1. No category

CMV BriteTM Kit
Detección de antigenemia CMV
----------------------------------------El nuevo estándar
en el diagnóstico del Citomegalovirus
100 pruebas
(Español)
-----------------------------------------
[REF] VIR-CMV-100
0344
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
IQ Products
Rozenburglaan 13a
9727 DL Groningen
Holanda
Tel: +31 50 5757 000
Fax: +31 50 5757 002
Utilidad
El CMV BriteTM Kit se utiliza para la detección cualitativa de la proteína de matriz de bajo peso molecular
pp65 del Citomegalovirus (CMV) por inmunofluorescencia indirecta. Se observan al microscopio
preparaciones de leucocitos aislados a partir de sangre periférica humana, anticoagulada con EDTA o
heparina.
La detección de pp65 CMV en células de sangre periférica apoya el diagnóstico de una infección por CMV,
aguda o reactivada. Este producto no está aprobado por la FDA para su uso en muestras procedentes de
donantes de sangre.
Resumen y explicación
El citomegalovirus humano (CMV) es un virus ADN, de aproximadamente 200 nm. de diámetro, que
pertenece a la familia de los herpes virus. Posee un núcleo de ADN bicatenario, una cápsida integrada por
162 capsómeros y una cubierta externa (1). La infección por CMV es muy frecuente y habitualmente
asintómatica en individuos sanos. Sin embargo, la infección fetal o en huéspedes inmunodeprimidos
puede provocar enfermedad, ya sea localizada o diseminada.
Las manifestaciones clínicas son variadas: neumonía, retinitis, hepatitis, enteritis y transtornos
neurológicos.
A pesar de la mejoras en los tratamientos, la infección por CMV puede provocar unas elevadas tasas de
morbilidad y mortalidad en pacientes transplantados, enfermos de SIDA o enfermos oncológicos, en
especial los aquejados de leucemia o linfoma. Este tipo de pacientes están expuestos tanto a infecciones
primarias como a reactivaciones de infecciones latentes (2-4). El diagnóstico precoz y rápido es de gran
importancia para evitar el sobretratamiento con fármacos inmunosupresores y para orientar la terapia
antiviral.
Sin embargo, a menudo resulta complicado diferenciar la infección asintomática del proceso patólogico
que requiere tratamiento. Se ha demostrado que el aislamiento de CMV a partir de muestras de sangre
(viremia CMV) correlaciona bién con la aparición de la enfermedad, mientras que el aislamiento en saliva
y orina se produce en ausencia de patología.
Los métodos convencionales para el aislamiento de CMV poseen una elevada sensibilidad, sin embargo los
resultados no se obtienen hasta pasadas varias semanas. El cultivo en "shell vial" proporciona los
resultados en 1 o 2 días, pero su sensibilidad es deficiente en las muestras de sangre. La detección de
CMV en los leucocitos polimorfonucleares (PMNs) de sangre periférica (antigenemia CMV) es rápida y
sensible (5,6). Esta técnica emplea anticuerpos monoclonales para detectar la fosfoproteína de bajo peso
molecular (pp65), un antígeno temprano de replicación viral, muy abundante en PMNs. La detección de
antigenemia CMV puede completarse transcurridas 5 horas desde la extracción de la muestra,
proporcionando valiosa información para el diagnóstico y seguimiento de la infección aguda por CMV en
pacientes transplantados tanto de órganos como médula ósea (1,2,10-13, 19). Igualmente, la
antigenemia CMV ha mostrado cierta correlación con la enfermedad provocada por CMV en pacientes con
SIDA (4,18).
Principio
En el desarrollo de la antigenemia CMV se ha utilizado una combinación de dos anticuerpos monoclonales
(C10/C11) dirigidos contra la proteína de matriz de bajo peso molecular pp65 (ref 6). El CMV BriteTM
emplea la combinación de C10/C11 en una tinción por inmunofluorescencia indirecta de preparaciones por
citocentrifugación de leucocitos de sangre periférica. El método de antigenemia consta de los siguientes
pasos:
a.
Separación de los leucocitos
b.
Preparación de los portas por citocentrifugación
c.
Fijación y permeabilización
d.
Tinción por inmunofluorescencia indirecta empleando anticuerpos monoclonales frente a la
proteína pp65.
e.
Lectura e interpretación de los resultados
En el primer paso purificamos los leucocitos y lisamos los hematíes, obteniendo una suspensión de
leucocitos. A continuación citocentrifugamos sobre un porta, fijamos y permeabilizamos para
posteriormente detectar el antígeno CMV pp65. La presencia de este antígeno es detectada por los
monoclonales C10/C11, visualizándola por medio de un anticuerpo secundario marcado con FITC.
Observados al microscopio de fluorescencia, los leucocitos positivos exhiben fluorescencia amarilloverdosa nuclear, polilobulada y homógenea. El número de células antígeno positivas se cuentan en
preparaciones duplicadas.
Todo el procedimiento, incluida la separación de los leucocitos puede ser realizado en aproximadamente
5 horas.
1
Reactivos
Materiales y reactivos incluidos en el CMV BriteTM
Reactivo A:
Solución de dextrano - 1 x 100 ml de dextrano en PBS con < 0.1 % de azida sódica.
Reactivo B:
Solución lisante de eritrocitos - 1 x 30 ml. de cloruro amónico con < 0.1 % de azida
sódica.
Reactivo C:
Solución de fijación - 1 x 290 ml. de formaldehido en PBS con < 0.1 % de azida
sódica. Xn 20-22/36-38/40/43.
Reactivo D:
Solución de permeabilización - 1 x 290 ml. de Igepal Ca-630 y suero de ternero recién
nacido en PBS con < 0.1 % de azida sódica.
Reactivo E:
Suero de ternero recién nacido - 1 x 15 ml. de suero bovino fetal en PBS
con < 0.1 % de azida sódica.
Reactivo F:
Anticuerpo monoclonal de ratón C10/C11 - 1 x 5.9 ml. de la combinación de
anticuerpos monoclonales de ratón (inmunoglobulinas IgG de ratón, ambos de los
isotipos IgG1) frente a la proteína de matriz de bajo peso molecular del CMV pp65 con
< 0.1 % azida sódica.
Reactivo G:
Conjugado FITC anti globulina de raton - 1 x 5.9 ml. De conjugado FITC de oveja anti
globulina de raton con azul de Evans y < 0.1 % de azida sódica.
Portas de control:
Portas de control para antigenemia CMV - 20 x 1 portas de control en bolsa sellada
con desecante.
Cada porta contiene un pocillo de control negativo (leucocitos antígeno CMV negativos fijados) y un pocillo
de control positivo (células pp65 positivas mezcladas con leucocitos antígeno negativos).
Antes de abrir el envase, dejar que los portes alcancen la temperatura ambiente.
Mantener los reactivos a 2-8 C. Evitar la luz solar directa. Los reactivos conservados de acuerdo con
estas instrucciones son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
Un envase de CMV BriteTM permite la realización de 100 pruebas, contiene 20 portas de control. Se
recomienda realizar la prueba de antigenemia por duplicado.
Advertencias y precauciones
Para diagnóstico in vitro.
Portas de control
Para la preparación de los portas de control incluidos en el kit CMV BriteTM se han empleado leucocitos
provenientes de un donante sano. Cada unidad donada ha sido sometida a técnicas analíticas aprobadas
por la FDA y ha demostrado no contener anticuerpos frente a HIV-1, HIV-2, HCV y CMV, así como su
negatividad frente a HBsAg. A pesar de la gran fiabilidad de los métodos empleados, no se puede
garantizar la detección de todas las unidades infectadas. Además, el producto podría contener algún
material de origen humano para el que no existe método de detección aprobado. Ya que no existe método
conocido que ofrezca garantía absoluta de ausencia de HIV-1, HIV-2, virus de la hepatitis B, CMV u otros
agentes infecciosos, todos los reactivos deben ser utilizados de acuerdo con las buenas prácticas de
laboratorio, observando todas las precauciones descritas en "Biosafety in Microbial and Biomedical
Laboratories", 2nd edition, 1.988. HHS Publication No (CDC) 88-8395, Centers for Disease Control.
Advertencia
Los reactivos que contienen azida de sodio pueden reaccionar con tuberías de plomo o de cobre y formar
azidas metálicas explosivas. Al desecharse, utilizar una gran cantidad de agua corriente para prevenir la
formación de azidas.
2
Advertencia
Todos los reactivos deben ser manejados con las debidas precauciones, en conformidad con las buenas
prácticas de laboratorio. Las mismas precauciones se emplearán con las muestras de pacientes. No
pipetear con la boca.
El Reactivo C contiene menos de un 9.3 % de formaldehido, tóxico altamente alergénico y potencialmente
carcinogénico, por tanto debe manejarse con las debidas precauciones, en conformidad con las buenas
prácticas de laboratorio. Evitar el contacto con la piel o con los ojos.
El Reactivo G contiene azul de Evans. Evitar el contacto con los ojos, piel y ropa. Mantener el envase
herméticamente cerrado. Tras su utilización, lavarse intensamente las manos.
Obtención y preparación de la muestra
Procesamiento de la muestra de sangre
Recoger mediante venipuntura aséptica, de 5 a 10 ml. de sangre venosa en un tubo heparinizado o
tratado con EDTA. Enviar la muestra al laboratorio sin demora. Hasta la separación de los leucocitos, la
muestra debe mantenerse a temperatura ambiente (20 - 25 C). La separación debe realizarse en las 68 horas siguientes a la obtención de la muestra. En muestras heparinizadas, puede observarse un
descenso en el número de células antígeno-positivas por porta (15,16,17). No se ha determinado el
tiempo máximo de almacenamiento de la muestra a temperatura ambiente. Por tanto, se debe intentar
siempre la preparación inmediata de los portas. En pacientes con neutropenia severa (recuento absoluto
de neutrófilos inferior a 200/mm3) se pueden necesitar al menos 10 ml de sangre.
Procedimiento
Materiales y reactivos incluidos en el CMV BriteTM
Reactivo A:
Solución de dextrano (lista para su uso)
1 envase de 100 ml
Reactivo B:
Solución lisante de eritrocitos (diluir antes de usar)
1 envase de 30 ml
Reactivo C:
Solución de fijación (diluir antes de usar)
Xn 20-22/36-38/40/43.
1 envase de 290 ml
Reactivo D:
Solución de permeabilización (diluir antes de usar)
1 envase de 290 ml
Reactivo E:
Suero de ternero recién nacido (diluir antes de usar)
1 envase de 15 ml
Reactivo F:
Anticuerpo monoclonal de ratón C10/C11 frente a la proteína
de matriz de bajo peso molecular del CMV pp65
(listo para su uso)
1 envase de 5,9 ml
Conjugado FITC anti globulina de ratón con azul de Evans
(listo para su uso)
1 envase de 5,9 ml
Reactivo G:
Portas de control: Portas de control para antigenemia CMV (listos para su uso)
20 portas
Material y equipo necesarios pero no incluidos en el CMV BriteTM
*
Centrifuga de laboratorio
*
Tubos de centrífuga de 15 ml, estériles y de fondo cónico
*
Pipetas
*
Micropipetas y puntas de pipeta
*
Agua desmineralizada (destilada)
*
Hemocitómetro o contador hematológico automático
*
Portas para citocentrífuga
*
Citocentrífuga (por ejemplo Cytospin 3 de Shandon Southern Products Ltd.)
*
Cubetas Coplin
*
Cámara húmeda
*
Incubador a 37 C
*
Microscopio de fluoresecencia con amplificación de 250x a 1000x
*
Medio de montaje no fluorescente (por ejemplo el CITI FLUOR, Glycerol PBS solution, UKC Chem
Lab; or Immunoconcept Mounting Media, catalogue # 111)
*
Campana extractora
*
Cubreobjetos
3
Procedimiento de la prueba
Nota: a menos que se establezca otra cosa, los reactivos (incluido el PBS) deben encontrarse a
temperatura ambiente en el momento de su utilización. Se considera temperatura ambiente entre
20 y 25 C.
I.
Separación de los leucocitos (sedimentación por dextrano)
Nota: el proceso de preparación de las muestras debe incluir los correspondientes controles.
*
Mezclar de 5 a 7 ml. de sangre con 1,5 ml. de Reactivo A en un agitador vortex durante
5-10 segundos en un tubo cónico de 15 ml., incubando a 37 C durante 20 minutos (en ángulo de
45 ). No cerrar el tapón por completo. Si se usa un mayor volumen de sangre, se debe mantener
una proporción dextrano/sangre de 1:4.
Transferir mediante pipeta el sobrenadante que contiene los leucocitos más la capa superior de
eritrocitos a otro tubo de 15 ml. Centrifugar durante 10 minutos a 1200 rpm (aproximadamente
300 x g). Desechar el sobrenadante.
Diluir el Reactivo B 1:10 en agua desmineralizada (destilada), dejándola enfriar hasta 4 C.
Resuspender la pastilla celular en 5 ml. de solución lisante para eritrocitos diluida. Agitar en vortex
e incubar durante 10 minutos a 4 C, añadir 5 ml. de PBS y centrifugar como antes. Desechar el
sobrenadante. Repetir este paso si los glóbulos rojos no han sido lisados por completo.
Lavar con 5 ml. de PBS, centrifugar como antes y desechar el sobrenadante.
*
*
*
II.
*
*
*
III.
*
*
*
IV.
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
V.
*
*
*
*
*
Preparación de la dilución adecuada por contaje de celular.
Resuspender la pastilla en 1 ml. de PBS (en pacientes con neutropenia severa (recuento absoluto de
neutrófilos inferior a 200/mm3) es posible que sea preciso resuspender en un volumen tan pequeño
como 0.2 ml.
Contar las células mediante hemocitómetro o contador hematológico automático
Ajustar la concentración a 1.5 x 106 células/ml. diluyendo con PBS.
Preparación de los portas por citocentrifugación.
Centrifugar 100 l. de la suspensión a 1.5 x 106 células/ml. (1.5 x 105 células por pocillo) a
600-800 rpm durante 4 minutos sobre los portas.
Preparar al menos 3 portas por muestra de paciente (dos para utilizar en la prueba y uno adicional
como reserva).
Dejar secar los portas durante aproximadamente 5 minutos.
Los portas pueden permanecer a temperatura ambiente durante toda la noche antes de ser fijados.
Fijación y permeabilización
Diluir el reactivo C 1:5 en agua desmineralizada (destilada) antes de usar.
Emplear campana extractora.
Diluir el reactivo D 1:5 en agua desmineralizada (destilada) antes de usar. No reutilizar.
Sumergir 2 portas en Reactivo C diluido durante 10 minutos a temperatura ambiente y en campana
extractora.
Preparar 100 ml. de solución de lavado diluyendo el Reactivo E 1:200 en PBS antes de usar. No
reutilizar.
Bañar los portas 3 veces en la solución de lavado, manteniéndolos en la misma solución durante
5 minutos.
Sumergir los portas en Reactivo D diluido durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Bañar los portas 2 veces en solución de lavado fresca, manteniéndolos en la misma solución de
5-10 minutos.
Lavar en agua desmineralizada (destilada) durante 15 segundos.
Dejar secar los portas bajo la campana extractora durante aproximadamente 20 minutos.
Una vez secos, los portas se deben teñir inmediatamente, o mantenerse a 4 C durante 24 horas o
congelarse a -80 C.
Tinción inmunofluorescente
Marcar el área celular sobre el porta para aprovechar al máximo el monoclonal. Dejar secar durante
5 minutos.
Sumergir los portas durante 3-5 minutos en PBS en una cubeta Coplin; a partir de este momento,
evitar que la muestra se seque durante todo el proceso.
Retirar un porta cada vez de la cubeta Coplin; secar cuidadosamente la zona que rodea el pocillo
con toallita o paño de algodón.
Aplicar 35 l de Reactivo F durante 30 minutos a 37 C en cámara húmeda. Como control positivo
incubar un porta con una muestra de positividad comprobada o un porta de control CMV BriteTM.
Lavar 2 veces con PBS fresco en cubeta Coplin durante 3 minutos.
4
*
*
*
VI.
*
*
*
*
*
*
Retirar un porta cada vez de la cubeta Coplin; secar cuidadosamente la zona que rodea el pocillo
con toallita o paño de algodón.
Aplicar 35 l. de Reactivo G durante 30 minutos a 37 C en cámara húmeda. Como contro
Lavar 2 veces con PBS fresco y a continuación de forma cuidadosa con agua del grifo (5 veces).
Montar con medio de montaje y cubreobjetos.
Lectura
Realizar la lectura lo antes posible. Los portas se pueden mantener, bien cubiertos para evitar la
pédida de fluorescencia, hasta 8 horas a 4 C.
Realizar la lectura con un microscopio de fluorescencia a una amplificación de 250x.
Para obtener una mayor resolución, se pueden utilizar amplificaciones superiores (400x o 1000x).
Examinar toda la superficie del pocillo.
Las células positivas muestran tinción amarillo-verdosa nuclear, polilobulada y homógenea.
Las células negativas no muestran tinción amarillo-verdosa nuclear alguna.
En raras ocasiones (menos del 5%) se producen lecturas equívocas ocasionadas por artefactos.
-
*
*
El artefacto más habitual es la tinción citoplásmica no específica, en ocasiones con espacios
negros. Generalmente la tinción aparece apagada y más amarillenta; se trata por lo general de
eosinófilos. En la mayor parte de los casos, los artefactos se pueden distinguir facilmente de las
células verdaderamente positivas debido a su diferente patrón de tinción.
Si todas las células aparecen verdosas, se trata de un artefacto (en muy raras ocasiones).
Una tinción tipicamente verdosa de las células situadas en la periferia del pocillo no se considera
positiva (en muy raras ocasiones).
Si los portas no pueden ser interpretados por causa de lecturas equívocas provocadas por
artefactos, teñir el porta de reserva. Si el problema continua, obtener y procesar una nueva
muestra.
En la figura 1 se muestra un resultado típico de células pp65 positivas obtenidas de una muestra de
paciente. Los resultados de controles positivos y negativos se muestran en las figuras 2 y 3
respectivamente.
Control de calidad
Las Láminas de control positivo y negativo se proporcionan con el kit. Las Láminas se utilizan
únicamente para comprobar el procedimiento de tinción y no influyen en el valor diagnóstico del kit. El
control positivo debe demostrar una tinción apropiada antes de que puedan ser evaluadas las
muestras de pacientes. El control positivo debería mostrar una tinción homogénea amarillo-verdosa
de células positivas con morfología redonda (de núcleo no visible). El control negativo no
debería mostrar tinción amarillo-verdosa. A pesar del hecho de que los procedimientos de calidad son
estrictamente seguidos, podrían observarse células positivas individuales en el control negativo. En
tales casos, la prueba de tinción no debería ser considerada inválida. Las células
positivas individuales en el control negativo no significan que la placa con el material del paciente no
pueda ser interpretada. Se debe controlar el proceso de preparación de las muestras, mediante la
utilización de los materiales de control adecuados (tal como se indica en I. Separación de los
leucocitos).
Resultados
Interpretación
Los resultados de la evaluación de las muestras de pacientes son cualitativos y deben ser informados
como positivos o negativos de acuerdo con las siguientes definiciones:
POSITIVO
duplicado.
Presencia de una o más células antígeno CMV positivas por tinción en
No se ha determinado el significado de la cantidad de células antígeno CMV positivas en una muestra
aislada o del incremento/descenso de las células positivas en pares de muestras.
NEGATIVO Ausencia de células antígeno positivas por tinción en duplicado.
Para considerar un resultado negativo deben estar presentes al menos 50.000 células.
Si se producen lecturas equívocas por artefactos en alguna de las tinciones en duplicado, interpretar los
resultados de la siguiente forma:
Positivo
una o más células antígeno CMV positivas en una de las tinciones por duplicado.
Tinción celular equívoca en el otro duplicado.
5
Negativo
ninguna célula CMV positiva en una de las tinciones por duplicado.
Tinción celular equívoca en el otro duplicado.
Si se producen lecturas equívocas por artefactos en ambas tinciones, no deben interpretarse los
resultados. Teñir el porta de reserva u obtener y procesar una nueva muestra.
Limitaciones del procedimiento
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
La detección de la proteína de matriz de bajo peso molecular pp65 del CMV debe ser llevada a cabo
por laboratorios con experiencia en técnicas inmunocitoquímicas.
La preparación de los leucocitos debe ser realizada en laboratorios con experiencia en técnicas
asépticas.
No se ha establecido la eficacia del CMV BriteTM Kit con muestras diferentes a los leucocitos de
sangre humana.
No se han establecido las prestaciones de la prueba con anticoagulantes diferentes a la heparina o
el EDTA.
El CMV BriteTM Kit ha sido diseñado para observación microscópica de la tición inmunofluorescente,
no para citometría de flujo.
Las características y el estado de la instrumentación utilizada influirán la apariencia de la imagen
obtenida. La reacción puede variar debido al tipo de microscopio empleado, la fuente de luz, la edad
de la lámpara, las características de los filtros, diferencias en la sensibilidad del substrato del
antígeno o en el procedimiento utilizado. Cada laboratorio deberá establecer sus propios criterios
para la lectura de las muestras de los pacientes, empleando los controles adecuados.
La detección y confirmación de la proteína de matriz de bajo peso molecular pp65, proteína
estructural temprana, en leucocitos de sangre periférica no asegura el diagnóstico de la enfermedad
sintomática, ya que el CMV puede estar presente durante un período significativo tras una infección
aguda y los pacientes con antigenemia CMV (especialmente en niveles bajos) pueden encontrarse
asintómaticos. En todos los trabajos publicados se presentan pacientes con antigenemia negativa y
viremia positiva; algunos de estos pacientes pueden padecer la enfermedad. Por tanto un resultado
negativo de antigenemia no excluye de forma absoluta la infección o enfermedad por
citomegalovirus.
El CMV BriteTM Kit no se ha diseñado para el seguimiento del tratamiento antiviral.
No se han establecido las prestaciones de la prueba con muestras de neonatos.
Se puede apreciar un descenso en el número de células antígeno-positivas por porta (en muestras
con heparina) trás un cierto tiempo de almacenamiento (15,16,17). Por tanto, siempre se deberá
intentar la preparación inmediata de los portas. No se ha establecido el tiempo máximo de
almacenamiento de las muestras a temperatura ambiente.
En pacientes con neutropenia severa (recuento absoluto de neutrófilos inferior a 200/mm3) pueden
requerirse al menos 10 ml. de sangre.
Para la preparación de los anticuerpos monoclonales se ha utilizado una cepa prototipo por tanto es
posible que no detecten la totalidad de los antígenos o nuevas cepas de CMV.
Es posible que los anticuerpos monoclonales no detecten cepas de CMV que hayan sufrido
variaciones menores en la secuencia de aminoácidos del epitopo.
Valores esperados
El CMV BriteTM ha sido evaluado en dos laboratorios de Virología Clínica separados geograficamente, en
centros relacionados con los transplantes de médula u órganos o con los pacientes de SIDA (20). Se
recogieron un total de 300 muestras de sangre de receptores de transplantes (159 de transplante
alogénico de médula y 47 de órgano), 85 pacientes de SIDA, HIV positivos y 9 pacientes
inmunocompetentes. 92 muestras (30.7 %) resultaron positivas con el CMV BriteTM. No se estableció la
prevalencia en una población asintomática con presencia de anticuerpos anti-CMV.
Especificaciones
Se comparó el CMV BriteTM con los sistemas de detección vírica por cultivo celular convencional (CC) o por
"shell vial" (SV) utilizando leucocitos de sangre períferica humana. Se evaluaron 300 muestras,
comparándolas con el cultivo convencional (CC) y con el "shell vial" (SV).
6
Comparación del CMV BriteTM con el CC y SV. (Laboratorio # 1)
CMV BriteTM
CC/SV
+
-
Total
+
3
0
3
-
45
103
148
Total
48
103
151
Comparación del CMV BriteTM con el CC y SV. (Laboratorio # 2)
CMV BriteTM
CC/SV
+
+
28
3
Total
31
-
16
102
118
Total
44
105
149
Comparación del CMV BriteTM con el CC y SV. (Combinación de los 2 laboratorios)
CMV BriteTM
CC/SV
+
-
Total
+
31
3
34
-
61
205
266
Total
92
208
300
Sensibilidad 31/34 = 91.2 % (95 % CI= 76.3 a 98.1 %)
Especificidad 205/266 = 77.1 % (95 % CI= 70.2 a 81.1)
La imprecisión del cultivo CMV (convencional y "shell vial") comparada con la antigenemia está
debidamente documentada (21). Las discrepancias observadas parecen deberse a la terapia antiviral o a
la variabilidad de las muestras (12). Asimismo, la detección de antigenemia CMV ha sido aceptada como
clara evidencia de infección activa por CMV, junto al cultivo en "shell vial" y al cultivo convencional
(4th International CMV Workshop, París, April 19-21, 1993).
Los resultados discrepantes fueron resueltos mediante la búsqueda de evidencia de infección en otras
localizaciones, por ejemplo, cultivos positivos en orina, garganta, lavado bronco-alveolar (BAL) o
revisando la historia clínica a la búsqueda de indicios de infección por CMV. Además, se obtuvo evidencia
de infección mediante estudios histológicos o cultivo de bipsias, y/o serología IgG o IgM (excepto en
pacientes con transplantes de médula o pacientes de SIDA), y/o ensayos de antigenemia CMV de
referencia (reactivos no comerciales, validados en el laboratorio).
7
Comparación del CMV BriteTM con otros métodos para detectar la infección por CMV.
(Laboratorio # 1)
Resultado esperado
+
Total
+
47
1
48
CMV BriteTM
6
97
103
Total
53
98
151
Comparación del CMV BriteTM con otros métodos para detectar la infección por CMV.
(Laboratorio # 2)
Resultado esperado
+
-
+
42
2
CMV BriteTM Test
3
102
Total
44
105
Total
45
104
149
Comparación del CMV BriteTM con otros métodos para detectar la infección por CMV.
(Los 2 laboratorios combinados)
Resultado esperado
+
89
Total
3
92
CMV BriteTM Test
+
9
199
208
Total
98
202
300
19 de los 64 resultados discrepantes fueron resueltos basándose en el ensayo de referencia para
antigenemia CMV en combinación con las pruebas serológicas.
Sensibilidad trás la resolución 89/98 = 90.8 % (95 % CI = 83.3 a 95.7 %)
Especificidad trás la resolución 199/202 = 98.5 % (95 % CI = 95.7 a 99.7 %)
Valor predictivo positivo 89/92 = 96.7 % (95 % CI = 90.8 a 99.3 %)
Valor predictivo negativo 199/208 = 95.7 % (95 % CI = 91.6 a 97.9 %)
8
Reactividad cruzada
Se han realizado estudios de reactividad cruzada empleando los reactivos del CMV BriteTM y aislamientos
víricos simples (excepto para el HSV-1, en el que se ensayaron 7 aislamientos) de virus relacionados con
el CMV, que producen una sintomatología similar y/o aislados de sangre periférica. A menos que se
indique otra cosa, se ensayaron aislamientos clínicos de los siguientes virus:
Herpes virus tipo 1
Herpes virus tipo 2
Varicela-zoster virus
Adenovirus 2
Adenovirus 4
Adenovirus 5
Parainfluenza virus 1
Parainfluenza virus 2
Parainfluenza virus 3
Virus respiratorio sincitial
Poliovirus 3 (tipo salvaje 3)
Echovirus 11
Echovirus 30
Epstein Barr virus (cepa de laboratorio P3HR1) *
Herpes virus humano tipo 6 (cepa de laboratorio GS) *
Virus de la inmunodeficiencia humana (tipo 1 en porta comercial para IF) **
*
**
National Institute of Public Health Environmental Protection, The Netherlands.
Virion, Switzerland
No se observó reactividad cruzada, excepto una reacción debilmente positiva en el ensayo "shell vial" con
seis de los siete aislamientos HSV-1. La tinción observada con el HSV-1 fué citoplásmica (se apreciaba
fuera del núcleo, en un número limitado de pequeños focos) similar al patrón de IF que se obtiene con
anticuerpos monoclonales frente al HSV-1. La débil tinción observada puede atribuirse a receptores Fc
expresados por las células infectadas con HSV-1 en el ensayo "shell vial". Análisis posteriores
demostraron la inexistencia de reacción cruzada entre el HSV y la prueba de antigenemia que utiliza la
combinación de monoclonales C10/C11.
Version 3
9
Bibliography
1.
Van Son. W.J. and The, T.H. (1989). Cytomegalovirus infection after organ transplantation: an
update with special emphasis on renal transplantation. Transpl. Int. 2, 147-164.
2.
The, T.H., Van der Bij, W., Van den Berg, A.P., Van der Giessen, M., Weits, J., Sprenger, H. and
Van Son, W.J. (1990). Cytomegalovirus antigenemia. Rev. Inf. Dis. 12, S737-744.
3.
Boeckh, M., Bowden, R.A., Goodrich, J.M., Pettinger, M., Meyers, J.D. (1992). Cytomegalovirus
antigen detection in peripheral blood leukocytes after allogeneic marrow transplantation. Blood 80,
1358 – 1364.
4.
Mazzulli, T., Rubin, R.H., Ferraro, M.J., D’Aquila, R.T., Doveikis, S.A., Smith, B.R., The, T.H. and
Hirsch, M.S. (1993). Cytomegalovirus antigenemia: clinical correlations in transplant recipients
and in persons with AIDS. J.Clin. Microbiology 31, 2824-2827.
5.
Van der Bij, W., Schirm, J., Torensma, R., Van Son, W.J., Tegzess, A.M., The, T.H. (1988)
Comparison between viremia and antigenemia for detection of cytomegalovirus in blood. J. Clin.
Microbiology 26, 2531 – 2535.
6.
Grefte, J.M.M., Van der Gun, B.T.F., Schmolke, S., Van der Giessen, M., Van Son, W.J. and The,
T.H. (1992). The lower matrix protein pp65 is the principal viral antigen present in peripheral
blood leukocytes during an active cytomegalovirus infection. J.Gen.Virol. 73, 2923-2932.
7.
Gerna, G., Revello, M.G., Percivalle, E., Zavattoni, M., Parea, M., Battaglia, M. (1990).
Quantification of human cytomegalovirus viremia by using monoclonal antibodies to different viral
proteins. J. Clin. Microbiology 28, 2681 – 2688.
8.
Revello, M.G., Percivalle, E., Di Matteo, A., Morini, F., Gerna, G. (1992). Nuclear expression of the
lower matrix protein of human cytomegalovirus in peripheral blood leukocytes of
immunocompromised viremic patients. J. Gen Virol 73, 437 – 442.
9.
Gerna, G., Revello, M.G., Percivalle, E., Morini, F. (1992). Comparison of different immunostaining
techniques and monoclonal antibodies to the lower matrix phosphoprotein (pp65) for optimal
quantitation of human cytomegalovirus antigenemia. J. Clin. Microbiology 30, 1232 – 1237.
10. Van den Berg, A.P., Van der Bij, W. Van Son, W.J., Anema, J., Van der Giessen, M., Schirm, J.,
Tegzess, A.M., The, T.H. (1989). Cytomegalovirus antigenemia as a useful marker of symptomatic
cytomegalovirus infection after renal transplantation: a report of 130 consecutive patients.
Transplantation 48, 991 – 995.
11. Van den Berg, A.P., Klompmaker, I.J., Haagsma, E.B., Scholten-Sampson, A., Bijleveld, C.M.A.,
Schirm, J., van der Giessen, M., Slooff, M.J.H., The, T.H. (1991). Antigenemia in the diagnosis and
monitoring of active cytomegalovirus infection after liver transplantation. J. Infect. Dis. 164, 265 –
270.
12. Gerna, G., Zipeto, D., Parea, M., Revello, M.G., Silini, E. Percivalle, E., Zavattoni, M., Milanesi, G.
(1991). Monitoring of human cytomegalovirus infections and ganciclovir treatment in heart
transplant recipients by determination of viremia antigenemia and DNAemia. J. Infect. Dis. 164,
488 – 498.
13. The, T.H., van der Ploeg, M., van der Berg, A.P., Vlieger, A.M., van der Giessen, M., van Son, W.J.
(1992). Direct detection of cytomegalovirus in peripheral blood leukocytes – a review of the
antigenemia assay and the polymerase chain reaction. Transplantation 54, 193 – 198.
14. Landry, M.L. and Ferguson D. (1993). Comparison of quantitative cytomegalovirus antigenemia
assay with culture methods and correlation with clinical disease. J.Clin.Microbiology 31, 28512856.
15. Boeckh, M., Woogerd, P.M., Stevens-Ayers, T., Ray, C.G., and Bowden, R.A. (1994). Factors
influencing detection of quantitative Cytomegalovirus antigenemia. J.Clin.Microbiology 32, 832834.
16. Landry, M.L., Ferguson D., Cohen, S., Huber, K., and Wetherill, P. (1995). Effect of delayed
specimen processing on Cytomegalovirus antigenemia test results. J.Clin.Microbiology 33, 257259.
17. Nìubò, J., Pérez, J.L., Carvajal, A., Ardanuy, C., and Martin, R. (1994). Effect of delayed
processing of blood samples on performance of cytomegalovirus antigenemia assay.
J.Clin.Microbiology 32, 1119-1120.
18. Gerna, G., Parea, M., Percivalle, E., Zipeto, D., Silini, E., Barbarini, G., and Milanesi, G. (1990).
Human cytomegalovirus viraemia in HIV-1 seropositive patients at various clinical stages of
infection. AIDS 4, 1027 – 1031.
10
19. Koskinen, P.K., Nieminen, M.S., Mattila, S.P., Häyry, P.J., and Lautenschlager, I.T. (1993). The
correlation between symptomatic CMV infection and CMV antigenemia in heart allograft recipients.
Transplantation, 55, 547-551.
20. Landry, M.L., Ferguson, D., Stevens-Ayers, T., De Jonge, M.W.A., and Boeckh, M. (1996).
Evaluation of CMV BriteTM Kit for detection of Cytomegalovirus pp65 antigenemia in peripheral
blood leukocytes by immunofluorescence. J.Clin. Microbiol. 34, 1337-1339.
21. Erice, A., Holm, M.A., Gill, P.C., Henry, S.A. et al (1992). Cytomegalovirus (CMV) antigenemia
assay is more sensitive than shell vial cultures rapid detection of CMV in polymorphonuclear blood
leukocytes. J. Clin. Microbiology 30, 2822-2825.
Version 3
11