1. Ciencia

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA TIPO QUITINASA DE
ACTINOMICETOS Y SU CAPACIDAD ANTAGONICA FRENTE A HONGOS
FITOPATÓGENOS
Ivonne Alexandra Barreto
Camila Castro Rico
DIRECTORA:
María Ximena Rodríguez
PROYECTO DE TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de Microbiólogo Industrial
BOGOTÁ D.C 2011
1
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia”
2
CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA TIPO QUITINASA DE
ACTINOMICETOS Y SU CAPACIDAD ANTAGONICA FRENTE A HONGOS
FITOPATÓGENOS
Ivonne Alexandra Barreto
Camila Castro Rico
APROBADO
___________________________________
María Ximena Rodríguez Bocanegra Ph.D
Directora
_____________________________
Ivonne Gutiérrez M.sc
Profesor Asociado
Jurado
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CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA TIPO QUITINASA DE
ACTINOMICETOS Y SU CAPACIDAD ANTAGONICA FRENTE A HONGOS
FITOPATÓGENOS
Ivonne Alexandra Barreto
Camila Castro Rico
APROBADO
____________________________
INGRID SCHULER
Decana Académica
Facultad de Ciencias
___________________________
JANETH ARIAS
Directora de Carrera
Facultad de Ciencias
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AGRADECIMIENTOS
A Dios, nuestros padres y familia quienes nos han apoyado durante todo este proceso y han
sido parte fundamental de nuestros logros.
A María Ximena por su dedicación, su paciencia y sus consejos que hicieron posible el
desarrollo de nuestro trabajo.
Al mono y al cuy por darnos el impulso de empezar con el pie derecho y por su apoyo moral
constante.
Finalmente a Diana, Caro, e Iván que nos guiaron en todos nuestros momentos de duda y
en sí a UNIDIA que han sido una excelente familia muy grata de conocer.
5
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………8
2. MARCO TEORICO……………………………………………………………………………….9
2.1. Generalidades de la rizósfera………………………………………………………….......9
2.2. Rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal (PGPR) ……….............................9
2.3. Actinomicetos ………………………………………………………………………………..9
2.4. Quitina y producción de quitinasas………………………………………………………..9
2.5. Generalidades de hongos fitopatógenos (Fusarium oxysporum – Rhizoctonia
solani)………………………………………………………………………………………..10
2.6. Actividad Antagónica frente a patógenos fúngicos …………………………..……….11
3. OBJETIVOS.…………………….……………...……………………………………………….12
4. METODOLOGÍA…………………..…………………………………………………………….13
4.1. Reconstitución de aislamientos de actinomicetos…………………….……….……....13
4.2. Evaluación de la actividad quitinolítica………………………………………….……....14
4.3. Evaluación de actividad antifúngica in vitro…………………………………….….…...15
4.4. Actividad inhibitoria del extracto enzimático…………………………..……….…….…16
4.5. Análisis estadístico……………………………………………………….……….……....17
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………….……………….……....18
5.1. Reconstitución de los aislamientos de actinomicetos.. ……………………………....18
5.2. Cuantificación de la Actividad Quitinolítica…………………………………….……....18
5.3. Actividad antagónica de los actinomicetos frente a Fusarium oxysporum y
Rhizoctonia solani……………………………………………………………..….………21
5.4. Actividad inhibitoria del extracto enzimático quitinolítico frente a Fusarium
oxysporum y Rhizoctonia solani……………………………………………..….….…..25
5.5. Correlación estadística de variables …………………………………………………..26
6. CONCLUSIONES………………………………………………………………...…….……..30
7. RECOMENDACIONES………………………………………………………….…….……...31
8. BIBLIOGRAFÍA …………………………….…………………………………………….……32
9. ANEXOS…………………………….…………………………………………………….…...36
6
RESUMEN
Los actinomicetos son considerados microorganismos promotores de crecimiento vegetal
(PGPR) al ser prometedores agentes del control biológico por su conocida capacidad de
producir metabolitos extracelulares antifúngicos. Debido a que se han encontrado reportes
de enzimas hidrolíticas de pared celular fúngica como uno de los mecanismos de acción
biocontroladora de actinomicetos, en el presente estudio se decidió evaluar la producción de
enzimas quitinolíticas por parte de 15 aislamientos de actinomicetos provenientes de suelo
rizosférico de trébol en la Sabana de Bogotá. Para el cumplimiento de este objetivo se midió
la actividad quitinolítica mediante la cuantificación de azúcares reductores liberados por la
técnica de Somogyi-Nelson al usar quitina coloidal al 0,252% (p/v) como sustrato inductor. Al
mismo tiempo se evaluó la actividad antifúngica in vitro de los aislamientos frente a los
hongos fitopatógenos de suelo Rhizoctonia solani y Fusarium oxysporum, por medio de la
técnica de enfrentamiento dual en placas de PDA. Por otro lado, para confirmar la acción de
las quitinasas sobre los hongos, se determinó la actividad inhibitoria de los extractos
enzimáticos quitinolíticos de cada aislamiento frente a los patógenos mencionados por
medio de la técnica de difusión del extracto en agar.
De acuerdo a los resultados obtenidos el aislamiento con mayor actividad quitinolítica fue el
MCR 12 (0,0955 UQ). Los asilamientos con mayor porcentaje de inhibición frente a
Rhizoctonia solani fueron MCR 7, MCR 4 y MCR 11 (89,8, 85,1 y 85,1% respectivamente) y
frente a Fusarium oxysporum fueron MCR 7, MCR 16 y MCR 12 (86.6, 82,83 y 80,83%,
respectivamente), encontrándose una inhibición de amplio espectro por parte de los
aislamientos. Adicionalmente, los porcentajes de inhibición de los extractos enzimáticos no
superan el 15,5%, siendo los mayores los de los aislamientos MCR 4 (8,24%) y MCR 14
(8,03%) frente a Rhizoctonia solani y frente Fusarium oxysporum los de los asilamientos
MCR 2, MCR 4, MCR 14, MCR 16 y MCR 24 (15,52%, 14,42%, 14,87%, 13,36% y 15,30%,
respectivamente). Finalmente, se realizó un análisis de correlación de Pearson entre las
diferentes variables, donde se evidenció principalmente la ausencia de una correlación
significativa entre la actividad quitinolítica y la actividad antagónica de los aislamientos,
sugiriendo así que son otro tipo de metabolitos difusibles al medio los que ejercen la acción
antifúngica y no propiamente las enzimas quitinolíticas.
7
1. INTRODUCCIÓN
De acuerdo al cambio climático y desarrollo sostenible, hoy en día se requieren soluciones
para producción de cultivos, ambientalmente amigables, que generen menos contaminación
y contribuyan al mejoramiento de las diferentes condiciones del suelo cultivable. Es por esto
que se hace necesaria la disminución del uso de agroquímicos con la búsqueda de
alternativas agrícolas de manejo de sostenible de origen biológico que ayuden a mejorar la
salud de la planta y la calidad estructural del suelo.
Los principales problemas de los cultivos que conllevan al uso de plaguicidas de origen
químico son las enfermedades causadas por los hongos patógenos de plantas que tienen la
capacidad de afectar la raíz. Fusarium oxysporum es un hongo productor de un amplio
rango de metabolitos secundarios (Suga y Hyakumachi, 2004) que ha sido reportado por
afectar cultivos económicamente importantes como el tabaco, algodón, frijol y clavel, entre
otros, causando marchitez vascular (Alves et al., 2007; Fravel et al., 2005). Por otro lado,
Rhizoctonia solani es otra especie fitopatógena causante de “damping-off” en un amplio
espectro de cultivos, que posee fuertes estructuras de resistencia como lo son los
esclerocios y una fácil dispersión en el suelo (Nerey et al., 2010).
Una de las alternativas de biocontrol es la utilización de microorganismos promotores del
crecimiento vegetal (PGPR, por su sigla en inglés) como los actinomicetos. Estos son un
grupo de microorganismos filamentosos de tipo bacteriano que se propagan por esporas y
se caracterizan por colonizar el suelo por hifas muy finas. Tienen gran importancia en la
comunidad de la rizósfera ya que influencian fuertemente las raíces generando un efecto
benéfico en el desarrollo de la planta protegiéndolas contra patógenos (Figueireido y
Nogueira, 2009).
Los actinomicetos se han estudiado como prometedores agentes en el control biológico al
poseer diferentes mecanismos indirectos de promoción de crecimiento vegetal, como la
producción de una gran variedad de enzimas degradadoras de paredes de hongos y
oomycetos tales como glucanasas, quitinasas, celulasas y hemicelulasas (Ezzyyani et al.,
2007). La sensibilidad de las paredes celulares a estas enzimas ayudan a disminuir la
presencia de estos patógenos en los cultivos agrícolas, afectando su desarrollo y viabilidad
(Agrios, 2002).
Siendo la quitina el principal polímero componente estructural de la pared celular de los
hongos, este proyecto busca a través de métodos cuantitativos determinar la actividad
quitinolítica de actinomicetos aislados de suelos colombianos, su capacidad antagónica y la
capacidad inhibitoria del extracto enzimático quitinolítico frente a los hongos fitopatógenos
Fusarium oxysporum y Rhizoctonia solani, como modelos experimentales, con el fin de
establecer si existe o no una correlación entre tales variables.
8
2. REFERENTES CONCEPTUALES - MARCO TEORICO
2.1 Generalidades de la rizósfera
La rizósfera es la región del suelo influida bioquímica y biológicamente por las raíces de las
plantas, donde proliferan e interactúan los microorganismos. Las relaciones entre los
microorganismos de la rizósfera y las plantas están mediadas por los exudados radiculares,
que dependiendo de su naturaleza inhiben o promueven el crecimiento de bacterias,
hongos, áfidos y nematodos (Rosenblueth et al., 2001). Muchas de las interacciones de
tales comunidades microbianas, que son reguladas por señales moleculares específicas,
son responsables de los procesos biológicos claves para el medio ambiente tales como los
ciclos biogeoquímicos de nutrientes, el mantenimiento de la salud de la planta y la calidad
del suelo (Barea et al., 2004). Estas se basan principalmente en la modificación, por parte
de microorganismos, de las características del suelo por procesos como la captación de
nutrientes y minerales, la producción de factores de crecimiento vegetal y su acción frente a
agentes patógenos (Manoharachary y Mukerjli, 2006).
2.2 Rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal (PGPR)
Las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) son bacterias del suelo que
colonizan las raíces de las plantas, facilitando su enraizamiento y crecimiento por medio de
diversos mecanismos, ya sean directos o indirectos. Directamente pueden aumentar la
solubilización de nutrientes minerales y la fijación de nitrógeno haciendo estos disponibles
para las plantas; así como también la producción de reguladores de crecimiento vegetal
(Maheshary, 2010). Indirectamente, estas rizobacterias potencian el crecimiento de las
plantas vía supresión de fitopatógenos por una variedad de mecanismos. Estos mecanismos
incluyen la habilidad de sintetizar sideróforos que quelan el hierro haciéndolo no disponible
para los patógenos, metabolitos con actividad antifúngica como antibióticos, enzimas líticas
de pared celular fúngica o producción de agentes volátiles como el cianuro de hidrogeno, el
cual suprime el desarrollo de hongos patógenos; la capacidad de competir exitosamente por
nutrientes o nichos específicos en la raíz y su habilidad de inducir la resistencia sistémica en
las plantas (Holguin et al., 2003).
2.3 Actinomicetos
Los actinomicetos son una de las poblaciones microbianas que predominan en el suelo.
Estos microorganismos pertenecen a un diverso grupo de bacterias filamentosas Gram
positivas, que juegan un papel ecológico muy importante en la rizósfera al estar involucrados
en diversas asociaciones (Franco-Correa et al., 2010).
Los actinomicetos muestran crecimiento óptimo en suelos neutros y levemente alcalinos con
un rango de pH óptimo entre 6.5 y 8.0, son aeróbicos, heterótrofos y saprófitos; la mayoría
tiene un máximo crecimiento entre 25-30 ºC, aunque también se encuentran representantes
9
termotolerantes y termofílicos. Estos microorganismos presentan actividades metabólicas
que los pueden catalogar como rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal. Se ha
reportado su habilidad de producir sideróforos de tipo hidroxamato, hormonas de
crecimiento vegetal in vitro y otro tipo de metabolitos promotores de crecimiento vegetal en
la rizósfera (Diaz, 2009; Hamdali et al, 2008). Por otro lado, se han descrito como agentes
biocontroladores de hongos fitopatógenos por su habilidad de sintetizar una variedad de
enzimas biodegradativas como quitinasas, glucanasas, celulasas y otras enzimas
involucradas en su actividad micoparasitaria (Tokala et al., 2002).
2.4 Quitina y producción de quitinasas
La quitina es un homopolímero lineal insoluble compuesto por subunidades de Nacetilglucosamina (GlcNAc) unidas por enlaces β- 1,4. La quitina se encuentra en la
naturaleza como microfibrillas cristalinas que forman parte del exoesqueleto de los
invertebrados y la pared de hongos filamentosos. Las principales fuentes comerciales de
quitina han sido las conchas de cangrejos y camarones e industrialmente se extrae de los
crustáceos por un tratamiento ácido que disuelve el carbonato de calcio seguido de una
extracción alcalina que solubiliza las proteínas (Rianudo, 2006).
Las quitinasas son glicosil hidrolasas que catalizan la degradación de la quitina. Estas
enzimas están presentes en un amplio rango de organismos como bacterias, hongos,
plantas y animales cumpliendo diferentes roles. En vertebrados hacen parte del tracto
digestivo, en insectos y crustáceos son asociadas con la degradación parcial de la cutícula,
en hongos se ha pensado que tienen papeles autolíticos, nutricionales y morfogenéticos, en
virus están involucradas en la patogénesis y en bacterias juegan un papel importante en la
nutrición y el parasitismo (Patil et al., 2002).
2.5 Generalidades de hongos fitopatógenos (Fusarium oxysporum – Rhizoctonia
solani)
Fusarium oxysporum y Rhizoctonia solani son hongos patógenos del suelo, ampliamente
distribuidos en el país. Se consideran agentes causales de enfermedades de gran impacto
económico al tener la capacidad de influenciar la rizosfera, penetrando las raíces de las
plantas.
Fusarium oxysporum, es una especie anamórfica con una considerable variación
morfológica y fisiológica. Tiene la habilidad de causar enfermedades en cultivos
económicamente importantes como frijol, arroz, tomate y clavel, entre otros, causando
pudrición en los tallos y raíces (Alves et al., 2007). Este patógeno es capaz de invadir el
sistema vascular de la planta produciendo una variedad de enzimas líticas que
despolimerizan todos los componentes de la pared vegetal (Roncero et al., 2000). De este
modo, penetra las diferentes capas de la corteza de la raíz hasta alcanzar el sistema
10
vascular, una vez establecido coloniza el xilema y causa el síntoma característico de la
marchitez (Bohorquez, 2010).
Por otro lado, Rhizocotonia solani es un basidiomiceto que se reproduce asexualmente y se
encuentra en suelo en forma de micelio y/o esclerocios debido a la ausencia de conidios y la
escasez de esporas sexuales. Puede permanecer en el suelo como saprófito por largos
periodos de tiempo y se dispersa vía esclerocios ya sea por el agua, viento o durante
prácticas agrícolas (Lehtonen, 2009). Se caracteriza por ser un parasito no obligado,
patógeno del suelo, causando damping-off en numerosas especies de plantas como
consecuencia del estrangulamiento y la necrosis del tallo a nivel del cuello, reduciendo
significativamente su vigor (Tovar, 2008).
2.6 Actividad Antagónica frente a patógenos fúngicos
Los actinomicetos se propagan por esporas y colonizan el suelo. Hacen parte de la
comunidad de la rizosfera la cual está fuertemente influenciada por las raíces de las plantas.
Debido a la gran variedad de microorganismos presentes, entre ellos patógenos fúngicos,
los actinomicetos son capaces de generar mecanismos como antibiosis, produciendo
metabolitos de bajo peso molecular fácilmente difusibles que inhiben el crecimiento
vegetativo de estos patógenos (Figueiredo y Nogueira 2006). Sin embargo, se han reportado
otros mecansimos de acción biocontroladora por parte de los actinomicetos tales como; la
producción de sideróforos, sustancias de bajo peso molecular capaces de quelar el hierro
haciéndolo este elemento esencial no disponible para los hongos (Macgnan et al., 2008), la
competencia por nutrientes, en algunos casos su capacidad micoparasitica, la inducción de
resistencia sistémica en las plantas y la producción de enzimas líticas de pared celular
fúngica, tanto quitinasas como glucanasas (El-Trabily et al., 2006).
11
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo General
Determinar la correlación existente entre la actividad quitinolítica, la capacidad antagónica
frente a hongos fitopatógenos y la actividad inhibitoria de extracto enzimático (quitinolítico)
de actinomicetos aislados de suelo rizosférico en la Sabana de Bogotá.
3.2 Objetivos Específicos

Cuantificar la actividad quitinolítica de 15 aislamientos de actinomicetos de suelo
rizosférico de plantas de trébol.

Evaluar la actividad antagónica de los aislamientos de actinomicetos frente a hongos
fitopatógenos del suelo, Fusarium oxysporum y Rhizoctonia solani.

Evaluar la actividad inhibitoria de crecimiento fúngico de extractos crudos quitinolíticos
de los actinomicetos.
12
4. METODOLOGÍA
4.1 Reconstitución de aislamientos de actinomicetos.
Se trabajó con un total de 15 aislamientos de actinomicetos provenientes del banco de
microorganismos de la Unidad de Investigaciones Agropecuarias (UNIDIA) de la PUJ
(Franco-Correa et al., 2010) y una cepa control de Streptomyces sp., donada por el
Laboratorio de Biotecnología Aplicada de la PUJ, conocida por su actividad quitinolítica
gracias a los estudios hechos por Sastoque (2006).
Los aislamientos fueron reconstituidos por triplicado en agar avena (anexo 2) e incubados
durante 7 a 10 días a 25°C. Luego de la confirmación macroscópica y microscópica de su
morfología, se llevó a cabo la preparación del banco de trabajo por crioconservación en
glicerol al 20% (v/v), a temperatura de -20°C. Estos aislamientos fueron seleccionados, en
su mayoría, por presentar actividad quitinolítica a nivel semicuantitativa en estudios
realizados por Farfán y Gutiérrez (2009) (Tabla 1).
Tabla 1. Identificación morfológica y molecular de los aislamientos de actinomicetos en estudio y su
actividad quitinolítica semicuantitativa.
Aislamiento
Caracterización
Microscópica*
ARDRA*
BLAST*
Actividad Quitinolítica
semicuantitativa **
MCR 1
Streptomyces
Streptomyces
----
0,000 ± 0,000
MCR 2
Streptomyces
MCR 4
Nocardia
MCR 5
MCR 7
Saccharopolyspora Saccharopolyspora (84%)
5,167 ± 1,027
Thermobifida
Thermobifida (83%)
3,333 ± 0,514
Streptomyces
Streptomyces
----
3,750 ± 0,816
Nocardia
Thermomonospora
----
3,240 ± 1,021
MCR 10
Streptomyces
Streptomyces
Streptomyces (98%)
1,433 ± 0,094
MCR 11
Streptomyces
Streptomyces
Streptomyces (96%)
0,000 ± 0,00
MCR 12
Nocardia
Streptomyces
Streptomyces (96%)
2,667 ± 0,236
MCR 14
Streptomyces
Streptomyces
Streptomyces (99%)
7,083 ± 1,179
MCR 16
NI
Streptomyces
----
1,125 ± 0,125
MCR 19
Streptomyces
Streptomyces
Streptomyces (99%)
0,000 ± 0,00
MCR 21
Streptomyces
Streptomyces
Streptomyces (96%)
3,333 ± 0,624
MCR 24
Nocardia
Thermobifida
Thermobifida (84%)
8,500 ± 0,408
MCR 25
NI
Streptomyces
----
3,333 ± 0,408
MCR 26
NI
Streptomyces
----
6,167 ± 0514
*Identificación morfológica y molecular (Franco-Correa et al., 2010)**Milím
etros de halo de hidrólisis en agar quitina coloidal 1% (Farfán y Gutiérrez, 2009)
13
4.2 Evaluación de la actividad quitinolítica
4.2.1 Preparación quitina coloidal
20g de quitina comercial (Sigma ®) fueron disueltos en 300mL de ácido fosfórico al 85%
(v/v) y llevados a agitación a 4°C durante 48 horas, para ser luego se filtrados a través de
fibra de vidrio. Posteriormente, se adicionó etanol acuoso al 50% alcanzando un volumen
final de 600mL para generación del coloide. Esta mezcla se llevó a agitación hasta observar
una solución homogénea y de aspecto coloidal. A continuación se realizaron 15 lavados con
agua destilada mediante centrifugación a 4500 x g a 10°C con el fin de eliminar el ácido
fosfórico y alcanzar un pH neutro.
4.2.1.1 Diálisis de quitina coloidal
Para los ensayos enzimáticos la quitina coloidal que se utilizó como sustrato fue sometida a
un proceso de diálisis para eliminar metabolitos de bajo peso molecular o impurezas que
pueden inhibir la actividad de las enzimas quitinolíticas. Como primera medida se realizó un
pre tratamiento de las membranas de diálisis con una solución de NaHCO3 100mM y EDTA
10mM a 60°C durante 2 horas, a continuación se repitió el paso anterior con la misma
solución fresca. Luego, la solución fue reemplazada por agua destilada y se mantuvieron las
mismas condiciones de tratamiento. Posteriormente, se realizaron cinco ciclos de lavado con
agua destilada y se almacenaron las membranas a 4°C en agua destilada con cloroformo al
0.1% (v/v). En fragmentos de 20 cm de longitud de membrana pretratada se adicionaron
aproximadamente 25mL de quitina coloidal, las membranas fueron selladas y ubicadas en
un recipiente con agua destilada que se llevó a diálisis a 4°C durante 48 horas haciendo
cambios periódicos del agua.
La concentración final de la quitina coloidal se estimó de acuerdo al volumen final obtenido.
Para las reacciones enzimáticas, la quitina coloidal dializada fue diluida a una concentración
final de 0,5% (p/v) en una solución de buffer fosfato de potasio a pH 6.
4.2.2 Obtención de extractos enzimáticos
Se preparó un inóculo de concentración 109 células/mL a partir de cada aislamiento,
previamente crecido y esporulado en agar avena, realizando un recuento en cámara de
Neubauer. El volumen de inóculo para cada medio fue de 0.2mL para obtener en el medio
una concentración de 107 células/mL. Por cada aislamiento fueron preparadas cuatro
réplicas biológicas.
Para la inducción de la actividad enzimática se tuvo como base el estudio realizado por
Hernández y Muñoz (2009), donde estandarizaron el medio óptimo para la inducción de la
actividad quitinolítica. El medio está compuesto por sales (K2HPO4 1.5% (p/v), KH2PO4 1.5%
(p/v), MgSO4.7H2O 1.5 % (p/v), CaCl2 0.5% (p/v),FeCl3 0.06% (p/v), NaCl 0.5% (p/v), NH4Cl
14
0.1% (p/v)) y 2.62 g/L de quitina coloidal y 5g/L de galactosa como fuentes de carbono
(Anexo 2). Los cultivos fueron realizados en erlenmeyer de 100mL con un volumen efectivo
de trabajo de 20mL, incubados a 25°C y 120rpm durante 7 días.
Luego de la incubación, los cultivos fueron sometidos a doble centrifugación (9000rpm y
12000rpm, centrífuga Sorval RC-5b, rotor SS-26) durante 20 minutos, para remover las
células bacterianas y obtener los extractos crudos enzimáticos.
4.2.3 Determinación de actividad quitinolítica por cuantificación de azúcares
reductores
La evaluación de la actividad quitinolítica se realizó por medio de la cuantificación de
azúcares reductores liberados al reaccionar con el sustrato de quitina coloidal al 0.5%. Se
trabajó con las condiciones de reacción previamente establecidas por Hernández y Muñoz
(2009): proporción enzima sustrato 1:4, temperatura de reacción 50°C durante 30 minutos,
pH 6. La reacción se realizó por triplicado y se determinaron los azúcares reductores
liberados por el método de Somogyi-Nelson. Se definió una unidad quitinolítica (UQ) como la
cantidad de enzima capaz de liberar un micromol de N-acetilglucosamina por minuto.
Siendo la galactosa un azúcar reductor se decidió llevar a cabo la determinación de
azucares reductores tanto en las reacciones enzimáticas bajo las condiciones previamente
estandarizadas, como en los extractos crudos con el fin de descontar los azucares
reductores provenientes del medio de cultivo a los azucares totales presentes, para así
determinar los azúcares reductores que fueron realmente liberados por la acción enzimática
sobre el sustrato de quitina coloidal.
4.2.3.1 Curva de calibración para la determinación de azucares reductores
La curva de calibración para la cuantificación de azúcares reductores por el método de
Somogyi-Nelson (Modificado por Rodríguez 2001) (Anexo 3) fue realizada con Nacetilglucosamina, monómero de quitina. Se tomaron diferentes concentraciones del azúcar
a partir de una solución stock 2 µg/mL (0,08 – 0,36µg/mL), tomando 15 puntos entre el
rango por triplicado. Se determinó Abs595nm después de ser sometidos a la reacción de
Somogyi-Nelson.
4.3 Evaluación de actividad antifúngica in vitro
Para la determinación de la capacidad antagónica de las cepas de actinomicetos frente a
hongos fitopatógenos, se llevó a cabo la técnica de enfrentamiento dual en placa
(actinomiceto vs hongo). El enfrentamiento se hizo frente a hongos conocidos por su
patogenicidad en suelo, Fusarium oxysporum y Rhizoctonia solani, aislados de clavel y frijol,
respectivamente. El aislamiento de Fusarium oxysporum hace parte de la colección de
15
UNIDIA y del aislamiento de Rhizoctonia solani fue donado por el laboratorio de patología de
frijol del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT).
Para el enfrentamiento se realizó una siembra masiva de cada una de las cepas de
actinomicetos por triplicado ocupando un espacio de 3cm desde el extremo de la caja en
agar papa dextrosa (PDA) (anexo 2). Las siembras fueron incubadas a 25°C durante 10 días
hasta esporulación y posteriormente fue inoculado el patógeno (disco de agar-micelio) a una
distancia de 3cm del extremo de la siembra del actinomiceto.
Se evaluó el efecto antagónico de los aislamientos MCR10, MCR14, MCR19 y MCR 21
sobre Fusarium oxysporum, siguiendo la técnica de enfrentamiento dual previamente
descrita. Los resultados obtenidos permitieron complementar el estudio realizado por Farfán
y Gutiérrez (2009). Sobre Rhizoctonia solani se evaluó el efecto antagónico de los 15
aislamientos de actinomicetos estudiados.
Por otro lado, se realizó, un control de viabilidad de cada hongo fitopatógeno inoculado en el
centro de una caja de PDA. Después de 8 días de incubación, se midió el crecimiento libre
del hongo y el influenciado con el fin de determinar el porcentaje de inhibición de crecimiento
radial (PICR) generado por el actinomiceto por medio de la siguiente ecuación (Ec 1):
(Ecuación 1)
4.4 Actividad inhibitoria del extracto enzimático
Con el fin de determinar la actividad inhibitoria del extracto enzimático quitinolítico frente a
los hongos fitopatógenos se llevó a cabo una prueba de difusión del extracto en agar. Para
esto se sirvieron 300µL de cada extracto enzimático en una caja de PDA por triplicado; las
cajas se dejaron en refrigeración hasta el siguiente día para asegurar la difusión del extracto
en el medio de cultivo. Posteriormente el patógeno (disco de agar-micelio) fue inoculado en
el centro de la caja. Adicionalmente, se realizó un control de viabilidad de los hongos,
sembrados en PDA sin extracto alguno. El crecimiento radial de cada hongo fue medido
diariamente en milímetros durante un periodo de ocho días para obtener una curva de
crecimiento de los patógenos en el medio libre e influenciado por los extractos.
Posteriormente, se calcularon y compararon sus respectivas áreas bajo la curva (ABC) por
medio de la ecuación reportada por Istifadah (2006) (Ec 2), para determinar el porcentaje de
inhibición de crecimiento radial generado por los extractos.
 Y  Y 
ABC    i1 i ti1  ti 
2

i 1 
n1
(Ecuación 2)
16
4.5 Análisis estadístico
Con los datos obtenidos de las unidades quitinolíticas, los porcentajes de inhibición por parte
del actinomiceto y los porcentajes de inhibición por parte del extracto enzimático, se realizó
un análisis estadístico de correlación lineal de Pearson. Adicionalmente se determinó la
diferencia de actividad quitinolítica e inhibitoria entre los actinomicetos por un análisis de
comparación de medias (ANOVA). Los análisis estadísticos se llevaron a cabo con el
programa SPSS versión 17.
17
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Reconstitución de los aislamientos de actinomicetos
La reconstitución de los aislamientos de actinomicetos del banco de cepas del grupo UNIDIA
de la Pontificia Universidad Javeriana en agar avena, permitió observar colonias opacas y
secas de textura pulverulenta. Cada aislamiento presentó características morfológicas tanto
macroscópicas como microscópicas específicas que fueron comparadas con la descripción
de Duque y Quintana 2008 (anexo 1). Este medio de cultivo altamente nutritivo permite el
crecimiento de los actinomicetos y favorece el desarrollo de las características propias de
estos. Se detectó también la presencia de olor a suelo húmedo que caracteriza a estas
bacterias filamentosas por la producción del compuesto terpenoide geosmina (Sylvia, 2005).
5.2 Cuantificación de la Actividad Quitinolítica
Los extractos enzimáticos quitinolíticos fueron obtenidos al séptimo día de crecimiento en el
medio de inducción líquido de quitina coloidal tal como fue determinado óptimo por
Hernández y Muñoz (2009). La producción de enzimas extracelulares tipo quitinasas en un
medio de cultivo como este se debe a la capacidad que tienen los actinomicetos de utilizar
este sustrato como fuente de carbono. La mínima cantidad de galactosa utilizada en el
medio funciona como fuente de carbono inicial para la generación de una mayor cantidad de
biomasa trabajando en la hidrólisis de quitina y por consiguiente una mayor producción de
enzimas hidrolíticas. Cabe destacar entonces que la galactosa no actúa como inductor de la
actividad enzimática, sino como un sustrato que no presenta represión catabólica (Han et
al., 2008; Hernández y Muñoz, 2009).
En la reacción de Somogyi-Nelson, usada para cuantificar los azúcares producidos por
hidrólisis de la quitina, todas las sustancias con propiedades reductivas pueden causar
interferencia; es decir que la cuantificación no es específica para N-acetilglucosamina
(Fournier, 2001)..
Al realizar la cuantificación de proteínas por el método de Bradford (datos no mostrados), no
se observó una cantidad significante de estas, por lo tanto no se determinó la actividad
enzimática específica en el estudio. Se decidió no utilizar agentes precipitantes de proteínas
ya que en los estudios realizados por Farfán y Gutiérrez (2009) y Hernández y Muñoz (2009)
se encontró que los métodos de precipitación por acetona y por sulfato de amonio no eran
efectivos cuando se tienen cantidades bajas de proteínas, debido a que conlleva a la
pérdida de actividad enzimática.
Los resultados obtenidos por el análisis de varianza (ANOVA) (anexo 5), en cuanto a
unidades quitinolíticas (UQ), mostraron tener diferencias estadísticamente significativas
entre aislamientos (α: 0,05, sig: 7,521x10-38). Estos fueron organizados en ocho conjuntos
de acuerdo a al agrupamiento de Duncan. Los aislamientos con menor producción de
unidades quitinolíticas fueron el MCR 7, seguido del aislamiento MCR 26 (0,0015 y 0,0126
18
UQ, respectivamente). Los aislamientos con mayor producción fueron el MCR 12 y la cepa
control (0,0955 y 0,0515 UQ, respectivamente) (Figura 1).
0,12
h
0,10
UQ
0,08
0,06
fg
0,02
def
def
0,04
b
g
efg
cd
cd de
b
b
bc
bc
ab
a
0,00
1
2
4
5
7
10 11 12 14 16 19 21 24 25 26
C
Aislamientos (MCR)
Figura 1. Unidades Quitinolíticas de aislamientos de actinomicetos, determinadas por hidrólisis de
quitina coloidal.
La cepa MCR 7 perteneciente al género Thermomonospora presentó una actividad
quitinolítica baja comparada con los datos de los demás aislamientos. Teniendo en cuenta
que en el ensayo semicuantitativo realizado por Farfán y Gutierrez (2009) este aislamiento
presentó una actividad media comparada con los otros aislamientos y que en las pruebas de
estandarización de la cuantifiacion de la actividad enzimatica realizadas por Hernandez y
Muñoz (2009) este aislamiento evidenció mayores valores de unidades quitinolíticas, se
considera una pérdida de la actividad enzimática por parte de este aislamiento. Esto pudo
deberse a una conservación inadecuada o a los diversos pases a los que fue sometido el
aislamiento. Se han reportado estudios donde los subcultivos continuos de actinomicetos
pueden tener efectos negativos en la producción de metabolitos y en la viabilidad, al ejercer
posibles cambios en sus características morfológicas, fisiológicas y genéticas (Taddei et al,
1999). Por otro lado, es posible que se haya presentado una pérdida de actividad enzimática
debido a una unión inespecífica del centro activo enzimático con el sustrato. Esta unión es
efectuada por interacciones no covalentes entre los aminoácidos que forman el dominio
activo y el sustrato, en este caso quitina (Franco, 2007). Por ejemplo los sitios catalíticos de
la familia 18 y 19 de quitinasas difieren entre sí, siendo los de la familia 19 ricos en cisteína y
constituidos principalmente por hélices alfa (Itoh et al., 2002).
Para comparar los resultados de cuantificación enzimática obtenidos en el estudio con los
datos del ensayo semicuantitaivo realizado por Farfán y Gutiérrez (2009), se realizó una
correlación de Pearson de estas variables (Tabla 2). Los resultados muestran una
significancia mayor a 0,05 lo que indica que no existe una correlación lineal entre las
variables. En la figura 2 se puede observar que aquellos aislamientos que generaron
19
mayores halos de hidrólisis en el medio sólido de quitina (actividad semicuantitativa), no
fueron necesariamente los que presentaron mayores unidades quitinolíticas (actividad
cuantitativa).
Tabla 2. Correlación de Pearson de las variables actividad quitinolítica semicuantitativa y cuantitativa
Semicuantitativo
Semicuantitativo
Cuantitativo
Correlación de Pearson
Sig. (bilateral)
Correlación de Pearson
Sig. (bilateral)
1
Cuantitativo
-.053
.725
-.053
.725
0,12
1
10
UQ
mm de Hidrólisis de quitina
0,10
0,08
UQ
6
0,06
4
0,04
Halo de hidrolísis (mm)
8
2
0,02
0,00
0
1
2
4
5
7
10 11 12 14 16 19 21 24 25 26 C
Aislamientos (MCR)
Figura 2. Comparación actividad enzimática semicuantitativa (mm de hidrolisis en agar quitina
coloidal 1%) y cuantitativa (determinación de Unidades Quitinolíticas por reacción Somogyi-Nelson)
El grado de hidrolisis final del sustrato, quitina coloidal, está determinado por las condiciones
utilizadas en el ensayo, siendo estas la concentración del sustrato, el tiempo de incubación y
las condiciones fisicoquímicas como pH, aireación y temperatura (Benitez et al., 2008). En
este caso, la concentración de quitina coloidal en el ensayo en placa fue del 1% (p/v),
mientras que en el medio de inducción fue de 0,262% (p/v). Por otro lado, en el ensayo en
placa la única fuente de carbono era la quitina coloidal, mientras que el medio de inducción
tenía galactosa además de quitina. La concentración de células por mililitro, el pH del medio,
la temperatura y el tiempo de incubación fueron los mismos en ambos ensayos, sin embargo
hay que tener en cuenta que en el medio de inducción líquido las bacterias se encontraban
en agitación lo que proporciona una mejor disponibilidad de los nutrientes al estar en mejor
contacto con el sustrato; así como también, mejor aireación por el volumen efectivo de
trabajo lo que afecta directamente la producción enzimática (Shanmugaiah et al., 2008).
En la literatura no se encuentran reportes de estudios donde se evalúe la actividad
quitinolítica de actinomicetos de los géneros Thermobifida sp.,Thermomonospora sp., o
20
Saccharopolispora sp. La mayoría de los estudios publicados son basados en diferentes
especies del género Streptomyces (Degtyareva et al., 2009) o en otros géneros como
Actinoplanes sp. y Micromonospora sp. (El-Tarabily et al., 2006), por lo cual los resultados
de actividad quitinolítica obtenidos en el estudio no son asociables a género.
5.3 Actividad antagónica de los actinomicetos frente a Fusarium oxysporum y
Rhizoctonia solani
El antagonismo se define como un mecanismo basado principalmente en la actividad
inhibitoria entre dos microorganismos, los cuales presentan acciones opuestas en un mismo
ecosistema. Los antagonistas son agentes biológicos que reducen la densidad poblacional
de microorganismos patógenos a través de uno o más de los siguientes mecanismos:
antibiosis, competencia e hiperparasitsmo (Chet et al., 1990). Los actinomicetos han sido
reconocidos como fuentes de diversos metabolitos secundarios, antibióticos y enzimas
líticas que afectan el crecimiento fúngico (Crawford et al., 1993). Por esta razón han sido
estudiados como agentes potenciales de control biológico frente a hongos patógenos de
plantas como lo son Fusarium oxysporum (Getha et al., 2005) y Rhizoctonia solani
(Sabaratnam y Traquair, 2002).
Con base en tales reportes, se decidió evaluar la capacidad antagónica de los aislamientos
de actinomicetos que presentaron actividad quitinolítica frente a dos cepas de patógenos
fúngicos, Fusarium oxysporum y Rhizoctonia solani, por medio de la técnica de
enfrentamiento dual. En las pruebas se observó que los aislamientos fúngicos presentaban
una inhibición en diferentes grados (Figura 3).
100
100
A
g
fg
fg
B
fg
efg
ef
ef
80
f
e
ef
e
80
ef
ef
e
60
cd
bcd
bc
ab
a
40
a
a
% Inhibición micelial
% Inhibición micelial
d
d
20
60
c
d
c
bc
ab
ab
bc
ab
a
40
20
0
0
1
2
4
5
7
10 11 12 14 16 19 21 24 25 26
Aislamientos (MCR)
C
1
2
4
5
7
10 11 12 14 16 19 21 24 25 26
C
Aislamientos (MCR)
Figura 3. Porcentaje de inhibición micelial del enfrentamiento dual en PDA de los actinomicetos frente
a Rhizoctonia solani (A) y Fusarium oxysporum (B)
Se realizó un análisis de varianza (anexo 5) para los datos de inhibición micelial de
Rhizoctonia solani indicando diferencias estadísticamente significativas (α: 0,05, sig:
1,614x10-17). En la figura 3 se observan los resultados de tal análisis, las letras minúsculas
indican los grupos formados a través de un agrupamiento de Duncan según las medias de
los porcentajes de inhibición entre aislamientos. El mayor porcentaje de inhibición se
21
presentó en los aislamientos MCR7, MCR11 y MCR4, con valores de 89,8, 85,1 y 85,1%,
respectivamente (figura 4), y los porcentajes más bajos se evidenciaron en los aislamientos
MCR24 y MCR25 Y MCR 26 con valores de 33,3 34,1 y 34,11%, respectivamente (figura 5).
La figura 6 muestra el crecimiento libre de R. solani. Los 15 aislamientos de actinomicetos
evaluados presentaron un porcentaje de inhibición promedio de 61,09%. Estos resultados se
pueden comparar con los estudios realizados por Castillo y colaboradores (2004), donde
evaluaron 24 aislamientos de actinomicetos provenientes de suelos mexicanos frente a una
cepa patogénica de Rhizoctonia solani en papa y presentaron un promedio de inhibición
micelial del 57%, siendo su mejor inhibición del 87,05% (Castillo et al, 2004).
MCR7
MCR4
MCR11
Figura 4. Aislamientos con mayores porcentajes de inhibición en el enfrentamiento dual frente a
Rhizoctonia solani y producción de pigmento difusible al medio.
Figura 5. Aislamientos con más bajos porcentajes de inhibición en el enfrentamiento dual frente a
Rhizoctonia solani
Figura 6. Crecimiento libre de Rhizoctonia solani.
Se puede observar también que los aislamientos de actinomicetos que produjeron un
pigmento difusible al medio, fueron los que presentaron un mayor porcentaje de inhibición
frente a los hongos. Los pigmentos son producidos principalmente durante la fase
estacionaria de los microorganismos, donde llevan a cabo su metabolismo secundario
22
sintetizando metabolitos volátiles, compuestos aromáticos y quinonas que pueden tener
efecto antibiótico (Dastager et al., 2006).
El análisis de varianza (anexo 5) realizado para los datos resultantes del enfrentamiento
hacia Fusarium oxysporum indican igualmente la existencia de diferencias estadísticamente
significativas entre aislamientos (α: 0,05, sig: 6,095x10-17). El agrupamiento de Duncan
generó la formación de 6 grupos (Figura 3 B) donde se evidencian los aislamientos que
presentaron mejores porcentajes de inhibición frente a este hongo, siendo estos MCR7,
MCR12 y MCR16, presentando valores de inhibición de 86.6, 80,83 y 82,83%,
respectivamente (Figura 7) y los porcentajes más bajos se evidenciaron en los aislamientos
MCR 24 y MCR 26 con valores de 45,8 y 41,6%, respectivamente (Figura 8). La figura 9
muestra el crecimiento libre de F. oxysporum.
MCR 12
MCR 16
Figura 7. Aislamientos con mayores porcentajes de inhibición en el enfrentamiento dual frente a
Fusarium oxysporum (Imágenes obtenidas por Farfán y Gutiérrez 2009).
MCR 24
MCR 26
Figura 8. Aislamientos con más bajos porcentajes de inhibición en el enfrentamiento dual frente a
Fusarium oxysporum (Imágenes obtenidas por Farfán y Gutiérrez 2009).
Figura 9. Crecimiento libre de Fusarium oxysporum (Imágenes obtenidas por Farfán y Gutiérrez
2009).
Los resultados de inhibición de crecimiento micelial son comparables con el estudio hecho
por Rajeswari (2011), donde evalúan los efectos antagónicos de Trichoderma viride,
23
Trichoderma harzianum y Pseudomonas flourescens frente a una cepa de Fusarium
oxysporum, aislada de hojas infectadas de maní. Estos microorganismos mostraron una
inhibición in vitro del 86,6, 64, y 60%, respectivamente, y luego in vivo lograron una
reducción significativa del patógeno. Por otro lado, Shafii y colaboradores (2005) reportan un
efectivo control biológico en cultivos de melón afectados por este patógeno por una cepa de
Streptomyces olivaceus que presentó altos niveles de inhibición micelial en los ensayos en
placa. Asíi mismo, Getha y Vikineswary (2002) observaron la alteración y lisis de las hifas de
Fusarium oxysporum por Streptomyces violaceusniger tanto in vitro como en suelo. Esto
indica que los aislamientos de actinomicetos que presentaron mayores porcentajes de
inhibición en los ensayos antagónicos, pueden actuar como posibles biocontroladores de
Fusarium oxysporum.
La mayoría de reportes de actinomicetos como agentes potenciales biofungicidas se basan
en el género Streptomyces (Degtyareva et al., 2009; Gopalakrishnan et al., 2011) y se le
presta poca atención a los otros géneros de actinomicetos, ya que son de difícil aislamiento
(El-Tarabily et al., 2006). Cabe resaltar que los aislamientos MCR 7 y MCR 4 que generaron
altos porcentajes de inhibición frente a los patógenos pertenecen a los géneros
Thermobifida sp. y Thermomonospora sp., según la identificación molecular realizada por
Franco-Correa (2010). Estas bacterias aisladas de suelos colombianos pueden ser
novedosas para subsiguientes estudios como biocontroladoras.
Los actinomicetos poseen diferentes mecanismos de acción para la inhibición del
crecimiento fúngico in vitro; por un lado la producción de metabolitos antifúngicos difusibles
al medio como antibióticos y sideróforos, metabolitos volátiles como el ácido cianhídrico y la
por producción en enzimas líticas de pared como proteasas, glucanasas y quitinasas
(Gopalakrishnan et al., 2011).
A nivel de antibióticos y metabolitos secundarios se producen una variedad de compuestos
con diversas estructuras químicas como policetidos, b-lactámicos y péptidos. Bordoloi y
colaboradores (2002) reportan la producción de un nuevo antibiótico 2-metilheptil
isoniconitato por una cepa de Streptomyces sp. con fuerte actividad antifúngica frente a
Fusarium oxysporum. A su vez, Sun y colaboraodres (2008) reporta un metabolito aislado de
Streptomyces cacaoi denominado Polyoxin B, el cual actúa como fungicida natural a nivel de
síntesis de pared celular fúngica, inhibiendo específicamente la quitin-sintasa. A nivel de
sideróforos, se ha evidenciado la producción de tales compuestos por especies de
actinomicetos, que gracias a su competencia por el hierro actúan como inhibidores del
crecimiento de fitopatógenos (Tokala et al., 2002). Para los aislamientos de actinomicetos
evaluados, existe un reporte previo de producción de sideróforos totales y de tipo
hidroxamato realizado por Díaz (2009), en el que el 100% de los aislamientos presentó la
producción de sideróforos a través de la prueba de CAS líquido. Sin embargo. no se
evidencio correlación de esta producción con la capacidad de antifúngica determinada
previamente por Farfán y Gutiérrez (2009). Esto pudo deberse a que el medio utilizado para
los antagonismos no era un medio hipoférrico que indujera la síntesis de sideróforos.
24
5.4 Actividad inhibitoria del extracto enzimático quitinolítico frente a Fusarium
oxysporum y Rhizoctonia solani.
Con el fin de determinar la existencia de una relación entre la producción de quitinasas y el
efecto antagónico de los actinomicetos, se realizó una prueba de difusión en agar con los
extractos crudos quitinolíticos, libres de células, para limitar los mecanismos de antagonismo
basados en la producción de metabolitos secundarios antifúngicos y observar el efecto
inhibitorio in vitro en el crecimiento de Fusarium oxysporum y Rhizoctonia solani por parte de
los extractos enzimáticos. Para esto se realizó una curva de crecimiento en función de
crecimiento radial y se determinó el área bajo la curva, con la que posteriormente se calculó
el porcentaje de inhibición micelial de cada aislamiento. Se realizó un análisis de varianza
con los datos de inhibición de crecimiento micelial y se determinó la existencia de
diferencias estadísticamente significativas entre los datos con un α:0,05 y una significancia
de 3,77x10-11 para los extractos frente a Rhizoctonia solani y 1,59x10-10 para los extractos
frente a Fusarium oxysporum.
Para el caso de Rhizoctonia solani ninguno de los extractos quitinolíticos produjo más del
10% de Inhibición como se observa en la figura 10. Los resultados se clasificaron en 7
grupos luego del test de Duncan realizado y se evidenció que los extractos quitinolíticos de
los aislamientos MCR 4 y MCR 14 mostraron la mayor inhibición con porcentajes de 8,24% y
8,03%, respectivamente. El extracto del aislamiento MCR 11 no produjo ningún efecto
inhibitorio frente a este fitopatógeno, el extracto del aislamiento MCR 7 tan solo del 0,055%
y el del MCR 25 de 0,180%, siendo estos los extractos con menores efectos inhibitorios en
el crecimiento radial del hongo.
10
g
fg
g
% Inhibición
8
ef
efg
efg
6
de
de
cde
bcd
4
bcd
b
bc
2
a
a
a
0
1
2
4
5
7
10 11 12 14 16 19 21 24 25 26 C
Extractos quitinoliticos de los aislamientos (MCR)
Figura 10. Porcentaje de inhibición de Rhizoctonia solani por parte de los extractos crudos
quitinolíticos.
25
20
h
h
h
15
% Inhibición Micelial
h
gh
fgh
efg
efg
10
def
cde
cde
bcd
abc bcd
5
ab
0
a
1
2
4
5
7
10 11 12 14 16 19 21 24 25 26 C
Extractos Quitinolíticos de los aislamientos (MCR)
Figura 11. Porcentaje de inhibición de Fusarium oxysporum por parte de los extractos crudos
quitinolíticos
Por otro lado, el efecto de los extractos crudos quitinolíticos frente a Fusarium oxysporum
produjeron como máximo 15,53% de inhibición micelial por el extracto del aislamiento MCR
2, los aislamientos MCR 24, MCR 14 y MCR4 produjeron 15,31, 14,87 y 14,43% de
inhibición, respectivamente. Se observó una inhibición nula por el extracto MCR 1. En este
caso el análisis de Duncan arrojó la formación de 8 grupos como se evidencian en la figura
11.
Es importante tener en cuenta que para estos ensayos los extractos no fueron
concentrados, ni se hizo purificación enzimática y posiblemente se hayan encontrado trazas
de otros compuestos producidos en el medio de inducción quitinolítica, por lo que no se
puede descartar los efectos de tales metabolitos en el crecimiento fúngico. La única forma
de confirmar que la inhibición del crecimiento radial se haya dado por la actividad enzimática
quitinolítica es por medio de la purificación e identificación de tales enzimas por medio de
técnicas cromatográficas como lo han reportado Han y colaboradores (2008) y Mukherjee y
Sen (2007). Prapagdee y colaboradores (2008) reportan una inhibición del 20% del
crecimiento de Colletotrichum gloesporioides y Sclerotium rolfsii por la acción de los
metabolitos extracelulares encontrados en los extractos crudos filtrados de Streptomyces
hygroscopus. Al llevar estos extractos a una concentración de 80% v/v obtuvieron mejores
resultados de inhibición.
5.5 Correlación estadística de variables
El objetivo principal del estudio fue establecer el tipo de correlación existente entre las
variables evaluadas. En el anexo 4 se puede observar los datos resultantes de cada prueba.
26
A continuación en la tabla 3 se observan los coeficientes de correlación resultantes después
de un análisis de Pearson para tales datos.
Tabla 3. Correlación de Pearson de todas las variables evaluadas en el estudio.
Correlación de Pearson
AQC
Sig.
Correlación de Pearson
EDR
Sig.
Correlación de Pearson
EDF
Sig.
Correlación de Pearson
IER
Sig.
Correlación de Pearson
IEF
Sig.
*. Correlación significativa α:0,05.
**. Correlación significativa α:0,01.
AQC
1
*
.358
.013
*
.308
.033
**
.461
.001
-.083
.575
EDR
*
.358
.013
1
**
.699
.000
.132
.369
.073
.620
EDF
*
.308
.033
**
.699
.000
1
-.281
.053
-.151
.305
IER
**
.461
.001
.132
.369
-.281
.053
1
.071
.632
IEF
-.083
.575
.073
.620
-.151
.305
.071
.632
1
(AQC) Actividad Quitinolitica Cuantitativa: Unidades Quitinolíticas resultantes de la cuantificación de azúcares
reductores por Somogyi-Nelson.
(EDR) Enfrentamiento Dual Rhizoctonia solani: Porcentaje de Inhibición micelial de Rhizoctonia solani por
parte de los aislamientos de actinomicetos.
(EDF) Enferntamiento Dual Fusarium oxysporum Porcentaje de Inhibición micelial de Fusarium oxysporum
por parte de los aislamientos de actinomicetos.
(IER) Inhibición por extracto Rhizoctonia solani: Porcentaje de Inhibición micelial de Rhizoctonia solani por
parte de los extractos quitinolíticos.
(IEF) Inhibición por extracto Fusarium oxysporum: Porcentaje de Inhibición micelial de Fusarium oxysporum
por parte de los extractos quitinolíticos.
Respecto a la correlación de las variables AQC con las variables EDR y EDF se observan
coeficientes similares y positivos, siendo estos más cercanos al 0 que al 1 (0,358 y 0,308,
respectivamente), indicando que la relación entre las unidades quitinolíticas determinadas y
el porcentaje de inhibición de ambos hongos es directamente proporcional; sin embargo el
valor del coeficiente correlación no es representativo. Cabe mencionar que el medio PDA
donde se realizaron los ensayos de antagonismo no es el adecuado para la inducción de
enzimas quitinolíticas, ya que este contiene glucosa y se sabe que la glucosa es el principal
represor catabólico en la expresión de estas enzimas (Saito et al., 1998), por lo que la
inhibición se atribuye principalmente por otros mecanismos diferentes a actividad
quitinolítica. Por tal motivo, se haría necesario emplear otra técnica que permita tanto la
inducción enzimática como la inhibición del crecimiento fúngico simultáneamente. Boer y
colaboradores (1998) evaluaron el efecto antagónico de cepas bacterianas junto con la
producción de quitinasas por medio de la técnica de doble capa en agar, siendo una de
estas de agar quitina que actuaba como inductor enzimático.
Como ya se había mencionado y como se observa en la gráfica de dispersión (anexo 6), el
aislamiento MCR 7 presenta el valor más bajo de unidades quitinolíticas y los mayores
porcentajes de inhibición en el ensayo de enfrentamiento dual frente a ambas cepas
27
fúngicas. En este caso se deduce que el aislamiento posee otro tipo de metabolitos volátiles
o difusibles al medio capaces de ejercer una acción antifúngica.
Es importante tener en cuenta que no puede descartarse que las quitinasas hayan
contribuido a la actividad antifúngica observada en las cepas que presentaron la producción
de estas enzimas. Un caso ejemplo es el del aislamiento MCR 12 que presenta tanto altos
porcentajes de inhibición micelial para ambos hongos como la mayor producción de
unidades quitinolíticas. Es posible que se haya dado un sinergismo en el proceso de
inhibición entre las enzimas quitinolíticas y otro tipo de metabolitos antifúngicos difusibles al
medio (Boer et al., 1998).
Al correlacionar las unidades quitinolíticas (AQC) con la inhibición por los extractos frente a
Rhizoctonia solani (IER) se obtiene un coeficiente de 0,461 y un alto grado de significancia
(0,001), lo que indica una relación directamente proporcional entre estas variables; mientras
que no se encontró ningún tipo de relación lineal de las unidades quitinolíticas con el efecto
de los extractos enzimáticos frente a Fusarium oxysporum. Por un lado, se asume que en
los extractos crudos existe la presencia de las enzimas de tipo quitinasa gracias a la
inducción previa con quitina coloidal y por ende una acción de tales enzimas frente a las
paredes fúngicas. Sin embargo, es posible que la concentración de quitina en la inducción
no haya sido proporcional con el nivel encontrado en las paredes del hongo (Mahadevan y
Crawford, 1997) y por eso la ausencia de correlación. Se ha encontrado que la pared celular
de Fusarium oxysporum tiene una capa externa de glicoproteínas que cubre la interna
compuesta de quitina y glucanos, de tal manera que resiste más la actividad de quitinasas y
glucanasas y se requiere mayor concentración de enzimas para degradarla o una actividad
sinérgica entre proteasas y quitinasas y glucanasas (Schoffelmeet et al., 1999). Además de
esto, se debe resaltar que una actividad proteolítica se hace necesaria para mayor
disolución de las paredes fúngicas (Singh y Chhatpar, 2011) y no se tienen datos de este
tipo de actividad en los aislamientos de actinomicetos evaluados.
Además de la purificación enzimática, se recomienda evaluar la acción directa de las
enzimas frente a las paredes fúngicas como lo realizaron Skujins y colaboradores (1965) o
la observación directa de la alteración morfológica del micelio por medio de microscopia
electrónica (Jung et al., 2003)
Respecto a la correlación entre las variables EDR y EDF se observa una correlación positiva
con un alto grado de significancia y un coeficiente cercano al 1 (0,699), lo que señala una
relación directamente proporcional y estrecha. Esto quiere decir que los aislamientos de
actinomicetos tienen un comportamiento general similar de inhibición y un amplio espectro
frente a los hongos fitopatógenos evaluados siendo estos de diferente phylum.
En general se obtuvieron mejores porcentajes de inhibición del crecimiento radial cuando los
aislamientos fueron enfrentados a Fusarium oxysporum. Hay que tener en cuenta que la
velocidad de crecimiento de Rhizoctonia solani no es comparable, ya que 96 horas son
suficientes para que crezca cubriendo la totalidad del diámetro de la caja de petri, por lo
tanto al necesitar Fusarium oxysporum mayor tiempo para su crecimiento, pudo darse una
28
mayor acumulación de metabolitos secundarios en el medio de cultivo producidos por los
actinomicetos. Sin embargo, se observan casos especiales como el del aislamiento MCR 4.
Este particularmente genera mayor inhibición frente a Rhizoctonia solani (85,1%) que frente
a Fusarium oxysporum (56,7%) indicando que los metabolitos producidos por este
aislamiento tienen mayor especificidad hacia un patógeno.
El aislamiento MCR 7 es postulado como candidato promisorio para la formulación de un
bioinoculante, al ser este el que presentó mayor capacidad de inhibición frente a ambos
hongos fitopatógenos. Sin embargo, al no ser buen productor de enzimas quitinolíticas se
considera la acción de un inoculante mixto del aislamiento MCR 7 y el MCR 12 que combine
los mejores resultados tanto para actividad inhibitoria de crecimiento fúngico como para
actividad quitinolítica.
29
6. CONCLUSIONES

No se encontró la existencia de una correlación lineal entre la prueba
semicuantitativa realizada por Farfán y Gutiérrez (2009) con la cuantificación de
azúcares reductores liberados por la acción enzimática quitinolítica.

Los aislamientos más representativos en la inhibición del crecimiento fúngico frente a
Rhizoctonia solani fueron los MCR 7, MCR 4 y MCR 11 (89,8%, 85,1% y 85,1%
respectivamente), presentando estos pigmentos difusibles al medio.

Los aislamientos más representativos en la inhibición del crecimiento fúngico frente a
Fusarium oxysporum fueron los MCR 7, MCR 16 y MCR 12 (86,7%, 82,5 y 80,1%
respectivamente)

El aislamiento MCR 7 presentó los mayores porcentajes de inhibición micelial contra
los dos patógenos fúngicos evaluados Rhizoctonia solani y Fusarium oxysporum
(89,8% y 86,6% respectivamente), por lo que puede ser tenido en cuenta para
estudios posteriores de producción de metabolitos antifúngicos.

El aislamiento MCR 12 presentó valores de inhibición micelial y de unidades
quitinolíticas mayores que los de la cepa control considerándose apropiado para
posteriores estudios de producción enzimática.

En general los aislamientos de actinomicetos presentaron una actividad antifúngica
de amplio espectro ya que la correlación de la inhibición micelial de ambos
fitopatógenos fue representativa.

Se evidencio ausencia de correlación entre el ensayo de inhibición micelial por los
extractos crudos con las pruebas antagónicas, indicando que la inhibición del
crecimiento radial no se da por la acción de las quitinasas, sino por la producción de
metabolitos difusibles al medio con capacidad antifúngica.
30
7. RECOMENDACIONES

Realizar la purificación de las enzimas quitinolíticas por medio de técnicas
cromatográficas, con el fin de observar el efecto directo de estas sobre el
crecimiento fúngico.

Además de la cuantificación de enzimas quitinolíticas cabe realizar la detección
de enzimas de tipo glucanasa y proteasa implicadas en la lisis de pared celular
fúngica.

Evaluar otros mecanismos antifúngicos tales como producción de sideróforos,
HCN, antibióticos y otros metabolitos secundarios en los aislamientos que
produjeron altos porcentajes de inhibición micelial.

Realizar pruebas in vivo con plantas de clavel y frijol inoculadas con los
actinomicetos que presentaron mayores inhibiciones frente a los hongos
fitopatógenos Fusarium oxysporum y Rhizoctonia solani con el fin de evaluar su
acción como posibles biocontroladores.
31
8. BIBLIOGRAFÍA
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35
9. ANEXOS
Anexo 1. Características macroscópicas y microscópicas de las cepas de
actinomicetos evaluadas.
CARACTERISTICAS
MACROSCOPICAS
Colonia seca, pulverulenta,
MCR1 sin producción de pigmentos
difusibles, reverso de
colonia naranja claro,
anverso color café claro.
CEPA
MCR
2
MCR
4
Colonia seca, pulverulenta,
sin pigmentos difusibles,
reverso violeta, anverso
color inicial café,
esporulación blanca.
Colonia seca pulverulenta,
reverso café oscuro, sin
pigmentos difusibles al
medio, anverso color inicial
verde militar, con el tiempo
de incubación se torna café
con blanco
CARACTERISTICAS
ID
MICROSCOPICAS
MICROSCÓPICA
Micelio vegetativo ramificado no
fragmentado, aéreo, cadenas de
conidios sencillos, formando
espirales.
ID
ARDRA
Streptomyces
Streptomyces
Streptomyces
Saccharopolyspora
Actinomiceto 100x
Micelio vegetativo no
fragmentado, micelio aéreo
fragmentado presentando
cadenas de conidios sencillos
en espiral.
Actinomiceto 100x.
Micelio vegetativo no
fragmentado, micelio aéreo
fragmentado, cadenas largas de
conidios ovalados.
N.I
Thermobifida
Actinomiceto 100x
MCR
5
.
Colonia seca pulverulenta,
reverso naranja, anverso al
inicio cremoso, color inicial
rojo fucsia a medida que
pasa el tiempo se torna
blanco a gris sin pigmento.
Conidios sencillos y dobles,
pocos filamentos no ramificados.
N.I
Streptomyces
N.I
Thermomonospora
Actinomiceto 100x
MCR
7
Colonia seca pulverulenta,
sin pigmento difusible en el
medio. Anverso colonia
color rosado pálido y se
torna blanco a medida que
pasa el tiempo. Olor a
Micelio vegetativo sin
fragmentar, cadena larga de
conidios sin espirales.
36
geosmina.
Actinomiceto 100x
MCR
10
Colonia seca, pulverulenta,
sin pigmento difusible en el
medio, reverso verde,
anverso color blanco gris
que con el paso del tiempo
se torna café, presenta
exudados de color verde.
Micelio no fragmentado, tortuoso
formación de entramadas.
Pocas conidias.
N.I
Streptomyces
Streptomyces
Streptomyces
N.I
Streptomyces
N.I
Streptomyces
N.I
Streptomyces
Actinomiceto 100x
MCR
11
MCR
12
Colonia seca pulverulenta,
sin pigmento difusible en el
medio, sin pigmentación en
reverso, anverso color inicial
marrón oscuro
Colonia seca, anverso
grisáceo con bordes
blancos. Sin pigmentación
en reverso.
Micelio vegetativo no
fragmentado, micelio aéreo
fragmentado con espirales,
tortuoso.
Actinomiceto 100x
Filamentos largos, micelio no
fragmentado, pocas conidias.
Actinomiceto. 100x
MCR
14
Colonia seca pulverulenta,
sin pigmento difusible en el
medio, reverso café claro,
anverso colonias grises
borde blanco;
Micelio no fragmentado, tortuoso
en espiral. Forma entramada.
Pocas conidias.
Actinomiceto 100x
MCR
16
Colonia seca pulverulenta,
anverso café, sin
pigmentación en reverso, sin
pigmento difusible en el
medio.
Micelio no fragmentado, no
tortuoso, formación de
entramada. Pocas conidias.
Posible género: Streptomyces
sp.
37
MCR
19
MCR
21
MCR
24
Colonia seca pulverulenta,
sin pigmento difusible al
medio, anverso colonias
blancas a grises con
"agujeros" sobre micelio.
Colonia pequeña, anverso
café, sin color en el reverso.
Puntos blancos en la
superficie (esporulación).
Colonia seca, pulverulenta,
anverso amarillo -gris, sin
pigmentación en reverso, sin
pigmento difusible en el
medio.
Actinomiceto. 100x
Micelio vegetativo ramificado, no
fragmentado. Micelio aéreo
formando cadenas de conidios
en espiral.
Streptomyces
Streptomyces
Streptomyces
Streptomyces
N.I
Thermobifida
N.I
Saccharopolyspora
N.I
Streptomyces
Actinomiceto 100x
Micelio aéreo fragmentado,
micelio vegetativo con
fragmentación, pocos conidios
en cadena o en espiral.
Actinomiceto 100x
Filamentos ramificados, pocos
conidios simples.
Actinomiceto 100x
MCR
25
MCR
26
Colonia seca, pulverulenta,
dura, pigmento anaranjado
en el medio, anverso inicio
blanco con el tiempo a gris
con borde blanco.
Colonia pequeña, seca,
pulverulenta, sin pigmento
difusible en el medio,
anverso de color gris a
morado
Micelio aéreo, filamentos
fragmentados, tortuoso, con
cadenas de conidios.
Actinomiceto 100x
Filamentos, tortuosos,
fragmentados, sin espiral.
Actinomiceto. 100x
(Macroscopia y Microscopia por Duque y Quintana 2008)
38
Anexo 2. Medios de Cultivo

Agar avena 30g/L
COMPONENTES
g/L
Avena comercial en polvo
30
Sacarosa
5
Agar-Agar
15
Preparación: Agregar los componentes al agua destilada, calentar a fuego durante 5
minutos, ajustar el pH a 6.8. Esterilizar en autoclave (15lb, 121°C)

Medio de Inducción actividad quitinolítica
COMPONENTES
Quitina Coloidal
2.62 g/L
Galactosa
5 g/L
NH4Cl
0.1% p/v
Stock KH2PO4 y K2HPO4 1.5% p/v
10ml
Stock MgSO4 1.5% p/v
10ml
Stock CaCl2 0.5%p/v, FeCl3 0,06%, NaCl 0,5% p/v
10ml
Preparación: Mezclar los componentes y completar el volumen con agua destilada, calentar
a fuego durante 5 minutos, ajustar el pH a 6.8. Esterilizar en autoclave (15lb, 121°C)

Agar Papa Dextrosa PDA
COMPONENTES
g/L
Agar PDA
39
Agregar los componentes al agua destilada, calentar a fuego durante 5 minutos,
Esterilizar en autoclave (15lb, 121°C)
39
Anexo 3. Cuantificación de azúcares reductores por el método de Somogyi - Nelson
La reacción se lleva a cabo de la siguiente manera:
Muestra: 250 μL
Reactivo Somogyi I: 200 μL
Reactivo Somogyi II: 50 μL
Calentar a 90°C durante 30 minutos
Reactivo de Nelson: 250 μL
Agua destilada: 750 μL
Dejar estabilizar durante 24 horas y leer en espectrofotometro a una longitud de onda de
595nm

Preparación de los reactivos:
o Somogyi I
COMPUESTO
g/200mL
Carbonato de Sodio anhidro (Na2CO3)
4.8g
Sal de Rochelle
2.4g
Bicarbonato de Sodio (NaHCO3)
3.2g
Sulfato de Sodio (Na2SO4)
28.8g
Agua destilada
Aforar a 200 mL
En un beaker agregar 100 mL de agua destilada y disolver en agitación constante cada uno
de los componentes hasta obtener una mezcla homogénea. Completar con agua destilada
hasta un volumen de 200 mL. En caso de precipitarse calentar antes de usar.
o
Somogyi II
COMPUESTO
g/50mL
Sulfato cúprico pentahidratado (CuSO4.5H20)
1g
Sulfato de Sodio (Na2SO4)
9g
Agua destilada
Aforar a 50ml
En un beaker adicionar 25 mL de agua destilada y disolver en agitación constante cada uno
de los componentes hasta obtener una mezcla homogénea. Completar con agua destilada
hasta un volumen de 50 mL.
o
Nelson g/250 mL
COMPUESTO
g/250mL
Ácido Sulfúrico (H2SO4):
10.6mL
Arsenato de Sodio heptahidratado (Na2HAsO4.7H2O)
1.51g
Amonio Molibdato ((NH4)6Mo7O24. 4H2O)
12.6g
Agua destilada
239.4mL
Agregar a un beaker 225 mL de agua destilada disolviendo lentamente el molibdato de
amonio, posteriormente se adiciona el ácido sulfúrico hasta obtener una mezcla homogénea.
Paralelamente disolver arsenato de sodio heptahidratado en 12.6 mL de agua destilada.
40
Mezclar las dos soluciones aforando a un volumen de 250mL e incubar por 48 horas a
37oC. Almacenar en recipiente ámbar.

Curva Patrón N-acetilglucosamina
Concentración
N-acetilglucosamina µg/mL
Promedio Absorbancias
595nm
Desviación
Estándar
0
0
0
0,08
0,243
0,0078
0,1
0,275
0,0235
0,12
0,345
0,0212
0,14
0,416
0,0552
0,16
0,547
0,0190
0,18
0,637
0,0588
0,2
0,714
0,0177
0,22
0,768
0,0227
0,24
0,847
0,0031
0,26
0,915
0,0249
0,28
0,992
0,0219
0,3
1,048
0,0318
0,32
1,159
0,0286
0,36
1,339
0,0141
41
Anexo 4. Tabla de resultados de todas las variables
Aislamiento
AQS
AQC
EDR
EDF
IER
IEF
1
0,000 ± 0,00 0,0154 ± 0,001 41,176 ± 1,92 56,667 ± 1,18
2,177 ± 0,48
0,000 ± 0,00
2
5,167 ± 1,03 0,0144 ± 0,003 49,804 ± 2,22 48,333 ± 2,36
6,336 ± 1,20
15,528 ± 3,35
4
3,333 ± 0,51 0,0340 ± 0,003 85,098 ± 4,44 56,667 ± 1,18
8,242 ± 0,20
14,425 ± 1,71
5
3,750 ± 0,82 0,0463 ± 0,006 71,765 ± 1,92 78,333 ± 3,12
4,862 ± 0,77
6,191 ± 1,11
7
3,240 ± 1,02 0,0015 ± 0,000 89,804 ± 1,11 86,667 ± 1,18 0,055 ± 0,04
9,386 ± 0,29
10
1,433 ± 0,09 0,0301 ± 0,003 45,882 ± 5,08 50,000 ± 2,04
3,322 ± 0,81
11,942 ± 2,116
11
0,000 ± 0,00 0,0327 ± 0,000 85,098 ± 4,44 80,000 ± 0,00
0,00 ± 0,00
9,910 ± 1,33
12
2,667 ± 0,24 0,0955 ± 0,005 80,392 ± 2,93 80,833 ± 2,36 7,135 ± 0,043
8,263 ± 0,53
14
7,083 ± 1,18 0,0399 ± 0,001 57,647 ± 5,08 48,649 ± 2,21
8,033 ± 1,43
14,874 ± 3,28
16
1,125 ± 0,10 0,0170 ± 0,001 77,255 ± 5,87
82,500 2,04
2,341 ± 0,24
13,368 ± 2,68
19
0,000 ± 0,00 0,0185 ± 0,002 54,510 ± 1,11 49,550 ± 3,37
4,441 ± 0,50
4,640 ± 1,47
21
3,333 ± 0,62 0,0448 ± 0,006 76,471 ± 1,92 76,667 ± 1,18 7,449 ± 1,131
1,170 ± 0,91
24
8,500 ± 0,41 0,0182 ± 0,004 33,333 ± 9,08 45,833 ± 5,88
3,11 ± 0,27
15,310 ± 2,29
25
3,333 ± 0,47 0,0302 ± 0,009 34,118 ± 3,84 66,667 ± 3,12
0,180 ± 0,25
6,209 ± 1,56
26
6,167 ± 1,03 0,0103 ± 0,001 34,118 ± 6,66 41,667 ± 8,50
4,519 ± 0,81
2,650 ± 2,56
0
3,333 ± 0,51 0,0515 ± 0,004 85,882 ± 1,92 64,167 ± 3,12
5,534 ± 2,60
4,559 ± 0,25
(AQS) Actividad Quitinolítica Semicuantitativa: mm de hidrolisis en agar quitina coloidal al 1% al
7mo día. Resultados obtenidos por el estudio de Farfán y Gutierrez (2009)
(AQC) Actividad Quitinolitica Cuantitativa: Unidades Quitinolíticas resultantes de la cuantificación
de azucares reductores por Somogyi-Nelson.
(EDR) Enfrentamiento Dual Rhizoctonia solani: Porcentaje de Inhibición micelial de Rhizoctonia
solani por parte de los aislamientos de actinomicetos.
(EDF) Enfrentamiento Dual Fusarium oxysporum Porcentaje de Inhibición micelial de Fusarium
oxysporum por parte de los aislamientos de actinomicetos.
(IER) Inhibición por extracto Rhizoctonia solani: Porcentaje de Inhibición micelial de Rhizoctonia
solani por parte de los extractos quitinolíticos.
(IEF) Inhibición por extracto Fusarium oxysporum: Porcentaje de Inhibición micelial de Fusarium
oxysporum por parte de los extractos quitinolíticos.
42
Anexo 5. Análisis de varianza

ANOVA para Unidades Quitinolíticas resultantes de la cuantificación de azucares reductores
por Somogyi-Nelson.
Sum of Squares
A.
df
Mean Square
Between Groups
.069
15
.005
Within Groups
.023
149
.000
Total
.092
164
F
Sig.
30.444
.000
ANOVA para Porcentaje de Inhibición micelial de Rhizoctonia solani por parte de los
aislamientos de actinomicetos.
Sum of Squares
Between Groups
Within Groups
Total
df
Mean Square
19719.954
15
1314.664
893.195
32
27.912
20613.149
47
F
Sig.
47.100
.000
B. ANOVA para Porcentaje de Inhibición micelial de Fusarium oxysporum por parte de los
aislamientos de actinomicetos
Sum of Squares
Between Groups
Within Groups
Total
df
Mean Square
10750.217
15
716.681
532.027
32
16.626
11282.244
47
F
Sig.
43.106
.000
C. ANOVA para Porcentaje de Inhibición micelial de Rhizoctonia solani por parte de los extractos
quitinolíticos.
Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
352.818
15
23.521
Within Groups
44.249
32
1.383
Total
397.067
47
F
Sig.
17.010
.000
ANOVA para Porcentaje de Inhibición micelial de Fusarium oxysporum por parte de los extractos
quitinolíticos.
Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
1232.123
15
82.142
Within Groups
172.002
32
5.375
Total
1404.125
47
F
15.282
Sig.
.000
43
Anexo 6. Graficas de Dispersión
A. Grafica dispersión AQC vs EDR
100
MCR 1
MCR 2
MCR 4
MCR 5
MCR 7
MCR 10
MCR 11
MCR 12
MCR 14
MCR 16
MCR 19
MCR 21
MCR 24
MCR 25
MCR 26
CONTROL
% Inhibición Rhizoctonia solani
90
80
70
60
50
40
30
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Unidades Quitinolíticas
B. Grafica dispersión AQC vs EDF
% Inhibición Fusarium oxysporum
90
MCR 1
MCR 2
MCR 4
MCR 5
MCR 7
MCR 10
MCR 11
MCR 12
MCR 14
MCR 16
MCR 19
MCR 21
MCR 24
MCR 25
MCR 26
CONTROL
80
70
60
50
40
30
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Unidades Quitinolíticas
44
C. Grafica dispersión AQC vs IER
% Inhibición Rhizoctonoa solani por extractos
10
MCR 1
MCR 2
MCR 4
MCR 5
MCR 7
MCR 10
MCR 11
MCR 12
MCR 14
MCR 16
MCR 19
MCR 21
MCR 24
MCR 25
MCR 26
CONTROL
8
6
4
2
0
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Unidades Quitinolíticas
D. Grafica dispersión EDR vs EDF
% Inhibición Fusarium oxysporum
90
MCR 1
MCR 2
MCR 4
MCR 5
MCR 7
MCR 10
MCR 11
MCR 12
MCR 14
MCR 16
MCR 19
MCR 21
MCR 24
MCR 25
MCR 26
CONTROL
80
70
60
50
40
30
30
40
50
60
70
80
90
100
% Inhibición Rhizoctonia solani
45