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MÓDULO FORMATIVO 3
PROCESADO CITOLÓGICO
Y TISULAR
UNIDAD FORMATIVA 1:
OPERACIONES FÍSICO-QUÍMICAS
BÁSICAS EN CITOLOGÍA
1.1. Disoluciones y tampones (o
amortiguadores o buffers)
1.2. Estudio microscópico. Microscopía:
microscopio óptico y electrónico. Bases,
funcionamiento, mantenimiento y artefactos
técnicos
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1. OPERACIONES FÍSICO-QUÍMICAS
BÁSICAS EN CITOLOGÍA
1.1. DISOLUCIONES Y TAMPONES (O AMORTIGUADORES O
BUFFERS)
$QWHV GH LQLFLDU OD WHPiWLFD VH YH OD QHFHVLGDG GH GHVFULELU EUHYHPHQWH
ORV PDWHULDOHV XWLOL]DGRV HQ ODERUDWRULR SDUD GLVROXFLRQHV FODVL¿FDGRV HQ
YROXPpWULFRV\QRYROXPpWULFRV
‡ 5HVSHFWRDOPDWHULDOYROXPpWULFRVHKDEUiGHWHQHUHQFXHQWDXQDVHULH
de precauciones:
‡ Respetar las condiciones que rigieron su calibración, tipo de aforo,
temperatura de referencia, etc.
‡ (Yitar errores de paralaMe en la lectura.
‡ 1unca debe colocarse el material Yolumptrico a temperaturas ma\ores
de 50 ºC.
‡ /as YasiMas deben estar perfectamente limpias.
‡ $ntes de usar el material Yolumptrico, el mismo debe calibrarse.
‡ (Yitar el contacto del material Yolumptrico con sustancias que lo
ataquen.
Dentro de los materiales volumétricos se encuentran:
‡ Matraz aforado: También conocidos como frascos volumétricos,
consisten en un recipiente de Yidrio con la parte inferior con forma
esférica o de pera y con la base plana. Tiene una marca o aforo para indicar
su capacidad. Cuando se enrasa Kasta la marca contiene un Yolumen
exactamente conocido a una temperatura preestablecida. Se utiliza,
para contener disoluciones de concentración conocida con los cuales se
Ya a trabaMar posteriormente. (l cuello se Kace relatiYamente estrecKo
de modo que un pequexo cambio en el Yolumen del ltquido proYoque
una considerable diferencia en la altura del menisco; de esta forma el
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Operaciones físico-químicas básicas en citología
error que se pueda cometer al lleYar el menisco Kasta el enrase sea el
menor posible. /os matraces aforados suelen lleYar tapones esmerilados
pulimentados, con un mtnimo de irregularidad en la super¿cie para
poder agitar las disoluciones sin peligro de que se derrame líquido, siendo
la distancia desde el enrase Kasta el tapón relatiYamente grande para que
Kaya su¿ciente espacio para agitar. Se emplea para preparar disoluciones
de concentración conocida con exactitud, es decir, cuando el soluto se ha
pesado en una balanza analítica o de precisión.
‡ Probetas graduadas: Son recipientes cilíndricos, graduados, de Yidrio
grueso, de boca ancha, abierta y con pico, y las hay de distintos Yol~menes.
Como la super¿cie libre del líquido es mucho mayor que la de los matraces
aforados, de igual Yolumen la exactitud es mucho menor. 3or eso solo son
~tiles para medidas aproximadas.
‡ Pipetas aforadas: La parte superior de una pipeta tiene grabado un
anillo que ¿Ma un Yolumen del líquido que debe descargarse. 8na pipeta
que se usa de este modo para medir un Yolumen de¿nido de líquido, se
conoce como pipeta para transferencia. Las más usadas son: 5, l0, 20, 50 y
l00 ml. Cabe mencionar que existen también pipetas de doble aforo (uno
superior y otro inferior), siendo éstas más exactas que las anteriores.
‡ Pipetas graduadas: Son tubos estrechos subdiYididos en graduaciones
que se emplean para medir cantidades Yariables de líquido. (l ori¿cio de
una pipeta debe ser de un tamaxo que no proYoque una salida del líquido
demasiado rápida, porque de otro modo llegarían a ser demasiados los
errores debidos a pequeñas diferencias en el tiempo de escurrido. Se usan
habitualmente pipetas de: 2, 5, l0, 25 ml y muchas otras. Cabe mencionar
que de acuerdo al Yolumen que escurran y otras características (como
por ejemplo la graduación al centésimo o al décimo) tendrán en la parte
superior unas bandas de colores que las distinguen. Por ejemplo, las de 5
ml tienen una banda de color azul.
‡ Buretas: Son tubos largos, graduados, de calibre uniforme, proYistos
de un extremo inferior con un dispositiYo que permite un control fácil del
líquido obtenido. Se usan para descargar cantidades Yariables de líquido y
por esta razón se subdiYiden en muchas diYisiones pequeñas. Las buretas
se usan frecuentemente en las titulaciones (aYeriguación de concentración
de un elemento o compuesto).
La bureta de 50 ml graduada en décimas de ml es la que se emplea más a
menudo. Las buretas con robinete de Yidrio deben ser usadas preferentemente y
son necesarias para algunos líquidos concretos (soluciones de yodo). El llenado
de las buretas se debe realizar con un embudo especial para las mismas.
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Los materiales no volumétricos se utilizan para mediciones que no requieren
una alta precisión de medida. Entre ellos encontramos:
‡ Vasos de precipitados: Este recipiente de Yidrio de laboratorio se utiliza
para contener sustancias, disolYerlas, atacarlas, calentarlas y en general
cualquier acción que no necesite una medida de precisión del Yolumen.
Suelen tener forma cilíndrica con base plana y una pequeña boca en
la parte de arriba para poder transferir el líquido contenido con mayor
facilidad. Existen Yarios tamaños de Yasos de precipitados, desde muy
pequeños que suelen tener un Yolumen aproximado de mL hasta Yarios
litros. Los más utilizados son los de 250 ml y 500 ml. Los materiales
con etiquetación PYREX son aptos para el calentamiento y pueden ser
utilizados con mecheros bünchen. Los que no tienen esa etiquetación no
se pueden exponer a una fuente de calor continua ya que puede romperse.
‡ Erlen Meyer: Son recipientes cónicos de base ancha y cuello angosto.
Tienen muchas aplicaciones. Facilitan una mejor agitación del líquido
eYitando pérdidas por salpicaduras en la preparación de soluciones y dan
la posibilidad de agitar la mezcla a ¿n de acelerar el proceso de disolución,
etc.
‡ Cristalizadores: Recipientes de forma cilíndrica con base plana, con
poca altura y un gran diámetro, por lo que su super¿cie abierta es grande.
Se usan cuando se desea eYaporar rápidamente el líquido de una solución
facilitando la cristalización del soluto que se encontraba formando dicha
solución.
‡ Tubos de ensayo: Son tubos de Yidrio de diferentes anchos y largos.
También se ha desarrollado toda una serie de tubos plásticos (desechables)
de diferentes tamaños. Las gradillas son los elementos que se utilizan para
colocar los tubos generalmente en posición Yertical. Las hay de los más
diYersos tamaños y materiales (madera, metal, etc.).
Material de medición en un laboratorio
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Operaciones físico-químicas básicas en citología
1.1.1. Disoluciones
La mayor parte de los procesos químicos que se realizan en un laboratorio,
no se hacen con sustancias puras, sino con disoluciones, generalmente acuosas.
Además, es en la fase líquida y en la gaseosa, en las que las reacciones transcurren
a más Yelocidad.
Las disoluciones se preparan en recipientes especí¿cos para ello citados
anteriormente.
El método de disoluciones se describe continuación en dos casos distintos en
función de la base de partida:
a) Preparación de una disolución a partir de un soluto sólido
El primer paso será pesar la cantidad necesaria de soluto, asegurándose de que
el ¿el de la balanza marque cero. En caso contrario, se ajustará. Las sustancias
a pesar no se deben poner directamente sobre los platillos, sino sobre papel de
¿ltro o un Yidrio de reloj, que deben encontrarse escrupulosamente limpios y
secos. Para sacar el sólido del recipiente que lo contiene utilizaremos una espátula
perfectamente limpia y seca.
8na Yez pesado se pone en un Yaso de precipitados con la menor cantidad
posible de agua destilada (enjuagar con agua destilada el Yidrio de reloj echando
este agua en el Yaso). Se disuelYe agitando con una Yarilla de Yidrio y se Yierte en
el matraz aforado. Enjuagamos con agua destilada el Yaso y echamos este agua
al matraz aforado. Se añadirá agua con el frasco laYador hasta que el niYel haya
subido casi hasta el cuello del matraz, pero no dentro del mismo. A continuación
se agita de modo que el líquido se mezcle bien. Se sigue añadiendo agua hasta
que falte como un centímetro, para la marca de enrase. Por ~ltimo, con un gotero
y gota a gota, el matraz se llena de agua destilada hasta el enrase. El enrase se
considera bien realizado cuando el menisco que forma el líquido queda tangente,
por encima, a la marca de enrase.
Ejemplo de meniscos. A. Cóncavo. B. Convexo.
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b) Preparación de una disolución a partir de una disolución de ácido
concentrado comercial
Con un frasco laYador llenamos de agua destilada la mitad del matraz aforado.
8tilizando una pipeta graduada con un émbolo o una bureta se toma la cantidad
necesaria del ácido concentrado comercial, que se Yierte en el matraz aforado.
Acto seguido se agita para que el líquido se mezcle bien y se YuelYe a añadir
agua hasta que el niYel suba casi al cuello del matraz, pero no dentro del mismo.
La mezcla se sigue agitando para mezclar bien mientras se le Ya añadiendo agua
hasta antes de llegar al enrase (1 cm aproximadamente). Para alcanzar el enrase
del matraz, se añade gota a gota con un gotero. El enrase se considera bien
realizado cuando el menisco que forma el líquido queda tangente, por encima, a
la marca de enrase.
1.1.2. Tampón químico, amortiguador o buffer.
Estas soluciones son aquellas que ante la adición de un ácido o base son capaces
de reaccionar oponiendo la parte de componente básica o ácida para mantener
¿jo el p+. Cuando se agrega un ácido fuerte, la base conjugada reacciona con
los +, aumentando la cantidad del ácido conjugado, pero como este es un ácido
débil, se disocia poco y el p+ del medio no cambia en forma importante. Si se
añade una base fuerte, esta es neutralizada por el ácido débil que se transforma
en su base conjugada más débil que la original, amortiguando el cambio de p+.
Puede haber soluciones reguladoras básicas que tienen Yalores de p+ por
encima de , y soluciones reguladoras ácidas con Yalores de p+ menores de .
Las soluciones reguladoras básicas se preparan a partir de mezclas de bases
débiles que se disocian o ionizan en pequeño grado, es decir que produce una
mínima cantidad de iones hidroxilo (2+) en agua y sus sales o ácidos conjugados.
Las soluciones reguladoras ácidas se preparan a partir de mezclas de ácidos
débiles, siendo un ácido que se disocia o ioniza en pequeño grado; es decir que
produce una cantidad muy pequeña de iones hidrógeno (+) y sus sales o bases
conjugadas.
Cuando un buffer es añadido al agua, se produce un cambio de p+ con el ¿n
de que este se YuelYa constante. De esta manera, ácidos o bases (álcalis bases)
adicionales no podrán tener efecto alguno sobre el agua, ya que esta siempre se
estabilizará de inmediato gracias al efecto del tampón.
Los buffer consisten en sales hidrolíticamente actiYas que se disuelYen en
agua. Los iones de estas sales se combinan con ácidos y bases. Estas sales
hidrolíticamente actiYas son los productos que resultan de la reacción entre
los ácidos débiles y los álcalis fuertes como el carbonato de calcio (a partir
del ácido carbónico e hidróxido de calcio) o entre ácidos fuertes y álcalis
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Operaciones físico-químicas básicas en citología
débiles como el cloruro de amonio (a partir del ácido clorhídrico e hidróxido
de amonio). 8n ácido buffer reacciona cuando un ácido débil o base débil
se combina con su correspondiente sal hidrolítica en una solución de agua.
No siempre un sistema buffer es apropiado, porque los iones de algunas sales
hidrolíticas pueden, por ejemplo, dañar a los organismos que entran en contacto
con él.
Cada sistema buffer tiene su propio rango efectiYo de p+, el cual dependerá
del ácido o base empleados.
Tampones típicos son el par amoniacocatión amonio, ácido acéticoanión
acetato, anión carbonatoanión bicarbonato, ácido cítricoanión citrato o alguno
de los pares en la disociación del ácido fosfórico.
El p+ de una solución tampón se calcula utilizando la Ecuación de HendersonHasselbalch.
pH = pKa+log ([sal]/[ácido])
En ella los componentes se describen como:
‡ p.a
log.a >sal@
‡ >ácido@
concentración de la sal.
concentración de iones hidrógeno.
Cuando se trata del p+ de una solución amortiguadora o tampón químico
de una sal con su base (no con un ácido como hemos Yisto) correspondiente se
calcula el p2+ de la misma forma solo que con una Yariante: p2+ p.blog
(>sal@>base])
El p+ luego se calcula restando el p2+ a 1 :pH=14-pOH
La elección del tampón es de acuerdo al Yalor de p.a, que debe ser lo más
próximo al Yalor de p+ que se quiere construir.
La capacidad reguladora es la máxima cantidad de ácido o base que una
solución buffer puede neutralizar y Ya a depender del p+ de la solución y de
la concentración. La capacidad reguladora máxima está en el rango de: p+
p.a ± 1
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1.2. ESTUDIO MICROSCÓPICO. MICROSCOPÍA: MICROSCOPIO
ÓPTICO Y ELECTRÓNICO. BASES, FUNCIONAMIENTO, MANTENIMIENTO Y ARTEFACTOS TÉCNICOS
1.2.1. Microscopio óptico
8n microscopio es un dispositiYo encargado de hacer Yisibles objetos muy
pequeños. El microscopio compuesto consta de dos lentes o sistema de lentes,
llamados objetiYo y ocular.
El objetivo es un sistema de focal pequeña que forma una imagen real e
inYertida del objeto (situado cerca de su foco) próxima al foco del ocular. Éste
se encarga de formar una imagen Yirtual de la anterior ampliada y situada en un
punto en el que el ojo tenga fácil acomodación (a 25 cm o más). Dada la reducida
dimensión del objeto, se hace imperioso el recolectar la mayor cantidad de luz
del mismo, utilizando sistemas de concentración de la energía luminosa sobre
el objeto y diseñando sistemas que aproYechen al máximo la luz procedente del
objeto.
El microscopio está formado por componentes mecánicos y ópticos.
Componentes mecánicos:
1. EstatiYo o soporte: Formado por un pie pesado que sostiene un brazo
inclinado del que salen la platina y el tubo.
2. Tubo o cañón: Tubo largo de metal hueco cuyo interior es negro.
Proporciona sostén a la lente ocular y lentes del objetiYo.
3. Platina: Plataforma proYista de pinzas, donde se coloca el objeto o
preparación. Puede ser tanto ¿ja como móYil. Prácticamente todos los
microscopio profesionales poseen un carro móYil graduado que con el
moYimiento hacen posible la localización de áreas de interés.
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4. Revólver: Sistema que contiene los lentes objetiYos y que puede girar,
permitiendo el intercambio de dichas lentes.
5. Mando de enfoque: 0anejan el enfoque bien por moYimiento Yertical
de la platina o del tubo en función del modelo de microscopio. Suelen ir
colocados a ambos lados del estatiYo. Para una precisión en el enfoque,
existen el enfoque micro y macrométrico, que trabajan sobre el mismo eje
(coaxiales), mejorando el enfoque.
Tornillo macrométrico: Mando mecánico o perilla de gran tamaño,
que al girarla permite acercar o alejar el objeto que se está obserYando.
Tornillo micrométrico: Permite a¿nar la imagen, enfocándola y
haciéndola más clara. La manipulación de ambos mangos (macro y
micro), permite enfocar la imagen de forma que
Componentes ópticos:
1. Objetivos: Constan de sistemas de lentes. Se puede hablar de objetiYos
secos, que se de¿nen como aquellos que entre el objetiYo y la preparación
solo hay aire y de los de inmersión, que son aquellos que utilizan un líquido
entre la lente y preparación con el ¿n de aumentar la luminosidad. Esta
y otras características como el aumento del objetiYo, apertura numérica,
longitud del tubo y espesor del cubreobjetos, Yiene indicadas mediante
unas marcas en el objetiYo.
2. Oculares: Están formados por dos lentes separadas por un diafragma.
Algunos microscopios para hacer la obserYación más fácil, cuentan con
dos oculares en lugar de uno, permitiendo dicha obserYación con dos
ojos a la Yez. También existen cabezales m~ltiples para que puedan haber
Yarios obserYadores a la Yez.
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3. Fuente de luz: 8na correcta iluminación es la base de una buena
obserYación. Debajo de la platina existe un espejo que recoge tanto la luz
natural como la arti¿cial y reÀecta la luz incorporada bajo el microscopio.
4. Condensador: Está situado debajo de la platina y su función es concentrar
la luz en la muestra utilizando un conjunto de lentes. Dependiendo de
los requerimientos de la obserYación, encontramos distintos tipos de
condensadores: abbe, acromático, de campo oscuro…
5. Diafragma: Situado bajo la platina y el condensador, se encarga de
regular la luz al condensador. En ciertos modelos el mecanismo se acciona
por palanca y mediante rueda con distintos diámetros.
Respecto a los accesorios que complementan y mejoran la microscopia gracias
a los aYances tecnológicos e informáticos, encontramos las cámaras fotográ¿cas,
monitores, Yídeos y Yídeoimpresoras, que han de ser tomados en cuenta como
componentes adicionales al microscopio.
La microscopía puede clasi¿carse de distintas maneras. A continuación
se expone un esquema del tipo de microscopios que atiende a los criterios de
clasi¿cación clásicos:
‡ Microscopía óptica: Está formado por numerosas lentes (en el caso
de los compuestos) que pueden aumentar la Yisualización de un objeto.
Algunos microscopios ópticos pueden agrandar la imagen por encima de
las 2.000 Yeces. Con este tipo de instrumento se pueden Yer tejidos YiYos
y obserYar los cambios que ocurren en un período de tiempo.
Microscopio simple: ProYisto de una lente o sistema de lentes
conYergentes de forma que ofrecen una imagen Yirtual, alineada
y mayor que el objeto, el cual está situado entre la lente y el foco.
Se utiliza para disecciones de pequeños animales o disociación de
piezas histológicas, debido a su limitada ampliación de imagen. Se
denominan lupas y las hay de dos tipos: Lupas mono y binoculares.
Microscopio compuesto: En este tipo la combinación de dos lentes o
sistema de lentes conYergentes de ampli¿cación de imagen colocados
en los extremos del tubo: el denominado objetiYo (colocado cerca del
objeto a obserYar), y el ocular (más cercano al ojo del obserYador).
» Estereomicroscopio
» De luz ultraYioleta
» De contraste de fases
» De campo oscuro
» De polarización
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» Microscopía por luz reÀejada
» De Àuorescencia: Como se había tratado en su momento,
la Àuorescencia se de¿ne como la capacidad de algunas
sustancias, denominadas Àuorescentes, de emitir, bajo la acción
de onda corta, otras radiaciones de acción larga, llamadas de
Àuorescencia. Los componentes de este tipo de microscopios
son una fuente de luz que emite en una banda de longitudes de
onda desde la ultraYioleta al infrarrojo; un ¿ltro que delimita
la banda de excitación, que normalmente es la ultraYioleta;
una muestra Àuorescente, después de la cual, encontramos un
segundo ¿ltro (¿ltro de barrera), que corta los restos de la luz
de excitación y deja pasar sólo la Àuorescencia. Este tipo de
microscopia puede ser primaria (la propia muestra es la que
posee Àuorescencia), secundaria (la muestra está marcada con
sustancias Àuorescentes) y la inmunoÀuorescencia (la ¿jación
colorante se realiza con un anticuerpo marcado. Es el uso
principal de la microscopia de Àuorescencia, siendo su principal
¿nalidad la detección de anticuerpos para estudiar reacciones
inmunológicas.
Descripción del manejo del microscopio óptico:
1. Ajustar primero el asiento al microscopio.
2. Seleccionar el objetiYo.
3. Colocar la preparación: Bajar la platina rotando el tornillo macrométrico
y colocar la preparación sobre ella, sujetándola con las pinzas de la platina,
también centraremos la preparación mediante los tornillos que hay debajo
de la platina cuidando de que este colocado en el sitio adecuado.
4. Ajuste de la iluminación: Enchufar, encender y regular la intensidad
luminosa de la lámpara. Cuando se usa el objetiYo de inmersión el
diafragma estará un poco abierto y el condensador alto. +abrá que poner
una gota de aceite de inmersión y esto se usa para preparaciones teñidas
y sin cubre. Si el objetiYo es seco el diafragma se pondrá más cerrado y
en condensador bajo y suele utilizarse para preparaciones en fresco o en
anatomía patológica.
5. Ajuste de la distancia interpupilar: Se mueYen los oculares hasta que se
obserYe un solo campo Yisual al mirar por ambos oculares.
6. Enfoque de la preparación: Cuando se utilice el de 100x se coloca una
gota de aceite sobre la preparación después se sube cuidadosamente la
platina con el macro hasta tocar el aceite con el objetiYo. Es muy importante
mirar esto por fuera del aparato, para no romper el objetiYo por choque.
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Cuando los objetiYos son secos, se hace con el macro y la preparación lo
más cerca posible del objetiYo, sin tocarlo, mirando también por fuera del
aparato. Finalmente en ambos casos se mueYe lentamente con el micro
y moYiendo los tornillos de obserYaran diferentes campos. Para cambiar
de objetiYo no hay nada más que moYer el reYólYer hasta oír un clic y
¿nalmente ajustamos con el tornillo micrométrico.
1.2.2. Microscopio electrónico
El microscopio electrónico utiliza haz de electrones en lugar de fotones (como
el óptico) y esto permite una ampli¿cación hasta 1000 Yeces mayor que el óptico.
Todos los microscopios electrónicos cuentan con Yarios elementos básicos:
‡ Disponen de un cañón de electrones que emite los electrones que chocan
contra el objeto, creando una imagen aumentada.
‡ Se utilizan lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan
el haz de electrones, ya que las lentes conYencionales utilizadas en los
microscopios ópticos no funcionan con los electrones.
‡ El sistema de Yacío es una parte releYante del microscopio electrónico.
Los electrones pueden ser desYiados por las moléculas del aire, de forma
que tiene que hacerse un Yacío casi total en el interior de un microscopio
de estas características.
‡ Por ~ltimo, todos los microscopios electrónicos cuentan con un sistema
que registra o muestra la imagen que producen los electrones.
+ay dos tipos básicos de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico
de transmisión (Transmission Electron Microscope, TEM) y el microscopio
electrónico de barrido (Scanning Electron Microscope, SEM).
‡ De barrido (SEM): Crea una imagen ampliada de la super¿cie de un
objeto. No es necesario cortar el objeto en capas para obserYarlo con
un SEM, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos
preparatiYos. El SEM explora la super¿cie de la imagen punto por punto,
al contrario que el TEM, que examina una gran parte de la muestra
cada Yez. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz
muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz
de electrones por la pantalla de una teleYisión. Los electrones del haz
pueden dispersarse de la muestra o proYocar la aparición de electrones
secundarios. Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y
contados por un dispositiYo electrónico situado a los lados del espécimen.
Cada punto leído de la muestra corresponde a un píxel en un monitor
de teleYisión. Cuanto mayor sea el n~mero de electrones contados por el
dispositiYo, mayor será el brillo del píxel en la pantalla. A medida que el
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haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma
en el monitor. Los microscopios electrónicos de barrido pueden ampliar
los objetos 200.000 Yeces o más. Este tipo de microscopio es muy ~til
porque, al contrario que los TEM o los microscopios ópticos, produce
imágenes tridimensionales realistas de la super¿cie del objeto.
‡ De transmisión (TEM): El microscopio electrónico de transmisión
emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto cuya imagen se desea
aumentar. 8na parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el
objeto y otros lo atraYiesan formando una imagen aumentada de la muestra.
Para utilizar un microscopio electrónico de transmisión debe cortarse la
muestra en capas ¿nas (ultra¿nos), no mayores de un par de miles de
Angstrom. Se coloca una placa fotográ¿ca o una pantalla Àuorescente
detrás del objeto para registrar la imagen aumentada. Los microscopios
electrónicos de transmisión pueden aumentar la imagen de un objeto hasta
un millón de Yeces.
‡ Microscopio confocal de barrido láser: La mayor parte de las muestras
obserYadas con microscopía óptica son trasl~cidas o, en el caso de ser
opacas, su super¿cie de reÀexión no se encuentra perfectamente pulida.
En ambos casos la luz interacciona con la muestra a Yarias profundidades
por lo que la imagen que llega al obserYador presenta áreas borrosas
debidas a la luz procedente de zonas fuera del plano de enfoque, lo que
produce una degradación en el contraste y resolución de la imagen. El
principio de la microscopía confocal se basa en eliminar la luz reÀejada o
Àuorescente procedente de los planos fuera de foco. Para ello se ilumina
una pequeña zona de la muestra y se toma el haz luminoso que proYiene del
plano focal, eliminándose los haces procedentes de los planos inferiores y
superiores. La utilización de un láser como fuente de luz permite focalizar
la iluminación en una región muy pequeña de la muestra y con una gran
intensidad.
A.)ImaJen obtenida con óptica de Àuorescencia.
B.) Imagen obtenida con microscopio confocal
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Otros tipos de microscopios:
‡ Microscopio de efecto túnel: Este microscopio utiliza una especie
de aguja cuya punta es tan ¿na que ocupa un solo átomo. Esta punta se
sit~a sobre el material y se acerca hasta una distancia determinada. Luego
se produce una débil corriente eléctrica. Al recorrer la super¿cie de la
muestra, la aguja reproduce la información atómica del material de estudio
en la pantalla de una computadora. Los materiales que pueden obserYarse
con este tipo de microscopio tienen sus limitaciones; deben, por ejemplo,
conducir la electricidad y ser elementos que no se oxiden: como el oro, el
platino o el gra¿to, entre otros.
‡ Microscopio de fuerza atómica: Es similar al del efecto t~nel. 8sa
una aguja muy ¿na situada al ¿nal de un soporte Àexible para entrar en
contacto con la muestra y detectar los efectos de las fuerzas atómicas. El
resultado que se obtiene es parecido al del efecto t~nel pero sirYe para
materiales no conductores de la electricidad.
Imagen de un microscopio electrónico
Mantenimiento del microscopio
El microscopio óptico es un instrumento que debe cuidarse con esmero, se debe
coger del brazo para trasladarlo de un lado a otro. Se situará en una mesa recta,
ausente de Yibraciones, no se usarán cantidades exageradas de aceite de inmersión
para que no queden restos sobre la lente. Los objetiYos secos se limpiarán con agua
destilada y papel para lente. Si el objetiYo es de inmersión se limpia con pequeños
toques de xilol y con papel para lentes con cuidado para que no se desprendan.
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Se debe hacer una reYisión profesional al año, debe mantenerse tapado y una Yez
que ¿nalizado el trabajo, se debe apartar la fuente de iluminación, quitar el porta,
desenchufar y guardarlo limpio y con su funda.
8n microscopio es un dispositiYo encargado de hacer Yisibles objetos muy
pequeños. El microscopio compuesto consta de dos lentes o sistema de lentes,
llamados objetivo y ocular.
El microscopio electrónico utiliza haz de electrones en lugar de fotones y
esto permite una ampli¿cación hasta 1000 Yeces mayor que el óptico.
Artefactos técnicos en la observación al microscopio
La técnica citológica o histológica es compleja y con muchos pasos.
8n pequeño fallo en un paso, una pequeña partícula, inYisible a simple
Yista pero que se incluye durante el montaje u otro paso del proceso,
puede proYocar efectos no deseados como la aparición de cuerpos
extraños en la preparación durante la obserYación al microscopio.
A estos fenómenos se les denomina artefactos y al conocer su existencia e
identi¿cación se hace posible la distinción de los mismos con Yerdaderos
hallazgos anómalos en la muestra de estudio. Los artefactos más habituales
presentes en muestras obserYadas por microscopía son (entre otros):
‡ Inclusiones: Pequeños elementos, inapreciables a simple Yista que se
incorporan a la preparación durante el procesamiento y luego son Yisibles
al microscopio, pueden ser ¿bras, pequeños pelos, polYo o incluso cristales
de colorante.
‡ Pliegues: Durante el procesamiento de los cortes, el tejido puede
plegarse sobre sí mismo, lo cual es perfectamente Yisible al microscopio.
Pliegue en tejido
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‡ Bandeado: Este artefacto se suele producir por un incorrecto ángulo de
incidencia de la cuchilla y se reconoce por la presencia de bandas en el
tejido cuando se obserYa al microscopio.
‡ Mellas: Son producidas cuando la cuchilla tiene un pequeño defecto o
desperfecto en el ¿lo de la hoja. Se reconoce porque este defecto proYoca
una rasgadura lineal en el tejido siguiendo la dirección del corte.
Irregularidades por cuchilla defectuosa
‡ Burbujas: Se suelen producir en el medio de montaje, habitualmente en
cortes gruesos y medios de montaje de alta densidad.
El círculo blanco encierra dos burbujas atrapadas entre la preparación y el cubreobjetos
durante el montaje.
‡ Coloración: Pueden haber problemas de sobrecoloración por exposición
demasiado larga al colorante y de precipitaciones de los pigmentos por
no ¿ltrar los colorantes o por preparados teñidos hace mucho tiempo
(Yencidos).
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Operaciones físico-químicas básicas en citología
Exceso de precipitados en el reborde derecho en una tinción realizada
con hematoxilina-eosina
‡ Retracciones: Producidas por la exposición de la muestra a alcoholes o
por sobrecalentamiento en inclusiones en para¿na.
Los asteriscos muestran una retracción en el tejido y células
‡ Autólisis o degeneración post-mortem: Se obserYará una muestra
de mala calidad debido a una mala ¿jación yu obtención de muestra
inadecuada.
Se presenta cuando el tejido no se ¿ja inmediatamente o la cantidad no es
su¿ciente para el tamaño de la muestra. Los fenómenos de autolisis ocasionados
por anoxia ocasionan liberación de enzimas hidrolíticas por parte de los lisosomas
y los elementos celulares y tisulares se degradan. Esto ocasiona la pérdida de
la morfología y las células pierden los detalles que se deberían obserYar al
microscopio.
32
MÓDULO
CITOLÓGICO
Y TISULAR
UNIDAD FORMATIVA 1: Técnicas de apoyo
psicológico3:yPROCESADO
social en situaciones
de crisis
Muestra donde se observa un daño tisular importante con cambios celulares por una mala
praxis en la ¿jación y tinción del preparado.
33