al virus ISA, permitió la incorporación en el genoma viral de la secuencia que codifica para la proteína VP2 del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV). Los análisis mostraron que el virus ISA recombinante conduce la expresión de la proteína VP2 en células ASK, logrando así la producción en células de salmón de la proteína mas inmunogénica y mas importante estructuralmente del virus IPNV. Estos resultados sugieren el virus ISA para ser utilizado en salmonicultura como vector viral, de la misma forma que en mamíferos se utilizan sistemas adenovirales o lentivirales. Panelistas: Guillermo Mazzolini. Laboratorio de Terapia Génica, Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Austral, Buenos Aires, Argentina. Marcelo Cortez‐San Martín. Centro de Biotecnología Acuícola, Universidad de Santiago de Chile, Santiago, Chile. Lorena Garaicoechea. Instituto de Virología, INTA, Castelar, Argentina. TERAPIA GÉNICA CON ADENOVIRUS PARA EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER GD Mazzolini Laboratorio de Terapia Génica. Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Austral, Argentina. A pesar de los avances que se vienen realizando en la terapia contra el cáncer como por ejemplo con el empleo de anticuerpos monoclonales inmunoestimuladores o con terapias moleculares dirigidas, para muchos tumores sigue siendo un desafío alcanzar respuestas clínicas objetivas y/o incrementar la sobrevida de los pacientes. La terapia NANOANTICUERPOS VHH CONTRA VIRUS ROTAVIRUS Y NOROVIRUS L Garaicoechea Instituto de Virología, INTA, Castelar, Argentina. GASTROENTÉRICOS: En el año 1989 se descubrió que las llamas poseen anticuerpos que carecen de las cadenas livianas y fueron denominados por ello anticuerpos de cadena pesada; la porción variable de estos anticuerpos está formada por una sola cadena polipeptídica, se llama VHH y puede clonarse y expresarse como un fragmento monoclonal recombinante que constituye el dominio natural más pequeño (15kDa o ~140 aminoácidos) capaz de reconocer un antígeno. Para producir anticuerpos VHH específicos, la estrategia más utilizada ha consistido en inmunizar una llama, luego a partir de los linfocitos circulantes amplificar la porción variable de los anticuerpos de cadena pesada, generar entonces una biblioteca que incluya todos los genes VHH amplificados y por último seleccionar los VHH deseados utilizando la tecnología de display en fagos. Los VHH son moléculas versátiles que pueden expresarse en distintas plataformas biotecnológicas; se han 13 Libro de resúmenes expresado VHH en E coli, levaduras, cloroplastos de tabaco, en el sistema de expresión de baculovirus, lactobacilos y en plantas de arroz. En el año 2008 se reportó la existencia de VHH específicos para Rotavirus, virus causante de diarrea en niños. Estos VHH fueron los primeros anticuerpos anti-VP6 de Rotavirus capaces de neutralizar in vitro la infección de cepas virales con diferentes genotipos de VP7, VP4 y VP6. Por otra parte, se ha observado que la administración oral preventiva de dichos clones previenieron la ocurrencia de diarrea en cerdos gnotobióticos y disminuyeron el porcentaje de ratones con diarrea y la excreción viral en el modelo de ratón lactante infectado con RVA. Estas moléculas anti VP6 poseen la capacidad de desarmar las partículas doble cápside de RVA y podría estar relacionada indirectamente con la propiedad neutralizante de las moléculas. Estos VHH también son ideales para desarrollar un método diagnóstico ya que se encuentran dirigidos a la proteína VP6, que es la mayoritaria en el virión y la más inmunogénica. Por su parte, en el año 2012 se desarrollaron nanoanticuerpos VHH específicos para Norovirus, otro patógeno viral gastroentérico. Se logró obtener un panel de 30 anticuerpos VHH: específicos para los genogrupos I y II y un VHH con actividad cruzada para ambos genogrupos de Norovirus que podría utilizarse en el desarrollo de un método diagnóstico. Algunos de los VHH lograron bloquear la unión de las VLPs a antígenos de grupo histo-sanguíneo (HBGA), por lo que podrían neutralizar la infección viral ya que se postula que los Norovirus se unen a carbohidratos HBGA en etapas tempranas de la infección. Además, recientemente se ha reportado un VHH antiNorovirus capaz de agregar y desestabilizar la estructura de la VLP. Esta propiedad de desarmar cápsides virales fue observada en un VHH anti Norovirus así como también en los VHH anti VP6 de Rotavirus y le otorga a estas pequeñas moléculas propiedades promisorias para el desarrollo de terapias antivirales contra estos patógenos. 11:45 – 13:15 hs. MESA REDONDA 4: ASPECTOS INMUNOLÓGICOS Y MECANISMOS DE EVASIÓN A LA RESPUESTA INMUNE DEL HOSPEDADOR Coordinadores: Ana Ceballos. INBIRS, UBA‐CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Alejandra Capozzo. Instituto de Virología, INTA, Castelar, Argentina. Panelistas: Frank Rösl. Instituto Alemán de Investigación sobre Cáncer (DKFZ), Heidelberg, Alemania. Gabriela Turk. INBIRS, UBA‐CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Lourdes Arruvito. Instituto de Inmunología, Genética y Metabolismo, Hospital de Clínicas "José de San Martín", UBA, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. HUMAN PAPILLOMAVIRUS INFECTION AND EVASION MECHANISMS OF INNATE RESPONSE B Rincon Orozco, M Niebler, F Rösl German Cancer Research Center, Research Program Infection & Cancer, Alemania. Our research is aimed at understanding how infection with oncogenic viruses modulates the immune system that critically contributes to neoplastic development and progress. Pathogen-induced inflammation represents highly interconnected processes within a cellular network. The modulation of inflammatory processes in HPV-associated malignancies is complex since it involves responses capable of allowing viral persistence inducing progression of associated neoplastic lesions due to modulation of the tumor microenvironment. The activation of the innate defense represents the first response of the immune system against HPV infection and is essential to initiate a specific and effective long-lasting adaptive immunity. Here we have unraveled some pathways of immune escape during HPV carcinogenesis, showing how the virus circumvent the innate immune response of its host: this can be mediated by counteracting interferons type I expression such as the keratinocytes specific interferon kappa (IFN-κ) or by degrading IL-1β via the proteasome, thereby knocking-out one key player in the activation of both innate and adaptive immunity. In my present talk, I will discuss different strategies how HPV can reprogram its target cell to warrant a persistent infection, a prerequisite on the way towards cervical cancer. RESPUESTA INMUNE ESPECÍFICA EN LA INFECCIÓN AGUDA POR HIV‐1 Y SU ASOCIACIÓN CON PROGRESIÓN A LA ENFERMEDAD. G Turk Instituto Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA INBIRS, Argentina. La respuesta T CD8+ juega un rol central en el control de la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Sin embargo aún sigue siendo clave la identificación y compresión de los correlatos inmunes de protección que mejor correlacionan con el control viral. En este sentido, la etapa aguda de la infección representa un escenario propicio para dichos estudios. El objetivo de este trabajo fue analizar la especificidad, funcionalidad y el fenotipo de la respuesta T CD8+ en una cohorte de individuos recientemente infectados y su asociación con el control de la replicación viral y de la progresión a la enfermedad. Los resultados indicaron que, a pesar que Nef dominó la respuesta anti-HIV durante la infección aguda/temprana, la aparición temprana de una alta proporción de células T anti-Gag se correlacionó con una menor progresión. Las células T CD8+ HIV-específicas polifuncionales fueron detectadas a tiempos tempranos post-infección pero no se asociaron con control viral. Por el contrario, se observó que los sujetos que presentaban células T CD8+ con una mayor capacidad de mediar actividad antiviral (VIA) en la muestra basal, presentaron set points inmunes más elevados. Además, los niveles de VIA se correlacionaron con la magnitud de la respuesta T CD8+ anti-Gag. A su vez, las células T CD8+ Gag-específicas mostraron una mayor capacidad de mediar la lisis de células infectadas (mayor capacidad de degranulación) y de producir, de manera simultánea, INF-γ lo cual les conferiría una ventaja para ejercer su actividad antiviral. Por otro lado, se observó que la distribución de las subpoblaciones de memoria de las células T CD8+, tanto totales como de las HIV-específicas, se encuentra sesgada en los individuos recientemente infectados, pero no alcanza los niveles dramáticos observados en los sujetos Crónicos. El análisis de la expresión de PD-1, tanto en las células T CD8+ totales como HIVespecíficas, reveló no sólo una asociación con progresión a la enfermedad si no también con el perfil de memoria de la población celular T CD8+. Notablemente, se obtuvieron correlaciones directas entre los niveles de VIA y la proporción de células T CD8+ con fenotipo terminal, tanto en la muestra basal como a los 12 meses post-infección. En consecuencia, se estableció una relación entre la preservación de la ruta de diferenciación de las células T CD8+ y la funcionalidad de las mismas. El poder descifrar la relación que existe entre las características que definen a las células T CD8+ con los niveles de activación inmune, el control viral y la progresión a la enfermedad en los distintos estadíos de la infección es primordial para profundizar en el conocimiento que se tiene de la inmunopatogénesis del virus. Además, esta información es de suma importancia para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas frente al HIV así como en el diseño y posterior testeo de vacunas que promuevan una respuesta beneficiosa. CÉLULAS T REGULATORIAS EN LA INFECCIÓN PEDIÁTRICA POR VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO L Arruvito Instituto de Inmunología, Genética y Metabolismo (INIGEM). UBACONICET. Hospital de Clínicas “José de San Martín”, Buenos Aires, Argentina. El virus respiratorio sincicial (VSR) es la causa más importante de bronquiolitis infantil y un patógeno respiratorio frecuente en ancianos e inmunodeprimidos. El 49-70% de los niños hospitalizados debido a infección por VSR son niños menores de seis meses, indicando que la edad muy temprana representa el factor de riesgo más importante para el desarrollo de infección severa. Una pregunta central, relativa a la infección pediátrica por VSR, refiere a los motivos por los cuales 14 Libro de resúmenes mientras que la mayoría de los niños que padecen infección por VSR sufren una enfermedad leve, del 2 al 5% de ellos padecen un cuadro severo. ¿Cuáles son las causas que explican este comportamiento disímil? Un segundo interrogante guarda relación con el manejo clínico de los niños infectados: ¿qué marcadores biológicos permitirían predecir el curso clínico de la infección? La resolución de estos dos interrogantes afronta un principal escollo: es muy poco lo que conocemos respecto de la etiopatogenia de la infección por VSR. La mayoría de las observaciones han sido realizadas en modelos murinos, que no reflejan adecuadamente el curso de la infección pediátrica por VSR. Sin embargo, existe consenso en un punto: la respuesta inmune contribuye, no solo a la resolución de la infección, sino también a la inducción del daño en la vía aérea inferior. Estudios realizados en modelos murinos han indicado que las células T regulatorias FOXP3+ (Tregs) juegan un papel protector en el curso de la infección, al prevenir efectos deletéreos mediados por la respuesta inmune sobre la vía aérea inferior. Observaciones realizadas recientemente por nuestro grupo han revelado que la infección severa por VSR en niños menores de 1 año se asocia a una notoria depleción de células Tregs en sangre periférica. En relación a esta observación, cabe destacar dos aspectos. En primer lugar, la magnitud de la depleción: los niños que requirieron internación hospitalaria mostraron niveles de depleción mayores al 80%. Por otra parte, es interesante destacar observaciones realizadas en otros estudios, indicando que la infección aguda por el virus influenza A o el virus del dengue, en individuos adultos, no se asocia a depleción periférica de células Tregs, por el contrario, se asocia a una incrementada frecuencia de las mismas. Estas observaciones contrastantes podrían explicarse ya sea por un comportamiento singular de las células Tregs en el curso de la infección por VSR, o bien por propiedades particulares de las células Tregs en el transcurso de los primeros meses de vida. Nuestras observaciones plantean, centralmente, dos nuevos interrogantes. a) ¿cuáles son los mecanismos subyacentes a la depleción de células Tregs en el transcurso de la infección pediátrica por VSR? y b) ¿podría resultar un parámetro predictivo de utilidad la determinación del nivel de células Tregs en sangre periférica? En la actualidad estamos abocados a responder a estos dos interrogantes. Jueves 25 de junio Sala A (Salón Pigalle - 2º piso) 09:45 – 11:15 hs. MESA REDONDA 5: MECANISMOS DE PATOGENIA PATOGENIA DE LA INFECCIÓN CRÓNICA POR EL VIRUS DE HEPATITIS C P Valva Laboratorio de Biología Molecular, División Patología, Hospital de Niños Ricardo Gutiérrez, Argentina. La infección por HCV es una de las principales causas de enfermedad hepática crónica caracterizada por daño celular, inflamación y fibrosis que puede progresar a cirrosis y/o hepatocarcinoma. Hasta el momento no se han definido claramente los mecanismos moleculares involucrados en el daño hepático, pero tanto las reacciones mediadas por el sistema inmunitario como el efecto directo del virus participan en la patogénesis. Se postula que HCV gobierna la lesión hepática mediante la regulación de la apoptosis, la esteatogénesis, la activación de las células estrelladas hepáticas (CE) y la respuesta citotóxica. Se ha demostrado que la respuesta inmunitaria no efectiva durante la infección aguda es la principal causa del desarrollo de hepatitis crónica. El microambiente inmunitario hepático está compuesto por diversos tipos celulares (células de Kupffer, células dendríticas, NK, NKT y LTgd) que serían importantes en la patogenia. En la infección crónica los componentes tanto de la inmunidad innata como de la inmunidad adaptativa son refractarios a la activación y adquieren nuevas funciones que serían responsables del daño. Entre las posibles causas de la falla en la respuesta inmunitaria adecuada se han propuesto: 1) la presencia de mutantes de escape de HCV; 2) la falla en la presentación antigénica; 3) el efecto inmunosupresor de ciertas proteínas virales, 4) los defectos en la maduración de los LT; 5) la supresión de la respuesta por linfocitos T reguladores; y 6) el ambiente hepático tolerogénico. La evolución natural de la infección cuando el virus se adquiere en etapas tempranas de la vida y su progresión a largo plazo es aún tema de debate. La severidad de la enfermedad hepática varía ampliamente tanto en niños como en adultos; sin embargo, desde el punto de vista histológico, la infección crónica por HCV sería más leve en niños. Nuestros estudios sobre la patogenia de la infección crónica en niños y adultos mostraron, mediante la cuantificación de hepatocitos infectados, células en apoptosis y del infiltrado, que el virus, la apoptosis y la respuesta inmunitaria están implicados en la patogenia de la infección crónica por HCV. Sin embargo, existen diferencias sustanciales entre los grupos respecto del papel que cada uno de los componentes tiene en el escenario final. En niños el HCV no tendría un efecto directo sobre los parámetros histológicos, sino que participaría del daño hepático a través de la inducción de la apoptosis, que a su vez contribuiría al desarrollo de la fibrosis. En cambio en adultos el predominio de hepatocitos no infectados en apoptosis, sumado a la asociación de ésta el infiltrado inflamatorio y la severidad de la hepatitis podría indicar que la apoptosis no está directamente relacionada con el virus sino que sería consecuencia de la respuesta local generada por el sistema inmunitario ante la infección viral. Coordinadores: Paola Chabay. Laboratorio de Biología Molecular, División Patología, Hospital de Niños “Ricardo Gutiérrez”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Ricardo Gómez. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular, CONICET, Universidad Nacional de La Plata (UNLP), La Plata, Argentina. Panelistas: Pamela Valva. Laboratorio de Biología Molecular, División Patología, Hospital de Niños “Ricardo Gutiérrez”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Soledad Negrotto. Instituto de Medicina Experimental ‐ CONICET ‐ Academia Nacional de Medicina, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Daniela Gardiol. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario, CONICET, Universidad Nacional de Rosario, Rosario, Argentina. ROL DE LAS PLAQUETAS EN LA PATOGÉNESIS DE LAS INFECCIONES VIRALES S Negrotto, M Schattner Laboratorio de Trombosis Experimental. Instituto de Medicina Experimental-CONICET-Academia Nacional de Medicina, Buenos Aires, Argentina. Las plaquetas son elementos claves en la hemostasia y la trombosis. Sin embargo numerosas evidencias básicas y clínicas han demostrado que también participan en el desarrollo y resolución de la respuesta inflamatoria, en la inmunidad innata y en la defensa del huésped contra patógenos. La interacción entre virus y plaquetas se comenzó a estudiar hace más de cincuenta años con el fin dilucidar los mecanismos asociados a la disminución en el recuento plaquetario (trombocitopenia) inducido por infecciones virales. Hoy sabemos que los mecanismos involucrados en la trombocitopenia mediada por virus son varios incluyendo destrucción plaquetaria inmunológica, activación y consumo inapropiado o alteración de la megacariopoyesis. Si bien la trombocitopenia es una complicación frecuente en varias infecciones virales, aún no está esclarecido si este mecanismo es una estrategia viral para evadir el sistema inmune o si es un mecanismo gatillado para proteger al hospedador. Los virus pueden unirse a receptores específicos de las plaqueta produciendo alteraciones tanto en la plaqueta como en el agresor. La interacción virus-plaquetas generalmente dispara la activación 15 Libro de resúmenes plaquetaria y esto no solo incrementa el clearence plaquetario sino que además colabora con la eliminación de partículas virales. Por otro lado, durante la activación plaquetaria tiene lugar la liberación del contenido granular y esto constituye un mecanismo de defensa ya que dichos gránulos poseen una gran variedad de moléculas incluyendo kinocidinas y proteínas antimicrobianas importantes para la defensa del hospedador. Por último, la interacción plaqueta-virus promueve la interacción con los leucocitos e induce la maduración y aumento de su función. Sin embargo, además de estos efectos beneficiosos, las plaquetas también pueden tener efectos deletéreos en la patogénesis de ciertas infecciones virales. Por ejemplo, los virus pueden ser internalizados por las plaquetas resultando en una protección contra el sistema inmune favoreciendo la diseminación viral. Además, la liberación de quemoquinas por parte de los gránulos alfa plaquetarios puede facilitar la atracción de células blanco para la infección viral. En conclusión, las plaquetas y las moléculas que liberan desde sus gránulos pueden tener tanto efectos beneficiosos como deletéreos sobre el hospedador convirtiendo a las plaquetas en un arma de doble filo durante las infecciones virales. Sin embargo, aún se necesitan más estudios para comprender la relevancia fisiopatológica de las plaquetas en las infecciones virales para, de este modo, predecir el efecto de las plaquetas y su posible inhibición en el transcurso de una infección viral. MECANISMOS CONSERVADOS DE PATOGÉNESIS VIRAL: ROL DE LOS MOTIVOS DE INTERACCIÓN PROTEICA PDZ. D Gardiol1, M Bugnon Valdano1, F Marziali1, G Barbieri1, F Facciuto1, E Boccardo2, AL Cavatorta1 1 Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario-CONICET, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, Argentina, Argentina. 2 Lab. Oncovirología, ICB, Ubuversidad de San Pablo, San Pablo, Brasil, Brasil. Los dominios PDZ (PSD95, DLG1, ZO-1) son módulos de interacción proteica muy abundantes, que reconocen secuencias específicas de sus partners, denominadas sitios de unión a PDZ. Dichos dominios están presentes en proteínas que regulan la polaridad celular, las uniones intercelulares y los mecanismos de transmisión de señales. Proteínas derivadas de diferentes virus pueden interaccionar e interferir con la función de proteínas PDZ, resultando en alteraciones funcionales importantes en diversos procesos infecciosos. Así, emerge un importante tema para el entendimiento de la patogénesis viral. En nuestro grupo nos hemos focalizado, en primer lugar, en el estudio de los mecanismos de oncogénesis asociados a infecciones por el virus papiloma humano (VPH), y desde el punto de vista de la disrupción de la polaridad. Esto último teniendo en cuenta que las oncoproteínas E6 de VPH de alto riesgo interaccionan con proteínas PDZ involucradas en los complejos que mantienen la polaridad apicobasal. Así, hemos identificado algunos de estos blancos celulares, como la proteína de uniones adherentes Discs large (DLG1) y la proteína de uniones oclusivas Partitioning defective 3 (PAR3). A través del uso de distintas herramientas metodológicas, como el cultivo celular tradicional, cultivos histotípicos y cultivos organotípicos tipo raft, pudimos entender las consecuencias de dichas interacciones, E6-proteína PDZ, en cuanto a la interferencia con la polaridad celular y los mecanismos de transducción de señales. Dado que la pérdida de la polaridad celular es una característica de los mecanismos carcinogénicos, los datos obtenidos han contribuido al conocimiento de los procesos de progresión maligna en general, y en particular aquellos asociados a VPH. Estamos extendiendo estos estudios a proteínas derivadas de otros virus tumorales, como el virus linfotrópico de células T humanas tipo 1, así como a proteínas de virus de interés regional que no se asocian a procesos cancerígenos, y que presentan la capacidad de interaccionar con proteínas celulares que poseen dominios PDZ. El entendimiento de la importancia de la presencia de un sitio de interacción a proteínas PDZ en distintas proteínas virales, sus interacciones específicas, y su participación en mecanismos comunes de los procesos de patogénesis viral, podría servir de base para el desarrollo de nuevas herramientas diagnósticas y terapéuticas. 11:45 – 13:15 hs. MESA REDONDA 6: VIROLOGÍA AMBIENTAL Y ALIMENTARIA Coordinadores: Célia Barardi. Laboratorio de Virología Aplicada, Departamento de Microbiología, Inmunología y Parasitología, Centro de Ciencias Biológicas, Universidad Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Brasil. Viviana Mbayed. Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Panelistas: Célia Barardi. Laboratorio de Virología Aplicada, Departamento de Microbiología, Inmunología y Parasitología, Centro de Ciencias Biológicas, Universidad Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Brasil. Andrea Quiberoni. Instituto de Lactología Industrial ‐ INLAIN (Universidad Nacional del Litoral‐CONICET), Santa Fe, Argentina. Rodney Colina. Laboratorio de Virología Molecular, Regional Norte, Universidad de la República, Salto, Uruguay. ADENOVIRUS SURVIVAL IN WATER MATRICES AND OYSTERS G Fongaro, LA Totaro Garcia, M Rangel Pilotto, V Moresco, CR Monte Barardi Laboratório de Virologia Aplicada, Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, Brasil. Among the viral pathogens that contaminate aquatic matrices, the adenoviruses are considered one of the most resistant and prevalent. The present study aimed to evaluate the adenovirus behavior, in the following matrices: surface freshwater, seawater, reuse water and oysters. I) Surface Water: thermal and temporal stability of human adenovirus-2 (HAdV-2) was studied regarding sample storage conditions. The stability was evaluated over 230 days by cell-culture integrated with RT-qPCR (ICC-RT-qPCR). It was found that the viral stability decreased with increasing temperatures (-80>-20>4>22°C). The time required to reach one log reduction in viral titers (T90) was similar among all the storage temperatures. As conclusion, the temperature plays a key role in viral stability indicating that, under laboratory storage conditions, surface freshwater samples should be kept at 4°C and at -80°C for short and long-term periods, respectively. II) Seawater: Human recombinant adenovirus (rAdV-GFP) expressing Green Fluorescent Protein (GFP) was used as model to study adenovirus disinfection in seawater inside mollusks depuration tanks with and without UV light by fluorescence microscopy. As result, rAdV-GFP declined 99.99% after 24h and 48h with and without UV treatment respectively, showing that the depuration tanks were effective to inactivate adenoviruses in seawater and the UV disinfection treatment accelerated the process. III) Oysters: The stability and depuration of (HAdV-2) was evaluated in oysters Crassostrea gigas using plaque assay. The viral depuration rate was measured during up to 120h using depuration tanks supplied or not with UV light as disinfection tool. After 24h of depuration with UV and 48h without UV, no infectious viruses were detected. The depuration tanks were effective to inactivate HAdV-2 and UV disinfection speeds the depuration. IV) Reuse water: Adenovirus (human and animal) settling and survival profile was evaluated in swine effluent from aerobic reactor (AR) and settling tank (ST) for reuse water purposes. The experiment was conducted in real-scale (porcine adenovirus (PAdV) as model) by qPCR methods and in laboratory-scale (HAdV-2 as model) by ICC-RT-qPCR. In real-scale the PAdV removal was efficient after ST application, reducing 99.9% (3log10). In laboratory-scale HAdV-2 settling in ST was positively correlated with the solid particles settling (r² = 0.995 p<0.05), requiring 1.8 h to settle 90% (r²= 0.87). HAdV-2 post settling was evaluated in sludge from process and not presented decay trend up to 120 h. Adenovirus was removed in ST and was up taken to the sludge, surviving for longer periods. In general the data warn of the need of surveillance and implementation of efficient methods for removing 16 Libro de resúmenes enteric viruses from water and foods matrices and suggest the use of adenovirus as viral biomarker. LOS BACTERIOFAGOS EN LA INDUSTRIA FERMENTATIVA DE ALIMENTOS: AMIGOS Y ENEMIGOS A Quiberoni Instituto de Lactología Industrial (INLAIN, UNL-CONICET), Facultad de Ingeniería Química, Santiago del Estero 2829, 3000 Santa Fe, Argentina. E-mail: [email protected], Argentina. Desde que fueron descubiertos en el año 1915, y gracias a su versatilidad, los bacteriofagos se han convertido en una herramienta muy apreciada para una gran diversidad de campos de investigación. Como predadores naturales de bacterias patógenas y benéficas, desempeñan el rol de ‘amigos’ o ‘enemigos’, respectivamente. Durante los primeros años, fueron utilizados como alternativa para paliar las persistentes infecciones bacterianas que diezmaban las poblaciones mundiales. Una veintena de años más tarde, surgen como los enemigos de las bacterias lácticas que se usan en la industria para la elaboración de productos lácteos fermentados. Desafortunadamente, las fagos no pueden erradicarse de los ambientes lácteos y, debido a esta ubicuidad, los esfuerzos de tecnólogos y científicos se resignan y dirigen a su control en lugar de su eliminación. Durante los años ’80, y gracias a la vertiginosa evolución de la biología molecular, los fagos de bacterias lácticas se convierten en la herramienta que permitió diseñar una extraordinaria variedad de cultivos lácticos fagorresistentes. Sin embargo, y debido a las fuertes restricciones reglamentarias que aún rigen en el mundo, estas bacterias ‘ingenierizadas’ no fueron más allá de las fabulosas colecciones de cultivos de los más famosos centros de investigación mundiales. A comienzos del siglo XXI, y con el notable auge de las bacterias probióticas, surgen los primeros casos de infecciones fágicas sobre estos valiosísimos cultivos que no tienen reemplazantes. Aún hoy, estos episodios constituyen un enorme detrimento económico para la industria láctea, que por el momento no cuenta con ninguna alternativa tecnológica que le permita hacer frente a los ataques fágicos. Actualmente, y debido a la preocupante antibiótico-multirresistencia demostrada por numerosas bacterias patógenas, resurge el potencial de los fagos como alternativa natural para hacerles frente. Es así que, durante los últimos años se han multiplicado las investigaciones dirigidas a optimizar el empleo de los fagos para el biocontrol de bacterias patógenas durante el procesamiento/manipulación de alimentos, y para la prevención/tratamiento de ciertas infecciones. Finalmente, y como herramienta que recién comienza a ser explorada, el estudio de los CRISPRs (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ya cuenta con resultados aplicados en la industria fermentativa de alimentos: cultivos lácticos fagorresistentes diseñados ‘a medida’, a través de la inducción natural de inmunidad de las bacterias, cuando éstas se enfrentan a los fagos. Hoy se sabe que los bacteriofagos constituyen el grupo de entidades biológicas más abundantes sobre el planeta, superando en un orden de magnitud a las bacterias. Por esta razón, constituyen un ‘pool’ de agentes biológicos con una potencialidad inimaginable e inexplorada que ha contribuido, desde los inicios de la vida, a regular naturalmente las poblaciones bacterianas. serio riesgo de salud a nivel global. El objetivo de éste estudio fue determinar la diversidad genética de Rotavirus A (RVA), Norovirus Genogrupos I y II (NoV GI/GII), y Astrovirus Humanos (HAstV), en muestras de aguas residuales de seis ciudades del litoral oeste y noreste del Uruguay, limítrofes con Argentina y Brasil. Se colectaron 116 muestras (marzo 2011/ abril de 2013): a) Litoral oeste, ciudades de Bella Unión, Salto, Paysandú y Fray Bentos (n=96), colectadas quincenalmente (marzo 2011/ febrero 2012); b) Región Noreste, ciudades de Melo y Treinta y Tres (n=20), colectadas cada dos meses (setiembre 2011/ abril 2013). La concentración viral se realizó mediante el método de ultracentrifugación. La extracción del ARN viral, mediante el sistema comercial Qiagen Viral RNA®, y la síntesis del ADN copia (RT) con la enzima SuperScript II Invitrogen ®. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fueron las siguientes: a) NoV, semi-nested región parcial de la cápside; b) HAstV, región ORF2; y c) RVA, semi-nested multiplex genes VP4 y VP7 (WHO). Los productos de PCR fueron secuenciados bi-direccionalmente y analizados (MEGA 6). Un total de 53% de las muestras fueron positivas para RVA (n = 61); los genotipos P y/o G fueron determinados mediante análisis filogenético para el 61% de las muestras positivas (n= 37) y fueron los siguientes: G1P[8] (n = 1), G2P[4] (n = 4), G3P[8] (n = 1), G3P[3] (n = 1), G12P[8] (n = 1), G1P[X] (n = 1), G2P[X] (n = 10), G3P[X] (n = 3), G12P[X] (n = 1), GXP[3] (n = 1) y GXP[8] (n = 13). Se observó marcada estacionalidad en invierno. NoV fue detectado en todas las ciudades estudiadas: 72% (n=84). 9 pertenecieron a GI, 48 a GII y 27 fueron positivas para ambos genogrupos. Es de destacar la elevada diversidad genética identificada: GII.2 (n=13), GII.4 (n=13), GII.13 (n=4), GII.1 (n=3), GII.6 (n=3), GII.3 (n=1), GII.17 (n=1), GI.1 (n=5), GI.4 (n=5), GI.8 (n=4), GI.3 (n=1), GI.5 (n=1) y GI.6 (n=1). Se observó un completo re-emplazo de las variantes GII.4 New Orleans (2009) por GII.4 Sydney (2012), en 2012. No fue observada estacionalidad en la circulación de NoV. HAstV fue detectado en 49 % (n=57) de las muestras y 75 % (n=43) fueron secuenciadas. 54 % (n=31) pertenecieron al genotipo 1 (linaje 1a); 19 % (n=11) al genotipo 2 (9 al linaje 2d y 2 al linaje 2c) y 2% (n=1) al genotipo 5. El linaje 1a circuló durante todo el período, el 2d en invierno y el 2c solamente en la ciudad de Salto, dónde se observó la mayor diversidad genética, debido a que es un sitio turístico con arribo de personas de distintos países o regiones del Uruguay. Éste estudio, constituye el primer reporte en Uruguay, que ha permitido establecer la diversidad genética viral en aguas residuales que son vertidas a ríos de gran importancia y que pueden generar un riesgo para las distintas poblaciones que allí conviven. 16:30 – 18:00 hs. MESA REDONDA 7: ANTIVIRALES Coordinadores: Viviana Castilla. Laboratorio de Virología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Federico Di Lello, Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Panelistas: DIVERSIDAD GENETICA DE VIRUS GASTROENTERICOS EN MUESTRAS AMBIENTALES COLECTADAS EN REGIONES LIMITROFES Y TURISTICAS DEL URUGUAY R Colina1, M Victoria1, F López Tort1, A Lizasoain1, L Maya1, M Castells1, M Miagostovich2, JP Leite2, J Cristina4, M Berois3 1 Laboratorio de Virología Molecular. Regional Norte – CENUR Noroeste, Universidad de la República. Gral. Rivera 1350. Salto, 50000, Uruguay. 2 Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental. Instituto Oswaldo Cruz. Fundação Oswaldo Cruz. Av. Brasil 4365, Rio de Janeiro, 21040360, Brasil. 3 Sección Virología, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Iguá 4225, 11400, Montevideo, Uruguay. 4 Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Iguá 4225, 11400, Montevideo, Uruguay. Adrián Gadano. Servicio de Hepatología, Hospital Italiano de Buenos Aires, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Lorena Itatí Ibañez. Instituto de Ciencia y Tecnología “Dr. César Milstein”, CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Claudia S. Sepúlveda. Laboratorio de Virología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA IQUIBICEN, CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. La transmisión de virus entéricos entre poblaciones humanas a través de aguas superficiales contaminadas con aguas residuales constituye un Todos los pacientes con hepatitis crónica por HCV, naïve de tratamiento, no respondedores a un tratamiento previo, que quieran NUEVAS ESTRATEGIAS ANTIVIRALES CONTRA EL VIRUS DE LA HEPATITIS C AC Gadano Hospital Italiano de Buenos Aires, Argentina. 17 Libro de resúmenes ser tratados y no tengan contraindicaciones, pueden ser considerados candidatos a recibir tratamiento. El tratamiento debe considerarse de alta prioridad en los pacientes con alto riesgo de complicaciones severas: en los pacientes con fibrosis avanzada (F3–F4), en receptores de un trasplante hepático, y en pacientes que presenten complicaciones extrahepáticas graves asociadas al HCV. Pueden también considerarse prioritario, y está justificado, el tratamiento en los pacientes con fibrosis moderada (F2), coinfección con HBV o HIV o que presenten otras hepatopatías asociadas. Los pacientes infectados por HCV-2 y 3 deben recibir tratamiento con Peg-interferón más ribavirina (PEG-IFN+RBV) durante 24 a 48 semanas según la respuesta virológica durante el tratamiento. Este esquema se asocia con una tasa de respuesta viral sostenida (RVS) que oscila entre el 69% y el 80%. Los pacientes infectados por HCV-1 reciben tratamiento con PEG-IFN+RBV combinado con los inhibidores de proteasa (IP) de primera generación, boceprevir (BOC) o telaprevir (TVR). Estos tratamientos con triple terapia se asocian con una tasa de RVS del 65% al 75%, superior a la obtenida previamente con la terapia doble (PEG-IFN+RBV) en pacientes infectados por HCV-1 que era del 40% al 50%. El problema de la terapia triple, es la mala tolerancia por los múltiples efectos adversos que presentan estas drogas. La aparición de nuevos tratamientos, más efectivos y mejor tolerados, hará que en un futuro cercano estas drogas sean paulatinamente abandonadas. En la actualidad múltiples drogas han sido aprobadas en Europa y EEUU para el tratamiento combinado de la hepatitis C: Sofosbuvir, un inhibidor análogo nucleotídico de la polimerasa; Simeprevir, inhibidor de la proteasa NS3/4A; Daclatasvir, un inhibidor de NS5A; Ledipasvir, un inhibidor de NS5A y por último la combinación de Ombitasvir (inhibidor de NS5A), Paritaprevir (inhibidor de proteasa) combinado con dosis fijas de ritonavir y Dasabuvir (inhibidor no nucleósido de la polimerasa NS5B. La utilización de estas drogas incrementará la tasa de RVS a niveles superiores a 90 % con un excelente pefil de seguridad. Se espera que estas drogas estén disponibles en nuestro país en un futuro próximo. La decisión del esquema de tratamiento a elegir va a depender de 3 factores: • Genotipo y subtipo del virus HCV del paciente • Severidad de la enfermedad hepática • Si es naïve o ha sido previamente tratado • Si es intolerante o no elegible para IFN. Estas situaciones caracterizan la no elegibilidad para IFN: – Enfermedades autoinmunes – Enfermedad hepática descompensada – Hipersensibilidad a PEG IFN – Trastorno psiquiátrico, pulmonar o cardíaco severos – Retinopatías severas – Post trasplante de riñón, corazón, pulmón – Neutropenia (neutrófilos <1500 cels/mm3), trombocitopenia (plaquetas <90.000 cels/mm3), y/o anemia (hemoglobina < 10 mg/dl). NANOANTICUERPOS, MOLÉCULAS PROMISORIAS PARA LA DETECCIÓN Y LA NEUTRALIZACIÓN DE VIRUS LI Ibañez Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein, Argentina. El sistema inmune de los vertebrados genera millones de moléculas de anticuerpos que responden de manera específica a diferentes antígenos. La alta diversidad y selectividad de los anticuerpos hace que estas moléculas constituyan excelentes herramientas para investigación, diagnóstico y terapéutica. Hasta 1989, se creía que todos los anticuerpos estaban conformados por dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas. Pero ese año se identificó un nuevo tipo de anticuerpo en sueros de camélidos que carecían de cadenas livianas y de un dominio constante de la cadena pesada. A partir de la región variable de estos anticuerpos se pueden obtener Nanoanticuerpos (NanoAcs), que hasta el momento han sido aplicados exitosamente tanto para la neutralización de virus como VIH, HBV, Influenza, RSV, Rabia, FMDV, Poliovirus, Rotavirus, entre otros; como para la detección de vaccinia, virus de Marburgo y virus Tulip X de plantas. Los NanoAcs, por su pequeño tamaño, tienden a reconocer epítopes únicos, poco accesibles. Se pueden producir fácilmente en microorganismos reduciendo notablemente los costos de producción, son muy estables a temperatura ambiente, tienen alta solubilidad en medios acuosos y pueden modificarse por ingeniería genética para producir moléculas con mayor afinidad, especificidad y sensibilidad. En la presente exposición se presentarán datos obtenidos del uso de NanoAcs para la inhibición de la infección viral provocada por virus de Influenza y Virus Sincicial Respiratorio (RSV) en modelos in vitro e in vivo. En el caso de influenza, se produjeron y caracterizaron NanoAcs contra las proteínas Hemaglutinina (HA) y Neuraminisa (NA) obtenidas de un virus subtipo H5N1. Se observó que in vitro los NanoAcs contra HA pueden inhibir la infección viral aún a dosis muy bajas, del orden picomolar. Su administración intranasal de manera profiláctica, controló de manera efectiva la replicación del virus en los pulmones de ratones y evitó la morbilidad y la mortalidad luego del desafío letal con el virus. La terapia con NanoAcs después del desafío redujo fuertemente la replicación viral y aumentó la sobrevida. Los NanoAcs contra NA demostraron inhibir efectivamente la replicación viral en sistemas in vitro. El tratamiento profiláctico in vivo protegió contra desafío letal, incluso cuando se utilizó una cepa resistente a oseltamivir, un antiviral de referencia. En el caso de RSV, se generaron NanoAcs que pudieron neutralizar RSV in vitro de manera más eficiente que palivizumab, un anticuerpo monoclonal comercializado para el tratamiento de infecciones con este virus. La administración intranasal de estas moléculas protegió contra la infección por RSV y evitó la inflamación pulmonar. El tratamiento terapéutico después de la infección viral redujo la replicación viral y la inflamación pulmonar. Por lo expuesto, los NanoAcs pueden considerarse moléculas promisorias para la prevención y el tratamiento de infecciones provocadas por diferentes virus. LA INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS DEL RNA VIRAL CON AGENTES DIRIGIDOS A ENZIMAS CELULARES COMO ESTRATEGIA ANTIVIRAL CONTRA EL VIRUS JUNÍN CS Sepúlveda Laboratorio de Virología, IQUIBICEN (UBA-CONICET), FCEyN, UBA, Argentina., Argentina. En los últimos años, la creciente emergencia de infecciones virales representa uno de los aspectos más notorios en el campo de la salud humana y animal. Ante este panorama, el desarrollo de compuestos antivirales efectivos para su uso en el ser humano es un tema que ha adquirido gran preponderancia. Sin embargo, numerosas infecciones humanas de relevancia sanitaria incluidas dentro de las llamadas infecciones emergentes, como las fiebres hemorrágicas (FH), están huérfanas de quimioterapia efectiva. Arenaviridae es la familia que contiene el mayor número de virus que causan FH. En nuestro país, el virus Junín (JUNV) es el agente causante de la FH argentina en la región agrícola de la pampa húmeda. La terapia actual contra las infecciones de arenavirus incluye el tratamiento con ribavirina, y la administración pasiva de suero de convaleciente con alto título de anticuerpos específicos, ambas terapias presentan varios efectos colaterales adversos. Como una alternativa al enfoque tradicional para el desarrollo de agentes quimioterapéuticos, en los últimos años ha comenzado a surgir con fuerza la idea de utilizar factores celulares que participan en la infección viral como potenciales blancos antivirales. Las ventajas de este abordaje se basan en la obtención de drogas de amplio espectro antiviral así como la posibilidad de evitar la aparición de la resistencia antiviral. En contraposición, esta estrategia antiviral puede resultar en mayor citotoxicidad, pero permite el uso de drogas ya utilizadas con otros fines terapéuticos de las que se conoce su perfil de seguridad. En distintos procesos de la infección con arenavirus participan numerosos componentes celulares que representan nuevos puntos posibles de ataque para bloquear la infección viral. Por ello se decidió estudiar la inhibición de la síntesis del ARN viral como blanco antiviral, utilizando compuestos dirigidos a enzimas celulares que participan en este proceso: la enzima celular inosina monofosfato deshidrogenasa (IMPDH) involucrada en la síntesis de novo de nucleótidos de guanosina y dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH), que participa en la ruta biosintética de las pirimidinas. El ácido micofenólico (MPA) y la teriflunomida fueron evaluados como inhibidores de la IMPDH y DHODH respectivamente. Ambos compuestos inhibieron la multiplicación de JUNV en forma dosis 18 Libro de resúmenes dependiente. Estudios mecanísticos demostraron que la adición de los compuestos a células infectadas entre 1-4 h después de la adsorción del virus causó una fuerte inhibición de la producción de virus mientras que el tratamiento en tiempos posteriores resultó en una disminución del efecto antiviral dependiente del tiempo. Ambos compuestos no resultaron virucidas ni lograron inactivar al virus por pre-tratamiento de las células. La síntesis de RNA viral fue el blanco de ambos compuestos en el ciclo viral. La infectividad viral pudo ser restituida en presencia de exceso de los nucleósidos correspondientes. Viernes 26 de junio Sala A (Salón Pigalle - 2º piso) 09:45 – 11:15 hs. MESA REDONDA 8: VIRUS VEGETALES Coordinadores: Mariana del Vas. Instituto de Biotecnología, INTA, Castelar, Argentina. María Laura García. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular, UNLP‐CONICET, La Plata, Argentina. Panelistas: Sebastián Asurmendi. Instituto de Biotecnología, INTA, Castelar, Argentina. Eduardo José Peña. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP‐CONICET, La Plata, Argentina. Ana Julia Distéfano. Instituto de Biotecnología, INTA, Castelar, Argentina. UN NUEVO NIVEL DE REGULACIÓN MEDIADO POR SRNAS ENDÓGENOS QUE SE PRODUCEN ANTE LA INFECCIÓN DE PLANTAS POR TOBAMOVIRUS D Zavallo, G Conti, C Manacorda, A Venturuzzi, S Asurmendi Instituto de Biotecnología, CICVyA INTA. CONICET, Argentina. Las infecciones virales inducen profundos cambios en el metabolismo de la planta originados en una importante modificación del transcriptoma. Esta alteración de la expresión involucra a un gran número de genes, tanto de aquellos que intervienen en mecanismos de defensa y contra defensa viral como otros no relacionados que tienen efectos secundarios. Entender estas modificaciones de forma global nos permite alcanzar un conocimiento profundo de la interacción virusplanta y de su impacto en la planta, es decir en la producción de los síntomas que a su vez son la principal causa de las pérdidas económicas en los cultivos. Los RNAs pequeños (sRNAs) son reguladores de la expresión génica, contribuyen a la integración del control genético, ya que cada uno de ellos puede afectar múltiples RNAs o loci de DNA por lo que podrían jugar un papel importante en los cambios transcriptómicos producidos durante la infección. En la actualidad se conocen distintas clases de sRNAs y aunque varían en biogénesis, secuencia y modo de acción, la mayoría median la regulación de la expresión de genes a través del silenciamiento génico. En base a su origen los sRNAS se pueden dividir en dos grandes grupos: los derivados de precursores de simple cadena con una estructura de horquilla, cuyos representantes principales son los microRNAs (miRNAs) y los derivados de precursores de doble cadena (RNAs aberrantes o DNA repetitivos), representados por los RNAs pequeños interferentes y los sRNAs heterocromáticos. Se estudió el impacto de la infección en la población de sRNAs endógenos en Arabidopsis utilizando dos virus relacionados con severidad contrastante: ORMV (síntomas severos) y TMV-CG (síntomas leves) utilizando NGS. El análisis de nuestros resultados muestra que, además de producir los cambios en los miRNAs ya descriptos, la infección viral impacta sobre sRNAs derivados de transposones, promotores y mRNAs. Este impacto se verificó en los perfiles de sRNAs incluso a 2dpi cuando aún no hay acumulación de virus en el tejido muestreado. De manera interesante, los sRNAs endógenos se acumularon diferencialmente entre plantas infectadas con los virus contrastantes indicando un posible rol en la sintomatología diferencial. Luego de identificar bioinformáticamente los posibles genes blanco de los sRNAs que se acumulan diferencialmente ante la infección, se seleccionaron algunos de ellos que intervienen en procesos clave tales como la regulación de la estabilidad del RNA, la degradación de proteínas y el estrés biótico y se verificó por qPCR que sus niveles estaban alterados por la infección evidenciado una correlación con los niveles de sRNAs. Aunque aún se desconoce el origen y función de estos sRNAs, nuestros resultados nos permiten proponer la existencia de una nueva capa de regulación mediada por sRNAs (no solo por miRNAs) que modula la interacción planta-virus y en particular juega un rol preponderante en la producción de síntomas. EVOLUCIÓN EXPERIMENTAL DEL VIRUS DEL MOSAICO DEL TABACO REVELA UN ROL DE LA DINÁMICA DE MICROTÚBULOS EN EL TRANSPORTE DE ARNS. EJ Peña Instituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM), CCT - La Plata CONICET, Fac. Cs. Exactas, U.N.L.P., La Plata, Argentina. El citoesqueleto es una red interconectada de polímeros filamentosos y proteínas regulatorias responsable de procesos biológicos fundamentales como división, mantenimiento de la estructura, señalización y destino celular. Observaciones in vivo indican que el citoesqueleto de microtúbulos (MTs) está involucrado en la diseminación del ARN del virus del mosaico del tabaco (TMV), sugiriendo la existencia de un mecanismo gobernado por MTs en la localización y transporte de ARNs en plantas. Para demostrar el rol de los MTs en las interacciones de TMV con el hospedante y entonces en la formación y transporte de complejos ribonucleoproteicos en el citoplasma, hemos desafiado al virus con hospedantes de Arabidopsis thaliana tor1 y tor2, mutantes afectados en la dinámica de MTs. Luego de realizar pasajes seriados tanto en los mutantes como en la plata salvaje, encontramos la acumulación de mutaciones en el genoma viral y que estas mutaciones están asociadas con un aumento de la infectividad y acumulación viral. Controles de infección en protoplastos indican que estos cambios no son causados por un aumento en la tasa de replicación, indicando una mayor eficiencia para diseminar la infección en el entorno modificado. Los resultados resaltan la importancia de la dinámica de la red de MTs en el ensamblaje y diseminación de complejos ribonucleoproteicos en el citoplasma celular y el valor de la evolución experimental para identificar interacciones biológicas complejas en organismos multicelulares. ESTUDIO DE POLEROVIRUS DE ALGODÓN MEDIANTE EL USO DE CLONES INFECTIVOS AJ Distéfano Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA-Castelar. Buenos Aires, Argentina. El algodón es un cultivo clave para la región del NEA. La enfermedad de origen viral más importante del algodón en Sudamérica es la enfermedad azul (CBD); fue reportada en la Argentina en la campaña agrícola 1982/83 y actualmente causa importantes pérdidas en el cultivo. Es producida por el Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) el cual es transmitido exclusivamente por el insecto vector Aphis gossypii. Los síntomas de CBD son enanismo, enrollamiento de las hojas con coloración verde oscura-azulada y amarillamiento de las nervaduras. Nuestro grupo obtuvo la secuencia completa del virus presente en Argentina, postulando que el CLRDV debe clasificarse como una nueva especie del género Polerovirus, familia Luteoviridae. El CLRDV posee un genoma de RNA de simple cadena (ssRNA) positivo de 5,866 kb, está limitado a las células acompañantes del floema de su planta huésped y es transmitido por el áfido vector, no siendo posible su transmisión en forma mecánica a nuevas plantas de algodón. En las campañas algodoneras del 2009 al 2014 se detectó en la pcia. de Chaco una virosis similar a CBD en cultivares de algodón resistentes a CLRDV, produciendo el primer quiebre de resistencia del germoplasma. Los síntomas se caracterizaron por enrollamiento de las hojas y deformaciones foliares en la zona apical con aspecto "arrosetado". Nuestro grupo secuenció el genoma completo del virus y determinó 19 Libro de resúmenes que las proteínas codificadas por el mismo tienen una identidad de secuencia entre el 88% y 98% con las proteínas del CLRDV. Este virus constituye una variante virulenta del CLRDV, a la que denominamos Cotton leafroll bushy virus (CLRBV), y produce la enfermedad azul atípica. Para la caracterización de estos virus hemos desarrollado una nueva estrategia de infección mediante la obtención de un clon infectivo de cDNA del CLRDV e inoculación vía agroinfección, independizándose de la transmisión por el áfido. El clon infectivo logró establecer la infección en plantas de algodón susceptibles, que desarrollaron los síntomas típicos de CBD, como así también en plantas modelo como Nicotiana benthamiana y Arabidopsis thaliana. El sistema está siendo utilizado en el programa de mejoramiento genético del algodón para la evaluación de plantas resistentes al CLRDV y para el estudio de la interacción planta-virus. Con el objetivo de estudiar cuál/es de las proteínas del CLRBV son las responsables de la virulencia y del cambio de sintomatología, realizamos construcciones de reemplazo de las proteínas candidatas en el clon infectivo de la variedad CLRDV y evaluamos la infección y los síntomas en variedades de algodón resistentes y susceptibles a CBD. El reemplazo de la proteína de movimiento (MP) del clon infectivo del CLRDV por la MP del CLRBV no logró quebrar la resistencia y no se observaron diferencias en la sintomatología en las variedades susceptibles. En consecuencia, los cambios encontrados en la MP del CLRBV no serían los responsables por sí solos de la virulencia. 11:45 – 13:15 hs. MESA REDONDA 9: VIRUS EMERGENTES co-circulación de diversos sub-tipos. Sin embargo en este sentido, la información referente a la historia evolutiva y demográfica de HEV-3 en las poblaciones humanas en el mundo, y particularmente en Sudamérica, es muy escasa, y han sido muy pocos los intentos que han buscado reconstruirla. En este trabajo se pretende investigar la dinámica poblaciónal y la historia evolutiva de HEV-3 a nivel global y particularmente se plantean como objetivos caracterizar la emergencia de HEV en Sudamérica identificando el origen genético y geográfico de las cepas de HEV-3 introducidas en esta región y estimar su patrón de diseminación espacio-temporal. A su vez, aqui se indaga en la relación entre la inferencia poblacional y las estrategias de muestreo actualmente utilizadas. Con este fin, se aplicó un enfoque Bayesiano basado en coalescencia a un set de secuencias de HEV-3 con fecha y lugar de aislamiento documentada abarcando un período de 18 años. El análisis filogenético mostró que la diversidad genética global de HEV3 puede ser agrupada en dos clados, con un tMRCA datado en aproximadamente 340 años, y que al menos tres introducciones independientes del HEV-3 han ocurrido en Sudamérica. Por su parte, el análisis bayesiano sugirió que todas las cepas Uruguayas, detectadas entre 2010 y 2011, formaron hace unos 100 años un único clado con un linaje europeo, y compartieron, a su vez, un ancestro común muy reciente calculado entre 2004 y 2009. La inferencia filodinámica, por su parte, evidenció que el tamaño poblacional de HEV habría sufrido drásticas variaciones a partir de la segunda mitad del siglo XX. En este sentido, y contrariamente a lo postulado en estudios previos, proponemos que la población efectiva global de HEV-3 no está disminuyendo, sino aumentando. Coordinadores: Alejandro Castello. Laboratorio de Inmunología y Virología, Universidad Nacional de Quilmes (UNQ), Quilmes, Argentina. Mario Lozano. LIGBCM‐AVEZ. Departamento de Ciencia y Tecnología, UNQ, Quilmes, Argentina. Panelistas: Santiago Mirazo. Sección Virología, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay. Marize Pereira Miagostovich. Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental, Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil. Luis Adrián Díaz. Laboratorio de arbovirus y arenavirus, Instituto de Virología "Dr. J. M. Vanella", Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba (UNC), Argentina. HEPATITIS E EN REGIONES NO ENDÉMICAS: DE LA EMERGENCIA HACIA UN NUEVO ORDEN. S Mirazo1, D Mir2, G Bello2, N Ramos1, J Arbiza1 1 Sección Virología. Facultad de Ciencias. UdelaR., Uruguay. 2 Laboratorio de AIDS e Inmunología molecular. FIOCRUZ. Rio de Janeiro, Brasil. El virus Hepatitis E (HEV) es el agente causal de la hepatitis E aguda; una infección de significativa morbi-mortalidad considerada endémica en diversos países subdesarrollados en Africa y Asia. En la última década se ha producido una emergencia de la infección en diversas regiones desarrolladas y no endémicas, evidenciada con un constante crecimiento en el registro de casos esporádicos de hepatitis E adquiridos localmente en esas zonas. La infección por HEV presenta dos claros perfiles epidemiológicos distintivos que definen regiones de bajo y alto endemismo. El virus se trasmite principalmente por vía fecal-oral, aunque diversas líneas de investigación han aportado profusa evidencia que permite afirmar que la hepatitis E es, de hecho, una zoonosis, siendo los cerdos y jabalíes los principales reservorios de HEV. Las secuencias de HEV han sido clasificadas en 4 genotipos (1-4), cada uno de los cuales está a su vez dividido en subtipos. Sin embargo, esta clasificación ha sido recientemente puesta en discusión. La epidemiología molecular de HEV en Sudamérica es muy compleja; no existen regiones endémicas y es el genotipo 3 (HEV-3) el más prevalente en humanos y cerdos, habiéndose demostrado además la AGENTES DE DIARREA VIRAL DE IMPORTANCIA EN LA ERA POSTVACUNA ANTI ROTAVIRUS MP Miagostovich, TM Fumian, MS Rocha, JM Fioretti, JA Silva, MP Xavier, S Portes, R Assis, A Fialho, E Volotao, JPG Leite Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental. Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz. Rio de Janeiro, Brasil. De acuerdo con La Organización Mundial de La Salud (OMS), considerando únicamente las enfermedades diarreicas agudas frecuentemente asociadas al consumo de agua o alimentos contaminados, cerca de dos millones de niños menores de cinco años de edad mueren anualmente en los países subdesarrollados. Los rotavírus de la especie A (RVA) son los principales virus causantes de gastroenteritis aguda (GA) en niños. Luego de la implementación de la vacuna contra RVA en diversos países, otros virus, específicamente los Norovirus (NoV), han sido detectados como importantes agentes responsables por la etiología de las GA de vehiculización hídrica y alimentar. Además de los RVA y los NoV, otros virus considerados emergentes como los nuevos Astrovirus (MLB1), Bocavirus, Aichivirus, Klassevirus y Sapovirus han sido asociados a casos de diarrea. Debido al impacto actual de los NoVs en los casos esporádicos y brotes de GA en el mundo, los estudios que involucran el desarrollo de una vacuna contra NoVs ya se encuentran en fase II y III. Los NoV pertenecen al género Norovirus dentro de la familia Caliciviridae y son genéticamente clasificados en seis genogrupos (GI-GVI), siendo GI, GII y GIV los únicos descriptos capaces de infectar humanos. Los NoV GII son los mundialmente prevalentes, mientras que GI es detectado en baja frecuencia y comúnmente asociado a casos asintomáticos. Los NoV GIV son raramente detectados, relatados mayoritariamente en muestras ambientales. Hasta el presente fueron descriptos nueve genotipos de GI, 22 de GII y dos de GIV. El genotipo de NoV más frecuente es el GII.4, involucrado en la mayoría de los brotes vinculados a esta enfermedad. La capacidad evolutiva de los NoV, resultado de recombinaciones homólogas y mutaciones puntuales, principalmente en la región hipervariable P2, resulta en la emergencia de nuevas variantes de NoV GII.4, responsables por el suceso de la dispersión de este virus y la ocurrencia de brotes y epidemias de GA en el mundo. Cada 2-4 años nuevas variantes de GII.4 emergen, substituyendo la variante anterior y proporcionando al virus un mecanismo de escape del sistema inmune de la población. En Brasil, datos epidemiológicos de prevalencia de los NoV demuestran la importancia de estos virus en brotes y casos esporádicos de GA, con reportes de amplia diversidad genética e inclusive de la circulación de cinco variantes de GII.4 en un periodo de 20 Libro de resúmenes ocho años. Recombinantes intergenotipos GII.7/GII.20 de NoVs también fueron descriptos en el país. La detección y caracterización molecular de otros virus emergentes mencionados anteriormente, así como la primera descripción del astrovirus recientemente descripto (MLB-1) en el estado de Rio de Janeiro apunta a la necesidad de realizar una vigilancia laboratorial activa para determinar los diferentes agentes etiológicos de las GA, y caracterizar los genotipos de RVA que circulan en la era post-vacuna. Financiamiento: IOC, CNPq, Faperj FACTORES PROMOTORES DE LA REEMERGENCIA DE VIRUS DE LA ENCEFALITIS DE ST. LOUIS EN EL CENTRO DE ARGENTINA LA Diaz Laboratorio de Arbovirus. Instituto de Virología "Dr. J. M. Vanella" // IIByT - CONICET UNC., Argentina. El virus St. Louis encephalitis (SLEV) es agente causal de encefalitis en el continente americano. Asociado a epidemias sólo en los EEUU, su comportamiento ecoepidemiológico cambió a inicios del 2000 cuando se observó su reemergencia como patógeno neurológico humano en Argentina y Brasil. En nuestro país, el SLEV ha provocado brotes epidémicos de encefalitis en Córdoba (2005, 2010), Paraná (2006), Buenos Aires (2010) y San Juan (2011). El SLEV es mantenido en la naturaleza a través de una red de interacciones entre mosquitos vectores del género Culex y hospedadores aviares paseriformes y columbiformes, las cuales pueden modificarse en diferentes contextos ambientales y geográficos. De comportamiento generalista, en la región de Córdoba el SLEV es mantenido por mosquitos Culex quinquefasciatus y Culex interfor y Palomas Torcazas (Zenaida auriculata) y Torcacitas (Columbina picuí). Potencialmente, otras especies de aves (gorriones -Passer domesticus-, hornero -Furnarius ruffus-, benteveo -Pitangus sulphuratus-) y de mosquitos (Cx. saltanensis, Oc. scapularis) podrían aportar al flujo viral. Entre eneromayo de 2005 una epidemia de encefalitis en humanos se registró en Córdoba provocando 47 casos y 9 muertes. Durante el brote se aislaron cepas del genotipo III relacionadas con cepas enzoóticas aisladas en Santa Fe en el año 1979. Los estudios ecoepidemiológicos tendientes a estudiar las causas de esta epidemia permitieron detectar factores que promovieron la reemergencia del SLEV en Córdoba capital. Los estudios retrospectivos de caracterización molecular de cepas circulantes indicarían la introducción de cepas pertenecientes a un nuevo genotipo no detectado antes del brote. Estudios de caracterización biológica en aves y roedores demuestran que esta cepa genera mayores viremias en aves (pollitos, gorriones y palomas torcazas) y posee mayor virulencia en ratones albinos que otras cepas circulantes en Córdoba. Estas características permiten una mayor replicación viral, mayor transmisión y mayor probabilidad de infectar y enfermar a humanos. Por otro lado, el estudio de la dinámica poblacional y composición de las comunidades de mosquitos vectores permitieron detectar un marcado aumento de las poblaciones de mosquitos vectores Culex quinquefasciatus y Cx. interfor años previos al brote y una dominación por estas especies de las comunidades de mosquitos. Si bien no ha sido cuantificado, en el transcurrir de los años, las comunidades de aves urbanas han ido cambiando hacia un desplazamiento de poblaciones de gorriones por poblaciones de Paloma torcaza, hospedador amplificador del SLEV. Nuestros estudios indican que los factores promotores de la reemergencia del SLEV en la región central de Argentina incluyen factores biológicos, virológicos y ambientales promoviendo el incremento de las poblaciones de vectores y hospedadores y la introducción de una cepa con mayor capacidad virémica y patogénica. 21 Libro de resúmenes IV Simposio de Virología Clínica Conferencias plenarias y mesas redondas Martes 23 de junio Sala B (Salón Dorée - 1º piso) 10:30 – 12:00 hs. MESA REDONDA SC1: IMPACTO DE LAS NUEVAS TECNOLOGÍAS EN LOS ALGORITMOS DIAGNÓSTICOS Coordinadores: María Alejandra Picconi. Servicio de Virus Oncogénicos, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas-Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (INEI‐ANLIS) “Dr. Carlos G. Malbrán”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Adriana Giri. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario, CONICET, Universidad Nacional de Rosario, Rosario, Argentina. mujeres testeadas en el GC (Risk Ratio 4,02, 95%CI 3,44-4,71). Las tasas de detección CIN2+ fueron 1,15% (29/2519) y 1,29% (9/698) en mujeres con autotoma y con test convencional respectivamente, diferencia no estadísticamente significativa. Los casos de CIN2+ por 1000 mujeres participantes fueron 10,2 (31/3049) y 2,4 (7/2964) en el GI y el GC respectivamente (p=0,0002). Interpretación: la autotoma del test de VPH ofrecida por los AS es altamente efectiva para aumentar rápidamente la participación en el tamizaje para la detección de las lesiones precursoras del cáncer. Financiamiento: Instituto Nacional del Cáncer (Argentina). FRENTE AL NUEVO ESCENARIO DE LA EPIDEMIA HIV/SIDA: EL NUEVO ALGORITMO DIAGNÓSTICO H Salomón Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA, CONICET, Buenos Aires, Argentina. Panelistas: Silvina Arrossi. Programa Nacional de Prevención del Cáncer Cérvico Uterino. Instituto Nacional del Cáncer, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Horacio Salomón. INBIRS, UBA‐CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Jorge González. Servicio de Hepatitis Virales, INEI‐ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. EFECTIVIDAD DE LA AUTOTOMA DEL TEST DE HPV OFRECIDO POR AGENTES SANITARIOS DURANTE VISITAS DOMICILIARIAS PARA AUMENTAR EL TAMIZAJE (ESTUDIO EMA): UN ESTUDIO ALEATORIZADO POR CLUSTERS S Arrossi1 4, L Thouyaret1, R Herrero2, A Campanera3, A Magdaleno3, M Cuberli1, P Barletta1, R Laudi1, L Orellana1 1 Programa Nacional de Prevención del Cáncer Cérvico-uterino, Instituto Nacional del Cáncer, Ministerio de Salud de la Nación, Argentina. 2 International Agency for Research on Cancer, 150 Cours Albert Thomas, Lyon (69372), Francia. 3 Ministerio de Salud de la Provincia de Jujuy, Argentina. 4 Centro de Estudios de Estado y Sociedad, CONICET, Buenos Aires, Argentina. Introducción: El alcance de altos niveles de cobertura del tamizaje es uno de los principales desafíos de los programas de prevención de cáncer cervicouterino. Este estudio se propone evaluar el efecto en la participación en el tamizaje de la autotoma del test de VPH ofrecida por agentes sanitarios. Metodología: se realizó un estudio aleatorizado por clusters en la provincia de Jujuy, Argentina. Los clusters fueron los agentes sanitarios (AS) evaluados con buena performance que se desempeñaban en el sistema público de salud de Jujuy en julio del año 2012. Se randomizaron 200 AS y fueron asignados 1:1 a dos grupos: a) ofrecer durante las visitas domiciliarias la autotoma del test de VPH (grupo de intervención -GI- ) o b) promocionar un test convencional, es decir el test realizado por un profesional en el centro de salud (grupo control GC-). Las mujeres elegibles tenían ≥30 años, y vivían en un hogar visitado por un AS seleccionado. El outcome principal fue la participación en el tamizaje, definida a nivel individual: proporción de mujeres con un test de VPH seis meses después de la visita del AS. Los outcomes secundarios incluyeron la tasa de detección de los CIN2+. Se reportan los casos de CIN2+ por 1000 mujeres. El estudio está registrado en ClinicalTrials.gov (NCT02095561). Resultados: 94 y 97 AS en el GI y en el GC respectivamente reclutaron a 6013 mujeres. En el GI 2618/3049 (85,9%) mujeres se realizaron la autotoma o un test convencional, comparado con 599/2964 (20,2%) Para fines de 2013, 33,2 millones de personas [33,2 millones–37,2 millones] vivían con el HIV en todo el mundo. Las nuevas infecciones en 2013 se estimaron en 2,1 millones [1,9 millones–2,4 millones], lo que significó un 38% menos que en 2001. El número de muertes relacionadas con el sida sigue bajando, con 1,5 millones [1,4 millones– 1,7 millones] de personas que mueren por causas relacionadas con el sida en 2013, un 35% por debajo del punto máximo en 2005. El tratamiento puede prolongar radicalmente la esperanza de vida de las personas que viven con el HIV y prevenir con eficacia la transmisión del virus. Las infecciones por el HIV podrían no desaparecer en el futuro inmediato, pero la epidemia de sida puede llegar a su fin en su carácter de amenaza mundial contra la salud. Para lograr esto para el año 2030, será necesario reducir el número de nuevas infecciones y muertes relacionadas con el sida un 90%, en comparación con el año 2010. Por primera vez existe un consenso mundial para lograr que el 90% de las personas que viven con el HIV conozcan su estado serológico positivo, que el 90% de las que lo conocen reciban tratamiento y que el 90% de quienes se encuentran en tratamiento para el HIV logren la supresión de la carga viral. Los objetivos 90–90–90 son aplicables a los niños y adultos, hombres y mujeres, pobres y ricos, de todas las poblaciones — mientras es preciso alcanzar niveles incluso más altos entre las mujeres embarazadas. Si el mundo debe poner fin a la epidemia de sida para el año 2030, debemos realizar unos importantes avances en los próximos 5 años. Si la respuesta es demasiado lenta, la epidemia de sida continuará creciendo, con grandes pérdidas humanas y económicas por una creciente demanda de terapia antirretroviral y un aumento de los costos de prevención y tratamiento. Los modelos encomendados por ONUSIDA confirman este resultado. Los tres objetivos principales de este nuevo escenario son llamados o denominados 90-90-90 para el 2020: El primero de ellos es que las personas que viven con el HIV conozcan su estado serológico, para lograr este objetivo se ha planteado la necesidad de abordar nuevos algoritmos de diagnóstico en los cuales se incorporan herramientas como los test rápidos, la carga viral y recuento de células CD4 a fin de definir el diagnóstico de infección por HIV. HEPATITIS C: EL LABORATORIO EN LA ERA DE LOS ANTIVIRALES DE ACCIÓN DIRECTA. JE Gonzalez Lab. Nacional de Referencia para Hepatitis virales. INEI ANLIS "Dr C. G. Malbrán", Argentina. La hepatitis C representa un problema mundial de salud pública y se calcula que alrededor de 170 millones de individuos están infectados en todo el mundo. A pesar de no presentar síntomas la historia natural de la infección llevará a la cirrosis con o sin desarrollo de hepatocarcinoma 22 Libro de resúmenes y muerte. Las alternativas terapéuticas incluyen el tratamiento con inmunomoduladores y antivirales o como alternativa final el trasplante hepático. El laboratorio es una herramienta clave en su diagnóstico dado que la mayoría de las infecciones son asintomáticas y/o subclínicas, para muchos especialistas se trata de una “epidemia silenciosa”. La detección de anticuerpos específicos de clase IgG es el primer marcador a estudiar en una sospecha de infección. La detección de anticuerpos IgM es muy poco utilizada dado su bajo título e inespecificidad en este contexto clínico ya que el estudio y/o sospecha rara vez es agudo. Frente a un resultado positivo de antiHCV IgG es necesario confirmarlo, mas aún si es un hallazgo que no se condice con la clínica. Aunque existen ensayos suplementarios de serología con péptidos linearizados (LIA), en la práctica cotidiana directamente se confirma la infección detectando la viremia a través de una técnica de Biología molecular (BM). La detección de antígeno Core del virus solo o en combo con anticuerpos permite cerrar la ventana serológica. Inclusive su cuantificación se propone para algunos lugares donde la BM no está disponible aunque su sensibilidad es mucho menor. Dada la variabilidad genética que el virus presenta la determinación del genotipo es muy útil no solo para estudios epidemiológicos sino que además determina la duración y el tipo de tratamiento en la enfermedad crónica. En el tratamiento de la enfermedad crónica, el laboratorio cumple un rol crucial dado que determina la eficacia y eficiencia del mismo. La evolución del tratamiento, ha permitido desde los noventa hasta la fecha pasar de menos del 15% de respuesta con el uso de Interferón (IFN), a más del 95% gracias al uso de antivirales de acción directa (ADD). La accesibilidad de los pacientes al tratamiento, que incluye no solo la prescripción, implementación y seguimiento sino también y más importante aún, el costo del mismo, es un problema mayúsculo e irresuelto. En los últimos años el tratamiento estándar con IFN Peguilado y ribavirina tenia éxito en un número aceptable de pacientes pero con bastantes efectos adversos, la incorporación de AAD de primera generación mejoró la respuesta pero no los efectos adversos. Esto finalmente parecería estar superado con el tratamiento con ADDs de última generación que elimina el uso de IFN. Esto esta en continua evolución. El monitoreo de todos estos regímenes fue acompañado desde la BM mejorando la sensibilidad y el rango dinámico de cuantificación, así últimamente con el uso de PCR en tiempo real es posible no solo monitorear la respuesta sino también la eliminación del virus que significa la cura de la enfermedad crónica. Sala B (Salón Dorée - 1º piso) 15:45 – 16:30 hs. CONFERENCIA SC1 Mauricio Caballero. Fundación Infant, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. BRONQUIOLITIS: DEL LABORATORIO AL PACIENTE M Caballero Fundación Infant, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. El virus sincicial respiratorio (VSR), responsable de la bronquiolitis, es la principal causa de hospitalización y muerte en lactantes en la Argentina. Si bien varios factores epidemiológicos han sido asociados con presentaciones severas de dicha infección, las variables que determinan que dos chicos viviendo en condiciones similares tengan cursos clínicos completamente opuestos son aun poco claras. En este contexto, estudiamos polimorfismos en genes seleccionados en base a su interés fisiopatológico para definir roles en la susceptibilidad contra VSR. Nuestros hallazgos identificaron al receptor de patrón Tolllike receptor 4 (TLR4) como un componente esencial en la severidad de la bronquiolitis. El efecto de TLR4 en los lactantes es modificado por las concentraciones de lipopolisacárido bacteriano (LPS) en el medioambiente de los niños. Es así que un niño que presenta un polimorfismo en posición 299 del TLR4 (10% de la población) y ha nacido en aéreas de clase media en Argentina con baja exposición a LPS tiene ocho veces mas chances de desarrollar VSR severo que los niños que carecen del polimorfismo en el mismo grupo social. Esta susceptibilidad exagerada a la infección se asocia a un déficit de producción de interferón-gama y un exceso de producción de interleuquina-4 en el tracto respiratorio y abre nuevas posibilidades de abordaje terapéutico contra un problema que hoy carece de tratamiento efectivo. 16:30 – 18:00 hs. MESA REDONDA SC2: VIRUS RESPIRATORIOS Coordinadores: Elsa Baumeister. Departamento de Virología, INEI‐ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Guadalupe Carballal. Unidad de Virología, CEMIC, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Panelistas: Adriana Kajon. Infectious Disease Program, Lovelace Respiratory Research Institute, Albuquerque, EE.UU. Andrea Pontoriero. Departamento de Virología, INEI‐ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Marcela Echavarría. Unidad de Virología, CEMIC, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE INFECCIONES RESPIRATORIAS POR ADENOVIRUS: EL VALOR DE ESTUDIOS LONGITUDINALES Y CARACTERIZACION GENOMICA DETALLADA DE AISLAMIENTOS CLINICOS AE Kajon Lovelace Respiratory Research Institute, Albuquerque, New Mexico, Estados Unidos. Hasta el día de hoy se han descripto 51 serotipos de adenovirus humanos (HAdV) los cuales han sido clasificados en 6 especies, HAdV-A – HAdV-F. La creciente utilización de secuencias genómicas y análisis filogenético en la caracterización de aislamientos clínicos ha resultado en la reciente definición de más de 20 nuevos “genotipos” de HAdV designados con numerous consecutivos, 52, 53, etc. y en la creación de una nueva especie, HAdV-G para acomodar la clasificación de HAdV52. Desde los años 1970s, el uso de enzimas de restricción para la caracterización genómica de adenovirus ha permitido visualizar variabilidad genética intraserotípica y eventos de potencial relevancia epidemiológica tales como el reemplazo de variantes genomicas o la emergencia de nuevas variantes. El analisis de perfiles de restriccion (electroforeticos a partir de DNA vira purificado, o virtuales generados a partir de secuencias genómicas) es un recurso analitico sumamente valioso para la rápida discriminación de variantes y la comparación de cepas de virus de diverso origen geográfico o temporal. En la practica, la amplificación y secuenciación de las regiones hipervariables del gen del hexón es la estrategia adoptada para la rápida identificación de adenovirus directamente en la muestra clinica o en aislamientos. La tipificación molecular de genes de hexon y fibra han reemplazado a la serología (neutralización e inhibición de la hemaglutinación) en la identificación virus recombinantes intertípicos los cuales, por lo general, presentan reactividades antigénicas intermedias reaccionando con 2 o más antisueros de referencia. En la presentación, y a modo de ejemplo de aplicación de las mencionadas estrategias de caracterización de aislamientos clínicos de adenovirus, se discutirán los resultados de estudios colaborativos incluyendo la caracterización de cepas de HAdV7 aisladas recientiemente de casos de infeccion respiratoria aguda severa, la caracterización de cepas de HAdV21 aisladas en los Estados Unidos a lo largo de 37 años de muestreo, la caracterización de cepas de HAdV4 aisladas de reclutas militares no vacunados durate los 15 años de interrupción de protocolos de vacunación, y ejemplos de identificacion y descripcion de nuevos “genotipos” de HAdV-D. 23 Libro de resúmenes VIGILANCIA DE LA SUSCEPTIBILIDAD DE LAS CEPAS DE INFLUENZA A CIRCULANTES A LOS ANTIVIRALES DISPONIBLES MEDIANTE LA DETECCIÓN DE CAMBIOS GENOTÍPICOS DESCRIPTOS ARGENTINA PERÍODO 2011-2014. A Pontoriero Centro Nacional de Influenza OPS/OMS, Laboratorio Nacional de Referencia de Influenza y otros virus respiratorios, Servicio Virosis Respiratorias, Departamento Virología, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, ANLIS Malbrán, Buenos Aires, Argentina. Introducción: Aunque las vacunas son el mejor medio de protección, los antivirales constituyen una modalidad importante para el control de estas infecciones. Las principales sustituciones aminoacídicas en la neuraminidasa viral (NA) que confieren resistencia a los inhibidores de la NA (INA) en cepas A(H1N1)pdm09 y A(H3N2) son H275Y y E119V, respectivamente. En la actualidad la susceptibilidad de los virus influenza a los antivirales se determina mediante estudios genotípicos y/o fenotípicos. Objetivos: Describir la situación de la resistencia a antivirales de las cepas circulantes de influenza A en nuestro país y aportar información para la recomendación del uso de estas drogas en nuestra población. Correlacionar las características genotípicas de las cepas resistentes identificadas localmente con cepas descriptas previamente. Metodología: Las muestras analizadas correspondieron a pacientes pediátricos y adultos, internados y ambulatorios con infección respiratoria aguda baja con diagnóstico de influenza A enviadas al Laboratorio Nacional de Referencia (LNR) por los integrantes de la Red Nacional de Laboratorios en el período 2011-2014. Se implementaron dos técnicas de rtRT-PCR que permiten detectar la presencia de los cambios H275Y y E119V en cepas influenza A(H1N1)pdm09 y A(H3N2), respectivamente. Se estudiaron mediante rtRT-PCR 2.062 muestras A(H1N1)pdm09 para la detección del cambio H275Y: 79 en 2011, 660 en 2012, 1315 en 2013 y 8 en 2014. Además, en el 2014, se estudiaron 864 muestras A(H3N2) para la detección del cambio E119V. Se llevó a cabo el intento de aislamiento viral en cultivos celulares y la secuenciación de los segmentos hemaglutinina (HA) y NA viral y se construyeron árboles de filogenia para comparar cepas resistentes detectadas en Argentina con otras ya descriptas. Resultados: Durante el período de estudio, la Red llevó a cabo el diagnóstico de 275.251 muestras y 12.323 fueron positivas (4.5%). El LNR recibió 6.434 muestras con diagnóstico de virus influenza A. Mediante el ensayo de susceptibilidad a antivirales por rtRT-PCR se detectó el cambio H275Y en 21 (1%) virus A(H1N1)pdm09: 2 aislados en 2011, 1 en 2012, 17 en 2.013 y 1 en 2014, la mayoría de ellos habían sido recolectados de pacientes de sexo femenino (52%) que no habían recibido terapia antiviral (86%). Con respecto a las cepas A(H3N2), se detectó el cambio E119V en un único virus (0.1%) en una muestra proveniente de una paciente inmunosuprimida que había recibido tratamiento antiviral. El árbol de la HA viral demostró que este virus pertenecía al grupo 3C.3 que nuclea cepas con cambios nucleotídicos que difieren de la componente vacunal A/Texas/50/2012 (H3N2). Conclusiones: El ensayo de susceptibilidad a oseltamivir demostró que la prevalencia de cepas resistentes en Argentina es baja (1% para A(H1N1)pdm09 y 0.1% para A(H3N2)), prevalencias que apoyan la recomendación del uso de los INA en nuestro medio. RINOVIRUS: EL NUEVO IMPACTO DE UN ANTIGUO VIRUS M Echavarría Unidad y Laboratorio de Virología, CEMIC, Argentina. Los rinovirus humanos fueron descriptos en los años ´50 como los principales agentes causales del resfrío común. Sin embargo, en los últimos años, se los ha detectado también en cuadros de infección respiratoria baja, en exacerbaciones de asma y de enfermedad pulmonar obstructiva crónica. En algunos casos, las infecciones respiratorias bajas pueden ser graves y requerir internación. Los rinovirus pertenecen a la familia Picornaviridae, género Enterovirus y se dividen en tres especies: A, B y C. Dada la multiplicidad de genotipos y serotipos es difícil el diseño de vacunas. El promedio de infecciones anuales oscila entre 2 y 5 veces al año en adultos y hasta 12 veces al año en niños. El diagnóstico se realiza principalmente por métodos moleculares ya que no existen anticuerpos monoclonales para realizar una diagnóstico rápido. Si bien inicialmente se realizaba aislamiento en cultivo, no se emplea habitualmente y además, los genotipos de la especie C ( última descripta) no crecen en cultivo. En un estudio en realización en nuestra institución en 1.000 niños menores de 6 años con infección respiratoria aguda, detectamos rinovirus en el 40 % de los casos. El 55% presentó bronquiolitis, 13% neumonia y el 72% de los casos requirió oxígenoterapia. La presencia de rinovirus fue un factor de riesgo de internación (OR: 2.47). Los rinovirus circularon durante todo el año, incluso en verano. La genotipificación demostró la presencia de las 3 especies, siendo la A y C las más frecuentes. Los análisis de filogenia demostraron la circulación simultánea de distintos genotipos. Actualmente, hemos incorporado la detección de rinovirus al diagnóstico de rutina. Miércoles 24 de junio Sala B (Salón Dorée - 1º piso) 09:00 – 10:30 hs. MESA REDONDA SC3: DIFICULTADES EN EL DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO EN PACIENTES INMUNOCOMPROMETIDOS Coordinadores: Lilia Mammana. Unidad de Virología, Hospital de Infecciosas "F. J. Muñiz", Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Alfredo Martínez. Unidad de Virología, CEMIC, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Panelistas: Dolores Fellner. Servicio de Virus Oncogénicos, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas‐ Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (INEI‐ANLIS) “Dr. Carlos G. Malbrán”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Cristina Videla. Unidad de Virología, CEMIC, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Humberto Metta. Hospital de Infecciosas "F. J. Muñiz", Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. INFECCIÓN POR VIRUS EPSTEIN-BARR (EBV) EN PACIENTES TRASPLANTADOS: HACIA UN CONSENSO EN EL DIAGNÓSTICO ENFOCADO A LA DETECCIÓN TEMPRANA DE LOS DESÓRDENES LINFOPROLIFERATIVOS POST-TRASPLANTE (PTLD) D Fellner Servicio de Virus Oncogénicos, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas-Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (INEI-ANLIS) “Dr. Carlos G. Malbrán”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. El virus Epstein-Barr en pacientes trasplantados induce el desarrollo de los Desórdenes Linfoproliferativos Post-trasplante. Es un virus ubicuo, luego de la primoinfección persiste en linfocitos B. Por ello, su detección no es suficiente, mientras que la medición de la carga viral por métodos de amplificación en cadena de la polimerasa (PCR) ha mostrado ser una herramienta potencial para el diagnóstico, seguimiento y pronóstico de las enfermedades asociadas. Actualmente, la PCR en tiempo real, se utiliza como metodología de referencia para cuantificar EBV; sin embargo hasta el momento no existe una estrategia “gold standard” y cada laboratorio mide la carga de EBV con su propio sistema artesanal o comercial. Un gran avance, lo constituyó la disponibilidad desde el año 2012, del primer estándar de referencia internacional de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para cuantificar EBV, que permite expresar las cargas virales en unidades internacionales. De esta forma las comparaciones de los resultados entre diferentes laboratorios se hacen más válidas y harán posible la identificación de umbrales o niveles de referencia universales que puedan utilizarse en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento preventivo de PTLD. No obstante, esto no es suficiente para la estandarización, ya que también se ha observado variabilidad en los resultados de carga viral dependiendo de 24 Libro de resúmenes la combinación de primers y sonda, de la región genómica amplificada y de la calibración utilizada. Por otra parte, tampoco se ha determinado cuál es la muestra clínica óptima sobre la cual cuantificar EBV. Inicialmente se tomó a las células mononucleares periféricas (CMP), que contienen a los linfocitos B, como la muestra más precisa, pero se ha demostrado que la sangre entera es igualmente eficiente para el seguimiento de pacientes trasplantados, con las ventajas técnicas adicionales del menor tiempo y costo al evitar los métodos de separación de CMP. Por otra parte, si bien se ha informado que el plasma es menos sensible con respecto a los compartimientos celulares, algunos estudios indican una información clínica más específica en relación a PTLD. Por lo tanto, es necesario seguir trabajando en la búsqueda de la muestra clínica óptima, su procesamiento y almacenamiento, así como en la determinación de la frecuencia recomendada de monitoreo en grupos de alto y bajo riesgo de PTLD. Con el fin de mejorar la sensibilidad y especificidad clínica, se ha combinado la medida de la carga de EBV con otras técnicas tales como la detección del perfil de expresión de genes virales, la identificación y cuantificación de inmunidad celular específica y analizado el uso de paneles de ensayos que permiten testear múltiples factores virales y humanos. Se han realizado importantes avances en relación a la búsqueda y estandarización de pruebas de laboratorio que permitan una prevención más eficiente de los PTLD, aunque todavía queda mucho por recorrer para lograr un consenso internacional. sistema nervioso central (SNC) y periférico y las reactivaciones de las infecciones latentes originan variadas y graves manifestaciones clínicas en los enfermos con sida. Los cuadros clínicos más frecuentes incluyen meningitis, meningoencefalitis, mielitis, polineuritis y cualquiera de sus combinaciones. El diagnóstico de compromiso del SNC se confirma a través de la punción lumbar, el examen físico, químico y citológico del LCR y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección del genoma de virus de la familia herpes. La utilidad clínica de la misma ha sido fundamental para el diagnóstico de las infecciones del SNC por virus herpes en pacientes con enfermedad HIV/SIDA a partir del hallazgo de coinfecciones como así también la presencia de agentes poco comunes como el HHV-6, un patógeno emergente en estos pacientes, y su posible rol en las complicaciones neurológicas agudas o subagudas. El virus identificado con mayor frecuencia es el citomegalovirus. El pronóstico de estos pacientes está directamente relacionado con un diagnóstico precoz y la terapéutica antiviral específica y oportuna. El diagnóstico precoz seguido del tratamiento antiherpético y la reconstitución inmunológica alcanzada con la TARGA pueden mejorar el pronóstico de esta clase de pacientes. 10:30 – 11:15 hs CONFERENCIA SC2 Alfredo Seijo. Servicio de Zoonosis, Hospital de Infecciosas "F. J. Muñiz", Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. DIFICULTADES EN EL DIAGNOSTICO DE CITOMEGALOVIRUS (CMV) EN PACIENTES TRASPLANTADOS C Videla Laboratorio de Virología Clínica, Hospital Universitario CEMIC, Argentina. El Citomegalovirus (CMV) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en pacientes trasplantados tanto de órgano sólido como de médula ósea. El gran desafío en el diagnostico de CMV es poder diferenciar entre infección y enfermedad. Para el diagnostico de CMV se cuenta con una amplia gama de métodos que van desde los clásicos, como la histopatología, el cultivo viral y la antigenemia hasta los más recientes de detección de ácidos nucleicos (NAT). En la actualidad, el NAT es el más utilizado para detección y cuantificación del CMV (carga viral). La carga viral en sangre es empleada para predecir enfermedad e instaurar la terapia preventiva, para el seguimiento del tratamiento antiviral guiando la duración del tratamiento, señalando la aparición de cepas resistentes y determinando el riesgo de enfermedad tardía por CMV. Debido a la alta sensibilidad y valor predictivo negativo del NAT, este se utiliza para descartar enfermedad por CMV. Sin embargo, los valores de corte de las cargas virales para cada una de estas situaciones no están aún bien definidos. Una de las causas por la cual no existen valores de corte de carga viral para predecir enfermedad e iniciar la terapia preventiva es la falta de estandarización de los métodos. La introducción en el 2011 del estándar internacional es un gran avance para poder lograr uniformar las cargas virales y disminuir la variabilidad de resultados interlaboratorio. La estandarización de las cargas virales permitirá una mejor interpretación de los resultados en las diferentes situaciones diagnosticas y así un mejor manejo de los pacientes inmunocomprometidos. DIFICULTADES EN EL DIAGNÓSTICO DE LAS NEUROVIROSIS EN PACIENTES CON ENFERMEDAD VIH/SIDA H Metta1 2 1 Jefe División VIH/sida, Hospital de Infecciosas "F. J. Muñiz", Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. 2 Profesor Regular Titular, Departamento de Medicina, Orientación Enfermedades Infecciosas, Facultad de Medicina, UBA, Argentina. El compromiso neurológico es muy frecuente en la enfermedad HIV/sida y se asocia con una elevada morbimortalidad. Estas complicaciones pueden presentarse en cualquier momento de la historia natural de la enfermedad; las infecciones oportunistas son las causas más frecuentes del compromiso neurológico en estos pacientes. Los virus de la familia Herpesviridae tienen un marcado tropismo por el ¿QUÉ HACEMOS LOS HOMBRES PARA QUE EMERJAN LAS ENFERMEDADES VIRALES? A Seijo1 2 1 Jefe del Servicio de Zoonosis del Hospital FJ Muñiz, GCBA, Argentina. 2 Director de la Maestría en Control y Prevención de las Zoonosis (UNNOBA), Argentina. En las últimas décadas, con escasas excepciones, las enfermedades transmisibles que pueden considerarse estrictamente emergentes, han sido producidas por virus, de los cuales la mayoría presenta dos caracteres comunes: son zoonosis y además sus nichos ecológicos originarios, se localizan en las grandes extensiones boscosas de las áreas tropicales y subtropicales. La caracterización de emergentes, como problema de salud pública, no puede explicarse sólo por hechos de la biología propia de los microorganismos o por la susceptibilidad de los potenciales enfermos. En este sentido, realizaremos un análisis sobre factores y circunstancias que facilitan la emergencia de un virus como problema de salud pública. Entre las causas biológicas se hará mención a la relación factores de virulencia/memoria inmunológica, entendida como proceso evolutivo. Por otra parte, se describirán factores que posibilitan la emergencia, analizados desde una perspectiva social e histórica. Estos factores, en general desencadenantes, serán relacionados con hechos biológicos concretos. Desde este punto, se verán como algunos paradigmas históricos y sociales, cuyos efectos pueden ser mensurados en relación con el estrés y la mal nutrición, pueden tener consecuencias sobre la inmunidad natural y actuar como emergentes de enfermedades virales. Como ejemplos, se comentarán emergencias sucedidas en el pasado, con énfasis en el Nuevo Mundo y algunos de los sucesos contemporáneos. Entre los primeros, las epidemias de viruela y sarampión en comunidades originarias de las Américas y entre los hechos más recientes el espectro que transita desde la fiebre hemorrágica Argentina, la enfermedad de Heine-Medin el síndrome pulmonar por hantavirus hasta la enfermedad por virus Chikungunya. 16:30 – 18:00 hs. MESA REDONDA SC4: ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO DE VIROLOGÍA Coordinadores: Eduardo Anchart. Redes Bioquímicas, Ministerio de Salud, Santa Fe, Argentina. Mirta Remesar. Área de Infecciones Transmisibles por Transfusión, Hospital Garrahan, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. 25 Libro de resúmenes Panelistas: Marcelo Rodríguez. Departamento de Parasitología, INEI‐ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Catalina Massa. Laboratorio de Hemoderivados, UNC, Córdoba, Argentina. Héctor Daniel Elías. División Gestión de Calidad de la Dirección de Bioquímica de la Municipalidad de Rosario y Gestión de Calidad para la Red de Laboratorios del Ministerio de Salud de Santa Fe, Rosario, Argentina. EVALUACIÓN DE MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN EL LABORATORIO DE VIROLOGÍA CONSIDERACIONES PRÁCTICAS M Rodriguez Departamento de Parasitologia ANLIS, Argentina. La evaluación de reactivos de diagnóstico (IVD’s) moleculares se realiza en 3 instancias particulares,1) cuando se desarrolla un IVD “in house” y el investigador/desarrollador se dispone estimar los parámetros de performance (validación analítica y diagnóstica),2) cuando se incorpora una nueva metodología al laboratorio y es necesario saber si alcanza los parámetros de la ya implementada y 3) si el laboratorio está acreditado y necesita dar cuenta de la performance de los IVD`s y de cómo realiza el seguimiento de los mismos a los largo del tiempo (verificación). Se trate de validar nuevos métodos o verificar la performance declarada, implementar esta tarea implica planificar un proceso previo con actividades antes de poner los IVDs en la mesada y emitir resultados de pacientes. Algunas de estas actividades son:- definir cuales serán considerados insumos críticos, y de cómo se producirán y lotearan para elaborar el denominado “Lote Maestro”, cuyo objetivo es proveer un único lote para completar la Validación Analítica y Diagnóstica y así generar datos históricos.; -definir “la concentración” (de significancia clínica) de controles de amplificación/calibradores (CA) y de la estrategia de fraccionamiento, conservación y loteo (para el armado de las futuras curva de calibración), y así evitar el “se cayó el CA”;- definir con que CA se realizará el seguimiento de la presicion en una carta de control;-calibrar los equipos críticos para asegurar que la impresición o sesgo, no tenga componentes extras que sobreestimarían dichos parámetros;-suscribirse a un Control de Evaluación Externa de la Calidad y por último estimar parámetros de performance. Existen numerosas guías y recomendaciones internacionales para estimar los parámetros en forma aislada, pero no en la organización y secuencia para estimar “conjuntamente” los mismos, de manera de poder ahorrar tiempo y dinero. En nuestra institución desarrollamos un “protocolo múltiple” con aplicación transversal para estimar “conjuntamente” parámetros analíticos. : -Requisitos de calidad mínimos (Error Total Aceptable a partir del estado del arte de los datos de validación),Repetibilidad, -Precisión Intralaboratorio,-Perfil de Precisión,Elaboración de cartas de control diario de Levey Jennings,-Linealidad, Rango de trabajo (Límite Inferior y superior de Cuantificación),- Límite de detección (a partir de curvas Probit o POD/LOD),-La Verificación de Repetibilidad y Precisión Intralaboratorio,-El cálculo de La incertidumbre expandida. La evaluación de IVD`s moleculares debe ser conceptualizada como un proceso bien organizado que nos permita: conocer la performance de los métodos, afirmar que los resultados del informe de evaluación son satisfactorios con el uso previsto y dar evidencia objetiva de la cuantificación del error del método para asegurar así la calidad de los resultados informados. CONTROLES VIROLÓGICOS PARA LA SEGURIDAD BIOLÓGICA EN LA CADENA DE PRODUCCIÓN DE MEDICAMENTOS HEMODERIVADOS C Massa Laboratorio de Hemoderivados. UNC, Argentina. Los medicamentos hemoderivados deben cumplir estrictos requisitos de calidad, eficacia terapéutica y seguridad biológica. La seguridad biológica de los productos derivados del plasma humano depende fundamentalmente de la seguridad del plasma utilizado como materia prima. Las especificaciones internacionales referidas a la seguridad biológica de los hemoderivados están dirigidas a reducir al mínimo el riesgo de transmisión de agentes patógenos a través de la administración de los mismos. Las medidas dirigidas a garantizar el cumplimiento de estas especificaciones están referidas principalmente a la adecuada selección de los donantes de sangre o plasma, al estricto cumplimiento de las Buenas Prácticas de Fabricación y Control (BPFyC) y a la realización de un riguroso control, tanto en la materia prima de partida como en las distintas etapas del proceso productivo, de marcadores virales transmisibles por sangre y sus derivados. Por consiguiente la seguridad biológica de los medicamentos hemoderivados está garantizada por la aplicación de las siguientes medidas: Centro de Colecta de sangre y/o plasma - Estricto cumplimiento de BPFyC en los procesos de selección, obtención, control, almacenamiento y distribución de hemocomponentes. - Control de marcadores virales en cada unidad individual de sangre o plasma enviada a fraccionamiento proteico para obtención de medicamentos, Planta Industrial - Certificación de la ejecución de los procesos operativos en los bancos de sangre y centros de colecta de plasma. Los principales procesos involucrados en la seguridad biológica del plasma destinado a la elaboración de medicamentos son la selección de los donantes, la obtención y control de la sangre y hemocomponentes y la verificación del sistema de calidad aplicado en la institución. - Reanálisis de marcadores virales en las unidades de plasma enviadas a fraccionar. - Control de marcadores virales en el pool de plasma inicial que da origen a cada lote de producto final. - Inclusión y validación de etapas de inactivación viral en el proceso productivo. - Estricto cumplimiento de BPFyC en las distintas etapas del proceso productivo. - Control de marcadores virales en producto final. En función de las etapas de control y de los productos hemoderivados a elaborar se requiere la investigación de la presencia de marcadores virales para virus de la Inmuno Deficiencia Humana 1 y 2, virus de la Hepatitis C, virus de la Hepatitis B y Parvo virus B19 Los métodos de detección aplicados deben responder a las exigencias especificadas para cada etapa y deben ser validados para demostrar el cumplimiento de requisitos de sensibilidad y especificidad. EXPERIENCIA EN SISTEMAS DE GESTIÓN DE CALIDAD EN LABORATORIOS DE VIROLOGÍA DEL ÁMBITO ESTATAL HD Elías División Gestión de Calidad de la Dirección de Bioquímica de la Municipalidad de Rosario y Gestión de Calidad para la Red de Laboratorios del Ministerio de Salud de Santa Fe, Rosario, Argentina. Etapas en implementación de sistemas de gestión de calidad en laboratorios públicos. Definición de la política, objetivos y compromisos organizacionales, objetivos particulares. Como se trabaja en redes de laboratorio, la generación de los consensos de trabajo, gestión de los documentos. Los sistemas de registros para creación de indicadores, elementos de gestión para la mejora continua, proceso de certificación. La gestión de equipos, mantenimientos y trazabilidad de las medidas, Los recursos humanos capacitación según objetivos, evaluación de desempeño, Evaluación de proveedores de productos y servicios, procesos analíticos aseguramiento de la calidad. 26 Libro de resúmenes II Simposio de Virología Veterinaria “Dr. José L. La Torre” Conferencias plenarias y mesas redondas Jueves 25 de junio Sala B (Salón Dorée - 1º piso) 09:00 – 10:30 hs. MESA REDONDA SV1: AVANCES EN VIRUS DE RUMIANTES Coordinadores: Sandra Pérez. Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires (UNCPBA) CIVETAN‐CONICET, Tandil, Argentina. Carolina Ceriani. Facultad de Ciencias Veterinarias, UNCPBA CIVETAN‐CONICET, Tandil, Argentina. Panelistas: Viviana Parreño. Instituto de Virología, INTA, Castelar, Argentina. Maia Marín. Grupo de Sanidad Animal, INTA EEA Balcarce, Argentina. Erika González Altamiranda. INTA EEA Balcarce, Argentina. EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR Y ESTRATEGIAS DE PREVENCIÓN DE AGENTES VIRALES CAUSANTES DE DIARREA V Parreño Instituto de Virologia, CICV y A, INTA., Argentina. El síndrome de diarreas neonatal del ternero (DNT) es un problemática de alto impacto sanitario tanto en los explotaciones de ganado de cría como en los establecimientos lecheros. Dentro de los agentes virales que participan en este síndrome, nuestro grupo de investigación ha trabajado en el diagnóstico y caracterización molecular de Rotavirus, Coronavirus y Norovirus bovino. También hemos investigado la circulación de rotavirus en otras especies animales de interés económico como equinos, porcinos y camélidos sudamericanos, encontrandose variantes geneticas propias de cada especie y marcadores moleculares del virus compartido entre especies y propios de la región. Según resultados obtenidos en relevamientos realizados en los últimos 20 años rotavirus grupo A bovino se encuentra ampliamente distribuido en ambos tipos de explotaciones bovinas con prevalencias mayores al 70%, siendo diferente la epidemiologia de la enfermedad y variantes que circulan en rodeos de cría y de tambo. Coronavirus bovino es un agente que se presenta asociado a diarrea preferentemente en los rodeos lecheros. Por su parte se ha detectado recientemente la circulación de las dos variantes de norovirus bovino en terneros de leche. A partir de los resultados de diagnóstico se ha trabajado en el diseño y desarrollo de vacunas y estrategias de inmunidad pasiva para prevenir las diarreas causadas por estos agentes, asi como en la estandarizacion de modelos animales para controlar la potencia y eficacia de estas herramientas preventivas y terapéuticas. RECEPTORES TIPO TOLL Y SU RELACIÓN CON LA INFECCIÓN POR HERPESVIRUS BOVINO TIPO 1 Y 5 M Marin Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Rivadavia 1917, C1033AAJ, Buenos Aires, Argentina. Los receptores tipo toll (TLRs) son proteínas de señalización de transmembrana que ejercen un rol importante en la respuesta inmune innata mediante el reconocimiento de “patrones moleculares asociados a los patógenos”. Durante la infección microbiana estas moléculas altamente conservadas son reconocidas por una gran variedad de células a través de los TLRs, induciendo la producción de citoquinas pro-inflamatorias y moléculas antimicrobianas y la estimulación de la respuesta adaptativa. Así, los TLRs participan activamente en el desarrollo de la respuesta innata, destinada a eliminar al microorganismo en los primeros estadios de la enfermedad, y constituyen el nexo entre las respuestas inmunes innata y adaptativa. La información publicada sobre la expresión de los TLRs en la especie bovina es escasa. Homólogos de los TLRs 1-10 humanos existen en el bovino, sin embargo la mayoría de los trabajos sobre los TLRs bovinos se concentra en los TLRs 2 y 4 y su asociación con la infección por herpesvirus bovinos no ha sido esclarecida. Dicha interacción en la infección por Herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1), fue caracterizada basándose exclusivamente en los TLR2 y 4 que detectan proteínas virales, revelando que la infección por BoHV-1 amplifica la expresión de estos receptores e incrementa las respuestas pro-inflamatorias. Definir los mecanismos que participan en dichas respuestas permitirá identificar aquellos inhibidores o ligandos de TLRs que permitan modular la infección con el fin de proveer nuevas herramientas que puedan ser utilizadas en la prevención y/o tratamiento de las enfermedades ocasionadas por los herpesvirus en el ganado. Hasta el momento, no existían estudios que caracterizaran el papel de los TLRs que detectan ácidos nucleicos (TLR3, 7, 8 y 9) en las infecciones por alfaherpesvirus bovinos, como tampoco había sido investigada la asociación de los TLRs con la infección por Herpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5). El BoHV-5 es el agente etiológico de la meningoencefalitis necrotizante en terneros, causal de brotes fatales frecuentes en Argentina y Brasil. Las investigaciones realizadas demostraron, por primera vez, la participación de los TLR3, 7, 8 y 9 en el reconocimiento inmune innato de BoHV. La infección por los herpesvirus bovinos ejerce efectos variados sobre los niveles de expresión de estos TLRs en el sistema nervioso bovino, lo cual permitió caracterizar diferencias en la neuropatogenia de BoHV-1 y 5. Además, se identificó un agonista del TLR7/8 con marcada actividad anti-viral que podría ser útil como herramienta complementaria en la modulación de la infección. Actualmente, se estudia también el rol de los TLRs en proceso de infección respiratoria y en el mantenimiento de la latencia y/o reactivación de BoHV, con el fin de contribuir al desarrollo de nuevas propuestas para la prevención y control de la enfermedad en los rodeos. UTILIZACIÓN DE UNA TÉCNICA DE NESTED RT-PCR PARA LA DETECCIÓN DE ANIMALES PERSISTENTEMENTE INFECTADOS CON EL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA (VDVB) Y MONITOREO DE RODEOS EA González Altamiranda1 2 1 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, Argentina. 2 EEA INTA Balcarce, Argentina. El virus de la diarrea viral bovina (vDVB) es un patógeno que ocasiona importantes pérdidas económicas para la industria ganadera a nivel mundial. Tiene múltiples formas de presentación, entre las que se incluye la infección aguda, un síndrome fatal denominado “Enfermedad de las Mucosas” y cuadros reproductivos de infertilidad, abortos y anomalías congénitas. Una situación relevante en la patogenia del vDVB es el desarrollo de infecciones persistentes en animales expuestos congénitamente al virus. Estos animales persistentemente infectados (PI) son reservorio del virus y la principal fuente de diseminación en la población bovina. Por este motivo, los esfuerzos para el control deben dirigirse a la detección y eliminación de bovinos PI del rodeo. La vacuna por sí sola es insuficiente para el control de la infección ya que no elimina los animales portadores. El saneamiento 27 Libro de resúmenes mediante la detección y remoción de animales PI es el procedimiento que se utiliza en varios países de la UE, habiéndose logrado su erradicación. La técnica “gold-estándar” para la detección de animales PI es el aislamiento viral a partir de leucocitos; sin embargo, es necesaria la implementación de un método más rápido y sensible que permita, a un costo razonable, la identificación de animales portadores infectados. Ante la creciente demanda para implementar medidas de saneamiento eficaces que permitan controlar las infecciones por vDVB y lograr el estatus de establecimientos libres, a partir del año 2010 se comenzó a implementar en nuestro laboratorio la técnica nested RTPCR para la detección de animales PI. La misma fue puesta a punto para la detección del virus en pooles de sueros, con el propósito de optimizar el diagnóstico con una técnica rapida, confiable y altamente sensible. La aplicación de esta técnica permite la identificación de bovinos PI, para segregarlos del rodeo y de esta manera, eliminar la principal fuente de infección del vDVB en los establecimientos ganaderos. Con la ejecución de la presente propuesta se contribuye al desarrollo socio-económico del país porque se aplica un test diagnóstico sensible que incrementa la posibilidad de controlar una importante infección viral, aumentando los índices productivos. Los resultados iniciales resultaron de importancia para la posterior validación del ensayo, evaluando la reproducibilidad de la técnica como parámetro para determinar la precisión del mismo. Es importante considerar que la ganadería vacuna argentina ha visto reducida su superficie a causa de la importante expansión de la agricultura y aunque el stock vacuno se ha mantenido a pesar de esta reducción en su superficie, una de las consecuencias es que frecuentemente la producción ganadera bovina en su conjunto (leche y carne) se encuentra en condiciones sanitarias desfavorables. Está claro entonces que contar con métodos de diagnóstico y control adecuados resulta fundamental para una adecuada salud animal. 10:30 – 11:15 hs. CONFERENCIA SV1 Etienne Thiry. Veterinary Virology and Animal Viral Diseases, Department of Infectious and Parasitic Diseases, Faculty of Veterinary Medicine, University of Liège, Lieja, Bélgica. SCHMALLENBERG VIRUS INFECTION: EUROPE IN FACE OF REPEATED EMERGING VECTOR BORNE VIRAL DISEASES IN RUMINANTS E Thiry Veterinary virology, FARAH Center, Faculty of Veterinary Medicine, University of Liège, B-4000 Liège, Bélgica. After the severe infection with the orbivirus bluetongue virus serotype 8 in 2006, Northern Europe faced an unexpected emerging bunyavirus infection in 2011. Although there have been already scarce reports about bunyaviruses, except hantaviruses, in Europe, this emerging virus was remarkable because of its extremely rapid and efficient spread within the ruminant populations. The emergence of Schmallenberg virus (SBV), an orthobunyavirus, was first recorded in dairy farms in Germany (precisely in Schmallenberg town) and the Netherlands. The associated clinical signs, hyperthermia and drop in milk production, were not obvious. Nevertheless a metagenomic approach successfully identified a previously unknown bunyavirus as being associated with the disease. The virus genome was similar to sequences of various orthobunyaviruses, namely Akabane, Aino and Shamonda viruses. As other orthobunyaviruses, SBV is an arbovirus and is transmitted through culicoid bites. The infection gained larger areas of Germany, the Netherlands and Belgium and was soon after linked to abortions and more to congenital abnormalities in ruminant foetuses, especially of the bovine and ovine species and caprine to a lesser extent. The clinical presentation was arthrogryposis and hydranencephaly in newborn animals that led to severe neurological and locomotor disorders and a rapid death of affected animals. SBV is not zoonotic and reaches mainly ruminant species. Two main waves of clinical manifestations were observed in 2012 and 2013 reaching more than 20 European countries. However the economic consequences of this widespread infection remained relatively low with estimated morbidity and mortality rates of less than 3%. An international effort made possible the fast availability of molecular and serological diagnostic tools. Vaccines were also quickly introduced in the market but, due to the low impact of the disease and the absence of compensations, they have been poorly used. The remarkable introduction and efficient spread of this orthobunyavirus are described. The properties of the virus and the current knowledge of its pathogenesis are reviewed. The epidemiology of the infection takes into account the spread via culicoids. The situation of SBV within orthobunyaviruses as well as speculations about its origin based on molecular phylogeny are discussed. 11:45 – 13:15 hs. MESA REDONDA SV2: VIRUS DE AFTOSA Coordinadores: Mariano Pérez Filgueira. Instituto de Virología, INTA, Castelar, Argentina. Nora Mattion. Instituto de Ciencia y Tecnología “Dr. César Milstein”, CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Panelistas: María Inés Gismondi. Instituto de Biotecnología, INTA, Castelar, Argentina. Viviana Malirat. Instituto de Ciencia y Tecnología “Dr. César Milstein”, CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Emilio León. Instituto de Patobiología, INTA, Castelar, Argentina. DIFERENCIAS EN LA INTERACCIÓN HOSPEDADOR-PATÓGENO EN VARIANTES DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA SEROTIPO A M Cacciabue1, MS García Núñez1, F Delgado2, E Carrillo1 3, MI Gismondi1 1 Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA, Argentina. 2 Instituto de Patobiología, CICVyA, INTA, Argentina. 3 CICVyA, INTA, Argentina. El virus de la fiebre aftosa (VFA, familia Picornaviridae, género Aftovirus) produce una enfermedad altamente contagiosa que afecta a animales biungulados ocasionando importantes pérdidas económicas. Previamente se determinó que dos variantes del VFA A/Arg/01 presentaban diferencias en su virulencia en el modelo ratón, siendo VFA-L un virus letal y VFA-NL un virus no letal. Nuestros objetivos fueron caracterizar la patogenia de la infección en el modelo ratón adulto C57BL/6 y estudiar la replicación de VFA-L y VFANL en distintos cultivos celulares. Se inocularon por vía intraperitoneal grupos de 9 ratones hembras adultas de 8 a 9 semanas con cada virus (105 UFP/ratón). A las 24 horas postinfección (hpi) se tomaron muestras de sangre (n=9) y órganos (hígado, bazo, cerebro, páncreas, timo; n=5) para el análisis histopatológico y la determinación del título viral. Se controló durante 7 días el resto de los ratones por signos de enfermedad y muerte. Ratones inoculados con VFA-NL fueron desafiados 14 días postinoculación con 104 UFP totales de VFA-L y se monitorizó su evolución clínica durante 7 días. Además, se determinó el tamaño y la morfología de las placas de lisis de cada virus y se caracterizó su cinética de crecimiento en los cultivos celulares BHK-21, PK-15, MDBK, IBRS-2, riñón fetal bovino (RFB) y riñón ovino (RO). Los ratones infectados con VFA-L presentaron lesiones más severas, con edema generalizado en la cavidad abdominal y hemorragias en la cavidad torácica. El análisis histopatológico reveló que ambos VFA causaron lesiones severas en el páncreas, que afectaron 80% del tejido exócrino en los animales infectados con VFA-L y 60% del mismo en animales infectados con VFA-NL. El timo y el bazo presentaron alteraciones apoptóticas multifocales. No se evidenció daño tisular en hígado y en cerebro. A las 24 hpi, la viremia y el título viral por gramo de tejido (hígado, bazo y páncreas) fueron significativamente mayores en los animales infectados con VFA-L. Asimismo, sólo se detectó virus infectivo en muestras de cerebro de los animales infectados con VFA-L. Los animales inoculados inicialmente con VFA-NL y desafiados con VFAL no presentaron signos de enfermedad durante el período evaluado, sin detectarse viremia a las 24 horas postdesafío. Por otro lado, ambos virus presentaron cinéticas de crecimiento similares y placas de lisis de 28 Libro de resúmenes idénticas características en células BHK-21 y RFB, en tanto no se observó replicación en las líneas celulares MDBK, PK-15 e IBRS-2. Por el contrario, VFA-L produjo placas de lisis de mayor diámetro y un mayor título en células RO a las 24 y 48 hpi. En conclusión, ambos virus producen una infección sistémica con lesiones evidentes en el páncreas, el timo y el bazo de los ratones afectados. La virulencia de VFA-L puede controlarse mediante inmunización previa con VFA-NL. Las diferencias de virulencia entre ambos virus dependen de las características de la interacción hospedador-patógeno. VIRUS DE AFTOSA: CEPAS CIRCULANTES EN LA REGIÓN Y SU RELACIÓN CON LAS CEPAS INCLUIDAS EN LA FORMULACIÓN DE LAS VACUNAS. V Malirat1, E Maradei2, C Pérez Beascoechea2, S Galdo Novo2, I Ballette2, R D'Aloia2, C Seki1, ER Caffarena3, D Antunes3, IE Bergmann1 1 CEVAN‐ICT Dr. César Milstein, CONICET, CABA, Argentina. 2 DILABSENASA. Dirección de Laboratorios. Servicio Nacional de Calidad y Sanidad Agroalimentaria, Martínez, Argentina. 3 PROCC. Programa de Computacao Científica- Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil. El virus de la fiebre aftosa es el agente causal de una de las enfermedades más devastadora en la producción agropecuaria, afectando a animales de pezuña hendida, como bovinos, porcinos y ovinos. La Argentina es reconocida como país libre de fiebre aftosa por la Organización Mundial de Sanidad Animal, con una zona donde no se aplica la vacunación, principalmente concentrada al sur del paralelo 42, y una región donde se vacuna sistemáticamente, por lo cual la reintroducción de la enfermedad supone un riesgo alarmante. Existen siete serotipos inmunológicamente distintos, O, A, C, Asia 1, SAT 1, SAT2 y SAT3, y es conocido que la infección o vacunación con un serotipo no confiere protección cruzada contra los otros, e inclusive puede no proteger completamente contra otros subtipos del mismo serotipo, por lo que las cepas incluidas en la vacuna, y también las que componen las reservas de bancos de antígenos, se seleccionan considerando esta característica. En Argentina las vacunas son formuladas con cepas que, luego de estudios detallados de protección cruzada, han probado ser eficaces contra los virus que han circulado en el país y la región. En los últimos años, los brotes registrados en el continente, y de los cuales existen muestras disponibles, se han limitado a Ecuador (164 brotes del tipo O entre los años 2008-2011) y a la re-aparición del virus tipo O en Paraguay, en el año 2011. En este trabajo se presenta la caracterización genética, mediante el análisis del secuenciamiento de nucleótidos de las regiones que codifican para la proteína VP1 y la poliproteína P1, y la composición aminoacídica deducida del mismo de estos aislamientos. Este análisis se comparó con los perfiles antigénicos que se obtienen por la reactividad del virus frente a un panel de anticuerpos monoclonales, con los resultados de relaciones r1 de estos virus con respecto a la cepa vacunal, calculados mediante ensayos de Virus Neutralización bidimensional, y con los resultados de protección in vivo (PGP). Los cambios genéticos que puedan haber impactado en el comportamiento antigénico también se analizaron mediante la determinación de la estructura 3D de la P1, establecida a través de modelado por homología, con respecto a la cepa vacunal. La caracterización genética mostró que los virus aislados en Ecuador y Paraguay son molecularmente alejados del virus vacunal. Los cambios genéticos detectados se reflejan en el perfil de reactividad con anticuerpos monoclonales y también en las relaciones inmunogénicas (r1), y en la protección al desafío viral. El análisis de la composición aminoacídica y de modelaje molecular de la región que codifica para la región que codifica a las 4 proteínas de la cápside viral (P1) mostró que se registran cambios importantes como deleciones y sustituciones en sitios antigénicos, localizados en las proteínas VP1, VP2 y VP3, que podrían explicar las diferencias antigénicas encontradas así como la disminución en la protección conferida por las vacunas. EVALUACIÓN DE LA EFECTIVIDAD DE LAS CAMPAÑAS DE VACUNACIÓN ANTIAFTOSA EN ARGENTINA EA León, AM Perez, MA Stevenson, B Robiolo, N Mattion, C Seki, J La Torre, A Torres, B Cosentino, SJ Duffy Instituto de Patobiología, INTA, Castelar, Argentina. La vacunación sistemática y obligatoria de los bovinos ha sido la principal estrategia de muchos países de Sudamérica para controlar la Fiebre Aftosa (FA). Actualmente la utilizan para prevenir las consecuencias vinculadas a una eventual reintroducción del virus. Su objetivo es inducir un nivel de protección en la población bovina capaz de reducir las probabilidades de establecimiento y diseminación del virus y facilitar su control en el caso de que los animales fuesen expuestos al agente. La efectividad de una campaña de vacunación depende de: a- la calidad de la vacuna; b- la estrategia de vacunación; c- la cobertura vacunal; dla operatividad. La evaluación de la efectividad de las campañas de vacunación es necesaria para identificar posibles fallas e implementar medidas correctivas a tiempo. Objetivo del estudio: evaluar la efectividad de las campañas de vacunación anti FA en la provincia de Buenos Aires. Se diseñó un estudio serológico a nivel ENTE de vacunación, para estimar con un 95% de confianza la prevalencia de bovinos de categoría 1 (6 a 12 meses de edad) y de categoría 2 (1 a 2 años de edad) protegidos contra el virus de la FA. El diseño permitió también estimar la proporción de establecimientos adecuadamente vacunados. Se tomaron 420 sueros de bovinos de categoría 1 y 126 de categoría 2, procedentes de 42 establecimientos por ENTE. Es estudio se realizó en la provincia de Buenos Aires los años 2004, 2007, 2008 y 2011. Participaron de manera voluntaria 39, 18, 11 y 21 ENTES respectivamente. Se analizaron más de 42000 muestras procedentes de 3300 establecimientos. Las muestras se analizaron por ELISA en fase líquida. Se determinaron los títulos de anticuerpos séricos contra los tipos A2001 y O1Campos. Se fijó una línea de corte para identificar a los animales protegidos (títulos compatibles con el 75% de expectativa porcentual de protección). No se observaron diferencias significativas entre los títulos de los dos tipos virales analizados. En términos generales se apreció un incremento de los niveles inmunitarios a través del tiempo, así como niveles de protección significativamente superiores en los animales de categoría 2 con respecto a los de categoría 1. Los resultados globales, incluyendo la totalidad de los animales y establecimientos estudiados durante los 4 estudios fueron: Bovinos categoría 1 protegidos: 63% (IC95%: 62%-64%) Bovinos categoría 2 protegidos: 91% (IC95%: 90%-92%) Establecimientos adecuadamente vacunados: 81% (IC95%: 80%-82%) La distribución de los resultados por ENTE fue variable, con diferencias significativas en las proporciones de animales y establecimientos protegidos, sugiriendo deficiencias en la implementación de la vacunación en ciertos ENTES. Se destaca que en ENTES con similar proporción de animales protegidos se observaron importantes diferencias en la proporción de establecimientos protegidos. El método propuesto resultó efectivo para la evaluación de la efectividad de las campañas de vacunación anti FA. Viernes 26 de junio Sala B (Salón Dorée - 1º piso) 9:00 – 10:30 hs. MESA REDONDA SV3: EPIDEMIOLOGÍA DE ZOONOSIS DE INTERÉS REGIONAL Coordinadores: María Isabel Craig. Instituto de Virología, INTA, Castelar, Argentina. Marcelo Peccoraro. Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, La Plata, Argentina. 29 Libro de resúmenes Panelistas: Laura Tauro. Laboratorio de arbovirus y arenavirus, Instituto de Virología “Dr. J.M. Vanella” Facultad de Ciencias Médicas, UNC, Córdoba, Argentina. Javier Cappuccio. Instituto de Virología, INTA, Castelar, Argentina; Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, La Plata, Argentina. Daniel M. Cisterna. Departamento de Virus, INEI‐ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. VIRUS BUNYANWERA, UN PATÓGENO EMERGENTE DE IMPORTANCIA VETERINARIA PARA ARGENTINA LB Tauro Instituto de Virologia "Dr. J.M. Vanella" Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. La mayoría de los arbovirus que poseen relevancia médica / veterinaria pertenecen a un grupo reducido de géneros, como Orthobunyavirus (Bunyaviridae), Flavivirus (Flaviviridae) y Alphavirus (Togaviridae). En Argentina circulan numerosos virus pertenecientes a estos tres géneros y para muchos de ellos aún no se conoce su potencial patógeno en humanos y animales. Dentro del género Orthobunyavirus se encuentra el virus Bunyamwera (BUNV), el cual incluye 27 cepas alrededor del mundo. En toda América, este virus merece especial atención por su potencial patógeno tanto animales como en el hombre ya que se lo encuentra asociado a la producción de enfermedad del Sistema Nervioso Central, malformaciones congénitas y abortos. En Argentina han sido recuperadas de mosquitos dos cepas de BUNV, CbaAr426 (Córdoba, 1964-1965) y AG83-1746 (Santa Fe, 1982). Encuestas serológicas realizadas en Argentina detectaron elevadas prevalencias de infección para BUNV (CbaAr426) en humanos (sanos, con síndrome neurológico y enfermedad febril indiferenciada) y en animales domésticos y silvestres. En el año 2009 en la ciudad de Córdoba se detectó un caso de síndrome febril en humanos por BUNV (CbaAr426), siendo este es el primer registro para América del Sur de enfermedad por este virus. Durante el otoño del 2013 en la provincia de Santa Fe ocurrió el primer brote de importancia veterinaria por BUNV en el país, donde se produjo la muerte de dos caballos con síndrome neurológico a partir de los cuales se aislaron 2 nuevas cepas (SFCrEq231 y SFBzEq232) de BUNV; posteriormente (Julio, 2013) en la misma zona otra cepa de BUNV (SFAbCrEq238) fue recuperada a partir del cerebro de un aborto equino. La obtención del genoma completo mediante técnicas de secuenciación de última generación (GSFLX 454 e Ion PGM torrent) de las nuevas cepas de BUNV aisladas durante el brote y su posterior análisis filogenético mostró que las mismas resultaron ser idénticas entre si pero diferentes a la cepa CbaAr426 de BUNV. Estudios serológicos detectaron anticuerpos neutralizantes contra CbaAr426 en mas del 70% de los caballos convivientes con los equinos muertos y con la hembra que sufrió el aborto. De acuerdo a la prueba de neutralización cruzada la cepa CbaAr426 mostro una diferencia de 4 veces en el título de su suero homólogo respecto a las nuevas cepas aisladas. Estos hallazgos ponen en evidencia la circulación de nuevas cepas de BUNV en Argentina y constituyen la primer evidencia de una posible asociación entre la infección por BUNV y síndrome neurológico en animales domésticos para Centro y Sudamérica. Por otra parte estos resultados remarcan la importancia de intensificar la vigilancia epidemiológica de BUNV para mejorar el diagnostico diferencial y así poder determinar el verdadero agente etiológico causante de enfermedad en animales domésticos teniendo en cuenta que en nuestro país circulan otros virus también asociados a la producción de síndrome neurológico en equinos. EPIDEMIOLOGÍA DEL VIRUS DE INFLUENZA EN CERDOS EN LA REPÚBLICA ARGENTINA. QUEDA UN LARGO CAMINO PARA RECORRER JA Cappuccio1 2, M Dibarbora1, M D´Angelo1, V Olivera1, A Pereda1 1 Instituto de Virología, CICVyA, INTA, Argentina. 2 Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, Argentina. La epidemiologia de la influenza porcina (IP) presenta diferencias con la epidemiología de la infección en el hombre, algunas de ellas son: - Diferente origen de los subtipos en países y continentes. - La tasa de mutaciones en el cerdo es menor. - Estudios de campo estiman un R0 de 2 a 7. Debemos tener esto siempre presente para poder comprender mejor la epidemiología de la IP Situación en Argentina: La IP en Argentina tiene un antes y después de la pandemia de 2009. Estudios previos a los primeros casos confirmados de IP reportaron anticuerpos contra cepas humanas o estrechamente relacionadas con virus humanos desde el año 2002. Granjas intensivas: Lamentablemente, aún no se han realizado estudios epidemiológicos profundos en relación a IP en nuestro país. Similar a lo reportado en otros países, se considera a la IP como un problema frecuente en cerdos de destete (afecta generalmente animales de entre 30 y 60 días), menos frecuentemente se observan signos en otras categorías. La presentación clínica más frecuente es la endémica, reportándose pocos cuadros epidémicos, asociados a un elevado recambio de plantel reproductor de granjas previamente infectadas. Siendo también frecuente la presencia de cuadros subclínicos (se detecta circulación viral, en ausencia de signos clínicos). La sobrevida del virus en una granja, difiere según los sistemas de producción. En sistemas multisitios parece tener lugar mediante el pasaje continuo entre cerdos susceptibles o el ingreso de nuevas reproductoras. En los sistemas de único sitio hay quienes la consideran que es una infección autolimitante. Desde el año 2010 se recibieron muestras de 56 establecimientos porcinos para detección de virus de influenza, 26 (46,4%) tuvieron al menos una muestra positiva. Todas las granjas evaluadas tuvieron anticuerpos anti influenza. Granjas pequeñas (confinadas, mixtas o a campo): Se realizó un estudio serológico en 60 establecimientos de productores porcinos de menos de 100 madres en las provincias de Buenos Aires, Córdoba, Chaco, Misiones, Tucumán, Neuquén y Rio Negro. De las mismas 44 (73%) tenían anticuerpos contra virus H1pdm y 6 (10%) contra H3 porcino de origen humano. Al evaluarlo a nivel animal el 55% de las cerdas y el 14% de los capones fueron positivos a H1pdm, mientras que solo el 1,6% de las hembras y capones fueron positivos a H3. Una sola de las granjas fue positiva por real time PCR. Caracterización molecular de los aislamientos obtenidos en Argentina período 2008-2014: A la fecha se caracterizaron 44 aislamientos. El 68,8% corresponden al subtipo H1N1pdm. El 11,3% pertenecen al subtipo H3N2 y 15,9% al subtipo δ2 H1N1. Otros subtipos identificados fueron el δ2 H1N1 y un recombinante H3N2. Conclusiones: Queda mucho trabajo por hacer para entender mejor la epidemiología de la IP en nuestro país. El tipo y tamaño de la explotación afecta la persistencia del virus en la granja. El uso masivo de vacunas podría ayudar a estabilizar inmunológicamente a la población porcina. RABIA EN MURCIÉLAGOS DE ARGENTINA DM Cisterna Servicio de Neurovirosis, INEI-ANLIS Malbran, Argentina. La rabia es una enfermedad mortal prevenible mediante vacunación producida por el virus rábico (RABV) perteneciente al género Lyssavirus de la familia Rhabdoviridae. Se distinguen dos ciclos epidemiológicos: urbano y selvático. La rabia urbana tiene como principal reservorio al perro. En cambio, en la rabia silvestre intervienen varias especies animales según el nicho ecológico; el virus permanece en su ciclo enzoótico y tiene dos formas: la terrestre, donde intervienen una gran variedad de mamíferos silvestres y la aérea, mantenida por los quirópteros o murciélagos. En Argentina, el control de la rabia canina ha puesto de manifiesto la importancia de la rabia silvestre transmitida por murciélagos insectívoros y hematófagos. La rabia por murciélagos insectívoros, se extiende a lo largo de todo el país. La prevalencia en los centros urbanos oscila entre el 3-6%, aunque estos valores pueden estar influidos por diversos sesgos. El análisis antigénico y genético de una colección de cepas de rabia de Argentina obtenidas de diferentes 30 Libro de resúmenes especies de murciélagos insectívoros reveló patrones epidemiológicos complejos caracterizados por la presencia de múltiples ciclos endémicos mantenidos por sus reservorios. Estos ciclos son afectados por los diversos aspectos ecológicos de los murciélagos tales como conducta social, patrones migratorios y hábitat natural. La rabia por murciélagos vampiros o rabia paresiante es transmitida por el murciélago Desmodus rotundus. Es una enfermedad epidémica, regional, focal y recurrente, cuya área endémica en Argentina abarca la totalidad de las provincias de Misiones, Chaco y Formosa y parte de las de Salta, Jujuy, Tucumán, Catamarca, Santiago del Estero, Santa Fe y Corrientes. El análisis filodinámico de la estructura poblacional del virus rábico en Argentina asociado a esta especie reveló una estructura temporal y geográfica influida por las condiciones climáticas, topográficas y biogeográficas. El discernimiento de los ciclos de transmisión rábica en los que participan estas especies es de relevancia para la identificación de áreas de riesgo humano y animal y en la elaboración de estrategias de control de la rabia. posteriormente modificada mediante manipulación genética para introducir los correspondientes marcadores antigénicos. La cepa candidata fue posteriormente evaluada como vacuna en diferentes ensayos de efectividad, protegiendo cerdos primo-vacunados a diferentes tiempos post-vacunación, así como demostrando la funcionalidad de sus marcadores antigénicos. Para finalizar, se discutirá la factibilidad de introducir mejoras en la cepa desarrollada, tanto como la validez y aplicabilidad de la estrategia utilizada. 11:45 – 13:15 hs. MESA REDONDA SV4: ENFERMEDADES VIRALES EN ANIMALES DE PRODUCCIÓN NO CONVENCIONAL Coordinadores: Maximiliano Wilda. Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. Cesar Milstein", CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Mariano Bacci. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA), Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. 10:30 – 11:15 hs. CONFERENCIA SV2 Manuel Borca. Plum Island Animal Disease Center, Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture, Greenport, Nueva York, EE.UU. DESARROLLO DE UNA VACUNA CONTRA LA PESTE PORCINA CLÁSICA MEDIANTE LA IDENTIFICACIÓN Y MANIPULACIÓN DE DETERMINANTES GENÉTICOS DE VIRULENCIA DEL VIRUS. M Borca Plum Island Animal Disease Center, Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture, Greenport, Nueva York, Estados Unidos. La peste porcina clásica (PPC) es una grave enfermedad que afecta principalmente al cerdo domestico. Debido a su importancia epidemiológica, la enfermedad es de denuncia obligatoria. Su presentación clínica es de gravedad variable, dependiendo en gran medida de la cepa viral actuante. La PPC es causada por un virus pequeño, envuelto, con un genoma compuesto por una cadena simple, relativamente pequeña (aproximadamente 12Kb) de RNA de polaridad positiva. El genoma codifica para una poliproteína que una vez procesada en el citoplasma celular, da origen a 4 proteínas estructurales y 7 no estructurales. La cápside viral está formada por una de las proteínas estructurales, Core, mientras que las otras tres, las glicoproteínas E0, E1 y E2 están asociadas con la envoltura. La prevención de la enfermedad tradicionalmente se obtiene mediante la utilización de vacunas basadas en cepas virales atenuadas. Estas vacunas a pesar de ser altamente efectivas (protegen desde una semana de administradas), carecen de marcadores antigénicos que permitan diferenciar animales vacunados de aquellos infectados con cepas virales de campo. Esta problemática demandó el desarrollo de vacunas antigénicamente marcadas (VAM). La primera VAM se basó en el uso de la glicoproteína E2 (que concentra la mayoría de los epitopes inductores de anticuerpos protectores) expresada en baculovirus. La vacuna resultó eficaz aunque la inducción de inmunidad demandaba al menos 3 semanas. Esto desembocó en la necesidad de desarrollar VAM utilizando cepas virales atenuadas. Esta presentación describe la estrategia seguida en nuestro laboratorio en el desarrollo racional de una cepa vacunal atenuada conteniendo marcadores antigénicos. La estrategia general consistió en la identificación de marcadores genéticos de virulencia (MGV), áreas del genoma críticas en el proceso de patogénesis viral. Se emplearon diferentes estrategias a partir de un clon infeccioso codificante para una cepa viral altamente virulenta, Brescia. Se discutirán brevemente las estrategias utilizadas, incluyendo genómica comparativa y estructural, genética funcional e interacción proteica, y sus implicancias en términos de alteración de la virulencia viral. La información obtenida fue utilizada para el desarrollo racional de cepas atenuadas, algunas de ellas conteniendo combinaciones de MGV, las que fueron evaluadas como vacunas experimentales. A partir de la información obtenida, la cepa vacunal desarrollada fue Panelistas: Francisco José Reynaldi. Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, La Plata, Argentina. Fernando Raibenberg. Dirección de Acuicultura, Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Andrea Marcos. Dirección Nacional de Sanidad Animal, SENASA, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. VIRUS QUE AFECTAN A LAS ABEJAS DE ARGENTINA. FJ Reynaldi1 2, GH Sguazza1, RS Castilla2 3, MRI Pecoraro1, CM Galosi1 3 1 Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, Argentina. 2 CCT - CONICET La Plata, Argentina. 3 CIC PBA, Argentina. La producción apícola resulta una actividad agrícola primordial no solo por la producción de miel sino también por el rol que cumplen las abejas como polinizadores en cultivos industriales y plantas silvestres. La polinización, asegura la reproducción sexual en la mayoría de la plantas con flores, garantizando la sustentabilidad productiva y el mantenimiento de la biodiversidad de la mayoría de los ecosistemas terrestres. Desde el punto de vista económico, Argentina es un importante productor de miel, en la actualidad, ocupa el 5º lugar como productor mundial con 60 miles de toneladas por año. Las abejas melíferas son susceptibles de padecer enfermedades causadas por parásitos, hongos, bacterias y virus. También pueden verse afectadas por diversas plagas, depredadores y factores ambientales adversos (incluida la acción del hombre). En 2006, comenzó a producirse a gran escala, pérdidas inexplicables de abejas en diferentes partes del mundo, que afectaron negativamente la producción apícola global. El fenómeno, denominado “Síndrome de despoblamiento de las colmenas” (SDC), fue en parte responsable de la disminución de la producción mundial de miel, y en la actualidad, el SDC sigue siendo un problema para la producción y el comercio de miel; particularmente en Estados Unidos y la Unión Europea, que han sido las regiones más afectadas. En Argentina sólo se han reportado esporádicos casos con sintomatología similar a la descripta para SDC. En el mundo hasta el presente se han identificado 22 virus de abejas que infectan las colonias. La mayoría de estos virus tienen un genoma de ARN de simple cadena con polaridad positiva y son clasificados como virus tipo Picornavirus. En Argentina, desde que se iniciaron los estudios en el año 2008 se han detectado 7 virus; Virus Israel de la Parálisis Aguda (IAPV), Virus de las Alas deformadas (DWV), Virus de la Parálisis Crónica (CBPV), Virus de la Cría Ensacada (SBV), Virus de las Celdas Reales Negras (BQCV), el Virus de la Parálisis Aguda (ABPV) y el Virus de Kashmir (KBV). Si bien muchos de estos virus con frecuencia existen en la colonia como infecciones latentes pueden multiplicarse rápidamente bajo condiciones de estrés y causar enfermedad. Esto ocurre a menudo, cuando la colonia se ve comprometida por factores de estrés externos tales como la infestación con el ácaro Varroa 31 Libro de resúmenes destructor, que también pueden transmitir alguno de estos virus y la alteración de la función inmune del huésped. Ya que los efectos de la infección viral no siempre son observables, existe un reto en el diagnóstico y seguimiento de las infecciones por estos agentes. El conocimiento de la incidencia y diseminación de cada uno de estos virus en Argentina, es vital para intentar la prevención de futuras epizootias, permitiendo un control más efectivo de estas enfermedades. ENFERMEDADES VIRALES DE ANIMALES ACUÁTICOS DE INTERÉS EN ACUICULTURA. FC Raibenberg Dirección de Acuicultura, Subsecretaria de Pesca y Acuicultura, Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca, Argentina. El crecimiento sostenido de la acuicultura mundial constituye uno de los cambios más importantes en la producción global de agroalimentos de los últimos 50 años. Impulsada por el crecimiento demográfico, el progresivo aumento de la demanda de pescado y mariscos (Fish food), y la limitada capacidad de la pesca extractiva para satisfacer tal demanda, han estimulado la rápida expansión de los cultivos de animales acuáticos para convertir al sector acuícola, en una industria de importancia internacional. La acuicultura figura actualmente como una parte integral de la economía de varios países (China, India, Noruega, Chile). Provee empleos y ha promovido el desarrollo socio económico en regiones rurales y comunidades costeras de escasos recursos, particularmente en Asia, aliviando la presión de la pesca tradicional sobre la sustentabilidad de ríos, lagos, y océanos. En Argentina, si bien la producción es de bajo volumen (4000 ton/2013), viene aumentando (27 % interanual 2012-13). Una gran variedad de especies de animales acuáticos se cultivan en sistemas de mediana a alta densidad en aguas continentales y marinas donde se ven expuestas a nuevos ambientes, en consecuencia a potenciales nuevas enfermedades. El stress del cautiverio, las dietas artificiales no balanceadas, y un manejo no adecuado pueden comprometer la inmunidad de los animales acuáticos para combatir las infecciones. Asimismo, las prácticas de cultivo intensivo pueden favorecer la rápida propagación de las enfermedades. El prolífico comercio internacional a través del movimiento de animales acuáticos vivos, y sus productos que pueden estar infectados o ser portadores de agentes virales viables, es y continúa siendo la principal causa de dispersión de enfermedades virales. Dicho escenario constituye una amenaza significativa para los cultivos, y las poblaciones silvestres de todo el mundo. Los virus de animales acuáticos de interés en acuicultura tienen importancia debido a las pandemias y pérdidas económicas que generan. Varios virus ARN y ADN que infectan peces, crustáceos, y moluscos de importancia para la acuicultura han sido identificados, y estudiados en los últimos 20 años. En esta revisión se presenta un panorama general de los agentes etiológicos virales que afectan los cultivos de animales acuáticos y como los virus que producen mayor impacto constituyen un factor limitante para la expansión de la acuicultura mundial. Además se describe la situación particular de la Argentina y los programas de vigilancia epidemiológica de enfermedades virales de animales acuáticos que están vigentes y en desarrollo por parte de la autoridad nacional competente, el Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria SENASA en convenio de cooperación técnica con la Dirección de Acuicultura, de la Subsecretaria de Pesca y Acuicultura, del Ministerio de Agricultura Ganadería y Pesca de la Nación. VIRUS EN CAMÉLIDOS SUDAMERICANOS Y CIERVOS DE PRODUCCIÓN A Marcos Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria, Argentina. Si bien la producción predominante en nuestro país es la producción bovina, existen otras producciones no convencionales. Estas producciones se caracterizan por ser de menor tamaño y estar asociadas a alguna región del país. En el caso de los camélidos es una producción que permite aprovechar zonas marginales. La distribución de la producción depende de la especie. Las vicuñas y las llamas se encuentran en el Noroeste Argentino, principalmente en la provincia de Jujuy. La explotación de guanacos, en cambio, se realiza en la Patagonia, en mayor cantidad en Santa Cruz. Los productos obtenidos son la fibra y la carne, que se comercializan a nivel local y regional. La producción de ciervos colorados se concentra en Buenos Aires, La Pampa y San Luis. Los productos obtenidos en su mayoría se exportan, ya sea la carne, menudencias y otros incomestibles (por ejemplo astas). Existen antecedentes mundiales de virus detectados en ciervos colorados y camélidos sudamericanos de producción. Algunos de los virus que pueden afectar a los ciervos y camélidos de producción son: Herpesvirus, Adenovirus, Poxvirus, Picornavirus, Reovirus, Pestivirus, Rabdovirus, Rotavirus y Coronavirus. La Fiebre Catarral Maligna (Herpesvirus) es una de las principales enfermedades virales que afectan a los ciervos de producción en Norteamérica. Otro Herpesvirus que puede afectar tanto a ciervos como camélidos es el que produce la Rinotraqueítis Infecciosa Bovina. El Adenovirus produce la Enfermedad Hemorrágica en ciervos, detectada en Canadá, y el Poxvirus (Parapoxvirus) que provoca enfermedad en ciervos solo ha sido detectado en Nueva Zelanda. La Fiebre Aftosa (Picornavirus) es una enfermedad que puede afectar a todos los animales biungulados, como los ciervos. Hay dos enfermedades producidas por Reovirus, Lengua Azul y Enfermedad Hemorrágica Epizoótica, la primera distribuida mundialmente y la segunda que afecta cérvidos de Norteamérica. La Diarrea Viral Bovina, producida por un Pestivirus, está ampliamente distribuida en bovinos y puede afectar a ciervos y camélidos. La rabia, producida por un Rabdovirus, se encuentra presente en la zona centronorte de nuestro país y podría afectar tanto a ciervos como camélidos. En nuestro país existen antecedentes en camélidos de anticuerpos contra Rotavirus, virus de la Diarrea Viral Bovina, virus de la Rinotraqueítis Bovina Infecciosa. Desde SENASA se han realizado monitoreos serológicos en estas producciones. De 856 camélidos analizados entre 2010 y 2013 todos resultaron negativos a anticuerpos contra Fiebre Aftosa ni Lengua Azul. El 28,27% resultó positivo a anticuerpos contra Diarrea Viral Bovina. De 245 ciervos analizados entre 2008 y 2013 no se detectaron anticuerpos contra Fiebre Aftosa, Lengua Azul ni Diarrea Viral Bovina, pero el 7% resultaron positivos a la detección de anticuerpos contra el virus de la Rinotraqueítis Infecciosa Bovina. Se puede suponer que la fuente de infección serían los animales de producción convencionales. 32 Libro de resúmenes Posters Martes 23 de junio Sala C (Petit Dorée - 1º piso) 13:45 - 15:15 hs. Evolución 0008 EVIDENCIA DE RECOMBINACIÓN HOMOLOGA EN VIRUS CHIKUNGUNYA PE Casal1, D Chouhy1 2, EM Bolatti2, GR Perez1, EJ Stella2, AA Giri1 2 1 Área Virología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, Argentina. 2 Grupo de Virología Humana, IBR-CONICET/Universidad Nacional de Rosario, Argentina. El Virus Chikungunya (CHIKV; Togaviridae: Alphavirus), es un arbovirus transmitido por mosquitos que causa fiebre aguda y dolor de las articulaciones en los seres humanos. Recientemente, diversos brotes endémicos de CHIKV han puesto en peligro la salud pública en numerosas regiones geográficas del mundo, causando millones de casos en más de 50 países. Si bien en Argentina hasta el momento no se han registrado casos de fiebre Chikungunya autóctonos, existe un brote epidémico que abarca numerosos países del Caribe, América Central y Sudamérica. En este trabajo, se analizaron las asociaciones filogenéticas de las cepas de CHIKV depositados en la base de datos GenBank y se exploraron los posibles eventos de recombinación en 152 aislamientos genómicos. Mediante análisis Bayesiano se definieron los tres genotipos de CHIKV [West African, Asian, East/Central/South African (ECSA)], y se obtuvo una clara división del genotipo ECSA en tres subgrupos (I-II-III). Resultados similares se obtuvieron utilizando secuencias de genomas completos y del gen E1. Para facilitar la clasificación de CHIKV dentro del clado ECSA aquí proponemos un valor de corte basado en la identidad nucleotídica que se puede aplicar, ya sea en el análisis de genomas completos, así como en el del gen E1. Sucesivamente se exploraron posibles eventos de recombinación utilizando siete métodos bioinformáticos (RDP, GENECONV, BootScan, MaxChi, CHIMAERA, SIScan, 3Seq). Este análisis permitió identificar un evento estadísticamente significativo (rango de p: 1.14x10-7 - 4.45x10-24) situado dentro de la región codificante de la proteína no estructural 3 (nsP3). Este hallazgo se confirmó mediante la construcción de redes filogenéticas usando el programa SplitTree (Test PHI, p = 0,004) y por el análisis de incongruencias filogenéticas. La cepa recombinante, KJ679578/India/2011 (ECSA III), fue aislada del suero de un paciente visitando Calcuta (India) y deriva de cepas pertenecientes a los subgrupos ECSA III y ECSA I. El virus recombinante carece de las sustituciones adaptativas (primera, E1-A226V; segundas, E2-E2-K252Q y L210Q) de CHIKV en Aedes albopictus, lo que sugiere que la cepa KJ679578/India/2011 se ha transmitido principalmente por Aedes aegypti. En conclusión, este estudio demuestra por primera vez a la recombinación como un mecanismo adicional de diversidad genética en CHIKV, y podría facilitar el proceso de transmisión inter-especies. 0058 ANALISIS DEL GENOMA COMPLETO DE UNA CEPA INUSUAL G3P[3] DE ROTAVIRUS GRUPO A EN PACIENTE SINTOMATICA: EVIDENCIA DE REORDENAMIENTO A PARTIR DE MULTIPLES ESPECIES JI Degiuseppe1, IM Silveyra2, EA Reale1, JA Stupka1 1 Laboratorio de Gastroenteritis Virales. INEI ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”. CABA, Argentina. 2 Servicio de Microbiología. Hospital "Gobernador Centeno". La Pampa, Argentina. Los rotavirus del grupo A son los principales agentes etiológicos de diarrea aguda en los menores de 5 años. Su genoma está compuesto por once segmentos de RNA de doble cadena, rodeado por una triple cápside proteica. Esta naturaleza segmentada le permite experimentar fenómenos de reordenamiento intergénico en condiciones de coinfección con dos o más cepas de rotavirus. Convencionalmente, los rotavirus del grupo A se clasifican de acuerdo a la caracterización molecular de los genes que codifican para las proteínas de la capa externa de la cápside (VP7 y VP4, para el G y el P tipo, respectivamente). A pesar de que hasta el momento se han descripto 27 G y 37 P tipos, más del 90% de los rotavirus que producen diarrea en humanos corresponde a 5 asociaciones: G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8] y G9P[8]. En el año 2013, en el contexto de la vigilancia nacional de genotipos circulantes de rotavirus, se detectó la asociación G3P[3] en una paciente sintomática de 2 meses de edad en la provincia de La Pampa. Para establecer el posible origen de esta cepa inusual, se secuenciaron y analizaron los once segmentos genómicos de acuerdo a las recomendaciones del Rotavirus Classification Working Group (RCWG). La cepa estudiada presentó la constelación genómica G3P[3]-I2-R5-C2M3-A9-N2-T3-E3-H6. El genotipo G3 agrupó dentro del linaje III, a diferencia de los G3 detectados comúnmente en humanos (linaje I). Los análisis filogenéticos demostraron una elevada similitud global (9/11 genes) con cepas de rotavirus de origen felino/canino y, particularmente, con una cepa detectada en un niño de pueblos originarios de Estados Unidos. Por otra parte, dos genes (VP6 y VP1) se relacionaron con cepas de origen bovino y de animales del orden Artiodactyla. Es importante destacar que el genotipo R5 (gen VP1) solamente fue detectado circulando en alpacas en Perú y en guanacos, cabras y vacas en Argentina. Por lo tanto, para nuestro conocimiento, este estudio constituye el primer reporte de detección de este genotipo en humanos. Estos resultados indican que la cepa se originó a partir de múltiples eventos de reordenamiento entre dos o más especies animales y, posteriormente, produjo infección sintomática en el humano. Asimismo, al no observarse diseminación, se refuerza la hipótesis de que este tipo de asociaciones inusuales no presenta ventajas de adaptabilidad frente a las asociaciones más frecuentes. Consideramos importante esta clase de estudios debido a que contribuyen al conocimiento de la compleja dinámica evolutiva de este enteropatógeno. 0090 EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DEL VIRUS PARAINFLUENZA HUMANO TIPO 3, EN UN PERIODO DE 5 AÑOS (2009-2013) EN BUENOS AIRES, ARGENTINA S Goya, A Mistchenko, M Viegas Laboratorio de Virología del Hospital de Niños Dr. R. Gutiérrez, Argentina. El virus parainfluenza humano tipo 3 (HPIV3) pertenece al género Respirovirus, familia Paramixoviridae. Es la segunda causa de infecciones respiratorias agudas bajas, como bronquiolitis y neumonía, en los pacientes menores de 2 años en nuestro país, siendo superado solo por el virus sincicial respiratorio. Tiene un genoma ARN de polaridad negativa que codifica para 6 proteínas estructurales, entre ellas la glicoproteína Hemaglutinina-Neuraminidasa (HN). La HN es la proteína que presenta la mayor variabilidad de secuencia en el virus y por eso es la escogida para la caracterización molecular de los HPIV3. Recientemente dos autores fueron los que, en base a la variabilidad del gen de la HN y utilizando el cálculo de distancias genéticas, clasificaron al virus en clusters, subclusters y linajes genéticos. En este trabajo se analizaron las muestras de pacientes de 0 a 5 años de edad, hospitalizados con diagnóstico clínico de infección respiratoria agua baja que fueron positivas por inmunofluorescencia para el HPIV3 correspondientes al periodo 2009-2013. Se secuenció el extremo carboxilo terminal del gen de la HN en 89 muestras con un tamaño de fragmento analizado de 858 nt (que corresponde a la región de mayor variabilidad del gen). El análisis filogenético por inferencia bayesiana mostró que todas las cepas analizadas se clasificaron dentro del cluster C, y dentro de éste en los subclusters C1, C3 y C5; de los cuales el C3 resultó ser el predominante durante todo el período analizado. Se definieron nuevos linajes genéticos de circulación local dentro del subcluster C3. Se observó que no existe un patrón de circulación definido para este virus ya que existe cocirculación de subclusters y de linajes a nivel regional, circulación paralela de linajes en regiones 33 Libro de resúmenes distantes del mundo y circulación actual de linajes detectados hace 10 años en nuestra región y en el mundo. Se realizó un análisis de variabilidad y predicción de epitopes con recursos bioinformáticos y se encontraron mutaciones no sinónimas que se ubicaron dentro de probables epitopes B lineales. Las mismas se ubicaron en el modelo molecular realizado a partir de secuencias obtenidas en nuestro laboratorio y junto con evaluaciones pertinentes se confirmó que se ubicarían en la superficie de la proteína, expuestas hacia el exterior del virus, y susceptibles de ser reconocidas por el sistema inmune, por lo cual podrían ser un posible mecanismo de evasión del virus. Todas estas mutaciones no sinónimas que formarían parte de epitopes B lineales ocurren en secuencias que clasificaron dentro de los nuevos linajes locales descriptos en este trabajo. Por lo tanto, la información que proporciona este trabajo a nivel local, junto con análisis de otras partes del mundo, permitirá evaluar si la composición de la vacuna a virus vivos y atenuados que se encuentra actualmente en ensayos de fase clínica I será efectiva para proteger a los pacientes pediátricos contra los virus que circulan en nuestra región. 0102 COMPARTIMENTACION DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C EN PACIENTES CON HEPATOCARCINOMA PS Perez1, O Galdame2, E Mullen2, B Livellara2, A Gadano2, DM Flichman1, RH Campos1 1 Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA, Argentina. 2 Hospital Italiano Buenos Aires, Argentina. El virus de la Hepatitis C (HCV) posee alta variabilidad genética en cada paciente infectado, posibilitando un comportamiento de cuasiespecies. La infección crónica por HCV puede conducir, en última instancia, al desarrollo de hepatocarcinoma (HCC). Esto se debe, entre otras causas, a proteínas virales que interactúan con vías intracelulares potencialmente oncogénicas. Entre ellas, Core se ha asociado a transformación celular. Además, la variabilidad de la glicoproteína E2 responde a la acción del sistema inmune en el proceso de carcinogénesis. Estudios de estas proteínas arrojaron evidencias contradictorias sobre la existencia de compartimentación de las poblaciones del HCV en los tejidos hepáticos tumorales (T) y no tumorales (NT). El objetivo de este trabajo fue evaluar la compartimentación viral en 4 pacientes con HCC infectados por HCV-1b. Se amplificaron por RT-PCR las regiones de Core y E2 de suero, tejido hepático T y NT de los 4 pacientes. Los amplicones fueron clonados; las 481 secuencias obtenidas se analizaron filogenéticamente por máxima verosimilitud y se evaluó estadísticamente la compartimentación en un marco bayesiano. Se evaluaron los patrones de aminoácidos (aa) característicos de cada compartimento. El análisis filogenético mostró un comportamiento particular para cada paciente. En el caso 1, los clones de cada muestra agruparon por separado mostrando clara compartimentación. El caso 2 fue similar, pero un bajo número de clones resultaron entremezclados. En el caso 3, las secuencias de suero agruparon juntas; mientras que en los clones de los tejidos se observaron 2 linajes, representados en ambos compartimentos T y NT. Por último, en el caso 4, todos los clones se entremezclaron, aunque se observó cierta asociacion entre aquellos del mismo compartimento. El análisis bayesiano validó estadísticamente, en los 4 casos y en ambas regiones, la distribución asimétrica de las variantes virales en los compartimentos analizados. Finalmente, el análisis de aa reveló un patrón diferencial entre tejidos T y NT en todos los casos en la región de E2, pero sólo en los casos 1 y 2 en Core. En conclusión, los análisis filogenético y bayesiano permitieron demostrar la existencia de compartimentación viral en los tejidos hepáticos T y NT. Además, el análisis de aa reveló patrones característicos de cada compartimento hepático. Estas diferencias podrían responder, en E2, a una acción diferencial del sistema inmune frente a las células T y NT mientras que en Core podrían relacionarse con la regulación de genes celulares que contribuyen a la carcinogénesis. Si bien la situación fue distinta para cada paciente, ambas proteínas presentaron posiciones de aa propias cuyo posterior estudio podría contribuir al conocimiento del proceso de carcinogénesis mediado por la infección con HCV. 0115 DINÁMICA INTRAHUÉSPED DE CEPAS DE HIV-1 CON DISTINTOS TROPISMO POR SECUENCIACIÓN MASIVA. MF Fernández1, M Distéfano1, J Sfalcin2, S Baquedano2, F Fay2, A Mangano1, L Sen1, P Aulicino1 1 Laboratorio de Biología Celular y Retrovirus, Hospital de Pediatría ¨Juan P. Garrahan¨, Argentina. 2 Laboratorio CIBIC, Rosario, Argentina. Las cepas de HIV-1 pueden caracterizarse como X4 o R5 en función de su tropismo, que puede predecirse a partir de la secuencia del loop V3 (env) o determinarse in vitro, siendo las cepas formadoras de sincicios (SI) las que usan CXCR4 (X4) y no formadoras de sincicios (NSI) las que usan CCR5 (R5). La caracterización del tropismo viral ha cobrado importancia clínica para el tratamiento con drogas bloqueantes del CCR5 que impiden la replicación únicamente de los virus R5. En un estudio previo, hallamos discordancia entre el fenotipo caracterizado in vitro y la proporción de variantes X4 y R5 encontradas por clonado molecular. Nos propusimos caracterizar con mayor profundidad la diversidad de las variantes de HIV-1 en un individuo infectado por transmisión vertical utilizando la técnica de secuenciación masiva. Además, comparamos distintos compartimentos que representan cepas virales históricas (CMT) o circulantes (plasma) y cepas aisladas de co-cultivo. Se amplificó un fragmento de 633pb del gen env de HIV-1 –incluyendo 105pb correspondientes a la región hipervariable loop V3- de muestras de células mononucleares totales (CMT), plasma (P) y sobrenadante de co-cultivo (SN) previamente estudiado fenotípicamente en tres tiempos post-infección: t1 (SI, 9 años) t2 (NSI, 10 años) y t3 (SI, 11 años). Se secuenciaron las cuasiespecies virales con el equipo 454 GS-FLX (Roche). Para la predicción del tropismo viral, se analizó la secuencia del loop V3 con la herramienta bioinformática PSSM. Las cuasiespecies representativas se obtuvieron con el software QuRe, utilizando el fragmento completo del env. Las relaciones filogenéticas se evaluaron por Neighbor-Joining con el programa MEGA 6.0. En todas las muestras excepto P3, se analizaron de 2000 a 7000 secuencias. En los 3 tiempos, se encontró predominio neto de variantes X4 (>98%) y una mínima proporción de variantes R5 en todos los compartimentos (P, CMT y SN). La alta frecuencia de cepas X4 encontradas en t2 fue discordante con el fenotipo NSI. En el árbol filogenético, las secuencias del fragmento env completo no se agruparon de acuerdo al tropismo viral en el loop V3. Sin embargo, se observaron diferencias en la evolución de las cuasiespecies asociadas al fenotipo viral (SI/NSI): mientras que las variantes presentes en SN de t1 y t3 fueron similares entre sí, las presentes en SN de t2 fueron divergentes y no se encontraron representadas en muestras de P o CMT del paciente de ningún tiempo, Si bien en el paciente estudiado se observaron cambios en el fenotipo del HIV-1 “in vitro” en función del tiempo de infección, éstos cambios no fueron evidenciados en las secuencias del loop V3 (principal determinante del tropismo viral). Sin embargo, los cambios evolutivos en el gen env sugieren la contribución de otros determinantes genotípicos -aún no identificados- al tropismo viral. 0131 EVOLUCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C EN UN PACIENTE COINFECTADO CON EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA QUE NO RESPONDE A LA TERAPIA ANTIRETROVIRAL F Di Lello1, A Culasso1, C Parodi2, P Baré2, R Campos1, G García1 1 Cátedra de Virología, FFyB, UBA., Argentina. 2 Laboratorio de Virología, Academia Nacional de Medicina, Argentina. Durante la coinfección con los virus de hepatitis C (HCV) y de la inmunodeficiencia humana (HIV), la terapia antiretroviral de gran actividad (TARGA) puede modificar la evolución del HCV, al disminuir la carga viral del HIV, aumentar el número de CD4 (respondedor inmunológico) y favorecer la reconstitución del sistema inmune. Sin embargo, en algunos individuos tratados, se ha evidenciado el aumento del número de CD4, sin una disminución de la carga viral de HIV (no respondedor virológico). Debido a que es limitado el conocimiento de la evolución viral en estos individuos, el objetivo de este trabajo fue investigar cómo la TARGA afecta la evolución molecular del HCV y analizar su relación con la actividad del sistema inmune en un paciente 34 Libro de resúmenes con estas características (respondedor inmunológico, no respondedor virológico). Para ello, se realizó un estudio longitudinal donde se estimó la presión selectiva ejercida por el sistema inmune (recuento de CD4 y carga viral de HIV) sobre la variabilidad genética del HCV, a partir de 7 muestras de suero obtenidas en un período de 10 años. Los cambios en las poblaciones virales del HCV fueron estudiados mediante el análisis de diversidad (media de la distancia genética ± desvio standard) y complejidad (entropía normalizada de Shannon) en 123 secuencias de clones de las regiones hipervariables 1, 2 y 3. Durante todo el seguimiento, el paciente presentó una carga viral detectable para HIV con un valor promedio de 12589 (1659-63095) copias/ml. La muestra basal (M1) al inicio de la TARGA, presentó el menor recuento de CD4 (222 cel/μl), diversidad intragrupo (0,004 ±0.001) y complejidad (0,27) para HCV, de todo el período en estudio. En las cinco muestras siguientes (M2-M6), obtenidas a los 10, 48, 58, 65 y 76 meses de TARGA, el número de CD4 aumentó y permaneció estable por encima de 500 cel/μl. En paralelo, un incremento en la variabilidad genética de HCV se observó en los valores de diversidad de M2, M3, M4 y M5 (0,008 ±0,002; 0,020 ±0,004; 0,017 ±0,003 y 0,014 ±0,002) y complejidad (0,50; 0,73; 0.85 y 0.82), respectivamente. Al suspender el tratamiento se obtuvo la muestra M6, en la cual disminuyeron los valores de complejidad (0,010 ±0,003) y diversidad (0,62). De manera similar se comportó la muestra (M7), obtenida 35 meses luego de suspendida la TARGA. Presentó una disminución de los CD4 (300 cel/µl) y al igual que M6, una reducción en los valores de diversidad (0,012 ±0,002) y complejidad (0,67), que también indicaría una población viral menos heterogénea. Estos resultados fueron soportados por el estudio de Coalescencia Bayesiana donde se observó la menor diversidad viral en M1 y M7 (sin TARGA) y la mayor en las muestras M2 a M6. En conclusión, en nuestro paciente, la TARGA determinó el incremento de los valores de CD4 y esto se correspondió con un aumento en la diversificación viral del HCV. Esto estaría asociado a una mayor actividad del sistema inmune, aún en presencia de una carga viral detectable del HIV. 0182 EVOLUCIÓN DE LA PROTEÍNA LATENTE DE MEMBRANA 1 DEL VIRUS DE EPSTEIN BARR M Gantuz1, M Lorenzetti1, J Altcheh2, E De Matteo3, P Chabay1, MV Preciado1 1 Laboratorio de Biología Molecular, División Patología, Hospital de Niños R. Gutiérrez, Argentina. 2 Servicio de Parasitología y Enfermedad de Chagas, Hospital de Niños R. Gutiérrez, Argentina. 3 División Patología, Hospital de Niños R. Gutiérrez, Argentina. El Virus de Epstein Barr (EBV) es un gamaherpesvirus linfotrópico, agente etiológico de la Mononucleosis infecciosa (MNI), asociado a diversas neoplasias. La Proteína Latente de Membrana 1 (LMP1) es la proteína viral con mayor capacidad oncogénica, simula al receptor celular CD40 constitutivamente activo de una forma independiente de ligando, para estimular múltiples vías de señalización promoviendo así el crecimiento y la transformación celular e inhibición de la apoptosis. LMP1 es una de las proteínas del EBV con mayor variabilidad genómica, incluso la intra-individuo fue comparable con la observada en la infección inicial por ciertos ARN virus como West Nile Virus o HIV. Las causas por las cuales el EBV contribuye a la patogénesis de diferentes procesos neoplásicos están aún en discusión, la identificación de variantes específicas de LMP1 asociadas a tumores aportaría algunas respuestas a este interrogante. El objetivo fue estudiar la diversidad y evolución de las variantes de LMP1 circulantes en Argentina y determinar su asociación a neoplasias en pacientes pediátricos. En muestras pediátricas EBV+ (20 de sangre periférica de MNI, 27 biopsias ganglionares de linfomas y 14 de hiperplasia reactiva), se amplificó el gen BNLF1 (proteína LMP1) completo por PCR anidada. Se realizó la reconstrucción filogenética por Máxima Verosimilitud (PhyML) incluyendo aislamientos de GenBank. La fecha de toma de muestra (desde 1972 a 2013) se utilizó como tiempo de calibración para inferir la tasa de evolución y el tACMR utilizando BEAST 2.0. La Selección Molecular se analizó con HyPhy en el servidor web Datamonkey. Se identificó un grupo de aislamientos mayoritario (47,54%) relacionado a la variante Raji, que resultó de circulación predominante en nuestra región y en menor medida otras variantes previamente descriptas como B95.8, Alaskan y China2. No se observó asociación entre las variantes filogenéticas y alguna de las condiciones patológicas estudiadas, dado que las mismas se distribuyeron uniformemente entre los grupos con condición benigna, maligna y portadores sanos. El análisis filogeográfico incluyendo aislamientos de otras regiones del mundo mostró una estructura compleja en la cual algunas variantes mostraron distribución global y otras restringida a una región, como la variante argentina y las asiáticas. En cuanto a la evolución de LMP1, se observó una tasa acelerada en comparación a lo esperado para virus ADN, 1,394 x 10-4 subs/sitio/año (0,658-2,276 x 10-4 subs/sitio/año, 95% HPD), pero fue concordante con observaciones previas para ciertas proteínas de latencia de EBV. La edad estimada para el tACMR fue de 575 años. Se evidenció presión de selección sobre codones específicos tanto positiva como negativa sugiriendo que podría estar involucrado en la alta tasa de sustitución calculada. El análisis de variantes de LMP1 identificó una nueva variante de circulación en nuestra región y confirmó el alto grado de variación descripto para esta proteína. 0215 DISEÑO DE UN ENSAYO IN VITRO PARA LA EVALUACIÓN DEL FITNESS DE VARIANTES VIRALES DEL HBV. APLICACIÓN AL ESTUDIO DE MUTACIONES ASOCIADAS AL PROCESO DE SEROCONVERSIÓN DEL HBEAG DURANTE LA INFECCIÓN CRÓNICA. I Sevic, MM González López Ledesma, DM Flichman, RH Campos Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. El virus de hepatitis B (HBV) es un agente etiológico de enfermedad aguda y crónica con amplia distribución mundial. La infección crónica por HBV está asociada con patologías hepáticas severas como cirrosis y hepatocarcinoma. Durante el curso de la infección, el HBV evoluciona desde una etapa con elevada replicación viral, altos niveles de enzimas hepáticas y presencia del antígeno e (HBeAg) hacia una etapa de bajo nivel de replicación viral, enzimas hepáticas bajas/normales y presencia de anticuerpos antiHBe. La seroconversión de HBeAg a antiHBe está vinculada con la progresión de la patología hepática y puede detectarse a nivel molecular por la presencia de mutaciones en las regiones del promotor basal del core (BCP) y del precore (pC). La fijación de dichas mutaciones sería consecuencia de una ventaja comparativa (aumento de fitness) que permitiría el desplazamiento de la población viral salvaje. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un sistema experimental que permita evaluar el fitness relativo del HBV a nivel celular. Se obtuvieron los clones de genoma completo de HBV: a. Mutante BCP con las mutaciones 1753C-1762T-1764A-1766T (BCPmut), b. Mutante pC con la mutación 1896A (pCmut) o c. Cepa Salvaje sin estas mutaciones (HBVcs); 10-20 clones por muestra. Se transfectaron células Huh7 con una relación 50%-50% de clones BCPmut o pCmut con HBVcs. El sobrenadante que contiene la progenie viral fue cosechado a las 96 hs postransfección, el ADN viral fue extraído y amplificado por PCR. El producto de amplificación fue clonado y se analizó la frecuencia de cada variante en la progenie viral. Las frecuencias se compararon utilizando el test de Student. La frecuencia de clones BCPmut en la progenie (60,87±15,32%) fue significativamente mayor que la de HBVcs (39,13±15,32%) (p=0.045). Por otro lado, la diferencia en la frecuencia entre clones pCmut (47,50±10,07%) y HBVcs (52,50±10,07%) no fue significativa (p=0,49). En conclusión, se desarrolló un ensayo que permite evaluar el fitness relativo del HBV a nivel celular. Esta herramienta permitirá caracterizar biológicamente las mutantes que emergen durante el curso de la infección crónica por HBV. Los resultados obtenidos sugieren que las BCPmut tienen una diferencia a nivel replicativo que implicaría una ventaja comparativa respecto de la cepa salvaje a nivel celular (mayor fitness). Mientras que la fijación de las mutaciones en el pC sería consecuencia de una ventaja de los virus mutados a nivel del individuo (igual fitness), lo que podría estar relacionado con su interacción con el sistema inmune del hospedador. 35 Libro de resúmenes 0228 EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR Y DIVERSIDAD GENÉTICA DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B EN MAR DEL PLATA MC Torres1, E Civetta2, C D'Amico3, L Barbini1 1 Cátedra de Microbiología Clínica. Departamento de Química, FCEyN, UNMdP., Argentina. 2 Unidad de Hepatología y Alcoholismo del HIGA Dr. O. Alende., Argentina. 3 Unidad de Hepatología del Centro de Especialidades Médicas Ambulatorias., Argentina. Introducción: El virus de la hepatitis B (HBV) causa enfermedades hepáticas, incluyendo hepatitis agudas, crónicas, cirrosis y hepatocarcinoma. Se clasifica en diferentes genotipos (gts) con distinta distribución geográfica. Los estudios moleculares de los genomas contribuyen a comprender el estado epidemiológico actual en distintas localidades y permiten inferir si las infecciones por ciertos genotipos se encuentran en estado estacionario o en expansión. Objetivo: Describir la epidemiología molecular y la diversidad genética del HBV a nivel local en la ciudad de Mar del Plata. Metodología: Se estudiaron muestras de 56 pacientes infectados por HBV, consultantes en centros de salud pública de la ciudad. Se secuenciaron y analizaron filogenéticamente dos regiones del genoma: gen S y la región entre el gen X, BCP y PC. Se realizó un análisis Bayesiano de coalescencia para estimar la dinámica poblacional y el ancestro común más cercano (tMRCA) del subgt más prevalente (F1b). Se analizó la presencia de mutaciones de relevancia clínica. Resultados: Del análisis filogenético del gen S, se obtuvo la siguiente prevalencia de gts: 80% F1b, 9% A2, 7% D3 y 2% D1. Una muestra resultó un recombinante F4/D2. El punto de recombinación se ubicaría en ORF-X. Para el subgt más prevalente en esta muestra (F1b), del análisis de coalescencia Bayesiano, se estimó que el tMRCA sería de aproximadamente 14,4 años, situando al nodo más ancestral en 1998 y que la mayoría de los eventos de diversificación habrían ocurrido a partir del 2000. Por otro lado, se encontraron mutaciones de importancia clínica en las muestras analizadas. Un 20% gt F1b, un 2% A2, un 2% D1 y un 2% D3, presentaron las sustituciones A1762T y G1764A en el BCP, asociadas a disminución en la expresión de HBeAg. Una muestra gt D3 presentó la sustitución G1896A en el PC, resultante en un codón de stop, que confiere el fenotipo HBeAg negativo. Un 13% (2 F1b, 3 D3 y 1 A2) presentó mutaciones en el inmunodeterminante "a" del HBsAg, asociadas a escape a la vacuna. En el dominio RT de la polimerasa se hallaron mutaciones en un 52% de las muestras (16 F1b, 4 A2, 3 D3 y 1 D1), ninguna de ellas previamente reportada asociada a la resistencia a los antivirales. Conclusiones: La alta prevalencia de gt F1b resulta característica de Mar del Plata. Los análisis filogenéticos y de coalescencia mostraron que el sgt F1b, autóctono de Latinoamérica, habría llegado a Mar del Plata por los procesos migratorios recientes, desplazando a los gt del “viejo mundo” (A y D), presentes desde antes en la ciudad, y sería el responsable de las nuevas infecciones por HBV a nivel local. Los virus circulantes en la ciudad también presentan mutaciones de relevancia clínica, a ser consideradas en las estrategias de diagnóstico, prevención y tratamiento del HBV circulante en la ciudad. 0262 FILODINAMIA DE ECHOVIRUS 30 ASOCIADO A MENINGITIS ASÉPTICA EN ARGENTINA C Lema1, C Torres2, D Girard1, DM Cisterna1, J Cello3, MC Freire1 1 Servicio de Neurovirosis, INEI-ANLIS- Dr. Carlos G. Malbrán, Argentina. 2 Cátedra de Virología, FFyB, UBA, Argentina. 3 Center for Infectious Diseases, School of Medicine, Stony Brook University, Estados Unidos. El enterovirus humano (HEV) Echovirus 30 (E30) es un importante agente causal de meningitis aséptica, con patrón epidémico caracterizado por el desplazamiento temporal de diferentes linajes. Es un virus ARN, y su genoma evoluciona por mutación puntual y recombinación. La recombinación (región 3Dpol) se correlaciona con la divergencia en la proteína VP1. El objetivo de este trabajo fue estudiar el patrón filodinámico de E30 que circuló en Argentina durante 19982012; y analizar su variación debido a la recombinación. Se buscó HEV en casos de meningoencefalitis (ME) de probable etiología viral por RT-PCR y aislamiento viral en células RD (5188 muestras). Los E30 se identificaron por secuenciación de la región que codifica para la proteína VP1 y 3Dpol de los HEV aislados. Las secuencias de E30 se estudiaron mediante análisis filogenéticos y filodinámicos. Para la determinación de los linajes de E30 se analizaron 79 cepas de E30 junto con 858 disponibles en GenBank. La recombinación se estudió mediante análisis filogenéticos con cepas de referencias de todos los serotipos de HEV. El patrón filodinámico global y de los linajes con muestras de Argentina se estudió mediante análisis de coalescencia con el programa BEAST. Se detectaron 1926 HEV en 5188 casos de ME. De 393 HEV aislados, 132 cepas fueron E30, obtenidas desde 114 líquidos cefalorraquídeos y 18 heces. Los años 1998, 2003-2004, 2007 y 2011-2012 mostraron alta circulación viral. La reconstrucción filogenética mostró 8 grupos monofiléticos (linajes A-H), cada uno con subgrupos, y asociación temporal. Los linajes A, C, D, E y F presentaron una amplia distribución mundial (3 o más continentes), mientras que los linajes B, G y H mostraron una distribución más acotada (1 o 2 continentes). En Argentina y América del Sur sólo circularon los linajes E y F. El análisis de coalescencia de E30 mostró que el ancestro común más reciente comenzó a diversificarse en 1934 con una tasa de sustitución de 4,5 x10-3s/s/y. El ancestro más probable del linaje E se ubicaría en EEUU en 1991 y la del linaje F en Países Bajos en 1993. Se detectaron 12 recombinantes (todas de la especie B), 8 del linaje E y 4 del F. Los eventos de recombinación serían más frecuentes en el linaje E, que a su vez presentó una estructura más diversa en la región VP1 que el linaje F. Todas las recombinantes fueron monofiléticas con respecto al agrupamiento en VP1, esto muestra una estrecha relación genética de las cepas estudiadas entre ambas regiones (genes estructurales y no estructurales). Este es el primer estudio filodinámico de E30 con cepas de nuestra región. Los linajes E y F se distribuyeron mundialmente en un corto período de tiempo, lo que sugiere que podrían presentar alguna ventaja evolutiva con respecto a los otros linajes con diversificación igualmente reciente que no lograron esta amplia distribución, y también con respecto a linajes más antiguos, ya que necesitaron menor tiempo para establecerse como los más importantes. 0268 ANÁLISIS DE LA VARIACIÓN DE LAS POBLACIONES DEL VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO (HRSV) EN PACIENTES QUE SUFRIERON INFECCIÓN RESPIRATORIA PROLONGADA O REINFECCIÓN UTILIZANDO NUEVAS TECNOLOGÍAS M Viegas1 2, S Goya1, AS Mistchenko1 3 1 Laboratorio de Virología, Hospital de Niños "Dr. Ricardo Gutiérrez", Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. 2 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, CONICET, Argentina. 3 Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires, CIC, Argentina. El HRSV es una de las principales causas de infección respiratoria aguda baja (IRAB) severa en niños en todo el mundo. La población susceptible son los menores de cinco años, siendo los bebés menores de seis meses los que sufren infecciones más severas. Una de las características distintivas del HRSV es que se producen reinfecciones durante toda la vida. En ese sentido, numerosos estudios sobre aislamientos clínicos han demostrado una gran variación genética y antigénica, la cual surgiría como respuesta a la presión de selección inmune. El objetivo de este trabajo fue estudiar las características genéticas de las poblaciones virales que infectaron a pacientes hospitalizados por IRAB prolongada o reinfección entre los brotes epidémicos 2011 a 2013. Se analizó el gen de G, glicoproteína más variable, en muestras consecutivas de aspirados nasofaríngeos, mediante el clonado y secuenciación por Sanger (CSS), y por secuenciación con equipos de nueva generación (NGS). Además, se analizó el impacto en la población general de nuevas variantes genéticas detectadas. A partir de los sets de datos obtenidos por NGS y por CSS se reconstruyeron los haplotipos virales por alineamiento con cepas de referencia utilizando QuRe, Vphaser y PredictHaplo. Para analizar la dinámica de las poblaciones virales encontradas dentro y entre muestras y para determinar asociaciones con cepas que circularon local y globalmente se realizaron análisis filogenéticos por inferencia bayesiana (MrBayes) y se calcularon las distancias genéticas (dist.) de las poblaciones (MEGA v6). 36 Libro de resúmenes La profundidad para los diferentes set de datos obtenidos por NGS fue entre 8000X y 25000X, mientras que por CSS fue 30X, mostrando la potencialidad de la tecnología de NGS para este tipo de análisis. Entre los pacientes analizados, dos presentaban una fuerte inmunosupresión. Como consecuencia, los haplotipos virales encontrados en la primera y en la segunda muestra y la secuencia directa obtenida de cada muestra se asociaron en el mismo clado genético. La dist. máxima entre las variantes fue baja (0.38%), sugiriendo una infección prolongada. De los pacientes inmunocompetentes, uno albergaba en su primer muestra un solo haplotipo asociado con una cepa con duplicación de 72-nt que emergió en 2011. Nueve días después, albergaba dos haplotipos semejantes al primero y 50 días después de la primer muestra, presentaba al menos 4 tipos de haplotipos algunos asociados con el de la primera muestra y otros con cepas que circularon localmente en ese momento, sugiriendo infección prolongada y reinfección. El valor de dist. máxima fue de 3.96%. Otro paciente, sufrió su primer IRAB en diciembre del 2011 y su segunda en el brote de 2012. Los haplotipos virales encontrados entre ambas muestras fueron completamente diferentes, sugiriendo reinfección. Estos resultados muestran que diferentes condiciones inmunes de los pacientes podrían ser utilizados por el virus para generar reservorios y así explorar toda su plasticidad genética. 0275 IDENTIFICACIÓN DE UN NUEVO SUBGENOTIPO DEL VIRUS DE HEPATITIS B GENOTIPO F A PARTIR DE MUESTRAS DE PACIENTES CON INFECCIÓN CRÓNICA DE ARGENTINA. LN Mojsiejczuk1, C Torres1, V Re2, MB Pisano2, HA Fainboin3, OA Galdame4, RH Campos1, DM Flichman1 1 Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. 2 Instituto de Virología “Dr. Vanella”. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 3 Unidad de Hepatopatías Infecciosas, Hospital F. J. Muñiz, Argentina. 4 Sección Hepatología, Hospital Italiano, Argentina. El virus de la hepatitis B (HBV) se clasifica en ocho genotipos (A-H) en base al análisis de distancias genéticas entre secuencias de genoma viral completo. El genotipo F, considerado originario de los pueblos nativos americanos, es uno de los más prevalente de Argentina y hasta la actualidad se ha clasificado en cinco subgenotipos (sgt) denominados F1 a F5. El objetivo de este trabajo fue realizar una caracterización y análisis evolutivo de seis genomas completos del HBV genotipo F. Tres de ellos fueron aislados de pacientes residentes en la Ciudad de Buenos Aires y, los restantes, en la Provincia de Córdoba. Las secuencias, junto a referencias obtenidas de GenBank, fueron alineadas (ClustalX v2.1) y editadas (BioEdit v7.1.3.0). El posible origen recombinante de las secuencias se evaluó con el programa Simplot v3.5.1. Se realizó un análisis filogenético por el método de Máxima Verosimilitud (PhyML v3.0), se calcularon las distancias genéticas entre grupos (MEGA6) y se llevó a cabo un análisis de coalescencia por metodología bayesiana (paquete BEAST v1.7.5). Como resultado del análisis filogenético, se observó que los seis aislamientos formaron un grupo monofilético dentro del genotipo F, con alto soporte estadístico, pero separado de los demás sgt descriptos hasta el momento. Las distancias genéticas calculadas entre el nuevo grupo y secuencias de referencia del genotipo F se encontraron entre el 4,03 %, respecto al sgt más cercano: el F4, y 6,20% en relación al sgt F1. A lo largo del genoma, las seis secuencias presentaron 19 posiciones nucleotídicas únicas y características, no observadas en los demás sgt. En los cuatro marcos abiertos de lectura que presenta el genoma de HBV, dichas sustituciones generan 12 cambios por codones sinónimos y 11 no sinónimos. En base a estos últimos, se puede establecer un patrón de aminoácidos únicos y característicos del nuevo grupo: sp254L, sp271K, sp314P, rt21I, rt132D, rt261E, rt277R, rh743R y rh807L en la polimerasa viral, 91N en PreS1 y 47S en la proteína X. Por otra parte, el análisis de coalescencia situó al ancestro común más reciente (ACMR) del nuevo grupo en el año 1030 d.C. [HPD95%=1386-480 d.C.], con una diversificación entre los años 1100 a 1430, lo que coincide con el período de expansión poblacional de los demás sgt reconocidos del genotipo F. Dadas las actuales recomendaciones para la clasificación del HBV que asigna como nuevo subgenotipo a un grupo monofilético, con soporte estadístico y con distancia genética entre 4.0 y 7.5% con los grupos anteriormente reportados, se propone que los seis genomas descriptos en este trabajo componen un nuevo sgt del HBV: el sgt F6. La identificación de nuevos subgenotipos permite profundizar los conocimientos sobre la historia evolutiva del HBV, así como clarificar la relación entre los (sub)genotipos virales y la historia natural de la infección. 0285 ANALISIS DE COALESCENCIA DE LOS VIRUS DENGUE 3 DETECTADOS EN BUENOS AIRES EN 2007 E Tittarelli1 2, PR Barrero1 2, M Viegas1 2, AS Mistchenko1 3 1 Laboratorio de Virología, Hospital de Niños "Dr. Ricardo Gutiérrez", Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. 2 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, CONICET, Argentina. 3 Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires, CIC, Argentina. El virus del dengue (DENV) pertenece a la familia Flaviviridae y se clasifica en cuatro serotipos (DENV1-4) sub-divididos en genotipos, los cuales no presentan inmunidad cruzada. Posee un genoma RNA simple cadena de polaridad positiva que codifica para tres proteínas estructurales (cápside, membrana y envoltura) y siete proteínas no estructurales. El DENV es el agente causal de la enfermedad del dengue, un grave problema de salud pública dado que su incidencia se encuentra en abrupto crecimiento a nivel mundial. En la Argentina, la mayoría de los brotes tuvieron su origen en países vecinos. En la Ciudad de Buenos Aires, se reportaron casos importados de DENV1, DENV2 y DENV3, y por primera vez en el 2009 se reportaron casos de transmisión local de DENV1. Puntualmente, durante el 2007, 35 casos de DENV3 fueron confirmados en el Laboratorio de Virología del Hospital de Niños “Dr. Ricardo Gutiérrez”. Si bien los pacientes residían en la Ciudad de Buenos Aires, declararon historia de viaje reciente a Brasil o Paraguay. En este trabajo, se realizará un análisis filogenético y de coalescencia de las secuencias de DENV3 del año 2007 obtenidas en nuestro laboratorio y su relación con secuencias de DENV3 del resto del mundo disponibles en bases de datos. Se obtuvo la secuencia que codifica para las proteínas estructurales (2413 nt.) de 13 DENV3 aislados en nuestro laboratorio. Las mismas se genotipificaron mediante métodos Bayesianos, utilizando el gen de la envoltura (nt. 935-2413). Se realizaron análisis de coalescencia mediante el paquete BEAST, utilizando la secuencia que codifica para todas las proteínas estructurales (nt. 95-2413). En cada caso, se evaluó el modelo evolutivo apropiado mediante jModelTest. Filogenéticamente, detectamos que todas las muestras analizadas corresponden al genotipo III de DENV3. A partir del análisis de coalescencia del genotipo, el ancestro común más reciente dataría aproximadamente en 1973 (95%HPD 1968-1978). La tasa media de sustitución de nucleótidos sería de 9,93E-4 sustituciones/sitio/año (95%HPD 8,21E-4─1,2E-3). Evaluando la reconstrucción demográfica, el tamaño poblacional resultó constante desde el origen hasta 1997 donde se observó un abrupto crecimiento poblacional que duró hasta aproximadamente el año 2006, probablemente relacionado con la reemergencia de DENV3 genotipo III en América Latina reportado previamente. A partir del análisis del árbol de máxima credibilidad de los clados, se observó que el ancestro común a todas nuestras secuencias dataría en 1996. Además, las secuencias obtenidas en nuestro laboratorio se agruparon en dos clados separados, uno asociado con secuencias reportadas de Paraguay-2007 y el otro con secuencias de Brasil-2007. Esta observación se encontró en concordancia con el origen de viaje declarado de los pacientes. Este estudio, junto con análisis filogeográficos, contribuirá al conocimiento de las características evolutivas y de dispersión del DENV3 genotipo III a nivel global. 37 Libro de resúmenes 0343 EVOLUCIÓN MOLECULAR Y EPIDEMIOLOGÍA (2005-2011) DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C EN URUGUAY M Castells1, G Bello2, S Ifrán3, S Pereyra3, S Boschi3, R Uriarte3, J Cristina4, R Colina1 1 CENUR Noroeste - Universidad de la República, Uruguay. 2 Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, Brasil. 3 Asociación Española Primera de Socorros Mutuos, Uruguay. 4 Facultad de Ciencias - Universidad de la República, Uruguay. Mundialmente más de 170 millones de personas están crónicamente infectadas con el virus de la hepatitis C (VHC) y cada año mueren cerca de 500 mil personas por enfermedades relacionadas con este virus. Recientemente, VHC fue reclasificado en siete genotipos y 67 subtipos. Algunos subtipos como 1a, 1b y 3a se han convertido en epidémicos como resultado de nuevas rutas de transmisión parenteral y son responsables de la mayoría de las infecciones por VHC en los países occidentales. El subtipo 1a ha sido subcategorizado en dos clados separados. Estudios recientes basados en el análisis de la región NS5B del genoma, revelaron que la epidemia de VHC tanto en Argentina como en Brasil está caracterizada por múltiples introducciones de los subtipos 1a, 1b y 3a del virus a estos países, seguido de dispersión local de estos subtipos. No hay información acerca de los genotipos circulando en Uruguay, así como tampoco de su historia evolutiva ni demográfica. Para obtener esta información, realizamos la extracción del ARN de 247 muestras de pacientes positivos para VHC por serología provenientes de la Asociación Española Primera de Socorros Mutuos entre los años 2005 y 2011. Luego por transcripción reversa, reacción en cadena de la polimerasa semi anidada y secuenciación, obtuvimos 204 secuencias. De estas 204 secuencias 104 (51,0%) fueron subtipo 1a, 52 (25,5%) subtipo 3a, 35 (17,2%) subtipo 1b, 9 (4,4%) subtipo 2c, 3 (1,5%) subtipo 2b y 1 (0,5%) subtipo 2j. Las secuencias del subtipo 1a se distribuyeron dentro de ambos clados descritos por Pickett y colaboradores. Cuatro clados locales del VHC fueron hallados, 3 dentro del subtipo 1a y uno dentro del subtipo 3a. Además, la epidemia en Uruguay ha sido dirigida por múltiples introducciones de los subtipos 1a, 1b y 3a y por la diseminación local de algunas cepas específicas uruguayas. La historia evolutiva y la historia demográfica de los principales clados de dispersión local así como de los principales subtipos circulando en Uruguay fue reconstruida utilizando tasas de evolución previamente estimadas. Este es el primer trabajo exhaustivo acerca de la epidemiología molecular y la historia evolutiva del VHC en Uruguay. Replicación y estructura 0007 LA SÍNTESIS DE LA VERSIÓN PROCESADA Y NO PROCESADA DE LA PROTEÍNA BÁSICA DE DEDOS DE ZINC (HBZ), DEL VIRUS DE LA LEUCEMIA DE LINFOCITOS T HUMANOS DE TIPO 1 (HTLV-1) ES REGULADA A NIVEL TRADUCCIONAL. CJ Cáceres1 2, E Olivares1, J Angulo1, K Pino1, E Castillo1, M López-Lastra1 1 Laboratorio de Virologia Molecular, Centro de Investigaciones medicas, Escuela de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile, Chile. 2 Programa de Doctorado en Ciencias mención microbiología, Universidad de Chile/Universidad de Santiago, Santiago., Chile. El virus de la leucemia de linfocitos T humanos de tipo 1 (HTLV-1) sintetiza una población de RNAs mensajeros (mRNAs) antisentidos con respecto al genoma, los cuales codifican para la proteína básica de dedos de Zinc (HBZ). HBZ es fundamental para la patogenia asociada a HTLV-1, y es detectada en todos los pacientes que desarrollan la patología mediada por HTLV-1. En este estudio se evaluó el mecanismo de inicio de la síntesis de proteína de los dos mRNAs que codifican para HBZ. Uno de estos mRNA sufre un procesamiento por splicing generando una versión procesada de la proteína HBZ (SpHBZ) y el otro, es utilizado directamente para generar la versión no procesada de HBZ (UsHBZ). Ambos mRNAs difieren significativamente solo en la región 5’ no traducida (UTR). Se ha descrito que los niveles de mRNA de ambas versiones es similar en células infectadas, sin embargo, los niveles de proteína generada a partir del mRNA SpHBZ, son mayores en relación a los niveles de proteína generada a partir del mRNA UsHBZ. Para estudiar este fenómeno, se generaron construcciones monocistronicas en las cuales el 5’UTR de SpHBZ y UsHBZ fue fusionado rio arriba al gen de la luciferasa de luciérnaga (FLuc). Los resultados muestran que en lisado de reticulocito de conejo (RRL), la región 5’UTR de SpHBZ exhibe una mayor eficiencia traduccional en relación a la región 5’UTR de UsHBZ y dicho efecto no es explicable por diferencias en la estabilidad de los mRNAs. El efecto observado fue confirmado mediante ensayos de marcaje metabólico. Resultados similares son observados en un contexto ex-vivo, donde la eficiencia traduccional de SpHBZ es superior con respecto a UsHBZ. Ensayos de qRT-PCR a partir de RNA total extraído descartan un efecto a nivel transcripcional. La eficiencia traduccional diferencial no es explicable por una competencia entre ambos mRNAs por factores celulares. Se evaluó la posibilidad de que el 5’UTR de SpHBZ posea un sitio interno de entrada a ribosomas (IRES). Los resultados muestran que el 5’UTR de SpHBZ, pero no el de UsHBZ, es capaz de mediar la síntesis del segundo cistrón de un mRNA bicistrónico tanto in-vitro como ex-vivo. Se estableció además que la síntesis de FLuc a partir del mRNA bicistrónico no es explicable por presencia de promotores crípticos ni por variantes de splicing en un contexto ex-vivo. Por tanto este estudio muestra la existencia de un IRES en la región 5’UTR del mRNA de SpHBZ de HTLV-1. Trabajo financiado por el proyecto Fondecyt 1130270 y el proyecto P09/016-F de la Iniciativa Científica Milenio del Ministerio de Economía, Fomento y Turismo. C. Joaquín Cáceres es financiado por una beca CONICYT para estudios doctorales 0034 DOMINIOS ESTRUCTURALES DEL 5’UTR DE RNA MENSAJERO COMPLETO DE HIV-1 INFLUENCIAN EL INICIO DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS CAP-DEPENDIENTE F Carvajal1 3, M Vallejos1, E Olivares1, BA Walters2, MI Hertz2, CJ Cáceres1, N Contreras1, K Pino1, SR Thompson2, M López-Lastra1 1 Laboratorio de Virología Molecular, Instituto Milenio de Inmunología e Inmunoterapia, Departamento de Infectología e Inmunología Pediátrica, Escuela de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile, Marcoleta 391, Santiago, Chile. 2 Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, Birmingham AL, Estados Unidos. 3 Programa de Doctorado en Ciencias Biológicas, mención Genética Molecular y Microbiología, Facultad de ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Católica de Chile, Chile. La región 5’ no traducida (5’UTR) del RNA genómico del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (HIV-1) es una región multifuncional que posee una estructura secundaria/terciaria altamente conservada, la cual regula múltiples etapas del ciclo replicativo viral. Los elementos funcionales incluyen la región de transactivación (TAR), la señal de poliadenilción (PolyA), el sitio de unión del partidor de la transcripción reversa (PBS), el sitio de inicio de la dimerización del genoma (DIS), el dador mayor de splicing (SD), y la señal de empaquetamiento (Psi). La región 5’UTR del mRNA de HIV-1 contiene además un sitio interno de entrada al ribosoma (HIV-1 IRES), el cual dirige el inicio de la traducción bajo condiciones celulares que inhiben el inicio de la traducción dependiente de cap. Este estudio proporciona nuevas evidencias sobre el mecanismo molecular usado por el HIV-1 IRES, durante el reclutamiento de la maquinaria de síntesis de proteínas del hospedero. En este trabajo se demuestra que el HIV-1 IRES depende de la proteína ribosomal 25 (RPS25) para su funcionamiento, y muestra que este IRES es insensible a la droga edeína. Esto último sugiere que el HIV-1 IRES recluta la subunidad ribosomal 40S directamente sobre el codón de inicio, sin requerir de scanning ribosomal. En este trabajo también se explora el impacto de mutaciones en el 5’UTR sobre la actividad IRES. Los resultados sugieren que el HIV-1 IRES posee una naturaleza modular, y que los dominios estructurales PBS, DIS y SD contribuyen a la actividad IRES. En conjunto, estos hallazgos dan luces sobre el mecanismo utilizado por el HIV-1 IRES para el reclutamiento de la maquinaria de síntesis de proteínas del hospedero. 38 Libro de resúmenes 0076 LA INFECCION CON EL VIRUS JUNIN ACTIVA LA VIA DE LA AUTOFAGIA JS Roldán1, LR Delgui2, NA Candurra1 1 IQUIBICEN, Dpto. de Química Biológica, FCEyN, UBA, Argentina. 2 IHEM, UNC-CONICET, Mendoza, Argentina. Autofagia es un proceso degradativo conservado en mamíferos que cumple una función fundamental en el mantenimiento de la homeostasis celular a través de la eliminación de proteínas y organelas dañadas. El proceso inicia con la formación de vesículas de doble membrana, denominadas autofagosomas, que luego se fusionan con lisosomas donde ocurre la degradación enzimática. Este proceso tiene, además, un papel protagónico en la protección de la invasión viral en las células. Sin embargo, algunos agentes virales han desarrollado estrategias para utilizar esta vía durante su ciclo de replicación. El virus Junín (JUNV) pertenece al clado B de la familia Arenaviridae. Es el agente etiológico de la fiebre hemorrágica Argentina, una enfermedad endemo-epidémica que afecta a una gran parte de la población Argentina. En este trabajo, analizamos la participación de la vía autofágica durante la infección por el JUNV en una línea celular humana. Utilizamos la proteína LC3 como marcador de la modulación de la vía luego de la infección. LC3 es una proteína citoplasmática (LC3I) que se asocia a la membrana de las vesículas (LC3-II) luego de inducción de la vía. Cuando se observa en el microscopio de fluorescencia, las vesículas conteniendo la proteína LC3-II se ven como un puntillado verde. Observamos que las células sobreexpresando EGFP-LC3 e infectadas con el JUNV mostraron un aumento en el número de células positivas para autofagia de manera similar a las tratadas con medio de ayuno o con Bafilomicina A1, los cuales inducen la formación o acumulación de autofagosomas, respectivamente. También monitoreamos la conversión de LC3-I (citosólica) a LC3-II (asociada a autofagosomas) mediante Western blot, detectando niveles similares de LC3-II en las células infectadas y en células tratadas con medio de ayuno. Por otro lado, el pre-tratamiento de las células con rapamicina (un inductor de la autofagia) o con medio de ayuno durante 2 hs incrementaron el número de células infectadas, mientras que el pre-tratamiento con wortmanina (un inhibidor de la vía) disminuyó dicho parámetro. Por último, analizamos la capacidad de replicación del JUNV en células MEF fenotipo salvaje (wt) y MEF carentes del gen Atg5 (gen estructural de la vía, esencial para la activación de la misma), observando que en aquellas células que carecen del gen Atg5, se obtuvo una menor infectividad y un menor número de células infectadas. Por último, analizamos los niveles de LC3-II en células MEF wt y observamos mayor acumulación de LC3-II en las células infectadas respecto de las mismas células sin infectar, confirmando que el virus induce la activación de la autofagia. Estos resultados nos permiten concluir que la infección por el JUNV activa la vía de la autofagia y que dicha vía es empleada para su replicación. 0089 LOS RETROVIRUS MLV Y HIV-1 UTILIZAN DIFERENTES COMPONENTES DEL COMPLEJO DINEINA CITOPLASMÁTICO PARA SU TRANSPORTE RETROGRADO EN EL CITOPLASMA DE LA CÉLULA HOSPEDERA. G Arriagada1 2, T Opazo1, F Barraza1, T Schwenke1 2, R Valle-Tenney1, A Garcés1 1 Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Andres Bello sede Viña del Mar, Chile. 2 Núcleo Milenio Biología de Enfermedades Neuropsiquiátricas., Chile. Introducción En las etapas tempranas de la infección, luego de la entrada a la célula, los retrovirus necesitan llegar al núcleo para poder integrar su genoma en el genoma de la célula hospedera. Debido a la alta densidad del citoplasma celular es poco probable que puedan difundir, es por eso que se ha postulado que los virus, en general, utilizan el transporte activo a través del citoesqueleto, para alcanzar sus sitios de replicación. En el caso particular de los retrovirus se ha propuesto que utilizarían las distintas proteínas motoras asociada a microtúbulos como dineinas y kinesinas. Buscando proteínas celulares que se asociaran al virus de la leucemia murina (MLV) a tiempos tempranos de infección, encontramos que miembros del complejo de dineina citoplasmático se asocian al complejo de preintegración de MLV. Es por esto que decidimos evaluar el rol de estos complejos proteicos en la infección por MLV y por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1). Objetivos Analizar el rol de las distintas proteínas que conforman el complejo de dineina citoplasmático en la infección por los virus MLV en células murinas y HIV-1 en células humanas. Metodología Células murinas NIH3T3 y células humanas TE761 fueron transducidas con vectores lentivirales codificantes para shRNA dirigidos contra las distintas proteínas que conforman el complejo de dineina citoplasmático. Una vez seleccionadas las células por resistencia al antibiótico puromicina, se infectaron con virus reporteros luciferasa y se comparó la respuesta del reportero en células control no-silenciadas y en aquellas silenciadas para cada una de las cadenas. Resultados Nuestros resultados indican que la proteína DYNLT3 es necesaria en las etapas tempranas de infección de HIV-1. En el caso de MLV, las proteínas DYNLRB2 y DYNLT1 tienen un rol en las etapas tempranas de la infección, en un punto posterior a la transcripción reversa y anterior a la entrada al núcleo. Conclusiones Nuestros resultados sugieren que las cadenas livianas del complejo dineina citoplasmático son importantes para la infección de ambos retrovirus, y que se utilizarían de forma diferencial. Actualmente nos estamos enfocando en determinar si existe una interacción directa entre las proteínas virales y las cadenas livianas del complejo dineina. 0094 EL SUBDOMINIO IIID DEL IRES DEL VIRUS DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C UNE Y PARTICIPA EN EL REMODELAMIENTO DE LA SUBUNIDAD RIBOSOMAL 40S EUCARIONTE. J Angulo1, J Deforges2, N Chamond2, N Ulryck2, M López-Lastra1, B Sargueil2 1 Laboratorio de Virología Molecular, Instituto Milenio de Inmunología e Inmunoterapia (IMII), Centro de Investigaciones Médicas, Escuela de Medicina, División de Pediatría, Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile. 2 Laboratoire de Cristallographie et RMN Biologiques – CNRS UMR8015, Université Paris Descartes, Paris, Francia. El inicio de la traducción del RNA mensajero (mRNA) del virus de la hepatitis C (HCV) es dependiente de un sitio interno de entrada a ribosomas (IRES). El IRES de HCV es una estructura de RNA compuesta por 3 dominios, II, III y IV. El reclutamiento de la subunidad ribosomal 40S al IRES de HCV ocurre en ausencia de factores de inicio. Se ha propuesto que este proceso es mediado parcialmente por interacciones del tipo Watson-Crick entre tres pares de bases C-G consecutivas entre el loop de la hélice 26 del rRNA 18S (nucleótidos 1116-1118) y el subdominio IIId del IRES (nucleótidos 266-268). En este estudio se utilizó la tecnología de “Selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer Extensión” (SHAPE) para determinar los sitios de unión directa entre el IRES de HCV y los nucleótidos 981-1187 del rRNA 18S. Como control negativo se utilizó una mutante del subdominio IIId, denominada variante G266A/G268U, previamente descrita en nuestro laboratorio. Esta variante, en la cual no se altera la estructura global del IRES, no exhibe actividad traduccional al no unir la subunidad ribosomal 40S. Los resultados muestran protección de los nucleótidos 1021-1023, 1027, 1057-1058, 1080, 1112-1118, 1130, 1178 del rRNA y mayor reactividad en las posiciones 990, 1012, 1124, 1146. Estos resultados sugieren que pueden existir más sitios de interacción directa entre el rRNA 18S y el IRES de HCV. Alternativamente, los datos sugieren un remodelamiento estructural de la subunidad ribosomal 40S posterior a su unión al IRES. Esta observación confirma de manera experimental que el apareamiento de bases mRNA-rRNA no está restringido sólo a procariontes y que es esencial para el reclutamiento de la subunidad pequeña eucariótica sobre el IRES de HCV. Estos resultados sugieren por tanto que la interacción entre el rRNA y el loop IIId del IRES de HCV representa un potencial blanco terapéutico. Financiamiento: PICS #5283 – L.I.A - CNRS; Iniciativa Científica Milenio del Ministerio de Economía, Fomento y Turismo: Proyecto P09/016-F; Fondecyt 1130357. 39 Libro de resúmenes 0116 ENTRADA DEL VIRUS JUNIN DEPENDIENTE DE LA LECTINA DC-SIGN MB Forlenza1, JS Roldán1, MG Martinez2, SM Cordo1, NA Candurra1 1 IQUIBICEN, FCEN, UBA, CONICET, Argentina. 2 Albert Einstein School of Medicine, Estados Unidos. La entrada de algunos virus y su diseminación pueden ser mediadas por lectinas de tipo c como DC-SIGN, miembro de una familia de receptores que reconoce estructuras de carbohidratos presentes en patógenos. En trabajos previos, proporcionamos evidencia de que hDC-SIGN reconoce e internaliza el arenavirus del nuevo mundo Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, que presenta en su envoltura proteínas altamente glicosiladas. En este trabajo nos proponemos proporcionar más evidencia de la especificidad de la interacción y caracterizar las primeras etapas de la entrada mediada por DC-SIGN. Para esto, infectamos cultivos de células NHI3T3 y NIH3T3-hDC-SIGN en presencia de EGTA. Se observó inhibición de la multiplicación sólo en cultivos que expresan la lectina humana. Para analizar los componentes moleculares de la lectina implicados en la internalización, las células NIH3T3 se transfectaron con plásmidos de expresión que codifican para la construcción salvaje o mutantes de motivos citoplasmáticos conservados de la lectina: dileucina (LL), y el grupo triácido (EEE) que se cree que regulan la unión y el tráfico intracelular respectivamente. Nuestros resultados mostraron que la presencia de las mutaciones LL y EEE interfiere con el aumento de infección. Para evaluar la forma de entrada, a través de la lectina, utilizamos compuestos que bloquean específicamente diferentes vías de entrada. Nuestros resultados mostraron inhibición significativa de la infección con dynasore (DYN); que inhibe la endocitosis dependiente de dinamina II, clorpromazina (CZ), que inhibe la endocitosis dependiente de clatrina y metil-B-ciclodextrina (MBCD) que inhibe la endocitosis dependiente colesterol. Para determinar los componentes celulares implicados, las células fueron transfectadas transitoriamente con plásmidos que codifican proteínas dominantes negativas implicadas en la endocitosis. Observamos que la infección con JUNV depende EPS15 y dinamina-2, ambos implicados en la endocitosis mediada por clatrina. Se estudió el rol de los microfilamentos y microtúbulos durante la infección temprana del virus. Sólo se obtuvo inhibición de la infección durante los tratamientos con latruculinA, un compuesto que interrumpe la dinámica de los microfilamentos corticales y citoplasmáticos mientras que utilizando citochalasina D, que sólo afecta a los microfilamentos citoplasmáticas no mostró un efecto inhibitorio sobre la multiplicación de JUNV. En contraste, los fármacos que alteran los microtúbulos no mostraron afectar la multiplicación de JUNV. Concluyendo, nuestros resultados demuestran que JUNV interactúa específicamente con hDC-SIGN y que la vía de entrada prefencial involucrado es la endocitosis mediada por clatrina con dependencia del colesterol y filamentos de actina corticales. 0132 CARACTERIZACIÓN DEL COMPLEJO DE PRE-INTEGRACIÓN DEL VIRUS DE LA LEUCEMIA MURINA (MLV) EN CÉLULAS HUMANAS. ML Acevedo, F García, J Saldias, O León Programa de Virología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Chile. El virus de la leucemia murina (MLV) es un retrovirus utilizado como vector en terapia génica que puede producir activación de oncogenes durante su integración en el genoma de la célula hospedera, por lo que el conocimiento de las etapas del ciclo replicativo y la interacción con el hospedero son fundamentales. Durante el ciclo replicativo de MLV, después de la entrada del virus a la célula, se produce la transcripción reversa de su genoma de ssRNA hacia dsDNA mediante el complejo de transcripción reversa (RTC), una vez formado el DNA viral, el complejo cambia hacia complejo de preintegración (PIC) formado por proteínas virales y celulares que desplazan y protegen el genoma viral por el citoplasma que, luego de la mitosis, entra al núcleo, permitiendo su integración. Escasa información existe acerca del PIC de MLV, por lo que proponemos su caracterización. Se generó el pseudotipo viral mediante transfección de tres plásmidos en la línea celular 293T, el sobrenadante que contiene el virus fue concentrado y utilizado para transducir células 293T. Mediante PCR cuantitativo se realizó una cinética de formación del PIC en el citoplasma, una cinética de integración viral y se analizó la actividad de los PIC citoplasmático. Se observó que la máxima concentración del PIC en el citoplasma se obtiene a las 16 horas post-transducción, resultados que están acorde a la cinética de integración, donde el máximo se observa a las 24 horas. Sin embargo, el PIC citoplasmático no fue activo, sugiriendo que la conformación de proteínas del PIC en el núcleo son esenciales para la función de la integrasa, proteína viral que cataliza la integración. Luego se analizó la estabilidad del PIC citoplasmático en solución, por lo que se transducieron células 293T por 16 horas las que fueron tratadas con y sin entrecruzamiento in vivo con DSG durante 30 minutos. Las células se rompieron por lisis hipotónica, el extracto citoplasmático se cargó en una cromatografía de sepharose CL-4B y los complejos se purificaron mediante inmunopreciptación utilizando la resina de NHSagarose unida al anticuerpo anti-capside, proteína que conforma parte del PIC. Mediante el análisis de western blot se observó los tamaños de los productos obtenidos. Los complejos unidos a la cápside sin entrecruzamiento mayoritariamente tuvieron un tamaño aproximado de 30 y 60 KDa mientras que aquellos tratados con DSG se observó principalmente complejos de aproximadamente 60, 100 y mayores a 130 KDa. Sugiriendo que las metodologías de purificación utilizadas podrían mantener indemne la conformación del PIC para lograr su purificación. Financiado por Proyecto Fondecyt 11121411 y U-Inicia 11/08. 0156 ROL DE LA ACTIVACIÓN DE ERK EN DIFERENTES ETAPAS DE LA MULTIPLICACIÓN DEL VIRUS JUNÍN EN CULTIVOS CELULARES JE Brunetti, VM Quintana, LA Scolaro, V Castilla Laboratorio de Virología, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA, Argentina. En trabajos previos hemos demostrado que la infección con el arenavirus Junín (JUNV), agente etiológico de la Fiebre Hemorrágica Argentina, provoca la activación de la vía de señalización celular Raf/MEK/ERK en cultivos celulares de distinto origen. Asimismo, determinamos que el compuesto U0126, inhibidor específico de la vía de ERK, inhibe la multiplicación de JUNV, mientras que el tratamiento con el éster miristato acetato de forbol (PMA), activador de la vía, promueve la multiplicación viral. El objetivo de este trabajo fue investigar cuál es el rol de la activación de ERK en la multiplicación de JUNV. En primer lugar, se examinó la cinética de activación de ERK en cultivos de células Vero infectadas con JUNV o JUNV inactivado con luz UV. El análisis por western blot (WB) de los niveles de p-ERK detectados a diferentes tiempos post-infección (p.i.) mostró que el virus infeccioso induce una activación temprana de ERK en los primeros minutos de la infección y una tardía a partir de las 7 h p.i. Por el contrario, el virus inactivado produjo sólo la fosforilación temprana de ERK. Por otra parte, se analizó la activación ERK en células Vero tratadas con clorpromazina (CZ), inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina, e infectadas con JUNV. La inhibición de la internalización viral provocada por CZ produjo una marcada disminución, detectada por WB, de los niveles de p-ERK y de la nucleoproteína viral N internalizada detectada a 1 h p.i. Para establecer si la entrada del virus a la célula requería de la fosforilación temprana de ERK, células Vero se infectaron con JUNV a 4 °C y luego los cultivos se incubaron a 37°C en presencia de U0126 o PMA. La cuantificación del virus internalizado a distintos tiempos p.i. mostró que U0126 no afecta la cinética ni la cantidad de virus internalizado; sin embargo PMA provocó un incremento significativo de la internalización de viriones. Con el objeto de evaluar el efecto de U0126 sobre la síntesis de proteínas virales en un único ciclo de multiplicación, este compuesto se agregó a distintos tiempos p.i. en células Vero infectadas con JUNV y a las 14 h p.i. se cuantificó el rendimiento viral por UFP y la síntesis de N por WB. La adición temprana de U0126 provocó una marcada inhibición de la síntesis de N mientras que los títulos virales se redujeron de manera significativa aún en aquellos cultivos tratados con U0126 durante las últimas 4 h de la infección. 40 Libro de resúmenes En conclusión, JUNV induce la activación bifásica de ERK: la activación temprana es consecuencia de la internalización viral, mientras que la activación tardía depende la multiplicación viral. Asimismo, la activación temprana de ERK no sería indispensable para la entrada de JUNV. La caracterización del modo de acción de U0126 permitió determinar que este compuesto no afecta la entrada del virus pero sí inhibe la síntesis de proteínas y las etapas tardías de la multiplicación viral. 0166 DESARROLLO DE VIRUS RECOMBINANTES PARA ESTUDIAR LA ENTRADA DEL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA A LA CÉLULA HUÉSPED F Merwaiss, C Czibener, DE Alvarez Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, UNSAM-CONICET, Argentina. El virus de la dirrea viral bovina (BVDV) es un pestivirus patógeno del ganado vacuno cercanamente relacionado al virus de la hepatitis C dentro de la familia Flaviviridae de virus de RNA simple cadena de polaridad positiva. La cubierta del virus está compuesta por una membrana lipídica y las glicoproteínas estructurales E1 y E2 que median la entrada del virus a la célula huésped. La entrada de BVDV ha sido estudiada empleando métodos de virología tradicionales basados en la cuantificación de la unión del virus a la célula o de la susceptibilidad a la infección. De acuerdo con estos estudios, BVDV entra a la célula utilizando la endocitosis dependiente de clatrina mediada por la unión del virus a receptores específicos del huésped. La fusión de membranas permite que el virus libere el genoma de RNA al citoplasma para iniciar un ciclo de replicación. Distintos trabajos sugieren que la entrada de BVDV a la célula huésped requiere de la interacción del virus con receptores y co-receptores aún no identificados en una secuencia de pasos poco estudiados a nivel molecular. Nuestro objetivo es comprender cuáles son las interacciones huésped-patógeno que median la entrada de BVDV a la célula huésped. Utilizando genética inversa para manipular el genoma del virus desarrollamos nuevas herramientas que nos permitirán estudiar el detalle molecular del proceso de entrada. Se construyó el virus recombinante BVDV/BAP-E2, que expresa una versión de E2 fusionada en su extremo amino terminal al péptido aceptor de biotina (BAP) para permitir la marcación sitio específica de la partícula viral. Nuestros resultados indican que la fusión de BAP a E2 no interfiere con la función de la glicoproteína de envoltura. BAP es el sitio blanco para la unión de biotina mediada por la enzima biotin-ligasa BirA de Escherichia coli. La infección de células que expresan establemente BirA con BVDV/BAP-E2 permitirá recuperar del sobrenadante de infección partículas virales marcadas con biotina en su superficie. Esta estrategia de marcación puede usarse para unir sondas fluorescentes a E2 permitiendo seguir partículas virales individuales por microscopía de fluorescencia. Además se construyó el virus BVDV/GFP, que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) en el contexto del genoma de RNA del virus. Con el fin de asegurar su correcto procesamiento, se insertó GFP fusionada en su extremo carboxilo terminal a la autoproteasa 2A del virus de aftosa (FMDV2A) entre la proteasa de BVDV Npro y la proteína de cápside C. Utilizando BVDV/GFP, pueden identificarse las células infectadas por el virus mediante la detección de GFP. Estos virus recombinantes servirán como herramientas para la caracterización de nuevos factores del huésped receptores y co-receptores de entrada de BVDV y para el estudio molecular de la interacción de partículas virales individuales con estos factores. 0171 CONSTRUCCIÓN DE UN REPLICÓN PARA EL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA Y ANÁLISIS DE LA REGION N-TERMINAL DE 3A EN LA REPLICACIÓN/TRANSCRIPCIÓN CM Lotufo, M Wilda, AN Giraldez, PR Grigera, NM Mattion ICT Milstein - CONICET, Argentina. Introducción La fiebre aftosa es una enfermedad vesicular aguda que afecta a animales rumiantes biungulados, de amplio rango de huesped y rápida propagación. El agente causal es el virus de la fiebre aftosa (VFA), un virus no envuelto con genoma ARN de polaridad positiva perteneciente a la familia Picornaviridae. El genoma del VFA codifica para 4 proteínas estructurales y 8 proteínas no estructurales, entre estás últimas se encuentra la proteína 3A de 153 aa de longitud. Esta posee un dominio hidrofóbico N-terminal (aa 25-44) y un dominio hidrofóbico transmembrana (aa 57-76). Se cree que 3A juega un papel relevante en la síntesis del ARN y en el anclaje a membranas intracelulares del complejo replicativo, como también en el grado de virulencia y rango de huésped del VFA. Objetivos Generar por medio de genética reversa, un replicón que pueda ser usado en laboratorios de seguridad mínima y permita el estudio de los componentes de la replicación y transcripción viral, de las proteínas no estructurales, así como de las regiones 3´ y 5´ no codificantes. Identificar en 3A dominios involucrados en la replicación/transcripción a través de mutaciones generadas en el replicón sobre el correspondiente gen. Metodologías Se diseñó y construyó un replicón plasmídico basado en una copia de ADN del genoma completo del VFA de la cepa O1/Campos, en el cual se le reemplazaron las proteínas capsidales por el gen reportero de la luciferasa de luciérnaga (pRep), bajo regulación del promotor de la polimerasa del fago T7 (T7pol). Como control de la actividad replicativa de pRep, se construyó un replicón defectivo del mismo por medio de una deleción de 1 nt la cual genera un transcripto no funcional (pRepD). Para la medición de la actividad luciferasa del replicón y su control células BHK-21 se cotransfectaron con los plásmdos pRep o pRepD junto con los plásmidos que expresan T7 polimerasa y luciferasa renila (normalizador). Se obtuvieron lisados celulares a 8,16 y 24 hs posttransfección (pt) y la actividad luciferasa (luciérnaga y renilla) de los mismos se midió utilizando el Dual-Luciferase Assay System™ (Promega) con un luminómetro BioTek FLx800. Para el estudio de 3A se realizaron deleciones sobre pRep en la región que codifica para el extremo N terminal, resultando las mutantes: p∆6-11, p∆6-17 y p∆6-23 fueron evaluadas utilizando la misma metodología junto con pRep y su control pRepD a 16hs pt. Resultados Se logró la construcción del Replicón del VFA O1/Campos con capacidad de trascripción/replicación medible a través de la actividad luciferasa, obteniéndose la mayor actividad a las 16hs. Las mutantes p∆6-11 y p∆6-17 presentaron actividades de luciferasa similares a pRep, planteando que la región comprendida entre los aa 6 a 17 de 3A no sería necesaria para la funcionalidad del mismo. Por el contrario, p∆623 presentó una disminución en dicha actividad, sugiriendo que los aa 18 a 23 de 3A podría estar involurados en los eventos de replicación/transcripción. 0210 MÚLTIPLES REGIONES CODIFICANTES Y NO CODIFICANTES DEL GENOMA DE LOS BACULOVIRUS ACTUARÍAN COMO ORÍGENES DE REPLICACIÓN SAB Miele, MV Nugnes, CS Cerrudo, CN Parsza, DL Mengual Gómez, PD Ghiringhelli, MN Belaich Laboratorio de Ingeniería Genética y Biología Celular y Molecular -Área Virosis de Insectos-, Universidad Nacional de Quilmes, Argentina. Los baculovirus son un grupo de patógenos de lepidópteros, himenópteros y dípteros con numerosas especies distribuidas por todo el planeta. Se caracterizan por presentar un genoma grande de dsDNA circular (80-180 kpb), y en función del hospedador que parasitan, su carga genética y morfología se clasifican en 4 géneros: Alphabaculovirus, Betabaculovirus, Gammabaculovirus y Deltabaculovirus. El gran interés por esta familia viral radica en sus numerosas aplicaciones biotecnológicas, que incluyen el control biológico de plagas agrícolas, la expresión de proteínas recombinantes, o la vehiculización de genes terapéuticos en mamíferos, entre otras. Y en muchos de estos usos, los genomas baculovirales deben ser alterados. Por ello, el conocimiento acabado de las funciones génicas esenciales y auxiliares se transforma en un foco de investigación central para expandir y optimizar los usos derivados de estos virus de insectos. Entre tales funciones se encuentra la replicación del genoma viral y el 41 Libro de resúmenes reconocimiento de cuáles secuencias participan como puntos de inicio de la síntesis de DNA. Considerando lo anterior, se eligió al nucleopoliedrovirus múltiple de Anticarsia gemmatalis (AgMNPV) y a la línea ceular UFL-Ag-286 como modelo de estudio para identificar y caracterizar los orígenes de replicación (ORI) en baculovirus. Para ello, en primer lugar se realizó un estudio de la cinética de replicación genómica durante 30 horas mediante PCR en tiempo real, dónde se identificaron 4 fases: una inicial de 5 horas sin progreso de síntesis de DNA; una etapa exponencial de 11 horas; una fase intermedia de 6 horas sin incremento significativo de DNA viral; y por último, otra etapa exponencial de síntesis. Una vez conocida la temporalidad de la replicación, se procedió a la búsqueda de secuencias ORI. Para ello, se construyó una biblioteca genómica de AgMNPV en bacterias (insertos de entre 500-2.000 pb); y luego, todos las construcciones genéticas derivadas fueron transfectadas en células UFL-Ag-286, a las cuales también se las infectó con el virus. Pasado un período de incubación que involucrara las 4 fases antes identificadas, se recuperaron los plásmidos, se los trató con la endonucleasa DpnI para eliminar el DNA molde no replicado en las células eucariotas, y se transformaron bacterias competentes. Del análisis de estos nuevos clones pudieron identificarse 8 porciones codificantes y 8 no codificantes del genoma baculoviral que pudieron replicar a las construcciones por la acción transactivadora de la maquinaria viral. Un posterior análisis bioinformático sobre las secuencias pudo mostrar que la característica común de todas las regiones recuperadas fue la existencia de palíndromos dispuestos en un patrón particular, posibilitando en consecuencia generar una estructura secundaria conservada, similar a la que se puede predecir en otras especies baculovirales, que probablemente sea la responsable de la captura de la maquinaria de replicación. 0319 EFECTO DE LA DELECIÓN DEL GEN AC109 DEL BACULOVIRUS ACMNPV EN SU INTERACCIÓN CON CÉLULAS DE MAMÍFERO V Alfonso1 2, S Amalfi1, GS Costa Navarro1, MG López1 2, O Taboga1 2 1 Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina. Los baculovirus son patógenos de insectos utilizados en el control biológico de plagas y como vectores de expresión de proteínas heterólogas en cultivos de células de insecto y en larvas de lepidópteros. Además, se estudia su utilización en terapia génica, como vacunas e inmunomoduladores en mamíferos, pues son capaces de ingresar en estas células pero no de replicar en ellas. La proteína Ac109 de Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus es esencial para la replicación viral en insectos. Nuestros trabajos previos han descripto que es una proteína localizada en la nucleocápside y han mostrado su relevancia en los procesos de envoltura y oclusión de los viriones en el núcleo celular y en la llegada de las nucleocápsides a los núcleos de nuevas células infectadas. Con el objeto de determinar si Ac109 está involucrada en la interacción de los baculovirus con las células de mamífero, se evaluó la presencia de DNA viral en citoplasma y núcleo utilizando virus defectivos para esta proteína. Se construyeron baculovirus ac109 knockout (KO) que además contenían el gen de la proteína verde fluorescente eGFP bajo la regulación del promotor citoplasmático T7 o del promotor de la β actina de pollo activo en el núcleo de las células de mamífero, se evaluó la integridad de los viriones a través de la presencia y proporción de las proteínas mayoritarias GP64 y VP39 y se analizó la fluorescencia en células de mamífero tras la infección con cantidades equivalentes de virus salvajes y KO. La cantidad de células que mostraron la presencia de DNA viral en el citoplasma o en núcleo disminuyó dos órdenes de magnitud cuando los viriones no poseían Ac109 en su estructura. Dado que la integridad de la envoltura de los viriones nos permite asumir que la entrada de los virus a las células no está alterada, estos resultados muestran que el desensamblado de las nucleocápsides y liberación del genoma en ambos comportamientos podría verse afectado, mientras que, a diferencia de lo observado en células de insecto, la entrada de las nucleocápsides en el núcleo no parece estar impedida. 0352 OBTENCIÓN DE UN CLON INFECCIOSO PARA EL ARENAVIRUS TACARIBE S Foscaldi, ME Loureiro, C Marotte, A D’Antuono, N Lopez Centro de Virología Animal (CEVAN)-Instituto de Ciencia y Tecnología “Dr. Cesar Milstein”, CONICET, Argentina. La familia Arenaviridae incluye virus productores de fiebres hemorrágicas en humanos, tales como el virus Junin, así como virus no patógenos como el virus Tacaribe (TCRV), prototipo de los arenavirus del Nuevo Mundo. TCRV es un virus envuelto, cuyo genoma está constituido por dos segmentos de ARN de cadena simple (llamados S y L). Ambos segmentos usan una estrategia “ambisentido” para codificar dos proteínas: la nucleoproteína (NP) y el precursor (GPC) de las glicoproteínas de envoltura en el ARN S; la ARN polimerasa viral (L) y la proteína Z, esencial para la morfogénesis viral, en el ARN L. Las proteínas NP y L son necesarias y suficientes para sostener la transcripción y replicación del genoma viral. En este trabajo hemos generado un sistema de genética reversa para la obtención de TCRV infeccioso a partir de plásmidos transfectados en células de mamífero. En primer lugar, se construyeron los plásmidos pSag y pLagWT que expresan, respectivamente, la copia complementaria completa del ARN S y del ARN L de TCRV bajo el control del promotor de la ARN polimerasa del fago T7 (T7Pol). Construimos además dos plásmido derivados del pSag, denominados pSagGFP y pSagCherry, que contienen el gen de la proteína fluorescente GFP o mCherry en remplazo del gen GPC o NP, respectivamente. También se generó un plásmido control, pLag_pol(-), que contiene dos cambios puntuales en el ORF de L que inhiben su actividad polimerasa. Para evaluar estas construcciones se emplearon células BHK-T7, que expresan la T7Pol en forma constitutiva. Las células fueron transfectadas con distintas cantidades de los plásmidos pSag GFP o pSagCherry junto con pLagWT. Se evaluó paralelamente el efecto de la adición a la mezcla de transfección de los plásmidos pNP y/o pL, que expresan las proteínas NP y L, respectivamente. Los resultados mostraron la acumulación de la correspondiente proteína fluorescente (GFP o mCherry) en las células cotransfectadas con pLagWT. Además, la adición de pL resultó en un incremento de la señal fluorescente. En contraste, como se esperaba, no se detectó fluorescencia en las células cotransfectadas con pLag_pol(-). Estos resultados indicaron que el ARN transcripto a partir de los plásmidos pSagGFP o pSagCherry fue efectivamente transcripto y replicado. Con el fin de obtener virus infeccioso, células BHK-T7 fueron transfectadas con las cantidades y proporciones óptimas de los plásmidos pSag, pLagWT y pL determinadas previamente. La titulación de los sobrenadantes celulares colectados luego de 72 hs de incubación, indicó la presencia de 102 pfu/ml de TCRV infeccioso. Luego de 4 pasajes de los sobrenadantes en células BHK, se logró amplificar el stock viral obteniéndose un titulo de 106 PFU/ml. La generación de TCRV recombinante constituye una valiosa herramienta para el estudio de diversos aspectos de la biología de los arenavirus a nivel molecular, en el contexto de una autentica infección. 0358 MODULACIÓN DE LA TRADUCCIÓN DE LOS ARN MENSAJEROS DEL VIRUS TACARIBE MEDIADA POR LA REGIÓN 3’ NO CODIFICANTE S Foscaldi, A D’Antuono, N Lopez Centro de Virología Animal (CEVAN)-Instituto de Ciencia y Tecnología “Dr. Cesar Milstein”, CONICET, Argentina. Los ARNm del virus Tacaribe (TCRV), perteneciente a la flia. Arenaviridae, poseen estructura cap en el extremo 5’. Poseen además regiones 5’ y 3’ no codificantes (UTR) y, a diferencia de la mayoría de los ARNm celulares, carecen de cola de poli(A) en el extremo 3’. Dentro de la región 3’ UTR, presentan una secuencia de 40 nucleótidos que podría adoptar una estructura secundaria muy estable de tipo hairpin. Utilizando transcriptos sintéticos que contienen estructura cap, codifican para el gen Firefly Luciferasa (FLUC), y que son análogos a uno de los ARNm virales (el ARNm de la Nucleoproteína -NP-), demostramos previamente que la integridad de la región 3’ UTR es requerida para la traducción de los ARNm virales. En este trabajo, se analizó la 42 Libro de resúmenes contribución de la estructura y la secuencia de dicha región en este proceso. Para tal fin, se evaluó la eficiencia de traducción de transcriptos sintéticos, con deleciones, inserciones o substituciones en la región 3’ UTR, luego de la transfección de células en cultivo. El reemplazo de la secuencia hairpin por una secuencia que podría plegarse para formar una estructura de menor estabilidad resultó en un aumento de la actividad FLUC de hasta 40% respecto al control; mientras que la inserción de un segundo hairpin en el extremo 3’ del ARNm la redujo en un 30%. La substitución de la totalidad de la región 3’ UTR por una secuencia de igual longitud, sin estructura secundaria predicha, cuadriplicó los valores de actividad FLUC y su reemplazo por una cola de poli(A) produjo valores de actividad FLUC que llegaron a 1400% respecto a los valores promedio del control. Por otra parte, se investigó también la dependencia del factor celular de iniciación eIF4G así como la contribución de la proteína viral NP. La cotransfección del ARN sintético con un plásmido que expresa la proteasa 2A de enterovirus resultó en el clivaje de eIF4G, determinado por Western blot, y en la reducción de la actividad FLUC en un 50% respecto al control. En contraste, la presencia de NP no modificó la eficiencia de traducción del ARNm salvaje. Estos resultados, junto con la observación que la ausencia del cap reduce 100 veces la eficiencia de traducción del transcripto salvaje, sugieren que: 1) la traducción de los ARNm es dependiente de cap y del factor celular eIF4G; 2) la proteína viral NP no desempeñaría un rol en la traducción; 3) la estructura hairpin es un elemento modulador de la eficiencia de traducción de los ARNm virales. 0412 ROL DE LAS ESTRUCTURAS DE ARN DURANTE LA ADAPTACIÓN A HUMANOS Y MOSQUITOS C Filomatori, S Villordo, A Gamarnik Fundación Instituto Leloir-CONICET, Buenos Aires, Argentina. El virus de dengue es un patógeno humano transmitido por mosquitos para el cual no existen tratamientos antivirales efectivos. En este trabajo hemos investigado la relevancia de las regiones no codificantes del genoma del virus del dengue durante la adaptación viral. Mediante ensayos de evolución in-vitro y el empleo de tecnologías de secuenciación de nueva generación hemos podido detectar una secuencia del extremo 3’ del ARN viral que está sometida a fuerzas de selección opuestas durante la adaptación del virus a células de humanos y mosquitos. El empleo de técnicas de mapeo químico y ensayos del fitness viral nos permitió determinar que esta región contiene una estructura de ARN duplicada que necesita adaptarse cuando el virus pasa de humanos a mosquitos. Durante la infección de la célula huésped, se produce la acumulación de fragmentos de ARN subgenómicos (ARNsf) derivados del extremo 3’ UTR de los Flavivirus. Estos fragmentos se originarían por degradación incompleta de las moléculas del genoma por acción una exoribonucleasa celular, la cual se detiene en estructuras rígidas de ARN al inicio del 3’UTR. Puesto que durante la adaptación al hospedador se seleccionan virus con modificaciones en estructuras que podrían estar directamente asociadas a la acumulación de los fragmentos subgenómicos, estudiamos el patrón de ARNsf en virus adaptados a células de humano y mosquito. Este abordaje nos ha permitido determinar que existe una correlación entre la mejora del fitness viral y cambios cualitativos del perfil de ARNsf durante la adaptación al hospedador. Con la realización de este trabajo hemos generado nuevos conocimientos sobre la biología de la transmisión del virus que podrán ser útiles para el desarrollo de nuevas estrategias antivirales. 0414 REQUERIMIENTO DIFERENCIAL DE ESTRUCTURAS DE ARN PARA LA REPLICACIÓN DEL VIRUS DEL DENGUE EN DISTINTOS HOSPEDADORES L De Borba, SM Villordo, NG Iglesias, CV Filomatori, LG Gebhard, AV Gamarnik Laboratorio de Virología Molecular, Fundación Instituto Leloir-CONICET, Argentina. El virus del dengue (DENV) es un miembro de la familia Flaviviridae, que incluye otros patógenos importantes, como el virus de la fiebre amarilla (YFV), el virus del Nilo Occidental (WNV), el virus de la encefalitis de Saint Louis (SLEV) y el virus de la encefalitis japonesa (JEV). El genoma del DENV es una molécula de ARN, simple cadena y polaridad positiva que contiene un único marco abierto de lectura flanqueado por regiones muy estructuradas, 5’ y 3’ no traducidas (UTRs). Elementos de ARN situados dentro de estas regiones son responsables de la iniciación de la traducción y la replicación del genoma. El genoma del DENV es una molécula dinámica que adopta conformaciones alternativas, lineales y circulares, que son necesarias para la replicación del ARN viral y el equilibrio entre estas formas del genoma es crucial para la infectividad del virus. Recientemente, identificamos una estructura de ARN en la región codificante de la proteína de cápside, a la que llamamos C1, que facilita la circularización del genoma viral. Este proceso esta mediado por interacciones ARN-ARN de larga distancia por complementariedad de bases entre la secuencia conservada C1 y una secuencia del 3’UTR contenida en una estructura llamada dumbbell 1 (DB1). Empleando genética reversa junto con estudios bioquímicos pudimos demostrar que dichas interacciones de larga distancia aumentan la eficiencia de replicación del ARN viral. En todos los serotipos de DENV, la estructura DB1 se encuentra duplicada (DB2). Si bien anteriormente se ha postulado que ambos DBs serían necesarios para una replicación viral eficiente, aún se desconoce cómo funcionan en forma individual. Debido a que nuestros estudios recientes le asignan un rol específico a secuencias del DB1, nos propusimos extender el análisis al DB2. Utilizando un clon infeccioso del DENV2 que codifica para una luciferasa como reportero, diseñamos deleciones de cada uno de los DBs o incorporamos mutaciones que alteren la estructura de los mismos. Las moléculas de ARN viral fueron transfectadas en células de mosquito y de mamífero crecidas en cultivo y la replicación fue evaluada a distintos tiempos por medio de actividad luciferasa. Los resultados indican que la deleción del DB1 disminuye notablemente la replicación viral, corroborando la importancia de su presencia para la interacción de larga distancia con la secuencia C1 de cápside. Por otro lado, la deleción del DB2 aumentó más de 10 veces la replicación viral en células de mosquito C6/36, sugiriendo que esta estructura modula negativamente la replicación en dichas células. Sorprendentemente el virus con la deleción del DB2 infectó y replicó en células de mamífero a niveles comparables al virus parental. Estos resultados resaltan un requerimiento diferencial de estructuras de ARN del 3’UTR para la replicación del DENV en células de mosquito y mamífero. 0415 ESTUDIO DE LOS REQUERIMIENTOS DE LA PROTEÍNA DE CÁPSIDE DEL VIRUS DEL DENGUE PARA LA ENCAPSIDACIÓN Y EL DESNUDAMIENTO DEL VIRUS L Byk, NG Iglesias, MM Samsa, AV Gamarnik Laboratorio de Virología Molecular, Fundación Instituto Leloir-CONICET, Buenos Aires,, Argentina. El virus del dengue (DENV) es el patógeno viral humano transmitido por mosquito de mayor importancia a nivel mundial, infectando a más de 400 millones de personas cada año. Es un virus envuelto con un genoma a RNA simple cadena de polaridad positiva de aproximadamente 11 Kb. Contiene un solo marco abierto de lectura el cual es traducido en una poliproteína que es procesada co y posttraduccionalmente dando lugar a 10 proteínas, 3 de las cuales son estructurales: cápside, prM y E. El virus ingresa a la célula hospedadora por un mecanismo de endocitosis mediada por receptor, el cual involucra la unión de E a un receptor celular. Luego de la internalización, la fusión de la membrana viral con la membrana endosomal permite la liberación de la nucleocápside al citoplasma. El desnudamiento viral involucra la disociación de la cápside del RNA. Por otro lado durante la morfogénesis de las nuevas partículas virales la proteína de cápside debe asociarse al RNA para formar la nueva nucleocápside. Los procesos de desnudamiento y encapsidación, que involucran ambos a la proteína de cápside y al genoma viral, ocurren por mecanismos aún desconocidos. La proteína de cápside posee un peso molecular de 12 kDa, es altamente básica y forma un homodímero en solución. Cada monómero está formado por cuatro alfa hélices y los primeros 20 aminoácidos no poseen estructura definida en solución. 43 Libro de resúmenes En este trabajo examinamos los determinantes de la proteína de cápside del virus del dengue necesarios para la encapsidación y el desnudamiento. Un análisis mutacional sistemático utilizando un sistema de virus reportero indicó que se requiere la presencia de aminoácidos básicos en el extremo amino terminal y en el centro de la alfa hélice 4 para la formación de partículas infectivas. A partir de estos estudios elaboramos un modelo de interacción cápside-RNA. Por otro lado se identificaron aminoácidos específicos que redujeron levemente la producción de partículas virales pero que afectaron drásticamente la infectividad viral. De esta forma identificamos requerimientos específicos que nos permiten disociar los procesos de encapsidación y desnudamiento. Por último, pudimos detectar y estudiar la cinética de degradación de la proteína C que ingresa a la célula durante la infección. Nuestros resultados indican que tanto C como el genoma viral son degradados luego de la internalización, y que la degradación de C es dependiente de la actividad del proteosoma. 0416 LA PROTEÍNA NS5 DEL VIRUS DEL DENGUE 2 ALTERA EL SPLICING CELULAR DURANTE LA INFECCIÓN FA De Maio1, G Risso2, NG Iglesias1, P Shah3, N Krogan3, R Andino3, A Srebrow2, AV Gamarnik1 1 Laboratorio de Virología Molecular, Fundación Instituto Leloir – CONICET, Argentina. 2 Laboratorio de Fisiología y Biología Molecular, FCEyN UBA – CONICET., Argentina. 3 University of California, San Francisco, Estados Unidos. El virus del dengue posee un genoma de ARN simple cadena de polaridad positiva el cual codifica un único marco abierto de lectura. El ARN viral es traducido en una poliproteína precursora de 10 proteínas virales. La proteína NS5 es la de mayor tamaño (105 kDa), con un dominio metiltransferasa y otro ARN polimerasa dependiente de ARN, siendo fundamental para la replicación viral. Con el objetivo de identificar proteínas celulares que interaccionan con NS5 durante la infección, se abordó un proyecto de proteómica. Para esto se desarrolló un virus recombinante que expresa NS5 fusionada a un péptido de purificación Strep-tag. Esto permite la recuperación de la proteína viral formando parte de complejos proteicos nativos en el contexto de una infección. Utilizando como herramienta este virus modificado, se infectaron líneas celulares humanas y se procedió luego a analizar por espectrometría de masa las proteínas recuperadas. Se identificaron así más de 50 proteínas celulares con interacción específica a NS5 durante la infección. Entre estas se observó la presencia de componentes del spliceosoma, destacándose entre ellos varios factores que integran la ribonucleoproteína denominada complejo U5. Estos hallazgos fueron validados por estudios de interacción de NS5 sobre-expresada con componentes específicos del spliceosoma por medio de co-precipitaciones. Con el fin de indagar sobre un posible efecto de la infección viral sobre el splicing celular, analizamos en células no infectadas e infectadas una serie de eventos de splicing alternativo de distintos genes por una estrategia de PCR que permite detectar las distintas formas resultantes de este proceso (inclusión o exclusión de un determinado exón en el ARN mensajero maduro). Mediante esta técnica determinamos que la infección viral tiene un claro efecto sobre la abundancia relativa de las isoformas analizadas. En vista de estos hallazgos, estudiamos el efecto directo de la proteína NS5 sobre eventos de splicing por medio de la sobre-expresión de la proteína fuera del contexto de la infección. Para ello transfectamos un vector de expresión de NS5 conjuntamente con plásmidos portando “minigenes”, construcciones utilizadas como reporteras de splicing. Los resultados de estos ensayos mostraron un importante efecto de NS5 alterando la relación de isoformas en el sistema usado. Por último, para estudiar la relevancia que la interacción NS5-spliceosoma pudiera tener para la replicación viral, decidimos realizar ensayos de RNA de interferencia para componentes del spliceosoma identificados como interactores de NS5. Interesantemente, se observó que al interferir ciertos factores del complejo U5 se produjo un incremento significativo en la replicación viral. Los resultados obtenidos indican que el virus del dengue altera el patrón de splicing en células humanas infectadas, por un mecanismo que involucra a la proteína NS5 y que probablemente esto de lugar a un estado celular más favorable para la replicación viral. 0417 LA PROTEÍNA NS3 DEL VIRUS DEL DENGUE DESEMPEÑA UN ROL ESENCIAL EN LA PRODUCCIÓN DE PARTÍCULAS VIRALES INFECTIVAS LG Gebhard, NG Iglesias, LA Byk, FA De Maio, AV Gamarnik Laboratorio de Virología Molecular, Fundación Instituto Leloir-IIBBA CONICET, Argentina. La proteína no estructural 3 (NS3) del virus del dengue (DENV) es una proteína multifuncional (69 kDa) que contiene las actividades de serinproteasa, ARN-helicasa y NTPasa. Estas actividades enzimáticas son esenciales para la replicación viral. Su dominio de proteasa (residuos 1 al 169) escinde la poliproteína viral en múltiples sitios. Su dominio helicasa/NTPasa (residuos 179 al 618) asiste a la ARN-polimerasa viral en la síntesis y amplificación del genoma viral. Estos dominios funcionales y estructurales están unidos a través de una región interdominio de 9 residuos de aminoácidos. Se ha implicado al dominio helicasa de la NS3 del virus de la fiebre amarilla (YFV), que al igual que DENV pertenece a la familia Flaviviridae, en desempeñar un papel en el ensamblado de las partículas virales, aunque su función en este proceso es hasta ahora desconocida. Para determinar el papel de la NS3 del DENV en la formación de las partículas virales, se utilizó genética inversa para llevar a cabo una mutagénesis de barrido por alaninas en la secuencia de la NS3 de un clon infeccioso del DENV. Para este estudio también se utilizó un virus monocistrónico reportero que expresa luciferasa. Teniendo en cuenta la estructura cristalográfica conocida de la NS3, se obtuvieron 30 mutantes del DENV con cambios en residuos superficiales situados en los dominios de proteasa, helicasa, y la región interdominio. De acuerdo a los niveles de expresión del gen de luciferasa en células transfectadas con el virus reportero, algunos mutantes mostraron defectos moderados o severos en la replicación viral. Otros mutantes fueron capaces de replicarse y producir virus infecciosos tan eficientemente como el virus original. Notablemente, ciertos mutantes replicaron de manera eficiente, con niveles de expresión de proteínas y ARN virales similares al virus original, pero tuvieron graves defectos e incluso impedimentos en la producción de partículas infectivas. De esta manera se identificaron ciertos residuos situados en los dominios de proteasa, helicasa y la región interdominio de la NS3 que son esenciales para el ensamblaje del virión y, consecuentemente, para la producción de partículas infecciosas del DENV tanto en células de mamífero como de mosquito. En este trabajo se estableció que el ensamblado del virus del dengue y la producción de partículas infecciosas son procesos sensibles a mutaciones puntuales en residuos superficiales que no afectan las actividades enzimáticas de la proteína NS3 y que los dominios de proteasa, helicasa y la región interdominio de la NS3 están involucrados en estos procesos. Virus en plantas 0018 ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN IN VIVO DE LA PROTEÍNA SUPRESORA DE SILENCIAMIENTO P0 DEL COTTON LEAFROLL DWARF VIRUS CON PROTEÍNAS DEL HOSPEDANTE VC Delfosse1, YC Agrofoglio1, MF Casse2, HE Hopp1, I Bonacic Kresic2, V Ziegler-Graff3, AJ Distéfano1 1 Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA-Castelar, Argentina. 2 EEA Roque Sáenz Peña, INTA-Chaco, Argentina. 3 Institute de Biologie Moléculaire des Plantes (IBMP), Strasbourg, Francia. El algodón es un cultivo regional clave en el NEA. La “enfermedad azul” del algodón fue reportada en la Argentina durante la campaña agrícola 1982/83 y actualmente causa importantes pérdidas en el cultivo si no se implementan medidas adecuadas de control. La enfermedad es producida por el Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) y el virus es transmitido por el pulgón del algodón Aphid gossypii Glover. El CLRDV pertenece al género Polerovirus de la familia Luteoviridae, posee un 44 Libro de resúmenes genoma de RNA simple cadena positiva (5,866 kb) que codifica para un total de seis proteínas. Nuestro grupo ha demostrado recientemente que la proteína P0CLRDV posee actividad supresora del mecanismo de silenciamiento génico. Según lo reportado para la proteína P0 del polerovirus Turnip yellow virus, P0 interacciona con el sistema SCFubiquitin ligase y media la degradación de la proteína AGO1 de la vía de silenciamiento de la planta. Además, estos estudios indican que dicha interacción ocurre a través del dominio F-Box (LPXXL/IX10-13P) de la proteína P0. Con el objetivo de determinar si la proteína P0CLRDV interacciona con el sistema SCF-ubiquitin ligase se evaluó, mediante la técnica de doble hibrido en levaduras, la interacción de P0CLRDV con las proteínas ASK de Arabidopsis thaliana y sus correspondientes ortólogos en Nicotiana benthamiana (SKP) y en su hospedador natural Gossipium hirsutum (GSK). Además, se evaluaron dichas interacciones en mutantes de P0CLRDV en el dominio F-Box (P0CLRDV-Box), con el objetivo de determinar la implicancia de dicho dominio en el mecanismo de acción de P0CLRDV. Los resultados indicaron que P0CLRDV es capaz de interaccionar con SKP de N. benthamiana y GSK de G. hirsutum pero no fue posible determinar su interacción con ASK de A. thaliana mediante la técnica utilizada. Por otra parte P0CLRDV-Box perdió la capacidad de interaccionar con SKP. Estos resultados muestran que el mecanismo de acción de P0CLRDV se encuentra conservado respecto de otros P0 previamente caracterizados y que el dominio F-Box es indispensable para que ocurra dicha interacción. Nuestros resultados representan un avance en la comprensión de la función de P0CLRDV como factor de patogenicidad del CLRDV. 0065 CARACTERIZACIÓN DE LA PROTEÍNA SUPRESORA DE SILENCIAMIENTO Y DE MOVIMIENTO VIRAL DE UNA VARIANTE VIRULENTA DEL COTTON LEAFROLL DWARF VIRUS YC Agrofoglio1, VC Delfosse1, MF Casse2, HE Hopp1, I Bonacic Kresic2, AJ Distéfano1 1 Instituto de Biotecnología, INTA Castelar, Argentina. 2 EEA Saénz Peña, INTA Chaco, Argentina. El algodón es un cultivo regional económicamente clave en el NEA. En las campañas 2009/10/11/12 se detectó una virosis en cultivares de algodón resistentes al Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV, género Polerovirus), agente causal de la enfermedad azul, produciendo el primer quiebre de resistencia del germoplasma local. Este nuevo virus fue secuenciado completamente y se determinó que las proteínas codificadas por el mismo tienen una identidad de secuencia con las proteínas codificadas por el CLRDV que varía del 88% al 98%. Debido a que la proteína P0 de esta variante del CLRDV posee menos de 90% de identidad con respecto a la proteína P0 del CLRDV, postulamos a este virus como una nueva especie dentro del género Polerovirus, a la que denominamos Cotton leafroll bushy virus (CLRBV). Nos propusimos determinar cuál/es de las proteínas del CLRBV son las responsables del sobrepaso de la resistencia en las variedades de algodón locales. Se seleccionaron para el estudio las proteínas P0 y P4. P0 es la proteína que presenta el menor valor de identidad con respecto al CLRDV (88%), además de ser una proteína descripta para otros virus de la familia como determinante de patogenicidad y supresor de silenciamiento génico. La proteína P4, es la proteína responsable del movimiento del virus de célula a célula, presenta varios cambios de aminoácidos con respecto al CLRDV (95% de identidad) y esta descripto para otros virus que pequeñas variaciones en la proteína de movimiento son responsables del quiebre del germoplasma resistente. Se demostró que la proteína P0 del CLRBV no posee actividad supresora de silenciamiento local ni sistémico, a diferencia de lo observado con la proteína P0 del CLRDV que sí posee actividad supresora de silenciamiento local. Esto se debe, posiblemente, a una mutación encontrada en el dominio F-Box, como fue demostrado para otros virus del mismo género. Se realizaron construcciones de reemplazos de las proteínas candidatas en el clon infectivo de la variedad CLRDV y fueron evaluadas en infecciones controladas en el invernáculo utilizando variedades de algodón resistentes y susceptibles a enfermedad azul. Las plantas con resistencia a CLRDV fueron infectadas con el clon infectivo del CLRDV con su proteína de movimiento reemplazada por la del CLRBV. Este virus no logró quebrar la resistencia y las plantas no se infectaron, al igual que ocurre con el CLRDV. Por otro lado, las variedades susceptibles que fueron infectadas con ambos virus no mostraron diferencias con respecto a la sintomatología. Los cambios aminoacídicos encontrados en la MP de CLRBV no serían los responsables por sí solos del quiebre de la resistencia y de la distinta sintomatología observada en las plantas de algodón. 0203 CARACTERIZACIÓN DEL PERFIL DE SIRNAS DERIVADOS DEL GENOMA DEL VIRUS DEL MAL DE RÍO CUARTO EN PLANTAS DE TRIGO INFECTADAS UTILIZANDO SECUENCIACIÓN DE ALTO RENDIMIENTO LA de Haro1, A Dumón2, MF Mattio2, E Argüello Caro2, G Llauger1, D Zavallo1, S Asurmendi1, G Truol2, M del Vas1 1 Instituto de Biotecnología, CICVyA, CNIA, INTA, Argentina. 2 Instituto de Patología Vegetal, CIAP, INTA, Argentina. El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causa la enfermedad más importante del maíz en la Argentina. El virus replica tanto en gramíneas como en insectos de la familia Delphacidae que actúan como vectores. Su genoma está compuesto por 10 segmentos de dsRNA que codifican para 13 proteínas. El silenciamiento génico mediado por RNA es un mecanismo generalizado de defensa contra infecciones virales y bacterianas que da lugar a RNAs de 21 a 24 nt que se denominan ARNs pequeños interferentes o siRNAs. Durante el desarrollo de una infección viral, el silenciamiento se desencadena a partir de estructuras de dsRNA que se producen durante la replicación que dan lugar a siRNAs derivados del genoma viral (vsiRNAs). Luego, proteínas de tipo AGO se unen a vsiRNAs formando complejos RISC capaces de reconocer de manera específica de secuencia a moléculas blanco de mRNA promoviendo su degradación o la represión de su traducción. En el presente trabajo, se infectaron plántulas de trigo con MRCV utilizando su vector natural (Delphacodes kuscheli) en condiciones controladas de invernáculo (dos réplicas de n = 164). Se colectaron muestras de hojas superiores a la hoja infectada a los 12 y 21 días post transmisión (dpt) y se cuantificó la carga viral por RT-qPCR. Se extrajo RNA enriquecido en RNAs pequeños a de pooles de 3 plantas con carga viral similar y se secuenciaron utilizando el equipo HiSeq 1500 (Illumina, INDEAR). Luego del recorte de adaptadores y filtrado por calidad se obtuvieron en promedio 23 millones de lecturas limpias por muestra. En primer lugar se mapearon las secuencias obtenidas al genoma viral utilizando el programa CLC Genomics Workbench. Entre ellas dominaron las lecturas de 21 y 22 nt que se distribuyeron de manera heterogénea entre los 10 segmentos. Un promedio de 230 mil lecturas (~1,7%) mapearon a los 12 dpt mientras que 1,9 millones (~5,2%) lo hicieron a 21 dpt. A partir de todas las secuencias virales se reconstruyó el genoma correspondiente al aislamiento de MRCV utilizado. Se analizó el número de lecturas por cadena y por segmento, obteniéndose perfiles diferenciales según los dpt. Se observó una acumulación y distribución de vsiRNAs característica para cada segmento, posiblemente debida a diferencias en los niveles de expresión de cada uno de ellos y/o a la presencia de estructuras secundarias. Finalmente, se estudió si aquellas regiones del genoma viral en las que mapearon un número inusitadamente alto de lecturas (hot spots) son capaces de plegarse sobre sí mismas dando lugar a estructuras secundarias locales de dsRNA que podrían desencadenar silenciamiento de manera preferencial. En particular, se observó una alta cantidad de vsiRNAs que mapean sobre los extremos 5´ y 3´ de los segmentos 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 y 10. Este trabajo representa el primer estudio de RNAs pequeños virales para Mal de Río Cuarto, y según nuestro conocimiento, la primera secuenciación de RNAs pequeños en plantas de trigo infectadas con virus. 45 Libro de resúmenes 0312 ANÁLISIS DE INFECCIONES MIXTAS DE BEGOMOVIRUS EN TOMATE Y PIMIENTO EN INVERNADERO MEDIANTE LA TÉCNICA DE ROLLING CIRCLE AMPLIFICATION-RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (RCA-RFLP) VA Bornancini, CG Vaghi Medina, D Ducasse, PM López Lambertini Instituto de Patología Vegetal, CIAP-INTA, Argentina. El género Begomovirus (Familia Geminiviridae) agrupa virus que ocasionan severas pérdidas económicas en el cultivo de tomate y pimiento en nuestro país y a nivel mundial. Son virus con genoma de DNA simple cadena empaquetado en partículas gemelas, transmitidos por mosca blanca (Bemisia tabaci). Particularmente en Argentina hemos identificado 7 especies de begomovirus y la presencia de infecciones mixtas en tomate. En el presente trabajo nuestro objetivo fue estimar la diversidad de begomovirus en tomate y pimiento involucrados en infecciones mixtas mediante RCA-RFLP en localidades productoras (Pichanal, Orán, Yuto y Lules) del noroeste argentino (NOA). Para ello se analizaron mediante la técnica de PCR-Multiplex 101 muestras de pimiento y 117 de tomate. A partir de las muestras positivas (52 de pimiento y 59 de tomate) se amplificaron mediante RCA los genomas completos de begomovirus. Cada producto de amplificación fue digerido con ApaI, BamHI, PstI y XhoI y sembrado en geles de agarosa al 1,2% obteniéndose 4 patrones polimórficos de restricción para cada muestra, a partir de los cuales quedó conformado un patrón de restricción combinado (PRC). Se obtuvieron un total de 58 PRC de los cuales correspondieron 34 PRC para tomate y 24 PRC para pimiento y solo 4 de estos patrones fueron compartidos entre ambos cultivos. La cantidad de PRC registrados en un mismo invernadero osciló entre 1-4 para pimiento y 1-11 para tomate. La elevada cantidad de PRC registrados permite inferir una gran diversidad de especies de begomovirus y la presencia de distintos begomovirus involucrados en infecciones mixtas en plantas que se encuentran en un invernadero. Cabe destacar que mediante el presente trabajo se confirma la presencia de infecciones mixtas de begomovirus en pimiento en nuestro país. Debido a los resultados obtenidos se alerta sobre la ineficiencia de seleccionar medidas de control basadas en resistencia a un begomovirus en particular, ya que el escenario es mucho más complejo. 0314 RECONSTRUCCIÓN DE HAPLOTIPOS DEL GENOMA COMPLETO DEL VIRUS DEL MOSAICO ESTRIADO DEL TRIGO (WHEAT STREAK MOSAIC VIRUS, WSMV) A PARTIR DE SECUENCIAS GENERADAS POR TÉCNICAS DE NUEVA GENERACIÓN (NEXT-GENERATION SEQUENCING) V Alemandri, PM López Lambertini, G Truol IPAVE-CIAP-INTA, Argentina. El virus del mosaico estriado del trigo o Wheat streak mosaic virus (WSMV) es la especie tipo del género Tritimovirus en la familia Potyviridae. WSMV es el agente causal de una de las enfermedades virales más importantes en ese cereal. Está constituido por un segmento de ssRNA sentido positivo de aproximadamente 9384 nucleótidos, el cual es traducido como una única poliproteína, con una organización de su genoma similar a los Potyvirus. WSMV se encuentra en plantas infectadas como poblaciones heterogéneas de variantes genéticas no idénticas pero si relacionas entre sí. Las técnicas de secuenciación de nueva generación (next-generation sequencing, NGS) permiten realizar estudios con nuevos enfoques sobre la diversidad de poblaciones virales dentro de su hospedante. El objetivo de este trabajo fue obtener la reconstrucción de haplotipos del genoma completo del WSMV y su frecuencia a partir de secuencias generadas por pirosecuenciación (tecnología 454, Roche) en plantas de trigo y otras gramíneas infectadas. Se diseñaron iniciadores y se ajustaron todos los parámetros de la reacción de RT-PCR para la amplificación del genoma completo del virus. Los productos de amplificación de 13 aislamientos del WSMV de diferentes regiones productoras del país se aislaron de gel de agarosa y se secuenciaron mediante 454/Roche GS FLX (INDEAR). Las lecturas obtenidas fueron sometidas a una serie de pasos de pre-procesamiento utilizando la herramienta FlexBar y el paquete estadístico R. Los mismo implicaron eliminación de adaptadores, separación por barcode y filtrado según criterios de calidad. Se emplearon las siguientes cuatro herramientas de ensamblado para la reconstrucción de haplotipos virales de genoma completo a partir de secuencias generadas por técnicas NGS: QuasQ, QuRe, QuasiRecomb y PredictHaplo. Se logró la reconstrucción de haplotipos, y la estimación de su frecuencia, del genoma completo de todos los aislados de virus con tres de los ensambladores, con la excepción de QuRe, el cual solo reconstruyó haplotipos parciales de longitudes menores. Se observó diferencias en el número y frecuencia de haplotipos tanto entre los aislados virales estudiados, como entre diferentes programas utilizados. La herramienta PredictHaplo estimó menor número de haplotipos para todos los aislados virales (entre 1 y 4), a diferencia de QuasQ y QuasiRecomb, los cuales se mostraron menos conservadores (entre 3 y 10000). La diferencia en el número y frecuencia de haplotipos de cada muestra observada entre los diferentes programas, donde solo comparten una tendencia las muestras con mayor número de haplotipos, es un buen debate. Los resultados obtenidos en este trabajo permitirán contribuir a una mejor comprensión de la diversidad genética intra-hospedante del WSMV y aportarán conocimientos para el manejo de esta enfermedad en el cultivo de trigo. 0332 DESCRIPCIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DE UN AISLAMIENTO COLOMBIANO DEL VIRUS DE LA RAYA NECRÓTICA DEL FIQUE GP Barrera Cubillos1, MN Belaich2 1 CORPOICA, Colombia. 2 Universidad Nacional de Quilmes, Argentina. El fique (Furcraea spp.) comprende a un conjunto de especies de agave muy cultivados en las zonas alto-andinas de la América tropical. Su valor comercial radica en la alta calidad de las fibras que producen sus hojas, aptas para su uso en diversas cadenas industriales, aunque también son empleadas por los pueblos originarios para la producción de artesanías, expresando así su valor cultural. Por otro lado, cumple un rol social dado que se promueve su siembra en reemplazo de otros vegetales cuyo cultivo es ilícito. Su distribución en Colombia comprende principalmente a los Departamentos Cauca, Nariño, Santander, Antioquia y Boyacá, caracterizándose por su desarrollo en territorios relativamente secos y atemperados por la acción de la altura. Y dado el rol destacado que quiere otorgársele a este vegetal, se está trabajando en pos de describir los factores que entorpecen su desarrollo para propender a su mejor explotación. Por ejemplo, una de las principales causas que afectan la productividad es la enfermedad de la Macana producida por el virus de la raya necrótica (Furcraea Necrotic Streak Virus o FNSV). Este patógeno se encuentra distribuido por toda el área productiva de Colombia, y posiblemente sea propagado por algunas especies de hongos que actuarían como vectores. Considerando esta situación, es importante describir biológicamente al virus y desarrollar estrategias diagnósticas que posibiliten el control de su dispersión, como así también diseñar aproximaciones terapéuticas que puedan servir en la mejora de la sanidad de los cultivos vigentes, dado que el potencial productor de fibra se da años después de la siembra del vegetal. En el Departamento Nariño se tomaron muestras de plantas de fique con sintomatología de la enfermedad de la Macana, a partir de las cuales se aislaron partículas virales que fueron caracterizadas mediante microscopia electrónica. Posteriormente, se aisló el material genético de RNA simple cadena y polaridad positiva, el cual se retro-transcribió in vitro utilizándose para ello primers diseñados ad hoc basados en una única secuencia disponible. Mediante clonado molecular de los productos, secuenciación automática por Sanger y RACE 5´ y 3´ se completó la secuencia genómica. Su análisis bioinformático permitió identificar las regiones codificantes y clasificar a este virus dentro de la Familia Tombusviridae. Por otro lado y como una primera aproximación para su control y potencial erradicación, se inició con el desarrollo de una estrategia basada en PCR para colaborar en el diagnóstico y seguimiento de la dispersión de este patógeno en las zonas colombianas productoras de Fique. 46 Libro de resúmenes 0338 ESTUDIO DE LA ALTERACIÓN DEL PROCESAMIENTO Y ACUMULACIÓN DEL MICRORNA-156 EN PLANTAS DE CITRUS CINENSIS (NARANJO DULCE) INFECTADAS CON CITRUS PSOROSIS VIRUS FE* Marmisollé1, CA* Reyes1, E Ocolotobiche1, A Bazzini2, S Asurmendi3, ML Garcia1 1 Instituto de Biotecnología y Biología Molecular, CCT-La Plata, CONICET – UNLP, La Plata, Buenos Aires, Argentina. 2 Department of Genetics, Yale University School of Medicine, New Haven, CT 06510, Estados Unidos. 3 Instituto de Biotecnología, CICVyA-INTA, Hurlingham, Buenos Aires, Argentina. * Ambos autores contribuyeron de igual manera en este trabajo. Citrus psorosis virus (CPsV) es el miembro tipo del género Ophiovirus, familia Ophiovoridae. Su genoma consiste de tres RNAs de simple cadena de polaridad negativa que codifican para cuatro proteínas: la RNA polimerasa RNA dependiente (280K) la proteína de movimiento (MP), la proteína de cápside (CP) y una pequeña proteína (24K) cuya función se desconoce. Los microRNAs (miRNAs) juegan un rol muy importante en la regulación del desarrollo de la planta. Estudios recientes realizados en plantas y animales han sugerido que los virus pueden interferir con la regulación de genes del huésped mediada por miRNAs a través de diferentes estrategias. Los miRNAs pueden ser afectados por la infección viral a nivel transcripcional o postranscripcional esta última pudiendo involucrar el procesamiento, la acumulación o la actividad de los miRNAs de la planta. Plantas de naranja dulce (Citrus sinensis (L.) Osbeck) fueron infectadas con CPsV y se observó una desregulación en la acumulación de un grupo de miRNAs conservados de la planta. Los niveles de las especies maduras de los miRNAs en las muestras de tejido infectado, evaluadas por Northern blot, disminuyeron respecto a las muestras sanas y se registró además un aumento concomitante de sus transcriptos targets (analizados por RT-qPCR). En particular el miR156 y sus targets SPLs (Squamosa Transcription Factors) fueron de los más afectados. Los precursores e intermediarios de procesamiento de dicho miRNA fueron también analizados mediante ensayos de Northern blot y corroborados por ensayos de RT-qPCR. Las muestras de tejido infectadas mostraron un aumento de la acumulación de los precursores no procesados (premiRNAs) respecto de las sanas. En particular se observó que el premiR156 de 143 nt se procesa mediante un mecanismo del tipo loop to base de dos cortes que también fue confirmado por modelaje bioinformático de las secuencia de los 7 miembros de la familia de precursores del miR156. Mediante Northern blots se detectaron los productos de ambos cortes. El primer corte produce dos especies intermediarias; una de 41 nt que constituye el loop principal y dos de 51 nt que incluyen los dos brazos del tallo principal y la secuencia madura. El segundo corte libera la especie madura. En las muestras infectadas la acumulación de estos intermediarios se encuentra reducida concomitantemente con el mencionado aumento en los precursores no procesados. Los resultados obtenidos nos permiten proponer la existencia de una asociación entre alguna o varias de las proteínas y/o RNAs virales y los precursores de miRNAs, que impediría el normal procesamiento de los mismos por la maquinaria de silenciamiento. 0345 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y FILODINÁMICA DEL VIRUS DE LA TRISTEZA DE LOS CÍTRICOS MJ Benítez1, A Bertalmío2, L Rubio2, F Rivas2, D Maeso2, R Colina1 1 Universidad de la República, CENUR Noroeste, Salto, Uruguay. 2 Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, Uruguay. Desde que apareció hace dos siglos atrás, la enfermedad conocida como Tristeza, es la enfermedad viral más devastadora de la industria citrícola a nivel mundial. Su agente etiológico, el Virus de la Tristeza de los Cítricos (CTV), es transmitido por injertos de material vegetal infectado o por insectos vectores como el áfido Toxoptera citricida. La existencia de variantes genéticas del virus con diversos grados de severidad, han sido reportadas en todas las áreas citrícolas afectadas. La caracterización de aislados de CTV puede proveer información epidemiológica importante que puede ser de gran utilidad para el control de la enfermedad. En el Uruguay, no existen datos moleculares, que reflejen las variantes genéticas circulantes en el país. De esta manera nos propusimos realizar en el presente estudio el diagnóstico y caracterización de CTV mediante el uso de técnicas moleculares. En el presente estudio se implementa, por primera vez en Uruguay, un método de detección del genoma de CTV por RT-PCR en tiempo real con química TaqMan que constituye un herramienta rápida, confiable y precisa. Esta herramienta permitirá el procesamiento de un gran número de muestras lo que puede ser de gran utilidad tanto para los productores como para las entidades de vigilancia sanitaria. También constituye el primer estudio de caracterización molecular y reconstrucción filogenética de las variantes genéticas que circulan en el país, basado en el análisis de la secuencia completa de los genes p25, p20 y p23 amplificados por RT-PCR. Por último, se logró conocer la composición poblacional de los distintos aislados utilizando como metodología la clonación. Los resultados mostraron que CTV presenta una gran diversidad genética, observando la presencia de cuatro linajes co-circulantes con distinta prevalencia, tres de ellos previamente descritos (VT, T3 y T36) y el cuarto identificado en este trabajo. Este nuevo clado (NC) se encuentra conformado por aislados de diversas partes del mundo incluyendo Uruguay, Argentina y Brasil. También se detectó la presencia de un aislado recombinante, procedente de un evento de recombinación entre los aislados T36 y NZ-M16, hecho altamente descrito en la historia de CTV. Por último, mediante análisis de coalescencia, se logró datar el ancestro común más reciente del nuevo linaje, así como también calcular la tasa de evolución del mismo. Se logró también modelar el comportamiento de la población de este linaje a lo largo de la historia, desde su origen al presente, identificando eventos que explican las fluctuaciones ocurridas por el tamaño de la población del virus en el tiempo. Estos resultados son de gran importancia para el monitoreo del virus en el país y para la implementación de planes de control a largo plazo. A su vez, cabe destacar que son resultados pioneros en el país, los que brindan información del estado de situación de este agente tan importante para la industria citrícola nacional. 0371 FILOGEOGRAFÍA DEL TOMATO YELLOW VEIN STREAK VIRUS EN AMÉRICA DEL SUR CG Vaghi Medina, PM López Lambertini Instituto de Patología Vegetal (IPAVE), CIAP-INTA, Argentina. Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV) es la especie de begomovirus (Familia Geminiviridae) prevalente en las regiones productoras de tomate para consumo en Argentina. El ToYVSV también infecta pimiento y papa. Los síntomas que ocasionan son clorosis, moteado y disminución de la hoja. Puede ocasionar grandes pérdidas económicas dependiendo del cultivar y el momento de infección. Los begomovirus del Nuevo Mundo poseen dos componentes genómicos denominados DNA-A y DNA-B. El DNA-A tiene 5 genes (Rep-AC1, TrAP-AC2, REn-AC3, CP-AV1). En este estudio se aplicó análisis filogeográfico del gen AV1 de aislamientos de Argentina, Brasil y Chile. Se clonó y secuenció 10 componentes genómicos DNA-A completos de ToYVSV de diferentes regiones productoras de Argentina. Las secuencias del gen AV1 se alinearon con MUSCLE y se determinó el modelo de evolución molecular con el jModeltest. El análisis filogeográfico fue llevado a cabo con el programa BEAST v1.7.5 calibrando el reloj molecular con el año de recolección. Se realizaron análisis continuos con las combinaciones de modelos de coalescencia, relojes moleculares, distintos modelos demográficos y el modelo de evolución molecular TIM1+G. Las cadenas de Markov se corrieron hasta convergencia. Las combinaciones de modelos de coalescencia y demográficos se compararon cada uno ellos estimando los likelihood marginales y el método AICM (Akaike Information Criterium Markov-Montecarlo) utilizando el Tracer. El modelo de coalescencia que más se ajusta al set de datos utilizado es el Cauchy con reloj molecular relajado lognormal y modelo de expansión demográfica lognormal. La tasa de sustitución nucleotídica calculada fue 9.8x10-3/s/s/a, la dispersión del ToYVSV se dio a una tasa de 164 km/año y edad del ancestro común más cercano fue de 29.28 años. En los inicios de la década del 80, el ToYVSV, se encontraba en el sur de Brasil cerca de localidad de Silveira Martins. No fue sino hasta 47 Libro de resúmenes aproximadamente el año 2002, casi 20 años después, que se produjo la migración hacia Argentina, más precisamente a la provincia de Misiones en las cercanías de la localidad de Albardón. Fue desde este punto donde comenzó una expansión más veloz que dio origen a los aislamientos encontrados en las provincias de San Juan y Córdoba en Argentina y en la localidad de Paty do Alferes, Brasil aproximadamente en el 2005. La llegada del virus a los cultivos de tomate en las provincias de Buenos Aires, Corrientes y Salta fue alrededor de 5 años después (2010). El último movimiento fue probablemente en el 2012 en el cual cruzó la barrera geográfica de La Cordillera de Los Andes llegando al norte de Chile en las cercanías de la localidad de Arica en el Valle de Azapa. Sala D (Salón Rodin - 2º piso) 13:45 - 15:15 hs. Epidemiología 0009 DISTRIBUCIÓN DE TIPOS DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO EN PACIENTES JÓVENES MEXICANAS E Rodriguez-Zitlalpopoca1 2, E Carreón1, C Lara1, ML Cedillo1 2 1 Centro de Detección Biomolecular. Vicerrectoría de Investigación y Estudios de Posgrado. Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, México. 2 Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas. Instituto de Ciencias. Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, México. Introducción El Virus del Papiloma Humano (VPH) es el principal causante de cáncer cervicouterino. Los genotipos 16 y 18 son los principalmente asociados con esta enfermedad. Los genotipos 6 y 11 están relacionados con la aparición de verrugas genitales o condilomas que raramente llegan a desarrollar cáncer. Objetivo El propósito de este estudio fue determinar cuáles genotipos son frecuentes entre mujeres jóvenes mexicanas las cuales no han sido vacunas contra VPH. Metodología Se tomaron ciento cuarenta y cuatro muestras de exudados cervicales en mujeres de 18 a 26 años de edad que no han sido vacunas, estas pacientes acudieron al laboratorio durante el año 2014. Firmaron una carta de consentimiento informado y un aviso de confidencialidad. Obtención del ADN con kit de extracción viral. Tipificación por microarreglos de ADN con kit HPV Type 3.5 (Chipron). La secuenciación de algunas muestras fue realizada para evaluar la especificidad del ensayo de microarreglo, para secuenciar se utilizó el método de Sanger. Resultados Cincuenta y ocho (40%) mujeres fueron positivas a VPH de las cuales 35 presenta más de un genotipo. Dos mujeres tuvieron siete genotipos diferentes. La distribución de los genotipos fue la siguiente: genotipo 91 (8%), 90 y 52 (7%), 42 y 56 (6%), 16 (5%), 18 (0.75%), 6 (1.5%) y 11 (0%). Otros genotipos fueron detectados con menor porcentaje que el tipo 16. Una muestra no pudo ser genotipificada por microarreglos se secuencio y se identificó como el tipo 89. Conclusiones Algunas niñas en México entre los 9-12 años son vacunadas, pero estas vacunas solo son efectivas contra los tipos 06, 11, 16 y 18, pero esos genotipos presentan una baja incidencia en el grupo de mujeres jóvenes mexicanas de nuestro estudio. Con el diagnóstico molecular de VPH y la genotipificación se pretende evaluar la distribución de esta infección para poder desarrollar una nueva vacuna. 0029 ROL ENDÉMICO DE LOS CALICIVIRUS EN LA GASTROENTERITIS AGUDA INFANTIL. ESTUDIO MULTICÉNTRICO. K Gomes1, A Zurschmitten2, MF Haddad2, P Cortes3, S Ferreyra3, HF Mina3, C Roldan4, D Amoedo4, L Ayala5, ML Cacace5, J Stupka1 1 INEI-ANLIS Dr "Carlos G. Malbrán", Argentina. 2 Hospital de Area Junín de los Andes, Argentina. 3 Hospital Pediátrico "Del niño Jesús", Argentina. 4 Hospital de Pediatria S.A.M.I.C "Prof. Dr. Juan Garrahan", Argentina. 5 Hospital "San Vicente de Paul", Argentina. Los síntomas principales de una gastroenteritis son diarrea, nauseas y vómitos, siendo la deshidratación la principal causa de internación y muerte por diarrea aguda (DA). La DA es una de las causas principales de morbi mortalidad en países en desarrollo donde se estima que alrededor de tres millones de niños fallecen por año por esta causa en todo el mundo. En Argentina se reporta anualmente alrededor de medio millón de casos de DA en niños menores de 5 años, donde es conocida la importancia de los agentes virales como causantes de dicha patologìa. Así se ha demostrado que en nuestro país aproximadamente el 18% en pacientes ambulatorios y el 30 % en pacientes internados por DA, el agente causal fue Rotavirus (RV). Sin embargo, resultados obtenidos a partir de la vigilancia de Diarreas por Unidades Centinela muestran que existe aproximadamente un rango de 40 a 60 % de casos de DA en niños sin diagnóstico etiológico conocido, reforzando la necesidad de ampliar el espectro de búsqueda de otros agentes. Norovirus (NV) y Sapovirus (SV) conocidos con el nombre genérico de calicivirus (CV), pertenecen a la familia Caliciviridae donde NV es la principal causa de brotes de gastroenteritis aguda (GA) epidémica. En nuestro país se reportó que NV fue detectado en el 87% de brotes de GA no bacteriana. El objetivo de este trabajo es determinar el rol de CV en la DA en niños menores de 5 años como así también determinar su prevalencia y estacionalidad. Para ello se realizó la búsqueda de CV mediante técnicas de biología molecular en 326 muestras de materia fecal. Las mismas provinieron de niños menores de 5 años con DA atendidos en cuatro centros hospitalarios ubicados en diversas regiones de nuestro país (Neuquén, Córdoba, Salta y CABA) que fueron internados o consultaron en forma ambulatoria durante el período comprendido entre diciembre de 2011 y noviembre de 2012. De las 326 muestras analizadas, 116 (35%) arrojaron un resultado positivo. De este total, en 104 (89%) se detectó NV, en 10 (9%) SV y en 1 (1%) ambos virus. Del total de pacientes estudiados, 131 (40,2%) debieron ser internados. En 58 de ellos (44%) se detectaron NV y SV (91% y 9% respectivamente) mientras que en pacientes ambulatorios, se detectaron NV y SV en 55 casos (89% y 11% respectivamente). La mayorìa de los casos positivos fueron detectados durante los meses fríos del año. Se destaca la alta prevalencia de NV encontrada en casos de DA infantil, con niveles de positividad similares a RV, quien es considerado el principal enteropatógeno durante la primera infancia. Por otro lado se observó que la diarrea por CV muestra un patrón estacional en coincidencia a lo reportado en otras regiones del mundo. El incremento en el espectro de búsqueda de agentes virales, permitirá profundizar en el conocimiento etiológico de la DA, lo que llevará al uso racional de los recursos disponibles contribuyendo en la implementación de medidas de control y prevención a nivel nacional. 0036 PREVALENCIA DE HEPATITIS VIRALES EN PERSONAS ATENDIDAS EN EL CENTRO DE PREVENCIÓN, ASESORAMIENTO Y TESTEO EN HIV Y SÍFILIS (CEPAT) DEL CENTRO E. CONI, MENDOZA, ARGENTINA. N Martínez1 2, S Bontti1 2, C González Arra1 2, D Delgado1 2, M Campero2, S Salvarredi2, C Sanz2, M Luna2, B Damiani3, V Bittar4, C Espul5, C Salomón1 2 1 Laboratorio de Referencia de Enfermedades Transmisibles, Centro E. Coni, Mendoza, Argentina. 2 CePAT, Centro E. Coni, Mendoza, Argentina. 3 Laboratorio de Análisis Clínicos, Centro E. Coni, Mendoza., Argentina. 4 Programa Provincial de SIDA, Mendoza, Argentina. 5 Programa Provincial de Hepatitis Virales, Mendoza, Argentina. Introducción: El testeo de hepatitis virales en población en riesgo resulta estratégico para conocer su situación epidemiológica e implementar medidas de prevención y tratamiento. Debido a que estas infecciones comparten vías de transmisión con HIV y Treponema pallidum, el centro de prevención, asesoramiento y testeo para HIV y sífilis (CePAT) en el que se desarrolla el presente trabajo, incluyó el ofrecimiento del testeo de estas patologías, desde el año 2.012. 48 Libro de resúmenes Objetivo: Determinar y analizar la prevalencia de hepatitis virales en la población atendida en un CePAT, tras dos años de la implementación del testeo voluntario de estas infecciones. Metodología: Entre agosto/2.012 y diciembre/2.014 se testearon 2.275 personas: 1.459 hombres y 816 mujeres, edad media de 32 ±10 años y rango de 11 a 80 años. Los sueros fueron analizados por métodos de enzimoinmunoanálisis (EIA) para antiHBc, antiHCV y antiHAV IgG. Las muestras con resultados reactivos para antiHBc fueron testeadas para HBsAg por EIA. Se determinaron las prevalencias de las hepatitis virales y se analizaron en función de variables edad/sexo. Resultados: La prevalencia de antiHAV fue de 63,52% (1.445/2.275), sin diferencias significativas respecto al sexo. El mayor porcentaje de personas susceptibles se detectó en menores de 30 años (47,44%), disminuyendo progresivamente con la edad. La prevalencia de antiHBc fue de 9,23% (210/2.275), significativamente mayor en hombres (12,13%) que en mujeres (4,04%), (p<0,001); aumentó gradualmente con la edad (desde 1,37% en < de 20 años, hasta 18% en > de 60 años). De estos pacientes 7,62% (16/210) presentaron HBsAg reactivo. La prevalencia hallada de antiHCV fue de 0,53% (12/2.275). Los pacientes con resultado reactivo fueron 7 hombres y 5 mujeres, con edad media de 36 ±9 años y rango de 22 a 49 años. Conclusiones: El testeo voluntario de hepatitis virales permitió el asesoramiento personalizado en base a los resultados de la serología específica de cada paciente. La vacunación para prevenir la hepatitis A, incorporada al calendario de vacunación en el año 2.004, produjo una reducción de la circulación del virus con un aumento de adultos jóvenes susceptibles. En la población estudiada, casi el 50% de las personas menores de 30 años resultaron susceptibles a contraerla. La vacunación en estos casos puede constituir una buena estrategia de prevención. El aumento de la prevalencia de antiHBc con la edad, evidencia la circulación del virus de hepatitis B en la población estudiada. El acceso universal a la vacuna, implementado desde el año 2.012, podría determinar una disminución de la prevalencia en todos los grupos etários. La hepatitis C es una enfermedad con alta tasa de cronicidad y disponibilidad de tratamiento, por lo tanto, pese a que la prevalencia determinada fue de 0,53%, es muy importante su detección temprana. Analizar las prevalencias en la población, es punto de partida para implementar y evaluar estrategias futuras. 0054 CARACTERIZACIÓN ANTIGÉNICA Y GENÓMICA DE LOS VIRUS INFLUENZA CIRCULANTES EN LA ERA POST-PANDEMIA 2010-2014 EN ARGENTINA E Benedetti, M Avaro, A Czech, M Russo, A Pontoriero, A Campos, N Periolo, E Baumeister Centro Nacional de Influenza OPS/OMS, Laboratorio Nacional de Referencia de Influenza y otros virus respiratorios. Servicio Virosis Respiratorias, Departamento Virología, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, ANLIS Malbrán, Buenos Aires, Argentina. La gripe estacional causa epidemias en humanos afectando al 5-20% de la población mundial cada año y genera demanda importante de los servicios de salud, afectando especialmente a grupos de riesgo. Al mismo tiempo posee un potencial pandémico. Influenza tipo A se clasifica según las características de los 18 subtipos de hemaglutinina (HA) y los 11 de neuraminidasa (NA) conocidos. Influenza tipo B se divide en dos linajes Yamagata (B-Y) y Victoria (B-V). Los objetivos de este trabajo fueron conocer el patrón de circulación de los tipos y subtipos de influenza que circularon en nuestro país después de la introducción de la cepa A(H1N1)pdm09 en 2009 y establecer las relaciones antigénicas y genómicas con virus de otras latitudes y los presentes en las fórmulas vacunales del período 2010-2014. El Centro Nacional de Influenza (CNI) de la OMS localizado en el INEI-ANLIS en Buenos Aires conduce la vigilancia virológica, es cabecera y coordina la Red Nacional de Laboratorios de Influenza y otros virus respiratorios (RNLIVR) en un marco mundial. La RNLIVR procesó 344.057 muestras para detección de virus respiratorios en los años 2010-2014, identificó 16.040 muestras positivas para influenza, remitió al CNI 8.256 para caracterización viral. Se intento el aislamiento en células MDCK y MDCK-SIAT, la subtipificación por rtRT-PCR usando primers y sondas desarrollados por los CDC, la caracterización antigénica por IHA, la caracterización genómica secuenciando las HA y NA y construyendo árboles de filogenia. En las 5 temporadas, se detectó circulación del virus de enero a diciembre, con mayor actividad entre las semanas 20 y 35, excepto en 2012 que se presento una demora de 10 semanas. En todo el período los dos tipos y los dos subtipos A(H1N1)pdm09 y A(H3N2) fueron detectados. En 2010 la circulación de A(H1N1)pdm09, sorpresivamente, fue baja. Aumentó en las temporadas siguientes llegando a ser el subtipo prevalente en 2013 y volviendo a caer en 2014. Las secuencias de HA estudiadas agrupan a los virus de A(H1N1)pdm09 en grupos genéticos diferentes respecto de los identificados en la pandemia de 2009 pero antigénicamente relacionados con la cepa vacunal que continúa sin modificaciones. Influenza A(H3N2) mantuvo una fuerte circulación en todos los años, antigénica y genomicamente en 2010, 2011 y 2013 fueron similares a las cepas incluidas en las fórmulas vacunales, no así en 2012. En 2014 la mayoría estuvieron antigénicamente relacionados con el componente vacunal pero con diferencias genómicas. Los virus B analizados en 2010 fueron B-V, en 2012 comenzó a cocircular con el B-Y; por lo que se cambia en la vacuna el B-V a B-Y para ambos Hemisferios. En 2013 y 2014 se mantiene la cocirculación de ambos linajes con mayor proporción de B-Y. La vigilancia de los virus de influenza en Argentina es una herramienta que ha permitido la detección precoz de nuevos virus y tener una concordancia superior al 80 % entre las cepas circulantes y las vacunales. 0059 DIVERSIDAD GENÉTICA DE LAS CEPAS CIRCULANTES DE ROTAVIRUS GRUPO A EN ARGENTINA, 2004-2013 JI Degiuseppe, EA Reale, JA Stupka, RNVLGV Laboratorio de Gastroenteritis Virales. INEI ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”. CABA, Argentina. Rotavirus del grupo A es el responsable del 30-40% de los casos de diarrea aguda en los menores de 5 años. A nivel mundial, causa aproximadamente 450.000 muertes por año, principalmente en los países en desarrollo. La caracterización clásica de los rotavirus del grupo A consiste en la tipificación molecular de los genes que codifican para las proteínas externas de la cápside VP7 (G tipo) y VP4 (P tipo). A pesar de que hasta el momento se han descripto 27 G y 37 P tipos, los estudios de vigilancia epidemiológica indican que los genotipos G1-4, G9, P[4] y P[8] son aquellos que se detectan más frecuentemente. Asimismo, 5 asociaciones de G y P tipos se consideran entre las más comunes (> 90%) mundialmente: G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8] y G9P[8]. Esta distribución no es homogénea entre los países desarrollados y los países en desarrollo. En estos últimos, eventualmente se detectan emergencias de genotipos infrecuentes (G5, G8 y G12), con distintas prevalencias. El objetivo de este estudio es describir la diversidad genética de las cepas circulantes de rotavirus grupo A en Argentina, durante el período 2004-2013. La caracterización molecular se llevó a cabo mediante la extracción del ARN viral de las muestras de materia fecal positivas para rotavirus que se remitieron al Laboratorio Nacional de Referencia desde diversos laboratorios del país, en el marco de la vigilancia nacional. Posteriormente, se realizó una RT-PCR nested multiplex, de acuerdo a protocolos convencionales. En el período estudiado, se caracterizaron 3.240 cepas de rotavirus del grupo A. Las asociaciones más frecuentemente detectadas en forma global fueron el G3P[8] y el G2P[4] (27,5 y 25,6%, respectivamente). Asimismo, se observó una elevada variabilidad en la prevalencia de los genotipos anualmente. Se destaca la emergencia de las asociaciones G9P[8] (2004-2006), G12P[8] (2008-2009) y G3P[8] (2009-2011), todas ellas en elevada frecuencia. El genotipo G1P[8], estimado como el más prevalente a nivel mundial, mostró una tendencia descendente hasta el año 2013, en que se detectó con moderada frecuencia. Las 5 asociaciones de G/P tipo consideradas comunes representaron más del 80% de las cepas circulantes, valor que asciende al 90% si se incluyen las cepas G12P[8]. Con respecto a las asociaciones menos frecuentes, se observó la emergencia de cepas G3P[6] (aproximadamente 7%) en 49 Libro de resúmenes los años 2011-2012. Las infecciones mixtas representaron menos del 2% de las muestras analizadas. En el contexto de la reciente introducción de la vacuna anti rotavirus en nuestro país (2015), este estudio constituye la descripción del escenario prevacunal. Se considera necesario continuar con esta clase de estrategias de vigilancia epidemiológica, a nivel nacional, para permitir evaluar en qué medida la circulación viral se relaciona con la eficacia vacunal, así como el posible efecto de estas vacunas sobre la ecología del virus. 0061 EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DEL VIRUS DE HEPATITIS D EN DIFERENTES POBLACIONES DE ARGENTINA G Pataccini1, C Berini1, ML Cuestas3, EA Gentile3, AI Castillo3, W Pedrozo4, R Malán4, JR Oubiña3, VL Mathet3, MM Biglione1, CM Delfino1 3 1 Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (INBIRS, UBA-CONICET), Argentina. 3 Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica (IMPAM, UBA-CONICET), Argentina. 4 Laboratorio de Calificación Biológica del Banco de Sangre Tejidos y Biológicos. Ministerio de Salud Pública de Misiones., Argentina. Introducción: el virus de hepatitis D (HDV) requiere del virus de hepatitis B (HBV) para su ensamblaje y secreción. Por este motivo, la infección por HDV sólo puede ocurrir en presencia del HBV; ya sea en eventos de coinfección o sobreinfección. Ambos tipos de infecciones, incrementan el riesgo de desarrollar hepatitis fulminante, cirrosis y/o hepatocarcinoma celular. Se estima que alrededor de un 5% de los portadores crónicos del HBV, tiene evidencia serológica de haber estado expuestos al HDV. Se observa una alta prevalencia de infección por este virus en el centro de África, Cuenca Amazónica, región Mediterránea, Oriente Medio y algunas partes de Asia. En Argentina, la prevalencia serológica oscila alrededor del 0,7%-5,7% al evaluarse muestras séricas de hemodonantes, pacientes con enfermedad hepática e individuos coinfectados con HIV-1. Además, nuestro grupo ha descripto esta infección en donantes de sangre y amerindios del noreste. En esta última población, la presencia del HDV fue detectada mediante transcripción inversa (RT) - nested-PCR (n-PCR) en individuos con infección oculta por HBV (OBI: HBsAg sérico indetectable ) y ELISA no reactivo para anticuerpos (Acs) anti-HDV. Objetivo: evaluar la presencia de la infección por HDV en diferentes poblaciones con distintos marcadores serológicos de infección para el HBV. Metodología: se analizaron un total de 232 muestras de plasma de diferentes poblaciones: usuarios de drogas inyectables (UDIs; n=35); pacientes HTLV-1 y 2 (pHTLV; n=14) y donantes de sangre (DS; n=183) que eran reactivos para distintos marcadores serológicos de infección por HBV (HBsAg y/ó Acs totales anti-HBc). A todas las muestras se le realizó el diagnóstico serológico de la infección por HDV mediante ELISA (Acs anti-HDV total, Abbott). A un total de 68 muestras que se encontraban disponibles (35 UDIs, 14 pHTLV y 19 DS) se les realizó la extracción del RNA y una región nucleotídica que codifica una parte del antígeno delta del HDV fue amplificada mediante RT-n-PCR. Resultados: la prevalencia para Acs anti-HDV fue del 14,3% (2/14) en pHTLV y del 7,1% (13/183) en DS. En UDIs no se detectó muestra reactiva alguna para Acs anti-HDV. Por RT-n-PCR, 2 muestras resultaron positivas para HDV (1 UDIs y 1 pHTLV-1), aunque ambas fueron no reactivas para Acs anti-HDV. Conclusiones: estos resultados confirman la circulación del HDV en las poblaciones estudiadas y sienta precedentes sobre la importancia de seguir investigando esta infección en otras poblaciones. Además, se demuestra la infección en casos no reactivos para Acs antiHDV por ELISA, lo cual resalta la importancia de realizar el diagnostico serológico y molecular en forma conjunta ante la sospecha de infección por HDV. 0062 NUEVOS CASOS DE HEPATITIS D EN PACIENTES CON HBSAG REACTIVO E INFECCIÓN OCULTA POR VIRUS DE HEPATITIS B EN ARGENTINA CM Delfino1 2, G Pataccini1, E Outon3, G García3, N Dieguez3, M Cicero3, S Castro3, C Berini1, ML Cuestas2, EA Gentile2, AI Castillo2, JR Oubiña2, VL Mathet2, MM Biglione1 1 Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (INBIRS, UBA-CONICET), Argentina. 2 Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica (IMPAM, UBA-CONICET), Argentina. 3 Laboratorio de Virología del Hospital Interzonal General de Agudos "Dr. Pedro Fiorito", Argentina. Introducción: el virus de hepatitis D (HDV) fue descubierto en un grupo de pacientes italianos con infección crónica por el virus de hepatitis B (HBV). Los autores describieron un antígeno asociado a un genoma de ARN pequeño que utilizaba las proteínas de envoltura del HBV para formar su virión, es por este motivo que la infección por HDV sólo puede ocurrir en presencia del HBV; ya sea en eventos de coinfección o sobreinfección. Ambos tipos de infecciones incrementan el riesgo de desarrollar hepatitis fulminante, cirrosis y/o hepatocarcinoma celular. Se estima que alrededor de un 5% de los portadores crónicos del HBV, tiene evidencia serológica de haber estado expuesto al HDV. Las guías de diagnóstico sugieren que todo paciente con HBsAg reactivo debería ser testeado para evaluar la presencia de anticuerpos (Acs) anti-HDV. Nuestro grupo ha descripto esta infección en donantes de sangre y amerindios del noreste de nuestro país. En esta última población, la presencia del HDV fue observada mediante transcripción inversa (RT)nested-PCR (n-PCR) en individuos con infección oculta por el HBV (OBI; HBsAg no reactivo) y ELISA no reactivo para Acs anti-HDV. Objetivo: evaluar la presencia de infección por HDV en una población hospitalaria con diferentes marcadores serológicos del HBV. Metodología: se analizaron 19 muestras de plasma de individuos reactivos para el HBV (13 con Acs totales anti-HBc solamente y 6 con Acs totales anti-HBc y HBsAg) que estuvieron internados por diferentes patologías en el Hospital Interzonal General de Agudos “Dr. Pedro Fiorito”, Avellaneda, Pcia de Buenos Aires. Todas las muestras fueron analizadas por ELISA para Acs anti-HDV totales (Abbott). Luego de la extracción del RNA del HDV, una región nucleotídica que codifica una parte del antígeno delta fue amplificada mediante RT-nPCR. Asimismo, se realizó la extracción del DNA-HBV y se amplifico por PCR y n-PCR las regiones S y Precore/Core, respectivamente. Resultados: del total, 3 muestras (M13, M14 y M17) resultaron positivas por RT-n-PCR para el HDV. De ellas, la M17 resultó reactiva para Acs anti-HDV con una prevalencia del 5.3% (1/19). La misma presentaba marcadores de OBI, mientras que M13 y M14 exhibían reactividad para HBsAg y Acs anti-HBc. Además, en la M14 se amplificó la región S del HBV. Conclusiones: estos resultados nuevamente confirman infección por el HDV en casos de OBI y la circulación de dicho virus en nuestra población. Estos datos muestran la importancia de la realización adicional del diagnóstico molecular con el objeto de evitar un sub-diagnóstico y conocer la real prevalencia de esta infección. En base a estos hallazgos, se propone reevaluar el actual algoritmo diagnóstico del HDV internacionalmente vigente. 0063 PREVALENCIA DEL VIRUS DE HEPATITIS E Y COINFECCIONES VIRALES EN MUJERES EMBARAZADAS Y PACIENTES CON HEPATOGRAMA ALTERADO DEL HOSPITAL INTERZONAL SAN JUAN DE DIOS DE LA CIUDAD DE LA PLATA, ARGENTINA R Ercole1, C Crespi1, MM Biglione2, CM Delfino2 1 Hospital Interzonal Especializado de Agudos y Cronicos (HIEAyC) “San Juan de Dios” de La Plata, Argentina. 2 Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (INBIRS, UBA-CONICET), Argentina. Introducción: Según la Organización Mundial de la Salud cada año se registra 20 millones de casos de infección por el virus de hepatitis E (HEV) y las principales causas de los decesos se deben a hepatitis fulminantes y encefalopatía hepática. Se transmite principalmente por vía fecal-oral, transfusiones de sangre infectada o transmisión vertical por vía intrauterina, observándose una mayor prevalencia en países de Asia, África y Latinoamérica. La tasa de mortalidad es baja (0,5 al 4%) pero se incrementa al 30% en mujeres embarazadas por inducir en éstas, insuficiencia hepática aguda más fácilmente. Sin embargo, estudios serológicos indican que una parte considerable de individuos de países desarrollados también presentan anticuerpos (Acs) anti-HEV. En los últimos años, se ha diagnosticado infección crónica por el HEV en pacientes inmunosuprimidos por trasplante de órganos y en pacientes coinfectados con HIV-1 que presentan un estado avanzado de la inmunodeficiencia. En Argentina se reportaron prevalencias entre 0,15 50 Libro de resúmenes a 6,6% en pacientes pediátricos, donantes de sangre e individuos infectados con HIV-1. Objetivo: determinar la prevalencia de infección por HEV y evaluar la presencia de otras coinfecciones virales en una población hospitalaria de la ciudad de La Plata, Buenos Aires. Metodología: se analizaron un total de 89 muestras de plasma del Hospital Interzonal Especializado de Agudos y Crónicos “San Juan de Dios” de la ciudad de La Plata, Argentina (HIEAyC): 82 de mujeres embarazadas (ME) que concurrieron para realizarse estudios de rutina y 7 de pacientes con hepatograma alterado (PHA; 5 internados y 2 ambulatorios). Para el diagnóstico se utilizaron dos kits de Elisa comerciales de Diapro Diagnostic (uno para detectar IgM, y otro IgG+M). Se evaluó la presencia de coinfecciones por ensayos comerciales (Abott, Architect) para los virus de hepatitis A (HAV), B (HBV), C (HCV), D (HDV) y HIV. Resultados: del total, 3 casos presentaron Acs anti-HEV IgM con una prevalencia para la infección aguda del 3.4%, 2 (2.4%) eran ME y 1 (14.3%) PHA. Por otro lado, 4 casos resultaron reactivos para Acs anti-HEV IgG con una prevalencia final del 4.5%, 2 (28.6%) fueron ME y 2 (2.4%) PHA. Una de ellas fue reactiva para ambos ensayos. Todas las muestras Acs anti-HEV reactivas (n=6) estaban coinfectadas, 5 HAV, 1 HBV y 1 HIV. En cuanto a las muestras no reactivas (n=83), 65 tenían HAV, 2 HBV, 1 HCV y 1 HIV. Conclusiones: En este estudio se demuestra por primera vez, la circulación de HEV en una población de mujeres embarazadas de Argentina y en pacientes diagnosticados para otras infecciones virales con una alta prevalencia de confección HEV-HAV. Estos datos plantean la necesidad de sospechar la infección de HEV y realizar el diagnóstico en individuos infectados por HAV y poblaciones sanas con factores de riesgo para esta infección. 0070 PROPUESTA DE DETECCIÓN COMBINADA DE PICOBIRNAVIRUS, ENTEROVIRUS Y POLIOMAVIRUS JC COMO INDICADORES DE CONTAMINACIÓN VIRAL DE AGUAS SUPERFICIALES. ESTUDIO DE CASO: EMBALSE SAN ROQUE, PROVINCIA DE CÓRDOBA G Masachessi*, CA Mateos*, LJ Ferreyra, MO Giordano, LC Martinez, V Prez, PA Barril, V Ré, JV Pavan, SV Nates Instituto de Virología Dr. J.M. Vanella, Facultad de Ciencia Médicas, Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba Argentina, Argentina. *Ambos autores aportaron de igual manera al trabajo El vertido de aguas residuales sin tratamiento previo o ineficientemente tratadas, es la principal fuente de contaminación fecal de recursos hídricos. Como consecuencia, el agua superficial recibe grandes concentraciones de virus entéricos, constituyendose en fuente potencial de transmisión de virus a población expuesta. Las normas vigentes de calidad microbiológica de aguas se basan en la medición de indicadores bacterianos de contaminación fecal (coliformes fecales, enterococos y E. coli), pero su medición puede no correlacionarse con la presencia y carga viral. Por este motivo se hace necesario el diseño de una estrategia que permita predecir y reducir el riesgo de infección viral asociado con la contaminación fecal de las aguas superficiales. Objetivo: Diseñar una estrategia para identificar contaminación viral y origen de especie de fuente de contaminación en aguas superficiales, tomando como caso de estudio al Embalse San Roque de la Provincia de Córdoba. MyM: Muestreo piloto de aguas (n = 16); período Noviembre 2011Septiembre 2012 en dos puntos centrales representativos del Dique San Roque, Centro (C) y Toma (T). Se determinó la carga de coliformes fecales, enterococos y E. coli. Posteriormente las muestras fueron concentradas y analizadas para detectar enterovirus viable (EV) mediante inoculación en células Hep-2 e inmunofluorescencia (indicador de viabilidad viral); RT-PCR para la detección de genoma de picobirnavirus (PBV) (posible indicador de contaminación fecal); y RTPCR/PCR para la detección de genoma de Astrovirus humano (HAstV) y virus JC (JCV) (posibles indicadores de fuente origen de contaminación humana). Resultados: La frecuencia de EV, PBV, HAstV y JCV en el total de muestras (n=16), fue del 68,75%, 62,5%, 56,25% y 56,25% respectivamente, detectandose siempre uno o más de los virus estudiados en ambos puntos de muestreo. El análisis mensual de detección viral (C+T) mostró la presencia de PBV, EV y JCV en el 100% de los meses y HAstV en el 75%, con tendencia estacional en meses fríos. Se detectaron cargas bacterianas dentro de los niveles guía en el 93,75% de las muestras (n=16); de estos el 100% resultó positivo para la detección de virus. Se determinó una excelente correlación (r=0,96) de cargas bacteriana entre los tres indicadores legislados. Conclusión: Se propone para el monitoreo viral de aguas del San Roque a la detección combinada de PBV, EV y JCV (virus independientes de fluctuaciones estacionales), en ambos puntos de muestreo, en muestras con calidad bacteriológica dentro de los valores guias, seleccionando para determinar carga bacteriana indistintamente a uno de los indicadores legislados. Esto informa sobre presencia de virus, viabilidad viral y participación de fuente humana en la contaminación viral. La estrategia deberá ser validada en otros cuerpos de agua a los fines de proponer los virus detectados como indicadores de polución viral de aguas recreacionales. 0075 ANALISIS CUANTITATIVO DE RIESGO DE INFECCIÓN POR ROTAVIRUS EN AGUAS SUPERFICIALES DE LA PROVINCIA DE CÓRDOBA VE Prez, PR Cuadrado, PI Gil, MO Giordano, LC Martinez, G Masachessi, CA Mateos, VE Ré, JV Paván, SV Nates, PA Barril Instituto de Virología Dr. JM Vanella - Laboratorio de Gastroenteritis Virales y Sarampión - FCM - UNC, Argentina. La contaminación fecal de aguas superficiales es un problema que impacta directamente en la salud humana, a través de la transmisión hídrica de microorganismos entéricos patógenos a población expuesta. El objetivo del presente estudio fue 1) Evaluar el nivel de contaminación viral de los Ríos Suquía, Xanaes y un punto central del Embalse San Roque de la provincia de Córdoba, mediante la detección de enterovirus viable (EV) y genoma de rotavirus (RV) y 2) Estimar el riesgo de infección por RV por contacto con estas aguas. Es de destacar, que las aguas en estudio son utilizadas por la población local con fines recreacionales y de riego. Se realizó un muestreo anual en ambos ríos y en un punto central del Embalse, se determinó la presencia de coliformes fecales y totales; y posteriormente las muestras fueron concentradas y analizadas mediante: i) inoculación en células Hep-2 e inmunofluorescencia para la identificación de EV viable ii) RT-nestedPCR y qPCR para la detección y cuantificación de RV y iii) análisis cuantitativo de riesgo microbiológico para estimar el riesgo de infección por RV. La contaminación fecal del Suquía fue considerable, detectándose cargas de bacterias coliformes que exceden los límites establecidos para calidad microbiológica de aguas recreacionales en todo su recorrido; por el contrario el Xanaes exhibió generalmente cargas de coliformes con valores aceptables y el Embalse siempre bajo los niveles guía. Se detectó EV viable en una frecuencia del 78.6% en el Suquía, 82% en el Embalse y 87.5% en el Xanaes. A su vez, genoma de RV fue detectado en todo el Río Suquía y Embalse San Roque en concentraciones que variaron en un rango de 1.9x103-8.6x106 cg/L (media 5.7x105 cg/L); en el Río Xanaes solo se detectó en un 18.7%, en concentraciones de 0-3x106 cg/L (media 8.5 cg/L). Concentraciones significativamente más altas de RV fueron detectadas en el Xanaes durante la estación húmeda (primavera-verano), a diferencia del Suquía y el Embalse que no revelaron variaciones estacionales significativas. Se determinó un riesgo de infección con RV alto (>0.91) tanto en puntos de muestreo con cargas bacterianas elevadas como en aquellos con concentraciones aceptables. Los resultados obtenidos muestran que la detección de virus es un evento frecuente en aguas superficiales de Córdoba, sugiriendo que la población expuesta a estas aguas está en riesgo de infección por virus entéricos. La presencia viral en las aguas superficiales no se refleja en los niveles de bacterias indicadoras, por lo tanto el monitoreo viral debería ser incluido en la determinación de la calidad microbiológica de las aguas. Según nuestros conocimientos estos son los primeros resultados de análisis de riesgo y viabilidad viral en aguas recreacionales y de riego en Argentina. Los hallazgos de este estudio serían el primer aporte para Argentina para implementar políticas públicas dirigidas a mejorar las condiciones sanitarias en el área urbana. 51 Libro de resúmenes 0078 CIRCULACION DE LOS VIRUS PARAINFLUENZA HUMANOS DURANTE EL PERIODO 2011-2014 MV Cabassi, MJ Palau, AS Fallesen, A Vera, C Vescina Sala de Microbiología. HIAEP “Sor María Ludovica”, Argentina. INTRODUCCION: Los virus parainfluenza humanos (VPIh) se dividen genética y antigénicamente en 4 tipos. Los tipos 1 al 3 son agentes causales de infección respiratoria en niños. OBJETIVOS: Establecer la importancia de los VPIh como agentes causales de infección respiratoria viral, describir su variación según semanas epidemiológicas (SE) y la distribución por grupo de edad en pacientes internados en la institución durante el período 2011-2014. METODOLOGIA: Se procesaron 10023 muestras respiratorias de pacientes pediátricos internados, entre enero de 2011 y diciembre de 2014. En todas ellas, se realizó coloración de Inmunofluorescencia Directa para VPIh-1, VPIh-2 y VPIh-3 y otros virus respiratorios (Virus Sincicial Respiratorio, Influenza A y B, Adenovirus y Metapneumovirus). RESULTADOS: De las 10023 muestras procesadas 3285 resultaron positivas para al menos uno de los virus estudiados. El VPIh-1, VPIh-2 y VPIh-3 representaron el 1,6%, 0,5% y 7,3% respectivamente. Tabla 1: Características de la circulación de VPIh en el período 20112014 Positivos en menores de 1 año Pico de Circulación hallado 10 8 (80%) SE 43 13 8 (61,5%) - 2013 2 1 - 2014 28 9 (32%) SE 12 a 14 2011 11 6 (54%) - 2012 5 4 (80%) - 2013 - - - 2014 1 - - 2011 104 78 (75%) SE 32 a 49 2012 76 52 (68%) SE 37 a 52 2013 60 45 (75%) SE 20 a 32 2014 108 79 (73%) SE 38 a 47 Virus Estudiado Año Total de positivos VPIh-1 2011 2012 VPIh-2 VPIh-3 CONCLUSIONES: Los VPIh representaron un porcentaje considerable de las infecciones respiratorias virales en el período analizado. Entre ellos, el VPIh-3 fue el detectado con mayor frecuencia. Tal como se reporta en la literatura, el mayor número de infecciones por VPIh-3 ocurrió en los menores de un año. El patrón estacional encontrado también coincide con el descripto, presentando el pico de circulación durante la primavera. En el año 2013 ocurrió un corrimiento del pico de circulación hacia el período invernal. La baja circulación de VPIh-1 y 2 durante los años estudiados no permitió establecer un patrón estacional y etario claro. 0083 EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE HTLV-1 EN INDIVIDUOS INFECTADOS CON DIFERENTES MANIFESTACIONES CLÍNICAS M Pineda1, A Mangano1, MB Bouzas2, M Remesar3, P Aulicino1, L Mammana2, L Sen1, M Golemba1 1 1Lab. de Biología Celular y Retrovirus- CONICET, Hospital Garrahan, Buenos Aires, Argentina. 2 Unidad de Virología, Hospital Muñiz, Buenos Aires, Argentina. 3 Servicio de Hemoterapia, Hospital Garrahan, Buenos Aires, Argentina. El HTLV-1 es el agente etiológico de la leucemia/linfoma de células T del adulto (ATLL) y de la paraparesia espástica tropical (TSP). El mismo se clasifica en 7 subtipos (a-g) siendo el más prevalente el Cosmopolita (a) el cual se subdivide en 5 subgrupos: Transcontinental (A), Japonés (B), África Occidental (C), Norte de África (D) y Perú (E). En el subgrupo A se han descripto diferentes clados entre ellos el clado Latinoamericano α y β, y el clado sudafricano A. El objetivo de este trabajo fue estudiar la situación epidemiológica molecular de HTLV-1 en residentes de Argentina y establecer su relación con las características clínicas de los mismos. Se analizaron 23 muestras de pacientes infectados con HTLV-1. Las características clínicas de los pacientes y su procedencia fueron: 18 asintomáticos [10 procedentes de Argentina (6 Bs As, 2 Jujuy, 1 Tucumán y 1 sin dato), 2 de Bolivia, 2 de Paraguay, 4 Perú], y 4 sintomáticos procedentes de Bs As) de los cuales 3 tenían ATLL y 1 TSP. El análisis filogenético se realizó por Maximum Likelihood a partir de un fragmento de 672 bp del LTR. A partir del árbol filogenético se observó que todas las muestras pertenecían al subtipo Cosmopolita (a): 1 agrupaba en el subgrupo japonés (B) -perteneciente a un individuo de Bs As-, y 22 en el subgrupo Transcontinental (A). De ellas, 1 agrupó en el clado Latinoamericano α que correspondía a un individuo de Bolivia; 15 agruparon en el clado Latinoamericano β procedentes de distintas regiones geográficas (9 Argentina, 2 Perú, 2 Paraguay, 1 Bolivia), 3 pertenecían al clado sudafricano A (1 Perú y 2 Bs As) y 3 muestras no agruparon en ningún clado previamente descripto (1 Jujuy, 1 Bs As y 1 Perú). De los 4 pacientes con síntomas: los 3 casos de ATLL pertenecían al subtipo aA: 2 del clado Latinoamericano β y uno sin agrupamiento. El paciente con TSP pertenecía al suptipo aA clado sudafricano A y su madre también pertenecía a este clado aunque no presentó síntomas. En conclusión: la mayoría de las cepas de HTLV-1 pertenecieron al subtipo aA, el mayor contribuyente a la circulación del virus en países de América del Sur. En un sólo caso fue subtipo HTLV-1aB a pesar de que no tenía vínculos epidemiológicos con Japoneses. Aunque la clasificación filogenética del HTLV-1 se ha asociado con el origen geográfico de los individuos infectados, en nuestro estudio encontramos una alta frecuencia de cepas procedentes de Argentina y Perú (26%) no vinculadas al clado Latinoamericano. Su introducción y circulación en América del Sur podría ser un fenómeno reciente. No se halló ninguna relación entre los análisis filogenéticos y las características clínicas de los pacientes. 0099 ANALISIS DE VARIANTES DE HPV-16 Y BACKGROUND GENÉTICO DEL HOSPEDADOR EN EL DESARROLLO DE LESIONES DE CUELLO DE ÚTERO EN LA PROVINCIA DE MISIONES DJ Sanabria1, ME Totaro1, TG Schurr2, DJ Liotta1, RH Campos3, I Badano1 1 Laboratorio de Biología Molecular Aplicada. Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales. Universidad Nacional de Misiones, Argentina. 2 Department of Anthropology, University of Pennsylvania., Estados Unidos. 3 Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Los Virus Papiloma Humano tipo-16 (HPV16) pueden ser clasificados en variantes genéticas denominadas: Africanas (Af), Europeas (E), Asiáticas (As) y Asiático-Americanas (AA). Estas variantes habrían surgido por mutación durante el establecimiento de los principales grupos étnicos humanos, con una datación molecular estimada de aprox 119000 años (Af) y 20000 años (AA). En este contexto, algunos autores han propuesto que las infecciones por HPV16 podrían tener un desenlace diferente en el desarrollo de lesiones de cuello de útero según el background genético de su hospedador. Esta situación podría ser importante en poblaciones multiétnicas de Argentina, donde la distribución geográfica ancestral de variantes AA ha sido afectada por la colonización española (Siglo XV), el tráfico de esclavos, y la inmigración de europeos, no españoles, de fines del S.XIX y principios del XX. El objetivo de este trabajo fue evaluar la existencia de asociación entre el origen geográfico de la variante, el linaje mitocondrial de la paciente (ADNmt Amerindio, Europeo o Africano) y el desarrollo de lesiones de cuello uterino en una muestra de mujeres de la Provincia de Misiones. Métodos: Se analizaron 48 muestras de ADN positivas para la infección por HPV16 de mujeres no-aborígenes residentes de Posadas, Misiones. Las variantes virales fueron determinadas por secuenciación de 364pb de la LCR viral y el background genético humano mediante secuenciación de 575pb de la HVS-1 del ADNmt. Para el análisis estadístico de asociación los resultados se dicotomizaron como (i) Presencia/Ausencia de lesión de cuello uterino (≥L-SIL) y, (ii) origen 52 Libro de resúmenes virus-hospedador coincidente (AA-Am o EE-E o Af-Af) /no coincidente (AA-E; AA-Af; EE–Af). Para el cálculo de Odds Ratio, se definió como categoría de referencia la ausencia de lesiones y el origen virus/hospedador coincidente. Resultados: El análisis de ADNmt indicó un 50% de componente Amerindio, 42% Europeo y 8% Africano en la muestra. Por otra parte, el análisis de variantes de HPV16 indicó un 96% de linajes Europeos y 4% Asiático-Americanos. Al combinar ambos marcadores, los orígenes del virus-hospedador no fueron coincidentes en el 58,3% (28/48) de las muestras, sin embargo no se encontraron diferencias significativas entre esta variable y el desarrollo de lesiones (OR=1,1; IC95% 0,3 – 4,9). Conclusión: El perfil genético de la población mostró un patrón trihíbrido con un componente principal Amerindio y una fuerte irrupción europea viral. No se encontró relación entre el origen geográfico de las variantes, el ADNmt de la paciente y el desarrollo de lesiones de cuello uterino. A pesar de nuestro pequeño n, estos resultados coinciden con otros reportados para Costa Rica, Brasil y Colombia, contribuyendo al conocimiento de los patrones de dispersión viral en esta población. Financiamiento: Fundación Florencio Fiorini para investigaciones Biomédicas (2011). CEDIT, Gob de Misiones (2011). ANPCyT, PICTOUNaM 2011-106, PICT-2012-0761. CONICET. 0105 LOS VIRUS PAPILOMA HUMANO CUTÁNEOS (HPVC) SON MUY FRECUENTES EN LA PIEL SANA DE INDIVIDUOS INMUNOCOMPETENTES. RM Correa1, M Coringrato2, MC Colucci1, L Olivares2, S Vladimirsky1, LV Alonio1, MA Picconi1 1 Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS "Dr. Malbrán"., Argentina. 2 Hospital de Infecciosas " Dr. F. Muñiz"., Argentina. El cáncer cutáneo no melanoma (CCNM) es el segundo cáncer más frecuente en población caucásica. Su etiología se vincula con la exposición solar, aunque también se ha postulado a la infección con ciertos tipos de virus papiloma humano cutáneos (HPVc) como un cofactor. Los HPVc muestran gran heterogeneidad, distribuyéndose en todos los géneros descriptos (alfa, beta, gama, mu y nu). El objetivo fue conocer la frecuencia de la infección por HPVc en piel sana de individuos inmunocompetentes e identificar los genotipos virales presentes. Se analizaron 209 muestras de hisopados tomados de la piel sana de la frente, de individuos que concurrieron a los servicios de Dermatología de los hospitales Muñiz y Argerich y de personal del Instituto Malbrán que se ofreció voluntariamente. Para cada participante, se completó una ficha epidemiológica con datos sobre edad, sexo, exposición solar, tipo de piel y se les solicitó la firma del consentimiento informado. La integridad del ADN se verificó por PCR para el gen de la β -globina humana. La detección y tipificación viral se realizó por dos PCR genéricas combinadas con hibridación reversa (PCR-RLB) con oligosondas tipo-específicas que permitieron identificar 35 tipos de HPVc: 5 tipos del género alfa (HPV 2,3,7,10 y 27); 25 tipos del género beta (HPV 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 36, 37, 38, 47, 49, 75, 76, 80, 92, 93 y 96) y 5 tipos del género gama (HPV 4, 48, 50, 60 y 65). El 82,8 % (173/209) de las muestras resultó apta para el estudio, siendo el DNA de HPV detectado en 86,1 % (149/173); en ellas pudo identificarse al menos un tipo viral del género alfa en 15,4% (23/149), del género beta en 91,3% (136/149) y del género gama en 13,4% (20/149). Los genotipos más frecuentemente encontrados, en orden decreciente, fueron los HPVs 20, 12, 23, 5, 8, 17, 14, 24, 9 y 15. Hubo un 75,2 % (112/149) de muestras portadoras de infecciones múltiples (con dos, tres, cuatro o más genotipos). Los datos obtenidos confirman que la piel sana de la mayoría de los individuos inmunocompetentes está infectada con al menos un tipo de HPVc. El hecho de detectar predominio de los tipos virales del género beta, al igual que se encuentra en los CCNM, reafirma que el potencial oncogénico de estos virus estaría restringido a un rol de co-factor, siendo el estado inmune del hospedador y la exposición solar, los principales factores determinantes. ( Trabajo subsidiado por la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, PICTO 0158) 0114 ANÁLISIS DE 2 GENOMAS COMPLETOS DEL HBV DEL GENOTIPO E AISLADOS DE PACIENTES CON Y SIN INMUNIZACIÓN ACTIVA. N Eguibar1, P Perazzo1, C Lezama2, K Fuat3, EA Gentile1, AI Castillo1, C Delfino1, VL Mathet1, ML Cuestas1, JR Oubiña1 1 Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica (IMPAM; UBA-CONICET), Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, Argentina., Argentina. 2 Unidad 4 de Hepatología, Hospital de Niños “Ricardo Gutiérrez”, Buenos Aires, Argentina., Argentina. 3 Department of Clinical Molecular Informative Medicine, Nagoya City University Graduate School of Medical Sciences, Kawasumi, Nagoya, Japan, Japón. En nuestro laboratorio, se documentó por 1ra. vez la circulación en Argentina de 2 cepas del HBV del genotipo E provenientes de 2 pacientes pediátricas hermanastras (M, inmunizada contra la hepatitis B al nacer, y K, sin inmunización específica previa), ambas cursando una hepatitis crónica y sin tratamiento antiviral. El objetivo de este trabajo fue analizar el genoma completo de dichos aislamientos mediante la secuenciación nucleotídica de amplicones obtenidos por PCR. Se observaron las 4 características genéticas comunes a todas las cepas del genotipo E actualmente depositadas en el GenBank: a) una deleción de 3 nucleótidos en la región 5´de del dominio pre-S1 de la proteína L HBsAg; b) el motivo LSWTVPLEW entre los residuos 3-11 de dicho dominio; c) el subtipo serológico ayw4; y d) la sustitución A3095G que genera la introducción adicional de un codón de iniciación de la traducción (M83) en el dominio pre-S1, dentro de la región (solapada) D del promotor de pre-S2. Entre los aislamientos del genotipo E, dicha región, se encuentra habitualmente flanqueada por una secuencia de Kozak 5´GGCATGC3´ que regula la eficiencia del inicio de la traducción, al contener G en la posición -3 y C en la posición +4. Sin embargo, se observó que los genomas de los aislamientos M y K poseen una G en la posición -3 pero una A en +4, lo cual podría afectar la traducción de la proteína M HBsAg. Ambas muestras (M y K) exhibieron dentro de la proteína L HBsAg las sustituciones Y195S y A264D, detectándose sólo en M la mutación Q177H. Se detectó la mutación R152I en el Core del aislamiento M. En la proteína X de los aislamientos M y K del HBV, se evidenció la sustitución W87R. Con respecto a la Polimerasa viral sólo se observó la sustitución rtY221F en ambas muestras, asociada a la resistencia al adefovir. En la proteína S del HBV se evidenciaron las sustituciones T57I, S59N, L209V y R215L (epítope para LTCD4+) en ambas muestras. En la muestra M se detectó mediante clonado molecular, la cocirculación de las variantes G145 y G145R (mutante de escape a los anticuerpos neutralizantes anti-HBs más frecuentemente documentada a nivel mundial) mientras que en K se observó la presencia de una población viral mixta con fenotipos D144 y D144A (otra mutante de escape). Dado que el genotipo E es el que presenta el determinante “a” más divergente entre todos los descriptos, sería relevante estudiar la eficacia de las vacunas contra el HBV actualmente comercializadas (preparadas en occidente con HBsAg del genotipo A, subtipo adw) para proteger frente a la infección con genotipo E. Esta característica, junto a la emergencia de mutantes de escape S, ha promovido la reciente evaluación de dicha vacuna contra el HBV en países donde dicho genotipo prevalece. Por lo expuesto, la caracterización del genoma completo de los 2 aislamientos del genotipo E del HBV en Argentina tiene importantes implicancias en la patogénesis, la epidemiología y la profilaxis contra la hepatitis B. 0117 ESTUDIO PILOTO DE VIGILANCIA AMBIENTAL DE POLIOVIRUS COMO PARTE DE LA VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA DE LAS PARALISIS FLACIDAS AGUDAS EN VENEZUELA. M Saavedra1, D Tsortouktzidis1, W Betancourt2 1 Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel", Venezuela. 2 Instituto Venezolano de Investigaciones Cientificas, Venezuela. En Venezuela se aplica la vacuna oral de polio (VOP) en los programas de inmunización rutinaria. En los últimos años se han observado brotes epidémicos de poliomielitis causados por poliovirus derivados de la vacuna (PVDV). Estas cepas han revertido a la forma neurovirulenta por mutaciones genómicas que ocurren tras la replicación prolongada del virus en pacientes con inmunodeficiencias primarias. Estos casos 53 Libro de resúmenes representan una amenaza en la erradicación de la poliomielitis. El Instituto Nacional Higiene “Rafael Rangel” es el encargado de realizar la vigilancia epidemiológica de las parálisis flácidas agudas (PFA) en Venezuela, notificando para el año 2014, 70 casos de PFA asociados con Enterovirus No Polio con una tasa de positividad del 6%, sin evidencia de circulación de poliovirus. En función de fortalecer la vigilancia de la PFA en Venezuela se realizó el primer estudio de vigilancia ambiental de poliovirus en colaboración con el Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas. Objetivo: Implementar la vigilancia ambiental de poliovirus para el fortalecimiento de la vigilancia epidemiológica de las parálisis flácidas agudas en Venezuela, en apoyo a la vigilancia global de poliovirus. Metodología: Durante tres meses continuos se captaron muestras de aguas en colectores marginales, quebradas impactadas con descargas municipales y un rio canalizado (Rio Guaire) que recibe 11000 L/s de aguas residuales no tratadas del área metropolitana de Caracas. Para la concentración de los virus se utilizó filtración con membranas electronegativas seguido por ultrafiltración rápida (Centriprep®). El concentrado se inoculó en células de Rabdomiosarcoma humano (RD) y células L recombinantes de ratón que expresan el receptor para poliovirus (L20B). La identificación de poliovirus y la diferenciación intratipica se llevó a cabo por métodos de amplificación molecular en tiempo real (rRT-PCR) desarrollados por los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades Infecciosas (CDC, Atlanta, EEUU). Estos ensayos forman parte del algoritmo estándar de la OMS en la Red de Laboratorios Global de Polio. Resultados: Se identificaron cepas de origen vacunal en 9 muestras que correspondieron a 5 poliovirus Sabin, 3 poliovirus Sabin-Discordantes (PVDV) y una mezcla de Sabin con Sabin- Discordante (PVDV). Asimismo, se detectó en 6 muestras enterovirus no polio, mientras que el virus polio salvaje no se detectó en ninguna de las muestras. Conclusiones: Se confirma la ausencia de poliovirus salvajes en el área y tiempo estudiado. La vigilancia ambiental es una herramienta sensible para investigar la circulación de poliovirus en Venezuela, asimismo suministra una medida indirecta de la cobertura de vacunación en el país. Estrategias adicionales de caracterización de los aislamientos ambientales de poliovirus por secuenciación genómica permitirían consolidar la vigilancia ambiental y epidemiológica de poliovirus, fortaleciendo de esta manera la vigilancia de PFA en el país. 0119 PREVALENCIA Y CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA DEL HERPESVIRUS HUMANO TIPO 8 (HHV-8) EN ARGENTINA: ASOCIACIÓN CON LA ANCESTRALIDAD DE LA POBLACIÓN ML Hulaniuk1, H García Rivello2, E Mocetti2, V Volonteri2, D Kohan3, B Elsner3, E Frangi4, S Bartoli5, L Fortuny6, L Burgos Pratx6, A Frías7, O Torres7, F Nuñez6, D Corach8, M Caputo8, J Trinks9 1 Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental (ICBME), Hospital Italiano de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina. 2 Servicio de Anatomía Patológica, Hospital Italiano de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina. 3 Centro Privado de Patología, Buenos Aires, Argentina. 4 Servicio de Laboratorio Central, Hospital Italiano de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina. 5 Servicio de Medicina Transfusional, Hospital “Pablo Soria”, San Salvador de Jujuy, Jujuy, Argentina. 6 Servicio de Medicina Transfusional, Hospital Italiano de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina. 7 Servicio de Medicina Transfusional, Hospital Materno Infantil “Ramón Sardá”, Buenos Aires, Argentina. 8 Servicio de Huellas Digitales Genéticas (SHDG), Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Buenos Aires, Argentina. 9 Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental (ICBME), Hospital Italiano de Buenos Aires, Buenos Aires; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Buenos Aires, Argentina. El HHV-8 ha sido postulado como un marcador de migraciones humanas ancestrales. Su prevalencia varía a nivel mundial con una distribución geográfica y étnica caracterizada por 6 subtipos virales (AF) y valores de seroprevalencia elevados en poblaciones africanas y nativo americanas. Sin embargo, es escasa la información respecto a su epidemiología molecular así como a la relación que posee con la composición étnica diversa de la población argentina. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue estudiar la prevalencia y la caracterización genotípica del HHV-8 en Argentina determinando posibles asociaciones con la ancestralidad de la población. La prevalencia del HHV-8 se estableció mediante amplificación parcial del ORF-26 en 667 muestras de ADN de donantes de sangre: argentinos (Buenos Aires=200 y noroeste [NOA]=106) e inmigrantes (bolivianos=187, paraguayos=98 y peruanos=76). En 319 muestras elegidas al azar, se analizaron los haplogrupos de los linajes maternos y paternos (ADNmt e Y-SNPs) para la determinación de la composición étnica. Por otro lado, se recolectaron 22 muestras de ADN extraídas de pacientes con enfermedades atribuibles al HHV-8 para la caracterización genotípica viral mediante análisis filogenético del ORFK1. Luego, se determinó la composición étnica de los linajes maternos y paternos. El análisis estadístico se realizó por test de Fisher y Chicuadrado. La prevalencia del HHV-8 fue mayor en el NOA (24,5%) en comparación con Paraguay (7,1%), Perú (6,6%), Buenos Aires (3,5%) y Bolivia (3,2%) (p<0,001); detectándose una mayor frecuencia en los individuos del NOA mayores de 30 años al comparar con los otros grupos (p<0,04). Asimismo, se detectó un mayor riesgo de infección en Buenos Aires entre los menores de 30 años (p<0,05) y un posible riesgo aumentado en los bolivianos de sexo masculino (p=0,05). Se observaron diferencias significativas en la composición étnica de las poblaciones estudiadas. La prevalencia de haplogrupos maternos y paternos nativo americanos fue menor en Buenos Aires en comparación con los otros grupos (p<0,01). Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas al analizar la relación entre la prevalencia del HHV-8 y la ancestralidad de la población. El ORF-K1 pudo ser amplificado en 59,1% (13/22) de las muestras de los pacientes, detectándose los subtipos europeos A (53,8%) y C (46,2%). El análisis de la ancestralidad reveló que sólo 18,2% de las muestras presentaron haplogrupos maternos y paternos nativo americanos. En conclusión, éste es el primer estudio en reportar una prevalencia elevada del HHV-8 en donantes de sangre del NOA. Si bien, la distribución heterogénea de la frecuencia del genoma viral en poblaciones sudamericanas no estaría asociada a la ancestralidad de la población (quizás a ciertas conductas o factores de riesgo), los subtipos circulantes del HHV-8 detectados -hasta el momento-se correlacionarían con el origen y la composición étnica de la población residente en Argentina. 0133 CIRCULACIÓN ENDEMOEPIDÉMICA DE BOCAPARVOVIRUS PRIMATE 1 EN CÓRDOBA: ESTUDIO DE 7 AÑOS EN NIÑOS HOSPITALIZADOS CON INFECCIÓN RESPIRATORIA AGUDA BAJA Y MANIFESTACIOENS CLÍNICAS EN PACIENTES SIN COINFECCIÓN NI COMORBILIDADES. AL Marchesi1, NS Wasinger1, A Cardozo Tomás1, LM Ghietto1, L Eguizábal2 3, R Bracciaforte1, D Quiroga2, LB Moreno2 3, MP Adamo1 1 Instituto de Virología "Dr. J. M. Vanella", Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 2 Cátedra de Clínica Pediátrica, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 3 Hospital de Niños de la Santísima Trinidad de Córdoba, Argentina. El Bocaparvovirus primate 1 (Bocavirus humano, HBoV) es un virus respiratorio. Trabajos previos en Córdoba han registrado su presencia en pacientes con infección respiratoria aguda (IRA), con prevalencias variables entre 23% y 6%. Sin embargo, en la práctica médica no se realizan ensayos diagnósticos de rutina para identificar al HBoV debido a que no se conoce su significancia como responsable de enfermedad grave. A fin de aportar datos sobre la circulación local de HBoV, en este estudio descriptivo retrospectivo reportamos la frecuencia del virus en pacientes pediátricos internados con IRA baja durante 7 años consecutivos y analizamos las manifestaciones clínicas de pacientes previamente sanos con monoinfección por HBoV. Se incluyeron niños menores de 5 años de edad hospitalizados por IRA baja desde la semana epidemiológica 13 a la 36 (otoño-invierno) de cada año del período 2007-2013. Las muestras clínicas fueron secreciones respiratorias y se determinó la presencia de genoma viral por PCR. Se analizaron los datos demográficos y clínico-radiológicos de pacientes HBoV-positivos sin coinfección viral o bacteriana demostrada (diagnóstico hospitalario) ni comorbilidad previa. Del total de 1.605 pacientes estudiados, 239 resultaron HBoV-positivos (14,9%). Las 54 Libro de resúmenes prevalencias en cada semestre fueron: 13/81 (16%) en 2007, 9/33 (27,3%) en 2008, 59/223 (26,5%) en 2009, 26/125 (20,8%) en 2010, 12/215 (5,6%) en 2011, 42/322 (13%) en 2012, y 78/606 (12,9%) en 2013. La distribución de casos HBoV-positivos por año muestra una tendencia con dos picos de mayor magnitud, uno en el invierno de 2009 (semanas epidemiológicas 33-36) y otro hacia fin de otoño de 2013 (semanas 25-28). Entre los pacientes HBoV-positivos, 203 (84,9%) fueron menores de 1 año. Se analizó la presentación clínica de 34 pacientes monoinfectados por HBoV sin comorbilidades previas: la edad mediana fue 6 meses; en promedio estuvieron hospitalizados 6 días (rango: 1-25) y en 19 pacientes (56%) el evento de internación correspondió al primer episodio de IRA baja; 22 pacientes (65%) requirieron oxígeno pero sólo 2 (6%) asistencia respiratoria mecánica; 25 pacientes (74%) recibieron antibióticos y 13 (38%) otro tratamiento (sintomático o antiviral). Los síntomas más frecuentes fueron sibilancias (68%), fiebre (58%), tos (53%) y rinitis (29%). Los exámenes de radiografía de tórax mostraron infiltrado intersticial en 13/34 pacientes (38%), infiltrado intersticio-alveolar en 9 (26%), atrapamiento aéreo en 2 (6%) e infiltrado alveolar en 3 (9%), en tanto sólo 3 (9%) tuvieron imagen normal. Bronquiolitis fue el principal diagnóstico (21/34, 62%), seguido de neumonía (11/34, 32%). Ninguno falleció. Conclusiones: HBoV es un agente respiratorio frecuente en lactantes con enfermedad del tracto respiratorio bajo, con circulación tipo endemoepidémica. La infección en pacientes sin comorbilidad previa, se asocia con bronquiolitis y, en menor medida, neumonía, con buena evolución y sin complicaciones al alta. 0134 DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE POLIOMAVIRUS HUMANOS EN MUESTRAS DE AGUA Y EFLUENTES EN ARGENTINA M Barrios1, MD Blanco Fernández1, RV Cammarata1, DM Cisterna2 VA Mbayed1, C Torres1 1 Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. 2 Servicio de Neurovirosis, INEI-ANLIS "Dr. Carlos G. Malbrán", Argentina. Introducción En los últimos años, a los ya conocidos poliomavirus JC (JCPyV) y BK (BKPyV) se sumó la descripción de nuevos poliomavirus humanos, entre los que se encuentran el Merkel-Cell (MCPyV), Malawi (MWPyV) y poliomavirus humano 6 (H6PyV). Estos virus establecerían infecciones persistentes y presentarían manifestaciones clínicas en poblaciones específicas, como individuos con inmunosupresión. Objetivo Detectar y caracterizar poliomavirus humanos a partir de muestras de agua de río y efluentes cloacales provenientes de la Ciudad de Buenos Aires y del conurbano bonaerense. Materiales y métodos Se obtuvieron muestras de agua del Río Matanza–Riachuelo en los períodos 2005-2006 (n=25) y 2012 (n=20) y muestras de aguas cloacales colectadas a la entrada de plantas de tratamientos del área metropolitana y conurbano durante 2011 y 2013 (n=24). Las muestras de río se concentraron por adsorción-elusión en membranas con carga negativa y las muestras de efluentes cloacales, por ultracentrifugación. La detección se realizó con PCRs genéricas y específicas dirigidas hacia una región genética parcial que codifica para las proteínas VP2/VP1. La caracterización se realizó por secuenciación y análisis filogenético del gen que codifica para la proteína VP1. Resultados En el período 2005-2006, se detectó poliomavirus humanos en el 80,0 % de las muestras, la mayor detección se observó para MCPyV (52,0 %), seguido por BKPyV (40,0 %), JCPyV (20,0 %) y MWPyV (4,0 %). En el período 2012, la detección alcanzó el 85,0 % de las muestras de río, con presencia de JCPyV (85,0 %), BKPyV (75,0 %), MCPyV (25,0 %) y H6PyV (25,0 %). Por último, se detectó poliomavirus en el 91,7 % de las muestras de efluentes cloacales, con presencia de BKPyV (87,5 %), JCPyV (83,0 %), MCPyV (8,3 %) y H6PyV (4,2 %). La caracterización molecular indicó la coexistencia de distintos genotipos y variantes genéticas, sobre todo en efluentes cloacales. Para JCPyV, se observó la presencia de genotipo 2A, y minoritariamente, genotipo 3A. Los virus BKPyV caracterizados correspondieron a los subtipos Ib1, Ib2 y II. Las secuencias del virus MCPyV (únicas secuencias de Argentina) formaron un grupo monofilético y agruparon con la única secuencia de América del Sur disponible hasta el momento. Conclusiones La presencia de contaminación viral de origen humano en aguas superficiales despierta preocupación por su potencial rol como fuente de infecciones virales y enfatizaría la necesidad de establecer controles virológicos entre los estándares de calidad de aguas. Por otro lado, el alto nivel de detección y de diversidad de los poliomavirus hallados a partir de la vigilancia ambiental, que involucró incluso la caracterización de virus no descriptos previamente en Argentina o en América del Sur, refuerza la utilidad de esta estrategia para describir la epidemiología viral en población general, sobre todo de aquellos virus por cuyas infecciones no se consulta a un servicio asistencial de salud en forma rutinaria. 0136 RELEVANCIA DE LA MUESTRA DE AGUAS RESIDUALES EN ESTUDIOS EPIDEMIOLÓGICOS Y EVOLUTIVOS DEL ROTAVIRUS GRUPO A. M Mandile1, L Lewezuk1, M Argüelles1, D Cisterna2, G Glikmann1, A Castello1 1 Laboratorio de Inmunología y Virología, Universidad Nacional de Quilmes, Argentina. 2 Servicio de Neurovirosis, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, ANLIS Dr. Carlos G Malbran, Argentina. Los Rotavirus del grupo A (RVA) son el agente etiológico más importante de gastroenteritis en niños menores de dos años. Se estima que anualmente mueren ~450.000 niños menores a 5 años y es la principal causa de consulta médica e internación por diarrea aguda. Las tasas de infección por RVA no se relacionan con el nivel socioeconómico, afectando por igual a niños independientemente de su condición social. Sin embargo, el 90% de las muertes ocurren en regiones necesitadas. Se estima que debido a condiciones precarias de vivienda y difícil acceso a centros de salud. Desde el año 2006 se licenciaron en Argentina dos vacunas contra RVA, una monovalente (RV1), compuesta por una cepa atenuada G1P[8], y otra pentavalente (RV5), mezcla de reasociantes bovino-humana. Muchos países de Latinoamérica han introducido alguna de estas vacunas a sus calendarios de inmunización, siendo Argentina uno de los últimos en sumarse al incorporar RV1 a su calendario. Tanto en la era pre como en la postvacunal, es de suma importancia saber cuáles son las cepas circulantes de este virus. En nuestro laboratorio se lleva a cabo la vigilancia de genotipos de RVA desde hace casi 20 años. Estos estudios, apoyados por la caracterización por secuenciamiento, permiten obtener información útil sobre las cepas prevalentes, detectar cepas emergentes o reemergentes, la fluctuación de las mismas y las posibles modificaciones por la introducción vacunas. Estos estudios se han realizado utilizando muestras clínicas (MC) de hospitales de Gran Buenos Aires y Capital Federal, sin embargo desde hace algunos años se ha empezado a utilizar y evaluar muestras ambientales (MA) como herramienta de vigilancia. El objetivo de este trabajo es comparar genotipos y secuencias de RVA en MA y MC durante el período septiembre de 2010-Marzo de 2012 con el fin de contribuir a la validación de la MA como herramienta para la vigilancia epidemiológica. Se encontró que existe correlación de genotipos dominantes entre ambos muestras, siendo G2 el más abundante (40% en MA y 75% en MC). El análisis de secuencias sugiere identidad entre ambas lo cual avala el estudio de MA para la identificación y caracterización de las cepas de RVA relevantes de cada pico epidémico. Sin embargo se ha observado mayor diversidad de genotipos en MA lo cual sugiere que, además de detectarse las cepas dominantes responsables de las presentaciones clínicas, se detectan también cepas excretadas por individuos infectados en forma asintomática y casos leves que no concurren a centros de salud. Los resultados de este trabajo sugieren válida la utilización de MA como una herramienta práctica epidemiológica. Además, la posibilidad de identificar y caracterizar un rango más amplio de cepas excretadas genera un panorama más completo de los genes circulantes lo cual es muy útil en estudios evolutivos. Adicionalmente, la posibilidad de identificar cepas vacunales y sus derivados abre una vía para el estudio de la evolución de éstas en la población. 55 Libro de resúmenes 0138 GENOTIPOS DE VIRUS PAPILOMA HUMANO (VPH) CIRCULANTES EN MUESTRAS DE TAMIZAJE, EN EL MARCO DEL PROYECTO DE EVALUACIÓN DE LA MODALIDAD AUTOTOMA (EMA) EN LA PROVINCIA DE JUJUY. JV González1, G Lapiedra2, O Marin2, A Campanera3, R Laudi4, S Arrossi5, MA Picconi1 1 Servicio Virus Oncogénicos, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas-ANLIS “Dr. Malbrán”, CABA, Argentina. 2 Hospital Provincial “Pablo Soria”, S.S. de Jujuy, Argentina. 3 Ministerio de Salud de la Provincia de Jujuy, S.S. de Jujuy, Argentina. 4 Programa Nacional de Prevención del Cáncer Cérvico Uterino, Instituto Nacional del Cáncer, CABA., Argentina. 5 Centro de Estudios de Estado y Sociedad (CEDES, CONICET), CABA, Argentina. Introducción: El VPH es la infección de transmisión sexual más común, siendo la infección persistente por virus de alto riesgo la causa necesaria para el desarrollo del cáncer cervicouterino (CC). En 2011, el Programa Nacional de Prevención de Cáncer Cervicouterino (PNPCC) del Ministerio de Salud de la Nación, implementó en Jujuy la prueba de VPH por captura híbrida (VPH-CH2) como método de tamizaje primario para mujeres mayores de 30 años. Esta prueba detecta ADN de 13 tipos de VPH de alto riesgo oncogénico (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, y 68) en células del cuello uterino. Su efectividad para reducir la incidencia y mortalidad por CC ha sido comprobada científicamente, con una sensibilidad superior a la del PAP (alrededor del 90%). Una alternativa a la toma de muestra convencional realizada por un profesional, es la autotoma; en esta estrategia, es la propia mujer la que toma su muestra en su domicilio, preservando su intimidad y privacidad. En 2012, el PNPCC inició en Jujuy el estudio EMA para evaluar la autotoma para disminuir las barreras del acceso al tamizaje virológico y aumentar la cobertura. Objetivo: Determinar los genotipos de VPH circulantes en mujeres participantes del estudio EMA. Metodología: Se incluyó un subgrupo de 231 mujeres cuyas muestras de células cérvico-vaginales habían resultado positivas para VPH de alto riesgo por la prueba de CH2. El material remanente luego de haber realizado esta prueba, fue diluido y se usó directamente para la genotipificación viral. Esta se llevó a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) combinada con una posterior hibridación reversa que permite identificar 32 tipos de VPH, en un solo ensayo (validada según OMS). La aptitud de las muestras se evaluó mediante una PCR para el gen de HLA (control interno). Resultados: De las 231 muestras recibidas, 227 resultaron aptas para el estudio. La detección del VPH fue del 91,2%, correspondiendo el 41,6% a infecciones múltiples. Los tipos virales más frecuentemente detectados fueron: VPH16 (19,2%), VPH 39 (12,1%), VPH 31 (11,6%), VPH 51 (10,1%), VPH 52 y VPH 53 (8,7%)y VPH 18 (8,2%), siendo el porcentaje del resto de los tipos virales menor a 8%. Conclusión: El estudio brinda los primeros datos de circulación de genotipos de VPH en mujeres mayores de 30 años en la provincia de Jujuy, aprovechando muestras previamente procesadas para el tamizaje virológico. 0143 CIRCULACIÓN DE ROTAVIRUS GRUPO A EN CERDOS DE ARGENTINA CG Vega1, M Bok1, MF Jabif2, N Fermentini2, J Cappuccio1, M Dibárbora1, H Piscitelli3, N Aznar4, F Bessone3, A Wigdorovitz1, V Parreño1 1 Instituto de Virología, CICVyA, INTA, Argentina. 2 Vetanco S.A., Argentina. 3 EEA Marcos Juárez, INTA, Argentina. 4 Instituto de Patobiología, CICVyA, INTA, Argentina. En todo el mundo, la diarrea neonatal es endémica y constituye un importante problema sanitario de las explotaciones porcinas. En la cría intensiva, las diarreas neonatales resultan en pérdidas económicas directas e indirectas. Existen múltiples agentes infecciosos involucrados aunque lo más frecuente son las coinfecciones. Rotavirus es responsable de cuadros de diarrea en neonatos de múltiples especies animales. Este virus se ha detectado en todos los países donde existe producción porcina. Es ubicuo en el ambiente de las granjas y se considera una infección hiperendémica. En general, sólo afecta a lechones (<40 días). Rotavirus se clasifica en grupos, de los cuales el Grupo A (RVA) es el más importante epidemiológicamente. A su vez, este grupo se subclasifica en G y P genotipos según la variación genética de las proteínas VP7 (glicoproteína, G) y VP4 (proteasa sensible, P). En porcinos, los G tipos más frecuentes en el mundo son G3, G4, G5, G9 y G11 combinados con P[6], P[7], P[13] y P[19]. En estudios previos se ha reportado la circulación de los genotipos G5P[7], G4P[6], G8P[6] y G6P[1] en cerdos de Argentina. Existe una fuerte relación filogenética entre cepas de RVA circulantes en niños y cerdos. El objetivo del presente trabajo fue caracterizar las cepas de RVA circulantes porcinos de nuestro país durante un período de dos años. Se colectaron un total de 280 muestras de material fecal e hisopados rectales de lechones con y sin diarrea. Las mismas procedieron de 21 establecimientos (industriales y de cría familiar) ubicados en 8 provincias y se tomaron entre agosto de 2013 y diciembre de 2014. Las muestras fueron analizadas por ELISA para la detección de RVA, secuenciándose las positivas para determinar las cepas. Se detectó la presencia de RVA en 57% de los establecimientos analizados, con incidencias de entre 6% y 67%, en lechones con y sin sintomatología diarreica. Las muestras positivas correspondieron a granjas de Buenos Aires, Córdoba, Santa Fe, La Pampa y Neuquén. El análisis molecular de las mismas reveló la presencia del genotipo G5P[7] como el predominante. Este genotipo ha sido detectado previamente en nuestro país así como en muchas otras regiones del mundo y está incluido en las vacunas que se comercializan en otros países. Se observó la presencia del genotipo G4, típicamente americano, con fuerte asociación filogenética con cepas circulantes en niños de nuestro país lo que resalta la importancia de la vigilancia epidemiológica de este agente viral dado su potencial zoonótico. Por otro lado, se encontraron dos muestras independientes procedentes de Buenos Aires y de La Pampa genotipificadas como G3P[13], una de ellas perteneciente a una explotación familiar. El análisis filogenético de las cepas P[13] revela que se encuentran relacionadas con cepas de Canadá, Brasil y Australia. Esta combinación genotípica es rara y su hallazgo en este estudio constituyen el primer reporte de circulación de G3P[13] en cerdos de nuestro país. 0159 VIRUS HERPES ASOCIADO AL SARCOMA DE KAPOSI, GENOTIPOS BASADOS EN POLIMORFISMOS DEL ORF26 CL Pérez, MI Tous, MC Colucci, C Rovito Servicio Cultivo de Tejidos- Departamento Virología INEI-ANLIS Dr Carlos G Malbrán, Argentina. La secuencia de ADN más usada para detectar el virus herpes asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV) en muestras clínicas por PCR es ORF26, cuyo fragmento KS330 sirvió para identificar el virus en 1994. Esta PCR da resultados positivos en muestras de todas las formas clínicas de Sarcoma de Kaposi (SK): clásico (SKC), iatrogénico (SKI), asociado a SIDA (SKE) y afro-endémico-, linfoma primario de efusión (PEL) y enfermedad multicéntrica Castleman (EMC). Esta región contiene varios polimorfismos que agrupan en patrones distintivos conocidos como subtipos o genotipos correlacionados con la etnia y la geografía, y no con una enfermedad determinada. En un principio se asignaron genotipos en base al fragmento de 330pb evaluando 8 polimorfismos. La ampliación del análisis a todo el ORF26 (965pb) permite examinar 38 sitios según los cuales se describen los subtipos actuales: A/C, J y K, predominantes en Europa, Estados Unidos y Asia-, B, Q y R en África subsahariana y D, en Polinesia. Con el objetivo de detectar genotipos de KSHV y evaluar la utilización el fragmento generado en la PCR diagnóstica del virus, se estudiaron muestras clínicas de 22 pacientes de Argentina con EMC (n=1), PEL (n=1), SKC (n=5), SKI (n=2) y SKE (n=12) y un donante de órgano (DO). Se diseñaron primers que franquean 606pb del ORF26. Los amplicones se secuenciaron y alinearon con la cepa de referencia BCBL-R (subtipo A/C) y se compararon con cepas de todos los subtipos con el programa BioEdit. Resultados: en la tabla se detallan polimorfismos y subtipos en la población estudiada. Los puntos representan identidad con la cepa de referencia BCBL-R. 56 Libro de resúmenes Polimorfismos (24/606pb) 111111111 1 11111111111 Estado clínico 9 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 3 4 4 4 5 5 Subtipo (Nº de 389 3 3 4 4 5 8 8 9 0 2 3 3 5 0 9 9 1 6 9 1 2 (n total) pacientes) 5 1 4 236955643 2 29864712040 SKE(n=3) SKC(n=3) SKI(n=2) PEL(n=1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A/C (n=9) SKE(n=4) SKC(n=1) DO(n=1) . C . A . . . T . . . . G C . . . . . . . . . . J (n=6) SKE(n=1) . C . A . . . . . . . . G C . . . . . . . . . . B (n=1) SKE(n=1) . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . D (n=1) SKE(n=1) SKC(n=4) . C . . . . . . . T . . . C . . . . . . . T . . R ó K (n=5) Se observó predominancia de los subtipos euro-asiático A/C y J (n=9 y 6 respectivamente). El subtipo B (africano) encontrado era eperable porque hay reportes en países de la región (Brasil). El hallazgo del subtipo D (Polinesia), fue inesperado. Las cepas de los 3 pacientes con SKE y los 4 con SKC, podrían pertenecer al subtipo R o al K, ya que comparten los polimorfismos en las bases analizadas, para diferenciarlas se debe incluir la posición 1684 (CxA), que será nuestro próximo objetivo a estudiar. No se observó asociación entre genotipos y estado clínico. El fragmento utilizado fue útil para genotipificar el 88% de las cepas. 0163 PREVALENCIA DE LOS GENOTIPOS DE VIRUS PAPILOMA HUMANO (VPH) EN MUJERES ADOLESCENTES: UN PRIMER PASO HACIA LA VIGILANCIA DE LA INFECCIÓN EN LA ARGENTINA. JV Gonzalez1, JA Basiletti1, GD Deluca2, DJ Liotta3, AM Suarez4, N Katz5, A Giurgiovich6, C Vizzotti5, MA Picconi1 1 Servicio Virus Oncogénicos, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas-ANLIS “Dr. Malbrán”, CABA, Argentina. 2 Facultad de Medicina, Universidad Nacional del Nordeste, Argentina. 3 Laboratorio de Biología Molecular Aplicada, Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Misiones, Argentina. 4 Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumán, Argentina. 5 Dirección Nacional de Control de Enfermedades Inmunoprevenibles, Ministerio de Salud de la Nación., Argentina. 6 Hospital “Evita Pueblo”, Berazategui, Pcia. de Buenos Aires., Argentina. La infección persistente por VPH es causa necesaria para el desarrollo del cáncer cérvico-uterino. Alrededor de 40 tipos virales infectan las mucosas anogenitales; entre ellos los VPH de bajo riesgo los VPH 6, 11, 42, 43 y 44, entre otros, comúnmente presentes en las lesiones benignas con mínimo riesgo de progresión maligna; y VPH de alto riesgo los VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82, los cuales, pueden conducir a la transformación neoplásica. El Ministerio de Salud de la Nación, a través de la Dirección Nacional de Control de Enfermedades Inmunoprevenibles ha introducido en 2011 la vacuna contra los VPH tipos 16 y 18 en el Calendario Nacional de Vacunación, para niñas de 11 años. El Laboratorio Nacional de Referencia de VPH comenzó la vigilancia virológica para conocer el impacto de esta intervención, siendo las adolescentes el blanco más temprano para dicha evaluación. Objetivo: Determinar la prevalencia basal tipo-específica de VPH en adolescentes (15-16 años) sexualmente activas, no cubiertas por la Dirección Nacional de Vacunación contra VPH, concurrentes a seis hospitales públicos (3 de CABA, 1 de Berazategui, 1de Sgo. del Estero y 1 de Misiones). Metodologia: Durante el 2014 se realizaron talleres de entrenamiento con los centros participantes y se distribuyeron Manuales de Procedimiento a fin de unificar los criterios aplicados a cada una de las etapas. Se invitó a las adolescentes a participar en el estudio; luego de haber leído y firmado el consentimiento informado, se tomaron muestras de células cérvico-vaginales empleando cepillo y medio de transporte validado para este fin (STM, Qiagen). El ADN se purificó utilizando una plataforma robótica (QIAcube). La detección y tipificación de VPH se realizó mediante una reacción en cadena de la polimerasa combinada con una posterior hibridación reversa que permite identificar 36 tipos de VPH, en un solo ensayo (validada según OMS). Resultados: A Febrero de 2015, se recolectaron 550 muestras; en un subgrupo de 350 muestras, se completó la detección y tipificación de VPH. Casi la totalidad de las muestras (99,7%) fueron aptas para el estudio. Los resultados mostraron una prevalencia genérica de VPH de 55,4%, correspondiendo el 64,4% a infecciones múltiples. Los tipos virales más frecuentemente detectados fueron: VPH42 (23,7%), VPH16 (22,2%), VPH52 (16,0%), VPH51 (15,5%), VPH58 (14,9%), VPH 56 (13,4%), VPH53 (12,9%), VPH31 (11,9%), VPH 66 (10,3%), VPH6 y VPH39 (9.8%), VPH18 (9,3%), siendo el porcentaje del resto de los tipos virales menor a 8%. Conclusión: El estudio brinda los primeros datos sobre la prevalencia de los distintos tipos de VPH en las adolescentes de 15-16 años sexualmente activas, que no recibieron la vacuna, constituyendo la línea basal de prevalencia tipo-específica contra la cual comparar las mediciones post-vacunales. La alta prevalencia detectada se asocia con la edad de inicio de relaciones sexuales, principal vía de contacto con el virus. 0165 BROTE DE PAROTIDITIS POR GENOTIPO G EN ARGENTINA R Bonaventura, L Martínez, DM Cisterna, MC Freire Servicio de Neurovirosis, INEI- ANLIS "Carlos G. Malbrán", Argentina. La parotiditis es una enfermedad caracterizada por la tumefacción de las glándulas salivales especialmente las parótidas. El espectro de la enfermedad varía desde una infección subclínica a meningoencefalitis, sordera y orquitis, la severidad aumenta con la edad. El agente causal más frecuente es el virus de la fiebre urliana (virus de la parotiditis), el cual es un virus ARN, envuelto, de polaridad negativa y pertenece a la Flia. Paramixoviridade, sub-familia Paramixorivinae. Es una enfermedad prevenible mediante el uso de la vacuna triple viral que está incluída en el Calendario Nacional de Inmunizaciones desde 1998, existen tres cepas vacunales disponibles: Urabe, L-Zagreb y Jeryl Lynn. Por otra parte, están descriptos 13 genotipos denominados de A-N que se definen sobre la base del gen que codifica la proteína hidrófobica pequeña (SH) según las recomendaciones de la OMS (Boletín epidemiológico, Junio 2012). El objetivo de este estudio fue caracterizar un brote de parotiditis ocurrido entre junio de 2014 y febrero de 2015 que se hizo extensivo a todo el país. Se recibieron muestras de 13 provincias de 211 pacientes saliva(n=203), orina(n=62), y LCR(n=6). Las mismas fueron estudiadas mediante RTPCR en tiempo real para Parotiditis para el diagnóstico y para su tipificación por RT-PCR anidada y posterior secuenciación del gen SH completo. El 67% tenían entre 10 y 25 años (rango 8 meses-75 años), mediana 17 años. El 58% fueron varones y el 52% estaba vacunado (1 a 3 dosis), no se contó con los datos de vacunación del 33% de los pacientes. Veintiséis (12%) casos presentaron complicaciones, siendo orquitis la de mayor frecuencia (n=10). Se diagnosticaron 101 (48%) casos positivos, tres de ellos padecían síntomas neurológicos y 15 otro tipo de complicaciones. Se secuenciaron 93 cepas (92%) las que en su totalidad pertenecían al genotipo G. En 2012 ocurrió un brote de parotiditis en Argentina en adultos jóvenes no vacunados de una comunidad cerrada (aspirantes de Gendarmería y Prefectura) identificándose al genotipo K como agente causal. A diferencia de aquél, este brote se extendió a todo el país, la población afectada fue más joven y el 52% estaba vacunado. Recientemente se han descrito brotes de parotiditis por genotipo G en población vacunada en EEUU, España, Canadá, Reino Unido y Holanda, se plantea que los factores que pueden contribuir a la emergencia de estos brotes son múltiples, entre otros, una cobertura inferior a la óptima y una protección insuficiente por parte de la vacuna. Por estas razones es fundamental, además de continuar con una buena cobertura de vacunación, contar con datos bien documentados de los casos o campañas en las que se utiliza Doble Viral (en la que el componente parotídeo está ausente) en lugar de Triple y qué cepa vacunal se emplea en éste último caso. Por otra parte, es importante continuar 57 Libro de resúmenes con la vigilancia laboratorial para establecer cuáles son los genotipos de parotiditis circulantes en Argentina. 0169 FRECUENCIA DE BOCAVIRUS EN NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS DE LA PROVINCIA DEL CHACO: ANÁLISIS DEL AÑO 2014 GD Deluca1, MC Urquijo1, C Passarella1, HM Marín2 1 Laboratorio de Aplicaciones Moleculares, Argentina. 2 Área de Biología Molecular. Instituto de Medicina -Regional - UNNE, Argentina. Introducción: La infección respiratoria aguda (IRA) es la patología más frecuente a lo largo de la vida del ser humano y es la causa más común de morbilidad y mortalidad en niños menores de 5 años, generando un aumento importante de las consultas externas y las hospitalizaciones en el periodo invernal. Los diagnósticos más frecuentes son la Neumonía e Influenza, seguidas de Bronquitis y Bronquiolitis. El Bocavirus humano (hBoV), descubierto en 2005, puede causar distintas afecciones del arbol respiratorio, particularmente en la población señalada, sin embargo, es escasa la información epidemiológica sobre este agente en el norte argentino. Objetivo: estudiar la frecuencia y estacionalidad de las infecciones por hBoV en la Provincia del Chaco. Materiales y métodos: Se evaluaron 488 aspirados nasofaríngeos (ANF) de niños con IRA ingresados a un laboratorio privado de Resistencia Chaco. Los ácidos nucleicos se extrajeron con kit de columnas Roche y la retrotranscripción se realizó en dos pasos con enzima MMLV IMPROM de Promega. Para la detección viral se utilizó PCR en tiempo real con sondas de hidrólisis (Taqman) y con mix de reacción KAPA en un equipo ECO de Illumina. Paralelamente, y con la misma metodología, se evaluaron otros 7 agentes respiratorios a fin de establecer la proporción de infecciones mixtas del hBoV. Resultados: Se obtuvo una frecuencia de 7.4% de hBoV en el total de 488 muestras analizadas. El período de mayor presencia viral fue el de JunioSeptiembre, en el que se detectó el 77.8% del total de casos positivos de la serie. El 94% de positividad se observó en pacientes menores de 2 años, con una frecuencia mayor en niños de 6-18 meses de vida, los cuales totalizaron el 72.2% (28/36 muestras) de los casos. En cuanto a las infecciones mixtas (se evaluaron el Virus Sinc. Resp., Adenovirus, Influenza A y B, Parainfluenza 1,2 y3, Rinovirus y My. pneuoniae), las más frecuentes fueron la de hBoV+Rinovirus con una frecuencia del 11.1% (4/36 muestras) y la de hBoV+Vir. Sinc. Resp. en un 19.4% (7/36 muestras). Discusión: Este es el primer proyecto en el norte argentino que contempla la evaluación sistemática de la frecuencia de hBoV. Sin dudas, los estudios epidemiológicos y el diagnóstico de las patologías respiratorias de origen vírico han dado un giro rotundo a partir del desarrollo de las metodologías moleculares de detección genómica. Hace no más de 15 años las infecciones virales del tracto respiratorio eran frecuentemente diagnosticadas sólo por la clínica, y al no contar éstas con tratamiento específico, no se veía la necesidad médica de profundizar en el diagnóstico etiológico. Los “nuevos virus” deben evaluarse epidemiológicamente con las mejores herramientas técnicas disponibles a fin de establecer fehacientemente las pautas de prevención y tratamientos adecuados. Este primer informe muestra claramente que el hBoV no es un agente poco frecuente en nuestra población pediátrica de menores de 2 años. 0179 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE VIRUS ORF EN CAPRINOS DE ARGENTINA A Peralta1 2, JF MIcheloud3, L Alvarez1 4, GA Konig1 2, C Robles4 1 CONICET, Argentina. 2 Instituto de Biotecnología INTA-Castelar, Argentina. 3 Área de Sanidad Animal-IIACS Leales/INTA-Salta, Argentina. 4 Grupo Salud Animal INTA-Bariloche, Argentina. El Ectima Contagioso (EC) es una enfermedad zoonótica causada por el virus Orf (ORFV), de amplia distribución mundial, que afecta principalmente a ovinos y caprinos. ORFV es un virus epiteliotrópico que produce comúnmente lesiones en labios, mucosa oral y nasal y ubres. Las lesiones son dolorosas y pueden producir anorexia e inanición, que conducen a un deterioro de la condición corporal de los animales. Históricamente, el diagnóstico presuntivo de la infección se ha realizado a través de la observación del cuadro clínico, y la confirmación mediante el aislamiento viral a partir de las escaras y observación de la partícula viral mediante microscopía electrónica. En la actualidad, el método de diagnóstico aceptado mundialmente es la detección e identificación del ADN viral mediante la amplificación de secuencias específicas utilizando la técnica de PCR. Hasta el momento, de los brotes de EC descriptos en Argentina, sólo fueron caracterizados a nivel molecular dos aislamientos de ORFV procedentes de ovinos. El objetivo de este trabajo es identificar y caracterizar molecularmente el virus Orf en dos brotes en caprinos de Argentina, ocurridos en 2014. A partir de dos poblaciones de cabras con síntomas clínicos de EC, se colectaron muestras de las lesiones de 5 caprinos de la provincia de Río Negro y muestras de 2 caprinos de la provincia de Salta. En el caso de Patagonia el brote se originó al ingresar caprinos Criollos de la provincia del Neuquén, posiblemente portadores asintomáticos del virus, en un hato de caprinos Angora de la provincia de Río Negro. Los animales afectados, principalmente cabras preñadas o lactando, presentaban lesiones en ubres, boca y rodete coronario de miembros anteriores y posteriores. En el caso del brote de Salta, las lesiones aunque severas, se restringieron a la boca. En este caso la incidencia fue baja y sólo fueron afectados seis individuos adultos que habían ingresado a la majada unos 20 días previos al brote. Con el fin de detectar el ADN viral, se realizó una PCR diagnóstica para ORFV (ORF045) sobre el ADN extraído de las muestras. De los 7 animales evaluados, sólo dos dieron positivo. A fin de aumentar la sensibilidad diagnóstica, las muestras fueron sometidas a una PCR semi-anidada cuyo templado es el gen ORF011. El resultado de este ensayo elevó a 5 el número de animales con diagnóstico de EC confirmado por PCR (tres caprinos de Río Negro y dos de Salta). Luego se procedió a la amplificación de genes que permiten realizar estudios filogenéticos entre aislamientos. Las secuencias obtenidas para los brotes de Río Negro y de Salta fueron comparadas entre sí y con las dos cepas conocidas de ORFV aislados de ovejas en Argentina. Este trabajo constituye la primera confirmación de brotes de EC en caprinos por PCR y presenta la primera caracterización molecular de virus Orf de caprinos en Argentina e incrementa el conocimiento a nivel molecular de las cepas de ORFV que circulan en nuestro país. 0185 EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE LA INFECCIÓN CERVICAL POR VIRUS DE PAPILOMA HUMANO (HPV) EN LA CIUDAD DE VIEDMA DF di Pratula1, JA Basiletti2, MA Picconi2 1 Hospital Regional Artemides Zatti, Argentina. 2 Servicio Virus Oncogénicos, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas – ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán., Argentina. Introducción: La infección genital por virus papiloma humano (HPV) es la enfermedad de transmisión sexual más común a nivel mundial, está demostrado que el cáncer cérvico-uterino (CCU) es consecuencia de la infección persistente por ciertos genotipos de alto riesgo oncogénicos. Objetivo: Identificar los genotipos de HPV circulantes en las mujeres concurrentes al Hospital Regional Artemides Zatti de la ciudad de Viedma. Metodología: el diseño fue observacional descriptivo de corte transversal. Se estudiaron pacientes concurrentes al Servicio de Ginecología, que aceptaron participar y firmaron el consentimiento informado. Se completó una ficha y se procedió a tomar las muestras para la citología por Papanicolau (Pap) y el estudio virológico. Para el análisis estadístico se utilizó Epi-Info y se calcularon asociaciones entre las distintas variables y la infección por HPV con intervalos de confianza del 95%. La detección del HPV se hizo con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores consenso MY09/11; luego, las muestras positivas fueron tipificadas mediante una PCR-PGMY utilizando primers biotinilados, seguida de una hibridación reversa en línea sobre una membrana de nylon con oligosondas tipo-específicas correspondientes a 32 tipos virales (PCR-RLB). Se utilizó como control interno una PCR del gen de beta-globina humana. Resultados: Se incluyeron 160 muestras cérvico-vaginales (en fresco) y 14 biopsias (fijadas). Todas las muestras de células fueron aptas para el estudio, 6 biopsias fueron descartadas por no amplificar el control interno. Se procesaron 168 muestras totales con citología 58 Libro de resúmenes correspondiente a: Normal (N-SIL): 109; Células escamosas de significado indeterminado (ASCUS): 12; Lesión intraepitelial de células escamosas de bajo grado (L-SIL): 16; Lesión intraepitelial de células escamosas de alto grado (H-SIL): 28 y CCU: 3. El 46% (77/168) de las muestras fueron positivas para HPV, con predominio en mujeres menores de 30 años (55/91, 60%). El virus se pudo detectar en el 23% de las citologías normales y en más del 81% de las lesiones. El 86% (66/77) de las pacientes estaban infectadas con un HPV-AR, siendo el HPV 16 el tipo viral más frecuente en todas las categorías citológicas (45%; 35/77). Se detectaron infecciones múltiples en el 51% de las pacientes (39/77). Conclusiones: Este estudio aporta los primeros datos sobre la prevalencia de la infección por HPV y la distribución de los distintos genotipos en Viedma; sus valores concuerdan con los hallados en trabajos previos (nacionales e internacionales). La mayor positividad para HPV en mujeres más jóvenes se vincula con la alta exposición viral durante el inicio de la actividad sexual, asociada a la adquisición de infecciones mayoritariamente transitorias; sin embargo, el predominio de HPV-AR aumentaría el riesgo de persistencia y potencial desarrollo de lesiones graves. La información aportada puede contribuir al control de la enfermedad y a la vigilancia posvacunal. 0191 EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE PARVOVIRUS HUMANO B19 EN ARGENTINA. RESULTADOS PRELIMINARES JM Marengo, CA Gonzalez, AM Alonso Servicio de Virosis Congénitas, Perinatales y de Transmisión Sexual. Departamento de Virología. INEI-ANLIS “Carlos G. Malbrán”, Argentina. La infección por Parvovirus Humano B19 (B19V) está asociada a un amplio rango de patologías como: exantema (quinta enfermedad), artralgias, hidropesía fetal, pérdida fetal, anemia crónica y crisis aplásica, según la población afectada. B19V es miembro de la familia Parvoviridae, subfamilia Parvovirinae, género Eritroparvovirus, especie Primate erythroparvovirus 1. Su genoma se compone de una cadena simple de DNA de 5592 nucleótidos organizado en dos principales marcos abiertos de lectura (ORF`s). El primero codifica para la proteína no estructural (NS1) implicada en la replicación viral y en la transcripción del genoma, y el segundo ORF para las proteínas estructurales VP1 y VP2. Actualmente están descriptos tres genotipos y cuatro subtipos, genotipo 1a, 1b, 2, 3a y 3b, que presentan entre 10 -14 % de divergencia nucleotídica en base a VP1-VP2. El genotipo 1 es el prevalente en el mundo. El genotipo 2 se ha detectado en Europa, EEUU y Brasil en un número reducido. El genotipo 3 predomina en el oeste de África, habiéndose reportado en los últimos años limitados casos en Europa y Brasil. El objetivo de este trabajo es determinar los genotipos de B19V circulantes en nuestro país. Se estudiaron 31 muestras que fueron positivas para el diagnóstico B19V, en diversas matrices (líquido amniótico, sangre seca en tarjeta de pesquisa neonatal y suero). Estas muestras correspondieron a pacientes con diversas patologías: exantemas (n=13), hidropesías fetales (n=10), crisis aplásicas (n=4), anemias crónicas (n=4) derivadas de diversos centros de salud del país para su diagnóstico en nuestro laboratorio. Se extrajo el ADN, a partir del cual se realizó una PCR anidada que amplifica un fragmento de 696 pb correspondiente a la región VP1-VP2. Los amplicones resultantes fueron secuenciados y alineados con cepas de referencia del Genbank. El árbol filogenético obtenido con 1000 réplicas de soporte, fue creado utilizando el método UPGMA a partir de una matriz de distancia (método p-distancia), en la plataforma MEGA. Del análisis realizado resultó que las 31 muestras correspondían al genotipo 1a con una divergencia nucleotídica entre el 0.3%-0.5%. Esto demuestra la circulación del genotipo 1a en nuestro país. Estos resultados preliminares sobre genotipos circulantes de B19V en Argentina coinciden con los obtenidos en Brasil, Chile, América del Norte y Europa. Para contribuir al conocimiento de la epidemiología de B19V es necesario profundizar la búsqueda de B19V y ampliar su análisis. 0212 ACCIDENTES LABORALES CON POTENCIAL RIESGO BIOLÓGICO EN LA GUARDIA MÉDICA DE UN HOSPITAL PÚBLICO DE TERCER NIVEL DE ATENCIÓN. R Huanca1, L Perreta2, N Lebensohn1 2, L Di Tullio1 2, L Vietti2, L Valenti1, O Di Paolo1, M Pires1, N Quaglia1 1 Area Tecnología y Salud Pública- Fac. Cs Bioq y Farm-Universidad Nacional de Rosario, Argentina. 2 Hospital Provincial del CentenarioRosario, Argentina. Entre los trabajadores de la salud, médicos y enfermeros lideran la exposición a accidentes con potencial riesgo biológico. Los patógenos más frecuentes causales de las infecciones asociadas al trabajo son los virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de hepatitis B (VHB) y el virus de hepatitis C (VHC). El Hospital Provincial del Centenario (HPC) es un hospital público de 3° nivel de atención y referencia en la Provincia de Santa Fe. En este, el Servicio de Guardia Médica (GM), exhibe características propias presentando un plantel asistencial conformado por médicos de planta, médicos graduados recientemente en formación bajo el sistema de Medicato, y enfermeros. Objetivo: caracterizar los accidentes laborales con riesgo biológico para VIH, VHB y VBC en médicos y enfermeros de la GM del HPC de la Ciudad de Rosario, Santa Fe y valorar la tasa de incidencia (TI) de los mismos en ambos grupos de trabajadores. Metodología: estudio de cohortes retrospectivo entre los años 2009 a 2013 realizado a partir del relevamiento de la información obtenida de las fichas epidemiológicas de denuncia obligatoria de accidentes laborales con riesgo biológico asentadas en el Centro de Tecnología y Salud Pública (Fac Cs Bioq y Farm, UNR- HPC) en donde se realizan las determinaciones bioquímicas para el seguimiento serológico de los virus mencionados. Se realizó el estudio estadístico descriptivo. Se valoró la razón de TI, para lo cual se calcularon las personas-horas trabajadas en los cinco años relevados. Resultados: Del total de áreas asistenciales del HPC la GM dio cuenta del 34,1% (IC95%: 26,2-42,6%) de los accidentes (n=138) reportados durante los años estudiados. El 69,8% (53,9-82,8%) de los accidentes (n=43) fueron cortes o punciones con material contaminado con sangre. El resto correspondió a salpicaduras que involucraban fluidos biológicos. El 88,1% (74,4- 96,0%) de los trabajadores que registraron accidentes (n=42) tenía menos que 30 años, con una mediana de 25 años. La mediana de antigüedad fue de 0,42 años. Del total de accidentes reportados (n=43), el 90,7% aconteció en médicos (77,997,4%). Razón de TI (med/enf) = 6,34 (IC95%= 2,26- 17,73). Conclusiones: El Servicio de GM del HPC se evidencia particularmente vulnerable ante los accidentes ocupacionales. Son los trabajadores médicos quienes presentan una mayor tasa de accidentes en relación con los enfermeros. Resultan considerablemente más afectados los profesionales jóvenes y aquellos con escasa antigüedad. La práctica médica es un factor de riesgo para la adquisición de las infecciones por VIH, VHB y VHC, resultando imperioso extremar medidas de concientización, profilaxis mediante vacunación para VHB y prevención de accidentes laborales. 0219 IMPROVEMENT OF THE SURVEILLANCE SYSTEM FOR ARBOVIRUSES IN THE CITY OF RIO DE JANEIRO, BRAZIL. RM Campos1, D Cadar2, MS Ribeiro3, LLR Santos1, MDF de Meneses1, JL da Silva3, AS dos Reis3, MCD Giordano3, J Schmidt-Chanasit2, DF Ferreira1 1 Departament of Virology, Institute of Microbiology Paulo de Góes, UFRJ, Rio de Janeiro; RJ, Brasil. 2 WHO Collaborating Centre for Arbovirus and Haemorrhagic Fever Reference and Research, Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine, Hamburg, Alemania. 3 Noel Nutels Central Laboratory (LACEN-RJ), Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Arthropod-borne viruses (arboviruses) may cause human disease, ranging from mild febrile illness to encephalitis and death. Most of the characterized human pathogenic arbovirus species belong mainly to 3 families: Togaviridae, Flaviviridae, and Bunyaviridae. During the last decade several countries worldwide have been facing the burden of introduction and re-introduction of arboviruses such as dengue virus (DENV), chikungunya virus, Japanese encephalitis virus, and West Nile virus in urban areas. Arboviruses-are a very diverse group. In Brazil, 59 Libro de resúmenes DENV is the most important arbovirus causing hundreds of deaths annually. The city of Rio de Janeiro is an important tourist destination. Thus, it has been playing an important role on arbovirus introduction into Brazil. The last DENV epidemic in the state of Rio de Janeiro was caused by co-circulation of DENV serotypes 4 and 1 and the number of cases reached 213.058. Many questions remain unanswered regarding the factors that influence the DENV outbreaks. The ecology of vectors, seasonal variation, abundance of infected mosquito females and the movement of vectors between human modified environment and urban forest may influence the course of DENV epidemics. The present work represents an observational ecologic study of the circulating arboviruses in vectors. Six areas were chosen in the city of Rio de Janeiro and Nova Iguaçu, as trapping sites of adult mosquitoes using BG Sentinel® traps and aspirators. After morphological species identification on chilled tables mosquitoes were pooled according to species and homogenized. Extracted RNA from homogenized mosquito pools was screened by RT-PCR for flaviviruses, alphaviruses, phleboviruses and orthobunyaviruses. After 12 months of continuous trapping 22,202 and 52,000 mosquitoes were collected in the cities of Rio de Janeiro and Nova Iguaçú, repectively. Flavivirus RNA was detected in 01 pool from Rio and 13 pools from Nova Iguacu, respectively. Sanger sequencing of the amplicons demonstrated the presence of different genotypes of DENV serotype 4 and DENV serotype 2 respectively. Our findings may provide a solid base to determine the underlying causes of the seasonal fluctuations of DENV activity and the relative abundance of the mosquito vector species. This information can be used as a basis for vector control programs and might provide an early warning of the presence of DENV in the state of Rio de Janeiro. 0220 ANÁLISIS POR SECUENCIACIÓN MASIVA DE MUESTRAS FECALES DE NIÑOS CON GASTROENTERITIS AGUDA REVELAN ELEVADA DIVERSIDAD GENÉTICA DE NOROVIRUS Y SAPOVIRUS EN PARAGUAY. ME Galeano1, SM Gabaglio1, M Martínez1, G Russomando1, GI Parra1 2 1 Departamento de Biología Molecular y Biotecnología, IICS, UNA, Asunción, Paraguay. 2 Dirección actual: Caliciviruses Section, Laboratory of Infectious Diseases, NIAID, NIH, Bethesda, Estados Unidos. Introducción: En Paraguay, la gastroenteritis aguda es una de las causas más importantes de morbilidad y mortalidad en niños menores de 5 años de edad: siendo los rotavirus los agentes causales más frecuentes. Los norovirus y los sapovirus pertenecen a la familia Caliciviridae, y han sido identificados como los principales causantes de brotes de diarrea aguda a nivel mundial; sin embargo, en Paraguay han sido hasta el momento poco estudiados. Con el objeto de determinar la presencia de potenciales nuevos virus asociados con la gastroenteritis aguda, analizamos por Next Generation Sequencing un set de muestras fecales del Departamento Central, Paraguay. En este trabajo analizamos los calicivirus detectados. Métodos: Se seleccionó un set de muestras fecales (n=118) de niños paraguayos con gastroenteritis aguda no bacteriana colectadas durante los años 2004-2005; que fueron negativas para rotavirus y norovirus por técnicas moleculares convencionales. Las lecturas colectadas por Next Generation Sequencing, correspondientes a norovirus y sapovirus, fueron comparadas con una base de datos de genomas de referencia para ensamblar los genomas detectados y analizar la filogenia de los mismos. Resultados: En base a los datos analizados, fue posible ensamblar seis genomas pertenecientes a la familia Caliciviridae: cinco norovirus (GII.4=3, GII.3=1 y GII.17=1) y un sapovirus (GV.1). Las tres cepas de norovirus GII.4 se agruparon en el cluster Farmington Hills, correspondiente a cepas pandémicas de los años 2002-2005. Los residuos aminoacídicos de la cápside de las cepas paraguayas no presentaron diferencias con la cepa Farmington Hills, excepto una que presentó mutaciones en el epítopo E. Se detectaron dos cepas de norovirus recombinantes: Py36_40 (GII.P21/GII.3) y Py116_119 (GII.Pe/GII.17). Según el análisis filogenético del gen de la proteína de la cápside (VP1), la cepa Py36_40 fue similar a otras GII.3 de inicios de los 2000s. Sin embargo, el gen de la polimerasa viral (RdRp) agrupó con cepas recombinantes GII.P21 de Francia y Sudáfrica. Por otro lado, fue analizado el gen de la polimerasa de la cepa Py116_119, que agrupó con los de cepas recombinantes GII.Pe/GII.4; mientras que su gen de la VP1 agrupó con cepas GII.17 de Río Grande del Sur, Brasil del año 2005. El sapovirus detectado agrupó con las cepas de referencia GV.1, junto a otras GV.1 del mundo. Conclusiones: Este trabajo presenta los primeros genomas completos de calicivirus circulantes en Paraguay. Se detectó la circulación de cepas de norovirus recombinantes intergenotipo y de virus asociados al genotipo pandémico GII.4; así como la presencia del genotipo GV.1 correspondiente al género Sapovirus, correspondiente al primer reporte para el Paraguay. 0233 ACEPTABILIDAD DEL TEST RÁPIDO PARA HIV. EXPERIENCIA DURANTE UN ESTUDIO DE PREVALENCIA EN POBLACIONES EN MÁS ALTO RIESGO (PEMAR) DE ARGENTINA. A Duran1, D Rossi2, R Marone3, L Gallo Vaulet4, M Rodriguez Fermepín4, R Casco5, G Orellano6, M Romero7, C Petracca8, E Benedetti9, MM Avila10, H Salomón10, MA Pando10 1 Coordinacion SIDA, Ministerio de Salud, Buenos Aires, Argentina. 2 Intercambios AC, Buenos Aires, Argentina. 3 Nexo AC, Buenos Aires, Argentina. 4 Laboratorio de Inmunología y Virología Clínica, Hospital de Clínicas “José de San Martín”, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina. 5 Programa de Enfermedades de Transmisión Sexual (PETS), Hospital de Clínicas José de San Martín, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina. 6 Asociación de Mujeres Meretrices de Argentina (AMMAR), Buenos Aires, Argentina. 7 Asociación de Travestis Transexuales y Transgéneros de Argentina (ATTTA), Buenos Aires,, Argentina. 8 Programa de VIH-sida e ITS, Municipalidad de San Martín, San Martín, Provincia de Buenos Aires, Argentina. 9 Hospital en Red Especializado en Salud Mental y Adicciones (ex CENARESO), Buenos Aires, Argentina. 10 Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (INBIRS), Buenos Aires, Argentina. Introducción: Las recomendaciones de los organismos internacionales enfatizan la importancia de encarar el control de la epidemia de HIV/SIDA con programas de prevención focalizados en el acceso al diagnóstico y la inclusión de las personas afectadas al sistema de salud. Como primer paso para lograr este objetivo la DSyETS del Ministerio de Salud de la Nación ha incluido el test rápido de HIV en el algoritmo diagnóstico. Objetivo: estimar la prevalencia de infección por HIV y Treponema pallidum en población en más alto riesgo (PEMAR): hombres que tienen sexo con hombres (HSH), mujeres trans, usuarios de drogas (UD) y trabajadoras sexuales mujeres (TS) utilizando algoritmos diagnósticos que incluyen test rápidos. Metodología: Se realizó un muestreo por conveniencia. Todos los participantes pasaron por tres etapas para realizarse los test rápidos de HIV y T. pallidum (Alere Determine): entrevista inicial, realización de los test rápidos y entrega de resultados. A los 15 días se realizó la entrega de resultados confirmatorios (ELISA, Carga Viral y CD4). El proyecto incluyó una primera etapa de capacitación técnica en el uso del test rápido en las instituciones participantes. Resultados: Se incorporaron al estudio un total de 1517 participantes (1015 HSH, 78 TS, 165 mujeres trans y 259 UD) entre septiembre del 2013 y mayo del 2014. La prevalencia de infección por HIV en HSH fue 11,5% (IC 95% 9,5-13,5), en TS 5,1% (IC 95% 1,4-12,6), en mujeres trans 31,5% (IC 95% 24,1-38,9), en UD 3,5% (IC 95% 1,1-5,9). En relación a la prevalencia de infección por T. pallidum, en HSH fue 17,7% (IC 95% 15,2-20,0), en TS 14,1% (IC 95% 5,7-22,5), en mujeres trans 47,3% (IC 95% 39,3-55,2) y en UD 7,7% (IC 95% 4,3-11,2). El 99,5% de los participantes reportó que el procedimiento del test rápido le pareció “Bueno” o “Muy Bueno”. Un 22% de los individuos incluidos en el estudio nunca se habían realizado el diagnóstico de HIV, sin embargo 3,2% de ellos nunca retiraron el resultado, llegando esta frecuencia a valores más elevados en los UD (8,6%) y las mujeres trans (10,6%). Un 55,7% de los participantes se habían realizado el test de HIV en el último año. El 57,9% de los participantes con infección por HIV tenían menos de 500 células T CD4/µl al momento del diagnóstico. Conclusiones: Si bien en Argentina el diagnóstico y tratamiento de la infección por HIV es libre, 60 Libro de resúmenes confidencial y gratuito, uno de los mayores problemas que se ha observado es la demora en llegar al diagnóstico. Este problema se evidencia en el alto porcentaje de individuos que son diagnosticados en estadios avanzados de la infección, situación que desfavorece su evolución y favorece la diseminación de la infección a otros individuos. En este proyecto se realizó por primera vez en el país un estudio epidemiológico para evaluar prevalencia de infección por HIV y T. pallidum en PEMAR utilizando un algoritmo diagnóstico que incluye el test rápido, destacándose la excelente aceptabilidad. 0244 DETECCION DE NUEVAS VARIANTES CIRCULANTES DEL VIRUS DE LA HEPATITIS A EN LA ARGENTINA NR Altabert1, MS Munne1, SN Vladimirsky1, SS Soto1, LO Otegui1, LS Brajterman1, M Frías Céspedes2, P Barbero2, A Ubaldi3, JE Gonzalez1 1 Laboratorio Nacional de Referencia para Hepatitis Virales-INEI -ANLIS, Argentina. 2 División Epidemiología. Ministerio de Salud de la Provincia de Córdoba, Argentina. 3 Dirección de Promoción y Prevención en Salud. Ministerio de Salud de la Provincia de Santa Fe, Argentina. INTRODUCCION Con la implemetación de la vacunación universal contra el virus de la hepatitis A con una dosis en niños de 1 año de edad en junio de 2005, la incidencia de la enfermedad disminuyó drásticamente. Hasta el momento no se ha detectado la introducción de subgenotipos diferentes a los detectados antes de la vacunación, siendo el subgenotipo IA el único caracterizado en variantes adquiridas localmente. Sin embargo, en este contexto de vigilancia intensificada por tratarse de una infección inmunoprevenible y el cambio de las condiciones epidemiológicas, es posible la detección de nuevas variantes circulantes. OBJETIVO Caracterización molecular de nuevas variantes detectadas en el marco de la vigilancia intensificada de Hepatitis A que se realiza en la Argentina. MATERIALES Y METODOS Muestras de dos pacientes diagnosticados con serología positiva para anticuerpos anti HAV-IgM por métodos comerciales derivadas para su estudio al Laboratorio Nacional de Referencia para Hepatitis Virales. Paciente 1: Suero y materia fecal de un paciente 25 años, no vacunado, estudiante de Ciencias Agrarias, residente en la ciudad de Rosario con antecedente de viaje a Totoras, provincia de Sante Fe, donde refiere el consumo de agua de pozo en febrero de 2014. Paciente 2: Materia fecal de una paciente de 32 años, no vacunada, de profesión antropóloga forense, residente el la ciudad de Córdoba con antecedentes de viaje a Africa, Chad en junio de 2014. En ambos casos, se realizó una RT- nested PCR con primers dirigidos a diferentes regiones genómicas del HAV. Los productos de PCR fueron secuenciados y analizados con programas filogenéticos. RESULTADOS Paciente 1: Se obtuvieron diferentes regiones genómicas VP1/2A, VP3 en las cuales se descartó eventos de recombinación entre el subgenotipo IA y IB. Un fragmento de 294 bases de la región VP1/2A agrupa con variantes de España y muestras ambientales de Argentina que recientemente fueran propuestas como un nuevo subgenotipo IC. Paciente 2: Se obtuvo un fragmento de 349 bases de la región VP1/2A con una identidad a nivel nucleotídico del 98% con variantes caracterizadas en Francia de casos importados del oeste de Africa, designadas con el subgenotipo IIA. CONCLUSIONES A partir del oportuno estudio epidemiológico se pudo detectar la primer variante correspondiente al subgenotipo IC en una muestra clínica y la primer variante importada perteneciente al subgenotipo IIA. Con el cambio de endemicidad, los individuos susceptibles permiten la introducción de nuevos genotipos y variantes no caracterizadas hasta el momento, revelando un cambio en su epidemiología. La vigilancia a través de la caracterización molecular es indispensable para estudiar y comprender los cambios en el patrón de circulación y tomar medidas para el control y la prevención de la infección por el virus de la Hepatitis A. 0247 CIRCULACIÓN DE GENOTIPOS DE CITOMEGALOVIRUS EN POBLACION PEDIATRICA EN ARGENTINA CA Gonzalez, JM Marengo, AM Alonso Servicio de Virosis Congénitas, Perinatales y de Transmisión Sexual. Departamento de Virología. INEI-ANLIS “Carlos G. Malbrán”, Argentina. La infección por Citomegalovirus (CMV) es la infección viral congénita más frecuente. La misma puede afectar el desarrollo fetal y embrionario, y dar como consecuencia muerte fetal, retraso del crecimiento intrauterino (RCIU), hidrops, sepsis neonatal, microcefalia o hidrocefalia y coriorretinitis entre los hallazgos más patognomónicos. Uno de los genes más estudiados de CMV es UL55 que expresa la glicoproteína B (gB). Esta proteína es el mayor componente de la envoltura viral, induce una fuerte respuesta de anticuerpos neutralizantes, y juega un rol importante en la infectividad y la propagación célula a célula. Al estudiar muestras clínicas sobre la base del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) se identificaron variantes genómicas únicas: gB1-gB4. Se postula que los distintos genotipos podrían correlacionarse con el tropismo y la patogenia viral. El objetivo de este trabajo es caracterizar los genotipos gB circulantes en una población pediátrica en la Argentina, su correlación según se trate de una infección congénita (IC) o perinatal (IP) y su relación con la patogenia viral. Se estudiaron pacientes pediátricos (n=95), con IC (n=44), con IP (n=9) y en los restantes no pudo ser determinado el momento de la infección (n=42). Las edades oscilaron entre los 5 días de vida y los 4 años de edad. El ADN viral purificado de los aislamientos y amplificado con cebadores específicos para la región gB (UL55) que produce un fragmento de 305 bp, fue digerido con las enzimas HinfI y RsaI. Los genotipos obtenidos presentaron la siguiente distribución: gB1: 39 (41%), seguido de gB3: 28 (29,50%), gB2: 22 (23,20%) y gB4: 6 (6,30%). Los genotipos predominantes en las IC fueron gB1 (18/44) y gB2 (14/44) seguidos de gB3 (9/44) y gB4 (3/44). En la IP correspondió a gB1 (5/9), gB3 (3/9) y gB4 (1/9). Se observó la ausencia de gB2 en dicha infección. En los casos que no se determinó el momento de la infección (ND) los resultados fueron: gB1 y gB3 (16/42) en igual proporción, gB2 (8/42) y gB4 (2/42). En el análisis considerando las patologías se observó que en los casos de trastornos del sistema nervioso central (SNC) (n=33) la circulación predominante fue de gB1 (48,48%) seguida de gB2 (30,30%). En cambio en ausencia del trastorno (n=62) la presencia de gB1 y gB3 fueron iguales (37,10%) y la de gB2 (19,35%). En los casos que presentaron RCIU (n=22), bajo peso para la edad gestacional (n=20) y anemia (n=24) el predominio fue de gB1 y gB3, no observándose diferencias en la distribución de gB cuando se consideraron otras manifestaciones como hepatoesplenomegalia, ictericia, prematurez y petequias. Cuando se relacionó la IP con los trastornos del SNC el único genotipo presente fue gB1 (2/2). En este trabajo se observó que el genotipo gB1 es el prevalente en la población pediátrica estudiada de nuestro país y que el gB4 es el menos frecuente. Este último se logró detectar luego de incrementar el número de casos de 30 a 95. 0252 EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE METAPNEUMOVIRUS HUMANO EN NIÑOS Y ADULTOS INTERNADOS POR INFECCIÓN RESPIRATORIA AGUDA DURANTE EL AÑO 2012 EN CÓRDOBA, ARGENTINA. PE Rodríguez, JA Cámara, A Cámara Instituto de Virología "Dr. J. M. Vanella". Facultad de Ciencias Médicas. UNC, Argentina. Metapneumovirus humano (MPVh) es un importante agente causal de infecciones respiratorias agudas (IRA) descubierto en el año 2001 por van den Hoogen. Representa una de las principales causas de morbimortalidad en niños y adultos. En Córdoba fue detectado por primera vez en el año 2011 en niños con una prevalencia del 4% por medio de Inmunofluorescencia directa (IFD). 61 Libro de resúmenes Objetivo: determinar por medio de la técnica RT-PCR la circulación de MPVh en niños y adultos internados por IRA durante el 2012 en distintos hospitales de la ciudad de Córdoba. Doscientas diecinueve muestras de secreciones nasofaríngeas de pacientes de 0- 67 años de edad, se procesaron para la extracción de ARN y se detectó una región del gen N de MPVh (199pb) por medio de RT-PCR convencional, adaptada de Bouscambert- Duchamp (2005). Previamente estas muestras habían sido analizadas para otros virus respiratorios por medio de IFD. De las 219 muestras testeadas (200 <14 años y 19 >15 años), el 35,61% (78/219) resultaron positivas para MPVh. El 21,91% (48/78) se presentó en monoinfección y el 13,69% en coinfección, 28/30 con VRS y 2/30 con Influenza B. Las detecciones se encontraron desde marzo a noviembre y el pico de casos positivos se registró entre julio y agosto. MPVh fue encontrado tanto en niños como en adultos: <1 año: 57; 1-4 años: 5; 514 años: 6; 15-59: 9; ≥ 60 años: 1. En los casos de monoinfección los síntomas asociados más frecuentes fueron presencia de mucosidad, fiebre y tos y la infección se relacionó con bronquiolitis, síndrome de dificultad respiratoria y exacerbación del asma. Los resultados indican prevalencias mayores a lo reportado (5-15%) aunque algunos autores han encontrado hasta un 30%. Como describe la bibliografía la circulación del virus se da hacia finales de invierno continuando hasta los meses de primavera. En este análisis la mayoría de las detecciones se encuentran en los menores de 5 años, debido a que en este estudio ha sido el grupo que presentó mayores internaciones. Además se sabe que presentan mayor riesgo de infección por MPVh y gravedad luego de Virus Respiratorio Sincicial. Se comunica por primera vez la detección de casos en adultos en la ciudad de Córdoba. Presentan enfermedad tipo influenza (ETI), con una prevalencia de entre 5-25% principalmente en adultos mayores con enfermedades de base e inmunocomprometidos. En este estudio el paciente mayor de 60 años presentaba diabetes, mientras que el resto de los adultos jóvenes y mayores no padecían enfermedades de base y la infección se asocio con una ETI. Consideramos que con estos nuevos aportes, es de suma importancia la implementación de búsqueda rutinaria de este agente tanto en niños como en adultos que en casos de tener enfermedades de base o complicaciones la infección es más severa. 0259 ROTAVIRUS COMO AGENTE CAUSANTE DE SOBREINFECCION EN PACIENTES PEDIATRICOS INTERNADOS POR INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS DE ETIOLOGIA VIRAL SS Marchiano, MM Campora, MA Sanchez, MA Taborda Laboratorio de Diagnóstico Virológico, Cátedra de Virología, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR, Rosario, Argentina. INTRODUCCION: las Infecciones Respiratorias Agudas (IRA) y las Gastroenteritis Agudas (GEA) son las principales causas de morbimortalidad infantil en el mundo y están asociadas a un importante numero de internaciones. Los agentes etiológicos predominantes de estas patologías son los virus: Virus Respiratorio Sincicial para las IRA y Rotavirus grupo A (RV-A) para las GEA. En Argentina se necesita trabajar más en la epidemiología de los GEA de origen viral con el fin de implementar estrategias para el control de estas enfermedades. OBJETIVO: Documentar los resultados de un análisis retrospectivo de los pacientes internados con diagnóstico de IRA que presentaron sobreinfecciones por RV-A durante su internación. MATERIALES Y METODOS: Se analizaron muestras de materia fecal de pacientes internados en salas de neonatología y pediatría del Hospital Provincial del Centenario durante el periodo comprendido entre enero 2010 y diciembre 2014. Las muestras fueron analizadas por métodos de Inmunocromatografia “RIDA QUICK Rotavirus” R-biopharm. En aquellos pacientes cuyas muestras fueron positivas para Rotavirus se busco motivo y fecha de ingreso al hospital encontrándose la IRA como principal causa de internación. RESULTADOS: En 2010 se procesaron 25 muestras de materia fecal (MF) de las cuales 9 (36%) fueron positivas. En 2011 se procesaron 38 muestras de las cuales 22 (58%) fueron positivas. En 2012 se procesaron 32 muestras de las cuales 10 (31%) fueron positivas. En 2013 se procesaron 38 muestras de las cuales 13 (34%) fueron positivas y en 2014 se procesaron 52 muestras de las cuales 22 (42%) fueron positivas. De las 76 muestras positivas para RV-A, se encontraron 22 (29%) que fueron diagnosticadas con GEA luego de que los pacientes fueron internados por complicaciones de una IRA de etiología viral. CONCLUSIONES: El mayor porcentaje de positividad de RV-A coincidió con el pico estacional de VRS, sospechándose sobreinfecciones intrahospitalarias de los pacientes que fueron internados por IRA. Estos datos se podrían reforzar si aumentara la búsqueda de agentes virales como causa de GEA. El análisis de nuestros datos también pone en evidencia la necesidad de continuar trabajando con las medidas de higiene en el manejo de los pacientes hospitalizados debido a la alta transmisibilidad de estos virus. 0260 VIGILANCIA DE POLIOVIRUS EN ARGENTINA DURANTE EL PERÍODO 1996-2010 C Lema1, D Girard1, L Martínez1, DM Cisterna1, J Cello2, J Stupka1 4, M Caparelli3, MC Freire1 1 Servicio de Neurovirosis, INEI-ANLIS- Dr. Carlos G. Malbrán, Argentina. 2 Center for Infectious Diseases, School of Medicine, Stony Brook University, Estados Unidos. 3 PRONACEI, Ministerio de Salud de la Nación, Argentina. 4 Servicio de Gastroenteritis virales, INEI-ANLIS- Dr. Carlos G. Malbrán, Argentina. La campaña mundial para erradicar la poliomielitis comandada por la OMS con el uso de la vacuna oral a virus atenuados Sabin (OPV) disminuyó drásticamente el número de casos a 359 en 7 países en 2014. Los efectos adversos de la OPV son poliomielitis paralítica asociada a la vacuna (PPAV) y a los poliovirus derivados de la vacuna (VDPV). Los VDPV son virus con 6 y 10 nucleótidos diferentes (según el serotipo), en la región P1 del genoma (VP1), con respecto a la cepa Sabin. Para lograr la erradicación se deben eliminar los reservorios de PV salvaje y dejar de usar la OPV, fuente constante de virus Sabin y VDPV. La circulación de poliovirus (PV) se controla a través de la vigilancia de pacientes con parálisis aguda fláccida (PAF) menores a 15 años. El principal reservorio y transmisores de PV son los niños menores a 5 años de edad. En este estudio, se analizó la prevalencia de PV Sabin a partir de materia fecal (MF) en pacientes con PAF y niños menores de 5 años con diarrea (D) entre 1996 y 2010 en Argentina. Se estudiaron 6784 MF: 4982 de D y 1802 de PAF, por cultivo celular y métodos moleculares (RT-PCR y secuenciación) siguiendo los protocolos de la OMS. Se encontraron 224 PV Sabin en el período estudiado en 20 provincias: 49 y 175 cepas a partir de 39 y 134 casos de D y PAF, respectivamente. Se observó diferencia estadísticamente significativa: entre las tasas de detección de PV de D y PAF (0.5 y 6.7% respectivamente) y entre los PV aislados de pacientes menores (85/173) y mayores (14/173) a 1 año de edad. La tasas de aislamiento por serotipo y patología fue la siguiente: Sabin1: 0.3 y 1.9%; Sabin2: 0.4 y 3.7%; y Sabin3: 0.3 y 4.0 % para D y PAF respectivamente. La búsqueda de VDPV por RT-PCR mostró 22 posibles VDPV: 2 tipo 1 y 20 tipo 2. De ellos solo uno se confirmó como tal por secuenciación. Además se detectó otro VDPV directamente por secuenciación sin RT-PCR. Ambos eran casos de PAF, tipo 1, de los años 1998 y 2009. Argentina se encuentra libre de PV salvaje desde 1984. La vacuna utilizada en el calendario nacional es la OPV y se aplica a los 2, 4, 6 y 18 meses de edad. La elevada tasa de aislamiento de virus Sabin y VDPVs en los pacientes con PAF reflejaría la introducción de cepas vacunales por el uso de OPV. Se confirmó la presencia de PV vacunal en la población y el posible riesgo epidemiológico que implica, ya que podría generar la circulación sostenida de cepas virales neurovirulentas. Además, los datos sugieren que la búsqueda de PV en fuentes no convencionales no aporta información adicional a la obtenida por la vigilancia de PAF y no justificaría su implementación como método complementario para determinar la presencia de PV en la población. Los pacientes con asilamiento de PV y parálisis (transitoria o no) sugerirían que la misma podría ser producida por la OPV, lo que sería otro efecto no deseado. El cambio a un esquema secuencial IPV-OPV de vacunación es necesario para evitar los PPAV, VDPV y circulación de cepas vacunales. 62 Libro de resúmenes 0261 ANALISIS Y DESCRIPCION DE RESULTADOS DE INFECCIONES RESPIRATORIAS VIRALES EN UN PERÍODO DE 5 AÑOS EN HOSPITALES PROVINCIALES DE ROSARIO, SANTA FE. MA Sanchez, MM Campora, SS Marchiano, MA Taborda Laboratorio de Diagnóstico Virológico, Cátedra de Virología, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR, Rosario, Argentina. Las infecciones respiratorias agudas (IRA) son la primera causa de morbilidad en la infancia en el mundo. La investigación epidemiológica es fundamental para conocer los agentes involucrados, su impacto en los sistemas de salud y para el desarrollo de estrategias de prevención, tratamiento y formulación de vacunas. Nuestro objetivo fue analizar los resultados obtenidos del estudio de paneles virales en pacientes pediátricos internados en los hospitales Provincial del Centenario y de Niños Zona Norte en el período enero 2010-diciembre 2014. Se estudiaron 1755 aspirados nasofaríngeos (ANF) de pacientes internados en salas de neonatología y pediatría con sospecha de IRA durante el período mencionado y con un tiempo de evolución de la sintomatología de hasta 5 días. Las muestras remitidas fueron analizadas por Inmunofluorescencia Directa mediante “Respiratory DFA Viral Screening & Identification Kit” LIGHT DIAGNOSTICS-Millipore para la detección cualitativa de: Adenovirus, Virus Sincicial Respiratorio (VRS), Virus Influenza A y B, Virus Parainfluenza 1, 2 y 3. En función de la época del año, las muestras se procesaron de 2 maneras diferentes: durante los períodos donde se esperaba baja frecuencia de resultados positivos se utilizó el reactivo de Screening, las muestras positivas fueron posteriormente analizadas con panel de identificación. En los meses donde se esperaba mayor frecuencia de resultados positivos se trabajó directamente con anticuerpos monoclonales específicos para los siete virus. Esta forma de trabajo nos permitió eficientizar el uso de los insumos de los que disponemos. En 2010 se estudiaron 282 muestras de las cuales 69 (24%) fueron positivas. En 2011 se estudiaron 388 muestras de las cuales 72 (21.3%) fueron positivas. En 2012 se estudiaron 317 muestras de las cuales 116 (36.6%) fueron positivas. En 2013 se estudiaron 319 de las cuales 117 (36.6%) fueron positivas. En el 2014 se estudiaron 499 muestras de las cuales 182 (36.5%) fueron positivas. En todas las muestras de screening positivos se logró identificar el agente viral. Durante los años estudiados se observó un franco predominio de VRS con picos de aparición promediando las semanas epidemiológicas 23 y 28, coincidente con lo notificado por el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica por Laboratorios de Argentina (SIVILA). Los datos analizados demuestran un aumento en la solicitud de búsqueda de agentes virales en el diagnostico diferencial de IRA. El mayor número de muestras positivas puede deberse a una mejora de la etapa pre-analítica (momento y forma de obtención de la muestra) y a un aumento de la vigilancia virológica por parte del sistema de salud. Este aumento en la demanda conlleva a la necesidad de optimizar los recursos humanos y económicos. Proponemos intensificar el sistema de redes de laboratorios que ya esta en marcha. 0264 PREVALENCIA DE VIRUS WEST NILE Y SAINT LOUIS EN ALOUATTA CARAYA DEL NORDESTE DE CORRIENTES, ARGENTINA. GI Oria1, L Spinsanti2, MM Kowalewzki3, M Raño3, GE Zunino4, OS Stechina5, MS Contigiani2, M Stein5 1 Instituto de Medicina Regional-Facultad de Medicina-UNNE, Argentina. 2 Laboratorio de Arbovirus- Instituto de Virología “Dr. J.M. Vanella”- Fac. Cs. Médicas- UNC., Argentina. 3 Estación Biológica Corrientes. (MACN BR –CONICET) Corrientes, Argentina. 4 Universidad Nacional de General Sarmiento- Buenos Aires., Argentina. 5 Instituto de Medicina Regional-UNNE, Argentina. En la Argentina habitan cinco especies autóctonas de monos, entre ellos los aulladores negros y dorados (Alouatta caraya). Estos primates son susceptibles a la infección por Flavivirus, pudiendo actuar como centinelas de algunas enfermedades. Diferentes estudios han reportado la presencia de los virus de Encefalitis de San Luis (SLE), y Nilo Occidental (WN) en A. caraya, en algunas provincias del Noreste argentino (NEA). El objetivo del trabajo fue conocer la seroprevalencia de estos virus en monos que viven en ambientes próximos a áreas urbanas. Los primates fueron capturados empleando dardos con anestésicos. Se registró el peso, medida, edad de cada individuo y se tomó una muestra de sangre por vía femoral. Las muestras tomadas corresponden a capturas en los meses de septiembre de 2010 (N=2) en la localidad de Itatí (27° 16´16´´S, 58° 15´40´´W), octubre de 2010 (N=4) en el INTA Sombrerito (27° 39´45´´S, 58° 47´07´´W) y noviembre de 2012 (N=19) en Estación Biológica Corrientes (MACN-CONICET) en San Cayetano (27° 30´S, 58° 41´W), sin recaptura. La mayoría de los ejemplares (19/25) correspondió a monos adultos con edades superiores a los 4 años. De las muestras obtenidas 11/25 correspondieron a hembras. Se detectaron anticuerpos neutralizantes contra los virus WN y SLE, mediante la técnica de neutralización con células Vero C76. La seroprevalencia general para Flavivirus fue de 32%, y de esos el 50 % (4/8) correspondió a virus WN y 37,5 % (3/8) a SLE. Una sola muestra de suero fue positiva para ambos virus. Cuatro de las muestras positivas correspondieron a ejemplares adultos, 3 a subadultos y 1 juvenil. Sólo una de las muestras positivas correspondió a un adulto capturado en el 2010, las restantes, a sueros obtenidos de capturas realizadas en el 2012. Los resultados obtenidos muestran la co-circulación de los virus SLE y WN en la provincia de Corrientes, en poblaciones de Alouatta caraya. Estudios de seroprevalencia para estos virus en humanos realizados en el 2007 en Corrientes ya alertaban sobre su circulación. Durante el año 2010 algunos de los investigadores de este grupo de trabajo, obtienen prevalencias de 10,2% y 19,81% para SLE y WN respectivamente de sueros de primates capturados en localidades cercanas a las nombradas en el presente trabajo. A partir de esta investigación surge la necesidad de continuar y profundizar estudios que permitan revelar los ciclos de transmisión de estos virus en el nordeste de Argentina, teniendo en cuenta que se confirma A. caraya como huésped susceptible de los mismos y por otro lado el alerta hacia las autoridades sanitarias ya que podemos pensar que la circulación también es reciente dado que fueron detectados en ejemplares juveniles. 0286 VIGILANCIA DE LOS VIRUS SARAMPION Y RUBEOLA EN LA REPÚBLICA ARGENTINA: ACTIVIDAD DEL LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA, PERIODO 2012-2014 N Periolo1, M Avaro1, E Macias Machicado1, F Pardon1, E Benedetti1, A Czech1, A Pontoriero1, M Russo1, A Campos1, F Bruggesser2, G Elbert2, C Vizzotti2, E Baumeister1 1 Laboratorio Nacional de Referencia de Sarampión - Rubéola, Servicio Virosis Respiratorias, INEI-ANLIS “C. G. Malbran”., Argentina. 2 Dirección Nacional de Control de Enfermedades Inmunoprevenibles del Ministerio de Salud, Argentina. Introducción: El sarampión (S) y la rubéola (R) son enfermedades febriles exantemáticas (EFE) causadas por virus de ARN, perteneciente a la familia de los Paramixovirus en el caso del S y a la familia Togavirus para el virus de la R, Además la infección intrautero por R puede acarrear el desarrollo del síndrome de rubéola congénito (SRC). Gracias a las elevadas coberturas de vacunación que se mantienen en forma continua y a la vigilancia epidemiológica, en nuestro país no se registran casos autóctonos de S desde el año 2000 ni de R y SRC desde el 2009. En 2012 el Laboratorio Nacional de Referencia de Sarampión– Rubéola (LNRSR) alcanza la acreditación para la OPS/OMS. En diciembre de 2013 Argentina certificó ante la OPS la eliminación de la circulación endémica de S y R. El LNRSR en conjunto con la Dirección Nacional de Control de Enfermedades Inmunoprevenibles (DiNaCEI) del Ministerio de Salud Nacional trabajan para mantener activos los mecanismos de prevención, alerta temprana y de intervención inmediata ante la presencia de casos sospechosos. Objetivos: Describir y analizar los resultados de laboratorio de la vigilancia para S y R obtenidos en el LNRSR. Metodología: Las muestras de casos sospechosos de S y R fueron derivadas al LNRSR para su confirmación desde diferentes regiones del país. El diagnóstico de laboratorio se realiza mediante la detección de anticuerpos IgM y recuperación del ARN viral de muestras de orina y secreciones respiratorias. La detección del ARN viral se realizó mediante RT-PCR Real Time. El estudio del genotipo se realizó utilizando el kit distribuido por los Centros para el Control y Prevención 63 Libro de resúmenes de Enfermedades (CDC) secuenciando las proteínas N del S y E1 del R. Resultados: En los últimos tres años se estudiaron, en el LNRSR, 348 casos sospechosos de EFE (76 casos en 2012, 108 en 2013 y 168 en 2014) y 172 casos sospechosos de SRC. No se confirmó ningún caso de SRC. En 11 muestras se determinó la presencia de genoma viral para el virus de S, en dos de ellas se confirmó la importación de los genotipos D4 (2012) y D8 (2014) acompañados de serología positiva. El resto correspondieron a casos asociados a la vacunación reciente. Se detectaron dos casos importados de R, uno correspondiente al genotipo 2B. Conclusiones: Nuestro país en conjunto con los países de las Américas se encuentran en proceso de lograr la eliminación del S y la R, sin embargo, en otros continentes, estas enfermedades son endémicas y continúan siendo una amenaza. Por lo cual, un caso importado constituye un evento con gran repercusión en la salud pública del país y la Región, generando demanda de recursos para el estudio de los contactos y las acciones de bloqueo vacunal. Sostener altas coberturas de vacunación, fortalecer la vigilancia epidemiológica y confirmar la ausencia de circulación viral son los pilares para mantener los objetivos de los programas de eliminación y control. 0299 ANALISIS DE POLIMORFISMOS DE LA PROTEINA TAX DEL VIRUS LINFOTROPICO T HUMANO TIPO 1 (HTLV-1) EN CASOS POSITIVOS DE ARGENTINA JP Salido1, ME Eirin2, CB Cánepa1, G Pataccini1, M Ruggieri1, S Fraile1, M Carobene1, MM Biglione1, C Berini1 1 Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (INBIRS), UBA-CONICET, Argentina. 2 Laboratorio de Tuberculosis Bovina, Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA-Castelar, Argentina. El HTLV-1 es el agente etiológico de la Leucemia/Linfoma a Células T del Adulto (ATL) y de la Mielopatía asociada al HTLV-1 (HAM/TSP). La proteína Tax es un factor viral crítico para la activación genómica, la expresión de genes virales, como así también para la transformación celular. El objetivo de este estudio consistió en analizar la presencia de polimorfismos nucleotídicos en Tax en casos HTLV-1 positivos provenientes de diferentes regiones de la República Argentina. Se analizaró un total de 85 muestras, 10 de ellas pertenecientes a individuos Kollas de Jujuy y 75 residentes de la provincia de Buenos Aires (BA). Estas últimas incluyeron 54 muestras de individuos asintomáticos y 21 de pacientes de servicios de hematología y neurología. A partir del ADN obtenido de CMSP se realizó la amplificación del gen tax mediante una hemi-nested-PCR (1058pb), la misma fue secuenciada, editada y alineada. Como secuencia de referencia se usó la ATK-1. Las secuencias nucleotídicas fueron luego traducidas a aminoácidos y a partir de ellas se identificaron mutaciones no sinónimas en los dominios funcionales de la proteína. Se detectaron mutaciones puntuales en todas las secuencias analizadas. La variación media de la de los Kollas fue de 5,2 ± 0,5, semejante a la de los portadores asintomáticos residentes de BA (6,2 ± 1,5) y significativamente menor que la de individuos con patología (6,9 ± 2; p>0,05). Las mutaciones detectadas se registraron en los dominios de localización nuclear; LZR (Leucine Zipper Region); de dimerización y activación de NF-kB; en la señal de exportación nuclear, entre otras, en individuos asintomáticos y con patologías. En secuencias obtenidas de Kollas de Jujuy se encontraron dos polimorfismos (T7914C and C7982T), ausentes en las de BA, sin impacto en la estructura aminoacídica de la proteína. Además, se hallaron dos mutaciones (A221V y F304N) presentes tanto en las secuencias de los Kollas como en las de los residentes de BA. La primera en los dominios de dimerización y de activación del factor celular NF-kB de la región central de la proteína, y la segunda en el extremo carboxi-terminal, en una región a la cual no se le han asignado función por el momento. Si bien no se puede establecer asociación entre mutaciones determinadas y patologías, estos resultados corroboraron la presencia de diferentes polimorfismos en la proteína Tax posiblemente, alguna de ellas relacionadas con el origen étnico. 0301 PRIMERA CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO EN LA PROVINCIA DE CORRIENTES EN LOS AÑOS 2013 Y 2014. N Ruiz Diaz1 2, G Andino1 2, J Benegui1, M Coceres1, J Espinoza1 1 Laboratorio Central de Redes y Programas. Ministerio de Salud Pública de la Provincia de Corrientes, Argentina. 2 Cátedra “Virología Clínica” Carrera de Bioquímica. FaCENA. UNNE., Argentina. Resumen Las infecciones respiratorias por Virus sincitial respiratorio (RSV) constituyen un problema en salud, ya que representan la primera causa de internación en los meses de invierno con una elevada morbimortalidad en niños menores de 5 años. Se presenta generalmente como una bronquiolitis, cuya gravedad puede depender del huésped, del virus y/o ambiente. Objetivo: El objetivo del estudio fue confirmar por primera vez la circulación de los subtipos A y B del RSV, en niños menores de 5 años hospitalizados durante los años 2013 y 2014, en la provincia de Corrientes. Materiales y métodos: se realizó un estudio descriptivo retrospectivo, en el que se analizaron 100 ARN (50 correspondientes a cada periodo analizado) extraídos por columna comercial de muestras de aspirados e hisopados nasofaríngeos, de niños hospitalizados entre 0 a 5 años previamente positivos por IFD, correspondientes a los años 2013 y 2014. Los ARN fueron mantenidos a – 70° C hasta su procesamiento y fueron analizadas por la técnica de RT-PCR en tiempo real múltiplex para los subtipos A y B, estandarizado en el laboratorio Virología molecular. Resultados: La frecuencia del VRS por inmunofluorescencia directa(IFD), fue del 47% y 27%, para una población de niños menores de 5 años, durante 2013 y 2014 respectivamente. Analizando en forma individual cada periodo, de las 50 muestras estudiadas por la técnica molecular se hallaron para el 2013, 40 (80%) muestras positivas para el subtipo A y 9 (18%) para el subtipo B, no observándose infección mixta para este periodo. Para 2014, 37 (74%) fueron positivas para el subtipo B y 8 (16%) para el subtipo A; observándose la presencia de ambos subtipos en 4 pacientes. Dos muestras resultaron negativas, una en cada periodo. Conclusión: los datos arrojados por el presente trabajo permiten confirmar por primera vez la circulación de los subtipos A y B, en población pediátrica menor a 5 años, en la provincia de Corrientes. Si bien la cohorte estudiada es acotada a un pequeño número de muestras, esto permitió demostrar por medio del análisis molecular que los subtipos A y B del RSV cocircularon durante el período analizado, encontrándose una mayor prevalencia del subtipo A sobre el B en el año 2013, de forma inversa en el 2014, percibiéndose además en este ultimo la presencia de infecciones mixtas. El presente estudio pretende sentar las bases de la epidemiología molecular de VRS, entendiendo que la misma contribuye a un mejor conocimiento de la circulación del mismo y permite establecer parámetros de importancia, dándole un rol fundamental al laboratorio de Virología en la vigilancia molecular en la provincia. Es preciso realizar nuevos estudios con poblaciones más grandes, con el fin de determinar si existen diferencias estadísticamente significativas en cuanto a la severidad de la infección y la edad de los pacientes, debidas a los subtipos A y B. 0309 DISTRIBUCION DE GENOTIPOS DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO EN MUJERES CON DIAGNOSTICO CITOLOGICO DE ATIPIAS ESCAMOSAS DE SIGNIFICADO INDETERMINADO (ASC-US) SL Gomez1, JP Sanchez Lancheros1, LT Ortiz Velasquez1, ML Guerrero Caicedo1, J Amaya2, LP Diaz1, H Vargas1 1 Laboratorio de Salud Publica- Secretaria de Salud de Bogota, Colombia. 2 Hospital de Engativa, Colombia. INTRODUCCIÓN. ASC-US no establece un diagnóstico determinante frente a la patología cervical pero pone en evidencia, algunos cambios transitorios del epitelio entre ellos la infección por Virus de Papiloma Humano (VPH) que pueden potencializar la evolución a lesiones intraepiteliales y cáncer. OBJETIVO: Establecer el perfil epidemiológico 64 Libro de resúmenes de la infección genital por Virus del Papiloma Humano (VPH) en un grupo de mujeres con diagnóstico de ASC-US de Bogotá. MATERIALES Y MÉTODOS: fueron tamizados por Linear Array 200 frotis de mujeres (17-63 años) con diagnóstico de ASC-US remitidas a valoración colposcópica captados por un hospital de la red pública de Bogotá durante el 2014. RESULTADOS: Prevalencia global de VPH 70% (140/200), 57% (80/140) infecciones múltiples, 47%, 16% y 37% infección tipos VPH alto, bajo y mixtos (alto-bajo) riesgo respectivamente. Los tipos de VPH de mayor prevalencia en el estudio fueron: ¨VPH16 (26,4%); VPH53 (16,4%), VPH52 (13,6%); VPH58 (12,9%); VPH59 (12,1%). CONCLUSIÓN: Carcaterización epidemiológica de los tipos de VPH en mujeres con ASC-US permite el establecimiento de algoritmos unificados asociados a la atención integral de la patología cervical de igual forma permite el fortalecimiento del programa de atención y control de cáncer cervical. 0313 ESTUDIO DE LA INFECCIÓN PERSISTENTE DE PAPILOMAVIRUS HUMANOS CON TROPISMO CUTÁNEO EN INDIVIDUOS SANOS DE LA CIUDAD DE ROSARIO, SANTA FE, ARGENTINA. D Chouhy1 2, EM Bolatti1, PE Casal2, EJ Stella1, AA Giri1 2 1 Instituto de Biología Celular y Molecular de Rosario CONICET, Argentina. 2 Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas Universidad Nacional de Rosario, Argentina. Los papilomavirus (PV) son virus pequeños y sin envoltura que se encuentran asociados a infecciones de epitelios mucosos y cutáneos de una amplia variedad de especies de reptiles, aves y mamíferos. Hasta el momento se han identificado y secuenciado completamente 204 tipos de PV que infectan epitelios en humanos (HPV). Además, existen más de 200 potenciales tipos nuevos de HPV (tipos potenciales), en su mayoría en piel, de los que sólo se conoce un pequeño fragmento de su genoma y se ignoran las implicancias clínicas de sus infecciones. Los HPV cutaneotrópicos presentan mayor heterogeneidad genética que los mucosotrópicos y están distribuidos en 5 géneros diferentes (α-, β-, γ-, µ- y η-PV) en la familia Papillomaviridae. La epidemiología de sus infecciones es poco entendida, existiendo pocos estudios de persistencia de la infección de HPV en epitelios cutáneos descriptos en la bibliografía, tanto en lesiones como en piel sana y ninguno se ha realizado hasta ahora en Argentina. Con el fin de determinar las características de la infección por HPV en piel sana en relación a los niveles de exposición UV, se analizó el estado de infección por HPV en un área de piel expuesta a la luz solar (frente) de 78 individuos sanos (edad media: 39 años rango etario: 23-63 años, 55 mujeres y 23 hombres) durante 1 año. Se tomaron 3 muestras con hisopo por voluntario (total de muestras): al inicio de la primavera, al final del verano y al final del invierno. La presencia y tipo de HPV se determinó mediante “PCR de gota colgante” con 2 sistemas de cebadores diferentes: FAP y CUT-EXTED. El 90% (70/78) de la personas resultó positiva para HPV en al menos una de las muestras y con al menos uno de los dos sistemas. El 67% (52/78) de los voluntarios fueron positivos para HPV al inicio de la primavera, pero ésta positividad disminuyó al final del verano e invierno con un 51% (40/78) y un 54% de voluntarios positivos para HPV, respectivamente. El 52% (43/78) de los voluntarios resultaron positivos en al menos dos de los períodos analizados. Sólo 8 de los 78 voluntarios fueron negativos para la infección por HPV en las tres muestras mientras que la mayoría (90%) estuvo infectado con uno o más tipos de HPV durante el período de estudio. Este resultado demuestra que los HPV pueden propagarse fácilmente entre los individuos y causar infecciones sin inducir ningún daño en el tejido. Utilizando la técnica de PCR altamente sensible para fragmentos largos, se amplificó y caracterizó el genoma completo de uno de los nuevos tipos potenciales identificados en este estudio. El nuevo virus (EP01) comparte un 85% de identidad nucleotídica en el ORF L1 con el HPV173 (γ-1) y ha sido enviado al International Human Papillomavirus Reference Center (Karolinska Institute, Estocolmo, Suecia) para su confirmación y denominación oficial. El descubrimiento de nuevos HPV expande el conocimiento sobre la diversidad, evolución e implicancias clínicas de la familia Papillomaviridae. 0329 EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE VIRUS RESPIRATORIOS EN BOGOTA A TRAVÉS DE LA VIGILANCIA CENTINELA DE ENFERMEDAD RESPIRATORIA AGUDA, UNA MIRADA DESDE 2010. L Gómez1, L Díaz1, A Díaz1, Y Gónzalez1, M Díaz1, P Arce2, H Vargas1 1 Grupo de Laboratorio de Salud Pública. Secretaría de Salud de Bogotá, Colombia. 2 Vigilancia Salud Pública. Secretaría de Salud de Bogotá, Colombia. INTRODUCCIÓN. Actualmente se realiza la estrategia de vigilancia epidemiológica tipo centinela en Infección Respiratoria Aguda, para detección de virus. El desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico como son las pruebas moleculares, permite identificar con mayor sensiblidad los virus de notificación obligatoria y la detección de nuevos virus. Este estudio buscó identificar los 7 virus de notificación obligatoria y los llamados emergentes como Metapneumovirus, Bocavirus, Rinovirus y Coronavirus, entre otros que se han reportado a nivel mundial estan involucrados en casos de IRA, teniendo en cuenta que en Bogotá- Colombia no se tiene conocimiento de su circulación. OBJETIVO. Establecer el perfil epidemiológico de los virus respiratorios, por medio de nuevas metodologías diagnósticas durante tres años del programa de vigilancia centinela para Infección Respiratoria Aguda. MATERIALES Y MÉTODOS. Estudio descriptivo retrospectivo, con análisis de muestras de los años 2010, 2012 y 2014, recibidas por medio de la estrategia de vigilancia centinela, con criterios de caso para Infección Respiratoria Aguda Grave. RESULTADOS. 925 muestras fueron analizadas, el mayor porcentaje fue del año 2010 con 434 (46,9%). El 25,6% de las muestras fueron negativas (n=237), mientras la positividad se observó en el 74,3% (n=688). Los virus de notificación obligatoria por las nuevas técnicas fueron detectados en el 81,2% (n=559), de las muestras y los virus emergentes en el 41,2% (n=284). El 34,3% (n=236) se presentaron como coinfecciones. El virus de notificación más frecuente fue el Sincitial Respiratorio A en el 31,2% (n=215), de los emergentes ocupa el Bocavirus el primer lugar con 22,3% (n=154). Las semanas 14, 19 y 15, evidenciaron la mayor positividad para los años 2010, 2012 y 2014, respectivamente. CONCLUSIONES. El seguimiento en los tres años permitió identificar el comportamiento de los virus respiratorios para la implementación de nuesvas estrategias de manejo de la infección respiratoria en el distrito. 0331 CORREDOR ENDÉMICO DE VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO EN NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS L López, P Miceli, E Langan, I Mirayes, C Aranda Hospital General de Agudos "Dr. Carlos G. Durand", Argentina. Introducción: Un corredor endémico es una herramienta de vigilancia epidemiológica. Constituye una representación gráfica de la incidencia actual sobre la histórica y permite detectar precozmente cifras anormales de casos de la enfermedad en estudio. La infección por virus sincicial respiratorio (VSR) puede ser vigilada por esta metodología ya que es una entidad endémica, de incubación breve y evolución aguda. Es la causa más importante de enfermedad del tracto respiratorio en infantes y niños. A la edad de 5 años la mayoría de los niños ha experimentado infección por este virus al menos una vez en la vida. Objetivos: Confeccionar el corredor endémico semanal de infección respiratoria aguda baja (IRAB) por virus sincicial respiratorio en niños de 0 a 5 años de edad internados en nuestra institución en el período 2007 a 2013. Determinar el patrón de presentación de VSR en 2014. Metodología: Se realizó un estudio epidemiológico descriptivo. Se incluyeron 3541 muestras de secreciones respiratorias de niños menores de 5 años internados por IRAB entre 01/01/2007 y 31/12/2014. Para el diagnóstico virológico se utilizó inmunofluorescencia directa e indirecta. Los resultados se volcaron en la planilla de Notificación Agrupada del SIVILA semanalmente y se exportaron a un archivo de Excel. De acuerdo con la metodología descripta por Bortman para la elaboración de corredores endémicos, se calcularon tasas de incidencia, media geométrica, desvío estándar e intervalo de confianza de 95%, y se confeccionaron los gráficos de áreas que definen 4 zonas: éxito, seguridad, alarma y epidemia o brote. Resultados: El promedio del porcentaje de detección de virus respiratorios para el período fue 40,7% (33.5 - 47.6%). El 66.7% (56.8 – 65 Libro de resúmenes 75.4%) de los positivos correspondió a VSR. Se confeccionó el corredor endémico de VSR que presentó patrón epidémico estacional con mayor actividad entre las semanas epidemiológicas (SE) 17 a 33. En 2014 la incidencia de VSR transcurrió mayormente por zona de alarma y se mantuvo dentro de los rangos de fluctuación normal. Se detectó circulación viral desde la SE 8 hasta la 40. A partir de la SE 15 se observó un incremento gradual de casos hasta la semana 23 en que se registró el máximo, superando la zona de seguridad del canal endémico. Conclusión: La circulación de VSR para 2014 pudo ser vigilada a nivel local en tiempo real. Contar con un corredor endémico confeccionado con la población de nuestro hospital permite identificar tempranamente posibles brotes e implementar medidas de prevención y control en el área de influencia y en el ambiente hospitalario. 0336 EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE LA INFECCIÓN DE PAPILOMAVIRUS HUMANOS EN LESIONES DE LA MUCOSA ORAL/NASAL EJ Stella1, EM Bolatti1, D Chouhy1 2, PE Casal2, G Rulloni3, AL Nocito4, AA Giri1 2 1 Instituto de Biología Celular y Molecular de Rosario CONICET, Argentina. 2 Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas Universidad Nacional de Rosario, Argentina. 3 Servicio de Otorrinolaringología, Hospital Provincial del Centenario, Argentina. 4 Cátedra de Anatomía Patológica, Facultad de Ciencias Médicas (UNR), Argentina. Los papilomavirus humanos (HPVs) son un grupo heterogéneo de virus sin envoltura y con genoma de ADN doble hebra circular de aproximadamente 8 kpb. Hasta el momento se han caracterizado más de 200 tipos de HPVs, distribuidos en 5 géneros diferentes (α-, β-, γ-, µy η-PV) en la familia Papillomaviridae. Un grupo de ellos vinculados a infecciones de mucosas (α-PV) son considerados los agentes causantes de canceres cervicales, anogenitales y orofaríngeos. Se asume que los HPV reflejan el tropismo tisular de donde fueron aislados originalmente. Sin embargo, estudios recientes demuestran que la cavidad oral contiene un amplio espectro de tipos de los géneros β-PV y γ-PV que originalmente fueron considerados cutaneotrópicos. Nos propusimos conocer la epidemiología de la mucosa oral y respiratoria de pacientes con lesiones benignas y malignas con el sistema L1HPVPCR que combina la amplificación con cebadores MY09/11, hibridación líquida con sondas específicas para 16 HPV mucosos y detección colorimétrica. Para ello se reclutaron 65 pacientes (edad media: 45 años; rango: 3-76 años; 51 hombres y 14 mujeres) que concurrieron al Servicio de Otorrinolaringología del Hospital Provincial del Centenario por presentar lesiones en la cavidad oral/nasal (cuerdas vocales, fosas nasales, amígdalas, laringe). La prevalencia de la infección por HPV fue del 26% (17/65). El tipo más prevalente fue el HPV-6 (6/65), seguido por los tipos 16, 18 y 35 (2/65 cada uno). Las biopsias fueron agrupadas según el diagnóstico histológico en 4 categorías: A) procesos inflamatorios negativos para neoplasias, B) presencia de coilocitos y displasia, C) carcinomas in situ e infiltrantes y D) lesiones malignas no epiteliales. La mayor frecuencia de infección por HPV se encontró en la categoría B (4/5, 80%), seguida por la C (6/25, 24%) y la A (7/31, 23%). La categoría D fue negativa para HPV en los 4 pacientes incluidos. En conclusión, la concordancia obtenida entre la metodología molecular y la histología confirma el rol de la infección con ciertos tipos en el desarrollo de patologías tradicionalmente asociadas al virus. En contraste, el desarrollo de neoplasias malignas (C) podría estar relacionado a la exposición a otros factores de riesgo (alcohol y/o tabaco). Se encuentran en curso los experimentos con otros cebadores para identificar un mayor espectro de tipos de HPV para hacer un análisis exhaustivo de la epidemiología de HPV en mucosa oral/nasal. 0346 DETECCION Y CARACTERIZACION MOLECULAR DE AICHIVIRUS A PARTIR DE AGUAS RESIDUALES VOLCADAS SIN TRATAMIENTO AL RIO URUGUAY, URUGUAY LFL Tort1, L Burutarán1, M Victoria1, M García1, A Lizasoain1, M Miagostovich2, JPG Leite2, R Colina2 1 Laboratorio de Virología Molecular, Regional Norte, CENUR Litoral Norte, Universidad de la República, Salto, Uruguay. 2 Laboratorio de Virología Comparada y Ambiental, Instituto Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasil. Los Aichivirus (AiV) pertenecen al género Kobuvirus, de la família Picovirnaviridae, y se han descrito tres genotipos de AiV capaces de infectar humanos: A, B y C. AiV es un virus entérico humano con una prevalencia global entre 0,9 y 4,1% en casos esporádicos de gastroenteritis, y también ha sido detectado en aguas superficiales ambientales. El objetivo del presente estudio fue evaluar la contaminación con AiV de aguas residuales que son descargadas al Rio Uruguay sin tratamiento previo. Con este propósito, fueron realizadas colectas quincenales de Marzo del 2011 Febrero del 2012 en cuatro ciudades uruguayas localizadas en el litoral noroeste del país (n = 96): Bella Unión, Salto, Paysandú y Fray Bentos. Las muestras fueron concentradas por un método de ultracentrifugación, para luego realizar la extracción de ARN del concentrado viral, y a partir del ARN extraído fue realizada una RT-PCR anidada direccionada a la región 3CD del genoma de AiV. Las muestras positivas por RT-PCR fueron secuenciadas, y a partir de las mismas fue realizado un análisis filogenético para determinar el genotipo de AiV. Fue observada una gran diseminación de AiV en las muestras de aguas residuales analizadas, con una positividad de 57,3%, siendo detectado en una alta prevalencia en las cuatro ciudades analizadas. No se detectó una estacionalidad marcada, sin embargo, fue observada una positividad mayor en las estaciones más frías de año (otoño e invierno). El análisis filogenético mostró que todas las muestras analizadas pertenecieron al genotipo B. El presente estudio representa la primera detección de AiV en nuestro país; y muestra un potencial riesgo de infección con este virus de las poblaciones localizadas sobre el Rio a través de: i) actividades recreacionales (deportes acuáticos, zonas de playa, pesca, etc), ii) riego de frutas y vegetales, así como iii) el consumo de agua del Rio Uruguay, al cual son vertidas estas aguas residuales sin previo tratamiento. 0351 DISTRIBUCIÓN TEMPORAL DE LOS SEROTIPOS DEL VIRUS DENGUE (DENV) EN UN AREA HIPERENDÉMICA DE COLOMBIA DEL 2001 AL 2012. A Bonelo, J Gonzalez, L Osorio, B Parra Universidad del Valle, Colombia. Introducción: La infección por virus dengue (DENV) es la arbovirosis más frecuente en el mundo. Existen 4 serotipos del DENV, y la circulación simultánea de ellos en una región aumenta el riesgo de gravedad asociada a la ocurrencia de infecciones secundarias. La ciudad de Cali, al suroccidente colombiano, es una zona hiperendemica para dengue, con un aumento marcado en el numero de casos en la ultima década y epidemias importantes en el 2002, 2009-2010 y 2013. Objetivos: El objetivo del estudio fué describir la cronología de circulación de los serotipos de DENV en Cali y su relación con la incidencia de casos, desde el 2001 a 2012. Métdología: Se estimó la frecuencia de cada uno de los serotipos virales por mes y año en 381 casos de la enfermedad, confirmados por RT-PCR o aislamiento viral. La información se obtuvo retrospectivamente de estudios en sujetos con sindrome febril sospechosos de dengue. La frecuencia de circulación de cada serotipo por mes se expresó como un porcentaje del total de aislamientos del mismo serotipo para el año correspondiente. La incidencia de dengue se obtuvo del sistema de vigilancia en salud pública de la ciudad. Resultados: Se obtuvieron aislamientos desde noviembre del 2001 hasta diciembre de 2012, exceptuando el 2003, 2009 y 2011. En el 2001 y 2002 predominó DENV-4 (57.6% y 47.1%) y en menor proporción DENV-2 seguido por DENV1. En 2004 se identificó por primera vez después de 30 años, el DENV-3 (77.8%), el cual desplazó en frecuencia al DENV-4 y se mantuvo por tres años consecutivos hasta el 2006 como el serotipo más frecuentemente aislado. DENV-1 se identificó excepcionalmente desde Mayo del 2002 hasta mayo del 2005. En el 2007, año de baja incidencia de dengue, circularon todos los 4 serotipos en una proporción similar. En 2008 y los dos primeros meses del 2010 se identificó casi exclusivamente DENV-1 y el resto del año se aisló DENV-2 y DENV-4; siendo éste un periodo epidémico. Para 2012, el 66 Libro de resúmenes serotipo predominante y casi exclusivo fué DENV2 (87.9%), el cual no tuvo predominio en ningun año de la década anterior. Conclusiones: En conclusión, del 2001 a 2012 circularon los 4 serotipos de DENV, con circulación anual simultanea de 2 o más. Sin embargo, uno solo de los serotipos fue el predominante por periodos continuos de dos a tres años. La secuencia de los serotipos más frecuentes fue DENV-4, seguido de DENV-3, luego DENV- 1 y finalmente DENV-2. Basados en estos resultados, se esperaria que en los años siguientes al 2012 los serotipos predominantes fueran DEN-4 o DENV-3. Las epidemias con mayor numero de casos en Cali hasta el 2012 coinciden con la circulación de los serotipos DENV-4 (epidemia 2002), DENV-1 (epidemia 2009-2010). Este ultimo brote, fue precedido por un periodo de 4 a 5 años de mínima circulacion del DENV-1, serotipo responsable de la epidemia. La ocurrencia de epidemias podría ser explicada por la acumulación de susceptibles a un serotipo del DENV. 0357 PREVALENCIA HISTORICA DE LA INFECCION GENITAL POR VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (VPH) EN MUJERES ATENDIDAS POR EL PROGRAMA DE PROMOCION Y PREVENCION DE CANCER DE CUELLO UTERINO EN BOGOTA-COLOMBIA H Vargas1, SL Gomez1, LP Diaz1, D Rodriguez-Hernandez1, E Teusaba2, S Salamanca3, P Arce5 6, L Torres de la Hoz5 1 Laboratorio de Salud Publica-Secretaria de Salud de Bogota-Colombia, Colombia. 2 Laboratorio PATOLAB LTDA. Clinica de la Mujer, Colombia. 3 GINESALUD IPS, Colombia. 5 Coordinacion del Programa Distrital Ampliado de Inmunizaciones-Secretaria de Salud de Bogota, Colombia. 6 Subdireccion de Vigilancia Epidemiologica. Secretaria de Salud de Bogota, Colombia. Introducción En Colombia, el ministerio de salud incluyo dentro del programa ampliado de inmunizaciones la vacuna cuadrivalente con el VPH en agosto del 2012 para niñas escolarizadas de 9 a 20 años y no escolarizadas de 9 a 17 años. Por otro lado, los sistemas de detección del Virus del Papiloma Humano (VPH) capaces de identificar la presencia de alguno de los tipos virales, ha permitido la caracterizacion epidemiologica de los tipos de VPH que circulan en mujeres sexualmente activas que le permite a instituciones rectoras de salud diseñar indicadores epidemiologicos de seguimiento y/o fortalecer estrategias asociadas a la prevención y control de la patología cervical a nivel local. Objetivo: Establecer la prevalencia histórica de la infección genital por VPH y su posible asociación con ciertos factores de riesgo en muestras embebidas en parafina (MEP) de mujeres con histología confirmada de lesión intraepitelial escamosa de alto grado (LIE-AG) y cáncer cervical (CC) diagnosticadas en Bogota durante el 2010-2014. Materiales y métodos: En este estudio descriptivo-retrospectivo fueron analizadas, las muestras embebidas en parafina de 2092 mujeres de régimen vinculado y subsidiado con diagnostico confirmado de lesión intraepitelial escamosa de alto grado (LIE-AG) y cáncer cervical (CC) las cuales fueron diagnosticadas en el Laboratorio Centralizado de Citopatología Cervical de Bogota y el Laboratorio de Patologia-Patolab. La extraccion de ADN se realizó usando el Kit QIAamp DNA FEPE Tissue Kit (Qiagen) y luego se procedió a la amplificación, hibridación y revelado de los 37 tipos de VPH usando la técnica Linear Array (Roche). Resultados: La prevalencia puntual de la infección por VPH fue del 34,5% (n=721) entre todas las muestras analizadas, identificándose 37 genotipos diferentes de VPH, de los cuales 14 fueron de alto riesgo (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68) y 23 de bajo riesgo (6, 11, 26, 40, 42, 53, 54, 55, 61, 62, 64, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39 y CP6108). La distribución general de los genotipos más frecuentes en mujeres positivas para VPH de alto riesgo fue VPH 16 (43%), VPH 58 (13%), VPH 52 (11,4%), VPH 31 (8,9%) y VPH 18 (8,3%) y en el caso de los genotipos de VPH de bajo riesgo fue VPH 53 (8,2%), VPH 61 (3,6%), VPH 6 (3,2%), VPH 70 y VPH 62 cada uno con 2,9%. En cuanto al régimen de afiliación, en las pacientes evaluadas el 2,9% pertenecen al Contributivo, el 38,9% al Subsidiado y el 52,3% al Vinculado, el 5,9% restante no presentó dato de afiliación. Conclusion: Con la información obtenida se logró establecer los tipos de VPH presentes en la población femenina del Distrito Capital antes y despues de la introduccion masiva de la vacuna de VPH en Bogota. 0382 EVIDENCIA DE LA CIRCULACION DEL VIRUS DE LA HEPATITIS A Y DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E EN MUESTRAS AMBIENTALES EN EL DEPARTAMENTO DE ANTIOQUIA, COLOMBIA PA Baez1, CM Jaramillo1, L Arismendi2, JC Rendón1, F Cortés-Mancera1 3, M Toro1, D Pelaez4, MM González5, F Molina2, MC Navas1 1 Grupo de Gastrohepatología, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia. 2 GAIA, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia, Colombia. 3 Grupo de Investigación e Innovación Biomédica GI2B, Instituto Tecnológico Metropolitano, Medellín, Colombia. 4 Instituto Nacional de Salud, Bogotá D.C, Colombia. 5 Universidad del Quindío, Armenia, Colombia. La hepatitis viral de transmisión entérica es una causa importante de morbilidad y mortalidad a nivel global. Colombia presenta un patrón de endemicidad intermedia para la infección por el Virus de la Hepatitis A (VHA). Con respecto a la epidemiología de la infección por Virus de la Hepatitis E (VHE) en el país, la información disponible es muy limitada. Se planteó un estudio con el fin de determinar la presencia de VHA y VHE y los genotipos circulantes en muestras de agua de 9 municipios del departamento de Antioquia, Noroccidente de Colombia. De Diciembre/2012 a Mayo/2013 se realizó un muestreo seriado (3 muestras) de la fuente principal de abastecimiento del acueducto (AA) y de los sitios de descarga de agua residual (AR) de cada municipio. Las muestras se obtuvieron en periodos con diferente grado de pluviosidad. Las muestras fueron concentradas por filtración/ultrafiltración tangencial (AA) y por las técnicas de Polietilenglicol y floculación con leche descremada (AR). Luego se realizó extracción del ARN viral y se amplificó por RT-PCR la región VP3-VP1 de VHA para detección y por nRT-PCR la región VP1-2B para genotipificación. La detección y genotipificación de VHE se realizó mediante amplificación por nRT-PCR de la región ORF2/3. Durante el primer muestreo se detectó el genoma del VHA en AA del corregimiento Nutibara (quebrada La Golondrina) y del municipio de Puerto Berrío (río Magdalena); en AR el VHA se detectó en Arboletes, Zaragoza y Venecia. Este hallazgo coincidió con el reporte casos de hepatitis A en el mismo periodo en 4 de estos municipios. En el segundo muestreo, solo 1 espécimen fue positivo (AR en Frontino), municipio que también tuvo reporte de caso de hepatitis A en este periodo. Todos los especímenes del 3er muestreo fueron negativos por RT-PCR. Mediante el análisis de las secuencias (MEGA 5.2) se identificó el genotipo IA de VHA en 4 muestras. El genoma del VHE fue detectado en las muestras de AA de los municipios de Granada, Zaragoza y Puerto Berrío (1er muestreo); San Pedro de los Milagros, Granada y Frontino (2do muestreo) y Girardota, vereda San Andrés, (3er muestreo). En las muestras de AR se detectó el VHE en San Pedro de Los Milagros, Venecia y Cisneros (primer muestreo); Zaragoza y San Pedro de Los Milagros (tercer muestreo). El genotipo 3 del VHE fue identificado en 3 de las muestras de AR (MEGA 5.2). La presencia del VHA en AA implica un riesgo de infección para las comunidades sin planta de potabilización, como es el caso del corregimiento de Nutibara. Se reporta por primera vez la circulación del genotipo IA/VHA en muestras ambientales en Antioquia. El VHE genotipo 3 ha sido reportado previamente en pacientes en Medellín; este genotipo se ha relacionado con casos de zoonosis en Latino América y en países industrializados. Es de anotar que Antioquia es el principal productor de ganado porcino en Colombia, y en particular los municipios de San Pedro de Los Milagros y Cisneros. 0383 IDENTIFICACIÓN MOLECULAR Y ANÁLISIS GENETICO DE POXVIRUS EN LESIONES DE PIEL DE BALLENA FRANCA AUSTRAL, EUBALAENA AUSTRALIS C Fiorito1 2, CA Palacios3 4, MD Golemba5, A Bratanich3, M Bertellotti1, D Lombardo2 1 Centro Nacional Patagónico, CONICET, Puerto Madryn, Chubut, Argentina. 2 Laboratorio de Histología, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires, Argentina. 3 Laboratorio de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires, Argentina. 4 Centro de Virología Animal, Instituto de Ciencia y 67 Libro de resúmenes Tecnología Dr. Cesar Milstein, CONICET, Buenos Aires, Argentina. 5 Laboratorio de Biología Celular y Retrovirus, Hospital de Pediatría S.A.M.I.C. "Prof. Dr. Juan P. Garrahan", Buenos Aires, Argentina. Enfermedades ocasionadas por infecciones con diferentes patógenos, incluyendo poxvirus, son indicadoras de la salud de cetáceos. Distintos trabajos realizados sobre la ballena franca austral (Eubalaena australis) estudiada en Península Valdés, muestran una variedad de lesiones epiteliales de etiología desconocida, y el número de estas lesiones ha ido en aumento en lo últimos años. Con el objetivo de analizar las causas de estas lesiones, se tomaron muestras de ballenas muertas. Durante las campañas de muestreo realizadas en el año 2012 y 2013, dos de los individuos analizados, uno joven y otro adulto, presentaban lesiones circulares, caracterizadas por un área circunscripta por un borde elevado de piel. Las lesiones se caracterizaron histológicamente, observando microvesículas y células vacuoladas presentes en el estrato intermedio, junto con hiperplasia del estrato externo, acompañado de cuerpos de inclusión en el citoplasma de células epiteliales. Por medio de microscopía electrónica, se observaron agregados intracitoplasmáticos de viriones con una morfología compatible con poxvirus. Estas muestras fueron procesadas para la extracción de ADN, a fin de realizar la caracterización molecular de poxvirus de cetáceos (CPV). Para esto, se amplificaron por PCR fragmentos de ADN polimerasa y ADN topoisomerasa I de CPV, y como control un fragmento de la ADN polimerasa de parapoxvirus. Molecularmente se confirmó la presencia de CPV, y el análisis filogenético muestra que los virus detectados en ballena franca austral pertenecen al grupo CPV del tipo 2 (CPV-2). Este es el primer reporte que confirma la presencia de infecciones ocasionadas por CPV-2 en ballena franca austral. La presencia de infecciones ocasionadas por poxvirus puede ser uno de los indicadores que asocian, problemas de salud en estos cetáceos, con a la degradación del medioambiente por actividades antropogénicas. 0385 CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE VIRUS DE INFLUENZA A H1N1PDM CIRCULANTES EN URUGUAY MEDIANTE SECUENCIACIÓN MASIVA V Comas1, M Soñora1, A Fajardo1, P Moreno1, M Moratorio2, J Cristina1 1 Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias (UDELAR). Iguá 4225, 11400 Montevideo, Uruguay. 2 Laboratorio de Poblaciones virales y patogénesis, Departamento de Virología, Instituto Pasteur. 25 Rue du Docteur Roux, 75015 Paris, Francia. La gripe es una enfermedad de gran trascendencia a nivel de salud pública, ya que es la principal causa de muerte por infecciones respiratorias en humanos, presentando tasas de mortalidad anual de entre 250 a 500 mil casos a nivel mundial. El agente etiológico de esta enfermedad es el virus de la influenza A (VIA), virus perteneciente a la familia Orthomixoviridae. Como la mayoría de los virus cuyo genoma está compuesto por ARN estos virus presentan elevadas tasas de mutación, por lo que estos virus circulan como complejas poblaciones virales constituidas por múltiples variantes genéticamente relacionadas, denominadas cuasiespecies. Esta característica le permite al virus evolucionar y adaptarse a nuevos ambientes y hospederos, representando blancos móviles para la intervención terapéutica, evolucionando hacia la resistencia a vacunas y drogas antivirales. La caracterización de las variantes epidémicas, debido a cambios en HA y NA, es de suma importancia a la hora de la formulación vacunal, así como para la vigilancia de cepas resistentes a drogas antivirales. El objetivo del presente trabajo es profundizar en la vigilancia de las cepas H1N1pdm que circularon en nuestro país entre los años 2009 y 2013, realizando una detallada caracterización de la diversidad poblacional mediante secuenciación masiva y evaluar la relación de éstas con la cepa vacunal así como posibles marcadores de resistencia a los antivirales. Con este fin se analizaron 25 muestras de pacientes positivos para VIA H1N1pdm (5 del año 2009 y 15 del año 2011 y 5 del año 2013). Se realizó la extracción del ARN y se amplificaron por RT-PCR los genes HA y NA. Los productos fueron purificados y secuenciados para su identificación y posteriores análisis filogenéticos. Posteriormente se utilizarón 18 de estos amplicones (9 HA y 9 NA) y se realizó la secuenciación masiva en la plataforma MiSeq de Illumina y posterior análisis con el pipeline Viral Variance Analysis (ViVan). Los análisis filogenéticos para ambos genes mostraron una relación genética distante entre la cepa vacunal y las cepas analizadas para todos los años estudiados. Asimismo, difirieron de la cepa vacunal en varias posiciones aminoacídicas. La mayoría de éstas sustituciones se localizaron en la superficie de las proteínas y para el caso de NA, las mismas no interfieren con el sitio activo de la enzima. Si bien en las secuencias consenso no se identificaron marcadores de resistencia a los antivirales actuales, los datos de secuenciación masiva permitieron la identificación de variantes minoritarias para algunos de estos marcadores en cinco de las nueve muestras analizadas. Además los datos mostraron una gran diversidad en distintas posiciones relacionadas a epítopes de superficie. La continua vigilancia de las cepas circulantes a través de métodos de secuenciado profundo es de suma importancia para identificar variantes minoritarias que podrían poseer la capacidad de emerger frente a diferentes presiones selectivas. 0386 VARIABILIDAD GENETICA DE LAS REGIONES NS3 Y NS5B DEL GENOMA DE HEPATITIS C EN PACIENTES URUGUAYOS: SU IMPORTANCIA A LA HORA DE LA UTILIZACIÓN DE DROGAS ANTIVIRALES DIRECTAS N Echeverria1, G Betancour1, S Boschi2, R Uriarte2, J Cristina1, P Moreno1 1 Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República Oriental del Uruguay, Uruguay. 2 Laboratorio de Biología Molecular, Asociación Española Primera de Socorros mutuos, Montevideo, Uruguay. La infección por el virus de la hepatitis C (VHC) es una de las principales causas de trasplante hepático, debido principalmente a su capacidad de generar una infección crónica que puede derivar en hepatocarcinoma. Para aquellos pacientes que no resuelven la infección aguda, existen tratamientos antivirales indirectos que desafortunadamente no son 100% efectivos (bi-terapia con interferón-α-pegilado y ribavirina). A lo largo de los años se han desarrollado antivirales de acción directa (DAAs) que actúan a nivel de alguna proteína específica del virus. La mayoría de estas drogas se encuentran dirigidas a la serín-proteasa viral (NS3) o a la polimerasa viral (NS5B) y se administran con la terapia dual. Concomitantemente con el desarrollo de estos fármacos, y teniendo en cuenta la velocidad evolutiva de los virus cuyo genoma está compuesto por ARN (como el VHC), se han ido generando mutaciones que generan resistencia a estos nuevos antivirales. Cabe destacar que de los DAAs aprobados en otros países del mundo (telaprevir, boceprevir, simeprevir, sofosbuvir), únicamente el telaprevir ha sido aprobado en Uruguay, pero actualmente el Fondo Nacional de Recursos financia únicamente la bi-terapia. El presente estudio consistió en la identificación de nuevas variantes y de variantes ya asociadas a resistencia a los DAAs en las regiones que codifican para la proteasa y para la polimerasa viral en 16 pacientes uruguayos infectados con VHC, que no han sido previamente tratados con este tipo de drogas. Asimismo se realizaron estudios filogenéticos con cada región analizada. Se empleó el método de máxima verosimilitud utilizando los modelos evolutivos T92+G+I (polimerasa) y GTR+G+I (proteasa). Los resultados obtenidos muestran que de los 16 pacientes 13 se encuentran infectados con VHC de genotipo 1 (9 subtipo 1a y 3 subtipo 1b) y 4 con el genotipo 3 (subtipo 3a). El estudio realizado a nivel de la secuencia de NS3 evidenció la presencia, en dos pacientes infectados con el genotipo 1a, de las sustituciones Q80K y Q80L. Estas mutaciones confieren resistencia al simeprevir, en mayor o menor grado. Fueron identificadas además, variantes no reportadas previamente cuya implicancia en la respuesta al tratamiento aún resta ser dilucidada. De las variadas sustituciones asociadas con resistencia a inhibidores de la polimerasa, ninguna fue detectada en los aislamientos estudiados (si bien hay regiones no abarcadas en nuestro estudio). Sin embargo, en varias de las muestras se hallaron las sustituciones D244N y Q309R, comúnmente asociadas con una respuesta virológica sostenida en pacientes tratados con la bi-terapia clásica. La identificación de variantes de NS3 y NS5B resistentes a las DAAs (previo al tratamiento con éstas) podría ser de gran utilidad a la hora de identificar a aquellos individuos con menor probabilidad de responder favorablemente a 68 Libro de resúmenes dicha terapia pudiendo ser seleccionados más apropiadamente para terapias antivirales alternativas o futuras. 0387 ANALISIS FILOGENETICOS DE CEPAS DE NOROVIRUS DETECTADAS EN URUGUAY REVELAN LA CIRCULACIÓN DE VARIANTES RECOMBINANTES GII.P7/GII.6 A Fajardo1, F López-Tort2, M Victoria2, TM Fumian3, MP Miagostovich3, JPG Leite3, J Cristina1, R Colina2 1 Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Igua 4225, 11400, Montevideo, Uruguay. 2 Laboratorio de Virología Molecular. Regional Norte, Universidad de la Republica, Gral. Rivera 1350, 50000, Salto, Uruguay. 3 Laboratorio de Virología Comparada e Ambiental, Instituto Oswaldo Cruz, Ministerio da Saude, Avenida Brasil, 4365 – Pav. Helio & Peggy Pereira, 21040-360 Manguinhos, Rio de Janeiro, Brasil. Los norovirus (NoV) son unos de los principales agentes etiológicos responsables de brotes de gastroenteritis aguda (GA) en todo el mundo. Distintos genotipos de NoV han sido asociados con diferentes patrones de transmisión y gravedad de la enfermedad en los seres humanos. Es por ello que resulta importante identificar genéticamente los diferentes genotipos de NoV que circulan en una región particular. Sin embargo, la genotipificación se ha convertido en un importante desafío debido a la alta frecuencia de eventos de recombinación que ocurren principalmente en la región de solapamiento de los marcos abiertos de lectura ORF1/ORF2. Esto resulta en el surgimiento de variantes cuyas regiones codificantes para la polimerasa y la cápside derivan cepas parenterales de diferentes genotipos. Teniendo esto en cuenta, se obtuvieron secuencias conteniendo la región de solapamiento ORF1/ORF2 de diferentes cepas de NoV obtenidas de pacientes con uruguayos con GA. Se realizaron diferentes abordajes in silico con el objetivo de investigar la posible presencia de variantes recombinantes. El objetivo del presente trabajo es Investigar la presencia de presuntos eventos de recombinación en poblaciones de NoV circulantes en pacientes uruguayos con GA. Con el fin de cumplir con los objetivos planteados, se aisló el ARN a partir de 3 muestras de diarrea y 3 de vómito obtenidas de diferentes pacientes con GA residentes en la ciudad de Salto, Uruguay, que previamente fueron diagnosticados como positivos para NoV. Se amplificó mediante RT-PCR la región solapante ORF1/ORF2. Se realizaron árboles filogenéticos de máxima verosimilitud para ambas regiones codificantes con el fin de genotipificar cada variante. Asimismo, las secuencias obtenidas fueron analizadas con el Norovirus Genotyping Tool. Las incongruencias filogenéticas observadas fueron analizadas con abordajes bioinformáticos implementados en los programas SplitsTree, SimPlot y Recombination Detection Program con el fin de investigar la posible ocurrencia de eventos de recombinación. Este estudio evidencia la presencia de eventos de recombinación en cuatro de las seis cepas analizadas para las que el gen de la polimerasa corresponde al genotipo GII.P7 mientras que la región codificante de la cápside pertenece al genotipo GII.6. Se trata del primer reporte de variantes recombinantes GII.P7/GII.6 en las Américas. Asimismo, su frecuencia relativa indica que estas variantes circulan naturalmente entre poblaciones de NoV en esta región del noroeste de Uruguay. 0388 ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN Y VARIABILIDAD GENÉTICA DE RETROVIRUS ENDÓGENOS HUMANOS EN LEUCEMIA LINFOIDE CRÓNICA S Fischer1, N Echeverria1, G Moratorio1, G Dighiero2, J Cristina1, P Oppezzo2, P Moreno1 1 Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República Oriental del Uruguay, Uruguay. 2 Unidad de Proteínas Recombinantes, Institut Pasteur de Montevideo, Uruguay. Los retrovirus endógenos humanos (HERVs) son remanentes genéticos de infecciones retrovirales ancestrales de la línea germinal que han sido transmitidos de generación en generación hasta nuestros días. Alrededor del 8% de nuestro genoma está constituido por este tipo de elementos. HERV-K (HML-2) es la familia de retrovirus endógenos más joven en el genoma humano y por lo tanto la más preservada genéticamente. Varias evidencias reportan un aumento de expresión tanto a nivel transcripcional como traduccional de diferentes genes pertenecientes a los HERVs (gag, env, np9, rec, etc) en una gran variedad de cánceres entre los cuales se encuentran leucemias y linfomas. El presente trabajo se plantea como objetivo central, estudiar la posible relación entre la expresión de los genes np9 y gag de HERV-K en la patología hemato-oncológica Leucemia Linfoide Crónica (LLC). Con el fin de cumplir con estos objetivos, se recolectaron 25 muestras de sangre periférica de pacientes con LLC (14 indolentes y 11 progresores) y 6 muestras provenientes de donantes sanos. Se realizó la separación de células mononucleares mediante el método del Ficoll Hypaque, extracción de ARN (trizol) y posteriormente se realizó la transcripción reversa. La cuantificación relativa de los genes de HERV-K, np9 y gag, fue realizada mediante PCR a tiempo real y posterior cálculo del 2E-delta delta Ct. Se realizó además una PCR convencional con el fin de amplificar la secuencia completa del gen np9 de HERV-K de 4 muestras de donantes sanos y 10 muestras de ADNc de pacientes con LLC. Los productos de amplificación fueron purificados, enviados para su secuenciación y posteriormente las secuencias fueron editadas y analizadas utilizando el programa Seq Man y MEGA versión 5.0, respectivamente. Los resultados de este trabajo reportan que la actividad transcripcional del gen np9 de HERV-K se encuentra sobre-expresada (al menos cinco veces más) en el 75% de las muestras analizadas de pacientes con LLC al ser comparadas con muestras provenientes de donantes sanos. Por otro lado el estudio del nivel de expresión del gen gag de HERV-K evidenció que solo un 33% de los pacientes con LLC expresaron este gen al menos dos veces más en comparación a los donantes sanos. Tanto en el caso del análisis de np9 como el de gag se observó una gran variabilidad entre los pacientes de LLC analizados, no observándose una diferencia significativa entre los subgrupos de pacientes LLC idolentes y progresores. Con respecto al estudio de la variabilidad genética en esta región, los resultados muestran un alto grado de conservación en la secuencia del gen que codifica para la proteína Np9 en las diferentes muestras amplificadas. Se identificaron dos posibles polimorfismos y tres sitios nucleotídicos donde se observaron mutaciones puntuales. Este trabajo representa el primer reporte de la sobreexpresión del oncogén np9 de HERV-K en sangre periférica de pacientes con LLC. 0389 DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE POLIOMAVIRUS JC EN AGUAS RESIDUALES EN SANTIAGO, CHILE J Levican, A Gaggero Programa de Virología, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Chile. Introducción. Poliomavirus JC (PyVJC) es un virus DNA sin manto, que se encuentra ampliamente distribuido en humanos. Habitualmente la infección cursa de manera asintomática y persistente, afectando el tejido renal, pudiendo reactivarse lo que lleva a la excreción de virus en la orina. Su gran resistencia ante diversas condiciones físico-químicas, hace de PyVJC un buen marcador de contaminación humana en diversas muestras ambientales. Además, debido a su alta estabilidad genética combinada con un mecanismo de transmisión, principalmente intrafamiliar, hace de PyVJC una novedosa aproximación para trazar migraciones humanas. Recientemente se ha detectado PyVJC en aguas residuales urbanas en distintas localidades geográficas y los análisis filogenéticos de secuencias nucleotídicas, constituyen un buen enfoque para estudiar la composición de la etnia de una región en particular. Este estudio tiene como objetivo determinar la circulación de PyVJC en aguas de plantas de tratamiento de aguas residuales en la ciudad de Santiago, Chile. Metodología. Muestras de aguas residuales crudas y tratadas, fueron recolectadas mensualmente durante un año y analizadas para detectar PyVJC usando PCR en tiempo real (qPCR). Las muestras positivas fueron amplificadas con partidores específicos, dirigidos a la región IG PyVJC de 610 pb y los productos de PCR fueron 69 Libro de resúmenes clonados y secuenciados. Las secuencias nucleotídicas resultantes, se utilizaron para el análisis filogenético usando el software MEGA 5.05. Resultados. PyVJC fue detectado en un 80,56% de las muestras en un rango de 5,84x103 y <1 copias genómicas (CG)/ml. El número de CG fue de al menos 1 orden de magnitud mayor en las aguas residuales crudas con respecto a las tratadas. Las muestras positivas se detectaron durante todo el año y no se observó estacionalidad. El análisis filogenético indica que los aislados de PyVJC detectados agrupan principalmente con el genotipo asiático 2 (A/C). Conclusiones. Nuestro estudio indica la presencia de PyVJC, siendo la detección molecular en aguas residuales una aproximación factible para monitorear polución humana. La presencia del genotipo asiático, concuerda con estudios antropológicos anteriores e indica un fuerte componente étnico nativo americano en la parte sur de América. Miércoles 24 de junio Sala C (Petit Dorée - 1º piso) 14:30 - 16:00 hs. Virología clínica 0019 DETECCIÓN Y GENOTIPIFICACIÓN DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO EN MUJERES SIN LESIÓN CERVICAL GB Jorda1 2, A Wegert2, J Mosmann3, ML Lopez2, C Cuffini3 1 Universidad Nacional de Misiones, Argentina. 2 Instituto de Previsión Social, Argentina. 3 Instituto de Virología Dr J.M. Vanella. Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. El virus del papiloma humano (HPV) es el agente etiológico de infecciones genitales más frecuente. Se describieron alrededor de 100 genotipos de HPV, aproximadamente 40 infectan la mucosa genital. La mayoría de las infecciones, aun las producidas por los tipos de HPV de alto riesgo (con o sin anomalías citológicas), son transitorias, autolimitadas y no dejan secuelas oncopatogénicas. Sin embargo, los HPV pueden generar una infección persistente en una proporción minoritaria y causar cáncer cérvico uterino. El objetivo fue establecer la prevalencia de la infección genital por el HPV y determinar los distintos genotipos de HPV en mujeres de edad fértil, que concurren al laboratorio del Instituto de Previsión Social de Misiones (IPSM) con solicitud de estudio de exudado vaginal. Se estudiaron 505 mujeres (r = 15- 49 años), durante Enero 2012 Mayo 2013. Se tomó una muestra endocervical y se colocó en PBS pH 7,2, luego se realizó la extracción en forma manual con un equipo comercial. Se utilizó un control interno que amplifica el gen de la beta actina para evaluar la calidad de la muestra y/o la presencia de inhibidores. Para la detección del HPV por PCR se utilizó el protocolo de Mannos y cols. Se amplificó un fragmento de 450 pb del genoma viral perteneciente al fragmento L1 mediante los primers MY 11 y MY 09. El genotipo de HPV se determinó por el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción. Se requirió el consentimiento de las mujeres participantes. Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS versión 15. Del total de mujeres estudiadas 155 resultaron infectadas con el virus del papiloma humano (30,7 %). Se tipificaron 73 muestras. Los genotipos encontrados fueron: 6(11%), 11(5,5%), 16(35,6%), 18(2,7%), 31(8,2%), 33(2,7%), 35(1,4%), 45(1,4%), 53(2,7%), 57(1,4%), 58(11%), 59(2,7%), 61(11%), 66(2,7%) y 68(1,4%). La edad media de las mujeres HPV positivas fue de 27,4 ±7,9 años. Se observó asociación entre HPV y el mayor número de parejas (p=0,045). No hubo diferencias significativas entre la presencia de HPV y la sintomatología, el rango etario, el uso de profiláctico y la edad de inicio de las relaciones sexuales. Estos resultados aportan datos sobre la importancia de la implementación del estudio de HPV en nuestra región, debido a que la prevalencia detectada es alta, al igual que el porcentaje de genotipos oncogénicos de los cuales sólo dos de ellos están incluídos en la vacuna. Aunque, es posible que las infecciones por HPV detectadas en las jóvenes sean transitorias, se recalca que son mujeres que acudieron al laboratorio por un estudio de exudado vaginal, sin considerar una lesión cervical o un estudio de PAP. Cabe destacar también la importancia de hacer un seguimiento de las pacientes mayores de treinta años que presentan cepas oncogénicas, para la prevención de las lesiones del cuello uterino y para la vigilancia epidemiológica de dichos genotipos en esta provincia. 0020 IMPACTO CLÍNICO DE LA COINFECCIÓN POR RINOVIRUS Y SINCICIAL RESPIRATORIO EN NIÑOS CON INFECCIÓN RESPIRATORIA AGUDA DN Marcone1, G Carballal1, C Ricarte1, F Poletta1, C Videla1, J Ekstrom1, A Ellis1 2, SM Vidaurreta1, M Echavarria1 1 Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas (CEMIC) Hospital Universitario, Argentina. 2 Sanatorio Mater Dei, Argentina. 70 Libro de resúmenes Los virus respiratorios son la causa principal de infección respiratoria aguda (IRA) en niños, representando la mayoría de las consultas médicas e internación. El virus sincicial respiratorio (RSV) es uno de los más frecuentes en niños con IRA; sin embargo, los rinovirus (HRV) son una causa común y subestimada de IRA grave. OBJETIVOS Determinar la frecuencia viral en niños internados y ambulatorios con IRA. Tipificar los virus más frecuentes. Determinar el riesgo asociado a la coinfección viral. METODOS Se obtuvieron aspirados (internados) e hisopados nasofaríngeos (ambulatorios) de 876 niños <6 años con IRA y menos de 5 días de evolución (1/6/08-31/12/11). Se registraron datos demográficos y clínicos. Criterios de exclusión: cardiopatías, enfermedad pulmonar crónica, enfermedades genéticas o metabólicas, inmunodeficiencias. Las muestras se estudiaron por IFI para RSV, adenovirus (AdV), influenza A y B (FluA, FluB), parainfluenza (PIV) 1, 2, 3 y metapneumovirus (HMPV) y por RT-PCR en tiempo real para HRV. Los RSV se tipificaron con anticuerpos monoclonales y los HRV por secuenciación de la región parcial VP4/VP2 y análisis de filogenia con cepas de referencia. Se realizó un análisis bivariado para identificar factores de riesgo asociados a internación. RESULTADOS Se obtuvo un diagnóstico viral positivo en 73,4% niños con IRA. HRV fueron los virus más frecuentes seguidos por RSV. Tabla. Detección viral [n(%)] en 876 niños con IRA (2008-2011). Total HRV RSV HMPV AdV FluA FluB PIV positivos Internados n=579 463 (80) 265 (46) 168 (29) 46 (8) Ambulatorios 180 (61) n=297 86 (29) 39 (13) 18 (6) 6 (2) 12 (4) 13 (4) 19 (6) 351 (40) 207 (24) 64 (7) (25 (3) 29 (3) 17 (2) 29 (3) Total n=876 643 (73) 19 (3) 17 10 4 (1) (3) (2) Se detectó 9% de coinfecciones virales siendo HRV-RSV la más frecuente. La detección de RSV o HRV se identificó como un factor de riesgo asociado a internación: OR: 3,67 (IC95%: 2,29-5,87) y OR: 2,77 (IC95%: 1,91-4,01), respectivamente. Sin embargo, la coinfección RSV-HRV presentó un riesgo mucho mayor: OR: 12,44 (IC95%: 3,51-44,14). Se identificó RSV-A en 94% y RSV-B en 6% de las muestras. Los HRV-A y HRV-C fueron las especies más frecuentes (55% y 43%) y sólo 2% de HRV-B; se identificaron 30 genotipos diferentes de HRV. Los niños internados presentaron IRA baja [bronquiolitis (70%) y neumonía (15%)]. Los ambulatorios tuvieron IRA baja [bronquiolitis (39%), neumonía (6%) y bronquitis (5%)] y alta (50%). CONCLUSIONES HRV y RSV fueron los virus más frecuentes en niños con IRA. Todas las especies de HRV y los tipos de RSV se detectaron circulando en Buenos Aires durante 2008-2011. La coinfección HRV-RSV presentó un riesgo 4 veces mayor asociado a internación que la infección simple. La incorporación de métodos moleculares para la identificación de coinfecciones virales contribuirá a un mejor manejo clínico y medidas de control de infecciones. 0022 INCIDENCIA DE INFECCIONES RESPIRATORIAS VIRALES EN NIÑOS INTERNADOS Y AMBULATORIOS MENORES DE 6 AÑOS Y SUS COSTOS ASOCIADOS DN Marcone1, LO Durand2, E Azziz-Baumgartner2, SM Vidaurreta1, J Ekstrom1, G Carballal1, M Echavarria1 1 Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas (CEMIC) Hospital Universitario, Argentina. 2 Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC), Estados Unidos. Introducción Los datos sobre incidencia de infecciones respiratorias agudas (IRA) virales en niños y los costos asociados son de gran utilidad para asesorar a los organismos de Salud Pública a establecer medidas de control y futuras intervenciones. Sin embargo, en países de medio y bajos recursos estos datos son muy limitados dada la dificultad en obtener denominadores poblacionales para el cálculo de incidencia. Metodología Durante 2008–2010, se estudiaron 1,800 niños <6 años para identificar aquellos que requirieron internación o que realizaron una consulta en sala de urgencias con signos o síntomas de IRA (rinorrea, tos, sibilancias, taquipnea, tiraje o cianosis, etc). Las muestras de secreciones respiratorias se estudiaron por IFI para los virus sincicial respiratorio (RSV), influenza, parainfluenza, adenovirus, y metapneumovirus y por RT-PCR en tiempo real para rinovirus. Para estimar la incidencia anual de IRA en niños internados, se dividió el número de niños de CEMIC con IRA, por el número total de niños afiliados a CEMIC en 2008, 2009 y 2010. Se utilizó un modelo multiplicador para estimar la incidencia en sala de urgencias, dado que no se contó con los recursos económicos suficientes para enrolar a todos los niños con IRA que consultaron en sala de urgencias. Todas las tasas estimadas se estratificaron por grupos etarios (<6 meses, 6-23 meses y 2-5 años). Se examinaron los archivos administrativos de los niños internados con IRA para determinar los costos asociados. Resultados La incidencia de infección por RSV (24/1000 niños/año), metapneumovirus e influenza (8/1000 niños/año, ambos) fue mayor en los niños internados <6 meses y disminuyó al incrementarse la edad. En contraste, la incidencia de rinovirus fue mayor (12/1000 niños/año) en los niños de 6-23 meses de edad, y disminuyó en el resto de los grupos. En la sala de urgencias, la incidencia de los virus respiratorios cada 1,000 niños/año fue de: 459 para rinovirus, 352 para RSV; 185 para influenza, 177 para parainfluenza, 130 para metapneumovirus y 73 para adenovirus. La mediana de días de internación fue de 3 días y la mediana del costo total de internación estimado fue de $2000 (rango intercuartil $1375– 3000). El 50% del mismo comprendió a los costos de habitación, 13% a consumibles, 12% a procedimientos diagnósticos, 10% a medicamentos y 6% a consultas con especialistas. Conclusiones Nuestro estudio indica que los virus respiratorios, en particular rinovirus, RSV, metapneumovirus e influenza se asocian a cuadros graves en niños con infección respiratoria aguda y causan una carga económica sustancial al sistema de salud. El desarrollo de vacunas para RSV, metapneumovirus y rinovirus permitirían en un futuro próximo reducir el impacto de estos virus en Pediatría. 0026 ESTUDIO DE LA DEGENERACIÓN NEURONAL EN LA INFECCIÓN CON EL VIRUS SAINT LOUIS ENCEPHALITIS ME Rivarola1, S de Olmos2, LB Tauro1, C Caula4, L Spinsanti1, A Gruppi3, MS Contigiani1 1 Laboratorio de Arbovirus. Instituto de Virología “Dr. J. M. Vanella”. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 2 Laboratorio de Neuroanatomía e histología experimental Instituto de Investigaciones “Mercedes y Martín Ferreyra”., Argentina. 3 Inmunología. Departamento de Bioquímica Clínica. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 4 Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Católica de Córdoba, Argentina. El virus St. Louis encephalitis (SLEV, Flavivirus, Flaviviridae) es un arbovirus ampliamente distribuido en América. En Sudamérica ha emergido como un patógeno del sistema nervioso central causando brotes de encefalitis tanto en Argentina como en Brasil. La detección de casos de infección humana por SLEV en la ciudad de Córdoba, sumado a los antecedentes de seroprevalencia en distintas provincias argentinas, es un signo de alerta para intensificar su investigación. Estudios realizados en nuestro laboratorio en modelo murino, indican que la cepa virulenta CbaAr-4005 (aislada en un brote epidémico ocurrido en 71 Libro de resúmenes Córdoba, 2005) es capaz de ingresar y replicar a nivel del SNC. El objetivo de este trabajo es analizar y estudiar los fenómenos de degeneración neuronal desencadenados en la infección por esta cepa epidémica, en el cerebro de ratones con y sin signos neurológicos. Cada animal se inoculó en la región dorsal con 3000 u.f.p./ml. A los 8 y 11días post-infección (con y sin síntomas neurológicos respectivamente) todos los animales fueron sacrificados y perfundidos. Se realizaron cortes sagitales (40um) y frontales (25um) que fueron sometidos a las técnicas de tinción Amino-Cupro-Argéntica, Nissl, Fluor Jade-B y Tunel. Se identificaron distintos tipos de degeneración neuronal (apoptosis, degeneración neuronal terminal, degeneración somatodendrítica y degeneración de fibras) y se evaluaron las distintas áreas cerebrales afectadas. Finalmente para confirmar la infección en el SNC se realizó una inmunofluorescencia indirecta que detecta la proteína E de envoltura viral. Si bien en ambos modelos encontramos los mismos tipos de degeneración neuronal, el nivel de daño cerebral fue marcadamente superior en los animales sacrificados al día 11 postinfección. En los animales asintomáticos las regiones del bulbo olfatorio, del claustrum endopiriforme dorsal, de la corteza piriforme y de la comisura anterior fueron las regiones cerebrales más afectadas, mientras que en los animales sintomáticos las principales áreas fueron corteza motora, cerebelo y cuerpo estriado. Estos resultados sugieren que la neuro-invasión podría iniciarse en la corteza piriforme y zonas aledañas para luego diseminarse al resto del SNC y que las áreas afectadas podrían correlacionarse con los síntomas neurológicos observados. Estos resultados amplian el conocimiento de la neuropatogénesis inducida por este flavivirus que resulta crucial para el futuro desarrollo de terapias enfocadas en mitigar las complicaciones neurológicas en aquellos pacientes susceptibles. 0028 TRASTORNOS NEUROLÓGICOS EN GRUPOS FAMILIARES INFECTADOS CON HTLV-1 EN EL NOROESTE ARGENTINO E Maturano1, C Remondegui2, R Gastaldello1, G Barbas3, G Lamas2, M Balangero1, G Castro1, R Otsuki4, A Paulo Vicente4, S Gallego1 1 Instituto de Virología “Dr J.M. Vanella”, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 2 Servicio de Infectología & Medicina Tropical, Hospital San Roque, San Salvador de Jujuy, Argentina. 3 Laboratorio Central, Ministerio de Salud de la provincia de Córdoba, Argentina. 4 Laboratorio de Genética Molecular de Microorganismos, Fundación Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Río de Janeiro, Brasil. El noroeste argentino muestra una articulación compleja de condiciones ambientales propias de las regiones tropicales y andinas de Sudamérica las cuales se conjugan con diferentes características socioculturales, étnicas, laborales, alimentarias y familiares que favorecen la presencia de neuropatías, entre ellas, las asociadas a infección por HTLV-1/2, más conocida como Paraparesia Espástica Tropical (PET). A partir de un registro de pacientes infectados con HTLV-1/2, fueron valorados 29 casos índices y 180 convivientes residentes en la provincia de Jujuy. Previo consentimiento informado, extracción de sangre y confección de fichas clínico-epidemiológicas, estas personas (91 varones y 118 mujeres) fueron sometidas a exámenes médicos y de laboratorio para investigar la presencia de neuropatía y eventual infección viral. La detección de anticuerpos anti HTLV-1/2 mediante pruebas de tamizaje y confirmación arrojó 119 seropositivos, todos tipificados como HTLV-1 por Nested-PCR, determinando una prevalencia de infección intrafamiliar del 56,94%. De los 119 positivos, 65 eran mujeres de entre 2 y 83 años (media 31,71 años; DE 23,38) y 54 varones de entre 1 y 76 años (media 34,00 años; DE 20,68 años), con trastornos neurológicos en grado variable. Los cuadros más floridos se presentaron en mujeres, y si bien se reconocieron manifestaciones neurológicas en todos los grupos etáreos, la mayor gravedad se verificó en las personas ancianas. El análisis multivariado de los 119 infectados permitió construir tres perfiles sindrómicos: a. Asintomáticos: 32/119 (26,89%). b. Con escasa sintomatolgía (hiporreflexia aquileana, síndrome cerebeloso, déficit de pares craneales, nistagmus e hiposensibilidad vibratoria): 12/119 (10,08%). c. Con abundante sintomatología (lumbociatalgia, trastornos sensitivos, debilidad proximal de miembros inferiores, temblor, impotencia y/o pérdida de la libido, hiperreflexia de miembros inferiores, atrofia muscular y disfunción vesical): 75/119 (63,03%). Dado el conocimiento sobre la existencia de neuropatías de diversa etiología similares a PET, el correcto diagnóstico e interpretación del cuadro asociado a HTLV en el noroeste argentino requiere, además de considerar la infección, la clínica y semiología, evaluar la existencia de neuropatías de origen no infeccioso (error tipo 1). En tal sentido, la presencia de convivientes afectados por HTLV-1, especialmente mujeres; el amamantamiento prolongado; la existencia de grupos étnicos descendientes de pobladores originarios; la persistencia de prácticas endogámicas, la pobreza con marcado déficit nutricional, etilismo, exposición a contaminantes con potencialidad neurotoxica: As, Pb, Cd, Cr, Li, agroquímicos, etc., exigen una interpretación médica integral de los cuadros observados y el hallazgo de marcadores con valor diagnóstico, pronóstico y terapéutico. 0033 RINOVIRUS EN INFECCIONES RESPIRATORIAS BAJAS EN NEONATOS PREMATUROS CON PATOLOGÍAS DE BASE M Echavarria, DN Marcone, M Irañeta, Y Rubies, MB Falbo, SM Vidaurreta, G Carballal Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas (CEMIC) Hospital Universitario, Argentina. Introducción Los rinovirus (HRV) pueden causar infecciones respiratorias agudas (IRA) bajas y un incremento en la morbilidad, que se puede observar en recién nacidos que permanecen en neonatología debido a su patología de base. La duración y evolución de la infección puede variar de acuerdo al hospedador. Objetivos Determinar la duración de las infecciones por HRV en infantes prematuros con patologías de base. Determinar la potencial transmisión nosocomial de HRV mediante genotipificación. Metodología Se evaluaron 3 infantes internados en terapia intensiva neonatal debido a sus patologías de base, y que desarrollaron IRA. Se obtuvieron aspirados nasofaríngeos al inicio de los síntomas y semanalmente durante el curso de la infección. Se realizó diagnóstico viral y bacteriano. La detección de HRV se realizó por RT-PCR en tiempo real. Para la tipificación de los HRV se realizaron análisis de filogenia utilizando la región parcial codificante VP4/VP2. Resultados Los primeros 2 casos fueron gemelos prematuros internados con displasia broncoplulmonar y ductus. Uno de ellos (LS) fue el caso inicial: un infante de 2 meses que desarrolló tos, taquipnea, sibilancias y tiraje. Tuvo diagnóstico positivo para HRV, y negativo para bacterias y otros virus respiratorios. Su hermano gemelo (LP) internado a su lado, desarrolló la misma sintomatología respiratoria 72 hs. después, también con un diagnóstico de HRV positivo. La condición clínica de ambos se deterioró significativamente durante la infección por HRV. El paciente LS permaneció con clínica respiratoria y positivo para HRV durante 17 días mientras que su gemelo LP permaneció con clínica respiratoria y positivo para HRV por 28 días. Durante este período, un tercer recién nacido prematuro (TI), con una enfermedad genética, desarrolló taquipnea y tiraje a los 8 días de su nacimiento. Se obtuvo un diagnóstico positivo para HRV, permaneciendo con sintomatología y PCR positiva por 28 días. En todos los pacientes se implementó aislamiento de contacto hasta que la PCR de HRV fuera negativa. El análisis filogenético reveló que los 2 primeros casos fueron HRV especie C (C43 y C1, respectivamente) mientras que el paciente TI tuvo HRV especie A63. Luego de una prolongada internación, los 3 pacientes recibieron el alta. Tres meses después, el paciente LP desarrolló una nueva IRA por HRV, genotipo A103. 72 Libro de resúmenes Una semana después del alta, el paciente TI también desarrolló una nueva infección por HRV, genotipificado como A75. Conclusiones Los HRV pueden causar IRA baja grave en infantes prematuros con patologías de base. Los infantes pueden sufrir infecciones sucesivas por diferentes especies y genotipos de HRV. Este estudio confirma la gran diversidad genética de HRV circulando simultáneamente. La infección por HRV y su detección por PCR tuvo una duración de 17 a 28 días en estos prematuros con patologías de base. La transmisión nosocomial podría descartarse debido a que diferentes especies y genotipos de HRV se detectaron en estos pacientes. 0048 MAYOR SENSIBILIDAD EN DETECTAR VARIANTES X4 DEL HIV-1 EN MUESTRAS TRIPLICADAS DE PACIENTES INFECTADOS MD Golemba, P Aulicino, A Mangano, L Sen Laboratorio de Biología Celular y Retrovirus. Hospital de Pediatría Dr. Juan P Garrahan, Argentina. Para que el tratamiento antiviral con antagonistas CCR5 sea efectivo, es necesario establecer la ausencia de variantes X4. Aunque aún se encuentra en debate, actualmente se recomienda el análisis genotípico por triplicado para incrementar la probabilidad de detección de variantes minoritarias X4. El objetivo del trabajo es evaluar si la determinación por triplicado aumenta la sensibilidad de detectar variantes X4 en pacientes pediátricos. Se secuenció por triplicado el Loop-V3 del gen env de 32 pacientes infectados por transmisión vertical (27 en primoinfección sin tratamiento antirretroviral y 5 mayores de 12 años de infección con tratamiento prolongado). Se determinó el tropismo mediante el algoritmo Geno2Pheno (G2P). El resultado obtenido por el G2P es un valor cuantitativo definido como False Positive Rate (FPR). A menor valor de FPR mayor es la probabilidad de detección de variantes X4. En este trabajo se utilizaron 3 puntos de cortes (FPR 5,75%, 10% y 20%) para determinar el tropismo viral. Cuando el valor de FPR se encuentra por debajo del punto de corte, la variante del tropismo va a ser considerada como X4. El tropismo viral de cada paciente se determinó con el menor valor de FPR de las 3 replicas. Con un FPR<5,75% en el 16% (5/32) de los casos se detectaron variantes X4. Se sumaron 2 casos con variantes X4 con un FPR<10% (22%, 7/32) y con un FPR<20% aumentaron al 53% (17/32). Los 5 pacientes con valores de FPR<5,75% presentaron en la posición 25 del Loop-V3 aminoácidos (aa) básicos (Lisina o Arginina) marcadores característicos de variantes X4. Previamente se ha reportado que una elevada carga neta positiva en la secuencia de aa del Loop-V3 se encuentra relacionada con variantes X4. Nosotros hallamos que las variantes X4 presentaron significativamente mayor carga neta positiva con un FPR<5,75% (mediana "Md"= 7; 5,5-8,5) y FPR<10% (Md= 6; 5,0-8,0) comparadas a las secuencias R5 (Md= 5; 5,0-6,0) y (md= 5; 5,0-5,5), respectivamente. Sin embargo, esta asociación no se observó con el FPR<20% (MdX4= 5 (5,0-7,0) y MdR5= 5 (5,0-6,0)). Cuando se compararon los 27 pacientes con infección aguda con los 5 crónicos, se observó una mayor proporción de variantes X4 en los crónicos. De acuerdo al FPR<5,75% 3/5 pacientes crónicos presentaron variantes X4, con un FPR<10% las variantes X4 se hallaron en 4/5 casos y con un FPR<20% 5/5 pacientes. Las secuencias de aa en el Loop-V3 por triplicado fueron idénticas en 21 pacientes. De los 11 casos con diferencia entre sus réplicas, 2 pacientes crónicos tuvieron discrepancia en el tropismo con distantes valores de FPR. En estos casos, las secuencias X4 presentaron valores de FPR<2% y las secuencias R5 presentaron valores de FPR>25%. Los aislamientos virales en estos dos pacientes fueron inductores de sincicios (variantes X4) en el ensayo fenotípico en células MT2. Nuestro trabajo demuestra que la determinación del tropismo por triplicado a partir de provirus del HIV aumentó la posibilidad de detectar variantes X4. 0050 VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE ROTAVIRUS EN UN HOSPITAL PEDIÁTRICO MJ Palau1, MV Cabassi1, S Fallesen1, A Vera1, JI Degiuseppe2, C Vescina1 1 Sala de Microbiología. HIAEP “Sor María Ludovica”. La Plata, Argentina. 2 Laboratorio de Gastroenteritis Virales. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”. CABA, Argentina. Introducción. Rotavirus es el agente etiológico más importante de gastroenteritis aguda en la primera infancia. En Argentina, se estima que este enteropatógeno causa alrededor de 150.000 casos, 15.000 internaciones y alrededor de 30 muertes anuales en menores de 5 años de edad. Con el fin de reducir la carga de enfermedad por diarrea aguda asociada a rotavirus se incorporó la vacuna monovalente G1P[8] al Calendario Nacional de Vacunación a partir del 1 de enero de 2015. Objetivo. Determinar la frecuencia, estacionalidad, distribución por grupos de edad y diversidad de genotipos circulantes de rotavirus en pacientes que asistieron a la institución en el año 2014. Metodología. Se analizaron muestras de materia fecal con solicitud para la detección de rotavirus (RV) en pacientes internados y ambulatorios durante el año 2014. La búsqueda de antígenos virales se realizó con el kit ProSpecTTM Rotavirus Microplate Assay (Oxoid). Una fracción representativa de las muestras positivas fue enviada al Laboratorio Nacional de Referencia para el estudio de los genotipos circulantes, mediante técnicas de RT-PCR nested multiplex de los genes que codifican para las proteínas VP7 y VP4 (G y P tipo, respectivamente). Resultados. De las 898 muestras analizadas, 104 (11,6%) resultaron positivas para RV. Se obtuvo una prevalencia de 9,8% en pacientes ambulatorios y de 12,2% en pacientes internados. La población con mayor cantidad de muestras testeadas correspondió a la de menores de 1 año (n=388), la cual a su vez presentó el mayor porcentaje de muestras positivas (17%). El 73% de las muestras positivas pertenecieron al periodo comprendido entre las semanas epidemiológicas (SE) 18 a 29, que se corresponden con los meses de mayo, junio y julio. Se caracterizaron molecularmente 59 muestras de materia fecal, de las cuales la asociación de G/P tipo más prevalente fue G1P[8] (88%). En menor proporción se hallaron G12P[8] (6,8%), G9P[8] (3,4%) y G2P[4] (1,7%). Conclusiones. La vigilancia epidemiológica de las diarreas agudas por rotavirus es muy importante en pediatría. En nuestro estudio, la mayor prevalencia de detección se observó en los menores de un año, en coincidencia con lo descripto en la literatura. El patrón estacional de la enfermedad se corresponde con una mayor actividad en los meses de otoño e invierno, como se ha observado en años anteriores y en el resto del país. Es importante destacar la alta prevalencia de la asociación G1P[8], debido a que no se había descripto su detección en elevada frecuencia desde el año 2003. Asimismo, en el contexto de introducción de la vacuna monovalente, es de vital importancia continuar con la vigilancia epidemiológica, no sólo para estudiar la eficacia de la vacunación sino también para conocer los efectos de la misma sobre la circulación viral. 0056 UTILIDAD DE LOS MARCADORES MOLECULARES PARA EL DIAGNOSTICO Y SEGUIMIENTO DE LA INFECCION POR HBV S Blanco1, M Balangero1 2, H Carrizo1, S Gallego1 2 1 Fundación Banco Central de Sangre, Argentina. 2 Instituto de Virología "Dr. J. M. Vanella", FCM, UNC., Argentina. En la infección por el virus HBV, los ANTI HBs son los anticuerpos que neutralizarían la capacidad infectiva del HBV, sin embargo, se ha documentado la transmisión por transfusión sanguínea de un portador de infección oculta por HBV (OBI) con ANTI HBs a receptores inmunocompetentes, demostrando la limitante capacidad neutralizante de los ANTI HBs en algunos casos. Además, se han documentado casos de personas con niveles detectables de ANTI HBs en infecciones hepáticas crónicas. Los casos de OBI requieren el empleo de metodologías moleculares de gran sensibilidad y especificidad para su diagnóstico, ya que se definen como infecciones con niveles muy bajos de DNA HBV (< 200 UI/mL), sin AgHBs detectable y con o sin presencia 73 Libro de resúmenes de anticuerpos contra HBV. Otros casos que revisten gran interés y desafìan el rol protector de los ANTI HBs son las HBV mutantes, las cuales carecen de la región antigénica contra la cual este anticuerpo esta dirigido. Se presenta a continuación la evolución de los marcadores serológicos y virológicos en el seguimiento de dos donantes de sangre, en los cuales se detectó la infección por HBV con la técnica de amplificación de ácidos nucleicos (NAT), como único marcador de infección al momento de la donación. El donante 1 era NAT positivo para HBV como único marcador de infección con una carga viral (CV) de 294 UI/mL. El DNA se negativizó a los 27 días post-donación, momento en que apareció el anticuerpo ANTI CORE. A los 35 días dió positivo el ANTI HBs (77,3UI/mL) pero el DNA de HBV nuevamente fue detectable en ese momento por técnicas de NAT, con una CV de 27,1 UI/mL. Luego, el donante discontinuó los controles. El Donante 2 fue NAT HBV positivo al momento de la donación con una CV no cuantificable. A los 19 días post-donación se detectó AgHBs, ANTI CORE y NAT HBV con una CV de 6,160 UI/mL. A los 39 días postdonación tenía AgHBs No Reactivo y se detectó ANTI CORE, IgM CORE, ANTI HBe, ANTI HBs (142 UI/mL) y ADN HBV con una CV de 47UI/mL. A los 54 días post-donación no se detectó más el DNA HBV. Nuestros resultados muestran como en el seguimiento de ambos individuos infectados persisten el DNA viral con los anticuerpos ANTI HBs y corroboran la necesidad de utilizar técnicas altamente sensibles de detección de DNA viral en el algoritmo de diagnóstico, a los fines de descartar una infección por HBV, aún en presencia de anticuerpos ANTI HBs. Si bien el ANTI HBS ha sido descripto como el marcador de protección definitivo frente al HBV, los avances en la biología molecular permiten cuestionar el rol protectivo del mismo, su interpretación en el algorritmo de diagnóstico e indican la necesidad de evaluar sus implicancias clínicas. El presente trabajo aporta información que apoya la necesidad de reveer los algoritmos diagnósticos tradicionales y la sensibilidad de las metodologías empleadas en el diagnóstico y seguimiento de la infección por HBV. 0057 MARCADORES VIROLÓGICOS EN INFECCIÓN OCULTA POR EL VIRUS DE LA HEPATITIS B (HBV) S Blanco1, H Carrizo1, S Gallego1 2 1 Fundación Banco Central de Sangre, Argentina. 2 Instituto de Virología "Dr. J. M. Vanella", FCM, UNC., Argentina. La latencia del genoma de HBV en ausencia de AgHBs detectable ha sido definida como casos de infección oculta por HBV (OBI). Estas infecciones se caracterizan por la presencia de DNA viral en hígado y niveles detectables o no de DNA viral en sangre (carga viral <200 IU/mL), sin niveles detectables de antígeno de superficie (AgHBs), con o sin anticuerpos contra el antígeno CORE (ANTI CORE) o anticuerpos contra el AgHBs (ANTI HBs). Los casos falsos de OBI se definen como aquellos en que los niveles de ADN HBV son comparables a los detectados en otras fases de la infección. La visión general es que, luego de la infección por HBV hay individuos que, tras la negativización del AgHBs habrían resuelto la infección, pero estos individuos podrían ser en realidad portadores de infección oculta por HBV, los cuales teniendo niveles detectables de DNA viral, constituyen una fuente de transmisión del HBV. Se presenta el estudio de marcadores virológicos para HBV en donantes de sangre con infección confirmada. En el periodo Noviembre 2009 a Junio 2014, se estudiaron en la Fundación Banco Central de Sangre 114.432 muestras de donantes de sangre para HBV por técnicas serológicas y moleculares (NAT). En el tamizaje molecular resultaron positivos por NAT 0,045% (52/114.432). De las muestras positivas por NAT, 6/52 (11,5%) presentaron perfiles virológicos compatibles con OBI al momento de la donación. Ag HBs Ag HBe Anti CORE IgM CORE Anti HBe Anti HBs NAT CARGA VIRAL Donante 1*1 NO NO NO NO NO NO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO 294 UI/mL Donante 2 2* NO REACTIVO N/R REACTIVO NO NO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO < 29 UI/mL Donante 3*1 NO REACTIVO N/R REACTIVO NO NO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO < 29 UI/mL Donante 2 4* NO NO NO NO NO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO < 29 UI/mL Donante 5 NO NO NO NO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO < 29 UI/mL Donante 3 6* NO NO NO NO NO NO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO REACTIVO 99 UI/mL *1 Donantes con infección demostrada por seguimiento. *2 Donantes 2 y 4 con resultados de Carga viral de 6,2 UI/mL y 12 UI/mL respectivamente, por debajo del límite de cuantificación. *3 Muestra Positiva para amplificación de la región core/precore (pC/BCP). Estos resultados muestran como gracias a las técnicas de NAT fue posible detectar en el banco de sangre un 11,5% de OBI entre los donantes con infección por HBV confirmada. Las técnicas de amplificacion de ácidos nucleicos (NAT) tienen alta sensibilidad y especificidad y, por ello, son actualmente empleadas en bancos de sangre para evitar la transmisión mediante productos sanguíneos. Estas técnicas, por su mayor sensibilidad, serían herramientas más eficientes que las técnicas de cuantificación de ácidos nucleicos (carga viral), actualmente disponibles en nuestro medio, para el diagnóstico de infección oculta por HBV. 0064 DIAGNÓSTICO DE MENINGOENCEFALITIS VIRALES UTILIZANDO UNA TÉCNICA DE BIOLOGÍA MOLECULAR L Badaloni, MJ Palau, MV Cabassi, S Fallesen, P Lagoa, RS Oderiz, MR Agosti, C Vescina HIAEP Sor María Ludovica, Argentina. Introducción. Los virus son la causa principal de meningoencefalitis a líquido cefalorraquídeo (LCR) claro y encefalitis. El diagnóstico virológico específico es importante debido a que permite indicar un tratamiento oportuno en el caso de etiología herpética, evitar el uso inadecuado de antibióticos y establecer la etiología enteroviral de evolución favorable y autolimitada. Objetivo. Conocer la etiología de meningoencefalitis a LCR claro y encefalitis, en niños internados, utilizando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR). Metodología. Se analizaron 86 muestras de LCR de pacientes pediátricos (0-17 años) con diagnóstico de meningoencefalitis a LCR claro y encefalitis, internados en nuestra institución, en el período septiembre de 2013 a diciembre de 2014. Se realizó RT-PCR (Q – Alert Nanogen) para la determinación de virus Herpes Simplex (HVS) I y II, Enterovirus (EV) y Citomegalovirus (CMV), según solicitud médica. Se analizaron la edad, las formas de presentación clínica y las características del LCR. Resultados. De las 71 muestras de LCR procesadas para detección de EV, 28 resultaron positivas (39,4%). La determinación de HVS I y II se realizó en 54 muestras, resultando positivas sólo dos para HVS II. CMV se investigó en 8 muestras que resultaron negativas. El 50% de los niños con diagnóstico de meningoencefalitis por EV presentó una edad igual o superior a los 6 años (n=14), mientras que el grupo de niños menores de un año de edad abarcó un 43% (n= 12). De estos últimos, 6 presentaban 1 mes de vida. Las manifestaciones clínicas que predominaron fueron: fiebre (100 %) y signos de irritación meníngea (89 %). El LCR estaba alterado en el 94% de los casos: 86% presentaban celularidad entre 10 y 600/ul con predominio mononuclear en el 67% de las muestras. El valor de proteinorraquia presentó un rango entre 0,25 -1,30 g/L y la glucorraquia fue menor a 0,62 g/L. Conclusiones. La incorporación de la RT-PCR al laboratorio de microbiología permite realizar un diagnóstico temprano de los agentes 74 Libro de resúmenes más frecuentes de la meningoencefalitis viral. En nuestra población, EV fue el principal agente etiológico de meningoencefalitis a LCR claro. Disponer del diagnóstico virológico rápido, evita el uso inadecuado de antibióticos y antivirales y disminuye los días de internación en la mayoría de los casos. 0068 ESTUDIO DE INTERCOMPARACIÓN INTERLABORATORIO PARA EVALUAR LA CALIDAD DEL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE VIRUS INFLUENZA A Y B EN LOS LABORATORIOS DE LA RED NACIONAL DE INFLUENZA Y OTROS VIRUS RESPIRATORIOS A Czech, M Avaro, E Benedetti, M Russo, A Pontoriero, A Campos, N Periolo, E Baumeister Centro Nacional de Influenza OPS/OMS, Laboratorio Nacional de Referencia de influenza y otros virus respiratorios, Servicio Virosis Respiratorias, Departamento Virología, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, ANLIS Malbrán, Argentina. Se realizó un estudio de intercomparación entre los Laboratorios de la Red Nacional de influenza y otros virus respiratorios (RNIVR) para evaluar su desempeño en el diagnóstico de influenza A y B por RTPCR en tiempo real (rtRTPCR) o de punto final (fRTPCR) en casos de infección respiratoria aguda. El Laboratorio Nacional de Referencia de influenza y otros virus respiratorios produjo un panel de muestras incógnitas (PMI) a partir de cepas de referencia de influenza que se amplificaron en células MDCK. Se extrajo ARN de distintas diluciones de los stocks virales y se realizó la detección del gen M del virus influenza A y del gen M del virus influenza B por rtRT-PCR. Se ajustaron diluciones de los stocks para obtener CTs de 25, 30 y 35. Posteriormente se cuantificaron frente a estándares internacionales por rtRT-PCR por triplicado. El PMI estaba compuesto por 6 muestras incógnitas (M): M1: B/Brisbane/60/08 32copias/µl(cp/µl), M2: A/Argentina/17/09 (H1N1)pdm09 7,0x103cp/µl, M3: Negativa(PBS), M4: A/Argentina/17/09(H1N1)pdm09 2,32x102cp/µl, M5: 2 A/NewYork/55/04(H3N2) 1,92x10 cp/µl, M6: A/NewYork/55/04(H3N2) 4,1x103cp/µl. Se extrajo el ARN de 40 tubos de cada M. Se mezclaron y homogenizaron los 40 extractos de ARN de cada M y se alicuotaron de a 50µl por vial. Se precipitó y desecó el ARN de cada uno de los tubos del PMI. Tres tubos de cada M se reconstituyeron con 50µl de agua de calidad biología molecular y se procesaron por rtRT-PCR determinando el CT promedio de cada una. El PMI y las indicaciones para la reconstitución de las M, se repartió a 33 laboratorios de la RNIVR involucrando a 19 provincias y CABA. No disponen de capacidad de detectar el genoma del virus influenza B 3 laboratorios. 32 laboratorios entregaron los resultados del panel a término informando el CT y la interpretación de cada M. Los participantes que utilizan rtRTPCR(30) reportaron 100% de resultados correctos para M1, M2, M3 y M4 y 96,7% para M5 y M6. El 100 % de los laboratorios que utilizan fRTPCR(2) reportaron resultados correctos para M2, M3, M4 y M5 y el 50% para M6. Todos los laboratorios fueron capaces de identificar correctamente la cepa de influenza A(H1N1)pdm09 y la de virus influenza B. Alrededor del 6% tuvieron dificultades en la detección de la cepa de virus influenza A(H3N2). Las posibles causas de errores pudieron ser fallas en la reconstitución del PMI, degradación del ARN en la desecación o mala interpretación de los resultados en cada laboratorio. Los resultados obtenidos indican que el país dispone de una red de laboratorios de vigilancia nacional con una sensibilidad adecuada para la detección del virus influenza, que garantiza la calidad de diagnóstico de las muestras respiratorias que se procesan anualmente. La RNIVR proporciona al país información epidemiológica al día, contribuyendo a la decisión anual de la vacuna contra la influenza y detección temprana de nuevas variantes virales que podrían surgir causando epidemias o brotes con potencial pandémico. 0091 POLIMORFISMOS GENÉTICOS DEL HOSPEDERO SE ASOCIAN CON LA SEVERIDAD DE LA PATOLOGÍA INDUCIDA POR EL VIRUS ANDES. J Angulo1, K Pino1, N Echeverría-Chagas2, C Marco3, C MartínezValdebenito3, H Galeno4, E Villagra4, L Vera4, N Lagos4, N Becerra4, J Mora4, A Bermúdez5, M Cárcamo5, J Díaz5, JF Miquel6, M Ferrés3, M López-Lastra1 1 Laboratorio de Virología Molecular, Instituto Milenio de Inmunología e Inmunoterapia (IMII), Centro de Investigaciones Médicas, Escuela de Medicina, División de Pediatría, Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile. 2 Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay. 3 Laboratorio de Infectología, Centro de Investigaciones Médicas, Escuela de Medicina, División de Pediatría, Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile. 4 Subdepartamento de Virología Clínica, Departamento Laboratorio Biomédico Nacional y de Referencia, Instituto de Salud Pública de Chile, Santiago, Chile. 5 Departamento de Asuntos Científicos, Instituto de Salud Pública de Chile, Santiago, Chile. 6 Departamento de Gastroenterología, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile. El virus Andes (ANDV) es el agente etiológico del síndrome cardiopulmonar por Hantavirus (HCPS) en Chile. En este trabajo se evaluó si los polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) rs12979860 y rs8099917, asociados a una expresión diferencial de IFN-λ, y el SNP rs1800629 asociado a una expresión diferencial de TNF-α, podrían asociarse con la severidad de la patología inducida por ANDV. En este estudio se analizó las frecuencias alélicas para estos SNPs en 238 pacientes infectados con ANDV (60,4% de los casos reportados entre los años 2006-2014). Los resultados muestran una asociación significativa entre la presencia del alelo menor en su estado homocigoto (TT para el rs12979860 y GG para el rs8099917) y una patología leve, mientras que el estado heterocigoto o homocigoto para el alelo mayor (CT/CC ó TG/TT, respectivamente) se asocian con una patología grave. El SNP rs1800629, no mostró diferencias en las frecuencias alélicas entre individuos controles y pacientes infectados con ANDV, ni tampoco existe una asociación entre los distintos genotipos (AA/GA/AA) y la severidad de la patología asociada a ANDV. En conclusión, este estudio sugiere que los polimorfismos rs12979860 y rs8099917 pueden ser utilizados como marcadores moleculares de la progresión de la enfermedad asociada con ANDV en pacientes chilenos. Financiamiento: Iniciativa Científica Milenio del Ministerio de Economía, Fomento y Turismo: Proyecto P09/016-F. 0140 IMPLICANCIA DEL GENOTIPO DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B EN LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL ANTÍGENO E EN LA INFECCIÓN CRÓNICA M Speroni1, L Tadey2, S Fernández Giuliano2, L Mammana2, MB Bouzas2, RH Campos1, D Flichman1 1 Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica UBA, Argentina. 2 Unidad de Virologia Hospital F.J. Muñiz, Argentina. INTRODUCCIÓN La infección por el virus de la hepatitis B (HBV) es uno de los principales problemas mundiales de Salud Pública, se estima que un tercio de la población - 2 mil millones de personas - ha estado expuesta al HBV y alrededor de 400 millones permanecen infectados crónicamente. Se reconocen en la actualidad 10 genotipos denominados de la A a la J y varios subgenotipos (sgt). El antígeno e (HBeAg) del HBV es una proteína considerada inductora de la tolerancia viral, favoreciendo la persistencia de la infección; Además, la carga viral de HBV en suero durante la etapa HBeAg positiva es significativamente mayor que en la etapa anti-HBe. Por lo tanto, la expresión del HBeAg se asocia al establecimiento de infecciones crónicas y a una mayor probabilidad de transmisión. La seroconversión del HBeAg ha sido reconocida como un evento importante en la historia natural de la infección crónica, confiriendo un resultado clínico favorable cuando la misma es temprana, y asociándose a una evolución más severa cuando es tardía. En los últimos años, se ha incrementado la información que sugiere que la progresión de la infección crónica, el 75 Libro de resúmenes cuadro clínico inicial, y la respuesta al tratamiento antiviral, pueden variar dependiendo del genotipo del HBV. Sin embargo, la implicancia de los genotipos de HBV en la progresión de la infección es aún motivo de controversia. Asimismo, no hay información sobre la implicancia de los genotipos de HBV en la expresión del HBeAg. OBJETIVO Caracterizar la relación entre los niveles de HBeAg y de carga viral en pacientes crónicamente infectados por diferentes genotipos de HBV. METODOLOGIA Se determinó el genotipo viral por secuenciación, los niveles de HBeAg (Architect HBeAg EIA, Abbott Laboratories) y la carga viral (COBAS TaqMan HBV, Roche), en 29 pacientes HBeAg positivos, infectados crónicamente por HBV. RESULTADOS La distribución de genotipos fue: A2: 34,5%, F1b: 34,5%, F4: 17.2%, otros: 13.8%. Los niveles de HBeAg fueron significativamente mayores en los pacientes infectados con el sgt F1b que en aquellos infectados con el sgt A2 o el sgt F4; mientras que no se observaron diferencias significativas en los niveles de HBV-ADN entre los genotipos. n A2 F1b F4 10 10 5 p HBeAg (S/CO) 1025,3 ± 682,6 1641,4 ± 445,8 859,8 ± 781,6 0,031 HBV-ADN (Log10 UI/ml) 8,73 ± 0,37 8,85 ± 0,53 8,75 ± 0,55 ns CONCLUSIONES En el presente estudio se observaron diferencias en los niveles de HBeAg de acuerdo al genotipo de HBV lo cual podría tener implicancias en la progresión de la infección crónica. Asimismo, no se halló correlación entre los niveles de HBeAg y carga viral como ha sido previamente reportado, sugiriendo una regulación independiente de la transcripción de los mensajeros correspondientes. 0155 APOPTOSIS DE NEUTRÓFILOS EN LA INFECCIÓN ASINTOMÁTICA POR EL VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA PM Cooke1, C Caula1, E Rivarola2, MA Orsilles1 1 Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Católica de Córdoba, Argentina. 2 Instituto de Virología Dr. J.M. Vanella, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. Los neutrófilos pueden ser reclutados a sitios de infección viral y participar en la defensa inmune innata antiviral. El objetivo del presente estudio fue evaluar el nivel de apoptosis y la expresión de antígenos de superficie en neutrófilos de pacientes con infección asintomática por Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) sin tratamiento antirretroviral (TAR). Se incluyeron 32 pacientes con infección por VIH sin TAR y 45 con TAR. Como grupo control, se incluyeron 45 sujetos sanos. El nivel de apoptosis de neutrófilos de sangre periférica se evaluó por citomorfología y por citometría de flujo. La expresión de los antígenos de superficie CD62L y CD16 de neutrófilos se determinó mediante citometría de flujo. En pacientes sin TAR se detectó un aumento de la apoptosis inicial respecto a pacientes con TAR y controles sanos (6.8% ± 1.7; 2.3% ± 0.5; 1.5% ± 0.3 respectivamente. Controles sanos vs VIH sin TAR: p˂0.001; VIH con TAR vs VIH sin TAR: p˂0.01). No hubo diferencia significativa entre los grupos respecto al nivel de apoptosis tardía. No se encontró diferencia en el porcentaje de neutrófilos CD11b+/CD62L+ entre pacientes VIH seropositivos y controles sanos. Sin embargo, se evidenció una disminución del porcentaje de neutrófilos CD11b+/CD16+ en los pacientes VIH+ con y sin TAR, con respecto a los controles. En conclusión, en individuos con infección asintomática por VIH sin TAR se evidencia una susceptibilidad incrementada a la apoptosis de los neutrófilos que parece estar relacionada con la replicación viral; la disminución de expresión de CD16 en los neutrófilos podría estar relacionada a la apoptosis inicial de los mismos. Estas alteraciones podrían comprometer los mecanismos de defensa contra la infección y la modulación de la respuesta inmune contra el VIH. 0160 ACTIVACIÓN DE LINAJES CELULARES B Y T EN PACIENTES CON SÍNDROME PULMONAR POR HANTAVIRUS. AA Iglesias1, M García2, CM Bellomo1, A Bruno3, MT Córdoba3, M Ciancaglini1, PJ Padula1, MC Sasiain2, LP Shierloh2, VP Martinez1 1 Laboratorio Nacional de Referencia para Hantavirus – Servicio Biología molecular – INEI-ANLIS “Dr. C. G. Malbrán” - CABA, Argentina. 2 Laboratorio de inmunología de enfermedades respiratorias - IMEX – Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires- CABA, Argentina. 3 Laboratorio de Enfermedades Tropicales – Hospital San Antonio de Paul – Salta, Argentina. INTRODUCCION El origen de la patogenia del Síndrome Pulmonar por Hantavirus (SPH) estaría mediado por mecanismos inmunopatogénicos. Hallazgos contradictorios han sugerido que en la respuesta celular existe un balance delicado entre la protección y la inmunopatogenia. Los hallazgos hematológicos diferenciales en pacientes con SPH en fase aguda incluyen trombocitopenia, hemoconcentración, leucocitosis neutrofílica-desplazada hacia a la izquierda (inmaduros) y presencia de linfocitos atípicos (inmunoblastos) en frotis de sangre periférica. OBJETIVOS Realizar análisis del fenotipo de leucocitos circulantes mediante citometría de flujo en pacientes con SPH para detectar linajes celulares específicos potencialmente involucrados en la inmunopatogenia del SPH. METODOLOGIA Participaron de forma voluntaria 15 pacientes confirmados para SPH, 16 con cuadros clínicos compatibles (SPH negativos) y 6 personas sanas. La carga viral se determinó por RT-PCR en tiempo real y la caracterización genética viral por RT-PCR y secuenciación nucleotídica. Fenotipificación celular: las subpoblaciones celulares se analizaron cualitativa y cuantitativamente por citometría de flujo. RESULTADOS Todas las muestras positivas para SPH por serología (N=23, 15 pacientes) fueron confirmadas por RT-PCR. El promedio de días desde el inicio de los síntomas hasta la toma de muestra fue 9 para muestras agudas y 20 para convalecientes (rangos 3-14 y 8-42). La carga viral fue similar en todas las muestras (CT medio 25,5; rango: 23,8-26,1), independientemente del genotipo viral y del tiempo de evolución, a excepción de un paciente de 2 años de edad cuya carga viral fue muy baja (CT>36). Se confirmó un aumento significativo en el número de leucocitos y en la proporción de linfocitos, en particular linfocitos T, mostrando una inversión de la relación CD4/CD8, la cual fue más marcada en las muestras más tempranas. Se identificaron poblaciones de inmunoblastos circulantes como eventos FSC/SSCalto significativamente aumentadas en pacientes con SPH comparado con donantes sanos (p<0,001) o pacientes seronegativos para SPH (p<0,01). En los pacientes con SPH, los inmunoblastos circulantes están constituidos por linfoblastos T CD4+ y CD8+ T activados y en menor medida por plasmoblastos CD19+/CD38hi diferenciados a partir de células B. Contrariamente, las células NK (CD56+/CD16+/CD3-) y T Gamma/Delta no contribuyen significativamente a esta población reactiva. En pacientes convalecientes (N=4) las poblaciones de inmunoblastos de T y B se encontraron retraídas a niveles normales. CONCLUSIONES Se observó un aumento de la respuesta celular, principalmente de T CD8+, en todos los pacientes de SPH. La presencia de inmunoblastos reveló activación de células B y T durante la fase aguda de la enfermedad. Al momento del alta médica (>20 días desde el inicio) no se observó clarificación viral y la proporción de células T CD8+ no disminuyó a valores normales como si se reportó en infecciones con virus Puumala. 0177 ESTUDIO DE LAS MUTACIONES DE LOS GENES E6 Y LCR DEL VIRUS PAPILOMA HUMANO 16; DETECTADO EN MUESTRAS ENDOCERVICALES DE LA CIUDAD DE CÓRDOBA. C Cuffini1, J Mosmann1, A Lucca2, M Monetti1, M Frutos1, A Kiguen1, R Venezuela1 1 Laboratorio de Clamidias y Virus Papiloma Humano, Instituto de Virología “Dr. J.M. Vanella”, Facultad de Ciencias Médicas; Universidad 76 Libro de resúmenes Nacional de Córdoba. E-mail: [email protected], Argentina. 2 Fundación para el Progreso de la Medicina. Córdoba, Argentina. Los Virus Papiloma Humano (VPH) están asociados etiológicamente con el carcinoma cervical. El genotipo 16 es el más frecuentemente detectado en la mayoría de las neoplasias de cérvix. En el análisis de la región LCR del VPH 16, se identifican cuatro variantes: Europea (E), en la cual se distinguen Europea prototipo (Ep) y Europea asiática (Ea); Asiática-Americana (AA) y Africanas (AF-1 y AF-2); ésta es la región más variable del genoma viral. Algunos autores han demostrado que la existencia de mutaciones puntuales en las secuencias de E6 y LCR tendría relación con la progresión a una lesión de mayor grado. En mujeres de la ciudad de Córdoba; también se detectó al VPH 16 como el más frecuente; entre los genotipos de alto riesgo, sin embargo, se desconocen las variantes circulantes y las mutaciones asociadas a carcinogénesis; por esta razón el objetivo del trabajo fue, estudiar filogenéticamente secuencias de VPH 16 de muestras de endocervix con lesiones intraepiteliales de diferentes grados, de la provincia de Córdoba, con la finalidad de distinguir los linajes circulantes y analizar la presencia de mutaciones relacionadas a los procesos malignos. Se estudiaron 23 muestras de pacientes positivos para VPH 16. Las muestras fueron analizadas por PCR para las regiones L1, E6 y LCR y luego secuenciadas. El análisis filogenético de E6 y LCR fue construido por Maximun Likelihood (PhyML software), con parámetros sugeridos por JModelTest3.7. Este análisis determinó que el 92% de las muestras pertenecen a la variante E (61% Ep y 31% Ea), el 4% a la variante AF-1 y el 4% restante a AF-2. El alto porcentaje de variante europea estaría en concordancia con los patrones de migración humana, ya que Argentina presentó una fuerte inmigración europea en las primeras décadas del siglo XX. La mutación más frecuentemente detectada en la región LCR fue G7521A, en el 70% de las muestras, la cual afecta al sitio de unión del factor de transcripción YY1 (represor responsable de silenciar la transcripción del promotor de E6), pudiendo contribuir a la carcinogénesis. En la región E6 la mutación más frecuente fue T350G (L83V) detectada en el 61% de las muestras, asociada al incremento del riesgo de una infección persistente. Notablemente, ambas mutaciones fueron halladas, en su mayoría, en lesiones de bajo grado, podríamos inferir que dichas lesiones tienen un riesgo mayor de avanzar a la malignidad. Estos resultados son los primeros aportes en el campo de la epidemiología molecular del VPH 16 en pacientes de Córdoba, los cuales enfatizan la importancia del estudio de las diferentes variantes y la detección de las mutaciones asociadas con el desarrollo de procesos carcinogénicos. Apoyo económico: PIO2010-MincytCba. 2011-2013. Ref. Res. MINCYT Cba. Nº170/2011. 0186 EFECTO DE LA INFECCIÓN CON VIRUS SAINT LOUIS ENCEPHALITIS SOBRE LA VIABILIDAD Y FENOTIPO DE MONOCITOS HUMANOS C Caula1, PM Cooke1, ME Rivarola2, MA Orsilles1, M Contigiani2, LI Spinsanti2 1 Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Católica de Córdoba., Argentina. 2 Instituto de Virología “Dr. J.M. Vanella”, Facultad de Medicina. Universidad Nacional de Córdoba., Argentina. El virus St.Louis encephalitis (SLEV, Flavivirus, Flaviviridae) es un virus transmitido por mosquitos que puede provocar en humanos manifestaciones clínicas tales como cefalea febril, meningitis y encefalitis según el daño de la célula nerviosa. En Argentina es endémico y se han aislado cepas a partir de humanos, roedores, y mosquitos. Si bien, para otros flavivirus, se ha demostrado que la patogenicidad deriva de la capacidad de infectar, replicar y finalmente matar células inmunes, no existen estudios previos en cuanto a la relación del SLEV con monocitos. Éstas, son células fagocíticas de la inmunidad innata, que pueden tener un rol dual, ya sea eliminando al virus o convertiéndose en su reservorio si son susceptibles a su replicación. Nuestro objetivo fue determinar la capacidad de dos cepas del SLEV para infectar y replicar en monocitos humanos y evaluar los efectos sobre su fenotipo y viabilidad. Se infectaron células U937, de linaje mieloide, con las cepas CbaAr-4005 y 78V-6507 (aisladas de mosquitos) a una MOI= 1 (índice de multiplicidad de infección) y se analizaron del día 1 a 5 post infección (pi). La infección se demostró por inmunofluorescencia y el nivel de replicación viral como una estimación de la carga viral mediante qRT-PCR. La expresión de marcadores de linaje y activación (CD14 y HLA-DR) y viabilidad celular se midieron por citometría de flujo. Desde el día 4 pi, se evidenció diferencia significativa entre la infección por CbaAr-4005 respecto a 78V-6507, tanto en el porcentaje (%) de células infectadas (día 4pi 84±7,8 vs.17,3±1,4 p=0,03 y día 5pi 93,3±1,8 vs 10±1,7 p=0,0001, respectivamente) como en el número de copias de cDNA viral (día 4pi 827000±18000 vs. 260000±12583 p=0,001 y día 5pi 1525000±25000 vs 224500±6500 p=0,0004, respectivamente). En los días 4 y 5 pi de la infección por CbaAr-4005 respecto al control negativo, se evidenció disminución significativa en el % de células viables (48±10 vs 88±13 p= 0,02 y 38±9,7 vs 82±13 p= 0,03, respectivamente), aumento en el porcentaje de células CD14+ (34,7±10,9 vs 4,2±3 p= 0,01 y 31,5±16,8 vs 11,7±8,5 p= 0,02, respectivamente) y en el día 5pi aumento en la expresión de HLA-DR (281±8,5 vs 68±32,3 p= 0,01). En conclusión, estos resultados demuestran que ambas cepas infectan y replican en monocitos humanos, pero con diferencia cuantitativa importante. La infección de estas células por SLEV podría tener efectos profundos en sus propiedades funcionales y comprometer el desarrollo de la inmunidad celular y humoral contra el virus. Lo demostrado para SLEV CbaAr-4005 podría estar relacionado con la patogenicidad de esta cepa y explicar, en parte, su mayor virulencia y su comportamiento epidemiológico. 0187 INFECCION POR VIRUS EPSTEIN BARR EN PACIENTES TRASPLANTADOS HEPATICOS MD Borgnia, D Viale, M Dip, A Bosaleh, ME Venuta, A Lencina, A Nuñez, C Hernandéz Hospital de Pediatría "Dr. Juan P. Garrahan", Argentina. Introducción: La Infección por Virus Epstein Barr (I-VEB) es una causa significativa de morbimortalidad en pacientes pediátricos trasplantados hepáticos. La misma se presenta como una enfermedad continua desde una infección sintomática hasta un síndrome linfoproliferativo postrasplante (PTLD) confirmado histológicamente. Objetivo: Describir el manejo y los resultados obtenidos en los pacientes con I-VEB, diagnosticados por PCR en Tiempo Real, tratados con basiliximab + tacrolimus. Metodología: Estudio descriptivo, retrospectivo de pacientes pediátricos trasplantados hepáticos entre noviembre 2009 y diciembre 2012 en nuestra institución. Se excluyeron retrasplantes (n=10) y fallecidos dentro del mes (n=1). El tiempo de seguimiento fue de 21,5 meses (3,6-40,1 m). El monitoreo de las cargas virales fue semanal durante los primeros 3 meses, mensual desde los 4 meses hasta el año y trimestral luego del año postrasplante. Los resultados se expresaron en copias por ml de sangre y su correspondiente logaritmo. Se consideraron que variaciones de 0,5 logaritmos entre muestras serán cambios clínicamente significativos. Los pacientes con al menos dos cargas de VEB superiores a 4.000 copias/ml en ascenso o una mayor a 16.000 copias/ml y hepatograma normal se controlaron bajando la inmunosupresión. Se consideraron portadores crónicos a aquellos pacientes con más de 16.000 copias/ml durante al menos 6 meses. Resultados: Se analizaron 80 pacientes. La edad media al trasplante fue 1 año (r: 0,5-17a). Treinta y un niños desarrollaron I-VEB (38,7%) detectada por PCR, con o sin progresión a PTLD, a una mediana de 2,7 meses (0,2-29 m) postrasplante. El tiempo de seguimiento fue de 21,5 meses (3,6 – 40,1 m). El 61,3% (19/31) de los pacientes eran de alto riesgo serológico(D+/R-o R menor de 2 años) y el 64,5% (20/31) presentó rechazo agudo. De estos últimos el 60% lo hizo antes de la IVEB(12/20). El 54,8% fue portador crónico (17/31). Cuatro pacientes desarrollaron PTLD (global: 5%, I-VEB: 12.9%). La tasa de supervivencia global fue 95% (77/80) y en I-VEB fue 93,5% (29/31). Sólo una muerte fue relacionada con PTLD(1/4). Conclusión: El monitoreo con carga viral e inmunomodulación preventiva es una estrategia de manejo que ha permitido disminuir la enfermedad por VEB y PTLD. Sin embargo, la tasa de rechazo agudo en 77 Libro de resúmenes I-VEB fue superior a la media. El rechazo podría actuar como un factor de riesgo para el desarrollo de I-VEB o ser consecuencia de la reducción de la inmunosupresión utilizada para el control de la I-VEB. Los menores de 1 año y el alto riesgo serológico son factores determinantes para el desarrollo de I-VEB. 0192 DIAGNÓSTICO DE CITOMEGALOVIRUS CONGÉNITO A TRAVÉS DE LA DETECCIÓN GENÓMICA EN TARJETAS DE PESQUISA NEONATAL DURANTE EL 2014 EN EL HOSPITAL GARRAHAN D Viale, MD Borgnia, AD Núñez, A Lencina, MP Ochoa, O Jiménez, C Hernández Hospital de Pediatría "Dr. Juan P. Garrahan", Argentina. La infección por Citomegalovirus (CMV) durante la gestación puede transmitirse de la madre al feto resultando en una infección congénita. La infección congénita ocurre en un 0,2 a 2,2% de todos los nacidos vivos. El diagnóstico de la misma se realiza por detección del virus en saliva u orina durante las dos primeras semanas de vida por cultivo o técnicas de biología molecular. Si se efectúa más tarde y se detecta, ya no puede asegurarse que se trate de una infección congénita, sino que la presencia del virus puede deberse a una infección perinatal. Para confirmar se puede recurrir a una muestra que siempre se toma dentro de la primera semana de vida: la gota de sangre seca recolectada sobre la tarjeta de pesquisa neonatal. Esta sangre se analiza por técnicas de amplificación de ácidos nucleicos y su positividad confirma la infección intrauterina. El propósito del estudio es describir la experiencia del Laboratorio de Virología del Servicio de Microbiología del Hospital de Pediatría “Dr. J. P. Garrahan” con esta metodología durante el año 2014. Durante el 2014 se analizaron 22 tarjetas de pesquisa neonatal correspondientes a 22 pacientes con sospecha de infección congénita por CMV mediante la detección genómica del virus por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR-RT) desarrollada en nuestro servicio, incluyendo controles negativos y detección del gen de la β globina humana como control interno de cada reacción. Los pacientes estudiados tenían signos y/o síntomas compatibles con infección congénita y en 14 de ellos se había realizado la detección viral en orina previamente por PCR-RT. Las muestras de orina se enviaron en promedio 86 días después del nacimiento. En 10 de esas 14 muestras de orina se detectó genoma viral, pero la infección congénita se corroboró en 3 casos por detección en la tarjeta de pesquisa. Las 4 orinas negativas coincidieron con tarjetas negativas. Se recibieron 8 tarjetas sin muestras de orina previas, de las cuales 2 resultaron positivas, conformando un total de 5 infecciones congénitas detectadas. La detección genómica en las tarjetas de pesquisa neonatal resultó útil en los casos en los que el paciente ya había superado las dos semanas de vida al momento de recolección de la orina, permitiendo discriminar entre infección congénita y perinatal. Las tarjetas se conservan por largo tiempo, se obtienen de todos los recién nacidos, y se puede acceder a ellas de manera sencilla, por lo cual pueden utilizarse para múltiples propósitos, entre ellos, la detección retrospectiva del CMV en sangre y la confirmación de la transmisión intrauterina del virus. 0196 UTILIZACION DE CARTAS DE CONTROL PARA LA MEJORA CONTINUA EN TECNICAS DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS IN HOUSE PARA VIRUS HIV, HCV Y HBV E Gareca, MF Freytes, L Canavesio, A Ahumada Laboratorio de Hemoderivados Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. Introducción Las cartas de control se utilizan para seguir el desarrollo de los procesos de producción e identificar posibles inestabilidades y circunstancias anómalas. Este tipo de análisis permite controlar los procesos para asegurarse de que funcionan correctamente. En nuestro Laboratorio, esta metodología se implementó para técnicas NAT in house y nos permitieron tomar acciones para detectar y ajustar distintas variables que afectan directamente la performance del ensayo y mejorar el desempeño logrando mayor eficacia y eficiencia del proceso. Objetivo Aplicar herramientas de control de calidad que permitan tener conocimiento del estado de todo el proceso. Utilizar cartas de control para conocer la influencia de las variables de cada etapa, detectar las causas que modifiquen el desempeño (inhibiciones) contribuyendo a la gestión del control de proceso conformando una tarea pro‐activa y permanente con el fin de asegurar la calidad del resultado. Metodología Técnica in house para detección de AN virales HBV-MULIPLEX (HCVHIV): Extracción en columnas/retro-transcripción/amplificación PCRNESTED/revelado. Control interno: agregado como control de eficiencia de la reacción a través del cual se calcula el porcentaje de inhibiciones. Cartas control: Gráficos del porcentaje de inhibición por ensayo vs tiempo. Se dividieron 518 ensayos en cuatro periodos. Resultados Periodo 1: 148 ensayos con 26% inhibición promedio para HCV. Periodo 2: 81 ensayos con 29 % inhibición promedio para HCV. Periodo 3: 225 ensayos con 8% de inhibición promedio para HCV, 17% para MULTIPLEX, 10% HBV. Periodo 4: 64 ensayos con 11% de inhibición promedio para MULTIPLEX y 4% excluyendo muestras contaminadas, 3% de inhibición promedio para HBV y 2% excluyendo muestras contaminadas. Conclusiones Identificación de causas: En los períodos 1 y 2 se relacionó con variables propias de la técnica como reactivos, controles, fraccionamiento y almacenamiento de los mismos y condiciones ambientales de las salas de trabajo con los altos porcentajes de inhibición. Mejora del proceso: En el periodo 3 se incorporan nuevos ensayos, se realizaron mejoras en las variables mencionadas observándose una notable disminución de los porcentajes de inhibición. Seguimiento y estabilización: En el periodo 4 se logra la eliminación de las causas que afectaban al proceso con mejoras edilicias importantes lo que se evidencian con inhibiciones menores al 5%. El diseño y aplicación de cartas de control nos permiten detectar y prevenir las variables críticas que afectan significativamente la calidad del proceso, mejorando el desempeño y una gestión optima de procesos y recursos. 0206 EVIDENCIAS DE INFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E (HEV) EN INDIVIDUOS INMUNOSUPRIMIDOS DE CÓRDOBA, ARGENTINA. MB Pisano1, J Debes2, MG Martínez Wassaf3, M Lotto1, H Coseano4, LG Marianelli5, N Frassone5, MB Isa1, MS Contigiani1, D Balderramo4, VE Ré1 1 Instituto de Virología "Dr. Vanella", Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 2 Universidad de Minnesota, Minneapolis, USA, Estados Unidos. 3 Laboratorio de Virología y Biología Molecular, LACE, Argentina. 4 Hospital Privado, Córdoba, Argentina. 5 Hospital Rawson, Córdoba, Argentina. El virus de la hepatitis E (HEV) causa hepatitis aguda de transmisión entérica en escenarios epidémicos. En áreas de circulación endémica, la mayoría de las infecciones son asintomáticas, con casos agudos esporádicos, con la excepción de pacientes embarazadas, que pueden presentar hepatitis fulminante. Algunos reportes sugieren mayor prevalencia de HEV en inmunosuprimidos. Así, en varios países del mundo se han reportado casos de hepatitis crónica por HEV en dicha población, incluyendo transplantados de órganos sólidos y pacientes HIV (+). En Argentina poco se conoce acerca de la circulación de HEV. En el área Metropolitana se ha reportado una prevalencia de 1,8% en donantes de sangre y 6,6% en individuos HIV (+). En Córdoba, el valor de prevalencia de infección por este virus es de 4,4% en población general, pero no existen estudios acerca de la circulación del mismo en individuos con inmunosupresión. El objetivo de este trabajo fue investigar la evidencia de infección por HEV en individuos HIV (+) y hemodializados de Córdoba. Para ello, se realizó la determinación de IgG e IgM anti-HEV (EIA, Diapro, Milan), y la amplificación del ARN viral por RT-Nested PCR de la 78 Libro de resúmenes región genómica ORF2 en sueros obtenidos de individuos HIV (+) (20092010, n=95) y hemodializados pre-transplante renal (2014, n=83) que concurrieron a centros de salud de Córdoba. Del total de muestras analizadas, 16 resultaron positivas para la detección de IgG (8,99%): 8 correspondientes a individuos HIV (+) (8/95; 8,4%), y 8 a pacientes hemodializados (8/83; 9,6%). De éstas, se detectó IgM en 3 pacientes: 2 HIV (+) y 1 dializado. Solo 1 muestra, correspondiente a un individuo HIV (+) con síntomas de vómitos y diarrea, resultó positiva por PCR, con IgG (-) e IgM (-). En pacientes HIV (+), la prevalencia de HEV estuvo relacionada al conteo de células CD4, ya que la misma fue de 18% (5/27) en pacientes con media de valor de CD4 de 43 cel/mm3, mientras que en el subgrupo con media de valor de CD4 de 543 cel/mm3, la prevalencia fue de 4,4% (3/68) (p=0.03). Los resultados muestran los primeros datos de circulación de HEV en individuos adultos inmunosuprimidos de Córdoba y aportan nuevas evidencias de la mayor prevalencia hallada en este grupo respecto de la población adulta sana de la misma región, especialmente asociada a individuos con bajos niveles de CD4. La presencia de IgM y ARN viral daría cuenta de infecciones agudas por este virus. Los hallazgos obtenidos enfatizan la necesidad de expandir el conocimiento clínico y epidemiológico local de HEV en estas poblaciones, así como profundizar en la identificación de factores de riesgo para la infección crónica. 0216 FRECUENCIA DE DETECCION DE ENTEROVIRUS Y HERPESVIRUS HUMANOS EN LIQUIDO CEFALO RAQUIDEO DE PACIENTES PEDIATRICOS DE LA CIUDAD DE CORDOBA CON SOSPECHA DE ENCEFALITIS VIRAL V Nader, SL Grutadauria, L Jares, R de Elías, OI Kiener Laboratorio de Elías y Kiener SRL - Sanatorio Allende, Argentina. Los virus son agentes causales frecuentes tanto de encefalitis como de meningitis. Un diagnóstico certero y rápido es siempre beneficioso, tanto para establecer la terapia adecuada (en el caso de Herpes Simple) como para evitar el uso de medicamentos y gastos de hospitalización en infecciones por enterovirus, así como para establecer la etiología del cuadro clínico. En este estudio retrospectivo se reporta la frecuencia de detección de enterovirus y herpesvirus humanos en una población pediátrica. Se analizaron 96 muestras de líquido céfalo raquídeo remitidas por el Servicio de Neurología del Sanatorio Allende, entre Abril de 2013 y Enero de 2015 pertenecientes a pacientes menores de 11 años con sospecha de encefalitis de origen viral. Las muestras fueron conservadas a -70ºC y procesadas usando el reactivo Entherpex (Genómica, Coslada, España) que consiste en una RT-PCR múltiple que permite la determinación simultánea de los 8 herpesvirus humanos y enterovirus (Coxsackie, Echovirus y Polio). La reacción incluye un control interno de amplificación. La detección se realiza por medio de un microarray de baja densidad con lectura e interpretación automatizadas. El 22.1% de las muestras procesadas fueron positivas (23/96) para alguno de los agentes estudiados. Las frecuencias de detección y cantidad de casos positivos fueron: Herpes Herpes Virus Varicela Citomégalo Herpes Herpes Herpes Enterovirus Simple Simple EpsteinZoster Virus 6 7 8 1 2 Barr 50.0% 4.2% 8.3% 4.2% 4.2% 4.2% 12 1 2 1 1 1 12.5% 16.7% 0.0% 3 4 0222 COINFECCIÓN DE VIRUS DENGUE Y CHIKUNGUNYA EN VENEZUELA, ENTRE JULIO 2014 Y ENERO 2015. D Guerrero, D Morón, D Arteaga, R Hernández Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel", Venezuela. La fiebre de dengue, es causada por el flavivirus dengue (VD) el cual consta de cuatro serotipos perteneciente a la familia Flaviviridae, es la arbovirosis más prevalente en el trópico y regiones subtropicales, en la cual se ubica Venezuela. La fiebre por Chikungunya, es causada por el virus Chikungunya (CHIKV), un alfavirus de la familia Togaviridae, presente en África, Asia y recientemente en América. Tanto VD como CHIKV son transmitidas a los humanos principalmente por el mosquito Aedes aegypti. En ambas enfermedades la sintomatología frecuentemente encontrada incluye: fiebre, erupciones, artralgias, mialgias, cefalea, fatiga. El objetivo de este estudio consiste en reportar los hallazgos de coinfección de VD y CHIKV en muestras de pacientes sintomáticos provenientes de diferentes regiones de Venezuela entre julio 2014 y enero 2015 procesadas en el Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel” evaluando aspectos clínicos y epidemiológicos. En el marco del brote de CHIKV en Venezuela y aplicación de diagnóstico diferencial de VD, se procesaron 121 muestras agudas de casos notificados, como sospecha de fiebre Chikungunya según la definición de casos, contenidas en la Clasificación Internacional de Enfermedades (CIE-10 A 92.0). Para la detección de VD y CHIKV se empleó la técnica de RT-PCR en tiempo real (RT-PCRTR), siguiendo el protocolo del CDC de Atlanta del año 2010, y considerando las recomendaciones de la OMS/OPS del año 2011. Se encontraron 5 casos de coinfección VD y CHIKV en muestras de pacientes, todos de la región centro-costera del país. Los serotipos de dengue identificados fueron: VD-4 (3), VD-1 y VD-3 (1). 3 pacientes de sexo masculino y 2 femeninos, tres de ellos adultos jóvenes, un lactante menor y un anciano. Los signos y síntomas más frecuentes fueron fiebre, artralgias y erupción. Como parte de la confirmación del brote epidémico ocurrido en Venezuela en el año 2014 de fiebre Chikungunya, a un número importante de muestras de pacientes sintomáticos provenientes de diferentes regiones del país, se les realizó diagnóstico diferencial para VD encontrándose 5 casos de coinfección. Este hallazgo se podría explicar por la amplia distribución de vector Aedes aegypti en el país y con la probable implicación del Aedes albopictus en la transmisión de estos agentes virales, considerando además la condición de hiperendémica de VD en Venezuela. Estas condiciones son propicias para la ocurrencia de coinfecciones por VD y CHIKV. El alcance que tienes este tipo de estudio es enfatizar la importancia que tienen las medidas de control sobre el vector en la prevención de estas enfermedades, así como aportar información relevante para el manejo clínico del paciente. 0224 COMPARACIÓN DE DOS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS EN SANGRE SECA EN PAPEL DE FILTRO PARA DIAGNÓSTICO DE INFECCIÓN CONGÉNITA POR CITOMEGALOVIRUS C Theaux, M Hunt, C Aranda Hospital General de Agudos Dr. Carlos G. Durand, Argentina. 0 El agente causal más frecuentemente encontrado en esta población fue enterovirus. En dos casos se detectaron coinfecciones: uno con HSV 1 y HSV 2 y otro HSV6 y HSV 7. La metodología es de utilidad para satisfacer la demanda diagnóstica del cuerpo médico. Adicionalmente permite la detección de agentes virales no comúnmente considerados como probables causantes de encefalitis (Herpes 6 y herpes 7), posibilitando establecer la causa del cuadro clínico en pacientes que a menudo quedaban sin un diagnóstico etiológico. Introducción: La infección congénita por Citomegalovirus (CMV) es generalmente asintomática al nacimiento, y se manifiesta clínicamente meses o años después. La detección de ADN de CMV en sangre seca en papel de filtro (DBS) obtenida al nacer se acepta para su diagnóstico retrospectivo por su prolongada conservación. Existen diversos protocolos de diferente sensibilidad para la extracción de ácidos nucleicos (AN) en DBS. Objetivos: Comparar dos protocolos de extracción de AN a partir de muestras de DBS para la determinación de CMV por PCR real time (qPCR). Materiales y métodos: Se obtuvieron muestras de sangre entera (SE) de 9 donantes sanos; de cada una se tomó una alícuota y se le adicionó una alícuota (spiking) de estándar de CMV 1.106 copias/ul. En 3 de las muestras se cuantificó en este punto la concentración real de CMV por qPCR. Por cada mezcla de SE + CMV se llenó una tarjeta de papel de 79 Libro de resúmenes filtro (50 ul/círculo). Se dejaron secar 24 hs a temperatura ambiente, y luego se realizaron los dos protocolos de extracción de ácidos nucleicos, A y B. Protocolo A (adaptado de de Vries et al.): Incluye el agregado de Bacteria lysis buffer y una incubación overnight. Protocolo B (propuesto por el fabricante): Incluye el agregado de agua destilada y una incubación de 2 hs a 56°C. En ambos se continuó con el protocolo de extracción High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche). Con los extractos de AN obtenidos se realizaron qPCR para CMV y se obtuvo la concentración en DBS. significativa (p<0,05). En los pacientes de los que se dispuso de múltiples muestras de seguimiento, las curvas de las CV detectadas en CMP y SE mostraron una tendencia semejante y diferente al plasma. CONCLUSIONES: Las muestras de CMP y SE tienden a comportarse en forma semejante para la determinación de la carga de EBV. El plasma mostró el menor rendimiento analítico. Dadas las ventajas de procesamiento y desempeño, la SE sería la muestra de elección para determinar la carga de EBV en pacientes trasplantados, si bien faltaría analizar su utilidad clínica en relación al desarrollo de PTLD. Resultados: 0235 FRECUENCIA Y VARIACIÓN TEMPORAL DE GENOTIPOS DE HEPATITIS C EN PACIENTES REGISTRADOS EN LAS UNIDADES CENTINELA PARA HEPATITIS VIRALES, 2007-2014 SN Vladimirsky1, RED de U. Centinela para HV2, SS Soto1, NR Altabert1, LO Otegui Mares1, LS Brajterman1, MS Munne1, JE Gonzalez1 1 Laboratorio Nacional de Referencia para Hepatitis Virales-INEI -ANLIS "C. G. Malbrán", Argentina. 2 Ver listado completo en: www.hepatitisviral, Argentina. Concentración Concentración Concentración Concentración teórica en S.E. cuantificada en DBS protocolo A DBS protocolo B (cop/ml) SE (cop/ml) (cop/ml) (cop/ml) 1 1.107 Inferido* 1. 106 2,76 . 104 6,55 . 105 2 1.10 7 Inferido* 1. 10 6 1,66 . 10 5 1,69 . 105 3 1.10 7 Inferido* 1. 10 6 9,92 . 10 4 1,15 . 105 4 1.107 Inferido* 1. 106 2,33 . 105 6,43 . 105 5 1.10 7 6 4 4,13 . 105 6 1.107 3,33 . 104 3,67 . 105 3 6,20 . 105 7 8 9 Inferido* 1. 10 Inferido* 1. 106 1,11 . 10 7 1,11 . 10 7 1,11 . 10 7 4,09 . 10 2,54 . 10 6 5,64 . 10 2,15 . 10 6 No detectable 2,12 . 10 6 3,70 . 10 3 2,17 . 105 3,02 . 105 (*) Inferido a partir de las concentraciones cuantificadas por qPCR en muestras 7, 8 y 9. Conclusiones: La recuperación fue mayor con el protocolo B. Además, B presenta mayor practicidad, estabilidad y es más económico siendo por lo tanto el método de elección. Se requeriría en una próxima etapa la evaluación del protocolo B con muestras positivas de pacientes con CMV. 0234 COMPARACIÓN DE LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE VIRUS EPSTEIN-BARR (EBV) MEDIDA EN DISTINTAS MUESTRAS DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES PEDIÁTRICOS TRASPLANTADOS MD Fellner1, KA Durand1, S Nuñez1, MD Borgnia2, D Viale2, ME Venuta2, LV Alonio1, MA Picconi1 1 Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas Carlos G. Malbrán, Argentina. 2 Hospital de Pediatría Prof. Dr. J. P. Garrahan, Argentina. La infección por EBV en pacientes trasplantados (Tx) se asocia al desarrollo de PTLD. Su detección temprana es crítica ya que una intervención terapéutica oportuna permite evitar el estadío irreversible de linfoma. Se ha demostrado que niveles elevados de ADN de EBV preceden al desarrollo de PTLD, por lo que la carga viral (CV) se utiliza como marcador de riesgo. Diferentes muestras clínicas (células mononucleres periféricas, CMP; sangre entera, SE; plasma, PL) se emplean para cuantificar EBV; sin embargo, todavía no hay consenso sobre cuál sería la óptima de acuerdo a sus ventajas de procesamiento, desempeño analítico y utilidad clínica. OBJETIVO: comparar las cargas de EBV en diferentes muestras clínicas de pacientes trasplantados pediátricos. MATERIALES Y MÉTODOS: Se estudiaron 155 muestras pareadas de células mononucleares periféricas (CMP), sangre entera (SE) y plasma (PL), provenientes de 93 pacientes trasplantados. Se determinó la carga viral utilizando un método artesanal de PCR en tiempo real, desarrollado y validado en nuestro laboratorio, que amplifica un fragmento de 73 pb del gen que codifica EBNA-1. Los datos se analizaron con el programa WinPEPI ETC, versión 2.56. RESULTADOS: La CV fue detectable en el 84,5%, 73,5% y 30,1% de las muestras de CMP, SE y PL, respectivamente, observándose una menor sensibilidad en plasma con respecto a CMP (p<0,05) y SE (P< 0,05). Se observaron resultados discordantes de detección en el 14,8% de CMP vs SE, 45,8% de SE vs PL y 55,8% de CMP vs PL. Las cargas virales que fueron cuantificables en CMP y SE mostraron una correlación Introducción: En Hepatitis C la duración del tratamiento, las tasas de curación y la necesidad de interferón y ribavirina como adyuvante en la era de los antivirales de acción directa continúa siendo dependiente en parte del subgenotipo viral. Se han publicado varias revisiones que reportan la prevalencia relativa de los genotipos a nivel global que incluyen a la Argentina, pero estas revisiones no muestran la variabilidad dentro del país, las modificaciones temporales en los últimos años, ni la asociación de los genotipos con los factores de riesgo. Las Unidades Centinela para Hepatitis Virales (UC) registran información clínica, epidemiológica y demográfica de pacientes con Hepatitis Virales en un software “at hoc”, que incluye el registro de genotipos y subtipos de HCV. Objetivo: Analizar la distribución de genotipos y subtipos del virus de la Hepatitis C, los factores de riesgo asociados y la tendencia temporal en casos de Hepatitis C registrados en el software de UC en el período enero 2007setiembre 2014 Métodos: La base de datos del software de UC fue analizada usando herramientas descriptivas e inferenciales de Excel y SPSS. Se analizaron las variables: Genotipo (Gt), Sub-Genotipo (sGt), edad (>40, <=40), sexo, consumo de drogas intravenosas (DEV), condición frente al HIV, cirugía (Cr) y transfusión. Para el análisis temporal se consideró el período 2007-2010 frente a 2011-2014. Se consideró estadísticamente significativo p valor < a 0.01. Resultados: 17 de 27 UC habilitadas para la carga registraron 365 Gt. 6 UC cargaron 28 ó más casos. Gt1 fue el más prevalente: 66% -22%sGt 1a 43% sGt 1b-, seguido por Gt 2 21%, Gt 3 12% y Gt 4 1%. La prevalencia de Gt 2 en la UC de la ciudad de Córdoba fue de 42 %, mientras que en las otras UC que registraron 28 casos ó más varió entre 0% y 28%. sGt1a (en relación a sGt 1b) estuvo asociado con (OR, IC 95%): edad <=40 (4.37, 2.31-8.24), sexo masculino (2.37, 1.34-4.15), DEV (3.70, 1.59-8.62) HIV+ (8.18, 2.59-25.8), Cr (0.41, 0.22-0.77). En el análisis multivariado permanecen asociados: edad <=40 (3.50, 1.75-7.00) y HIV+ (5.89, 1.69-20.47) La frecuencia de Gt 2 disminuyó a partir de 2011: 25% vs 13%. Aunque sin significación estadística, Gt 3 aumentó a partir de 2011: 10% vs 16%. Gt2 es más frecuente en mayores de 40 años. Conclusiones: En esta serie Gt 1 es el más prevalente. En Córdoba la frecuencia relativa de Gt 2 es mayor que en la otras UC. La frecuencia de Gt 2 está en disminución. Como se describió previamente, el sGt 1a es más frecuente en pacientes más jóvenes. Estos resultados son consistentes con que el sGt 1a emergió posteriormente al sGt 1b y por lo tanto es más frecuentemente encontrado en individuos jóvenes y con factores de riesgo asociados a 80 Libro de resúmenes conductas, tales como el consumo de drogas endovenosas y la condición de HIV positivo. 0241 COMPARACIÓN DE ENSAYOS DE PCR EN TIEMPO REAL COMERCIAL Y ARTESANAL PARA LA DETERMINACIÓN DE LA CARGA DE VIRUS EPSTEIN-BARR (EBV) EN SANGRE ENTERA MD Fellner1, KA Durand1, S Nuñez1, MD Borgnia2, D Viale2, ME Venuta2, LV Alonio1, MA Picconi1 1 Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas Carlos G. Malbrán, Argentina. 2 Hospital de Pediatría Prof. Dr. J. P. Garrahan, Argentina. El monitoreo de la carga viral es útil en el diagnóstico y seguimiento de enfermedades asociadas al virus Epstein-Barr (EBV), como los desórdenes linfoproliferativos post-trasplante (PTLD). En la actualidad no hay todavía consenso sobre la estrategia metodológica óptima para medir la carga de EBV. Se han descripto una amplia diversidad de ensayos que utilizan distintos métodos de PCR (tipo de PCR cuantitativa, comerciales o artesanales, fragmento viral amplificado), tipos y cantidad de muestra clínica a analizar, controles para estandarizar los ensayos, expresión de los resultados, entre otros. Todo esto hace que sea difícil comparar los datos publicados, así como extrapolar los valores de referencia de un laboratorio a otro. OBJETIVO: comparar las cargas de EBV determinadas con un método artesanal y otro comercial sobre sangre entera de pacientes pediátricos trasplantados. MATERIALES Y MÉTODOS: Se estudiaron 157 muestras de sangre entera (SE) de pacientes pediátricos trasplantados. Se determinó la carga viral utilizando un método artesanal de PCR en tiempo real, desarrollado y validado en nuestro laboratorio, que amplifica un fragmento de 73 pb del gen que codifica EBNA-1, y uno comercial (Nanogen) que amplifica otro fragmento del mismo gen. Los datos se analizaron con el programa WinPEPI ETC, versión 2.56. RESULTADOS: La CV fue detectable en el 73,9% y 70,7% de las muestras de SE medidas con el método artesanal y comercial, respectivamente, demostrando una sensibilidad semejante (P> 0,05). Se observaron resultados discordantes en la detección del 15,9% de los casos, siendo el 60,0% de estas muestras detectadas por el método artesanal y el 40,0% por el comercial (p>0,05). Las cargas virales cuantificables por ambos métodos mostraron una correlación significativa (p<0,05). Los resultados de CV obtenidos con el método artesanal resultaron en promedio 0,86 log mayores que con el método comercial, el 82,2% mostró una diferencia mayor a 0,5 log. CONCLUSIONES: Los métodos analizados (artesanal y comercial) se comportaron de forma semejante para medir la carga de EBV en muestras de sangre entera. Sería deseable que ambos métodos fueran calibrados con el estándar internacional actualmente disponible, lo que permitiría medir valores absolutos y mejorar su aplicación clínica. 0243 ENTEROVIRUS EN LCR DE INFANTES URUGUAYOS L Garcia Aguirre1 2, E Hernández1 1 Laboratorio de Biología Molecular. Dpto de Patología Clínica. Centro Hospitalario Pereira Rossell. Administración de Servicios de Salud del Estado (ASSE), Uruguay. 2 Laboratorio de Virología Molecular. CIN. Facultad de Ciencias. Udelar, Uruguay. INTRODUCCION: Los virus del género Enterovirus son miembros de la familia Picornaviridae, y presentan un genoma ARN+, de 7500 bases. Infectan humanos y animales provocando diversas enfermedades, que pueden ser desde asintomáticas a mortales. EV 71 y EV 68 han sido relacionados en los últimos años con cuadros graves de meningitis aséptica y alteraciones respiratorias en niños, respectivamente. Se clasifican en polio y no-polio, siendo estos últimos de amplia distribución en la infancia. Los Enterovirus son los agentes causales de neurovirosis mas frecuentemente encontrados en Pediatría en nuestro hospital. OBJETIVOS: Tipificar los Enterovirus no-polio causantes de neurovirosis en niños que consultaron en el Centro Hospitalario Pereira Rossell (CHPR) en el período 2012-2014. MATERIALES: Se cultivaron 72 muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) en células RD proporcionadas por la Dra. María Cecilia Freire del Instituto Dr. Malbrán de Buenos Aires. Se realizaron 3 pasajes y se extrajeron los ácidos nucleicos del sobrenadante del cultivo. Se realizó una transcripción reversa y amplificación por PCR (Onestep, Qiagen) del gen de la proteína de la cápside viral, VP1. Se secuenciaron los productos de PCR y se alinearon con las cepas de referencia de Enterovirus. Se realizó un análisis filogenético de las cepas que determinó el genotipo de las mismas. Se analizaron los parámetros citoquímicos de los LCR: proteinorraquia, glucorraquia, lactato y células. RESULTADOS: Se obtuvieron 18 secuencias de Enterovirus que correspondieron a 9 genotipos diferentes: CV-B1, CV-B3, CV-B5, E3, E5, E6, E11, E13 y E18, pertenecientes a la especie de Enterovirus Humanos del grupo B (HEV-B). No se observaron cepas de EV71 ni EV68. Las cepas E11 se concentraron en los meses de abril-junio, a diferencia de las demás cepas que se distribuyeron en los meses de noviembremarzo. Todos los casos en los que se detectó E11 tenían menos de 2 meses de vida, presentaron un cuadro de fiebre sin foco y el cuadro se resolvió sin secuelas. La mayoría de los niños afectados por las restantes cepas también fueron menores de 2 meses. Los parámetros citoquímicos del LCR fueron normales en el 40% de los pacientes. La proteinorraquia fue el parámetro más sensible. CONCLUSIONES: En la población estudiada, las neurovirosis fueron causadas por los genotipos CV-B1, CV-B3, CV-B5, E3, E5, E6, E11, E13 y E18 que no conformaron un brote en el período estudiado. No se detectaron EV71 ni EV68. Las cepas de E11 se concentraron al final del período estacional esperado. Los parámetros citoquímicos del LCR pueden ser totalmente normales en casos de neurovirosis de niños pequeños. 0266 INFECCIÓN POR VIRUS JC EN RECEPTORES DE TRASPLANTE RENAL E Frangi, H Diaz de Arce, BI Livellara, JM Oyhamburu Servicio de Biología Molecular, Laboratorio Central, Hospital Italiano de Buenos Aires., Argentina. El virus JC (JCV) es un virus DNA miembro de la familia Polyomaviridae, con elevadas tasas de seroprevalencia, que establece infección de bajo nivel o latente en células derivadas de la médula ósea y del tracto renourinario. Si bien la reactivación de otro Polyomavirus humano, el virus BK (BKV), es común en receptores de trasplante renal y, se asocia con nefropatía y otras enfermedades del tracto urinario, relativamente pocos estudios han sido publicados con relación a la replicación de JCV en pacientes trasplantados renales, solo o en co-infección con BKV y los mismos exhiben resultados contradictorios. El objetivo de este estudio fue investigar la replicación de polyomavirus JCV sólo y en co-infección con BKV en el tracto urinario de receptores de trasplante renal. Se colectaron muestras de orina de adultos receptores de trasplante renal atendidos en el Hospital Italiano de Buenos Aires que fueron monitoreados prospectivamente durante el período de un año a intervalos variables aproximados de tres meses. El ADN total fue extraído usando el MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I (Roche Diagnostics GmbH, Germany). La detección de ADN se realizó por PCR en tiempo real con LightMix Kit Polyomaviruses JC and BK (TIB MOLBIOL GmbH, Berlin, Germany) en el instrumento LightCycler 480 (Roche, Germany). Las características demográficas de la población evaluada correspondieron a 128 y 200 pacientes femeninos y masculinos respectivamente, con una media de edad de 35 años. Los inmunosupresores más ampliamente usados fueron tacrolimus, ciclosporina y ácido micofenólico. La media del número de muestras de orina obtenida por paciente durante el curso del estudio fue de 3 (rango de 1 a 7); con 665 muestras de orina analizadas en total. El estudio mostró las siguientes tasas de infección: sólo JCV 73/328 (22,3%); sólo BKV 96/328 (29,3%); ambos, JCV/BKV 9/328 (2,7%), negativos 150/328 (45,7%). Los pacientes con infección activa por JCV mostraron una carga viral media de log 4.2 copias/mL de orina, intervalo (log 1.8 a mayores de log 7). En todos los pacientes que mostraron infección por JCV el virus fue detectado en el 100% de las muestras de orina colectadas durante el curso del estudio. 81 Libro de resúmenes Este estudio mostró una elevada tasa de infección, con un rango medio-alto de cargas virales en orina de JCV en receptores de trasplante renal. En particular, resultó interesante la persistencia de la infección por JCV, que lejos de ser transitoria, se extendió a todo el período evaluado en la totalidad de los pacientes detectados positivos. Este estudio brinda resultados que contribuyen a sustentar el potencial patogénico del poliomavirus JC en receptores de trasplante renal. Considerando que el tamizaje de la replicación viral es una herramienta crucial en la identificación de pacientes trasplantados en riesgo de desarrollar nefropatía, recomendamos realizar monitoreo de la infección por el virus JC durante al menos un año luego de realizado el trasplante. 0278 IMPLEMENTACION DE TÉCNICAS MOLECULARES PARA LA AMPLIACIÓN DEL DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BAJAS EN PACIENTES PEDIÁTRICOS LE Valinotto1 2, E Tittarelli1 2, S Goya1, MI Natale1, SB Lusso1, MA Marques1, J Cipelli1, PR Barrero1 2, M Viegas1 2, AS Mistchenko1 3 1 Laboratorio de Virología Hospital de Niños “Ricardo Gutiérrez”, Argentina. 2 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, Argentina. 3 Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires, Argentina. Actualmente la inmunofluorescencia (IF) permite determinar la etiología viral del 40% de las infecciones respiratorias agudas bajas (IRAB). El análisis del impacto de los virus respiratorios en su conjunto requiere incorporar métodos moleculares, tales como PCR en tiempo real (qPCR), que posibilitan aumentar el número de agentes detectados así como hallar virus en bajo número de copias y en infecciones múltiples. Los objetivos fueron ampliar la detección de virus asociados a IRAB en niños utilizando protocolos de detección por qPCR; evaluar sensibilidad, especificidad y reproducibilidad de qPCR frente IF y definir un algoritmo de progresión de complejidad de los métodos de diagnóstico convencionales y moleculares para la detección de virus respiratorios. Se analizaron aspirados nasofaríngeos (ANF) de niños hospitalizados en instituciones de CABA por IRAB durante un período de 30 meses corridos. Se utilizó la técnica de IF para detectar virus sincicial respiratorio (RSV); adenovirus (AdV); parainfluenza (PIV) 1, 2 y 3; influenza (INF) A y B, y protocolos de qPCR para detectar y cuantificar RSV, AdV, PIV1, PIV2, PIV3; INFA H1N1 y H3N2 e INFB, rinovirus y enterovirus (PER); bocavirus (BoV) y coronavirus (CoV). Se construyeron controles sintéticos con los que se realizaron curvas de calibración para evaluar la eficiencia y la sensibilidad en valores absolutos y relativos al número de células presentes en la muestra. Con los protocolos de qPCR seleccionados se analizaron 200 muestras al azar entre la población de aproximadamente 12000 ANF analizados por IF en el período de estudio. El número de casos detectados por qPCR para cada virus fue considerablemente mayor que la detección por IF. Se determinó la sensibilidad de IF para la detección de RSV, INFB, INFA H3N2 y AdV, siendo mayor a: 5, 15, 3 y 20 copias/célula, respectivamente. Para el caso de PIV3 e INFA H1N1 no se encontró relación entre la carga viral y la capacidad de detección por IF. Además, por qPCR se detectaron ácidos nucleicos (AN) de MPV; PER; BoV y CoV (en 8, 51, 37 y 2 muestras respectivamente). Todo lo mencionado anteriormente incrementó el porcentaje de positividad del 66% al 90% de las muestras analizadas, permitiendo otorgar un diagnóstico virológico a un mayor número de pacientes. Adicionalmente, en el 53% de las muestras analizadas se detectaron AN de múltiples virus (hasta 6 en la misma muestra). Este estudio permitió correlacionar carga viral con la capacidad de detección por IF, ampliar el número de virus detectados y detectar coinfecciones. A partir de este proyecto se puso en marcha la detección molecular de rutina tanto cuali- como cuantitativa de virus respiratorios en nuestro laboratorio ya que permitió definir un algoritmo para el diagnóstico de virus respiratorios. Además, el uso rutinario de qPCR proveerá la información necesaria que permitirá asociar el número de copias detectado con la enfermedad, portación, excreción y transmisión viral. 0279 DETECCIÓN MOLECULAR DEL VIRUS PAPILOMA HUMANO DE ALTO RIESGO ONCOGÉNICO EN EL SEGUIMIENTO DE MUJERES TRATADAS POR LESIÓN ESCAMOSA INTRAEPITELIAL. LABORATORIO CENTRAL DE SALUD PÚBLICA. PRIMEROS RESULTADOS. ML Bobadilla1, V Villagra1, ME Zorrilla1, P Pratt1, G Roscher2, F Franco2 1 Laboratorio Central de Salud Publica, Paraguay. 2 Hospital San Pablo, Paraguay. El cáncer de cuello uterino (CCU) es la primera causa de muerte por cáncer en mujeres en países en vías de desarrollo. En Paraguay la incidencia es superior que en países vecinos; 34,2 por 100.000 mujeres, con tasa de mortalidad de 15,7 por 100.000 mujeres. La infección persistente por el virus papiloma humano (VPH) es factor necesario en lesiones intraepiteliales escamosas (SIL) y CCU que se tratan con el procedimiento de escisión electroquirúrgica de lazo (LEEP), crioterapia y conización existiendo posibilidad de recidiva o de desarrollar CCU. La citología cervicovaginal es el método mayormente utilizado para detectar el CCU y el uso combinado de la citología con el test de detección de ADN viral a los seis meses post-tratamiento aumenta la efectividad para identificar mujeres tratadas con riesgo de desarrollar SIL residual y recidivas. El objetivo de este estudio descriptivo de corte transverso fue describir la frecuencia de VPH-AR en mujeres tratadas 6 meses antes de la toma de muestra para VPH por SIL en el Servicio de Patología Cervical del Hospital San Pablo de enero a diciembre de 2014. Los estudios citológicos fueron clasificados según Bethesda 2001. Se utilizó el sistema Cobas 4800 HPV Test (Roche) para la detección individual de genotipos de VPH 16 y 18, y un pool de 12 VPH-AR (31, 33, 35, 39, 45, 51, 56, 58, 59, 66 y 68). Se incluyeron 80 pacientes para control post tratamiento por SIL. La edad de las mujeres fue de 34 ± 12,4 años. El inicio de las relaciones sexuales fue de 18 ± 7,4 años y el 47% con más de una pareja sexual. El uso de anticonceptivos hormonales fue referido por el 15,7% y se declararon fumadoras 2,4 %. Previo al tratamiento, el 81% (65/80) presentó diagnóstico confirmado de SIL de bajo grado (LSIL) y el 19 %(15/80) de SIL de alto grado (HSIL). Se detectó VPH-AR en un 7,5% (6/80) de las pacientes tratadas por SIL, 3/6 con diagnóstico previo de LSIL y 3/6 con diagnóstico previo de HSIL. Se identificó el VPH-16 en 3/6 de los casos positivos. En Paraguay existe alta incidencia de lesiones pre-neoplásicas y CCU siendo un problema de salud pública. La detección de VPH-AR por el sistema Cobas 4800 en mujeres tratadas por SIL mostró 93% de negativización de la infección por VHP-AR en el control post tratamiento comparable con trabajos previos en la región y en nuestro país hecho de gran importancia, ya que se demuestra, por medio de este test la efectividad del tratamiento médico establecido. La detección de ADN de VPH-AR que identifique separadamente los genotipos 16 y 18 podría contribuir a identificar grupos de mujeres quienes podrían recibir un seguimiento más cercano. Por su relevancia clínica, la prueba del VPH optimiza el seguimiento post-tratamiento y conduce a la selección eficiente de un subgrupo en riesgo de una lesión invasora. Una prueba de VPH negativa post-tratamiento tiene valor predictivo negativo de casi el 100%, lo que permite aumentar el intervalo de tiempo en un seguimiento de rutina. 0290 LESION LIQUENOIDE ORAL. REPORTE DE CASO CLÍNICO RF Venezuela1, A Talavera2, AX Kiguen1, R Panico2, JP Mosmann1, R Ferreyra de Prato3, C Cuffini1 1 Instituto de Virologia "Dr. J. M. Vanella " FCM-UNC, Argentina. 2 Cátedra de Estomatología "A" Facultad de Odontología UNC, Argentina. 3 Cátedra de Anatomia Patológica de la Facultad de Odontología UNC, Argentina. La Lesión Liquenoide Oral (LLO) es un Desorden Potencialmente Maligno mucocutáneo crónico, de carácter inflamatorio y etiología desconocida. La LLO es de ubicación unilateral e histopatológicamente presenta displasia epitelial y un mayor potencial de malignización que el Liquen Plano Oral (LPO). El principal inconveniente en el manejo de este tipo de lesiones es su naturaleza crónica con periodos de actividad y remisión. Se presenta un caso clínico de LLO de 7 años de evolución. Paciente femenino, que concurrió en el año 2008, a la Fac. de Odontología-UNC refiriendo dolor de lengua. Durante la anamnesis no presentaba 82 Libro de resúmenes factores de riesgo convencionales (tabaco, alcohol), pero sí otros de orden general: hipertensión arterial, desordenes emocionales y factores locales irritativos, mecánicos traumáticos físicos y químicos. En el análisis clínico estomatológico se observaron múltiples lesiones en el lado izquierdo de la lengua (manchas blancas, rojas, queratosis y erosiones) con características citopatológicas de grado III con displasia moderada, el diagnóstico histopatológico fue compatible con LLO con coilocitos y displasia epitelial moderada. Se implementó tratamiento interdisciplinario: local (odontoestomatológico y fonoaudiológico) para actuar sobre los factores irritativos y general (médico-psicológico) para estabilizar presión arterial y estado emocional. Se realizaron biopsias de control en el año 2009 y 2011, con los mismos resultados histopatológicos que 2008. Sin embargo, no se detectó la presencia de Virus Papiloma Humano (VPH) por PCR en ninguna de las muestras. En el año 2013; se observó una reactivación de la enfermedad, por lo que se obtuvo una cuarta biopsia. Se diagnosticó Leucoplasia Verrugosa Proliferativa con displasia grave. Por biología molecular se detectó la presencia de VPH genotipos 6, 16 y 53. Luego de consultas interdisciplinarias se indica la administración de vacuna tetravalente para VPH y se deriva al Servicio de Cabeza y Cuello para extirpación completa de las lesiones. Se confirmó el diagnóstico de Carcinoma escamoso mínimamente invasor con márgenes libres. Al cabo de seis meses, la paciente presentaba pequeñas lesiones compatibles con la infección de VPH. Por este motivo, se realizó tratamiento local con ácido tricloroacético e inmunomodulador hasta remisión. En su último control (Marzo 2015) hay remisión clínica total de las lesiones. Este caso nos permite inferir que la evolución de las LLO podría verse condicionado por el genotipo de VPH detectado. Debido a que se trata de una patología muy dinámica y agresiva requiere de controles clínicos frecuentes y ante la presencia de cualquier cambio realizar citología exfoliativa y biopsia, a los fines de diagnosticar precozmente una posible transformación maligna y su tratamiento debe ser abordado de una manera interdisciplinaria y multiterapeutica. 0291 LA ESTIMACIÓN DEL LIMITE DE DETECCION EN MÉTODOS MOLECULARES DE DIAGNOSTICO VIROLÓGICO. DIFERENCIAS EN LA APLICACIÓN DE LOS MODELOS PROBIT Y POD/LOD M Rodriguez1, L Irazu1, N Bueno1, R Bonaventura2, A Mariotti2, MC Freire2 1 INEI ANLIS "Carlos G Malbran", Argentina. 2 Servicio Neurovirosis ANLIS "Carlos G Malbran", Argentina. La estimación del límite de detección (LoD), antiguamente denominado Sensibilidad Analítica, es un parámetro de Validación Analítica, y es parte componente de la “calidad analítica” de un reactivo de diagnóstico (IVD), en la practica del diagnóstico molecular de enfermedades virales, se interpreta erróneamente como parámetro de “calidad diagnóstica”, pero no necesariamente es reflejo de los parámetros de performance diagnóstica (Sensibilidad Diagnóstica Relativa, entre otros). El cálculo de LoD tienen un error asociado a: la variabilidad a concentraciones cercanas al blanco, el tipo de modelo y diseño experimental utilizado, ambos dependientes del número de repeticiones por nivel de concentración y de la cantidad de niveles de concentración ensayados. Este error se refleja en la amplitud del intervalo de confianza del 95%(AM IC95) y generalmente no es declarado por los laboratorios comerciales en los insertos. Nuestro objetivo consistió en estimar el LoD con los modelos PROBIT y POD/LOD para un IVD “in house” de diagnóstico de Virus BK (BKV), utilizando tres diseños experimentales, con el fin de describir las diferencias obtenidas con ambos modelos. Se utilizó un método de cuantificación de virus BK “in house”real time PCR, desarrollado en el Servicio de Neurovirosis, para la obtención de los calibradores se expresó un plásmido de ADN, y se prepararon muestras con 13 niveles de concentración entre 1x108 y 3 copias ADN /reacción. Las mismas se ensayaron por 20 días. Los diseños utilizaron distinto número de repeticiones: 40, 30 y 20 replicados en total por nivel de concentración. Se estimó el LoD 95% modelo Probit con el programa SPSS V17 y con el Modelo POD /LOD utilizando POD/LOD calculation programe V6 obteniendose los siguientes resultados: Límite de detección (copias / reacción) Modelo1 (N:40) Modelo 2 (N:20) Modelo3 (N:10) límite límite Amplitud inferior superior del IC95% del IC 95% del IC 95% Probit 45.02 28.80 98.54 69.74 POD/LOD 32.57 25.47 41.64 16.18 Probit 40.50 22.67 159.78 137.11 POD/LOD 29.60 20.98 41.76 20.79 Probit 52.16 24.11 679.30 655.19 POD/LOD 34.97 21.66 56.47 34.81 Cuando el número de réplicas disminuye, la AMIC95 se incrementan para ambos modelos. Para 10 réplicas el LoD Probit, fue de 52 copias/reaccion AM IC95: 655 copias/reacción y solo 34.81 copias/ reacción para POD/LOD. Se observan diferencias del orden de 1 log para AM IC95 por Probit entre 40 y 10 replicados, 69.74 y 655.19 respectivamente. Dependiendo del modelo y del diseño experimental utilizado, la estimación de LoD varía, y su ponderación debería ser realizada considerando la amplitud del IC 95. 0292 DESAFÍOS DIAGNÓSTICOS DE LAS MENINGOENCEFALITIS VIRALES EN LA PROVINCIA DE CÓRDOBA MG Barbás, GM Castro, MP Sosa, MJ Sosa, M Borda, A Cudola Laboratorio Central de la provincia de Córdoba, Argentina. El Sistema Nervioso Central (SNC) es susceptible a infecciones por diversos agentes tales como virus, bacterias, hongos y parásitos. Diferentes virus están asociados con las infecciones del SNC. Su frecuencia varía anualmente, varía según el grupo etario, depende de los programas de vacunación instaurados y de la exposición a reservorios animales o vectores, entre otros factores. Las meningoencefalitis son enfermedades sujetas a notificación obligatoria desde 1960 (Ley Nº 15.465) y a partir de 1994, se implementó el Sistema de Vigilancia Intensificada para meningoencefalitis. En Córdoba, el Laboratorio Central del Ministerio de Salud, es el laboratorio de Referencia provincial, trabajando coordinadamente con el área de epidemiología y los centros de salud. Desde 2010 realiza el diagnóstico virológico de todos los casos con sospecha de meningoencefalitis de origen viral. El objetivo de este estudio es determinar la incidencia de los principales agentes virales productores de meningoencefalitis en la provincia de Córdoba, durante el período 2010-2013. Se estudiaron un total de 821 muestras de LCR correspondientes a pacientes con sospecha de meningoencefalitis viral. Mediante la Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR) se detectaron los siguientes agentes virales: Herpes Simplex 1 y 2 (HSV-1/2), Citolmegalovirus (CMV), Varicela Zóster (VVZ), Epstein Barr (EBV), todos ellos en/sobre plataforma LightCycler® 2.0 - Roche; Enterovirus (protocolo I. Casas et al. - J. of Vir. Meth. 66:39-50-1997) y Flavivirus (SLEV: Hull et al.-Diagn. Microb. Infect. Dis. 62(3):272-279-2008 y WNV: Lanciotti et al.-J. of Clin. Mic. 38(11):4066-4071-2000). En el período 2010-2011, se estudiaron un total de 158 pacientes (61% niños y 39% adultos). En un 5% (8) de los pacientes analizados se detectó alguno de los agentes virales estudiados: 6 muestras pediátricas positivas para HSV y 2 muestras de adultos positivas para HSV y CMV respectivamente. Durante el período 2012-2013, se estudiaron un total de 663 pacientes (51% niños y 49% adultos). El 15% (100) resultó positivo para alguno de los agentes virales estudiados. De estos, el 22% (74) correspondieron a muestras pediátricas: 70 Enterovirus, 2 HSV-2, 1 VVZ, 1 CMV y 8% (26) muestras de adultos: 13 Enterovirus, 6 HSV-1/2, 5 CMV y 2 EBV. En referencia al diagnóstico de Flavivirus, durante dicho período, se estudiaron 213 muestras de LCR para la detección de anticuerpos de tipo IgM anti-Flavivirus (MAC-ELISA), 153 adultos y 60 niños. De ellas, 7% resultaron reactivas para IgM anti-Flavivirus. 83 Libro de resúmenes En el presente estudio, los principales agentes etiológicos detectados fueron Enterovirus y HSV, tanto en niños como en adultos. Conocer estos datos, es fundamental para la vigilancia de meningoencefalitis, su notificación y diagnóstico diferencial y para permitir, no sólo la oportuna implementación de las medidas de control, sino también para poder tomar medidas de salud pública adecuadas, de acuerdo a la situación epidemiológica local. 0300 EFECTO DE LOS ERITROCITOS SOBRE LA PRODUCCIÓN VIRAL EN MACRÓFAGOS DERIVADOS DE MONOCITOS INFECTADOS CON EL VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA TIPO 1. L Fazzi, CG Cevallos, RD Rabinovich, MM Ávila Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida, (INBIRS), Universidad de Buenos Aires /CONICET, Buenos Aires, Argentina., Argentina. Nuestro grupo y otros autores han demostrado en pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1, por sus siglas en ingles) que una fracción importante del virus circulante se encuentra unido a eritrocitos (HIV-E). Además, in-vitro se observó que el HIV-E podría mantener su infectividad intacta. Durante el proceso de clearence en el hígado y bazo los eritrocitos (E) entran en estrecho contacto con macrófagos residentes, lo que daría un ambiente adecuado para la infección de estas células. Así el HIV-E puede ser de importancia en la formación y alimentación de estos reservorios. Una vez que se establece la infección en éstos macrófagos y ante un nuevo contacto con los E hay una interacción entre los receptores de membrana de los E y el virus que está brotando. Estudios previos de nuestro grupo demostraron que en cultivos de macrófagos derivados de monocitos (MDM) la presencia de E aumenta la cantidad de virus en el sobrenadante del cultivo de manera significativa. Por lo tanto, el siguiente trabajo se centra en la cinética de producción de MDM infectados con HIV-1 en presencia y ausencia de E. Para el estudio se utilizaron MDM obtenidos de dadores sanos infectados con HIV-1 de cepa BaL y eritrocitos purificados con Dextran. Al día 14 post-infección los MDM se incubaron a distintos tiempos (5, 15, 30 y 60 minutos) con E o RPMI como control. La producción viral del los MDM se evaluó midiendo antígeno p24. La producción total de los MDM en presencia de E se toma como la sumatoria de la medición de Agp24 en el sobrenadante más el asociado a E. Al analizar la cinética de producción viral de los MDM en el cultivo sin E, el punto de mayor producción viral se observó a los 30 minutos con una caída significativa de la misma a los 60 minutos. En cambio, en presencia de E el punto máximo de producción total se observó a los 15 minutos y no se observó una caída en la producción en los siguientes puntos medidos. Cuando se comparó la producción viral en presencia vs. ausencia de E, la máxima diferencia (6 veces mayor) se observó a los 15 minutos (p= 0.035). Al calcular el porcentaje de virus que se une al E luego de ser liberado de los MDM se observó que a los 15 minutos éste es 69.7% del total coincidiendo así, el máximo porcentaje de HIV-E con el de mayor producción viral. De este modo los resultados destacan el impacto de los E en la cinética de la replicación viral de los MDM. La mayor cantidad de HIV-1 detectado en los tiempos más tempranos sugeriría que ante el contacto con los E se facilita la liberación del virus por parte de los MDM. Por lo tanto, los E cumplirían un rol más que importante en la patogénesis del HIV en condiciones fisiológicas como lo es la presencia de E. 0307 INFECCIONES SECUNDARIAS POR VIRUS DENGUE EN BUENOS AIRES DURANTE EL AÑO 2009 E Tittarelli1 2, PR Barrero1 2, MC Alvarez López1, AS Mistchenko1 3, LE Valinotto1 2 1 Laboratorio de Virología, Hospital de Niños "Dr. Ricardo Gutiérrez", Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. 2 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, CONICET, Argentina. 3 Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires, CIC, Argentina. El dengue es un grave problema de salud pública dado que su incidencia se encuentra en abrupto crecimiento a nivel mundial. El virus del dengue (DENV) se clasifica en cuatro serotipos sub-divididos en genotipos, los cuales no confieren inmunidad cruzada. Según se cree, la inmunidad contra un serotipo incrementa el riesgo de una enfermedad más severa en caso de infectarse con otro serotipo. En el Área Metropolitana de Buenos Aires, el mayor número de casos de DENV se reportó en el año 2009 cuando la transmisión local se detectó por primera vez. El objetivo de este trabajo es comprobar la existencia de infecciones secundarias por virus dengue en un área no endémica y comparar la carga viral en pacientes con infección primaria y secundaria por DENV. Se utilizaron muestras de suero de pacientes con diagnóstico clínico de sospecha de dengue que fueron remitidas al Laboratorio de Virología. Se confirmó el diagnóstico de DENV mediante cultivo celular, PCR o detección de anticuerpos IgM anti-dengue según los días desde el comienzo de la fiebre. Las muestras con DENV confirmado fueron evaluadas para discriminar infecciones primarias de secundarias mediante ensayos serológicos. Se midieron las cargas virales presentes en infecciones primarias y secundarias de pacientes en fase aguda mediante qRT-PCR. Se realizaron estudios estadísticos evaluando diversos factores que podrían correlacionarse con las diferencias en las cargas virales de infecciones primarias y secundarias. De las 761 muestras de suero evaluadas, se confirmaron un total de 229 casos (109 mujeres y 120 hombres) de DENV-1 dentro de los cuales se halló un 22,7% de infecciones secundarias. Las infecciones secundarias correspondieron a 23 mujeres y 29 hombres, con una edad media de 38,4 años (9-77 años). Del total de casos DENV-1 confirmados, se evaluaron las cargas virales de 65 muestras de pacientes en periodo virémico, correspondientes a 49 infecciones primarias y 16 infecciones secundarias. No se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre las cargas virales de infecciones primarias y secundarias. Hemos detectado un alto porcentaje de infecciones secundarias en un área no endémica. Este hallazgo podría estar relacionado con las características socio-demográficas del grupo en estudio o estar indicando la posible circulación críptica del virus causando infecciones inaparentes. Son necesarios estudios que permitan elucidar la prevalencia de anticuerpos anti-DENV entre residentes del Área Metropolitana de Buenos Aires, ya que resultarán de gran utilidad para el sistema de salud en el manejo de pacientes en riesgo de sufrir infecciones secundarias de DENV en futuros brotes. 0308 ANÁLISIS DE LA CIRCULACIÓN DE CORONAVIRUS EN NIÑOS INTERNADOS CON INFECCIÓN RESPIRATORIA AGUDA ML Minassian1, M Avaro2, G Cabral1, E Baumeister2 1 Hospital Nacional Prof. A. Posadas, Argentina. 2 INEI-ANLIS Carlos Malbrán, Argentina. Las infecciones respiratorias agudas (IRA) son una importante causa de morbi-mortalidad en niños. La mayoría son causadas por virus pero un gran número queda sin diagnóstico. El rol de Coronavirus (HCoV) está siendo reconsiderado. Es imperioso evaluar su significado clínico. OBJETIVO Documentar la circulación de HCoV en niños con IRA internados y analizar sus características clínicas y epidemiológicas. Identificar los diferentes tipos de HCoVs. METODOLOGÍA En 1206 aspirados nasofaríngeos (ANF) de pacientes con IRA ≤14 años (mediana: 1año) tomados entre las SE 1 y 48 de 2013 con resultado negativo por inmunofluorescencia directa para virus Sincicial respiratorio, Adenovirus, Parainfluenza, Metapneumovirus e Influenza A y B (Virus respiratorios clásicos o VRC), se realizó PCR multiplex para HCoV, Rinovirus (RV), Enterovirus, Bocavirus (Coiras et al. 2004). Las muestras positivas para HCoV fueron testeadas para los VRC por PCR en tiempo real (CDC 2011). Los HCoV detectados fueron tipificados mediante PCR en tiempo real desarrollada por CDC (2011). Se compararon datos clínicos y epidemiológicos de niños con HCoV con los de la población pediátrica internada con IRA en 2013. (Test χ2 y estadístico Z, p<0,05) 84 Libro de resúmenes RESULTADOS Se detectaron 64 HCoV, 22 como único agente y 42 con otros virus respiratorios. La codetección más fecuente fue RV-HCoV (26). La mayor circulación se observó entre julio y octubre con pico en septiembre. HCoV-OC43 fue el más frecuente (42), luego HCoV-229E (10) y HCoVNL63 (1). En 2 pacientes se codetectó HCoV-OC43/HCoV-229E y en 9 no se pudo tipificar con la metodología empleada. La presentación clínica fue 26 IRA alta, 17 Bronquiolitis (BQ) y 14 Neumonías (NMN). La proporción de pacientes con IRA alta es mayor que en la población total (p<0,001), en cambio la de BQ fue menor (p<0,05), no evidenciándose diferencias de proporciones en las NMN. En 41 pacientes se observaron comorbilidades con mayor proporción de inmunosuprimidos (IS) (26) que en la población total (p<0,001). La mediana de días de internación fue 10; 28 pacientes requirieron O2, en menor proporción que la población total (p<0,05). No se observaron diferencias en las variables estudiadas entre los tipos de HCoV ni en infección única vs mixta. CONCLUSIONES Se documentó la circulación de HCoV en 6% de pacientes con IRA sin diagnóstico para VRC, predominando la codetección, siendo más frecuente con RV. El tipo de HCoV circulante preponderante fue el HCoV-OC43. El pico de detección fue en septiembre a diferencia de la mayoría de los VRC. La presentación clínica más frecuente fue IRA alta. En IS el riesgo de infección por HCoV fue 5 veces mayor. La elevada prevalencia de los HCoV-OC43 y HCoV-229E asociados a casos de IRA alta en la población estudiada están de acuerdo con hallazgos previos en los que se los asocia a la producción del resfrío común junto a los RV. Debería considerarse la búsqueda de HCoV en pacientes con IRA e IS con hallazgos negativos para los VRC. 0315 LA FALLA PREVIA A INTERFERÓN NO ALTERA LA FRECUENCIA DE VARIANTES DE RESISTENCIA A INHIBIDORES DE NS3 Y NS5B EN PACIENTES COINFECTADOS POR HIV/HCV MM Sede, NL Laufer, M Parra, JF Quarleri INBIRS (UBA/Conicet), Argentina. Introducción: Desde el año 2011 el tratamiento de la infección crónica por HCV incluye drogas de acción directa (DAA, de sus siglas en inglés) en combinación con interferón pegilado (peg-INF) y ribavirina (RBV) y posteriormente en esquemas libres de interferón. Las terapias basadas en INF inducen la actividad citotóxica de los linfocitos T dirigida contra los epitopes derivados de la polimerasa (NS5B) y proteasa (NS3) de HCV. Este aumento de la presión inmunológica puede favorecer la selección de variantes capaces de evadir la respuesta inmune. Asimismo, estas variantes virales pueden estar asociadas a resistencia a las DAA (RAVs) Objetivo: Analizar la dinámica de RAVs asociadas a inhibidores de proteasa y polimerasa de HCV que puedan afectar futuros tratamientos en pacientes coinfectados por HCV/HIV con fallo previo a terapia basada en INF. Materiales y Métodos: Se extrajo ARN de muestras de 18 pacientes coinfectados por genotipo 1a de HCV. Las muestras fueron tomadas previo y durante (24hs y semanas 4, 12, 24) el tratamiento con peg-INF y RBV. Se realizó secuenciación ultraprofunda (454 FLX, Roche) sobre los productos de NS3 y NS5B obtenidos a partir de la RT-nested PCR. Dos medidas de diversidad genética fueron utilizadas para comparar las poblaciones virales: diversidad nucleotídica (π) y el estadídtico D de Tajima. Resultados: De la población en estudio, el análisis de secuencias nucleotídicas implicó un total de 63674 para NS3 y 48127 para NS5B. Tanto en NS3 como en NS5B se detectaron RAVs en muy baja frecuencia (< 5%) en muestras de todos los individuos pero en general su presencia no fue constante durante el seguimiento. Sólo en una muestra de dos pacientes se observaron variantes mayoritarias exhibiendo la Q80R/K/L (asociada a resistencia a simeprevir) y la A421V (asociado a resistencia a baclabuvir). Se obtuvieron valores negativos estadísticamente significativos para el estadístico D en ambas regiones, pero no se observaron diferencias significativas entre las muestras de los distintos tiempos como tampoco para los valores de π. Conclusiones: La falla a una terapia previa con peg-INF/RBV no se asoció con un aumento de la frecuencia de RAVs que afectan a drogas que actúan a nivel de NS3 o NS5B. Los valores obtenidos para π y D podrían asociarse al exceso de polimorfismos en baja frecuencia, los cuales a su vez ocasionalmente podrían portar RAVs. Sin embargo son seleccionados negativamente y en consecuencia fluctúan a baja frecuencia e incluso desaparecen, lo cual concuerda con el comportamiento observado para las RAVs en ausencia de presión de selección por las drogas antivirales de acción directa. 0318 VALOR DE LA CARGA VIRAL PARA EBV EN LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO EN PACIENTES HIV/SIDA CON LESIÓN OCUPANTE DE ESPACIO CEREBRAL L Mammana1, L Tadey1, A Tkach1, A Del Portillo2, D Della Paolera2, M Corti2, MB Bouzas1 1 Unidad Virologia. Hospital F J Muñiz. CABA., Argentina. 2 División B, HIV/sida, Hospital de Infecciosas F. J. Muñiz. CABA, Argentina. En pacientes infectados con HIV y lesión ocupante de espacio (LOE) cerebral el principal diagnostico presuntivo es toxoplasmosis, siendo el linfoma primario de sistema nervioso central (LPSNC) un diagnóstico diferencial. En el 75- 100% de los pacientes con HIV/SIDA y LPSNC se detecta ADN-EBV en líquido cefalorraquídeo (LCR), sin embargo no es utilizado como único marcador diagnóstico dado que pueden encontrarse niveles elevados de ADN-EBV en pacientes sin LPSNC. Ha sido reportado que cargas virales de EBV (CV-EBV) en LCR superiores a 10000 copias/ml (c/ml) mejoran la especificidad y el valor predictivo positivo para el diagnostico de LPSNC. Objetivo: Analizar los valores de CV-EBV en LCR en una serie de pacientes con enfermedad HIV/SIDA y LOE cerebral en función de su evolución clínica. Métodos: Se revisaron retrospectivamente las historias clínicas de pacientes internados con LOE, cuya CV-EBV resultó cuantificable en LCR. Se consignaron los siguientes datos: sexo, edad, nivel de CD4, tratamiento, tiempo desde el diagnóstico de HIV, diagnóstico presuntivo, presencia de LOE cerebral en las neuroimágenes, diagnóstico de coinfecciones en SNC, CV-EBV en LCR y evolución clínica. Se seleccionaron 8 pacientes que no presentaron detección simultánea de otro agente en LCR y en 5 pacientes se constató su evolución. En 7/8 pacientes se estudió una muestra y en una 3 muestras consecutivas con un mes de diferencia. La CV- EBV se realizó con el kit (EBV Q-PCR (Alert, Elitech) cuyo target de amplificación es EBNA-1, sensibilidad analítica 10 copias/reacción y rango lineal de cuantificación: 300-30000000 de copias/ml. La extracción de ADN se realizó con columnas (Zymo Research) a partir de 200 uL de LCR. Resultados: De los 8 pacientes, 5 fueron de sexo masculino, la mediana de edad fue de 44 años (rango:18-59) y la mediana de CD4 de 84 células/ul (rango:25-116). Ningún paciente se encontraba bajo tratamiento antirretroviral. El 50% de los pacientes presentaron diagnóstico tardío de HIV y el diagnostico presuntivo fue toxoplasmosis en el 63%. En los 7 pacientes con una sola muestra la mediana de CV-EBV fue 1320 c/ml, 3,1 log10 (rango:514-57292 c/ml, 2.71-4.76 log10), en 4 de ellos el diagnóstico presuntivo fue toxoplasmosis cerebral y 2/4 fallecieron con CV-EBV de 602 y 57293 c/ml a pesar del tratamiento empírico para toxoplasmosis. La paciente con tres muestras consecutivas presentó un aumento de la CV-EBV de 894 a 36114 c/ml (2.95-4.56 log10) y obitó. Conclusiones: Si bien la toxoplasmosis cerebral es el principal diagnóstico presuntivo en pacientes con HIV/SIDA y LOE, en este estudio un 60% de los pacientes evolucionó desfavorablemente y falleció a pesar del tratamiento empírico antiparasitario. Los valores de CV-EBV resultaron superiores a 10000 c/ml en el 50% de los pacientes, lo cual podría sugerir un diagnostico de LPSNC, hasta la realizacion de la biopsia estereotáctica y el estudio histopatológico definitivo. 0339 CIRCULACIÓN DE NUEVOS AGENTES VIRALES DETECTADOS POR BIOLOGÍA MOLECULAR EN PACIENTES INTERNADOS CON INFECCIÓN RESPIRATORIA S Zunino, V Acosta, ML Minassian, E Bardossy, G Cabral Hospital Nacional Prof. A. Posadas, Argentina. Las Infecciones respiratorias agudas (IRAS) virales son la primera causa de mortalidad infantil. Con la detección de virus respiratorios clásicos(VRC): Sincicial respiratorio(RSV), Adenovirus(ADV), 85 Libro de resúmenes Parainfluenza(PI), Metapneumovirus(MPV) e Influenza A y B(FA/FB) por inmunofluorescencia(IF) quedan sin diagnostico 1600(67%) pacientes anualmente en nuestro hospital. La PCR permitió la detección de otros virus respiratorios(OVR): Coronavirus(HCoV), Rinovirus(RV), Enterovirus(EV), Bocavirus(BoV). No hay datos de circulación de estos agentes virales en Argentina Objetivos: Disminuir el número de pacientes sin detección viral con el uso de biología molecular y la búsqueda de nuevos virus Definir la circulación de VRC y OVR detectados por PCR en pacientes con IRA internados durante 2013 en nuestro hospital Materiales y métodos: De 2285 aspirados nasofaríngeos(ANF) de pacientes pediátricos internados con IRA recibidos en 2013 se analizaron 478 obtenidos por muestreo aleatorio estratificado por mes, edad, género, y comorbilidad (α: 5%). Se testearon por IF(OXOID) y PCR en tiempo real(PCR)(CDC 2011) para los VRC y por PCR multiplex(M-PCR)(Coiraset al. 2004) para los OVR. Resultados: La detección viral por IF alcanzó 31 % anual. Agregando PCR para Flu A y B a los negativos por IF se llegó al 34%. Utilizando PCR para los VRC se alcanza el 51% anual. Incorporando M-PCR para OVR se detectó genoma viral en el 82% de las muestras del 2013. En cuanto a la circulación viral por detección de genoma se obtuvieron los siguientes resultados por virus: RSV desde el mes 4 hasta el 10 con un pico en los meses 6 y 7 que tuvo un máximo de 58%; ADV se detectó durante todo el año(promedio:7% mensual) con un pico en los meses 1 y 2 de 16%.; PI-1 circula hacia el final del año llegando a un 13% en diciembre y PI-3 tuvo una detección sostenida, sin picos aparentes, con un promedio de 6%; MPV se detectó en curva bimodal con picos en marzo(13%) y julio(15%); FA se detectó desde 5 hasta el 10 con un máximo en junio(12%); FB se detectó 2% en septiembre. La circulación de OVR fue: RV de forma constante durante todo el año con máximos en el mes 3(75%) y 11(65,5%) y un mínimo en el 6(29%); BoV también se detectó de forma constante desde el mes 2 hasta el 12 en un promedio de 8% y un máximo en enero(32%); EV de detectó de forma contante(promedio: 4% por mes) y CoV desde el mes 4 hasta el 12 con un máximo de 12% en abril y en septiembre(10%). Conclusión: Los perfiles de circulación viral son específicos de cada virus. En los meses cálidos RV, BoV y ADV son los virus más frecuentes. RV tuvo un perfil de circulación opuesto a RSV. Los OVR están presentes en 59% de las muestras. Debería investigarse RV y BoV en primavera-verano. Se incrementó la detección de virus en las IRA en un 50% usando PCR para VRC y en un 61% con la búsqueda de OVR por M-PCR. Se logró disminuir el número de pacientes sin detección viral con el uso de biología molecular y la búsqueda de nuevos virus a sólo un 18% 0354 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL VIRUS PAPILOMA HUMANO EN CUELLO UTERINO Y ANO DE TRABAJADORAS SEXUALES DE PARAGUAY, PERIODO 2012-2013 A Valenzuela1, L Mendoza1, P Mongelos1, G Gimenez1, MI Rodríguez1, G Medina4, A Castro1, W Castro1, M Páez1, E Kasamatsu1, JV Gonzalez2, JA Baseletti2, G Aguilar3, Z Suarez3, R Valdez3, G Deluca5, MA Picconi2 1 Departamento de Salud Pública, Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud, Universidad Nacional de Asunción, Paraguay, Paraguay. 2 Servicio de Virus Oncogénicos, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (INEI), “Dr. Malbrán” Administración Nacional de Laboratorios e Instituto de Salud (ANLIS), Buenos Aires, Argentina., Argentina. 3 Programa Nacional de Control del Sida (Pronasida), Ministerio de Salud Pública y Bienestar Social, Asunción, Paraguay, Paraguay. 4 Hospital de Clínicas, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Asunción, Paraguay, Paraguay. 5 Facultad de Medicina, Universidad Nacional del Nordeste, Corrientes, Argentina., Argentina. Los virus papiloma humano de alto riesgo oncogénico (HR-HPV) son los agentes etiológicos del cáncer de cuello uterino y ano. Las mujeres trabajadoras sexuales (MTS) constituyen un grupo de riesgo para la adquisición de HPV. Este estudio tuvo como objetivo caracterizar molecularmente al HPV en MTS provenientes de la ciudad de Asunción, y los departamentos de Central, Amambay y Caaguazú periodo 2012/2013. Este estudio transversal analítico incluyó 144 mujeres integrantes de la asociación de trabajadoras sexuales Unidas en la Esperanza, que aceptaron participar a través de un consentimiento informado. Se completó una ficha y se procedió a la tomar muestras de células exfoliadas de cérvix y ano, para la citología y el estudio virológico. Los tipos de HPV fueron detectados por PCR PGMY09/11 y PCR BSGP5+/6+ seguida de hibridación reversa. La frecuencia de HPV y HRHPV detectada fue del 50% y 40,9% en cuello uterino y del 56% y 36,1% en ano. El HPV 16 fue el más frecuente en ambos sitios. Seguido del HPV 16 en cuello uterino fueron detectados HPV 52 (11,1%), HPV 26 (5,5%), HPV 31 y HPV 45 (4,9 % cada uno) y en ano HPV 53 (8,3%), HPV 52 y HPV 66 (6,2% cada uno), HPV 44 y 45 (5,5 % cada uno). Se observó una asociación altamente significativa entre la presencia de infección por HPV o HR-HPV en cuello uterino y en ano, con valores de p˂0,00001. El 1,4% de las mujeres presentó citología anormal en cuello uterino y el 8,3% en ano. Estos resultados sugieren que MTS HR-HPV positivas constituyen un grupo que debe ser controlado frecuentemente en ambos sitios a fin de identificar infección viral persistente y prevenir el desarrollo de lesiones. 0356 CITOMEGALOVIRUS EN PACIENTES PEDIÁTRICOS SOMETIDOS A TRASPLANTE DE MÉDULA ÓSEA. E López-Montanero1, M Aray-Andrade1, N Cajas-Flores1, E Frías2, B Maldonado2 1 Universidad Espíritu Santo-Ecuador, Ecuador. 2 Solca, GuayaquilEcuador, Ecuador. Introducción: El Citomegalovirus (CMV) pertenece a la familia de los herpesvirus, su distribución es a nivel mundial, en todas las localizaciones geográficas y en todos los grupos socioeconómicos, tiene alta prevalencia debido al uso de inmunosupresores en pacientes pediátricos trasplantados de médula ósea, hígado y riñón. En un estudio en Uruguay el 63% de los pacientes pediátricos con trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos presentaron reactivación de CMV (Dufort, 2014); Uribe en el 2010 encontró que el 30% de los pacientes pediátricos dentro del primer año post trasplante hepático desarrollaron infección por CMV. El 24,26% de los pacientes infantiles con trasplante renales desarrollan CMV (Fijo-López-Viota, 2013). Los niños portadores de leucemia y linfoma también son susceptibles a infecciones graves por CMV, sin embargo la prevalencia de esta infección es variable entre los estudios realizados en diversos países, debido a múltiples factores como raza, tipo de trasplante, método de detección viral utilizado, tratamiento inmunosupresor y estatus serológico de donante y receptor (Díaz-Betancur, 2012). Citomegalovirus tiene alta prevalencia en pacientes con trasplante de células hematopoyéticas, riñón e hígado, siendo una de las complicaciones pos-trasplante, a pesar de todas las medidas y esfuerzos que se realizan, que van dirigidos a la detección, diagnóstico y tratamiento precoz de la enfermedad, esto incrementa el riesgo de morbi-mortalidad (Boeckh, 2003; Pergam, 2012). El objetivo de este estudio es evaluar la prevalencia de CMV en niños sometidos a trasplante de médula ósea. Metodología: Estudio retrospectivo, comparativo y transversal. Se determinó la carga viral por Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real (PCR-TR) en muestras de plasma recolectadas desde el 2009 hasta 2012 en niños que recibieron trasplante de médula ósea en el Hospital de la Sociedad de Lucha contra el cáncer de la ciudad de Guayaquil, Ecuador. Resultados: De 38 pacientes sometidos a trasplante de médula ósea analizados, se obtuvo 5 resultados positivos (13,2%) con CMV por PCRTR, de los cuales el 80% son niñas y el 20% niños con una edad promedio de 7,2 años. Los pacientes que fueron trasplantados a causa de leucemia linfoblástica aguda y linfoma leucemizado a leucemia linfoblástica aguda son los que tuvieron resultados positivos por infección activa por citomegalovirus con un 80 % (n=4) y 20 % (n =1). Conclusiones: En este estudio el porcentaje de resultados positivos para CMV fue bajo en comparación a lo observado en trasplante de hígado y riñón. Entre los factores de riesgo para CMV determinados en esta investigación es el sexo femenino con edad promedio de 9 años, lo 86 Libro de resúmenes que difiere con otras publicaciones donde el mayor riesgo es sexo masculino de edad inferior. La PCR-TR es una técnica de diagnóstico útil para la detección precoz de la enfermedad. 0360 DETERMINACIÓN DE VIRUS RESPIRATORIOS POR MÉTODOS MOLECULARES EN PACIENTES PEDIÁTRICOS CON INFECCIÓN RESPIRATORIA AGUDA INTERNADOS EN HOSPITAL POSADAS V Acosta, ML Minassian, S Zunino, G Cabral Hospital Prof. A. Posadas, Argentina. Los virus respiratorios son la principal causa de infección respiratoria aguda (IRA) en pediatría. La PCR mejoró el diagnóstico de virus respiratorios clásicos (VRC) -Sincicial respiratorio, Adenovirus, Parainfluenza, Metapneumovirus e Influenza A y B- y permitió además la detección de otros virus respiratorios (OVR) -Coronavirus, Rinovirus, Enterovirus y Bocavirus- evidenciándose un alto número de codetecciones. La información respecto de la importancia de la codetección es escasa y contradictoria. Objetivos Comparar indicadores de gravedad en pacientes con detección única y múltiple de VRC y en pacientes con VRC y OVR. Definir la utilidad de la detección de OVR. Materiales y Métodos Se analizaron 400 ANF de niños (mediana de edad: 9 meses) internados con IRA obtenidos por muestreo aleatorio estratificado por mes, edad, género, y comorbilidad, de 2285 recibidos en 2013 (α:5%). Las muestras fueron testeadas por PCR en tiempo real (CDC 2011) para los VRC y por PCR multiplex (Coiras et al. 2004) para los OVR. Se registraron datos clínicos y epidemiológicos de cada paciente. Resultados El 56% de las muestras presentó al menos un VRC (codetecciones: 7%). Al adicionar la PCR para OVR la detección aumentó a un 84% (codetecciones: 33%). De 216 muestras positivas para OVR,105 (48%) fueron positivas para VRC. Se observó una mayor proporción de neumonías en pacientes con VR C con respecto a los que presentaban OVR (p=0.0001). En los pacientes con OVR fue mayor la proporción de IRA alta que en niños con VRC (p=0.0001). La proporción de IRA alta y Bronquiolitis fue mayor en pacientes con OVR que en los negativos (p<0,005). No se observaron diferencias en la presentación clínica entre los niños con detección única y múltiple de VRC ni entre pacientes con VRC y aquellos con VRC más OVR. Al analizar las variables requerimiento de O2 (RO2), de cuidados intensivos, presencia de comorbilidades y días de internación, hubo diferencias significativas de RO2 y presencia de comorbilidades (p<0.005) entre pacientes con VRC y pacientes con OVR. También se observaron diferencias entre pacientes con OVR y pacientes con resultado negativo en lo que respecta a RO2 (p<0.05) y la presencia de comorbilidad respiratoria (p<0.05). No se observaron diferencias significativas en estas variables entre pacientes con detección única y múltiple de VRC ni entre pacientes con detección de VRC y VRC más OVR. Conclusiones Las IRA con múltiples VRC no presentaron mayor gravedad que las infecciones únicas. Tampoco si los VRC estaban asociados a OVR. En cambio presentaron mayores indicadores de gravedad los pacientes con detección de VRC que aquellos con OVR, y a su vez estos últimos respecto a los pacientes con resultado negativo. Si bien agregando la PCR para OVR disminuye el % de negativos, el 48% de las muestras presentan codetección VRC-OVR. Teniendo en cuenta esto y la mayor gravedad de los pacientes con VRC, la detección de OVR sería relevante en los pacientes con resultado negativo para VRC. 0361 AUMENTO DE LA SENSIBILIDAD EN LA CUANTIFICACIÓN DE ADN DE HIV-1 EN CÉLULAS MONONUCLEARES TOTALES POR PCR EN TIEMPO REAL ANIDADA M Moragas, P Aulicino, L Sen, A Mangano Laboratorio de Biología Celular y Retrovirus, Hospital de Pediatría "Prof. Juan P. Garrahan", Argentina. La terapia antirretroviral combinada (ARVc) contra el HIV-1 ha mejorado notablemente la eficacia en el control del virus circulante en plasma. Sin embargo, existen formas de ADN viral intracelular (proviral y episomal) que se hallan en muy baja frecuencia en distintos tipos celulares y constituyen los reservorios virales, principal obstáculo en la erradicación del HIV-1. Por este motivo, es importante contar con técnicas de elevada sensibilidad y especificidad para la cuantificación del ADN intracelular total de HIV-1 (ADNt HIV). El objetivo del trabajo fue desarrollar una metodología altamente sensible basada en PCR en tiempo real anidada para la cuantificación del ADNt HIV. La técnica consiste en dos rondas de amplificación por PCR. En la primera se amplifica una región del LTR/Gag, y dicho producto se utiliza como molde para una segunda ronda de amplificación mediante PCR en tiempo real. Los cuatro cebadores (dos por ronda) y la sonda fueron diseñados basados en los subtipos B, F y B/F del HIV-1. El número de células totales por reacción se cuantificó mediante la amplificación, en paralelo, de un fragmento de b-globina. Se desarrolló un vector que porta la región LTR/Gag y el fragmento de b-globina para la realización de la curva estándar. La técnica de PCR en tiempo real de dos rondas de amplificación presentó un límite de cuantificación mayor en comparación al obtenido mediante una única ronda de amplificación: 8 copias/106 CMT y 50 copias/106 CMT, respectivamente. La especificidad fue del 100% analizando, por triplicado y en dos ensayos independientes, 2 pooles de ADN genómico de individuos no infectados (10 muestras/pool). El coeficiente de correlación de la curva estándar fue 0,99, por lo que la primera ronda de amplificación no influye en la linealidad de dicha curva. El desvío estándar promedio del ciclo umbral intra-ensayo incluyendo todos los puntos de la curva, fue de 0,14 ± 0,11 ciclos, demostrando una alta reproducibilidad. Por otra parte, se estudiaron 57 muestras de niños HIV-1 positivos con seguimiento clínico en el Hospital Garrahan: 22 muestras fueron tomadas antes (pre) y 35 luego (post) del ARVc. Del total de muestras se lograron cuantificar 52 (91%), mientras que solo en 5 (9%) muestras (1 muestra pre ARVc y 4 post ARVc) no se detectó ADNt HIV. Por otro lado, de 21 muestras que presentaron cargas virales plasmáticas inferiores al límite de cuantificación (34 copias ARN/ml plasma) se logró cuantificar el ADNt HIV en 19 (90%). La técnica de PCR en tiempo real anidada desarrollada para la cuantificación de ADNt HIV resultó ser altamente sensible y reproducible. De este modo, fue posible cuantificar más del 90% de las muestras estudiadas, conservándose esta tendencia aún en muestras que presentaban cargas virales indetectables. Este desarrollo permitirá disponer de un parámetro más para analizar con mayor profundidad y con fines terapéuticos, el comportamiento del HIV-1 en aquellos pacientes que suprimen la carga viral plasmática. 0364 PREVALENCIA DE VIRUS BK UTILIZANDO TÉCNICA DE REAL TIME PCR EN PACIENTES CON TRASPLANTE RENAL DE LA PROVINCIA DE CORRIENTES, ARGENTINA. CC Ortowski1, VA Flores1, LA Ferrini1, MF Ferrini1, A Aguerre2, MS Maurich2, S Soto1 1 Laboratorio Central de Corrientes, Argentina. 2 Instituto de Cardiología de Corrientes, Argentina. Introducción: El virus BK es un poliomavirus. Su infección ocurre en la infancia, generalmente, en forma asintomática o con síntomas respiratorios leves, pero puede permanecer latente, en el tracto urogenital, especialmente en riñón. En pacientes con trasplante renal, la inmunosupresión permite que el virus BK se replique en el injerto, ocasionando Nefropatía, responsable de disfunción del injerto renal en pacientes trasplantados. La pérdida de injerto puede ocurrir en 10- 80% de los casos de nefropatía. Estos porcentajes son menores en aquellos centros donde se realiza una vigilancia periódica de infección por virus BK y se instituye un tratamiento precoz. Objetivo: conocer el grado de prevalencia de virus BK en muestras de orina y plasma en pacientes receptores de trasplante renal en un periodo de 6 meses. Metodología: El trabajo incluyó muestras de plasma y orina de 100 receptores de trasplante renal, sin signos clínicos de infección renal o nefropatía al momento de realizar el estudio, de un único Centro de 87 Libro de resúmenes Trasplante Renal, que ingresaron al laboratorio en un periodo de 6 meses. Se realizó la extracción de ADN con columna comercial. Para la técnica de qPCR (RealTime) cualitativa se trabajó con primer y sonda que reconocen el gen VP-1 (Randhawa, 2004), siguiendo las especificaciones propuestas por el autor. Para la técnica de qPCR cuantitativa se trabajó con kit comercial BKV Q-PCR Alert Kit NANOGEN, siguiendo las instrucciones del comerciante. Se registró el CT de cada una de las determinaciones realizadas por ambos métodos y se calculó la carga viral en Genomas Equivalentes / mililitro (GE/mL) del método cuantitativo. Cada muestra se procesó con ambas metodologías y se correlacionaron los CT registrados, los cuales fueron comparables entre sí con mínimas diferencias. Resultados: La prevalencia del virus BK en nuestros pacientes en las muestras de orina fue de 32% y en las muestras de plasma fue de 8%. El mismo porcentaje de positividad por virus BK se encontró en un estudio realizado por este grupo en el año 2010. A pesar de encontrar una frecuencia elevada de virus BK en orina, solo el 2% del total de pacientes presentó valores de carga viral superior a 10 7 GE/ml, valor que se asocia con nefropatía por BK. Las 8 muestras de plasma con viremia correspondían a pacientes con virurias de más de 10 5 GE/ml. De estos 8 pacientes, solo 1 presentó carga viral en plasma superior a 10 4 GE/ml; valor que se asocia con nefropatía por BK. Del seguimiento de los 2 pacientes que presentaron viruria con carga viral significativa se observó un descenso de la misma. Conclusiones: Estos resultados demuestran la utilidad de Real time PCR para un diagnóstico precoz y certero permitiendo así evitar los efectos indeseables que puede llegar a generar la pérdida del injerto a causa de la infección producida por virus BK. Permitiendo así a los médicos definir conductas terapéuticas y posterior seguimiento de los pacientes. 0365 EVALUACIÓN DE LA LA CARGA VIRAL Y PROVIRAL EN NIÑOS INFECTADOS CON HIV-1 ANTES Y DESPUÉS DEL INICIO DE TRATAMIENTO ANTIRRETROVIRAL COMBINADO M Moragas1, P Aulicino1, D Mecikovsky2, R Bologna2, L Sen1, A Mangano1 1 Laboratorio de Biología Celular y Retrovirus, Hospital de Pediatría "Prof. Juan P. Garrahan", Argentina. 2 Servicio de Infectología y Epidemiología, Hospital de Pediatría "Prof. Juan P. Garrahan", Argentina. La carga viral en plasma (CV) y el recuento de células T CD4+ son los parámetros bioquímicos más efectivos para el monitoreo de la infección por HIV-1. Sin embargo, estos parámetros no reflejan el comportamiento de las formas de ADN viral intracelulares (carga proviral -CpV) que constituyen los reservorios del HIV-1. El objetivo del trabajo fue cuantificar la CpV y evaluar su correlación con la CV en niños infectados con HIV-1 antes y luego del inicio de tratamiento antirretroviral combinado (ARVc). Se estudiaron 21 niños con seguimiento clínico en el Hospital Garrahan desde el año 2008 hasta el 2013. En la totalidad de los pacientes se cuantificó los niveles de CpV y CV plasmática antes del inicio del ARVc (pre-ARVc). De ellos, en 17 se cuantificaron dichos niveles luego de 18 ± 6 meses de iniciado el tratamiento ARVc (post-ARVc) que incluía zidovudina, lamivudina y lopinar/ritonavir. La cuantificación del ADN viral se realizó mediante un ensayo de PCR en tiempo real desarrollado en el laboratorio, cuya sensibilidad es de 8 copias/106 células mononucleares totales (CMT). La CV plasmática se midió utilizando el kit comercial COBAS Taqman HIV-1 test v2.0 (límite de cuantificación= 34 copias ARN HIV-1/ml de plasma). La mediana de carga viral pre-ARVc fue 5,7 (IQR 5,2 - 6,1) log10 copias ARN/ml, y post-ARVc de 1,7 (IQR 1,7 - 2,2) log10 copias ARN/ml. La mediana de CpV pre-ARVc fue de 1204 (IQR 346,8 – 2182,0) copias/106 CMT, mientras que post-ARVc fue de 164,2 (IQR 63,9 – 359,3) copias/106 CMT. Esto muestra una importante reducción en los niveles de ambas variables, siendo esta del 70% en CV y del 86% en CpV. No se observó una correlación entre la CV y CPV previo al inicio de ARVc (r= 0,11, P>0,5). Sin embargo, psot- ARVc hubo una correlación positiva entre dichas variables (r=0,49, P<0,05). De los 17 niños estudiados postARVc, 14 (78%) lograron la supresión virológica (CV<400 copias/ml) con una mediana de CpV de 110 (IQR 63,25 - 1026) copias/106 CMT, mientras que en los 4 (22%) pacientes sin supresión virológica la mediana de CpV fue de 308,4 (IQR 239,6-370,4) copias/106 CMT. Nuestros resultados demuestran que no hay una correlación entre el comportamiento del virus circulante en plasma y aquellas formas de ADN del virus que se encuentran dentro de las células antes del inicio de ARVc. Esto podría deberse a distintos factores, entre los cuales es importante resaltar el gran recambio de las células blanco del HIV-1 durante la infección aguda. Sin embargo, luego de 18 meses de tratamiento ARVc, además de observarse una considerable disminución en la CV y CpV como era de esperar, el comportamiento entre ambas variables fue directamente proporcional. Este comportamiento podría deberse al impacto positivo del tratamiento ARVc en el control de la viremia plasmática, como así también en el establecimiento del virus dentro de las células blanco. 0367 SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA EN LA GRAVEDAD DE LA INFECCIÓN POR VIRUS RESPIRATORIO SINCICIAL EN LACTANTES CHILENOS. S Ampuero, L Lizama, F Núñez, D Silva, A Pinto, C Mellado, V Luchsinger, A Gaggero, C Larrañaga Programa de Virología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile. El virus respiratorio sincicial (VRS) es el principal agente de bronquiolitis en lactantes. El 0,5% desarrollará una infección grave. La mayoría de los lactantes hospitalizados no tienen factores de riesgo conocidos. Se han planteado factores genéticos asociados a enfermedad grave por VRS; entre ellos los polimorfismos de un nucleótido (SNPs) en genes de respuesta inmune. Nuestro objetivo fue evaluar la asociación de 18 SNPs con la gravedad de la primoinfección por VRS en lactantes chilenos. Se obtuvieron muestras de aspirado nasofaríngeo y sangre de 212 lactantes menores de 6 meses de edad, previamente sanos, durante las epidemias del 2005-2007 y 2010-2011. Según la gravedad clínica de la infección, se clasificaron en graves (96), moderados (62) o leves (54). En el grupo grave, 34 lactantes recibieron ventilación mecánica (VM). El diagnóstico de VRS se confirmó mediante transcripción inversa-PCR tiempo real. Los SNPs estudiados en los distintos genes fueron: rs721917, SPD; rs2243639, SPD; rs1060826, NOS2A; rs1921622, IL1RL1; rs2274064, NCF2; rs1800925, IL13; rs20541, IL13; rs4986790, TLR4; rs4986791, TLR4; rs11096957, TLR10; rs2251746, FCER1A; rs1800872, IL10; rs1800795, IL6; rs10735810, VDR; rs643070, IFNA13; rs11688, JUN; rs10757212, IFNA5; rs2069885, IL9. La detección de los alelos se realizó mediante PCR-High Resolution Melting y el análisis estadístico mediante Unphased y test de Armitage, (Odds Ratio: OR). Seis de los SNPs presentaron asociación significativa con la gravedad de la infección. El genotipo T/C del rs721917 fue más frecuente en pacientes graves, y el genotipo C/C en leves. La presencia del alelo T aumenta el riesgo. En el rs1921622, la frecuencia del heterocigoto G/A fue mayor en pacientes graves, donde el alelo A constituyó el factor de riesgo (OR: 2,5). El alelo T del rs2274064 se asoció a riesgo al comparar graves frente a leves con moderados (OR: 1,6), la presencia del genotipo T/T aumenta el riesgo a 2,8. En el rs1800872, el genotipo T/T fue más frecuente en graves con VM y el genotipo C/C en graves sin VM, siendo el alelo A de riesgo (OR: 2,8). Las frecuencias alélicas y genotípicas de los SNPs rs1060826 NOS2A y rs1800795 IL6, fueron significativamente diferentes entre graves y leves. El alelo G de rs1060826 se asoció a riesgo (OR: 2,0) y el genotipo G/G fue más frecuente en graves y A/A en leves. También, el alelo C de rs1800795 fue un alelo de riesgo (OR: 2,1), así como el genotipo C/G. En la combinación de los SNPs se detectaron haplotipos de gravedad. Dentro de los más significativos (p<0,005) se encontraron: T/C(rs721917)–G/A(rs1921622), OR:6,6; G/A(rs1060826)– G/C(rs1800795), OR:3,9; G/A(rs1921622)–G/C(rs1800795), OR:12; C/A(rs1800872)–G/C(rs1800795), OR:15,6; T/C(rs721917)– G/A(rs1060826)–G/A(rs1921622), OR:4,75; G/A(rs1921622)– C/A(rs1800872)–G/C(rs1800795), OR:5,4e11. La determinación de marcadores genéticos asociados a riesgo, permitiría el manejo oportuno de enfermedad grave por VRS. Proyecto FONDEF CA13I10003. 88 Libro de resúmenes 0368 DETECCION DE VIH EN MUESTRAS DE SANGRE SECA, RECOLECTADAS SOBRE TARJETAS DE PAPEL DE FILTRO, EN UNA POBLACION DE ADULTOS EN EL HOSPITAL ITALIANO DE BUENOS AIRES. D Arrigo, P Schneider, M Aragone, M De Cristofano, J Oyhamburu, F Seoane, B Livellara Hospital Italiano, Argentina. Introducción: Habitualmente la detección de Anticuerpos(Ac) / Antígenos(Ag) para VIH se realiza sobre muestras de plasma y/o suero. La implementación de la recolección de gotas de sangre sobre papel de filtro (GSPF, Dried Blood spot en inglés) resulta una buena alternativa por la simplicidad en su método de obtención, conservación y posibilidades de transporte. Objetivo: Validar el empleo de GSPF como muestra adecuada para detectar la infección por VIH y establecer el valor optimo de corte. Metodología: Estudio prospectivo transversal que se llevó a cabo en el Hospital Italiano de Buenos Aires desde Mayo a Noviembre 2013. Se analizaron 218 muestras pareadas (GSPF y plasma) para la detección de VIH Ag/Ac; 149 Positivas y 69 negativas. La técnica utilizada fue CMIA Architect de Abbott. Los valores obtenidos con las GSPF fueron comparados con los obtenidos sobre las muestras de plasma. El cálculo del valor óptimo de corte, se realizó utilizando un programa estadístico predictivo para el análisis de la curva ROC. Resultados: Sensibilidad y especificidad estimada, basada en el valor de corte del GSPF S/CO. Valor de corte 0.20 0.32 0.34 0.40 0.50 Sensibilidad 95.9 90.6 88.6 87.9 85.2 Especificidad 79.7 95.7 100 100 100 De acuerdo a los datos obtenidos por el análisis de la curva ROC el valor de corte sugerido es 0.20 S/CO con una sensibilidad del 95.9% y una especificidad del 79.7%. Conclusiones: La GSPF ofrece una buena opción para el screening de VIH cuando existen dificultades técnicas para la toma de plasma o suero, fundamentalmente en pacientes que se encuentren alejados de centros diagnósticos y para estudios epidemiológicos en grandes extensiones geográficas y/o poblaciones de bajos recursos. El empleo de GSPF simplifica la toma de muestra, reduce el volumen de sangre necesario, ofrece una mayor estabilidad durante su conservación y transporte. Se plantea incrementar el empleo del GSPF validando esta metodología de muestreo para otros marcadores virales 0374 VALIDACION DEL SISTEMA HPV DIRECT FLOW CHIP- EBRID PARA LA DETECCION Y TIPIFICACION DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (HPV). B Livellara2, H Díaz de Arce Landa2, E Mocetti1, J Oyhamburu2 1 Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Italiano de Buenos Aires, Argentina. 2 Servicio de Laboratorio del Hospital Italiano de Buenos Aires, Argentina. INTRODUCCIÓN: Las seis posibles aplicaciones clínicas de ensayos basados en detección y tipificación de ADN para HPV son: aclasificación “triage” de mujeres con anomalías citológicas equívocas o de bajo grado; b- seguimiento de mujeres con resultados anómalos en el tamizaje que son negativos en la colposcopia / biopsia; c- predicción del resultado de la terapia después del tratamiento de neoplasia intraepitelial cervical (CIN); d- tamizaje o cribado primario de ADN del HPV, solo o en combinación con una prueba de Papanicolaou, para detectar precursores de cáncer cervical; e- obtener información valiosa en la persistencia de ciertos tipos de VPH; f- investigaciones de tipo específico de HPV, tanto regionales como de país, para proporcionar el impacto global de la vacunación contra el HPV. OBJETIVO: Validación del sistema HPV Direct Flow CHIP para la detección y tipificación del virus del papiloma humano METODOLOGIA: Para el análisis se utilizó un set de 15 muestras, representativas de diferentes orígenes, genotipos y patologías, de una población de pacientes del Hospital Italiano de Buenos Aires y cinco muestras de referencia recibidas como parte de un “Prociency Survey” del CAP Se comparó la técnica de secuenciación con HPV Direct Flow CHIP. Este ensayo permite la tipificación de 36 genotipos clasificados como de alto riesgo (16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 y 82) o bajo riesgo ( 6, 11, 40, 42, 44, 54, 55, 61, 62, 67, 69, 70, 71, 72, 81, 84 y 89). Estudios analíticos: Determinación del Límite de detección y precisión Intra e Interensayo. Asimismo se evaluó la sensibilidad y especificidad clínica sobre un panel de 16 muestras considerando los estudios citológicos e histopatológicos. RESULTADOS: De las 20 muestras evaluadas 6 resultaron negativas por ambas metodologías con un 100% de especificidad diagnóstica, lo que coincide con el alto valor predictivo negativo reportado. Las 14 muestras resultaron positivas por ambas metodologías. El límite de detección: 10 copias por reacción, con una precisión del 100% intra e inter-ensayo. Los datos citológicos e histológicos aportados por médicos especialistas en Patología demostraron una sensibilidad y especificidad clínica del 100% para lesiones de alto grado y carcinoma. CONCLUSIONES: No hubo diferencias en cuanto al genotipo de alto riesgo mayoritario presente en cada espécimen evaluado. En 5 muestras se observaron diferencias en cuanto al número de genotipos detectados por ambos ensayos. Este hecho se explica debido a que el el HPV Direct Flow CHIP es capaz de detectar todas las variantes presentes en la muestra mientras que la secuenciación, si bien es considerada estándar de oro, no es capaz de resolver muestras con presencia de varios genotipos de HPV, brindando un resultado con el genotipo mayoritario con frecuencia electroferogramas complejos que son informados como HPV positivo no tipificable. Sala D (Salón Rodin - 2º piso) 14:30 - 16:00 hs. Biotecnología 0040 EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA ESTRUCTURAL DE CÁPSIDE VP6 DE ROTAVIRUS HUMANO A EN EL SISTEMA BACULOVIRUS-CÉLULAS DE INSECTO. FC Raibenberg1, OR Pérez1, R Jurado1, AV Peralta2 1 Servicio de Vacuna antirrábica, Instituto Nacional de Producción de Biológicos INPB, Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud, ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán,”, Argentina. 2 CONICET, Argentina. Los rotavirus humanos grupo A (RV HA) son la causa más común de gastroenteritis aguda en niños menores de 5 años. Se estima que más de 450.000 niños mueren por esta enfermedad cada año a nivel mundial. Las infecciones por RV HA continúan generando costos directos significativos para los sistemas de salud. El uso de pruebas diagnosticas comerciales de origen importado constituye una carga económica considerable para estos sistemas en países en desarrollo. El ensayo ELISA es la metodología de uso principal en el diagnóstico de RV HA. El Servicio de Vacuna Antirrábica del INPB ANLIS Malbrán desarrolló un ensayo diagnóstico ELISA para la detección de rotavirus A en heces, de producción nacional que permitiría mejorar el acceso, a esta tecnología diagnóstica. Con el fin de optimizar y complementar la elaboración de los componentes del ensayo ELISA, se propuso la producción local de la proteína estructural de cápside VP6 de RV HA para su aplicación como antígeno control positivo del mencionado diagnóstico. Para expresar la proteína estructural de cápside VP6 humana A se empleo el sistema de expresión baculovirus-células de insecto. La secuencia completa del segmento 6 de RV HA que codifica para la proteína VP6 se aisló por RT-PCR y se subclonó en el vector donante pFastBac™1 del sistema Bac-to-Bac. Este sistema proveyó una manera rápida y sencilla para la generación de baculovirus Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) recombinantes AcVP6RVHA. La proteína VP6 recombinante se expresó en altos niveles en células de insecto en cultivo. El análisis por SDS- 89 Libro de resúmenes PAGE confirmó que posee un peso molecular de ~ 44 kD y que presenta la misma movilidad que la proteína VP6 de rotavirus de simio SA11 de referencia. La inmunodetección por western blot con un anticuerpo policlonal anti RV HA y la evaluación mediante el ensayo ELISA, para la detección de antígeno de rotavirus A en heces, corroboraron que la VP6 humana A recombinante producida en el presente estudio conserva su capacidad antigénica. Adicionalmente se realizó un estudio complementario para evaluar la posibilidad de producir partículas similares a virus, VLPs 2/6 quiméricas cuyo resultado demostró que cuando ambas proteínas estructurales de cápside de rotavirus son coexpresadas a través de la co infección de células Sf9 con los baculovirus recombinantes AcVP2SA11 y AcVP6RVHA, la proteína VP2 SA11 de simio es capaz de interactuar con la proteína VP6 humana A formando VLPs 2/6 quiméricas de doble capa que se autoensamblan intracelularmente y que pueden ser purificadas a partir de sobrenadantes de cultivos de células Sf9 co infectados. Este trabajo demuestra que es factible producir localmente la proteína estructural de cápside VP6 de rotavirus humano A, a partir de aislamientos de Argentina usando el sistema de expresión baculoviruscélulas de insecto. 0049 EXPRESIÓN DE LA GLICOPROTEÍNA DEL VIRUS DE LA RABIA EN PICHIA PASTORIS LD Picotto1, GH Sguazza2, CM Galosi2 4, SF Cavalitto1 3, MR Pecoraro2 1 CONICET, Argentina. 2 Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, Argentina. 3 Facultad de Ciencias Exactas, UNLP, Argentina. 4 CIC, Pcia Bs As, Argentina. La rabia es una zoonosis causada por un virus de la familia Rhabdoviridae que afecta a animales domésticos y salvajes, y mayormente se propaga al humano mediante mordeduras de perros infectados. La prevención de la rabia humana puede lograrse mediante vacunación masiva y control de perros callejeros. En Argentina, la elaboración de vacunas contra la rabia se hace en ratones lactantes y en cultivo celular, y tienen un gran riesgo operativo al manipular un virus altamente peligroso. La proteína más antigénica del virus es la glicoproteína G de la envoltura, por lo que una alternativa de producción, para evitar el inconveniente mencionado anteriormente, sería obtener la glicoproteína utilizando un sistema heterólogo como Pichia pastoris, ya que es seguro, fácil de manipular y capaz de realizar modificaciones post traduccionales similares a las realizadas en eucariotas superiores. El objetivo de este trabajo fue expresar la glicoproteína del virus de la rabia en Pichia pastoris. El inicio del trabajo consistió en una extracción del ARN viral a partir de la cepa vacunal CVS que sirvió como molde para amplificar, por RT-PCR con primers específicos, la secuencia nucleotídica que codifica para la glicoproteína. La RT-PCR se chequeó mediante una electroforesis en gel de agarosa. El producto de amplificación fue ligado al vector pCRTOPO2.1. La ligación se comprobó por PCR con primers específicos para la región M13, observándose la banda esperada en una electroforesis en gel de agarosa. Posteriormente se sub-clonó el gen dentro del vector pPIC9, con el inserto colocado bajo el control del promotor AOX1 (inducible por metanol) y fusionado a una secuencia de exportación capaz de secretar la proteína al medio de cultivo. La construcción se chequeó por PCR con primers específicos para el gen AOX1, arrojando la banda esperada por electroforesis en gel de agarosa. El plásmido obtenido fue linealizado enzimáticamente y transformado en Pichia pastoris GS115. Las colonias recombinantes fueron visibles en medio selectivo. La transformación fue confirmada por PCR con primers específicos para el gen AOX1 arrojando las bandas esperadas. Finalmente, se secuenció el gen clonado y se hizo el análisis de secuencia para corroborar su identidad frente a una base de datos, mostrando una homología de secuencia superior al 99%. Se realizaron cultivos en pequeña escala tomándose muestras de sobrenadante para evaluar la expresión de la glicoproteína. Se midió el nivel de expresión mediante Western Blot, observándose la banda correspondiente a la glicoproteína. Conclusión: Los resultados obtenidos confirman que el gen que codifica para la glicoproteína antigénica del virus de la rabia fue exitosamente clonado y expresado en el sistema de expresión P. pastoris. Este resultado nos permite seguir avanzando en el desarrollo de una vacuna para la profilaxis de esta enfermedad que sea segura, barata y efectiva. 0077 ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DE STOCKS DE VIRIONES BROTADOS DE BACULOVIRUS CONGELADOS EN MEDIOS LIBRES DE SUERO I Eberhardt, GA Micheloud, VV Gioria, JD Claus Laboratorio de Virología, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional del Litoral, Argentina. Los baculovirus (familia Baculoviridae) son virus específicos de artrópodos cuyo ciclo replicativo se caracteriza por generar dos progenies diferentes: los viriones ocluídos (OVs), que quedan retenidos en los cuerpos de oclusión (OBs), y los viriones brotados (BVs). Los BVs no sólo son empleados como stocks para la infección de cultivos celulares destinados a la producción de OBs insecticidas, sino que también se utilizan como vectores para la expresión de proteínas recombinantes, producción de pseudo-partículas virales y terapia génica, entre otras aplicaciones biotecnológicas. Por lo tanto, existe interés académico e industrial en establecer protocolos optimizados para la producción y almacenamiento de stocks de BVs, principalmente en medios libres de suero por razones económicas y regulatorias. El congelamiento a -80°C es un procedimiento bien establecido para la preservación de los stocks de BVs producidos en medios suplementados con suero, pero la escasa información disponible indica que el congelamiento a la misma temperatura de los stocks producidos en medios libres de suero provoca una reducción muy significativa de la infectividad, cuya causa no ha sido aún establecida. Fue objetivo de este trabajo investigar la estabilidad de la actividad infecciosa de stocks de BVs del Virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Anticarsia gemmatalis (AgMNPV) congelados a -80°C en medios libres de suero suplementados con micromulsiones lipídicas. Los resultados obtenidos demuestran que los stocks de AgMNPV producidos y almacenados en distintos medios libres de suero, comerciales y no comerciales, reducen su título infeccioso entre 48% y 91% luego de un ciclo de congelado de 6 meses a -80°C. Mediante ensayos factoriales se determinó que la causa de tal pérdida de actividad infectiva en los stocks congelados radica en la presencia de microemulsiones lipídicas en la composición de los medios de cultivo libres de suero para células de insecto. Además, se identificó a un componente de dichas microemulsiones, el Polisorbato 80, como responsable principal del efecto inactivante. Imágenes de microscopia electrónica de transmisión mostraron daños estructurales que afectaron principalmente la envoltura de los BVs congelados en medios suplementados con microemulsiones lipídicas, que son compatibles con las propiedades surfactantes del Polisorbato 80. Esta información puede ser útil para mejorar la composición de los medios de cultivo libres de suero de células de insecto, como así también para optimizar los procedimientos de preservación de stocks de BVs por congelación a temperaturas ultra-bajas. 0087 DESARROLLO DE UN ADENOVIRUS RECOMBINANTE NO REPLICATIVO COMO CONTROL INTERNO DE PROCESOS DE VIROLOGÍA AMBIENTAL Y ALIMENTARIA MD Blanco Fernandez1, OA Taboga2, VA Mbayed1 1 Catedra de Virología, FFyB, UBA, Argentina. 2 Instituto de Virología, INTA Castelar, Argentina. Debido a su alta infectividad, persistencia en el medio y tolerancia a tratamientos, los virus entéricos humanos son uno de los principales agentes causales de enfermedades asociadas al consumo de alimentos o aguas contaminados. La detección de estos virus en aguas y alimentos se basa en la concentración y/o elusión de los virus desde matrices sólidas o líquidas seguidas de técnicas moleculares para la detección de ácidos nucleicos. No existe todavía un consenso acerca de los protocolos a utilizar y la metodología desarrollada hasta el momento presenta una alta variabilidad intra e interlaboratorios. A su vez, la presencia de inhibidores en muestras ambientales y alimentos interfiere en la detección y cuantificación de los virus presentes, lo que hace necesaria la inclusión de controles internos virales que permitan 90 Libro de resúmenes evaluar integralmente los diferentes procesos de la Virología ambiental y de alimentos. El objetivo del trabajo fue generar adenovirus recombinantes no replicativos como controles internos de amplificación de genomas virales y de procesos de Virología ambiental y alimentaria. Se sintetizaron químicamente 2 construcciones con las regiones genómicas apropiadas para la detección por PCR cuantitativa en tiempo real [(q)PCR] de virus humanos que pueden encontrarse en el ambiente. Una representa a virus con genoma ARN (enterovirus, virus de hepatitis A, norovirus, virus de hepatitis E y rotavirus) y la otra representa a virus con genoma ADN (adenovirus y poliomavirus). La región de amplificación de cada virus se diseñó manteniendo el tamaño, el porcentaje de GC y los sitios de hibridación cebadores de los virus nativos pero modificando la secuencia interna de complementariedad con sondas específicas. Para la generación de partículas virales, se utilizó un vector basado en adenovirus (CellBiolabsRAPAd® AdenoviralExpressionSystem). Las dos construcciones se clonaron en el vector pacA5K-NpA y se cotransfectaron junto a un vector “helper” (pacAd5 9.2-100) en células HEK 293A utilizando un agente de transfección de polímeros catiónicos (X-tremeGENE 9, Roche). La progenie viral obtenida se amplificó en esta misma línea celular, que aporta la región genómica E1 que no está incluida en el vector viral para impedir su replicación. Los stocks virales generados se cuantificaron utilizando ensayos de dilución de punto final, alcanzándose títulos en el orden de 109 TCID50/ml. El adenovirus control obtenido en este trabajo permitirá la evaluación de metodología aplicada a la detección de virus en agua y alimentos, así como la eficiencia de extracción de ácidos nucleicos y de las (q)PCRs de los virus entéricos incluidos en el diseño. Además, podrá incorporarse de rutina a las muestras reales evaluadas para controlar la performance de los procesos. 0125 ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DE VIRIONES BROTADOS DEL VIRUS DE LA POLIEDROSIS NUCLEAR MÚLTIPLE DE ANTICARSIA GEMMATALIS (AGMNPV) EN UN MEDIO DE CULTIVO LIBRE DE SUERO Y DE COMPONENTES DE ORIGEN ANIMAL. MF Legascue, GA Micheloud, VV Gioria, JD Claus Laboratorio de Virología. Facultad de Bioquímica y Cs. Biológicas. Universidad Nacional del Litoral, Argentina. Introducción Los baculovirus son virus específicos de artrópodos. Durante su replicación se producen dos progenies: los viriones brotados (BVs) y los viriones ocluidos (OVs). Contrariamente a la elevada estabilidad de los stocks virales conservados en los medios de cultivo suplementados con suero fetal bovino (SFB) se ha demostrado que, los BVs producidos en cultivos libres de éste suplemento, y congelados a -80° C, pierden hasta un 90% de su infectividad al cabo del primer descongelado. En el laboratorio se diseñó un medio de cultivo libre de SFB, y de todo componente de origen animal (UNL-9), que permite la proliferación de la línea celular UFLAg-286 y la replicación del AgMNPV. En función de éstos antecedentes, se propone estudiar la estabilidad de los BVs del AgMNPV en el medio UNL-9 a distintas temperaturas de almacenamiento. Objetivos Evaluar el efecto del proceso de congelado y descongelado sobre el título de un stock de BVs, del AgMNPV producido en el medio UNL-9, cuando la muestra se conserva a -80ºC. Estudiar la estabilidad en el tiempo de un stock viral del AgMNPV almacenado a 4ºC. Metodología Se utilizaron cultivos de la línea celular UFLAg-286 adaptada a los medios UNL-9 y UNL-8 suplementado con 10% de SFB y stocks virales producidos en ambos cultivos, cuyos títulos fueron calculados por el método de dilución límite y punto final. a) Se evaluó el efecto del congelado y descongelado sobre la infectividad de los stocks virales. Los títulos fueron determinados antes del congelado y después del descongelado, el que fue llevado a cabo de manera rápida en un baño de agua a 37ºC y lenta en un baño de hielo. b) Se titularon mensualmente, alícuotas de ambos stocks virales conservados a 4ºC. Resultados A una temperatura de conservación de -80ºC, los mayores porcentajes de inactivación viral fueron registrados en los stocks producidos en las células adaptadas al cultivo en UNL-9. El medio de almacenamiento libre de suero fue el factor que ejerció un efecto negativo estadísticamente significativo sobre la estabilidad viral. En cambio, la forma de descongelado y la asociación entre el tipo de medio de cultivo y descongelado de los stocks sólo estuvo asociado a un ligero efecto negativo, no significativo. Por otra parte, no se registraron cambios en los valores de los títulos virales cuando los stocks fueron conservados a 4ºC. Conclusión El proceso de congelado y descongelado, de los stocks de BVs almacenados en el medio de cultivo UNL-9 a -80°C, afectó significativamente el título viral. Por el contrario, el valor del título de los BVs producidos en los mismos cultivos no fue modificado cuando las muestras no fueron congeladas. Como futuro trabajo se propone, el estudio de la conservación de los stocks virales en nitrógeno líquido y a -80°C, utilizando contenedores que permitan un descenso lento de la temperatura, a fin de determinar si la velocidad de congelado influye sobre la estabilidad de los BVs. 0178 VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA TIPO 1 (HIV-1): OBTENCIÓN DE LA PROTEÍNA P24 RECOMBINANTE EN ESCHERICHIA COLI Y EVALUACIÓN DE SU REACTIVIDAD INMUNOLÓGICA MA Zak1, TA Teodoroff1, GS Braidot1, A Edelstein2 1 INEI-ANLIS "Dr. Carlos G. Malbrán", Argentina. 2 UOCCB-ANLIS "Dr. Carlos G. Malbrán", Argentina. El presente trabajo se desarrolló en el marco de una línea de producción local de blancos moleculares que puedan ser utilizados como materiales de referencia y/o para el diseño de herramientas metodológicas aplicables al diagnóstico e investigación de la infección por HIV. Los objetivos fueron obtener la proteína p24 del HIV-1 en forma recombinante (p24r) en E. coli, diseñar un ensayo que permita evaluar su reactividad inmunológica y realizar un estudio comparativo de la capacidad de detección de anticuerpos anti p24 del HIV-1 entre el ensayo diseñado y un método confirmatorio comercial en línea (LIA). A partir del ARN viral extraído de cepas circulantes en el país, se optimizó la amplificación de la región codificante para la p24 del HIV-1 utilizando cebadores diseñados en base a una secuencia consenso entre las correspondientes a cepas de la región publicadas en Genbank. Se seleccionó el fragmento más representativo por análisis filogenético de nucleótidos y homología de aminoácidos utilizando secuencias de referencia de subtipos de HIV-1 y se clonó en el vector pRSET A para originar la p24r fusionada a una cola de histidinas (HIStag). Luego de la amplificación y purificación del vector recombinante en E. coli JM 109, se transformó la cepa E. coli BL21 (DE3) pLysS por electroporación y se confirmó la presencia del inserto de interés en las bacterias seleccionadas por PCR de colonias y secuenciación. Se indujo la expresión proteica y en alícuotas sonicadas del cultivo se observó la mayor expresión a las 11 hs posinducción y que la p24r se localizó principalmente en la fracción insoluble. La purificación de la p24r se realizó en condiciones desnaturalizantes por cromatografía de afinidad de metales. La proteína purificada se cuantificó (3,26 mg/200 ml de cultivo) y se confirmó su identidad por estimación del peso molecular y la reactividad frente a anticuerpos monoclonales específicos anti-HIStag y anti-p24 de HIV-1. Para profundizar la evaluación de su reactividad inmunológica, se analizaron plasmas de pacientes HIV positivos y de controles negativos, ya caracterizados por LIA, por medio de un ensayo de puntos diseñado y optimizado en el laboratorio. Este método fue capaz de discriminar la presencia y la ausencia de anticuerpos anti p24 en las muestras de plasma: reacción de color franca en el 100% (30/30) de las muestras que presentaron banda positiva para p24 (2+ a 4+) en el LIA, no presentando reacción de color franca en ninguna de las 14 muestras cuyas bandas de p24 resultaron negativas en el LIA (10 de pacientes HIV negativos y 4 de pacientes HIV positivos), observándose así una buena correlación en la capacidad de detección de estos anticuerpos entre ambos métodos. 91 Libro de resúmenes De esta manera, se estandarizó la obtención homogénea y biosegura de la p24r desnaturalizada de HIV-1 en un sistema de expresión procariota en pequeña escala manteniendo su capacidad de reaccionar inmunológicamente frente a los anticuerpos dirigidos contra la proteína salvaje. 0211 USO DE INOSINAS EN PRIMERS GENERALISTAS PARA APLICACIONES DE PCR EN ESTUDIOS POBLACIONALES DE VIRUS: EL CASO DE LOS GENES PIFS Y BACULOVIRUS. CS Turco, MN Belaich, PD Ghiringhelli Laboratorio de Ingeniería Genética y Biología Celular y Molecular - Área Virosis de Insectos, Universidad Nacional de Quilmes, Argentina. Los baculovirus son patógenos virales con genomas dsDNA que infectan lepidópteros, himenópteros y dípteros, siendo explotados biotecnológicamente por sus interesantes propiedades biológicas. Una de las aplicaciones más destacadas es su uso en el control biológico de plagas, ya que poseen gran virulencia, posibilidad de generar epizootias y alta especificidad hacia el hospedador donde multiplican. Se han descripto decenas de especies, las cuales se clasifican en 4 géneros: Alphabaculovirus (subdividido en Grupos I y II), Betabaculovirus, Gammabaculovirus y Deltabaculovirus. Una particularidad que los destaca es la ocurrencia de dos fenotipos durante el ciclo infectivo: los viriones brotantes (BVs), de aparición temprana y asociados con la infección sistémica; y los viriones derivados de los cuerpos de oclusión (ODVs), de aparición tardía y vinculados directamente con la infección primaria. Los ODVs infectan con alta especificidad las células intestinales del hospedador susceptible, gracias a la presencia de proteínas virales localizadas en la envoltura que se denominan PIFs (Per os Infectivity Factors). Cabe señalarse que los 7 genes que las codifican se encuentran en todos los genomas baculovirales analizados hasta la fecha, revelando su rol esencial en la infección. Por esta cuestión, y por ser el complejo proteico encargado del reconocimiento inicial al hospedador, surge como atractivo el diseño de estrategias experimentales que asistan en la realización de estudios poblacionales sobre baculovirus. En función de lo anterior, se diseñaron pares de primers para PCR con el objetivo de recuperar fragmentos internos de todos los genes pifs de cualquier alpha- y betabaculovirus, los miembros más abundantes de Baculoviridae. Para ello, se realizaron alineamientos múltiples de las secuencias nucleotídicas correspondientes, generándose en consecuencia tres conjuntos de primers para cada pif: uno para alphabaculovirus de Grupo I; otro para los ortólogos de Grupo II; y el restante para betabaculovirus. Dada la alta variabilidad secuencial en estos genes, se incorporaron en los oligonucleótidos inosinas en lugar de ambigüedades con el fin reducir el tamaño poblacional. Posteriormente, se realizó la puesta a punto de los ensayos de PCR para cada juego de primers, utilizando como moldes distintos genomas virales (AgMNPV, AcMNPV, RanuMNPV, DijuMNPV, SfMNPV, SeMNPV, EpapGV y CpGV), algunos con secuencias completas y otros no. Así, se lograron optimizar condiciones exitosas de reacción donde se pudo corroborar la identidad de los productos de amplificación mediante su clonado molecular y posterior secuenciación. También, se realizaron inferencias filogenéticas que mostraron resultados similares a los realizados con genomas completos, mostrando en consecuencia la utilidad de la estrategia como primera aproximación en la clasificación de un baculovirus, o como metodología para correlacionar el rango de hospedador con las secuencias que portan en sus genomas. 0214 VECTORES BACULOVIRALES COMBINADOS: EXPOSICIÓN SUPERFICIAL DE ANTÍGENOS Y TRANSDUCCIÓN DE GENES PARA LA PREVENCIÓN DE LA FIEBRE HEMORRÁGICA ARGENTINA. ML Pidre, M Sapir, S Haase, AE Ure, RM Gómez, V Romanowski Instituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM, UNLP-CONICET), Facultad de Ciencias Exactas, UNLP. Calle 115 y 49, (1900) La Plata, Argentina. Los baculovirus son virus envueltos cuyo genoma consiste en una molécula de DNA doble hebra de entre 80 kpb hasta 180kpb. La estrategia de baculovirus display apunta a la obtención de memoria inmunológica dependiente de baculovirus y se basa principalmente en la exposición de uno o más epítopes de interés en la forma de un polipéptido quimérico fusionado a la proteína transmembrana mayoritaria de los viriones brotantes, GP64. Con algunas modificaciones esta estrategia permite expresar los genes seleccionados en células de mamíferos utilizando a los baculovirus recombinantes (recBVs) como vehículos de transducción, permitiendo la generación de una respuesta celular específica, además de humoral. De allí nuestro interés en desarrollar un sistema de este tipo para el abordaje de la prevención de la fiebre hemorrágica argentina (FHA). Inicialmente se amplificó el gen completo de gp64 por PCR y se clonó el producto de amplificación en el vector pCR4-TOPO. Se modificó el gen de gp64 por PCR con el objetivo de incorporar sitios de clonado en el marco de lectura de la glicoproteína. Con el fin de desarrollar un sistema rápido y versátil para la obtención de recBVs, se utilizó como material de partida el vector de transferencia pBAcPak9 del sistema de recombinación bAcGOZA. En ese contexto, se clonó el gen modificado de gp64 en dicho vector de transferencia. El vector resultante fue denominado pBAcDis. Asimismo, se amplificó por PCR la secuencia completa de la subunidad G1 de la glicoproteína de superficie del virus Junín (JUNV). De forma complementaria, se realizó un análisis bioinformático para predecir los sitios de interacción de la subunidad G1 de JUNV con su receptor y utilizar ese fragmento como posible inmunógeno. Posteriormente se obtuvo por PCR el fragmento de 120 pb (G1PD) predicho in silico. Finalmente, los fragmentos correspondientes a G1 y G1PD fueron clonados en el vector de transferencia generado anteriormente. Además, se utilizaron dos construcciones adicionales constituidas por el ORF completo de la glicoproteína GPC de JUNV clonada en el vector pBAcPak9, bajo el control del promotor de la poliedrina baculoviral y bajo el control del promotor del gen ie1 de citomegalovirus respectivamente. A continuación, se co-transfectó el DNA del bácmido bAcGOZA y las construcciones plasmídicas mencionadas como complejos formados con lípidos catiónicos. De este modo se obtuvieron los recBVs y se confirmó por PCR la incorporación de los genes heterólogos. Posteriormente, se infectaron células de insecto High Five o células de mamífero Vero (según corresponda) con los recBVs y se evidenció la expresión de las proteínas recombinantes por SDS-PAGE, western blot, ELISA, inmunofluorescencia y citometría de flujo. La obtención de estos recombinantes permitirá en el corto y mediano plazo la utilización de los mismos como vectores de vacunación de modelos animales con el objetivo de desarrollar una alternativa a la vacuna ya existente contra la FHA. 0218 DESARROLLO DE UN SISTEMA BASADO EN PCR DE TIEMPO REAL PARA LA DETECCIÓN Y SEROTIPIFICACIÓN DEL VIRUS DENGUE HL Urán Landaburu1, DL Mengual Gómez2, PD Ghiringhelli1, M Bilen1 1 Universidad Nacional de Quilmes, Laboratorio de Ing. Genética y Biología Celular y Molecular, Argentina. 2 Productos Bio-Lógicos S.A, Argentina. La fiebre del Dengue es una enfermedad endémica en Sudamérica. En 2014 se han confirmado, según datos de la Organización Panamericana de la Saud, más de 600.000 casos tan solo en Argentina, Brasil, Paraguay, Chile y Uruguay. El agente etiológico de la fiebre del Dengue es un virus perteneciente a la familia Flavivirdae conocido como Virus Dengue. Éste presenta 4 serotipos distintos. En Argentina, las metodologías de diagnóstico más utilizadas se basan en ensayos serológicos, cultivo celular en células C6/36, o análisis molecular mediante RT-PCR. El empleo de metodologías de PCR en tiempo real para la detección del Dengue, tiene una aplicación limitada en los centros de salud de nuestro país debido a los altos costos de los reactivos y el equipamiento necesario. Este trabajo presenta el desarrollo de un sistema de detección basado en qPCR, donde se utilizaron primers y sondas de diseño original y componentes de reacción producidos localmente. Los primers y sondas utilizadas fueron diseñados a partir de un análisis bioinformático exhaustivo, contemplando 80-90 secuencias de 92 Libro de resúmenes genomas completos de cada serotipo viral, en el que se detectaron potenciales regiones de interés para ensayos moleculares. Se utilizó esta información para generar oligonucleótidos consenso y serotipoespecíficos. A su vez, se generaron clones de cDNA de cada serotipo viral correspondientes a las regiones reconocidas como blanco. Dichos clones fueron utilizados como molde de PCR durante el subsiguiente proceso de evaluación de la especificidad, sensibilidad y estabilidad del sistema. Por otro lado, para evaluar la eficiencia general, se comparó la mezcla de reacción contra otros productos comerciales. Como resultado de este trabajo se destaca la obtención de un sistema optimizado para la detección y sero-tipificación del virus Dengue, utilizando una mezcla de reacción diseñada ad hoc y valiéndose de componentes originales y producidos localmente. El sistema mostró un 100% de especificidad de serotipo y una sensibilidad suficiente para la detección de 10-100 moléculas blanco. Adicionalmente, las pruebas de estabilidad mostraron que la mezcla de reacción desarrollada conserva sus propiedades hasta 6 meses (almacenada a -20ºC) y los análisis comparativos resultaron satisfactorios, presentando una eficiencia comparable a la obtenida con otros productos comerciales. 0223 CARACTERIZACIÓN DE UN AISLAMIENTO ARGENTINO DEL GRANULOVIRUS DE SPODOPTERA FRUGIPERDA, SFGV KB Sabalette1, J Niz2, R Salvador2, A Sciocco-Cap2, V Romanowski1, ML Ferrelli1 1 Instituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM-UNLP-CONICET), Argentina. 2 Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola - INTA Hurlingham, Argentina. La oruga militar tardía, Spodoptera frugiperda, es una plaga importante del cultivo de maíz en nuestro país y resto de América. Una de las estrategias utilizadas para su control, además del uso de insecticidas químicos, ha sido la utilización de maíz transgénico que expresa la toxina Cry 1F (maíz Bt). Recientemente se han informado casos de resistencia en Brasil y Puerto Rico. Una alternativa para el control de esta plaga surge del uso de baculovirus, una familia de virus específicos de insectos. El nucleopoliedrovirus SfMNPV (género Alfabaculovirus) y el granulovirus SfGV (género Betabaculovirus) solo infectan S. frugiperda. Diferentes aislamientos de SfMNPV han sido probados con éxito como bioinsecticidas mientras que SfGV podría ejercer una acción sinérgica con alfabaculovirus. Existen escasos reportes sobre SfGV, y recientemente se dio a conocer el primer genoma de un aislamiento de este virus, aislado en Colombia. En este trabajo, nos propusimos caracterizar un aislamiento de SfGV autóctono (SfGV-ARG) (Castelar, Buenos Aires) conservado en la colección del IMYZA y compararlo con otros aislamientos del virus. El SfGV-AR fue amplificado en larvas de S. frugiperda de cuarto estadio. A partir de un macerado de larvas muertas, se purificaron los cuerpos de oclusión (OB). Se realizó un SDS PAGE para analizar el perfil proteico de los OBs. Además se extrajo su DNA, el que se utilizó como molde para PCRs y para digestión con enzimas de restricción. Se amplificaron regiones de los genes de granulina, lef-8 y lef-9 con primers degenerados de la familia Baculoviridae. Los fragmentos de PCR se purificaron a partir de gel de agarosa y se secuenciaron. Las secuencias obtenidas fueron analizadas por blastn y se utilizaron para comparar con las de otros baculovirus mediante análisis filogenético. Se realizó el análisis del patrón de restricción de DNA con las enzimas EcoRI, BamHI, HindIII y BglII. El perfil proteico por SDS-PAGE mostró la presencia de una proteína mayoritaria de los OBs en aproximadamente 29 kDa, lo que concuerda con el peso molecular de las granulinas de todos los GVs. Las secuencias parciales obtenidas se analizadas por blastn, obteniendo un alto porcentaje de identidad (>98%) con las secuencias de otros aislamientos de SfGV. Luego estas se utilizaron para realizar alineamientos con sus homólogas del género Betabaculovirus. Los alineamientos concatenados se utilizaron para analizar las distancias por el modelo Kimura-2-parameter que confirmó que nuestro aislamiento se trata de la especie SfGV. Además se analizó la filogenia por Minumum Evolution y Maximum Likelihood lo que permitió relacionar a SfGV-ARG con el resto de los betabaculovirus, indicando que el más cercano evolutivamente es el aislamiento SfGV A12-4. El análisis de restricción permitió estimar el tamaño del genoma en 136 Kpb. La caracterización de este granulovirus tanto a nivel molecular como biológico nos permitirá evaluarlo para su uso en el control biológico de plagas. 0231 CONSTRUCCIÓN DE BIBLIOTECAS DE ANTICUERPOS DE DOMINIO ÚNICO DERIVADOS DE CAMÉLIDOS (VHH O NANOANTICUERPOS) Y OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA LA CEPA A24/CRUZEIRO DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA V Grippo, J De Nicola, J Bozzo, N Mattion Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein, Argentina. Introducción. La Fiebre Aftosa plantea necesidades importantes no satisfechas que exigen enfoques innovadores. Debido a sus propiedades únicas en comparación con los anticuerpos convencionales, los Nano-anticuerpos o VHH han revolucionado el campo de los anticuerpos monoclonales y presentan un gran potencial en el desarrollo de nuevos métodos diagnósticos más sensibles y específicos. Esto se debe a que los VHHs permiten fijar una mayor densidad de anticuerpos incrementando la sensibilidad en el diagnóstico al detectar concentraciones significativamente menores de un antígeno. Por esta razón, el presente trabajo tiene como objetivo obtener y producir Nano-anticuerpos contra la cepa A24/CRUZEIRO del virus de la Fiebre Aftosa para ser utilizados en la innovación y mejora del diagnóstico de esta infección viral. Metodología y resultados. Para lograr tal objetivo, dos llamas (Lama glama) fueron inmunizadas 3 veces cada 2 semanas con la cepa A24/CRUZEIRO (SENASA). Se comprobó la inducción de una alta respuesta inmune por ELISA en fase líquida, el título fue menor a 1.10 para el suero pre-inmune y alcanzó después de las inmunizaciones un valor de 3.70 y 4.55 para la llama S y B, respectivamente. A partir de la sangre total periférica de estas llamas inmunizadas, se preparó ARN total y se sintetizó el ADNc. En una primera PCR, se amplificaron las regiones variables de cadenas pesadas tanto de anticuerpos convencionales (VH, producto de 900bp) como de anticuerpos de cadena única (VHH, producto de 700bp). En una segunda PCR, se amplificó solo el repertorio de VHH (400bp) y se introdujeron los sitios de restricción para su posterior clonado. Los fragmentos VHH fueron clonados en el vector pHEN4 y tales construcciones se electroporaron en la cepa E. coli TG1 obteniéndose 2 bibliotecas inmunes de Nanoanticuerpos. En ambos casos, su tamaño fue mayor a 107 ufc/ug y el porcentaje de clones con inserto completo determinado por “colonyPCR” fue superior a 92%. Luego, se procedió al rastreo de las bibliotecas aprovechando la afinidad de los fagos que expresan los VHH por la cepa A24/CRUZEIRO. Después de la segunda ronda de selección, se obtuvieron fagos expresando en su superficie los VHHs que reconocieron a la cepa en ELISA de fagos policlonal y monoclonal. La diversidad de los clones fue analizada por digestión enzimática con HinfI y posterior secuenciación. Luego, se indujo la expresión de los VHHs en forma soluble a partir de los clones seleccionados y se confirmó la reactividad específica de los anticuerpos solubles contra la cepa A24/CRUZEIRO por ELISA en fase líquida. Conclusiones. Este trabajo presenta la primera obtención y caracterización de Nano-anticuerpos contra la cepa A24/CRUZEIRO del virus de la Fiebre Aftosa, lo cual constituye una herramienta innovadora como base para el desarrollo y mejora del diagnóstico de esta infección viral. 0232 BÚSQUEDA DE PATRONES PARA LA IDENTIFICACIÓN DE SEÑALES DE LOCALIZACIÓN NUCLEAR EN PROTEOMAS DE BACULOVIRUS. CS Cerrudo, SAB Miele, MN Belaich, PD Ghiringhelli LIGBCM-AVI, Universidad Nacional de Quilmes, Argentina. Los baculovirus son virus de insectos con genoma de DNA circular doble cadena de 80 a 180 kpb, ampliamente estudiados por sus múltiples aplicaciones biotecnológicas. Previamente en nuestro laboratorio se identificaron 37 genes esenciales (core genes), con ortólogos en 74 genomas baculovirales completamente secuenciados, de entre más de 93 Libro de resúmenes 800 existentes en la familia. Persiguiendo objetivos similares, en este trabajo se pretende comenzar con predicciones proteómicas. En distintos estudios se han identificado y caracterizado potenciales Señales de Localización Nuclear (NLS, por sus siglas en inglés) en proteínas baculovirales, principalmente en Autographa californica MNPV (AcMNPV). Sin embargo, las NLS caracterizadas no han sido identificadas en las proteínas ortólogas de las otras especies. En este sentido, el objetivo final del trabajo es disponer de patrones formulados de acuerdo a reglas sintácticas estándar (por ej. del tipo PROSITE), perfiles numéricos o modelos de Markov que permitan identificar NLSs en proteomas baculovirales novedosos. En la búsqueda de un patrón secuencial genérico hemos analizado el subconjunto del proteoma baculoviral cuyos miembros desarrollan funciones dentro del núcleo y tienen alguna NLS con caracterización experimental. El trabajo se ha desarrollado en un esquema iterativo, donde las NLS de las proteínas Polh, BV/ODV-C42, IE1, LEF-3, LEF-11, DNApol (caracterizadas en AcMNPV), y BM47 (caracterizada en Bombyx mori NPV) fueron enriquecidas con las secuencias correspondientes al resto de los baculovirus. Mediante el PSI-BLAST se recuperaron las secuencias aminoacídicas correspondientes a cada grupo de proteínas a partir de los proteomas de los 74 genomas completos (2014). Para cada subconjunto se realizó un alineamiento múltiple utilizando el PSICoffee. Luego de una verificación y corrección manual se confeccionaron patrones tipo PROSITE que permitieron detectar las NLS de las 7 proteínas mencionadas en los proteomas de los diferentes Baculovirus (ejemplos en Tabla I). El empleo de dichos patrones en proteomas novedosos permitirá la asignación tentativa de función/funciones a las proteínas teóricas identificadas, las cuales podrán ser evaluadas experimentalmente a posteriori. De este modo, se avanza en la propuesta de herramientas predictivas para la caracterización de nuevos genomas baculovirales. Tabla I. Proteína NLS original Patrón NLS Polh 32 [KN]-[RK]-[KRQT]-[KREH] BV/ODVC42 357 K-[RK]-[KRVTALYNFCS]-[KR] IE1 KRKK35 KRKK360 Alfabaculovirus: H-[HYFV]-[VMIL]-[FLY][NASKRV]-[ILM]-[SNKVIG]-[NKRSTP]-[TSNVLGC][NSTGI]-R-[RK] 534 537 538 K, R, R Betabaculovirus: H-[AISTMN]-[EVN]-[TV][VTSM]-[KR]-[LHF]-[IV]-[ILM]-[RK]-Y-[IV]-[LMVI][EQS]-[RGS]-R 0239 PRODUCCIÓN Y EVALUACIÓN DE ANTICUERPOS IGY DE GALLINA ANTIIGG DE BOVINO CONJUGADOS A PEROXIDASA DE SOJA GD Asenzo1, G Gutiérrez1, G Levin2, L Bracco2, V Parreño1, K Trono1, MV Miranda2, A Wigdorovitz1 1 Instituto de Virología, CICVyA, INTA Castelar, Argentina. 2 Depto. de Microbiología, Inmunología y Biotecnología, FFyB, UBA., Argentina. Introducción: Los anticuerpos conjugados a peroxidasa son utilizados rutinariamente en diagnóstico. Su producción es sencilla, sin embargo es necesario el sangrado de animales para la obtención de los anticuerpos y disponer de la enzima en cantidad y bajo costo para su marcación. Para superar estas limitaciones, nos planteamos producir anticuerpos IgY anti-IgG bovino (H+L) a partir de yema de huevo y purificar peroxidasa a partir de la cáscara de soja (SbP), para finalmente conjugar estas moléculas. Metodología: Se hiperinmunizaron gallinas de raza Brown Nick con IgG bovina durante 2 meses. Se comprobó la respuesta inmune en los animales. Se recolectaron los huevos, se separó la yema y se extrajo la fase soluble de la yema por dilución en H2O y congelación. Se precipitó la IgY con sulfato de amonio y se purificaron los anticuerpos específicos por cromatografِía de afinidad a IgG bovina. Paralelamente, se purificó la SbP por cromatografía de intercambio iónico y de interacción hidrofóbica. Se conjugó la IgY a la SbP por medio de una reacción con periodato de sodio y una vez obtenido el conjugado IgY-SbP, se lo tituló en el ELISA indirecto para Leucosis Bovina Enzoótica (LBE), ensayo ya estandarizado en nuestro Instituto, en diluciones seriadas; para de esta manera analizar su performance. Por último, se analizaron muestras de campo utilizando un conjugado comercial y el producido en nuestro laboratorio. Resultados: Se logró obtener por medio de una hiperinmunización de gallinas un título de anticuerpos IgY anti-IgG de bovino con una dilución 1/262000 a punto final del suero. Se obtuvo un rendimiento de 2 mg de IgY específica por huevo. Se puso a punto la conjugación de esta IgY con la SbP, usando 160 mM NaIO4 para la oxidación de la enzima y 100 mM de NaBH4 para el bloqueo de la reacción. Se comprobó la marcación de la inmunoglobulina en una placa de ELISA sensibilizada con IgG de bovino. Se analizó la eficiencia de la marcación por medio de un SDSPAGE. El conjugado alcanzó una dilución de uso 1/1000 en el ELISA para LBE. La comparación estadística de los resultados utilizando muestras de campo mostró que el conjugado IgY-SbP tuvo un comportamiento semejante al conjugado comercial. Conclusiones: Se logró estandarizar el protocolo de marcación de las IgY. Se alcanzó una eficiencia de marcación y un título de uso comparable a las observadas en anticuerpos marcados con peroxidasa comercial. Se consiguió realizar el primer lote de anticuerpos conjugados IgY de gallina anti-IgG de bovino. Se empleó este reactivo en el ELISA estandarizado de LBE con resultados promisorios. Estos resultados positivos son un aliento para la evaluación del conjugado en otros métodos de diagnóstico en que se use anticuerpos anti-IgG bovina conjugado a peroxidasa. En un primer ensayo realizado con este reactivo, se obtuvo una performance aceptable para el uso en el laboratorio. 0251 DESARROLLO DE VHH RECOMBINANTES CONTRA NOROVIRUS PARA ELABORAR UN MÉTODO DIAGNÓSTICO A Aguilar1, L Garaicoechea1, M Bok1, G Canziani3, K Bok2, K Green2, V Parreño1 1 Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria, Argentina. 2 National Institute of Health, Estados Unidos. 3 Instituto Leloir, Argentina. Norovirus genera brotes pandémicos de gastroenteritis en humanos de todas las edades, llegando a ocasionar miles de muertes por año. El cuadro clínico incluye vómitos, fiebre, calambres abdominales y diarrea aguda. En la actualidad es difícil encontrar un método de diagnóstico antigénico rápido y con aceptable sensibilidad. Los anticuerpos recombinantes VHH son moléculas de 15KDa que por su pequeño tamaño y por estar formados por una sola cadena polipeptídica poseen características diferenciales a los anticuerpos convencionales. En nuestro grupo de trabajo realizamos dos bibliotecas de genes VHH específicas para Norovirus de los genotipos GI.1 y GII.4. A partir de estas seleccionamos VHH específicos para cada genotipo. Con el objetivo de obtener VHH que sean útiles para realizar un test diagnóstico se evaluó las capacidades de cruzamiento de los VHH seleccionadas con cepas de distintos genotipos, pero de igual genogrupo. A continuación, se realizó el mapeo epitópico de un anticuerpo VHH que mostró actividad cruzada y se determinaron sus afinidades por Resonancia Plasmática de Superficie empleando un equipo biosensor. Por otro lado, con el objetivo de seleccionar anticuerpos que crucen entre ambos genogrupos se realizó la técnica de biopaneo sobre las bibliotecas de VHH utilizando en el proceso de selección VLPs (partículas de virus vacías) del genotipo GI.1 y GII.4 en forma secuencial. Como resultado se observaron, por técnica de ELISA, distintos grados de cruzamiento de los VHH con cepas pertenecientes a distintos genotipos. Los VHH específicos para el genotipo GI.1 mostraron alta afinidad, en el orden nanomolar, pero no lograron reconocer todos los genotipos testeados. Por su parte, uno de los nanoanticuerpos que reconoció al genotipo GII.4 mostró cruzamiento con las VLPs de todos los genotipos ensayados dentro del genogrupo GII. Este mismo VHH presentó elevada afinidad por VLPs del genotipo GII.4, con una KD de 40 picomolar y reconoció un epítope lineal ubicado en el dominio P de VP1, entre los aminoácidos 517 y 528, según los resultados del mapeo epitópico. A su vez, de aquellos biopaneos secuenciales con VLPs de distinto genogrupo, se logró obtener un nanoanticuerpo VHH con capacidad de reconocer simultáneamente cepas de los genogrupos GI y GII. 94 Libro de resúmenes En base a estos resultados, concluimos que los anticuerpos VHH poseen un elevado potencial para diseñar una herramienta diagnóstica para la detección de Norovirus, gracias a su elevada afinidad, especificidad y a su vez capacidad de entrecruzamiento entre distintos genogrupos. Actualmente se están realizando estructuras multiméricas de estos VHH con el objetivo de aumentar el grado de entrecruzamiento y la afinidad por los antígenos. 0297 OPTIMIZACIÓN DE LA INCLUSIÓN DE PROTEÍNAS DE INTERÉS EN CUERPOS DE OCLUSIÓN DE BACULOVIRUS MG López1 2, HM Pallarés1, V Alfonso1 2, O Taboga1 2 1 Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA Castelar, Argentina. 2 CONICET, Argentina. Los baculovirus son virus de insectos usados principalmente en el control biológico de plagas y la expresión de proteínas recombinantes. La característica de estos virus de generar estructuras de resistencia llamadas cuerpos de oclusión (OBs o poliedros) conformados mayoritariamente por la proteína poliedrina (POLH), los hace especialmente atractivos desde el punto de vista biotecnológico. El objetivo de este trabajo consiste en desarrollar un método de obtención de poliedros quiméricos mediante fusiones traduccionales entre poliedrina y proteínas de interés, de manera de producir altos rendimientos de proteínas recombinantes fácilmente purificables a bajo costo, en un sistema eucariota. Para ello se diseñaron y obtuvieron baculovirus que expresan las fusiones POLHpprGFP o ΔPOLHpprGFP, siendo ppr un sitio de clivaje para la proteasa PreScission (GE), POLH la proteína poliedrina completa y ΔPOLH, el fragmento comprendido entre los aminoácidos 19 a 110 de poliedrina. Para aumentar la probabilidad de formación de poliedros que incorporan proteínas, se coexpresó una copia adicional del gen poliedrina salvaje. Se ensayaron distintas condiciones de infección aportando esa copia en cis (en el genoma del baculovirus, polh+) o en trans (aportada por líneas celulares que expresan polh). Así, se determinó que la mayor proporción de poliedros fluorescentes se obtiene cuando se infectan líneas trans-empaquetadoras con el baculovirus AcPOLHpprGFP de genotipo polh+. En particular, la línea que mostró mayor producción de poliedros quiméricos al ser infectada fue la Sf9POLHmut, que expresa una copia de poliedrina mutada en el residuo de aminoácido 44 que genera poliedros de mayor tamaño y con escasa oclusión viral. Las infecciones con el baculovirus AcΔPOLHpprGFP incorporaron solo trazas de la fusión. Los poliedros quiméricos obtenidos bajo las condiciones de infección mencionadas fueron aislados en base a su insolubilidad a pH neutro y alto coeficiente de sedimentación y analizados en su composición de manera cualitativa por Western blot, demostrando la presencia de la proteína quimérica y escasa presencia de viriones ocluidos. La proteína GFP quimérica presente en los poliedros disueltos con Na2CO3 fue eficientemente reconocida en ensayos de ELISA, demostrando que la fusión a poliedrina no afectó su reconocimiento inmunológico. Asimismo, los poliedros disueltos tratados con la proteasa PreScission dieron altos rendimientos de proteína GFP soluble. En conjunto, estos resultados alientan el potencial uso de este sistema como herramienta de expresión y purificación de antígenos de interés en el sistema baculovirus. 0321 DESTINO DEL GENOMA DE LOS BACULOVIRUS EN LA INFECCIÓN DE CÉLULAS NO INMUNES DE MAMÍFERO S Amalfi1 3, GN Molina1 2, E Tavarone1 2, O Taboga1 2, V Alfonso1 2 1 Instituto de Biotecnología, CICVyA INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina. 3 ANPCyT, Argentina. Los baculovirus son virus que infectan insectos, con aplicaciones biotecnológicas que incluyen la producción de proteínas recombinantes y el control biológico de plagas. La infección de células de mamífero con baculovirus es no productiva, lo que ha permitido su utilización en el delivery de genes y el desarrollo de vacunas de nueva generación. Además, en los últimos años se han descripto las propiedades antivirales y adyuvantes de los baculovirus. Los cambios fenotípicos que sufren las células de mamífero tras la infección con estos virus no han sido lo suficientemente estudiados, siendo la respuesta inmune innata el efecto más frecuentemente encontrado. Se ha demostrado la importancia del receptor TLR-9 como inductor de esta respuesta en células dendríticas; sin embargo, también ha sido descripta la producción de interferones de tipo I (IFN-I) por vías independientes de este receptor en células no inmunes. Los mecanismos inductores de la síntesis de IFN-I en células no inmunes de mamíferos en respuesta a infecciones virales están mediados por la detección de ácidos nucleicos no propios en el citoplasma, a través de la participación de moléculas como RIG-I, MAD5 y STING. En este marco, nuestro objetivo general es estudiar el impacto de los ácidos nucleicos de los baculovirus en la generación de un estado antiviral en células no inmunes infectadas. En particular, nos proponemos evaluar la presencia y proporción de ADN viral en el citoplasma de células de mamífero no inmunes respecto del ADN que alcanza el núcleo. Para ello, construimos baculovirus recombinantes y realizamos ensayos de infección en células BHK evaluando la expresión de genes reporteros a partir de promotores reconocidos por las maquinarias transcripcionales nuclear o citoplasmática de células de mamífero, aportada en este último caso en trans por coinfección con un virus Vaccinia-T7ARNpol. Los resultados mostraron que la proporción de genomas baculovirales disponibles para ser transcriptos en el citoplasma es mucho mayor que el ADN viral que llega al núcleo y puede ser templado para la expresión de genes. Así, la elevada cantidad de ADN baculoviral presente en el citoplasma de las células no inmunes puede impactar en receptores de ácidos nucleicos en forma directa o a través de su transcripción citoplasmática, dando lugar a la producción de interferones de tipo I en respuesta a la infección por baculovirus. Conocer el destino mayoritario del ADN baculoviral en células de mamífero permitirá el diseño de las estrategias más convenientes para la manipulación del genoma del virus con el fin de modificar la respuesta de las células a la infección. 0323 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LA HEMAGLUTININA DEL VIRUS DEL SARAMPIÓN EN UN SISTEMA DE GENERACIÓN DE VLPS IMPULSADO POR LA PROTEÍNA Z DEL VIRUS JUNÍN AF De Ganzó1, AL Belizan2, CS Borio1, MS Collado1, MH Argüelles2, SE Goñi1, ML Lozano1 1 Laboratorio de Ingeniería Genética y Biología Celular y Molecular (LIGBCM), Área de Virosis Emergentes y Zoonóticas (AVEZ), Instituto de Microbiología Básica y Aplicada (IMBA), DtoCyT, Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina., Argentina. 2 Laboratorio de Inmunología y Virología (LIV), Instituto de Microbiología Básica y Aplicada (IMBA), DtoCyT, Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina., Argentina. La proteína Z de los arenavirus presenta tres dominios principales: una región amino terminal que contiene la señal para la modificación por miristoilación y anclaje a membrana; un dominio RING central y una región carboxilo terminal en la cual se identificaron dominios tardíos (LD, Late Domains) altamente conservados en proteínas matriz virales. Los LD poseen la capacidad de interaccionar con componentes de la maquinaria celular de direccionamiento proteico vacuolar que median el tránsito endosomal, e iniciar el proceso de brotación viral. Esta capacidad de dirigir el proceso de brotación es autónoma incluso en ausencia de otras proteínas del virión, siendo útil para generar partículas tipo virales (VLPs, Virus-Like Particles). Las VLPs son de utilidad como herramienta biotecnológica debido a su estructura y morfología: están formadas por proteínas estructurales con capacidad de autoensamblarse e imitar la estructura viral, carecen de infectividad al no poseer genoma y son capaces de brotar de manera autónoma. Asimismo, las VLPs derivadas de virus envueltos se presentan como una alternativa segura y eficiente para vehiculizar antígenos de naturaleza proteica. En trabajos previos en nuestro laboratorio se ha demostrado que la proteína Z del virus Junín fusionada a la proteína fluorescente verde (GFP, Green Fluorescent Protein) conserva la capacidad de brotación autónoma en sistemas de expresión eucariota (mamíferos e insectos) y que las VLPs producidas estimulan una respuesta inmune en ratones inoculados. Las construcciones diseñadas en este trabajo incluyen el clonado de las proteínas Z y la hemaglutinina del virus del sarampión (HA) en vectores individuales, una fusión entre ambas en un único plásmido y el clonado 95 Libro de resúmenes del ectodominio de la HA (ETD-HA) en un vector presentador de antígenos en proceso de diseño en nuestro laboratorio. Luego de los ensayos de transfección y co-transfección transitoria, se sometieron las monocapas de cultivo a ensayos de inmunodetección con anticuerpos específicos a fin de evaluar la expresión de las diferentes variantes. Además, para comprobar la capacidad de este sistema de generar VLPs quiméricas, se ultracentrifugó el sobrenadante de cultivo y se sometieron las diferentes muestras a ensayos de inmunodetección con anticuerpos específicos idénticos a los utilizados en las monocapas respectivas. Estos ensayos dieron como resultado la detección de diferentes proteínas heterólogas conteniendo Z y HA, tanto en las monocapas de cultivos como en los sobrenadantes. Los resultados preliminares confirmarían que la capacidad de la proteína Z de dirigir el proceso de brotación se conserva aún en fusiones proteicas que incluyen no solo eGFP sino también proteínas virales con propiedades antigénicas y, sumados a ensayos de inmunización exitosos en animales de laboratorio, permitirían iniciar el desarrollo de una herramienta biotecnológica para ensayar la vehiculización de antígenos de importancia epidemiológica. 0324 ANÁLISIS DE LA SEÑAL DE MIRISTOILACIÓN DE LA PROTEÍNA Z DEL VIRUS JUNÍN EN CÉLULAS DE INSECTO. CS Borio2, CS Turco1, MF Bilen1, ME Lozano2 1 Universidad Nacional de Quilmes - LIGBCM-AVI, Argentina. 2 Universidad Nacional de Quilmes - LIGBCM-AVEZ, Argentina. La proteína Z del virus Junín posee en su extremo N-terminal una señal consenso, conservada en los miembros de toda la familia Arenaviridae, para la adición de un ácido mirístico en la glicina de la posición 2 de la proteína. Esta modificación postraduccional localiza a la proteína Z en la membrana plasmática de la célula, donde ejerce su función impulsora de la brotación de la partícula viral. En células de mamífero se ha demostrado que la sola expresión de la proteína Z es capaz de producir partículas tipo virales (VLPs), las cuales poseen potencial biotecnológico como plataforma de presentación de antígenos. En consecuencia, es de interés el estudio de la producción de estas VLPs en sistemas técnicamente más simples y comercialmente más aptos, como es el caso de células de insecto, ampliamente utilizadas en la industria farmacéutica. En función de lo anteriormente expuesto, en este trabajo se estudió la capacidad del sistema de células de insecto, de reconocer la señal de miristoilación presente en la proteína Z del virus Junín, con el fin de generar un sistema de producción de VPLs fusionadas a antígenos específicos. Para esto, se construyeron virus recombinantes de AcMNPV conteniendo el gen que codifica para la proteína Z, la misma fusionada a GFP (ZGFP), y dos mutantes en las cuales la glicina de la posición 2 fue reemplazada por alanina. Para ello se realizaron los clonados correspondientes utilizando el sistema Bac to Bac. Una vez confirmado el genotipo de cada virus, se evaluó la expresión de las proteínas antes mencionadas, infectando células sf9 y hi5 con los viriones brotantes, correspondientes a cada versión viral. Se analizaron las células mediante microscopia de fluorescencia y la expresión de las proteínas mediante inmunodetección. Por otro lado, se evaluó la capacidad de producir VLPs derivadas de la expresión de Z en células de insecto, a partir de las versiones virales construidas. Fue posible detectar la expresión de Z y ZGFP junto con sus versiones mutantes y se detectó una distribución celular diferencial de las proteínas expresadas conteniendo las mutaciones. Para el caso de la infección con los viriones conteniendo la proteína Z wild type, se detectó una distribución localizada principalmente en la membrana plasmática de las células infectadas, mientras que para el caso de la mutante, la fluorescencia se encontró distribuida inespecíficamente en toda la célula. Esta observación indica la importancia de la glicina 2 en el direccionamiento de la proteína Z en la célula, y permite presuponer que las células de insectos también estarían reconociendo esta secuencia como señal para el direccionamiento específico de Z. Por otro lado, se detectaron VLPs a partir de la expresión de Z y ZGFP en el sobrenadante de células infectadas. Estos resultados dan indicio de la enorme potencialidad del sistema basado en la proteína Z - células de insecto como plataforma de producción de VLPs para fines biotecnológicos. 0330 DESARROLLO DE UNA PLATAFORMA BIOTECNOLÓGICA PARA LA PRODUCCIÓN DE INTERFERÓN FELINO EN INSECTOS MB Arregui, AM Targovnik, O Cascone, MV Miranda Nanobiotec (UBA-CONICET), Cátedra de Biotecnología, FFyB, UBA, Argentina. El interferón felino (FeIFN) es una citoquina que se aplica en la industria veterinaria para el tratamiento y prevención de enfermedades virales y neoplasias de origen felino y canino. Estas citoquinas no se comercializan en nuestro país. El FeIFN-α consiste en una proteína de 171 aminoácidos con un sitio potencial de N-glicosilación. Esta proteína fue expresada en diversos sistemas sin embargo, los mayores niveles de expresión de FeIFN-α han sido obtenidos utilizando el sistema baculovirus. Esta proteína es comercializada en el mercado Europeo bajo el nombre de Virbagen Omega. Se ha demostrado la eficacia del tratamiento con FeIFN-α para mejorar la sintomatología y prolongar la supervivencia de los animales infectados con diversos virus felinos resultando más efectivo a largo plazo que el tratamiento con interferón alfa humano. Por otro lado el FeIFN-β es una proteína de 165 aminoácidos con cuatro sitios potenciales de N-glicosilación. El FeIFN-β no ha sido expresado en ningún sistema con anterioridad y todo lo que se conoce es por similitud con interferones de especies asociadas. Es sabido que los INF-α e INF-β presentan diferentes mecanismos de acción y pueden ser utilizados para distintos tratamientos. El objetivo del trabajo fue obtener FeIFN-α y el FeIFN-β a partir de cultivos celulares de Sf9 como plataforma para el posterior escalado en larvas autóctonas. Se analizaron sus perfiles de expresión y sus actividades antivirales. Se construyeron dos baculovirus recombinante donde el gen de FeIFNα y el FeIFN-β, con sus respectivos péptidos de secreción, fueron clonados bajo el promotor de poliedrina. Para la producción del FeIFN en cultivo, se utilizó una línea celular de insectos, Sf9, adaptada al medio SF900 con 1% SFB. Se estudió la cinética de expresión a diferentes multiplicidades de infección (MOI) y se evaluó la actividad antiviral de dichos sobrenadantes por titulación a punto final sobre la línea celular de origen felino CRFK infectadas con el virus VSV. Tras optimizar las condiciones, los máximos niveles de expresión de FeIFN-α se lograron a los 4 días post infección a partir de células Sf9 infectadas a una MOI de 1. Bajo las condiciones seleccionadas se obtuvo 1,28x106 UI/ml. La proteína presento un peso molecular aproximado de 25 kDa con similares características a la comercial. Por otro lado los máximos niveles de expresión de FeIFN-β se obtuvieron a los 3 dpi a partir de células Sf9 infectadas a una MOI de 0,5 Bajo las condiciones seleccionadas se obtuvo 2x105 UI/ml. La proteína presentó un PM aproximado de 23 kDa. Estos resultados demuestran que los péptidos señales perteneciente a cada uno de los FeIFN fueron reconocidos eficientemente por el sistema baculovirus/células de insecto. Los resultados obtenidos alientan el desarrollo de una plataforma biotecnológica para la producción de interferones de uso veterinario basada en larvas de R. nu. 0337 EXPRESIÓN DE UN ANTÍGENO DEL VIRUS DEL DENGUE EN CÉLULAS Y LARVAS DE INSECTOS FUSIONADO A HIDROFOBINA PARA SU PURIFICACIÓN DIRECTA EN SISTEMAS DE DOS FASES ACUOSAS ME Smith, AM Targovnik, MV Miranda, J Rodriguez Talou Instituto Nanobiotec (UBA-CONICET). Cátedra de Biotecnología, FFyB, UBA, Argentina. Introducción El virus del Dengue pertenece al género Flavivirus y su genoma codifica para 3 proteínas estructurales. De ellas, la proteína de la Envoltura es la más abundante e inmunogénica. Su Dominio III (DomIII) contiene epitopes que generan anticuerpos neutralizantes serotipo específicos. Las hidrofobinas (HFB) son proteínas anfifílicas producidas por hongos filamentosos. Han sido descriptas como eficientes tags para la 96 Libro de resúmenes purificación de proteínas recombinantes por sistemas de dos fases acuosas (ATPS) basados en surfactantes no iónicos. Además, permiten la inmovilización de manera orientada de los antígenos fusionados a ellas en soportes sólidos empleados en kits de diagnóstico. El objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión y purificación de DomIII fusionado a HFB en el sistema baculovirus/células de insecto. Esta proteína posee una potencial aplicación biotecnológica orientada hacia el desarrollo de una vacuna y kits diagnósticos. Metodología Se construyó un vector de transferencia clonando la secuencia codificante del DomIII fusionado a HFB en el plásmido pAcGP67-B. Por cotransfección de este vector con el ADN viral BaculoGoldTM Bright (Pharmingen) en la línea celular Sf9 se obtuvieron los baculovirus recombinantes. Se infectaron cultivos de células Sf9 con el baculovirus recombinante y se evaluó la cinética de expresión con 2 multiplicidades de infección (MOI 0.5 y 2). Luego se evaluó la purificación de DomIIIHFB por ATPS ensayando tres concentraciones de Tritón X-114: 2%, 5% y 8%. Por otro lado, se llevó a cabo la expresión de la proteína recombinante en larvas de Rachiplusia nu y se evaluó su purificación por ATPS. En todos los casos la detección y análisis de las proteínas recombinantes se llevó a cabo por SDS-PAGE y Western Blot. Resultados Se logró obtener un baculovirus recombinante para la expresión de DomIII-HFB. Se evaluó la expresión en la línea celular Sf9 y se vio que la proteína era mayormente liberada al medio de cultivo. En este sistema las condiciones óptimas de expresión fueron con MOI 0,5 y cosecha a los 2 días postinfección. Por medio de ATPS se logró purificar parcialmente DomIII-HFB desde el medio de cultivo. Los mejores resultados se obtuvieron utilizando una concentración de Tritón X-114 del 2%. Se evaluó la expresión de DomIII-HFB en larvas de Rachiplusia nu obteniéndose altos niveles de expresión y se logró purificar parcialmente la proteína por ATPS. Conclusiones Los resultados expuestos en el presente trabajo indican que el sistema de expresión baculovirus/células de insecto resulta adecuado para la producción de antígenos del virus del Dengue como proteínas fusionadas a HFB, permitiendo de esta manera su purificación por medio de sistemas de dos fases acuosas de manera fácil y económica. La expresión en larvas demostró ser un sistema adecuado para el escalado de este proceso. 0341 DISEÑO Y EVALUACIÓN PRELIMINAR DE UNA METODOLOGÍA DE MUTAGÉNESIS INSERCIONAL PARA ESTUDIOS DE GENÓMICA FUNCIONAL EN VIRUS CON GENOMAS GRANDES DE ADN DOBLE CADENA MJ Garavaglia, JA Simonin, MN Belaich, PD Ghiringhelli Universidad Nacional de Quilmes, Argentina. Los virus con genomas grandes de ADN doble cadena conforman un grupo que contiene a numerosas familias, entre las cuales pueden mencionarse Herpesviridae, Baculoviridae, Iridoviridae, Adenoviridae y Poxviridae. Una característica común de estos patógenos es su gran contenido génico, el cual a su vez suele ser variable cuando se comparan especies emparentadas. De hecho los baculovirus, parásitos de insectos de amplia distribución mundial y con numerosas aplicaciones biotecnológicas, poseen genomas circulares de entre 80 y 180 kpb mostrando regiones codificantes compartidas y otras tantas únicas de miembros particulares. La situación relativa al alto número de genes y su contenido diferencial entre especies hace que los estudios de genómica funcional sean complejos, y usualmente, involucren mutaciones direccionadas mediante procedimientos de recombinación homóloga con tediosos pasos de selección. Ante este escenario una metodología de mutagénesis insercional al azar podría acelerar los tiempos, además de incrementar los alcances de las investigaciones centradas en la comprensión de la información contenida en este tipo de genomas virales. Para propender a lo anterior, existen secuencias naturales que pueden ser la base de la herramienta. Por ejemplo, los transposones de clase II suelen presentar una genética simple que controla su movilidad. Incluso, pueden ser de-construidos y modificados para utilizarlos en procedimientos de transgénesis. Y en particular, piggybac es un elemento móvil ampliamente utilizado para introducir mutaciones por interrupción. Por ello, se decidió desarrollar una herramienta de mutagénesis insercional basada en el transposón mencionado que transforme a los genomas circulares de ADN viral en megaplásmidos de Escherichia coli, utilizándose un aislamiento propio obtenido de líneas celulares de insecto. A partir del mismo y mediante procedimientos tradicionales de clonado molecular, se recuperaron los brazos conteniendo las terminales invertidas, que luego se utilizaron para construir un casete de inserción (ADN donante) incluyendo un gen indicador (que expresa GFP), una resistencia a antibiótico bacteriano y un origen de replicación plasmídico de bajo número de copias (miniF). En tanto, se generó una construcción genética con sintaxis eucariota para producir la transposasa piggybac in vivo (ADN colaborador); y también, se logró la expresión recombinante de dicha proteína en bacterias para su potencial empleo in vitro. La funcionalidad de cada componente de la herramienta fue evaluada individualmente, así como su utilidad colectiva en forma preliminar (in vivo e in vitro) utilizando genomas de baculovirus como blanco de las inserciones. 0359 GENERACIÓN DE UNA LÍNEA CELULAR TRANSGÉNICA QUE EXPRESA EL GEN ESENCIAL 1629 DEL BACULOVIRUS DE ANTICARSIA GEMMATALIS CON PROYECCIÓN AL DESARROLLO DE UN SISTEMA DE RECOMBINACIÓN CON ALTA EFICIENCIA ML Fabre, S Haase, ML Ferrelli, ML Pidre, V Romanowski Instituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM) UNLP-CONICET, Argentina. Introducción El virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Anticarsia gemmatalis (AgMNPV) ha sido utilizado con éxito en paises con climas cálidos para el control biológico de la oruga de las leguminosas, una plaga que ocasiona pérdidas en el cultivo de soja y otras leguminosas. Sin embargo, su velocidad de acción lenta en climas templados limita su aplicación en otros países como Argentina. Una herramienta que permite el mejoramiento de las propiedades insecticidas de los baculovirus consiste en la ingeniería genética de sus genomas, usualmente basada en la recombinación homóloga entre el virus y un vector de transferencia apropiado. La frecuencia de recombinación es muy baja y por eso la proporción de virus recombinantes suele ser menor al 1%, el aislamiento de virus modificados resulta muy laborioso y demanda mucho tiempo. Por esto, se han desarrollado sistemas de selección que permiten aumentar la proporción de virus recombinantes, algunos de ellos basados en la generación de virus deficientes en genes esenciales, incapaces de subsistir en células infectadas, que recuperan el gen eliminado al recombinar con un vector de transferencia. Para comenzar a abordar la generación de un sistema de recombinación de alta eficiencia para AgMNPV, se desarrolló una línea celular que permitirá el mantenimiento de un virus AgMNPV deficiente en el gen esencial 1629. Métodología Se construyó un vector plasmídico para la generación de la línea celular transgénica que exprese constitutivamente el gen 1629, basado en el vector de selección pIB/V5-His. Se transfectaron células High Five con esta construcción y se aislaron clones de células transgénicas mediante un procedimiento de dilución terminal. La línea celular obtenida fue infectada con un bácmido de AcMNPV (virus de la poliedrosis múltiple de Autographa califormica) deficiente en el gen 1629. Finalmente, se evaluó la producción de virus brotantes del bácmido en estas células infectando una línea celular (XXL-GFP) que posee un gen indicador bajo un promotor viral tardío. Resultados Se desarrolló la línea celular High Five-1629Ag que permite expresa el gen 1629 constitutivamente. Para analizar la complementación funcional de la línea transgénica, se infectaron, en una línea tituladora (XXL-GFP), los sobrenadantes de las células High Five-1629Ag y High Five, previamente transfectadas con el bácmido. Se observó fluorescencia sólo con el sobrenadante de High Five-1629Ag, indicando que el bácmido sólo puede formar viriones brotantes funcionales en estas células. Para la eliminar parte del gen 1629 de AgMNPV se cotransfectó el DNA genómico de este virus con un plásmido de 97 Libro de resúmenes transferencia. La recombinación homóloga entre ambos se verificó por la expresión de un gen indicador del vector (GFP). Conclusiones La línea celular transgénica generada permitió la complementación de un bácmido deficiente en el gen 1629 y podría utilizarse asímismo para el mantenimiento de un AgMNPV con una deleción en este gen. 0413 EVALUACIÓN DE ESQUEMAS DE INMUNIZACIÓN DE RATONES CON EL VIRUS DIMINUTO DEL RATÓN (MVM) AS Maiza, GS Gamboa, MA Mariani, MC Saavedra, AM Ambrosio Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas Dr. Julio I. Maiztegui. Monteagudo 2510. 2700 Pergamino. Buenos Aires, Argentina. 0375 ESTUDIO DE LAS PROTEÍNAS DE LARVAS DE RACHIPLUSIA NU INFECTADAS CON BACULOVIRUS RECOMBINANTE A TRAVÉS DE GELES 2-DE PARA EL DESARROLLO RACIONAL DE PROCESOS DE PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES AM Targovnik1, MB Arregui1, M Fogar2, FJ Wolman1, O Cascone1, MV Miranda1 1 Nanobiotec (UBA-CONICET), Cátedra de Biotecnología, FFyB, UBA, Argentina. 2 3INTA EEA Sáenz Peña, Laboratorio de Entomología, Chaco, Argentina, Argentina. La calidad microbiológica es una condición indispensable en los animales utilizados en investigaciones biomédicas y veterinarias para arribar a resultados finales confiables y reproducibles. Entre los contaminantes virales mas frecuentes en ratones se encuentran los parvovirus murinos. Estos tienen un importante efecto deletéreo en los estudios científicos de investigación debido a la ausencia de manifestaciones clínicas de la enfermedad y a la ausencia de lesiones histopatológicas en ratones natural o experimentalmente infectados. Además, desencadenan efectos inmunomoduladores tanto in vivo como in vitro. El virus Diminuto de Ratón (MVM, Género Parvovirus; Familia Parvoviridae) es un contaminante común de líneas de cultivos celulares, tejidos y otros materiales biológicos de origen murino. Su elevada estabilidad en el medio ambiente potencia su efecto nocivo y justifica aun más su búsqueda mediante métodos apropiados en las colonias de ratones haciendo crítica su identificación para poder minimizar el impacto en las investigaciones científicas. El objetivo del presente trabajo fue evaluar los líquidos inmunes (suero y líquido ascítico) de ratón obtenidos mediante diferentes esquemas de inmunización con el virus MVM (ATCC VR-1346), para ser utilizados como controles positivos en pruebas serológicas destinadas a la detección de este agente. Para la obtención de suero inmune fueron inoculados por vía intranasal (IN) grupos de cinco ratones adultos (Mus musculus, cepa CD1, exocriados, SPF) variando las DICT 50 / ml del virus MVM y sus respectivos controles normales. El día 21 post inoculación, los animales fueron anestesiados y sangrados por punción intracardiaca. Los sueros individuales fueron separados, fraccionados y conservados a – 40ºC. Igual esquema se siguió para la obtención de líquido ascítico inmune (LAI). En el día 21 se les inyectó por vía intraperitoneal la ascitis resultante de la inoculación de ratones SPF con sarcoma 180 (ATCC TIB 66). Se cosecharon los LAI el día 32. La respuesta de anticuerpos para cada esquema de inmunización fue evaluada por pruebas de Inmunofluorescencia Indirecta (ifi) y ELISA. En sueros se detectaron por ifi anticuerpos específicos con títulos entre 32 y 128 mientras en los LAI entre 32 y 64. Por la técnica de ELISA los títulos en suero fueron entre 1600 y 6400 mientras que los resultados en LAI entre 200 y 800. Los títulos obtenidos son los que resultaron de una única inoculación del agente viral. Se concluye que los diferentes esquemas evaluados de inmunización de ratones con virus MVM permitieron el desarrollo de anticuerpos específicos en suero y en LAI, siendo óptimo el resultante de una sola inoculación IN con una DICT 50 / ml equivalente a 104 de la cepa viral original. Los líquidos inmunes (suero y líquido ascítico) de ratón anti MVM desarrollados resultaron eficaces para ser utilizados como controles positivos en pruebas serológicas para la detección de MVM. La expresión de proteínas recombinantes en el sistema baculovirus/células de insecto es cada vez más utilizado. Para aquellos productos que no tienen alto valor de mercado, cabe la posibilidad de utilizar directamente los insectos vivos como “biofábricas”. Las especies susceptibles a baculovirus pertenecen a la familia Noctuidae que corresponden a mariposas de hábitos nocturnos como ser R. nu. El sistema está limitado para su utilización en la producción de proteínas de interés comercial dado el escaso conocimiento sobre el downstream processing de proteínas recombinantes a partir de extractos larvales. Cuando se trata con muestras complejas como en este caso es crítico el diseño de esquemas de purificación que involucren un número reducido de etapas y establecer las condiciones óptimas de cada una de ellas para lograr un alto grado de purificación y rendimiento del producto. Cuando se trata de establecer métodos generales en sistemas no estudiados en profundidad, es necesario describir el proteoma del huésped (proteínas contaminantes del proceso). El objetivo de este trabajo es analizar a través de geles 2-DE, el perfil proteico de extractos larvales no infectados e infectados con baculovirus recombinante, con el fin de identificar los principales contaminantes virales y del huésped. Las larvas de R. nu fueron criadas y alimentadas con dietas artificiales hasta alcanzar el 4º estadio donde fueron infectadas con baculovirus recombínate que expresaba el gen de Interferón Beta felino. Las larvas fueron cosechadas a los 3 días post infección y homogeneizadas. Los homogenatos fueron centrifugados a 14000 rpm durante 10 minutos a 4 °C y filtrados con un papel Whatman grado 1. Las muestras fueron analizadas a través de geles 2-DE seguido, en el caso que correspondiera, de Western Blot con anticuerpos específicos anti extracto total de larva. Los geles fueron analizados a través del software ImageMaster 2D platinum 6.0 (GE Healthcare). A través de geles 2-D se pudo evidenciar una clara diferencia del perfil proteico de la larva infectada respecto de la larva control. Se detectaron alrededor de 50% menos número de spots en la larva infectada demostrando un proceso de silenciamiento y redireccionamiento de la maquinaria de transcripción por parte del virus. Los puntos isoeléctricos de los spots se ubicaron alrededor de todo el gradiente de pH (3-10) presentando una mayor densidad de proteínas a pesos moleculares superiores 20 kDa. Mediante Western Blot con anticuerpos específicos anti larva, se pudo detectar 47 proteínas inmunogénicas en la larva infectada respecto a 69 proteínas inmunogénicas en la larva control, todas proteínas de tendencia básicas y peso molecular superior a 26 kDa. Este conocimiento de las propiedades fisicoquímicas de las proteínas del huésped de expresión posibilitaría el desarrollo futuro de procesos de dowmstream in silico permitiendo predecir desde un principio el grado de complejidad del proceso. Vacunas e inmunidad 0010 LA CITOTOXICIDAD MEDIADA POR ANTICUERPOS EN LA INFECCIÓN POR HIV NO GENERA PROTECCIÓN DURANTE EL PRIMER AÑO DE INFECCIÓN Y SU MAGNITUD DECAE EN PRESENCIA DE IGA GP-120 ESPECIFICA MJ Ruiz1, YA Ghiglione1, J Falivene1, ME Socías2, NL Laufer1 3, CA Trifone1, P Cahn2 3, O Sued2 3, MM Gherardi1, H Salomon1, AM Rodriguez1, G Turk1 1 Instituto Nacional de Investigaciones Biomédicas en retrovirus y SIDA (INBIRS), Facultad de Medicina, UBA-CONICET, Argentina. 2 Fundación Huésped, Argentina. 3 Hospital Juan A. Fernández, Unidad Enfermedades Infecciosas, Argentina. 98 Libro de resúmenes El rol de la citotoxicidad mediada por anticuerpos (ADCC) en la infección natural por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) es controversial, y los factores que determinan una mejor o peor respuesta ADCC son aun desconocidos Objetivo: Evaluar la capacidad de los anticuerpos (abs) específicos antiHIV presentes en el plasma de los pacientes reclutados de mediar ADCC. Determinar el título de abs IgG e IgA anti-gp120 en dichos pacientes con el fin de evaluar su relación con la magnitud de la respuesta ADCC. Metodología: Se utilizó plasma de 20 sujetos HIV+ cursando la infección primaria (PHI) recolectado antes de los primeros seis meses post infección (muestra basal) y al año; de 10 sujetos crónicos “naïve” de tratamiento antirretroviral y de 7 Elite Controllers (EC). A los PHI se los dividió en dos subgrupos dependiendo si su recuento de CD4 caía por debajo de 350 cel/l (PHI < 350) o no (PHI >350 cel/l) durante el primer año post infección. El porcentaje de ADCC se determinó incubando células CEM-NKR recubiertas con la proteína gp120BAL, previamente teñidas con CFSE (indicador de viabilidad) y PKH-26 (colorante de membrana), con distintas diluciones de suero inactivado de los sujetos HIV+ y células efectoras (PBMC de dadores sanos). El análisis se realizó por citometría de flujo. La presencia de abs IgG e IgA específicos anti-gp120 se evaluó por ELISA. En un subgrupo de pacientes, el plasma se depletó de IgA por inmunoprecipitación. Los datos se analizaron por métodos estadísticos no paramétricos. Resultados: La actividad ADCC (titulo > 1000) fue documentada en el 80% de las muestras basales y en el 100% de las muestras obtenidas a los 12 meses post infección. De manera similar, en todos los pacientes crónicos se documentó un título de ADCC > 1000 y ≥10,000 en EC. Se observó un mayor % de ADCC (%ADCC) al año respecto de la muestra basal (mediana 24% versus 12.85%, p=0.0003), pero no se observaron diferencias entre crónicos versus EC. Al comparar la respuesta ADCC entre PHI<350 y PHI>350 no se observaron diferencias estadísticamente significativas. Tampoco se observaron correlaciones entre el %ADCC basal y la carga viral plasmática ni con el recuento de células CD4 tanto basal como al año. La relación IgG/IgA se correlaciono de manera directa con el %ADCC al año en pacientes PHI (r= 0.6997 p=0.0053). Más aún, el %ADCC fue significativamente mayor en plasma depletado en IgA, comparado con el sin depletar en los individuos evaluados. Conclusiones: Aunque los abs capaces de mediar ADCC surgen tempranamente durante la infección por HIV, la magnitud de la respuesta no se asoció a la tasa de progresión a la enfermedad. Más aun, la correlación directa entre IgG/IgA y %ADCC, junto con el mayor %ADCC observado en el plasma depletado respecto del sin depletar, refuerzan la hipótesis de que los abs IgA interferirían con la magnitud ejercida por IgG. Estos resultados podrían contribuir al desarrollo racional de vacunas específicas. 0015 OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE VIRUS VACCINIA ANKARA MODIFICADO QUE EXPRESAN LA PROTEÍNA F DEL VIRUS RESPIRATORIO SINCICIAL BOVINO. A Ferella1, MJ Dus Santos1, M Mozgovoj1, G Calamante2, MP Del Médico Zajac2 1 Instituto de Virología, CICVyA, INTA Castelar, Argentina. 2 Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA Castelar, Argentina. El virus respiratorio sincicial bovino (bRSV) es una de las principales causas de neumonías en terneros de temprana edad a nivel mundial. Si bien hay disponibles en el mercado numerosas vacunas convencionales, existe una demanda creciente en cuanto al desarrollo de vacunas de nueva generación, más eficientes, capaces de inducir una respuesta inmune duradera en el tiempo. Una estrategia novedosa en el desarrollo de vacunas que permiten mejorar la inmunidad es el empleo de vectores virales que expresen proteínas inmunorelevantes, como el virus vaccinia Ankara modificado (MVA), ampliamente utilizado para el desarrollo de vacunas seguras y efectivas para humanos y en medicina veterinaria. Además, con el propósito de obtener vectores optimizados basados en MVA recientemente hemos obtenido y caracterizado un vector que carece del gen codificante de la proteína de unión a IL-18 (MVAd008) y observamos un aumento en la respuesta celular T CD4+ y CD8+ respecto del vector viral convencional en ratones. Estos resultados sugieren que el vector optimizado MVAd008 constituye una interesante herramienta a utilizar al momento de diseñar vacunas de nueva generación. El objetivo de nuestro trabajo consistió en la obtención de un MVAd008 recombinante que exprese la proteína F de bRSV. Se seleccionó la proteína F de bRSV como antígeno de interés por ser la principal inductora de inmunidad protectora. Por otra parte, dado el gran tamaño del genoma de los poxvirus se descarta la manipulación directa del ADN y los virus recombinantes se obtienen por recombinación homóloga entre el genoma del virus y un vector de transferencia (VT) que porta el gen de interés flanqueado por regiones genómicas que serán el blanco de inserción. Para la obtención del MVA recombinante se subclonó direccionalmente la secuencia codificante de la proteína F en el VT-Mtk-GUS río abajo del promotor poxviral. Este vector contiene además un cassette para la expresión de la enzima beta-glucuronidasa (GUS) y secuencias flanqueantes correspondientes al gen MVA086R (sitio blanco de recombinación). La identidad del gen de interés se confirmó por secuenciación. Se transfectaron cultivos de fibroblastos de embrión de pollo previamente infectados con MVAd008 con el VT-Mtk-F y los virus recombinantes se aislaron por su capacidad de formar placas de lisis azules en presencia del sustrato de la enzima GUS (X-Gluc). La presencia y expresión de la secuencia codificante de la proteína F se confirmó mediante amplificación por PCR y RT-PCR, respectivamente. En este trabajo se obtuvieron virus MVA recombinantes que expresan la proteína F del virus respiratorio sincicial bovino. Su capacidad inmunogénica y protectora se evaluará en el modelo murino. 0037 OBTENCIÓN DE VECTORES NO REPLICATIVOS PARA LA EXPRESIÓN IN VIVO DE LA GLICOPORTEÍNA DEL VIRUS RÁBICO. D Garanzini1, MP Del Médico Zajac1 2, O Pérez3, G Calamante2 1 CONICET, Argentina. 2 Inst. de Biotecnología CICVyA INTA, Argentina. 3 INPB-ANLIS, Argentina. La rabia es una enfermedad zoonótica de evolución aguda, habitualmente mortal. Es causada por el virus de la rabia (RV) el cual se transmite entre algunas especies de sangre caliente y el hombre. La vacunación periódica y masiva es la forma de prevención más eficaz. Las vacunas que se utilizan en nuestro país están basadas en virus rábico inactivado (producidas por amplificación viral en sustratos celulares), que si bien son efectivas, presentan ciertas desventajas por la composición indefinida del antígeno, manipulación de grandes cantidades del patógeno en las plantas de producción, necesidad de estricta cadena de frío y la dificultad para diferenciar animales infectados de vacunados. Estos inconvenientes se pueden superar desarrollando vacunas biotecnológicas basadas en microorganismos vivos o vacunas génicas, diseñadas racionalmente para que sean seguras y efectivas para la prevención de enfermedades infecciosas. Se ha reportado la utilización de vectores virales (replicativos o no) para la expresión de la glicoproteína (RG) del virus rábico, principal antígeno responsable de inducir inmunidad protectora en el hospedador. En particular, los vectores basados en poxvirus y adenovirus ofrecen numerosas ventajas para el desarrollo de vacunas: estabilidad (física y genética), administración por diferentes vías, inducción de respuestas inmunes humorales y celulares protectoras e inmunidad duradera. Además, se utilizan combinados en esquemas de inmunización heterólogos. El objetivo de este trabajo es obtener y caracterizar molecularmente vectores que porten y expresen la secuencia codificante de la glicoproteína de RV basados en virus vaccinia Ankara modificado (MVA), adenovirus (AdHu5) y vacuna génica (plásmido pCI-Neo). Para obtener el adenovirus que exprese la glicoproteína de RV se utilizó la tecnología de clonado Gateway® (Life-Technologies). Se amplificó por PCR el gen RG, se clonó en el vector pCR™8/GW/TOPO® (vector de entrada) y se introdujo en el vector de destino (pAd/CMV/V5 DEST™) por recombinación sitio específica. El vector pAd-RG se transfectó en células 293A y se identificó el virus recombinante por la presencia de efecto citopático. Para obtener el virus MVA-RG se clonó el gen RG en el vector de transferencia (VT) VT-Mtk-GUS (obtenido previamente en nuestro laboratorio) y se transfectaron fibroblastos de embrión de pollo previamente infectados con MVA. Los virus recombinantes se 99 Libro de resúmenes aislaron por su capacidad de formar placas de lisis azules en presencia del sustrato de la enzima GUS (X-Gluc). Además, el gen RG se clonó direccionalmente en el vector pCI-Neo río abajo del promotor de CMV. La presencia y expresión del gen de interés se confirmó en células infectadas o transfectadas con cada uno de los vectores mediante PCR y Western blot, respectivamente. En este trabajo se obtuvieron los vectores recombinantes MVA-RG, AdRG y pCI-RG. La inmunogenicidad y eficacia de estos vectores se evaluará solos o combinados en el modelo murino. 0066 VIRUS-LIKE PARTICLES DEL VIRUS DE LA RABIA INDUCEN LA PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES Y GENERAN PROTECCIÓN EN ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN D Fontana1, M Echeverrigaray2, R Kratje2, C Prieto1 1 Laboratorio de Desarrollo Biotecnológico, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL, Argentina. 2 Laboratorio de Cultivos Celulares, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL, Argentina. INTRODUCCIÓN La rabia es una de las enfermedades infecciosas más letales del mundo, con una mortalidad cercana al 100%. Si bien actualmente hay disponibles vacunas para rabia, existe la necesidad de desarrollar vacunas de nueva generación, eficaces y económicas para dicha enfermedad. Durante las últimas décadas, las partículas pseudovirales (VLPs, Virus-Like Particles), por sus características inmunogénicas y bioseguridad, han cobrado gran relevancia en el desarrollo de vacunas. En trabajos previos, nuestro grupo demostró el desarrollo de VLPs para rabia (RV-VLPs) y logró su caracterización fisicoquímica, observándose partículas circulares, envueltas, con un diámetro hidrodinámico promedio de 64 nm y con glicoproteína G (principal antígeno del virus) asociada a su membrana. El objetivo del presente trabajo fue estudiar las propiedades inmunogénicas de dichas RV-VLPs, específicamente analizando su capacidad de inducir anticuerpos neutralizantes y de generar protección en animales de experimentación. METODOLOGÍA Y RESULTADOS RV-VLPs producidas en células HEK293 y purificadas por ultracentrifugación fueron utilizadas en un plan de inmunización en el que ratones Balb/c fueron inyectados por vía intramuscular, con dos dosis separadas por 7 días y utilizando vacunas antirrábicas comerciales de uso humano y veterinario como controles. Se evaluó el título de anticuerpos específicos y los resultados obtenidos demostraron que las VLPs fueron capaces de generar una respuesta inmune humoral comparable a la obtenida para las vacunas comerciales. Luego, se llevó a cabo la detección de anticuerpos neutralizantes mediante un ensayo de inhibición de la transducción por parte de lentivirus recombinantes pseudotipados con la glicoproteína del virus de la rabia. En este ensayo, los anticuerpos con capacidad neutralizante presentes en los sueros inhiben la transducción de vectores lentivirales codificantes de GFP (Green fluorescent protein). Los resultados demostraron que las VLPs son capaces de inducir la producción de anticuerpos neutralizantes y que, además, lo hacen en una forma similar a las vacunas comerciales, en estas condiciones de experimentación. Finalmente, y para confirmar que las RV-VLPs son capaces de generar una respuesta inmune protectiva, se llevó a cabo el ensayo de potencia de referencia para la vacuna antirrábica (NIH potency test). En este ensayo, grupos de ratones son inmunizados con diluciones de la vacuna a evaluar y de una vacuna de referencia, y luego son enfrentados con el virus de la rabia activo. Se obtuvo un valor de 1,5 UI/ml de potencia de vacuna antirrábica, demostrando de esta forma que las RV-VLPs producidas no sólo son capaces de conferir protección a los animales vacunados, sino que también alcanzan los requerimientos mínimos de potencia para la vacuna veterinaria. Estos resultados confirman que estas RV-VLPs constituyen un candidato vacunal apto y más ventajoso para la rabia. 0069 OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE VIRUS FOWLPOX RECOMBINANTES QUE EXPRESAN LA PROTEÍNA VP2 DEL VIRUS DE LA BURSITIS INFECCIOSA CR Federico1, FA Zanetti1, G Calamante2 1 CONICET, Argentina. 2 Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTACastelar, Argentina. El virus fowlpox (FWPV) es el avipoxvirus mejor estudiado y caracterizado, posee un genoma de ADN doble cadena y se lo utiliza como vector de expresión en el desarrollo de vacunas de nueva generación contra enfermedades aviares. La enfermedad de Gumboro es causada por el virus de la bursitis infecciosa (IBDV) y produce importantes pérdidas económicas en la industria avícola. Dicho virus produce una depleción de los linfocitos B que maduran en la bolsa de Fabricio causando una enfermedad aguda y muy contagiosa que provoca inmunosupresión y alta mortalidad en pollos jóvenes. La proteína VP2 de IBDV ha sido ampliamente estudiada por ser la más inmunogénica e inducir respuestas inmunes protectoras. En base a esto, el objetivo general del trabajo consistió en obtener y caracterizar molecularmente virus fowlpox recombinantes que expresen la proteína VP2 de IBDV. Debido a que el tamaño del genoma de los poxvirus impide la manipulación directa del ADN, se utilizan vectores de transferencia (VT) con secuencias genéticas que permiten la recombinación homóloga con el virus salvaje. Mediante amplificación por PCR se obtuvieron dos regiones homólogas, que serán el sitio blanco de recombinación y corresponden a las posiciones 1321-1619 y 1676-1970 del gen FPV030, el cual no es esencial para la replicación viral in vitro. Los amplicones obtenidos se clonaron direccionalmente en pBlueScript. Luego, entre ambas regiones, se introdujeron secuencialmente construcciones genéticas que comprenden: a) el promotor temprano pE/L y b) un cassette para la expresión del gen marcador uidA (codifica para la enzima beta-glucuronidasa bacteriana, GUS). El plásmido así obtenido constituye el VT universal en el cual se clonó la región codificante de la proteína VP2 de IBDV río abajo del promotor pE/L. Este VT se transfectó en cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo previamente infectados con una cepa vacunal de FWPV y se incubó hasta la aparición de efecto citopático. Posteriormente, el aislamiento de los virus recombinantes se realizó por clonado de las partículas infectivas bajo agar por su capacidad de formar placas de lisis azules en presencia de X-Gluc, sustrato de la enzima GUS. De esta forma, se obtuvo un stock viral puro y se confirmó la presencia de la región codificante del gen vp2 mediante PCR. Para corroborar la expresión del gen se realizó una RT-PCR detectándose el ARN mensajero de VP2 a las 24hs postinfección. Adicionalmente, se evidenció la expresión de la proteína VP2 madura a las 24hs/48hs post-infección mediante un western blot, utilizando un anticuerpo anti-VP2 producido en conejo. De esta manera, en el presente trabajo se logró obtener FWPV recombinantes que expresan la proteína VP2 de IBDV. Las perspectivas a futuro incluyen evaluar su inmunogenicidad y eficacia en pollos libres de patógenos específicos, para su posible uso como vacuna de nueva generación contra la enfermedad de la bursitis infecciosa. 0071 EL VECTOR VIRAL MVA-GDS ADMINISTRADO POR VÍA INTRANASAL INDUCE UNA RESPUESTA INMUNE LOCAL EN RATONES Y CONFIERE PROTECCIÓN FRENTE AL DESAFÍO CON BOHV-1 EN CONEJOS MP Del Medico Zajac1 2, FA Zanetti2, MS Esusy1, CR Federico1 2, AR Valera4, O Zabal3, G Calamante1 1 Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina. 3 Instituto de Virología, CICVyA, INTA, Argentina. 4 Cátedra de Virología, Fac. C. Veterinarias, UNLP, Argentina. El herpesvirus bovino 1 (BoHV-1) es un patógeno que causa infecciones respiratorias y genitales y es el principal agente etiológico del complejo respiratorio bovino (CRB). Las pérdidas económicas que ocasiona son debidas al tratamiento del CRB, a la pérdida de peso, a la baja performance reproductiva y a abortos. La infección con BoHV-1 está distribuida mundialmente y en Argentina es endémica. Si bien existen disponibles vacunas tradicionales atenuadas e inactivadas, presentan limitaciones respecto de su seguridad y eficacia. El virus vaccinia Ankara 100 Libro de resúmenes modificado (MVA) es ampliamente utilizado como vehículo para vacunas humanas y veterinarias dado su perfil de alta seguridad e inmunogenicidad. En este contexto, cobra gran relevancia el desarrollo de vacunas seguras y eficaces contra BoHV-1, que además permitan diferenciar animales vacunados de infectados. Previamente, en nuestro laboratorio, se obtuvo el virus MVA-gDs que codifica para la versión secretada de la glicoproteína D de BoHV-1. La administración de MVAgDs por vía intranasal en combinación con la toxina colérica, indujo anticuerpos anti-gD en mucosas y en suero de ratones. Además, su administración por vía intramuscular confirió buenos niveles de protección frente al desafío con BoHV-1 en conejos. El objetivo de este trabajo fue estudiar la inmunogenicidad y eficacia del vector MVA-gDs administrado por vía intranasal sin el agregado de adyuvante de mucosas en dos modelos animales. Para ello se inmunizaron ratones BALB/c por vía intranasal con los virus MVA-gDs o MVA no recombinante. Se aplicaron dos dosis separadas 21 días y a los 14 días post revacunación, se sacrificaron los ratones, se obtuvieron lavados nasales y broncopulmonares y muestras de suero. Por otro lado, se inocularon conejos por vía intranasal con MVA, MVAgDs o buffer TMN. Se aplicaron dos dosis separadas por dos semanas y a los 14 días, los animales fueron desafiados por vía intranasal con BoHV-1. Se tomaron hisopados nasales luego del desafío para medir excreción viral. La presencia de anticuerpos anti-gD analizó por ELISA. Se observó que los ratones inmunizados con dos dosis de MVA-gDs presentan niveles de IgA anti-gD en lavados nasales y broncopulmonares significativamente mayores que el grupo inmunizado con MVA (p<0.016 y p<0.051 respectivamente). Además, se detectó una fuerte respuesta sistémica en el grupo MVA-gDs. Por otro lado, luego del desafío con BoHV-1, los conejos inmunizados con MVA o TMN excretaron virus por 6/7 días con un pico máximo de excreción de 2.5 y 2.3 logDICT50/ml respectivamente. Por su parte, los conejos inmunizados con MVA-gDs presentaron un período de excreción viral menor (4 días) y redujeron el título del pico máximo de excreción (1.4 logDICT50/ml). La administración del vector MVA-gDs por vía intranasal sin el agregado de adyuvante de mucosas es capaz de inducir respuesta humoral de mucosas y sistémica en ratones y de conferir protección parcial frente al desafío con BoHV-1 en conejos. 0103 DISEÑO DE UNA VERSIÓN RECOMBINANTE DE LA GLICOPROTEÍNA DE ENVOLTURA E2 UNIDA A BIOTINA COMO VACUNA MARCADORA CONTRA EL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA F Merwaiss1, M Trotta2, D Alvarez1, A Capozzo3 1 Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, UNSAM-CONICET, Argentina. 2 INTA, Instituto de Virología, Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronómicas, Argentina. 3 Consejo Nacional de Investigaciones Científico y Técnicas (CONICET)., Argentina. El virus de la diarrea viral bovina (BVDV) es un patógeno del ganado vacuno que pertenece al género pestivirus de la familia Flaviviridae de virus de RNA de simple cadena. La infección por BVDV es altamente prevalente en la Argentina provocando pérdidas económicas para la industria lechera y ganadera. Actualmente se administran en campo vacunas a virus inactivado con resultados dispares en el control de la infección por BVDV. La glicoproteína de envoltura E2 de BVDV es inmunodominante en el animal infectado y produce una respuesta inmune con anticuerpos neutralizantes contra BVDV. Por este motivo E2 es el antígeno ideal para el desarrollo de vacunas a subunidad. Con el objetivo de generar una nueva versión recombinante de E2 que sirva como vacuna marcadora permitiendo diferenciar animales infectados de vacunados, se desarrolló un sistema de expresión eucariota para producir una versión soluble de E2 acoplada a biotina (E2-biotina). La unión sitio-específica de biotina se acopló a la síntesis de E2 a través de la co-expresión en células eucariotas de la proteína E2 fusionada en su extremo N-terminal a un péptido aceptor de biotina (BAP) de 15 aminoácidos y de la proteína ligasa de biotina BirA de Escherichia. coli, que reconoce específicamente a BAP para unir covalentemente una molécula de biotina a un residuo lisina del péptido. E2-biotina se purificó del sobrenadante de células en cultivo mediante cromatografía de afinidad. Utilizando ensayos de inhibición del efecto citopático en células en cultivo, demostramos que E2-biotina inhibe eficientemente la infección por BVDV sugiriendo que la proteína recombinante es funcional. Con el fin de evaluar la inmunogenicidad de E2-biotina se realizó una prueba de vacunación en bovinos. Los animales fueron inmunizados en dos dosis con E2-biotina o con la proteína recombinante sin biotina. Se presentarán los resultados de ensayos de seroneutralización y el diseño de una prueba adecuada para diferenciar animales vacunados de animales infectados basada en la detección de BAP-biotina. 0106 EVALUACION DE UNA VACUNA ALTERNATIVA CONTRA LA GRIPE. “DISPLAY” EN LA SUPERFICIE DE BACULOVIRUS DE LA PORCION EXTRA-CITOPLASMATICA DE LA PROTEINA MATRIX 2 (M2E) PROTEGE CONTRA EL DESAFIO CON INFLUENZA. LA Boado1, P Alvarez1, O Taboga2, N Mattion1 1 Centro de Virología Animal, ICT-Milstein, CONICET, Argentina. 2 Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA, Castelar, Argentina. Introducción: La gripe es una de las enfermedades virales respiratorias agudas con mayor impacto sobre la población humana y la vacunación es el método más efectivo para prevenirla. Sin embargo, la falta de cobertura heterosubtípica de las vacunas en uso es un serio problema potencial para la sanidad humana. El surgimiento de una cepa de alta virulencia podría convertirse en un problema muy grave. Por esta razón, es de interés de nuestro laboratorio, la generación de una vacuna del tipo “universal” contra la gripe. Es decir, una vacuna que genere una respuesta inmune “cross-protectora” contra distintas cepas del virus. Hace años se identificaron a la nucleoproteína (NP) y a la proteína Matrix 2 (M2) como blancos principales de la inmunidad cruzada. Para el presente trabajo, se eligió como antígeno el péptido extra-citoplasmático de la proteína Matrix 2 (M2e), demostrado ya, que genera una respuesta inmune cross-protectora. Para vehiculizar este antígeno se utilizó el sistema baculovirus (Bv) exponiendo en las membranas de las partículas virales el péptido de interés. Este sistema de “display” en superficie permitiría presentar este antígeno al sistema inmune de una manera similar a su presentación en una infección natural. Objetivo: Evaluar la capacidad protectora del “display” en la superficie de Bv de una copia de M2e como fusión a la proteína gp64 (principal glicoproteína de membrana de Bv). Metodología: Para generar el sistema de “display”, se clonó la secuencia codificante de M2e entre el péptido señal y la secuencia madura de la gp64 en el vector de transferencia, obteniendo así el vector pVLSUP1-M2e. Se obtuvieron Bvs recombinantes (rBv) por transfección de células de insecto Sf9 con el vector pVLSUP1-M2e y el reactivo BaculoGold™. También se generaron partículas de Bv wild type (Bv-wt) para ser utilizados como control. Se inocularon grupos de 3 a 5 ratones Balb/c con tres dosis cada 21 días con rBv formulados con y sin adyuvantes (se utilizaron hidróxido de aluminio o adyuvante de Freund completo). A los 21 días posteriores a la tercera dosis, los ratones se desafiaron con 5 DL50 de virus de influenza adaptado a ratón. Se tomaron registros diarios de peso para cada grupo. Resultados: El mayor índice de protección al desafío se obtuvo para el grupo de ratones vacunados con partículas de Bv que expresan en la membrana el péptido M2e sin adyuvante (protección del 60%). Cuando se formularon las partículas virales recombinantes, tanto con hidróxido de aluminio como con adyuvante de Freund, la protección fue de solamente un 20% de los animales desafiados. La inoculación con Bv-wt no presentó protección para ningún grupo. Conclusiones: El ensayo de desafío en animales inmunizados con las construcciones generadas demostró que es posible lograr protección contra influenza utilizando este sistema convirtiéndolo, de esta manera, en una alternativa interesante para el desarrollo de vacunas universales contra influenza. 0123 ESTUDIO DE LA BIODISTRIBUCION ESPACIO-TEMPORAL DEL VIRUS VACCINIA ANKARA MODIFICADO EN POLLOS R Cardona1 2, D Garanzini2, E Gómez1 2, G Calamante1 1 Inst. de Biotecnologia-INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina. En la búsqueda de vacunas alternativas para el sector avícola los virus vaccinia Ankara modificado (MVA) serían excelentes candidatos porque 101 Libro de resúmenes han sido evaluados exitosamente como vacunas para la prevención de enfermedades de interés en salud humana (malaria, SIDA, tuberculosis) y sanidad animal (rabia, lengua azul y tuberculosis bovina). Los MVA recombinantes son incapaces de replicar en la mayoría de las células de mamífero y en el laboratorio se amplifican en cultivos primarios de embrión de pollo. Si bien existen reportes en los que se analizó la expresión in vivo de luciferasa a partir de vectores basados en cepas atenuadas MVA y NYVAC del virus vaccinia en ratones; donde se observó la expresión del transgen hasta las 24 o 72 horas post inmunización (hpi), respectivamente; no existen datos sobre su capacidad replicativa en aves. Previamente en nuestro laboratorio evaluamos la presencia del genoma de MVA en pollos a tiempos cortos y pudimos detectarlo en el sitio de inmunización en una sola ave a las 24 hpi. El objetivo de este trabajo fue evaluar la distribución in vivo de la cepa atenuada MVA a las 16, 24 y 72 hpi en pollos. Para ello, se inocularon aves de 11 días de edad (5 aves por grupo) con virus MVA (1,4 x 107 UFP conteniendo 0,25% v/v de tinta china) por vía intramuscular en la pata y se sacrificaron a las 16; 24 y 72 hpi. Además se incluyó un grupo de 5 aves inmunizadas con PBS las cuales fueron sacrificadas a las 24 hpi (grupo control negativo). A los diferentes tiempos se tomaron muestras de músculo inyectado (identificado por la presencia de tinta china), hígado, bazo y bolsa de Fabricio. Los tejidos se procesaron en nitrógeno líquido y el ADN fue purificado utilizando el kit QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) siguiendo las indicaciones del fabricante. Se realizaron dos reacciones de amplificación por PCR para detectar la presencia del genoma viral o celular utilizando oligonucleótidos específicos para el gen MVA157 o el gen aviar codificante de la enzima gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (gapdh), respectivamente. Primeramente, comprobamos la integridad del ADN purificado mediante visualización en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio. Luego, se realizaron las amplificaciones por PCR. En todas las muestras fue posible amplificar el gen aviar gapdh indicando la ausencia de inhibidores para la reacción de PCR. El genoma viral (amplicon de 318 pb correspondiente al gen MVA157) fue detectado solo en el sitio de inoculación a las 16 hpi en 3 de las 5 aves inmunizadas. En cambio, no fue posible detectar el genoma de MVA en otros tejidos ni a las 24 o 72 hpi. Los resultados obtenidos sugieren que MVA no replicaría en el sitio de inoculación ni se diseminaría a los otros órganos analizados. Este trabajo aporta evidencias sobre la seguridad del uso de vectores basados en MVA para el desarrollo de vacunas aviares. 0124 OBTENCION Y CARACTERIZACION DE ADENOVIRUS HUMANDO TIPO 5 RECOMBINANTES QUE EXPRESA LA PROTEINA VP2 DE LA BURSITIS INFECCIOSA. R Cardona1 2, G Calamante1 1 Inst. de Biotecnologia-INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina. En nuestro laboratorio trabajamos en la búsqueda de vacunas basadas en vectores virales no replicativos que sean seguras y efectivas para la prevención de la enfermedad de Gumboro, causada por el virus de la bursitis infecciosa (IBDV). La proteína estructural VP2 contiene los principales epitopes conformacionales inductores de anticuerpos neutralizantes en el hospedador y es el antígeno de elección para el desarrollo de vacunas biotecnológicas. Para generar respuestas inmunes potentes y de gran avidez se utilizan estrategias de inmunización prime-boost que se basan en la inoculación secuencial de inmunógenos basados en diferentes vectores (inmunización heteróloga). En particular, los poxvirus se utilizaron exitosamente combinados con otros inmunógenos basados en adenovirus. Previamente, demostramos que la inmunización del virus canarypox recombinante que expresa la proteína VP2 (CNPV-VP2) induce una respuesta inmune específica con presencia de anticuerpos seroneutralizantes de IBDV luego de 2 o 3 inoculaciones. El objetivo de este trabajo fue obtener y caracterizar adenovirus recombinantes, no replicativos, que expresen la proteína VP2 de IBDV para utilizarlo como inmunógenos en esquemas de inmunización prime-boost combinados con CNPV-VP2. En este trabajo se utilizó el plásmido pAd/CMV/V5-DEST (Life Technologies) que es un vector destino adaptado para usar la Tecnología Gateway® donde la expresión del gen de interés está regulada por el promotor del citomegalovirus. La secuencia codificante de la proteína VP2 se amplificó por PCR utilizando oligonucleótidos específicos, se clonó en el vector pCR8/GW/TOPO/TA (vector de entrada). La orientación e identidad del inserto se confirmó por secuenciación. Luego, el gen de interés se introdujo en el vector destino mediante recombinación sitio específico. El vector final pAd-VP2, se linealizó por tratamiento con la enzima de restricción Pac I y se utilizaron diferentes cantidades (2; 5; 10 o 20 ug) para transfectar cultivos de células 293A con el lípido catiónico Lipofectamine reagent. Las células 293A aportan en trans las proteínas E1a y E1b requeridas para generar los adenovirus recombinantes. A los 10 días se observó el efecto citopático (ECP) característico de adenovirus. Se amplificaron los stocks virales que presentaban mayor ECP, pero no fue posible detectar el gen de interés mediante PCR. Luego se determinó, se trataba de una población de adenovirus salvaje (RCA) posiblemente obtenido por recombinación con los genes E1 presentes en las células 293A. Se realizaron nuevas transfecciones utilizando Lipofectamine 2000 y menor cantidad de vector, se observó CPE a los 7 días, se amplificó el stock viral, se confirmó la presencia y expresión del gen codificante de la proteína VP2. El virus recombinante obtenido, será utilizado en experimentos de prime-boost para la evaluación de nuevos candidatos vacunales contra la enfermedad de Gumboro. 0137 EL SEMEN POTENCIA LA MEMORIA INMUNOLÓGICA EN LA RESPUESTA CONTRA HSV-2 A Varese, F Remes Lenicov, G Ernst, A Merlotti, G Duette, P Pereyra Gerber, J Rubione, E Dantas, F Erra Díaz, JR Geffner, A Ceballos Instituto Nacional de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA (INBIRS), Facultad de Medicina, UBA-CONICET, Argentina. El semen es el principal vector de una amplia gama de enfermedades de transmisión sexual. Además, es capaz de inducir acciones inmunosupresoras que favorecen la tolerancia alo-reactiva a antígenos paternos, evitando el rechazo fetal luego de la implantación. Nuestra hipótesis es que el semen, más allá de ser un vehículo de agentes infecciosos, tiene la capacidad de modular la respuesta inmune contra patógenos de transmisión sexual. Con el objetivo de evaluar la modulación de la respuesta inmune femenina frente a un agente infeccioso, ensayamos un modelo murino de vacunación intravaginal de HSV-2. Hembras Balb/c fueron vacunadas con HSV-2 inactivado (1x104 UFP) por vía intravaginal en presencia o ausencia del fluido que contienen las vesículas seminales (VS), extraído de machos singeneicos. Un mes después fueron desafiadas por la misma vía con una dosis letal de HSV2 (3x106 UFP). La producción viral se evaluó en la mucosa vaginal por inmunohistoquímica. Tanto en lavados vaginales, como en células recuperadas de ganglios ilíacos y mucosa genital se evaluó la producción de citoquinas por ELISA, y el número de células productoras de IFN-γ por ELISpot. La expresión de IFN-α, IFN-β, TGF-β, IL-10, FOXP3, CCL2, CCL5, CXCL9 y CXCL10 se midió por RT-qPCR. Se evaluó la expresión de CD3, CD8, CD4, CD11c, y DX5 (NK), y la medida de proliferación celular (pérdida de CFSE) por citometría de flujo. Los títulos de IgG e IgA en fluidos vaginales e IgG en suero se cuantificaron por ELISA. Los ratones vacunados en presencia de VS mostraron una supervivencia del 90% vs 10% en el grupo control (n=20 p<0,001), y un menor progreso de la enfermedad (n=20 p<0,001). En el sitio de infección se observó una mayor proporción de células T CD8+, y un aumento de IFNγ en lavados vaginales al día 3 post-desafío (pd) (n=20 p<0,01). Siete días pd observamos un aumento significativo en la producción de IFN-γ, TNF-α, IL-6 e IL-17A, acompañado por una disminución de IL-10 en la mucosa vaginal (n=20 p<0,01). En los ganglios drenantes, 3 días pd, observamos aumentada la expresión de CXCL9 (n=10 p<0,001), mayor número de células por ganglio, e incrementada la proporción de células T CD8+ (n=10 p<0,05). Observamos, además, que las células T CD4+ y T CD8+ presentaron mayor capacidad proliferativa (n=10 MFI 23.727 vs 17.200; p<0,01) y un 102 Libro de resúmenes aumento en la producción de IFN-γ (n=10 p<0,05) frente estímulos específicos. No observamos diferencias significativas en el título de IgG e IgA. Por otro lado, evaluamos la respuesta inmune a tiempos tempranos post-vacunación (48 hs), observando que el grupo VS presentó ganglios drenantes de mayor peso y un aumento en la producción de IFN-γ e IL6 (n=10 p<0,001); y observamos un aumento en el número de células NK en la mucosa vaginal. Nuestros resultados sugieren que la presencia de VS durante la vacunación promueve una respuesta inflamatoria temprana, potenciando la subsecuente respuesta T específica de memoria contra HSV-2, y la protección mediada por IFN-γ. 0164 CLONADO Y EXPRESIÓN DE DISTINTAS PROTEÍNAS DEL VIRUS DISTEMPER CANINO PARA SU EVENTUAL USO COMO INMUNÓGENOS DE NUEVA GENERACIÓN C Romanutti, M Gallo Calderón, L Keller, J La Torre ICT Milstein, Argentina. Introducción. El Virus Distemper Canino (VDC), miembro del género Morbillivirus, familia Paramyxoviridae, es altamente contagioso y de distribución mundial. Afecta a animales de compañía y a distintas especies silvestres susceptibles. Durante la década del 60, se desarrollaron vacunas atenuadas que junto con la aplicación de medidas preventivas, lograron controlar la enfermedad, pero recientemente se han registrado a nivel mundial y en Argentina un aumento de casos de DC tanto en animales vacunados como en no vacunados. Debido a la falta de actualización de las cepas atenuadas presentes en las vacunas comerciales, y al ser el VDC un virus con genoma a ARN, que presenta una alta tasa de mutación (10-3/10-5), provoca la aparición de cepas emergentes pobremente protegidas por los anticuerpos vacunales. Es por estos motivos que el objetivo propuesto en este trabajo, apunta al desarrollo de inmunógenos recombinantes, de nueva generación, para lograr un mejor y efectivo control de la enfermedad. Metodología. Mediante técnicas de ingeniería genética se clonaron los genes codificantes para la proteína de Fusión (F), la Hemaglutinina (H) y la Nucleoproteína (NP) viral de distintas cepas de VDC en el vector pCIneo bajo el promotor de Citomegalovirus. Luego el ADN de estos vectores se transfectó en células BSR y a las 24 y 48 horas post transfección (hpt), se evaluó la expresión de las proteínas recombinantes por Western Blot (WB). Por otro lado, el gen de la NP se clonó en un vector de expresión procariota (pRSET-B). Luego de transformar bacterias BL21 se realizaron ensayos de inducción a distintos tiempos, para definir el tiempo óptimo de producción de la proteína recombinante. Resultados. Se pudo demostrar la expresión de las proteínas F, H y NP en células de mamíferos transfectadas con los distintos vectores y cosechadas a las 48 hpt. Por otro lado, se demostró la expresión de la NP mediante SDS-PAGE y su identidad fue confirmada por WB. El mayor nivel de expresión se obtuvo a las 5 h post inducción, tanto en la fracción insoluble como en el sobrenadante. Conclusiones. Se lograron expresar las proteínas F, H y NP del VDC en sistemas de expresión eucariotas y procariotas. Se espera poner a punto los ensayos de purificación de la NP a partir del sobrenadante de cultivos inducidos utilizando columnas de afinidad a Ni2+, para posteriormente ser utilizada como inmunógeno a proteína recombinante. Por otro lado, se espera obtener plásmidos libres de LPS, los cuales serán utilizados como posibles vacunas a ADN. Posteriormente, con los inmunógenos desarrollados, se inmunizarán ratones y se evaluará la capacidad de dichas vacunas para otorgar protección a través de ensayos de seroneutralización. 0188 GENERACION DE VACUNAS ALTERNATIVAS CONTRA LA GRIPE UTILIZANDO VECTORES VIRALES HETEROLOGOS. “DISPLAY” EN LA SUPERFICIE DE BACULOVIRUS DE 4 COPIAS DE LA PORCION EXTRACITOPLASMATICA DE LA PROTEINA MATRIX 2 (M2E). JM Morales1, P Molinari2, LA Boado1, N Mattion1, O Taboga2, P Alvarez1 1 Centro de Virología Animal, ICT-Milstein, CONICET, Buenos Aires, Argentina., Argentina. 2 Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA, Castelar, Buenos Aires, Argentina., Argentina. Introducción: La falta de cobertura heterosubtípica de las vacunas en uso para el control de la influenza humana es un serio problema potencial dado el tiempo prolongado del sistema de producción actual para generar una vacuna contra una nueva cepa. El surgimiento de una cepa de alta virulencia podría convertirse en un problema muy grave. Por esta razón, es de interés de nuestro laboratorio, la generación de una vacuna del tipo “universal” contra la gripe. Es decir, una vacuna que genere una respuesta inmune “cross-protectora” contra distintas cepas del virus y que, por lo tanto, no requiera de una actualización anual. Con este objetivo se eligió como antígeno el péptido extracitoplasmático de la proteína Matrix 2 (M2e) ya que se ha demostrado, que la inmunización con este péptido genera una respuesta inmune protectora contra el virus de influenza (VI). Además, dado que este péptido se encuentra altamente conservado entre las distintas cepas de influenza A, la respuesta generada es, en la mayoría de los casos, crossprotectora. Así también, trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron la capacidad protectora del “display” en la superficie de baculovirus (Bv) de 1 copia de M2e como fusión a la proteína gp64 (principal glicoproteína de membrana de Bv). Objetivo: Dado que se ha demostrado que la inmunización con más de una copia del péptido M2e aumenta significativamente la respuesta obtenida, en este trabajo decidimos evaluar la capacidad inmunogénica de un péptido conteniendo 4 copias en tandem de M2e también vehiculizado en la superficie de Bv. A diferencia de lo realizado en el trabajo anterior, en este caso el péptido fue fusionado a la secuencia de anclaje en membrana de la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV) y no a la gp64, ya que la fusión a esta secuencia permite el “display” en la superficie de los viriones no solo en los polos de las partículas, como ocurre con las fusiones a gp64, sino también en los laterales de la misma. Metodología: Para generar el sistema de “display” en la superficie de Bv, utilizamos un vector conteniendo el péptido señal de gp64 y la región de anclaje de VSV mencionada previamente. Para obtener los Bv recombinantes se utilizó el sistema “Bac to Bac” (Invitrogen) de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Resultados: En el presente trabajo se diseñó un oligonucleótido sintético conteniendo 4 copias de M2e y éste fue clonado en el vector detallado previamente. Se obtuvieron los bácmidos recombinantes y se transfectaron células de insecto con estos bácmidos. Se obtuvieron Bv recombinantes que incorpararon el péptido 4M2e. Conclusión: Se produjeron stocks purificados de estos virus recombinantes los que serán utilizados, en la etapa siguiente, para la inmunización de ratones y evaluar, así, la capacidad protectora de esta vacuna contra el desafío con virus de influenza. 0195 ENSAYO DE BACULOVIRUS COMO POTENCIAL INMUNOMODULADOR PARA VACUNAS AVIARES MS Lucero1 2, E Gómez1 2, S Chimeno Zoth1 2, JM Carballeda1 2, M Richetta1 3, MJ Gravisaco1, A Berinstein1 2 1 Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina. 3 ANPCyT, Argentina. El Virus de la Bursitis Infecciosa (IBDV) es el agente etiológico de una enfermedad altamente contagiosa e inmunosupresora que afecta pollos jóvenes causando importantes pérdidas económicas en la industria avícola. La proteína de cápside VP2 ha sido utilizada para el desarrollo de vacunas a subunidad en diversos sistemas heterólogos como alternativa a las vacunas tradicionales basadas en virus vivoatenuado o inactivado. No obstante, dichas vacunas presentan la desventaja de ser pobres inmunógenos siendo de vital importancia la utilización de adyuvantes para generar protección efectiva y respuesta inmune de memoria. Se ha observado que los baculovirus (BV) tienen potentes propiedades inmunomoduladoras promoviendo respuestas adaptativas humorales y celulares contra antígenos coadministrados, evitando las reacciones adversas causadas por los adyuvantes convencionales. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la capacidad adyuvante del BV al ser coadministrado junto con VP2 producido en plantas. Para ello, se inmunizaron por vía intramuscular 103 Libro de resúmenes pollos libres de patógenos específicos de 21 días con extracto de planta conteniendo 7,5 ug de VP2 solo o adyuvado con adyuvante de Freund o con BV (107 UFP). Los controles negativos recibieron BV solo o PBS. A los 14 días post inyección (dpi) se administró una dosis refuerzo. Los animales fueron sangrados a 0, 8, 14, 17 y 23 dpi y los sueros fueron analizados para determinar la presencia de anticuerpos específicos contra VP2. Diez días después del refuerzo los pollos fueron desafiados per os con 500 µl del virus LZD (6934 TCID50/ml) y al cabo de 5 días fueron sacrificados. Se extrajeron las bursas y se procesaron para su observación histológica y para el aislamiento de linfocitos y posterior análisis por citometría de flujo. Los pollos inoculados con el extracto de planta conteniendo VP2, adyuvado o no, desarrollaron una respuesta humoral de altos títulos, mientras que los grupos negativos no presentaron anticuerpos contra IBDV. Adicionalmente, las bursas de los animales vacunados con VP2 mostraron una morfología normal y presentaron una menor infiltración de linfocitos T comparadas con los grupos control, luego del desafío viral. En suma, estos resultados demuestran que, en las condiciones de nuestro ensayo, la coadministración intramuscular de baculovirus, no logró potenciar la respuesta inmune. Esto podría deberse a una necesidad de que el antígeno y el baculovirus estén juntos físicamente y sean procesados por el mismo endosoma. Por esta razón, actualmente estamos trabajando en la construcción de un baculovirus que exprese a VP2 en su envoltura para ser evaluado como inmunógeno recombinante alternativo. Por otro lado, el extracto de planta conteniendo VP2 es capaz de despertar una respuesta inmune sin la necesidad de adyuvantes adicionales; sin embargo, no podemos descartar el beneficio del agregado de adyuvantes no sólo para la magnitud de la respuesta sino también para su duración en el tiempo. 0199 EVALUACIÓN DE LA INMUNOGENICIDAD DE ANTÍGENOS RECOMBINANTES DERIVADOS DE LA HEMAGLUTININA DEL VIRUS DE INFLUENZA EQUINA PARA USO COMO VACUNAS UNIVERSALES C Caldevilla, Y Paredes Rojas, LI Ibañez, N Mattion ICT Milstein, Argentina. Las vacunas convencionales contra influenza equina estimulan una fuerte respuesta inmune humoral frente a glicoproteínas de superficie, en particular la hemaglutinina (HA). Sin embargo, el virus sufre continuos cambios aminoacídicos en los dominios reconocidos por los anticuerpos, que provocan que los virus escapen a la neutralización y que las vacunas no generen respuestas cruzadas contra diferentes cepas. Numerosos trabajos han reportado la existencia de epitopes altamente conservados en la región del tallo de la HA, que pueden ser utilizados para mejorar la respuesta inmune cruzada. Con el fin de generar vacunas que provean dicha protección, diseñamos dos inmunógenos basados dominios conservados de la HA de un virus equino aislado en Argentina. El primero es una proteína recombinante (ΔHAp), el segundo es una secuencia de nucleótidos clonada en vectores aptos para la generación de vacunas a ADN (ΔHAe). La inmunogenicidad de ambos antígenos fue evaluada mediante diferentes protocolos de inmunización. La secuencia que codifica para ΔHAp fue clonada en el vector pET22b, se transformó en E.coli y la proteína recombinante fue purificada a partir de cuerpos de inclusión. La secuencia ΔHAe fue clonada en varios vectores que fueron transfectados en células HEK 293T para su análisis. La correcta expresión de las proteínas fue determinada mediante Western blot. Se establecieron cinco esquemas de inmunización en ratones BALB/c y se realizaron 2 inmunizaciones con un intervalo de 15 días. El grupo 1 recibió dosis de 50 g/ratón de ADN por vía IM. El grupo 2 recibió dosis de 10 g de proteína recombinante en adyuvante incompleto de Freund por vía IP. Los animales del grupo 3 recibieron una dosis de ADN y un refuerzo con proteína recombinante. El grupo 4 recibió una inmunización inicial con proteína y luego un refuerzo con ADN. El grupo 5 se utilizó como grupo control no vacunado. Todos los sueros se evaluaron para determinar la presencia de anticuerpos antiHA mediante ELISA ya sea en placas cubiertas por proteína o virus. Cuando se analizaron los títulos de anticuerpos en placas cubiertas con proteína recombinante, se observó que los animales que recibieron sólo ADN generaron bajos títulos y los vacunados con proteína mostraron los títulos más altos. En las inoculaciones combinadas de ambos antígenos, la respuesta inmune sólo mejoró cuando el refuerzo se realizó con proteína. Cuando los sueros se analizaron en placas cubiertas con virus, se observó mejor respuesta a la inmunización con proteína cuando el virus pertenecía al mismo grupo filogenético. Sin embargo la respuesta frente a virus pertenecientes a diferentes grupos filogenético fue mejor en el caso de inmunizar con ADN. Las proteínas se expresaron correctamente en sistemas procarióticos y eucarióticos. El esquema que mostró mayores títulos de anticuerpos fue el basado en proteína recombinante, en el caso de analizar respuesta homotípica, y en ADN en el caso de analizar respuesta heterotípica. 0202 OBTENCIÓN DE UN ANTISUERO ESPECÍFICO PARA LA DETECCIÓN DE LA PROTEÍNA ESTRUCTURAL VP2 DEL VIRUS DE LA BURSITIS INFECCIOSA M Richetta1 2, E Gómez1 3, MS Lucero1 3, G Calamante1, A Berinstein1 3 1 Instituto de Biotecnología - INTA Castelar, Argentina. 2 ANPCyT, Argentina. 3 CONICET, Argentina. La Bursitis Infecciosa es una patología que tiene gran impacto económico en la producción avícola. Su agente causal, el virus de la Bursitis Infecciosa (IBDV), ha sido ampliamente estudiado y caracterizado, determinándose que la proteína viral de cápside VP2 es el principal antígeno capaz de inducir una respuesta inmune humoral protectora. En nuestro laboratorio se desarrollan vacunas biotecnológicas contra IBDV, que poseen a la proteína VP2 como componente principal. En este contexto, es fundamental la disponibilidad de una herramienta molecular que permita detectar específicamente la presencia de la proteína VP2 expresada a partir de diversos sistemas. Previamente, en nuestro grupo se expresó y optimizó la purificación de la proteína VP2 recombinante (VP2r) en bacterias. El objetivo del presente trabajo fue obtener y evaluar la utilidad de un antisuero policlonal específico para la detección de la proteína VP2 de IBDV. Se partió de un cultivo bacteriano (500 ml) que se creció con agitación hasta alcanzar la fase de crecimiento exponencial (OD600 = 0,5), se indujo la expresión de VP2r por el agregado de IPTG (0,5 mM) y las bacterias se colectaron por centrifugación 1 hora post inducción. El total del pellet bacteriano se procesó usando el método optimizado. Brevemente, la purificación se realizó en dos etapas: 1) mediante columnas de afinidad con Ni-NTA agarosa (la proteína VP2r posee un tracto de seis histidinas en el extremo N-terminal) y, 2) electroforesis en PAGE-SDS y electroelución. El rendimiento total fue de 1,5 mg de proteína VP2r pura. Para la obtención del antisuero la proteína VP2r pura (0,5 mg/dosis) se formuló con adyuvante de Freund, se inmunizó intramuscularmente (día 0 y 21) un conejo y a distintos tiempos se realizaron sangrías exploratorias para detectar la presencia de anticuerpos específicos contra VP2r por Western blot. Además, para evaluar la utilidad del suero anti-VP2 se realizaron ensayos de Western blot contra extractos proteicos provenientes de plantas de tabaco agroinfiltradas (GV3101/pBINPLUS-VP2) y de cultivos celulares infectados con IBDV o con poxvirus recombinantes que expresan VP2. Luego de una o dos inmunizaciones fue posible detectar la presencia de anticuerpos específicos contra VP2r hasta diluciones del suero 1/800 y 1/8000, respectivamente. Además, el suero anti-VP2 permitió la detección específica de la proteína de interés a partir de sistemas de expresión utilizados en el desarrollo de vacunas biotecnológicas: plantas y poxvirus (MVA y FWPV) recombinantes. Finalmente, la proteína VP2 fue también detectada en el contexto de la infección de IBDV en cultivos celulares o en aves (en homogenatos de bolsa de Fabricio). En conclusión, se obtuvo un antisuero específico (de alto título) contra la proteína VP2 de IBDV que constituye una herramienta de suma utilidad para el trabajo en nuestro laboratorio y para la detección de IBDV en muestras biológicas. 104 Libro de resúmenes 0230 EFECTO ANTIVIRAL DE BACULOVIRUS EN POLLOS. EVALUACIÓN DE DIFERENTES RUTAS Y ESQUEMAS DE INOCULACIÓN. S Chimeno Zoth1 2, JM Carballeda1 2, MS Lucero1 2, E Gómez1 2, M Richetta1 3, MJ Gravisaco1, A Berinstein1 2 1 Instituto de Biotecnología-INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina. 3 ANPCyT, Argentina. Los Baculovirus (BVs) son virus a ADN que infectan insectos y han sido utilizados como bioinsecticidas y como sistemas productores de proteínas foráneas. Existen diversos reportes que demuestran que los BVs tienen además una potente actividad adyuvante sobre el sistema inmune de mamíferos y estudios recientes de nuestro grupo indican que esta propiedad también se comprueba para aves. El Virus de la Bursitis Infecciosa (IBDV) es un agente endémico en la mayoría de las regiones productoras avícolas, que causa una enfermedad inmunosupresora aguda, sumamente contagiosa de pollos. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto antiviral de BV contra IBDV, considerando diferentes esquemas y rutas de inoculación. Pollos SPF White Leghorn de 28 días fueron inoculados por vía endovenosa con 108 ufp de BV Autographa californica nuclear polyhedrosis virus 3 horas antes o 3 horas después de recibir una dosis oral (2x103 TCID50) de una cepa intermedia de IBDV con sus correspondientes controles. Con la intención de explorar otra ruta de inoculación, se realizó un segundo ensayo en el que los pollos se inocularon por vía intranasal con 1,7x107 ufp en cada narina de BV, 3 hs antes de la infección con IBDV. En ambos experimentos, los animales fueron sacrificados a 5 dpi y se procesaron las bursas para la extracción de ARN (medición de citoquinas por RT PCR en tiempo real) y para aislamiento de linfocitos (análisis por citometría de flujo). Otra porción de cada bursa fue conservada para aislamiento viral. Los resultados mostraron que la administración de BV 3 horas después de la inoculación de IBDV produce importantes cambios en el efecto que IBDV causa en la bursa. Mientras la infección induce infiltración de linfocitos T, la inoculación de BV disminuye este evento. También pudimos observar una disminución en la expresión de IL-6 e IFNγ y una inhibición de la replicación viral en la bursa. El tratamiento con BV previo a IBDV también atenuó los efectos de la infección pero los resultados no fueron tan concluyentes como en el tratamiento post IBDV. Por último, la administración intranasal de BV indujo una fuerte respuesta inflamatoria y, al menos en las condiciones evaluadas en nuestro ensayo, no logró disminuir la replicación de IBDV. Los resultados obtenidos demuestran la capacidad antiviral de baculovirus en pollos y promueven la profundización de los estudios para definir las dosis y rutas de inoculación apropiadas para lograr el efecto deseado. 0238 VEDEVAX®: PRIMERA VACUNA A SUBUNIDAD RECOMBINANTE REGISTRADA CONTRA EL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA D Bellido1, A Pecora2, MS Perez Aguirreburualde2, MM Vena3, MJ Dus Santos2, JA Escribano4, A Wigdorovitz2 1 Vetanco SA, Argentina. 2 Instituto de Virología, INTA Castelar, Argentina. 3 Incuinta, Argentina. 4 Algenex, España. El virus de la diarrea viral bovina (VDVB) es un virus que causa importantes pérdidas económicas al sistema agropecuario, debido a diversos factores como son, la constante circulación de virus en todos los sistemas productivos, la variedad de síntomas que los animales infectados pueden presentar (abortos, malformaciones, cuadros respiratorios, enfermedad de las mucosas) y a las dificultades que presenta el control de la diseminación viral. Una de las herramientas más utilizadas para controlar a éste y otros agentes infecciosos, es la vacunación de los animales susceptibles. En el caso del VDVB, las vacunas suelen tener dificultades para generar respuestas inmunes efectivas y duraderas, debido, principalmente, a que la producción a escala industrial del VDVB no logra alcanzar altos títulos virales. Para subsanar esta dificultad, Vetanco SA junto con Algenex se asociaron al Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) y decidieron generar una vacuna a subunidad basada en la proteína inmunodominante del virus, la glicoproteína E2, fusionada a un anticuerpo de simple cadena (APCH), que tiene la capacidad de dirigir los antígenos a células presentadoras del sistema inmune. Para la expresión de la proteína de fusión APCH-E2, se escogió el sistema de Baculovirus Recombinante. El antígeno se expresó en el sobrenadante de cultivo con niveles de 2 (± 0,5) mg/lt de cultivo. Una vez obtenido el antígeno, la vacuna se formuló en adyuvante oleoso, utilizando 1,5 ug de APCH-E2 por dosis. La generación de la vacuna se realizó siguiendo todas las indicaciones del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA), de acuerdo a las normativas internacionales y bajo GMP. Se realizaron los bancos Maestro y de Trabajo tanto de las células SF9 como del baculovirus APCH-E2, con sus respectivos controles: cariotipos, certificado de libre de virus adventicios y micoplasma, identidad de secuencia, pureza y viabilidad. La producción del antígeno se realizó de manera controlada al igual que la formulación de la vacuna. La vacuna APCH-E2 se evaluó en 16 bovinos (8 controles y 8 tratados), obteniendo títulos neutralizantes mayores a 3 (60 dpv). Estos animales, a su vez, lograron mantener niveles de anticuerpos neutralizantes superiores a 2, por al menos, un período de 12 meses. La vacuna fue evaluada en el modelo cobayo sugerido por la autoridad sanitaria para el control de la inmunogenidad de vacunas virales bovinas. Se obtuvieron títulos neutralizantes que superaron en un 96% el sitio de corte establecido. Estos resultados permitieron generar un dossier que fue presentado ante el SENASA, el cual fue posteriormente aprobado. Actualmente, se está produciendo la primera serie control, por lo que Vedevax se convierte en la primera vacuna a subunidad recombinante en bovinos aprobada para su comercialización en el país. 0242 ANÁLISIS DE IMPACTO DE UNA CEPA ATENUADA DEL VIRUS DE LA LEUCOSIS BOVINA M Sowul1, G Gutiérrez2 3, I Alvarez2 3, D Franco4, A Vilor5, JP Jaworski2 3, N Gillet6, L Calvinho7, L Willems6, K Trono2 1 DEyAR-DNSA-SENASA, Argentina. 2 Instituto de Virologia, CICVyA, INTA, Argentina. 3 CONICET, Argentina. 4 Campo Experimental de Animales de Producción, CICVyA, INTA, Argentina. 5 Establecimiento La Pia, Marcos Paz, Argentina. 6 University of Liège (ULg), Bélgica. 7 EEA Rafaela, INTA, Argentina. En nuestro país, más del 80% de los bovinos de tambo están infectados con el Virus de la leucosis bovina (BLV), contra el cual no existe ningún sistema de prevención o tratamiento disponible. Entre ellos, el 10% muere cada año como consecuencia de lesiones neoplásicas del sistema linfático (linfosarcomas). El propósito integral de nuestro grupo de trabajo consiste en contribuir en la maduración de un sistema profiláctico para prevenir la transmisión de la infección. El sistema se basa en el uso de una cepa viral atenuada por modificación genética que, si bien es infectiva y capaz de provocar una respuesta inmune, posee baja capacidad replicativa y reducido potencial patogénico. La idea central consiste en infectar al hospedador con un competidor discapacitado para replicar, enfermar y contagiar, pero que le permita resistir el desafío natural presente en el campo. Las características candidatas de la cepa atenuada han sido previamente identificadas, analizadas y confirmadas en ensayos in vivo. En este trabajo se realizaron análisis de la seguridad asociada al uso de la cepa, con el propósito de definir el impacto sobre el hospedador natural y/o el efecto potencial sobre los posibles consumidores de productos provenientes de animales inoculados con la cepa modificada. Los ensayos de infectividad in vivo mostraron que la transferencia de 1 ml de sangre fresca de un animal infectado con la cepa vacunal, no provoca la infección en terneros receptores susceptibles (n = 6). En cambio, la transferencia de 100 ul de sangre de un bovino infectado natural de alta carga proviral, así como 1 ml de sangre de un bovino infectado natural con baja carga proviral, fueron capaces de provocar la infección en terneros receptores (4/4 y 3/7, respectivamente). Complementariamente, la leche proveniente de 10 animales infectados con la cepa vacunal no presentó evidencia de provirus, ni tampoco de infectividad (0/7) cuando el pellet de células viables proveniente de 50 ml de leche fresca fue inoculado en corderos receptores susceptibles (2 por muestra). Además, los terneros nacidos de madres infectadas con cepa atenuada mostraron presencia de anticuerpos específicos en sangre. Ninguno presentó evidencia de infección perinatal (0/21). 105 Libro de resúmenes Los resultados de este trabajo agregan información que permitirá evaluar el producto que se utilizaría potencialmente en un sistema profiláctico y colaborar con las autoridades sanitarias en la actividad desregulatoria asociada a los microorganismos modificados. La propuesta integral futura consiste en analizar el peligro que encierra el uso de la cepa y evaluar los riesgos asociados a dicho peligro con el objetivo final de gestionar instancias de intervención adecuadas para reducirlo a niveles insignificantes, para lo cual se realizarán ensayos de validación de la inactivación viral por tratamiento térmico y ensayos de equivalencia sustancial de leche proveniente de animales infectados con la cepa vacunal. 0257 EXPRESIÓN DE LA GLICOPROTEÍNA J DEL VIRUS DE LARINGOTRAQUEITIS INFECCIOSA AVIAR EN LA ENVOLTURA VIRAL DE BACULOVIRUS Y SU CAPACIDAD DE ACTIVACIÓN DE PBMCS DE AVES. S Morales, J Bendezú, W Medina, L Choque, A Figueroa, A Montalvan, M Fernández Farvet SAC., Laboratorio de Biotecnología Molecular y Genómica. Panamericana Sur N° 766 Km 198.5, Chincha Alta, Ica, Perú. El virus de laringotraqueitis infecciosa aviar (ILTV, siglas en inglés) es el agente causante de pérdidas económicas en la industria avícola mundial. ILTV, subfamilia alphaherpesviridae, causa reducción en la producción de huevos así como desórdenes agudos en el tracto respiratorio de pollos que conllevan a la muerte por asfixia. El desarrollo de nuevas vacunas que confieran una mayor protección de la respuesta inmune es necesario para evitar la diseminación de los focos de infección causados por ILTV. La glicoproteína J (gpJ) representa el principal antígeno presente en la envoltura viral de ILTV y está relacionado a procesos de invasión. Debido a éstas características, gpJ ha sido seleccionado como un potencial candidato a vacuna. Se obtuvo un baculovirus recombinante que exprese en su membrana viral la gpJ fusionada a la proteína Dsred2 (Bv-gpJ). Mediante ensayos de Western blot utilizando anticuerpos anti his se detectó la presencia de la gpJ en membranas de células de insecto a los días 1 y 2 postinfección utilizando MOIs de 1, 5 y 20. Se utilizó el Bv –gpJ y baculovirus wild- type para infectar células de insecto que luego de fueron lisadas y sus membranas utilizadas como antígenos para ensayos de ELISA indirecto con sueros de aves infectadas experimentalmente con ILTV, estos ensayos confirmaron la presencia de gpJ en las células de insecto infectadas. El sobrenadante de las células infectadas fueron concentrandas por filtración tangencial (10 veces), seguido de un paso de ultracentrifugación en sucrosa (10 veces) para obtener Bv-gpJ concentrado. Este concentrado fue utilizado para ensayos de seroneutralización con sueros de aves infectadas con ILTV así como sueros de pollos libres de patógenos (SPF, siglas en inglés) en células insecto. No se detectó fluorescencia a los 7 días post-infección en los sueros de aves infectadas hasta la dilución 1/16 demostrando así la posible exposición de gpJ en la membrana viral de baculovirus y su reconocimiento por anticuerpos presentes en el suero. Además, los Bv concentrados fueron utilizados para ensayos de transducción en células mononucleares periféricas sanguíneas (PBMCs, siglas en inglés) de aves. Se determinó una relación lineal entre la dosis de baculovirus modificados utilizados para transducir PBMCs (expresados en MOIs) con la producción de IL-12 (pg/ml) y la expresión de MHC-2 en la superficie de los PBMCs (1.5 veces). Una vacuna es óptima si es capaz de evocar una respuesta inmune primaria frente al agente extraño, para este caso la producción de IL12 y PBMCs expresando MHC-2 es un indicio de la activación de los PBMCs, lo que indica que Bv-gpJ es capaz de estimular la respuesta immune innata del ave. Futuros ensayos son necesarios para corroborar su potencial como vacuna. 0263 VIPERINA, UN FACTOR DE RESTRICCIÓN EN LA INFECCIÓN CON EL ARENAVIRUS JUNÍN J Peña Cárcamo1, C Sobarzo2, V Guazzone2, S Cordo1, C García1 1 Laboratorio de Estrategias Antivirales, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. IQUIBICEN-CONICET, Argentina. 2 Instituto Investigaciones Biomédicas (INBIOMED) UBA-CONICET, Argentina. de La respuesta inmune innata es la primera línea de defensa contra los patógenos. El principal receptor de reconocimiento de patrones que sensa la entrada de RNA viral de cadena simple en el citoplasma celular es la proteína RIG-I. Su activación induce la producción de interferón (IFN), y en consecuencia la síntesis de genes estimulados por IFN (ISGs) que bloquean distintas etapas del ciclo de replicación viral. Viperina (VIP) es una proteína reportada como factor de restricción viral y cuya expresión es inducida por IFN. Nuestro objetivo es la caracterización de factores de restricción viral en las infecciones con virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina. En el presente trabajo se evaluó la respuesta de IFN y el rol de VIP durante la infección con JUNV en la línea celular humana HepG2. JUNV es un arenavirus envuelto con genoma fragmentado de RNA simple cadena que posee una estrategia de expresión ambisentido. El fragmento L codifica la RNA polimerasa RNA dependiente y la proteína Z; mientras que el fragmento S codifica la proteína de la nucleocápside N y el complejo glicoproteico. En primer lugar se analizó la activación de RIG-I frente a la infección con JUNV. Los resultados de PCR cuantitativa mostraron que este sensor responde a la presencia del virus en la célula. Luego, se analizaron los niveles relativos de mRNAs de VIP, y se observó un aumento de estos mRNAs tanto a las 24 como a las 48 h post infección (p.i.). Asimismo, se evaluó por inmunofluorescencia la expresión de VIP en células HepG2 infectadas. Las imágenes mostraron una expresión de VIP a las 24 h p.i., sin embargo no se observó expresión de esta proteína a las 48 h p.i. Posteriormente, se transfectaron células con siRNAs específicos para VIP y luego se infectaron con JUNV. Los niveles de mRNAs virales fueron 10 veces más abundantes en las células donde la expresión de VIP estaba reducida por los siRNAs. Por otro lado, está reportado que en estructuras celulares llamadas Lipid Droplets (LDs), VIP colocaliza con complejos de replicación viral. Interesantemente, estas estructuras se vieron aumentadas en número y tamaño en células infectadas con JUNV. El siguiente paso fue evaluar por microscopía confocal la posible localización de las proteínas de JUNV en estas estructuras lipídicas. Para esto las células fueron infectadas y a las 48 h p.i. se revelaron los antígenos virales, y se visualizaron los LDs con una sonda específica fluorescente. Se observó la localización de la proteína N de JUNV en los LDs de las células HepG2. La localización celular de las proteínas virales en LDs y la expresión de VIP en estas células, podría sugerir interacciones a nivel de estas estructuras, confirmando un posible rol antiviral de VIP en la infección con arenavirus. El estudio de estos factores antivirales celulares permitirá ampliar nuestro conocimiento sobre los mecanismos replicativos y al mismo tiempo aportará información para el diseño de estrategias antivirales. 0288 LOS ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES DIRIGIDOS CONTRA GP64 NO AFECTAN LA INDUCCIÓN DE RESPUESTA INMUNE INNATA NI LA INDUCCIÓN DE ESTADO ANTIVIRAL PERO SI LA RESPUESTA CITOTÓXICA ESPECÍFICA PARA EL ANTÍGENO TRANSPORTADO EN LA CÁPSIDE DEL BACULOVIRUS. P Molinari1, G Molina1, E Tavarone1, S García-Nuñez2, G Moron3, O Taboga1 1 INTA-CONICET, Argentina. 2 INTA, Argentina. 3 CIBICI-CONICET, Argentina. Los baculovirus (BV) son una familia de virus que infectan artrópodos. Los BV tienen fuertes propiedades adyuvantes, promoviendo respuestas humorales y celulares contra antígenos coadministrados, la maduración de células dendríticas (CD) y la producción de mediadores inflamatorios. Estudios previos realizados por nuestro grupo demostraron que los BV inducen un estado antiviral que otorga protección frente a un desafío letal de FMDV en el modelo murino y que el transporte de un antígeno en la cápside (“capsid display”) de los BV permite la inducción de una fuerte respuesta citotóxica antígeno específica in vivo. Para avanzar en la utilización de este vector vacunal, ya sea para estrategias de prime-boost o para la vacunación con antígenos 106 Libro de resúmenes diferentes, es importante conocer el efecto de la respuesta inmune contra el carrier (BV) en el impacto en la respuesta innata y en la inducción de una primo respuesta. En este trabajo se estudió el impacto de los baculovirus en la respuesta innata y en la respuesta citotóxica específica contra el antigeno transportado en la cápside en un escenario en el que existe una respuesta inmune específica previa contra el BV. Para evaluar el efecto sobre la respuesta inmune innata, se realizaron ensayos en los que se incubaron BV con sueros de ratones inmunizados previamente con BV (in vitro) o se inyectaron BV en ratones previamente inyectados con BV (in vivo). Ambos ensayos mostraron que la respuesta inmune innata contra la segunda inyección de BV no se vio afectada por la respuesta inmune humoral previa, medida como la inducción de IL6 e IFNg y de un estado antiviral efectivo contra FMDV. Para evaluar el efecto en la respuesta citotóxica específica contra un antígeno transportado en la cápside (BV/OVA), se inmunizaron ratones con BV o se preincubaron viriones BV/OVA con un suero policlonal anti BV o el anticuerpo monoclonal V1 dirigido contra la glicoproteína de superficie GP64 y se evaluó la inducción de linfocitos T CD8 citotóxicos específicos contra OVA mediante un ensayo de citotoxicidad in vivo. En los ratones inmunizados con BVOVA se obtuvo un 90 % de lisis específica, mientras que en los inmunizados con BVOVA previamente inmunizados con BV, con BVOVA neutralizados con Mab o preincubados con el suero anti BV, se obtuvieron porcentajes de lisis entre 0 y 10%. En conjunto, la inducción de la respuesta inmune innata por los BV no se ve afectada en un escenario de respuesta humoral preexistente, mientras que la respuesta citotóxica específica contra el antígeno transportado OVA sí se ve afectada, siendo los anticuerpos neutralizantes responsables de dicha inhibición. 0293 DESARROLLO DE UNA PLATAFORMA PARA LA PRODUCCIÓN DE VACUNAS VIRALES. CASO: VACUNA ANTIRRÁBICA PARA HUMANOS CA Palacios1 2, AV De Nichilo1, OP Larghi3, AD Parola1 2 1 Fundación Pablo Cassará, Saladillo 2452, Buenos Aires, Argentina. 2 Instituto de Ciencias y Tecnología Dr. César Milstein – CONICET. Saladillo 2468, Buenos Aires, Argentina. 3 Laboratorio Pablo Cassará, Carhué 1096, Buenos Aires, Argentina. La rabia es una zoonosis aguda ocasionada por virus del genero Lyssavirus, siendo letal en casi el 100% de los casos. Infecciones con el virus rábico causan al menos 55.000 muertes anuales en el mundo, aunque en el mismo período más de 15 millones de personas reciben tratamiento con vacunas antirrábicas. En nuestro país aún se producen vacunas para humanos a partir de cerebro de ratón y de rata lactantes, a pesar de haber sido desaconsejadas por la OMS desde 1984. Los avances en los sistemas de cultivos de células para la propagación de virus han llevado a un gran incremento en el desarrollo de vacunas virales. En particular, Vero es la línea celular continua con mayor aceptación por las autoridades regulatorias para la producción de vacunas para humanos. La misma ha sido utilizada por más de 30 años para la producción de vacunas contra poliovirus y el virus de la rabia y más recientemente para vacunas contra rotavirus, viruela, influenza, hepatitis A y encefalitis Japonesa. Establecer una plataforma de producción de vacunas virales para su uso en humanos es de gran interés para la industria nacional, permitiendo abrir un camino que pueda abastecer en un futuro, el mercado de vacunas local y regional. En este sentido, el objetivo del siguiente trabajo ha sido establecer una plataforma de cultivos celulares en un biorreactor a escala piloto, la puesta a punto de un proceso de producción del antígeno rábico, y el desarrollo de metodologías analíticas para control de proceso y de calidad. En este trabajo se muestran los resultados obtenidos en lotes pilotos, donde inicialmente se cultivaron células Vero sobre microesferas alcanzando una densidad de 2,5 - 3,5 x 106 células/ml. Las células se obtuvieron de un banco maestro de células Vero (CCL 81 ATCC) con controles de esterilidad e identidad celular (por secuencia y perfil de isoenzimas). El desarrollo del cultivo se monitoreó por recuento de núcleos, y se realizó un seguimiento de metabolitos (glucosa y lactato). Las células Vero se infectaron con la cepa Pitman Moore del virus rábico a una multiplicidad de infección de 0,1 y se monitoreó el avance de la infección cualitativamente por medio de inmunofluorescencia y estado del cultivo, y cuantitativamente por medio de contenido de glicoproteína viral. La productividad mínima de los procesos pilotos fue de 12.000 dosis de vacuna antirrábica para humanos (previo a su purificación) y 30.000 dosis de vacuna para animales. Es importante destacar que la plataforma de cultivo de células Vero desarrollada en nuestro laboratorio, puede ser empleada en el futuro para propagar otros virus o vectores virales como agentes vacunales, tanto de interés veterinario como de medicina humana. 0294 ESTABLECIMIENTO DE LA ESPECIFICACIÓN INTERNA DE SUERO HIPERINMUNE DE CONEJO ANTI VIRUS JUNIN PARA LOS ENSAYOS IN VITRO E IN VIVO DE LIBERACIÓN DE LA VACUNA CANDID # 1. J Chale, G Gamboa, A Maiza, A Bottale, S Fossa, L Riera Instituto Nacional de Enfermedades Virales Huamans “Dr. Julio I. Maiztegui” – INEVH – ANLIS, Argentina. El suero hiperinmune anti virus Junin es un reactivo biológico que se utiliza en el control de calidad de la vacuna Candid # 1 en los ensayos de liberación de lote que fueron establecidos por el desarrollador de la vacuna y declarados ante la Autoridad Regulatoria Nacional. Los ensayos que involucran la utilización del suero son: identidad de la vacuna Candid # 1, seguridad en cultivos celulares y seguridad en animales. El objetivo del presente trabajo fue estandarizar los títulos de anticuerpos específicos del suero hiperinmune obtenido en conejos para su utilización en ensayos in vivo e in vitro de control de calidad de la vacuna Candid # 1 mediante el estudio de parámetros de calidad. El ensayo consiste en la medición de anticuerpos neutralizantes por reducción de placas lisis en células Vero C76. Los parámetros estudiados para caracterizar el suero fueron: precisión intermedia y linealidad. Para los mismos se utilizó virus Junin de referencia (VR) Cepa Candid # 1, y distintos lotes de suero hiperinmune. La linealidad se estableció a partir de 12 determinaciones realizadas en distintas diluciones 1:500, 1:1000, 1:2000 de distintos lotes de suero y para la precisión intermedia se realizaron 22 determinaciones con distintas muestras de lotes de VR, distintos lotes de suero, a distintos horarios y distintos analistas. Se calculó la incertidumbre expandida (U) a partir del desvío estándar obtenido en el ensayo de precisión intermedia. Ambos materiales biológicos aportan una variabilidad al método que resulta necesario conocer y controlar. El grado de heterogeneidad es evidenciado por el coeficiente de variación (CV=5.0 %) obtenido en la prueba de precisión intermedia. El ensayo demostró un comportamiento lineal para distintas diluciones del suero (R2= 0.9793). Luego de la validación de la metodología, se calculó la U asociada a la expresión del resultado del título de suero y de esta forma se logró establecer la especificación del suero para el uso previsto. El título promedio obtenido fue de 3 unidades logarítmicas (1000) por lo que incorporando la U calculada (0.30 unidades logarítmicas) se establece la especificación en (3 +/- 0.30) para el título de suero: de 500 a 2000. Los antisueros estudiados que son utilizados además para ensayos de seguridad en animales y cultivos celulares, han demostrado poseer el título de anticuerpos suficiente para neutralizar el virus vacunal y no provocar interferencias en los ensayos de seguridad en sustratos biológicos susceptibles a la cepa Candid # 1 como son los ratones lactantes y las células Vero. La estandarización realizada reviste una gran importancia ya que el reactivo en estudio produce un fuerte impacto en la consistencia de los resultados de los ensayos de control de calidad. 0302 ESTUDIO DE LA CAPACIDAD INMUNOESTIMULATORIA DE LOS BACULOVIRUS DERIVADOS DE CUERPOS DE OCLUSIÓN EN EL MODELO MURINO GN Molina1 2, O Taboga1 2, P Molinari1 2 1 CONICET, Argentina. 2 Inst. Biotecnología, INTA, Castelar, Argentina. Los baculovirus son virus que infectan principalmente insectos. Su ciclo de vida es bifásico, con dos tipos de viriones: los virus derivados de cuerpos de oclusión (ODV) incluídos en la matriz de los poliedros y los 107 Libro de resúmenes virus brotados (BV). Aunque sus nucleocápsides son prácticamente idénticas, difieren en el origen y la composición de sus envolturas. Aunque incapaces de replicar en células de mamífero, los BV son utilizados para transducir construcciones génicas y para el desarrollo de vacunas debido a los efectos que producen en el sistema inmune. Estudios previos realizados por nuestro grupo demostraron que el transporte de un antígeno en la cápside de los BV permite la inducción de una fuerte respuesta citotóxica antígeno específica in vivo. Sin embargo, en una segunda inoculación, estos efectos se ven alterados debido a la inmunidad previa específica contra el vector. Dado que los ODV poseen los mismos patrones moleculares asociados a patógenos que los BV pero distinta envoltura, es posible que impacten en el sistema inmune innato de mamíferos sin verse afectados por la respuesta inmune humoral preexistente. Por esta razón, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la capacidad inmunoestimulatoria de los cuerpos de oclusión y los ODV. Para estudiar el impacto en el sistema inmune innato, se inocularon ratones C57 BL/6 por vía intravenosa con ODV y poliedros y, como controles, BV, poliedrina y PBS. A las 6 horas fueron sangrados a blanco y se realizó el dosaje de citoquinas mediante ELISA. A pesar de que los BV indujeron altos valores de IL-6, IL-12 e IFN-γ, la inoculación de ODV o poliedros resultó en niveles significativamente menores (p<0,05), siendo similares a los basales del control con PBS. Con el fin de estudiar la interacción de células dendríticas derivadas de médula ósea murina (BM-DC) con ODV o con poliedros, se realizaron ensayos de inmunomicroscopía confocal incubándolos a 37°C. Se detectó la presencia de ODV (mediante anticuerpo α-vp39) dentro de estas células colocalizando con marcadores de endosomas tardíos y lisosomas y se observó que a las 24 hs los poliedros habían sido fagocitados pero no disueltos. Para evaluar la capacidad de los ODV de inducir la maduración de BMDC, se incubaron estas células durante 18 hs en distintas condiciones con ODV y, como controles, BV, LPS, poliedrina y medio de cultivo. Se evaluó el aumento de marcadores de maduración fenotípica (CD86 y MHCII) en células CD11c+ mediante marcación con anticuerpos y análisis por citometría de flujo y se cuantificaron por ELISA los niveles de IL-6 secretada al sobrenadante. Los ODV no tuvieron la capacidad de los BV para inducir la maduración de BM-DC en cuanto a expresión de marcadores ni en producción de IL-6. Los resultados obtenidos indican que los ODV de AcMNPV, así como los poliedros enteros, no estimulan la secreción de citoquinas en ratones y, a pesar de ser capaces de ingresar a compartimentos acídicos dentro de las BM-DC, tampoco inducen su maduración. 0304 VÍA DE PRESENTACIÓN ANTIGÉNICA DE LOS BACULOVIRUS EN CÉLULAS DENDRÍTICAS MURINAS P Molinari1, I Cebrián2, G Morón3, LS Mayorga2, O Taboga1 1 INTA-CONICET, Argentina. 2 IHEM-CONICET, Argentina. 3 CIBICICONICET, Argentina. Los baculovirus (BV) son una familia de virus que infectan artrópodos. Son virus envueltos a ADN doble cadena y patógenos para los insectos. Los BV tienen fuertes propiedades adyuvantes en mamíferos, promoviendo respuestas humorales y celulares contra antígenos coadministrados. Asimismo, estimulan la maduración de células dendríticas (DC) y la producción de mediadores inflamatorios. Estudios previos realizados por nuestro grupo demostraron que el transporte de un antígeno en la cápside de los BV induce una fuerte respuesta citotóxica antígeno específica in vivo. Sin embargo, dicha respuesta no se desencadena cuando el antígeno es transportado en la superficie del BV. Para entender el mecanismo de presentación del antígeno modelo ovoalbúmina (OVA) expresado en la cápside de los BV, se estudió el tráfico intracelular de BV-OVA en DCs mediante inmunofluorescencia y análisis por microscopía confocal y electrónica. Los estudios realizados permitieron demostrar que BV-OVA alcanza compartimentos endosomales una hora post-infección. Además, se determinó que las proteínas mayoritarias de la envoltura (GP64) y de la cápside (VP39) permanecen juntas hasta las 3 horas de infección, para luego desasociarse. Por otro lado, se observó un reclutamiento temprano (1 hora post-infección) de moléculas MHCI a los compartimentos BVs+. También se estudió la colocalización del virus con marcadores del retículo endoplasmático y lisosomas. Finalmente, mediante microscopía electrónica se pudo visualizar al virus en las diferentes instancias de infección de las DC, es decir, en membrana plasmática, compartimentos intracelulares y en el citoplasma. Los resultados obtenidos hasta el momento sugieren que los BV ingresan íntegros a compartimentos subcelulares de las DC, y tras un proceso de acidificación mediado por vesículas lisosomales, la cápside viral alcanza el citoplasma. 0310 PRESENTACIÓN ANTIGENICA EN BACULOVIRUS: LA LOCALIZACIÓN Y ESTRATEGIA DE PRESENTACIÓN DETERMINAN EL TIPO DE RESPUESTA CONTRA EL ANTÍGENO VECTORIZADO E Tavarone1 2, S Amalfi1, P Molinari1 2, O Taboga1 2 1 Instituto de Biotecnologia, INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina. En la búsqueda de estrategias de presentación de antígenos heterólogos y para montar respuestas humorales o celulares, modulando y adyuvando adecuadamente cada tipo de respuesta, los baculovirus (BV) están siendo estudiados como vectores vacunales con resultados promisorios. Desde hace algunos años diversos grupos de investigación exploraron diferentes sistemas de presentación antigénica utilizando el BV AcNPV mediante la expresión de polipéptidos en la superficie de viriones brotados (peplomérica como fusiones a la glicoproteína GP64 o distribuida en toda la superficie viral por fusión a porciones de la proteína G del virus de la estomatitis vesicular, VSV) o por síntesis de novo de los antígenos heterólogos mediante transducción de células de mamífero. Recientemente nuestro grupo desarrolló la estrategia de presentación cruzada de antígenos por fusión a la proteína de cápside VP39 (presentación en nucleocápside) para la generación de respuestas de tipo citotóxico. Si bien las distintas estrategias seguidas por diferentes autores mostraron ser eficaces para despertar respuestas inmunes, la individualidad de cada análisis no permite comparar las respuestas generadas. Así, el objetivo de este trabajo fue contrastar vis a vis las diferentes estrategias de presentación antes mencionadas. Para esto se construyeron y caracterizaron BV que transportan el antígeno modelo ovoalbúmina (OVA) fusionado a los dominios de transmembrana y citosólico (CTD) de la proteína G de VSV (BV OVAsd), a la glicoproteína baculoviral Gp64 (BV OVAsup), a la proteína de cápside VP39 (BV OVAcap) o lo transcriben a partir del promotor mamífero CAG (BV OVAcag). Tras su caracterización molecular, se inocularon ratones BALB/c con 3 dosis de 1x108 ufp de BVs por vía IP y 1x107 ufp de BVs por vía IM, con intervalos de dos semanas, se evaluó la respuesta humoral anti OVA mediante ELISA directo y se analizó el perfil de IgG generado. Sólo los grupos BV OVAsd y OVAsup generaron anticuerpos específicos. El grupo BV OVAsd mostro un nivel de respuesta muy superior al grupo OVAsup y un perfil IgG tipo 2a. Por otro lado, la respuesta celular fue determinada mediante un ensayo de citotoxicidad in vivo tras la inoculación de ratones C57BL/6 con una única dosis de 5x107 ufp de BVs por vía IV, siendo el grupo BV OVAcd el que mostró mayor porcentaje de citotoxicidad (96,6% vs 12,3% para OVAsup y menos del 3% para el resto). Los resultados obtenidos en este trabajo nos permitieron concluir que las estrategias de presentación en la superficie son más adecuadas para la inducción de respuestas humorales (siendo más eficiente la distribución en toda la superficie que la distribución peplomérica y fuertemente perfilada al tipo Th1) mientras que la presentación cruzada de OVA transportada en la cápside resultó más adecuada para despertar respuesta citotóxica. 0340 DELECIÓN DE GENES INMUNOMODULADORES DEL GENOMA DE MVA: EFECTO SOBRE SU INMUNOGENICIDAD MP Holgado1, CA Maeto1, J Falivene1, MP del Médico-Zacaj2, G Calamante2, MM Gherardi1 1 Instituto INBIRS, UBA-CONICET, Buenos Aires, Argentina. 2 Instituto de Biotecnología – CICVyA - INTA Castelar, Buenos Aires, Argentina. 108 Libro de resúmenes El virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) aún conserva genes relacionados con la evasión de la respuesta inmune del huésped. Previamente, nuestro grupo reportó la optimización del potencial vacunal de este vector al cual se le había delecionado el gen C12L, que codifica para una proteína de unión a IL-18. En este trabajo analizamos la inmunogenicidad del vector MVA luego de la deleción dos genes virales: el A44L, implicado en la síntesis de hormonas esteroideas, y el A46R, que inhibe la señalización de receptores Toll (MVAΔA44L-A46R: MVAd). Como así también el análisis de las tres deleciones en simultáneo (MVAΔC12L/ΔA44L-A46R: MVAt). Para ello, ratones C57BL/6 fueron inmunizados por vía intramuscular con el virus salvaje (MVAwt) o los virus delecionados (ΔMVAs). Evaluamos la respuesta celular T frente a epitopes del virus Vaccinia a los 7 y 45 días post-inmunización (dpi), correspondientes a las etapas de respuesta aguda y de memoria, respectivamente, en bazo y ganglios ilíacos. La proporción de células productoras de IFNγ e IL-2 se evaluó mediante ELISPOT y la producción de citoquinas a través de ELISA. El porcentaje de células T-CD8 citotóxicas se analizó por citometría de flujo, mediante la expresión de CD107, y la proliferación específica de las distintas subpoblaciones de células T de memoria mediante marcación con CFSE y la expresión de CD44 y CD62L. Para estudiar la respuesta innata inducida por el virus, se inmunizaron ratones con el MVAwt y el MVAt, y se evaluó por ELISA el patrón de citoquinas producido entre las 0 y 30 horas post-inoculación (hpi). A los 7 dpi, los ΔMVAs indujeron un aumento significativo en el número de T-CD8 y CD4 productoras de IFNγ específicas contra Vaccinia en comparación al MVAwt, como así también en el número de T-CD8 productoras de IL-2. Este incremento, también se observó a los 45 dpi. El porcentaje de T-CD8 de memoria que proliferó luego de la estimulación fue mayor en el grupo inmunizado con MVAt (6%) que en el MVAwt (3%), obteniéndose resultados similares en la población TCD4 (7% vs 1% respectivamente). Dentro de las células que proliferaron, el MVAt indujo una mayor proporción de células de memoria central (TCM: 37%) y de memoria efectora (TEM: 25%) versus el MVAwt (TCM: 20%,TEM: 11%). Resultados similares se obtuvieron para la población T-CD4 (TCM: 37%,TEM: 16% vs TCM: 8%,TEM: 2% respectivamente). Sumado a esto, los ∆MVAs indujeron mayor porcentaje de T-CD8 específicas bifuncionales productoras de IFNγ y con capacidad citotóxica. Al analizar la respuesta innata observamos que el MVAt produjo mayores niveles de IFNγ e IL-12 a las 20 y 30 hpi en comparación al MVAwt. La deleción simultánea de genes específicos del genoma de MVA, cuyas funciones se encuentran inter-relacionadas, compone una estrategia apropiada para aumentar el potencial vacunal de este vector, creando una herramienta útil y versátil, para ser utilizada en el desarrollo de vacunas frente a infecciones tales como HIV, Malaria y Tuberculosis. 0350 LA PROTEÍNA DE LA LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA ES UN FACTOR DE RESTRICCIÓN CONTRA EL VIRUS DENGUE F Giovannoni, EB Damonte, CC García Laboratorio de Virología, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Argentina. La inmunidad intrínseca está basada en factores celulares de restricción que son expresados de manera constitutiva, estableciendo así, un mecanismo de defensa inmediato frente a infecciones virales. La proteína de la leucemia promielocítica (PML, también llamada TRIM19) es un factor de restricción que también puede ser inducido por interferón (IFN). PML interactúa con más de cien proteínas celulares, formando estructuras nucleares discretas conocidas como Nuclear Bodies (NBs). En múltiples familias de virus se han identificado proteínas capaces de interaccionar con PML y, por lo tanto, afectar a los PML-NBs como una estrategia para evadir la respuesta celular antiviral. Dada la ausencia de agentes antivirales y vacunas efectivas contra el virus dengue (DENV), resulta de gran importancia conocer aquellos factores involucrados en la respuesta celular antiviral para ser tenidos en cuenta en posibles desarrollos de agentes farmacológicos. En nuestro trabajo, se propuso investigar la actividad de PML frente al serotipo 2 de DENV (DENV-2) en la línea celular humana A549. El silenciamiento de PML por medio de siRNAs causó un aumento de 0,76 log en la producción de partículas virales a las 24 h post infección (p.i). Análogamente, su sobreexpresión causó una disminución de 1,6 log. Estos resultados fueron corroborados por cuantificación de la expresión de antígeno viral a través de inmunofluorescencia. Posteriormente, se evaluó el efecto de la infección con DENV-2 sobre el patrón nuclear de los PML-NBs al ser visualizados por inmunofluorescencia. Las imágenes revelaron una disminución del número de PML-NBs por núcleo observados a tiempos tardíos p.i. Estos resultados sugieren que la infección con DENV-2 altera a los PML-NBs. Por otro lado, células vecinas a las infectadas mostraron un aumento significativo en el número y tamaño de PML-NBs encontrados por célula. Para estudiar en mayor detalle si este fenómeno estaba relacionado con la liberación de IFN por parte de células infectadas, se cuantificó por RT-PCR en tiempo real el nivel de expresión de genes involucrados en su vía de señalización. Estos ensayos revelaron un aumento significativo en la expresión relativa de IL-6 e IFN-β, entre otros. En particular, la expresión relativa de PML aumentó hasta 5000 veces ante la infección con DENV-2. Interesantemente, estos efectos se vieron disminuidos en células A549 tratadas con un inhibidor de la vía JAK/STAT y en células Vero (deficientes para la producción de IFN). Esto demuestra que la actividad antiviral intrínseca de PML es independiente de IFN, aunque su efecto es potenciado por esta molécula. En resumen, nuestro trabajo constituye la primera evidencia de la contribución de PML a la respuesta antiviral celular contra DENV-2. Serán necesarios otros estudios para determinar el mecanismo molecular detrás de esta actividad. 0380 ADMINISTRACION INTRANASAL DE UNA VACUNA DE INFLUENZA FORMULADA CON LA NUCLEOPROTEINA VIRAL Y EL ADYUVANTE C-DIAMP PROTEGE A RATONES CONTRA LA INFECCIÓN VIRAL MV Sanchez1, T Ebensen2, D Cargnelutti1, K Schulze1, E Scodeller1, CA Guzmán2 1 Instituto de Medicina y Biología Experimental de Cuyo (IMBECU) CCTMendoza, Argentina. 2 Helmhotz Centre for Infection Research. Braunschweig, Alemania. El virus de influenza tiene la capacidad de provocar epidemias anuales y pandemias, con un alto impacto en la salud mundial en términos de morbilidad y mortalidad. Actualmente existe una crítica necesidad de vacunas de influenza de rápida disponibilidad capaces de proteger contra cepas de virus constantemente emergentes. Una de las propuestas, es el desarrollo de vacunas universales utilizando antígenos conservados del virus, que induzcan respuestas celulares y humorales vigorosas capaces de actuar en el portal de la entrada de este patógeno. En este estudio evaluamos las respuestas inmunes humorales y celulares y la eficacia protectora de una vacuna intranasal formulada con un antígeno viral recombinante conservado, la nucleoproteína (NPr) co-administrada con el adyuvante bis-(3 ',5')-adenosina monofosfato ciclico dimérico (c-di-AMP). Metodología: La NPr del virus A/PR/8/34 (H1N1),se sintetizó y purificó mediante columnas de afinidad e intercambio iónico. Ratones BALB/c (n=5), fueron inmunizados en los días 0 y 21 por vía i.n.. Los ratones recibieron NPr sola o co-administrada con c-di-AMP (PCT/EP 2006010693), además se incluyó un grupo control negativo (PBS). Para la evaluación de la respuesta inmune humoral, se determinaron los títulos de IgG total y subtipos en suero, e IgA en lavados mucosales. Para la evaluación de la respuesta inmune celular, suspensión de esplenocitos fueron obtenidos y cultivados para realizar ensayos de proliferación celular y ensayos de ELISPOTs para determinar las células productoras de IL-17, IFN-γ, IL-2, IL-4. En el día 60, los ratones inmunizados (n=6) fueron infectados con una dosis sub-letal del virus de influenza A/PuertoRico/8/34 (H1N1) y observados y pesados diariamente durante 2 semanas en busca de signos de morbilidad. Resultados: El título de IgG total obtenido en ratones inmunizados con NPr/c-di-AMP demostró un fuerte incremento (972800),al igual que los títulos de IgG subtipos, IgG1 (1.33x106) e IgG2a (2.86x106), comparado con la inmunización sin adyuvante. Los esplenocitos de los ratones inmunizados con NPr/c-di-AMP mostraron una muy buena proliferación después de la re-estimulación con concentraciones crecientes de NP (Indice de estimulación=6). El análisis de ELISPOTs indicó que la 109 Libro de resúmenes formulación NPr/c-di-AMP es capaz de estimular la producción de IL17,IFN-γ, IL-2 e IL-4, dirigiendo la respuesta predominantemente hacia un perfil Th1/Th17. Con respecto al análisis del desafío viral, ratones inmunizados con NPr/c-di-AMP no sufrieron pérdida de peso durante la infección mientras que ratones inmunizados con NPr y PBS, mostraron una pérdida de peso del 10 y 12 % respectivamente. Este estudio demuestra que la administración intranasal de la formulación NPr/c-di-AMP puede ser considerada como una prometedora vacuna universal, la cual es capaz de estimular fuertes respuestas inmunes humorales a nivel sistémico y local y fuertes respuestas inmunes celulares, capaces de proteger a ratones de la infección viral. Jueves 25 de junio Sala C (Petit Dorée - 1º piso) 14:30 - 16:00 hs. Virología veterinaria 0017 CIRCULACIÓN DEL VIRUS DE INFLUENZA PORCINA EN PEQUEÑOS PRODUCTORES DE LA ARGENTINA M Dibarbora1, JA Cappuccio1, M D´Angelo1, N Aznar2, F Bessone3, H Piscitelli3, A Pereda2 1 Instituto de Virología, CICVyA, INTA Castelar, Argentina. 2 Instituto de Patobiología, CICVyA, INTA Castelar, Argentina. 3 EEA-INTA Marcos Juarez, Argentina. La infección por el virus de influenza A (AIV) es considerada endémica en la población porcina Argentina, siendo los subtipos predominantes el pandémico H1N1 (pH1) y el H3N2 cluster II (H3II). Sin embargo, estos estudios fueron realizados principalmente en granjas porcinas de más de 100 madres. Este estrato de granjas representa apenas el 1,47% del total de explotaciones porcinas del país. Sin embargo, el 98,53% de los establecimientos lo componen productores pequeños de menos de 100 madres, o familiares. El objetivo de este trabajo fue determinar la circulación de AIV en pequeños productores y productores familiares de cerdos. Se realizó un muestreo sesgado en las provincias de Misiones, Tucumán, Chaco, Buenos Aires, Córdoba, Neuquén y Río Negro. Se caracterizaron los establecimientos según número de madres en dos categorías: establecimientos de menos de 50 madres (Tucumán, Chaco, Misiones, Río Negro y Neuquén) y los que poseen entre 50 a 100 madres (Buenos Aires y Córdoba). Se tomaron muestras de sangre de hembras adultas/padrillos y de capones (según disponibilidad) e hisopados nasales de animales con signos compatibles al momento del muestreo. Se realizó un ensayo de inhibición de la hemaglutinación contra subtipos predominantes en Argentina (pH1 y H3II). Se consideraron títulos de 1/40 o mayores como positivos y granja positiva aquella con al menos un animal positivo. El diagnóstico molecular fue realizado por Real Time PCR a partir de los hisopados nasales. Los estudios serológicos demuestran una mayor circulación de AIV en establecimientos de entre 50 a 100 madres, tanto del subtipo pH1 como del subtipo H3II. Cabe destacar, que ambas categorías presentaron un bajo porcentaje (<20%) de establecimientos positivos a H3II. En la categoría de <50 madres, se procesaron 22 hisopos (4 pooles), todos negativos por Real Time PCR. En la categoría 50 a 100 madres, se procesaron 31 hisopos (7 pooles) siendo solo uno, perteneciente a una sola granja, positivo a influenza por Real Time PCR. % animales Tipo de (positivos/total) establecimientos positivos pH1 % establecimientos (positivos/total) positivos pH1 % animales (positivos/total) positivos H3II % establecimientos (positivos/total) positivos H3II 50 a 100 madres 39.06 (150/384) 93.1 (27/29) 2.08 (8/384) 17.24 (5/29) < 50 madres 32.35 (77/238) 60.71 (17/28) 0.42 (1/238) 3.57 (1/28) La circulación de AIV es mayor en los establecimientos más grandes y tecnificados, esto podría estar asociado a la mayor densidad animal por m3, al uso de sistemas confinados, número de establecimientos cercanos, el ciclo productivo completo, la compra de reproductores, entre otros. Si bien los resultados obtenidos no son extrapolables a otras granjas por el tipo de muestreo, este estudio demuestra que existe circulación de AIV en pequeños productores. Existe una mayor circulación del subtipo pH1 que podría asociarse a su mayor circulación en humanos. 110 Libro de resúmenes 0023 ADAPTACIÓN DE UN VIRUS DE INFLUENZA A SUBTIPO H4N2 ARGENTINO PROVENIENTE DE AVES SILVESTRES ACUÁTICAS (ANAS VERSICOLOR) A AVES DOMÉSTICAS (GALLUS GALLUS DOMESTICUS) LM Ferreri, V Olivera, M Dangelo, AJ Pereda Laboratorio de Aves y Porcinos, CNIA Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Castelar, Argentina. El virus de influenza A subtipo H4N2 utilizado en este trabajo ha sido aislado de un pato capuchino (Anas versicolor) en el año 2011 bajo el marco de un estudio de prospección de aves acuáticas en el territorio nacional. Se ha descripto, en pocas oportunidades, la capacidad de este subtipo de infectar patos domésticos, codornices y otras aves de corral. Con el objetivo de estudiar la capacidad de este aislamiento autóctono de infectar aves de corral, se prosiguió a la infección de un grupo de nueve pollos de 21 días de edad. Los mismos fueron inoculados por vía ocular, nasal e intratraqueal con 1x106 TCID50/animal. Los animales fueron evaluados clinicamente y se cuantificó la carga viral mediante Real Time PCR. Si bien estos animales presentaban valores de Ct de alrededor de 30 al segundo día post infección, éste declinaba abruptamente al tercer día para luego desaparecer al cuarto. A partir de este resultado se decidió evaluar la capacidad del virus de infectar, en principio, células de riñón de embrión de pollo (REP). Estas permitirían la exposición del virus a tejidos del modelo a adaptar, sin la presión de selección del sistema inmune del modelo in vivo y de esta manera comenzar a seleccionar las variantes con capacidad de replicación en dichos tejidos. Se realizaron seis pasajes en REP, de forma tal de ir pasando la muestra del pocillo mas diluido que aún mostraba efecto citopático. De forma progresiva se alcanzó un título de 6.3x107 TCID50/ml. Luego se realizaron cinco pasajes en pollos de tres días de edad. Al tercer día post infección los animales fueron sacrificados y se maceraron los pulmones de los mismos. Se observó un incremento en la capacidad replicativa en el cuarto y quinto pasaje por Real Time PCR. En el quinto pasaje se decidió también hisopar traquealmente a los animales para evaluar la capacidad de excreción. Al quinto pasaje el virus demostró no sólo tener una mayor capacidad replicativa en pulmón sino también capacidad de ser excretado tanto al tercer como al cuarto día post infección. Como resultado de este estudio, se logró la adaptación del virus H4N2 argentino al modelo de pollo, pudiendo replicar y excretarse en este. Así mismo en este estudio se evaluarán los cambios necesarios para dicha adaptación en las proteínas de superficie, hemaglutinina y neuraminidasa, las cuales son responsables del reconocimiento de glico-receptores asociados a la entrada y salida del virus de la célula. 0031 DISTRIBUCIÓN DE HERPESVIRUS BOVINO TIPO 1 (BOHV-1) Y TIPO 5 (BOHV-5) EN EL SISTEMA RESPIRATORIO DE BOVINOS EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS M Marin1, S Quintana2, M Leunda3, S Pérez1, A Odeón3 1 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Rivadavia 1917, C1033AAJ, Buenos Aires, Argentina. 2 Instituto de Análisis Fares Taie, Rivadavia 3331, (7600) Mar del Plata, Buenos Aires, Argentina. 3 Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Estación Experimental Agropecuaria Balcarce, Ruta 226 Km 73.5 (7620), Balcarce, Buenos Aires, Argentina. La información disponible acerca del comportamiento de diferentes alfaherpesvirus con respecto a la invasión del hospedador en los sitios de replicación primaria es escasa. El objetivo de este trabajo fue determinar la distribución viral en el aparato respiratorio de bovinos infectados experimentalmente con Herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) y tipo 5 (BoHV-5) durante la infección aguda, latencia y reactivación viral. Terneros de 1 año de edad se inocularon por vía intranasal con la cepa Cooper de BoHV-1 o la cepa 97/613 de BoHV-5. Grupo 1 (Infección aguda): dos grupos de 2 terneros inoculados con 106.3 DICC50/ml de cada virus; eutanasia: 6 días post-infección (dpi). Grupo 2 (Latencia): dos grupos de 2 terneros inoculados con 103 DICC50/ml; eutanasia: 24 dpi. Grupo 3 (Reactivación): dos grupos de 2 terneros inoculados con 103 DICC50/ml y tratados con dexametasona (DEX) a los 21 dpi; eutanasia: 25 dpi. Grupo 4 (Control): 2 animales no infectados; un ternero recibió DEX. En la necropsia, se tomaron muestras de ganglios retrofaríngeos, bronquiales y mediastínicos, epitelio de mucosa nasal, tráquea y bronquios y lóbulos pulmonares apical, medio y diafragmático. Se extrajo el ADN total de las muestras con kit comercial (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) y la detección del genoma viral se realizó mediante PCR en Tiempo Real con análisis por High Resolution Melting de acuerdo a Marin et al. (2014). El ADN de BoHV-1 fue detectado en 12/18 muestras de terneros infectados agudamente. Las distintas muestras evaluadas resultaron positivas, con excepción de los ganglios mediastínicos. Durante la latencia, el genoma de BoHV-1 se detectó en 2/18 muestras correspondientes a ganglios bronquiales y epitelio traqueal y durante la reactivación viral en 4/18 muestras correspondientes a epitelio de mucosa nasal y tráquea y lóbulo diafragmático del pulmón. El ADN de BoHV-5 fue detectado en 7/18 muestras de terneros infectados agudamente, incluyendo ganglios retrofaríngeos y mediastínicos y epitelio de mucosa nasal, tráquea y bronquios. Durante la latencia o reactivación viral, el ADN de BoHV-5 se detectó sólo en 1/18 muestras, correspondiente a ganglios bronquiales o retrofaríngeos, respectivamente. El ADN viral no se detectó en ninguna de las 18 muestras de animales no infectados. El ADN de BoHV-1 exhibió una amplia distribución en el sistema respiratorio bovino. Como era de esperar, la distribución de BoHV-5 fue más restringida, alcanzando sólo el tracto respiratorio superior. Estos resultados enfatizan la participación de estos tejidos en el síndrome respiratorio causado principalmente por BoHV-1. Luego de la infección primaria, BoHV-1 y BoHV-5 muestran características biológicas similares y por lo tanto necesitan ser considerados en conjunto para el control de la infección por BoHV. Los hallazgos de este estudio contribuyen al conocimiento y comprensión de la distribución tisular de ambos virus y la difusión de los alfaherpesvirus bovinos en el sistema respiratorio. 0035 MAPEO DEL SITIO DE UNIÓN DEL ANTICUERPO MONOCLONAL MAB 3H7 A LA PROTEÍNA NO ESTRUCTURAL 3A DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA (VFA) CM Lotufo, M Wilda, C Seki, NM Mattion, PR Grigera Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. Cesar Milstein, Argentina. Introducción: La fiebre aftosa (FA), causada por el virus de fiebre aftosa (VFA), familia Picornaviridae, es una enfermedad altamente contagiosa y con potencial para generar graves pérdidas económicas en la industria ganadera de animales rumiantes biungulados. La campaña sanitaria de control del VFA implementada en la Argentina (2000-2002), fue enormemente asistida por el test 3ABC-ELISA que detecta anticuerpos reactivos, elaborado nuestro instituto, y utilizado para asistir a la autoridad sanitaria local y regional hasta la actualidad. El genoma del VFA codifica para 4 proteínas estructurales y 8 proteínas no estructurales (NS) todas producidas intracelularmente, y expuestas al sistema inmune del animal. Entre las NS se encuentra la proteína 3A, que se cree juega un papel relevante en la síntesis del ARN viral a través del anclaje del complejo replicativo a membranas intracelulares y está directamente relacionada con el grado de virulencia del VFA. La secuencia de 3A también corresponde al N-terminal de la proteína 3ABC recombinante utilizada por nuestro laboratorio como inmunógeno para generar el MAb3H7, reactivo clave en el desarrollo del test 3ABC-ELISA utilizado para diferenciar animales infectados de vacunados. Objetivo: Nos proponemos mapear el sitio de unión de MAb3H7 a la proteína 3A con precisión de 5-10 aa y utilizar péptidos conteniendo la secuencia del epítope para diversos estudios básicos y aplicados. Entre ellos, el diseño de un 3ABC-ELISA de competencia optimizado en su sensibilidad para detectar actividad anti-3ABC en suero de animales. Metodologías y Resultados: Mapeo de las secuencias reactivas con MAb3H7: se clonó el segmento 3ABC, el cual contiene una mutación puntual en el sitio activo de proteasa que neutraliza la actividad autoprocesadora de 3ABC, en el vector de expresión pET-30A. Se realizaron 7 deleciones secuenciales en el extremo 3' del gen 3ABC utilizando PCR con primers específicos. Los fragmentos fueron clonados en pET-30A y expresados en E.coli BL21. Los correspondientes lisados de expresión fueron evaluados en paralelo por inmunoblot (Western Blot) utilizando como referencia un anticuerpo monoclonal antiproteína 3C, para normalizar los niveles de expresión y el anticuerpo monoclonal MAb3H7, para diferenciar secuencias reactivas y no 111 Libro de resúmenes reactivas. Los resultados muestran con claridad que el Mab3H7 es solo capaz de unirse a la secuencia completa de 3ABC y a ninguno de los fragmentos de 3ABC secuencialmente deletados en su N terminal. Conclusión: Se concluye que el epítope específico reactivo con MAb3H7 mapea en los primeros 20 aa de la proteina 3A. Estos corresponden a la secuencia NH2-ISIPSQKSVLYFLIEKGQH-COOH. Al momento de este informe se esta testeando la actividad de MAb3H7 contra los peptidos 3Apep1 (SIPSQKSVL), 3Apep2 (QKSVLYFLI) y 3Apep3 (YFLIEKGQH) contenidos en la secuencia mencionada con el objeto de precisar el epítope y definir la secuencia a ser usada en un test de ELISA-3ABC de competencia mencionado. 0043 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA PROTEÍNA DE LA CAPSIDE DEL VIRUS DE ARTRITIS ENCEFALITIS CAPRINA DETECTADO EN CABRAS DE ARGENTINA. CJ Panei1 4, A Dellarupe2 4, ML Gos2 4, GE Metz1 4, MS Serena1 4, A Larsen3, CM Galosi1 5, MG Echeverría1 4 1 Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, Argentina. 2 Laboratorio de Inmunoparasitología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, Argentina. 3 Cátedra de Inmunología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, Argentina. 4 CONICET, Argentina. 5 CIC, Pcia Bs As, Argentina. El ELISA y la inmunodifusíon en gel de agar (IDGA) son las técnicas mayormente utilizadas para el diagnóstico de anticuerpos contra el virus de la artritis encefalitis caprina (CAEV) y del virus de maedi visna (MVV). Estas técnicas utilizan como antígenos aquellos producidos con proteínas nativas y también con proteínas recombinantes obtenidas por aislamientos de cabras u ovejas de diferentes regiones o países, debido a que ambas cepas están genética y antigénicamente relacionadas. El gen GAG codifica entre otras proteínas a la proteína de la capside viral (CA), siendo estas proteínas junto con las proteínas producidas por el gen ENV (gp de superficie, SU y gp de transmembrana, TM) la más inmunogénicas. La proteína de la CA es el primer antígeno reconocido por el sistema inmune de los animales y demostró tener reacción cruzada para la detección de CAEV como del MVV. La heterogeneidad antigénica de la CA podría resultar en una falta de sensibilidad si los animales fueron infectados con cepas diferentes a las que son empleadas en la producción de los equipos de diagnóstico. El objetivo de este trabajo fue caracterizar la proteína de la CA del CAEV obtenido de cabras en Argentina evaluando la composición aminoacidica de las regiones más inmunodominantes de la misma. Se extrajo sangre de cuatro cabras sin anticoagulante para la obtención de suero para detectar anticuerpos por IDGA y con anticoagulante para la extracción de ADN. Se amplifico un segmento del gen GAG que codifica para la proteína de la CA con cebadores específicos que corroboran la positividad obtenida previamente por IDGA. Las secuencias nucleotídicas fueron alineadas y traducidas a sus respectivos aminoácidos con el programa Bioedit. Con el programa MEGA 4, se llevó a cabo el análisis filogenético donde se observó el agrupamiento en otro cluster comparadas con aislamientos en otros países (GeneBank numero: CAEV: M33677; AY900630; AGH08193 y MVV: AAA17520). El cambio más significativo estuvo en el epítope de la región más inmunodominante del segmento C-terminal de la proteína donde una lisina fue sustituida por acido glutámico en las cuatro secuencias de Argentina. La caracterización de la proteína de la CA es altamente interesante para el desarrollo de equipos de diagnóstico en nuestro país con la inclusión de cepas locales, lo que permitiría probablemente aumentar la sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de estas virosis. 0044 EL HERPESVIRUS EQUINO 1 INTERFIERE CON LA APOPTOSIS EN CÉLULAS INFECTADAS MR Scrochi1 2 5, ME Bravi1 7, NA Fuentealba1 5, EJ Gimeno3 5, EL Portiansky3 5 , CG Barbeito2 3 5, CN Zanuzzi2 5, CI Muglia4 5, CM Galosi1 6 1 Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, Argentina. 2 Cátedra de Histología y Embriología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, Argentina. 3 Cátedra de Patología General, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, Argentina. 4 IIFP, Facultad Ciencias Exactas, UNLP, Argentina. 5 CONICET, Argentina. Argentina. 7 FONCYT, Argentina. 6 CIC, Pcia Bs As, El Herpesvirus equino 1 (EHV-1) produce signos respiratorios, nerviosos, aborto y síndrome neonatal en equinos, causando importantes pérdidas económicas. En las células la muerte por apoptosis actúa como un mecanismo de protección celular frente a la infección debido a que es un proceso programado con la finalidad de eliminar aquellas células potencialmente peligrosas para el organismo. En otros alphaherpesvirus, se han identificado acciones implicadas con la modulación de la apoptosis, sin embargo ésto no fue aún estudiado en el EHV-1. El objetivo de este trabajo fue evaluar en cultivos de células equinas, el efecto modulatorio sobre la apoptosis, del EHV-1 durante su ciclo de replicación. Se utilizaron células de cultivo primario de riñón equino crecidas con Medio Mínimo Esencial suplementado con glutamina, antibióticos y 10% de suero fetal bovino, infectadas con la cepa AR8 (MOI=10) y recolectadas a las 3, 9, y 18 hs posinfección (pi). Simultáneamente se realizaron controles de inducción a la apoptosis (incubación con sorbitol 1M durante 1 h a 37 °C) y controles negativos (sin tratamiento). La evaluación se realizó mediante tinción con bromuro de etidio y naranja de acridina (BE/NA), para la observación de compactación y fragmentación nuclear; Anexina V/ioduro de propidio por citometría de flujo para la detección de la exteriorización de fosfatidilserina; medición de actividad de caspasa 3 mediante incubación de los lisados celulares con el sustrato fluoregénico específico y determinación de cambios ultraestructurales por microscopía electrónica de transmisión (MET). El análisis por BE/NA determinó que a lo largo de todo el ciclo de replicación viral, el índice de apoptosis fue significativamente menor en los grupos infectados respecto al control positivo de la misma. El análisis de la exteriorización de fosfatidilserina reveló que a las 3 y 9 hs pi el porcentaje de marcación en los grupos infectados fue significativamente menor respecto al grupo 18 hs pi y al control positivo de apoptosis. La evaluación de la actividad de caspasa 3 reveló, en la totalidad de los grupos infectados, valores significativamente menores respecto del control positivo de apoptosis. Por MET se confirmó la presencia de partículas virales y cambios ultraestructurales característicos del proceso apoptótico. Resultados similares fueron encontrados con experiencias en células heterólogas (MDBK). Se concluye que la infección por EHV-1 interfiere con la muerte por apoptosis en las células infectadas durante su ciclo de replicación viral, estrategia utilizada por el virus para asegurar su ciclo de vida. 0046 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL SEGMENTO GENÓMICO 3 DE VIRUS DE INFLUENZA EQUINA DETECTADOS EN LA ARGENTINA C Olguin Perglione1, L Ferreri1, S Tordoya1, S Miño1, M Barrandeguy1 2 1 Instituto de Virología, CICVyA, INTA Castelar, Buenos Aires, Argentina. 2 Escuela de Veterinaria, Universidad del Salvador, Buenos Aires, Argentina. El segmento 3 del genoma del virus de Influenza A (PA) produce un ARNm que codifica una subunidad del complejo ARN polimerasa dependiente de ARN. Análisis filogenéticos previos de este segmento del virus de Influenza equina (VIE) H3N8 demostraron que ha evolucionado en 12 clados distintos. Adicionalmente, este segmento genómico codifica una segunda proteína denominada PA-X. Esta proteína posee 252 aminoácidos (aa) y su región N-terminal de 191 aa, deriva del ORF-O, mientras que la región C-terminal, de 61 aa, deriva del ORF-X, al cual se accede por un desplazamiento del marco de lectura ribosomal. Algunas cepas de Influenza A poseen codones de stop prematuros en el ORF-X, originando proteínas truncadas. Una mutación en la posición +20 del ORF-X presente en algunas cepas VIE H3N8 genera un codón de stop produciéndose una proteína de 220 aa. El objetivo del presente trabajo es evaluar las características moleculares y filogenéticas del segmento genómico 3 de los VIE H3N8 detectados en la Argentina. Se amplificó y secuenció parcialmente el segmento 3 (900 nt) de 22 VIE H3N8 detectados en la Argentina entre 1993 y 2012. Las secuencias obtenidas fueron editadas con el programa BioEdit 7.0.9.0 y alineadas con CLUSTAL_X v.2. El análisis filogenético se realizó mediante el 112 Libro de resúmenes método de Máxima Verosimilitud (MV) utilizando el programa PhyML. El modelo de sustitución de nucleótidos más adecuado fue seleccionado con el programa jModeltest 2.1.6. La secuencia deducida de aminoácidos se obtuvo con el programa BioEdit 7.0.9.0. El análisis filogenético demostró que las cepas aisladas en la Argentina entre 1993 y 2005 (n=15) forman un grupo monofilético distinto de los 12 clados descriptos previamente, denominado Sudamericano mientras que las cepas detectadas en el año 2012 (n=8) agrupan dentro del Florida clado 1 detectado también en otras regiones del mundo. La secuencia deducida de aminoácidos de la PA-X reveló un polimorfismo en las cepas circulantes entre 1997 y 2005 (n=9). La presencia de un codón de stop prematuro de la posición +30 del ORF-X debida a una mutación de nucleótidos sin sentido CGA (Arginina) por TGA (Stop), resulta en una proteína más pequeña de 230 aa. Las cepas aisladas entre 1993 y 1995 y las del año 2012 (n=13) presentan la proteína PA-X completa de 252 aa. Las cepas detectadas en la Argentina durante el periodo 1993-2005 se agrupan en un clado único: Clado Sudamericano, indicando que existió circulación regional, sin introducción de virus de otras regiones, durante ese período. Por el contrario, los virus detectados en el año 2012 se agrupan con los del Florida clado 1, demostrando la introducción de una cepa diferente de virus, probablemente debido al movimiento internacional de caballos con fines de competencia o reproducción. Si bien han sido descriptas mutaciones en el ORF-X que generan codones de stop, la mutación en la posición +30 detectada en algunas cepas Argentinas, no había sido observada previamente. 0047 ANÁLISIS FILOGENETICO Y FILODINAMICO DE CEPAS DE VIRUS DE INFLUENZA EQUINA (H3N8) CIRCULANTES EN ARGENTINA EN LOS ULTIMOS 30 AÑOS C Olguin Perglione1, MD Golemba2, M Barrandeguy1 3 1 Instituto de Virología, CICVyA, INTA Castelar, Buenos Aires, Argentina. 2 Hospital de Pediatría S.A.M.I.C. "Prof. Dr. Juan P. Garrahan", Buenos Aires, Argentina. 3 Escuela de Veterinaria, Universidad del Salvador, Buenos Aires, Argentina. La Influenza equina es producida por el virus de Influenza A subtipo H3N8. Debido a su rápida diseminación, es considerada la enfermedad respiratoria de mayor importancia económica en equinos. Análisis filogenéticos demostraron que el virus de Influenza equina (VIE) H3N8 ha evolucionado en 12 clados diferentes desde su primera detección en 1963. Objetivo: Estimar el origen y diversificación genética de los VIE H3N8 detectados en Argentina en los últimos 30 años. Se secuenció el gen completo de la Hemaglutinina (HA) de 19 VIE H3N8 detectados en Argentina entre 1993 y 2012. Las secuencias obtenidas fueron analizadas por métodos filogenéticos junto a secuencias de Argentina previamente publicadas y 143 secuencias de referencia obtenidas del “Influenza Research Database”. El tiempo del ancestro común más reciente (tMRCA) y la historia demográfica se estimaron mediante análisis de coalescencia. El análisis filogenético reveló la existencia de dos grupos adicionales a los 12 grupos descriptos previamente: Sudamericano clado 1 (SA1) y 2 (SA2). Los VIE H3N8 circulantes en Argentina durante el período 19852012 se agruparon en 4 clados independientes de distinto origen. Los VIE que circularon en el año 1985 (n=2) junto a un virus aislado en Chile en el mismo año forman un clado denominado grupo VIII, cuyo origen no pudo ser estimado. Los virus detectados entre 1993-1996 (n=5) forman un grupo monofilético denominado SA1, cuya secuencia ancestral es una cepa de Kentucky de 1992. Las cepas detectadas entre 1997 y 2005 (n=8) junto a una cepa aislada en Chile en el año 2006 forman el sublinaje SA2. El origen de este grupo podría ser una cepa de California de 1997 o de Kentucky de 1994. Por último, los virus detectados en el año 2012 (n=6) se agrupan con los de Florida clado 1 y su origen podría ser una cepa de Florida del 2011. Para el grupo VIII el tMRCA fue estimado en 1984, mientras que para los grupos SA 1, 2 y Florida clado 1 fue en 1992, 1997 y 2011 respectivamente. La dinámica poblacional obtenida con 143 secuencias de referencia y 21 argentinas hasta el año 2005 fue similar a la descripta previamente, manteniéndose constante, excepto entre 1981 y 1988 que se observó una disminución en la diversidad genética. En el año 2006, se observó un aumento pronunciado de la diversidad genética relativa, seguido de una leve disminución en 2007 que se hizo más intensa en 2009. El origen polifilético de las secuencias de Argentina sugiere que los brotes ocurridos en el país en los últimos 30 años han sido producto de múltiples introducciones del virus, probablemente a través de caballos subclínicamente infectados, provenientes de distintas regiones del mundo. El aumento de la diversidad genética observada en 2006 podría deberse a la co-circulación de cepas de linajes diferentes, mientras que la abrupta disminución de la diversidad genética observada a partir del año 2009 podría estar relacionada con la inclusión de cepas del linaje Florida clado 2 en las vacunas. 0052 CARACTERISTICAS DIAGNOSTICAS DE UN ELISA DUAL “IN HOUSE” PARA EL CONTROL EPIDEMIOLOGICO DE LA LEUCOSIS ENZOOTICA BOVINA A Larsen1, S Corva2, CJ Panei3, A Valera4, E Mortola1 1 Cátedra de Inmunología Veterinaria, Fac. de Cs. Veterinarias UNLP, Argentina. 2 Curso de Epidemiología Básica, Fac. de Cs. Veterinarias UNLP, Argentina. 3 CONICET, Argentina. 4 Cátedra de Virología, Fac, de Cs. Veterinarias UNLP, Argentina. La Leucosis Enzootica Bovina (LEB) se caracteriza por un largo periodo de latencia, sin viremia detectable aunque los animales infectados presentan una respuesta humoral persistente, dirigida hacia las dos proteínas estructurales más inmunogénicas del virus: gp51 y p24. A la fecha no existe un relevamiento integral que arroje un valor de prevalencia representativo y real de la situación epidemiológica en nuestro país. Para tal fin, se hace necesario contar con herramientas de diagnóstico cada vez más sensibles, específicas y económicamente factibles de realizar en grandes poblaciones de animales. Este trabajo tiene como objetivo evaluar el potencial diagnóstico de las proteínas recombinantes gp51y p24 del virus de la leucosis bovina en conjunto, como antígeno diagnóstico para un ensayo de ELISA indirecto, siguiendo las directivas del Manual de Pruebas de Diagnóstico y Vacunas para los Animales Terrestres (OIE, 2009). Para determinar la performance de nuestro ELISA dual se buscó definir la sensibilidad (SD) y especificidad (ED) diagnostica de la misma, para esto contamos con un grupo de individuos correctamente clasificados en su estatus sanitario por una prueba de referencia. En nuestro estudio se analizaron un total de 92 sueros. El análisis estadístico (Stata SE 11 y TG-ROC) arrojó el valor de sueros correctamente clasificados más alto en 92.39%. Para el valor de corte de 0.3 la sensibilidad fue de 95.35% y la especificidad del 89.80%. Para el valor de corte de 0.5 la sensibilidad fue de 88.37% y la especificidad del 95.35%. El coeficiente de Repetibilidad fue del 12%. Del análisis de los resultados podemos concluir que nuestro ELISA dual podría ser considerado como una alternativa válida a las pruebas existentes para el diagnóstico de LEB. Sin embargo se deberían analizar un mayor número de muestras para convalidar los valores preliminares obtenidos en este estudio y darle robustez a esta sugerencia. 0079 VARIABILIDAD GENÉTICA DEL VIRUS DE LA LEUCOSIS BOVINA EN GANADO LECHERO HOLSTEIN DE ANTIOQUIA, COLOMBIA. C Úsuga Monroy, A López Herrera Grupo Biodiversidad y Genética Molecular “BIOGEM”, Departamento de Producción Animal, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín., Colombia. El Virus de la Leucosis Bovina (BLV) es un retrovirus inmunosupresor que afecta principalmente al ganado de leche, se caracteriza por ser de alta morbilidad y está ampliamente distribuido en el mundo. La célula blanco de BLV son los linfocitos B en los cuales integra su genoma infectando a los bovinos de por vida. Las técnicas moleculares y herramientas bioinformáticas han permitido aislar el genoma del virus y caracterizarlo dentro de 8 genotipos. El gen env viral codifica para la proteína de superficie gp51 que hace parte de la envoltura del virus, este gen está altamente conservado por lo cual se ha usado para realizar análisis filogenéticos. El objetivo de este trabajo fue identificar 113 Libro de resúmenes el nivel de variabilidad genética del BLV que está circulando en los hatos lecheros del departamento de Antioquia, Colombia. Se extrajo el DNA de 500 vacas Holstein pertenecientes a diferentes municipios del departamento de Antioquia, Colombia (Bello, Belmira, Entrerrios, Medellín, San Pedro). Se realizó una PCR anidada para amplificar un fragmento de 444 pb del gen env y se encontró una prevalencia molecular del 44%. El producto de la PCR fue de ocho aislamientos que se enviaron a secuenciar, los municipios de Belmira y Medellín contaban con doble muestra secuenciada. Las secuencias nucleotídicas de las muestras fueron comparadas con 27 secuencias del gen env viral pertenecientes a diferentes regiones geográficas las cuales están registradas en el GeneBank. El análisis filogenético se realizó por medio del algoritmo de distancia Neighbor Joining (NJ) con el programa MEGA® V6. Se encontraron dos genotipos circulantes en el departamento de Antioquia, el genotipo más frecuente fue el 1 para todos los municipios evaluados y las muestras de Colombia se agruparon con secuencias de USA, Argentina y Japón; de otro lado una de las 2 muestras del municipio de Belmira fue clasificada como genotipo 3 y se agrupo con muestras de USA de este genotipo. El análisis filogenético permitió establecer la diversidad genética del BLV en el departamento de Antioquia, indicando que dicha diversidad es alta ya que dentro de un mismo municipio se pueden encontrar diferentes genotipos. El genotipo que circula con mayor frecuencia es el 1, sin embargo esta es solo una aproximación ya que más hatos deben ser evaluados para elucidar con mayor precisión la variabilidad genética del BLV en Colombia. 0080 CARACTERIZACIÓN HISTOLÓGICA Y MOLECULAR DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA HEPATITIS E EN CERDOS BENEFICIADOS EN ANTIOQUIA, COLOMBIA. A López-Herrera1, J Forero1, JE Parra1, G Correa1, B Rodríguez2, LA Gutiérrez3 1 Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, Colombia. 2 Universidad de Antioquia, Colombia. 3 Universidad Pontificia Bolivariana, Colombia. El virus de la Hepatitis E es un virus zoonótico del cual el cerdo es considerado uno de sus reservorios principales. En cerdos la infección se presenta de forma asintomática, pero pueden presentarse lesiones hepáticas inflamatorias leves a moderadas, con infiltración de linfocitos y degeneración vacuolar. En diferentes paises se ha reportado evidencia serológica y molecular de la presencia del VHE en cerdos en edad de beneficio y en hígados comercializados en expendios de carne. Con el objetivo de describir las características moleculares e histológicas de la infección en cerdos colombianos, se analizaron 300 muestras de hígados provenientes de las principales plantas de beneficio de Antioquia, principal departamento productor de carne de Cerdo de Colombia, y se sometieron a evaluación histológica, inmunohistoquímica y de detección del genoma del VHE. El análisis histológico mostró que el 59.67% de los cerdos presentaban hepatitis de interfase y el 43.67% presentaban lesiones en grado 2. El 37.28% y 23.69% de las muestras de hígados fueron positivas para la detección del genoma de VHE por PCR anidada del ORF1 y el ORF2 respectivamente; y el 41.41% fue positivo para la detección del antígeno ORF3 por inmunohistoquímica. Se observó una asociación estadísticamente significativa entre la presencia de lesiones hepáticas y la detección del genoma viral, pero no para la detección del antígeno ORF3 por inmunohistoquímica. La presencia del genoma viral y de antígenos del VHE en hígados de cerdos en edad de beneficio sugiere un riesgo tanto para la salud pública como para la inocuidad en la cadena de producción. Es importante realizar investigaciones futuras para determinar el efecto de la infección con VHE y de las lesiones hepáticas en los cerdos con relación a los parámetros productivos en estos animales 0084 CAMBIOS MOLECULARES A NIVEL DE LA RESPUESTA INMUNE LOCAL ANTE LA INFECCIÓN EXPERIMENTAL POR HERPESVIRUS EQUINO 1 EN EL MODELO RATÓN BALB/C. ME Bravi1 7, GH Sguazza1, MR Scrochi1 2 4, NA Fuentealba1 4, F Nishida3, L Orsini Delgado4 6, P Smaldini4 6, G Docena4 6, CG Barbeito2 3 4, CI Muglia4 6 , CN Zanuzzi2 3 4, CM Galosi1 5 1 Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata, Argentina. 2 Cátedra Histología y Embriología, FCV, UNLP., Argentina. 3 Cátedra de Patología General. Laboratorio de Análisis de Imágenes, FCV, UNLP., Argentina. 4 CONICET, Argentina. 5 CIC Pcia de Buenos Aires, Argentina. 6 Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos, Facultad Ciencias Exactas, UNLP, Argentina. 7 FONCyT, Argentina. El Herpesvirus equino 1 (EHV-1) es un patógeno endémico que genera pérdidas económicas en la industria hípica. Produce signos respiratorios, nerviosos, abortos y síndrome neonatal. Si bien aún no han sido dilucidados todos los aspectos sobre la patogenia del aborto, esta presentación requiere del establecimiento de una fase virémica que permita la llegada del virus al útero. Como se ha demostrado en otros procesos infecciosos, nuestra hipótesis es que la infección modifica el perfil de citoquinas uterinas hacia un predominio de aquellas que pueden determinar la interrupción de la preñez. La mayoría de las investigaciones relacionadas con el aborto por EHV-1 han sido realizadas utilizando el modelo murino BALB/c, que permite obtener datos completos, comparables y extrapolables al equino. El objetivo de este trabajo fue analizar cambios a nivel de la respuesta inmune local en úteros al día 3 posinfección (tiempo seleccionado según ensayos previos en los que hemos estandarizado el momento óptimo para los análisis histopatológicos, inmunohistoquímicos y moleculares) que podrían intervenir en la interrupción de la gestación en hembras desafiadas con el virus por vía intranasal. Todos los estudios del presente trabajo se realizaron comparativamente con ratonas controles inoculadas con medio de cultivo. Se cuantificó además el ARNm, por PCR en tiempo real (qPCR), de los genes que codifican para IL-10, TNF e IFN-γ utilizando primers específicos/SYBR green. Por ELISA (IFN-γ e IL13) y por Citometría de Flujo (CBA, Becton Dickinson) (TNF) se midieron los niveles de expresión de las proteínas producidas. Para la realización de estas últimas técnicas las muestras se homogenizaron y se trataron con inhibidor de proteasas. En la necropsia se observó que el número de unidades fetoplacentarias en los animales infectados fue menor que la media para la cepa utilizada pudiendo indicar el suceso del aborto. La cuantificación relativa por qPCR expresada como 2-∆∆Ct (cantidades en número de veces con respecto al calibrador de βactina) indicó diferencias del grupo infectado respecto al control, para los genes amplificados. La diferencia de expresión de las citoquinas, analizada por la prueba de T de Student indicó diferencias significativas. Se concluye que hay un aumento de TNF que indica un fuerte incremento de respuesta Th1 y aumento de IFN-γ que concuerda con una infección viral. Además el aumento moderado de IL-10, de respuesta Th2 y tolerogénica, podría atribuirse a una respuesta para restaurar el balance homeostático ante la infección. Este estudio fue financiado por el FONCYT (PICT 2011-1123), CIC Pcia. de Bs As y Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional de La Plata (Proyecto 11V221). 0085 VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA DE LAS PRINCIPALES VIROSIS QUE AFECTAN A LAS POBLACIONES DE CERDOS SILVESTRES (SUS SCROFA) EN DISTINTAS ZONAS DE LA REPÚBLICA ARGENTINA MS Serena1 10, MC Artuso2, A Pérez3, MG Echeverría1 10, Y Laksman3, G Arocena2, D Pereyra2, E Escobar2, HR Sanguinetti4, C Zenobi4, MF Suarez5, RT Debenedetti5, A Marcos6, P Borras6, G Castresana7, P Rojas7, M Monterubbianesi6, J Grant8, B Carpinetti9 1 CONICET, Argentina. 2 Departamento de Biología Molecular-DILABSENASA, Argentina. 3 Departamento de Enfermedades Porcinas DILABSENASA, Argentina. 4 Departamento de Patología DILAB-SENASA, Argentina. 5 Departamento de Enfermedades Exóticas DILAB-SENASA, Argentina. 6 Programa de Porcinos DNSA-SENASA, Argentina. 7 Dirección de Áreas Naturales Protegidas, Organismo Provincial para el Desarrollo Sostenible de la Provincia de Buenos Aires, Argentina. 8 114 Libro de resúmenes Centro Regional Buenos Aires Sur, SENASA, Argentina. 9 Instituto de Ciencias Sociales y Administración - Universidad Nacional Arturo Jauretche, Argentina. 10 Cátedra de Virología FCV-UNLP, Argentina. La población de cerdos salvajes en Argentina ha aumentado considerablemente en los últimos tiempos. El jabalí es una de las especies de la fauna de mayor relevancia sanitaria para la salud del hombre y de los animales domésticos debido a su amplia distribución geográfica y su abundancia creciente. Está reconocido que actúan como reservorios móviles de una serie de enfermedades. Entre las enfermedades reportadas se encuentran la Brucelosis, Enfermedad de Aujeszky (EA), Peste Porcina Clásica (PPC), Peste Porcina Africana (PPA), Triquinellosis y Tuberculosis. El objetivo de este trabajo fue evaluar la presencia y distribución de las principales virosis de origen porcino y la determinación de los agentes actuantes en cerdos silvestres de la Bahía de Samborombón en Buenos Aires, Quemú Quemú en La Pampa y Villa Huidobro en Córdoba. Durante 2013 y 2014 se tomaron muestras de 157 jabalíes y cerdos silvestres. La modalidad de obtención de las muestras fue diferente según la zona, en Bahía de Samborombón se realizó la captura de los animales y en Quemú Quemú y Villa Huidobro se realizó la toma de muestras en torneos de caza. Durante el 2014 se extrajeron las cabezas de los animales para la identificación en el laboratorio del virus de la EA a partir de cerebro, ganglio trigémino, bulbo olfatorio y tonsila. Las muestras de suero fueron analizadas para la búsqueda de anticuerpos contra el Virus del Síndrome Respiratorio Reproductivo Porcino -PRRSV(ELISA), PPC (ELISA), PPA (ELISA), Fiebre aftosa (VIAA) y EA (ELISA y VN). Las muestras de cerebro fueron procesadas para el aislamiento viral utilizando células RK13 y las muestras de tonsila y bulbo olfatorio fueron procesadas para identificar el mismo agente por PCR. El 100 % de los animales analizados resultaron negativos a las pruebas serológicas para PRRS, PPC, PPA y Fiebre aftosa. Mientras que para el caso de la EA 62 animales resultaron con serología positiva, lo que representa un 39,49 %. Hasta el momento, las muestras de cerebro de 8 animales de un total de 23 muestras colectadas fueron procesadas para el aislamiento viral; luego de siete días de incubación no se observó efecto citopatogénico compatible con el virus sobre las células inoculadas. Por la técnica de PCR se identificaron 13 muestras positivas. Este estudio es el primero que analiza el estado sanitario de los cerdos salvajes con respecto a las principales virosis que afectan a los porcinos. Teniendo en cuenta que estos animales representan un peligro sanitario para la salud del hombre y de los animales domésticos y que el impacto económico de las enfermedades que los afectan es muy importante, deben ser contemplados dentro de los planes sanitarios llevados a cabo por las distintas agencias del estado. Los resultados obtenidos aportan al sistema de vigilancia y alerta temprana los elementos necesarios para evaluar, a futuro, los riesgos que podría representar para la producción animal las poblaciones de cerdos silvestres como reservorio de distintas enfermedades que afectan a la actividad. 0093 ACTIVACIÓN DE CASPASAS POR EL VIRUS DE ARTERITIS EQUINA EN CÉLULAS RK13 GE Metz1, I Galindo2, MM Abeyá1, MG Echeverría1, C Alonso2 1 Virología. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional de La Plata. La Plata-Buenos Aires, Argentina., Argentina. 2 : Laboratorio interacción virus-célula. Dpto. de Biotecnología, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria. Madrid, España., España. La activación del mecanismo de apoptosis durante la infección del virus de arteritis equina (VAE) ha sido demostrada in vitro en cultivos celulares. Se ha encontrado activación de caspasas, degradación del ADN genómico y demás indicadores moleculares tanto en cultivos de células Vero y Baby Hamster Kidney 21(BHK21). Mientras que la vía intrínseca de apoptosis (caspasa 9) ha sido detectada en ambas líneas celulares, la detección de la caspasa 8 indicativa de la vía extrínseca, solo ha sido detectada en células Vero. La línea celular Rabbit Kidney 13 (RK13) es otra línea celular de elección para los ensayos in vitro con este virus y en la cual no existen reportes sobre la activación de la apoptosis. Esta línea celular es uno de los modelos celulares más utilizados tanto para el aislamiento viral como para el diagnóstico serológico mediante la técnica de neutralización viral, por lo cual es de nuestro interés estudiar y caracterizar el mecanismo de apoptosis en este modelo celular. El objetivo de nuestro trabajo es analizar si existe activación de la apoptosis en esta línea celular debida a la infección viral, empleando la caspasa 3 efectora como indicadora de este proceso. Para ello, una monocapa de células RK13 fue infectada con el virus de arteritis equina utilizando una multiplicidad de infección (MOI) inicial de 0,1 y un tiempo de infección (TOI) de 24 horas (h). Empleando un kit comercial fluorimétrico (Sigma) y un control positivo de activación de caspasa 3 inducido con Staurosporina comercial, nuestro análisis reveló un incremento del doble respecto al mock y de la mitad respecto al control positivo en el cultivo infectado con el VAE. Una vez corroborada la activación de la caspasa 3, se estudió el efecto de diferentes MOI (0,1, 0,25, 0,5, 1, y 5) a igual TOI (24 h). En este ensayo se detectó un aumento de los niveles de caspasa al aumentar la MOI alcanzando valores 2,5 veces superior al control empleando MOI=5. Para realizar una cinética de activación de caspasa 3 a distintos tiempos (4 h, 6 h, 16 h, 24 h, 48 h y 72 h), se seleccionaron las MOI de 0.25 y 1. Para la MOI de 0.25 se detectaron niveles significativos de caspasa a las 24 h con un pico de activación a las 48 h; mientras que para una MOI de 1, los primeros indicios de activación fueron a las 16 h y el pico máximo a las 24 h postinfección. A fin de determinar si existe activación de la vía extrínseca en esta línea celular, se usó un kit comercial colorimétrico (Biovisión) para detectar caspasa 8. Utilizando el inhibidor del proteosoma MG132 como control positivo de inducción, y condiciones de experimentación de MOI=1 y TOI =24 h, se logró determinar la activación de esta caspasa en el cultivo de células RK13 tras la infección por el VAE. En este trabajo se logró establecer la activación del mecanismo de apoptosis mediante la detección de la caspasa 3, así como la activación de la vía extrínseca (caspasa 8) en la infección experimental de células RK13 con el virus de arteritis equina. 0095 PRESENCIA DE VARIANTE GENÉTICA DEL VIRUS BRONQUITIS INFECCIOSA EN CUADROS DE ALTA MORTALIDAD DE AVES COMERCIALES EN EL CENTRO-ESTE DE ENTRE RIOS FS Vera1, HA Gamero2, M Plano2, MV Terrera3, CI Balette3, M Fabeiro3, MF Rojas1 1 Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Estación Experimental Agropecuaria Concepción del Uruguay., Argentina. 2 Empresa Granja Tres Arroyos, Argentina. 3 Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria. Dirección de Laboratorio Animal., Argentina. La Bronquitis infecciosa aviar (BIA) es una enfermedad altamente contagiosa que ocasiona cuantiosas pérdidas económicas por aumento de la mortalidad y alteración en los indicadores productivos. Es producida por un Coronavirus. Al igual que muchos otros virus ARN, tiene una alta tasa de error durante la transcripción de sus genomas (Lai y Cavanagh, 1997), circunstancia que favorece la presentación de variantes virales. La enfermedad presenta una distribución mundial. Se informó por primera vez en Argentina en 1965 (Polero B. J. y Smitsaart T. 1965) y en el año 2009 se realizó la caracterización genética de diferentes aislamientos locales (Rimondi et al. 2009). A fines del año 2012 un incremento de la incidencia de la enfermedad en la región centro-este (CE) de Entre Ríos, con alta mortalidad en lotes de aves vacunadas con cepas tipo Massachusett y Connecticut demando la investigación de presencia de variantes genéticas que ocasionan dicho cuadro. El objetivo del presente trabajo es caracterizar genotípicamente virus de Bronquitis infecciosa presentes en cuadro de alta mortalidad. La presencia del virus de Bronquitis infecciosa (IBV) en brotes de la enfermedad ha sido confirmada a través de pruebas de RTPCR, y la caracterización genotípica se realizó por análisis filogenético de la región hipervariable del gen S del virus. En el estudio se incluyeron un pool de órganos de aves enfermas como muestra de los establecimientos afectados y pertenecientes a diferentes empresas que comparten la región problema. De un total de 64 muestras tomadas y confirmadas por técnicas moleculares, se logró secuenciar 58 aislamientos genómicos. El análisis filogenético muestra que el 98% de 115 Libro de resúmenes los aislamientos resultaron agrupar en el cluster A, soportados con un valor de bootstrap de 97. Este cluster presenta como cepa de referencia a los aislamientos chinos denominados Q1, J2 y T3 (variantes de IBV). En tanto, el 2% restante agrupo con cepas vacunales del tipo Connecticut, soportados con un valor de bootstrap de 88 (según la clasificación realizada por Rimondi et al., 2009). Conclusión: Se ha logrado caracterizar genéticamente aislamientos genómicos provenientes de brotes de BIA de la región CE de Entre Rios. Dicha caracterización resulto en la emergencia de virus variante genéticamente relacionado con aislamientos del tipo Q1, cepa involucrada en otros países con brotes de la enfermedad con alta mortalidad (Yihai Jiang et al. 2001, López et al. 2006). 0097 DETECCIÓN DE VIRUS QUE AFECTAN A LAS ABEJAS DURANTE EL PERIODO 2009-2014 RS Castilla1, FJ Reynaldi1 2, GH Sguazza1, MRI Pecoraro1, CM Galosi1 3 1 Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, Argentina. 2 CCT-CONICET La Plata, Argentina. 3 CIC, Pcia Bs As, Argentina. Históricamente, la República Argentina siempre ha ocupado los primeros puestos tanto en la producción como en la exportación mundial de miel, con una producción media anual de 70.000 toneladas, de la cual se exporta alrededor del 95% por un valor aproximado de 110 millones de dólares. Las abejas (Apis mellifera), son afectadas por una gran cantidad de enfermedades infecciosas incluyendo virus, bacterias, hongos, protozoos y nematodos, que impactan sobre la producción de miel ya que reducen la población de las colonias infectadas. En los últimos 50 años se han aislado, caracterizado y descrito más de 18 virus, la mayoría son virus ARN de simple cadena positiva, comúnmente denominados Picorna-like virus. Estos virus presentan una distribución cosmopolita, habiéndose detectado en todos los continentes. Estudios previos realizados en nuestro país han evidenciado la presencia de diversos virus: el Virus Israel de la Parálisis Aguda (IAPV) que causa sintomatología neurológica caracterizado por abejas temblorosas, el Virus de las Alas deformadas (DWV) que genera malformaciones en las alas de las abejas, el Virus de la Parálisis Crónica (CBPV) que provoca problemas neurológicos, el Virus de la Cría Ensacada (SBV), que ataca a las larvas de las abejas deteniendo su desarrollo en estado de pupa, el Virus de las Celdas Reales Negras (BQCV) con sintomatología similar a SBV pero exclusiva de celdas reales de abejas reinas y el Virus de la Parálisis Aguda (ABPV) que presenta sintomatología neurológica. El objetivo de este trabajo fue el de estudiar la presencia de estos virus en colmenas de producción en las principales regiones apícolas de la República Argentina (Zona de Buenos Aires, Zona Centro, Zona del Litoral y Zona Patagónica) en el periodo 2009-2014, utilizando una técnica de multiplex RT-PCR previamente desarrollada en nuestro laboratorio. Los resultados obtenidos indicaron que DWV fue virus con mayor presencia en las muestras procesadas (19.75%), seguido por IAPV (12.89%), SBV (12.60%), BQCV (8.32%), CBPV (6.03%) y ABPV (3.53%). Se evidenció una notoria fluctuación en la frecuencia de aparición de ciertos virus de un año a otro. Se encontró una menor presencia viral en algunos años, probablemente debida a un control más eficaz del acaro Varroa destructor, que ha sido reportado como uno de los principales vectores para ciertos virus de abejas especialmente DWV. Es importante destacar que el alto porcentaje de DWV hallado, aun en colmenas asintomáticas, podría constituir un serio problema de producción ya que este virus ha sido relacionado con el Síndrome de Despoblamiento de Colmenas. Estos resultados amplían los conocimientos relacionados a las enfermedades virales que afectan la producción apícola y junto con otros estudios que se están desarrollando en nuestro laboratorio, se determinará el verdadero impacto sanitario que tienen estos virus con el fin de generar medidas de control que puedan evitar pérdidas económicas en la producción. 0100 ANÁLISIS PRELIMINAR DE LAS PROPIEDADES INMUNOGÉNICAS DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN Y LA HEMAGLUTININA DEL VIRUS DE DISTEMPER CANINO OBTENIDAS EN FORMA RECOMBINANTE EN LA LEVADURA PICHIA PASTORIS MA Tizzano1, GH Sguazza1, NA Fuentealba1 2, LD Picotto2, CM Galosi1 3, MRI Pecoraro1 1 Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, Argentina. 2 CCT-CONICET La Plata, Argentina. 3 CIC, Pcia Bs As, Argentina. El virus de Distemper canino (CDV), un morbillivirus de la familia Paramixoviridae, produce infecciones agudas y frecuentemente mortales en todos los miembros de las familias Canidae, Mustelidae, Procyonidae y en grandes felinos. La enfermedad se controla por vacunación con vacunas inactivadas, atenuadas o modificadas genéticamente. Los componentes antigénicos más importantes son dos glicoproteínas que se encuentran en la superficie del virión, la hemoaglutinina (H) y la proteína de fusión (F). La función de la H es la de producir la unión del virus con el receptor que se encuentra en la membrana plasmática celular. La proteína F media la fusión del virus con la célula huésped o entre una célula infectada y sus adyacentes favoreciendo así la diseminación del mismo. Estudios in vivo demostraron que los anticuerpos (Ac) contra proteína F y proteína H son de suma importancia en la prevención de la diseminación de la infección y en el desarrollo de la enfermedad, por lo se las considera como uno de los componentes principales en la formulación de la vacuna. El objetivo de este trabajo fue el de evaluar la capacidad inmunogénica de la proteínas H y la F expresadas en la levadura P.pastoris, para su posible utilización en el diagnóstico o la prevención del CDV. Para la expresión de H y F, se clonaron los fragmentos de PCR homónimos en el vector de expresión pPIC9. Los genes H y F quedaron bajo el promotor Aox1 y fusionados a una secuencia de exportación. Con los plásmidos obtenidos pPIC9-H y pPIC9-F se transformaron las levaduras P.pastoris GS115. Luego se seleccionaron los clones recombinantes y se realizaron ensayos de expresión en cultivos líquidos tipo “batch”. La expresión de la proteínas H y F recombinantes (Hrec y Frec) en las levaduras, se chequeó por SDS PAGE / Western blot utilizando un suero policlonal para su detección. Posteriormente las proteínas recombinante expresadas y exportadas al medio de cultivo, se purificaron por precipitación selectiva con NH4SO4. A continuación se inocularon en ratones Balb/c solas y combinadas. Se realizaron 3 inoculaciones por vía intramuscular, utilizando Specol como adyuvante para la primera inoculación. La producción de Ac específicos contra Hrec y Frec se evidenció por western blot, para lo cual se utilizaron células VERO infectadas con CDV. Posteriormente se realizaron ensayos de virus neutralización con los sueros específicos obtenidos para determinar su capacidad de neutralizante in vitro. Los resultados obtenidos demostraron que la Hrec y Frec fueron sintetizadas y exportadas al medio de cultivo. Cabe destacar además que fueron reconocidas específicamente por el Ac policlonal utilizado. Además, al ser inoculadas en ratones, indujeron anticuerpos que reconocieron específicamente a proteína homónima de origen viral. Por otra parte esos anticuerpos obtenidos fueron capaces de neutralizar al virus in vitro 0101 DETECCIÓN DE ANIMALES PERSISTENTEMENTE INFECTADOS CON EL VIRUS DE LA DIAREA BOVINA EN SUERO MEDIANTE UN METODO SEROLÓGICO DE ALTO RENDIMIENTO M Trotta1, M Lavoria1, ME Quintana2, D Malacari1, F Gonzalez1, N Cardoso2, A Capozzo2 1 INTA, Instituto de Virología, Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronómicas., Argentina. 2 Consejo Nacional de Investigaciones Científico y Técnicas (CONICET)., Argentina. El virus de la diarrea viral bovina (VDVB) es uno de los patógenos más comunes de los bovinos en el mundo que ocasiona considerables pérdidas económicas en la industria ganadera. Una de las claves en el control del VDVB es la identificación y eliminación de los animales persistentemente infectados (PI), que son inmunotolerantes al virus y mantienen su circulación en los rodeos. Los animales PI se diagnostican 116 Libro de resúmenes por ausencia de anticuerpos séricos anti-VDVB y presencia de antígeno en sangre mediante aislamiento viral, detección de genoma (RT-PCR), o identificación de antígenos virales por ELISA (en células sanguíneas o epitelio auricular). Sin embargo, la muestra mayormente remitida a laboratorios de diagnóstico nacionales es suero, donde los antígenos virales se encuentran en baja concentración, siendo prácticamente indetectables por estas técnicas. Nuestro objetivo ha sido desarrollar una metodología altamente sensible y específica para la detección de animales PI basada en FALELISA (Filtration Assisted Luminometric ELISA). Esta plataforma utiliza placas con base de filtro de polivinilidenofluoruro a las que se fija un anticuerpo anti- VDVB. Las muestras son filtradas por vacío a través de los pocillos donde la captura retiene los antígenos virales y se descartan los contaminantes que pueden interferir con las reacciones de detección. Se pueden filtrar 50ml de muestra por pocillo, por lo que se detecta virus aunque esté en baja concentración y en volúmenes grandes de muestra. La presencia de antígeno viral se revela con un monoclonal anti-VDVB conjugado con peroxidasa y luminol, lo que incrementa la sensibilidad. Se establecieron las condiciones de captura y revelado. Mediante diluciones de stocks virales se calculó el límite de detección de la técnica, siendo 100 veces más sensible que los ELISAs comerciales. La sensibilidad resultó equivalente al contaminar experimentalmente muestras de suero con cantidades conocidas de antígeno viral. Resultados preliminares utilizando muestras pareadas de suero, sangre entera y epitelio auricular indican que el FAL-ELISA puede detectar antígeno viral en todas estas muestras con alta sensibilidad, siendo más eficiente con suero bovino. Actualmente, se está realizando la validación del ensayo. Esta técnica posibilita una detección rápida y eficaz de animales PI, permitiendo realizar relevamientos en los rodeos utilizando pool de sueros, facilitando el manejo sanitario y por ende, el control de la enfermedad. 0122 ANÁLISIS DE TRANSCRIPTOS DEL GEN ASOCIADO A LA LATENCIA EN HERPESVIRUS BOVINO TIPO 5 CA Silvestro, AC Bratanich Facultad de Ciencias Veterinarias - UBA, Argentina. Herpesvirus bovino tipo 1 y 5 (BoHV-1 y BoHV-5) son alfa-herpesvirus que afectan la industria ganadera y se caracterizan por generar latencia en ganglios sensoriales. El gen Relacionado a la Latencia (LR) es el único transcripto hallado en BoHV-1 durante la latencia, y posee acción antiapoptótica durante la infección aguda y la reactivación pero se desconoce si LR5 comparte esta función acción. En BoHV-1 esta actividad esta mediada por un producto del LR de 180 aminoácidos (ORF-2). En todas las cepas de BoHV-5 secuenciadas hasta el momento ORF-2 sólo comparte 52 aminoácidos con la versión del tipo 1 debido a una señal de stop. El objetivo de este trabajo fue el estudio de los transcriptos producidos durante la infección lítica en BoHV-5. Para ello se infectaron células MDBK con la cepa 663 de BoHV-5 (MOI 1) de las cuales se extrajo ARN con Trizol 24 horas después. Previo tratamiento del ARN con RQ1 DNAsa (Invitrogen) para eliminar el ADN contaminante, se realizo una reacción de RT-PCR con el kit One Step (Qiagen) y primers diseñados específicamente para detectar transcriptos con y sin splicing (según datos de secuenciación). Para la retrotranscripción se utilizo el cebador reverso específico P2 (GGGTGGTGTTTCTCGACACCTCGGA). Posteriormente, se hizo una primera ronda de amplificación con los cebadores P1 (AGGCTGGGGGTCGCAAATACGCGGT) y el mismo reverso P2; y por último una segunda ronda de amplificación para aumentar la cantidad del producto específico con el cebador forward (P1A: CGGCCCGAGAGTTAAGTATGC) y P2 como reverso. Se logró la amplificación de dos productos, uno de 250 pares de bases y otro de 450 pares de bases que fueron purificados y secuenciados. Las secuencias obtenidas muestran intrones de entre 800 y 1000 pares de bases que sugirieren la edición alternativa del mensajero del LR para la generación de distintos productos de fusión entre ORF-1 y ORF-2. Uno de ellos se origina con el marco de lectura del ORF-2 y continúa con el del ORF-1 al eliminarse la señal de stop del ORF-2 contenida en el intrón. Esto originaría una proteína de fusión con el extremo aminoterminal correspondiente al ORF-2 y el carboxilo terminal correspondiente al ORF-1. Otros grupos de trabajo han hallado también varios productos a partir del LR de BoHV-1, alguno de los cuales generan una proteína de fusión entre ORF-2 y ORF-1 similar a la hallada en BoHV-5. Estos productos podrían poseer una capacidad antiapoptótica distinta a la conocida para el ORF-2 de BoHV-1 ya que si bien poseen el mismo extremo amino terminal, el carboxilo, donde reside esta función, es diferente. 0142 COMPARACIÓN DE LA CINÉTICA DE REPLICACIÓN DE CEPAS DE HERPESVIRUS BOVINO 4 AISLADAS EN ARGENTINA, EN LÍNEAS CELULARES DE DIFERENTE ORIGEN P Morán1, S Pérez2, D Rensetti1, A Odeón3, A Verna3 1 FCV - UNCPBA, Argentina. 2 FCV- UNCPBA - CIVETAN, Argentina. 3 INTA Balcarce, Argentina. El herpesvirus bovino tipo 4 (BoHV-4) ha sido aislado de bovinos con presentaciones clínicas variadas y de animales aparentemente sanos en diferentes partes del mundo; se lo asocia principalmente con infecciones del tracto reproductivo en bovinos y puede infectar diferentes especies tanto in vivo como in vitro, incluyendo líneas celulares de origen humano. A partir de sus primeros aislamientos se consideraron dos prototipos: el americano (tipo DN599) y el europeo (tipo Movar). En Argentina, el BoHV-4 se aisló y caracterizó en el año 2007 en muestras de mucus cérvico-vaginal (MCV) de vacas que presentaron cuadros de aborto, obteniéndose hasta el momento más de 40 aislamientos. La variabilidad genómica de estos aislamientos determinó la existencia de un nuevo prototipo en Argentina (Genotipo 3). El objetivo de este trabajo fue evaluar y comparar la cinética de replicación de tres cepas de BoHV-4, filogenéticamente diferentes, in vitro en tres líneas celulares de diferente origen. Estas cepas se aislaron en el Servicio de Diagnóstico Veterinario del INTA Balcarce, de MCV de vacas que abortaron. Se utilizaron cultivos celulares de origen bovino (MDBK), de simio (VERO) y de humano (HeLa) a una concentración de 5 x 104 células/ml en placas de 24 pocillos. Los cultivos se infectaron con las cepas 263, 365 y 435 a una multiplicidad de infección de 0.1, y se incubaron a 37 ᵒC con 5% de CO2. Los sobrenadantes se recolectaron a las 24, 48, 72, 96 y 120 h pos-infección (pi), realizándose la observación del efecto citopatico (ECP) y registro fotográfico de las monocapas. Los ensayos se realizaron por triplicado incluyéndose controles negativos de cada uno de los cultivos celulares utilizados. El título viral se determinó por el método de titulación a punto final sobre células MDBK y se expresó como TCID50. Los resultados se analizaron estadísticamente mediante ANOVA/Test de Tukey. Los títulos de las cepas 263 y 435 fueron significativamente mayores (p < 0,05) en los cultivos de MDBK con respecto a HeLa y VERO. La replicación de la cepa 365 fue significativamente menor (p < 0,05) en los cultivos de HeLa y no se observaron diferencias (p > 0,05) en MDBK y VERO. Coincidentemente con las diferencias en la cinética de replicación, el inicio de ECP se evidenció a las 24 h pi solamente en la línea MDBK infectadas con las cepas 263 y 435. A las 48 h pi se observó ECP en todos los cultivos excepto en las monocapas de HeLa infectadas con la cepa 365. A las 72 h pi todas las monocapas presentaron ECP marcado, excepto la línea HeLa infectada con la cepa 365, donde el ECP fue leve. Estos resultados demuestran que la dinámica replicativa de cepas filogenéticamente divergentes pueden variar en relación a las células infectadas y aportan información sobre el comportamiento biológico de este virus, lo cual constituye un aspecto importante para el diseño de experimentos in vivo e in vitro. 0144 ROL DE LOS RECEPTORES TIPO TOLL EN LA ENCEFALITIS OCASIONADA POR HERPESVIRUS BOVINO TIPO 1 Y 5. D Rensetti1, M Marin2, S Quintana3, P Morán1, A Odeón4, S Pérez5 1 FCV-UNCPBA, Argentina. 2 CONICET-INTA BALCARCE, Argentina. 3 INSTITUTO FARES TAIE, Argentina. 4 INTA BALCARCE, Argentina. 5 FCVUNCPBA CIVETAN, Argentina. El herpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5) y el herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) son alfa-herpesvirus estrechamente relacionados. El BoHV-5 es el agente causal de meningoencefalitis necrotizante no supurativa en terneros y, ocasionalmente, el BoHV-1 también puede causar 117 Libro de resúmenes encefalitis en bovinos. Los mecanismos responsables de la neuropatogenia de estos virus aún no han sido esclarecidos. En muchas infecciones virales una respuesta inmune inadecuada o exacerbada puede ocasionar alteraciones patológicas. Se ha descripto que en ciertos casos la respuesta inflamatoria mediada por los receptores tipo “toll” (TLRs) durante la infección viral puede resultar en daño tisular. En otros casos, la deficiencia o alteración en el nivel de expresión de estos receptores también ha sido asociada con el desarrollo de enfermedad. Los TLRs son proteínas de señalización de transmembrana que ejercen un rol importante en la respuesta inmune innata mediante el reconocimiento de “patrones moleculares asociados a los patógenos” (PAMPs). Los TLR3, 7, 8 y 9 están involucrados en la inmunidad contra las infecciones virales, y los mismos reconocen patrones moleculares basados en oligonucleótidos de ARN o ADN microbiano. El objetivo de este estudio fue analizar el nivel de expresión de los TLRs en el sistema nervioso central (SNC) durante la infección aguda de terneros infectados experimentalmente con BoHV-1 y BoHV-5 y en terneros sin infectar. Los terneros fueron inoculados intranasalmente con BoHV1(n=2) o BoHV-5 (n=2) (106.3 DICC50/ml) y un ternero permaneció como control. La eutanasia se realizó a los 6 días post-infección y se recolectaron muestras de cerebro, incluyendo corteza olfatoria, corteza frontal y posterior y de médula espinal. Las muestras se analizaron mediante Q-RT-PCR. Los resultados obtenidos revelan un incremento significativo (p<0,05) en los niveles de expresión de TLR3 y TLR7 en todas las área del SNC de terneros infectados con BoHV-1 y BoHV-5 con respecto a los terneros no infectados, excepto para el TLR7 en corteza posterior de terneros infectados con BoHV-1, donde no se detectaron diferencias (p>0,05). En la infección aguda por BoHV-1 se observó un aumento significativo (p<0,05) de la expresión de TLR8 en corteza olfatoria y médula cervical mientras que para BoHV-5 estas diferencias se hallaron en corteza posterior y médula cervical (p<0,05). Los niveles de TLR9 no difirieron significativamente (p>0,05) con respecto al control, excepto para la zona de corteza frontal donde se detectó una disminución (p<0,05) en el nivel de expresión durante la infección aguda por BoHV-1. A partir de estos resultados es posible inferir que el TLR3 y el TLR7 podrían estar involucrados en el desarrollo de encefalitis en bovinos infectados con BoHV-1 y BoHV-5. 0148 EVOLUCIÓN DEL PARVOVIRUS CANINO: LA CEPA 2C CONTINÚA SIENDO PREVALENTE EN LA POBLACIÓN CANINA DE ARGENTINA MB Gallo Calderon1, C Romanutti1, M Wilda1, A D'Antuono1, L Keller2, M Bucci3, MN Giacomodonato4, NM Mattion1, JL La Torre1 1 ICT Milstein, Argentina. 2 Fundación de Estudios en Virología Animal (FEVAN), Argentina. 3 UNSAM, Argentina. 4 IMPAM (UBA-CONICET), Argentina. Introducción: El Parvovirus Canino (PVC) provoca gastroenteritis hemorrágicas severas con altas tasas de morbilidad y mortalidad en perros. El virus, el cual es altamente contagioso, se libera en grandes cantidades y es sumamente resistente en el medio ambiente. El PVC invade el tejido linfoide de la región bucofaríngea y los ganglios linfáticos mesentéricos, provocando inmunosupresión e infecciones secundarias. Desde su aislamiento en 1978, el PVC ha sufrido cambios antigénicos. Las variantes antigénicas, PVC-2a y PVC-2b, reemplazaron secuencialmente a la cepa original PVC-2 y se encuentran en distintas proporciones en las poblaciones caninas de todo el mundo. La última variante en aparecer, en el año 2000, fue la denominada PVC-2c, que tiene una sustitución aminoacídica de un ácido Aspártico (Asp) por un ácido Glutámico (Glu) en la posición 426, localizada en el sitio antigénico más importante de la proteína de la cápside VP2. Objetivo: Analizar la presencia de las diferentes cepas de PVC en la población canina argentina. Metodología: Entre los años 2010 y 2013, fueron remitidas a nuestro laboratorio, 93 muestras (hisopos rectales) de perros sospechados de infección por PVC. Luego de la extracción del ADN, se amplificó por PCR un fragmento de 583 pares de bases del gen VP2, y en algunos casos (N=6), se amplificó el gen completo VP2. Resultados: Cuarenta y un muestras (44% del total) resultaron positivas para PVC. Un análisis posterior, por secuenciamiento directo de los productos de PCR obtenidos, mostró que 37 muestras (90,2%) fueron caracterizadas como PVC-2c, 4 muestras (9,8%) fueron identificadas como PVC-2a, mientras que la cepa PVC-2b no fue detectada. De acuerdo con estos resultados, la PVC-2c sigue siendo la cepa predominante en Argentina. También se observó que el 65% de las cepas PVC-2c argentinas posee una Alanina en lugar de una Treonina en la posición 440 (Thr440Ala); esta mutación está ausente en las cuatro cepas PVC-2a detectadas en este trabajo. El clonado y el análisis de la secuencia del gen completo de la VP2, de dos cepas representativas PVC-2c de este estudio (Arg 100 del 2012 y Arg 107 del 2013), mostró que las secuencias aminoacídicas fueron similares a las secuencias PVC-2c locales, previamente reportadas entre el año 2008 y 2010. Por otro lado, el análisis filogenético del gen completo de cepas PVC-2a argentinas, mostró que eran genéticamente más cercanas a un aislamiento local PVC-2a del 2003 y a una cepa PVC2a Sudafricana, que a cualquiera de las PVC-2a recientemente detectadas en Uruguay (2011). Conclusiones: Los resultados obtenidos en este trabajo, junto con los reportados en Uruguay; sugieren que, a pesar de la proximidad geográfica entre ambos países, las cepas salvajes de PVC siguieron diferentes vías evolutivas en cada país, lo que resulta en la prevalencia de diferentes cepas, en poblaciones caninas relacionadas. Para comprender la evolución del PVC, son necesarios estudios epidemiológicos continuos. 0158 DETECCIÓN DE ROTAVIRUS EN EL GANADO VACUNO Y TRABAJADORES RURALES DE LA PROVINCIA DE LA RIOJA. A Spano Cruz1, P Castillo1, V Cuffia1, A Rivero1, N Moreno1, A Grasselli2, JC Amaya1 3, L Sabini4, P Cordoba1 1 Instituto Universitario de Ciencias de la Salud de Fundación Barceló. Sede La Rioja, Argentina. 2 Secretaria de Ganaderia de la Provincia de La Rioja, Argentina. 3 Direccion de Zoonosis de la Provincia de La Rioja, Argentina. 4 Universidad Nacional de Rio Cuarto, Argentina. Rotavirus es un virus desnudo perteneciente a la Familia Reoviridae. Presenta su genoma dispuesto en 11 segmentos por lo que puede presentar un rearreglo de segmentos con otras especies. Produce diarrea en terneros menores de un año y en niños. Nuestro objetivo fue estudiar la presencia de rotavirus en vacuno y en trabajadores rurales de dos sectores de la Provincia para conocemos la importancia de rotavirus bovino en la produccion ganadera de la provincia y la interrelacion de especie que podria haber con los trabajadores rurales. Se estudiaron 102 muestras de materia fecal de terneros menores de 2 años con diarrea y 20 muestras de materia fecal de empleados rurales sin diarrea entre Mayo del 2013 - Mayo 2014 en dos regiones de la provincia. Las regiones estudiadas son Patquia, a 70 km de la capital, y Famatina, a 231 km de la capital. La detección de Rotavirus fue realizada por Inmunocromatografia (IC) Rota/Adeno screen dipstick (Microgen Bioproducts) para la detección del Grupo A y por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para el Grupo C. Las muestras positivas son amplificadas en el gen 9 por RT-PCR para su secuenciación en Macrogen Korea. Tres muestras vacunas fueron positivas correspondiente al 2,94 % del total. Una de ellas fue positiva por PAGE, presentando un patrón corto, pero negativa por IC confirmando un rotavirus del Grupo C. El ternero tenía 6 meses pertenecientes a la zona de Famatina. Las otras dos muestras positivas fueron rotavirus del grupo A. En este momento las tres muestras están siendo enviadas para su secuenciación. Ninguna de las muestras de los empleados rurales fue positiva. Los resultados muestran que rotavirus bovino del grupo A y C circulan en el ganado Riojano produciendo diarrea aunque con menos importancia que en otras regiones de Argentina. Los rotavirus detectados requieren aun su secuenciación para confirmar que no existe una relación Interespecie. 0168 BACTERIÓFAGOS LÍTICOS PARA EL BIOCONTROL DE LA TIFOSIS AVIAR H Barrios1, X Ortiz1 2, MI Gismondi1 3 118 Libro de resúmenes 1 Universidad Nacional de Luján, Argentina. 2 Comisión de Investigaciones Científicas (CIC), Argentina. 3 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Argentina. La tifosis aviar (TA) causada por Salmonella enterica subespecie enterica serovar Gallinarum biotipo Gallinarum (SG) afecta a las aves de postura y se transmite rápidamente por vía horizontal y vertical. En avicultura, para controlar esta enfermedad se utilizan antibióticos, pero su uso está restringido por la aparición de cepas resistentes con riesgos para la salud pública. Los bacteriófagos líticos muestran un uso potencial como biocontroladores de SG tanto en las aves como en el ambiente de las granjas donde es frecuente el uso de desinfectantes que podrían afectar la actividad bactericida del fago. El objetivo de este trabajo fue estudiar un bacteriófago aislado a partir de las heces de una gallina enferma de TA, evaluando la estabilidad frente a desinfectantes de uso común en avicultura y determinando su especificidad viral. Para la evaluación de la actividad lítica, el fago se incubó con distintas diluciones de yodo, lavandina, creolina, CID 20® y amonio, a 37°C, 2 horas. Posteriormente, alícuotas de cada suspensión desinfectante/fago (DF) se mezclaron con 103 UFC de SG y 2.5 ml de agar nutritivo semisólido; la mezcla se volcó inmediatamente sobre placas con agar nutritivo, que se incubaron a 37°C, 4 horas. Se determinó el número de calvas cada 30 minutos. Las mezclas DF se guardaron a temperatura ambiente y a la semana se repitió el ensayo. Cuando se utilizó la mezcla DF preparada en el momento, el crecimiento bacteriano fue inhibido por la presencia del antiséptico e impidió advertir la actividad del fago. Sin embargo, cuando se utilizó la suspensión DF preparada 7 días antes, los desinfectantes disminuyeron su poder antimicrobiano permitiendo el crecimiento en césped de bacterias y la formación de placas de lisis. El número de placas registradas no difirió al del control con fago solo, en tanto se observaron diferencias en el tamaño de las calvas, que fueron más grandes cuando se utilizaron los desinfectantes creolina, CID 20® y amonio. Para determinar la especificidad viral se utilizaron 2 cepas de SG y 17 cepas de S. Enteritidis (SE) obtenidas de granjas de pollos parrilleros, y 5 cepas de Salmonella spp., obtenidas de granjas de gallinas ponedoras. Se infectaron las distintas cepas bacterianas con el fago en placas de agar nutritivo y se determinó la lisis celular luego de una incubación a 37°C toda la noche. El fago produjo lisis total o parcial de las dos cepas de SG, mientras que en 5 cepas de SE se observó lisis total y en 8 de ellas la lisis fue parcial. No hubo actividad lítica en las 4 cepas de SE restantes. Con respecto a las cepas de Salmonella spp. aisladas en las granjas de gallinas ponedoras, sólo 1 evidenció lisis parcial. Estos resultados demuestran que la actividad lítica del fago no es afectada por la presencia de desinfectantes de uso en avicultura y su especificidad para actuar sobre SG. El efecto del fago sobre SE podría deberse a la similitud antigénica que existe entre SG y SE. 0175 EL CITOESQUELETO DE ACTINA Y SU RELACIÓN CON EL MECANISMO DE INTERNALIZACIÓN DEL VIRUS DE LA BURSITIS INFECCIOSA AVIAR MC Gimenez1 4, JF Rodríguez2, MI Colombo1 4, LR Delgui1 3 1 Instituto de Histología y Embriología Mendoza(UNCuyo-CONICET), Mendoza, Argentina. 2 Centro Nacional de Biotecnología-CSIC, Madrid, España. 3 Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UNCuyo, Mendoza, Argentina. 4 Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Juan Agustín Maza, Mendoza, Argentina. El Virus de la Bursitis Infecciosa Aviar(IBDV), miembro de la familia Birnaviridae, es el agente etiológico de la Enfermedad de Gumboro, infección inmunosupresora que afecta a individuos jóvenes del género Gallus gallus ocasionando graves pérdidas económicas en la industria avícola. Al inicio del ciclo de replicación, la mayoría de los agentes virales son internalizados en la célula hospedadora mediante la vía endocítica. El citoesqueleto de actina es un regulador clave de ciertas rutas endocíticas, siendo la dinámica de polimerización y despolimerización de los microfilamentos de actina un evento que subyace la formación de proyecciones de la membrana plasmática características de las vías endocíticas dependientes de actina. Diversos virus son capaces de alterar la homeostasis del citoesqueleto de actina durante su internalización en las células. El objetivo de nuestro trabajo de investigación consistió en estudiar el papel del citoesqueleto de actina y sus proteínas reguladoras, las GTPasas Rho, en la internalización de IBDV. Empleamos los agentes despolimerizantes del citoesqueleto de actina Citocalasina D y Latrunculina B para estudiar su efecto en la internalización de IBDV. Determinamos el porcentaje de células infectadas mediante microscopía confocal y los niveles de la proteína viral VP3 mediante Western blot luego de infectar las células pretratadas con los agentes. Realizamos estudios ultraestructurales mediante microscopía electrónica de trasmisión para estudiar la morfología de la internalización viral, tanto en células con el citoesqueleto íntegro como en aquellas pre-tratadas con los agentes. A su vez, utilizando microscopia confocal, analizamos la alteración en el citoesqueleto de actina asociada al proceso de internalización viral. Finalmente, sobreexpresamos versiones mutantes dominante-negativa de las proteínas reguladores del citoesqueleto de actina Rho A, Rac-1 y Cdc42 y analizamos su efecto sobre la entrada del virus en las células transfectadas. Hemos observado que el pre-tratamiento de las células con Citocalasina D y Latrunculina B afecta drásticamente la internalización de IBDV. Además, comprobamos que el citoesqueleto de actina resulta totalmente desorganizado de forma transciente durante la internalización, revirtiendo luego de esta. Por otro lado, la sobreexpresión de las proteínas mutantes dominante-negativas de Rho A y Rac-1 afectaron negativamente la infección de IBDV. El conjunto de datos obtenidos ha permitido demostrar el importante papel de los filamentos de actina y de sus proteínas reguladoras, las GTPasas Rac-1 y Rho A, durante el proceso de internalización de IBDV. A su vez, hemos demostrado que la internalización de IBDV conlleva la completa desorganización del citoesqueleto de actina. En conclusión, estos resultados apoyan a la vía macropinocítica, proceso endocítico altamente dependiente del citoesqueleto de actina, como la principal involucrada en la entrada de IBDV en las células. 0181 OBSERVACIÓN DE CAMBIOS MORFOLÓGICOS NUCLEARES COMPATIBLES CON APOPTOSIS EN CULTIVOS CELULARES INFECTADOS CON HERPESVIRUS BOVINO TIPO 1 Y 5. D Rensetti1, P Morán1, M Marin2, A Verna2, A Odeón5, S Pérez4 1 FCV-UNCPBA, Argentina. 2 INTA BALCARCE-CONICET, Argentina. 4 FCVUNCPBA-CIVETAN, Argentina. 5 INTA BALCARCE, Argentina. El herpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5) es un alfa-herpesvirus que produce meningoencefalitis necrotizante no supurativa en terneros. El herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) causa trastornos respiratorios, reproductivos y abortos. Ocasionalmente, BoHV-1 puede causar encefalitis en bovinos. El ciclo infeccioso de los herpesvirus se caracteriza por estadios de infección aguda, latencia y reactivación. El gen relacionado a la latencia (gen LR) del BoHV-1 es esencial para el establecimiento y mantenimiento de la latencia viral. Una de sus propiedades biológicas más estudiadas es su capacidad de inhibir la muerte celular programada (apoptosis). Los herpesvirus pueden inducir apoptosis durante la etapa de infección aguda para promover la diseminación de la progenie viral, o inhibir la apoptosis para preservar el pool de células latentemente infectadas. Las regiones codificante y regulatorias del gen LR del BoHV-5 difieren marcadamente de las del gen LR de BoHV-1, por lo cual es posible que sus propiedades biológicas también difieran. En este estudio se utilizó la tinción con 4',6-diamino2-fenilindol (DAPI) para evaluar los cambios morfológicos nucleares característicos de la apoptosis (condensación de la cromatina y fragmentación nuclear) en líneas celulares (MDBK, BHK-21 y BT) infectadas con las cepas A663 (BoHV-5b), 97-613 (BoHV-5a) y Cooper (BoHV-1.1) a una multiplicidad de infección de 0.1, sobre monocapas preformadas, en placas de 6 pocillos. Como controles de inducción de apoptosis se utilizó la micotoxina deoxinivalenol (DON) y DMSO al 2%. A las 24 horas post-infección (hpi) las células se lavaron, fijaron y tiñeron con DAPI. La morfología nuclear se observó con microscopio de fluorescencia. Se registraron de 3 a 6 campos visuales, se determinó el porcentaje de células apoptóticas y se evaluó mediante ANOVA/Test de Tukey. El porcentaje de apoptosis en MDBK infectadas con cualquiera 119 Libro de resúmenes de las cepas fue significativamente superior (p<0,05) con respecto a las MDBK sin infectar, aunque no se registraron diferencias entre BoHV-1 y las cepas de BoHV-5 (p>0,05). En BHK-21, sólo se detectaron diferencias significativas (p<0,05) en el porcentaje de apoptosis luego de la infección con la cepa 97-613 (BoHV-5) y la cepa Cooper de BoHV-1 con respecto al control. En BT, el porcentaje de apoptosis fue significativamente superior (p<0,05) para todas las cepas con respecto al control. Además, el porcentaje de apoptosis inducido por la cepa Cooper de BoHV-1 fue significativamente superior (p<0,05) con respecto a ambas cepas de BoHV-5. Estos resultados demuestran que la inducción de cambios nucleares indicativos de apoptosis por alfaherpesvirus bovinos son dependientes del tipo celular. BoHV-1 tendría mayor capacidad de inducir apoptosis que BoHV-5, al menos luego de 24 hpi en BT. Conocer los detalles de la interacción virus/célula permitirá discernir algunas de las diferencias en la patogenia de ambos herpesvirus. 0201 CARACTERIZACIÓN ANTIGENICA Y CIRCULACIÓN DE CORONAVIRUS BOVINO EN ARGENTINA DURANTE EL PERIODO 2011-2014 M Bok1, D Rodriguez1, A Badaracco1, S Miño1, C Vega1, L Saif2, V Parreño1 1 Instituto de Virología, INTA Castelar, Argentina. 2 FAHRP, The Ohio State University, Estados Unidos. Coronavirus bovino (CoVB) es un agente causal en el síndrome de la Diarrea Neonatal del Ternero (DNT) siendo responsable de grandes pérdidas económicas a nivel mundial. CoVB es un virus ARN simple cadena no segmentado que pertenece al género Betacoronavirus dentro de la subfamilia Coronavirinae, familia Coronaviridae, orden Nidovirales. La glicoproteina structural S de CoV es la responsable en la union al receptor y en la inducción de anticuerpos (Acs) neutralizantes, es la más pleomórfica entre las cepas de CoV y es utilizada para la caracterización molecular de los aislamientos. La proteína S consiste en dos subunidades, S1 y S2. La proteína S1 es útil para estudiar la variabilidad y evolución de CoV. Este trabajo describe la circulación de CoVB en Argentina en los últimos cuatro años y compara molecular y antigénicamente la cepa de referencia Mebus con las cepas circulantes en Argentina. Durante 2011-2014 ingresaron 2016 muestras de materia fecal para diagnóstico de DNT que fueron analizas por ELISA detectándose 22 muestras positivas a CoVB (1.09%) correspondiendo al 10,87% de los brotes (10/92). El 0.1% (2/2016) de las muestras y el 7.61% (7/92) de los brotes positivos a CoVB también fueron positivos a Rotavirus A. Los brotes positivos a CoVB pertenecían a rodeos de tambo de las provincias de Bueno Aires, Santa Fe y Córdoba y un rodeo de cría de la provincia de Buenos Aires. Se eligieron muestras representativas de cada explotación y provincia de las cuales se amplificó una porción de la proteína S por RT-PCR correspondiente a los nucleótidos 1167-2075 del dominio S1 y nucleótidos 2058-2730 del dominio S2. El análisis filogenético (Neighbor-joining) de las secuencias obtenidas en conjunto con cepas de CoVB argentinas de años anteriores y cepas disponibles en GenBank indico que las cepas argentinas detectadas en este periodo se agrupan tanto a nivel nucleotídico como aminoacídico junto con cepas de Italia y Dinamarca y alejadas de la cepa de Referencia Mebus utilizada en las vacunas para DNT existentes en el mercado argentino. Para estudiar si estas diferencias de aminoácidos se traducen en diferencias antigénicas, se realizó un ensayo de neutralización cruzada, en el cual Acs de yema de huevo (IgY) y sueros de cobayos y gallinas específicos contra la cepa de referencia Mebus y una cepa local adaptada a cultivo celular Arg95 se enfrentaron a la cepa viral homóloga o a la heteróloga y se observó que los títulos de Acs neutralizantes de la IgY anti Mebus y anti Arg95 eran iguales para ambas cepas virales (32768 y 8192, respectivamente) al igual que los títulos de Acs neutralizantes en el suero de las gallinas ( 8192 y 512, respectivamente) y en los sueros de cobayos ( 128 para ambos virus). Estos resultados confirman que a pesar de las diferencias observadas, existe un único serogrupo entre los CoVB y que vacunas que contengan la cepa Mebus en su formulación serían una herramienta eficaz para la prevención de la diarrea CoVB. 0209 DINÁMICA NATURAL DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA LEUCOSIS BOVINA: ¿PERMANECE EN TODOS LOS ANIMALES EN FORMA ESTABLE? I Alvarez1 2, G Gutiérrez1 2, F Rondelli4, K Trono1 1 Instituto de Virología, INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina. 4 Cátedra de Inmunología. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional de Rosario, Argentina. La infección natural con el virus de la leucosis bovina (BLV) alcanza niveles heterogéneos in vivo. En los rodeos con altas tasas de endemicidad, como la mayoría de los tambos de altos niveles productivos, alrededor del 40% de los animales poseen una alta carga proviral en sangre con más del 1% de glóbulos blancos circulantes infectados, según datos obtenidos en distintos estudios transversales. Una alternativa para el control de esta infección, consiste en la reducción de los niveles de carga proviral a nivel predial con el propósito final de reducir la transmisión entre animales susceptibles. Este concepto sería válido siempre y cuando el individuo infectado pudiera controlar en forma permanente los niveles bajos de infección. En este trabajo se evaluaron animales naturalmente infectados con BLV con el fin de establecer la dinámica de la infección a lo largo del tiempo en situación de campo. Se analizó la carga proviral de 7 vacas de tambo infectadas naturalmente, durante un período de un año, entre dos partos sucesivos. Asimismo, se analizó la presencia de material genético viral (ARN) en las muestras tomadas, con el objeto de detectar potenciales momentos de expresión viral activa. Los resultados indican que la carga proviral en sangre entera puede modificarse a lo largo del ciclo productivo. Cuatro de los 7 animales presentaron variaciones de hasta 5 veces entre dos puntos consecutivos, y 1 de los 7 animales en estudio, presentó fluctuaciones de alrededor de 40 veces. Asimismo, la detección de ARN viral en sangre en 2 de los animales en estudio, correspondiente a 2 genes diferentes de BLV, sugiere la presencia de picos de re-activación viral. 0225 PRIMER AISLAMIENTO DE HERPES VIRUS BOVINO TIPO 1 EN PATAGONIA ARGENTINA R Apóstolo1, S Maidana2 3, J Mellado1, JP Martínez4, M Raso1, SA Romera2 3, C Robles5 1 Estación Experimental Agroforestal INTA Esquel, Argentina. 2 Instituto de Virología, CICVyA, INTA Castelar, Argentina. 3 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas, Argentina. 4 Agencia de Extensión Rural INTA Trevelin, Argentina. 5 Estación Experimental Agropecuaria INTA Bariloche, Argentina. El Herpesvirus Bovino tipo 1 (BoHV1) afecta naturalmente al bovino y puede generar diversas manifestaciones clínicas como rinotraqueítis, vulvovaginitis y balanopostitis pustular infecciosa, conjuntivitis, aborto, enteritis y encefalitis. La distribución de la infección es mundial. En la Patagonia argentina, un estudio previo realizado en bovinos de 47 crianceros de la comunidad Millaín Currical, en la provincia de Neuquén, revelo una prevalencia serológica del 53,4% y en la zona noroeste de la provincia de Chubut, en un estudio realizado en 83 rodeos de cría se detectó un 50% de los establecimientos positivos con una seroprevalencia a nivel individual del 52,3%. A partir de esta información y teniendo en cuenta la ocurrencia en Patagonia de eventos que afectan la salud bovina que podrían corresponderse con los cuadros producidos por el BoHV1, se llevó a cabo un estudio durante un brote de rinitis y conjuntivitis en terneros alojados en una recría a corral en el Valle 16 de Octubre, al noroeste de la provincia de Chubut, durante el invierno de 2013 a fin de intentar el aislamiento de BoHV1. El lote estaba conformado por 88 terneros de raza Hereford, Aberdeen Angus y sus cruzas, todos provenientes del mismo campo de cría y estaban en confinamiento desde el destete, en mayo de 2013, con aproximadamente 6 meses de edad. A mediados de junio de ese año se detectaron 3 terneros con epifora. A comienzos de julio, se detectaron otros 22 terneros con conjuntivitis de tipo serosa y purulenta, 5 de estos presentaban además secreción nasal serosa y 5 presentaban sólo secreción nasal serosa. Se tomaron en total 11 muestras de secreciones oculares y nasales de animales con 120 Libro de resúmenes secreciones de tipo serosa. Todos los animales con síntomas fueron tratados con tilmicosina (10 mg/Kg peso vivo). Las muestras se tomaron utilizando hisopos de dracón estériles. Una vez colectada la muestra, los hisopos se colocaron en tubos conteniendo medio de transporte MEM-E suplementado con antibióticos y antifúngicos y conservados en nitrógeno líquido hasta su procesamiento. Las muestras fueron inoculadas sobre monocapas de células MDBK y observadas diariamente. Se realizaron tres pasajes ciegos para confirmar las muestras negativas. A partir de sobrenadante de cultivo de las monocapas que presentaron efecto citopático se realizó la extracción de material genético viral mediante el uso de kit comercial. Luego se realizó una PCR multiplex diferencial entre BoHV1/5 para tipificar los aislamientos. Se lograron aislar y confirmar por PCR 10 BoHV1. Uno obtenido de la mucosa ocular correspondiente al inicio del brote en junio y 5 de la mucosa nasal y 4 de la mucosa ocular del brote del mes de julio. Este trabajo confirma los trabajos previos de evidencia serológica de BoHV1 y constituye el primer aislamiento de BoHV1 en ganado bovino en la Patagonia argentina. 0227 EL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA INFECTA A LAS CÉLULAS DENDRÍTICAS BOVINAS DERIVADAS DE MONOCITOS A TRAVÉS DE UN MECANISMO MEDIADO POR LA GLICOPROTEÍNA E2 NP Cardoso, ME Quintana, DA Malacari, FC Mansilla, AV Capozzo INTA, Instituto de Virología, Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Buenos Aires, Argentina. La infección viral de las células presentadoras de antígeno puede tener un impacto devastador en el sistema inmunológico, favoreciendo el estado de inmunosupresión. En estudios previos demostramos que el virus de la diarrea viral bovina (VDVB), un virus que causa inmunosupresión y que presenta afinidad por células del sistema inmune, es capaz de infectar eficientemente a las células dendríticas bovinas. El objetivo de este trabajo fue estudiar la cinética de crecimiento viral y mecanismo de entrada del VDVB en células dendríticas diferenciadas de monocitos bovinos (moDC). Observamos que el VDVB infecta las moDC con una cinética acelerada en comparación con células MDBK, con producción de nuevas partículas virales entre las 3 y 6 horas post-infección (hpi). Estudios de fluorescencia mostraron que el virus ingresa rápidamente a las moDC. Dado que la glicoproteína E2 media la entrada del virus a MDBK y es una glicoproteína con alto contenido de manosa evaluamos si el virus usaría los receptores de manosa de las moDC y/o las vías fagocíticas mediadas o no por receptores Fc. Las moDC fueron pre-incubadas con EDTA, un polímero de manosa (mannan) o con proteína E2 truncada recombinante purificada (rtE2). Por otro lado el inóculo viral fue preincubado con anticuerpos anti-E2 de distintas especies y sueros normales. A las 0, 18 y 24 hpi se recogieron los sobrenadantes para la titulación en células MDBK y los pellets fueron procesados para detectar traducción (ELISA para proteína NS3). El pre-tratamiento de Mo-DC con mannan o EDTA no bloqueó la entrada del virus a las moDC mientras que la pre-incubación con concentraciones crecientes de rtE2 redujo el rendimiento viral. Todos los sueros anti-E2 bloquearon completamente la infección de las moDC, mientras que los sueros normales no interfirieron. Resultados preliminares utilizando un anticuerpo monoclonal anti-CD46 indican que esta proteína no sería el receptor que usa el virus. Concluimos que el VDVB infecta eficientemente a las moDC utilizando un mecanismo mediado por la glicoproteína E2. 0237 ESTUDIO DE LA APOPTOSIS INDUCIDA POR EL VIRUS DE LA BURSITIS INFECCIOSA, EL ROL DE LA PROTEÍNA NO ESTRUCTURAL VP5 EN ESTE PROCESO Y SU LOCALIZACIÓN SUBCELULAR. JM Carballeda1 2, G Maroniche2 4, S Chimeno Zoth1 2, MS Lucero1 2, M Richetta1 3, E Gómez1 2, MJ Gravisaco1, A Berinstein1 2 1 Instituto de Biotecnología-INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina. 3 ANPCyT, Argentina. 4 Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Mar del Plata, Argentina. El virus de la bursitis infecciosa (IBDV) pertenece a la familia Birnaviridae. Es un virus desnudo y su cápside posee geometría icosaédrica. Provoca inmunosupresión en pollos, sobre todo jóvenes. Posee un genoma de ARN doble cadena bisegmentado. El segmento pequeño codifica para una ARN polimerasa dependiente de ARN, la proteína VP1, mientras que el segmento mayor codifica para las proteínas de cápside VP2, VP3 y la proteasa viral VP4. Un marco de lectura superpuesto codifica para la proteína VP5 cuyo rol respecto a la apoptosis es muy discutido. En cuanto a su localización, por métodos bioinformáticos, se ha señalado que es una proteína de transmembrana que exhibe hacia el espacio extracelular la región C-terminal. El objetivo del presente trabajo fue determinar la capacidad de IBDV de inducir apoptosis en distintos tipos celulares y determinar el papel de VP5 en este proceso. Por otro lado, fue objetivo también ampliar los conocimientos acerca de la localización subcelular de esta proteína a través de distintos programas bioinformáticos y del análisis in vivo en células transfectadas con fusiones de genes de proteínas fluorescentes al gen de VP5. Los resultados obtenidos demostraron que si bien IBDV es capaz de inducir apoptosis tanto en la bursa de Fabricio (órgano blanco del virus) de animales inoculados como en células provenientes de fibroblastos de ave, no es capaz de hacerlo en la línea celular DT-40, derivada de linfocitos B de pollo. Incluso en esta última, la infección con IBDV reduce la activación del efector apoptótico Caspasa 3. Asimismo, VP5 es capaz de reducir la cantidad de mensajero de Caspasa 3 en células transfectadas. Respecto a su localización subcelular, al utilizar diferentes programas disponibles para el análisis in silico, observamos discrepancias entre los resultados obtenidos, no pudiendo caracterizar a VP5 consistentemente por esta metodología. Sin embargo, mediante estudios in vivo logramos determinar que VP5, si bien se encuentra en la membrana plasmática de las células transfectadas, no es una proteína de transmembrana ya que no expone ningún dominio hacia el exterior de la célula. 0249 EXPRESIÓN DE TNF-α Y TNFRII EN BOVINOS INFECTADOS CON EL VIRUS DE LA LEUCOSIS BOVINA QUE DESARROLLAN ALTA O BAJA CARGA PROVIRAL. MV Nieto Farías, PA Lendez, MC Ceriani, GL Dolcini Laboratorio de Virología-Facultad de Ciencias Veterinarias (FCV), CIVETAN (Centro de Investigación Veterinaria de Tandil)-CONICET, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires (UNCPBA), Tandil, Argentina, Argentina. Introducción: El virus de la leucosis bovina (BLV) es un retrovirus causante de una enfermedad linfoproliferativa que afecta al ganado bovino. El desarrollo de los perfiles de infección de alta carga proviral (ACPV) o de baja carga proviral (BCPV) estaría relacionado a factores genéticos e inmunológicos. El TNF-α tiene un importante rol en la respuesta inmune; sus acciones están relacionadas a la expresión de sus receptores TNFRI y RII: induciendo la apoptosis o estimulando la proliferación celular, respectivamente, aunque no de manera excluyente. En la infección por BLV, postulamos que los animales con ACPV son menos eficientes para eliminar los linfocitos infectados que los animales de BCPV; este fenómeno estaría regulado en parte por el mecanismo apoptótico y por un desbalance en la expresión de los receptores para TNF-α. Objetivo: Cuantificar la expresión de ARNm de TNF-α y TNFRII en animales de ACPV, BCPV o negativos para BLV. Metodología: Se extrajeron muestras de sangre entera de animales negativos y positivos para BLV. Se determinó el estatus infeccioso por ELISA y la carga proviral por PCR en tiempo real. Se seleccionaron 11 animales de ACPV, 8 de BCPV y 3 negativos. Se les extrajo 60 ml de sangre y se obtuvo el buffy coat mediante la lisis de los glóbulos rojos con cloruro de amonio. Por otro lado, se seleccionaron 3 animales de ACPV y 3 animales de BCPV, se les extrajo 60 ml de sangre y se obtuvieron los PBMC mediante gradiente de Ficoll. Estas células fueron cultivadas por 24 hs en presencia de rTNF-α. La expresión de ARNm para TNF-α y TNFRII se analizó mediante la metodología de cuantificación relativa por PCR en tiempo real, utilizando SybrGreen y amplificando GAPDH como gen endógeno. Los resultados de expresión fueron analizados con REST© (Relative Expression Software Tool) 2009. 121 Libro de resúmenes Resultados: Se evidenció una mayor expresión de ARNm de TNF-α y de TNFRII en los PBMC de los animales positivos para BLV con respecto a los negativos. No se encontraron diferencias significativas en la expresión de dichos genes entre los animales positivos con diferentes perfiles de infección. Se observó una mayor expresión de TNFRII en los PBMC de animales de BCPV estimulados con rTNF-α con respecto a los animales de ACPV. Esta diferencia no se observó para el gen de TNF-α. Conclusiones: En animales con perfiles de infección por BLV ya establecidos, la expresión de TNF-α y TNFRII fue similar. Restaría analizar el balance de expresión de ambos receptores para TNF-α, RI y RII, y su relación con la apoptosis o proliferación celular. 0250 EVIDENCIA DE LA PRESENCIA DE ADN DE VIRUS DE LEUCOSIS BOVINA EN TEJIDO MAMARIO HUMANO. PA Lendez1, MV Nieto Farías1, GC Buehring2, HM Shen2, GL Dolcini1, MC Ceriani1 1 Laboratorio de Virología-Facultad de Ciencias Veterinarias (FCV), CIVETAN (Centro de Investigación Veterinaria de Tandil)-CONICET, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires (UNCPBA), Tandil., Argentina. 2 The School of Public Health, University of California, Berkeley, California, Estados Unidos. Introducción: El virus de leucosis bovina (BLV) es un deltaretrovirus cuyo huésped natural es el ganado bovino, con una prevalencia de más del 90% en los tambos de nuestro país. Ocasiona grandes pérdidas económicas por la reposición de animales que desarrollan linfosarcoma. Además de las regiones genómicas características de los retrovirus, los deltaretrovirus poseen una región adicional que codifica para una proteína transactivante, Tax. Infecta linfocitos B- CD5+, pero se han encontrado mayor cantidad de DNA y proteínas virales en tejido mamario que en los linfocitos B. Se ha propuesto que este virus podría estar asociado con el cáncer de mama en humanos. Estudios previos en otros países demostraron la presencia de anticuerpos anti-p24 en suero de pacientes voluntarios y la presencia de ADN viral en cortes histológicos de tumores de mama humanos. Objetivo: Determinar la presencia de ADN viral en cortes histológicos provenientes de cirugías mamarias en nuestro país. Materiales y métodos: Se seleccionaron 25 cortes histológicos provenientes de cirugías mamarias humanas, sin resguardo de edad ni patología. Para la detección del ADN de BLV se utilizó la técnica de in situ-PCR amplificando una región del gen tax y el producto de PCR se detectó por un ensayo de inmunoperoxidasa. Todos los ensayos se realizaron en paralelo con sus respectivos controles negativos. Resultados: En 12 de los 25 cortes analizados se encontraron secuencias genómicas del BLV. Conclusión: Una de las vías de transmisión del BLV en bovinos es a través del calostro y la leche. Esta es la primera evidencia de la detección de ADN de BLV en tumores mamarios humanos en nuestro país. Se necesitan hacer estudios más profundos y con mayor número de casos para poder determinar su potencial zoonótico. 0254 CARACTERIZACIÓN DE UNA CEPA DE CAMPO DEL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA, GENOTIPO 2, UTILIZANDO EL MODELO DE TERNERO PRIVADO DE CALOSTRO. DA Malacari1, A Pecora1, AC Odeón2, AV Capozzo1 1 INTA, Inst. de Virología, Argentina. 2 INTA, EEA Balcarce, Argentina. El virus de la diarrea viral bovina (VDVB) genotipo 2 biotipo nocitopatogénico ha causado altas tasas de mortalidad en los últimos años en rodeos bovinos de diferentes partes del mundo. La presencia de este genotipo en nuestro país ha sido reportada en varias ocasiones. El objetivo del presente trabajo fue caracterizar la virulencia de un aislamiento del VDVB-2 argentino tanto in vitro como in vivo, en comparación con una cepa de alta virulencia de referencia del mismo genotipo y biotipo (NY-93). Se evaluó la inducción de apoptosis por infección de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) in vitro y se analizaron las secuencias correspondientes al extremo 5´UTR para identificar marcadores moleculares de virulencia. Estos ensayos clasificaron a la cepa local como de baja virulencia. Se realizaron posteriormente infecciones experimentales en dos grupos de 4 terneros privados de calostro (TPC) con ambas cepas (instilación nasal; 5.106 DICT50) y se analizaron parámetros fisiológicos, clínicos, inmunológicos y virológicos. Ambas cepas causaron signos entéricos, con hemorragia para NY-93. Los terneros infectados con NY-93 sufrieron una reducción porcentual de leucocitos promedio del 78,4%, mientras que la reducción fue de un 68,55% para los infectados con la cepa local. Se observó una mayor temperatura rectal en los TPC infectados con la cepa NY-93 (42,1˚C) en comparación con los infectados con la cepa local (41,3˚C; diferencias significativas p<0,05). La duración de la hipertermia también fue mayor para NY-93. No se detectaron diferencias en cuanto a la viremia (medida por qRT-PCR) pero si en la duración de la misma, que fue de entre 14 - 17 días para NY-93 y de entre 8 - 10 días para la cepa local. Los TPC desarrollaron anticuerpos neutralizantes y anticuerpos contra la proteína NS3 después de 3 semanas post-infección demostrando el nivel de inmunosupresión causado por la infección con cepas no citopatogénicas del VDVB. Las dos cepas redujeron la capacidad proliferativa de las CMSP frente al estímulo con Concanavalina-A; el efecto fue observado durante los primeros 10 días post infección para la cepa local y por más de 18 días para NY-93. Los TPC infectados desarrollaron una respuesta antiinflamatoria que se manifestó con un incremento del ARN mensajero para el factor de transcripción FoxP3 en CMSP, característico de la inducción de las células T reguladoras. Hemos podido reproducir la infección en el modelo TPC y evidenciar diferencias entre dos cepas de diferente virulencia. La evaluación realizada permitió caracterizar in vitro e in vivo la cepa aislada del VDVB tipo 2 biotipo no citopatogénico y clasificarla como una cepa de baja virulencia. 0267 PERFIL DE LECHES INDIVIDUALES Y DE TANQUE DE UN TAMBO NATURALMENTE INFECTADO CON BLV NG Porta1 2, JP Jaworski1 2, G Gutierrez1 2, I Alvarez1 2, KG Trono1 1 Instituto de Virologia, CICVyA, INTA Castelar, Argentina. 2 CONICET, Argentina. La infección con el Virus de la Leucosis Bovina (BLV) está instalada en el rodeo lechero de Argentina, con una endemicidad de más del 80% en las zonas de intensa producción. Alrededor del 10% de los animales infectados muere como consecuencia de lesiones neoplásicas del sistema linfático. Los hallazgos de estudios previos sugieren que la transmisión de sangre no sería el único modo de contagio. Nuestros estudios muestran una prevalencia aproximada del 50% antes del primer parto y del contacto con animales adultos infectados. Las infecciones podrían establecerse por consumo de calostro, por contacto con los animales nacidos infectados y/o por consumo de leche durante los primeros 60 días de vida, cuando se alimentan de leche fresca del tambo. El hecho de que productores que controlan la iatrogenia y calostran a sus terneros en forma artificial con banco de calostro de vacas no infectadas, y que continúan la crianza con leche fresca de tanque, posean alrededor del 40% de animales jóvenes con BLV, sugiere que la infección por consumo de leche sería un punto significativo en la transmisión. El objetivo de este trabajo es obtener mayores conocimientos acerca de este último punto. Se analizaron muestras individuales de leche (n=45) y muestras de leche de tanque (n=28) procedentes de animales naturalmente infectados de un tambo comercial. Los resultados muestran una amplia distribución de anticuerpos y carga proviral en las leches individuales. Aunque existe una correlación positiva entre anticuerpos en leche y sangre, así como entre anticuerpos en leche y carga proviral en sangre, no se observó una correlación entre la carga proviral en leche individual y el nivel de anticuerpos. En la leche de tanque del ordeñe diario, las muestras presentan un nivel de anticuerpos cercano al valor de la media aritmética de las muestras individuales (titulo = 1:32). Si bien, aproximadamente la mitad de las muestras individuales de leche con un título de anticuerpos igual a 1:32 no evidencia carga proviral detectable, el 80% de las leches de tanque posee cargas provirales detectables. Nuestra interpretación de los resultados obtenidos es que los terneros de tambo se encuentran en una situación de modificación del equilibrio 122 Libro de resúmenes natural, ya que todos consumen 2 litros por día de leche de tanque durante 60 días, y por lo tanto la misma oferta de anticuerpos y virus/provirus. Esto es diferente de lo que recibirían de su propia madre en caso de la crianza natural al pie, no sólo en el ámbito nutricional sino en el específico relacionado con el BLV. Como consecuencia probable, los que presenten menores niveles de inmunidad calostral estarían en situación de desventaja frente a la infección oral potencial provocada por la leche y necesitarían mayor potencial neutralizante en la misma, para poder detener la infección por consumo. 0287 EVALUACIÓN DE LA CERTEZA DE DIFERENTES TÉCNICAS SEROLÓGICAS PARA LA MEDICIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA PROTEÍNAS CAPSIDALES DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA EN SUEROS BUBALINOS JM Sala1, MV Trotta2, R Pereyra2, M Pérez Filgueira2, SG Caspe1, AV Capozzo2 1 INTA. Estación Experimental Mercedes Corrientes, Argentina. 2 INTA. CICVyA. Instituto de Virología., Argentina. El búfalo es considerado un reservorio del virus de la fiebre aftosa en estado portador, siendo capaz de transmitir la enfermedad por contacto directo. La producción bubalina en Argentina ha ido en constante crecimiento en los últimos años, principalmente en zonas marginales, como la Mesopotamia Argentina, lo que implica un alto riego por la condición de esta zona como área de frontera con países limítrofes endémicos desde los cuales puede ingresar la enfermedad al país. Nuestro objetivo fue evaluar la precisión de diferentes métodos serológicos, tradicionales y novedosos, para determinar los niveles de anticuerpos protectores contra el virus de la fiebre aftosa en sueros de búfalos vacunados y no vacunados con la vacuna oficial contra fiebre aftosa. Se utilizaron 94 sueros de búfalos de los cuáles 27 tenían títulos seroneutralizantes inferiores a 1,6 para la cepa O1 Campos y 64 tenían títulos superiores a este valor. Este título es el establecido como punto de corte para estimar una protección del 75%. Los sueros fueron evaluados mediante la técnica de ELISA en fase líquida (FL-ELISA) que es tradicionalmente utiliza para determinar protección en bovinos y cuyos resultados correlacionan con los títulos seroneutralizantes para esta especie. Se ensayó la misma técnica revelando con anticuerpos monoclonales (FL-ELISA/Mabs) o con suero hiperinmune de cobayo (FLELISA/SHI). Además se desarrollaron un ELISA indirecto (IE) y un ELISA de avidez (EA) de dilución única y se establecieron los puntos de corte mediante un análisis ROC. Los resultados obtenidos por ELISA-FL no correlacionaron con los de seroneturalización viral (SNV). Identificamos numerosos sueros de alto título por SNV que eran negativos en ELISAFL. Tomando con estándar de oro el ensayo de seroneturalización viral (SNV), calculamos sensibilidad y especificad de cada técnica. Los ELISAsFL y el IE presentaron una sensibilidad superior al 90% pero una especificidad que no superó el 56% (valor obtenido por el IE). Por el contrario, el ELISA de avidez fue altamente sensible (90%) aunque su especificidad fue baja (56%). Estos resultados muestran que, a diferencia de lo que se observa en bovinos, los sueros bubalinos no pueden ser evaluados únicamente por FL-ELISA ya que muchos de los animales positivos serían clasificados como negativos. Sin embargo, si se combinan dos técnicas en paralelo, por ejemplo los dos ELISAs de dilución única, se podría alcanzar una certeza diagnóstica del 92%, aumentando la sensibilidad y especificidad a valores superiores al 90%. Esto permitiría obtener los mismos resultados que con el ensayo de seroneutralización viral pero corriendo 40 sueros en una sola placa, obteniéndose el resultado en 6 horas de trabajo, y sin trabajar en condiciones de bioseguridad. Este es el primer trabajo que analiza la certeza diagnóstica de ensayos tradicionales y novedosos para el diagnóstico indirecto de protección contra el virus de la fiebre aftosa en búfalos. 0298 ESTUDIO COMPARADO DE MÉTODOS COMPUTACIONALES PARA LA CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA INTERACCIÓN ENTRE EL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA Y RECEPTORES CELULARES DE TIPO INTEGRINA. R Marrero1, G König1 2 1 Laboratorio de Virus Animales, Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA Castelar, Argentina. 2 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET), Argentina. El Virus de la Fiebre Aftosa (VFA) pertenece al grupo de los picornavirus y es el agente etiológico de una enfermedad de alto impacto agroeconómico. El reconocimiento y unión entre las partículas virales y las células hospedadoras ocurre mediante la interacción entre el denominado motivo RGD de la proteína viral 1 y las integrinas celulares. Dicho motivo se encuentra en el sitio A (SA) y posee una conformación funcional específica en dicha interacción. Esta es la principal conformación reconocida por el sistema inmune del hospedador. En el presente trabajo hemos realizado un análisis computacional-estructural de todas las posiciones aminoacídicas del SA (sitio antigénico inmunodominante) de VFA y caracterizado su aporte en la interacción con integrinas de células BHK-21 e integrinas bovinas. Nuestro objetivo es estudiar mediante diferentes análisis computacionales, la influencia de mutaciones aminoacídicas puntuales en el SA de VFA en la interacción con su receptor natural y realizar una prospección del espacio de secuencia tolerado en dicha interface de interacción con las integrinas. En este sentido, desarrollamos modelos de la estructura atómica de integrinas como la αVβ3 de células BHK-21, mediante programas que basan la construcción del modelo atómico en homólogos estructurales (Phyre2) o mediante el llamado abordaje de “primeros principios” o ab initio (i-Tasser). La información de secuencias de integrinas y estructuras atómicas homologas provinieron de bases de datos públicas. Posteriormente, se modelizó la estructura cuaternaria y ajustó la interacción de estas integrinas con un péptido representativo del SA de VFA mediante programas de ajuste conformacional de la cadenas peptídica y de las cadenas laterales de los aminoácidos (flexPepDock). Los modelos atómicos de los complejos de interacción obtenidos, fueron el dato de entrada para programas como FoldX u otros programas basados en el paquete Rosetta (Backrub), los cuales realizan propiamente el modelado de las mutaciones puntuales en el SA y determinan la estabilidad energética o la energía de interacción de los complejos. Nuestros resultados computacionales expresados como categorías de interacción, concuerdan con resultados publicados, provenientes de experimentos funcionales in vitro de inhibición de la infección de VFA en células BHK-21. En resumen, nuestros datos in silico coinciden en la relevancia de residuos como ARG y ASP del motivo RGD así como de las residuos R+1 y R+4 en el sitio A, y muestran (sumado a estudio computacionales previos de interacción del sitio A con anticuerpos) que los actuales programas computacionales de uso libre son una opción factible para el estudio de estos fenómenos de interacción y para asistir el diseño racional de antígenos vacunales. 0306 CONSTRUCCION DE UN HERPESVIRUS BOVINO TIPO 5 DELECIONADO EN EL GEN RELACIONADO A LA LATENCIA (LR) CA Silvestro, AC Bratanich Facultad de Ciencias Veterinarias - UBA, Argentina. Herpesvirus bovino tipo 1 y 5 (BoHV-1 y BoHV-5) son alfa-herpesvirus que afectan la industria ganadera y se caracterizan por generar latencia en ganglios sensoriales. El gen Relacionado a la Latencia (LR) es el único transcripto hallado en BoHV-1 durante la latencia, y posee acción antiapoptótica durante la infección aguda y la reactivación. Sin embargo, se desconoce si posee igual acción en BoHV-5. Para evaluarlo se construyó un BoHV-5 delecionado en el promotor mínimo del gen LR para anular su expresión sin alterar la expresión del gen bICP0 codificado en su cadena opuesta. Para facilitar la detección de los virus recombinantes se utilizo el gen reportero de la proteína verde fluorescente (GFP). En una primera etapa, se amplificó el gen de GFP a partir del plásmido eGFP-C1 usando cebadores específicos conteniendo sitios de restricción para facilitar los clonados posteriores (EcoRV y HindIII en GFP for, y sitios XbaI y SspI en GFPrev. El amplicón de 1570 pares de bases fue clonado en pGem T-Easy. A partir de construcciones previamente realizadas con el gen LR, se extrajeron dos fragmentos flanqueantes al promotor de LR5 para utilizar como sitios de recombinación que fueron clonados en ambos extremos del gen reportero. El vector recombinante se purificó, secuenció y se transfectó 123 Libro de resúmenes en células CRFK para probar la integridad y funcionalidad de la GFP que codifica. Posteriormente se co-transfectaron células CRFK con 5ug del plásmido recombinante purificado linealizado y 10ug de ADN de BoHV5 cepa A663. Veinticuatro horas más tarde se transfirieron las células a placas de 35mm y se cubrió con medio de crecimiento adicionado con metilcelulosa 1x. Cuando se evidenciaron placas de lisis, se procedió al aislamiento de las que presentaban expresión de GFP en la totalidad de sus células y se infectó una nueva monocapa. Se realizaron 6 plaqueos sucesivos similares al anterior para la purificación del clon infeccioso recombinante. Los extremos de recombinación se secuenciaron para corroborar la correcta integración de la GFP y la ausencia de las 500 pares de bases correspondientes al promotor de LR se confirmó por PCR. Estudios para verificar la ausencia del transcriptos a partir del gen de LR están en desarrollo. En los primeros ensayos en células MDBK con el virus recombinante se observó morfología típica a una infección por herpesvirus. Ensayos de cinética de crecimiento y tamaño de placa están en progreso. Este virus permitirá realizar ensayos para evaluar características del gen LR, entre ellas su rol en la apoptosis durante la infección lítica, establecimiento de latencia y reactivación. 0326 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE RECOMBINANTES NATURALES ENTRE HERPESVIRUS BOVINO 1 Y 5 (BOHV1 Y BOHV5) SS Maidana1 2 3, MI Craig2, A Mauroy4, E Thiry4, SA Romera1 2 3 1 CONICET, Argentina. 2 INTA, Argentina. 3 Universidad de Moron, Argentina. 4 Universidad de Liege, Bélgica. La subfamilia Alfaherpesvirinae agrupa agentes virales de importancia médica y económica tanto en el hombre como en los animales. La gran diversidad en esta subfamilia lleva a considerar a los mecanismos de recombinación como responsables de la diversidad favoreciendo la adquisición de propiedades “nuevas” en una cepa viral. Uno de los tipos de recombinación es la homóloga que se basa en un alto grado de similitud genética. Aunque también, se reportó recombinación interespecífica en condiciones experimentales, con un bajo nivel de homología como BoHV1 y BoHV5. En Argentina se ha demostrado la cocirculación de algunos de los alfaherpesvirus de rumiantes como el BoHV1/5. Si bien se han obtenido y caracterizado recombinantes in vitro entre estas especies virales aún no se han hallado recombinantes naturales. Nuestro grupo ha reportado la circulación en Argentina de 2 de los tres subtipos de BoHV5, los subtipo “b” y “a”, siendo este último el más prevalente. Los 3 aislamientos de subtipo “b” al ser analizados por filogenia basada en algunos genes, mostraron agrupamientos diferentes, ciertas regiones del genoma se agrupan con BoHV5 y otras con BoHV1, sugiriendo que estos virus podrían ser recombinantes naturales. Surge entonces como objetivo caracterizar molecularmente los virus donde se identificaron zonas genómicas foráneas en un determinado fondo genético y hallar los sitios de recombinación. Para la determinación del background genético se usó la estrategia de amplificación por PCR de fragmentos de genes a lo largo de todo el genoma y secuenciación de los mismos para localizar el o los puntos de recombinación. Los oligonucleótidos fueron diseñados en base a las secuencias disponibles en GenBank. Las secuencias nucleotídicas fueron editadas y analizadas con el BioEdit version 7.0.5.3. Los alineamientos se realizaron Clustal W. MEGA 5.0 software. Y finalmente las secuencias nucleotídicas de los diferentes fragmentos génicos fueron concatenados, alineados y sometidos a los programas RDP4 y Simplot. Se hallaron dos puntos de recombinación en la región única larga dentro del marco de lectura del gen UL27. Un punto de recombinación abarca desde el nt 56578 al 56586 y el otro desde el nt 58848 al 58855 (basándonos en el genoma de BoHV5 NC_005261.2) observándose un fragmento de recombinación de 2273 pb con 100% de identidad con el genoma de BoHV1.2b. El resto del genoma fue analizado amplificando fragmentos de 5 genes de la región UL (UL53, UL44, UL42, UL22 y UL10) y US (US8 y US6) resultando en un 100% de identidad nt con el genoma de BoHV5a. Los resultados demuestran que es posible la recombinación homóloga natural entre BoHV1y BoHV5 observándose en los 3 aislamientos de campo de BoHV5b reportados hasta el momento el mismo evento de recombinación. 0328 CARACTERIZACIÓN DE INFECCIÓN, TRANSMISIÓN Y SUSCEPTIBILIDAD DEL AISLAMIENTO ARGENTINO DE BUHV1 EN BÚFALOS Y BOVINOS SS Maidana1 2 3, F Delgado2, L Vagnoni2, A Mauroy4, E Thiry4, SA Romera1 235 1 CONICET, Argentina. 2 INTA, Argentina. 3 Universidad de Moron, Argentina. 4 Universidad de Liege, Bélgica. 5 Universidad del Salvador, Argentina. En la República Argentina, la explotación ganadera ocupa un lugar preponderante de la economía nacional. Gran porcentaje de las pérdidas que tienen lugar en la ganadería son debidas a la incidencia de enfermedades infecciosas ya sea de origen viral, bacteriano, o parasitario. En las últimas décadas se inició una intensa búsqueda de nuevas alternativas de producción de carnes no tradicionales en sistemas naturales o silvestres (búfalos, ciervos, llamas y la tradicional explotación de cabras). La producción de búfalo ha crecido en los últimos años principalmente en el NEA y centro de nuestro país por lo que resultó de interés determinar la circulación de virus de importancia económica en rodeos bubalinos y evaluar su patogenia en estudios controlados de infección. El objetivo de este trabajo fue estudiar el comportamiento in vivo de uno de los aislamientos bubalinos previamente obtenidos de un animal asintomático mediante pruebas experimentales de infección y transmisión a bovinos vírgenes. Dos bovinos y dos búfalos, de 6 meses, se infectaron por aerosolización intranasal con el aislamiento de BuHV1 (20287N) argentino previamente reportado. Además, dos bovinos centinela no recibieron virus, pero fueron alojados con los búfalos infectados para evaluar la transmisión horizontal. Después de la infección se registró excreción viral y los signos clínicos. Se realizó el examen histopatológico de diferentes tejidos y se analizó el establecimiento de latencia en los ganglios trigémino y tonsilas amplificando con la técnica de multiplex PCR-REA. La respuesta humoral se evaluó mediante seroneutralización y ELISA. Los búfalos inoculados experimentalmente se infectaron y mostraron excreción viral intermitente entre 2 y 18 días post infección (dpi) con un título máximo de log104.75 TCID50 / ml. Se observó una rinitis moderada entre los días 2 y 20 dpi e hipertermia a los 2 dpi. Los bovinos infectados experimentalmente con BuHV1 mostraron niveles de excreción (106 DICT50/ml y 105 DICT50/ml a los días 2 y 6 respectivamente) y un período de excreción similares a los observados en las infecciones con herpesvirus bovino. Se detectaron anticuerpos séricos 2.2 (log10) tanto en búfalos como en bovinos infectados experimentalmente 1.2 y 0.9 (log10) a los 21 dpi e IgA e IgG1 en los bovinos sentinelas a los 7 días después del contacto. También en el grupo centinela se detectó ADN viral en el ganglio trigémino y se observaron lesiones histopatológicas en diferentes tejidos. En conclusión, este estudio muestra que la patogenicidad de BuHV1 en búfalos fue similar a las provocadas por otros alfaherpesvirus en su hospedador natural. También se demostró que los bovinos son susceptibles de infección con BuHV1 tanto por infección experimental como por contacto con búfalos infectados. 0349 DINÁMICA DE LA EVOLUCIÓN VIRAL DE LAS CEPAS DE SEROTIPO A DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA DURANTE LA EPIDEMIA 2000-2002. MM Götte1 2, AM Perez2, C Perez3, GA König1 2 1 Inta Castelar, Argentina. 2 Conicet, Argentina. 3 SENASA, Coordinación de Laboratorio Animal, Argentina. Introducción La Fiebre Aftosa es una enfermedad viral altamente contagiosa. Durante los años 2000-2002 se produjo en Argentina la epidemia más grande de las últimas décadas, en la misma estuvieron involucradas dos cepas virales del serotipo A, identificadas como A2000 y A2001, distantes filogenéticamente. Objetivo Se estudió la dinámica de las cepas A2000 y A2001 con el objetivo de determinar posibles focos de introducción de la enfermedad y las relaciones filogenéticas y filogeográficas de los brotes secuenciados y la dinámica de la epidemia a nivel nacional. Metodología 124 Libro de resúmenes Durante la epidemia 2000-2002 en Argentina, se produjeron múltiples brotes en todo el país, los cuales se muestrearon a nivel nacional, de manera proporcional a la cantidad de brotes ocurridos en cada mes y región, durante la fase de crecimiento exponencial de los brotes del virus. El genoma viral se amplificó por RT-PCR y luego se secuenció por el método de Sanger, obteniéndose en promedio, 4 lecturas de cada una de las posiciones en estudio. El ensamblado de los contigs se realizó, con el programa “Codon Code Aligner”. Las secuencias consenso se alinearon con el programa “BioEdit”. Se realizaron filogenias con los parámetros en default para hacer un reconocimiento inicial de la filogenia, luego se determinó el modelo molecular que mejor ajusta a los datos por medio del JMODEL test utilizando el AIC. Las filogenias se realizaron con “MEGA 5.05” por distintos métodos, distancias(Neighbor Joining), máxima parsimonia, y máxima verosimilitud. El fragmento de genoma analizado es de aproximadamente 2,2Kb, corresponde a la región completa que codifica para las proteínas estructurales (P1). Resultados y Discusión Se logró una buena cobertura muestral a lo largo de la fase de crecimiento exponencial de los brotes de la epidemia. Incluso, en los meses en los cuales se produjo el reemplazo de la cepa A2000 por la A2001 se generaron más secuencias con el objetivo de determinar la dinámica evolutiva de ambas cepas. En total se generaron 98 nuevas secuencias y se sumaron al análisis 25 secuencias obtenidas en otro estudio de nuestro laboratorio. En la filogenia obtenida se observa una completa separación de ambas cepas en clados totalmente independientes que probablemente correspondan a distintos focos de introducción de la enfermedad. A su vez, la cepa A2001 se puede categorizar en 3 subgrupos que muestran una tendencia a la asociación temporoespacial, aunque no exclusiva ya que se observa superposición de los grupos en ambas variables. En conclusión, la separación genética entre ambas cepas, se ve reafirmada en este trabajo, mientras que dentro del clado de la cepa A2001 se marca una tendencia a la diferenciación en subgrupos que en parte se superponen durante el proceso de reemplazo de los mismos en la fase de crecimiento exponencial de la epidemia. 0363 EVOLUCIÓN GENÓMICA DE PARVOVIRUS CANINO EN URUGUAY S Grecco, L Calleros, A Marandino, L Francia, V Casabone, Y Panzera, R Pérez Sección Genética Evolutiva, Departamento de Biología Animal, Instituto de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Uruguay. El parvovirus canino de tipo 2 (CPV) es un virus autónomo de ADN simple hebra de polaridad negativa de 5,2 kb. Su genoma codifica proteínas de cápside (VP1 y VP2) y no-estructurales (NS1 y NS2). Este virus genera la parvovirosis canina, una de las enfermedades infecciosas más comunes en canes de entre seis y doce semanas de edad, caracterizada por cuadros graves de gastroenteritis hemorrágica y alta tasa de mortalidad. Actualmente existen tres variantes de CPV distribuidas mundialmente en distinta proporción y con diferentes características genéticas, no existiendo una explicación clara de los mecanismos que generan y mantienen la variabilidad en las distintas poblaciones caninas. La clasificación de las variantes se basa en el aminoácido presente en la posición 426 de la proteína VP2: Asn (2a), Asp (2b) y Glu (2c). En Uruguay, cepas CPV-2c de origen europeo fueron prevalentes durante 2006-2010. A mediados del 2010, la población canina uruguaya fue invadida por una cepa CPV-2a de origen asiático. Está cepa 2a difieren en varias posiciones del genoma de la variante 2c, posiblemente como consecuencia de su diferente origen geográfico. El hecho que se encuentren circulando variantes muy divergentes en la población canina de nuestro país, permite analizar su dinámica poblacional y la existencia de eventos de co-infección y recombinación. En este trabajo se analizaron muestras fecales de perros con síntomas presuntivos de parvovirosis canina obtenidas durante el 2012 a 2014 en Uruguay. Para la clasificación se utilizó un sistema de PCR-RFLP que distingue rápidamente las variantes 2c. Se amplificó el genoma completo de algunas cepas de distintas regiones del país utilizando un protocolo de long-PCR diseñado en nuestro laboratorio. La mayoría de las muestras pertenecieron a la variante 2a, indicando que esta variante ha desplazado casi completamente a la variante 2c en nuestro territorio. La secuenciación del genoma confirmó que ambas variantes presentan diferencias nucleotídicas y aminoacídicas en los genes NS y VP. Se detectó una cepa recombinante entre una variante 2a y una 2c. A pesar de su corta historia evolutiva debido a su reciente surgimiento, CPV es un virus de gran variabilidad y capacidad dispersiva que lo convierte en un interesante modelo evolutivo. Los resultados indican que Uruguay presenta un escenario epidemiológico único caracterizado por dos eventos de invasión y reemplazo por cepas que se originaron en diferentes continentes. 0370 PRIMERA CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE CEPAS DE CAMPO URUGUAYAS DEL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA L Maya1, R Puentes2, R Colina1 1 Regional Norte- CENUR Litoral Norte, UdelaR, Uruguay. 2 Facultad de Veterinaria, UdelaR, Uruguay. El virus de la Diarrea viral Bovina (BVDV) es un virus económicamente importante siendo una de las causas más importantes de desórdenes reproductivos en bovinos a nivel mundial. Este virus además tiene gran impacto a nivel productivo dado que causa otros tipos de afecciones clínicas como ser desordenes gastrointestinales, distrés respiratorio, inmunodepresión y enfermedad de las mucosas. El BVDV es un virus envuelto de genoma de ARN simple hebra de polaridad positiva de 12.5 Kb de longitud con un único marco abierto de lectura (ORF) que codifica para una única poliproteína que luego de la traducción es procesada por proteasas virales y celulares para dar lugar a las proteínas estructurales y no- estructurales del virión. En los extremos 5' y 3' del genoma se encuentran las regiones no traducidas (UTR), 5' UTR y 3' UTR, respectivamente. En base al análisis filogenético de la 5’UTR y la proteasa viral Npro de BVDV se han reconocido 2 genotipos virales: BVDV-1 que se subdivide en 20 subtipos virales BVDV-1a-t; y BVDV-2 que se subdivide en 3 subtipos, BVDV-2a-c. Hace pocos años se empezó a detectar un nuevo genotipo de BVDV denominado BVDV-3 del cual se han descripto 3 subtipos BVDV-3a-c. En la región se han detectado los 3 genotipos de BVDV. En Brasil se han descrito los subtipos BVDV-1a, 1b, 1d, BVDV-2b y BVDV-3. En Argentina se ha reportado la circulación únicamente del BVDV-1, y de sus subtipos 1a, 1b y 1c. En Uruguay se sospecha que BVDV es un problema importante a nivel reproductivo y productivo, y solo el 3% de los productores realiza la vacunación ya que no es obligatoria en Uruguay. BVDV fue detectado por primera vez en 1996 mediante inmunohistoquímica. El único estudio publicado en BVDV en Uruguay es serológico con muestras del 2000-2001 y reveló 100% de BVDV en todos los rodeos del país, y una prevalencia de 67% promedio en los rodeos. Con el objetivo de actualizar los datos sobre la incidencia de BVDV y cuales genotipos y subtipos de BVDV circulan en Uruguay, durante el año 2014 387 animales no vacunados de 14 establecimientos con animales con sintomatología clínica característica de la infección por BVDV provenientes de diferentes puntos de Uruguay fueron escogidos de manera aleatoria para ser testeados mediante ELISA indirecto y de captura. De las 388 muestras analizadas, 77% (298/387) fueron positivas a anticuerpos y 2.8% (11/387) fueron positivas al antígeno mediante ELISA. La genotipificación de estas muestras mediante el análisis filogenético con la 5’UTR y la región de la Npro con cepas representativas de BVDV-1, BVDV-2 y BVDV-3 obtenidas de la base de datos del Genbank reveló que 9 muestras son del subtipo BVDV-1a, 1 del BVDV-1i de BVDV-1; y 1 muestra del subtipo BVDV-2b de BVDV-2. Estos resultados que dan a conocer por primera vez en nuestro país la circulación los genotipos BVDV-1 y BVDV-2 brindan información preliminar para dar el puntapié inicial para realizar planes de contingencia contra este virus. 0373 SUSCEPTIBILIDAD DE CULTIVOS PRIMARIOS DE TIROIDES AL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA Y SU RELACIÓN CON LA EXPRESIÓN EN SUPERFICIE DE LA INTEGRINA ALFA-V BETA-6 JM Schammas1, SV Di Giacomo1, DO Bucafusco1 2, JF Pega1 2, AV Capozzo1 2, O Zábal1, M Perez Filgueira1 2 125 Libro de resúmenes 1 Instituto de Virología, CICVyA, INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina. El virus de la fiebre aftosa (VFA) es capaz de utilizar integrinas de la familia αv para el ingreso a las células de sus huéspedes naturales. En particular, αvβ3 y αvβ6 parecen jugar un rol importante en la patogenia, siendo αvβ6 la posible vía de entrada principal en bovinos. Actualmente, la línea celular BHK-21 se utiliza de manera estándar para el aislamiento y propagación de VFA, así como para la producción de antígeno vacunal. Sin embargo, esta línea establecida presenta baja permisividad, y por lo tanto baja sensibilidad, a la replicación viral cuando el virus es aislado desde huéspedes naturales, tal como ocurre en los brotes a campo. A su vez, la replicación del virus en BHK-21 selecciona variantes que utilizan una vía secundaria de entrada, a través de receptores de heparán sulfato, perdiendo al mismo tiempo la capacidad de infectar a los huéspedes naturales. El cultivo primario de tiroides bovina ha demostrado ser uno de los de mayor sensibilidad y con mayor espectro de susceptibilidad para los diferentes serotipos, aunque su producción resulta costosa y, por ser un cultivo primario, posee baja repetitividad. Más aún, la propagación de estos cultivos y su pasaje consecutivo con el fin de establecer líneas celulares, trae como consecuencia una rápida y marcada caída de la susceptibilidad a la infección por VFA. En este trabajo se buscó estudiar la posible relación entre la expresión en membrana de la integrina αvβ6 y la pérdida de susceptibilidad en los primeros pasajes a partir de un cultivo primario de tiroides para la cepa O1/Campos de VFA. Para ello se desarrolló una metodología de cuantificación de la integrina αvβ6, basada en citometría de flujo para determinar sus patrones de expresión. Con esta técnica se caracterizaron los perfiles de las subpoblaciones celulares presentes en los cultivos de tiroides bovina, así como en distintas líneas celulares establecidas (BHK-21, LFBK, LFBKαvβ6, CHO-K1). Esta herramienta fue también utilizada para cuantificar la expresión de esta integrina en pasajes consecutivos de cultivos primarios de tiroides. Los resultados permitieron demostrar que la pérdida de sensibilidad a muy tempranos pasajes de un cultivo de tiroides bovina se ve acompañada de la pérdida de la expresión del receptor celular αvβ6. También en base a su expresión se pudo identificar una población de células de potencial estirpe epitelial que son capaces de expresar la integrina, lo cual puede constituir una herramienta valiosa para la evaluación y, por tanto, de mejora de los cultivos de tiroides bovina producidos. Los resultados en su conjunto sugieren que esta integrina jugaría un rol importante en la sensibilidad de una línea celular, aunque no exclusivo, por lo que es probable que otras integrinas de la familia αv puedan contribuir para determinar más acabadamente el perfil de susceptibilidad al VFA de los cultivos celulares. 0376 EVALUACIÓN DE LA PROTECCIÓN CRUZADA DE CEPAS VACUNALES DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA FRENTE A CEPAS HETERÓLOGAS EN BOVINOS SV Di Giacomo1, DO Bucafusco1 2, JM Schammas1, JF Pega1 2, DA Malacari1, K Guevara3, S Cardillo3, A Fernández Acevedo3, C Pérez Beascoechea4, E Maradei4, AV Capozzo1 2, M Perez Filgueira1 2 1 Instituto de Virología, CICVyA, INTA, Argentina. 2 CONICET, Argentina. 3 Biogénesis-Bagó S.A., Argentina. 4 DILAB, SENASA, Argentina. La amplia diversidad antigénica del virus de la fiebre aftosa (VFA) puede dificultar la aplicación de estrategias vacunales durante la aparición de un brote debido a la escasa la protección cruzada entre diferentes cepas, aún dentro de un mismo serotipo. Por esta razón, es esencial conocer los mecanismos y variables para la generación de protección heteróloga. Para este trabajo se formularon 3 vacunas experimentales en adyuvante oleoso: monovalente de la cepa A24/Cruzeiro (40 ug/dosis, vacuna A), monovalente de la cepa A24/Cruzeiro (10 ug/dosis, vacuna B), y trivalente (vacuna T) con las cepas A24/Cruzeiro (10 ug/dosis), O1/Campos (20 ug/dosis) y C3/Indaial (10 ug/dosis). Con estas vacunas se inmunizaron grupos de bovinos (n=5) y se generaron 4 grupos experimentales A: el grupo 1 recibió una dosis de la vacuna A, el grupo 2 una dosis de la vacuna B, el 3 una dosis de la vacuna T y el grupo 4, dos dosis de la vacuna A (a los 0 y 15 días post-vacunación, dpv). Dos bovinos no se vacunaron y funcionaron como grupo testigo. Todos los grupos (y los animales testigo) fueron infectados a los 30 dpv con la cepa heteróloga A/Arg/2001 (10e4 DICT50% por vía IDL) y se verificó la aparición de vesículas en las patas a los 7 días post-infección (dpi). Se tomaron muestras de suero y sangre a distintos tiempos antes y después del desafío viral, y se midieron diferentes parámetros de la inmunidad inducida y de la patogenia. Mientras que ambos testigos se enfermaron, ninguno de los animales del grupo 3 y 4 mostraron signos de la enfermedad a los 7 dpi. Los grupos con una dosis de vacuna monovalente mostraron 1 (grupo 1) y 2 bovinos (grupo 2) con lesiones y síntomas de la enfermedad, aunque en forma menos severa y más retrasada que los testigos. Comparativamente, los síntomas fueron más severos en los testigos, seguidos por los del grupo 2 y los del grupo 1. También es interesante marcar que a pesar de poseer igual masa antigénica total (40 ug/dosis), los animales inmunizados con la vacuna T (grupo 3) no mostraron síntomas de la enfermedad, por lo que es probable que la mayor variedad antigénica favorezca la protección contra cepas heterólogas no incluidas en la vacuna. Las respuestas cruzadas de Ac fueron más restringidas inter-serotipo que intraserotipo y las de IFN-γ heterólogas se vieron más limitadas para el serotipo O. A su vez, la vacuna trivalente fue la de mayor promedio de producción de IFN-γ contra la cepa heteróloga. Por último, es interesante marcar que los porcentajes de avidez de los sueros a 30 dpv contra la cepa heteróloga mostraron mejor correlación con la protección al desafío que los títulos de Ac medidos a ese tiempo por ELISA contra la cepa A/Arg/2001. En conjunto, estos resultados indicarían que la mayor masa antigénica puede mejorar la protección cruzada pero también la multivalencia y que es necesario considerar otros aspectos de la inmunidad, además de los títulos totales por ELISA, para valorar adecuadamente la protección heteróloga. Sala D (Salón Rodin - 2º piso) 14:30 - 16:00 hs. Antivirales 0032 ACTIVIDAD ANTIVIRAL DE LOS CARRAGENANOS FRENTE A LA INFECCIÓN DE DENGUE SEROTIPO 3 EN CÉLULAS DE MAMÍFERO LE Piccini, V Castilla, EB Damonte Laboratorio de Virología, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA - IQUIBICEN, CONICET, Argentina. El virus del dengue (DENV) es un arbovirus perteneciente a la familia Flaviviridae, transmitido al hombre por los mosquitos Aedes aegypti y Aedes albopictus. Los cuatro serotipos de DENV (DENV1-4) son causantes de una enfermedad febril aguda, benigna y auto-limitada (fiebre del dengue), o de formas clínicas más severas y potencialmente letales (fiebre hemorrágica de dengue y síndrome de shock por dengue). Actualmente urge la necesidad del desarrollo de agentes antivirales para la quimioterapia, ya que no se dispone de vacunas ni de drogas específicas. La entrada viral se presenta como una alternativa atractiva para la intervención terapéutica, ya que bloquearía el comienzo de la infección. Estudios previos han demostrado que los polisacáridos sulfatados interfieren en la interacción receptorglicoproteína E viral. Dentro de este grupo, los carragenanos aislados de algas marinas presentaron una potente actividad antiviral frente a los serotipos DENV-2 y DENV-3 en células Vero y HepG2 mientras que no inhibieron la multiplicación de DENV-1. El objetivo del presente trabajo fue extender el estudio del mecanismo de acción de los carragenanos lambda y iota sobre la infección de DENV-3 en células Vero y A549. Ambos carragenanos presentaron actividad antiviral contra DENV-3 en los dos tipos celulares, con valores de concentración efectiva 50% de 0,5-0,7 µg/ml, determinados mediante ensayos de inhibición del rendimiento viral. También se observó una inhibición del orden del 90% en el número de células que expresan la glicoproteína viral por inmunofluorescencia indirecta. La ausencia de citotoxicidad sobre ambas células hasta la máxima concentración probada de 1000 µg/ml, medida por el método colorimétrico del MTT, confirió a estos polisacáridos un alto índice de selectividad. La actividad antiviral de los carragenanos fue dependiente 126 Libro de resúmenes del tiempo de adición del compuesto no registrándose significativa reducción en el número de placas cuando se agregaron después de 1 h post-infección. Por lo tanto, se decidió evaluar su efecto sobre las etapas iniciales de adsorción e internalización viral. Se observó inhibición de la multiplicación viral en células Vero y A549 cuando los compuestos sólo estuvieron presentes durante el período de adsorción viral a 4°C o durante la posterior internalización a 37°C. En conclusión, la acción antiviral de ambos carragenanos tanto en células Vero como en células A549 afectó las etapas tempranas del ciclo de multiplicación viral, probablemente por interferencia en la interacción de la glicoproteína viral con los residuos de heparan sulfato de proteoglicanos de la superficie celular, molécula propuesta como receptor inicial en la infección con DENV. 0145 DISEÑO Y EVALUACIÓN DE MICROARN ARTIFICIALES PARA EL SILENCIAMIENTO DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA AP Currá, MI Gismondi, S Asurmendi, O Taboga Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA, Argentina. La fiebre aftosa es una enfermedad viral altamente contagiosa que afecta animales biungulados y que causa grandes pérdidas económicas. El agente etiológico es el virus de la fiebre aftosa (VFA), un pequeño virus compuesto por una cápside icosaédrica que alberga una molécula única de ARN de cadena simple y polaridad positiva. Las vacunas actuales contra VFA están basadas en virus inactivado químicamente y son muy efectivas para el control y la erradicación de la enfermedad, aunque presentan el riesgo de incorrecta inactivación o escape desde las plantas productoras. Además, requieren al menos 7 días para conferir protección. Por lo tanto, resulta de interés desarrollar estrategias antivirales alternativas, entre las que se ha propuesto la tecnología de interferencia de ARN (ARNi). La ARNi es un proceso de silenciamiento génico postranscripcional en eucariotas, inducido por pequeñas moléculas de ARN complementarias al gen silenciado. Entre ellas se encuentran los microARN (miR), que están codificados en el genoma celular. El empleo de miR artificiales (amiR) diseñados para reconocer secuencias no endógenas constituye una herramienta segura y eficiente para el silenciamiento de ARN de interés. En el marco del desarrollo de una estrategia antiviral contra VFA mediada por amiR, en este trabajo se propuso la expresión constitutiva de amiR dirigidos contra la región 3D de VFA y su evaluación frente a la infección viral. Se determinó experimentalmente la estructura secundaria de la región 3D mediante hSHAPE y se realizó una predicción in silico utilizando el programa RNAxs para la selección de 7 secuencias blanco de amiR. Se construyeron vectores de expresión de amiR complementarios a cada una de esas regiones, que se utilizaron en experimentos de transfección transitoria y estable en células BHK-21 para evaluar su actividad de silenciamiento frente a la infección con VFA mediante la cuantificación del tamaño y el número de las placas de lisis. En 5 de 7 líneas celulares establemente transformadas, el diámetro de las placas de lisis obtenidas fue significativamente menor al observado en células control. Además, en 2 de 7 líneas celulares se observó una reducción del número de placas de lisis. Estos resultados sugieren que la región 3D es un blanco apropiado para el silenciamiento de VFA mediante amiR y que su expresión constitutiva en cultivos celulares afecta la replicación viral. 0152 EL POLOXÁMERO PLURONIC® F127: ¿UN NUEVO ALIADO PARA EL TRATAMIENTO ANTIVIRAL CONTRA EL VIRUS HEPATITIS C? EA Gentile1, ML Cuestas1, CM Delfino1 2, AI Castillo1, N Eguibar1, P Perazzo1, JR Oubiña1, VL Mathet1 1 Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica (IMPAM, UBA-CONICET), Facultad de Medicina, UBA, Argentina. 2 Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida (INBIRS, UBA-CONICET), Facultad de Medicina, UBA, Argentina. La OMS estima que existen aproximadamente 170 millones de personas crónicamente infectadas con el virus hepatitis C (HCV) a nivel mundial y que más de 350.000 mueren cada año producto de patologías hepáticas asociadas con este virus. En la actualidad el tratamiento de la hepatitis C crónica consiste en la administración combinada de interferón-α pegilado, ribavirina y/o un inhibidor de proteasa. Desafortunadamente, esta terapia no se encuentra disponible a nivel global, es costosa, presenta generalmente una gran cantidad de efectos adversos que dificultan la adherencia del paciente a la misma, y la respuesta es dependiente del genotipo viral. Es por estas razones que existe en la actualidad una intensa búsqueda de nuevas drogas antiHCV o de nuevas estrategias terapéuticas -como el targeting hepáticoque sean capaces de reducir los efectos adversos y mejorar la eficiencia de la terapéutica actual. Los poloxámeros o Pluronics® son copolímeros anfifílicos compuestos por bloques hidrofílicos de óxido de polietileno (PEO) y bloques hidrofóbicos de óxido de polipropileno (PPO) que se ordenan en una estructura lineal, PEO-PPO-PEO, siendo utilizados para mejorar la solubilidad y estabilidad de numerosas drogas dado su acción surfactante. De hecho, muchos de estos compuestos, como el poloxámero F127, fueron aprobados por la FDA para su uso como excipientes de numerosas formulaciones medicamentosas y dispositivos biomédicos. No obstante, en los últimos años, se fueron acumulando evidencias que demuestran que estos compuestos no debieran ser generalmente reconocidos como seguros (en inglés, GRAS) dado que afectan numerosas vías de transducción de señales, incluidas las de las MAPK y aquellas en las que interviene NF-kB. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad antiviral del F127, lo que podría constituir una nueva estrategia para optimizar la terapéutica contra el HCV. Para ello, se emplearon dos replicones del HCV subgenotipo 1b derivados de la línea celular Huh7.5, uno con genoma completo (FL) y otro subgenómico (SG), que sólo expresa las proteínas no estructurales del virus. Dichos sistemas de replicación in vitro del HCV fueron incubados con F127 a la concentración más alta no citotóxica (1%) determinada mediante citometría de flujo utilizando anexina V-FITC/IP e hipodiploidía. Subsiguientemente, se determinó la carga viral en el sobrenadante de las células a diferentes tiempos (24, 72 y 96 h) mediante RT-PCR en tiempo real. Se determinó que el F127 es capaz de inhibir la replicación del replicón FL generando una disminución en los niveles de HCV-ARN cercana al 80% (n=3; p<0,05) a las 24 h, que persiste al menos por 96 h. Dicha disminución también fue observada en el sistema de replicación SG (n=3; p<0,05). Es necesario implementar estudios exhaustivos tanto en modelos experimentales in vitro como animales para evaluar la eventual aplicación de este compuesto en el tratamiento de pacientes que padecen hepatitis C crónica. 0154 LAS POLOXAMINAS O TETRONICS®: UN NUEVO UNIVERSO DE COMPUESTOS PARA EL TRATAMIENTO ANTIVIRAL CONTRA EL VIRUS HEPATITIS C EA Gentile1, ML Cuestas1, AI Castillo1, CM Delfino1 2, P Perazzo1, N Eguibar1, JR Oubiña1, VL Mathet1 1 Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica (IMPAM, UBA-CONICET), Facultad de Medicina, UBA, Argentina. 2 Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida (INBIRS, UBA-CONICET), Facultad de Medicina, UBA, Argentina. La hepatitis C crónica es un serio problema de la salud pública mundial, ya que afecta a aproximadamente 170 millones de personas y puede evolucionar a la cirrosis y al hepatocarcinoma celular. El tratamiento antiviral más utilizado en las 2 últimas décadas consistió en la administración de interferón-α pegilado combinado con ribavirina. Esta terapia tiene muy baja eficacia (40% en los casos asociados al genotipo 1b), es costosa, genotipo-dependiente y presenta numerosos efectos adversos, lo que dificulta la adherencia del paciente. Con el objeto de optimizar la terapéutica antiviral, actualmente se están realizando múltiples esfuerzos para aumentar el arsenal de fármacos anti-HCV eficaces mediante la síntesis de nuevas drogas. Las poloxaminas o Tetronics® son co-polímeros en bloque de óxido de polietileno (PEO) y de óxido de polipropileno (PPO) ramificados que presentan un grupo etilén-diamino central que les confiere la capacidad de aceptar protones a pH fisiológico. Más aún, estas moléculas exhiben una gran diversidad estructural -en lo que respecta a tamaños y balances hidrofílicos-lipofílicoslo que favorece su uso como nanotransportadores de numerosas drogas, principalmente del tipo de las micelas poliméricas, aumentando de esta manera la solubilidad –y 127 Libro de resúmenes por ende, la biodisponibilidad- de numerosos fármacos. El objetivo del presente estudio fue evaluar la capacidad anti-HCV de las poloxaminas T304, T904, T1107 y T1301 como una estrategia novedosa, viable y de bajo costo para intentar mejorar la terapéutica de la hepatitis C crónica. Para ello se utilizó un sistema de replicación in vitro derivado de la línea celular Huh7.5 conteniendo el genoma completo (FL) del HCV subgenotipo 1b, internacionalmente empleado para el análisis de la actividad de drogas anti-HCV. Se determinó la concentración más alta no citotóxica de cada una de las poloxaminas mediante la medición de apoptosis celular/necrosis utilizando citometría de flujo para anexina VFITC/IP e hipodiploidía. Se colocó en el medio de cultivo del replicón cada una de las poloxaminas en la concentración correspondiente y se evaluó a las 24 h la capacidad de las mismas de inhibir la replicación viral mediante la medición de los niveles de HCV-ARN en los sobrenadantes de dichos cultivos mediante RT-PCR en tiempo real. Los ensayos se realizaron por triplicado y se consideró significativo un p<0,05. Todas las poloxaminas a las concentraciones ensayadas (T304 1%, T904 0,01%, T1107 0,1 % y T1301 0,01%) fueron capaces de inhibir en al menos un 50% la replicación del HCV. Este estudio aporta la primera evidencia en la que se demuestra la actividad antiviral de esta familia de moléculas. En conclusión, las poloxaminas podrían constituir una nueva plataforma nanotecnológica como adyuvantes para mejorar la eficacia de la farmacoterapia actualmente empleada en el tratamiento de pacientes con hepatitis C crónica a costos mucho más accesibles. 0157 NANOANTICUERPOS VHH ANTI-VP6 DISMINUYEN LA EXCRECIÓN VIRAL Y LA SEVERIDAD DE LA INFECCIÓN POR ROTAVIRUS A L Maffey, CG Vega, L Garaicoechea, V Parreño Instituto de Virología, CICVyA, INTA-Castelar, Argentina. Los Rotavirus Grupo A (RVA) causan cada año 453.000 muertes de niños menores de 5 años, la mayoría de las cuales ocurren en países pobres. Se evaluó la eficacia de dos clones de nanoanticuerpos VHH anti-VP6 -2KD1 y 3B2- para la prevenir y tratar la diarrea por RVA en un modelo de ratón lactante. Ensayo de Prevención: los ratones recibieron una dosis diaria de VHH desde los 4 días de vida, por 7 días: Grupo G1 2KD1+3B2 (80 µg c/u), G2 2KD1+3B2 (100 µg c/u), G3 no tratado. Al día 5 fueron inoculados con RVA murino (EcW) 2 horas post tratamiento. Se evaluó presencia de diarrea por RVA. Los ratones se sacrificaron secuencialmente de 1-7 días post-inoculación (dpi) tomándose muestras de intestino y suero. Los grupos pre-tratados redujeron significativamente la carga viral en intestino (p=0,009) y heces (p=0,006) y la duración de la diarrea (p=0,008) respecto del grupo no tratado. Ensayo de Tratamiento: los lactantes fueron inoculados a los 4 dias de vida y recibieron el tratamiento con VHH entre 1 y 7 dpi: G4 2KD1+3B2 (80 µg c/u), G5 2KD1+3B2 (100 µg c/u), G6 3B2 (200 µg ), G7 2KD1 (200 µg ), G8 no tratado. La administración terapéutica de cada uno de los clones de VHH o la combinación de ambos redujo significativamente la carga viral en intestino (p= 0,02) y heces (p=0,007), respecto del control no tratado. Sin embargo, dado que se trataba de ratones pre- desafiados, el tratamiento no logró modificar el curso de la diarrea. Un último grupo fue inoculado al cuarto día de vida y tratado desde los 2 dpi (al momento de inicio de la diarrea) para evaluar el efecto del inicio del tratamiento: G9 2KD1 (200 µg, 2dpi). El tiempo de administracion la primer dosis no interfirio en el efecto protector observado frente a la excrecion viral (G7 vs. G9). Con respecto a la respuesta inmune, todos los grupos tratados seroconviriteron frente a RVA, mostrando elevados niveles de anticuerpos anti-RVA IgA en intestino e IgG en suero, aunque menores que los del grupo no tratado, coincidentemente con infecciones menos severas. Los resultados obtenidos sugieren que la terapia con VHH sería una herramienta de prevención muy efectiva y una potencial opción terapéutica contra la diarrea asociada a RVA. 0167 DERIVADOS DE BENZIMIDAZOL INHIBIDORES DE LA ENTRADA DEL VIRUS DE LA DIARREA BOVINA A LA CÉLULA HUÉSPED POR INTERACCION CON LA GLICOPROTEINA DE ENVOLTURA E2 MJ Pascual1, F Merwaiss1, E Leal2, M Bollini2, DE Alvarez1 1 Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, UNSAM-CONICET, Argentina. 2 Departamento de Química Orgánica, Facultad de Farmacia y Bioquímica-UBA, Argentina. El virus de la diarrea viral bovina (BVDV) es un patógeno del ganado vacuno. La infección con BVDV reduce la productividad causando pérdidas económicas para la industria ganadera. La partícula viral comprende una membrana lipídica asociada a dos glicoproteínas de envoltura E1 y E2, que rodean a la nucleocápside que contiene el genoma de RNA del virus. E2 cumple un rol fundamental para la entrada del virus a la célula huésped dado que interacciona con receptores en la superficie de la célula que median la endocitosis de la partícula viral, y es esencial en la fusión de la envoltura del virus con la membrana del endosoma en medio ácido para liberar el genoma de RNA en el citoplasma de la célula infectada. La reciente determinación de su estructura cristalina reveló que E2 no es una proteína de fusión canónica abriendo nuevas perspectivas en el estudio del mecanismo molecular de la entrada de BVDV. El objetivo de este trabajo es usar E2 como blanco de pequeñas moléculas para inhibir la entrada de BVDV y determinar las bases moleculares de su mecanismo de acción. Para este fin se empleó el diseño guiado por computadoras para identificar compuestos líderes que interaccionan con E2 in silico y se realizó luego un screening de actividad antiviral mediante ensayos de reducción del efecto citopático en células en cultivo. Como resultado se identificó un derivado de benzimidazol con actividad antiviral en el rango micromolar que además no presentaba un efecto citotóxico sobre células MDBK. Con el fin de evaluar en qué etapa de la infección (adsorción, entrada ó replicación) actuaba este compuesto se realizaron ensayos de tiempo de adición. Se observó que el número de focos de infección disminuye cuando el compuesto se agrega luego de la adsorción sugiriendo que la inhibición ocurre durante la entrada. Por otra parte se realizó un ensayo de selección de virus resistentes mediante pasajes seriados de BVDV en presencia de concentraciones crecientes del compuesto y se secuenció la región que codifica para E2 con el fin de identificar las mutaciones que confieren resistencia antiviral y determinar el blanco molecular del compuesto. Finalmente, se estudió la interacción directa de este compuesto con E2 usando un ensayo de espectrometría de fluorescencia para medir la unión del compuesto a una versión recombinante de la glicoproteína E2 en solución. Nuestros resultados indican que el derivado de benzimidazol inhibe la entrada de BVDV a la célula huésped a través de la unión a E2 bloqueando presumiblemente el paso de la fusión de la envoltura viral con la membrana endosomal. 0183 EFFECT OF NATURAL PRODUCTS DERIVATIVE FROM SCHINUS TEREBINTHIFOLIUS AND PUNICA GRANATUM ON ARBOVIRUS REPLICATION MDF de Meneses1, TS Salles1 4, RM Campos1, CM Malnero2, IE Bergmann2, V Malirat2, RM Kuster3, MRS da Silva4, DF Ferreira1 1 Laboratório de Interação Vírus Célula, Departamento de Virologia, Instituto Microbiologia Prof. Paulo de Góes. Centro de Ciência e Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Rio de Janeiro, Brasil. 2 Centro de Virologia Animal, Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. Cesar Milstein (ICT Milstein/CONICET), Buenos Aires, Argentina. 3 Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, Centro de Ciências da Saúde, UFRJ, Rio de Janeiro, Brasil. 4 LAMMP, Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Centro Tecnológico, UFRJ, Rio de Janeiro, Brasil. Many human diseases are caused by arboviruses, the symptoms can range from mild febrile illness to encephalitis and death. Recently, American continent has been facing the burden of introduction and reintroduction of arboviruses such as Dengue virus (DENV), Chikungunya virus, Japanese encephalitis virus, and West Nile virus in urban areas. Most of the pathogenic arbovirus species belong mainly to 3 families: Togaviridae, Flaviviridae, and Bunyaviridae. Mayaro virus (MAYV) belongs to the genus Alphavirus, Togaviridae family, which causes a disease presenting symptoms similar to the classic dengue fever and was used as Alphavirus prototype. The Brazilian popular medicine explores the anti-inflamatory properties of substances extracted from the plants Schinus terebinthifolius (mastic) and Punica granatum (Pomegranate). In this work we present studies on the antiviral effect 128 Libro de resúmenes of these substances against MAYV and DENV. The toxicity of these substances in Vero cells was tested by the incorporation of neutral red after 24h of treatment. The CC50 of each substance was determined: 242, 315, 102 and 5000 µg/ml in acetate (mastic), flavonoids 1 and 2 (mastic), oil of Mastic, respectively, and 590 and 442 µg/ml for Crude Extract and Acetate of Pomegranate, respectively. Afterwards, tests for evaluation of antiviral effect were carried out. Cells were infected for 1 h with MAYV using a multiplicity of infection of 0.1, and treated for 24h with increasing concentrations of the substances. Viral yield, quantified by TCID50 method, demonstrated antiviral activity. The IC50 of each substance was determined by a dose response graph, and values obtained were: 4,3; 4,5; 14 and 830 µg/ml in acetate mastic, flavonoids 1 and 2 (mastic), oil of Mastic, respectively, and 12 and 30 µg/ml for Crude Extract and Acetate of Pomegranate, respectively. The selectivity index (ratio CC50/IC50), was determined rendering values > 7 for all substances. We also tested the substances for virucide properties, adsorption impairment, by means of pretreatment, immunofluorescence and transmission electron microscopy (TEM). Our results showed more than 95% virucidal effect for the mastic acetate and flavonoids partitions and for the Crude Extract of pomegranate. Mastic oil 22%, and pomegranate acetate did not present virucidal effect. We observed similar inhibition obtained in the virucidal test in immunofluorescence images. Damage in viral particles treated with the substances was also observed in the TEM images obtained. The proteomic analysis of the infection of MAYV showed differences in the expression of secreted proteins during infection and treatment with flavonoid 1. We conclude that some of the partitions in our substances act directly on the virus particle. These results will be compared to the activity of these substances on DENV, of the Flavivirus genus belonging to Flaviviridae family. 0198 NUEVAS TIOSEMICARBAZONAS DERIVADAS DE 1-INDANONAS CON ACTIVIDAD ANTIVIRAL FRENTE AL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA M Fabiani1, EF Castro1, MC Soraires Santacruz2, LM Finkielsztein2, LV Cavallaro1 1 Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. 2 Cátedra de Química Medicinal, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. El Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV) es el prototipo del género Pestivirus. Las infecciones por BVDV se distribuyen globalmente y causan serios problemas en la industria ganadera. La tiosemicarbazona (TSC) de la 5,6-dimetoxi-1-indanona (compuesto líder) fue identificado como un potente inhibidor no nucleosídico de la ARN polimerasa de BVDV. Con el objetivo de encontrar derivados de mayor potencia, se sintetizaron trece nuevas TSCs: nueve TSCs N4-sustituídas con grupos arilo (N4-TSCs), de las cuales tres derivan de la 1-indanona y seis de la 5,6-dimetoxi-1-indanona; y cuatro TSCs con distintos sustituyentes sobre el anillo aromático del núcleo indánico. El propósito de este trabajo fue evaluar la actividad antiviral in vitro frente a BVDV de estos nuevos derivados, y analizar en forma preliminar su relación estructura-actividad (REA). Los compuestos más activos, además, fueron evaluados frente a mutantes de BVDV resistentes al compuesto líder (BVDV-TSCr). La citotoxicidad de los compuestos fue medida por el método de MTS/PMS y la actividad antiviral contra BVDV-1 (NADL) fue evaluada por el método de reducción de UFP en células MDBK. Se determinó la concentración citotóxica 50% (CC50) y la concentración efectiva 50% (CE50) a partir de las respectivas curvas dosis-respuesta. De las N4-TSCs, sólo las derivadas de la 5,6-dimetoxi-1-indanona resultaron activas. Esto confirma la importancia de los grupos metoxilo en las posiciones 5 y 6 para la actividad anti-BVDV. Se observó, además, que la naturaleza de los sustituyentes en la posición 4 sobre el grupo arilo en N4 incide sobre la actividad de los derivados: aquellos con sustituyentes atractores de electrones resultaron más activos. Entre ellos, el derivado con un grupo nitro (NO2) en dicha posición (compuesto 8), resultó ser casi seis veces más activo que el compuesto líder (CE50= 0,7±0,3 y 3,8±0,4 µM, respectivamente). Ninguna de las N4TSCs presentó citotoxicidad a la concentración de 10 µM, máxima concentración que pudo ser evaluada debido a su solubilidad en medio acuoso. Entre las TSCs no sustituídas en N4, sólo la TSC de la 6-nitro-1-indanona (compuesto 11) presentó una actividad antiviral similar a la del compuesto líder. Los compuestos de esta serie poseen una solubilidad en medio acuoso similar a la del compuesto líder, y los valores de CC50 obtenidos variaron desde 50 µM hasta mayores a 100 µM. Las variantes BVDV-TSCr resultaron así mismo altamente resistentes al compuesto 8, pero menos resistentes al compuesto 11. Se realizarán estudios adicionales para determinar la CE50 del compuesto 11 frente a las variantes BVDV-TSCr, así como estudios de docking molecular para identificar las interacciones moleculares que se establecen entre los nuevos derivados activos y la polimerasa viral y que permitan explicar este comportamiento diferencial. 0200 ACTIVIDAD ANTIVIRAL DE COMPUESTOS DITERPENOIDES NATURALES Y SEMI-SINTÉTICOS SOBRE LA REPLICACIÓN DE ADENOVIRUS IN VITRO. E Petrera1, JE Bidart1, MW Pertino2, G Schmeda-Hirschmann2, LE Alché1 1 Laboratorio de Virología. Depto. Química Biológica. IQUIBICEN. FCEyN. UBA, Argentina. 2 Instituto de Química de Recursos Naturales. Universidad de Talca, Chile. Los Adenovirus (AdV) humanos se asocian tanto con infecciones esporádicas como con brotes en la comunidad afectando tanto a niños de corta edad como a adultos. Las manifestaciones clínicas comprenden infecciones tales como la fiebre faringo-conjuntival, neumonía, queratoconjuntivitis epidémica, cistitis, gastroenteritis, meningoencefalitis, hepatitis, miocarditis y la enfermedad fatal diseminada en pacientes inmunocomprometidos. Los serotipos AdV 1, 2, 5 y 6 son los causantes más comunes de las infecciones del tracto superior y fiebre faringo-conjuntival en niños pequeños. Hasta el momento no existe una terapia preventiva ni una terapia antiviral específica contra los AdV aprobada para su uso clínico. En nuestro laboratorio de Virología estudiamos la actividad antiviral de compuestos de origen natural y de síntesis. Recientemente hemos comenzado a trabajar con diterpenoides: jatrofolonas aisladas de raíces de Jatropha isabelii y sus derivados sintéticos, y con acido carnósico aislado de hojas de Rosmarinus officinalis L. del cual se han sintetizado distintos derivados. Hemos encontrado que la jatrofolona natural 2A, la jatrofolona semi-sintética 5B y el derivado 9C del acido carnósico presentan una potente actividad antiviral contra HSV-1 en células Vero. Considerando la urgencia por encontrar nuevas moléculas con acción antiviral, nos propusimos estudiar la actividad antiviral de los compuestos 2A, 5B y 9C contra AdV. Primeramente estudiamos la citotoxicidad de los compuestos en células de carcinoma de pulmón humano (A549) y comprobamos que la toxicidad es baja, obteniéndose valores de CC50 de 381,7μM, >400 μM y 246,9 μM para los compuestos 2A, 5B y 9C respectivamente. Para estudiar la actividad antiviral in vitro, las células A549 se infectaron con el serotipo AdV5 y se trataron durante 24 hs con los compuestos en concentraciones no citotóxicas. En todos los ensayos utilizamos el antiviral Rivabirina como control positivo. Mediante la técnica de inhibición del rendimiento viral utilizando una mi de 0,1 obtuvimos los siguientes valores de CE50: 50 μM, 43,5 μM y 50,2 μM para los compuestos 2A, 5B y 9C respectivamente. Con los correspondientes IS de 7,6; >9,2 y 4,9 respectivamente. Mediante el método de punto final determinando la acción citopática producida por el virus y utilizando una mi de 0,25, establecimos valores de CE50 menores: 11,3 μM; 6,25 μM y 18,8 μM para 2A, 5B y 9C respectivamente. Además, se corroboró la inhibición de la propagación del virus por la acción de los compuestos mediante la realización de una inmunofluorescencia indirecta contra las proteínas E1A y hexón de AdV. Ensayos de agregado y remoción del compuesto 5B a distintos tiempos revelan que la acción antiviral estaría ejerciéndose en una etapa tardía, luego de las 7 hs pi. Estos resultados indican que la jatrofolona natural 2A, la jatrofolona semi-sintética 5B y el derivado 9C del acido carnósico presentan actividad antiviral contra AdV5 en células A549. 129 Libro de resúmenes 0236 EVALUACION DE COMPUESTOS ANTIVIRALES CONTRA HERPES VIRUS EQUINO 3 MA Vissani1, MS Tordoya1, O Zabal1 2, E Thiry3, M Barrandeguy1 2 1 Instituto de Virología, CICVyA, INTA-Castelar, CC25, 1712 Castelar, Buenos Aires, Argentina. 2 Escuela de Veterinaria, Universidad del Salvador, Pilar, Buenos Aires, Argentina. 3 Veterinary Virology and Animal Viral Diseases, Department of Infectious and Parasitic Diseases, Faculty of Veterinary Medicine, University of Liege, B-4000 Liege, Bélgica. Herpes virus equino 3 (HVE-3), es el agente causal del Exantema Coital Equino (ECE), infección venérea altamente contagiosa, caracterizada clínicamente por la formación de pápulas, vesículas, pústulas y úlceras en los genitales externos de yeguas y padrillos. Si bien segregar de la reproducción a las yeguas que presentan lesiones típicas de ECE disminuye la posibilidad de contagio, la existencia de animales latentemente infectados, en los que el virus se reactiva y se excreta en forma subclínica, evidencia la necesidad de contar con otras alternativas de prevención. El objetivo de este trabajo fue evaluar la eficacia de los compuestos antivirales, ganciclovir, cidofovir y aciclovir para reducir y/o inhibir la replicación de HVE-3 in vitro. Se determinó el número y el tamaño de placas de lisis inducidas por la infección con HVE-3 en cultivos celulares en presencia y ausencia de concentraciones seriadas (0 a 100 µg/ml) de los compuestos antivirales mencionados, para determinar la concentración que reduce en un 50% la infección viral (CE50%). De acuerdo a estos resultados, se seleccionaron tres concentraciones para cada compuesto y se cuantificó la producción viral en presencia de los compuestos a distintos tiempos post infección mediante PCR en tiempo real. Como control, se cuantificó la producción de virus en ausencia de los compuestos. La CE50% de ganciclovir para reducir el número y el tamaño de placas de lisis fue de 0,04 y 0,15 µg/ml, respectivamente. Se observó que con una concentración de 0,05 µg/ml se obtuvo un 55% de inhibición de la producción de HVE-3 a las 48 h y 96% a las 72 h. El 100% de inhibición a las 72 h se obtuvo con el uso de 0,5 µg/ml. Cidofovir redujo el número y el tamaño de placas con una CE50% de 5,19 y 1,85 µg/ml, respectivamente, y con la utilización de 2 µg/ml se logró un 98% de inhibición de la producción de HVE-3 a las 48 h y 100% a las 72 h. Por último, aciclovir redujo el número y tamaño de placas con una CE50% de 12,91 y 6,29 µg/ml respectivamente. Se observó que con la utilización de 5 µg/ml se obtuvo un 65% de inhibición de la producción de HVE-3 a las 48 h y 95% a las 72 h. El 100% de inhibición a las 72 h se logró con una concentración de 20 µg/ml. Los tres compuestos inhibieron la replicación de HVE-3 in vitro. Ganciclovir resultó ser el compuesto más potente seguido por cidofovir, y aclicovir. Se están llevando a cabo ensayos in vitro para evaluar estos compuestos frente a distintas cepas de campo. Posteriormente, se seleccionará el compuesto más adecuado para su aplicación a campo, el que será evaluado en yeguas infectadas experimentalmente. 0253 ESPECIE VEGETAL AUTÓCTONA DEMUESTRA ACTIVIDAD ANTIVIRAL IN VITRO. ML Mugas1, BS Konigheim2, L Rojas3, JJ Aguilar2, MJ Joseau3, MS Contigiani2, SC Núñez Montoya1 1 IMBIV, CONICET. Farmacognosia, Dpto. Farmacia, Fac. Cs. Químicas, UNC., Argentina. 2 Instituto de Virología “Dr. J M Vanella”, Fac. Cs. Médicas, UNC., Argentina. 3 Fac. Cs. Agropecuarias, UNC., Argentina. A fin de ofrecer alternativas terapéuticas a virosis emergentes y reemergentes, muchas de las cuales no poseen un tratamiento farmacológico o disponen de una terapéutica que no es ideal en términos de eficacia y seguridad, nuestro grupo viene desarrollando una línea de investigación, abocada a la búsqueda de potenciales compuestos antivirales a partir de especies vegetales nativas de Argentina. Así, comenzamos el estudio de Galium latoramosum Clos. (Rubiaceae), planta usada popularmente como tintórea, abortiva y anticonceptiva. En esta oportunidad, evaluamos el efecto antiviral in vitro de extractos de diferente polaridad, sobre los virus Herpes Simplex Tipo 1 (HSV-1), West Nile (WNV) y Encefalitis de Saint Louis (SLEV). A su vez, determinamos la composición química de los extractos estudiados. Mediante un aparato Soxhlet, las raíces desecadas y molidas se extrajeron con benceno (Ben), seguido por acetato de etilo (AcOEt), etanol (EtOH) y agua (Ac). Los ensayos biológicos in vitro (citotoxicidad y actividad antiviral) se llevaron a cabo sobre células Vero, empleando la metodología de captación de Rojo Neutro. A partir de las curvas de viabilidad celular vs. concentración de cada extracto, se determinó la concentración que afecta al 20 % y al 50% de las células (Concentración subtóxica y Concentración citotóxica 50, respectivamente), y la máxima concentración no citotóxica (MCNC). Para evaluar la actividad antiviral, se eligieron 7 concentraciones ≤ a la MCNC. Los resultados se graficaron como porcentaje de inhibición de virus (%I) vs. concentración, estimándose la que inhibe el 50% del efecto provocado por la replicación viral en las células huésped (Concentración efectiva 50). La caracterización química de los extractos se realizó por Cromatografía Líquida de Alta Presión, asociado a espectrometría de masa (HPLC-MS), utilizando testigos para lograr la identificación de los compuestos. Los resultados obtenidos demostraron que ninguno de los extractos fue activo sobre WNV y SLEV, en tanto que el HSV-I fue inhibido entre un 99,63 y 78,88 % por los extractos AcOEt y EtOH respectivamente, a su MCNC. A través del análisis por HPLC-MS determinamos que ambos extractos contienen mayoritariamente Lucidina-primeverosido; una antraquinona glicosilada que podría ser la responsable de la actividad observada en los extractos, ya que las antraquinonas constituyen una familia de compuestos naturales con diversas bioactividades in vitro, incluyendo efecto antiviral. Es por ello que, en función de estos resultados, se prevé obtener el compuesto puro a fin de determinar si es el responsable del efecto exhibido por estos extractos. 0256 ACTIVIDAD ANTIVIRAL DE ALCALOIDES FRENTE AL VIRUS DENGUE TIPO 2 VM Quintana1, JE Brunetti1, MA Ponce1, EB Damonte1 2, V Castilla1 1 Laboratorio de Virología, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Argentina. 2 IQUIBICEN, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Argentina. El desarrollo de agentes antivirales para hacer frente a la infección por virus dengue (DENV) resulta prioritario dado que hasta el momento no se dispone de vacunas ni antivirales específicos para este virus. En trabajos previos hemos reportado la actividad antiviral de alcaloides como las beta-carbolinas, naturales y sintéticas, frente a DENV. Asimismo, se ha descripto que el alcaloide anisomicina presenta actividad antimicrobiana y modula vías de señalización celular implicadas en la replicación de DENV. El objetivo de este trabajo fue analizar el modo de acción antiviral de la beta-carbolina 9Nmetilharmina, obtenida por síntesis química, y de la anisomicina frente a DENV-2 en cultivos de células Vero. La actividad citotóxica de los compuestos se evaluó por el método de MTS y la actividad antiviral mediante ensayos de inhibición de rendimiento viral. A partir de estos ensayos, se calculó el índice de selectividad para cada compuesto obteniéndose valores de 56,2 y 171,8 para 9N-metilharmina y anisomicina, respectivamente. A las máximas concentraciones ensayadas, 9N-metilharmina y anisomicina provocaron una inhibición del rendimiento viral, medido a las 48 h post-infección (p.i.), del 90% y 99,9%, respectivamente. Además, se demostró la capacidad inhibitoria de los compuestos sobre la cantidad de células que expresaban proteína viral a las 48 h p.i. mediante ensayos de inmunofluorescencia. Para ambos compuestos, el tratamiento de las células en forma previa a la infección no afectó la multiplicación viral. En el caso de la 9N-metilharmina su actividad antiviral resultó independiente de la multiplicidad de infección utilizada y la presencia de este compuesto durante el periodo de adsorción-internalización viral no provocó alteraciones en la producción de virus. Asimismo, se comprobó que la síntesis de RNA viral, analizada por Q-PCR a las 6 y 24 h p.i., no se vio afectada por el tratamiento con 9N-metilharmina. Se realizó también un ensayo de adición de compuesto a distintos tiempos y a las 24 h p.i. se observó que el título de virus asociado a células no 130 Libro de resúmenes presentaba diferencias con el control sin tratar, mientras que sí se detectó una reducción significativa (90%) del título de virus liberado al medio extracelular aun en aquellos cultivos en los cuales el compuesto se agregó en forma tardía (8 h p.i.). Por el contrario, en el caso de la anisomicina, el agregado del compuesto hasta las 8 h p.i provocó una reducción significativa tanto del título de virus asociado a células como del virus extracelular. En conclusión, 9N-metilharmina inhibe la liberación de las partículas virales infecciosas al medio extracelular, afectando la propagación de la infección. Por su parte, la anisomicina resultó ser un inhibidor más potente y selectivo frente a DENV-2 que el compuesto 9N-metilharmina y a diferencia de este último, la anisomicina bloquearía alguna etapa tardía del ciclo de multiplicación evitando la formación de las partículas virales infecciosas. 0277 CARACTERIZACIÓN DE NANOANTICUERPOS CONTRA LA PROTEÍNA HA DEL VIRUS DE INFLUENZA A H1N1 J Baztarrica1, E Barbieri1, L Garaicoechea1, M Puntel1, E Baumeister2, A Wigdorovitz1, V Parreño1 1 Instituto de Virología, INTA Castelar, Argentina. 2 Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS, Malbran, Argentina. Influenza tipo A es un virus de la familia Orthomyxoviridae de genoma a ARN, de 8 segmentos. Debido al rápido cambio genético y reasociación del genoma viral segmentado, las cepas virales evolucionan continuamente y se hace necesaria la actualización de la formulación de las vacunas para la producción. En la Argentina, la pandemia H1N1 del año 2009 generó 1.390.566 personas infectadas y 617 muertes reportadas. A pesar de la disponibilidad de vacunas y drogas antivirales, los efectos profilácticos y terapéuticos permanecen incompletos. Esto se debe, en parte, al tiempo transcurrido entre que se detecta una cepa emergente y se produce una vacuna eficaz frente a dicha cepa. Esto impide contar con las herramientas para una protección inmediata para su aplicación en pacientes de alto riesgo, es por esto que en este trabajo estamos presentando la posibilidad de utilizar nano-anticuerpos contra una región conservada de la hemaglutinina del Virus. Los nano-anticuerpos (VHHs) son moléculas de un solo dominio, derivadas de anticuerpos de tamaño (15kD) presente en la naturaleza capaz de reconocer a un antígeno y son de muy alta afinidad, especificidad, estabilidad, y solubilidad. Debido a la carencia de la porción Fc típicamente encontrada en las inmunoglobulinas, estos anticuerpos no desencadenan respuestas celulares tóxicas o mediadas por complemento. Además, su pequeño tamaño y similitud con las inmunoglobulinas humanas los hace poco reactivos y aptos para su administración en la mucosa del tracto respiratorio. En el laboratorio de INCUINTA se han generado VHHs a partir de la inmunización de una llama con una vacuna trivalente conteniendo cepas de influenza tipo A H1N1, H3N2, y una cepa de tipo B. Por biopaneo, se seleccionaron 37 clones de VHHs, de los cuales 22 reconocen por ELISA de fagos a la proteína recombinante HA0 de la cepa viral H1N1 A/Puerto Rico 1934 y 15 reconocen al virus correspondiente a un aislamiento argentino (H1N1 A/Argentina/017/2009). La caracterización por secuenciación de los clones determinó que tres de los VHH (A5A.1, D81.1, D91.2) poseerían un doble puente disulfuro en el domino CDR3, lo cual redundaría en una mayor estabilidad de los mismos. Asimismo, se observó que 5 de los 37 anticuerpos poseen actividad neutralizante in vitro frente a la cepa A/Argentina/017/2009. Por otro lado, el clon G41.2 inhibe la hemoaglutinación por esta misma cepa. Los resultados mencionados indican que cinco clones son candidatos para su utilización tanto en la profilaxis y tratamiento de la infección, para lo cual se realizará la evaluación in vivo en un modelo murino, como también para el desarrollo de un kit diagnóstico. 0295 GENERACIÓN DE UNA BIBLIOTECA DE NANOANTICUERPOS PARA LA OBTENCIÓN DE MOLÉCULAS NEUTRALIZANTES DEL VIRUS DE INFLUENZA Y LA DETECCIÓN DE VIRUS DEL DENGUE. Y, Paredes Rojas1, C, Caldevilla1, D, Riva2, N, Mattion1, C, García2, I, Ibañez1 1 Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Miltein. CONICET, Argentina. 2 Laboratorio de Estrategias Antivirales, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. IQUIBICEN-CONICET, Argentina. En 1993 una observación sorprendente informó de la existencia de anticuerpos no convencionales en miembros de la familia Camelidae. Estos anticuerpos carecían de la cadena liviana y de un dominio constante de la cadena pesada. Cuando se expresó el único dominio variable, que recibió el nombre de Nanoanticuerpo (NanoAc), se observó que el mismo conservaba una fuerte especificidad y afinidad hacia el antígeno; era soluble en medio acuoso y resistente a varios pHs y temperaturas; podía reconocer epítopes poco accesibles; se expresaba fácilmente en microorganismos y podía ser modificado mediante técnicas de ingeniería genética para mejorar sus propiedades. Hasta el momento se ha reportado el uso exitoso de NanoAcs para inhibir y detectar varios tipos de virus como VIH, HBV, Influenza, RSV, Rabia, FMDV, Poliovirus, Rotavirus, vaccinia, entre otros. En este trabajo reportamos los resultados de la construcción de una biblioteca de NanoAcs contra la región del tallo de la proteína HA del virus de influenza y de la proteína E del virus del Dengue (DENV). Dos llamas fueron inmunizadas con cinco inmunizaciones de 50 g de proteína HA recombinante de influenza, de los subtipos H5N1 y H3N8, y 100 g de virus del Dengue purificado e inactivado de los serotipos DENV-1 (cepa HW); DENV-2 (cepa NGC), DENV-3 (cepa Philippines/H87/1956) y DENV-4 (aislamiento 8124). La respuesta de anticuerpos de los isotipos IgG1, IgG2 e IgG3 se determinó luego de cada inmunización utilizando anticuerpos específicos mediante la técnica de ELISA. Una vez alcanzada una buena respuesta inmune, los animales fueron sangrados y se extrajo ARN de los linfocitos aislados. Se preparó ADNc y se realizaron dos PCR para clonar los genes de inmunoglobulinas, la última con oligonucleótidos que permitieron ligar los fragmentos obtenidos en el vector fagémido pHEN4. Bacterias TG1 fueron transformadas con la ligación y se obtuvo una biblioteca representativa del repertorio de genes de cada llama. Los resultados de los ELISAs indicaron que ambas llamas fueron efectivamente inmunizadas. La respuesta inmune fue elevada contra los cuatro serotipos de DENV. La respuesta contra HA de influenza fue menor, por lo que fueron necesarias nuevas inmunizaciones. Las PCRs realizadas para clonar el repertorio de genes permitieron obtener inicialmente bandas correspondientes a las regiones variables de los anticuerpos convencionales y no convencionales. La segunda PCR permitió aislar únicamente los fragmentos provenientes de los anticuerpos no convencionales, que son los que dan lugar a los NanoAcs. Posteriormente, se prepararon bacterias TG1 competentes de alta eficiencia que permitieron generar una biblioteca de genes de inmunoglobulinas. Bacterias conteniendo los vectores fagémidos serán infectadas con un fago helper para producir fagos que expresen los NanoAcs. Mediante un procedimiento de biopanning se espera seleccionar NanoAcs que tengan propiedades de unión específica contra las proteínas inoculadas. 0347 BIOACTIVIDAD DE EXTRACTOS ETANOLICOS DE TAGETES MINUTA L. (ASTERACEAE) SOBRE ARBOVIRUS DE IMPORTANCIA MEDICOVETERINARIO. F Martinez1, Y Massuh2, J Aguilar1, L Cussa1, M Ojeda2, M Contigiani1, B Konigheim1 1 Instituto de Virología Dr. J. M. Vanella- Facultad de Ciencias Médicas – UNC., Argentina. 2 Cátedra de Genética, Facultad de Ciencias Agropecuaria –UNC, Argentina. Tagetes minuta L. (Asteraceae) popularmente conocida como "Suico", es una hierba aromática anual con distribución cosmopolita, abundante en Córdoba. Su aceite esencial (AE) es utilizado en medicina popular principalmente como antimicrobiano. Preliminarmente determinamos 131 Libro de resúmenes que extractos de esta especie tuvieron actividad virucida sobre los arbovirus West Nile (WNV) y Encefalitis Equina Venezolana (VEEV). Por ello, nos propusimos evaluar la capacidad antiviral para determinar si dichos extractos actúan luego de la etapa de penetración. Se utilizaron extractos etanólicos obtenidos a partir de material vegetal seco de partes aéreas de T. minuta, obtenido de tres poblaciones diferentes seleccionadas y domesticadas (PI, P2 y P3). La concentración subtóxica (CC20) de cada extracto se obtuvo por análisis de regresión logística (R2>0.9) a partir de las curvas de viabilidad celular vs. concentración, utilizando el método de captación de Rojo Neutro. La actividad antiviral se evaluó mediante el método de reducción de unidades formadoras de placa (UFP). Monocapas de células Vero fueron infectadas con 100 UFP de cada virus y luego de 1hora de incubación a 37ºC, se colocaron por triplicado concentraciones decrecientes de cada extracto a partir de la CC20, incubándose nuevamente durante 3-5 días a 37°C y 5% CO2. Se incluyeron controles de células, virus y extractos (n=4). Los valores de CC20 obtenidos fueron de 83, 64 y 34µg/ml para P1, P2 y P3 respectivamente. En cuanto a la evaluación de la actividad antiviral, se determino que ninguno de los extractos fue capaz de inhibir a los virus WN y EEV. Bajo estas circunstancias y por los resultados obtenidos previamente donde P1 tuvo actividad virucida sobre ambos virus (82%I, WNV y 50%I VEEV), P2 solo sobre VEEV (50%I) y P3 no fue activo para ninguno de los virus evaluados, podemos inferir que la inhibición de la infección viral se da en las etapas tempranas del ciclo de replicación, cuando el virus aun no ha ingresado a la célula huésped. Por otro lado, anteriormente demostramos que los AE correspondientes a P1 y P2 fueron ricos en E-Ocimenona (72-60 %) y Ocimeno, este último en mayor proporción en P2 (15%). Por su parte, el AE correspondiente a P3 fue el único que presento Dihidrotagetona y en proporción equivalente a la E-Ocimenona (30-32%). Por lo tanto, los resultados obtenidos sugieren que, T. minuta tendría compuestos con baja citotoxicidad y potenciales propiedades virucidas, y considerando la composición química del AE, la presencia de E-Ocimenona en porcentajes mayores al 50% sería importante para la actividad virucida. Lo cual justifica futuros estudios biológicos para evaluar en detalle las etapas tempranas de replicación como así también, valorar la bioactividad de E-Ocimenona compuesto mayoritario presente en P1, ya que este extracto resulto ser el más activo y menos citotóxico. 0348 EVALUACIÓN DE PLANTAS MEXICANAS CON ACTIVIDAD SOBRE EL VIRUS DE INFLUENZA F Domínguez1, L Márquez1, D Moreno2, F Ferrreres2, G Santos1 1 Centro de Investigación Biomédica de Oriente, IMSS, México. 2 CEBASCSIC, Department of Food Science and Technology, España. Las infecciones virales juegan un papel importante en las enfermedades humanas, y los brotes recientes en el advenimiento de la globalización y la facilidad de los viajes han subrayado su prevención como un tema crítico en la protección de la salud pública. A pesar de los progresos realizados en materia de inmunización y desarrollo de medicamentos, muchos virus carecen de vacunas preventivas y terapias antivirales eficaces, que a menudo son acosados por la generación de mutantes. La aparición de variantes resistentes a los fármacos de virus de influenza ha conducido a una necesidad de identificar agentes antivirales nuevos y eficaces. Por lo tanto, la identificación de nuevas moléculas antivirales es de importancia crítica. Las plantas medicinales y sus productos naturales purificados proporcionan una fuente para el desarrollo de fármacos antivirales. El objetivo de este estudio fue identificar y evaluar la actividad inhibitoria sobre el virus de influenza de diversos extractos crudos y fraccionados de plantas que contaban con antecedentes etnobotánicos,. Se evaluaron extractos de diferentes especies de los géneros Croton, Pinus, Geraniu, Justicia y Lippia sobre la inhibición de la enzima neuraminidasa del virus de la influenza AH1N1 porcino (A/Swine/Mexico/UNAM/2009). En la fase inicial, los ensayos in vitro de inhibición se realizaron en conjunto con la detección de citotoxicidad vía MTT, en células MDCK. De todos los extractos crudos, dos de ellos mostraron actividad antiviral, Croton spp y Pinnus spp inhibiendo la actividad enzimática de la neuraminidasa viral. Se llevó a cabo el fraccionamiento químico de los extractos crudos y se repitieron las pruebas, obteniéndose cuatro fracciones activas en total. Vía HPLC/MS se determinaron los compuestos activos. Tres flavonoides fueron aislados de Croton y Pinus, mostrando actividades de inhibición de la neuraminidasa con valores de IC50 que oscilaron entre 0.9 y 55 μM. La actividad in vitro contra el virus influenza de flavonoides 1 al 3 fueron evaluadas usando cepas del virus AH1N1 porcino (A/Swine/Mexico/UNAM/2009). De los compuestos, el flavonoide rutina exhibió la más potente actividad inhibitoria, con valores de IC50 de 0.9 μM sobre neuraminidasa, CC50 280 µM, índice selectivo (SI) = 5,8. En contraste, vitexina y kaempferitrina exhibieron valores de IC50 de 32 μM y 55 μM. 0362 ESTUDIO DEL MECANISMO DE ACCIÓN DE LA EUPARINA FRENTE A POLIOVIRUS. ANÁLISIS DE VARIANTES RESISTENTES Y DEPENDIENTES. MF Visintini Jaime1, S López1, V Martino2, RH Campos1, LV Muschietti2, LV Cavallaro1 1 Cátedra de Virología. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires, Argentina. 2 Cátedra de Farmacognosia. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires, Argentina. La euparina es un benzofurano natural con actividad antiviral selectiva frente a los tres tipos de poliovirus humano (PV). El estudio preliminar del mecanismo de acción, demostró que la euparina ejercía su acción en la primera hora del ciclo de replicación de PV-2. El objetivo de este trabajo fue profundizar el estudio del mecanismo de acción y determinar la etapa el blanco molecular en PV-2. Se evaluó el efecto de la euparina en la adsorción mediante el ensayo de centros infecciosos y en la penetración con el agregado de euparina a distintos tiempos infectando con un stock PV-2 fotosensible. Además, se seleccionaron 25 clones capaces de crecer en presencia de euparina. Una vez caracterizados fenotípicamente se seleccionaron 3 clones resistentes y 1 clon dependiente para su caracterización biológica y molecular que se amplificaron en presencia de euparina luego de 3 pasos de clonado biológico; obteniéndose las poblaciones PV-2-D13, R17, -D19,-R21. Se realizó la secuenciación de la región de las proteínas de la cápside (VP1-VP4). Los resultados obtenidos descartaron la acción de la euparina en la adsorción y confirmaron su acción en los primeros 20 min post adsorción, en tiempos compatibles con la penetración y/o desnudamiento. La caracterización fenotípica de susceptibilidad frente a euparina demostró que de los 25 clones seleccionados, 8 de ellos eran sensibles, 14 resistentes y 3 dependientes. La secuenciación genómica detectó a nivel molecular la presencia de una o dos mutaciones puntuales en la región secuenciada, que significaron cambios de aminoácidos en las proteínas VP1 y VP2, para las variantes resistentes; mientras que para las variantes dependientes los cambios se localizaron en VP3 y VP1. Con el objetivo de caracterizar la dependencia, se evaluó la capacidad de replicación de la variante PV-2-D19 en función de la concentración de euparina. Se observó que a una concentración de 5 µM se alcanzó el máximo número de placas virales. Además, se evaluó si la euparina era capaz de proteger a PV de la acción de altas temperaturas sobre la población wt y PV-2-D19. Se demostró un efecto protector de la euparina sobre el wt a 48°C y para la variante PV-2-D19, se observó una protección solamente a 37 °C. A 48°C, se confirmó una extrema labilidad a la acción del calor para la dicha variante. En conclusión, los resultados obtenidos, permitieron concluir que la euparina se comporta en forma similar a los denominados inhibidores de cápside. Estos compuestos se unen al bolsillo hidrofóbico localizado debajo del “canyon”, en la superficie de la cápside viral, desplazando lípido natural denominado “pocket factor”. La unión de la euparina le otorga rigidez a la cápside viral y en consecuencia no se producirían los cambios conformacionales necesarios en la cápside requeridos para la penetración y liberación del genoma viral en el citoplasma celular. 0381 B. ADOLESCENTIS, PROBIOTICO CON ACTIVIDAD ANTIVIRAL CONTRA EL ROTAVIRUS MF Gutierrez, JC Ulloa, K Fernandez, S Salas, J López, F Vélez, N Olaya Grupo de Enfermedades Infecciosas - Virología, Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, Colombia. 132 Libro de resúmenes El Rotavirus es la mayor causa de gastroenteritis en niños menores de cinco años a nivel mundial y aunque existen medidas preventivas como la vacunación y tratamientos como la rehidratación, el mundo se encuentra en constante búsqueda de medidas alternativas como el uso de probióticos para el control de éste patógeno. Por este motivo, en este trabajo se buscó determinar la capacidad que tienen 4 bacterias probióticas (Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium adolescentis y Bifidobacterium bifidum) para disminuir la infección in vitro por Rotavirus. Para desarrollar el proyecto, el efecto antiviral de estos probióticos se evaluó con tres estrategias: 1) la bacteria completa y viable, 2) los metabolitos primarios extraídos del cultivo bacteriano en medio MRS, 3) Extractos proteicos obtenidos de las bacterias por medio de sonicación en presencia de lizosima y de Lauryl Sarcosil. La actividad contra rotavirus se visualizó por medio de la disminución in vitro de la infección, y sobre la producción de calcio intracelular por parte la proteína no estructural NSP4. Las técnicas de cuantificación de la disminución de la infección por el virus en las células MA104, fueron citometría de flujo e inmunocitoquímica. Como resultados relevantes se tuvo que de las 4 bacterias estudiadas solamente B. adolescentis logró un efecto antiviral contra rotavirus por los 3 mecanismos evaluados, el cual estuvo relacionado con interferir directamente con el virus antes de ingresar a la célula, también se observó que los extractos proteicos de estas bacterias interactúan con los receptores HSC70 e integrina β3 de las células suceptibles a la infección por Rotavirus, inhibiendo la adherencia viral, y a nivel intracelular, sus metabolitos fueron capaces de generar una disminución de la cantidad de proteína NSP4 y la cantidad de calcio intracelular, producidos a partir de la infección por rotavirus. Con los resultados obtenidos se concluyó que el Bifidobacterium adolescentis disminuye la infección por Rotavirus afectando la entrada del virus a la célula blanco a través de la adhesión de extractos proteicos bacterianos y/o metabolitos primarios a moléculas receptoras del virus como la HSC70 e integrina β3 e igualmente produce una disminución de la enterotoxina NSP4 regulando la producción del calcio intracelular. Patogenia y oncogénesis 0025 CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DE VARIANTES DE LA PROTEÍNA X DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B DE DISTINTOS SUBGENOTIPOS EN HEPATOCITOS HUMANOS M Elizalde1, RH Campos1, L Barbini1 2 1 Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. 2 Cátedra Microbiología Clínica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Mar del Plata, Argentina. Introducción: La proteína X del virus de la hepatitis B (HBV-X) está asociada a la patogénesis durante la infección crónica. Las mutaciones BCP afectan a HBV-X en los aminoácidos (aa) 130-131 y se desconoce el rol de las mismas en relación a su actividad biológica. Existe la necesidad de caracterizar a los subgenotipos (sgts) más prevalentes en nuestra región. Objetivos: Estudiar el efecto de la presencia de distintas duplas aminoacídicas en 130-131 de HBV-X sobre su capacidad de inducir la apoptosis y/o la autofagia en hepatocitos humanos. Metodología: Se utilizaron tres líneas celulares de hepatoma (HepG2, Hep3B y Huh-7) con expresión transiente de HBV-X, sgts F1b y F4, wild type (wt, KV) y mutada (mut, MI). La viabilidad celular se cuantificó por tinción con Azul Tripán. La apoptosis se detectó por laddering de DNA y tinción con naranja de acridina-bromuro de etidio (NA-BE). Se estudió la expresión de proteínas anti (Bcl-2, Bcl-X) y pro-apoptóticas (Bax) por Western Blot. La autofagia se analizó mediante la detección de vacuolas autofágicas y conversión de LC3 por Western Blot. Resultados: La expresión de ambas formas de HBV-X (sgts F1b y F4) aumentó significativamente la mortalidad en las tres líneas celulares estudiadas. Se detectó laddering de DNA en las células transfectadas con las variantes de HBV-X (wt y mut) de ambos sgts. La tinción con NABE reveló una disminución en el porcentaje de células viables y un aumento en la cantidad de células apoptóticas (apoptosis temprana y tardía) para las 3 líneas celulares, que expresaban HBV-X wt y mut, de ambos sgts. Al estudiar las proteínas regulatorias de la familia de Bcl-2, se observó una disminución en los niveles de expresión de Bax y un aumento de Bcl-X en las células transfectadas con las HBV-X wt y mut, de ambos sgts. La proteína anti-apoptótica Bcl-2 disminuyó su expresión en las células Hep3B y Huh-7 transfectadas con las HBV-X wt y mut, de ambos sgts. Sin embargo, en las HepG2 su expresión aumentó en las células que expresaban las dos formas de HBV-X del sgt F1b y disminuyó para las HBV-X del sgt F4. Además, al estudiar la autofagia, se observó que la expresión de ambas formas de HBV-X indujo tanto la formación de vacuolas autofágicas como la disminución de los niveles de LC3-I, por formación de LC3-II de menor peso molecular. Conclusiones: Las distintas variantes de HBV-X estudiadas inducen la apoptosis de hepatocitos humanos y modulan de manera diferencial la expresión de las proteínas de la familia de Bcl-2. Estas HBV-X también tienen la capacidad de desencadenar la autofagia de los hepatocitos. Estos resultados describen algunos de los mecanismos moleculares mediante los cuales distintas variantes de HBV-X contribuyen a la patogenia en el hígado infectado. Además, aportan en la caracterización biológica y molecular del genotipo F, autóctono latinoamericano, responsable de la mayoría de las hepatitis crónicas B en nuestra región. 0041 EL LINFOMA DIFUSO A GRANDES CÉLULAS B EPSTEIN BARR POSITIVO EN ARGENTINA: ROL DEL VIRUS EN LA PATOGÉNESIS, COMPOSICIÓN Y FUNCIONALIDAD DEL MICROAMBIENTE TUMORAL M Cohen1, A Vistarop1, E De Matteo2, M Narbaitz3, F Matrebian3, MV Preciado1, P Chabay1 1 Laboratorio de Biología Molecular, División Patología, Hospital de Niños R. Gutiérrez, Argentina. 2 División Patología, Hospital de Niños R. Gutiérrez, Argentina. 3 División Patología, Instituto de Investigaciones Hematológicas Mariano R. Castex, Academia Nacional de Medicina, Argentina. El virus de Epstein Barr (EBV) es un virus oncogénico de distribución mundial que posee dos ciclos de infección: lítico y latente. En Argentina, la infección primaria ocurre tempranamente y suele ser subclínica. El virus infecta los linfocitos B de memoria de por vida, y está relacionado al desarrollo de linfomas. El linfoma difuso a grandes células B (LDGCB) es el más frecuente en adultos. La clasificación de la OMS en 2008 incluyó una nueva entidad provisoria, el LDGCB EBV+ del adulto mayor, en pacientes ≥50 años inmunocompetentes, aunque se observó en algunos pacientes jóvenes. La participación del virus en esta entidad estaría relacionada con la disminución en la respuesta de linfocitos T inherente al envejecimiento (inmunosenescencia) que permite la proliferación de linfocitos B infectados. Fue descripta en otros linfomas la interacción del EBV con el microambiente tumoral, que modificaría ciertas poblaciones celulares y la expresión de citoquinas. Nuestro objetivo fue determinar la participación del virus de EBV en la patogénesis del LDGCB en pacientes de todas las edades nuestro país, y además caracterizar el microambiente tumoral a fin de determinar si la presencia del virus afecta su composición y funcionalidad. Se analizaron 102 casos de LDGCB que incluían: 52 pacientes adultos ≥50 años, 24 <50 años y 26 pediátricos. Se realizó hibridación in situ (HIS) para EBERs, e inmunohistoquímica (IHQ) para EBNA2, EBNA3A, LMP1, LMP2A y BMRF1. Se determinó la expresión relativa de genes virales de latencia (EBNA1, EBNA2, EBNA3C, LMP1 y LMP2A) y líticos (BZLF1, BHRF1 y BLLF1) mediante PCR en tiempo real. Se caracterizó el microambiente tumoral mediante IHQ para CD4, CD8, Foxp3, GrB y PD1 junto con la expresión relativa de IL-10, TGFβ, IFNγ y CCL20. Finalmente, se compararon casos EBV+ y - y se correlacionaron con los datos clínicos. Establecimos un valor de corte del 20% de células tumorales EBERs+ para definir los casos como LDGCB EBV+. Determinamos que la frecuencia del LDGCB EBV+ en nuestro país coincide con lo descripto para poblaciones de Asia y Latinoamérica. El perfil de latencia II/III junto con genes y antígenos líticos predominó en nuestra serie. En particular, los casos EBV+ tuvieron un aumento significativo en la población de células citotóxicas efectoras GrB+ y una tendencia a 133 Libro de resúmenes mayor recuento de LT CD8+. La presencia del marcador inhibitorio PD1, de IL-10 y TGFβ fueron características de los LDGCB, independiente de la presencia del virus. Finalmente, observamos una tendencia a una menor sobrevida en los casos EBV+ respecto de los EBV-. El desarrollo del LDGCB aún en ausencia de EBV indica que el proceso de linfomagénesis sería multifactorial, involucrando genes virales, factores del hospedador e incluso ambientales. Sin embargo, en el LDGCB EBV+, el EBV cumpliría un rol en su patogénesis no solo en los casos ≥50 años, sino en un amplio rango etario. Este hallazgo avala la sugerencia de revisión del criterio de edad definido por la OMS. 0088 ESTUDIO DE LAS CARACTERISTICAS DE LA INFECCION POR EL VIRUS EPSTEIN-BARR EN PORTADORES RECIENTES PEDIATRICOS A Vistarop1, M Cohen1, E De Mateo2, MV Preciado1, P Chabay1 1 Laboratorio de Biología Molecular, División Patología, Hospital de Niños R. Gutiérrez, Argentina. 2 División Patología, Hospital de Niños R. Gutiérrez, Argentina, Argentina. Introduccion. La amígdala, sitio de ingreso del virus de Epstein Barr (EBV), está constituida por un epitelio, una región interfolicular(IF) y centros germinales(CG). Durante la primoinfección, el EBV atraviesa el epitelio e infecta linfocitos B (LB) subepiteliales (SubEp) con expresión de todas sus proteínas de latencia (LIII), para luego suprimirla hasta su silenciamiento en LB memoria. Existen 2 teorías de infección estudiadas en adultos, infección de LBmemoria o de LBnaive. En Argentina la primoinfección es subclínica y en niños pequeños, por lo tanto esta población representa un nicho biológico interesante. Objetivo. Caracterizar en amígdalas de pacientes pediátricos la expresión de antígenos virales, su localización histológica y la subpoblación de LB infectados. Metodología. Se estudiaron 90 pacientes pediátricos con amigdalectomía (2-14años). En biopsias fijadas en formol e incluídas en parafina se determinó la presencia del genoma viral por PCR, su localización y perfil de latencia por hibridación in situ (HIS) para EBERs (RNA codificados por EBV) e inmunohistoquímica para proteínas virales LMP1 y 2A, EBNA2 y 3A, y BMRF1. Se realizaron dobles marcaciones para EBERs e IgD y/o CD27. Se determinó la carga viral (QV) por PCR en tiempo real. Resultados. Se detectó la presencia de EBV en 29/90 casos por PCR e HIS. Los 29 casos presentaron en linfocitos expresión de antígenos de latencia de membrana LMP1 (29/29) y 2A (19/29), antígenos nucleares EBNA2 (19/29) y 3A (10/29) y del antígeno lítico BMRF1 (5/29). La media de edad fue menor en el grupo con LB SubEp.LMP1+ comparado con LB NoSubEp.LMP1+(3vs.6 años; p=0,04 testM-W) y en el grupo con LIII SupEp con respecto al LIII NoSubEp (5vs.9,5 años; p=0,02 testM-W). La media de edad fue mayor en los casos con marcación de antígenos virales (excepto LMP1) en células epiteliales (6vs.4,5 años; p=0,04 testM-W). Al analizar comparativamente la expresión conjunta de antígenos (IF-SubEp, IF, IF-SubEp-CG e IF-CG), se observó una tendenciaal aumento de la media de edad, de 3, 4, 5 y 9años respectivamente (p=0,07;testK-W). Las QV fueron mayores en los casos con LB SubEp.LMP1+(p=0,04; testM-W), mientras que bajas cargas se observaron al analizar las 4 localizaciones, en los casos con marcación en CG (p=0,02; testM-W). La mayoría de los casos presentan marcación EBERS+/IgD+(p=0.002;testc2) y LIII (11/15). Conclusión. Los pacientes estudiados son portadores recientes del virus ya que prevalece la LIII. En niños de corta edad, el EBV se localizaría en linfocitos de la región SubEp acompañado de alta QV, mientras que a mayores edades predomina la localización en CG, con menor QV y presencia del EBV en células epiteliales. Esto indicaría que el virusen el transcurso de la infección accede a LB SubEp, atraviesa la región IF y eventualmente ingresa a CG. La presencia del virus en LBnaive y la ausencia de ciertos antígenos virales en CG indica que los modelos de infección propuestos no serían mutuamente excluyentes. 0112 EFECTO DE LA PROTEÍNA CORE DEL VIRUS HEPATITIS C (HCV) SOBRE LA REGULACIÓN DE LA APOPTOSIS, LA PROLIFERACIÓN Y LA INMORTALIZACIÓN CELULAR N Eguibar, P Perazzo, EA Gentile, AI Castillo, C Delfino, VL Mathet, ML Cuestas, JR Oubiña Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica (IMPAM, UBA-CONICET), Facultad de Medicina, UBA, Argentina, Argentina. El HCV ha sido clasificado en 7 genotipos y múltiples subtipos según el porcentaje de identidad nucleotídica. Se desconoce si la infección por el subtipo 2c tiene un curso evolutivo diferente a la de los más estudiados 1a, 1b (los más prevalentes a nivel mundial) y 4. El subtipo 2c ha sido detectado principalmente en algunos países de Europa y África y en algunos de América incluyendo Argentina. Su prevalencia es significativa en algunas provincias del país, tales como Córdoba y Buenos Aires. Dentro de la región codificante del genoma viral, el gen core contiene la secuencia más conservada entre los diferentes aislamientos y genotipos del HCV, lo que sugiere una importante función biológica. Se han documentado diversas actividades funcionales de dicha proteína viral, incluyendo la encapsidación del RNA viral, la regulación de promotores celulares, las interacciones con proteínas celulares, la promoción del crecimiento celular e inmortalización, la inducción del hepatocarcinoma celular en ratones transgénicos, un rol inmuno-regulador y un controvertido –y aún no definitivamente establecido- papel regulador de la apoptosis. El objetivo del presente trabajo fue estudiar comparativamente los efectos de la expresión de la proteína Core de los subtipos 1b y 2c del HCV sobre los niveles de expresión de diversas proteínas involucradas en la apoptosis, proliferación celular e inmortalización. Para ello se expresó transitoriamente y en modo independiente la proteína Core de ambos subtipos en células Huh7 y se analizó mediante Western blot con anticuerpos específicos el efecto de la misma sobre las proteínas tanquirasa (activadora de la telomerasa), cIAP1 y cIAP2 (inhibidoras de la apoptosis), procaspasa 3 (ejecutora apoptótica), ganquirina (reguladora anti-apoptótica del ciclo celular) y c-Myc. A las 48 horas de expresión transitoria de la proteína Core de los genotipos 1b o 2c del HCV se produjo una disminución significativa (p < 0,05) de la expresión de tanquirasa (0,5 ± 0,1 y 0,3 ± 0,1, respectivamente), cIAP1 (0,5 ± 0,04 y 0,7 ± 0,1, respectivamente) y procaspasa 3 (0,7 ± 0,05 y 0,2 ± 0,03, respectivamente) pero solamente el subtipo 2c indujo una disminución significativa de ganquirina (0,6 ± 0,2). No se observaron efectos estadísticamente significativos sobre la expresión de cIAP2 y c-Myc. El valor de los controles se designó arbitrariamente como 1. Los resultados obtenidos sugieren que la expresión transitoria de los subtipos 1b y 2c de la proteína Core del HCV desempeñan in vitro un rol proapoptótico, lo que podría tener importantes implicancias en la patogénesis de la infección natural por HCV. En el modelo experimental utilizado, dicho efecto fue -en algunos casos- genotipo-dependiente, dado que -en general- el mismo fue observado sobre la proteínas regulatorias / efectoras de la apoptosis / inmortalización celular más acentuadamente en las células que expresaron Core del subtipo 2c. 0113 EFECTO DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA CORE DEL VIRUS HEPATITIS C (HCV) EN EL DESARROLLO DE INSULINO-RESISTENCIA P Perazzo, N Eguibar, AI Castillo, C Delfino, EA Gentile, VL Mathet, ML Cuestas, JR Oubiña Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica (IMPAM, UBA-CONICET), Facultad de Medicina, UBA, Argentina., Argentina. La proteína Core del virus hepatitis C (HCV) es un componente de la nucleocápside y cumple un papel importante en la patogénesis viral. Numerosos estudios epidemiológicos y experimentales sugieren que la infección crónica con HCV estaría asociada a insulino-resistencia y por ende, al desarrollo de diabetes tipo 2. Dichos efectos fueron observados fundamentalmente con la proteína Core del genotipo 1b del HCV. Cabe destacar que la intolerancia a la glucosa posee un efecto negativo respecto a la tasa de respuesta virológica sostenida a los 134 Libro de resúmenes antivirales empleados en la terapéutica actual de los pacientes con hepatitis C crónica, constituyendo además un factor de riesgo para el desarrollo del hepatocarcinoma celular. La circulación del genotipo 2c en nuestro país es de especial relevancia ya que desde el punto de vista patogénico se ignora si éste se asocia a un comportamiento biológico diferente respecto al de los genotipos 1a y 1b –los más prevalentes a nivel mundial- dada la significativa distancia filogenética entre ambos. El objetivo del presente trabajo fue analizar y comparar el efecto de la expresión de la proteína Core de los genotipos 1b y 2c del HCV en el desarrollo de insulino-resistencia. Para llevar a cabo este objetivo, se utilizó un modelo de expresión transitoria de la proteína Core (genotipos 1b y 2c) en células Huh7. Transcurridas 48 h posttransfección, se evaluaron los niveles de expresión de IRS (insulin receptor substrate)-1 e IRS-2 mediante Western blot. Cabe destacar que IRS-1 e IRS-2 regulan la vía de expresión en la superficie hepatocitaria del transportador 4 de glucosa (Glut-4), imprescindible para captar la glucosa circulante. En otros términos, IRS-1 e IRS-2 regulan la glucemia e insulinemia. De acuerdo a los resultados obtenidos, la expresión transitoria de las proteínas Core de los genotipos 1b y 2c del HCV durante 48 h en células Huh7 produjo una disminución estadísticamente significativa (p < 0,05) en los niveles de expresión de las proteínas IRS-1 (0,6 ± 0,05 y 0,4 ± 0,04, respectivamente) e IRS-2 (0,5 ± 0,05 y 0,4 ± 0,1, respectivamente). El valor de la expresión de los controles se designó arbitrariamente como 1. Estos resultados aportan las primeras evidencias del rol de la proteína Core del genotipo 2c en el desarrollo de insulino-resistencia. Futuros estudios deberán llevarse a cabo con el objetivo de evaluar si la disminución de la expresión de IRS-1 y -2 son atribuibles a un eventual efecto de represión transcripcional sobre sus respectivos promotores o a una (ya postulada) degradación proteica en el proteasoma. 0149 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA DISCS LARGE EN LESIONES INTRAEPITELIALES ESCAMOSAS DE CUELLO UTERINO Y SU SIGNIFICADO PRONÓSTICO EN LA EVOLUCIÓN DE LA PATOLOGÍA. AL Cavatorta1, A Di Gregorio2, M Cabral2, M Bugnon Valdano1, F Marziali1, G Barbieri1, J Cittadini2, AL Nocito3, D Gardiol1 1 Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario-CONICET, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, Argentina. 2 Sección de Oncología Pelviana del Servicio de Ginecología, Hospital Provincial del Centenario, Rosario, Argentina. 3 Cátedra de Anatomía y Fisiología Patológicas, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Rosario, Argentina. La infección por papilomavirus humanos (VPH) de alto riesgo es el evento clave en el desarrollo de los carcinomas de cuello de útero y de las lesiones neoplásicas precursoras (SIL). El cáncer cervical invasor está precedido por un espectro progresivo de anormalidades del epitelio cervical. Este proceso es reversible y la mayoría de las infecciones por VPH son transitorias, lo que conduce a la eliminación de manera espontánea de la infección e incluso a la regresión de las lesiones precursoras. Una premisa fundamental para determinar el tratamiento o el seguimiento de mujeres con SIL de bajo grado (LSIL) es el riesgo de una probable progresión a lesiones de mayor severidad (HSIL), y eventualmente, cáncer invasor. Así, es trascendente encontrar biomarcadores para predecir la evolución de tales lesiones, y que contribuyan a la prevención y definición de terapias adecuadas. De esta manera, resulta interesante identificar si variaciones en el nivel de expresión de las proteínas celulares blanco de la oncoproteína E6 de VPH pueden ser utilizadas como biomarcadores histológicos. Por ello, nos propusimos analizar como probable marcador de progresión durante el desarrollo oncogénico asociado a VPH, la expresión diferencial del oncosupresor Discs large (DLG1), una de las proteínas blanco de E6 que participa en la regulación de la proliferación y de la polaridad celular. En estudios previos por inmunohistoquímica (IHQ) demostramos que, para LSIL existen dos arquetipos de marcación diferentes para DLG1. En uno de ellos, la expresión y distribución de DLG1 son similares a lo observado en tejidos normales. El otro subgrupo de biopsias de LSIL presenta un arquetipo semejante al de HSIL, con una sobre expresión de DLG1 muy marcada a lo largo de todo el epitelio. Por ello, y dada las características de DLG1, y su probable participación tanto en procesos oncosupresores como oncogénicos, es interesante conocer si estos distintos patrones de expresión pueden asociarse a una progresión y/o regresión diferencial de las lesiones LSIL. Hemos analizado biopsias de cuello uterino de mujeres que presentaban diagnóstico de LSIL (N=30), por IHC usando anticuerpos contra la proteína DLG1. Los resultados obtenidos han sido relacionados con el seguimiento clínico de las pacientes durante 24 meses, para establecer su valor para predecir la progresión o regresión de la lesión. De manera interesante, nuestros resultados indican que aquellas muestras con patrones tipo normales (N=23) corresponden a pacientes que según el análisis de las historias clínica y seguimiento, regresaron sus lesiones. En cambio aquellas con marcación intensa (N=4) fueron las pacientes que mostraron una progresión en la severidad de las lesiones. Luego de aplicar el test exacto de Fisher se concluye que existe una asociación significativa (p<0.00001) entre expresión de DLG1 y la evolución de la lesión. Estos resultados son alentadores, y actualmente estamos completando estos estudios ampliando el número de muestras a analizar con el fin de determinar efectivamente si el patrón de expresión de DLG1 podría utilizarse como un biomarcador de progresión de lesiones cervicales. 0150 REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS DE POLARIDAD CELULAR DURANTE INFECCIONES DEL VIRUS DEL PAPILLOMA HUMANO M Bugnon Valdano1, AL Cavatorta1, F Marziali1, G Barbieri1, F Facciuto1, E Boccardo2, D Gardiol1 1 IBR/CONICET - Virología, Fac. Cs. Bioq. y Farm, UNR, Argentina. 2 Lab. Oncovirología, ICB, USP, Brasil. La polaridad de celular está determinada por una distribución asimétrica y muy regulada de proteínas y lípidos asociados a membrana. La pérdida de dicha polaridad y la consecuente alteración de las uniones celulares son características de los procesos carcinógenos. Por eso, estamos interesados en estudiar los diferentes mecanismos que regulan la expresión de proteínas de polaridad, considerando especialmente los procesos neoplásicos asociados a infecciones del virus del papiloma humano (VPH). Los VPH infectan epitelios de una gran variedad de sitios anatómicos, y se clasifican como de bajo o alto riesgo oncogénico, según las manifestaciones clínicas asociadas. Entre los blancos celulares de VPH se cuentan a varias proteínas PDZ de polaridad, incluyendo a la proteína Disc Large (DLG1), que tiene funciones tanto estructurales como de señalización. La expresión de DLG1 está alterada en diversos tumores, y en particular en el cáncer cervical, siendo los VPH de alto riesgo oncogénico agentes etiológicos de dicha patología. Para estudiar los mecanismos precisos involucrados en la regulación de DLG1 durante los procesos neoplásicos asociados a VPH, en el presente trabajo generamos cultivos organotípicos tipo RAFT, que reproducen el proceso de diferenciación epitelial in vitro, y que por tanto constituyen herramientas muy útiles para el estudio de mecanismos asociados a infecciones por virus epiteliotrópicos, como el VPH. En particular, desarrollamos cultivos RAFT a partir de queratinocitos primarios expresando las proteínas E7 y E6/E7 de VPH18 (de alto riesgo) y de VPH11 (de bajo riesgo). Corroboramos la expresión de los correspondientes transcriptos virales en los cultivos RAFT generados mediante la metodología de RT-PCR. Luego, analizamos la expresión de DLG1 en cada caso, mediante las técnicas de Western Blot (WB) e Inmunohistoquímica (IHQ). Los resultados mostraron que la expresión de DLG1 es desregulada en los cultivos expresando E7 y E6/E7 de VPH18 y de VPH11. En particular, encontramos un aumento en los niveles de expresión de la proteína celular y un cambio en su distribución ante la expresión de las proteínas virales. Observamos en todos los casos una redistribución de DLG1 hacia el citoplasma. Específicamente para el caso de los cultivos expresando proteínas de VPH 18, encontramos una evidente pérdida de DLG1 a nivel de los bordes celulares, y siendo esto aún más marcado para el caso de los cultivos expresando E6/E7 de VPH18. Más aún, mediante cultivo celular tradicional y WB, observamos que la expresión exógena en células de la línea 293 de las proteínas virales E7 y E6/E7 (de VPH 18 y VPH 11) también genera un aumento en los 135 Libro de resúmenes niveles de expresión de DLG1. En conjunto, hemos analizado la expresión de proteínas celulares blanco de VPH en un contexto que asemeja a las infecciones virales. Estos datos sugieren que las proteínas virales podrí
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