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Bogotá, Marzo de 2006
Señores
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
Ciudad
Estimados Señores:
Yo Estefanía Guevara Vega, identificada con CC. No 46380317 autor del trabajo de
grado
Titulado EFECTO DEL CLOROFILIN SOBRE LA PROLIFERACION DE
CÉLULAS DE FIBROSARCOMA HUMANO HT1080, presentado como requisito
para optar al título de Bióloga en el año de 2006 autorizo a la Universidad Javeriana
a:
a) Reproducir el trabajo en medio digital o electrónico con el fin de ofrecerlo para la
consulta en la Biblioteca General. Si
b) Poner a disposición para la consulta con fines académicos, en la página web de la
Facultad, de la Biblioteca General y en redes de información con las cuales tenga
convenio la Universidad Javeriana. Si
c) Enviar el trabajo en formato impreso o digital, en caso de que sea seleccionado
para participar en concursos de trabajos de grado. Si
d) Distribuir ejemplares de la obra, para la consulta entre las entidades educativas con
las que la facultad tenga convenio de intercambio de información, para que este sea
consultado en las bibliotecas y centros de documentación de las respectivas entidades.
No
e) Todos los usos, que tengan finalidad académica. Si
Los derechos morales sobre el trabajo son de los autores de conformidad con lo
establecido en el artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artículo 11 de la Decisión
Andina 351 de 1993, los cuales son irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e
inalienables. Atendiendo lo anterior, siempre que se consulte la obra, mediante cita
bibliográfica se debe dar crédito al trabajo y a su(s) autor(es). Este documento se
firma, sin perjuicio de los acuerdos que el autor(es) pacte con la Unidad Académica
referentes al uso de la obra o a los derechos de propiedad industrial que puedan surgir
de la actividad académica.
___________________________
Estefanía Guevara Vega
CC. 46380317
AUTOR
Apellidos
Nombres
Guevara Vega
Estefanía
DIRECTOR
Apellidos
Nombres
Díaz
Germán Darío
TRABAJO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE: Bióloga
TÍTULO COMPLETO DEL TRABAJO: Efecto del clorofilin sobre la proliferación
de células de fibrosarcoma humano HT1080
SUBTÍTULO DEL TRABAJO: Efecto del Clorofilin sobre células HT1080
FACULTAD: Ciencias
PROGRAMA: Carrera X Especialización ____ Maestría ____ Doctorado ____
NOMBRE DEL PROGRAMA: Biología
CIUDAD: BOGOTA AÑO DE PRESENTACIÓN DEL TRABAJO: 2006
NÚMERO DE PÁGINAS 83
TIPO DE ILUSTRACIONES:
__ Ilustraciones
__ Mapas
__ Retratos
X Tablas, gráficos y diagramas
__ Planos
__ Láminas
__ Fotografías
MATERIAL ANEXO (Vídeo, audio, multimedia o producción electrónica): Ninguno
DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVES: Apoptosis, células de fibrosarcoma
humano HT1080, ciclo celular, clorofilin, proliferación celular.
RESUMEN DEL CONTENIDO: El clorofilin (CHL), es un derivado hidrosoluble de
la clorofila usado en varias situaciones clínicas. La clorofila y el CHL exhiben una
potente actividad
antimutagénica
in
vitro
y
han
sido
reportados
como
anticarcinógenos en varios modelos animales. En el presente estudio, se examinó la
respuesta de células de fibrosarcoma humano HT1080 al tratamiento con CHL. El
objetivo principal fue evaluar el efecto del CHL sobre la proliferación y ciclo celular
de las células HT1080 las cuales fueron expuestas a concentraciones de 0.25 mM,
0.50 mM y 0.75 mM durante 24, 48 y 72 horas. Según el análisis de ciclo celular
mediante citometría de flujo, células expuestas a concentraciones entre 0.25 mM y
0.75 mM de CHL entraron en un arresto en la fase G0/G1 y en la fase G2/M del ciclo
celular. Además, la proliferación celular disminuyó de manera dosis dependiente y
posiblemente el CHL condujo a las células a apoptosis ya que en las células expuestas
a las diferentes concentraciones de CHL se observaron cambios morfológicos
característicos de este tipo de muerte celular. Así, el CHL se perfila como una
molécula con efectos importantes sobre el control de la proliferación celular, razón
por la cual, debe ser investigado rigurosamente por la comunidad científica para hacer
un uso efectivo de todos sus beneficios.
EFECTO DEL CLOROFILIN SOBRE LA PROLIFERACION DE CÉLULAS DE
FIBROSARCOMA HUMANO HT1080
ESTEFANÍA GUEVARA-VEGA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
Bióloga
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGIA
Bogotá, D. C.
Febrero de 2006
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y
a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
EFECTO DEL CLOROFILIN SOBRE LA PROLIFERACION DE CÉLULAS DE
FIBROSARCOMA HUMANO HT1080
ESTEFANÍA GUEVARA-VEGA
APROBADO
________________________
Germán Darío Díaz, M.D., Ph.D.
Director
________________________
Jorge Robles, Ph.D
Jurado
________________________
Adriana García, M. Sc.
Jurado
EFECTO DEL CLOROFILIN SOBRE LA PROLIFERACION DE CÉLULAS DE
FIBROSARCOMA HUMANO HT1080
ESTEFANÍA GUEVARA-VEGA
APROBADO
________________________
Ángela Umaña, M. Phil
Decano Académico
________________________
Cecilia Espíndola, M. Sc.
Director de Carrera
DEDICATORIA
A mi Papá por sus bendiciones y fidelidad hacia mí siempre.
A mis padres por su apoyo incondicional y por permitir que este triunfo sea una
realidad, con ellos y con las personas que amo lo comparto.
AGRADECIMIENTOS
A Dios, quien me infundió fuerzas a lo largo de la realización del proyecto y hoy me
permite terminarlo.
Al Dr. Germán Darío Díaz, director del trabajo, por su paciencia, sus enseñanzas y su
valioso apoyo en la realización de esta investigación.
Al Dr. Octavio Alberto González, miembro del
Centro de Investigaciones
Odontológicas (CIO) de la Facultad de Odontología de la Pontificia Universidad
Javeriana, por su apoyo y por compartir conmigo su conocimiento sobre cultivos
celulares.
A todo el personal del CIO por permitirme llevar a cabo la parte experimental del
proyecto en su laboratorio.
Al grupo de Inmunología de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad
Javeriana por su colaboración.
Febrero de 2006
TABLA DE CONTENIDO
1. Introducción
1
2. Marco Teórico
2
2.1 Ciclo Celular
2
2.1.1 Control del Ciclo Celular
4
2.1.2 Muerte celular
8
2.1.2.1 Apoptosis o Muerte Celular Programada
9
2.2 Biología del Cáncer
15
2.2.1 Iniciación, Promoción y Progresión del Cáncer
16
2.3 Sarcomas de Tejidos Blandos
21
2.3.1 Fibrosarcoma
21
2.4 Clorofilin
24
3. Formulación del problema y Justificación
28
3.1 Formulación del problema
28
3.2 Pregunta de Investigación
29
3.3 Justificación de la Investigación
30
4. Hipótesis
30
5. Objetivos
31
5.1 Objetivo General
31
5.2 Objetivos Específicos
31
6. Materiales y Métodos
31
6.1 Diseño de la Investigación
31
6.1.1 Población de estudio y muestra
31
6.1.2 Variables del estudio
32
6.2 Metodología
32
6.2.1 Cultivo Celular
32
6.2.2 Tratamiento de las Células con Clorofilin
33
6.2.3 Determinación de la Viabilidad Celular por MTS
34
6.2.4 Células Adheridas y Células Flotantes
34
6.2.5 Análisis de Morfología Celular por Microscopía de Luz
35
6.2.6 Análisis de Ciclo Celular por Citometría de Flujo
36
6.3 Recolección de la Información
37
6.4 Análisis de la Información
37
7. Resultados
38
7.1 Análisis de la Viabilidad celular por MTS
38
7.2 Células Adheridas y Células Flotantes
41
7.3 Análisis de Morfología Celular por Microscopía de Luz
44
7.4 Análisis de Ciclo Celular por Citometría de Flujo
45
8. Discusión
50
9. Conclusiones
60
10. Recomendaciones
60
11. Referencias
61
INDICE DE TABLAS
1. Diferencias entre Apoptosis y Necrosis
9
2. Valores promedio de absorbancia de células HT1080 expuestas
a diferentes concentraciones de CHL durante 24, 48 y 72 horas
39
3. Porcentaje de células adheridas y células flotantes a diferentes
concentraciones de CHL durante 24, 48 y 72 horas
4. Resultados del análisis de ciclo celular por citometría de flujo
42
47
INDICE DE FIGURAS
1. Fases del Ciclo Celular
3
2. Carcinogénesis
20
3. Estructura de la Clorofila
24
4. Estructura del Clorofilin
25
5. Viabilidad celular en Células HT1080 expuestas a CHL durante
24, 48 y 72 horas
40
6. Porcentaje de Células flotantes y Células adheridas expuestas
a CHL durante 24, 48 y 72 horas
43
7. Efecto del CHL sobre el Ciclo Celular de Células HT1080 hasta
72 horas de Tratamiento
49
8. Modelo propuesto de Acción del Clorofilin sobre Células
HT1080
58
Resumen
El clorofilin (CHL), es un derivado hidrosoluble de la clorofila usado en varias
situaciones clínicas. La clorofila y el CHL exhiben una potente actividad
antimutagénica in vitro y han sido reportados como anticarcinógenos en varios
modelos animales. En el presente estudio, se examinó la respuesta de células de
fibrosarcoma humano HT1080 al tratamiento con CHL. El objetivo principal fue
evaluar el efecto del CHL sobre la proliferación y ciclo celular de las células HT1080
las cuales fueron expuestas a concentraciones de 0.25 mM, 0.50 mM y 0.75 mM
durante 24, 48 y 72 horas. Según el análisis de ciclo celular mediante citometría de
flujo, células expuestas a concentraciones entre 0.25 mM y 0.75 mM de CHL
entraron en un arresto en la fase G0/G1 y en la fase G2/M del ciclo celular. Además, la
proliferación celular disminuyó de manera dosis dependiente y posiblemente el CHL
condujo a las células a apoptosis ya que en las células expuestas a las diferentes
concentraciones de CHL se observaron cambios morfológicos característicos de este
tipo de muerte celular. Así, el CHL se perfila como una molécula con efectos
importantes sobre el control de la proliferación celular, razón por la cual, debe ser
investigado rigurosamente por la comunidad científica para hacer un uso efectivo de
todos sus beneficios.
Abstract
Chlorophyllin (CHL), is a clinically used water-soluble derivative of chlorophyll.
Chlorophyll and CHL are known to exhibit potent antimutagenic activity in vitro, and
they have been reported as anticarcinogens in various animal models. The current
study examined the response of HT1080 human fibrosarcoma cells to CHL treatment.
The principal objective was evaluate the effect of CHL over cell proliferation and cell
cycle of HT1080 cells which was exposed to 0.25 mM, 0.50 mM and 0.75 mM for
24, 48 and 72 hours. Cell cycle analysis by flow citometry shows that cells exposed to
concentrations in the range 0.25–0.75 mM CHL underwent growth arrest in G0/G1
and G2/M cell cycle phase. In addition, cell proliferation decreases dose-dependent
manner and possibly CHL induced the cells to apoptosis because the cells exposed to
the different concentrations of CHL shows morphological changes hallmarks of this
cell death type. CHL is taking shape like a molecule with important effects over the
cellular proliferation control and must be researched for scientific community.
1. Introducción
La tasa de incidencia y mortalidad del cáncer se ha incrementado en las
últimas décadas en nuestro país, constituyéndose en la segunda causa de muerte de la
población después de las enfermedades cardiovasculares. Los tratamientos actuales
contra el cáncer no son del todo satisfactorios y en muchas ocasiones alteran la
calidad de vida del paciente. Si bien, el tratamiento de los sarcomas de tejidos blandos
ha evolucionado de forma considerable en los últimos años, siendo la cirugía la
modalidad terapéutica más efectiva, la quimioprevención o utilización de agentes
químicos naturales o sintéticos para revertir, suprimir o impedir el proceso de la
carcinogénesis, es una alternativa muy válida. El clorofilin, un derivado hidrosoluble
de la clorofila, es una mezcla de sales de sodio y cobre que exhibe una potente
actividad antimutagénica in vitro y ha sido reportado como anticarcinógeno en varios
modelos animales. Con el uso de este agente han sido demostrados efectos benéficos
sobre diferentes tipos de células tumorales, por lo cual se ha extendido su uso.
Con esta investigación se pretende conocer si el clorofilin es un agente
regulador de la proliferación celular en células de fibrosarcoma humano HT1080 in
vitro, que pudiera ser considerado como una alternativa para el tratamiento de
tumores de origen mesenquimal.
2. Marco Teórico
2.1 Ciclo Celular
El ciclo de división celular constituye un proceso básico en la génesis de
nuevas células (Junqueira y Carneiro 1997). Éste es un conjunto ordenado de eventos
que culmina con el crecimiento de la célula y la división en dos células hijas (Stein
et.al, 2002). El ciclo celular se divide en dos periodos, uno denominado mitosis, en el
que los cromosomas se condensan haciéndose visibles al microscopio óptico y que
finaliza con los procesos de segregación y división celular (Nigg 2001) y otro, que
comprende la mayor parte del ciclo celular denominado interfase por transcurrir entre
dos mitosis. La interfase se caracteriza por ser un periodo de gran actividad, en el que
se llevan a cabo y en forma ordenada los eventos que conducen a la división celular.
La interfase comprende a un periodo conocido como G1, que transcurre entre el final
de la mitosis del ciclo anterior y el comienzo de la síntesis de DNA, a un periodo
conocido como fase S, en el cual ocurre la síntesis del DNA y a una fase G2, intervalo
entre el fin de la fase S y el comienzo de la mitosis (Stein et.al, 2002) (Figura 1).
Durante la fase G1, la célula determina si las condiciones son adecuadas para
comenzar el proceso de división celular. Este es un período de actividad bioquímica
intensa, la célula incrementa el material enzimático, sus organelos se replican, así
como otras moléculas y estructuras citoplasmáticas también aumentan en número; en
consecuencia, la célula aumenta en tamaño. En células normales, esta fase tiene una
duración aproximada de 8 horas (Stein et.al, 2002; revisado en Lomanto et.al, 2003).
Durante la fase S (síntesis), que dura de 6 a 8 horas, ocurre el proceso de replicación
del DNA, en esta fase la doble hélice del DNA se abre y cada cadena es utilizada
como molde para la producción de una nueva doble cadena, que queda unida a la
original y que sirve como guía. En esta fase muchas de las histonas y otras proteínas
asociadas al DNA son sintetizadas (revisado en Lomanto et.al, 2003). Durante la fase
G2 ocurren los preparativos finales para la división celular, ocurre la duplicación del
par de centriolos y los dos pares de centriolos maduros ubicados por fuera de la
envoltura nuclear se disponen uno perpendicular al otro (revisado en Elliot y Elliot
2002).
Figura 1. Fases del Ciclo Celular. En esta grafica se observan las diferentes fases
del ciclo celular, G1, S, G2 y M. El estado G1 quiere decir "GAP 1"(Intervalo 1). El estado S
representa "Síntesis". Este es el estado cuando ocurre la replicación del DNA. El estado G2
representa "GAP 2"(Intervalo 2). El estado M representa "mitosis", y es cuando ocurre la
división nuclear (los cromosomas se separan) y citoplasmática (citocinesis).
2.1.1 Control del Ciclo Celular
El ciclo celular es un proceso ordenado que se encuentra regulado por una
serie de proteínas denominadas ciclinas, Cinasas Dependientes de Ciclinas (CDKs) y
por los complejos que se forman entre ambas, CDK-ciclina (Stein et.al, 2002). Las
ciclinas controlan los cambios que conducen a la división celular formando complejos
cinasa-ciclina los cuales fosforilan una serie de proteínas involucradas en la
replicación del DNA, como la proteína supresora de tumores del Retinoblastoma
(Rb), y en otros procesos del ciclo celular como en la formación de husos mitóticos
(Nahle et.al., 2003). Hay dos clases principales de ciclinas: las ciclinas G1 (D y E),
que se unen a CDKs durante la fase G1 del ciclo celular y son necesarias para el inicio
de la fase S, y las ciclinas mitóticas (A y B) las cuales se acumulan gradualmente
durante la fase G2 y se unen a CDKs formando el complejo cdk-ciclina también
llamado Factor Promotor de la Mitosis (MPF) el cual es necesario para la entrada en
mitosis (Stein et.al, 2002).
Las CDKs se encuentran en niveles similares a lo largo del ciclo celular y sus
actividades están a su vez moduladas por fosforilación y desfosforilación en residuos
específicos de serina y treonina y por la unión de los denominados inhibidores de
cinasas dependientes de ciclinas (CKIs). Las CDKs actúan cuando son activadas por
la ciclinas fosforilando moléculas importantes para la división celular como la
proteína del Retinoblastoma (Rb) (Sears y Nevins, 2002; Stein et.al, 2002).
Los complejos CDK-ciclina dirigen a la célula de una fase a otra del ciclo
celular. Por lo tanto, la dinámica del ciclo dependerá de las formas activas o inactivas
de los complejos CDK-ciclina, entre otros muchos sucesos (Sherr 1993; revisado en
Stein et.al, 2002). Aunque inicialmente se estudió la función de los complejos CDKciclina en Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces pombe, se han identificado
enzimas con actividades similares en mamíferos. Los estudios en levaduras aún
emplean los términos de p34cdc2 para CDK1; sin embargo, las funciones en el ciclo
celular son idénticas. Se sabe que CDK4, CDK2 y CDK5 son proteínas que forman
dímeros con las ciclinas D1, D2, D3, E, A y B, durante la progresión de la fase G1 a
la fase M (Sherr 1993). Por ejemplo, el complejo CDK4-D funciona tempranamente
en respuesta a factores de crecimiento. Los complejos CDK2-E y CDK2-A son
esenciales para la replicación del DNA, y los complejos CDK1-B, CDK2-A y CDK2B son importantes para la mitosis (Nigg 2001). La mayoría de los complejos CDKciclina de mamíferos pueden remplazar funcionalmente los correspondientes
complejos de levaduras, y lo mismo ocurre para las enzimas que regulan la actividad
de las cinasas, lo que sugiere que por la importante función que tienen los complejos
CDK-ciclina en el ciclo celular, éstos se han conservado durante la evolución de los
eucariotas (Peralta-Zaragoza et.al, 1997).
Estos complejos CDK-ciclina pueden inducir la interrupción del ciclo celular
cuando existe algún daño genético. En este caso, los mecanismos de control
transcripcional de los complejos CDK-ciclina inducen la interrupción del ciclo celular
hasta que el daño se corrige. Se ha identificado que esta interrupción de la
proliferación es mediada en mamíferos por proteínas como p27 que evita el
ensamblaje y activación del complejo CDK2-E, p16 y p21 (Koff et.al, 1993; Poliak
et.al, 1994).
La interrupción del ciclo celular se da en puntos de regulación específicos
muy importantes que se encuentran en las diferentes fases de éste y que garantizan
que las células se dividan cuando las condiciones son óptimas (Kastan y Bartek
2004). La existencia de éstos puntos control del ciclo celular es clave, pues permiten
que todo el proceso tenga lugar cuando la célula está correctamente preparada
mediante la comprobación de que las condiciones necesarias para iniciar una nueva
fase se han dado y sirven de freno durante el ciclo, asegurando que una fase no se
inicia antes de que la anterior haya finalizado (Kastan y Bartek 2004).
Estos puntos control se llaman puntos de restricción y se encuentran en la
fase G0/G1 y G2/M del ciclo celular. El punto de restricción G0/G1 es regulado
cooperativamente por la proteína del retinoblastoma (Rb), ciclinas, CDKs y por
factores de crecimiento como el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF), el Factor
de Crecimiento de Fibroblastos (FGF) y el Factor de Crecimiento Derivado de las
Plaquetas (PDGF). El evento fundamental que regula este punto de restricción es el
nivel de fosforilación (dado por las CDKs) de la proteína codificada por el gen
supresor de tumores Rb que regula la proliferación y supervivencia celular (Hanahan
y Weinberg 2000; Sears y Nevins 2002). La proteína Rb, de peso molecular 110 kDa,
regula la proliferación celular, en parte, modulando la actividad de los factores de
transcripción E2F y DP1 (Hanahan y Weinberg 2000). Cuando está hipofosforilada,
Rb bloquea la progresión del ciclo celular. Ello se debe a que se une e inhibe a varias
proteínas, entre ellas la familia de factores de transcripción E2F, los cuales controlan
la expresión de genes esenciales para la síntesis de DNA (Nahle et.al., 2003). Tras su
fosforilación, Rb ya no es capaz de unirse y bloquear a los factores de trascripción
E2F los cuales se expresan, permitiendo la progresión del ciclo celular (Sears y
Nevins 2002). Así, cuando hay presencia de factores de crecimiento apropiados, las
células pasan el punto de restricción y entran en la fase S del ciclo celular, donde
tiene lugar la síntesis de DNA y duplicación de los cromosomas (Stein et.al, 2002).
Durante la fase S se regulan los eventos asociados con la replicación del DNA, la
biosíntesis de histonas y la fidelidad del proceso de ensamblaje de la cromatina (Stein
et.al, 2002).
Por otra parte, si no hay factores de crecimiento apropiados disponibles en G1,
se frena la progresión a través del ciclo celular en el punto de restricción y las células
entran en un estado quiescente llamado G0. Las células G0 son metabólicamente
activas, aunque ellas cesan el crecimiento, la división y reducen la tasa de síntesis de
proteínas (Kastan y Bartek 2004).
Una de las proteínas importantes en el control del ciclo celular es la proteína
p53, sintetizada por el gen supresor de tumores p53, la cual juega un papel clave en
las decisiones celulares de detener el ciclo celular permitiendo la reparación del DNA
dañado o conduciendo a la muerte celular (Oren 1999; Vogelstein et.al., 2000).
Cuando hay daños en el DNA, por ejemplo por estrés celular, radiación gamma y/o
fármacos genotóxicos, los niveles de la proteína p53 se elevan y las células en
proliferación se detienen en la fase G0/G1 del ciclo celular proporcionando un lapso de
tiempo para que se verifique la reparación del DNA antes de que éste sea replicado
(revisado en Lutz y Nowakowska 2002). De mantenerse las concentraciones elevadas
de p53 se desencadena la muerte celular programada o apoptosis por inducción de la
expresión de Bax, miembro pro-apoptótico de la familia de proteínas Bcl-2. Sin
embargo, se conoce que la sobreexpresión de miembros anti-apoptóticos de esta
familia de proteínas, contrarresta el efecto apoptótico de p53 (Blagosklonny 2000).
2.1.2 Muerte Celular
La muerte celular es un mecanismo importante para mantener la homeostasis
celular. Los estudios de Kerr y colaboradores (1972) proveen evidencia de que
existen al menos dos formas diferentes de muerte celular. Una de estas, es la
apoptosis, que, se caracteriza por una reducción del tamaño celular, formación de
poros en la membrana plasmática, condensación y fragmentación del DNA y
formación de cuerpos apoptóticos, seguida por su remoción a través de la fagocitosis,
que se caracteriza por la no liberación de enzimas proteolíticas, sin causar daño
tisular. La fragmentación celular ocurre sin liberación de contenidos celulares al
espacio extracelular y la remoción de estas células no causa respuesta inflamatoria
(Revisado en Guimaraes y Linden, 2004). La otra forma de muerte celular es la
necrosis, una forma de degeneración rápida y algunas veces abrupta que se
caracteriza por un abultamiento del citoplasma, la destrucción de los organelos
celulares y el rompimiento de la membrana plasmática, que conduce a la liberación de
los contenidos intracelulares generando una respuesta inflamatoria (Revisado en
Guimaraes y Linden, 2004). A diferencia de la necrosis, la apoptosis usualmente
requiere energía de la célula en forma de ATP y es regulada genéticamente (Tabla 1)
(Kerr et.al., 1972). La necrosis puede ser causada por toxinas, radiación, trauma e
hipoxia entre otras (Revisado en Guimaraes y Linden, 2004).
Tabla 1. Diferencias entre Apoptosis y Necrosis (Kerr et.al., 1972).
•
•
•
•
•
•
APOPTOSIS
Afecta a células individuales
No induce liberación de enzimas
proteolíticas
No induce daño tisular
No causa respuesta inflamatoria
Requiere energía (ATP)
Regulada genéticamente
•
•
•
•
•
•
NECROSIS
Afecta
extensas
poblaciones
celulares
Induce liberación de enzimas
proteolíticas
Induce daño tisular
Causa respuesta inflamatoria
No requiere energía
No es regulada genéticamente
2.1.2.1 Apoptosis o Muerte Celular Programada
La apoptosis, es el estereotipo de muerte celular programada (PCD). La
palabra apoptosis deriva de la raíz griega apo que significa separación y ptosis, caída.
Este termino resalta el carácter fisiológico de la apoptosis, pues implica que para que
un organismo funcione adecuadamente, no solo debe tener la capacidad de producir
nuevas células sino también la habilidad de eliminar las que ya no son necesarias
(revisado en Sánchez-Torres y Vargas 2003). La muerte celular programada juega un
papel importante en el desarrollo y en la homeostasis celular. En organismos
multicelulares es necesario que el número de células de un determinado órgano se
mantenga constante para que conserve su morfología y correcto funcionamiento.
Enfermedades
degenerativas
humanas
(e.j
Alzheimer
y
Parkinson),
autoinmunes (e.j artritis reumatoide), virales (e.j infección por VIH) y cáncer, se
caracterizan por presentar alteraciones en la ejecución del programa de muerte celular
programada constituyéndolo como un componente importante del desarrollo normal
de un organismo (Guimaraes y Linden 2004).
Durante el proceso de la apoptosis las células sufren una serie de cambios
morfológicos. El primer cambio se observa a nivel de la membrana celular, donde se
observa una pérdida de su asimetría, la cual tiene como consecuencia la
externalización de la fosfatidilserina (FS), que bajo condiciones normales tiene una
localización intracelular. La exposición de la FS, es una señal importante para
estimular la fagocitosis de las células apoptóticas (Fadok et.al, 1992; Martin et.al,
1995). Posteriormente, el citoplasma sufre condensación la cual se caracteriza por un
agrupamiento de sus organelos y el desarrollo de vacuolas citoplasmáticas (Wang
2001). En el núcleo, se produce un colapso de la cromatina, contra la membrana
nuclear y subsecuentemente una hipercondensación en dominios esféricos bien
definidos. La reorganización y condensación de la cromatina está acompañada por el
clivaje del DNA (Kroemer et.al., 1997; Chang y Yang 2000). Después, el núcleo se
fragmenta, y las protuberancias en la superficie celular se desprenden envueltas en su
membrana, formando cuerpos apoptóticos de forma esférica u ovalada. El número,
tamaño y composición de los cuerpos apoptóticos derivados de una célula puede
variar ampliamente. Algunos contienen uno o más fragmentos nucleares y el
citoplasma condensado, mientras que otros contienen elementos citoplasmáticos
(Revisado en Sánchez-Torres y Vargas 2003). Una característica importante de la
apoptosis es la remoción de las células apoptóticas que se producen durante el
proceso. Los responsables de retirar la mayoría de las células apoptóticas son los
fagocitos profesionales, pero existen evidencias de que fagocitos no profesionales,
como las células dendríticas, epiteliales y fibroblastos, también participan en la
remoción de células apoptóticas (Gregory 2000).
Así como las células sufren cambios morfológicos durante el proceso de la
apoptosis, también sufren una serie de cambios bioquímicos. Entre los más
importantes se encuentra el clivaje o activación de varias proteínas de la familia de
cisteína proteasas denominadas caspasas (cisteinil proteasas especificas de aspartato),
las cuales son los componentes esenciales de la maquinaria apoptótica (Chang y Yang
2000; Mehmet 2000; Nahle et.al., 2003). Las caspasas están presentes en el
citoplasma de la mayoría de las células en una forma inactiva (pro-caspasas), éstas
son sintetizadas como precursores inactivos (zimógenos), por lo que requieren de un
procesamiento proteolítico para volverse activas (Mehmet 2000; Chang y Yang
2000). Una vez activas, las caspasas producen la hidrólisis a partir de residuos de
ácido aspártico en la proteína sustrato. Así, la activación inicial de una caspasa
provoca una reacción en cadena que conduce a la activación de otras caspasas y a la
muerte de la célula. Por lo tanto, la regulación de la activación de las caspasas es
fundamental para determinar la supervivencia celular (Thornberry y Lazebnik 1998).
Según su función, las caspasas se dividen en 2 grupos. El primer grupo
consiste en las caspasas iniciadoras (caspasa-2, -8 y -9), cuya función es la de activar
a otras caspasas y el segundo grupo consiste en las caspasas ejecutoras (caspasa-3, -6
y -7), que son responsables de la interacción con otras moléculas que desencadenan la
apoptosis (Mehmet 2000; Chang y Yang 2000; Elinos-Baez et.al, 2003).
En humanos, la caspasa-1, conocida como la enzima convertidora de
interleuquina (ICE), fue el primer miembro descrito de esta familia de cisteina
proteasas, que de forma casi exclusiva degradan sus sustratos en residuos de ácido
aspártico (Asp). Desde el descubrimiento inicial de ICE, se han descrito hasta 13
moléculas homólogas conocidas con el nombre genérico de caspasas (Thornberrry y
Lazebnik 1998). Las caspasas funcionan en forma de cascada, en la cual una caspasa
iniciadora es activada por su interacción con el adaptador de caspasa. Una vez
activas, las caspasas iniciadoras activan a una o más caspasas efectoras o ejecutoras
las cuales, a su vez, clivan varias proteínas celulares conduciendo a la muerte celular
(Chang y Yang 2000; Nahle et.al., 2003).
Hay dos vías que conducen a la activación de las caspasas. Una, se inicia en la
membrana celular y es mediada por ligandos que se unen a receptores y la otra, se
inicia en la mitocondria y es mediada por estrés celular o por lesión en el DNA. Estas
dos vías son denominadas extrínseca e intrínseca, respectivamente (Mehmet 2000).
La vía extrínseca ocurre a nivel de la membrana celular y se inicia por la
unión de un ligando con su receptor transmembranal, llamado receptor de muerte
(DR) como Fas, receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) y el ligando inductor
de la apoptosis (TRAIL) entre otros (Reed 2000). Los DR, que se localizan sobre la
membrana celular, están compuestos por tres proteínas homólogas, con una estructura
extracelular, una transmembranal y una intracelular en la que se encuentran los
dominios de muerte (DD) los cuales se agrupan en trímeros (Roseto et.al., 1999). La
unión del ligando con su DR, activa a las caspasas iniciadoras, que a su vez, activan
por proteolísis a las caspasas ejecutoras o efectoras, conduciendo a la apoptosis
(Chang y Yang 2000). Por tanto, los DR juegan un papel importante en la apoptosis
ya que pueden activar la cascada de caspasas en pocos segundos después de la unión
del ligando y el receptor (Reed 2000).
La vía intrínseca, se inicia en la mitocondria y se activa por estrés y otras
señales que provocan la translocación a la mitocondria proteínas pro-apoptóticas
miembros de la familia Bcl-2 como Bax (Kroemer et.al., 1998; Kroemer y Reed
2000), que provocan cambios en el potencial de la membrana mitocondrial (ΔΨm)
aumentando su permeabilidad y activando de ese modo la liberación de proteínas
mitocondriales potencialmente lesivas (Candé et.al., 2002). Los miembros proapoptóticos de este grupo de proteínas como Bak, Bax, o Bad promueven la
liberación de estas proteínas mitocondriales mientras que los miembros anti-
apoptóticos como Bcl-2 y Bcl-xL la previenen (Korsmeyer et. al., 2000 Hengartner
2000). Entre las proteínas mitocondriales liberadas al citosol tras un estímulo
apoptótico, se encuentran el citocromo c, Smac/Diablo y el Factor Inductor de la
Apoptosis (AIF) (Adrain y Martin 2001). Una vez en el citosol, el citocromo c puede
unirse al factor activador de las proteínas pro-apoptóticas (Apaf-1) y una vez unido y
en presencia de dATP o ATP se forma el complejo conocido como apoptosoma, el
cual recluta y activa a la procaspasa-9, la cual a su vez puede activar a las caspasas 3,
6 y 7 (Kroemer et.al., 1998).
El citocromo c es una proteína de 15-17 kDa que en condiciones normales se
encuentra localizada en el espacio intermembranal de la mitocondria. Su liberación al
citosol es activada por varios tipos de estrés celular, entre los que se incluyen drogas
citotóxicas, deprivación de factores de crecimiento y lesión en el DNA (Chang y
Yang 2000) y es regulada por proteinas miembros de la familia Bcl-2 (Adams y Cory
1998). Las proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2 y Bcl-xL la previenen mientras que
proteínas pro-apoptóticas como Bax y Bid la promueven (Gross et.al., 1999). Al ser
liberado al citosol, el citocromo c, inicia la activacion de las caspasas (Liu et.al.,
1996).
Del mismo modo que el citocromo c, Smac/Diablo, una proteína mitocondrial
de 25 kDa, es liberada en el citosol durante la apoptosis. Al salir al citosol, se une a
las Proteínas Inhibidoras de la Apoptosis (IAPs) liberando a las caspasas de la unión
con estas moléculas, por lo que Smac/Diablo es una molécula pro-apoptótica al ser un
regulador negativo de las IAPs (Salvesen y Duckett 2002).
Otra de las proteínas liberadas al citosol, es el Factor Inductor de la Apoptosis
(AIF). Después de que la célula recibe una señal o un estimulo apoptótico, la
membrana mitocondrial externa se permeabiliza y el AIF se transloca al citosol y al
núcleo en donde induce la condensación de la cromatina y la fragmentación del DNA
(Candé et.al., 2002). El AIF y las caspasas cooperan en la cascada de la muerte
celular, y su contribución puede depender del estimulo inductor de la apoptosis y tal
vez del tipo celular. En muchos casos se requiere que se de la neutralización
simultanea de las caspasas y el AIF para prevenir eventos de la apoptosis como la
condensación de la cromatina (Candé et.al., 2002).
2.2 Biología del Cáncer
El cáncer es una enfermedad de origen multifactorial que se caracteriza por un
aumento en la proliferación celular asociado a una pérdida en la diferenciación celular
(Amati y Meter 1996; Venegas 1997, Valladares 2000). El origen del termino cáncer
no se conoce con certeza, éste probablemente deriva de la palabra latina para
cangrejo, cáncer, porque el tumor se “adhiere a todo lo que agarra con la misma
obstinación que un cangrejo” (revisado en Robbins 2004). El cáncer se manifiesta en
neoplasias o tumores los cuales pueden ser benignos o malignos sin embargo, cáncer,
es la forma común de designar a todos los tumores malignos. Los componentes
básicos de la estructura de todos los tumores, benignos y malignos son las células
neoplásicas proliferantes que constituyen el parénquima y su estroma de sostén,
constituido por tejido conectivo y vasos sanguíneos (Cruz-Coke 1997; revisado en
Robbins 2004).
Las células tumorales se caracterizan por tener una morfología alterada que
refleja modificaciones en su proceso de diferenciación (Matilla 2000). La
diferenciación celular en un tumor o neoplasia hace referencia al grado de semejanza
de las células que lo componen a las células normales de donde proceden, tanto
morfológica como funcionalmente. Por ejemplo, los tumores bien diferenciados, son
los compuestos por células que recuerdan a las células maduras normales del tejido
del que proceden y los tumores poco diferenciados o indiferenciados están
compuestos por células de aspecto primitivo, no especializadas. Generalmente los
tumores benignos son bien diferenciados y los malignos, por el contrario, varían
desde bien diferenciados a indiferenciados (revisado en Robbins 2004).
2.2.1 Iniciación, Promoción y Progresión del Cáncer
La carcinogénesis, es un proceso que lleva a que una célula normal adquiera
alteraciones en su DNA, aumento en su proliferación y pérdida en su diferenciación,
generando un tumor, y que se caracteriza por estar dividido en 3 etapas: iniciación
tumoral, promoción tumoral, y progresión tumoral (Balmain y Harris 2000; Yuspa
2000).
La iniciación tumoral se refiere a los primeros cambios epigenéticos y
genéticos que ocurren en las células al ser expuestas a los diferentes agentes
carcinógenos (físicos, químicos y biológicos) (Matilla 2000); la promoción ocurre
consecuentemente a la iniciación, se refiere a la expansión clonal de células iniciadas
y precisa la exposición crónica a diferentes factores promotores, es decir, factores que
no tengan propiedades mutagénicas y, que por sí solos, sean incapaces de inducir
neoplasias (revisado en Balmain y Harris 2000; Yuspa 2000). Los hidrocarburos
policíclicos aromáticos desprendidos en la combustión de cigarrillos y tabacos
representan un ejemplo de elementos exógenos muy ricos tanto en factores
iniciadores como en promotores, razón por la cual han sido empleados en modelos
experimentales de carcinogénesis (Bernal Balaez 1996). El efecto de los factores
promotores es estimular la división celular de una célula que sufrió previamente una
mutación por la acción de un agente iniciador. La célula iniciada responde ante la
acción del promotor con un crecimiento distinto a las células normales (Cotran et.al,
1990; Balmain y Harris 2000).
Después de las etapas de iniciación y promoción tumoral, la siguiente etapa en
el proceso de carcinogénesis es la progresión tumoral, la cual se refiere a la tendencia
de las células con alteraciones en su DNA a proliferar de manera excesiva y a escapar
de los mecanismos de control del ciclo celular permitiendo una división rápida e
incontrolada (revisado en Balmain y Harris 2000; Yuspa 2000). Durante el período de
progresión, las células, hasta entonces premalignas, hacen su conversión en células
malignas a través de un proceso donde unas se transforman más rápido que otras. La
progresión de células que han transitado por etapas de iniciación y promoción, puede
ocurrir espontáneamente debido a la inestabilidad genética propia de la célula o puede
ser acelerado por la exposición a elementos genotóxicos, es decir, elementos que
actúan directamente sobre el DNA de la célula (Loeb 1994; revisado en Balmain y
Harris 2000).
Para el desarrollo del cáncer son necesarias múltiples alteraciones genéticas y
epigenéticas que implican a los oncogenes como sis, ras o myc y a los genes
supresores de tumores como Rb o p53 (Valladares 2000; Balmain 2001; Jones y
Baylin 2002). Estos dos tipos de genes tienen efectos opuestos en la carcinogénesis,
los oncogenes facilitan la transformación maligna de las células y tejidos normales y
los genes supresores de tumores bloquean el desarrollo del crecimiento anormal dado
que regulan el proceso de crecimiento (revisado en Cruz-Coke 1997). Los oncogenes
y los genes supresores de tumores interactúan de manera continua y contrapuesta
resultando del balance de sus acciones que la célula vaya o no a la apoptosis. Los
oncogenes fueron las primeras estructuras identificadas y relacionadas con la
aparición de tumores (Liotta y Liu 2001). Inicialmente se identificaron en los
retrovirus que se conoce, causan neoplasias transmisibles en los animales, pero
posteriormente se demostró que los oncogenes son variantes de genes normales de las
células o protooncogenes, encargados de estimular el crecimiento celular. Los
mecanismos por los cuales un protooncogen se activa, incluyen mutaciones puntuales
(cambio en una base de nucleótidos del DNA que se refleja en sustitución de un
aminoácido), amplificación genética y translocación cromosómica (revisado en CruzCoke 1997). La contraparte de los oncogenes está representada por los genes
supresores de tumores, los cuales inhiben la proliferación celular al actuar como
reguladores de la división celular. Al igual que en la activación de los
protooncogenes, las mutaciones en el DNA pueden causar, en este caso, una
inactivación de estos genes supresores y así favorecer la carcinogénesis (Liotta y Liu
2001) (Figura 2). Los genes supresores se inactivan por deleciones o mutaciones,
generalmente causadas por carcinógenos químicos (Kinzler y Vogelstein 1996). El
silenciamiento transcripcional por la metilación del DNA es otro mecanismo de
inactivación bien reconocido; la unión covalente de radicales metilo (-CH3) a las
citosinas en los dobletes CpG localizados en la región promotora de los genes,
también puede silenciar transripcionalmente a los genes supresores de tumores (Jones
y Baylin 2002).
Figura 2. Carcinogénesis. La carcinogénesis es un proceso que lleva a que una célula normal adquiera alteraciones en su DNA, aumento
en su proliferación y pérdida en su diferenciación, generando un tumor, y que se caracteriza por estar dividido en 3 etapas: iniciación
tumoral, promoción tumoral y progresión tumoral. La activación de los oncogenes y la inactivación de los genes supresores de tumores resultan
del daño causado al DNA por la exposición a agentes físicos, químicos y biológicos.
2.3 Sarcomas de Tejidos Blandos
Los sarcomas de tejido blando son un grupo heterogéneo de neoplasias de
tejido conectivo que se originan en los tejidos blandos por todo el cuerpo (Weiss y
Goldblum 2001). En Colombia, representan el 15% aproximadamente de los tumores
en pacientes pediátricos y en adultos corresponden al 1% de las neoplasias
(Ministerio de Salud 2001). Los sarcomas se clasifican según su tejido de origen; los
rabdomiosarcomas, tumores de músculo estriado y los sarcomas no diferenciados,
representan más de la mitad de todos los sarcomas de tejido blando infantiles. El resto
de los sarcomas de tejido blando no rabdomiosarcomatosos representan
aproximadamente el 3% de todos los tumores en pacientes pediátricos (Miser et.al
1997). Este grupo heterogéneo de tumores incluye las neoplasias de músculo liso
(leiomiosarcoma), de tejido conectivo (fibroso y adiposo), de tejido vascular (vasos
sanguíneos y linfáticos) y del sistema nervioso periférico (Weiss y Goldblum 2001).
Los sarcomas sinoviales, los fibrosarcomas y los neurofibrosarcomas predominan en
los pacientes pediátricos (Weiss y Goldblum 2001).
2.3.1 Fibrosarcoma
Dentro de los sarcomas de tejidos blandos, se encuentra el fibrosarcoma,
tumor maligno de origen mesenquimal caracterizado histológicamente por una
población predominante de células epiteliales dispuestas en fibras incrustadas en un
estroma fibrótico extensamente hialinizado (Chow et.al, 2004). El fibrosarcoma
exhibe diferenciación fibroblástica y muestra una fibrosis extendida evidente. El
37
tumor se presenta principalmente en musculatura profunda y está frecuentemente
asociado con la banda adyacente al periostio. El fibrosarcoma se caracteriza por una
proliferación de las células epiteliales con escaso o sin citoplasma dispuesto en fibras
y asociado con una esclerosis hialina prominente del estroma (Chow et.al, 2004).
El fibrosarcoma fue diagnosticado con más frecuencia en el pasado pero ahora
se distingue histológicamente de lesiones similares como tumores desmoides,
histiocitoma fibroso maligno, schwannoma maligno y osteosarcoma de alto grado
(Antonescu et.al, 2000).
Según características histológicas que permiten su identificación, los
fibrosarcomas se dividen en fibrosarcoma mixoide (mixofibrosarcoma), sarcoma
fibromixoide de bajo grado y fibrosarcoma epitelial escleroso (Weiss y Goldblum
2001). Histológicamente, la mayoría de los fibrosarcomas tiene en común un patrón
de crecimiento fasciculado consistente en células fusiformes o delgadas en forma de
espiga con escaso citoplasma y que están separadas por fibras de colágeno dispuestas
de manera paralela (Weiss y Goldblum 2001). El grado histológico de los
fibrosarcomas se basa principalmente en el grado de celularidad, grado de
diferenciación celular, número de mitosis, cantidad de colágeno producido por las
células tumorales y el grado de necrosis (Inwards y Unni 1995; Weiss y Goldblum
2001).
El tumor puede ocurrir en cualquier tejido blando del cuerpo pero es más
común en los tejidos blandos profundos de las extremidades inferiores,
particularmente en el muslo y las rodillas, seguido por las extremidades superiores y
38
el tronco (Weiss y Goldblum 2001). Generalmente la piel que rodea el tumor está
intacta aunque la mayoría de neoplasias localizadas superficialmente que crecen
rápidamente o han sufrido trauma pueden resultar en ulceración de la piel (Weiss y
Goldblum 2001). El fibrosarcoma puede ocurrir a cualquier edad pero es mas
frecuente entre los 30 y los 55 años (Weiss y Goldblum 2001). La edad media en la
literatura está entre los 39.4 y los 47.7 años (Pack y Ariel 1952; Pritchard et.al,
1977). La mayoría de estudios han reportado una incidencia ligeramente mayor en
hombres que en mujeres, por ejemplo, Scott et.al (1989) en un estudio de 132 casos
encontró que el 61% de los pacientes eran hombres. La mayoría de los pacientes
consulta por presentar masas palpables entre los 3 y los 8 centímetros que durante la
fase inicial crecen lentamente y causan dolor únicamente en la tercera parte de los
casos (Weiss y Goldblum 2001). Además, la mayoría de los pacientes carece de
manifestaciones sistémicas exceptuando la perdida de peso en aquellos en los que los
tumores son de gran tamaño y han hecho metástasis (Weiss y Goldblum 2001).
El tratamiento del fibrosarcoma más utilizado es la cirugía radical del tumor,
que a veces requiere la amputación o desarticulación del miembro donde se localiza,
debido a los altos índices de recidiva y a su capacidad metastásica por lo que la
radioterapia y la quimioterapia son utilizadas de forma adyuvante para la cirugía
(Weiss y Goldblum 2001).
39
2.4 Clorofilin
La clorofila y sus derivados hidrosolubles son constituyentes de la dieta
humana y son efectivos anticarcinógenos en varios modelos animales (Dashwood
et.al, 1998). Los derivados sintéticos o semisintéticos de los tetrapirroles son
ampliamente usados en fototerapia contra el cáncer, la psoriasis y degeneración
macular causada por la edad (Lane 2003). El clorofilin (CHL) (C34H31CuN4Na3O6) es
un derivado hidrosoluble de la clorofila, básicamente, es una mezcla de sales de sodio
y cobre que al igual que la clorofila exhibe una potente actividad antimutagénica in
vitro y ha sido reportado como anticarcinógeno en varios modelos animales
(Dashwood, 1997; Negishi et.al, 1997; Dashwood et.al, 1998). Al igual que la
clorofila, la molécula de clorofilin también está compuesta por anillos tetrapirrólicos
y se diferencia de la clorofila en que su átomo central es cobre y en que no posee el
extremo fitol (Fahey et.al, 2005) (Figura 3 y 4).
40
Figura 3. Estructura de la Clorofila. La molécula de clorofila es grande y está formada en
su mayor parte por carbono e hidrógeno; posee un átomo de magnesio en el centro, rodeado
por un grupo de átomos que contienen nitrógeno llamado anillo de porfirinas. El anillo de
porfirina es un tetrapirrol, con cuatro anillos pentagonales de pirrol enlazados para formar un
anillo mayor que es la porfirina. La clorofila posee una cadena larga llamada fitol que es una
cadena hidrocarbonada con restos de metilo (-CH3) a lo largo y que como todas las cadenas
orgánicas basadas sólo en C e H, tiene un carácter hidrofóbico.
Figura 4. Estructura del Clorofilin. La molécula de clorofilin está formada en su mayor
parte por carbono e hidrógeno y está compuesta por anillos tetrapirrólicos su átomo central es
cobre es grande y a diferencia de la clorofila no posee el extremo fitol, dándole un carácter
hidrofílico.
Los efectos de la clorofila y sus derivados han sido probados en laboratorios
de cultivos celulares y en animales (Sarkar et.al, 1994; Chernomorsky et.al, 1999).
Un estudio realizado en Qidong, China provee evidencia de los efectos
41
anticarcinógenos del CHL ya que se observa que el CHL puede reducir la cantidad de
casos de cáncer de hígado, el cual proviene de la exposición a aflatoxinas en las
comidas (maíz, nueces, soya y salsa de soya) (Egner et.al, 2001; Egner et.al, 2003).
Previamente, se ha demostrado que el clorofilin inhibe significativamente la actividad
mutagénica de gran variedad de xenobióticos actuando directamente como
antioxidante y formando complejos con los carcinógenos facilitando de este modo su
excresión (Dashwood et.al, 1998). El CHL puede disminuir la biodisponibilidad de
los carcinógenos presentes en la dieta impidiendo su absorción y transportándolos a
través de la materia fecal (Kensler et.al, 1998; Breinholt et.al, 1999).
Varios estudios sugieren que el CHL actúa como una “molécula interceptora”
entre la formación de complejos moleculares con carcinógenos como la aflatoxina B1
(Negishi et.al, 1997). Como un “agente bloqueador”, el CHL forma complejos
moleculares
con
compuestos
aromáticos
carcinógenos
como
las
aminas
heterocíclicas, carbonos aromáticos policíclicos y aflatoxinas y reduce su actividad
carcinógena (Dashwood 1997; Dashwood 2002). Se ha demostrado que el CHL
inhibe la actividad genotóxica y carcinógena de la aflatoxina B1 (AFB1) en trucha
arcoiris (Breinholt et.al, 1995).
El CHL inhibe la mutagenicidad de 2-amino-3- metilimidazol[4,5-f]quinolina
(IQ),
3-amino-1-metil-5H-
pirido[4,3- b]indol
(Trp-P-2),
aflatoxina
B1
y
benzo[a]pireno (B[a]P). Recientes estudios in vitro e in vivo han mostrado que el
complejo molecular es formado entre IQ y el CHL, sugiriendo que la formación de
este complejo puede ser la responsable de los efectos antigenotóxicos del CHL. La
42
enzima Citocromo P450 es uno de los principales catalizadores de la bioactivación de
estos carcinógenos (Yun et.al, 1995). Se ha sugerido que la actividad antimutagénica
del CHL proviene de su fuerte asociación con los mutágenos o sus intermediarios, de
la recolección de los radicales libres y de la supresión o la interferencia con la
activación metabólica por citocromos específicos (P-450) y otras enzimas
metabólicas (Newmark, 1984; Arimoto et.al, 1980; Dashwood et.al, 1991; Romert
et.al, 1992).
El CHL también inhibe la carcinogenicidad de 2-amino-1-metil-6fenilimidazol [4,5-b] piridina (PhIP). El CHL reduce la carcinogénesis mamaria PhIP
en ratas lo cual sugiere que el CHL es un quimiopreventor efectivo cuando es
ingerido simultáneamente con carcinógenos (Hasegawa et.al, 1995).
Trabajos recientes también muestran que el CHL altera el espectro de
mutaciones de β-catenina en tumores de colon inducidos en rata (Blum et.al, 2001) y
que genera cambios en las tasas de proliferación celular y apoptosis en la cripta del
colon (Dashwood et.al, 2001).
El CHL induce apoptosis en células HCT116 sin la liberación de Citocromo c
de la mitocondria ni la activación de la vía Apaf-1/Caspasa-9. Como un mecanismo
alternativo, el CHL activa la vía que envuelve a la caspasa-6 y la liberación de AIF de
la mitocondria, resultando en el clivaje de las laminas nucleares (Díaz et.al, 2003). El
CHL también induce cambios en la expresión de proteínas de la familia Bcl-2
incluyendo a tBid y Bak conduciendo a la apoptosis (Díaz et.al, 2003). El CHL
43
también actúa como un antioxidante para inhibir la peroxidación de los lípidos
(Kammat et.al, 2000).
El CHL ha sido usado en el tratamiento de varias condiciones humanas sin la
evidencia de toxicidad (Harrison et.al, 1954; Young and Beregi, 1980; Ong et.al,
1986) y recientemente ha sido usado como un inhibidor potente de la
hepatocarcinogénesis causada por aflatoxina B1 en trucha (Breinholt et.al, 1995).
Comercialmente, el clorofilin es ampliamente usado como desodorante de la materia
fecal y orina en pacientes geriátricos, para la cicatrización de heridas y como
colorante para comidas (PDR 2001). Ademas, se ha demostrado que la administración
oral a corto tiempo de CHL disminuye la genotoxicidad inducida por aminas
heterocíclicas mediante la inducción de enzimas de fase 2 (Dingley et.al, 2003).
Actualmente, las guías de la FDA (Administración de Alimentos y Drogas) permiten
la ingestión de 3 tabletas de 100 mg por día (Ikeda 2001).
3. Formulación del problema y Justificación
3.1 Formulación del problema
El cáncer es una enfermedad de origen multifactorial que se caracteriza por la
proliferación de células que presentan alteraciones en su DNA y que escapan a los
mecanismos de control del ciclo celular y muerte celular programada permitiendo una
división rápida e incontrolada. El cáncer ocasiona cerca del 20% de todas las muertes
44
a nivel mundial y constituye la segunda causa de muerte en los países desarrollados.
Por ejemplo, en Estados Unidos, más de un millón de personas son diagnosticadas
cada año para algún tipo de cáncer. En Colombia, las tasas de incidencia y de
mortalidad de cáncer se han venido incrementando en las últimas décadas; cerca de
28 mil hombres y mujeres mueren anualmente por esta causa.
Existen diferentes tipos de tumores los cuales se clasifican por su tejido de
origen, por ejemplo, el sarcoma es un tumor maligno que se origina en los tejidos
conectivos. Entre los sarcomas, el fibrosarcoma, es un tumor maligno de origen
mesenquimal que se caracteriza histológicamente por presentar una población
predominante de células epiteliales y se localiza con mayor frecuencia en las
extremidades inferiores. En Colombia, el fibrosarcoma tiene una incidencia promedio
de 2 casos por cada 100.000 habitantes, correspondiendo al 1% de las neoplasias en
adultos y al 15% en niños. Según la American Cancer Society, en Estados Unidos se
diagnostican 5000 casos nuevos al año y se estiman en 2000 las muertes anuales.
Si bien, la incidencia del fibrosarcoma es baja, en general, es un tumor con un
índice de agresividad alto, por lo cual, su pronostico en la actualidad es muy malo
debido a la ausencia de un tratamiento eficiente. Dentro de de las formas de
tratamiento para el fibrosarcoma, el quirúrgico continúa siendo el método más
efectivo, pero sus resultados no son del todo satisfactorios debido a los índices de
recidiva y a su capacidad metastatizante. La radioterapia y la quimioterapia son
alternativas válidas como coadyuvantes de la cirugía, pero tienen un alto costo y
45
efectos secundarios adversos reflejando la necesidad de implementar nuevas
estrategias terapéuticas para el tratamiento de la enfermedad.
3.2 Pregunta de Investigación
¿Es el clorofilin un regulador de la proliferación celular en células de
fibrosarcoma humano HT1080?
3.3 Justificación de la Investigación
Ya que el objetivo principal de la mayoría de las terapias contra el cáncer es
reducir el número de células tumorales y/o inducir su diferenciación, se plantea la
necesidad de realizar investigaciones con moléculas que tengan efectos sobre el
control de la proliferación y diferenciación celular. El clorofilin, un derivado
hidrosoluble de la clorofila, se perfila como una molécula con efectos importantes
sobre el control de la proliferación y diferenciación celular, tal como ha sido
reportado, no solo por sus propiedades antimutagénicas, sino también por la
modulación que ejerce sobre la apoptosis y diferenciación celular. Específicamente,
se ha observado que el clorofilin regula mecanismos de proliferación y diferenciación
en células de carcinoma de colon, mostrando una relación entre los efectos de esta
molécula con los mecanismos de control de muerte celular programada, ciclo y
diferenciación celular. A la fecha, la literatura no reporta estudios sobre los efectos
del clorofilin en células de fibrosarcoma. Con este trabajo se pretende conocer el
efecto del clorofilin sobre el ciclo y muerte celular en células de fibrosarcoma.
46
4. Hipótesis
Ho: El clorofilin regula la proliferación celular en células de fibrosarcoma humano
HT1080.
Ha: El clorofilin no regula la proliferación celular en células de fibrosarcoma humano
HT1080.
5. Objetivos
5.1 Objetivo General
Evaluar el efecto del clorofilin sobre la proliferación celular en células de
fibrosarcoma humano HT1080.
5.2 Objetivos Específicos
1.
Determinar el efecto del clorofilin a concentraciones de 0.25 mM, 0.50 mM y
0.75 mM sobre la proliferación y muerte de células de fibrosarcoma humano
HT1080.
2.
Determinar la viabilidad de células de fibrosarcoma humano HT1080 en
respuesta al clorofilin in vitro.
3.
Determinar el efecto del clorofilin sobre el contenido de DNA en células
HT1080.
47
6. Materiales y Métodos
6.1 Diseño de la Investigación
Diseño experimental in vitro
6.1.1 Población de Estudio y Muestra
La población correspondió a la línea celular de fibrosarcoma humano HT1080
obtenida de la American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD).
Se hicieron dos pruebas por triplicado para la determinación de la viabilidad
celular por MTS. Así mismo, se hicieron dos pruebas por triplicado para el conteo de
células adheridas y células flotantes, para el análisis de morfología celular por
microscopia de luz y para el análisis de ciclo celular por citometría de luz.
6.1.2 Variables del Estudio
En este estudio la variable independiente (X) fueron las distintas
concentraciones de CHL (0.25, 0.50 y 0.75 mM) y el tiempo de exposición a éste. La
variable dependiente (Y) fue el efecto del CHL sobre la proliferación y ciclo celular
de las células de fibrosarcoma humano HT1080.
48
6.2 Metodología
6.2.1 Cultivo Celular
Las células de fibrosarcoma humano HT1080 fueron sembradas en cajas de
cultivo T25 cm2 a una densidad de 1 x 105 en 5 ml de Medio Esencial Mínimo
(MEM) suplementado con 10% de Suero Fetal Bovino, 2.2 g/l de bicarbonato de
sodio, 100 u/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina al que se denominó
medio completo.
Los cultivos se mantuvieron a 37ºC en atmósfera húmeda al 5% de CO 2. Se
hicieron pases sucesivos por desprendimiento de las células con Tripsina 0.25%EDTA [1mM] durante cinco minutos a 37ºC y posteriormente fueron lavadas con
MEM suplementado con SFB al 1% (medio de lavado) y centrifugadas a 2000 rpm
durante cinco minutos a 4ºC con el objetivo de separar el medio de lavado y la
tripsina de las células. Posteriormente se descartó el sobrenadante teniendo
precaución de no disgregar el pellet. Este, fue resuspendido en 5 ml de medio
completo y la suspensión celular fue sembrada en nuevas cajas de cultivo T25 cm2
con el fin de expandir el cultivo celular. Se efectuaron cambios de medio cada dos o
tres días cuando se observaba el medio metabolizado por cambio de pH. El
seguimiento del cultivo se llevó a cabo en el microscopio invertido hasta que se
observó proliferación celular. Todas las pruebas fueron realizadas en cultivos que se
encontraban entre el 5º y el 12º pase.
49
6.2.2 Tratamiento de las Células con Clorofilin
Se preparó una solución stock de clorofilin de 20 mM en agua destilada
estéril, la cual fue protegida de la luz y diluciones en serie de 0.25mM, 0.50mM, y
0.75mM fueron preparadas justo antes de su adición a las células. Las células fueron
sembradas en placas de 6, 12 y 96 pozos a una densidad de 400 000 células en tres ml
de medio completo, 160.000 células en dos ml de medio completo y 30 000 células en
200 µl de medio completo respectivamente, y después de 24 horas de incubación a
37ºC en atmósfera húmeda al 5% de CO2 para lograr adherencia celular, se inició el
tratamiento con CHL durante 24, 48 y 72 horas. Se tuvo un grupo control células de
fibrosarcoma humano HT1080 únicamente con medio completo.
6.2.3 Determinación de la Viabilidad Celular por MTS
Se tomaron células de fibrosarcoma humano HT1080 de las cajas de cultivo
T25 cm2 y fueron sembradas en placas de 96 pozos a una densidad de 30 000 células
en 200 µl de medio completo y después de ser incubadas a 37ºC en atmósfera húmeda
al 5% de CO2 con concentraciones de 0.25 mM, 0.50 mM y 0.75 mM de CHL y el
respectivo grupo control, durante 24, 48 y 72 horas respectivamente, se aspiró el
medio, se agregaron 50 µl de medio completo y 10 µl de CellTiter 96® AQueous One
Solution Assay (Promega) y se incubaron a 37ºC durante dos horas. Posteriormente
se hizo la lectura de absorbancia a 480 nm en un lector de ELISA HUMAREADER
para determinar la viabilidad celular frente a las diferentes concentraciones de
clorofilin. El CellTiter 96® AQueous One Solution Assay
50
es un método
colorimétrico para determinar la viabilidad celular en ensayos de proliferación o
citotoxicidad. Este ensayo contiene un novedoso componente de tetrazolio llamado
MTS [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2Htetrazolio] y un reactivo llamado fenasina etosulfato (PES) el cual aumenta la
estabilidad quimica. El MTS es reducido por las células metabólicamente activas en
un producto de formazan que es soluble en el medio de cultivo (Barltrop et.al, 1991)
6.2.4 Células Adheridas y Células Flotantes
Se tomaron células de fibrosarcoma humano HT1080 de las cajas de cultivo
T25 cm2 y fueron sembradas en placas de doce pozos a una densidad de 160 000
células en 2 ml de medio completo y después de ser incubadas a 37ºC en atmósfera
húmeda al 5% de CO2 con concentraciones de 0.25 mM, 0.50 mM y 0.75 mM de
CHL y el respectivo grupo control, durante 24, 48 y 72 horas respectivamente, se
tomó el medio contenido en cada pozo y se llevó a un tubo falcon previamente
marcado de donde se tomaron 10 µl para ser montados en cámara de NeuBauer y
hacer el conteo de células flotantes.
Posteriormente, cada pozo fue lavado con 1 ml de PBS 1X pH 7.4 durante un
minuto y después se le agregaron 200 µl de Tripsina 0.25%-EDTA [1mM] y se
incubó durante cinco minutos a 37ºC en atmósfera húmeda al 5% de CO2 para
desprender las células. El monitoreo del desprendimiento celular se hizo en
microscopio de luz invertida. Una vez desprendidas las células, se inactivó la tripsina
añadiendo 1 ml de medio de lavado y se llevó la suspensión al tubo falcon
51
previamente marcado correspondiente a cada tratamiento para ser centrifugado a 2000
rpm durante cinco minutos a 4ºC. El pellet fue resuspendido en un volumen final de 2
ml de medio completo de donde se tomaron 10 µl de la suspensión celular para ser
montados en cámara de NeuBauer y hacer el conteo de células adheridas.
6.2.5 Análisis de Morfología Celular por Microscopía de Luz
Se tomaron células de fibrosarcoma humano HT1080 de las cajas de cultivo
T25 cm2 y fueron sembradas en placas de doce pozos a una densidad de 160.000
células en 2 ml de medio completo. Después de ser incubadas a 37ºC en atmósfera
húmeda al 5% de CO2 con concentraciones de 0.25 mM, 0.50 mM y 0.75 mM de
CHL y el respectivo grupo control, durante 24, 48 y 72 horas respectivamente, se
observaron bajo microscopio de luz para determinar si tenían características
morfológicas típicas de muerte celular programada (Alfaro et.al, 2000; Barrio et.al,
2003).
6.2.6 Análisis de Ciclo Celular por Citometría de Flujo
Para el análisis de ciclo celular, se tomaron células de fibrosarcoma humano
HT1080 de las cajas de cultivo T25 cm2 y se sembraron en placas de doce pozos a
una densidad de 200 000 células en 2 ml de medio completo y después de ser
incubadas a 37ºC en atmósfera húmeda al 5% de CO2 con concentraciones de 0.25
mM, 0.50 mM y 0.75 mM de CHL y el respectivo grupo control, durante 24, 48 y 72
horas respectivamente, se descartó el medio y los pozos fueron lavados con 1 ml de
52
PBS 1X pH 7.4 durante 1 minuto y desprendidos con 200 µl de Tripsina 0.25%EDTA [1mM] durante cinco minutos a 37ºC en atmósfera húmeda al 5% de CO2. El
monitoreo del desprendimiento celular se hizo en microscopio de luz invertida. Una
vez desprendidas las células, se agregó 1 ml de medio de lavado por pozo con el
objetivo de inactivar la tripsina y se llevó la suspensión celular a los tubos de
citometría de flujo previamente marcados y se centrifugaron a 2000 rpm durante
cinco minutos a 4ºC con el objetivo de separar el medio de lavado y la tripsina de las
células. Posteriormente se descartó el sobrenadante teniendo precaución de no
disgregar el pellet. A cada tubo se agregaron 300 µl de reactivo de Vindelov (100 ml
de buffer salino Tris pH 7.6, 1 mg (350 unidades) de Ribonucleasa A, la cual degrada
el RNA para permitir únicamente la lectura del DNA, 7.5 mg de Ioduro de Propidio
que se une tanto a DNA como a RNA, 0.1 ml de Igepal-C 240 el cual es un detergente
que rompe el citoplasma permitiendo la exposición del núcleo) (Vindelov 1997) y los
tubos fueron incubados durante una hora a 4ºC en oscuridad. Posteriormente, las
células fueron llevadas a estudio de citometría por medio de un citómetro de flujo
FACScalibur donde se adquirieron 10 000 eventos y se obtuvieron los porcentajes
relativos del número de células que se encontraban en cada fase del ciclo celular
(G0/G1, S, G2/M) a través del análisis con el software ModFit.
6.3 Recolección de la Información
Los datos del análisis de la viabilidad celular por MTS se obtuvieron mediante
la lectura de absorbancia a 480 nm en un lector de ELISA HUMAREADER. Así
53
mismo, los datos del ciclo celular fueron los porcentajes relativos del número de
células en cada fase del ciclo celular (G0/G1, S, G2/M) los cuales se obtuvieron del
análisis por citometría de flujo a través del software ModFit.
6.4 Análisis de la Información
El análisis de la información se hizo mediante la prueba estadística t de
student.
7. Resultados
7.1 Análisis de la Viabilidad Celular por MTS
El ensayo de viabilidad celular MTS mostró el efecto del CHL a diferentes
concentraciones durante 24, 48 y 72 horas de tratamiento sobre células de
fibrosarcoma humano HT1080. Para el análisis estadístico, se realizó una prueba t de
student en la que un valor de p<0.05 fue considerado estadísticamente significativo.
A las 24 horas de tratamiento las células del grupo control mostraron un
valor promedio de absorbancia de 0.968 ± 0.066; en las células expuestas a una
concentración de 0.25 mM de CHL, este valor disminuyó a 0.815 ± 0.036 siendo el
valor de p de 0.013 es decir estadísticamente significativo; para la concentración de
0.50 mM el valor de absorbancia fue de 0.899 ± 0.043 con un valor de p de 0.1821, y
para 0.75 mM de 0.829 ± 0.051 con un valor de p de 0.0284. A las 48 horas de
tratamiento con CHL se encontró para las células control un valor promedio de
54
absorbancia de 1.325 ± 0.034; el cual disminuyó a 1.282 ± 0.057 con un valor de p de
0.3017 en las células expuestas a una concentración de 0.25 mM de CHL, a 1.127 ±
0.037 con un valor de p de 0.0005 en las células expuestas a una concentración de
0.50 mM de y a 0.821 ± 0.090 con un valor de p de 0.0001 en las células expuestas a
0.75 mM de CHL. A las 72 horas de tratamiento se observó para el grupo control
un valor promedio de absorbancia de 1.400 ± 0.057, que disminuyó a 1.323 ± 0.057
con un valor de p de 0.1467 en las células expuestas a 0.25 mM de CHL, a 0.746 ±
0.089 con un valor de p menor de 0.0001 para la concentración de 0.50 mM de CHL
y a 0.437 ± 0.061 con un valor de p de 0.0001 para la concentración de 0.75 mM de
CHL (ver Tabla 2, Figura 5)
Tabla 2. Valores promedio de absorbancia de células de fibrosarcoma humano HT1080
expuestas a diferentes concentraciones de CHL durante 24, 48 y 72 horas. Se muestran
los valores promedio de absorbancia y ± desviación éstandar de dos experimentos por
cuadriplicado, del grupo control y de las concentraciones de 0.25 mM, 0.50 mM y 0.75 mM
de CHL. Un valor de p<0.05 fue considerado estadísticamente significativo *.
Tratamiento
Control
0.25 mM
0,5 mM
0,75 mM
24 horas
Promedio
± D.E
0,968
0,066
0,815*
0,036
0,899
0,043
0,829*
0,051
48 horas
Promedio
± D.E
1,325
0,034
1,282
0,057
1,127*
0,037
0,821*
0,090
55
72 horas
Promedio
± D.E
1,400
0,057
1,323
0,057
0,746*
0,089
0,437*
0,061
Viabilidad Celular en Células HT1080 tratadas con CHL
1,5
Absorbancia (O.D 480 nm)
1,4
1,3
1,2
1,1
Control
1,0
0.25 mM
0,9
0,5 mM
0,75 mM
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
24 horas
48 horas
Tiempo
56
72 horas
Figura 5. Viabilidad Celular en células de fibrosarcoma humano HT1080 expuestas a
CHL durante 24, 48 y 72 horas. Se muestran los valores promedio de absorbancia y las ±
desviaciones estándar de dos experimentos por cuadriplicado para cada una de las
condiciones experimentales
Como se observa en la figura cinco y según los resultados de la prueba t de
student, la viabilidad celular de las células expuestas a las concentraciones de 0.25
mM y 0.75 mM de CHL durante 24 horas de tratamiento, disminuyó cerca del 15%
siendo estadísticamente significativa con respecto a las células del grupo control
mientras que la disminución de la viabilidad celular en las células expuestas a 0.50
mM fue del 8%, no estadísticamente significativa. Según esto, las concentraciones de
0.25 y 0.75 mM de CHL sobre las células de fibrosarcoma humano HT1080 durante
24 horas afectan la proliferación celular. A las 48 horas de tratamiento con CHL, la
viabilidad celular de las células de fibrosarcoma humano HT1080 disminuyó de
manera dosis-dependiente con respecto al control siendo para la concentración de
0.25 mM del 5% aproximadamente, no estadísticamente significativa mientras que
para 0.50 mM la disminución en la viabilidad celular fue del 15% aproximadamente y
para 0.75 mM del 38% aproximadamente, estadísticamente significativa para ambas
concentraciones. A las 72 horas de tratamiento con CHL es donde se observa la
mayor disminución de la viabilidad celular en las concentraciones más altas de CHL
utilizadas siendo para 0.50 mM del 47% aproximadamente y para 0.75 mM del 70%
aproximadamente. De acuerdo con estos resultados el CHL evidencia un efecto fuerte
sobre la proliferación y viabilidad de células de fibrosarcoma humano HT1080.
57
7.2 Células Adheridas y Células Flotantes
La actividad del CHL sobre células de fibrosarcoma humano HT1080 se
evaluó mediante el conteo de células adheridas y células flotantes en el que se
observó un incremento estadísticamente significativo en el porcentaje de células
flotantes a medida que aumentó la concentración de CHL y el tiempo de exposición a
éste al igual que una disminución estadísticamente significativa en el porcentaje de
células adheridas. A las 24 horas de tratamiento en las células del grupo control, el
porcentaje de células flotantes fue de 0.77% ± 0.19; en las células expuestas a una
concentración de 0.25 mM de CHL, este valor aumentó a 11.50% ± 1.17; para la
concentración de 0.50 mM continuó aumentando a 32.32% ± 1.44 y para 0.75 mM
aumentó a 69.21% ± 1.10.
A las 48 horas de tratamiento con CHL, el porcentaje de células flotantes
para el grupo control fue de 4.57% ± 1.15; el cual aumentó en las células expuestas a
una concentración de 0.25 mM de CHL a 25.65% ± 0.66; para la concentración de
0.50 mM continuó aumentando a 65.77% ± 3.28 y para 0.75 mM aumentó a 87.96%
± 0.36. A las 72 horas de tratamiento, se observó también un aumento en el
porcentaje de células flotantes y una disminución en el porcentaje de células
adheridas a medida que aumentaba la concentración de CHL, aunque de una manera
más evidente pues para el grupo control el porcentaje de células flotantes fue de
6.84% ± 0.97 mientras que para las células expuestas a una concentración de 0.25
mM de CHL fue de 40.47% ± 0.56; para la concentración de 0.50 mM fue de 86.56%
± 0.83 y para 0.75 mM fue de 94.39% ± 0.53 (ver Tabla 3, Figura 6)
58
Tabla 3. Porcentaje de células adheridas y células flotantes a diferentes concentraciones
de CHL durante 24, 48 y 72 horas. Se muestran los porcentajes promedio de células
adheridas y células flotantes de dos experimentos por triplicado para cada una de las
condiciones experimentales. Un valor de p<0.05 fue considerado estadísticamente
significativo *.
Tratamiento
Control
0,25 mM
0,50 mM
0,75 mM
% Células Adheridas
24 Horas 48 Horas 72 Horas
99,23
95,44
93,16
88,51*
74,35*
59,53*
67,69*
34,24*
13,44*
30,79*
12,05*
5,62*
% Células Flotantes
24 Horas 48 Horas 72 Horas
0,77
4,57
6,84
11,50*
25,65*
40,47*
32,32*
65,77*
86,56*
69,21*
87,96*
94,39*
A.
% Células Flotantes
Efecto del CHL sobre células de Fibrosarcoma
Humano HT1080
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*
*
*
control
0,25 mM
*
*
0,75 mM
*
*
24 Horas
0,50 mM
48 Horas
Tiempo
59
72 Horas
B.
% Células Adheridas
Efecto del CHL sobre células de Fibrosarcoma
Humano HT1080
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*
*
control
*
0,25 mM
*
0,50 mM
*
0,75 mM
*
24 Horas
48 Horas
*
*
72 Horas
Tiempo
Figura 6. Porcentaje de Células Flotantes (A) y Adheridas (B) de células de
fibrosarcoma humano HT1080 expuestas a CHL durante 24, 48 y 72 horas. Se muestran
los promedios y las desviaciones estándar de cada una de las condiciones experimentales
hasta 72 horas de tratamiento. Un valor de p<0.05 fue considerado estadísticamente
significativo *.
60
Como se observa en la Figura 6A, el porcentaje de células flotantes aumenta
con respecto al del grupo control de manera dosis y tiempo-dependiente. Así mismo,
en la Figura 6B lo que se observa es la disminución del porcentaje de células
adheridas con respecto al grupo control de manera dosis y tiempo-dependiente.
7.3 Análisis de Morfología Celular por Microscopía de Luz
Para analizar los cambios en la morfología celular después del tratamiento con
las diferentes concentraciones de CHL, se utilizó la microscopia de luz (Alfaro et.al,
2000; Barrio et.al, 2003). Las células del grupo control presentaron una morfología
ovoide con núcleo pequeño, citoplasma claro rodeado de fibras de colágeno hialinas y
proyecciones hacia los lados. En estado de confluencia estas células crecieron en
múltiples capas y formaron microtumores a través de las placas de cultivo (Rasheed
et.al, 1974). En las células expuestas a las concentraciones de 0.25 mM, 0.50 mM y
0.75 mM se pudieron apreciar cambios en la organización celular, característicos de
la apoptosis tales como la condensación citoplasmática y de la cromatina, desarrollo
de vacuolas citoplasmáticas y aparición de fragmentos celulares o cuerpos
apoptóticos, sugiriendo que el CHL desencadenó la muerte celular programada en
células de fibrosarcoma humano HT1080.
7.4 Análisis de Ciclo Celular por Citometría de Flujo
61
Para el análisis de ciclo celular en células de fibrosarcoma humano HT1080 in
vitro, se realizó una marcación de las mismas con el reactivo de Vindelov y
posteriormente se llevaron a estudio de citometría de flujo donde se adquirieron
10.000 eventos. Para el análisis de esta información, se cuantificó el DNA, mediante
la obtención de histogramas que mostraron una distribución porcentual de cada una
de las fases del ciclo celular (G0/G1, S, G2/M).
En las células del grupo control a las 24 horas se observó un porcentaje de
células en G0/G1 de 38.33% ± 1.70; que a las 48 horas aumentó a 41.50% ± 0.71 y a
las 72 horas a 59.33% ± 0.47. De igual manera, el porcentaje de células en fase S
disminuyó en el tiempo para los diferentes intervalos de tiempo siendo menor a las 72
horas de tratamiento (24h: 57.67% ± 1.70; 48h: 43.63% ± 0.26; 72h: 33% ± 0). El
valor de porcentaje de células en fase G2/M incrementó entre las 24 y las 48 horas de
tratamiento siendo de 4.00% ± 0.82 y de 14.87% ± 0.90 respectivamente, mientras
que a las 72 horas de tratamiento el porcentaje de células en esta fase disminuyó a
7.67 % ± 0.47.
En las células expuestas a una concentración de 0.25 mM de CHL, se
observó a las 24 horas un porcentaje de células en G 0 /G1 de 42.40% ± 1.23 que
aumentó tanto a las 48 como a las 72 horas de tratamiento a 54.80% ± 1.07 y a
67.40% ± 3.11 respectivamente. El porcentaje de celulas en fase S a las 24 horas de
tratamiento fue de 49.00% ± 2.45; que disminuyó a 30.93% ± 0.90 a las 48 horas y a
18.33% ± 0.68 a las 72 horas. Para G2 /M, el porcentaje de células a las 24 horas fue
62
de 8.60% ± 1.98, que aumentó a 13.93% ± 1.55 a las 48 horas y a 14.27% ± 2.68 a las
72 horas.
En el análisis de las células expuestas a una concentración de 0.50 mM de
CHL se encontró un porcentaje de 46.67% ± 1.25 de células en G0/G1 a las 24 horas el
cual aumentó a 59.40% ± 5.94 a las 48 horas y a 60.53% ± 1.05 a las 72 horas. Para la
fase S se observó un valor de 44.50% ± 1.47 a las 24 horas, que disminuyó a 25.33%
± 4.43 a las 48 horas y a 13.93% ± 3.65 a las 72 horas de tratamiento. El valor de
porcentaje de células en fase G2/M a las 24 horas fue de 8.83 % ± 2.32, el cual
aumentó a 15.27% ± 1.52 a las 48 horas y a 25.53% ± 3.45 a las 72 horas.
En la concentración de 0.75 mM de CHL se observó un valor de 52.67% ±
2.36 de células en G0/G1 a las 24 horas, que aumentó a 68.04% ± 3.47 a las 48 horas y
disminuyó a 38.87% ± 5.08 a las 72 horas. En el porcentaje de células en fase S se
encontró un valor de 36.13% ± 2.99 a las 24 horas, que disminuyó a 11.87% ± 1.98 a
las 48 horas y aumentó a 29.07% ± 4.08 a las 72 horas. Para la fase G 2 /M se observó
un valor de 11.20% ± 0.86 a las 24 horas, el cual aumentó a 25.54% ± 1.04 y a
32.07% ± 1.05 a las 48 horas y a las 72 horas respectivamente (ver Tabla 4, Figura
7).
63
Tabla 4. Resultados del análisis de ciclo celular por citometría de flujo. Se muestran los
porcentajes de células HT1080 del grupo control y de las células expuestas a las diferentes
concentraciones de CHL así como los valores de desviación estándar hasta 72 horas de
tratamiento. Un valor de p<0.05 fue considerado estadísticamente significativo *.
Control
Tiempo
24 Horas
48 Horas
72 Horas
0.25 mM
Tiempo
24 Horas
48 Horas
72 Horas
0.50 mM
Tiempo
24 Horas
48 Horas
72 Horas
0.75 mM
Tiempo
24 Horas
48 Horas
72 Horas
Fase G0-G1
Promedio
D.E
38,33
1,7
41,5
0,71
59,33
0,47
Fase G0-G1
Promedio
D.E
42,40
1,23
54,80*
1,07
67,40*
3,11
Fase G0-G1
Promedio
D.E
46,67*
1,25
59,40*
5,94
60,53
1,05
Fase G0-G1
Promedio
D.E
52,67*
2,36
62,59*
1,77
38,87*
5,08
Fase S
Promedio
D.E
57,67
1,7
43,63
0,26
33
0
Fase S
Promedio
D.E
49,00*
2,45
30,93*
0,90
18,33*
0,68
Fase S
Promedio
D.E
44,50*
1,47
25,33*
4,43
13,93*
3,65
Fase S
Promedio
D.E
36,13*
2,99
11,87*
1,98
29,07*
4,08
64
Fase G2-M
Promedio
D.E
4
0,82
14,87
0,9
7,67
0,47
Fase G2-M
Promedio
D.E
8,60*
1,98
13,93
1,55
14,27*
2,68
Fase G2-M
Promedio
D.E
8,83*
2,32
15,27
1,52
25,53*
3,45
Fase G2-M
Promedio
D.E
11,20*
0,86
25,54*
1,04
32,07*
1,05
A.
% de Células
Fase G0/G1 en Células de Fibrosarcoma
Humano HT1080 expuestas a CHL
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Control
0.25 mM
0.50 mM
0.75 mM
24 Horas
48 Horas 72 Horas
Tiempo
B.
65
% de Células
Fase S en Células de Fibrosarcoma
Humano HT1080 expuestas a CHL
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Control
0.25 mM
0.50 mM
0.75 mM
24 Horas 48 Horas 72 Horas
Tiempo
C.
66
% de Células
Fase G2/M en Células de Fibrosarcoma
Humano HT1080 expuestas a CHL
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Control
0.25 mM
0.50 mM
0.75 mM
24 Horas 48 Horas 72 Horas
Tiempo
Figura 7. Efecto del CHL sobre el ciclo celular de células de fibrosarcoma humano
HT1080 hasta 72 horas de tratamiento. Se muestran los promedios y las desviaciones
estándar de cada una de las condiciones experimentales para: A. Fase G0/G1, B. Fase S y C.
Fase G2/M.
De acuerdo a los datos obtenidos por el análisis de ciclo celular de células de
fibrosarcoma humano HT1080 por citometría de flujo, se observó que el clorofilin
67
produce un arresto en la fase G0/G1 del ciclo celular forma dosis y tiempo-dependiente
hasta las 48 de tratamiento. A las 72 horas de tratamiento con CHL se observó que la
concentración que mantuvo un mayor porcentaje de células arrestadas en G0/G1 con
respecto al control fue la de 0.25 mM y no la de 0.75 mM como ocurrió para las otras
horas de tratamiento.
Con respecto a la fase S del ciclo celular, se observó que el clorofilin
disminuyó el porcentaje de células en esta fase del ciclo con respecto al grupo control
de una manera dosis y tiempo-dependiente lo cual concuerda con los porcentajes
obtenidos del numero de células adheridas y células flotantes (Figura 6).
Así como las diferentes concentraciones de clorofilin indujeron a las células
de fibrosarcoma humano HT1080 a arrestarse en la fase G0/G1 del ciclo celular,
también las indujeron a arrestarse en la fase G2 /M de una manera dosis y tiempodependiente.
8. Discusión
El clorofilin (CHL), derivado hidrosoluble de la clorofila, es una mezcla de
sales de sodio y cobre que al igual que la clorofila ha sido reportado como
anticarcinógeno en varios modelos animales (Dashwood, 1997; Negishi et.al, 1997;
Dashwood et.al, 1998). El clorofilin ha sido usado en varias situaciones clínicas entre
las que se incluye limpiar y acelerar la cicatrización de heridas, disminuir la
inflamación en quemaduras por radiación y disminuir el olor de la orina y la materia
fecal en pacientes geriátricos (Harrison et.al, 1954; Young and Beregi, 1980; Ong
68
et.al, 1986; PDR 2001). El CHL es uno de los aditivos para las comidas más
utilizados (Hendry 1996) y en Estados Unidos, es usado también como colorante para
cremas dentales (Ikeda 2001). Además, el CHL es capaz de inhibir la actividad
mutagénica de agentes químicos que causan los cambios genéticos característicos del
cáncer por lo que se ha perfilado como un agente muy efectivo a la hora de combatir
esta enfermedad.
En un estudio realizado por Chiu y colaboradores en el año 2003 evaluaron el
efecto del CHL sobre el crecimiento y la proliferación de células de leucemia HL-60
y K-562, de células de sarcoma de raton S-180 y de células de cáncer de seno MCF-7
encontrando que en estos tipos de células el CHL actúa como un agente
antiproliferativo. De igual forma, Díaz y colaboradores en ese mismo año, evaluaron
el efecto del CHL utilizando dosis de 0.0625 mM hasta 0.5 mM en cultivos de células
de cáncer de colon humano HCT116. En estas células, el CHL causó un arresto en el
crecimiento, las condujo a apoptosis e indujo cambios en la expresión de proteínas
miembros de la familia Bcl-2. Con base en estos resultados, se propuso hacer un
estudio in vitro utilizando el CHL sobre cultivos de células de fibrosarcoma humano
HT1080 para evaluar la reproducibilidad de su efecto antitumoral, observando, los
efectos sobre la viabilidad y ciclo celular en estas células hasta 72 horas de
tratamiento al ser expuestas a concentraciones de 0.25 mM, 0.50 mM y 0.75 mM de
CHL.
Para determinar los cambios morfológicos producidos por las diferentes
concentraciones de CHL en las células de fibrosarcoma humano HT1080 se utilizó la
69
microscopía de luz (Alfaro et.al, 2000; Barrio et.al, 2003). Una de las primeras
manifestaciones morfológicas de la muerte celular programada o apoptosis es la
pérdida de la unión celular, así como cambios en la organización de la membrana
citoplasmática y la aparición de condensación citoplasmática y de la cromatina
(Wang 2001). En las células HT1080 expuestas a las diferentes concentraciones de
CHL se observaron dichos cambios morfológicos así como la aparición de
fragmentos celulares o cuerpos apoptóticos los cuales se desprenden durante el
proceso de muerte celular programada, lo que sugiere que el CHL desencadena este
tipo de muerte celular en células de fibrosarcoma humano HT1080 así como lo hace
en células de carcinoma de colon HCT116 lo cual fue observado por Díaz y
colaboradores, quienes además de observar los cambios morfológicos característicos
de la apoptosis en esta línea celular después de ser tratada con CHL, encontraron que
el CHL disminuyó el potencial de membrana mitocondrial e indujo la liberación de
AIF al citosol y su translocación al núcleo. En cuanto a la vía mediante la cual el
CHL indujo la apoptosis, encontraron que el CHL produjo el clivaje de la pro-caspasa
8 en su forma activa, caspasa 8, la cual activó a la caspasa 6, produciéndose el clivaje
de las laminas nucleares. Así mismo, el CHL indujo cambios en los niveles de
proteínas de la familia Bcl-2, específicamente, observaron que el nivel de Bcl-2
disminuyó de manera dosis dependiente mientras que Bak aumentó favoreciendo de
esta manera la apoptosis. Con base en estos resultados es posible sugerir que el CHL
también induce la apoptosis en células de fibrosarcoma humano HT1080 de la misma
manera que en células de carcinoma de colon HCT116.
70
Es importante resaltar que las células de fibrosarcoma humano HT1080 en
cultivo no se encuentran en suspensión sino que son adherentes. En este estudio, a
medida que aumentó la concentración de CHL y el tiempo de exposición a éste, las
células perdieron su capacidad de adhesión a las placas de cultivo y se desprendieron
según lo indicaron los resultados del número de células adheridas y células flotantes,
en los que el porcentaje de células adheridas disminuyó y el porcentaje de células
flotantes aumentó con respecto al control, lo que concuerda también con los
resultados obtenidos por Díaz y colaboradores, fortaleciendo la idea de que el CHL
tiene un efecto apoptótico sobre las células de fibrosarcoma humano HT1080.
Además, los resultados obtenidos del ensayo de viabilidad celular CellTiter 96®
AQueous One Solution Assay (Promega), que indicaron una disminución en la
absorbancia a medida que aumentó la concentración de CHL y el tiempo de
exposición a éste, coinciden con los resultados obtenidos de los conteos de células
adheridas y flotantes mostrando aún más el posible efecto antiproliferativo y
apoptótico del CHL sobre células de fibrosarcoma humano HT1080.
En el estudio realizado por Chiu y colaboradores mencionado anteriormente,
se encontró que el CHL redujo de manera dosis-dependiente la proliferación de
células de leucemia HL-60 y K-562 y de células de sarcoma de raton S-180, las
cuales se encuentran en suspensión así como la proliferación de células de cáncer de
seno MCF-7 las cuales son adherentes. Según estos resultados y los observados en
este trabajo, se puede sugerir que el CHL regula la proliferación de células cancerosas
in vitro sin importar si están en suspensión o son adherentes.
71
Al igual que el CHL, se ha propuesto que los compuestos encontrados en
crucíferas, tales como los indoles, tienen efectos antimutagénicos y pueden actuar en
las diferentes etapas del proceso de carcinogénesis, logrando prevenirlo. En el
presente año, Neave y colaboradores realizaron un estudio en el que evaluaron el
efecto del Indol-3-carbinol (I3C) y el N-metoxi-indol-3-carbinol (NI3C) sobre el
crecimiento de dos líneas celulares de cáncer de colon, DLD-1 y HCT116. Sus
resultados indican que el I3C y el NI3C indujeron a las células a detenerse en la fase
G0/G1 y en la fase G2/M del ciclo celular respectivamente. Al analizar los niveles de
proteínas involucradas en el ciclo celular Neave y colaboradores encontraron que en
las células tratadas con los indoles, los niveles de p21 y p27, inhibidores de las CDKs,
incrementaron sugiriendo que el arresto en la fase G0/G1 podría estar relacionado con
este suceso (Neave et.al, 2005).
El efecto del CHL sobre el ciclo celular de células de fibrosarcoma humano
HT1080 fue analizado mediante citometría durante 72 horas después de la incubacion
con concentraciones de 0.25 mM, 0.50 mM y 0.75 mM de CHL. Como resultado, las
células del grupo control no mostraron inhibición en el crecimiento, sino que por el
contrario mostraron un proceso de proliferación excesivo. Este evento se correlacionó
con un alto porcentaje de éstas celulas en fase S, en donde a las 24 horas fue de
57.67%. Este alto porcentaje de células en fase S, con respecto al observado en las
células expuestas a las diferentes concentraciones de CHL, sugiere que las células del
grupo control han escapado a los puntos control del ciclo celular y que se encuentran
en un estado de alta replicación de DNA y por lo tanto, preparándose para sufrir
72
mitosis. Además, las células del grupo control mostraron un aumento progresivo en la
proliferación y adhesión a la superficie plástica de las placas de cultivo,
comportamiento típico de una célula tumoral (Mathiak et.al, 1997).
Con respecto a las células de fibrosarcoma humano HT1080 expuestas a las
diferentes concentraciones de CHL, los análisis de ciclo celular mostraron que el
porcentaje de células en fase S disminuyó mientras que el porcentaje de células en la
fase G0/G1 y en la fase G2/M del ciclo celular aumentó, concordando con los
resultados obtenidos por Neave y colaboradores. De esta manera, los resultados de
ciclo celular obtenidos en el presente estudio, sugieren que el CHL interfiere con la
activación de proteínas reguladoras del ciclo celular como las ciclinas y las Cinasas
Dependientes de Ciclinas (CDKs) las cuales controlan los cambios que conducen a la
división celular al formar complejos proteína-cinasa que fosforilan una serie de
proteínas involucradas en la replicación del DNA y en otros procesos del ciclo celular
(revisado en DeGregory et.al., 1997; Johnson y Walker 1999; Stein et.al, 2002).
Al igual que el NI3C y el I3C, el CHL indujo un arresto de las células en la
fase G0/G1 y en la fase G2/M del ciclo celular. Ya que Neave y colaboradores
analizaron los niveles de proteínas reguladoras del ciclo celular y encontraron que
p21 y p27 se encontraban incrementadas en las células arrestadas, es posible pensar
que el tratamiento con CHL pudiera aumentar los niveles de estas proteínas en las
células de fibrosarcoma humano HT1080 ya que se conoce que están envueltas en la
regulación de la transición de la fase G1 a la fase S del ciclo celular (Stein et.al,
2002). Estos inhibidores de las CDKs interactúan e inhiben la actividad cinasa de los
73
complejos formados entre éstas y las ciclinas como CDK2/ciclina E y CDK4/ciclina
D (Stein et.al, 2002). La proteína p21 interactúa con la CDK2, aunque puede inhibir
otros complejos ciclinas que contienen otras CDKs, como la CDK4. Además, p21
también puede unirse al antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), una
subunidad de la DNA polimerasa, y así inhibir directamente la síntesis de DNA
(Guevara et.al,1999).
El arresto en la fase G1 inducido por el CHL en las células de fibrosarcoma
humano HT1080 muestra que posiblemente la molécula interfiere con la activación
específicamente de las ciclinas D y E, que se unen a CDKs durante la fase G1 del
ciclo celular, aceleran la progresión de las células al mismo y son necesarias para el
inicio de la fase S. Al analizar los niveles de proteínas reguladoras del ciclo celular,
Chiu y colaboradores en el año 2003 encontraron que ciertamente el CHL disminuyó
el nivel de las ciclinas D1 y E y aumentó el nivel de la ciclina B1 en las células MCF7 lo cual sugiere que los cambios en los niveles de estas proteínas reguladoras del
ciclo celular pueden ser clave para el efecto antiproliferativo del CHL y que a la vez
apoya la idea de que estas ciclinas fueron alteradas también por el CHL en las células
de fibrosarcoma humano HT1080. Así mismo, el CHL pudiera interferir
negativamente con el nivel de fosforilación de la proteína Rb haciendo que esta se
una e inhiba a factores de transcripción E2F bloqueando así la progresión del ciclo
celular.
Los datos que muestran un arresto en el ciclo celular y una disminución en la
proliferación de células de fibrosarcoma humano HT1080, sugieren que el CHL,
74
podría aumentar los niveles de la proteína codificada por el gen p53 en estas células
ya que ésta tiene un papel decisivo en la muerte celular programada.
Con respecto al arresto en la fase G2/M del ciclo celular causado por el CHL
en las células de fibrosarcoma humano HT1080 se sugiere que el CHL pudiera
interferir con la activación de las ciclinas mitóticas (A y B) que se unen a CDKs
durante la fase G2 siendo necesarias para la entrada en mitosis (Stein et.al, 2002).
Posiblemente, el CHL interfiere con la fosforilación del complejo ciclina B-cdc2 que
induce la mitosis.
Así, en células de fibrosarcoma humano HT1080, el CHL podría alterar los
mecanismos que suprimen el crecimiento celular y conducen a la célula a apoptosis.
Ya que estas actividades están controladas en gran parte por oncogenes y genes
supresores de tumores, de acuerdo a los resultados obtenidos, éste estudio sugiere que
posiblemente el CHL afecta directamente la activación de dichos genes tales como
sis, ras o myc y Rb o p53, factores de crecimiento celular como FGF y factores de
transcripción como E2F que dan lugar al inicio de la síntesis de DNA y, en ultimo
termino, a la división celular.
De acuerdo a las investigaciones anteriores realizadas con CHL y a los
resultados obtenidos en este estudio, que lo perfilan
como un agente
quimiopreventivo muy prometedor, se insta a que sea investigado rigurosamente por
la comunidad científica para hacer un uso efectivo de todos sus beneficios. A
continuación se plantea un posible modelo de acción para explicar el efecto del CHL
sobre la proliferación de células de fibrosarcoma humano HT1080.
75
76
77
Figura 8. Modelo propuesto de acción del CHL sobre células HT1080. El CHL induce a las células de fibrosarcoma humano
HT1080 a un arresto en la fase G0/G1, el cual está posiblemente asociado a un incremento en los niveles de los inhibidores de las
CDKs como p21 y p27, los cuales inhiben la actividad cinasa de los complejos CDK2/ciclina E y CDK4/ciclina D, que son
importantes para la transición a la fase S del ciclo celular. Asi mismo, el CHL podría mantener a Rb hipofosforilada haciendo que ésta
se una e inhiba a los factores E2F bloqueando así la progresión del ciclo celular. Además, el CHL indujo a las células a arrestarse en
la fase G2/M del ciclo celular, posiblemente porque interfiere con la activación de las ciclinas A y B, que son necesarias para la
entrada en la fase M. Así, el CHL disminuye la proliferación de células de fibrosarcoma humano HT1080 conduciéndolas a apoptosis
por la activación de la caspasa iniciadora 8, la cual puede activar a Bid y a la caspasa ejecutora 6. En la mitocondria, Bak, miembro
pro-apoptótico de la familia de proteinas Bcl-2 induce la liberación de AIF.
78
9. Conclusiones
•
El CHL disminuye la proliferación y viabilidad celular en células de
fibrosarcoma humano HT1080.
•
El CHL induce un arresto en la fase G0/G1 y G2/M del ciclo celular en células
de fibrosarcoma humano HT1080.
•
El CHL puede desencadenar la apoptosis en células de fibrosarcoma humano
HT1080.
10. Recomendaciones
•
Corroborar la morfología apoptótica de las células flotantes mediante tinción
con naranja de acridina y bromuro de etidio.
•
Realizar pruebas para analizar el nivel de expresión de proteínas reguladoras
del ciclo celular como las ciclinas D, E, A y B.
•
Realizar pruebas para analizar el nivel de expresión de los inhibidores de las
CDKs como p21 y p27.
•
Realizar pruebas para analizar el nivel de expresión de proteínas como p53 y
Bcl-2 y su relación con la inducción de apoptosis.
79
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