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ENHEVA v.4
1 Uso previsto
RealCycler ENHEVA es un kit de reactivos que permite la detección
cualitativa por PCR a tiempo real del ARN de Enterovirus y del ADN
de virus Herpes Simple (tipo 1 + tipo 2) y de virus Varicela-Zoster
(VZV) en muestras clínicas, utilizando un equipo SmartCycler®
(Cepheid®).
El sistema incluye un control interno CHIC (Competitive
Heterologous Internal Control) para prevenir los falsos negativos
debidos a la inhibición de la reacción.
Componente
Viales
Volumen
AmpliMix
24
16,67 μL
Retrotranscriptasa
1
60 μL
Control Positivo
1
60 μL
2 Descripción del método
5 Estabilidad y almacenamiento
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) está basada en la
amplificación de una región específica del ADN/ARN usando
oligonucleótidos complementarios a la secuencia diana. En la PCR a
tiempo real se utilizan sondas marcadas con fluoróforos que emiten
fluorescencia en caso de amplificación. El ciclo de la PCR en el que
se detecta inicialmente un aumento significativo en la señal de
fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN/ARN presente en
la muestra. Este valor se denomina Ciclo umbral (Ct -Cycle Tresholdo Cq -Cycle Quantification-).
Todos los componentes del kit RealCycler ENHEVA deben ser
almacenados a -20 °C. El kit es estable a -20 °C hasta la fecha de
caducidad que consta en la etiqueta externa del kit.
6 Material y equipamiento adicional
requerido y no suministrado
- Equipo de PCR a tiempo real SmartCycler® (Cepheid®).
- Microcentrífuga para tubos SmartCycler®.
- Gradillas para tubos SmartCycler®.
- Kit de purificación de ADN/ARN.
- Guantes desechables.
- Pipetas calibradas.
- Puntas de pipeta con filtro.
- Congelador (-20 °C).
- Control negativo (ADN/ARN de muestras negativas, agua o tampón
de elución).
La amplificación de Enterovirus se detecta en el canal
correspondiente al fluoróforo FAM, la de CHIC en el correspondiente
al fluoróforo Alx532, la del virus Herpes Simple (tipo 1 + tipo 2) en el
correspondiente al fluoróforo TxR y la del virus Varicela-Zoster en el
correspondiente al fluoróforo Alx647.
3 Especificaciones
Sensibilidad
Enterovirus: 1 copia/µL.
Virus Herpes Simple tipo 1: 10 copias/µL.
Virus Herpes Simple tipo 2: 100 copias/µL.
Virus Varicela-Zoster: 100 copias/µL.
7 Advertencias y precauciones
- Todos los componentes del kit deben mantenerse en frío mientras
se están manipulando.
- Después de añadir el ADN/ARN, minimizar el tiempo necesario
para iniciar el programa de amplificación.
- Los tubos con la mezcla de amplificación no deben exponerse a la
luz durante un periodo de tiempo prolongado.
- Descongelar y congelar repetidas veces los reactivos puede
disminuir la sensibilidad del kit.
- Usar guantes desechables.
- Usar pipetas calibradas y puntas de pipeta con filtro.
- Los ensayos deben llevarse a cabo por personal cualificado y
siguiendo las buenas prácticas de laboratorio.
- Se recomienda que se lleven a cabo controles positivos y negativos
cada vez que se realice un análisis.
- Se recomienda atemperar los tubos durante 5 minutos a
temperatura ambiente antes de abrirlos. En caso contrario puede
producirse la rotura del tapón.
- No usar el kit después de la fecha de caducidad.
- La presencia de polimorfismos en las secuencias de unión de las
sondas u oligonucleótidos al ADN/ARN del patógeno puede generar
resultados erróneos. En el caso de discordancia entre las
observaciones clínicas y los resultados obtenidos se aconseja
comprobar los resultados mediante métodos alternativos.
- Los resultados obtenidos con este kit de diagnóstico deben
utilizarse e interpretarse en el contexto de un cuadro clínico general
y no deben ser el único criterio para la toma de decisiones clínicas.
- Uso para diagnóstico in vitro.
La sensibilidad analítica ha sido determinada por el método de
dilución límite. La sensibilidad ha sido obtenida en ensayos
repetitivos con una reproducibilidad superior al 95%.
Especificidad
Enterovirus: región 5’ UTR.
Virus Herpes Simple tipo 1: gen US6.
Virus Herpes Simple tipo 2: gen DNA polimerase.
Virus Varicela-Zoster: gen Single-stranded DNA-binding protein
(ORF 29).
La validación de la especificidad ha sido realizada mediante ensayos
experimentales y el análisis BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
4 Composición
RealCycler ENHEVA incluye la mezcla de reacción AmpliMix
dispensada en tubos de amplificación, una retrotranscriptasa y un
Control Positivo ENHEVA, el cual contiene una mezcla de ARN de
Enterovirus y de ADN de virus Herpes Simple (tipo 1 + tipo 2) y virus
Varicela-Zoster.
Todos los reactivos están listos para su uso sin añadir ni reconstituir
ningún componente.
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RealCycler ENHEVA v.4
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- Cepheid® y SmartCycler® son marcas registradas de Cepheid
Corporation.
- QIAamp es una marca registrada del Grupo QIAGEN.
- Maxwell® es una marca registrada de Promega Corporation.
- NucliSENS® easyMAG® es una marca registrada de bioMérieux.
c) Preparación de la reacción
- Descongelar los tubos AmpliMix necesarios para amplificar las
muestras y el Control Positivo. Utilizar como control negativo
ADN/ARN de muestras negativas, agua o tampón de elución de
ADN/ARN (no proporcionados).
- Añadir 2 μL de retrotranscriptasa a cada tubo.
- Añadir 8 μL del ADN/ARN de cada muestra o control a cada tubo.
- Centrifugar los tubos para que la reacción pase a la zona óptica del
tubo. Verificar que no se forman burbujas en la zona óptica.
- Colocar los tubos en el equipo.
- Create Run > Dye Set > FATA25.
- Add/Remove Sites: asignar el protocolo “ENHEVA” a las posiciones
correspondientes a las muestras y los controles.
- Start Run: iniciar el programa de amplificación.
8 Muestras clínicas
- Recoger las muestras en tubos estériles.
- Almacenarlas y transportarlas congeladas a -20 °C hasta su uso.
- El kit es compatible con cualquier muestra en la cual el patógeno
esté presente y se pueda extraer un ADN/ARN de calidad.
Muestras clínicas validadas:
● Enterovirus: cultivo, heces, lavado broncoalveolar, líquido
cefalorraquídeo y medio de transporte de virus (VTM).
● Virus Herpes Simple (tipo 1 + tipo 2): exudado genital, lavado
broncoalveolar, líquido cefalorraquídeo, medio de transporte de virus
(VTM) y orina.
● Virus Varicela-Zoster: líquido cefalorraquídeo y medio de
transporte de virus (VTM).
d) Ajustar el umbral de fluorescencia
- Analysis settings > Manual Thresh Fluor Units > fijar el valor a 30.0.
e) Interpretación del resultado de los controles
- Resultados válidos de los controles
9 Procedimiento
Canales
a) Purificación de los ácidos nucleicos
Control
El ADN y ARN deben purificarse a partir de las muestras clínicas
utilizando un procedimiento adecuado. En el mercado se encuentran
disponibles gran cantidad de sistemas de purificación de ácidos
nucleicos. Realizar el procedimiento de purificación siguiendo las
instrucciones del fabricante y partir del volumen de muestra
recomendado.
POS
NEG
Ch1
Ch2
Ch3
Ch4
FAM
Alx532
CHIC
TxR
Alx647
POS
POS
POS
(Ct dentro Indiferente (Ct dentro (Ct dentro
del rango)
del rango) del rango)
NEG
POS
(Ct dentro
del rango)
NEG
NEG
Interpr.
VÁLIDO
VÁLIDO
Sistemas de purificación validados:
● QIAamp DNA Blood Mini kit (referencias 51104, 51106). QIAGEN.
Este sistema sólo está indicado para la purificación de virus Herpes
Simple y virus Varicela-Zoster.
● QIAamp Viral RNA Mini kit (referencias 52904, 52906). QIAGEN.
● Maxwell® 16 Cell LEV DNA Purification kit (referencia AS1140).
Promega Corporation. Este sistema sólo está indicado para la
purificación de virus Herpes Simple y virus Varicela-Zoster.
- Resultados inválidos de los controles
Sistemas de purificación compatibles:
En el caso de obtener en algún canal del control negativo (excepto
en CHIC) un valor de Ct > 0, los resultados obtenidos en las
muestras incluidas en la serie de trabajo deben ser descartados (no
valorables).
En el caso de obtener en algún canal del Control Positivo (excepto
en CHIC) un resultado negativo o un Ct fuera del rango indicado en
la etiqueta interna se considera que ese control es inválido. Los
resultados obtenidos en las muestras incluidas en la serie de trabajo
deben ser descartados (no valorables).
● Maxwell® 16 Viral Total Purification kit. Promega Corporation.
● BioRobot EZ1. QIAGEN.
● QIAcube. QIAGEN.
● NucliSENS® easyMAG®. bioMérieux.
b) Protocolo
Programar el protocolo de amplificación “ENHEVA” de acuerdo con
las siguientes especificaciones:
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RealCycler ENHEVA v.4
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f) Interpretación de los resultados de las muestras
Interpretar el resultado obtenido en cada muestra o control según la
combinación de señales indicada en la siguiente tabla:
Canales
Ch1
Ch2
Ch3
Ch4
FAM
Alx532
CHIC
TxR
Alx647
POS
Indiferente
NEG
NEG
POSITIVO
Enterovirus
NEG
Indiferente
POS
NEG
POSITIVO
Herpes
Interpretación
NEG
Indiferente
NEG
POS
POSITIVO
VZV
POS
Indiferente
POS
NEG
POSITIVO
Enterovirus
y Herpes
POS
Indiferente
NEG
POS
POSITIVO
Enterovirus
y VZV
NEG
Indiferente
POS
POS
POSITIVO
Herpes y VZV
POS
Indiferente
POS
POS
POSITIVO
Enterovirus,
Herpes y VZV
NEG
Ct dentro
del rango
NEG
NEG
NO SE DETECTA
NEG
Ct fuera
del rango
NEG
NEG
NO VALORABLE
NEG
0,00
NEG
NEG
NO VALORABLE
Gráfica 2 (Canal Alx532: CHIC): Resultado obtenido al amplificar un
control negativo, un control positivo Enterovirus, un control positivo
Herpes y un control positivo VZV. Control negativo (A9 en azul): se
observa una señal con Ct=28,15. Control positivo Enterovirus (A10
en gris): se observa señal con Ct=26,40. Control positivo Herpes
(A11 en naranja): se observa señal con Ct=28,29. Control positivo
VZV (A12 en verde): se observa señal con Ct=28,04.
Gráfica 3 (Canal TxR: Herpes): Resultado obtenido al amplificar un
control negativo, un control positivo Enterovirus, un control positivo
Herpes y un control positivo VZV. Control negativo (A9 en azul):
ausencia de señal. Control positivo Enterovirus (A10 en gris):
ausencia de señal. Control positivo Herpes (A11 en naranja): se
observa señal con Ct=33,15. Control positivo VZV (A12 en verde):
ausencia de señal.
g) Ejemplo de resultado
Gráfica 1 (Canal FAM: Enterovirus): Resultado obtenido al amplificar
un control negativo, un control positivo Enterovirus, un control
positivo Herpes y un control positivo VZV. Control negativo (A9 en
azul): ausencia de señal. Control positivo Enterovirus (A10 en gris):
se observa señal con Ct=23,14. Control positivo Herpes (A11 en
naranja): ausencia de señal. Control positivo VZV (A12 en verde):
ausencia de señal.
Gráfica 4 (Canal Alx647: VZV): Resultado obtenido al amplificar un
control negativo, un control positivo Enterovirus, un control positivo
Herpes y un control positivo VZV. Control negativo (A9 en azul):
ausencia de señal. Control positivo Enterovirus (A10 en gris):
ausencia de señal. Control positivo Herpes (A11 en naranja):
ausencia de señal. Control positivo VZV (A12 en verde): se observa
señal con Ct=32,88.
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RealCycler ENHEVA v.4
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10 Interpretación de los resultados
utilizando la aplicación informática Visor
RealCycler
a) Exportación de resultados
a.1) Desde el equipo SmartCycler® Dx
- Export > se abre la ventana Export data > Export (dejar por defecto
la opción Export Optics Data, Export Results Tables y Export Assay
Settings).
b) Preparación Visor RealCycler
- Abrir el Visor RealCycler e introducir nombre de usuario y
contraseña.
- Seleccionar el instrumento utilizado > Options > Setup.
- Data > Lot input > seleccionar AmpliMix ENHEVA.
- Introducir el valor de lote indicado en la etiqueta externa del kit
RealCycler ENHEVA.
- Introducir los valores de Ct para cada canal indicados en la
etiqueta interna del kit RealCycler ENHEVA (obviar el signo “<“) >
guardar y salir.
- Columna AmpliMix > desplegar con el botón derecho y seleccionar
AmpliMix ENHEVA. Se mostrarán automáticamente los patógenos
detectados en cada canal.
- Columna Lot > seleccionar el lote de la AmpliMix.
- Save (opcionalmente cambiar el nombre del archivo).
c) Importación de resultados
- Data > Import Run Data > seleccionar fichero CSV.
- Elegir Use Preanalytical Data from SmartCycler® (esta opción
borrará los datos de las muestras que se hayan introducido en el
Visor) o Use Preanalytical Data from Visor (esta opción no importará
la identificación de muestras del SmartCycler®).
- Import data.
- En la columna Sample identificar los controles y opcionalmente las
muestras de la serie.
a.2) Desde el equipo SmartCycler® I+D
- Export > Se abre la ventana Export data > Export (dejar por defecto
la opción Export Optics Data y Export Results Table and Analysis
Settings).
d) Generar informe
- File > Reports > Seleccionar las muestras que se quieren imprimir.
- Save (opcionalmente cambiar el nombre del archivo).
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RealCycler ENHEVA v.4
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e) Interpretación de resultados
- Detección de los patógenos
La aplicación informática Visor RealCycler indicará en qué canal se
detecta o no señal. En controles y muestras las señales pueden ser
válidas (VAL) o inválidas (INV). En CHIC la señal puede ser VAL (Ct
dentro del rango en las muestras negativas) o VAL* (Ct indiferente
en las muestras positivas). Si se obtiene señal se considerará
positivo para ese patógeno siempre y cuando el estatus de la
muestra sea válido.
- Estatus de la muestra
ESTATUS
Interpretación
CHIC
Control
Positivo
Control
Negativo
VÁLIDO
Ct dentro
del rango
Ct dentro
del rango
Ct=0
ADVERTENCIA
Ct dentro
del rango
Ausente
Ct=0
ADVERTENCIA
Ct dentro
del rango
Ct dentro
del rango
Ausente
ADVERTENCIA
Ct dentro
del rango
Ausente
Ausente
INVÁLIDO
Ct fuera
del rango
Válido
Válido
INVÁLIDO
Ct dentro
del rango
Inválido
Válido
INVÁLIDO
Ct dentro
del rango
Válido
Inválido
INVÁLIDO
Ct dentro
del rango
Inválido
Inválido
Si las curvas que superan el umbral son anómalas (no sigmoideas) o
lineales, no son aptas para el análisis y los resultados obtenidos en
esas muestras deben descartarse. El Visor RealCycler realiza un
análisis para detectarlas, en cuyo caso las clasificará como inválidas.
No obstante, el usuario debe valorar individualmente si las curvas
son aptas o no para el análisis, y descartar aquéllas que tengan una
forma anómala (no sigmoideas) o lineales.
11 Control de calidad
Para validar los resultados, los valores de Ct obtenidos en el control
positivo y en los controles internos deben encontrarse dentro de los
rangos especificados en la etiqueta interna del kit.
Cada lote del kit RealCycler ENHEVA ha sido testado según las
especificaciones de la PCR a tiempo real utilizando el equipo
SmartCycler® (Cepheid®).
Fecha de publicación: Septiembre, 2015.
Progenie Molecular
Edificio Progenie. Valle de la Ballestera 56. 46015. Spain
T: +34 902 91 05 05 F: +34 902 91 05 06
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