1. Ciencia

Clase 02
Espectroscopía de
Compuestos Orgánicos
MALDI-MS
ESI-MS
Espectrometría de masas
Instrumentación y aplicaciones
Espectrometría de Masa
Fluid (no salt)
+
_
cyano-hydroxy
cinnamic acid
MALDI
Gold tip needle
ESI
Métodos de ionizacion suaves
• Estas técnicas mantienen la molecula de interes intacta
(poca fragmentación)
• ESI (Electro-spray ionization) inventada inicialmente 1960’s
por Malcolm Dole llevada a la prática en 1980’s by John
Fenn (Yale)
• MALDI introducida inicialmente en 1985 por Franz
Hillenkamp and Michael Karas (Frankfurt)
• Posibilitan el análisis de moléculas de alto PM mediante
un analizador de masas (cuadrupolo, ion trap y TOF)
Métodos de ionizacion
Métodos de ionizacion a presión atmosférica
Ionizacion por Electrospray
Métodos de ionizacion a presión atmosférica
After formation the ions are “dragged” through a potential gradient (an electric field) to the
counter plate. (Figure adapted from Andreas Dahlin showing positive ion mode).
Métodos de ionizacion a presión atmosférica
Ionizacion por Electrospray
Técnica muy sensible, precauciones con aditivos y bufferes no volátiles
Genera especies con multiples cargas, dependiendo de la muestra
Se pueden detectar iones de alta masa en bajo rango de m/z
Presición en la determinación de masa de ESI combinado con FT-MS es 0.001 – 0.005%
Modo de ionización POSITIVA, agregado de trazas ácido fórmico (evita protonación)
Modo de ionización NEGATIVA, agregado de trazas de formiato de amonio o aminas volátiles
(evita deprotonación)
Proteinas y péptidos analizados bajo condiciones de ionización positiva Sacáridos y
oligonucleotidos bajo condiciones de ionización negativa
Calibración de la escala m/z, estándares apropiados
ESI es uno de los métodos de ionización más suaves, no produce fragmentación molecular
LC-QTOF
HPLC Agilent 1200
Bomba binaria detector UV
Espectrometro de Masas
micrOTOF-Q II
Fuentes de ionizacion ESI y APPI
Con fuente APCI
Algunas aplicaciones no analíticas de interes
Química Orgánica
Metodologia
Fisicoquímica orgánica
Detección e identificación de
Intermediarios reactivos
Estudios ligando - macromolecula
Química medicinal
(descubrimiento de drogas)
Screening de nuevos inhibidores
(técnicas y estrategias variadas)
Modos de unión de drogas a blancos biologicos
Algunas aplicaciones no analíticas de interes
Química medicinal
(descubrimiento de drogas)
Estudios ligando - macromolecula
Screening de nuevos inhibidores
(técnicas y estrategias variadas)
Modos de unión de drogas a blancos biologicos
Ejemplos moleculas pequeñas – ESI-QTOf
Ejemplos moleculas pequeñas – ESI-QTOf
Citrato de Sildenafil
Ejemplos moleculas pequeñas – ESI-QTOf
Intens.
x104
+MS, 3.07-3.11min #(183-185)
650.11823
628.10621
0.8
683.39037
672.13187
727.41629
508.97198
756.43492
606.09409
0.6
705.14916
785.78551
815.13722
0.4
584.08211
844.48582
873.83728
0.2
903.52242
932.53789
0.0
500
600
700
800
900
1000
m/z
Ejemplos proteínas – ESI-QTOf
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
337 nm UV laser
cyano-hydroxy
cinnamic acid
MALDI
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
(F. Hillenkamp, M. Karas, R. C. Beavis, B. T. Chait, Anal. Chem.,
1991, 63, 1193)
 Apropiado para compuestos orgánicos termolábiles, no volátiles, de alta masa
molecular.
 Utilizada para el análisis de proteínas, péptidos, glicoproteínas, oligosacáridos
y oligonucléotidos.
 La presición en el valor determinado de masa depende del tipo y performance
del ANALIZADOR de MASA, en equipos modernos aprox. 0.01% en muestras de
hasta 40000 Da.
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
• La matriz es componente clave de la técnica (compuestos aromáticos con grupos
funcionales ácidos carboxílicos)
• Laser para muestras biológicas: IR y UV
• Método de ionización “suave”  generación de iones molecular con carga
simple (espectro fácil de interpretar)
• Generalmente NO ocurre fragmentación
 Modo de ionización positiva, la especie dominante son iones moleculares
protonados (M+H)+ (aductos de sales, trazas de iones doblemente cargados (a ½
de m/z), trazas especies diméricas (a 2 m/z)) Usos: análisis de péptidos y
proteínas
 Modo de ionización negativa, la especie dominante son iones moleculares deprotonados (M-H)- (aductos de sales, trazas de iones doblemente cargados o de
especies diméricas) Usos: análisis de oligonucleótidos y oligosacáridos
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
Matriz
+
+
+ +
Laser
Analito
+
+ ++ + --+
+
+
+
+
+
+
• Absorción de radiación UV de los
cromóforos de la matriz y ionización de la
matriz.
• Disociación de la matriz, cambio de fase a
gas supercomprimido, transferencia de
carga a las moléculas de analito.
• Expansión de la
matriz a velocidad
supersonica, el analito es atrapado en la
matriz en bocanada en expansión
(explosion/”popping”)
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
MALDI-MS:
• Calibración de la escala m/z del espectrómetro:
externa, muestra conocida analiza independiantemente
interna, muestra conocida premezclada con la muestra y la
matriz
• Fuentes de laser son fuentes pulsadas, MALDI asociado a
espectrómetros de masa con analizadores de muestra:
TOF (time of flight)
FTR-ICR (Fourier transform ion cyclotron
resonance)
• Presición de masa: ± 0.01% (± 1Da en masas moleculares de
10kDa)
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
ESI
MALDI
Análisis Espectroscópico
MALDI - Matrices
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
MALDI - preparación de muestras
MALDI - preparación de muestras
MALDI - preparación de muestras
MALDI - equipamiento
MALDI - equipamiento
MALDI - equipamiento
Linear Time Of Flight tube
ion source
detector
time of flight
Reflector Time Of Flight tube
ion source
detector
reflector
time of flight
MALDI - ejemplos
MALDI - ejemplos
MALDI vs ESI - resumen
ESI
Preparación
Muestra
Aductos
formados
MALDI
En solución
Agregado de HCOOH
NH4OAc
Estado sólido
(matriz)
Derivados del ácido cinámico
+ó–
Policargados
+ó–
Mono o di
Moléculas pequeñas:
M + H+ ; M + Na+; M + K+
2M + H+ ; 2M + Na+
Moléculas pequeñas:
M + H+; M + Na+; M + K+
(menos frecuentes) 2M + H+; 2M + Na+
Proteínas : M + nH+
Proteínas : M + H+; M + 2H+