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TÉCNICAS DE ANÁLISIS
DE MATERIAS GRASAS
MSc. Alejandra Terevinto
Curso Evaluación y Manejo de Alimentos
2015
Técnicas de Análisis de Grasas
Técnicas de Composición
Técnicas de Calidad
Técnicas de Extracción
Preparación de la muestra
• La preparación de la muestra depende del tipo de alimento y de la
naturaleza de los lípidos.
• La validación del análisis de grasas de un alimento depende de un
correcto muestreo y conservación de la muestra previo al análisis.
• Se deben eliminar las impurezas y el agua que pueda contener.
• La muestra debe mantenerse en lugar fresco, en oscuridad y sin
corriente de aire.
• Los granos deben ser molidos previamente.
Muestreo
 En la industria:
• Aplicable a grasas vegetales y animales, y aceites crudos y refinados
de origen vegetal o marino.
• Para que la muestra sea representativa del total, cuando es un tanque
de aceite líquido se debe sacar la muestra con un largo muestreador
de fondo con agitación permanente.
• Cuando la muestra es sólida se utiliza un muestreador de tubo para
sacar a diferentes profundidades. Si es posible la muestra se funde
para poder homogeneizarla.
De fondo
De tubo
 En el laboratorio:
• Las muestras líquidas deben homogeneizarse agitando previamente.
• Las muestras sólidas deben fundirse previamente para luego seguir
con los criterios de muestreo correspondientes a una muestra líquida.
Análisis de Composición
• Los métodos han sido estandarizados según
normas IUPAC, AOCS, ISO.
– Índice de Iodo
– Índice de Saponificación
– Puntos de fusión
– Clases lípídicas
– Cromatografía de gases
Indice de Iodo
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Son los gramos de iodo absorbidos por 100 gramos de grasa o aceite.
Constituye una medida del grado de insaturación de una grasa.
Se utiliza en la industria para conocer rápidamente el grado de insaturación de
un aceite previo a su hidrogenación.
Determinación
-Pesar aprox. 0,5 g de grasa o aceite filtrados en un frasco con tapón de vidrio
de 500 ml y disolverlos en 10 ml de cloroformo.
-Pipetear 25 ml del reactivo de Hanus (Sol. 0.2N de I y Br en ácido acético
glacial) y añadirlos al matraz.
-Dejar en reposo exactamente 30 min en la oscuridad, con agitación
ocasional.
-El exceso de reactivo añadido no debe ser inferior al 60 %. Transcurridos los
30 min agregar 10 ml de una solución de KI al 15 % y 100 ml de agua
destilada recientemente hervida y enfriada, arrastrando con ella cualquier
resto de iodo del tapón o cuello del frasco.
-Titular el iodo con una solución de S2O3Na2 0,1 N, con agitación constante,
hasta que se atenúe el color amarillo de la solución.
-Añadir aprox. 1 ml de una solución al 1% de almidón soluble y continuar la
titulación hasta que desaparezca el color azul casi completamente. Cerrar
bien el frasco, agitar violentamente para que el yodo remanente en la fase
inferior pase a la capa acuosa, y completar la titulación.
• Simultáneamente con la muestra problema realizar dos
determinaciones en blanco, dejando caer el reactivo de
Hanus de la pipeta exactamente durante el mismo tiempo que
en la muestra problema.
INDICE DE YODO = 100 x (T2 - T1) x M x 127
- T1 es el volumen de tiosulfato de sodio 0.1 N consumidos en la
titulación del aceite o grasa
-T2 es el volumen de tiosulfato de sodio consumido en la titulación de la
solución de reactivo de Hanus
- M es la molaridad del tiosulfato
Indice de Saponificación
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Permite determinar la cantidad total de ácidos grasos libres y combinados en el aceite.
A partir de dicho valor se puede estimar su peso molecular medio.
Se define como los mg de KOH requeridos para saponificar 1g de grasa o aceite.
Esta técnica es aplicable a grasas y aceites vegetales y animales.
•
Procedimiento:
-Pesar 2g de muestra fundida en un matraz de 250ml.
-Agregar 25ml de solución alcohólica de KOH y algunas piedras de ebullición
-Colocar el condensador de agua y dejar hervir suavemente la muestra a reflujo durante
60min.
-Detener la ebullición y estando aun caliente agregar 0.5-1.0ml de fenolftaleína y titular
con HCl 0.5N hasta viraje del indicador.
-Preparar un blanco con las mismas cantidades pero sin hervir a reflujo y valorarlo.
I.S.= (56,1 x N x (G0 - G))/m
Donde: N = normalidad del HCl
G = gasto de HCl en la muestra
G0 = gasto de HCl en el blanco
m = masa de muestra en gramos
PMmedio = (3 x 56,108)/I.S
Determinación del punto de fusión
• En capilar cerrado : temperatura a la cual la muestra se
vuelve completamente clara y líquida.
• En capilar abierto : temperatura a la cual una columna
de grasa comienza a subir por el capilar.
Procedimiento:
-fundir la muestra de grasa y sumergir la punta de 2
capilares hasta que la grasa ascienda 1cm.
-sellar la punta de uno de los capilares con calor
-colocar los capilares en un vaso de bohemia con agua y
hielo durante 1hora
-fijar los capilares a un termómetro con una banda
elástica, colocarlos en un baño de agua y calentar con
agitación
-anotar las temperaturas correspondientes a los puntos
de fusión en el capilar abierto y en el cerrado.
Clases lípidicas por TLC
• Placas de silica gel
• Se usan mezclas de solventes de distinta polaridad dentro de una cuba
de desarrollo como por ej: hexano:éter:ácido acético (80:20:2)
Cromatografía de gases
• Procedimiento:
-preparación de los ésteres metílicos de ácidos
grasos (FAMEs)
-inyección de la muestra en el inyector, donde
se vaporiza
-separación de los FAMEs en la columna
-detección de los FAMEs en el detector (FID: de
ionización de llama, TCD: conductividad
térmica, ECD: captura electrónica)
• Fase móvil: gas(H2, He, N2)
• Fase estacionaria: líquido
• T horno: 140-240ºC
• Resultado: área de picos = cantidad de ácido
graso
Inyector
Cromatograma
Cromatograma de ácidos grasos de la leche
Aceites de oliva y de palma
Aceite de almendra de palma
Aceites ricos en ácido palmítico, oleico y linoleico
Análisis de Calidad
• Los métodos han sido estandarizados según
normas IUPAC, AOCS, ISO
– Índice de acidez
– Índice de peróxidos
– Índice de anisidina
– Valor de TBA
– Dienos y trienos conjugados
Indice de Acidez
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Corresponde a los mg de KOH necesarios para neutralizar los ácidos grasos libres de 1g
de grasa.
La acidez de una grasa es una medida de la extensión de la hidrólisis que libera ácidos
grasos.
Procedimiento:
-Neutralizar la mezcla solvente, agregando unas gotas de fenolftaleína como indicador, y
gota a gota, la solución etanólica de KOH hasta un color rosado que permanezca 10 seg.
-Pesar la muestra fundida en un erlenmeyer de 250ml.
-Agregar 150ml del solvente neutralizado a la muestra y titular con agitación, con la
solución alcohólica de KOH 0,1N y fenolftaleína como indicador hasta un color rosado
que permanezca al menos 10 seg.
VA = (56,1 x N x G)/m
%A = (N x G x M)/(10 x m)
Donde:
N= normalidad de la solución de KOH
G= gasto de KOH en ml
m= masa de la muestra en gramos
M= peso molecular del ácido correspondiente
56,1= peso molecular de KOH
Indice de Peróxidos (PV)
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Es una medida del deterioro oxidativo del aceite.
Los hidroperóxidos son los productos primarios de oxidación
Determina todas las sustancias que oxidan el KI en las condiciones descritas.
Se expresan como mEq de O2 activo por kg de muestra.
Procedimiento:
-Pesar la muestra fundida en un erlenmeyer de 250ml.
-Agregar 10ml de cloroformo y disolver rápidamente con agitación.
-Agregar 15ml de ácido acético glacial y 1ml de solución saturada de KI y tapar.
-Agitar durante 1min y dejar 5min en la oscuridad a temperatura entre 15 y 25ºC.
-Agregar 75ml de agua destilada, valorar el yodo liberado con la solución de
tiosulfato correspondiente usando almidón como indicador.
-Realizar un blanco simultáneamente sin incluir la muestra.
P.V. = (N x G x 1000)/m
Donde: G = gasto de tiosulfato en ml
N = normalidad del tiosulfato
m = masa de la muestra en gramos
Indice de anisidina
• Se utiliza para determinar los niveles de aldehídos en
grasas animales y aceites vegetales.
• Los aldehídos son productos de la descomposición de los
ácidos grasos peroxidados.
• Sirve para calcular el valor total de oxidación junto con el
PV.
TOTOX = 2PV + anisidina
Valor de TBA
•Indica el grado de oxidación del alimento
•Depende de: la composición en ácidos grasos, el grado de
insaturación, la presencia de prooxidantes y antioxidantes,
de oxígeno, de la temperatura y la exposición a la luz.
•El MDA es un producto secundario de la
oxidación
•El resultado se
MDA/kg muestra
expresa
como
mg
535nm
Dienos y trienos conjugados
• Son compuestos que durante la oxidación cambian la posición
de los dobles enlaces
• Los dienos conjugados son hidrocarburos con 2 dobles enlaces
separados por un enlace sencillo y absorben a 234nm
• Los trienos conjugados tienen 3 dobles enlaces separados por
un enlace sencillo y absorben a 268nm
Técnicas de extracción de lípidos
 Muestra: vegetal o animal
 Solventes: orgánicos (éter de petróleo, etil éter, cloroformo, metanol)
• Características:
- alto poder de disolución de lípidos y ninguno para proteínas, AA, y
CHO.
- evaporarse rápido y no dejar residuos
- bajo punto de ebullición
- no ser inflamable ni tóxico.
• Las técnicas de extracción pueden ser: sólido–líquido o líquido-líquido.
• Consisten en generar dos fases no miscibles, una acuosa (mayor
proporción de sustancias iónicas y compuestos orgánicos polares) y
una orgánica (mayor proporción de compuestos orgánicos no polares).
C: cloroformo
M: metanol
Técnicas de extracción de lípidos
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•
•
Técnica de Folch (cloroformo-metanol)
Técnica de Bligh & Dyer (Folch modificado)
Método de Radin (hexano-isopropanol)
Método de Soxhlet
Técnica de Folch (1957)
• Se aplica a muestras con importantes cantidades
de agua (aprox. 80%) por ejemplo tejidos
animales y vegetales
• Proporciones C:M:W (8:4:3)
Procedimiento:
-pesar
la
muestra,
agregarle
la
mezcla
cloroformo:metanol (2:1) y homogeneizar
-filtrar la muestra con vacío y trasvasar a una
ampolla de decantación
-agregar NaCl2 para lograr la separación de fases y
agitar durante 1min
-dejar reposar durante toda la noche a la oscuridad
-recuperar la fase inferior conteniendo cloroformo y
los lípidos en balones previamente pesados
-evaporar el cloroformo en un rotavapor, luego en
estufa, dejar enfriar y pesar
-calcular el % de lípidos de la muestra
Técnica de Bligh & Dyer (1959)
• Se aplica a muestras con importantes cantidades de
agua (aprox. 80%) por ejemplo tejidos animales y
vegetales
• Proporciones C:M:W (8:3,2:1,6)
• Ventajas: es más rápida y gasta menos solvente
• Desventaja: Se pierden más lípidos
Método de Radin
• Alternativa a la técnica de Folch, ya que los solventes
son menos tóxicos.
• Homogeneizar la muestra con la mezcla de hexanoisopropanol (3:2) y luego agitar en agitador magnético
a temperatura ambiente durante 1 hora y media.
• Filtrar a un balón de vidrio previamente
pesado y rotaevaporar.
Método de Soxhlet (1879)
•Método de referencia para extracciones sólido-líquido
•Se aplica a muestras con un bajo contenido de agua
(raciones)
•Es útil para extraer el aceite de semillas oleaginosas
(girasol, maíz, etc) y es ideal para desgrasar alimentos de
raciones.
•Ventajas: permite utilizar el mismo solvente (éter de
petróleo o éter dietílico) realizando repetidas extracciones en
un proceso continuo y automático.
•Desventajas: larga duración, grandes volúmenes de
solvente, se potencian las reacciones de autooxidación,
solvente altamente inflamable
Procedimiento:
-Pesar el cartucho de papel vacío, colocar la muestra seca y
molida adentro y volver a pesar.
-Colocar el cartucho con la muestra en el cuerpo del Soxhlet.
-Pesar el matraz redondo, armar el sistema, y volcar el éter de
petróleo por la parte superior
-El solvente se calienta, comienza la ebullición y los vapores
condensan en el refrigerante, cayendo en el cuerpo del Soxhlet
-Cuando el nivel de solvente llega a la curva del sifón se produce
una sifonada, pasando todo lo del cuerpo del soxhlet al matraz,
donde se reinicia la ebullición del solvente, quedando el aceite en
el matraz. Dejar el sistema a reflujo por 2-6 horas hasta que el
solvente en el cuerpo del Soxhlet esté transparente.
-Quitar el matraz y evaporar el solvente con un rotavapor, luego
colocar en estufa y en desecador para enfriar.
-Pesar el matraz con los lípidos y calcular el porcentaje de grasa
en la muestra problema
Esquema del Método de Soxhlet
Aparato de Soxhlet
Cartucho de papel donde
se coloca la muestra
Plancha
Extracto etéreo
• Estima el contenido de TAG del alimento. Pueden aparecer
pequeñas cantidades de vitaminas liposolubles, carotenos,
ceras, resinas y esteroles.
• Por lo general, los alimentos vegetales contienen pequeñas
cantidades de extracto etéreo (1-5%)
• Excepciones: semillas de soja, girasol y algodón y algunos
alimentos de origen animal.
Alimento
% grasa
Semillas oleaginosas 15-35
Harinas animales
5-10
Tortas oleaginosas
1-3
Cereales
1-5
Forrajes
0-3
Bibliografía consultada
• Azadmard-Damirchi, S., & Dutta, P.C. 2009. A single step solid-phase
extraction method for complete separation of sterol oxidation products in
food lipids. Journal of Chromatography A, 1216: 36-42.
• Belitz, H.D., Grosch, W., & Schieberle, P. 2009. Lipids. Food Chemistry,
158-247.
• Belitz, H.D., Grosch, W., & Schieberle, P. 2009. Edible fats and oils. Food
Chemistry,640-669.
• Carrapiso, A.I., & García, C. 2000. Development in lipid analysis: some new
extraction techniques and in situ transesterification. Lipids, 35(11): 11671177.
• Min, D.B., & Ellefson, W.C. 2010. Fat Analysis. Food Science Texts Series,
117-132.
• Virot, M., Tomao, V., Colnagui, G., Visinoni, F., & Chemat, F. 2007. New
microwave-integrated Soxhlet extraction. An advantageous tool for the
extraction of lipids from food products. Journal of Chromatography A, 1174:
138-144.
Muchas gracias…