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4/20/2015
MÉTODOS RÁPIDOS EN
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
ANÁLISIS MICROBILÓGICOS CONVENCIONALES PARA
DETECTAR PATÓGENOS TRANSMITIDOS POR
ALIMENTOS
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PATÓGENOS
TRANSMITIDOS POR ALIMENTOS: FUNDAMENTOS
PARA LA APLICACIÓN
Colectar la muestra
Procesar la muestra
SIMPOSIO DE SEGURIDAD ALIMENTARIA URUGUAY, ABRIL 2015
Enriquecer la muestra (pre-enriquecimiento no-selectivo/
enriquecimiento selectivo)
Kendra Nightingale, Ph.D.
Detectar en la muestra enriquecida la presencia/ ausencia de patógenos
Centro Inter nacional para la Excelencia de la Industria Alimentaria
Depar tamento Ciencias Animales y Alimentarias
Plaquear las muestras en medio selectivo/diferencial
Universidad de Texas Tech
Examinar colonias de morfología típica en los platos
Confirmar las colonias presuntas
¿POR QUÉ MÉTODOS RÁPIDOS?
ANÁLISIS MICROBILÓGICOS PARA DETECTAR
PATÓGENOS TRANSMITIDOS POR ALIMENTOS
Toma entre 3 a 5 días obtener resultados definitivos
de análisis microbiológicos de una muestra utilizando
métodos tradicionales de detección de patógenos
transmitidos por alimentos.
• Departamento de Agricultura de los Estados Unidos
(USDA): Guía de Laboratorio para Servicios
Microbiológicos de Inspección de Inocuidad
Alimentaria (MLG). Carne, pollo y productos a base
de huevos.
Varios métodos rápidos han sido desarrolados y son
disponibles comercialmente para generar resultados
sustancialmente más rápido:
• http://www.fsis.usda.gov/science/microbiological_lab_g
uidebook/
• Administración de Medicamentos y Alimentos de los
Estados Unidos. Manual Analítico Bacteriológico;
Todos los demás alimentos.
•
• Evaluar la muestra después del
enriquecimiento.
http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/Labora
toryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/def
ault.htm
•Confirmar las muestras presuntas positivas.
CRITERIOS DE EVALUACIÓN Y
ENFOQUES PARA EL DIAGNÓSTICO
MOLECULAR
USO DE MÉTODOS RÁPIDOS EN LA DETECCIÓN,
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Evaluación del enriquecimiento:
• Decisión de aceptar o rechazar el producto.
• Si la prueba de detección es NEGATIVA el producto será
aceptado
• Si la prueba de detección es POSITIVA, la muestra es un
“potencial positivo” y puede ser sujeta a confirmación, El
producto puede ser aceptado o rechazado pendiente de
confirmación o basada en el tipo de producto.
Confirmación:
• Enriquecer el plato en medio selectivo/diferencial (colonias
de morfología típica; “presunto positivo”)
• Número de kits comercialmente disponibles/ métodos de
detección de patógenos transmitidos por alimentos
continuan aumentando a un rápido ritmo.
• Difícil de balancear las ventajas/desventajas de los
diferentes métodos para elegir el mejor método.
•
Conocimiento fundamental en métodos rápidos.
• Criterios generales para la industria de alimentos para
evaluar métodos rápidos de detección.
• Escojer varias colonias que presentan características
morfológicas típicas del patógeno meta y poner a prueba
• Pruebas de confirmación (bioquímicas, immunológicas,
moleculares)
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EL DOGMA CENTRAL
ADN
Métodos
moleculares
CÉLULA PROCARIOTA
Replicación de ADN
Transcripción
ARNm
Traducción
Métodos
Fenotípicos
Proteinas/Enzymas
Toxinas y otros metabolitos
MÉTODOS RÁPIDOS PARA DETECCIÓN Y
CONFIRMACIÓN
Bioquimícos: nuevos enfoques de la cultura,
sistemas bioquímicos comerciales de
identificación.
Immunológicos: interacciones antígenoanticuerpo; aglutinación de látex,
immunoensayo enzimático/ ensayo por
Inmunoabsorción ligado a enzimas, tiras de
prueba de flujo lateral inmunocromatográfico.
Métodos moleculares: hibridación AND-ADN,
cadena de reacción de polimerasa (PCR), PRC
en tiempo real, y no PCR basado en métodos.
EJEMPLOS DE MÉTODOS
INMUNOLÓGICOS RÁPIDOS
Aglutinación de látex: RIM Escherichia coli O157:H7 Kit
de Aglutinación de látex (Remel)
EJEMPLOS DE MÉTODOS
BIOQUÍMICOS RÁPIDOS
Nuevos enfoques culturales:
Cromatografía media (Ej., CHROMagar)
Sistemas comerciales de identificación:
VITEK (targeta bioquímica, BioMerieux)
API (líneas de prueba; BioMerieux)
BioLog (96-well plate)
EJEMPLOS DE MÉTODOS
INMUNOLÓGICOS RÁPIDOS
Inmunoensayo enzimático (EIA)/ ensayo por
Inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA):
Aseguramiento de la EIA para Listeria, EHEC, o
Salmonella (Control biológico)
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EJEMPLOS DE MÉTODOS
INMUNOLÓGICOS RÁPIDOS
Tiras de prueba de flujo lateral: RapidChek (SDIX), VIP
(BioControl), Reveal 2.0 (Neogen)
EJEMPLOS DE MÉTODOS MOLECULARES
RÁPIDOS
Hibridación de ADN: ACCUPROBE (Gen-Probe)
Cadena de Reacción de Polimerasa Estándar (PCR)
PCR en tiempo real: BAX (DuPont Qualicon), GeneDisc (Pall),
MicroSeq (LifeTechnologies), Assurance GDS (BioControl),
R.A.P.I.D. (BioFire Diagnostics), iQ (Bio-Rad)
No-PCR Métodos isotérmicos: Sistema de Detección Molecular
(3M), ANSR (Neogen), ATLAS (Roka Biosciences)
NUEVOS DESARROLLOS
• Detección basada bacteriófagos (ligandos y fago
completo)
• Detección basada en espectrometría de masas
(detección o caracterización de los productos de
la PCR)
• Detección integrada y subtipificación (Abbott
PLEX-ID)
CRITERIOS CLAVES DE EVALUACIÓN
Criterio para patógenos específicos:
• Inclusividad
• Exclusividad
• Sensibilidad del diagnóstico (Falsos Negativos)
• Especifidad del diagnóstico (Falsos Positivos)
• Sensitividad analítica (Límite de detección)
• Reproducibilidad
• Repetitibilidad
• Validación (AFNOR or AOAC)
CRITERIOS CLAVES DE EVALUACIÓN
Criterios Genéricos:
• Velocidad
• Diferenciar Viable/No Viable
• Rendimiento
• Robustez
• Tamaño del equipo
• Controles Positivos
• Fácil de usar
• Prevención de contaminación
cruzada a través de barreras.
• Flexibilidad
• Disponibilidad para diferentes
patógenos.
• Soporte de producto
• Compatibilidad con la matriz
de alimentos
• Costo
CONSIDERACIONES PRÁCTICAS
• Molécula diana (ADN o moléculas de ARNr, o
ADNr)
• Multiplexing (multiples genes, multiples
patógenos o líneas específicas)
• Control positivo interno
• Escoger un laboratorio de detección externo:
• Calidad
• Ubicación
• Tiempo/Costo
• Económicos
• Plataformas/Ensayos Ofrecidos
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CONSIDERACIONES PRÁCTICAS
• Tipo de prueba conducida (fenotípica vs.
molecular).
• Objetivo de la prueba (ej. virulencia vs. serotipo).
• Desarrollo de un plan de muestreo.
• Manejo de resultados de pruebas positivas con
impacto regulatorio.
• Detección de muestras positivas en multiplex PCR
GENÉTICA MICROBIANA 101
¿Qué es el ADN?
¿Qué tipos de moléculas de
ADN están presentes en una
célula bacteriana?
¿Cuál es el tamaño del
material genético de una
bacteria patógena típica?
¿Cuántos genes tiene una
bacteria patógena?
¿Cuál es el tamaño promedio
de un gen bacteriano?
¿De qué está formada esta molécula?
NUCLEOTIDO = CARBONO 5' DEL
AZÚCAR, BASE NITROGENADA &
GRUPO FOSFATO
EL ADN TIENE UNA ESTRUCTURA DE
DOBLE HELICE Y ORIENTACIÓN
ANTIPARALELA
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REPLICACIÓN DE ADN
ARN EN LA CÉLULA
ARN Ribosomal (ARNr), la mayoría de ARN en la célula
Leading strand;
continuous
replication
• 3 tipos (16s, 23s, y 5s)
• 3,000 copias en una célula
• Ribosomas; proteina ensamblada durante la traducción.
ARN Mensajero (ARNm), 5-10% de ARN en la célula
Lagging strand;
discontinuous
replication
• Casi tantos tipos como hay genes.
• No estable en la célula; tienen pocos cientos de copias de genes altamente
transcritos; vida-media unos pocos minutos (de 1 a 7 min.)
• Sintetizado a partir de AND durante la transcripción.
• Mueve la información contenida en el AND a la maquinaria de traducción.
ARN de tranferencia (ARNt)
• Alrededor de 50 tipos
• Recoge y transporta de aminoácidos al ribosoma durante la traducción.
ARN pequeño (ARNp)
• 50 - 200 nucleotidos
• Funciones reguladoras(Ej., afectar la estabilidad y traducción del ARNm)
APLICACIÓN DE LA DETECCCIÓN
MOLECULAR EN MICROBIOLOGÍA DE
ALIMENTOS
Los métodos moleculares incluyen ensayos
dirigidos a ácidos nucleicos (ej., ADN y ARN)
Métodos de detección de ADN
• Detectar la presencia o ausencia de gen(es) o fragmento(s)
de genes específicos en el organismo meta.
• Detección del gen universal o fragmento de gen (ej. 16S
ARNr) seguido por secuenciación de ADN
• Detección de ADN no diferencia entre organismos viables y
no viables.
Métodos de detección de ARNm
PRINCIPIOS DE LA PCR
• Conceptualizado por Kary Mullis en 1983.
• Amplificación de AND in vitrio utilizando los
siguientes componentes:
• Dos oligonucleótidos de ADN sintéticos (cebadores)
complementarios a cada extremo de la secuencia de
ADN específica – cebadores “sentido” y “antisentido”.
• Bases de nucleótidos individuales como sustratos.
• ADN Polimerasa: una enzima natural responsable de
la replicación y reparación in vivo de AND.
• Síntesis de una cantidad suficiente de ADN para
permitir su detección.
• El ARNm se degrada rádidamente y su detección indica la
presencia de organismos viables
APLICACIONES DE LA PCR
La detección de PCR es particularmente útil
cuando:
• La detección clásica consume demasiado tiempo.
• Es difícil la diferenciación de organismos no patógenos
estrechamente relacionados.
Ejemplo: Listeria monocytogenes
• Es la única especie dentro del género Listeria que es patógena
para humanos.
• El ensayo de PCR dirigido a detectar el gen hemolisina (hlyA)
puede diferenciar L. monocytogenes de otras esecies de Listeria.
APLICACIONES DE LA PCR
Inocuidad Alimentaria:
• Detección o confirmación molecular de microorganismos
específicos presentes en los alimentos.
• La sensitividad y especifidad de la PCR permite la
amplificación de genes únicos para un organismo dado.
• Subtipificación molecular de aislamientos.
Biología Molecular:
• Mutagénesis, clonación o secuenciación
Biología Evolutiva:
• Recrear la historia evolutiva de un grupos taxonómicos a
través ide la secuenciación de ciertos segmentos de
ADN.
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REACIÓN DE LA PCR
• Etapa 1: Desnaturalización
de la doble cadena de
moléculas de ADN
monocatenario.
• Etapa 2: Hibridación de los
primers con patrón de ADN
monocatenario en su
ubicación complementaria
específica.
• Etapa 3: Sintesis de una
nueva cadena de ADN
compementaria a la cadena
patrón de ADN mediante la
adición de dNTPs en la
dirección 5' a 3‘.
DETECCIÓN Y ANÁLISIS DE LOS
PRODUCTOS DE LA PCR
1
2
Electroforesis en gel de agarosa es la técnica más común
utilizada para detectar y analizar los productos de la PCR
3
DETECCIÓN Y ANÁLISIS DE LOS
PRODUCTOS DE LA PCR
•
El AND esta cargado
negativamente migra a
través de la matriz de gel
gracias a la aplicación de
un campo eléctrico.
•
Diferenciación de
productos de la PCR
basada en el tamaño del
fragmento y en su fluidez
para moverse a través de
la matríz del gel.
1000bp
900bp
800bp
700bp
300bp
250bp
PCR MULTIPLEX
• Utilizada para dirigir a multiples secuencias en una sola
prueba.
• Ventajas:
• Más información de una sola prueba.
• Disminuye el uso de materiales y reactivos/ consumibles
• Ahorra tiempo
• Desventajas:
• Requiere tiempo para optimización.
• El análisis de los resultados es menos sencillo.
• PCR que contiene multiples parejas únicas de cebadores
sentido y antisentido :
• Temperatura de anillamiento para cada pareja de primers debe ser
similar para poder trabajar correctamente dentro de una sola prueba.
+
PCR MULTIPLEX : UN EJEMPLO
• Cada pareja de primers debe amplificar fragmentos de varios
tamaños específicos para cada objetivo.
PCR EN TIEMPO REAL
• Funciona igual que lo hace la PCR convencional, excepto:
• Detección de EHEC O157:H7
• Detección simultanea de varios marcadores moleculares
presentes en cepas de EHEC O157:H7
Hemolisina E (772bp)
• No es necesario ejecutar un gel para obtener resultados
• Involucra sondas marcadas con fluoróforo fluorescente.
• Capaz de detectar cuándo el PCR objetivo empieza a amplificar
• Permite la detección del objetivo en tiempo real durante la
amplificación del ADN .
Antigeno flagelar H7 (625bp)
Shiga toxina Stx2 (484bp)
Intimina Eae (368bp)
Antígeno somático O157 (292bp)
Shiga toxina (210bp)
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TECNOLOGÍAS EN PCR EN TIEMPO
REAL
SYBR GREEN
• SYBR Green (Punto de ensayo final)
• Transferencia de energía de resonancia
fluorescente (FRET) Sondas de doble
etiquetado.
•
•
•
•
•
Hidrólisis basada en sondeos (ej., TaqMan)
Sondas de unión al surco menor
Sondas moleculares Beacons
Sondas Scorpión
Invasor
ANÁLISIS DE LA CURVA MELT
• Determinación de la
temperatura de hibridación
(Tm) de los productos a
evaluar la especifidad de la
amplificación llevada a cabo.
• Tm= temperatura a la cual se
desnaturaliza la mitad de
longitud de la amplificación
doble cadena.
• Temperatura elevada a un
punto donde las cadenas de
ADN estan completamente
separadas:
• Emisiones de fluoróforo.
• Descenso de fluorescencia
Stimulated fluorophore
Non-stimulated fluorophore
Primer
Amplicon
Targeted double stranded-DNA
SYBR GREEN
• Ventajas
• Barato, fácil de usar.
• Mínimo esfuerzo para diseñar
• Funciona bien con un solo objetivo definido
• Desventajas:
• Multiplexing limitado
• Se une a cualquier doble cadena de ADN
• Dímeros de primer
• Productos no específicos
• Se debe realizar una curva de disociación o una curva de
fusión después de completar el protocolo de la PCR –
MÁS TIEMPO
Idaho Technoloogy Inc.
ENSAYOS DE SONDA DOBLEMENTE
MARCADA
SONDAS DE HIDRÓLISIS
• Tecnología basada en FRET
• Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente
• Fluoróforo inhibidor y fluoróforo indicador:
• Cuando se irradia , el reportero transfiere fluoróforo de energía
a un fluoróforo inhibidor en lugar de a un fluorescente.
• El fluoróforo inhibidor debe estar en estrecha proximidad al
indicador.
• Aprovecha de la actividad en
exonucleasa de la Taq Polimerasa:
La sonda es destruida durante el
proceso de amplificación.
• Fluorescencia media al final de
cada ciclo
Reporter/Donor
Excitation
Reporter
• También conocida como ensayo
nucleasa 5’ o ensayo TaqMan®.
• Aumenta la señal de fluorescencia
con el número de amplificación de
cada ciclo de la PCR
Quencher
Close Proximity
Separation
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TAQMAN PCR- TIEMPO REAL
TAQMAN RT-PCR: MULTIPLEXING
• PCR en tiempo real: reacción de PCR de tiempo real que contiene
múltiple, parejas únicas de primer y sondas.
• El valor Ct puede
ser utilizado para
cuantificar el ADN
patrón
• Un valor Ct
retardado se puede
explicar por la
presencia de
mutación(es) en el
primer y/o sonda
sitio de unión lo cual
reduce la eficiencia
de la PCR.
SONDAS BASADAS EN PCR DE
TIEMPO REAL
• Ventajas:
•
•
•
•
Aumento de la especifidad y sensibilidad
Capáz de detectar multiples objetivos
Permite la cuantificación
Mas rápido que el PCR convencional y green SYBR
• Desventajas:
• Las sondas deben ser marcadas con diferentes fluoróforos fluorescentes a fin
de ser detectados por el instrumento.
• Ventajas
• Más información de una sola prueba
• Disminuye el uso de materiales y reactivos/ consumibles
• Ahorra tiempo.
• Desventajas
• Más consideraciones para el diseño experimental.
• Requiere tiempo para optimización.
STECS Y MANIFESTACIONES CLÍNICAS DE
LA ENFERMEDAD ASOCIADA CON LA
INFECCIÓN POR STEC
• El serotipo de E. coli lleva uno o ambos
genes de la Shiga toxina (stx1 and stx2)
• Portador asintomático
• Diarrea acuosa
• Colitis hemorrágica (CH)
• Caro para sintetizar sondas.
• Los reactivos son más caros
• Sindrome Urémico Hemolítico (SUH)
• Los químicos son continuamente mejorados y optimizados.
STEC SERO-PATOTIPOS
Seropatotipos
Serotipos
CH & SUH
Frecuencia de
los brotes
A
O157:H7,
O157:NM
Si
Común
B
O26:H11,
O103:H2,
O111:NM,
O121:H19,
O145:NM
Si
Raro
C
O91:H21,
O104:H21,
O113:H21,
otros
Si
Raro
D
Multiple
No
Ninguna
• Causa principal de la insuficiencia renal en niños
menores de 5 años en EE.UU.
NON-O157 STEC : UNA EMERGENCIA EN
LA SALUD PÚBLICA EN LOS EE.UU.
• La Shiga toxina producida por Escherichia coli
(STEC) perteneciente al serogrupo O se ha
convertido en un problema importante para la
salud pública en los EE.UU.
• En el 2008, El Departamento de Agricultura de
los Estados Unidos: Servicios de Inspección de
Inocuidad Alimentaria (USDA:FSIS) publicó un
artículo en el cual non-O157 STEC representa un
problema para la salud pública equivalente a
O157.
Karmali et al., 2003
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• Se ha demostrado que más de 300 serogrupos – O
llevan uno o ambos genes de la Shiga toxina .
• Algunos serogrupos – O específicos (ej., O26, O45,
O103, O111, O121 and O145) comunmente conocidos
como los “Seis grandes” han:
• Sido relacionados con la mayoría (75 a 80%) de las
enfermedades transmitidas por alimentos atribuidos a
non-O157 STECs en los EE.UU.
• Sido asociados a graves manifestaciones clínicas de
enfermedades (ej., CH y SUH)
PRUEBAS PARA NON-O157 STEC EN
LOS EE.UU.
REGULACIÓN Y MONITOREO EN
LOS EE.UU
• USDA:FSIS Anunció su plan para considerar estos
“Seis Grandes” serogrupos - O como adulterantes
en la carne de ganado vacuno no intacta y sus
componentes en septiembre del 2011.
• USDA-FSIS implementó la metodología analítica
(MLG 5B.02; ahora utilizando MLG 5B.05) para
iniciar esta nueva regulación a través de las pruebas
de rutina de los recortes de carne en junio de 2012
• BMT se produce en el lugar de cosecha del ganado e
incluye productos de carne en cajas tradicionales
destinadas al uso no intacto.
Per 325g sample, add 975ml of mTSB+n1, stomach for 2 min. Incubate @ 42
Day 1
LOS “SEIS GRANDES” SEROGRUPOS-O
OBJETIVOS EN LOS EE.UU
DNA Extraction
• Gobierno (USDA:FSIS)
1
Either stx (-) or eae (-)
Report as NEGATI VE
TO L EARN2
Multiplex
RT PCR
(eae, stx)
O antigen gene cluster (-)
Report as NEGATI VE
TO L EARN2
Multiplex
RT PCR
(O antigen
gene cluster)
O antigen gene cluster (+)
• Ensayos moleculares comerciales de detección de genes de
virulencia de EHEC y serogrupos-O en enriquecimientos, por
regulación de USDA:FSIS
• Confirmación de presuntas colonias positivas.
Prepare aliquot of mTSB+n for
Immunomagnetic capture for 1
to 6 serogroups
(O26, O45, O103, O111, O121, O145)
2
3
4
5
6
eae (+) & stx (+)
Day 2
• Guía de Laboratorio Microbiológico
• MLB 5B.05 “Detection and isolation of non-O157 Shiga Toxin
Producing Escherichia coli (STEC) from Meat Products
• Métodos de detección en enriquecimientos y confirmación por
cultivo en placa.
• Industria
1 C for 15-22 hours.
NOTE: A single test portion is used for testing with MLG 5 Detection, Isolation and Identification of Escherichia coli
O157:H7 from Meat Products and MLG 5B Detection and Isolation of non-O157 Shiga Toxin-Producing Escherichia
o
C is required.
coli (STEC) from Meat Products. Sample receipt temperatur
Modified Tryptone Soya or
Trypticase Soy Broth with 8mg/L
novobiocin plus casaminoacids
Laboratory Electronic Application
For Results Notification
Biological Information Transfer &
E-mail System
modified Rainbow Agar
Sheep Blood Agar
Outbreak Section of the Eastern
Laboratory, USDA-FSIS
Report as
Potential (+)
TO BI TES3 AND L EARN2
Streak prepared mTSB+n to mRBA4 then incubate
@35 C for 20-24 hrs.
Perform acid treatment step and streak prepared mTSB+n
to mRBA4 then incubate @35 C for 20-24 hrs.
Day 3
Select a well-isolated colony from each identified phenotype on mRBA4 and perform
latex agglutination with antisera specific for the serogroup of interest.
No growth or latex negative colonies
Report as NEGATI VE
Streak latex positive colonies onto
SBA5 for isolation then incubate
@35 C for 18-24hrs.
Report as
Presumptive (+)
TO BI TES3 AND L EARN2
TO BI TES3 AND L EARN2
Ensayos moleculares de detección de Non-O157 STEC comercialmente disponibles
Following SBA5 incubation, perform serological agglutination to
verify positive colonies for the serotype of interest.
Assay Name
Company
Assay
Chemistry
Target
NeoSEEK
Neogen
PCR +
Mass Spec
Top 6 +
O157
The Rapid Finder
Life
Technologies
RT-PCR
Top 6 +
O157
Assurance GDS
BioControl
RT-PCR
Top 6 + Need a customer log in to access O157
specific product information
E. coli O157 &
STEC GeneDisc
Pall GDS
RT-PCR
E. coli
GeneDisc plate for
STEC and
Salmonella spp.
Pall GDS
RT-PCR
STEC
BAX System RealTime PCR STEC
Suite
DuPont
Qualicon
RT-PCR
Stx,
eae, +
Top 6
DNA Extraction
Either stx (-) or eae (-)
Multiplex
RT PCR
(eae, stx)
Day 4
VI TEK2
Biochemical
Testing
Report as NEGATI VE
3
2
TO BI TES AND L EARN
eae (+) & stx (+)
Multiplex
RT PCR
(O antigen
gene cluster)
O antigen gene cluster (-)
Report as NEGATI VE
TO BI TES3 AND L EARN2
VI TEK (-)
O antigen gene cluster (+)
O antigen gene cluster (+)
Further Testing Required.
FSIS Laboratories send
isolate to OSEL6
VI TEK (+)
O antigen gene cluster (+)
Report as
CONFI RM ED
POSI TI VE TO BI TES3
AND L EARN2
CONFI RM ED POSI TI VE ISOLATES
FSIS Laboratories: Pick isolates to nutrient
agar deep for PFGE testing at OSEL6
Pick isolates to cryobeads for storage.
Time to
Result*
Limit of
Detection*
1 day/Not reported
Same day
(+), 10 hour
(-)
1-5 cfu in
sample
1 cfu/25g
6‐18 hour enrichment + < 1 hour run
1 cfu/25g
6‐18 hour enrichment + < 1 hour run
9-12 hour
10^4 cfu/ml
enrichment
+55 min run
*as reported by manufacturer
9
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RETO EN LA INTERPRETACIÓN DE LOS
RESULTADOS DE PCR DE UN
ENRIQUECIMIENTO
IMPLICACIONES
• La industria debe confiar en una detección por PCR
para aceptar o rechazar un producto fresco
altamente perecedero.
• La evaluación de una gran cantidad de colonias es
requerida para confirmar que una muestra contiene
aislamientos viables cargados con factores de
virulencia.
SUBTIPIFICACIÓN
ENFOQUES MOLECULARES PARA
MICROBIOLOGÍA ECOLÓGÍCA
SUBTIPIFICACIÓN MOLECULAR DE PATÓGENOS
TRANSMITIDOS POR ALIMENTOS: FUNDAMENTOS
PARA LA APLICACIÓN
SIMPOSIO DE SEGURIDAD ALIMENTARIA URUGUAY, ABRIL 2015
Kendra Nightingale, Ph.D.
• Capacidad para diferenciar un aislamiento
más allá del nivel de especie/subespecie.
• Fenotípica
• Identificación Molecular de ADN
• Basado en Bandeo
• Basada en secuencias de ADN.
Centro Inter nacional para la Excelencia de la Industria Alimentaria
Depar tamento Ciencias Animales y Alimentarias
Universidad de Texas Tech
FUSIÓN BINARIA
EVOLUCIÓN MICROBIANA 101
Generación 1
Generación 2
Generación 3
Generación N
Genotipo Ancestro
Clones
Clones
Clones y
genotipos
divergentes
¿Mutación ?
¿Tasa de mutación bacteriana?
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MECANISMOS DE CAMBIO GENÉTICO
• Mutaciones
• Mutaciones puntuales
• Mutaciones de cambio
• Inversiones
• Inserciones/deleciones (indels), incluye
duplicaciones.
• Transferencia horizontal de genes
• Transferencia horizontal de genes homólogos de
las secuencias de genes.
• Tranferencia horizontal de secuencia de genes
no homólogos
• Perdida de plásmido (!!!) o adquisición
TIPIFICACIÓN DE CEPAS BASADAS EN BANDEO
DE ADN/MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN
(“IDENTIFICACIÓN DE ADN”)
CONSIDERACIONES PARA LA
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS EN LA
SUBTIPIFICACIÓN MOLECULAR
• ADN humano “huella genetica”: el objetivo es
identificar un solo individuo específico
• Las huellas de ADN humano son únicas.
• ADN de huellas bacterianas/ no son subtipos
• Subtipificación Bacteriana: el objetivo es determinar si
los aislamientos comparten un antepasado común
reciente
• Aplicaciones
• Detección/identificación
• Investigación de brotes
• Patrones de contaminación y dinámicas de transmición a lo largo
de la cadena.
• Identificar los sitios de refugio.
• Vías de transmisión a los productos alimenticios terminados.
RESTRICCIÓN A NIVEL DE GENOMA
MÉTODOS BASADOS EN ENZIMAS
Incluye Ribotipificación y PFGE
• Métodos de la PCR
• Perfil del plásmido
• PCR Multiplex
• ADN Polimórfico amplificado al azar (RAPD)/ Primers Arbitrarios (APPCR)
• Elemento repetitivo PCR (rep-PCR)
• Métodos basados en enzimas de restricción
• PCR-fragmentos de restricción de longitud polimórfica (PCR-RFLP)
• Ribotipificación
• Electroforesis en Gel de campo pulsado (PFGE)
Detecta cambios (mutaciones)
en sitios de reconocimiento de
enzimas de restricción (6 – 8
bases de longitud)
• Mutación puntual puede
potencialmente crear un subtipo
diferente.
• Solo una pequeña fracción del
genoma es “probada” por variación
(ej., secuencias reconocidas por la
enzima de restricción)
SUBTIPIFICACIÓN E
INVESTIGACIONES DE BROTES
Patógenos en los alimentos
Infección humana
Almacenamiento de
alimentos
Aislamiento de fluido
corporal estéril usando
placas de sangre no
selectivas
Aislamiento mediante
enriquecimiento
selectivo, medio
selectivo y agar
diferencial
Subtipificación del
Aislado
Subtipificación del
Aislado
Imagen proporcionada por Peter Gerner-Smidt, Centros para el Control y la Prevención de
Enfermedades
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•
•
Mediados de Septiembre del
2006
• CDC alertó sobre enfermedades con
clusters de E. coli O157:H7 en el
noroeste
• CDC PulseNet confimó casos
causados por el mismo tipo PFGE
A finales de Septiembre del
2006
• 206 personas infectadas con cepas
del brote en 26 estados.
• 52% hospitalizados; 15% SUH; tres
muertes
• 95% de comidas con espinaca fresca
fueron reportadas dentro de 10 días
antes del inicio de la enfermendad.
•
Investigación de rastreo
• E. coli O157:H7 brote combinado con
aislamientos de tipo PFGE de ganado
en ranchos cercanos a campos de
espinacas y cerdos salvajes
HISTORIA DE LA SECUENCIACIÓN DEL
GENOMA
• La secuenciación de las moléculas de ADN inició a finales de 1970
• La degradación 1uímica, seguido por el método de terminación de
cadena de Sanger, conocido como el “Gold Standard" de la
secuenciación de ADN.
• Secuenciación Shutgun, basada en el método de Sanger, la
clonación de fragmentos en Escherichia coli para la amplificación
• Primera secuencia del genoma bacteriano completada
(Haemophilus influenzae; 1,8 millones de pares de bases),
terminada en 1995
• Estudios por genómica comparativa E. coli O157:H7/K-12; Primer
genoma de Listeria monocytogenes publicado en el 2001
• Finalización de la primera secuencia de genoma humano (3 billones
pb) completada en el 2003
• El proyecto tardó 13 años en completarse y costó $ 2.7 millones
TIPIFICACIÓN DE CEPAS BASADA EN
SECUENCIAS DE ADN/MÉTODOS DE
IDENTIFICCIÓN.
• Tipificación Alélica
• Tipificación multilocus de secuencias (MLST)
• Análisis multilocus de repeticiones en tándem de número variable
(MLVA)
• Tipificación de Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)
• Tipificación de Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y
regularmente espaciadas (CRISPR)
• Secuenciación completa del genoma.
• CDC, FDA y agencias regulatorias de otros países realizan
rutinariamente la secuenciación del genoma de patógenos
transmitido por alimentos, aislados de casos clínicos de pacientes
con enfermedades transmitidas por alimentos.
EL GENOMA DE 1.000 DOLARES
• 2003
• La Fundación Científica J. Craig Venter prometió 500,000
dólares al primer grupo en producir una tecnología capaz
de secuenciar un genoma humano por 1,000 USD
• La Fundación X Prize prometió otros $ 5-20 millones al
ganador.
• 2004
• Los Institutos Nacionales de Salud (NIH) pusieron en
marcha un programa de $ 70 millones para apoyar a los
investigadores que trabajan para secuenciar genomas
completos inicialmente por $ 100.000 y en última
instancia por $ 1,000
TECNICAS DE SECUENCIACIÓN DE NUEVA
GENERACION (NGS)
•
Genera grandes cantidades de datos de secuencia rápida y
relativamente económica
•
Química única y plataformas de preparación, secuenciación y
análisis de datos
•
Eliminar la necesidad de “secuenciacion por shotgun” clonación y
amplificación
•
Preparación del Templado
• Templado clonalmente amplificado procedente de una sola molécula.
• Molécula unica de ADN molde.
• Secuenciación.
•
•
•
•
Terminación reversible cíclica
Única adición de nucleótidos.
Secuenciación por ligación
Secuenciación en tiempo real.
Metzker, 2010
12
4/20/2015
APLICACIÓN DE LA SECUENCIACIÓN
DE NUEVA GENERACION
• Secuenciación ChIP
• Patrones de metilación
• Secuenciación completa del genoma
• Etiquetas de expresión.
• Metagenómica y diversidad microbiana
• Resecuenciación dirigida
• Análisis de pequenos ARN
• Secuenciación del transcriptoma
APLICACIONES DE NGS EN
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS /
INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS
•
Facilita el desarrollo de ensayos de detección mejorados
•
•
Identificación de genes/marcadores únicos para patógenos o cepas del
brote
Permite el desarrollo mejorado de métodos de tipificación molecular.
•
•
•
Patógenos que son difíciles de diferenciar por PFGE (ej., ciertos serotipos
de Salmonella)
Proporciona nuevos conocimientos sobre la biología de los
microorganismos asociados a los alimentos (patógenos, organismos de
descomposición, microorganismos beneficiosos)
NGS PARA LA DETECCIÓN
ESPECÍFICA DE BROTES.
• Antecedentes:
• Brotes muy grandes asociados con cepas no- O157:H7
• Características clínicas inusuales
• Serotipo O104:H4
• Taxonomía (Cinco nuevas subespecies de Listeria., nuevos serotipos de
Salmonella), perfil transcripcional y adaptación nicho.
Permite estudios basados en la gran escala de alimentos asociados con
microorganismos, microorganismo ambientales y microbios intestinales.
•
Metagenómica para investigar toda la comunidad microbiana (es decir,
cultivable y no cultivable) secuenciar el ADN microbiano total .
LA SECUENCIACIÓN DEL
GENOMA
•
Metas:
• Caracterizar la cepa para posiblemente ganar conocimiento en razón
más allá de las características epidemiológicas y clínicas únicas del
brote.
• Utilizar los datos de la secuencia del genoma para desarrollar ensayos
de PCR para la detección.
• Realizado, utilizando el sistema de Ion Torrent en Europa (Life
Technologies, Darmstadt Centro de Formación en colaboración
con la Universidad de Münster) y en China (BGI Shenzhen)
•
ENSAYO DEL GENOMA
Ion Torrent
• Instrumentos approx. $50,000
• Costo de reactivos por aislamiento alrededor de $100
• Secuenciación inicial de un aislado < 1 semana
Resultados:
• La cepa carece de intimina y codifica para un número de genes que
confieren resistencia a diferentes agentes antimicrobianos
• La cepa parece ser un "híbrido que tiene propiedades de EHEC y E.
coli enteroagregativa"
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NGS PARA MEJORAR LA
SUBTIPIFICACIÓN
Xbal SpeI
• Antecedentes
• Salmonella Montevideo es muy clonable.
• Un gran número de aislamientos no relacionados tienen el mismo
tipo PFGE, por ejemplo, los aislamientos de "brote de pistacho" y
"brote salami"
• Problemas similares con un número de otros serotipos de
Salmonella (ej, Newport y Enteritidis)
Den Bakker et al.
2011. AEM.
•
NGS BIOLOGÍA DE LOS MICROBIOS
ASOCIADOS CON ALIMENTOS
Sanger method (Nelson et al., 2004)
• F6854 (food – 1988)
• 133 contigs (2.97 MB combined length) – Pseudomolecule
• 8X coverage
• Roche/454 Pyrosequencer (Orsi et al., 2008)
• F6900 (human - 1988)
• 35 contigs (2.96 Mb combined length)
• 26X coverage
• J0161 (human – 2000)
• 49 contigs (2.97 MB combined length)
• 2 contigs (82,678 bp combined length) extra-chromosomal plasmid
(not used for analyses purposes)
• 29X coverage
• J2818 (food – 2000)
• 38 contigs (2.97 Mb combined length)
• 24X coverage
RESULTADOS
• Alineación totalmente refinada: 2,922,773 bp (98.4 %)
de la secuencia del cromosoma F6854 (2,971,285 bp)
• 3 sub-alineaciones
• Alineación backbone
• Alineamiento de Profago 1 (insertado en comK)
• Alineamiento de Profago 1 (insertado en tRNA-Thr-4)
• SNPs (backbone y profago 2):
• 44 SNPs
• 42 hijos únicos (observados en un solo aislamiento)
• 2 diferenciar 1988 aislamientos de 2000 aislamientos
• Posibles problemas :
• Ensamblado
• Alineación
• Secuencia de errores
DISTRIBUCIÓN DE SNPS
•Re-secuenciación ( Método Sanger) confirmó 12
SNPs
•8 SNPs específicos para J2818 (2000 – alimentos)
•3 en regiones intergénicas
•1 sinónimo
•4 no sinónimos
•Fosfoenolpiruvato sintasa, putativo
•similar a la etanolamina utilizando proteína
EutE
•Familia RDD (transporte?)
•AddB
•2 SNPs unicas para J0161 (2000 – humanos)
•2 en las regiones intergénicas
•1 no se encuentra en el J0161 aislada en la colección
FSL
•1 SNP única de F6900 (1988 – humanos)
•Región intergénica
•1 SNP diferenciado 1988/2000 aislamientos
•1 no sinónimo
•Proteína de la cola del fago putativo
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RECOMBINACIÓN
12 AÑOS DE EVOLUCIÓN
• Varios eventos de recombinación que implican un linaje que
aislar, J1194, fueron identificados por GENECONV
• Todos los acontecimientos dentro de un pofagos, insertados en
comK
ER ER
1
2
F685
4
F690
0J281
8
J016
FSL J11
194
Lysogeny
control
Cell
lysis
R
1
Tail and base
structures
Prophage inserted in
comK
R
2
F6900
1 (humano)
R
3
Ancestor
A
Lysogeny
DNA
control
Head structural components & packaging
assembly
DNA replication, recombination,
modification and gene expression
modulation
La secuenciación de todo el ADN encontrado
después del enriquecimiento es factible y se
está haciendo por la FDA.
•
• Reduce el sesgo que es inherente a la detección tradicional
• Crea datos sobre todo el ADN encontrado; un enorme
potencial para la creación de datos "comprometedores" en
ausencia de riesgos para la salud pública.
•
Caracterización basada en NGS de la diversidad
microbiana encontrado en una muestra dada
• Secuenciación de ARN masiva en paralelo
• Potencial de rastreo de fuentes
8
F6854
(alimentos)
ARNt propaga la
mutación o
recombinación
Ancestor
B
1
J2818
(alimento)
J0161
(humano)
RESUMEN GENERAL Y
CONCLUSIONES
NGS Y ESTUDIOS DE POBLACIÓN
•
comK
prophage
recombination
La secuenciación de nueva generación del
genoma esta contribuyendo a la inocuidad
alimentaria
• Subtipificación mejorada de PFGE
• Identificación de mejores genes diana para la detección.
• Traducción de transcriptómica, metabolómica, etc. hallazgos para
mejorar la prevención y tratamiento está en las primeras etapas
•
Sistemas bioinformáticos, están avanzando
rápidamente haciendo viable su aplicación en
laboratorios de salud pública.
•
NGS también impactará en los enfoques de
detección de patógenos
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