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UNIVERSIDAD DE CHILE
Campus Sur
Instituto de
Nutrición y
Tecnología de
los Alimentos
Facultad de
Ciencias
Agronómicas
Facultad de
Ciencias
Forestales
Facultad de
Ciencias
Veterinarias y
Pecuarias
PROGRAMA DE DOCTORADO
EN CIENCIAS SILVOAGROPECUARIAS Y VETERINARIAS
“SELECCIÓN
SELECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN
CARACTERIZACIÓN DE CONSORCIO
CONSORCIOS
BACTERIANOS CON POTENCIALIDAD DE REMOVER CO2 Y
H2S EN UNA ATMÓSFERA DE BIOGÁS”
BIOGÁS
MADELAINE SOLANGE QUIROZ ESPINOZA
Tesis para optar al Grado Académico de
Doctor en Ciencias Silvoagropecuarias y
Veterinarias
PROFESOR GUÍA: DRA. MARGARITA CARÚ M.
SANTIAGO, CHILE
2013
PROGRAMA DE DOCTORADO
EN CIENCIAS SILVOAGROPECUARIAS Y VETERINARIAS
“SELECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE CONSORCIOS
BACTERIANOS CON POTENCIALIDAD DE REMOVER CO2 Y
H2S EN UNA ATMÓSFERA DE BIOGÁS”
MADELAINE SOLANGE QUIROZ ESPINOZA
Tesis para optar al Grado Académico de
Doctor en Ciencias Silvoagropecuarias y
Veterinarias
COMITÉ DE TESIS
Firma
Margarita Carú Marambio, Dra.
Julieta Orlando, Dra.
María Sol Morales Silva, Ph.D.
Jaime Montealegre Andrade, Prof.
Guillermo Figueroa Gronemeyer, Prof.
Número de registro
SANTIAGO, CHILE
2013
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a la profesora Margarita Carú por permitirme formar parte del laboratorio y por la
confianza depositada en mí y a la profesora María Teresa Varnero directora del proyecto que
origina esta tesis. También quisiera agradecer a todos mis compañeros de laboratorio por su
cariño y diversos momentos gratos que pasamos: Vale, Enrique, Diego, Marcos, Lía, July,
Lauri, Phillippi, Cami M., Merly y a mi amiga Cata por convertirse en un gran y sólido apoyo
en todo este proceso. También agradezco a Clary, Cami S., Mauro y Felipe F. que ya partieron
del laboratorio. También a Sandra y a Juanita por su alegría y por transformarse en el corazón
del laboratorio. Muchas gracias a todos por permitirme, no solo un enriquecimiento
intelectual, sino también como persona.
Quisiera agradecer también al profesor Mauricio Isaacs por su colaboración y excelente
disposición, también por darme la oportunidad de aprender y poner en práctica una
metodología que había estudiado solo en forma teórica y, sobre todo, porque a pesar de no
conseguir las determinaciones que buscaba, pude quedarme con la invaluable tranquilidad de
haber hecho todo lo que estaba a mi alcance para mejorar este trabajo.
Además, agradezco a mi familia por su apoyo y preocupación en distintos momentos y,
especialmente, a mi madre por su amor inconmesurable e incondicional que, con su ejemplo
de fortaleza y calma, fue una inspiración en los momentos difíciles. También agradezco a mi
padre porque en las primeras etapas de este proceso, me mostró la forma de otorgar la debida
importancia a diferentes acontecimientos y a reordenar mis prioridades, siempre con su estilo
empático, dulce y divertido.
Agradezco también a Susy, Naty, Felipe M., Ceci e Iván, considero que ha sido y es un regalo
tenerlos como amigos, sin duda las salidas a comer junto con las gratas y sinceras
conversaciones en distintos momentos, se constituyeron en un soporte fundamental en este
largo proceso de aprendizaje.
1
Esta Tesis se realizó en el laboratorio de Ecología Microbiana de la Facultad de Ciencias de la
Universidad de Chile. Fue financiada por el Proyecto FONDEF D07 I-1008 “Purificación de
biogás mediante procesos bacterianos”. Además, por la beca Doctorado en Chile y por la Beca
Término de Tesis Doctoral de la Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología (CONICYT).
2
RESUMEN
La búsqueda de alternativas al uso del petróleo ha generado un fuerte interés en el desarrollo
de energías no convencionales, como el biogás. En la actualidad se han implementado
métodos físicos y químicos para remover los principales contaminantes del biogás. Sin
embargo, también han surgido otros métodos de remoción de contaminantes que utilizan
procesos microbiológicos, como el uso de consorcios bacterianos. Estos procedimientos se
caracterizan por su robustez frente a fluctuaciones ambientales, mientras se mantiene su
función en el tiempo. En este trabajo se seleccionaron dos consorcios microbianos a partir de
seis muestras de lixiviados de un relleno sanitario, los cuales tienen potencialidad para
remover CO2 y H2S. La composición de los consorcios se determinó mediante la construcción
de genotecas del gen que codifica para el rRNA 16S y su evaluación en el tiempo mediante su
actividad y T-RFLP. Primero, fueron pre-seleccionaron los consorcios C4, C5 y C6 por
presentar menor acumulación de CO2 disuelto. Los resultados de las genotecas muestran que
el género Rhodopseudomonas sp., presentó altos valores de abundancia de 46,6%, 42,5%,
86,8% en C4, C5 y C6, respectivamente. Xanthobacter sp. 24,5 % y Castellaniella sp. 18,0 %
en C5 y Sphingobium sp. 39,2 % en C4. Posteriormente, C5 y C6 fueron seleccionados por
presentar mayor biomasa fotosintética 1,42 y 1,52 µg/ml y por remover entre 53,6 % y 68,6 %
de CO2 disuelto, respectivamente, comparado con el control sin inóculo. Así, las principales
diferencias entre consorcios se encontraron en el medio de cultivo. Finalmente, los resultados
de CO2 disuelto en el tiempo y los perfiles de T-RFLP indican que la actividad y estructura
genética de los consorcios seleccionados se mantiene estable durante el periodo de incubación.
Palabras clave: Procesos bacterianos, remoción CO2, genotecas, consorcios microbianos.
3
ABSTRACT
The search for alternatives to the use of petroleum has generated a strong interest in the
development of unconventional energies, including biogas. Currently, both physical and
chemical methods have been implemented to remove the main biogas pollutants. However,
other removal methods using microbial processes, such as bacterial consortia have also
emerged. These procedures are characterized by their resistance to environmental fluctuations;
while their function is maintained over time. In this work, two microbial consortia were
selected from six samples obtained from a landfill’s leachates; which have the potential
ability to remove CO2 and H2S. Consortia composition was determined by the construction of
clone libraries of the gene that codes for the 16S rRNA and by an evaluation over time of their
activity and T-RFLP profiles. First, consortia C4, C5 and C6 were pre-selected for presenting
lower dissolved CO2. The results from the clone libraries showed that Rhodopseudomonas sp.
presented the higher abundance levels, with 46.6 %, 42.5 %, 86.8 % in C4, C5 and C6,
respectively, followed by Xanthobacter sp. and Castellaniella sp., with 24.5 % and 18.0 % in
C5 and Sphingobium sp., with 39.2 % in C4. Then, C5 and C6 consortia were selected for
presenting a higher photosynthetic biomass of 1.42 and 1.52 µg/ml respectively and for
removing 53.6% and 68.6% of the CO2 dissolved with respect to the control without
inoculum. Therefore, the main differences between consortia were determined in the culture
medium. Finally, the results of the CO2 dissolved over time and the T-RFLP profiles indicate
that the activity and the genetic structure of the selected consortia are maintained stable during
the incubation period.
Key words: Bacterial processes, CO2 removal, clone libraries, microbial consortia.
4
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................................... 9
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .............................................................................................................................. 10
1-. Producción de biogás a partir del proceso de digestión anaeróbica ............................................................... 10
1.2- Principales componentes del biogás....................................................................................................... 12
2.- Remoción de contaminantes del biogás utilizando microorganismos específicos y/o lodos. ........................ 13
2.1- Remoción biológica de H2S .................................................................................................................... 13
2.2- Remoción biológica de CO2 .................................................................................................................... 13
2.3- Fijación de dióxido de carbono asociado a la formación de azufre elemental y/o sulfato................. 14
3- Comunidades microbianas .............................................................................................................................. 15
4.- Consorcios microbianos y extracción de CO2 y H2S del biogás .................................................................... 17
4.1- Consorcios microbianos ......................................................................................................................... 17
4.2- Caracterización molecular de consorcios microbianos ......................................................................... 19
HIPÓTESIS ............................................................................................................................................................ 21
OBJETIVO GENERAL .......................................................................................................................................... 21
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................................................................. 21
MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................................................... 22
1.- Origen de las muestras................................................................................................................................... 22
2.-Pre-selección de los consorcios ...................................................................................................................... 22
2.1- Aclimatación de las muestras y formulación del medio de cultivo ....................................................... 22
2.2- Evaluación de los requerimientos de los consorcios y estandarización del medio de cultivo .............. 23
2.3- Determinación del crecimiento y consumo de CO2 de los consorcios................................................... 24
3.- Evaluación de parámetros fisicoquímicos, de cultivo y selección de consorcios .......................................... 25
3.1- Composición del biogás .......................................................................................................................... 26
3.2- Concentración de CO2 disuelto y medición de pH ................................................................................. 26
3.3- Concentración de sulfato ........................................................................................................................ 26
3.4- Concentración de sulfuro total, tiosulfato y sulfito. .............................................................................. 27
3.5- Concentración de bicarbonato ............................................................................................................... 28
3.6- Determinación de proteína total y bacterioclorofila a .......................................................................... 28
4.- Caracterización molecular de los consorcios ................................................................................................. 29
4.1- Extracción del DNA................................................................................................................................ 29
4.2- Amplificación por PCR........................................................................................................................... 30
4.2.1- Amplificación por PCR de marcadores fotosintéticos. ....................................................................... 30
4.2.2- Amplificación por PCR del gen que codifica para el RNA ribosomal 16S (rDNA 16S) ................... 31
4.3- Determinación de la composición bacteriana de cada consorcio ......................................................... 32
4.3.1- Clonación y secuenciación .................................................................................................................. 32
4.3.2- Estimación de la cobertura de las genotecas ...................................................................................... 33
4.4- Evaluación del cultivo y estabilidad de la estructura genética de los consorcios seleccionados. ........ 34
4.4.1- Determinación de la curva de crecimiento y variables físico químicas ............................................. 34
4.4.2- Determinación de los perfiles de T-RFLP .......................................................................................... 35
RESULTADOS ...................................................................................................................................................... 37
5.- Pre-selección de los consorcios ..................................................................................................................... 37
5.1- Aclimatación de las muestras provenientes de lixiviados del relleno sanitario .................................... 37
5.2- Evaluación de la fuente de carbono y estandarización del medio de cultivo ........................................ 37
5.3- Determinación del crecimiento y consumo de CO2 de los consorcios................................................... 39
5.4- Evaluación de la presencia de la potencial función fotosintética anoxigénica en los consorcios
preseleccionados ............................................................................................................................................ 43
6.- Selección de los consorcios ........................................................................................................................... 44
6.1- Composición bacteriana en los inóculos de los consorcios C4, C5 y C6. ............................................. 44
6.1.1- Amplificación de DNA, clonación y análisis de RFLP ...................................................................... 44
6.1.2- Análisis de secuencias y porcentaje de representación ...................................................................... 46
6.1.3- Estimación de la cobertura de las genotecas ...................................................................................... 48
5
6.2- Determinación de la composición del gas y evaluación de propiedades fisiológicas para la selección
de consorcios .................................................................................................................................................. 48
7.- Evaluación de la estabilidad y estructura genética de los consorcios seleccionados en el tiempo ................ 53
7.1- Determinación del crecimiento y consumo de CO2 de los consorcios en el tiempo .............................. 53
7.2- Determinación de los perfiles de T-RFLP ............................................................................................. 62
7.2.1- Amplificación del DNA de los consorcios seleccionados. .................................................................. 62
7.2.2- Determinación de la estructura genética de los miembros del consorcio .......................................... 63
DISCUSIÓN ........................................................................................................................................................... 66
8.- Estandarización del medio de cultivo y pre-selección de los consorcios....................................................... 66
9.- Selección de consorcios, fijación de CO2 disuelto y remoción de H2S presente en el biogás ....................... 68
10.- Propiedades fisiológicas de los consorcios seleccionados: C5 y C6............................................................ 70
11.- Composición bacteriana y estabilidad genética de los consorcios seleccionados ........................................ 71
12.- Aplicación de los consorcios seleccionados a la remoción de los principales componentes del biogás y
otras posibles aplicaciones .................................................................................................................................. 75
CONCLUSIONES .................................................................................................................................................. 78
BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................................................... 79
CONGRESOS Y PUBLICACIÓN ......................................................................................................................... 89
APÉNDICE............................................................................................................................................................. 90
Tablas
Tabla 1. Composición del biogás……………………………….……………………………………….................6
Tabla 2. Microorganismos fijadores de CO2 que utilizan compuestos reducidos de S……………..….................10
Tabla 3. Condiciones de crecimiento de algunas bacterias fotosintéticas mesófilas que oxidan S…….................11
Tabla 4. Partidores usados para la amplificación del gen pufM y rDNA 16S de bacterias fotosintéticas
anoxigénicas……………………………………………………………………………………………………….27
Tabla 5. Partidores usados para la amplificación del gen ribosomal DNA 16S de bacterias…………………......27
Tabla 6. Evaluación del efecto de los factores, tipo de gas y fuente de carbono y su interacción, sobre el
crecimiento de los consorcios bacterianos al término del periodo de incubación (60 días)………….…...…........33
Tabla 7. Parámetros (A, µm y λ) obtenidos mediante el ajuste realizado con la curva de Gompertz modificada al
crecimiento de los consorcios medido como DO, en la etapa de pre-selección……...……………………........…36
Tabla 8. Comparación entre las distintas determinaciones de CO2 disuelto de los seis consorcios estudiados y el
control sin inóculo al final de un periodo de incubación de 21 días……………………………………..........…..37
Tabla 9. Pendientes (B) obtenidas mediante ajuste lineal de la curva de acumulación de CO2 de cada
consorcio…………………………………………………………………………………………………..…........39
Tabla 10. Ajuste de las curvas de rarefacción y del cálculo de cobertura para los consorcios C4, C5 y
C6…………………………………………………………………………………………………………..…..….44
Tabla 11. Determinaciones de la fase gaseosa y acuosa para la elección de C4, C5 y C6.….........................……45
Tabla 12. Relación entre S-H2S (ac) + S-HS- y S-SO42- en el medio de cultivo……………………………..….....48
6
Tabla 13. Parámetros (A, µm y λ) obtenidos mediante el ajuste realizado con la curva de Gompertz modificada, al
crecimiento medido como concentración de proteínas de los consorcios seleccionados para un periodo de
incubación de 13 días……………………………………………………………………………………………...50
Tabla 14. Parámetros (A, µm y λ) obtenidos mediante el ajuste realizado con la curva de Gompertz modificada, al
crecimiento medido como concentración de Bclo a de los consorcios seleccionados para un periodo de
incubación de 13 días…………………………………………………………………………………..……….....52
Tabla 15. Comparación del estado inicial y final de cada consorcio seleccionado, de las mediciones de CO2
disuelto en un periodo de incubación de 13 días…………………………………………………………….....….53
Tabla 16. Parámetros (B máx. y Kd) obtenidos mediante el ajuste realizado con la curva
hiperbólica……………………………………………………………………………………………………...….56
Tabla 17. Distribución de los principales TRFs en los inóculos (I5 e I6) de los consorcios C5 y
C6………………………………………………………………………………………….………………………61
Figuras
Figura 1. Esquema de la formación de los principales constituyentes del biogás mediante digestión anaeróbica de
material orgánico…………………………………………………………………………………………….….....7
Figura 2. Principales interacciones que involucran compuestos de C y S entre grupos microbianos en
sedimentos………………………………………………………………………...………………….……………12
Figura 3. Esquema de un ejemplo de consorcio microbiano……………….……………………….…….........…13
Figura 4. Tratamientos para evaluar la fuente de C, acetato de sodio, en una atmósfera de biogás o
CO2….………………………………………………………………………………………………………….….34
Figura 5. Curvas de crecimiento medidas como DO600 durante un periodo de incubación de 9 días a cada uno de
los consorcios. Barras corresponden a desviación estándar (A). Curvas de crecimiento obtenidas a partir de los
datos ajustados mediante la curva de Gompertz modificada (B)………………………………………….....……35
Figura 6. Curvas de CO2 disuelto determinado de los consorcios en un periodo de incubación de 21 días. Barras
indican desviación estándar…………………………………………………………………………...……..…….37
Figura 7. Rectas provenientes del ajuste lineal de los datos obtenidos a partir de las curvas de CO2 disuelto de la
Figura 6………………………………………………………………………………………………….……….38
Figura 8. Consorcios pre-seleccionados (C4, C5 y C6)……….………………………………………….............39
Figura 9. Producto de amplificación del gen PufM de las bacterias púrpuras del S y púrpuras no del
S……........................................................................................................................................................................40
Figura 10. Producto de amplificación del gen del rRNA 16S de bacterias a partir de DNA extraído desde
muestras de los consorcios C4, C5 y C6…………………………………….………………………....………….41
Figura 11. Composición de bacterias en inóculos de C4, C5 y C6………………………………….……………43
Figura 12. Consorcios seleccionados (C5 y C6)……………………………………………………….......……..49
7
Figura 13. Curvas de crecimiento de los consorcios seleccionados (C5 y C6) y el control sin inóculo, medidas
como concentración de proteínas (µg/ml) durante un periodo de incubación de 13 días…………….........……...50
Figura 14. Curvas de crecimiento medidas como concentración de bacterioclorofila a (Bclo a) (µg/ml) durante
un periodo de incubación de 13 días a los consorcios seleccionados (C5 y C6) y el control sin inóculo.
……………………………………………………………………………………………………………….…….51
Figura 15. Cinética de consumo de CO2 disuelto (CO2 (ac)) (ppm) de los consorcios (C5 y C6) y el control sin
inóculo.………………………………………………………………………………………………………...…..52
Figura 16. CO2 total (CO2 (ac) + HCO3-) en la fase acuosa (ppm) de los consorcios (C5, C6) y el control sin
inóculo……………………………………………………………………………………………………..……....54
Figura 17. Curva de pH medido durante un periodo de incubación de 13 días a los consorcios seleccionados (C5
y C6) y el control sin inóculo. ………………………………………………………………………………...………...….54
Figura 18. Cinética de remoción de CO2 experimental (%) de los consorcios seleccionados (C5 y C6) durante un
periodo de incubación de 13 días (A). Curvas de cinética de remoción obtenidas a partir de los datos ajustados de
la Figura 18A mediante la curva hiperbólica (B)……………………………………….………….....…………...56
Figura 19. Curva de sulfato (SO42-) (ppm) medido durante un periodo de incubación de 13 días a los consorcios
seleccionados (C5 y C6) y el control sin inóculo (A). Curva de S-SO42- calculado a partir de la concentración de
SO42- en el medio de cultivo durante el periodo de incubación de 13 días a los consorcios seleccionados (C5 y
C6) y el control sin inóculo.
: indica estimación de la concentración de sulfuro (0,088 mM) en el medio de
cultivo al inicio del ensayo (B)………………………………………………………………....………………....57
Figura 20. Producto de amplificación purificado de muestras de C5 y C6 durante un periodo de incubación de 13
días, para el análisis de T-RFLP………………………………………………………………....……….………..58
Figura 21. Frecuencias relativas de TRFs de los consorcios C5 y C6 (expresadas como porcentaje relativo de
fluorescencia, % UF) obtenidos por digestión con la enzima de restricción Alu I, para el gen de rRNA 16S de
bacterias, en un periodo de incubación de 13 días……………………………………….…......…………………60
8
INTRODUCCIÓN
El aumento en el consumo de energía a nivel mundial, de las emisiones de gases de efecto
invernadero hacia la atmósfera y la dependencia de las importaciones de combustibles fósiles,
han determinado cambios en el tipo de energías que se usarán en los próximos años. Debido a
lo anterior y acentuado por la crisis energética, en Chile se estableció que se incentivará el
desarrollo de las energías renovables no convencionales (ERNC) para asegurar el suministro
energético, la diversificación de la matriz energética nacional y la sustentabilidad ambiental.
La producción de biogás, desde la digestión anaeróbica de la materia orgánica, se considera
como un tipo de ERNC, cuyas principales fuentes de generación corresponden a plantas de
tratamiento de aguas residuales, rellenos sanitarios y digestores de pequeña, mediana y gran
escala.
Una vez producido el biogás no puede utilizarse directamente, ya que presenta compuestos
contaminantes, que deben extraerse mediante un proceso de purificación, éstos son: dióxido de
carbono (CO2) y sulfuro de hidrógeno (H2S) el primero disminuye el poder calorífico de la
mezcla gaseosa y el segundo tiene efectos adversos tanto en la salud como en el ambiente. La
eliminación de ambos contaminantes aumentaría la combustibilidad del biogás y, podría
utilizarse en forma productiva en diferentes aplicaciones domésticas e industriales.
Actualmente, el proceso de extracción de CO2 y H2S del biogás, se realiza mediante métodos
físicos y químicos, como adsorción, filtración por membranas y absorción respectivamente.
Estos métodos presentan altos costos, elevado consumo de energía y, además, generan
residuos químicos y liberan a la atmósfera sub productos como CO2 y dióxido de azufre (SO2).
Por lo anterior, se ha dado importancia a la extracción de CO2 y H2S mediante procesos
microbiológicos, como el uso de H2S por parte de microorganismos y la fijación de CO2 en su
biomasa como una alternativa eficiente y económica para mejorar la calidad del biogás.
9
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1-. Producción de biogás a partir del proceso de digestión anaeróbica
El biogás corresponde a una mezcla gaseosa que se produce mediante el proceso de digestión
anaeróbica, en el cual compuestos orgánicos son degradados en ausencia de oxígeno (Noyola
et al., 2006), por distintos grupos de microorganismos.
Esta mezcla gaseosa está compuesta mayoritariamente por metano (CH4) y dióxido de carbono
(CO2), más otros compuestos como nitrógeno (N2), hidrógeno (H2), sulfuro de hidrógeno
(H2S), amoniaco (NH3) y gases traza que, usualmente, constituyen menos del 1 % del volumen
total (Tabla 1) (Angelidaki et al., 2003).
Tabla 1. Composición del biogás
Tipo de gas
Tipo de biogás
Aguas residuales
Metano (CH4)
65-75 %
Anhídrido carbónico (CO2)
20-35 %
Hidrógeno (H2)
Trazas
Nitrógeno (N2)
3,4 %
Oxígeno (O2)
0,5 %
Sulfuro de hidrógeno (H2S)
< 0,5 %
Fuente: Deublein y Steinhauser, 2008.
Silvoagropecuario
45-75 %
25-55 %
0,5 %
0,01 – 5 %
0,01 – 2 %
< 2%
Relleno sanitario
45 – 55 %
25 – 30 %
Trazas
10 – 25 %
1–5%
< 0,5 %
La composición del biogás varía de acuerdo a la materia prima a partir de la cual se genera, lo
cual determinará el poder calorífico que presente, que generalmente está en el rango de 4700 a
5500 Kcal/m3 dependiendo de la proporción de CH4 que contenga el biogás (Weiland, 2010).
La producción microbiológica del biogás es un proceso que involucra varias etapas: hidrólisis,
fermentación, acetogénesis y metanogénesis (Figura 1), en la cual participan diversos grupos
microbianos que actúan en forma conjunta y sintrófica (Madigan et al., 2006; Weiland, 2010).
En la etapa de hidrólisis ocurre una degradación de compuestos carbonados de alto peso
molecular a componentes monoméricos más solubles, mediante enzimas hidrolíticas
extracelulares sintetizadas por bacterias fermentativas anaeróbicas obligadas y facultativas
(Klass, 1984).
10
En la etapa de fermentación los compuestos solubles producidos en la etapa anterior se
degradan, mediante bacterias anaeróbicas obligadas y facultativas. Durante la fermentación se
generan distintos productos (Gerardi, 2006) como ácidos orgánicos (ácido butírico, ácido
propiónico, ácido acético), alcoholes, H2 y CO2 (O’ Flaherty et al., 2006). Los cuales son
utilizados como sustratos por otros microorganismos.
Figura 1. Esquema de la formación de los principales constituyentes del biogás, mediante digestión
anaeróbica de material orgánico. 1. Bacterias hidrolíticas, 2. Bacterias fermentadoras, 3. Bacterias
acetogénicas, 4. Metanógenos, 5. Reductoras de sulfato. AGVs: ácidos grasos volátiles (ácido butírico,
ácido propiónico, ácido acético) (Gerardi, 2006; Madigan et al., 2006, modificado).
Finalmente, productos como acetato, H2 y CO2 son utilizados por arqueas metanogénicas,
mientras que otros productos como alcoholes y ácidos grasos volátiles (AGVs) son oxidados
por bacterias acetogénicas que establecen relaciones sintróficas con los microorganismos
metanogénicos (etapa de acetogénesis) (Klass, 1984; O’ Flaherty et al., 2006).
En la etapa metanogénica los productos de la fermentación como acetato, H2 y CO2 son
convertidos en CH4 por metanógenos anaeróbicos obligados (Bryant, 1979; Klass, 1984). En
general, de acuerdo al tipo de sustrato que metabolizan, los microorganismos metanogénicos
se dividen en: metanógenos hidrogenotróficos y metanógenos acetotróficos, los primeros
11
forman CH4 a partir de H2 y CO2; y los segundos, forman CH4 desde la descarboxilación de
acetato (Demirel y Scherer, 2008).
Por otra parte, el H2S presente en el biogás puede formarse como producto de la fermentación
de aminoácidos como metionina y cisteína. Pero, en presencia de SO42-, el H2S, se genera
como producto de la reducción de sulfato, en donde intervienen compuestos orgánicos
solubles como AGVs (ácido propiónico, ácido butírico) oxidándose completamente a CO2, o
bien, pueden degradarse en forma incompleta a acetato y H2S (Madigan et al., 2006) (Figura
1).
1.2- Principales componentes del biogás
En el biogás el CH4 y CO2 son considerados los principales componentes por su alta
proporción, el primero otorga la propiedad combustible y el segundo baja el poder calorífico,
disminuyendo la calidad del biogás (Jensen y Webb, 1995).
El H2S se encuentra en baja proporción (0-0,3 % o más) respecto al CH4 y el CO2 pero es
altamente tóxico para la salud humana, genera malos olores, tiene efecto corrosivo y, además,
es fuente de emisiones de SO2 a la atmósfera (Jensen y Webb, 1995; Soreanu et al., 2005;
Syed et al., 2006; Panza y Belgiorno, 2010).
Por lo tanto, el CO2 y H2S son considerados contaminantes principales del biogás y, en el caso
de este último, se han realizados diversos estudios para extraerlo mediante procesos
bacterianos utilizando cepas específicas (Jensen y Webb, 1995; Henshaw y Zhu, 2001;
Ramírez et al., 2009).
12
2.- Remoción de contaminantes del biogás utilizando microorganismos específicos y/o
lodos.
2.1- Remoción biológica de H2S
La remoción biológica del H2S, en relación a la purificación del biogás, ha sido uno de los
procesos más estudiados, ya sea utilizando microorganismos fotoautótrofos o quimiolitotrofos
(Jensen y Webb, 1995; Henshaw y Zhu, 2001; Tang et al., 2009); y se basa en la oxidación de
H2S a compuestos de azufre de fácil eliminación, como azufre elemental (Sº) o sulfatos (SO42-)
(Soreanu et al., 2005).
Los principales géneros fotoautótrofos estudiados corresponden a Chlorobium y Chromatium.
Respecto
a
los
géneros
quimiolitotrofos
destacan
Xanthomonas,
Thiomicrospira,
Achromoatium, Acidithiobacillus y, especialmente, Thiobacillus (Jensen y Webb, 1995;
Kleerebezem y Méndez, 2002; Ramirez et al., 2009; Tang et al., 2009).
2.2- Remoción biológica de CO2
Si bien se han descrito diversos grupos microbianos capaces de fijar CO2 en condiciones
anaeróbicas o microaerófilas, existe escasa información sobre su aplicación al proceso de
purificación del biogás. Las estrategias para reducir el CO2 se han basado en favorecer la
última etapa de la metanogénesis, por ejemplo agregando distintas relaciones de H2/CO2 a
cultivos
de
Methanobacterium
thermoautotrophicum,
un
arqueón
metanógenico
hidrogenotrófico que utiliza CO2 e H2 para producir CH4 (Strevett et al., 1995). Otros estudios
favorecen la producción de hidrógeno por adición de ácidos grasos a inóculos provenientes de
lodos de digestores anaeróbicos y de esta forma favorecer la transformación de CO2 a CH4,
realizada por metanógenos hidrogenotróficos presentes en el lodo, aumentando así la
proporción de CH4 y disminuyendo la de CO2 en el gas de salida del sistema (Alimahmoodi y
Mulligan, 2008).
Sin embargo, no se ha encontrado información sobre reducción de CO2 en el biogás mediante
selección de microorganismos autotrofos anaeróbicos o microaerófilos que fijen el CO2 y lo
13
transformen en biomasa microbiana, aun cuando existen distintas vías de fijación de CO2
ampliamente distribuidas en la microbiota (Thauer, 2007).
2.3- Fijación de dióxido de carbono asociado a la formación de azufre elemental y/o
sulfato
En condiciones anaeróbicas y en presencia de luz, algunos fotoautótrofos como las bacterias
verdes del azufre (BVA), tales como Chlorobium y bacterias púrpuras del azufre (S) como
Allocromatium llevan a cabo la fijación de CO2 asociada a la oxidación de H2S en un proceso
conocido como fotosíntesis anoxigénica (Madigan et al., 2006). En estos casos el CO2 es
fijado en la biomasa celular y el Sº es depositado en forma de gránulos en el exterior e interior
de la célula y/o puede, posteriormente, oxidarse a SO42- (Syed et al., 2006).
En las BVA la fijación de CO2 ocurre a través del ciclo inverso de los ácidos tricarboxílicos,
con consumo de energía (Madigan et al., 2006; Falkowski et al., 2008). En este caso, las
enzimas catalizan reacciones que invierten la dirección del ciclo oxidativo normal (Madigan et
al., 2006). En el caso de las bacterias púrpuras del S y púrpuras no del S, la fijación del CO2
ocurre a través del ciclo de Calvin, en el cual se utiliza fosfoglicerato y CO2 generando
intermediarios de la glicólisis, que pueden usarse para biosíntesis celular (Madigan et al.,
2006). Otros microorganismos que pueden fijar CO2 y utilizar como dadores de electrones
compuestos reducidos de S se indican en la Tabla 2.
Tabla 2. Microorganismos fijadores de CO2 que utilizan compuestos reducidos de S.
Género
Chlorobium
Paracoccus
Rhodobacter
Thiobacillus
Thiomonas
Allochromatium
Beggiatoa
Thioploca
Acidithiobacillus
Thiomicrospira
Fototrofía
Quimiotrofía
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Oxidación de
H2S
S4O6
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
(+) Presencia; (-) Ausencia (Zehnder, 1988).
14
Producto
S2O32-
4-
Sº
SO42SO42SO42SO42SO42SO42SO42SO42SO42SO42-
El proceso de fijación de CO2 fototrófica está descrito por la reacción de fotosíntesis de van
Niel:
hv
2n H2S + n CO2
2n Sº + n (CH2O) + n H2O
Pero también puede ocurrir la reacción con acumulación de sulfato:
hv
n H2S + 2n CO2 + 2n H2O
n H2SO4 + 2n (CH2O)
Las bacterias fotoautótrofas anoxigénicas son en general mesófilas que crecen a pH cercano a
la neutralidad y, además, pueden presentar metabolismo fotoheterotrófico (Tabla 3).
Tabla 3. Condiciones de crecimiento de algunas bacterias fotosintéticas mesófilas que
oxidan S.
Especies
Chlorobium limícola
Chlorobium tepidum
Allochromatium vinosum
Rhodospirilum rubrum
Rhodopseudomonas palustris
pH
6,5 - 7,0
6,8 - 7,0
6,5 - 7,6
6,8 - 7,0
Temperatura (ºC)
25 - 35
47 - 48
25 - 35
30 - 35
6,9
30 -37
Fuente de carbono
CO2
CO2, acetato
CO2
Acetato, lactato,
malato, arginato,
butirato, propionato
CO2, lactato, malato,
benzoato, acetato,
butirato, succinato
Tang et al., 2009.
3- Comunidades microbianas
Las comunidades microbianas son ensambles de microorganismos de distintas especies que
comparten un espacio y un tiempo donde establecen diversas interacciones entre ellos. Las
comunidades más complejas se encuentran en el suelo, sedimentos y en la interfase agua:
sedimento, estas últimas se caracterizan por la presencia de bacterias fototróficas que habitan
la
región
oxigenada
y
que
interactúan
con
microorganismos
heterótrofos
y
quimiolitoautotrofos, cuya distribución temporal y espacial está determinada por gradientes
químicos y patrones de zonificación (Figura 2) (Fenchel y Bland, 1995).
15
Las bacterias fototróficas se encuentran en numerosos hábitats como suelos, ambientes
marinos, lacustres, aguas estancadas, estableciendo distintos tipos de interacciones con otros
microorganismos, por ejemplo bacterias reductoras de sulfato con las cuales interactúan
estrechamente, puesto que éstas últimas generan H2S como producto metabólico de la
reducción de sulfato (Fenchel y Bland, 1995; Madigan et al., 2006), el cual es usado como
dador de electrones en el proceso fotosintético anoxigénico (Madigan et al., 2006). Otro tipo
de interacción puede establecerse con fermentadores que producen ácidos grasos volátiles
(Figura 2).
Luz
agua
O2
HS-
0 mm
[CH2O]
Zona
óxica
Algas y
cianobacterias
Heterótrofos
aeróbicos
1,5 mm
Zona
anóxica
3,0 mm
4,5 mm
O2
quimiolitotrofos
bacterias del S
Bacterias
fototróficas del S
Fermentadores
Acetato, H2,
etc.
Sº, SO42-
FeS
HS-
Reductores de
sulfato
Figura 2. Principales interacciones que involucran compuestos de C y S entre grupos microbianos en
sedimentos. Los procesos microbianos están determinados verticalmente por la intensidad de la luz y
los gradientes de O2 y HS- establecidos (Fenchel y Bland, 1995, modificado).
En la zona óxica se encuentran bacterias fototróficas oxigénicas mientras en el zona anóxica se
encuentran las bacterias fototróficas anoxigénicas (por ejemplo, bacterias púrpuras y verdes
del S) las cuales participan en la oxidación del sulfuro (S2-), ya que mediante el proceso de
fotosíntesis utilizan S2- o Sº como dador de electrones y producen Sº o SO42-, respectivamente,
fijando CO2 (Madigan et al., 2006). Por otra parte, las bacterias púrpuras no del S, con mayor
versatilidad metabólica, realizan fotosíntesis utilizando H2, ácidos orgánicos (por ejemplo,
16
acetato), Fe2+ o S2- como dador de electrones y, en oscuridad, realizan respiración en
ambientes microaerófilos (Fenchel y Bland, 1995; Carlozzi et al., 2006). Si bien es cierto que
no forman florecimientos rojizos en el agua como las bacterias púrpuras del S, se encuentran
omnipresentes en este tipo de comunidades (Fenchel y Bland, 1995; Madigan et al., 2006).
4.- Consorcios microbianos y extracción de CO2 y H2S del biogás
4.1- Consorcios microbianos
Los consorcios o ensambles microbianos corresponden a agrupaciones de microorganismos
que coexisten e interactúan, pudiendo estar constituidos a partir de dos o más especies hasta
comunidades complejas (Zuroff y Curtis, 2012), estableciéndose una interdependencia
funcional entre ellos, en la que productos generados por algunos microorganismos proveen de
sustrato o un ambiente químico a otros microorganismos vecinos de especies diferentes que
también forman parte del consorcio (Figura 3) (Fenchel y Bland, 1995; Brenner et al., 2008).
S
X1
X2
P
Figura 3. Esquema de un ejemplo de consorcio microbiano. La generación de un producto (P) puede
requerir múltiples etapas para realizar la transformación del sustrato (S), a través de síntesis
secuenciales de intermediarios (X1, X2). Cada población se especializa en una etapa (Brenner et al.,
2008, modificado).
Estos ensambles microbianos se encuentran en diversos hábitats como sedimentos, suelo,
subsuelo, rumen de mamíferos herbívoros, tracto digestivo de termitas, aguas naturales,
sedimentos marinos, o bien, en sistemas de ingeniería como digestores anaeróbicos, rellenos
17
sanitarios y plantas de tratamiento de aguas residuales (Fenchel y Bland, 1995; Overmann y
Schubert, 2002; Noyola et al., 2006).
Se han descrito distintos tipos de consorcios, aquellos que presentan estructuras altamente
ordenadas, por ejemplo, bacterias verdes (Chlorochromatium aggregatum) o café
(Pelochromatium roseum) que rodean a bacterias heterotróficas no coloreadas las cuales
establecen una interacción mutualista (Overmann y Schubert, 2002) o consorcios constituidos
por poblaciones mixtas, en donde los miembros del consorcio actúan en forma secuencial, esto
es, un tipo de microorganismo degrada una variedad de polímeros, cuyos monómeros, se
utilizan como sustratos por otros microorganismos (O’ Flaherty et al., 2006). Es el caso de
asociaciones sintróficas entre microorganismos fermentadores, acetogénicos y metanogénicos
(Figura 1) (Overmann y Schubert, 2002; Madigan et al., 2006) o bacterias reductoras de
sulfato y bacterias verdes del S o púrpuras del S (Fenchel y Bland, 1995).
No obstante, independientemente de la distribución espacial y temporal que presente el
consorcio, su principal característica es que los miembros interactúan y cada uno realiza
funciones específicas, que aportan a la funcionalidad global del mismo (Brenner et al., 2008).
Un aspecto esencial que caracteriza a este tipo de relaciones microbianas, es que presentan
mayor robustez frente a fluctuaciones ambientales que poblaciones constituidas por un solo
tipo de microorganismo, otorgando así, estabilidad en el tiempo a los miembros del consorcio
(Brenner et al., 2008). Debido a esta característica y a la capacidad de realizar funciones
complejas, los consorcios microbianos se han transformado en entidades con atractivas
aplicaciones industriales y ambientales. Por ejemplo, remediación de suelos contaminados con
compuestos orgánicos recalcitrantes (Cunliffe y Kertesz, 2006; Chi et al., 2013), degradación
de residuos orgánicos (Sarkar et al., 2011), producción de bioenergía (Kleerebezem y van
Loosdrecht, 2007; Zuroff y Curtis, 2012), entre otras.
Una manera de obtener consorcios microbianos que remuevan los contaminantes del biogás,
es mediante una técnica de enriquecimiento de cultivo que consiste en la aplicación de una
18
presión de selección que favorece el crecimiento de microorganismos que poseen las
funciones metabólicas buscadas, como consumo de CO2 y H2S.
Como se mencionó previamente distintos tipos de microorganismos son capaces de realizar
fijación de CO2 y oxidación de H2S como parte de su metabolismo. Ellos forman parte de la
microbiota de hábitats naturales (Syed et al., 2006; Thauer, 2007) y de sistemas industriales
como plantas de tratamiento de aguas residuales o rellenos sanitarios (Zuroff y Curtis, 2012),
en estos últimos es posible encontrar microorganismos que además de ser autotróficos sean
capaces de tolerar la concentración de CH4 presente en el biogás.
4.2- Caracterización molecular de consorcios microbianos
Hasta ahora se ha descrito que sólo el 1% de la fracción viable de la microbiota es cultivable
como aislado puro, esta dificultad es en parte debida al desconocimiento en las necesidades
nutricionales de cada uno de los componentes microbiológicos que hacen difícil el cultivo de
la mayoría de los microorganismos de manera independiente, pero además porque se supone
que muchas veces se establecen interacciones biológicas obligadas en los consorcios
microbianos (Dunbar et al., 1997). Por otra parte, la selección de consorcios y su cultivo como
ensamble preserva la interdependencia funcional de los miembros que han sido seleccionados
para llevar a cabo una función. Los medios de cultivo, generalmente, producen nuevas
condiciones selectivas para el crecimiento de los miembros del consorcio, desarrollándose así
una nueva estructura de la comunidad distinta a la original (Dunbar et al., 1997).
Actualmente, métodos moleculares basados en PCR se han desarrollado para caracterizar estas
comunidades en forma independiente de cultivo y; aunque estos métodos presentan sus
propias limitaciones y sesgos, son complementarios a los métodos de cultivo tradicionales
(Singh et al., 2006), permitiendo dejar al descubierto una parte de la diversidad de
microorganismos existentes que, en la mayoría de los casos, no han sido cultivados (Thies,
2007). La mayoría de las aproximaciones experimentales independientes de cultivo se basan
en el análisis de ácidos nucleicos y se han convertido en herramientas útiles en la
caracterización de la diversidad microbiana, entre ellas están los perfiles de T-RFLP (Terminal
Restriction Fragment Length Polymorphism) (Liu et al., 1997).
19
El T-RFLP está basado en la amplificación por PCR de un marcador molecular como el gen
que codifica para el RNA ribosomal 16S (marcador rDNA 16S), usando uno de los partidores
marcado en su extremo 5’ con una molécula fluorescente. El producto amplificado y marcado
en uno de sus extremos, luego, es digerido con enzimas de restricción (Singh et al., 2006;
Thies, 2007). Posteriormente, los fragmentos de restricción terminales, obtenidos desde el
DNA digerido (TRFs), son separados por electroforesis capilar, generando un perfil de
fragmentos característico de cada comunidad (Thies, 2007).
Los perfiles de T-RFLP proporcionan datos cuantitativos sobre cada TRF detectado,
incluyendo tamaño en pares de bases e intensidad de fluorescencia de éste. De acuerdo a lo
anterior, entonces, se puede determinar el número de TRFs (riqueza de la comunidad) y la
distribución cuantitativa de cada uno de ellos dentro de cada perfil (abundancia de cada TRF)
(Singh et al., 2006).
Para conocer la composición de los tipos bacterianos presentes en los consorcios, una
aproximación experimental es la construcción de una genoteca o librería de genes que
represente la comunidad. Entre los marcadores genéticos más ampliamente usados para estos
propósitos está el gen que codifica para la subunidad menor del ribosoma (RNA 16S). Este
gen presenta ventajas sobre otros marcadores moleculares dada su ubicuidad en todas las
especies donde cumple la mismas función (Weisburg, et al., 1991). La amplificación del
marcador molecular rDNA 16S de bacterias requiere de partidores universales, luego los
amplicones obtenidos se individualizan por clonación y, posteriormente, se secuencian los
insertos; estas secuencias se comparan con aquellas presentes en bases de datos, pudiendo
asociarlas con los tipos bacterianos previamente descritos (Sambrook y Russell, 2001).
Considerando que existen diversos grupos bacterianos que poseen la capacidad metabólica
para fijar CO2 y oxidar H2S en condiciones anaeróbicas y/o microaerofílicas, y que estos
microorganismos se han descrito en numerosos hábitats, el objetivo de esta tesis fue
seleccionar y caracterizar fisiológica y genéticamente, al menos, un consorcio microbiano con
la potencialidad de reducir el CO2 y oxidar el H2S presente en el biogás.
20
HIPÓTESIS
Dado que en la naturaleza existen microorganismos anaeróbicos y microaerófilos
capaces de fijar CO2 y remover H2S, entonces es posible aclimatar y seleccionar un
consorcio microbiano que posea potencialmente esta función, el cual se podría utilizar
en procesos de reducción de contaminantes del biogás.
OBJETIVO GENERAL
Seleccionar y caracterizar un consorcio bacteriano con la potencialidad de fijar CO2 y
remover H2S en una atmósfera de biogás.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Pre-seleccionar consorcios bacterianos, a partir de muestras ambientales, que
potencialmente remuevan H2S y CO2 presente en el biogás.
•
Caracterizar la composición de los consorcios bacterianos.
•
Seleccionar y evaluar la capacidad de consumo de CO2 y utilización de H2S de los
consorcios pre-seleccionados, en presencia de biogás.
•
Evaluar el comportamiento del o los consorcio(s) en el tiempo mediante monitoreo
de su actividad y estructura genética.
21
MATERIALES Y MÉTODOS
1.- Origen de las muestras
Para la selección de los consorcios microbianos se utilizaron como fuente de
microorganismos, lixiviados provenientes del interior de seis pozos del ex relleno sanitario
Lepanto, localizado en la Región Metropolitana, ciudad de Santiago, comuna de San
Bernardo. Este relleno sanitario inicio el proceso de cierre en el año 2002, fecha a partir de la
cual comenzó el cese del depósito de residuos.
Cada una de las seis muestras de lixiviado se obtuvieron mediante extracción directa desde
cada pozo. Adicionalmente, de acuerdo a la bibliografía, en el proceso de digestión anaeróbica
que ocurre en los lixiviados del relleno sanitario, se encuentran microorganismos que podrían
llevar a cabo la fijación de CO2 y oxidación de H2S (dador de electrones), dado que la mayor
parte de la fracción lábil de la materia orgánica habría sido degradada por tratarse de un
relleno sanitario antiguo y en proceso de cierre. Asimismo, estos microorganismos serían
resistentes a altas concentraciones de CH4 presentes en el biogás.
2.-Pre-selección de los consorcios
2.1- Aclimatación de las muestras y formulación del medio de cultivo
La estrategia de pre-selección se realizó aclimatando los microorganismos de interés al medio
de selección (medio salino v1.0), para lo cual se incubaron 0,2 ml de las muestras de
lixiviados con 10 ml de medio salino v1.0 (2 % de inóculo) en presencia de luz, 25 ºC y en una
atmósfera de CO2 durante 90 días; renovándose la fase gaseosa cada tres días.
El medio de cultivo salino v1.0 para esta etapa de aclimatación, tuvo la siguiente formulación:
0,2 mM MgSO4 · 7H2O, 0,1 mM CaCl2 · 2 H2O, 0,02 mM NaEDTA, 10 mM NH4Cl, 1,5 mg/L
FeSO4 · 7H2O, 5 mM buffer fosfato de potasio, 1 ml/L de una solución stock de vitaminas (ver
apéndice Tabla A1), 1ml/L de una solución de micronutrientes (ver apéndice Tabla A2).
Todos estos componentes constituyeron el medio salino base al cual se agregó 1 mM de Na2S,
2 g/L NaHCO3 y 50 µg/L vitamina B12.
22
2.2- Evaluación de los requerimientos de los consorcios y estandarización del medio de
cultivo
Para determinar los requerimientos de los consorcios se evaluó la adición de acetato de sodio
al medio de cultivo salino v2.0 como una potencial fuente de carbono o dador de electrones en
un metabolismo fotoanoxigénico. Para ello se diseñó un experimento factorial de 2 x 2, en el
cual cada consorcio (0,2 ml) se incubó con 10 ml de medio salino v2.0 en presencia de luz, 25
ºC durante 60 días. Bajo estas condiciones de cultivo se constituyeron cuatro tratamientos
donde: tratamiento 1 (T1) = atmósfera de biogás y 10 mM de acetato de sodio, tratamiento 2
(T2) = atmósfera de CO2 y 10 mM de acetato de sodio, tratamiento 3 (T3) = atmósfera de
biogás y ausencia de acetato de sodio y, finalmente, tratamiento 4 (T4) = atmósfera de CO2 y
ausencia de acetato de sodio. Tanto el biogás como el CO2 se burbujearon en los tratamientos
respectivos, en un volumen cinco veces mayor que la unidad experimental de 25 ml. El
crecimiento bacteriano se midió como densidad óptica a 600 nm (DO600) en un
espectrofotómetro Spectronic 21, al término del periodo de incubación (60 días). Como blanco
se utilizó medio de cultivo salino sin inóculo v2.0, cuya DO600 fue restada a la DO600 medida
en cada uno de los tratamientos.
En esta etapa, la formulación del medio de cultivo v2.0 fue la siguiente: medio salino v1.0, al
cual se agregó 50 µg/L vitamina B12 y se eliminó de la formulación el Na2S y NaHCO3. La
composición del biogás fue: 59 % CH4, 37 % de CO2, 0,9 % de O2 y 925 ppm H2S; de esta
manera la única fuente de sulfuro provino del biogás en aquellos tratamientos que lo contenían
como parte de su fase gaseosa.
El diseño experimental fue completamente aleatorizado (DCA) con estructura factorial 2 x 2,
donde el primer factor correspondió a la fuente de carbono con dos niveles: presencia o
ausencia de acetato de sodio y el segundo factor correspondió al tipo de gas utilizado con dos
niveles: CO2 y biogás, constituyéndose cuatro tratamientos con dos repeticiones. La unidad
experimental correspondió a una botella serológica de 25 ml con sello de aluminio y tapón de
goma.
23
Una vez comprobados los supuestos de homogeneidad de varianzas y distribución normal de
los residuos, los datos fueron analizados mediante análisis de varianza o ANDEVA (P ≤ 0,05)
para evaluar si existía diferencia entre los distintos tratamientos y si esta diferencia era
afectada por la fuente de C, el tipo de gas o la interacción entre ambos factores. El análisis
estadístico se realizó usando el software Origin 8 (OriginLab Corporation, 2007).
2.3- Determinación del crecimiento y consumo de CO2 de los consorcios
El crecimiento de los consorcios se determinó en 10 ml de medio líquido v2.0 más acetato de
sodio 10 mM con 0,2 ml de inóculo (2 %) estandarizado a una DO600 de 0,45, incubados en
presencia de luz a 25 ºC, en una atmósfera de biogás durante 9 días. El biogás se hizo
burbujear en cada uno de los tratamientos, en un volumen cinco veces mayor que la unidad
experimental de 25 ml constituyendo la fase gaseosa. La composición del biogás en el ensayo
fue de: 59 % CH4, 37 % de CO2, 0,9 % de O2 y 925 ppm H2S. Los cultivos se realizaron en
triplicado. La curva de crecimiento para cada consorcio se determinó por densidad óptica a
600 nm (DO600) con tres repeticiones. El diseño experimental correspondió a un diseño
completamente aleatorizado (DCA) constituido por seis tratamientos, que correspondieron a la
curva de crecimiento de cada consorcio (C1, C2, C3, C4, C5, y C6). Como blanco se utilizó
medio de cultivo salino sin inóculo v2.0, cuya DO600 fue restada a la DO600 medida de cada
uno de los tratamientos.
Los datos experimentales obtenidos fueron ajustados mediante la curva de Gompertz
modificada (Zwietering et al., 1990) descrita por la ecuación:
DO = A exp{-exp(((µm * exp(1))/A) (λ-t) +1)}.
Donde:
DO= Densidad óptica
A= DO máxima
exp = función exponencial
µm= Velocidad específica máxima de crecimiento (1/día)
λ= Fase de latencia (días)
24
El consumo de CO2 de cada consorcio se evaluó bajo las mismas condiciones de cultivo del
ensayo anterior, usando como tratamiento control, medio de cultivo sin inóculo. El CO2
disuelto en el medio de cultivo se determinó por titulación siguiendo las indicaciones del kit
Hanna HI 3818, basado en el método propuesto por APHA, 1998, durante el transcurso de 3
semanas. Como blanco se utilizó agua destilada a temperatura ambiente, previamente hervida.
El consumo de CO2 se expresó en mg CO2/ml de muestra. Con los datos obtenidos se realizó
una curva de CO2 disuelto acumulado en el tiempo para cada consorcio y el control sin
inóculo.
Los datos experimentales obtenidos fueron ajustados en forma lineal. El diseño experimental
correspondió a un DCA constituido por siete tratamientos, que correspondieron a la curva de
CO2 acumulado de cada consorcio más el control sin inóculo (C1, C2, C3, C4, C5, C6 y
control sin inóculo) con dos repeticiones.
Para ambos diseños experimentales, una vez comprobados los supuestos de homogeneidad de
varianzas y distribución normal de los residuos, los parámetros de las curvas de crecimiento y
las pendientes de las rectas del consumo de CO2 y CO2 disuelto al final de periodo de
incubación (21 días) se analizaron mediante ANDEVA (P ≤ 0,05) y las diferencias estadísticas
significativas se determinaron mediante el test de Tukey (P ≤ 0,05). La unidad experimental
correspondió a una botella serológica de 25 ml con tapón de goma y sello de aluminio. El
análisis estadístico se realizó con el software Origin 8 (OriginLab Corporation, 2007). El
volumen de los consorcios pre-seleccionados se aumentó para mantener un stock de inóculos
para los experimentos posteriores.
3.- Evaluación de parámetros fisicoquímicos, de cultivo y selección de consorcios
Los consorcios preseleccionados, en la sección 2, se incubaron en las mismas condiciones del
experimento anterior, en un volumen final de 250 ml durante 20 días, en bolsas Tedlar de 5L
de capacidad, en triplicado, las cuales fueron previamente llenadas con biogás. Todos los
cultivos se iniciaron con inóculos estandarizados a una DO600 de 0,45 y se agregó un 2% de
inóculo. La composición inicial del biogás fue: 76,2 % CH4, 26,2 % de CO2, 0,31 % de O2 y
25
535 ppm H2S. Las variables medidas fueron: composición del biogás, concentración de CO2
disuelto, pH, concentración de sulfato, sulfuro total, tiosulfato, sulfito, bicarbonato, biomasa
bacteriana como proteína total y biomasa fotosintética como bacterioclorofila a (Bclo a).
3.1- Composición del biogás
La concentración porcentual de CH4, CO2, O2 y ppm de H2S en el biogás, se determinó con un
analizador de gases modelo Dragüer X-am 7000.
3.2- Concentración de CO2 disuelto y medición de pH
La concentración de CO2 se determinó por titulación del CO2 disuelto siguiendo las
indicaciones del kit Hanna HI 3818, basado en el método propuesto por APHA, 1998, en
triplicado. Los datos fueron expresados en ppm. Como blanco se utilizó agua destilada a
temperatura ambiente, previamente hervida. El pH fue medido por potenciometría con el pHmetro 500 OAKTON®.
3.3- Concentración de sulfato
La medición de sulfato se realizó de acuerdo al método propuesto por APHA, 1998, en
triplicado. A 5 ml de filtrado del cultivo se adicionó 0,2 ml de solución ácida acondicionadora
(solución que contiene 6 ml de ácido clorhídrico al 37 %, 60 ml de agua destilada, 20 ml de
etanol al 95 % p/v, 15 g de cloruro de sodio y 10 ml de glicerina), posteriormente se agregó 80
mg de cloruro de bario. Se agitó en vórtex durante 1 minuto y se dejó reposar dos minutos
más, midiendo la absorbancia a 420 nm (DO420) en los 2 min siguientes en un
espectrofotómetro (Spectronic 21). La concentración de sulfato se determinó mediante una
curva de calibración (ver apéndice Figura A1), la cual se elaboró con estándares desde 5 a 60
ppm de sulfato de sodio que contenían solución ácida acondicionadora y cloruro de bario,
como se mencionó anteriormente. Estos estándares se prepararon a partir de una solución
stock de 147,9 ppm de sulfato de sodio. Como blanco se utilizó medio de cultivo salino sin
inóculo v2.0, cuya concentración de sulfato (26 ppm) fue restada a la concentración de sulfato
medida en cada uno de los tratamientos. Los datos fueron expresados en ppm.
26
3.4- Concentración de sulfuro total, tiosulfato y sulfito.
La determinación de sulfuro total, tiosulfato y sulfitos se determinó de acuerdo a los métodos
propuestos por APHA modificado, 1998. Las muestras fueron pre-tratadas, para ello a 20 ml
de cada muestra se agregó NaOH 3 N hasta alcanzar pH 12 y 500 µl de acetato de zinc 2 N,
luego las muestras se mantuvieron a 4 ºC y se analizaron a los tres días.
Para la medición de sulfuro total se filtró 5 ml de cada muestra pre-tratada y el precipitado se
diluyó en 5 ml de agua destilada libre de oxígeno. Luego, se mezcló 5 ml de una solución de
yoduro de potasio 0,25 N, 5 ml de una solución de yodato de potasio 0,01 N, 1 ml de ácido
sulfúrico 3 N y 5 ml del precipitado diluido. Posteriormente, esta solución se tituló con
tiosulfato de sodio 0,05 N usando gotas de una solución de almidón (1 % p/v con 0,2 % de
ácido salicílico para preservar) como indicador hasta la desaparición del color azul. Como
blanco se utilizó agua destilada libre de oxígeno. Cada medición se realizó en triplicado.
Posteriormente el gasto (ml) de tiosulfato de sodio se relacionó con la concentración de
sulfuro presente en la muestra. Los datos fueron expresados en mM.
Alternativamente la concentración de sulfuros (S2-) fue determinada con el método del ion
selectivo con un ionómetro o analizador de iones pH/Ion 510 OAKTON®.
Para la medición de tiosulfato se filtró 12 ml de cada muestra pre-tratada. Se mezcló 5 ml de
sobrenadante obtenido con 600 µl de formaldehido, 0,5 µl de ácido sulfúrico 3 N y unas gotas
de la solución de almidón como indicador. Esta mezcla se tituló con una solución de yoduroyodato 0,002 M hasta un tenue color azul permanente. Como blanco se utilizó agua destilada.
Cada medición se realizó en triplicado. Posteriormente el gasto (ml) de yoduro-yodato se
relacionó con la concentración de tiosulfato presente en la muestra. Los datos fueron
expresados en mM.
Para la medición de tiosulfato y sulfitos se mezcló 5 ml del sobrenadante con 0,5 µl de ácido
sulfúrico 3 N y unas gotas de la solución de almidón como indicador. Esta mezcla se tituló con
una solución de yoduro-yodato 0,002 M hasta un tenue color azul permanente. Como blanco
se utilizó agua destilada. Cada medición se realizó en triplicado. Posteriormente el gasto (ml)
27
de yoduro-yodato se relacionó con la concentración de sulfito y tiosulfato presente en la
muestra. La concentración de sulfito se determinó por diferencia entre la concentración de
tiosulfato y sulfito obtenida y la concentración de tiosulfato. Los datos fueron expresados en
mM.
3.5- Concentración de bicarbonato
La concentración de bicarbonato se determinó por titulación de la muestra proveniente de cada
consorcio en triplicado, para lo cual a 3 ml de cultivo, se agregó unas gotas de azul
bromofenol (0,04 %), apareciendo una coloración azul y, luego, se tituló con una solución de
ácido clorhídrico 0,01 N hasta la aparición de un color verde en la muestra (APHA, 1998).
Como blanco se utilizó agua destilada a temperatura ambiente, previamente hervida. Los datos
fueron expresados en ppm.
3.6- Determinación de proteína total y bacterioclorofila a
La biomasa total fue determinada mediante proteínas totales usando el método colorimétrico
de Bradford (BIOQUANT® Protein, Merck). Para lo cual, 3 ml de muestra se centrifugaron
durante 15 min a 4000 rpm conservándose el precipitado, al cual se adicionó 500 µl de
hidróxido de sodio 0,5 N, 500 µl de agua destilada estéril y se agitó en vórtex por 30 s.
Posteriormente, los tubos fueron colocados en agua a ebullición durante 10 min. Luego, se
siguieron los pasos del método colorimétrico de Bradford comercial. Finalmente, se midió la
absorbancia de las muestras a una longitud de onda de 595 nm (DO595) en un
espectrofotómetro (Spectronic 21). Todas las determinaciones se hicieron en triplicado y como
blanco se utilizó agua destilada estéril. La concentración de proteína se determinó mediante
una curva de calibración (ver apéndice Figura A2), la que se elaboró con estándares de
albúmina de suero bovino (BSA) desde 5 a 70 µg BSA/ml. Estos estándares se prepararon a
partir de una solución stock de 10 mg BSA/ml. Los datos fueron expresados en µg/ml de
muestra.
La biomasa fotosintética fue determinada mediante la medición de Bclo a, utilizando el
método propuesto por Oelze, 1985. Para lo cual, 3 ml de cultivo bacteriano se centrifugaron
28
durante 15 min a 4000 rpm y posteriormente al precipitado se agregó 3 ml de acetona, se
homogeneizó y se mantuvo a 4 ºC en oscuridad hasta el día siguiente, durante este periodo la
clorofila se extrajo. Como blanco se utilizó acetona. Posteriormente se midió la absorbancia de
cada una de las muestras a una longitud de onda de 771 nm (DO771) en espectrofotómetro
(Spectronic 21). Todas las determinaciones se realizaron en triplicado. Los datos fueron
expresados en µg/ml. La concentración del pigmento se calculó de acuerdo a la ley de
Lambert-Beer:
E = C*d* ε
Donde:
E = Extinción en absorbancia máxima
C = Concentración de pigmento (mg/ml) / 1000 = (µg/ml)
d = Ancho de la cubeta (cm)
ε = Coeficiente de extinción máxima = 92,3 ml * mg-1 * cm-1.
El diseño experimental para evaluar el comportamiento de los consorcios correspondió a un
DCA en los cuales cada consorcio correspondió a un tratamiento más el control sin inóculo
(C4, C5, C6 y control sin inóculo) con tres repeticiones. Una vez comprobados los supuestos
de homogeneidad de varianzas y distribución normal de los residuos, se realizó un ANDEVA
(P ≤ 0,05), cuando existieron diferencias significativas se realizó el test de comparaciones
múltiples de Tukey (P ≤ 0,05). Además, para determinar variaciones, al final del ensayo
respecto al inicio, se realizó una prueba t para muestras dependientes para cada consorcio y el
control sin inóculo (P ≤ 0,05). La unidad experimental correspondió a una bolsa Tedlar de 5 L.
El análisis estadístico se realizó con el software Origin 8 (OriginLab Corporation, 2007).
4.- Caracterización molecular de los consorcios
4.1- Extracción del DNA
El DNA genómico total de cada consorcio se extrajo usando el kit “UltraClean® Microbial
DNA Isolation” (MoBio Laboratories, Inc.) según las indicaciones del fabricante. La
concentración y calidad del DNA se determinó por electroforesis en geles de agarosa al 0,8 %
(p/v) en amortiguador TAE 1X (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) y se visualizó por
29
tinción con GelRedTM comparándolo con cantidades conocidas del marcador de peso
molecular λ/HindIII (Gibco BRL®). El DNA extraído se almacenó a -20oC.
4.2- Amplificación por PCR
4.2.1- Amplificación por PCR de marcadores fotosintéticos.
Para evaluar si los consorcios tenían una potencial función fotosintética anoxigénica, se
realizó una amplificación del gen pufM y del marcador 16S rDNA con partidores específicos
para distintos grupos de bacterias que realizan fotosíntesis anoxigénica (Tabla 4). El gen pufM,
codifica para una proteína de la subunidad M del centro de reacción fotosintético de las
bacterias fototróficas púrpura del S y bacterias fototróficas púrpura no del S. Además, se
utilizaron partidores específicos basados en la secuencia del rDNA 16S para la detección de
otros grupos de bacterias fotoanoxigénicas tales como bacterias verdes del S, bacterias verdes
no del S y algunas especies del género Heliobacterias (Achenbach et al., 2001).
Para la amplificación del DNA por PCR se preparó una mezcla de reacción (25 µl) que
contenía GoTaq® Green Master Mix (GoTaq® DNA Polimerasa en 1X Green GoTaq®
Reaction Buffer (pH 8,5), 200 µM de cada dNTP y 1,5 mM MgCl2) (Promega) y 10 µM de los
partidores. El programa de amplificación consistió en una desnaturalización inicial a 94 ºC
durante 3 min, seguida de 30 ciclos con una temperatura de desnaturalización de 94 ºC por 1
min, hibridación de 55 ºC por 1 min y elongación a 72 ºC por 1 min. Terminando con una
extensión final de 10 min a 72 ºC (Achenbach et al., 2001).
La correcta amplificación del DNA se verificó por electroforesis en geles de agarosa al 1,2 %
en amortiguador TAE 1X teñidos con GelRedTM y visualizados mediante luz ultravioleta. Para
determinar el tamaño del fragmento se usó el marcador de peso molecular 100 bp
GeneRuler™ (Fermentas).
30
Tabla 4. Partidores usados para la amplificación del gen pufM y del marcador rDNA 16S
de bacterias fotosintéticas anoxigénicas.
Marcador
molecular
Puf M
rDNA 16S
rDNA 16S
Partidor
Tipo de bacteria
fototrófica
Tamaño
fragmento
amplificado
PufM.557F
PufM.750R
Bacteria fototrófica
púrpura del S
Bacteria fototrófica
púrpura no del S
229 pb
CGCACCTGGACTGGAC
CCCATGGTCCAGCGCCAGAA
GS.619F
GS.1144R
CFX.856F
CFX.1240R
Bacteria fototrófica
verde del S
Bacteria fototrófica
verde no del S
525 pb
GGGGTTAAATCCATGTGCT
CAGTTCARTTAGAGTCC
TGCCTTAGCTCACGCGGTAA
GCAACGCATTGTCGTGGCCA
HB.418F
HB.1159R
Heliobacterias
741 pb
384 pb
Secuencia
(5’ → 3’)
TCTTCGGATTGTAAACCC
CCGGTCGTCCCGGGCA
Achenbach et al., 2001
4.2.2- Amplificación por PCR del gen que codifica para el RNA ribosomal 16S (rDNA 16S)
Para amplificar el gen que codifica para el RNA ribosomal 16S se utilizaron los partidores
universales fD1 y rP2 (Tabla 5), descritos como específicos para el dominio bacteria
(Weisburg et al., 1991). La mezcla de reacción (25 µl) contenía GoTaq® Green Master Mix
(GoTaq® DNA Polimerasa en 1X Green GoTaq® Reaction Buffer (pH 8,5), 200 µM de cada
dNTP y 1,5 mM MgCl2) (Promega) y cada uno de los partidores 10 µM. El programa de
amplificación consistió en una desnaturalización inicial a 94 ºC durante 3 min, seguida de 30
ciclos con una temperatura de desnaturalización de 94 ºC por 1 min, hibridación de 57 ºC por
30 s y elongación a 72 ºC por 2 min. Terminando con una extensión final de 7 min a 72 ºC.
Tabla 5. Partidores usados para la amplificación del marcador DNA 16S de bacterias.
Partidor
fD1
rP2
Tamaño
fragmento
amplificado
1500 pb
Secuencia
(5’ → 3’)
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
ACGGCTACCTTGTTACGACTT
Weisburg et al., 1991
31
La correcta amplificación del DNA se verificó por electroforesis en geles de agarosa al 1,2 %
en amortiguador TAE 1X teñidos con GelRedTM y visualizados mediante luz ultravioleta. Para
determinar el tamaño del fragmento se usó el marcador de peso molecular 100 bp
GeneRuler™ (Fermentas). El DNA se cuantificó comparándolo con cantidades conocidas del
marcador de peso molecular.
4.3- Determinación de la composición bacteriana de cada consorcio
4.3.1- Clonación y secuenciación
Los amplicones del gen que codifica para el RNA ribosomal 16S se clonaron para construir
una genoteca para cada uno de los consorcios. Para ello se purificaron los productos de
amplificación por PCR con el kit Ultraclean PCR Clean-up DNA purification (MoBio Lab,
Inc). Los amplicones purificados se ligaron al vector pTZ57R/T. La mezcla de ligamiento se
utilizó para transformar células competentes de Escherichia coli XL1B. El proceso de ligado y
transformación se realizó con el kit InsTAcloneTM PCR Cloning (Fermentas) según las
indicaciones del fabricante.
Los transformantes se crecieron en medio LB–ampicilina (1,0 % Triptona; 0,5 % extracto de
levadura; 1,0 % NaCl; pH 7,0 con ampicilina a 50 µg/ml). Los clones portadores del vector
con un amplicón de DNA fueron seleccionados por su resistencia a ampicilina y por su
incapacidad de hidrolizar X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactopiranósido) en
presencia de IPTG (isopropil-β-D-tio-galactósido). Los clones seleccionados fueron
resuspendidos en 10 µl de amortiguador TE. El DNA se obtuvo por lisis celular mediante 8
ciclos sucesivos de choques térmicos de 1 min a 98 ºC / 1 min a 4 ºC. La presencia del inserto
del rDNA 16S se determinó por PCR usando los partidores M13f y M13r que hibridan con el
vector.
Previo a la secuenciación, se realizó un análisis de los polimorfismos en la longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP), para ello 4 µl de producto de PCR de los clones que
presentaron un tamaño de inserto esperado para el rDNA 16S de bacterias, se digirieron con 2
32
µl de la enzima de restricción BsuRI (Hae III) (Fermentas) durante 12 h a 37 ºC,
posteriormente la enzima se inactivó a 80 ºC por 20 min. Los productos de digestión se
resolvieron por electroforesis en geles de agarosa al 2 % en amortiguador TAE 1X teñidos con
GelRedTM y visualizados mediante luz ultravioleta. El tamaño de los fragmentos de digestión
se comparó con el estándar de peso molecular 100 bp (Fermentas). Los clones se agruparon de
acuerdo a su perfil de fragmentos de restricción. Uno o más representantes de cada perfil se
secuenciaron por Macrogen Inc. (Corea) con el analizador genético 3730XL (Applied
Biosystems). Los clones secuenciados se guardaron en glicerol al 20 % a -80 ºC.
Las secuencias de los clones se editaron para eliminar las posiciones del vector y se alinearon
mediante la herramienta ClustalW con el programa MEGA 5 (Tamura et al., 2011).
Posteriormente, las secuencias se relacionaron con las disponibles en la base de datos
GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI) mediante el programa
BLAST-n (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/); seleccionándose aquellas que presentaron
mayor identidad (> 95% de identidad en la mayoría de los casos).
4.3.2- Estimación de la cobertura de las genotecas
Las secuencias obtenidas se agruparon de acuerdo al género al cual se asociaron por
comparación en la base de datos. Los grupos formados fueron procesados con el programa
Analytic Rarefaction 1.3 (Holland, 2003) obteniéndose datos para construir la curva de
rarefacción. Posteriormente, estos datos fueron ajustados a una curva teórica mediante
regresión no lineal con el programa Origin 8, obteniéndose el número de géneros diferentes
para cada uno de los consorcios. Finalmente la estimación de la cobertura se realizó mediante
la fórmula CX = 1- (Nx/n), donde Nx representa el número de géneros diferentes y n el
número total de secuencias analizadas.
33
4.4- Evaluación del cultivo y estabilidad de la estructura genética de los consorcios
seleccionados.
4.4.1- Determinación de la curva de crecimiento y variables físico químicas
Los consorcios seleccionados, en la sección 3, fueron incubados en las mismas condiciones, en
un volumen final de 50 ml durante 13 días, en botellas serológicas con sello de aluminio y
tapón de goma de 100 ml, en triplicado. Todos los cultivos se iniciaron con inóculos
estandarizados a una DO600 de 0,45. El biogás se hizo burbujear en cada uno de los
tratamientos, en un volumen cinco veces mayor que la unidad experimental de 100 ml
constituyendo la fase gaseosa. La composición inicial del biogás fue de: 76 % CH4, 24,5 %
CO2, 0,3 % O2 y 505 ppm H2S. Aunque la composición del biogás, en esta etapa, presentó
algunas diferencias con el biogás utilizado en la etapa de selección, bajo estas condiciones, se
construyó la curva para determinar las fases de crecimiento bacteriano y así evaluar la
estabilidad del consorcio durante el período de incubación de 13 días. Además, se midieron las
variables físico-químicas del experimento de la sección 3, más la concentración de
bicarbonato. Para comparar las curvas de crecimiento de los consorcios seleccionados,
medidas como concentración de proteínas y Bclo a, se ajustaron los datos experimentales con
la curva de Gompertz modificada, como se describió en la sección 2.3.
Para comparar las curvas que describen la cinética de remoción de CO2, primero se calculó la
tasa de remoción de CO2 disuelto (TR), con los datos experimentales de CO2 disuelto de los
consorcios seleccionados y el control sin inóculo, de acuerdo a la siguiente expresión:
RCO2 = Cc– Cm * 100
Cc
Donde:
RCO2: Tasa de remoción de CO2 disuelto en el tiempo t expresada en %
Cc: Concentración de CO2 disuelto en el control sin inóculo en el tiempo t (ppm)
Cm: Concentración de CO2 disuelto en la muestra en el tiempo t (ppm)
34
Posteriormente, las variaciones porcentuales de la concentración de CO2 se ajustaron con una
función hiperbólica: RCO2= (B máx. * t) / (Kd + t).
Donde:
RCO2: Remoción de CO2 acumulado (%)
B máx.: CO2 máximo consumido por cada consorcio (%)
Kd: Constante que representa el tiempo requerido para alcanzar la mitad de B máx.
t: tiempo (días)
El diseño experimental correspondió a un DCA constituido por dos tratamientos, que
correspondieron a la cinética de remoción de los dos consorcios seleccionados con dos
repeticiones. Una vez comprobados los supuestos de homogeneidad de varianzas y
distribución normal de los residuos, los parámetros de las curvas fueron analizados mediante
ANDEVA (P ≤ 0,05) y las diferencias estadísticas significativas entre curvas, se determinaron
mediante el test de Tukey (P ≤ 0,05). Para determinar variaciones de la concentración de CO2
disuelto, al final del ensayo respecto al inicio, se realizó una prueba t para muestras
dependientes para cada consorcio y el control sin inóculo (P ≤ 0,05). La unidad experimental
correspondió a una botella serológica de 100 ml con sello de aluminio y tapón de goma. El
análisis estadístico se realizó con el software Origin 8 (OriginLab Corporation, 2007).
4.4.2- Determinación de los perfiles de T-RFLP
La estructura genética de los consorcios se determinó mediante perfiles de T-RFLP utilizando
como marcador molecular el gen que codifica para el RNA ribosomal 16S. Para ello se obtuvo
el precipitado celular por centrifugación (13000 rpm por 5 min) y se purificó el DNA de las
muestras utilizando un kit “Ultra Clean DNA” (MoBio Lab, Inc). El DNA purificado se utilizó
para amplificar los genes para el RNA ribosomal 16S mediante PCR utilizando partidores
universales fD1 y rP2 (Tabla 5) descritos por Weisburg et al., (1991). En la mezcla de
amplificación el partidor fD1 estuvo
marcado fluorescentemente
carboxyfluoresceína).
35
con
FAM (6-
Los productos de amplificación se trataron con la enzima de restricción de corte frecuente AluI
(Fermentas) durante 12 h a 37 ºC, según las indicaciones del fabricante. La enzima se inactivó
a 65 ºC durante 20 min y los fragmentos digeridos fueron limpiados mediante precipitación
alcohólica. Los fragmentos de restricción terminal (TRFs) se resolvieron por electroforesis
capilar en un Analizador Genético ABI 3730XL (Applied Biosystem; Macrogen Inc.). La
longitud de los TRFs marcados se determinó por comparación con un estándar interno
empleando el Programa GeneScan (ABI). Para cada consorcio en los distintos tiempos se
generó un electroferograma (perfil T-RFLP) donde se determinó el número de TRFs de cada
muestra (riqueza) y la fluorescencia de cada TRF (abundancia).
El tamaño en pares de bases (pb) de los TRFs, la altura y el área de los picos en los
electroferogramas, se determinaron con el programa GeneMapper v3.0 (Applied Biosystems).
Para el análisis se usó la altura de los picos, además, se incluyeron sólo fragmentos mayores a
50 pb para descartar las señales de los partidores. Para normalizar y hacer comparables los
electroferogramas de las distintas muestras, se realizó un procedimiento de normalización
iterativo (Dunbar et al., 2001) para homogeneizar las unidades de fluorescencia (UF).
Además, los perfiles se alinearon manualmente para evitar la identificación errónea de los
TRFs por el corrimiento esperable de los tamaños de los fragmentos debido a la electroforesis.
Con los datos corregidos se determinó la fluorescencia relativa de los TRFs, en porcentaje.
36
RESULTADOS
5.- Pre-selección de los consorcios
5.1- Aclimatación de las muestras provenientes de lixiviados del relleno sanitario
Las muestras de lixiviados, diluidas 100 veces, se aclimataron en un medio de cultivo salino
con HCO3-, una atmósfera de CO2 y Na2S durante 90 días de incubación, a 25 ºC y con una
renovación periódica de la fase gaseosa. Durante este período, se observó un bajo crecimiento
en los cultivos. No obstante, se generaron las condiciones requeridas para favorecer el
establecimiento de consorcios que, potencialmente, puedan remover contaminantes del biogás.
5.2- Evaluación de la fuente de carbono y estandarización del medio de cultivo
Para determinar los requerimientos de los seis consorcios y promover su crecimiento se evaluó
la adición de acetato de sodio al medio de cultivo como una fuente de carbono y/o dador de
electrones, y además, sulfuro (éste último presente sólo en aquellos tratamientos que contenían
biogás). Para ello el diseño experimental fue factorial de 2 x 2. Los valores de crecimiento,
medidos como densidad óptica (DO600), para los distintos consorcios y en las diferentes
condiciones de cultivo, se muestran en la Tabla 6, donde se observa que fluctuaron entre 0,02
y 0,43.
Tabla 6. Evaluación del efecto de los factores, tipo de gas y fuente de carbono y su
interacción, sobre el crecimiento de los consorcios bacterianos al término del periodo de
incubación (60 días).
T1
Biogás
c/acetato
T2
CO2
c/acetato
T3
Biogás
s/acetato
T4
CO2
s/acetato
Tipo de
gas
Fuente de
C
Tipo de gas x
Fuente de C
DO600
DO600
DO600
DO600
C1
0,053
0,040
0,026
0,023
P = 0,0001
P = 0,0050
P = 0,0238
C2
0,370
0,270
0,170
0,130
P = 0,0017
P < 0,0001
P = 0,0327
C3
0,063
0,075
0,026
0,037
P = 0,0002
P < 0,0001
P = 1,0000*
C4
0,100
0,100
0,052
0,060
P = 0,2508*
P < 0,0001
P = 0,2508*
C5
0,430
0,260
0,270
0,230
P = 0,0027
P = 0,0016
P = 0,0085
C6
0,100
0,055
0,047
0,200
P < 0,0001
P < 0,0001
P = 0,0022
* Diferencias no significativas P > 0,05.
37
Los datos obtenidos muestran que el tratamiento T1 (biogás c/acetato) sustentó un incremento
en el crecimiento en la mayoría de los consorcios C1, C2, C5 y C6 (con excepción de C3 y
C4) respecto a los demás tratamientos (Tabla 6).
Se determinó, además, la existencia de un efecto significativo de la interacción entre los
factores (tipo de gas y fuente de C) (P ≤ 0,05) sobre el crecimiento bacteriano en los
consorcios C1, C2, C5 y C6 (Tabla 6; ver apéndice Figuras A3, A4, A5 y A6). Respecto de C3
existió un efecto del tipo de gas y de la fuente de C que actúan de manera independiente.
Finalmente, C4 presentó un efecto principal de la fuente de C (adición de acetato), por lo que
las diferencias entre tratamientos, en este consorcio, sólo se deberían a la adición de acetato.
En general, los resultados muestran que la adición de acetato aumenta el crecimiento
bacteriano en el medio de cultivo de todos los consorcios. Lo cual podría deberse a que el
acetato es una fuente de C fácilmente asimilable por lo microorganismos, lo que promovería
su crecimiento. Además, en la mayoría de los consorcios el biogás y el acetato produjeron un
mayor crecimiento que CO2 y acetato por lo que, existiría algún componente del biogás, como
por ejemplo la presencia de sulfuro, que pudiera, junto con el acetato, aumentar el crecimiento
en esos consorcios.
Por otra parte, se observó la presencia de una pigmentación púrpura en todos los consorcios de
T1, tratamiento biogás más acetato (Figura 4), lo cual sumado al mayor crecimiento constituyó
un criterio de selección, es así que en los experimentos posteriores se usó el medio salino v2.0,
10 mM de acetato de sodio y atmósfera de biogás.
Biogás con
acetato
Biogás sin
acetato
CO2 con
acetato
CO2 sin
acetato
Figura 4. Tratamientos para evaluar la fuente de C, acetato de sodio, en una atmósfera de biogás o CO2.
(T1): atmósfera de biogás y 10 mM de acetato de sodio, (T2): atmósfera de CO2 y 10 mM de acetato de
sodio, (T3): atmósfera de biogás y ausencia de acetato de sodio y (T4): atmósfera de CO2 y ausencia de
acetato de sodio. Condiciones de incubación: medio salino v2.0, Tº 25°C, presencia de luz, 60 días.
38
5.3- Determinación del crecimiento y consumo de CO2 de los consorcios
Para evaluar el crecimiento de los consorcios y realizar una pre-selección de éstos se usó el
medio v2.0, 10 mM de acetato de sodio y atmósfera de biogás (determinado en la etapa
anterior) durante un periodo de 9 días. Las curvas de crecimiento de los seis consorcios se
muestran en la Figura 5A. Posteriormente estos datos fueron ajustados mediante la curva de
Gompertz modificada (Figura 5B).
0,6
0,6
A
0,5
0,5
0,3
0,2
C1
0,4
DO600
C1
C2
C3
C4
C5
C6
0,4
DO 600
B
C3
0,3
0,1
0
0
2
4
6
8
C4
C5
0,2
0,1
0
C2
C6
0
10
2
4
6
8
10
Tiempo (días)
Tiempo (días)
Figura 5. Curvas de crecimiento medidas como DO600 durante un periodo de incubación de 9 días a
cada uno de los consorcios. Barras corresponden a desviación estándar (A). Curvas de crecimiento
obtenidas a partir de los datos ajustados mediante la curva de Gompertz modificada (B).
En la Tabla 7 se muestran los valores obtenidos de los parámetros para la curva ajustada de
cada uno de los consorcios. Los valores promedios de densidad óptica máxima (A), velocidad
específica máxima de crecimiento (µm) y fase de latencia (λ) fluctuaron entre 0,43 y 0,51; 0,20
y 0,43; 0,80 y 1,14, respectivamente. No existiendo diferencias estadísticamente significativas
entre consorcios para ninguno de los parámetros (P > 0,5). R2 varió entre 0,9821 y 0,9979 lo
cual indica que el modelo (curva de Gompertz modificada) explica un 98,21% de la
variabilidad de la DO600 en C4 y 99,79% en C6. Para los demás consorcios R2 se encuentra en
este rango.
39
Tabla 7. Parámetros (A, µm y λ) obtenidos mediante el ajuste realizado con la curva de
Gompertz modificada al crecimiento de los consorcios medido como DO, en la etapa de
pre-selección.
Consorcios
A
R2
µm
λ
(1/día)
(días)
C1
0,48 a
0,29 a
1,14 a
0,9939
C2
0,46 a
0,32 a
1,01 a
0,9870
C3
0,47 a
0,20 a
1,07 a
0,9942
C4
0,43 a
0,32 a
0,80 a
0,9821
C5
0,51 a
0,43 a
0,98 a
0,9907
C6
0,48 a
0,26 a
0,87 a
0,9979
Letras minúsculas distintas, en sentido vertical, indican diferencias significativas (P ≤ 0,05) entre
distintos consorcios. A: DO600 máxima, µm: velocidad específica máxima de crecimiento, λ: fase de
latencia. R2: coeficiente de correlación. Curva de Gompertz modificada: DO600 = A exp{-exp(((µm*
exp(1))/A)(λ-t)+1)}. C: consorcio.
Para determinar el consumo de CO2 disuelto en los consorcios, se incubaron en las mismas
condiciones anteriores, usando como tratamiento control medio de cultivo sin inocular, el
tiempo de incubación fue 21 días (Figura 6), con el propósito de evaluar su concentración
después del día 9, dado que en el ensayo anterior la DO no varió a partir del día 6 del periodo
de incubación.
Los resultados experimentales muestran que la concentración de CO2 disuelto en el tiempo
aumenta (Figura 6). Sin embargo, la acumulación de CO2 es menor en los consorcios que
aquella determinada en el control sin inóculo; situación que se observa a partir del día 2. Antes
de burbujear biogás en el medio de cultivo, no fue detectado CO2 disuelto en el medio (0 ppm)
(Figura 6), por lo tanto, el CO2 detectado en el control sin inóculo proviene solo desde el
biogás. Es así, que la mayor concentración de CO2 disuelto en el medio de cultivo del control
sin inóculo sugiere que el CO2 proveniente del biogás se disuelve en el medio de cultivo y se
acumula como CO2 disuelto. En el caso de los consorcios la acumulación del CO2 disuelto
sería menor debido a su consumo por la biomasa bacteriana. Si bien es cierto que, en esta
etapa no se descarta la generación bacteriana de CO2, el consumo de CO2 sería mayor, lo cual
se reflejaría en la menor concentración de CO2 disuelto acumulado en los consorcios.
40
25
mg CO2 acumulado / ml
C1
20
C2
C3
15
C4
10
C5
5
C6
Control
0
0
5
10
15
20
Tiempo (días)
Figura 6. Curvas de CO2 disuelto determinado de los consorcios en un periodo de incubación de 21
días. Barras indican desviación estándar. Control: medio de cultivo sin inóculo.
Para determinar si existen diferencias entre los consorcios y el control sin inóculo al final del
periodo de incubación, se realizó un ANDEVA de la concentración de CO2 disuelto, los
resultados muestran que la concentración de CO2 disuelto de los consorcios es
significativamente menor que la concentración determinada en el control sin inóculo, lo cual
fue explicado anteriormente (Tabla 8).
Tabla 8. Comparación entre las distintas determinaciones de CO2 disuelto de los seis
consorcios estudiados y el control sin inóculo al final de un periodo de incubación de 21
días.
CO2 disuelto
Consorcios
mg CO2/ml
15,2 b
C1
13,7 b
C2
12,8 b
C3
13,4 b
C4
14,7 b
C5
13,0 b
C6
21,0 a
Control
Concentración de CO2 disuelto en el medio de cultivo antes de burbujear biogás: 0 ppm. Letras
minúsculas distintas, en sentido vertical, indican diferencias significativas (P ≤ 0,05) entre distintos
consorcios y el control sin inóculo. Control: control sin inóculo.
41
Posteriormente, para realizar la pre-selección de los consorcios, los datos experimentales de
CO2 disuelto fueron ajustados en forma lineal obteniéndose la pendiente para cada una de las
rectas de los consorcios (Figura 7).
1,5
C1
log (CO2)
1
C2
C3
0,5
C4
0
C5
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
-0,5
C6
Control
-1
Tiempo (log(días))
Figura 7. Rectas provenientes del ajuste lineal de los datos obtenidos a partir de las curvas de CO2
disuelto de la Figura 6. Control: control sin inóculo.
En la Tabla 9 se muestra la pendiente obtenida para cada recta, se observa una diferencia
estadística entre dos grupos de consorcios: C1, C2, C3 y el control sin inóculo y, por otra
parte, C4, C5 y C6, éstos últimos presentan una pendiente significativamente mayor (P ≤
0,05), las cuales estarían determinadas por la menor concentración de CO2 disuelto en las
primeros días de incubación, lo cual sugiere que esa disminución de CO2 disuelto podría
relacionarse con un mayor consumo de CO2 por parte de los miembros de los consorcios C4,
C5 y C6 a diferencia de los consorcios C1, C2, C3. Por lo que C4, C5 y C6 fueron preseleccionados (Figura 8). R2 varió entre 0,9733 y 0,9866 indicando que el modelo explica un
97,33 % de la variabilidad de log (CO2) en C6 y 98,66 % en el control sin inóculo. Para los
demás consorcios R2 se encuentra en este rango.
42
Tabla 9: Pendientes (B) obtenidas mediante ajuste lineal de la curva de acumulación de
CO2 de cada consorcio.
Consorcios
R2
B
(log(CO2)/log(días))
C1
1,07 b
0,9832
C2
1,08 b
0,9857
C3
1,01 b
0,9755
C4
1,49 a
0,9814
C5
1,49 a
0,9857
C6
1,44 a
0,9733
Control
1,11 b
0,9866
Letras minúsculas distintas, en sentido vertical, indican diferencias significativas (P ≤ 0,05) entre
distintos consorcios. B: pendiente de la recta, R2: coeficiente de correlación. C: consorcio. Control:
control sin inóculo.
C5
C4
C6
C4
Figura 8. Consorcios pre-seleccionados (C4, C5 y C6).
5.4- Evaluación de la presencia de la potencial función fotosintética anoxigénica en los
consorcios preseleccionados
Para determinar si los consorcios pre-seleccionados poseen bacterias fotosintéticas
anoxigénicas, se evaluó la presencia de un marcador molecular específico. Para ello se extrajo
DNA desde los consorcios C4, C5 y C6, se amplificó con partidores específicos del marcador
PufM de bacterias fototróficas púrpuras del S y fototróficas púrpuras no del S. Además se
probaron partidores que amplifican fragmentos específicos del gen para el RNA ribosomal
43
16S que permiten detectar bacterias fototróficas verdes del S, bacterias fototróficas verdes no
del S y Heliobacterias (Achenbach et al., 2001).
En la Figura 9 se muestra el fragmento obtenido de ~229 pb que corresponde al tamaño
esperado del producto de amplificación del gen PufM de las bacterias fototróficas púrpuras del
S y púrpuras no del S. Con lo cual se confirma que estas bacterias estarían presentes en los
consorcios C4, C5 y C6. La reacción de PCR con los otros partidores fue negativa lo que
sugiere que los otros tipos de bacterias fotoanoxigénicas están ausentes o se encuentran en
baja abundancia en los consorcios, resultando indetectables
indetectables por PCR.
Mar
C4
C5
C6
+
-
3000 pb
1000 pb
500 pb
200 pb
~ 229 pb
Figura 9. Producto de amplificación del gen PufM de las bacterias púrpuras del S y púrpuras no del S a
partir de DNA extraído
do desde muestras de los consorcios C4, C5 y C6, utilizando los partidores
PufM.557F y PufM.750R. Mar: marcador de peso molecular 100 bp.. C4: amplicón obtenido desde el
consorcio 4, C5: amplicón obtenido desde el consorcio 5, C6: amplicón obtenido desde
desd el consorcio 6,
+: control positivo, -:: control negativo.
6.- Selección de los consorcios
6.1- Composición bacteriana en los inóculos de los consorcios C4, C5 y C6.
6.1.1- Amplificación de DNA, clonación y análisis de RFLP
Para determinar la composición bacteriana de los consorcios pre-seleccionados
pre seleccionados se amplificó el
DNA extraído con los partidores universales para bacterias fD1 y rP2 (Weisburg
(
et al., 1991).
En la Figura 10 se muestra el fragmento obtenido de ~1500
1500 pb que corresponde al tamaño
esperado del producto de la amplificación.
44
Mar
C4
C5
C6
+
-
3000 pb
~1500 pb
1000 pb
500 pb
Figura 10. Producto de amplificación del gen del rRNA 16S de bacterias a partir de DNA extraído
desde muestras de los consorcios C4, C5 y C6, utilizando los partidores fD1 y rP2
rP2. Mar: marcador de
peso molecular 100 bp.. C4: amplicón obtenido desde el consorcio 4, C5: amplicón obtenido desde el
consorcio 5, C6: amplicón
cón obtenido desde el consorcio 6, +: control positivo, -: control negativo.
Después de confirmar la obtención del producto de PCR esperado en los tres consorcios, éste
se purificó, se ligó al vector pTZ57R/T y se clonó en E. coli XL1B. Las colonias
seleccionadas
cionadas por su incapacidad para hidrolizar X
X-gal
gal en presencia de IPTG, se lisaron y se
confirmó la presencia del inserto mediante PCR, usando los partidores M13f
M13 y M13r que
hibridan con el vector, seguido de una electroforesis en gel de agarosa. El tamaño esperado
para estos fragmentos fue de ~2000 pb (~1500 pb más la amplificación de una pequeña
fracción del vector). Mediante este procedimiento se obtuvieron 176
176 clones positivos en la
genoteca de C4 (200 clones totales),
totales) 200 clones positivos en la genoteca de C5 (205 clones
totales) y 190 clones positivos en la genoteca de C6 (202 clones totales)
totales).
Una vez identificados los clones positivos, se analizaron mediante los polimorfismos en la
longitud de los fragmentos de restricción
restricción (RFLP), usando la enzima de restricción BsuRI.
Posteriormente, los clones se agruparon de acuerdo a su perfil de fragmentos de restricción.
Uno o más representantes de cada perfil se seleccionaron para su secuenciación, luego los
clones no secuenciadoss dentro de un grupo se incluyeron junto a los clones secuenciados con
igual perfil de fragmentos de restricción.
45
6.1.2- Análisis de secuencias y porcentaje de representación
Las secuencias de los clones de los tres consorcios, C4, C5 y C6, se compararon con las
secuencias disponibles en la base de datos GenBank del National Center for Biotechnology
Information (NBCI), mediante la herramienta bioinformática BLAST-n. El alineamiento de las
secuencias se realizó con el programa MEGA 5. En el análisis se incluyeron las secuencias de
la base de datos que presentaron mayor identidad con las secuencias de los clones (ver
apéndice Tablas A4, A5 y A6).
Los resultados muestran que el género mayormente representado en las genotecas de los tres
consorcios es Rhodopseudomonas sp. con 46,6%, 42,5% y 87,3% en C4, C5 y C6,
respectivamente (Figura 11).
Se identificaron otros géneros como Sphingobium sp., Xanthobacter sp. y Castellaniella sp.
con porcentajes de representación de 39,2%, 24,5% y 18,0%, respectivamente. El primero se
encontró en la genoteca de C4 y los dos últimos en la genoteca de C5.
Además de Rhodopseudomonas sp. otro género como Xanthobacter sp. se encontró en las tres
genotecas. Sphingobium sp., en cambio, se encontró en la genoteca de C4 y C6; Castellaniella
sp., en C4 y C5 y Stenotrophomonas sp. y Bacteroidetes en C5 y C6.
Finalmente, otros géneros se asociaron a las secuencias de los clones constituyendo el 2,3%,
7,0% y 12,7% en las genotecas de C4, C5 y C6, respectivamente (Figura 11). La proporción
de los géneros con menor porcentaje de representación se describe en el apéndice, Tabla A7.
46
Genoteca C4
2,3%
Rhodopseudomonas sp.
Sphingobium sp.
39,2%
46,6%
Castellaniella sp.
Rhodobacter sp.
Xanthobacter sp.
Genoteca C5
7,0%
Rhodopseudomonas sp.
Xanthobacter sp.
18,0%
42,5%
Castellaniella sp.
24,5%
Stenotrophomonas sp.
Bacteroidetes
Genoteca C6
Rhodopseudomonas sp.
12,7%
Bacteroidetes
Stenotrophomonas sp.
Methylocystis sp.
Alcaligenaceae
87,3%
Hyphomicrobium sp.
Rhizobium sp.
Xanthobacter sp.
Dechloromonas sp.
Sphingobium sp.
Figura 11. Composición de bacterias en consorcios C4, C5 y C6.
47
6.1.3- Estimación de la cobertura de las genotecas
La cobertura de las genotecas se estimó mediante curvas de rarefacción a nivel de género, para
lo cual se realizó un ajuste a una hipérbola (ver apéndice Figura A7), observándose en los tres
casos una tendencia de las curvas a alcanzar la asíntota o máximo teórico, obteniendo
coberturas de 96,59 %, 97 % y 93,15 % para C4, C5 y C6, respectivamente (Tabla 10). Esto
indica que el número de secuencias estudiadas fue suficiente para cubrir un número importante
de los géneros presentes en cada uno de los consorcios y, además, sugiere que para encontrar
nuevos grupos, se requeriría un esfuerzo de muestreo considerablemente mayor.
Tabla 10. Ajuste de las curvas de rarefacción y del cálculo de cobertura para los
consorcios C4, C5 y C6.
Consorcios
C4
C5
C6
Grupos
observados
6
6
10
Clones
analizados
176
200
190
Máximo
grupo
teórico
6
6
13
Cobertura
R2
96,59
97,00
93,15
0,8512
0,9734
0,9955
6.2- Determinación de la composición del gas y evaluación de propiedades fisiológicas para
la selección de consorcios
Para determinar cómo variaron los % CH4, % CO2 y % O2 en la fase gaseosa y el pH del
medio de cultivo para cada consorcio, al inicio y final del ensayo, se realizó una prueba t para
muestras dependientes para cada consorcio y el control sin inóculo. Los resultados obtenidos
se muestran en la Tabla 11, en donde se observa que el gas CH4 aumentó significativamente (P
≤ 0,05) entre 1,7 a 2 % en C4, C5 y C6. En el caso del O2 aumentó significativamente en un
0,12 % en C4 y 0,96 % en el control sin inóculo (P ≤ 0,5), en este último caso el O2 (g) disuelto
presente en el medio de cultivo “escaparía” a la fase gaseosa aumentando el O2
(g).
Similar
situación se observó en C4. No encontrándose diferencias significativas (P > 0,05) en el estado
inicial y final de los demás consorcios. El CO2 disminuyó significativamente (P ≤ 0,05) entre
6,7 a 8 % en todos los consorcios y el control sin inóculo, en este último caso esta disminución
se produciría debido que el CO2 proveniente del biogás se disuelve en el medio de cultivo, se
48
disocia y posteriormente se acumula como CO2 disuelto (ver sección 7.1). En el caso del H2S
(g),
al final del ensayo, no fue detectado por el analizador, cuyo límite de detección es de 1
ppm, lo cual sugiere que el H2S
(g)
se disolvió en el medio de cultivo tanto en los consorcios
como en el control sin inóculo.
El pH bajó aproximadamente una unidad al final del ensayo para todos los consorcios y el
control sin inóculo. Los valores promedio de pH para los consorcios fluctuaron entre 7,1 al
inicio y 6,0 después de 20 días de incubación, siendo esta diferencia significativa (P ≤ 0,05).
En el caso del control sin inóculo el pH final fue de 5,4, lo cual podría atribuirse a la
disolución y, posterior, disociación del CO2 que tiende a bajar el pH del medio de cultivo de
acuerdo al equilibrio químico de la reacción CO2 (ac) + H2O ↔ HCO3- + H+ (ver sección 7.1).
Tabla 11. Determinaciones de la fase gaseosa y acuosa para la elección de C4, C5 y C6.
Fase acuosa
Fase gaseosa
Control
C4
C5
C6
i
76,2 a
76,2 a
76,2 a
76,2 a
% CH4
f
76,2 aB
77,9 bA
78,2 bA
77,9 bA
i
0,31 b
0,31 b
0,31 a
0,31 a
% O2
f
1,27 aA
0,43 aB
0,32 aC
0,31 aC
i
26,2 a
26,2 a
26,2 a
26,2 a
% CO2
f
19,7 bA
18,2 bA
19,4 bA
19,5 bA
i
505
505
505
505
ppm H2S
f
ND
ND
ND
ND
Control
C4
C5
C6
i
7,1 a
7,1 a
7,1 a
7,1 a
pH
f
5,4 bB
6,0 bA
6,1 bA
6,1 bA
f
3,3 B
102,3 A
102,7 A
104,0 A
Proteínas (µg/ml)
f
ND
1,2 B
1,42 A
1,52 A
Bclo a (µg/ml)
DO600
f
0,05 C
0,54 B
0,64 A
0,60 A
CO2 disuelto (ppm)
f
152,7 A
118,0 B
100,6 C
99,1 C
Sulfato (mM)
f
34,0 A
22,4 C
24,8 C
30,4 B
Sulfuro (ppm)
f
ND
ND
ND
ND
Letras minúsculas distintas, en sentido vertical, indican diferencias significativas (P ≤ 0,05) entre
estado inicial y final para cada variable medida.
Letras mayúsculas distintas, en sentido horizontal, indican diferencias significativas (P ≤ 0,05) entre
los distintos consorcios y el control sin inóculo al final del ensayo.
Control: control sin inóculo
i: inicio; f: final.
ND: no determinado
49
Para realizar una comparación entre consorcios y el control sin inóculo al final del ensayo se
hizo un ANDEVA para cada uno de los distintos componentes de la fase gaseosa, la biomasa
total y fotosintética y las variables físico químicas (Tabla 11). Los resultados de las
mediciones se indican en la Tabla 11, éstos muestran que los valores promedio de CH4 de los
consorcios y el control sin inóculo, fluctuaron entre 76,2 % y 78,2 %, encontrándose
diferencias significativas (P ≤ 0,05) entre los consorcios y el control sin inóculo.
En el caso del O2 los valores promedio fluctuaron entre 0,31 y 1,27 %, existiendo diferencias
significativas (P ≤ 0,05) entre los consorcios C5 y C6 y C4 más el control sin inóculo. No
existiendo diferencias significativas (P > 0,05) entre C5 y C6.
Por otra parte, no hubo diferencias significativas (P > 0,05) de pH entre los consorcios al
término del ensayo. Existiendo sólo diferencias significativas (P ≤ 0,05) entre el pH de los
consorcios y el control sin inóculo. La disminución del pH en este último se explicaría, como
se mencionó anteriormente, por la mayor concentración de CO2 disuelto en el medio que
contribuiría a bajar el pH (Alimahmoodi y Mulligan, 2008), respecto a los consorcios, en los
cuales la actividad bacteriana actuaría como tampón o buffer.
Las mediciones promedio de proteínas fluctuaron entre 102,3 µg/ml y 104,0 µg/ml de muestra,
no encontrándose diferencias significativas (P > 0,05) entre consorcios. Respecto de la
concentración de Bclo a, los valores promedios fluctuaron entre 1,2 y 1,52 µg/ml, los
consorcios C5 y C6 presentaron una concentración de Bclo a significativamente mayor (P ≤
0,05) que C4, lo cual refleja una mayor biomasa fotosintética en esos consorcios. Similares
resultados se obtuvieron para la DO600 que actuaría como un reflejo de la Bclo a, en vez de
constituir una medida de la biomasa microbiana total, probablemente debido a la presencia de
pigmentos fotosintéticos.
Los valores promedio de CO2, en la fase gaseosa, que presentaron los consorcios y el control
sin inóculo fluctuaron entre el 18,2 % y el 19,7 % no encontrándose diferencias estadísticas (P
> 0,05) entre éstos. Por otra parte, las concentraciones promedio de CO2 disuelto en el medio
de cultivo correspondiente a los consorcios C4, C5 y C6 son significativamente menores (P ≤
50
0,05) que el control sin inóculo. Considerando que antes de burbujear biogás en el medio de
cultivo, no fue detectado CO2 disuelto en el medio (0 ppm), el CO2 detectado en el control sin
inóculo provendría solo desde el biogás. Es así, que la mayor concentración de CO2 disuelto en
el medio de cultivo del control sin inóculo sugiere que el CO2 proveniente del biogás se
disuelve en el medio de cultivo y se acumula como CO2 disuelto. Por lo tanto, la disminución
del % de CO2 en la fase gaseosa se atribuiría, a la disolución del CO2 en el medio de cultivo y
a la fijación de CO2 por parte de los microorganismos que constituyen los consorcios, este
último, entonces, formaría parte de la biomasa microbiana.
Respecto de la concentración inicial de sulfato en el medio de cultivo, como se mencionó en la
sección Materiales y Método, fue de 26 ppm, el cual fue utilizado como blanco y restado a la
concentración obtenida de cada consorcio y del control sin inóculo para obtener la
concentración de sulfato al final del ensayo para cada tratamiento.
Las concentraciones promedio de sulfato en el medio fluctuaron entre 22,4 ppm y 34 ppm. Se
encontraron diferencias significativas (P ≤ 0,05) entre los distintos consorcios y el control sin
inóculo, correspondiendo la menor concentración de sulfato a C4 y C5 y la mayor
concentración se determinó en el control sin inóculo. Esto último podría explicarse por una
oxidación química del sulfuro a sulfato en presencia del O2 presente en el medio de cultivo. En
el caso de los consorcios la concentración de sulfato sería menor debido al consumo de la
biomasa bacteriana.
Como se mencionó anteriormente, el sulfuro de hidrógeno en la fase gaseosa no fue detectado,
tampoco se detectaron sulfuros en el medio de cultivo (límite de detección del método 1 mM).
Debido a lo anterior, se midió tiosulfato y sulfito, puesto que el sulfuro puede oxidarse
químicamente, en presencia de O2 a estas especies químicas, sin embargo, no fueron
detectados. Debido a lo anterior se realizó una estimación del S teórico proveniente del H2S (ac)
y HS- en el medio de cultivo al inicio del periodo de incubación (día 0), a partir de la
concentración de H2S (g) de 535 ppm, que resultó de 0,090 mM de S (ver apéndice Tabla A3).
51
En la Tabla 12 se muestran las estimaciones de S-H2S
(ac)
en el medio de cultivo obtenidas
mediante la ley de Henry, considerando el equilibrio de sulfuro en la fase acuosa (ecuación de
Henderson-Hasselbach) y, posteriormente, multiplicadas por el cuociente entre el peso
atómico y peso molecular del S y del SO42-, respectivamente (ver apéndice Tabla A3). Se
observa un aumento en S-SO42- en todos los tratamientos al final del ensayo, lo cual como se
mencionó anteriormente, podría producirse por una oxidación química del sulfuro a sulfato en
presencia del O2 presente en el medio de cultivo en el caso del control sin inóculo y, por
consumo de S-SO42- por la biomasa bacteriana.
Tabla 12. Relación entre S-H2S (ac) + S-HS- y S-SO42- en el medio de cultivo.
Periodo de
C4
C5
C6
incubación
Días
mM
mM
mM
*S-H2S (ac) + S-HS
0
0,09
0,09
0,09
S-SO4220
0,08
0,09
0,11
Control sin
inóculo
mM
0,09
0,12
*H2S (ac); S-HS-: Estimación del S teórico proveniente del H2S (ac) y HS- en el medio de cultivo al inicio del
periodo de incubación (día 0), a partir de la concentración de H2S (g) de 535 ppm.
Para obtener el S-H2S (ac) y S-SO42-, se multiplicó la concentración de H2S (ac), HS- y SO42- por la relación entre el
peso atómico del S y el peso molecular del H2S, HS- y SO42-, respectivamente. C: consorcio.
En resumen las diferencias se encontraron en la concentración de Bclo a, DO600, concentración
de CO2 disuelto y concentración de sulfato. C5 y C6 presentaron mayores concentraciones de
Bclo a que C4, lo mismo ocurrió con la DO600, además, presentaron concentraciones de CO2
disuelto significativamente menores que C4. Finalmente, en el caso de la concentración de
sulfato, C6 presentó una concentración significativamente mayor que C4 y C5.
Es así que, basándose en los menores valores de CO2 disuelto y mayores concentraciones de
Bclo a y DO600 que presentaron C5 y C6, estos consorcios fueron seleccionados para su
evaluación en el tiempo y, además, como aquellos consorcios que presentaron la mayor
potencialidad para extraer los principales contaminantes del biogás (Figura 12).
52
C6
C5
Figura 12. Consorcios seleccionados (C5 y C6).
7.- Evaluación de la estabilidad y estructura genética de los consorcios seleccionados en
el tiempo
Debido a que en la etapa de selección, las diferencias en las variables medidas se encontraron
solo en el medio de cultivo (la fase acuosa), en esta etapa de evaluación y monitoreo de los
dos consorcios seleccionados, las mediciones se realizaron solo en el medio de cultivo.
7.1- Determinación del crecimiento y consumo de CO2 de los consorcios en el tiempo
Las curvas de crecimiento de los dos consorcios (C5 y C6) se muestran en la Figura 13A. El
crecimiento se midió como concentración de proteínas totales. La figura muestra que los
consorcios inician la fase exponencial en el día 3 y alcanzan un máximo de crecimiento a los 6
días de incubación, bajo las condiciones de cultivo del ensayo. Posteriormente los datos se
ajustaron mediante la curva de Gompertz modificada (Figura 13B).
53
200
A
180
180
160
160
140
C5
120
100
C6
80
60
Control
Proteínas µ g/ml
Proteínas µ g/ml
200
140
120
60
20
20
0
0
4
6
8
C6
80
40
2
C5
100
40
0
B
0
10 12 14
Tiempo (días)
2
4
6
8
10 12 14
Tiempo (días)
Figura 13. Curvas de crecimiento de los consorcios seleccionados (C5 y C6) y el control sin inóculo,
medidas como concentración de proteínas (µg/ml) durante un periodo de incubación de 13 días. Barras
indican desviación estándar (A). Curvas de crecimiento obtenidas a partir de los datos ajustados de la
Figura 13A mediante la curva de Gompertz modificada (B).
En la Tabla 13 se muestran los valores obtenidos de los parámetros para la curva ajustada de
los consorcios para un periodo de incubación de 13 días. Los valores promedios de
concentración máxima de proteínas (A), velocidad específica máxima de crecimiento (µm) y
fase de latencia (λ) fluctuaron entre 156,93 y 156,51µg/ml; 96,24 y 135,05 (µg/ml)/día; y 2,90
días, respectivamente. Existiendo diferencias significativas (P ≤ 0,05) entre consorcios sólo
para µm. Donde C6 presentó una µm significativamente mayor (P ≤ 0,05) que C5. R2 varió
entre 0,8253 y 0,8620 lo cual indica que el modelo (curva de Gompertz modificada) explica
un 86,20 % de la variabilidad de la concentración de proteínas en C5 y 82,53 % en C6.
Tabla 13. Parámetros (A, µm y λ) obtenidos mediante el ajuste realizado con la curva de
Gompertz modificada, al crecimiento medido como concentración de proteínas de los
consorcios seleccionados para un periodo de incubación de 13 días.
Periodo de
Consorcios
A
R2
µm
λ
Incubación (días) (µg/ml) ((µg/ml)/día)
(días)
13
C5
156,93 a
96,24 b
2,90 a
0,8620
13
C6
156,51 a
135,05 a
2,90 a
0,8253
Letras minúsculas distintas, en sentido vertical, indican diferencias significativas (P ≤ 0,05) entre los
dos consorcios. A: Concentración de proteínas máxima, µm: velocidad específica máx. de crecimiento,
λ: fase de latencia. R2: coeficiente de correlación. Curva de Gompertz modificada: Proteínas = A exp{exp(((µm * exp(1))/A)(λ-t)+1)}. C: consorcio.
54
La determinación de la biomasa fotosintética en el tiempo se midió como concentración de
Bclo a. Los valores fluctuaron entre 0 µg/ml en el día 1 y 2,49 µg/ml en el día 6. Las curvas de
crecimiento de C5 y C6 se muestran en la Figura 14A. Luego, estos datos fueron ajustados
mediante la curva de Gompertz modificada (Figura 14B).
A
2,5
2,0
2,0
C5
1,5
C6
1,0
Control
0,5
0,0
Bclo a µ g /ml
Bclo a µ g /ml
B
2,5
1,5
C5
C6
1,0
0,5
0,0
0
2
4
6
8
10 12 14
0
Tiempo (días)
2
4
6
8
10 12
14
Tiempo (días)
Figura 14. Curvas de crecimiento medidas como concentración de bacterioclorofila a (Bclo a) (µg/ml)
durante un periodo de incubación de 13 días a los consorcios seleccionados (C5 y C6) y el control sin
inóculo. Barras indican desviación estándar (A). Curvas de crecimiento obtenidas a partir de los datos
ajustados mediante la curva de Gompertz modificada (B).
En la Tabla 14 se muestran los valores obtenidos de los parámetros para la curva ajustada de
los consorcios. No se observan diferencias significativas (P > 0,05) entre los consorcios para
los valores Bclo a máxima (A) y fase de latencia (λ). Existiendo diferencias significativas (P ≤
0,05) entre los consorcios sólo para µm. Donde C6 presentó una µm significativamente (P ≤
0,05) mayor que C5. De acuerdo a los valores de R2 el modelo explica un 97,34 % de la
variabilidad de la concentración de Bclo a en C5 y 98,75% en C6.
55
Tabla 14. Parámetros (A, µm y λ) obtenidos mediante el ajuste realizado con la curva de
Gompertz modificada, al crecimiento medido como concentración de Bclo a de los
consorcios seleccionados para un periodo de incubación de 13 días.
Periodo de
A
Consorcios
R2
µm
λ
incubación (días) (µg/ml)
((µg/ml)/día)
(días)
13
C5
2,271 a
0,928 b
3,013 a
0,9734
13
C6
2,091 a
1,346 a
2,957 a
0,9875
Letras minúsculas distintas, en sentido vertical, indican diferencias significativas (P ≤ 0,05) entre los
dos consorcios. A: Bclo a máxima, µm: velocidad específica máx. de crecimiento, λ: fase de latencia, t:
tiempo. R2: coeficiente de correlación. Curva de Gompertz modificada: Bclo a = A exp{-exp(((µm *
exp(1))/A)(λ-t)+1)}. C: consorcio.
Los valores experimentales promedios de la concentración de CO2 disuelto en el tiempo se
muestran en la Figura 15. Se observa una disminución en el tiempo del CO2 disuelto en los
consorcios respecto del control sin inóculo.
180
160
CO2 (ac) ppm
C5
140
C6
120
100
Control
80
60
0
2
4
6
8
10 12 14
Tiempo (días)
Figura 15. Cinética de consumo de CO2 disuelto (CO2 (ac)) (ppm) de los consorcios (C5 y C6) y el
control sin inóculo. Barras indican desviación estándar.
Para determinar cómo varió el CO2 disuelto, al final del ensayo respecto al inicio para cada
consorcio seleccionado y el control sin inóculo, se realizó una prueba t para muestras
dependientes (Tabla 15). La concentración de CO2 disuelto bajó significativamente (P ≤ 0,05)
34,3% en C5 y 32,5% en C6 al final del periodo de incubación; en cambio, en el control sin
inóculo no se produjo variación significativa (P > 0,05), lo cual sugiere que la disminución de
CO2 disuelto de los consorcios al final del periodo de incubación se debería al consumo de
CO2 por parte de la biomasa bacteriana que constituye los consorcios.
56
Fase
acuosa
Tabla 15. Comparación del estado inicial y final de cada consorcio seleccionado, de las
mediciones de CO2 disuelto en un periodo de incubación de 13 días.
CO2 disuelto
(ppm)
i
f
C5
Media ± DE
140,5 ± 0,7
91,8 ± 0,1
C6
Media ± DE
140,5 ± 0,7
94,9 ± 4,4
Control
Media ± DE
141,3 ± 1,2
154,5 ± 5,9
DE: Desviación estándar
Control: control sin inóculo
Por otra parte, para evaluar cambios en la concentración de CO2 de la fase acuosa en el tiempo
se midió el CO2 total (CO2
(ac)
+ HCO3-), los datos muestran que en ambos consorcios se
produce una disminución del CO2 total comparado con el control sin inóculo (Figura 16). El
CO2 total tuvo un comportamiento similar a CO2 disuelto (CO2 (ac)) en la fase acuosa (Figura
15) y la variación que presenta en el tiempo estaría relacionada con la variación del pH del
medio de cultivo. Al reaccionar el CO2 (ac) con el agua, se disocia estableciendo un equilibrio
con el bicarbonato y H+ de acuerdo a la ecuación: CO2 (ac) + H2O ↔ HCO3- + H+ (Manahan,
2005). Por lo tanto, al aumentar el CO2 (ac) en la solución (proveniente del CO2 (g) del biogás),
el equilibrio se desplaza hacia la derecha aumentando la concentración de H+, lo cual genera
una disminución del pH en el medio de cultivo, este hecho se observa en el control sin inóculo
(Figura 17), pero en C5 y C6 a partir del día 3 el pH comienza a aumentar hasta el día 6, lo
cual coincide con una disminución de CO2 (ac) y CO2 total (Figura 15 y 16) y un aumento del
crecimiento bacteriano (Figuras 13 y 14). El CO2 (ac) disminuiría debido al consumo por parte
de miembros de los consorcios, lo cual produciría un desplazamiento del equilibrio hacia la
izquierda disminuyendo el HCO3- y, por lo tanto, el CO2 total.
57
900
CO2 total ppm
C5
800
700
C6
600
Control
500
0
2
4
6
8
10 12 14
Tiempo (días)
HCO3-)
en la fase acuosa (ppm) de los consorcios (C5, C6) y el control
Figura 16. CO2 total (CO2 (ac) +
sin inóculo. Barras indican desviación estándar.
7,5
7,1
C5
pH
6,7
C6
6,3
Control
5,9
5,5
0
2
4
6
8
10 12 14
Tiempo (días)
Figura 17. Curva de pH medido durante un periodo de incubación de 13 días a los consorcios
seleccionados (C5 y C6) y el control sin inóculo. Barras indican desviación estándar.
Durante el periodo de incubación, el pH de los dos consorcios se mantuvo en el rango neutro
entre 7 y 6,3 (Figura 17); disminuyendo durante los primeros 3 días, lo que coincide con la
fase de latencia de la curva de crecimiento y donde el CO2
cultivo como CO2
(ac)
(g)
se disuelve en el medio de
y posteriormente se disocia como se mencionó anteriormente,
disminuyendo el pH. Luego aumenta hasta el día 7, periodo que coincide, aproximadamente,
con la fase exponencial de la curva de crecimiento. Posteriormente, se mantiene relativamente
58
constante hasta el término del periodo de incubación. En el caso del control sin inóculo, el pH
disminuye al inicio de la incubación hasta el día 3 y luego se mantiene sin mayor variación
con valores cercanos a 6,3.
Con los datos experimentales de CO2 disuelto de los dos consorcios seleccionados y el control
sin inóculo se calculó la tasa de remoción de CO2 disuelto según la siguiente expresión:
RCO2 = Cc– Cm * 100
Cc
Donde:
R CO2: Remoción de CO2 disuelto expresada en %
Cc: Concentración de CO2 disuelto en el control sin inóculo (ppm)
Cm: Concentración de CO2 disuelto en la muestra (ppm)
Los valores de RCO2 disuelto experimentales promedio graficadas en el tiempo se muestran en la
Figura 18A. El valor máximo de remoción correspondiente a un 44 % se alcanzó el día 10 de
incubación en ambos consorcios. Posteriormente, estos datos fueron ajustados mediante una
curva hiperbólica (Figura 18B) con el propósito de determinar la cinética de remoción de CO2
disuelto para ambos consorcios.
59
A
R CO2 acumulado (%)
R CO2 acumulado (%)
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
C5
C6
0
2
4
6
8
10
12
14
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
B
C5
C6
0
Tiempo (días)
2
4
6
8
10
12
14
Tiempo (días)
Figura 18. Cinética de remoción de CO2 experimental (%) de los consorcios seleccionados (C5 y C6)
durante un periodo de incubación de 13 días. Barras indican desviación estándar (A). Curvas de
cinética de remoción obtenidas a partir de los datos ajustados de la Figura 18A mediante la curva
hiperbólica (B).
En la Tabla 16 se muestran los valores obtenidos de los parámetros para la curva ajustada de
los consorcios. Los valores promedios de B máx. (% máximo de CO2 disuelto consumido por
cada consorcio) y Kd (constante que representa el tiempo requerido para alcanzar la mitad de
B máx.) fluctuaron entre 53,6 % y 68,6 %; 3,9 y 6,4 días, respectivamente. Existiendo
diferencias significativas (P ≤ 0,05) entre los consorcios para ambos parámetros. Donde C5
presentó una cinética de remoción significativamente (P ≤ 0,05) mayor que C6 (representada
por Kd), pero C6 presentó un potencial de remoción de CO2 significativamente mayor (P ≤
0,05) que C5 (representado por B máx.). Los valores de R2 indican que este modelo explica un
95% de la variabilidad del % de remoción de CO2 disuelto en C5 y C6.
Tabla 16. Parámetros (B máx. y Kd) obtenidos mediante el ajuste realizado con la curva
hiperbólica.
Consorcios
Periodo de
B máx.
Kd
R2
incubación (días)
(%)
(días)
13
0,9513
C5
53,6 b
3,9 b
13
0,9512
C6
68,6 a
6,4 a
Letras minúsculas distintas, en sentido vertical, indican diferencias significativas (P ≤ 0,05) entre los
dos consorcios para un determinado parámetro de la ecuación. RCO2: % de remoción de CO2
acumulado, B máx.: % máximo de CO2 removido por cada consorcio, Kd: Constante que representa el
tiempo requerido para alcanzar la mitad de B máx., t: tiempo. R2: coeficiente de correlación. Función
hiperbólica: RCO2 = (B máx. * t) / (Kd + t). C: consorcio.
60
Los resultados experimentales para la concentración de sulfato durante los 13 días de
incubación se muestran en la Figura 19A. En ambos consorcios la concentración de sulfato
aumenta en las primeras 24 h, lo cual podría representar una acumulación intracelular de algún
intermediario de la oxidación de tiosulfato, seguido por la oxidación a sulfato (Rolls y
Lindstrom, 1967). Posteriormente, la concentración de sulfato disminuye sostenidamente hasta
el día 6, periodo que coincide con la fase exponencial de la curva de crecimiento. En C6 la
concentración de sulfato aumenta durante los días 8 a 10, y en ese mismo periodo la
concentración de sulfato disminuye en C5, lo que sugiere que parte de la biomasa que
constituye ese consorcio estaría metabolizando mayormente sulfato que en C6, posiblemente
debido a diferencias en la composición de los miembros de C5 respecto de C6. Luego, se
obtienen valores cercanos a la concentración del control sin inóculo, que se mantuvo sin
mayor variación durante el periodo de incubación.
40
35
B
0,12
C5
25
C6
20
15
Control
10
0,08
0
0,00
4
6
8
Control
0,04
0,02
2
C6
0,06
5
0
C5
0,10
S-SO42- mM
30
SO42 - ppm
0,14
A
0
10 12 14
2
4
6
8
10 12 14
Tiempo (días)
Tiempo (días)
Figura 19. Curva de sulfato (SO42-) (ppm) medido a los consorcios seleccionados (C5 y C6) y el control
sin inóculo durante el periodo de incubación. Barras indican desviación estándar (A). Curva de S-SO42calculado a partir de la concentración de SO42- en el medio de cultivo de los consorcios seleccionados
(C5 y C6) y el control sin inóculo durante el periodo de incubación. Barras indican desviación
estándar;
: indica estimación de la concentración de sulfuro (0,088 mM) en el medio de cultivo al
inicio del ensayo (B).
De la misma manera que en la etapa de selección, debido a que no se detectó la presencia de
sulfuro en el medio de cultivo, se realizó una estimación del S teórico proveniente del H2S (ac)
y HS- en el medio de cultivo al inicio del periodo de incubación (día 0), a partir de la
concentración de H2S (g) de 505 ppm (ver apéndice, Tabla A3), que resultó de 0,088 mM de S,
61
indicado con una flecha de color rojo en la Figura 19B,, se espera que la concentración de
sulfuro disuelto disminuya durante las primeras horas por oxidación química a tiosulfato, el
intermediario más estable de la oxidación de sulfuro a sulfato. Además,
Además en la Figura 19B se
2presentan los resultados de S-SO
S
4 , que corresponde al S que aporta el sulfato al medio de
cultivo durante el periodo de incubación.
incubación
7.2- Determinación de los perfiles de T
T-RFLP
7.2.1- Amplificación del DNA de los consorcios seleccionados.
Para evaluar la estabilidad de los consorcios bacterianos
bacterianos seleccionados (C5 y C6), se
determinó la estructura genética de ellos mediante perfiles de T-RFLP
RFLP del gen que codifica
para rRNA 16S. Los consorcios fueron incubados durante 13 días y se determinó el perfil de
T-RFLP
RFLP en ocho tiempos de muestreo, correspondientes a los días 1, 2, 4, 5, 6, 7, 10 y 13 de la
curva de crecimiento. Para lo cual se amplificó el DNA extraído de cada consorcio utilizando
u
los partidores fD1 y rP2, donde el partidor fD1 de la mezcla de amplificación estuvo marcado
fluorescentemente con FAM
FAM. Como resultado de la amplificación y posterior purificación del
producto de PCR, se obtuvo una banda de ~1500 pb correspondiente
te al tamaño esperado del
gen ribosomal (Figura 20).
20
Mar
Mar 1d
3d
4d
5d
6d
7d
10d 13d 1d
3d
4d
5d
6d
7d
10d
13d Mar
~1500 pb
C5
C6
Figura 20.. Producto de amplificación purificado de muestrass de C5 y C6 durante un periodo de
incubación de 13 días, para el análisis de T-RFLP.
T
1d (1 día); 3d (3 días); 4d (4 días); 5d (5 días); 6d (6
días); 7d (7 días); 10d (10 días); 13d (13 días). Mar: marcador molecular 100 bp.
62
7.2.2- Determinación de la estructura genética de los miembros del consorcio
Una vez confirmada la presencia de los fragmentos del tamaño esperado, éstos se digirieron
con la enzima de restricción AluI (Fermentas) y se analizó la frecuencia relativa de los
distintos fragmentos de restricción terminales (TRFs) para cada consorcio (C5 y C6) en los
distintos tiempos.
Los perfiles de TRFs obtenidos para cada consorcio durante el tiempo de incubación se
muestran en la Figura 21. Los perfiles muestran que ambos consorcios son estables en su
estructura durante el tiempo de incubación estudiado.
Dado que ambos consorcios están enriquecidos en un tipo bacteriano, sus perfiles de T-RFLP
son altamente homogéneos, con un TRF predominante en el rango de 201-209 correspondiente
a Rhodopseudomonas sp. Los perfiles de T-RFLP muestran que C6 presenta una mayor
estabilidad en cuanto a la proporción en que se encuentran los distintos tipos bacterianos que
lo componen comparado con C5.
En C5, además, se observa la aparición del TRF 213-216 en los tiempos 3d, 4d, 5d y 10d, el
cual disminuye su abundancia relativa al aumentar el tiempo de incubación. Este TRF no se
detectó en el inóculo inicial (I5). También se observa variaciones en la abundancia del TRF
242-250.
63
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Inóculo
I5 1
100%
C5
80%
436
70%
242-250
60%
222-225
50%
213-216
40%
5
6
7 10 13
201-209
158-169
20%
187
4
231-239
30%
201-209
3
C6
90%
10%
56-61
127
0%
Inóculo
Periodo de incubación (días)
1
3
4
5
6
7
10 13
Periodo de incubación (días)
Figura 21. Frecuencias relativas de TRFs de los consorcios C5 y C6 (expresadas como porcentaje
relativo de fluorescencia, % UF) obtenidos por digestión con la enzima de restricción Alu I, para el gen
del rRNA 16S de bacterias, en un periodo de incubación de 13 días. I5, I6: inóculo de los consorcios 5
y 6 respectivamente equivalente a t=0. Tiempo de incubación: 1d, 3d, 4d, 5d, 6d, 7d, 10d, 13d días
Para relacionar los clones de las genotecas con los TRFs obtenidos en los perfiles de cada
consorcio, las secuencias de los clones se digirieron in silico con la enzima AluI. Con esto se
pudo relacionar los clones identificados en las genotecas (Figura 11) con un TRF específico
encontrado en el perfil de T-RFLP de cada consorcio.
La Tabla 17 muestra que el 87,2 % de los TRFs del inóculo de C5 (I5) se relacionan con el
género Rhodopseudomonas sp. Además, la clase Bacteroidetes junto con los géneros
Castellaniella sp. y Xanthobacter sp. constituirían el 12,9 % de los TRFs restantes. En cambio
en el inóculo de C6 (I6) los cuatro TRFs obtenidos se asocian con Rhodopseudomonas sp.
64
Tabla 17. Distribución de los principales TRFs en los inóculos (I5 e I6) de los consorcios
C5 y C6.
Experimental
In silico
Consorcio Géneros bacterianos
TRF (pb)
Abundancia
TRF (pb) Abundancia
(%)
(%)
Rhodopseudomonas sp.
C5
187
1,6
191
25,0
201-209
84,8
200
21,4
222-225
0,8
226
3,6
C5
Xanthobacter sp.
436
1,2
437
7,1
C5
Castellaniella sp.
56-61
3,1
54/57
10,7
C5
Bacteroidetes (clase)
242-250
8,6
245
3,6
C6
Rhodopseudomonas sp.
127
0,4
125
3,1
158-169
0,8
162
3,1
201-209
97,6
200
21,9
231-239
1,2
234/241
3,1
En C6 se observa una dominancia total de Rhodopseudomonas sp. (Figura 21), sugiriendo que
aquellos TRFs que, eventualmente, pudieron relacionarse con otros géneros bacterianos, como
aquellos encontrados en la genoteca de C6 (Figura 11), se encontrarían en una proporción muy
baja de manera que no alcanzarían a detectarse con la técnica T-RFLP, debido su baja
abundancia en las muestras de C6.
Además, considerando la Figura 21 con la Tabla 17 se desprende que el TRF 213-216 no se
detectó en el inóculo 5 (I5), sino que aparece durante el periodo de incubación. Este TRF se
asocia al género Xanthobacter sp. No obstante, en I5 se detecta el TRF 436 también asociado
con Xanthobacter sp., lo cual se explicaría por una digestión parcial por parte de la enzima de
restricción Alu I. Es así, como en C5 predomina Rhodopseudomonas sp. durante el periodo de
incubación de 13 días, pero en los tiempos de incubación 3d, 4d y 5d, que coincide con la fase
exponencial de crecimiento de C5, es detectado Xanthobacter sp., que reaparece en un bajo %
en 10d. En el caso de Bacteroidetes, se detecta en 7d, 10d y 13d, periodo que coincide con la
fase estacionaria.
65
DISCUSIÓN
En el dominio Bacteria se encuentran numerosos tipos de microorganismos con estrategias
metabólicas que pueden utilizarse para llevar a cabo procesos biotecnológicos como la
purificación de biogás. Entre los contaminantes prioritarios del biogás se encuentran el CO2 y
el H2S, los cuales podrían ser removidos de la fase gaseosa mediante bacterias que posean
estrategia metabólica fotoautotrófica como el proceso de fotosíntesis anoxigénica, que es
realizada por bacterias púrpuras o verdes del S y púrpuras o verdes no del S. Además, existen
otras bacterias como bacterias incoloras del S (Madigan et al., 2006) que son capaces de fijar
el CO2 y utilizar H2S como dador de electrones entre otros.
Estos microorganismos están ampliamente distribuidos en diversos ambientes, dado que los
componentes esenciales para su metabolismo como el CO2 y dadores de electrones como el
H2S, tiosulfato o Sº se encuentran en distintos ambientes naturales como por ejemplo: lagos,
sedimentos de agua dulce y suelos, y también en ambientes generados por invenciones
antrópicas como rellenos sanitarios (Madigan et al., 2006; Zuroff y Curtis, 2012). Es así, que
para este estudio se utilizaron lixiviados de un relleno sanitario como fuente de
microorganismos debido a la gran diversidad microbiana que sustentan (Liu et al., 2011;
Zhang et al., 2011) y debido a que los microorganismos que contienen serían resistentes a
altas concentraciones de CH4 presentes en el biogás.
8.- Estandarización del medio de cultivo y pre-selección de los consorcios
La etapa de pre-selección estuvo orientada a favorecer el crecimiento de bacterias capaces de
fijar CO2, remover H2S y, adicionalmente, que no metabolizaran CH4 desde una atmósfera de
biogás, de modo que la concentración de este gas, con propiedades combustibles, no
disminuyera en la atmósfera gaseosa.
Después de un periodo de aclimatación de tres meses, se observó un escaso crecimiento
bacteriano con CO2 y HCO3- en un medio salino suplementado con Na2S. No obstante, esta
fue la primera presión de selección aplicada que permitió favorecer el inicio del
establecimiento de los consorcios con la función de interés.
66
Debido a lo anterior y dada la conocida capacidad de los microorganismos fotosintéticos,
respecto al uso de sustratos orgánicos simples para promover su crecimiento (Stanier et al.,
1959; Sadler y Stanier, 1960), se escogió como fuente de C y/o dador de electrones: el acetato,
por corresponder a un compuesto de C orgánico de fácil asimilación y común en ambientes
microaerófilos y anaeróbicos (Fenchel y Bland, 1995). La adición de acetato aumentó el
crecimiento bacteriano en los seis consorcios evaluados, encontrándose que, en la mayoría de
éstos (C1, C2, C5 y C6), existió una interacción entre el acetato y el biogás (Tabla 6). Además,
el crecimiento fue mayor que con acetato y CO2 en esos consorcios. En presencia de acetato y
CO2 no existió una fuente de sulfuro disponible para potenciales bacterias fotoautotróficas del
S, que pudieran utilizarlo como dador de electrones.
Por otra parte, el mayor crecimiento del tratamiento con acetato y biogás sugiere la presencia
de algún componente en el biogás, que podría generar una interacción sinérgica que se
manifiesta en un aumento en el crecimiento en esos consorcios (como por ejemplo: H2S,
S2O32-). Adicionalmente, en todos los consorcios crecidos con acetato y biogás se observó la
aparición de una pigmentación púrpura durante el periodo de incubación (Figura 4), lo cual
podría indicar la presencia de bacterias púrpuras del S o púrpuras no del S como parte de los
consorcios (Barbosa et al., 2001; Madigan et al., 2006).
De esta manera, con la adición del acetato como fuente de C, se estandarizó el medio de
cultivo, aumentó el crecimiento bacteriano y, además, se asoció la aparición de una
pigmentación púrpura a la presencia de la función de interés.
Los resultados experimentales de la concentración de CO2 disuelto en el medio de cultivo
muestran que se incrementa en el tiempo, tanto en los medios inoculados como en el control
sin inóculo. Sin embargo, la acumulación de CO2 es menor en los consorcios (Figura 6, Tabla
8). Por otra parte, dado que antes de burbujear biogás en el medio de cultivo, no se detectó
CO2 disuelto, el CO2 medido en el control sin inóculo provendría solo desde el biogás y luego
se acumula como CO2 disuelto. En el caso de los consorcios, la presencia de CO2 disuelto
provendría del biogás, y también, existiría una fuente adicional de CO2 proveniente de la
67
actividad metabólica de aquellos microorganismos que degradan el acetato y generan CO2
como producto metabólico (Alimahmoodi y Mulligan, 2008), por lo cual sería esperable un
mayor contenido de CO2 en los consorcios. No obstante, los resultados muestran que, en los
consorcios, la concentración de CO2 disuelto es menor que en el control sin inóculo (Tabla 8),
lo cual estaría indicando que los distintos consorcios estarían constituidos por grupos
microbianos capaces de consumir el CO2 disuelto presente, situación consistente con la
presencia del género Rhodopseudomonas sp. en los consorcios (Figura 11), que se caracteriza
por su capacidad para fijar CO2 y sustentar una estrategia metabólica autotrófica.
9.- Selección de consorcios, fijación de CO2 disuelto y remoción de H2S presente en el
biogás
De acuerdo con los datos linealizados de la concentración de CO2 disuelto en el medio de
cultivo, los consorcios C4, C5 y C6 fueron pre-seleccionados, por presentar una mayor
pendiente comparados con los demás consorcios (Tabla 9), lo que se relaciona con un mayor
consumo neto de CO2 disuelto (o menor concentración de CO2 disuelto), por parte de los
miembros de estos consorcios durante los primeros días de incubación, lo que coincide con la
fase exponencial de la curva de crecimiento (Figura 5). Cabe considerar que en esta etapa los
consorcios podrían estar constituidos tanto por microorganismos que fijan CO2 (fototrofos o
quimiolitotrofos) como por microorganismos que lo generan como producto metabólico
(heterótrofos).
Para evaluar que los consorcios pre-seleccionados C4, C5 y C6 poseen, en su composición,
microorganismos fotoautotróficos con capacidad potencial de fijar CO2 y utilizar H2S, se
compararon distintas propiedades fisiológicas. De acuerdo a esto, no se encontraron
diferencias significativas entre consorcios en relación al pH y la concentración de proteínas.
Sin embargo, cuando se comparó el CO2 disuelto, se encontró que el consorcio C4 presentó
mayor contenido de CO2 en el medio de cultivo y menor contenido de Bclo a (Tabla 11), lo
cual sugiere que este consorcio presenta menor eficiencia en la fijación de C que los
consorcios C5 y C6.
68
En relación a la remoción de sulfuros, habría que mencionar que éstos no fueron detectados en
el medio de cultivo en la etapa de selección (Tabla 11), y esta situación, se confirmó en los
primeros días de incubación de la etapa de monitoreo. Esta ausencia podría explicarse debido
a la oxidación química de sulfuro que, en presencia de oxígeno, y antes de oxidarse a sulfato,
genera intermediarios (Nielsen et al., 2003) que podrían ser utilizados como dadores de
electrones en el proceso de fotosíntesis. La oxidación química del sulfuro a sulfato ocurre
espontáneamente en soluciones acuosas en presencia de O2, como es el caso de este sistema
experimental, generando intermediarios como Sº, polisulfuros, sulfito y tiosulfato, siendo los
intermediarios más comúnmente encontrados sulfito y tiosulfato (Cline y Richards, 1969;
Nielsen et al., 2003). Por otra parte, se ha encontrado que el tiosulfato es un intermediario
estable durante las primeras 72 horas en soluciones acuosas aireadas (O’Brien y Birkner,
1977). Es así, que los intermediarios de la oxidación química del sulfuro podrían influir en la
oxidación biológica del sulfuro, puesto que alguno de éstos y, especialmente, el tiosulfato
podría utilizarse como dador de electrones dado su estabilidad y, finalmente, oxidado
mediante la actividad bacteriana a sulfato. En otras palabras, debido a que la velocidad de la
oxidación química de H2S
(ac)
para generar intermediarios es mayor que la velocidad de
oxidación química de los intermediarios a sulfato (Nielsen et al., 2003), la concentración
significativamente mayor de sulfatos en el control sin inóculo, respecto a los consorcios (Tabla
11), podría explicarse por la oxidación química del sulfuro disuelto (H2S (ac)) que proviene del
biogás (H2S
(g)).
En el caso de los consorcios existiría, además, un consumo de sulfato
mediante una vía asimilativa por parte de la biomasa microbiana (Imhoff, 2006; Wiegel,
2006). En C6 la oxidación biológica del tiosulfato a sulfato se realizaría, principalmente, por
bacterias fotoanoxigénicas (Larimer et al., 2004, Luo et al., 2013) y, en el caso de C5, además,
por quimiolitotrofos microaerófilos como Xanthobacter (Meijer et al., 1990).
En forma paralela, se evaluó si en los consorcios C4, C5 y C6 existe la potencial actividad
fotosintética anoxigénica, para lo cual se buscó la presencia de un gen involucrado en esta
función, como el gen PufM que codifica para la subunidad M del centro de reacción
fotosintética, el cual está universalmente distribuido en el grupo de las bacterias púrpuras y no
púrpuras del S. Este marcador tiene la ventaja de ser especifico de este grupo funcional de
bacterias (Achenbach et al., 2001; Zeng y Jiao, 2007; Atamna-Ismaeel et al., 2012). Es así,
69
que la obtención de un amplicón específico con el tamaño esperado (Figura 9) sugiere que los
consorcios poseen microorganismos fotosintéticos del tipo fotoanoxigénico. Posteriormente, la
presencia de estos grupos microbianos fueron corroborados con la construcción de una
genoteca para cada consorcio, revelando el predominio de bacterias del género
Rhodopseudomonas sp. en los tres consorcios seleccionados, aunque, en distinta proporción
(Figura 11). Finalmente, considerando las propiedades indicadas anteriormente y,
específicamente la mayor concentración de Bclo a y menor concentración de CO2 disuelto, se
seleccionaron C5 y C6 para continuar con la etapa de monitoreo y evaluar la estabilidad de los
dos consorcios.
10.- Propiedades fisiológicas de los consorcios seleccionados: C5 y C6
Para evaluar el comportamiento de ambos consorcios durante la curva de crecimiento (Figura
13) se estudió su estabilidad de acuerdo a la función de interés. Sin embargo, debido a que en
la etapa de selección las diferencias en las variables medidas se encontraron solo en la fase
acuosa; en la etapa de monitoreo, la mediciones se realizaron en el medio de cultivo.
Respecto a la evaluación de la biomasa fotosintética (concentración de Bclo a), no se
encontraron diferencias significativas en la fase de latencia (λ) y, tampoco, en la máxima
concentración de Bclo a (A) en los consorcios C5 y C6, siendo la velocidad máxima de
crecimiento (µm) significativamente menor en C5 (Tabla 14). Similares resultados se
observaron en la biomasa total (concentración de proteínas) (Tabla 13), lo cual, en conjunto
con los resultados de las genotecas (Figura 11) y los perfiles de T-RFLP (Figura 21), indicaría
que la funcionalidad de los consorcios estaría determinada, principalmente, por la actividad de
microorganismos que realizan fotosíntesis.
En los consorcios el consumo de CO2 en el medio de cultivo, aumentó en el periodo que
coincide con la fase exponencial de la curva de crecimiento, lo cual se refleja en la
disminución de CO2 disuelto y CO2 total entre los días 3 y 6 en comparación con el control sin
inóculo (Figuras 15 y 16), lo que además se relaciona con el aumento del pH en el medio de
cultivo en ese periodo, al compararlo con el control sin inóculo (Figura 17). Por otra parte, el
70
consorcio C5 presentó una cinética de remoción de CO2 más rápida que C6, no obstante este
último mostró un potencial de remoción mayor (Tabla 16).
Finalmente, respecto a la concentración de sulfato, ésta disminuyó en la fase exponencial
respecto al control sin inóculo (Figura 19A), confirmando un consumo de sulfato por parte de
la biomasa microbiana (Imhoff, 2006; Wiegel, 2006), situación observada en la etapa de
selección. Estos resultados reflejarían una concentración de sulfato neta, que consideraría, por
una parte, una entrada de sulfato proveniente de una acumulación intracelular de
intermediarios de la oxidación de tiosulfato (día 1 del periodo de incubación; Figura 19A)
(Rolls y Lindstrom, 1967) y oxidación biológica de tiosulfato, y, por otra parte, consideraría
un consumo de sulfato de la biomasa microbiana. Por lo tanto, con los resultados de sulfato en
esta etapa de monitoreo no es posible confirmar la oxidación biológica de tiosulfato propuesta
en la etapa de selección.
11.- Composición bacteriana y estabilidad genética de los consorcios seleccionados
La aproximación utilizada para conocer la composición bacteriana de los consorcios fue la
construcción de una genoteca o librería de clones donde los altos valores de cobertura de C5 y
C6, que indica la relación entre el número de tipos de géneros observados y el máximo de
tipos de géneros esperados, muestra que se detectó una importante fracción de los tipos de
géneros bacterianos presentes en los consorcios (Tabla 10).
En las genotecas se encontró un mayor número de géneros que aquellos identificados con TRFLP. Esto podría explicarse por la eliminación de TRFs poco representados en la muestra
(baja fluorescencia) durante la estandarización del método, ya que estos se encuentran en el
límite de discriminación de la técnica (Dunbar et al., 1999; Schütte et al., 2008). Es el caso,
por ejemplo, de Sphingobium sp., Xanthobacter sp. y Alcaligenaceae en C6 (Figura 11 y 21).
No obstante lo anterior, el T-RFLP y la construcción de librerías de clones son técnicas
complementarias, ya que la secuenciación de los insertos de los clones y su posterior
71
comparación con la base de datos, se usa para interpretar los perfiles del T-RFLP, debido a
que a partir de éstos no se puede recuperar las secuencias (Schütte et al., 2008).
Las genotecas construidas a partir de los consorcios C4, C5 y C6 muestran que el género
mayormente representado fue Rhodopseudomonas sp. Aunque, además se obtuvieron otros
clones pertenecientes a los géneros Xanthobacter sp., Castellaniella sp. y Sphingobium sp. con
una abundancia significativa que podrían contribuir a las propiedades fisiológicas de los
consorcios (Figura 11).
No obstante, el género Rhodopseudomonas sp. es el componente dominante tanto en la
genoteca como en los perfiles de T-RFLP, indicando que existiría una estructura estable de los
consorcios seleccionados (C5 y C6) que se mantuvo en el tiempo durante el periodo de
incubación y que podría explicar las propiedades fisiológicas que presentan los consorcios
(Figura 21). Al respecto, Rhodopseudomonas sp. es un género constituido por bacterias
púrpuras no del S, que presentan una gran versatilidad metabólica en términos de sus fuentes
de carbono, pudiendo fijar CO2, o bien, utilizar diversas fuentes de carbono orgánico tales
como acetato, succinato, butirato, malato, citrato, formato, benzoato, entre otras. Además,
bacterias del género Rhodopseudomonas utilizan diferentes fuentes de energía (luz,
compuestos inorgánicos y orgánicos) (Larimer et al., 2004), es así que pueden crecer en forma
fotoheterotrófica (principal estrategia metabólica), fotoautotrófica o por fermentación, e
incluso, respiración aeróbica y anaeróbica (Imhoff, 2006). Por otra parte, estas bacterias
pueden cambiar de estrategia metabólica en respuesta a cambios en las condiciones
ambientales (Rolls y Lindstrom, 1967; Viale et al., 1985; Butow y Bergstein-Ben Dan, 1991;
Karpinets et al., 2009).
Por otra parte, dado que el biogás contiene O2 (baja proporción 0,3 %) como parte de su
composición, la selección de bacterias que realizan fotosíntesis anoxigénica como bacterias
verdes o púrpuras S, resultó poco favorecida debido a su alta sensibilidad a la presencia de
pequeñas concentraciones de O2 (Zehnder, 1988; Overmann y Schubert, 2002), sin embargo
las condiciones de selección permitieron el establecimiento de un consorcio dominado por un
tipo de bacteria púrpura no del S, Rhodopseudomonas sp. como se mencionó anteriormente.
72
Si bien es cierto, que Rhodopseudomonas crece preferentemente con una estrategia metabólica
fotoheterotrófica, pudiendo utilizar acetato como fuente de C y energía y/o acetato como
fuente de C y tiosulfato como fuente de energía (Rolls y Lindstrom, 1967; Larimer et al.,
2004), bajo las condiciones de cultivo del consorcio (fotosintética microaerófila), se podría
esperar que Rhodopseudomonas usara CO2 como fuente de C y acetato como dador de
electrones como fue reportado por Butow y Bergstein-Ben Dan, 1991, en similares
condiciones experimentales a las realizadas en este estudio, lo cual se relaciona con la
disminución de CO2 que se corresponde con la fase exponencial de la curva de crecimiento
(Figura 15).
Adicionalmente, a la capacidad de consumo de CO2 que presenta el consorcio C5 podrían
contribuir además bacterias del género Xanthobacter sp., las cuales fueron detectadas en un
24,5 % en la genoteca (Figura 11) y se detectó en los perfiles de T-RFLP (Figura 21) en la fase
exponencial de la curva de crecimiento. Los representantes del género Xanthobacter presentan
metabolismo autotrófico fijando CO2 y utilizando diversas fuentes de energía como H2,
metanol, formato y tiosulfato (Meijer et al., 1990; Padden et al., 1998), además de presentar
crecimiento heterotrófico (Meijer et al., 1990) y, también, mixotrófico utilizando como fuente
de C ácido acético y otras fuentes de C orgánico (Padden et al., 1998).
Por otra parte, Castellaniella sp. es un género formado por bacterias facultativas anaeróbicas
que pueden metabolizar diferentes compuestos como fuente C, como por ejemplo: succinato,
acetato, citrato, fumarato, glutarato, entre otras mediante un metabolismo heterotrófico
(Kämpfer et al., 2006; Liu et al., 2008). Este género tuvo un porcentaje de representación de
18 % en la genoteca de C5 (Figura 11), sin embargo, de acuerdo a los perfiles de T-RFLP
(Figura 21), solo se detecta en un muy bajo porcentaje al inicio de la fase estacionaria. Puede
sustentar su crecimiento, eventualmente, metabolizando ácidos grasos generados como
productos metabólicos en la fase exponencial de la curva de crecimiento, sin aportar
mayormente a las propiedades fisiológicas de interés del consorcio.
73
Sphingobium sp. es un género heterotrófico aeróbico y metabólicamente versátil, es por eso
que crecen con diferentes fuentes de C y en condiciones que presentan bajo nivel de nutrientes
y pueden sobrevivir con falta de éstos (Balkwill et al., 2006; Yan et al., 2010). Este género
tuvo un alto porcentaje de representación en la genoteca (39,2 %) de C4 pudiendo metabolizar
eficientemente el acetato en desmedro de Rhodopseudomonas, de hecho en la etapa de
selección, C4 presentó menor concentración de Bclo a que C5 y C6 (Tabla 11) y, al igual que
Castellaniella, puede considerarse como parte de la biota acompañante de las bacterias
representadas por los principales géneros (Rhodopseudomonas y Xanthobacter).
Bacteoroidetes es una clase que se encuentra escasamente representada en las genotecas de C5
y C6 (Figura 11), pero que presenta una abundancia creciente en los perfiles de T-RFLP de C5
(Figura 21) en la fase estacionaria de la curva de crecimiento (Figura 13). Los representantes
de esta clase poseen un metabolismo versátil que les permite colonizar ambientes aeróbicos,
microaerófilos y anaeróbicos; se han descrito como bacterias relacionadas con la degradación
de materia orgánica compleja como proteínas y polisacáridos en distintos ambientes (Thomas
et al., 2011) y monosacáridos como glucosa (Ito et al., 2012) que, al fermentarlos, producen
ácidos grasos como propionato, succinato y acetato. Los miembros de esta clase requieren
altas concentraciones de CO2 ya sea porque requieren fijarlo, o bien, porque compiten de
manera más exitosa por los recursos bajo estas condiciones (Fischbach y Sonnenburg, 2011),
por lo tanto, dependiendo del género perteneciente a Bacteroidetes podría contribuir a la
fijación de CO2, o bien, mediante fermentación generar ácidos grasos que podría metabolizar
Rhodopseudomonas, lo que podría mantener la funcionalidad del consorcio en el tiempo.
En general, se acepta que una comunidad microbiana constituida por especies o grupos
funcionales capaces de una respuesta diferencial puede mantener o aumentar su estabilidad en
el tiempo y, que comunidades especializadas con pocas especies microbianas dominantes
podrían resultar más frágiles y requerir mayor tiempo de recuperación (McCann, 2000).
En el caso de los consorcios seleccionados, existiría un tipo bacteriano dominante en el
tiempo, lo cual, en principio, podría sugerir el establecimiento de un sistema altamente
inestable. Sin embargo, la versatilidad metabólica de Rhodopseudomonas sp., podría explicar
74
su rápida aclimatación a los cambios abióticos producidos durante el periodo de incubación
(variaciones de pH debido a la disolución y disociación del CO2 en el medio de cultivo), lo
cual se reflejaría en los TRFs dominantes (202-209; 222-225 y 231-239) asociados a
Rhodopseudomonas y explicaría, además, la homogeneidad encontrada en la estructura de los
consorcios, especialmente en C6.
Adicionalmente, los resultados de CO2 disuelto en el tiempo (Figura 15) que muestran una
disminución sostenida durante el periodo de incubación, en ambos consorcios en comparación
con el control sin inóculo, y específicamente en el periodo en que se midió la fase estacionaria
(días 7 a 13), éste podría considerarse como un indicador de la estabilidad de los consorcios,
ya que su disminución es consistente con la no detección de actividad de bacterias
heterotróficas que generen CO2 al medio de cultivo.
12.- Aplicación de los consorcios seleccionados a la remoción de los principales
componentes del biogás y otras posibles aplicaciones
La composición, las propiedades fisiológicas y la estabilidad de los consorcios seleccionados
sugieren que pueden optimizarse para su uso en la purificación del biogás reduciendo sus
principales contaminantes, a pesar de no observarse diferencias significativas en la
concentración de CO2
(g)
y que el H2S
(g)
no fuera detectado, en la fase gaseosa, por el
analizador entre los consorcios y el control sin inóculo bajo las condiciones de cultivo.
Es así, que la potencialidad de los consorcios seleccionados para remover los contaminantes
del biogás radica principalmente, en la versatilidad metabólica de los representantes del
género Rhodopseudomonas sp. que pueden utilizar H2S y tiosulfato como dadores de
electrones y CO2 como fuente de C e incluso utilizar fuentes de C orgánico de fácil
asimilación para favorecer su crecimiento (Rolls y Lindstrom, 1967; Butow y Bergstein-Ben
Dan, 1991; Larimer et al., 2004; Luo et al., 2013).
La disminución de H2S desde 535 ppm a niveles no detectados en la fase gaseosa y acuosa,
tanto en los consorcios como en el control sin inóculo, sugiere que el H2S
(g)
se disuelve y
disocia en el medio de cultivo y posteriormente se oxida a sulfato, en presencia de O2,
75
estableciendo un equilibrio químico que favorece la formación de sulfato. En un sistema de
cultivo continuo se esperaría que al adicionar una nueva carga de sulfuro, se produciría una
saturación del medio de cultivo y el equilibrio, entonces, se desplazaría hacia la formación de
H2S
(g)
(Manahan, 2005). En el caso de los consorcios seleccionados, éstos podrían
metabolizar tiosulfato, intermediario de la oxidación química del sulfuro a sulfato y, además,
utilizar el sulfato generando biomasa microbiana; similar situación ocurriría con el CO2
(g)
(Manahan, 2005), en el caso de este último, además, se encontró una disminución significativa
en la concentración de CO2 disuelto en los consorcios respecto al control sin inóculo (Figura
15) y, también, al inicio y final del ensayo (Tabla 11). El CO2 disuelto, entonces, contribuiría
al crecimiento del consorcio junto con el acetato.
Al utilizar un sistema continuo y mantener el cultivo en la fase exponencial, se podría evaluar
si la disminución de la concentración en el CO2 disuelto de los consorcios se refleja en una
disminución del CO2 (g) en la fase gaseosa de cada consorcio respecto al control sin inóculo.
Además de evaluar diferentes concentraciones de sulfuro o tiosulfato.
Por otra parte, varios estudios se han realizado con bacterias fotosintéticas y la extracción de
H2S y CO2, bacterias verdes del S como Chlorobium (Cork et al., 1985; Syed y Henshaw,
2003), bacterias púrpuras del S como Allochromatium y reducción de sulfuros (Borkenstein y
Fischer, 2006) en medios anaeróbicos. No obstante, la ventaja de utilizar medios de cultivo
microaerófilos, como es el caso de este estudio, es que existe la posibilidad de utilizar un tipo
de biogás con mayor concentración de sulfuro (por ejemplo, proveniente del tratamiento de
aguas residuales), puesto que este sería oxidado en forma química por el O2 presente en el
medio de cultivo, disminuyendo su concentración al nivel tolerado por las bacterias púrpuras
no del S como Rhodopseudomonas sp. (0,5 mM) (Imhoff, 2006). González-Sánchez y Revah,
2007, encontraron que un consorcio quimioautotrófico creció en concentraciones de
intermediarios de la oxidación de sulfuro seis veces mayor, que la concentración de sulfuro
inhibitoria para ese consorcio (1,19 mM), permitiendo mayores tasas de carga de sulfuro. Esta
sería una forma de compensar la mayor tolerancia al sulfuro que presentan las bacterias verdes
del S (4 mM) (Overmann y Schubert, 2002) y púrpuras del S (2 mM) que crecen en
condiciones estrictamente anaeróbicas (Zehnder, 1988; Borkenstein y Fischer, 2006).
76
Los consorcios seleccionados también podrían optimizarse, ajustando variables como la
intensidad luminosa, temperatura, pH del medio de cultivo y volumen inicial de inóculo
(Carlozzi y Sacchi, 2001; Carlozzi et al., 2006). Además, la capacidad de Rhodopseudomonas
sp. para metabolizar compuestos orgánicos (acetato, piruvato, lactato, propionato, citrato, etc.)
permitiría acelerar la producción de inóculos para cualquier tipo de aplicación (Kantachote et
al., 2005).
Adicionalmente, el uso de consorcios bacterianos con una alta abundancia de
Rhodopseudomonas sp. permite la posibilidad de contribuir en el tratamiento de aguas
residuales y tratamiento de olores (Kim et al., 2004), metabolizando los ácidos grasos
presentes, así como sulfuro y tiosulfatos (Kantachote et al., 2005), además, posteriores
aislamientos de Rhodopseudomonas sp., permitirían utilizar esta biomasa bacteriana en la
alimentación animal debido a su alto contenido proteico o como biofertilizante por su alto
contenido en nitrógeno (Carlozzi y Sacchi, 2001); otros estudios han propuesto a
representantes de Rhodopseudomonas sp. en la producción de hidrógeno, una fuente de
energía limpia y sustentable ambientalmente (Barbosa et al., 2001; Lee et al., 2002; Ying et
al., 2008).
Finalmente, en este trabajo, a partir de una fuente de microorganismos proveniente de la
invención antrópica (relleno sanitario) se seleccionaron dos consorcios bacterianos con la
potencialidad de remover los principales contaminantes del biogás, favoreciendo su
establecimiento mediante enriquecimiento de cultivo.
77
CONCLUSIONES
A partir de muestras ambientales y utilizando una estrategia de selección, basada en la
formulación del medio de cultivo y una atmósfera de biogás, es posible aclimatar
microorganismos fotosintéticos anoxigénicos y obtener consorcios enriquecidos en estas
bacterias.
Los dos consorcios seleccionados están constituidos por bacterias fotosintéticas con
potencialidad de remover CO2 y H2S desde una atmósfera de biogás.
La bacteria púrpura no del S del género Rhodopseudomonas sp., cuyos representantes pueden
crecer en forma fotoautotrófica, son el grupo dominante en los consorcios seleccionados. No
obstante, en el caso de C5, bacterias del género Xanthobacter sp., también podrían contribuir a
la funcionalidad del consorcio.
Ambos consorcios mantuvieron una estructura estable en el tiempo de acuerdo a los perfiles
genéticos de T-RFLP basados en el marcador molecular rDNA 16S.
78
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88
CONGRESOS Y PUBLICACIÓN
Quiroz, Madelaine; Carú, Margarita. 2011. Diseño de un protocolo de selección de inóculos
bacterianos para la extracción de H2S y CO2 desde una muestra de biogás. IV Jornadas de
Investigación Doctorado Ciencias Silvoagropecuarias y Veterinarias. 29 de noviembre.
Universidad de Chile. Santiago. Panelista.
Quiroz, Madelaine; Carú, Margarita. 2012. Selección y composición de consorcios bacterianos
que remuevan CO2 de una atmósfera de biogás. V Jornadas de Investigación Doctorado
Ciencias Silvoagropecuarias y Veterinarias. 4 de diciembre. Universidad de Chile. Santiago.
Panelista.
M. Quiroz. 2013. Selecting and characterizing bacterial consortia with the potential of fixing
CO2 and removing H2S in a biogas atmosphere. Water, Air &, Soil Pollution. Aceptado.
89
APÉNDICE
Tabla A1. Composición de vitaminas usadas en el medio de cultivo.
VITAMINAS
NOMBRE
Cobalamina (B12)
Inositol
Biotina (B8)
ac. Fólico (B9)
ac. P-aminobenzoico
ac. Nicotinico
(Ca) D-panthotenato (B5)
Tiamina (B1)
Pyridoxina (B6)
Riboflavina (B2)
Concentración (mg/100 mL)
1
100
5
10
10
50
10
10
25
10
Tabla A2. Composición de micronutrientes usados en el medio de cultivo.
MICRONUTRIENTES
Compuesto
Concentración (g/L)
0,5
2,28
0,5
0,025
0,025
0,045
0,01
0,5 ml (1 mol/L)
H3BO3
MnCl2· 4H2O
ZnSO4· 7H2O
CuSO4· 5H2O
Na2MoO4· 2H2O
CoSO4· 7H2O
NiCl4
H2SO4
90
0,25
DO 420
0,20
0,15
0,10
y = 0,003x
R² = 0,9940
0,05
0,00
0
20
40
60
80
mg/L Na 2SO4
Figura A1. Curva calibración de sulfato.
0,6
0,5
DO 595
0,4
0,3
0,2
y = 0,007x
r = 0,9979
0,1
0,0
0
10
20
30
40
50
µ g/ml BSA
Figura A2. Curva de calibración de proteínas.
91
60
70
80
0,06
C1
0,05
DO600
0,04
0,03
0,02
con
sin
Acetato
-------- CO2
Biogás
0,4
C2
0,3
DO600
0,2
0,1
con
sin
Acetato
-------- CO2
Biogás
0,5
C5
0,4
DO600
0,3
0,2
con
Acetato
sin
Figura A3. Efecto del tipo de gas e interacción entre factores de los consorcios C1, C2 y C5.
92
0,15
C6
0,10
DO600
0,05
con
sin
Acetato
-------- CO2
Biogás
Figura A4. Efecto del tipo de gas e interacción entre factores (tipo de gas y fuente de C) del
consorcio C6.
0,06
C1
0,05
DO600
0,04
0,03
0,02
biogas
Gas
CO2
-------- sin acetato
con acetato
Figura A5. Efecto de la fuente de C e interacción entre factores (tipo de gas y fuente de C) del
consorcio C1.
93
0,4
C2
0,3
DO600
0,2
0,1
biogas
Gas
CO2
-------- sin acetato
con acetato
0,5
C5
0,4
DO600
0,3
0,2
biogas
CO2
Gas
-------- sin acetato
0,15
con acetato
C6
0,10
DO600
0,05
biogas
Gas
CO2
Figura A6. Efecto de la fuente de C e interacción entre factores de los consorcios C2, C5 y C6.
94
Tabla A3. Cálculo de la relación entre S-H2S (ac); S-HS- y S-SO42- en el medio de cultivo.
1
Consorcios
S-H2S(ac) + S-HSSO42- (mM)
S-SO42- (mM)
(mM)
C4
0,09
0,23
0,08
C5
0,09
0,26
0,09
C6
0,09
0,32
0,11
Control sin inóculo
0,09
0,35
0,12
1
Estimación sulfuro disuelto en el medio de cultivo en el día 0.
H2S (ac) = KH * H2S (g); KH = 0,0965 (mol * L/ atm); KH: constante de Henry.
H2S (g) = 535 ppm
H2S ↔ H+ + HSpKa =7,04
pH = pKa + log [HS-]/[H2S(ac)]
95
Tabla A4. Secuencias del marcador molecular rDNA16S, obtenidas usando el programa Blastn (NCBI), que presentaron la mayor identidad con los clones procedentes del consorcio C4. %
ID corresponde al porcentaje de identidad.
Secuencia del organismo más relacionado
Número de acceso
Género
FN556564.1
Sphingobium sp.
FN556564.1
Sphingobium sp.
FN556564.1
Sphingobium sp.
CP002418.1
Rhodopseudomonas sp.
FN556564.1
Sphingobium sp.
FN556564.1
Sphingobium sp.
AB696803.1
Rhodopseudomonas sp.
CP002418.1
Rhodopseudomonas sp.
AB696803.1
Rhodopseudomonas sp.
CP002418.1
Rhodopseudomonas sp.
DQ976366.1
Castellaniella sp.
FN556564.1
Sphingobium sp.
FN556564.1
Sphingobium sp.
GU951458.1
Castellaniella sp.
FJ823934.1
Xanthobacter sp.
EF562135.1
Rhodopseudomonas sp.
CP002418.1
Rhodopseudomonas sp.
FN556564.1
Sphingobium sp.
AB696803.1
Rhodopseudomonas sp.
FN556564.1
Sphingobium sp.
AB696803.1
Rhodopseudomonas sp.
AB696803.1
Rhodopseudomonas sp.
FN556564.1
Sphingobium sp.
HM053959.1
Rhodobacter sp.
21 secuencias no identificadas
Familia
Sphingomonadaceae
Sphingomonadaceae
Sphingomonadaceae
Bradyrhizobiaceae
Sphingomonadaceae
Sphingomonadaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Alcaligenaceae
Sphingomonadaceae
Sphingomonadaceae
Alcaligenaceae
Xanthobacteriaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Sphingomonadaceae
Bradyrhizobiaceae
Sphingomonadaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Sphingomonadaceae
Rhodobacteraceae
96
Clase
% ID Nº de clones
31
99
α-Proteobacterias
9
99
α-Proteobacterias
1
98
α-Proteobacterias
33
α -Proteobacterias 99
1
99
α-Proteobacterias
1
99
α-Proteobacterias
34
α -Proteobacterias 100
5
α -Proteobacterias 99
2
-Proteobacterias
99
α
1
α -Proteobacterias 99
1
93
β -Proteobacterias
23
99
α-Proteobacterias
2
99
α-Proteobacterias
1
β -Proteobacterias 100
1
98
α-Proteobacterias
1
α -Proteobacterias 100
1
α -Proteobacterias 99
1
97
α-Proteobacterias
1
α -Proteobacterias 99
1
99
α-Proteobacterias
1
α -Proteobacterias 98
1
α -Proteobacterias 99
1
96
α-Proteobacterias
1
α-Proteobacterias 100
Tabla A5. Secuencias del marcador molecular rDNA16S, obtenidas usando el programa Blastn (NCBI), que presentaron la mayor identidad con los clones procedentes del consorcio C5. %
ID corresponde al porcentaje de identidad.
Secuencia del organismo más relacionado
Número de acceso
Género
CP002418.1 Rhodopseudomonas sp.
GU951458.1 Castellaniella sp.
CP002418.1 Rhodopseudomonas sp.
AF487431.1 Rhodopseudomonas sp.
FJ823934.1 Xanthobacter sp.
GU951458.1 Castellaniella sp.
FJ823934.1 Xanthobacter sp.
JN995612.1 Stenotrophomonas sp.
FJ823934.1 Xanthobacter sp.
CP002418.1 Rhodopseudomonas sp.
CP002418.1 Rhodopseudomonas sp.
AB669242.1
ND
FJ823934.1 Xanthobacter sp.
AF487431.1 Rhodopseudomonas sp.
FJ823934.1 Xanthobacter sp.
CP002418.1 Rhodopseudomonas sp.
GU951458.1 Castellaniella sp.
AF487431.1 Rhodopseudomonas sp.
FJ823934.1 Xanthobacter sp.
CP002418.1 Rhodopseudomonas sp.
JN995612.1 Stenotrophomonas sp.
JN995612.1 Stenotrophomonas sp.
FJ823934.1 Xanthobacter sp.
FJ823934.1 Xanthobacter sp.
ND: no determinado.
6 secuencias no identificadas.
Familia
Bradyrhizobiaceae
Alcaligenaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Xanthobacteriaceae
Alcaligenaceae
Xanthobacteriaceae
Xanthobacteriaceae
Xanthobacteriaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
ND
Xanthobacteriaceae
Bradyrhizobiaceae
Xanthobacteriaceae
Bradyrhizobiaceae
Alcaligenaceae
Bradyrhizobiaceae
Xanthobacteriaceae
Bradyrhizobiaceae
Xanthomonadaceae
Xanthomonadaceae
Xanthobacteriaceae
Xanthobacteriaceae
97
Clase
α-Proteobacterias
β -Proteobacterias
α -Proteobacterias
α -Proteobacterias
α -Proteobacterias
β -Proteobacterias
α -Proteobacterias
γ-Proteobacterias
α -Proteobacterias
α -Proteobacterias
α -Proteobacterias
Bacteroidetes
α -Proteobacterias
α-Proteobacterias
α -Proteobacterias
α-Proteobacterias
β -Proteobacterias
α-Proteobacterias
α -Proteobacterias
α-Proteobacterias
γ-Proteobacterias
γ-Proteobacterias
α -Proteobacterias
α -Proteobacterias
% ID
99
99
100
99
99
99
99
98
98
99
99
99
99
99
99
99
100
99
99
100
99
99
99
99
Nº de clones
2
4
2
1
36
31
2
1
2
72
2
1
1
2
3
2
1
1
2
1
1
11
2
1
Tabla A6. Secuencias del marcador molecular rDNA16S, obtenidas usando el programa Blastn (NCBI), que presentaron la mayor identidad con los clones procedentes del consorcio C6. %
ID corresponde al porcentaje de identidad.
Secuencia del organismo más relacionado
Número de acceso
Género
AY007196.1 Methylocystis sp.
CP002418.1 Rhodopseudomonas sp.
CP002418.1 Rhodopseudomonas sp.
AF487431.1 Rhodopseudomonas sp.
FR851928.1 Rhodopseudomonas sp.
JQ689196.1 Rhizobium sp.
CP002418.1 Rhodopseudomonas sp.
AY007196.1 Methylocystis sp.
CP002418.1 Rhodopseudomonas sp.
JN995612.1 Stenotrophomonas sp.
JQ346770.1
ND
CP002418.1 Rhodopseudomonas sp.
JQ346770.1
ND
FR851928.1 Rhodopseudomonas sp.
FR851928.1 Rhodopseudomonas sp.
CP002418.1 Rhodopseudomonas sp.
AY124797.1 Dechloromonas sp.
FR851928.1 Rhodopseudomonas sp.
FR851928.1 Rhodopseudomonas sp.
JN995612.1 Stenotrophomonas sp.
CP002418.1 Rhodopseudomonas sp.
FM210029.1 Rhodopseudomonas sp.
AB696803.1 Rhodopseudomonas sp.
AM947938.1 Rhodopseudomonas sp.
FM210029.1 Rhodopseudomonas sp.
EU004438.1 Rhodopseudomonas sp.
CU921833.1
ND
FJ823934.1 Xanthobacter sp.
FJ823934.1 Xanthobacter sp.
AY934489.1 Hyphomicrobium sp.
FN556564.1 Sphingobium sp.
FR851928.1 Rhodopseudomonas sp.
JN872496.1
ND: no determinado.
1 secuencia no identificada.
Familia
Methylocystaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Rhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Methylocystaceae
Bradyrhizobiaceae
Xanthomonadaceae
ND
Bradyrhizobiaceae
ND
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Rhodocyclaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Xanthomonadaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobiaceae
ND
Xanthobacteriaceae
Xanthobacteriaceae
Hyphomicrobiaceae
Sphingomonadaceae
Bradyrhizobiaceae
Alcaligenaceae
98
Clase
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
γ-Proteobacterias
Bacteroidetes
α-Proteobacterias
Bacteroidetes
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
β-Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
γ- Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
Bacteroidetes
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
α-Proteobacterias
β -Proteobacterias
% ID
100
99
94
96
99
99
99
98
95
99
100
100
96
100
99
99
99
100
99
100
99
96
98
95
99
93
95
99
99
95
95
99
97
Nº de clones
3
51
14
1
41
2
10
1
3
4
2
1
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
18
1
10
7
1
1
1
2
1
1
2
Tabla A7. Porcentaje de representación de los géneros que constituyen la composición de las
bacterias de los consorcios C4, C5 y C6.
C4
Rhodopseudomonas sp.
Sphingobium sp.
Castellaniella sp.
Rhodobacter sp.
Xanthobacter sp.
%
46,6
39,2
1,1
0,6
0,6
C5
%
C6
Rhodopseudomonas sp. 42,5 Rhodopseudomonas sp.
Xanthobacter sp.
24,5 Bacteroidetes
Castellaniella sp.
18,0 Stenotrophomonas sp.
Stenotrophomonas sp.
6,5 Methylocystis sp.
Bacteroidetes
0,5 Alcaligenaceae
Hyphomicrobium sp.
Rhizobium sp.
Xanthobacter sp.
Dechloromonas sp.
Sphingobium sp.
99
%
87,3
2,6
2,6
2,1
1,1
1,1
1,1
1,1
0,5
0,5
Figura A7. Curvas de rarefacción para el gen de rRNA 16S bacteriano de los consorcios C4,
C5 y C6. Los cuadrados representan el número de clones. La línea roja continua, en todos los
gráficos, representa el ajuste de la curva a una hipérbola.
C4
Géneros observados
7
6
5
4
3
2
1
0
0
20
40
60
80
100 120 140 160 180 200
Número de clones
C5
Génros observados
7
6
5
4
3
2
1
0
0
20
40
60
80
100
120 140
160
180 200
Número de clones
C6
Géneros observados
12
10
8
6
4
2
0
0
20
40
60
80
100 120 140 160 180 200
Número de clones
100