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Universidad de La Habana
Instituto de Farmacia y Alimentos
DETERMINACIÓN DE RESIDUOS
PLAGUICIDAS PIRETROIDES EN MIEL DE
ABEJA
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE MASTER EN TOXICOLOGÍA
EXPERIMENTAL
PRESENTADA POR
Lic. Paula Gaspar Francisco
Tutores: DraC. Yoagne Maria Trapero Quintana
MsC. Armando Rafael Romeu Carballo
La Habana, 2015
Para Dios todo poderoso
Que nunca me dejaste, en momentos que solo Tu sabes!
Para los profesores, Dra. María Antonia Alemán y Dr. Gonzalo Dierskmeier:
Que me motivaron a hacer esta maestría, siempre me brindaron con su cariño y fuerza
para llegar al final…MUCHAS GRACIAS POR TODO!
Para Yoagne Maria Trapero Quintana:
Cuando las vendas de los ojos obligan a vivir en un mundo de sombras…
Cuando las ataduras en las manos no permiten hacer lo que está al alcance de nuestras
habilidades…
Cuando la ignorancia no permite imaginar las conclusiones obvias… solo una amiga, logra
desvanecer todas estas limitaciones imaginarias con sus palabras: “…tranquila, todo va
salir bien…”
Para Armando Carballo:
Por regalarme tus conocimientos, por tu gran empeño, dedicación y optimismo. Solo te
puedo decir: Muito obrigado!
Para mi familia:
Que les puedo decir más?!...
En verdad son como las abejas en una colmena. Preciosas como las Reinas, laboriosas
como Obreras y exigentes como los Zánganos.
Son las personas más valiosas para mí, sin ellas todo era más difícil…
También agradezco a los compañeros del LARCA, a mis amigas y compañeras de
la maestría, que compartieron conmigo momentos inolvidables, a los profesores
del instituto de Farmacia y alimentos de la Universidad de Habana… Estamos
juntos!
Mi mayor agradecimiento va también, para el Gobierno angolano por mantener
relaciones de cooperación ANGOLA – CUBA y por las Fuerzas Armadas
angolanas – FAA, por confiarme en esta ardua misión.
INDICE
Introducción
1. Revisión bibliográfica
1.1. La miel: definición, composición y usos
1.1.1.Sustancias tóxicas presentes en la miel y su calidad
1.2. Abeja Apis Mellifera
1.3. Plaguicidas. Definición
1.3.1. Clasificación de los Plaguicidas. Toxicidad
1.3.2. Contaminación de la miel por plaguicidas
1.4. Efectos ambientales de los plaguicidas, clasificación. Riesgo
toxicológico.
1.5.Límite Máximo de Residuos (LMR)
1.5.1.Ingesta Diaria Admisible
1.6. Los Piretroides. Clasificación y sus generalidades
1.6.1. Efectos de los piretroides sobre la salud humana
1.7. Residuos de plaguicidas. Desarrollo del método para
determinación de residuos plaguicidas
1.8. Cuantificación por cromatografía gaseosa
1.9.Procedimiento para validación del método de ensayo de residuos
de plaguicidas
2. Materiales y métodos
2.1. Materiales y equipos
2.2. Estándares, reactivos y soluciones.
2.3. Preparación de las soluciones de patrones analíticos y blanco
fortificado de miel de abeja.
2.4. Método de ensayo para análisis de residuos de plaguicidas
piretroides en miel de abejas.
2.5.Cuantificación y validación del método de ensayo
Páginas
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3. Resultados y discusión
35
3.1 Validación del método analítico
35
3.2. Cuantificación de los residuos de plaguicidas piretroides en
muestras de miel de abeja.
3.3. Efecto ambiental, producto de la toxicidad causada por la
presencia de residuos de plaguicidas piretroides en miel de abeja.
47
Conclusión
59
Recomendaciones
60
52
61
Referencias bibliográficas
TABLAS
Tabla 1. Clasificación de los plaguicidas según su toxicidad expresada en
DL50 mg.kg−1.
Tabla 2. Ingesta diaria admisible (IDA) y Límites máximos de residuos (LMR).
Tabla 3. Límites máximos de residuos establecidos por la Unión Europea
para los plaguicidas empleados en el tratamiento de enfermedades apícolas.
Tabla 4. Resultados obtenidos para la linealidad del método de ensayo
Tabla 5. Resultados obtenidos para la repetibilidad.
Tabla 6. Resultados obtenidos para la reproducibilidad.
Tabla 7. Resultados obtenidos en la evaluación de la exactitud.
Tabla 8. Resultados obtenidos para la prueba F de la exactitud.
Tabla 9. Sin cambios de los parámetros. Robustez 1
Tabla 10. Se cambian los programas de temperatura. Robustez 2.
Tabla 11. Cálculos obtenidos con la prueba F.
Tabla 12. Cálculos obtenidos del blanco fortificado con resolución.
Tabla 13. Cálculos obtenidos de la concentración de 0.002 mg.kg−1.
Tabla 14. Valor mínimo de los analitos validados
Tabla 15. Cálculos obtenidos de la cuantificación a 0.005 mg.kg−1
Tabla 16. Calculo de medición de la incertidumbre
Tabla 17. Tiempo de retención para los plaguicidas en estudio.
Tabla 18. Resultados (Piretroides 0.025 ng) Ruido (38.48-39.19 min.): 0.7922
[mV]
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56
FIGURAS
Figura 1. Curva de calibración para cada compuesto y el valor R2 para
cada uno.
Figura 2. Cromatograma patrón.
Figura3. Cromatograma supercompare patrón muestra blanco.
Figura 4 .Cromatograma blanco fortificado con resolución.
Figura 5. Cromatograma a una concentración 0.002 mg.kg−1
Figura 6. Cromatograma de muestras de miel contaminadas con
residuos plaguidas piretrides de tau-fluvalinato y deltametrina.
Figura 7. Cromatograma de muestras de miel contaminadas con
residuos plaguidas piretrides de cipermetrina y tau-fluvalinato.
Figura 8. Tau-fluvalinato: N-[2-cloro 4-(trifluorometil)fenil]-DL-valinato
de (RS)-α-ciano-(3-fenoxifenil)metilo – 1 isómero.
Figura 9. Deltametrina: [(S)-α-ciano-3 fenoxibenzil (1R, 3R)-3-(2,2
dibromovinil)-2,2 dimetilciclopropanocarboxilato] – 1 isômero.
Figura 10. Cipermetrina: (RS)-α-cyano-3-phenoxybenzyl (1RS, 3RS;
1RS, 3SR)-3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropane carboxylat 2 isómeros.
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42
42
43
44
48
48
51
51
51
GLOSARIO
 Ag – Plata
 As – Arsenio
 BPA – Buenas Prácticas Agrícolas

0
C – grado celcius
 CG – Cromatografía gaseosa
 CL – Cloruro
 CPA – Cooperativas de Producción Agropecuaria
 Cs – Coreoatetosis
 DDT – Dicloro Difenil Triclooetano
 DL50 – Dosis requerida para matar al 50 % de la población
 DS – Desviación estándar
 EPA – Agencia para la protección del medio ambiente (Environmental
Protection Agency)

0
F – Fahrenheit (unidad de temperatura)
 FAO – Food and AgricultureOrganization
 GABA – Acido gamma aminobutírico
 HCH – Hexanoclorocitohexano
 HCB – Hexaclorobenzeno
 Hg – Mercurio
 HMF – Hidroximetilfurfural
 HPLC – Cromatografía liquida de alta resolución
 IDA – Ingesta Diaria Admisible
 INISAV – Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal
 Kg – Kilogramo
 LARCA – Laboratorio de Análisis de Residuos de Plaguicidas y
Contaminación Ambiental
 LC – Límite de cuantificación
 LD – Límite de detección
 L – Litro
 LMR – Límites máximos de residuos
 mg – Miligramo
 Na – Sodio
 ND – No detectable
 NOEL – Nivel sin Efecto Observable
 O-C – Organoclorados
 OMS - Organización Mundial de la Salud
 O- P – Organofosforados
 P – Fósforo
 Pb - Plomo
 pc – Peso corporal
 PCP – Pentaclorofenol
 RSD – Desviación Estándar Relativa o Coeficiente de Variación
 SNC – Sistema nervoso central
 RMN – Resonancia magnética nuclear
 Ta – Tantalio
 U – Unidad
 UBPC – Unidades Básicas de Producción Cooperativa
 UCTB – Unidad cientifico-tecnica de base
 UE – Unión Europea
RESUMEN
El uso frecuente e inadecuado de compuestos químicos, como los plaguicidas
utilizados en actividades agropecuarias, traen consigo contaminación del medio
ambiente. Estos, inciden en la actividad apícola, debido a que son
recolectados, transportados y concentrados en la colmena, por las abejas
durante la actividad de pecoreo, permaneciendo como residuos en la miel. La
cuantificación de estos compuestos puede emplearse como un bioindicador,
para monitorear el estado del medio ambiente en una región apícola, ya que la
persistencia de estas sustancias tóxicas, perjudican directamente a todas las
especies que interactúan con el entorno. Se validó el método de ensayo para la
cuantificación utilizando muestras blanco de miel fortificadas con plaguicidas
piretroides para la posterior cuantificación. Se determinaron residuos de
plaguicidas piretroides en muestras de miel de abejas, para el consumo
humano y se determinó su impacto ambiental. Se validó el método
demostrando ser lineal, preciso, exacto, robusto, selectivo y específico, para 7
compuestos de plaguicidas piretroides. De las 31 muestras estudiadas se
cuantificó el tau-fluvalinato como el compuesto más frecuente para un 61,3%,
seguido de la deltametrina y cipermetrina para un 6,4%. Los Limites Máximos
de Residuos experimentales, revelan valores por encima de los establecidos
por la unión europea, demostrando la contaminación de la miel. Se corrobora
que las abejas y sus productos son empleados como bioindicadores del
impacto de varios contaminantes ambientales incluyendo los plaguicidas. Los
piretroides son agrupados de acuerdo a la ocurrencia de sus efectos adversos
ambientales como; que actúan a corto plazo en el ambiente cercano.
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
INTRODUCCIÓN
En la actualidad, la contaminación ambiental es una de las áreas de mayor
investigación por parte de la comunidad científica, así como, uno de los principales
temas de discusión, en las diferentes organizaciones y/o entidades gubernamentales,
que día a día emiten nuevas legislaciones en pro de la conservación de los recursos
naturales y la protección de la flora y fauna.
La industria apícola no escapa a esta problemática, sino que diariamente se enfrenta a
exigencias más férreas en cuanto a la comercialización de los productos de la colmena,
lo cual disminuye progresivamente las posibilidades de este comercio para los
pequeños apicultores (Díaz, A.M., y Col., 2013; Rodríguez 2011).
La presencia de residuos químicos en la miel, es una de las principales limitantes para
su comercialización causando subsiguiente quiebra y pierda de empleos (Rodríguez
2011; Díaz, A.M., y Col., 2013). También acarrea severos daños a la sociedad, pues
implica afectaciones a la salud humana y de las propias abejas, repercutiendo
negativamente en la conservación del equilibrio con el medio ambiente (Rodríguez
2011; Bernadou, A., y Col., 2009).
Desde tiempos antiguos, la miel se ha caracterizado por ser un endulzante natural,
teniendo una importante posición como un producto de consumo internacional, con una
producción mundial estimada en más de 1 millón de toneladas métricas (Molino, F.,
2008). De acuerdo con el precio promedio de este producto, los Estados Unidos en el
año de 2007 el valor global de la producción de miel alcanzó valores estimados en 1,25
billones de dólares (VanEngelsdorp, D. y M.D. Meixner, 2010).
Cuba fue una potencia exportadora de cera entre los siglos XVIII y XIX. Llegó a vender
fuera de fronteras, más de 2 000 toneladas de ese derivado de las colmenas. La
producción de miel en todo el territorio nacional, se concentra en 16 unidades
empresariales de base, de las cuales 14 son de acopio; una unidad de
1
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
comercialización, beneficio y embazado; y otra se encarga de la logística. En total,
intervienen en el proceso 1.692 productores, 47 Unidades Básicas de Producción
Cooperativa (UBPC), 24 Cooperativas de Producción Agropecuaria (CPA) y 27 granjas
estatales que acopian alrededor de 7000 toneladas anuales.
El crecimiento de la apicultura en Cuba, está sustentado en un programa de desarrollo
que prevé para el 2020 alcanzar la cifra de 10.000 toneladas, similar cantidad a la
registrada en los años 80. La provincia de Matanzas sobresale como la de mayor
acopio de miel, cera, abejas reinas y mayor parque de colmenas al cierre del 2013
(http://www.cubahora.cu/economia/apicultura-cubana-endulza-la-economia).
A fin de impedir que mieles contaminadas afecten a los consumidores, la Unión
Europea (UE) y otros países consumidores de miel de abejas han emitido reglamentos
estrictos que regulan la comercialización de este producto, en los cuales se establecen
límites máximos de residuos (LMR) para una gran variedad de contaminantes
(Reglamento, UE., 2005). De esta manera, la presencia de residuos de plaguicidas
puede llegar a convertirse en una barrera fitosanitaria en el momento en el que se
desea exportar la miel a estos países. Esta legislación ha tomado tal importancia, que
un país que no controle la calidad e inocuidad de este alimento puede llegar a ser
sancionado con un veto de comercialización. Por este motivo, en el mundo se
proponen constantemente metodologías analíticas, cada vez más precisas, específicas,
exactas, rápidas, robustas, capaces de detectar y cuantificar concentraciones inferiores
al LMR para un gran número de plaguicidas de uso agrícola y apícola en miel de
abejas. Con el objetivo de garantizar un producto inocuo y de buena calidad para el
usuario final.
Los plaguicidas son compuestos químicos, utilizados por el hombre con objetivo de
aumentar la productividad y la calidad de los productos, reduciendo los costos de mano
de obra, disminuyendo las pérdidas de los alimentos almacenados, exterminando
vectores de enfermedades, etc… (Pimpão, C.T, 2012).
2
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Los plaguicidas piretroides, son los insecticidas más usados, pues presentan una baja
toxicidad para el hombre y efectivos contra un largo espectro de insectos, ejercen su
poder de acción con bajas cantidades (Santos y col., 2007).
El medio que rodea a la colmena no es el único factor de contaminación de la miel por
plaguicidas, la aplicación directa de productos para el control de enfermedades que
afecten las abejas, por parte de los apicultores es otra fuente importante de tóxicos en
la colmena. Además, la miel es un alimento de alto consumo humano, especialmente
para los niños, por lo que debe cuidarse que estén libre de contaminantes.
Es por este motivo que el Laboratorio de Análisis de Residuos de Plaguicidas y
Contaminación Ambiental (LARCA) del Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal
(INISAV) de la Habana – Cuba, es el encargado de determinar los residuos de
plaguicidas piretroides en muestras de miel de abejas producida en este país. En este
instituto se desarrolló parte de la investigación, con el propósito de probar que la miel
producida en Cuba, cumple con los parámetros y requisitos de importación, inocuidad y
que los resultados obtenidos sean confiables, garantizando un producto de calidad
junto al consumidor.
Hipótesis
Usando un método validado, se puede determinar residuos plaguicidas piretroides en la
miel, para garantizar un consumo inocuo.
OBJETIVOS
General:
Determinar residuos de plaguicidas piretroides en muestras de miel de abeja.
3
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Específicos:

Validar el método de ensayo para la determinación de residuos de plaguicidas
piretroides, en miel de abeja.

Cuantificar los residuos de plaguicidas piretroides en muestras de mieles de
abeja.

Describir el efecto ambiental, producto de la toxicidad causada por la presencia
de residuos de plaguicidas piretroides en miel de abeja.
4
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.1.
La miel: definición, composición y usos
Se entiende por miel, el producto alimenticio producido por las abejas melíferas a partir
del néctar de las flores o de las secreciones procedentes de partes vivas de las plantas
o de excreciones de insectos succionadores de plantas que quedan sobre partes vivas
de las plantas, que las abejas recogen, transforman, combinan con consustancias
específicas propias, almacenan y dejan madurar, añejar en los panales de la colmena.
(FAO/WHO. 2001).
La composición de una muestra de miel va a depender de dos factores principales:
primero de la composición del néctar y segundo por factores externos. Por la
composición del néctar, va a depender principalmente de la especie o conglomerado de
especies de plantas que producen el néctar. Por factores externos o factores
secundarios son por tipo o química del suelo, clima, manejo apícola y manejo de la miel
una vez cosechada por los apicultores. Como alimento, la miel es una fuente gustosa y
digestible de carbohidratos (fructosa y glucosa) mayoritariamente, pero contiene una
gran variedad de sustancias menores dentro de los que se destacan; el agua, enzimas
aminoácidos y proteínas, ácidos orgánicos, antioxidantes, vitaminas, minerales, etc
(Gutiérrez, M.G. y Col., 2008; Izquierdo, M., 2006; Ulloa, J. A. y Col. 2010).
Además, se ha asociado otros usos o funciones, como para el tratamiento de
afecciones de la salud; para reducir el riesgo de enfermedades del corazón, sistema
inmune, cataratas y diferentes procesos inflamatorios. También es utilizada en
cosmética (cremas, mascarillas de limpieza facial, tónicos, etc…) debido a sus
cualidades astringente y suavizante (Ulloa, J. A., 2010).
1.1.1. Sustancias tóxicas presentes en la miel y su calidad
En la miel, se pueden encontrar sustancias tóxicas de origen vegetal y de origen
foráneo. La mayoría de las sustancias tóxicas que se encuentran en la miel son de
5
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
origen vegetal, o sea substancias secundarias aportadas por la planta al néctar. En
algunas áreas y bajo condiciones poco usuales, las abejas pueden recoger material
contaminado de plantas como; acetil andromedol, andromedol, anidroandromedol,
desacetilpieristoxin B, Scopalamina, etc. Es conveniente resaltar que la posibilidad de
que una miel esté contaminada por este tipo de compuestos es bastante remota; ya
que estas sustancias son también tóxicas para las abejas, razón por la cual estos
insectos tratan de evitar la recolecta de polen y néctar de dichas plantas.
Las de origen foráneo, por otro lado, según aumenta el uso de químicos y
agroquímicos por el ser humano, éstos se integrarán de alguna forma u otra a los
productos que consumimos, no siendo la miel una excepción. (Lullman, C., 2007).
Los parámetros más importantes para evaluar la calidad de la miel, son la ausencia de
contaminantes (antibióticos, plaguicidas y metales pesados) y la frescura de la miel
(Valega, O., 2013). Se ha implementado un sistema de detección y cuantificación de
enzimas, como método para determinar la calidad de la miel (Izquierdo, M., 2006).
Los índices
más
utilizados
para
medir
la
frescura de dicho alimento son el
hidroximetilfurfural (HMF) y la actividad diastásica (Valega, O., 2013). La cantidad de
HMF aumenta según aumenta la temperatura, pH y el tiempo a la que esté la miel
expuesta a calentamiento o a almacenamiento prolongado. Cuanto más se calienta la
miel o aumenta el tiempo de exposición al calor, aumenta la calidad de HMF y las
enzimas se desnaturalizan, que debe dar como resultado una miel de calidad inferior
(http://www.beekeeping.com/articulos/calidad_miel).
La actividad diastásica es un excelente indicador de calidad de la miel, mientras mayor
contenido de esta enzima, mayor su calidad (Izquierdo, M., 2006). También se
considera la calidad de la miel como indicadora del cumplimiento de las condiciones de
crianza, cultivo y manejo de los productos de las colmenas. Los elementos objetivos de
la calidad de la miel de abejas pueden reducirse a dos fundamentales y válidos para
todos: genuinidad (miel no adulterada) e higiene (que no contenga sustancias
nocivas) (Valega, O., 2013).
6
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
1.2.
Abeja Apis Mellifera
Los antófilos, (Anthophila, gr. que ama las flores) conocidos comúnmente como
abejas, son un clado de insectos himenópteros, de la superfamilia Apoidea, clasificadas
por Carolus Linnaeu en 1758, con más de 30 razas (Danforth BN. y Col., 2006). La
especie mejor conocida por todos es la abeja melífera (Apis Mellifera L.), también
llamada abeja europea, doméstica o simplemente por abeja.
Las abejas son el único productor de miel natural, formada por tres castas: reina,
obreras y zánganos, los cuales contribuyen en la conservación de especies
amenazadas y en la diversidad biológica. Además de la polinización en su proceso
vital, también producen cera, jalea real, polen, propóleos y veneno, productos muy
estimados por el hombre, este último usado en apiterapia.
Diversas características etnológicas y morfológicas contribuyen para la idoneidad de
las abejas como bioindicadores:
a) Por su gran movilidad: permitiendo monitorear una vasta área.
El radio de vuelo de una abeja pecoreadora en la recolección de néctar es de
aproximadamente 2 km, aunque a veces puede llegar hasta 4-5 km (Ghini, S. y
Col., 2004; Villota, P. 1999).
b) Son numerosas: por lo que es posible colectar una cantidad de muestras
suficiente (Ghini, S. y Col., 2004), pudiendo transportar una carga de 40-70 mg,
que representa más del 40% de su peso (Villota, P. 1999).
c) Son altamente sensibles a la mayoría de productos químicos.
d) Alta eficiencia: inspeccionando el terreno dado que realizan numerosos viajes en
el día para reunir néctar, polen y agua a partir de las flores (Ghini, S. y Col.,
2004; Villota, P. 1999).
Realizan 13.5 viajes por día y permanecen fuera de la colmena hasta por 10 horas al
día; mientras que en un año desfavorable, solamente se mantiene fuera por un máximo
de 7.5 horas (Villota, P. 1999).
7
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
1.3.
Plaguicidas. Definición
Según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura,
mundialmente conocida como FAO por sus siglas en inglés (Food and Agriculture
Organization), y la Organización Mundial de la Salud (OMS) definen el término
plaguicida, denominado también por pesticida, a la sustancia o mezcla de sustancias
utilizada para prevenir, controlar o destruir cualquier plaga, incluyendo vectores de
enfermedad humana o animal, especies de plantas o animales indeseables, sustancias
destinadas a utilizarse como reguladores del crecimiento de las plantas, defoliantes o
desecantes, durante la producción, almacenaje, transporte, comercialización o
procesado de los alimentos para el hombre o los animales.
1.3.1. Clasificación de los Plaguicidas. Toxicidad
Dada la gran cantidad de familias químicas implicadas, la clasificación de los
plaguicidas resulta difícil. Un recurso útil es clasificarlos en función de las plagas sobre
las que se usan. Otra posibilidad es hacer una clasificación en relación con la familia
química, que suministra mayor información sobre su toxicidad. En general, se tiende a
hacer una clasificación mixta por ambos criterios (Ferrer, A., 2003).
a) Clasificación por plagas: insecticidas, fungicidas, molusquicidas, rodenticidas y
acaricidas.
b) Clasificación por su naturaleza: biológicos y químicos.
-
Plaguicidas biológicos: organismos vivos y compuestos de origen natural.

Son los seres vivos o sus productos que se han demostrado eficaces para
combatir los organismos nocivos.

Naturales: la mayoría son extractos de plantas de tipo alcaloide (estricnina,
nicotina) o no (piretrina, rotenona). En general, su uso ha disminuido frente a
los productos de síntesis.
8
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
-
Plaguicidas químicos: sintéticos.
Sintéticos: son los más utilizados en la actualidad y entre ellos hay que destacar una
serie de familias;

Compuestos inorgánicos y órgano-metálicos: incluye compuestos de casi todos
los metales. Especialmente importantes por su toxicidad son los derivados del
As, Ag, Ta, Pb, P, y Hg.

Compuestos organoclorados (O-C): los representantes de
sus grupos
fundamentales son DDT, HCH, aldrín y toxafén. Entre los derivados del benceno
y el fenol están el HCB, PCP y los ácidos 2,4-D y 3,4,5-T.

Compuestos organofosforados (O-P): es uno de los grupos más extensos y
utilizados. Entre ellos hay que mencionar el paratión, malatión, diclorvós,
mevinfos, diazinon y demetón.

Carbamatos: entre ellos se distinguen los inhibidores de la colinesterasa
utilizados como insecticidas como carbaryl y aldicarb y los que carecen de esa
acción y son utilizados como fungicidas y herbicidas.

Compuestos nitrofenólicos: constituyen un grupo de fenoles substituidos que son
los mononitrofenoles, dinitrofenoles y halofenoles.

Piretroides de síntesis: entre los que se distinguen los de función éster (aletrina,
resmetrina, bioaletrina) y el grupo de piretroides fotoestables de síntesis
posterior (permetrina, cipermetrina, decametrina, etc).

Derivados bipiridílicos: paraquat, diquat.

Derivados dicumarínicos (Ferrer, 2003).
c) Por su vida media de efectividad: se clasifican en permanentes, persistentes,
moderadamente persistentes y no persistentes (Ramírez, J. A., 2001; Lacasaña,
M., 2001).
d) La OMS y la Agencia para la Protección del Medio Ambiente, en inglés
Environmental Protection Agency (EPA) han clasificado a los plaguicidas según
su toxicidad, en cuatro categorías (ver tabla 1).
9
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Tabla 1. Clasificación de los plaguicidas según su toxicidad expresada en DL50 mg.kg−1.
Clase
Toxicidad
IA
Muy tóxico
IB
Moderadamente tóxico
II
Poco tóxico
III
Mínimamente tóxico
Fuentes: OMS/OPS, 1993; WHO, 2007.
Los valores de DL50 deben ser calculados respectando la vía de administración del
animal.
Se considera tóxica a una sustancia o materia, cuando debido a su cantidad,
concentración o características físico químicas o infecciosas presenta el potencial de:
a) Causar o contribuir de modo significativo al aumento de la mortalidad, al
aumento
de
enfermedades
graves
de
carácter
irreversible
o
a
las
incapacitaciones reversibles.
b) Que presente un riesgo para la salud humana o para el ambiente al ser tratados,
almacenados, transportados o eliminados de forma inadecuada.
c) Que presente un riesgo cuando un organismo vivo se expone o está en contacto
con la sustancia tóxica (Ramírez, J. A., 2001; Lacasaña, M., 2001).
1.3.2. Contaminación de la miel por plaguicidas
La
apicultura
y
la
agricultura
son
consideradas
prácticas
agropecuarias
complementarias, pues existe un beneficio mutuo. La contaminación de la miel por
plaguicidas, se produce por el simple hecho de tener colmenas cerca de los cultivos
(Vásquez, R., y col., 2006). Con afán de controlar plagas y enfermedades, el apicultor
usa productos químicos y agroquímicos dentro de las colmenas, que son recolectados
por las abejas, así de este modo se contamina la miel (http://desinsectador.com
2014/01/20).
10
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
La agricultura se ha tornado incompatible con las prácticas apícolas debido a la fuerte
dependencia que hoy se tiene de los plaguicidas, cuya función es la de prevenir,
destruir, repeler o mitigar bacterias, hongos, insectos o cualquier otro tipo de plaga que
amenace los cultivos (Arias, E.M., y col., 2008; Kolankaya, D., 2004).
Cada año, son aplicados en los cultivos agrícolas de todo el mundo alrededor de 2,5
millones de toneladas de plaguicidas, naturales o sintéticos, los cuales suelen ser
perjudiciales para las abejas. Esta situación ha generado un impacto negativo en la
mayoría de especies polinizadoras del mundo, debido a que se han encontrado
residuos de contaminantes en la miel, producidos en diferentes partes del mundo.
1.4.
Efectos
ambientales
de
los
plaguicidas,
su
clasificación.
Riesgo
toxicológico
Los efectos indeseables de los plaguicidas sobre el ambiente se pueden agrupar en
aquellos que ocurren: a corto plazo en el ambiente cercano, a largo plazo en el
ambiente cercano y a largo plazo en el ambiente lejano (Peña, C.E. y col., 2001). A
continuación se discuten brevemente.
Efectos adversos a corto plazo en el ambiente cercano
Los plaguicidas actúan a corto plazo sobre el ambiente cercano al lugar donde se
aplican. Esto causa por un lado, la contaminación inmediata del ambiente como;
suelos, aire, aguas superficiales y subterráneas. Por otro, causando la muerte de
diversos organismos sensibles a los que no se deseaba afectar, como los insectos y a
los que el hombre considera como benéficos. A corto plazo, los plaguicidas también
causan la muerte de los organismos susceptibles entre los que constituyen la plaga y
afectan momentáneamente el equilibrio fisiológico de todos los organismos expuestos a
ellos, incluyendo los seres humanos (Devine, G.J., 2008).
11
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Estos efectos sólo son leves en apariencia, pues aunque se trate de plaguicidas no
persistentes y cuyas aplicaciones no sea continua, el efecto sobre los organismos
susceptibles a ellos forzosamente tendrá repercusiones adversas a largo plazo. Esto se
debe a que causan desequilibrios ecológicos sucesivos que alteran los controles
naturales y favorecen el desarrollo de las plagas; además, en las plagas mismas se
facilita la reproducción de los individuos resistentes, los que eventualmente llegan a
predominar (Devine, G.J., 2008).
Estas pequeñas alteraciones ecológicas, sumadas tienen consecuencias muy graves,
ya que por lo común el agricultor o el responsable de las decisiones de salud pública,
tienden a responder al desarrollo de resistencia o al surgimiento de nuevas plagas, con
la aplicación de mayores dosis de plaguicidas; con aplicaciones más frecuentes o con
nuevos productos, ya sea solos o combinados con los que se usaron antes. Por lo
tanto, en el contexto integral, estos efectos aparentemente menores, son el origen de
graves problemas no sólo ecológicos, sino agronómicos, económicos y de salud
pública (Devine, G.J., 2008; Peña, C.E. y col., 2001).
Efectos adversos a largo plazo en el ambiente cercano
Cuando los plaguicidas son persistentes o permanentes y se utilizan con frecuencia, el
problema se complica, pues con cada aplicación además del daño inmediato, se
agregan al ambiente nuevos contaminantes, que requerirán años para degradarse. Así,
aunque el producto deje de usarse en un lugar determinado, por sus características de
persistencia o las de sus productos de transformación, isómeros o impurezas que
contaminan los suelos, los sedimentos y los mantos freáticos, los que permanecerán
así hasta que se tomen medidas drásticas, como el dragado integral de un río o el
cierre de todos los pozos de una región, lo cual no siempre es costeable o factible,
sobre todo para los países en desarrollo. Una de las más importantes por sus
repercusiones a largo plazo, es la exposición indirecta de la población a los plaguicidas,
por la ingestión continua de alimentos contaminados con residuos (Peña, C.E. y col.,
2001).
12
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Efectos adversos a largo plazo en el ambiente lejano
Paradójicamente, estos fueron los primeros efectos indeseables que se conocieron de
los plaguicidas, puesto que los primeros plaguicidas sintéticos, o sea los
organoclorados, son muy persistentes y de esto se deriva su capacidad para
movilizarse en el ambiente, llegar a sitios remotos al de su uso inicial y causar
alteraciones en organismos que no se intentaba afectar. Estos efectos requieren que el
plaguicida, o alguno de sus productos de transformación o de sus contaminantes, sean
persistentes (Devine, G.J., 2008; Peña, C.E. y col., 2001).
Entre ellos está la presencia de residuos de plaguicidas en los polos de la tierra, su
biomagnificación a través de las redes tróficas la extinción de especies y naturalmente,
su presencia en los alimentos, sobre todo de origen animal. En este grupo de efectos
también debe incluirse la presencia de residuos de plaguicidas en tejidos humanos y en
la leche materna. Todo lo anterior ha llevado a que se trate de sustituir el uso de
productos persistentes por el de no persistentes, a que el uso de plaguicidas
permanentes se haya descontinuado prácticamente en todo el mundo (Peña, C.E. y
col., 2001).
Todos estos riesgos deben ser evaluados antes de poder autorizar el uso de un
determinado plaguicida en un cultivo. Las contaminaciones de la miel, también se
producen por malas prácticas y por manipulaciones erróneas, encaminadas a
conseguir una mayor producción. (http://desinsectador.com 2014/01/20).
El término riesgo describe la probabilidad de que se produzcan efectos adversos o
daños por exposición a un agente, como consecuencia de las propiedades del mismo y
las circunstancias o grado de exposición (Repetto, M., 2009). El riesgo o posibilidad de
daño para la salud, depende del grado de toxicidad del producto y de lo expuesto que
se esté a él (Peña, C.E. y col., 2001; Montiel, L., 2004). El riesgo se puede caracterizar
por la combinación de la exposición al plaguicida, con la toxicidad del plaguicida
mediante la siguiente ecuación:
Riesgo = Toxicidad x Exposición (WHO, 2007). La toxicidad es una medida del peligro
inherente de la sustancia (Peña, C.E. y col., 2001).
13
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
1.5.
Límite Máximo de Residuos (LMR)
Se entiende por LMR a la cantidad máxima de residuos de plaguicidas oficialmente
aceptada en los alimentos, como resultado de la aplicación apropiada en una fase
específica, desde la producción hasta el consumo, expresado como miligramo (mg) de
ingrediente activo por Kilogramo (Kg) de alimento (mg.Kg-1).
En la UE, fue publicado el Reglamento 396/2005, que pretende la armonización a nivel
comunitario de los LMR aplicables en alimentos y piensos de origen vegetal y animal.
Un aspecto novedoso de este reglamento, es que se establece un LMR por defecto de
0,01 mg.Kg-1 para los productos que no contengan fijado un LMR específico. Otra
novedad es la inclusión de la miel y las infusiones, no contempladas anteriormente, en
la lista de productos y partes de productos que van a usarse como alimentos o piensos
(Reglamento UE, 2005).
El cálculo de los LMR, se basa en los niveles si efectos observables (NOEL por sus
siglas en inglés), que se determina a partir de estudios toxicológicos sobre animales de
experimentación. Se le suministra una misma sustancia en un determinado nivel de
concentración durante un periodo muy prolongado y se estima la concentración
máxima
administrada,
sin
que
se
presenten
efectos
observables
sobre
el
funcionamiento de sus actividades biológicas. Luego, para extrapolarlo al ser humano,
se aplican factores de seguridad sobre el NOEL y se obtiene el parámetro IDA (Ingesta
Diaria Admisible) (Romano, M.B.A., 2008).
1.5.1. Ingesta Diaria Admisible
Se define como la cantidad de residuos que pueden ser ingeridos diariamente, durante
largo tiempo sin riesgos apreciables para la salud. Esto es derivado del NOEL para los
parámetros más sensibles y en la especie más sensibles y apropiadas.
14
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
IDA (mg/día) =
NOEL (mg.kg−1. de peso corporal x peso humano estándar (Kg))
Factor de Seguridad (100 ó 1000)
El cálculo de la IDA, se hace a partir de experimentos nutritivos en animales y se
expresan en mg.kg−1 de peso corporal. Para los plaguicidas, el LMR también es un
criterio importante, para la asistencia en prevención de la salud pública y se establece a
partir de valores de la IDA (tabla 2 y 3).
Tabla 2. Ingesta diaria admisible (IDA) y Límites máximos de residuos (LMR).
Piretróides
IDA (mg.kg-1p.c)
LMR (mg.kg-1p.c)
0,05
0,05
0,05
0,01
0,02
0,01
0,01
0,01
0,05
0,02
0,01
0,02
0,03
0,05
Permetrina
Cipermetrina
Lambda-cialotrina
Fenpropatrina
Bifentrina
Deltametrina
Beta-cipermetrina
Fuente: UE, 2005.
Tabla 3. Límites máximos de residuos establecidos por la Unión Europea para
los plaguicidas empleados en el tratamiento de enfermedades apícolas.
Piretróides
Valores de DL50
Oral
Flumetrina
Tau-fluvalinato
Fuente: Rodríguez, 2011.
228
261-282
Dermal
˃150
˃2000
LMR en miel
(mg.kg−1) UE
E
0,01
e: no tiene LMR
Estos plaguicidas también pueden permanecer como residuos en la miel cuando se
aplican de forma inapropiada en la colmena (Rodríguez, 2011). La flumetrina, debido a
que su determinación analítica es desarrollada mediante otra técnica analítica y por
cromatografía liquida de alta resolución (sus siglas en inglés, HPLC), no se hace
referencia en este estudio.
15
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
1.6.
Los Piretroides. Clasificación y sus generalidades
Los piretroides, son análogos sintéticos de las piretrinas naturales, esteres tóxicos
aislados de las flores secas del crisantemo (Chrysanthemum cinerae foliun, conocidas
anteriormente como
Pyrethrum) (Santos, y Col., 2007; Romano M. B. A., 2008),
obtenidos fácilmente por extracción, con disolventes metanol, acetona, etc., (Romano
M. B. A., 2008). Ellos actúan sobre todo por contacto y se introdujeron en el mercado
en los años 70 seguido de un cambio estructural de las piretrinas, para modificar la
estructura química y obtener sustancias con mayor estabilidad y potencial insecticida
(persistentes), con la inclusión de átomos de nitrógeno, azufre y de halógenos,
manteniendo relativamente baja toxicidad aguda en mamíferos (Heudorf, U.; Angerer,
J., 2001; Soderlund, D. M. y col., 2002). Con amplio espectro de acción contra todo tipo
parásitos externos (moscas, garrapatas, pulgas, piojos, ácaros, mosquitos, etc en el
ganado y otras mascotas), se usando abundantemente para el control de plagas en la
agricultura, apicultura, en salud pública y higiene privada (Manuel, C., 2009).
En general son moléculas bastante estables en la atmósfera y a la exposición solar.
Pertenecen a estos grupos los insecticidas: aletrina, resmetrina y tetrametrin, usados
en el control de insectos, vectores de enfermedades humanas. La cipermetrina,
deltametrina, fenvarelante, permetrina, fenpropatrina, tralometrina, lamba- cihalotrina,
teflutrina, cuflutrina, flucinatrinato, tau-fluvalinato y bifenato, son usados para el control
de insectos en la agricultura. La flumetrina, kadetrina y telaletrina son empleados para
el control de insectos domésticos (Pimpão, C.T, 2012; Romano M. B. A., 2008; Santos
y Col., 2007).
En el medio ambiente, los piretroides, así como otros plaguicidas, se pueden usar
como un modelo para el estudio de ecotoxicidad, porque contaminan el aire, la tierra y
el agua, ocasionando efectos adversos que afectan desde una bacteria hasta el
hombre. Son comprobadamente muy tóxicos para las, abejas, peces y los artrópodos
acuáticos (Grisolia, C.K, 2005; Pimpão, C.T, 2012).
16
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Ellos son neurotóxicos, en general actúan sobre los ganglios basales del sistema
nervoso central (SNC) por medio de la prolongación de la permeabilidad al sodio (Na +),
(retardo en el cierre de la compuerta del Na +) durante la fase de recuperación del
potencial de acción de las neuronas, lo que produce aumento del flujo del Na +,
persistencia de la despolarización de la membrana con descargas repetidas. Algunos
de ellos también afectan la permeabilidad de la membrana al cloruro (Cl -), actuando
sobre los receptores tipo A del ácido gamma amino butírico (GABA). En ambos casos,
el cuadro clínico es similar (Santos y Col., 2007).
Los piretroides se clasifican en dos grupos:
a) Tipo I que carecen del grupo alfa-ciano: aletrina, permetrina, tetrametrina,
cismetrina y d-fenotrina.
b) Tipo II que presentan el grupo alfa-ciano: tau-fluvalinato, cipermetrina,
deltametrina, fenvalerato y fenpropatrin (Santos y Col., 2007).
En general, son compuestos lipofílicos, con tendencia a la bioacumulación. Se
absorben rápidamente por el tracto gastrointestinal después de la administración oral y
por el tracto respiratorio a través de inhalación de polvo o spray. Mientras su absorción
por vía dérmica (a través de la piel intacta) es relativamente baja.
Estos compuestos son biotransformados con gran rapidez por las esterasas y oxidasas
microsomales hepáticas mediante mecanismos de hidroxilación y conjugación con gran
eficacia para lograr productos inertes, con poca tendencia a acumularse en los tejidos.
Además son rápidamente degradados en el ambiente, pues aunque se absorben
masivamente por el suelo, se eliminan fácilmente con el agua (Ramírez, J. A. y
Lacasaña, M., 2001).
La degradación acelerada, combinada con una biodisponibilidad hasta cierto punto
pobre, explica en gran medida, que su toxicidad para los mamíferos sea relativamente
baja. La mayoría de los metabolitos de los piretroides son excretados con rapidez por
17
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
los riñones, esta eliminación es debido a la escisión éster eficiente proporcionando
aumento de metabolitos polares, que se oxidan y se conjugan antes de la excreción.
Esta rápida metabolización, junto con la pobre absorción, explica la baja toxicidad de
los piretroides en los humanos. En la administración oral de dosis diarias, los
piretroides alcanzan niveles estables en los tejidos internos en pocos días. Estos
niveles persisten durante todo el período de dosificación y disminuyen cuando la
exposición cesa (Soderlund, D. M. y col., 2002).
1.6.1. Efectos de los piretroides sobre la salud humana
Los efectos de la intoxicación por piretroides están relacionados a su estructura
química, en el hombre la exposición breve a niveles muy altos de estos compuestos en
el aire, los alimentos o el agua puede causar mareo, dolor de cabeza, náusea,
espasmos musculares, falta de energía, alteración de la conciencia, convulsiones y
pérdida del conocimiento. Los cambios de estado mental, pueden durar varios días
luego de que la exposición a altos niveles haya terminado.
Los piretroides del tipo I parecen actuar principalmente en los nervios periféricos
causando el síndrome del envenenamiento tipo I o “síndrome T”, caracterizada por
inducir en ratas temblores por todo cuerpo, comportamiento agresivo, aumento de la
sencillez a los estímulos externos, hiperexitabilidad, ataxia y convulsiones. En
mamíferos no roedores causan parálisis no progresiva.
Los de tipo II actúan preferencialmente en el sistema SNC induciendo a Síndrome de la
Coreoatetosis tipo II o „‟CS’’, cuyos síntomas de intoxicación en ratas son
hipersensibilidad, salivación abundante, agitación de las patas anteriores, movimientos
de escavar y temblores repetitivos, que pueden evolucionar a movimientos tónico
clónicos. En concentraciones relativamente altas los piretroides del tipo II actúan sobre
el complejo receptor inotrópico del GABA, o sea ellos se ligan a los receptores GABA
bloqueando los canales de cloruro (Cl-) y su activación (Santos y Col., 2007).
18
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
El diagnóstico de intoxicación es difícil, al no existir pruebas de laboratorio específicas
(Dorman DC., 2005; Vit, P., y Villota, P., 1999). Se basa en el antecedente de
exposición al tóxico, en los síntomas y signos compatibles, en la ausencia de otra
causa que los justifique y en la respuesta favorable al tratamiento sintomático en las
horas siguientes, una vez finalizada la exposición al insecticida (Evangelista, M., 2001).
Por otra parte, como no se dispone de un antídoto, el tratamiento es fundamentalmente
sintomático (Ayala, R. 1999; Bateman DN, 2000; Ghini, S. y col., 2004).
1.7.
Residuos de plaguicidas. Desarrollo del método para determinación de
residuos plaguicidas
Se entiende por residuo de plaguicida a la concentración de este, presente en o sobre
plantas, animales, suelo y agua en un momento dado, como consecuencia directa e
indirecta de la lucha química que se encamina a disminuir los daños de plagas,
enfermedades y malezas (Norma Cubana, 1984).
La determinación de residuos de plaguicidas trata de identificar y cuantificar
compuestos orgánicos sintéticos en su gran mayoría, en el orden de los microgramos y
en muchos casos por debajo de esa magnitud, presentes en sustratos complejos de los
cuales la proporción del plaguicida buscado esta, generalmente en las unidades de las
centésimas de miligramo por kilogramo o aún por debajo de esta concentración. Esto
presupone procesos de extracción, aislamiento y purificación delicados antes de poder
cuantificar el plaguicida por algún método sensible y preferiblemente selectivo (Norma
Cubana, 1984).
.
En el caso de la miel, al ser una matriz sumamente compleja, el análisis no se puede
realizar en una sola etapa, y es necesario efectuar varios pasos antes de llegar a la
identificación y cuantificación del analito. El procedimiento de análisis de residuos en
una determinada muestra, se puede dividir en varias etapas: conservación de la
muestra (limpieza, pesada y preparación); extracción de los analitos; purificación del
19
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
extracto;
determinación
(identificación
y
cuantificación
de
los
analitos)
y
confirmación.Todo análisis de residuos consta de varias etapas, las cuales varían en
dependencia de las características del problema en particular (Norma Cubana, 1984).
Aunque realmente no puede considerarse el muestreo como una etapa en cualquier
determinación analítica, es preciso siempre considerarlo relacionado estrechamente
con esta última por la importancia que tiene, ya que de la calidad de la toma de
muestras dependerá, en última instancia, la validez del resultado analítico obtenido.
La conservación de muestras requiere condiciones que garanticen tanto su integridad
como la constancia en la conservación de residuos. En efecto una muestra mal
conservada aporta un nivel mayor de impurezas e interferencias, que en ocasiones es
difícil de eliminar. Se recomienda que la miel sea almacenada entre los 11°C hasta los
21°C (52°F – 70°F). Sin embargo, hay que tener precaución de no exponer la miel a
temperaturas muy elevadas, pues tendríamos otros problemas más serios aún como, la
decoloración, cambios en sabor, aroma y aumentos en el HMF (Rodríguez, 2011).
En esta etapa del proceso analítico se pone en contacto lo más completamente posible
a la muestra con un solvente o un sistema de solventes, de modo que el plaguicida
presente en ella, pase a la fase extractora. Esta extracción debe ser completa,
exhaustiva, pero preferentemente selectiva, esto es, el extracto debe enriquecerse con
el plaguicida y dejar en el sustrato otros componentes de este, perjudiciales o
interferentes en las etapas subsiguientes del proceso analítico (Niell, S., 2012).
La concentración es una etapa del proceso analítico a la que no se le concede mucha
importancia, ya que es muy sencilla. Los procesos de concentración más usados son:
a) Evaporador-concentrador Kuderna-Danish.
b) Concentración con corriente de nitrógeno.
c) Evaporador rotatorio.
20
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
El evaporador rotatorio es el equipo indicado para concentrar extractos de contenido
alto de grasas, ceras y pigmentos. Este es quizás el equipo más usado en los
laboratorios de residuos, para concentrar tanto extractos crudos como purificados, ya
que en este equipo se origina una fina película de líquido sobre la superficie interna
rotante del balón que contiene el extracto y sobre esta actúa un vacío moderado,
además de que este balón se encuentra sumergido continuamente en un baño de agua
termostatizado. La posibilidad de pérdidas de residuos por evaporación es grande,
estas son mayores cuantos más puros sea el extracto. Nunca se debe llevar a
sequedad un extracto durante la concentración ya que origina grandes pérdidas de
residuos (Merck Index, 1992).
La etapa de purificación de los extractos se aprovecha, en ocasiones con mucho éxito,
para hacer más selectiva la determinación. Esta es una etapa obligada en todo
procedimiento analítico, aunque con frecuencia se propone en la literatura métodos en
los cuales no se incluye esta etapa (Horwitz, W., 1990).
El proceso de purificación debe estar de acuerdo con la naturaleza del sustrato y del
plaguicida, pero hay que tener en cuenta, además, la vía final de determinación de los
residuos. Así, mientras menos selectivo es esta última, más rigurosa será la
purificación del extracto para evitar confusiones con interferencias (Niell, S., 2012). Los
procesos de purificación utilizados más frecuentes son:
a) Partición líquido-líquido: Es quizás el procedimiento de purificación obligado,
constante en cualquier método analítico de residuos.
b) Purificación por cromatografía de columna: Es un recurso poderoso en análisis
de residuos. Ilustra que la purificación sirve a la vez para separar los plaguicidas
en grupos, lo cual facilita su identificación y cuantificación (Dierskmeier,G.,
2001).
La comprobación final del proceso de purificación requiere trabajar con extractos de
muestras-control contaminados con cantidades conocidas de los plaguicidas para los
21
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
cuales está prevista la técnica. Por lo general se escoge el tipo de muestra que
presente mayor complejidad (Dierskmeier, G., 2001 y Niell, S., 2012).
1.8.
Cuantificación por cromatografía gaseosa
Los extractos purificados se concentran por lo general antes de determinar
cualitativamente y cuantitativamente los plaguicidas presentes en ellos. Con este
método se mejora el límite de detección del método. La determinación se favorece en
la medida en que el método con que se trabaja sea capaz de resolver los distintos
componentes de un extracto dado, lo que permite su identificación y cuantificación. El
método es tanto mejor cuanto más selectiva haya sido la extracción y la purificación
previas al análisis. (Dierskmeier, G., 2001).
El desarrollo de la cromatografía gaseosa (CG) a principios de la década de los años
cincuenta del siglo XX constituyó la vía analítica valiosa que permitió un crecimiento
rápido del número y la calidad de los métodos de determinación de residuos. Por sus
características, el método gas cromatográfico supera a todos los demás en uso
actualmente (cromatográficos o no cromatográficos) con respecto a la sensibilidad de
detección en numerosos campos analíticos, especialmente en la determinación de
residuos. Es rápido, exacto y sus resultados son muy fáciles de interpretar. Es además,
un método muy versátil. Puede acoplarse a otros métodos, como espectrometría de
masa, resonancia magnética nuclear (RMN) o espectroscopía infrarroja, con lo cual se
obtiene una técnica poderosa de investigación. Por sus características, es fácil de
automatizar completamente (Dierskmeier, G., 2001, 2005; Santos y col., 2007; Manuel,
C.M.A., 2009).
La CG, es aun la técnica más usada en la determinación de residuos piretroides,
debido a su bajo costo y conveniencia. A pesar de la alta sensibilidad del método, la
CG requiere un gran volumen de muestra (3-15 mL) y un largo tiempo de preparación
de la muestra y de corrida cromatográfica (60-70 minutos). En CG, la columna más
utilizada para los análisis de piretroides es de 5%
de fenil-metilpolisiloxano
(Dierskmeier, G., 2001). Aunque no existan sistemas específicos de detección para
22
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
piretroides, aquellos que poseen átomos de halógenos en sus moléculas son sensibles
al detector selectivo por captura electrónica (Santos y col., 2007).
1.8.1 Detector de captura electrónica
Es el más sensible de todos los detectores utilizados en el análisis de residuos de
plaguicidas. Este detector se desarrolló para aprovechar la posibilidad de detección que
brindan los compuestos que tienen una afinidad fuerte por los electrones libres de
energía moderada. En la práctica, son numerosos los compuestos que presentan esta
propiedad, por lo que la detección y cuantificación por captura electrónica no es fácil si
se deja de observar ciertas orientaciones que facilitan el trabajo.
Es preciso trabajar con solventes de poca afinidad electrónica, preferentemente
hidrocarburos de peso molecular bajo, lineales o ramificados (Dierskmeier,G., 1990).
Para ello, se utilizó el cromatógrafo dotado de la columna que se usará en el análisis,
con las condiciones de temperatura y flujo de gas portador prescrito, pero con la
máxima sensibilidad con la que se pudiera trabajar en un momento dado.
1.9.
Procedimiento para la validación del método de ensayo de residuos de
plaguicidas
Se utilizó una guía elaborada y aprobada por UCTB – Química/ Instituto de
Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV) de Cuba, codigo PT-QM-LR-03,
13/09/2010. El objetivo de la validación es probar la aptitud de los métodos, así como la
capacidad del laboratorio, o sea, demostrar que los resultados producidos por un
procedimiento analítico son fiables, reproducibles, y que se ajusta al propósito para el
que fue desarrollado.
Es necesaria la validación de un método, cuando se introduce un procedimiento nuevo
en el análisis rutinario. Cuando un método validado sufre modificaciones, debe ser
nuevamente validado; esto se lleva a cabo:
23
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
a) Siempre que cambien las condiciones operativas o ambientales,
-
Revisión o cambio de un instrumento,
-
Cambio de las condiciones ambientales,
b) Cuando se cambie el ámbito original de aplicación,
c) Análisis de concentraciones fuera del rango original,
d) Cambios en la matriz de la muestra a analizar.
El nivel de validación requerido aumenta conforme a la magnitud de los cambios
realizados. Se consideran cambios menores, por ejemplo, la modificación del tamaño
de la muestra y sustitución de reactivos, y cambios mayores, por ejemplo, el cambio de
metodología o tecnología. Para demostrar que una versión modificada de un método
cumple las mismas especificaciones que el método original, se deben realizar
comparaciones utilizando réplicas.
El diseño experimental y el análisis de los resultados deben ser estadísticamente
válidos. No existen directrices oficiales que nos indiquen el orden en el que los
experimentos de
validación
deben
realizarse,
siendo las características del
procedimiento a validar las que van a condicionar la estrategia a seguir en cada caso.
Para validar un método de ensayo de residuos de plaguicidas, hay que evaluar una
serie de parámetros que relacionamos a continuación:
a) Linealidad: Es la capacidad de una técnica analítica para demostrar que los
resultados obtenidos son directamente proporcionales (o se convierten en
directamente proporcionales mediante una transformación matemática bien
definida) a la concentración del analito dentro de un rango dado.
b) Precisión: Es la dispersión de los resultados obtenidos en el análisis múltiple de
una misma muestra, la cual se mide normalmente mediante la Desviación
Estándar Relativa o Coeficiente de Variación (RSD). Esta puede tener
significados diferentes según la manera de realizar las réplicas: repetibildad y
reproducibilidad.
24
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
-
Repetibilidad: cuando el método se lleva a cabo en un laboratorio, por un
operador, con el mismo instrumento en un corto período de tiempo (1 día). Al
menos 5 réplicas de la determinación de una muestra.
-
Reproducibilidad: cuando el método se lleva a cabo bajo diferentes
condiciones (operador, instrumento, tiempo).
c) Exactitud: Indica la capacidad del método analítico para obtener resultados lo
más próximos posibles al valor verdadero.
d) Robustez: Corresponde a los estudios que indican el grado de confiabilidad del
ensayo ante cambios de variables comunes, estos cambios pueden ser ligeras
diferencias operativas, de equipos, fase móvil, flujo, de columnas, etc.
e) Selectividad: Capacidad del método de evaluar inequívocamente el analito en
presencia de componentes que pueden estar presentes en una misma muestra.
Típicamente éstos pueden incluir impurezas, productos de degradación, la
matriz, compuestos de estructura química similar, etc.
f) Especificidad: Capacidad del método analítico para producir una señal única
para el analito.
g) Límite de detección (LD): Es la menor cantidad o concentración de analito en
la matriz de una muestra que puede ser detectada con razonable certeza por un
procedimiento analítico dado, pero no necesariamente cuantificada bajo las
condiciones experimentales establecidas.
h) Límite de cuantificación (LC): Es la menor cantidad o concentración de analito
en la matriz de una muestra
que puede ser cuantificada con exactitud y
precisión aceptable bajo las condiciones experimentales establecidas.
i) Estimación de la incertidumbre: La incertidumbre de la medición es un
parámetro que describe de manera cuantitativa la variación que ocasiona el
analito presente en la muestra. La incertidumbre proporciona una idea de la
calidad del resultado ya que indica cuanto puede alejarse un resultado del valor
considerado verdadero. Por tanto los resultados siempre deben ir acompañados
de su incertidumbre.
25
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Se realizó un estudio analítico, donde se analiza la miel de abejas provenientes de
varias regiones de cuba en el año 2015. Con la finalidad de obtener un producto inocuo
de plaguicida piretroide y validar el método de ensayo a utilizar en los Laboratorio de
residuos y contaminación ambiental (LARCA) – Química,
El universo estuvo constituido por, 31 muestras de miel de abejas provenientes de
distintas regiones Cuba.
2.1.
Materiales y equipos
Para la realización del ensayo se empleó:
a) Balanza analítica con sensibilidad 0,0001 g Radwag.
b) Balanza técnica con sensibilidad 0,1 g Sartoius.
c) Evaporador rotatorio con baño de agua termostato Büchi modelo R-114 B-480.
La determinación y cuantificación de los residuos de plaguicidas se realizó en un
cromatógrafo gaseoso con detector de captura electrónica DANI GC MASTER
100705003.
2.2.
Estándares, reactivos y soluciones
A continuación se relacionan los estándares certificados de plaguicidas piretroides con
sus grados de pureza que fueron utilizados en este estudio:
a) Bifentrin 99.6% IPO
b) Lambda - cialotrina 98.7% Syngenta
c) Permetrina 98.3% Sigma-Aldrich
d) Ciflutrina 98% Dr.Ehrenstorfer
e) Cipermetrina 99% Dr.Ehrenstorfer
f) Tau-fluvalinato 91.6% M.Agan
g) Deltametrina 99.5% Dr.Ehrenstorfer
26
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Reactivos y solventes utilizados en la metodología analítica:
a) Diclorometano para análisis de residuos AppliChem
b) n-Hexano para análisis orgánico de trazas AppliChem
c) Cloruro de sodio p.a, AppliChem
d) Sulfato de sodio anhidro p.a. AppliChem
e) Agua Ultrapura
2.3.
Preparación de las soluciones de patrones analíticos y blanco
fortificado de miel de abejas
Se prepararon soluciones de los patrones analíticos a una concentración de 1000 µg
ml-1 en n-hexano o acetona. A partir de estas soluciones se prepararon las soluciones
de trabajo a las siguientes concentraciones: 0.025 µg ml-1, 0.05 µg ml-1, 0.2 µg ml-1 y 0.1
µg ml-1 en n-hexano.
El blanco de miel empleado para el desarrollo e implementación de la metodología fue
una muestra de miel de abejas de origen desconocida traída al LARCA, la cual fue
analizada por cromatografía gaseosa y se confirmó que no presentaba ninguna señal
interferente con los tiempos de retención de los analitos de interés.
Las muestras blancos de miel de abejas fueron fortificadas tomando 1 mL, de cada una
de las soluciones de trabajo y añadiéndolos a la porción de 10 g de miel de abejas. Se
deja en reposo durante 1 hora y a continuación se realiza el proceso analítico de la
muestra según se describe en el acápite 2.4.
27
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
2.4.
Método de ensayo para análisis de residuos de plaguicidas piretroides
en miel de abejas
-
Principio del método:
Para el análisis de residuos de plaguicidas piretroides se empleó el Método Alternativo
para Miel de Abejas (Mariño, C.R., 2009) empleado en el Laboratorio de Análisis de
Residuos de Plaguicidas y Contaminación Ambiental (LARCA) del Instituto de
Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV),Cuba.
Las muestras de miel de abejas se disuelven en agua y se mezclan con acetonitrilo
manualmente. Se filtra la mezcla, se partición a hacia n-hexano y se purifica por
partición líquido-líquido mediante la adición de agua, quedando los plaguicidas en la
fase orgánica. El solvente orgánico se concentra, el residuo se disuelve en n-hexano.
Finalmente se determinan los residuos por cromatografía gaseosa con detector de
captura electrónica.
Extracción
Se toman 10 g de una muestra de miel previamente homogeneizada, se añada 70 mL
de agua ultrapura y se disuelve por agitación manual. Adicione 130 mL de acetonitrilo y
homogeneíce manualmente durante 2 minutos. Pase todo el contenido del frasco a una
probeta graduada, deje en reposo por 10 minutos y filtre (de la fase superior) a través
de un papel de filtro, una alícuota que represente 2,5 g de muestra.
Aislamiento y purificación por partición líquido-líquido
Se pasa la alícuota a un embudo separador y se extrae con 100 mL de n-hexano. Se
adiciona al embudo separador 150 mL de agua ultrapura y 2 g de cloruro de sodio.
Agite, deje separar las fases y elimine la fase acuosa. Extraiga la fase orgánica con
28
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
otros 120 mL de agua y deseche la fase acuosa. Pase la fase orgánica a través de 10 g
de sulfato de sodio anhidro hacia un balón y concentre a casi sequedad (2 mL) en un
evaporador rotatorio con temperatura del baño de 40 ºC. Elimine los restos del solvente
utilizando una corriente de nitrógeno o de aire seco.
2.5.
Cuantificación y validación del método de ensayo
La cuantificación de los residuos de plaguicidas piretroides se realizó en un
cromatógrafo gaseoso DANI GC MASTER con detector de captura electrónica con las
siguientes condiciones cromatográficas:
CG
Condiciones
Tipo de inyección
Automático
Temperatura del inyector
250 ºC modo Splitless
Flujo gas portador (Nitrógeno)
Promedio velocidad lineal: 22 cm/segundos
Columna
Capilar de Sílice fundida de 30m x 0,25 mm d.i., 0,25
µm de espesor de película
Recubierta
DB-5
Temperatura del horno
Programada: Isoterma inicial 70ºC (1 min.), Rampa 1
de
calentamiento
10ºC/min.,
Isoterma
intermedia
150ºC (1 min.), Rampa 2 de calentamiento 5ºC/min.,
Isoterma final 315ºC (25 min.)
Detector
Captura electrónica
Temperatura del detector
300 ºC
Corriente detector
0,5 nA
Flujo gas de purga
37 mL/minuto
(Nitrógeno)
Para la evaluación de los cromatogramas se utilizó el software Clarity 5.02.612.
29
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
La validación del método de ensayo se realizó según la guía elaborada y aprobada por
UCTB – Química/ Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV) de Cuba,
codigo PT-QM-LR-03, 13/09/2010.
Para la validación del método de ensayo se trabajó con muestras blanco de miel, las
cuales fueron fortificadas según los parámetros evaluados que se describen a
continuación.
Linealidad del método
Para la linealidad se prepararon mezclas de los patrones analitos estudiados en 4
niveles de concentración; 0.01 µg ml-1, 0.025 µg ml-1, 0,1 µg ml-1, 0,5 µg ml-1. Se
construyó el grafico de concentración del patrón analítico Vs respuesta cromatográfica.
Se determinó el coeficiente de correlación (R2) y la curva de regresión y= mx+n.
Se estableció el rango lineal y se seleccionó el nivel de concentración de trabajo.
Para que el método sea lineal el coeficiente de correlación debe ser R2 ≥ 0.990.
Precisión del método
Para evaluar la precisión del método se analizó la repetibilidad y la reproducibilidad.
Para el mismo se analizaron 5 muestras blanco fortificadas con una mezcla de
piretroides al nivel de concentración 0,01 mg.kg−1 que es equivalente a 0,025 µg
añadidos.
Para la repetibilidad se analizaron las 5 muestras en un mismo día y la reproducibilidad
las 5 muestras en 3 días diferentes. Se calculó para cada muestra la concentración y
se determinó el porciento de recuperación, el promedio ( ), la desviación estándar (S) y
el porciento de desviación estándar relativa (%RSD), usando las siguientes
expresiones:
30
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Dónde: n – número de análisis
Xi: valor hallado
(Media de los resultados) se calcula
% Desviación estándar relativa: % RSD
Para que el método sea preciso el porciento de recuperación debe estar entre 70-120 y
el %RSD debe ser para la repetibilidad menor que 22 y para la reproducibilidad menor
que 34 (ver en anexo 8, tabla para criterios de aprobación para métodos internos de
laboratorio para análisis de residuos plaguicidas y drogas veterinarias).
Exactitud del método
Este parámetro debe ser evaluado por el examen de un número de muestras blanco
fortificado. Se evaluó a los niveles de concentración 0,005 mg.kg−1, 0,01 mg.kg−1, y
0,02 mg.kg−1, donde se analizaran 3 muestras fortificadas por cada nivel. Se determinó
para cada muestra la concentración y el porciento de recuperación así como el
promedio ( ), la desviación estándar (S) y la desviación estándar relativa (RSD) para
cada nivel de fortificación.
-
. Fueron calculados el % de recobrado que debe estar entre 70-120, así
como la desviación estándar relativa y el porciento de desviación estándar
relativa que debe ser menor que 22 (ver anexo 8).
-
Se aplicó una prueba F (ver anexo 10), de la desviación estándar relativa
(RSD,s) de estos resultados y los obtenidos en la estimación de repetibilidad
para establecer que los resultados del recobrado no muestran diferencias
significativas de RSD para la estimación de la precisión.
.
% Recuperación =
x100
31
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Prueba F: F=
Dónde: RSD – desviación estándar relativa de la repetibilidad.
RSDs – desviación estándar relativa de la exactitud.
Robustez del método
Para la robustez se realizó la variación de cambio de programa de temperatura al nivel
de concentración de 0,01 mg.kg−1. Se realizó 5 inyecciones con este parámetro
variado, se determinó el porcentaje de recobrado, se calculó la media, la desviación
estándar y la desviación estándar relativa, comparándola mediante una prueba F (ver
anexo 10) con la desviación estándar relativa obtenida para la misma muestra blanco
fortificada sin cambiar el parámetro.
Prueba F: F=
Dónde: RSD – desviación estándar relativa sin cambios de temperatura.
RSDs – desviación estándar relativa con cambio de temperatura.
Selectividad y especificidad del método
Para evaluar este parámetro se preparó una muestra blanco, una muestra blanco
fortificado al nivel de 0,05 µg de una mezcla de patrones de piretroides (estructura
química similar) y se procedió de la siguiente manera.
-
Se inyecto en el cromatógrafo la solución de patrones de 0,025 µg ml-1. Se
determinó tiempo de retención.
-
Se inyecto en el cromatógrafo el blanco muestra, y se comprobó que no hay
señales detectables a los tiempos de retención de los piretroides, es decir, la
muestra no aporta interferencias.
-
Se inyecto en el cromatógrafo la muestra blanco fortificada y se determinó el
tiempo de retención y la resolución entre las señales adyacentes.
32
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Límite de detección (LD)
El LD debe ser la mínima concentración que se distingue el blanco.
Se inyectó en el cromatógrafo el extracto de blanco muestra (3 veces), se determinó el
ruido en el tiempo de retención correspondiente a los analitos tomando el área
promedio de cada inyección.
Para el cálculo del LD se multiplicó el promedio de ruido por 3. Con ese valor (del área)
se calculó la concentración aproximada teniendo en cuenta el porciento de
recuperación para cada analito. Se tuve en cuenta el porcentaje de recobrado para el
cálculo de la concentración al analito.
Se fortificó la muestra blanco con el analito en cuestión a la concentración de 0,002
mg.kg−1. Se inyectó al cromatógrafo y se determinó que las concentraciones al LD se
pueden distinguir del blanco.
Límite de cuantificación (LC)
El LC debe es la mínima concentración que se determina con una precisión y exactitud
calculada experimentalmente. Los datos cuantitativos se basan en el LC qué es tres
veces el LD.
Se fortificó 5 muestras blanco a una concentración (calculada como) LC, y se calculó
su precisión y exactitud, expresando en % RSD y el porciento de recuperación.
Estimación de la incertidumbre del método
Se determinó el intervalo de incertidumbre de la medición, basado en la desviación
estándar de reproducibilidad interna (S). Se Procesó 6 veces la muestra y se determinó
su concentración en mg.kg−1.
Se calculó el , RSD y la incertidumbre del método (U).
33
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
U= K x RSD x C
El valor del factor de cobertura recomendado es k = 2.
Donde: K= Factor de cobertura
C= concentración del analito
La incertidumbre de la medición expandida, U, calculada representa la mitad del
intervalo de incertidumbre de la medición. Usualmente, para expresar el intervalo
completo de incertidumbre de la medición se utiliza el formato siguiente: “resultado de
la medición ± U”.
Cuantificación del contenido de residuos de plaguicidas piretroides en muestras
de miel.
Con el método validado se analizaron 31 muestras de miel recibidas en el laboratorio
proveniente de distintas regiones de Cuba.
34
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1.
Validación del método analítico
En la validación del método de ensayo se obtuvieron los siguientes resultados, para los
parámetros en análisis:
Linealidad
Para la linealidad se prepararon mezclas de analitos en 4 niveles de concentración. Se
construyó el grafico concentración del patrón vs respuesta y se determinó el coeficiente
de correlación R2 (Tabla 4; Figura 1).
Tabla 4. Resultados obtenidos para la linealidad del método de ensayo
Conc.
Respuesta (A)
(µg/mL)
BFT
L-CL
PTR
CFT
0,01
80,116
152,94
17,378
106,7054
0,025
153,466
275,574
38,249
0,1
398,108
684,057 129,461
0,5
1061,576 1572,123
CTR
T-FV
DTR
87,080
89,428
62,188
271,904 168,9324 164,102
115,366
640,303
282,259
470,416 489,284
623,47 2073.,821 2153,193 1345,62 1157,0985
Bifentrin: BFT; Lamba-cihalotrina: L-CL; Permetrina: PTR; Ciflutrina: CFT; Cipermetrina: CTR;
Tau-flavulinato: T-FV; Deltametrina: DTR.
En la figura 1, se observa que el valor del coeficiente de correlación obtenido para cada
plaguicida. En todos los casos el valor obtenido es mayor que el valor mínimo requerido
de R2 = 0,990.
En los casos del bifentrin, lambda-cihalotrina y tau-fluvalinato se elimino el punto de
concentración 0,5 µg mL-1 ya que en estos casos se no cumplían con el parámetro de
linealidad. Por lo que se establecen los siguientes rangos lineales:

0,01– 0,1 µg ml-1, para Bifenrtin, Lambda Cihalotrina y Tau-Fluvalinato

0,01– 0,5 µg ml-1, Para Permetrina, Cilfutrina, Cipermetrina, y Deltametrina.
35
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Área
(mV.s)
Conc (µg ml-1)
Figura 1. Curva de calibración para cada compuesto y el valor R 2 para cada uno.
Los rangos lineales obtenidos son satisfactorios porque en el mismo se encuentra la
concentración equivalente al LMR 0,025 µg mL -1, la cual se tomo como nivel de
concentración de trabajo.
Precisión
-
Repetibilidad
Los resultados obtenidos para la repetibilidad se muestran en la tabla numero 5.
36
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Tabla 5. Resultados obtenidos para la repetibilidad.
Concentración 0,025 (µg)
BFT
L-CL
PTR
CFT
CTR
T-FV
DTR
1
2
0.0315
0.0320
0.0210
0.0270
0.0190
0.0300
0.0190
0.0260
0.0260
0.0280
0.0240
0.0230
0.0230
0.0230
3
0.0200
0.0180
0.0180
0.0180
0.0260
0.0200
0.0180
4
0.0249
0.0180
0.0250
0.0230
0.0270
0.0200
0.0190
5
0.0260
0.0240
0.0270
0.0260
0.0250
0.0250
0.0270
Promedio
0.02688
0.0216
0.0238
0.0224
0.0264
0.0224
0.0220
S
0.00498
0.00391
0.00516
0.00378
0.00114
0.00230
0.00360
RSD
0.1856
0.1810
0.2171
0.1688
0.0431
0.1027
0.1638
%RSD
18.56
18.10
21.71
16.88
4.31
10.27
16.38
%Recup.
107.52
86.40
95.20
89.60
105.60
89.60
88.00
Muestra
Bifentrin: BFT; Lamba-cihalotrina: L-CL; Permetrina: PTR; Ciflutrina: CFT; Cipermetrina: CTR;
Tau-flavulinato: T-FV; Deltametrina: DTR.
El porciento de recuperación para los analitos estudiados estuvo en el rango 70-120. El
porciento de desviación estándar relativa obtenida en todos los casos fue menor que
22.
-
Reproducibilidad
Los resultados obtenidos para la reproducibilidad se muestran en la tabla numero 6.
37
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Tabla 6. Resultados obtenidos para la reproducibilidad.
Concentración 0,025 (µg)
Muestra/Día
BFT
L-CL
PTR
CFT
CTR
T-FV
DTR
1 / Día 1
0.02
0.018
0.018
0.018
0.026
0.02
0.018
2 / Día 1
0.0249
0.018
0.025
0.023
0.027
0.02
0.019
3 / Día 2
0.019
0.022
0.018
0.02
0.024
0.021
0.027
4 / Día 2
0.022
0.024
0.019
0.023
0.024
0.018
0.028
5 / Día 3
0.024
0.025
0.023
0.021
0.026
0.024
0.023
Promedio
0.022
0.0214
0.0206
0.021
0.0254
0.0206
0.023
S
0.00252
0.00328
0.00320
0.00212
0.00134
0.00219
0.00452
%RSD
11.46
15.35
15.57
10.10
5.28
10.63
19.68
% Recup.
88.0
85.6
82.4
84.0
101.6
82.4
92.0
Bifentrin: BFT; Lamba-cihalotrina: L-CL; Permetrina: PTR; Ciflutrina: CFT; Cipermetrina: CTR;
Tau-flavulinato: T-FV; Deltametrina: DTR.
El porciento de recuperación para los analitos estudiados estuvo en el rango 70-120. El
porciento de desviación estándar relativa obtenida en todos los casos fue menor que
34.
Para la repetibilidad y la reproducibilidad los resultados obtenidos cumplen con los
valores admitidos por lo que podemos decir que el método es preciso.
Exactitud
En la tabla 7 se muestran los resultados obtenidos para la evaluación de la exactitud a
los 3 niveles de concentración:
- 0,005 mg.kg−1= 0,0125 µg añadidos
- 0,01 mg.kg−1 = 0,0250 µg añadidos
- 0,02 mg.kg−1 = 0,0500 µg añadidos
38
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Tabla 7. Resultados obtenidos en la evaluación de la exactitud.
Niveles de Conc.
(µg)
0,0125
0,0250
0,0500
BFT
L-CL
PTR
CFT
CTR
T-FV
DTR
Promedio
0,0101
0,0128
0,0114
0,0115
0,0127
0,0113
0.0124
RSD
0,0634
0,0852
0,0702
0,1452
0,1188
0,1391
0,0313
%RSD
6,34
8,52
7,02
14,52
11,88
13,91
3,13
%Recup.
81,06
102,93
91,46
92,00
102,33
90,4
98,90
Promedio
0,0274
0,021
0,0236
0,0226
0,0273
0,023
0,023
RSD
0,1287
0,1428
0,1759
0,1549
0,0558
0,1150
0,1739
%RSD
12,87
14,28
17,59
15,49
5,58
11,50
17,39
%Recup.
109,8
84,0
94,6
90,6
109,3
92,0
92,00
Promedio
0,045
0,050
0,045
0,045
0,046
0,051
0,050
RSD
0,0555
0,0980
0,0588
0,0466
0,0217
0,0392
0,1240
%RSD
5,55
9,80
5,88
4,66
2,17
3,92
12,4
%Recup.
90,6
100,0
90,0
90,0
92,0
102,0
100,0
Bifentrin: BFT; Lamba-cihalotrina: L-CL; Permetrina: PTR; Ciflutrina: CFT; Cipermetrina: CTR;
Tau-flavulinato: T-FV; Deltametrina: DTR.
Para los tres niveles de concentración los valores obtenidos para el porciento de
recuperación, así como para el porciento de la desviación estándar relativa están dentro
del rango de valores aceptados. En la Tabla 8, se muestran los resultados obtenidos en la
prueba F.
Tabla 8. Resultados obtenidos para la prueba F de la exactitud.
Niveles
BFT
L-CL
PTR
CFT
CTR
T-FV
Conc.(µg)
DTR
0.0125
8,56
4,51
9,58
1,35
0,13
0,54
1,93
0.0250
0,27
0,23
0,27
0,18
0,05
0,09
0,15
0.0500
11,18
3,41
13,63
13,12
3,95
6,87
1,72
Bifentrin: BFT; Lamba-cihalotrina: L-CL; Permetrina: PTR; Ciflutrina: CFT; Cipermetrina: CTR;
Tau-flavulinato: T-FV; Deltametrina: DTR.
39
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Para el grado de probabilidad P=0,05 y 4 grados de libertad para el numerador y 2
grados de libertad para el denominador F tabulada es: Ftab= 19.247.
En todos los casos Fexp<Ftab por lo que podemos decir que no hay diferencias
significativas entre las RSD de la repetibilidad y la exactitud, por lo que el método es
exacto.
Robustez
Para la robustez se realizó una variación en la programación de la temperatura.
Robustez 1: No se cambian parámetros.
Temperatura del horno
Programada: Isoterma inicial 70ºC (1 min.), Rampa 1
de calentamiento 10ºC/min., Isoterma intermedia
150ºC (1 min.), Rampa 2 de calentamiento 5ºC/min.,
Isoterma final 315ºC (25 min.)
Robustez 2: Se cambia el programa de temperatura.
Temperatura del horno
Programada: Isoterma inicial 200ºC (1 min.), Rampa
de calentamiento 5ºC/min., Isoterma final 315ºC
(6min.)
Tabla 9. Robustez 1. Sin cambios de los parámetros.
Robustez 1
BFT
L-CL
PTR
CFT
CTR
T-FV
Promedio
señal
58.344
135.645
14.2064
92.915
141.766
S
10.935
22.317
1.712
13.507
29.715
13.136
10.019
RSD
0.187
0.164
0.121
0.145
0.209
0.187
0.198
%RSD
18.7
16.4
12.1
14.5
20.9
18.7
19.8
µg
0.0275
0.023
0.0225
0.0217
0.0233
0.0244
0.0222
% Recup
110.0
92.0
90.0
86.8
93.2
97.6
88.8
70.1544
DTR
50.6968
Bifentrin: BFT; Lamba-cihalotrina: L-CL; Permetrina: PTR; Ciflutrina: CFT; Cipermetrina: CTR;
Tau-flavulinato: T-FV; Deltametrina: DTR.
40
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Tabla 10. Robustez 2. Se cambia el programa de temperatura.
Robustez 2
BFT
L-CL
PTR
CFT
CTR
T-FV
DTR
Promedio
señal
84.7746
89.91
2.7978
88.4072
57.5434
40.7468
19.3892
S
9.277
16.201
0.560
16.117
7.715
4.688
2.471
RSD
0.109
0.180
0.200
0.182
0.134
0.115
0.127
%RSD
10.9
18.0
20.0
18.2
13.4
11.5
12.7
µg
0.0253
0.0210
0.0223
0.0220
0.0280
0.0250
0.0229
% Recup
101.2
84.0
89.2
88.0
112.0
100.0
91.6
Bifentrin: BFT; Lamba-cihalotrina: L-CL; Permetrina: PTR; Ciflutrina: CFT; Cipermetrina: CTR;
Tau-flavulinato: T-FV; Deltametrina: DTR.
Tabla 11. Cálculos obtenidos con la prueba F.
F
BFT
L-CL
PTR
CFT
CTR
T-FV
DTR
0,34
1,19
2,75
1,57
0,41
0,38
0,42
Bifentrin: BFT; Lamba-cihalotrina: L-CL; Permetrina: PTR; Ciflutrina: CFT; Cipermetrina: CTR;
Tau-flavulinato: T-FV; Deltametrina: DTR.
Para el grado de probabilidad P=0,05 y 4 grados de libertad para el numerador y el
denominador F tabulada es Ftab= 6.388 Fexp < Ftab.
Para cada plaguicida la F determinada es menor que la F tabulada, por lo que podemos
decir que el método es confiable ante el cambio de programación de temperatura.
Selectividad y especificidad
La muestra blanco no presenta interferencias con los patrones y la resolución con las
señales adyacentes para todos los casos.
41
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Figura 2. Cromatograma patrón.
Figura 3. Cromatograma para comparar el patrón con la muestra blanco.
42
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Figura 4. Cromatograma blanco fortificado con resolución.
Tabla 12. Cálculos obtenidos del blanco fortificado con resolución.
La resolución con las señales adyacentes es mayor que 1 en todos los casos.
Pudiéndose afirmar que el método es selectivo y específico.
43
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Límite de detección
Se contaminó la matriz al nivel de contaminación de 0,002 mg.kg −1 y se inyectó en el
cromatógrafo y esta concentración se puede distinguir de la muestra blanco.
Tabla 13. Cálculos obtenidos de la concentración de 0.002 mg.kg −1
Bifenrtin
Lambda
Cihalotrina
Permetrina
Ciflutrina
Cipermetrina
TauFluvalinato
Deltametrina
5,0
5.0
5,0
20,0
20,0
10,0
5,0
0,0004
0,0003
0,0017
0,0011
0,0010
0,0007
0,0005
3 veces
ruido
Límite de
Detección
−1
(mg.kg )
Figura 5. Cromatograma a la concentración 0.002 mg.kg−1
Límite de cuantificación
El límite de cuantificación es tres veces el límite de detección y se muestra en la
siguiente tabla.
44
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Tabla 14. Valor mínimo del LC, de los analitos validados.
Límite de Cuantificación (mg.kg−1)
Bifentrin
Lambda
Cihalotrina Permetrina Ciflutrina Cipermetrina
0,0012
0,0009
0,0051
0,0033
TauFluvalinato
0,0030
0,0021
Deltametrina
0,0015
Se realizó el contaminado con el nivel de cuantificación 0.005 mg.kg −1 los resultado se
muestran en la siguiente tabla.
Tabla 15. Cálculos obtenidos de la cuantificación a 0.005 mg.kg−1
Muestras
Concentración (µg)
BFT
L-CL
PTR
CFT
CTR
T-FV
DTR
1
0,0094
0,0120
0,0106
0,0100
0,0144
0,0095
0,0112
2
0,0106
0,0125
0,0122
0,0133
0,0125
0,0120
0,0119
3
0,0104
0,0141
0,0115
0,0112
0,0114
0,0124
0,0140
Promedio
0,0101
0,0128
0,0114
0,0115
0,0127
0,0113
0,0124
S
0,00064
0,00109
0,00080
0,00167
0.00151
0,00157
0,00145
% RSD
6,34
8,52
7,02
14,52
11,88
13,91
3,13
% Recup.
81,06
102,93
91,46
92,00
102,33
90,4
98,90
Bifentrin: BFT; Lamba-cihalotrina: L-CL; Permetrina: PTR; Ciflutrina: CFT; Cipermetrina: CTR;
Tau-flavulinato: T-FV; Deltametrina: DTR.
Podemos decir que con los resultados obtenidos de RSD y % de recuperación el límite
de cuantificación del método analítico es de 0.005 mg.kg −1.
45
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
El valor obtenido es satisfactorio ya que es menor que el LMR establecido para cada
plaguicida.
Estimación de la Incertidumbre
El Intervalo de la incertidumbre del método de ensayo se determinó basado en la
desviación estándar de reproducibilidad interna (S).
Tabla 16. Cálculo de medición de la incertidumbre
−1
Concentración (mg.kg )
Muestras
BFT
L-CL
PTR
CFT
CTR
T-FV
DTR
1
0,0099
0,0072
0,010
0,0092
0,0108
0,0080
0,0076
2
0,0104
0,0096
0,0108
0,0104
0,010
0,010
0,0108
3
0,0126
0,0084
0,0076
0,0076
0,0104
0,0096
0,0092
4
0,0088
0,0096
0,0076
0,0092
0,0096
0,0072
0,0112
5
0,0096
0,01
0,0092
0,0084
0,0104
0,0096
0,0092
6
0,0076
0,0088
0,0072
0,0080
0,0096
0,0084
0,0108
Promedio
0,0098
0,0089
0,0087
0,0088
0,0101
0,0088
0,0098
S
0,0017
0,0010
0,0015
0,0010
0,0005
0,0011
0,0014
RSD
0,171
0,116
0,170
0,114
0,047
0,125
0,141
U
0,003
0,002
0,003
0,002
0,001
0,002
0,003
Expresión
resultado
0,0098±0,003
0,0089±0,002
0,0087±0,003
0,0088±0,002
0,010±0,001
0,0088±0,002
0,0098±0,003
Bifentrin: BFT; Lamba-cihalotrina: L-CL; Permetrina: PTR; Ciflutrina: CFT; Cipermetrina: CTR;
Tau-flavulinato: T-FV; Deltametrina: DTR.
46
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
3.2.
Cuantificación de los residuos de plaguicidas piretroides en muestras
de miel de abeja.
El análisis químico-toxicológico engloba por definición, al conjunto de procedimientos
realizados con el fin de poner de manifiesto en una muestra la presencia de un
xenobiótico, que en nuestra investigación es un plaguicida. Una vez identificada la
sustancia presente en la muestra, habrá también que cuantificar la concentración en la
que está presente.
El análisis de residuos de plaguicidas se realizó siguiendo la metodología que se validó
en este estudio. La identificación de los plaguicidas presentes en las muestras de miel,
se realizó a través de la comparación de los tiempos de retención de las señales
cromatográficas, encontradas para los posibles plaguicidas en las muestras y la de los
estándares de los plaguicidas, inyectados conjuntamente.
Con las condiciones cromatográficas se logró una buena separación entre los
diferentes plaguicidas que conformaron cada una de las muestras. La Tabla 17,
muestra los tiempos de retención obtenidos para cada compuesto.
Tabla 17. Tiempo de retención para los plaguicidas en estudio.
Compuesto
Tiempos de retención
[min]
Cipermetrina
37,710
Tau-fluvalinato
39,910
Deltametrina
40,687
Esta observación se puede apreciar en la comparación de los cromatogramas de la
muestra con el del patrón figuras (6 y 7) ilustradas a continuación.
47
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Figura 6. Cromatograma de muestras de miel con residuos plaguicidas piretroides taufluvalinato (39.9 min) y deltametrina (40.6 min) comparada con el patrón.
Figura 7. Cromatograma de muestras de miel con residuos de plaguicidas piretroides
de cipermetrina y tau-fluvalinato. Comparada con patrón.
Los plaguicidas más frecuentemente hallados en las muestras de miel, han sido el
insecticida/acaricida tau-fluvalinato (detectado en 22 de las 31 muestras), seguido de la
48
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
deltametrina y cipermetrina, insecticidas de uso en la agricultura, (detectado en 3 de las
31 muestras).
Los piretroides cuantificados en las muestras de estudio son del tipo II, presentando en
su estructura química los isómeros cis.
Según Santos y col., (2007), la actividad biológica de los piretroides es dependiente de
su estructura química y la configuración estérica. La toxicidad de la mezcla varía con la
relación a los isómeros cis/trans y las características del vehículo utilizado, los cis
demostraron mayor toxicidad relativa a los trans y la carga no polar aumenta la
toxicidad de ambos isómeros. Siendo también corroborado por Repetto, 2010 cuando
verificó la importancia de conocer la composición de los productos que se vendan como
mezcla ya que la toxicidad sobre mamíferos se atribuye al isómero cis.
Los compuestos que presentan en su estructura química el grupo alfa-ciano, son
clasificados
como
plaguicidas
piretroides del
tipo
II.
Son
los
que
actúan
preferentemente sobre el SNC, en concentraciones relativamente altas, actúan sobre el
complejo receptor inotrópico del GABA, o sea, se liga a los receptores del GABA
bloqueando los canales de Cl - y su activación. El GABA es el principal neurotransmisor
inhibitorio del SNC de los vertebrados y la ausencia de la inhibición sináptica lleva a
una hiperexcitabilidad del SNC (Santos y col., 2007).
Fuera de los efectos neurológicos, frecuentemente son detectadas manifestaciones
cardiovasculares tales como, el prolongamiento de intervalo Q-T y arritmias cardiacas
del tipo Torsade de pointes (TdP).
Alteraciones histopatológicas también son atribuidas a los piretroides. Según
Latuszynska y col., verificaron leves alteraciones histopatológicas en el cerebro de
ratas después de tres semanas de aplicación dérmica de la cipermetrina.
El potencial mutagénico de cada piretroide depende de su estructura molecular,
intensidad de la exposición y la velocidad de la degradación. Cuanto a la
49
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
carcinogenicidad, hay pocas referencias en la literatura, para que se pueda llegar a una
conclusión sobre la acción de los piretroides. Shukla y col., verificaron que la
deltametrina no demostró ser un promotor, pero si un iniciador de neoplasias en ratas,
pero advierten la ausencia de estudios a largo plazo.
Los efectos teratogénicos fueron verificados en ratas gestantes, tratadas con diferentes
dosis (1; 2.5 y 5 mg.kg-1p.c) de deltametrina. Se observó una mayor incidencia de
muertes embrionarias precoces, en los animales tratados con el plaguicida en relación
al grupo control. La deltametrina causó en los fetos retraso en el crecimiento, hipoplasia
de los pulmones, dilatación de la pelvis renal y aumento del peso de la placenta (Abdelkhalik, M. N., y col., 1993).
No hay ninguna evidencia de que los piretroides afecten la capacidad de reproducción
en los seres humanos expuestos. La susceptibilidad de un organismo a los agentes
químicos puede variar según la edad. Es probable que los efectos observados en niños
expuestos a altos niveles de piretroides sean similares a los observados en adultos. En
la literatura hay poca información relativa a los efectos de los piretroides en niños, en
los que parece existir mayor susceptibilidad a estas sustancias, debido a la capacidad
metabólica limitada, propia de la edad (Sheets LP., 2000; Reigart JR y Roberts JR.,
2001). La inmadurez de los sistemas de biotransformación hepática, en particular en
neonatos y lactantes, les hace especialmente vulnerables al contacto con los
piretroides y sus derivados, presentando con más frecuencia signos y síntomas de
toxicidad sistémica que los adultos. Asimismo, los trastornos sobre el sistema
hematopoyético,
observados
a
largo
plazo,
son
más
habituales
en
niños
(Muller.Mohnssen H y Hahn K., 1995).
Los compuestos que se encuentran en mayor por ciento, en las muestras de miel que
fueron analizadas, nos indican que ellos, están más expuestos en el ambiente. La
toxicidad de estos compuestos, va a depender de su estructura química (ver figuras 8,
9 y 10).
50
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Figura 8. Tau-fluvalinato: N-[2-cloro 4-(trifluorometil)fenil]-DL-valinato de (RS)-α-ciano(3-fenoxifenil)metilo – 1 isómero.
Figura 9. Deltametrina: (S) -α-ciano-3-fenoxibenzil- (1R) -cis-3 (2,2-dibromovinil) -2,2dimetilciclopropano carboxilato – 1 isômero.
Figura 10. Cipermetrina: α-ciano-3-fenoxibenzil-2,2-dimetil-cis, trans-3 (2,2-diclorovinilciclopropanocaboxilato – 2 isómeros.
51
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
3.3.
Efecto ambiental, producto de la toxicidad causada por la presencia de
residuos de plaguicidas piretroides en miel de abeja
En las últimas décadas del siglo XX, se demostró que el empleo de insecticidas
convencionales ocasiona graves daños ecológicos como son: la contaminación del
medio ambiente, junto con esto sus compartimentos; agua, aire y suelos, lo que
provoca una disminución en las especies biológicas y la contaminación de alimentos
con residuos tóxicos. Su aplicación, por tanto, crea desequilibrios ecológicos que dan
lugar a nuevas plagas y a especies nocivas resistentes.
Algunos ecosistemas naturales presentan contaminación como resultado de los
residuos generados, por el uso frecuente e inadecuado de compuestos químicos, como
plaguicidas utilizados en actividades agropecuarias. Estas sustancias xenobióticas
inciden en la actividad apícola del país, debido a que son recolectadas, transportadas,
almacenadas y permaneciendo como residuos en la miel.
Las fuentes de contaminación para los productos apícolas son varias; deben tenerse en
cuenta, los cultivos, la vegetación, los tratamientos fitosanitarios y las condiciones del
medio ambiente, que puede ser incorporada por las abejas junto con el néctar.
El riesgo de contaminación de la miel de abeja, va a estar dada desde el punto de vista
ambiental a la contaminación por plaguicidas. Si para las abejas el riesgo de los
plaguicidas es muy tóxico, en el caso de los piretroides los efectos de toxicidad en las
abejas esta dado por que
inducen movimientos
erráticos, inhabilidad para volar,
estupefacción seguido muy a menudo, por parálisis, morbilidad y muerte (Devillers,
2002b). La contaminación de los productos apícolas es baja, ya que éstas pueden
morir antes de llevar el néctar a la colmena.
Dado los resultados de la cuantificación de los residuos de plaguicidas piretroides en
mieles; se demuestra que la contaminación de las mieles es causada por el tratamiento
52
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
apícola y también a través del ambiente, el cual está contaminado dado al uso de
plaguicidas en los cultivos que se encuentran cerca de las colmenas.
Como se reportó en el capítulo I, reafirmado por Sammataro y col. (2000); Sammataro
y Finley (2004), que los plaguicidas tales como la flumetrina y el tau-fluvalinato son
usados para el control del ácaro Varroa destructor Anderson y Trueman, la cual es
considerada la mayor, más problemática y la más frecuente plaga que ataca a las A.
mellifera en el mundo.
Se constató que de las 31 muestras de miel analizadas en la presente investigación,
para la determinación de plaguicidas piretroides en miel de abejas, se obtuvo una
presencia significativa con 22 muestras contaminadas de tau-fluvalinato, con 19 por
encima del LMR correspondiendo al un 61,3 % del total de las muestras, por ser un
plaguicida que se usa directamente a la colmena, haciendo que la miel se contamine
muy fácil. Este piretroide se puede incorporar en la colmena por las dos vías de
contaminación.
Estos resultados referentes, al tau-fluvalinato, indican que es una aplicación habitual en
el interior de las colmenas, por los propios apicultores, una vez que este plaguicida
piretroide es usado específicamente para el control del ácaro Varroa destructor, como
se refiere anteriormente. Este es un producto que cuenta con ciertas aplicaciones
agrícolas, por lo que las abejas también pueden haberse visto expuestas a el polen
contaminado con esta sustancia, durante sus actividades de pecoreo.
Dada sus características físico-químicas que presenta este compuesto (liposolubilidad)
puede ser un gran factor de contaminación de la miel de abeja. Esto lo corrobora
(Neira, 2011), cuando dice que el uso del tau-fluvalinato, por su carácter lipofílico, tiene
el riesgo de contaminar los diferentes productos de la colmena presentándose muy
fácilmente en la cera, no así en la miel; sin embargo, una vez que se encuentra en la
miel permanece ahí por un largo tiempo. Dada esta afirmación, podemos decir que la
53
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
miel, puede ser un producto con una alta toxicidad, debido también a su tiempo de
exposición.
La deltametrina es otro de los piretroides encontrados en las muestras analizadas. En
menor cantidad, también se encontró con 3 muestras, 2 de ellas por encima del LMR
para un 6.4 %, siendo este último, uno de los plaguicidas piretroides más tóxico, dado
por sus características estructurales que lo hacen excepcional, por ser aislado a partir
de un solo isómero el D-cis, los cuales son los más dañinos (Santos y Col., 2007).
Como habíamos dicho anteriormente esta, es obtenida del aislamiento de apenas un
isómero (más activo D-cis), que es el más tóxico de los piretroides para los
vertebrados, utilizados particularmente en la agricultura, conocidos hasta la actualidad
(Santos y col., 2007). Por su uso y sus características de este plaguicida piretroide, se
justifica su presencia en las muestras de miel que fueron determinadas en este estudio.
Una vez que las abejas en su pecoreo de recolección de néctar, para la producción de
la miel llegan alcanzar un rango de aproximadamente 2 kilómetros de distancia,
pudiendo llegar de 4 – 5 kilómetros.
Su impacto ambiental es notable; al igual que para todos los piretroides, la deltametrina
es escasamente selectiva, por ser particularmente nociva para toda la entomofauna
auxiliar útil en los cultivos (Pimpão, 2012). Su uso debe ser, por tanto, limitado y
circunscrito de modo que su efecto nocivo sobre la fauna útil sea bajo o nulo.
La máxima concentración de un residuo resultado del uso de un producto veterinario
medicinal que puede ser aceptado por la comunidad para ser legalmente permitido o
reconocido como aceptable en un alimento es lo que conocemos como límite máximo
de residuos.
El límite máximo de residuos experimental (determinado en esta investigación) es
mayor que el límite máximo de residuos según la regulación de la Unión europea,
basado en estudios toxicológicos. Al analizar este indicador podemos llegar a afirmar
54
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
que estamos en presencia de contaminación de la miel, tabla 18 (ver en los anexos 9
los resultados para cada muestra analizada).
La cipermetrina es otro, de los compuestos referidos en esta investigación, que se
encontró en la misma proporción de resultados que la deltametrina, con 3 muestras, 2
de ellas por encima del LMR, representando 6.4%. Es un piretroide de uso restringido,
así categorizado por la EPA, debido a su alta toxicidad en los peces e invertebrados
acuáticos, debido a que su metabolización y eliminación de estos compuesto son
significativamente más lentos en peces que en mamíferos y pájaros (Pimpão, 2012).
Como los demás piretroides, también es usado ampliamente en el control de la plaga
del algodón, en el tratamiento de la lana de las ovejas (Jaensson et al., 2007).
Es también frecuentemente utilizado en la agricultura, (Jaensson et al., 2007; Singh,
2008), para el control de ectoparásitos que infectan el ganado bovino, ovino, aves y
algunos animales de compañía, (Pimpão, 2012) y también, para el control de insectos
domésticas e industriales (Singh, 2008).
Shires, relató que la mortalidad de los peces puede ocurrir debido al uso de la
cipermetrina en prácticas de la agricultura.
Los productos que contienen cipermetrina son clasificados según la clase de toxicidad
de tipo II (toxicidad moderada) o de tipo III (altamente tóxicos) dependiendo de la
formulación (Baser et al., 2003).
Vale la pena resaltar que la cipermetrina, así como los piretroides en general son de
una baja toxicidad para mamíferos y pájaros, pero específicamente, la cipermetrina, es
altamente tóxico para peces e invertebrados acuáticos. (Pimpão, 2012).
55
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
Tabla 18. Resultados de las muestras analizadas para determinación de plaguicidas
piretroides en la miel de abejas
Piretroides
Resultados
LMR (mg/kg)
Nr.de
muestras
Nr.de
muestras
> LMR
% Muestra
> LMR
Tau- fluvalinato
*0,05 – *0,197
0,01
22
19
61,3
Deltametrina
0,022; 0,048; 0,069
0,03
3
2
6,4
Cipermetrina
0,020; 0,125; 0,147
0,05
3
2
6,4
-
-
6
3
19,3
ND
* Valor mínimo y máximo de los resultados obtenidos para el Tau-fluvalinato;
ND- no detectable por encima del límite de cuantificación del método.
Como se observa en la tabla 18, en las muestras de miel de abejas analizadas, se
cuantificaron piretroides, Tau- fluvalinato, Deltametrina y Cipermetrina, siendo el de
mayor por ciento el Tau- fluvalinato. Al encontrarse en la miel en valores superiores al
LMR, esto quiere decir que hay riesgo de que la población que consume este producto
se contamine. Como refiere Santos y col., 2007 ellos presentan una alta lipofilia y
aunque no sufren biomagnificación a través de la cadena alimentaria, pero si van a
tener tendencia a la bioacumulación y un posible efecto tóxico crónico.
El uso de plaguicidas no está exento de riesgos, ya que estos compuestos se
seleccionan por su toxicidad frente a determinados organismos y al existir cierta
homogeneidad entre las diferentes formas de vida, pueden ser tóxicos para organismos
no-diana y también para los seres humanos si llegaran a estar expuestos a dichos
productos.
El uso indiscriminado de piretroides puede afectar el equilibrio en el medio ambiente,
requiriendo su monitoreo para análisis de sus residuos y sus efectos (Barrionuevo;
Lanças, 2001; Pimpão, 2012).
56
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
De acuerdo con estos resultados podemos reafirmar que las abejas y sus productos
son utilizados para biomonitorear la distribución y el impacto de varios contaminantes
ambientales, entre ellos los plaguicidas.
Una ventaja decisiva en el uso de biomarcadores en el monitoreo ambiental, demuestra
que la fisiología de los organismos está dentro de los límites normales, no hay que
hacer ninguna acción reparadora (Bernardi, 2008).
Aunque los piretroides no son persistentes en el medio ambiente se demuestra que
pueden ser encontrados en los compartimentos ambientales, donde de alguna forma
van a ejercer su toxicidad. Al encontrarse en la miel podemos afirmar que existen
modificaciones en el ambiente y sus componentes bióticos, por lo que se confirma el
impacto ambiental. Corroborando con Singh, 2008; cuando dice que a pesar de no ser
persistentes en el ambiente, pueden ser extremadamente sensibles a efectos
neurotóxicos.
A través de los efectos indeseables ambientales de los plaguicidas; podemos decir que
los piretroides son plaguicidas con efectos adversos a corto plazo en el ambiente
cercano. Esto se explica aunque los piretroides no son persistentes en el medio y su
aplicación no es continua, tienen efectos aparentemente leves, los cuales serán
observados a largo plazo. En el caso de la contaminación de las mieles por piretroides
el efecto se verá pasados los años de estar el individuo expuesto al xenobiótico.
A pesar de los beneficios que la sociedad obtiene de la aplicación de los plaguicidas,
no puede olvidarse que los estos son sustancias tóxicas empleadas, capaces de
eliminar a los organismos diana correspondientes y que por tanto pueden presentar un
impacto indeseable sobre los ecosistemas y sobre el hombre. Por tanto, según
Ecobichon, 1995; se puede afirmar que no existen plaguicidas completamente seguros.
El uso frecuente de los plaguicidas, que se lleva a cabo en la actualidad, produce
inevitablemente la contaminación del medio ambiente y de las cosechas a las que se
57
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
aplica. La movilidad de los plaguicidas a través del aire o el agua y su acumulación o
transformación en el medio donde se aplican, ha provocado que se alcancen, en ciertos
casos, niveles elevados en alimentos y en el agua, principales vías de llegada al
consumidor. Además, en general, estos compuestos son lipófilos y no se metabolizan
rápidamente por lo que se acumulan en el organismo, lo cual facilita el fenómeno de
biomagnificación y bioacumulación, producida a través de la cadena trófica (Briggs,
1981, Jury y col., 1987 y Spear, 1991). Todos estos riesgos deben ser evaluados antes
de poder autorizar el uso de un determinado pesticida en un cultivo.
Evaluar el impacto de un plaguicida en la cadena alimenticia es un proceso complejo ya
que un insecticida, en teoría, aplicado sólo a un cultivo, puede acabar en función de su
persistencia en distintos compartimentos ambientales como el agua, y de ahí pasar a la
distribución del agua corriente y afectar a diferentes organismos, como a los insectos,
las abejas productoras de miel, al ganado y a otros cultivos.
Estos hechos han desencadenado una preocupación social que está originando el uso
de menores dosis de aplicación y la utilización de sustancias menos tóxicas, menos
persistentes y más compatibles con el medio ambiente. La demanda de la sociedad de
una mayor seguridad en el uso de los productos fitosanitarios requiere el desarrollo y la
mejora de la metodología analítica, para garantizar la detección de estos compuestos,
a niveles muy bajos, en las distintas matrices ambientales y alimentarias.
Con respecto a lo anterior, lo ideal sería realizar las pruebas toxicológicas bajo las
mismas condiciones en las cuales se pretende analizar el efecto toxicológico; no
obstante, lo anterior es poco factible, ya que la mayor parte de los estudios de riesgo
humano, se apoyan en datos experimentales obtenidos en animales.
58
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
CONCLUSIÓN
1. El método de ensayo multiresiduo para el análisis de residuos de plaguicidas
piretroides en miel de abejas, demostró ser lineal, preciso, exacto, robusto,
selectivo y específico.
2. El límite de Cuantificación del método de ensayo es de 0,005 mg kg -1, el cual es
satisfactorio ya que es menor que los LMR establecidos internacionalmente.
3. Se cuantificó el tau-fluvalinato como el compuesto más frecuente en las 31
muestras de miel de abeja analizadas, por su aplicación directa en la apicultura y
agricultura.
4. Los resultados obtenidos en las muestras de miel analizadas, revelan valores
por encima de los LMR establecidos internacionalmente, demostrando la
contaminación de la miel, y un posible efecto tóxico al hombre.
5. Las abejas melíferas y sus productos son empleados como bioindicadores para
el monitoreo,
distribución y el impacto de varios contaminantes ambientales
incluyendo los plaguicidas.
6. Los piretroides son agrupados de acuerdo a la ocurrencia de sus efectos
adversos ambientales como; que actúan a corto plazo en el ambiente cercano.
59
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
RECOMENDACIONES
1. Se recomienda la continuidad de la validación del método de ensayo para la
determinación en miel de otros grupos de plaguicidas como por ejemplo
organofosforados
y
otros
contaminantes
como
compuestos
orgánicos
persistentes (COPs).
2. Realizar un estudio de monitoreo de miel, teniendo en cuenta la fecha de la
aplicación de los plaguicidas y la fecha de recolección de la miel.
60
Determinación de residuos plaguicidas piretroides en la miel de abeja.
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elaborado
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70
ANEXO 1
COMPUESTO
BETA CIFLUTRINA
MODO DE ACCIÓN
Insecticida no
sistémico, con acción de contacto e
ingestión.
PESO MOLECULAR
434.3
PUNTO FUSIÓN
81ºC (para enantiómero II); 106ºC (para enantiómero IV)
PRESIÓN VAPOR
(II) 1.4 x 10-5 mPa; (IV) 8.5 x10-5 mPa (both 20 ºC)
DENSIDAD
1.34 g/cm3 (22 ºC)
SOLUBILIDAD
Ambos pares enantiómeros: En agua 2 g/L (20ºC). En
diclorometano y tolueno > 200 g/L ( 20ºC).
Par enantiómero II en hexano 2-5, isopropanol 5-10 (en g/L,
20ºC).
Par enantiómero IV en hexano1-2, isopropanol 2-5 (en g/L,
20ºC).
En agua: (II) 2.1, (IV) 1.2 (ambos en g/L, 20 ºC). En
diclorometano y tolueno >200 ambos en g/L (20 ºC), (II) en
hexano 2-5, isopropanol 5-10 (ambos en g/L, 20 ºC). (IV) en
hexano 1-2, isopropanol 2-5 (ambos en g/L, 20 ºC).
ESTABILIDAD
Térmicamente estable a temperatura ambiente. DT 50 por
hidrólisis (22ºC). Para el par enantiómero II: 117 días (pH 4),
20 días (pH 7), 6 días (pH 9); Para el par enantiómero IV: 25
días (pH 4), 11 días (pH 7), 5 días (pH 9).
CLASE
DE WHO (i.a.) II; ( 450 mg/Kg. ); EPA (formulado) II
TOXICIDAD
ESTRUCTURA
Cl
C CH
Cl
CH3
O CN
C
CH
O
CH3
O
F
ANEXO 2
CIFLUTRINA
Insecticida no sistémico, con acción de contacto e
ingestión.
PESO MOLECULAR
434.3
PUNTO FUSIÓN
(I) 64ºC; (II) 81ºC; (III) 65ºC; (IV) 106ºC; técnico 60ºC
PRESIÓN VAPOR
(I) 9.6 X 10-4; (II) 1.4 X 10-5; (III) 2.1 X 10-5; (IV) 8.5 X 10-5
(todos en mPa, 20 ºC)
DENSIDAD
1.28 (20 ºC)
SOLUBILIDAD
El diastereoisómero I: En agua 2,5 (pH 3); 2,2 (pH 7)
(ambos en g/L a 20ºC). En diclorometano > 200; n-hexano
10-20; isopropanol 20-50 (todos el g/L a 20ºC)
El diastereoisómero II: En agua 2,1 (pH 3); 1,9 (pH 7)
(ambos en g/L a 20ºC). En diclorometano, tolueno > 200;
en n-hexano 10-20; en isopropanol 5 –10 (todos en g/L a
20ºC)
El diastereoisómero III: En agua 3,2 (pH 3); 2,2 (pH 7)
(ambos en g/L a 20ºC). En diclorometano, tolueno > 200; en
n-hexano, isopropanol 10-20; (Todos en g/L a 20ºC)
El diastereoisómero IV: En agua 4,3 (pH 3), 2,9 (pH 7)
(ambos en g/L a 20ºC). En diclorometano > 200, n-hexano
1-2, isopropanol 2-5 (todos en g/L a 20 ºC)
ESTABILIDAD
Térmicamente estable a temperatura ambiente. En agua
DT50 para el diastereoisómero (I): 36, 17, 7; (II) 117, 20, 6;
(III) 30, 11, 3; (IV) 25, 11, 5 (todos en días, pH 4, 7, 9
respectivamente, 22ºC).
CLASE
DE WHO (i.a.) II; ( 250 mg/Kg. ); EPA (formulado) II
TOXICIDAD
ESTRUCTURA
COMPUESTO
MODO DE ACCIÓN
Cl
C CH
Cl
CH3
O CN
C
CH
O
CH3
O
F
ANEXO 3
CIPERMETRINA
Insecticida no sistémico, con acción de contacto e ingestión.
Buena actividad residual.
PESO MOLECULAR
416.3
PUNTO FUSIÓN
61-83 °C, en dependencia de la relación isomérica.
PRESIÓN VAPOR
2.0 x 10-4 mPa (20 ºC)
DENSIDAD
1.24 (20ºC)
SOLUBILIDAD
En agua 0,004 mg/L (pH 7). En acetona, cloroformo,
ciclohexanona, xileno > 450, etanol 337, n-hexano 103
(todos en g/L a 20ºC)
ESTABILIDAD
Relativamente estable en medio neutro y en medio
ligeramente ácido, con estabilidad óptima a pH 4, DT50 1.8
días (pH 9, 25 ºC); estable a pH 5 y 7 (20 ºC). Se hidroliza
en medio alcalino. Relativamente estable a la luz en
condiciones de campo. Térmicamente estable hasta 220ºC
CLASE
DE WHO (i.a.) II; ( 250 mg/Kg. ); EPA (formulado) II
TOXICIDAD
ESTRUCTURA
COMPUESTO
MODO DE ACCIÓN
Cl
C CH
Cl
O
C
CH3 CH3
CN
O
O
ANEXO 4
DELTAMETRINA
Insecticida no sistémico, con acción de contacto e ingestión.
505.2
100 – 102ºC
1.24 x 10-5 mPa (25 °C, gas saturation method)
Densidad volumétrica 0.55 g/cm3 (25ºC)
En agua < 0,2 g/L (25ºC), en dioxano 900, ciclohexanona
750, diclorometano 700, acetona 500, benceno 450,
dimetilsulfoxido 450, xileno 250, etanol 15, isopropanol 6
(todos en g/L a 20ºC).
Extremadamente estable bajo exposición al aire. Estable a
temperatura < o = a190ºC. Bajo irradiación UV y luz solar
ocurre isomeración cis-trans, con pérdida de bromo. Más
estable en medio ácido que alcalino; DT50 2.5 días (pH 9,
25ºC).
DE WHO (i.a.) II; ( 135 mg/Kg. ); EPA (formulado) II
COMPUESTO
MODO DE ACCIÓN
PESO MOLECULAR
PUNTO FUSIÓN
PRESIÓN VAPOR
DENSIDAD
SOLUBILIDAD
ESTABILIDAD
CLASE
TOXICIDAD
ESTRUCTURA
CN
O
C
C O H
C C
Br H
H
CH3 CH3
Br
H
O
ANEXO 5
FENVALERATE
Insecticida y acaricida no sistémico, con acción de contacto
y respiratoria
PESO MOLECULAR
419.9
PUNTO FUSIÓN
39.5-53.7 °C (puro)
PRESIÓN VAPOR
1.92 x 10-2 mPa (20 ºC)
DENSIDAD
1.175 (25ºC)
SOLUBILIDAD
En agua < 10 g/Ll a 25ºC. En n-hexano 53, xileno > 200,
metanol 84 (todos en g/L a 20ºC).
ESTABILIDAD
Estable bajo condiciones de calor y humedad.
Relativamente estable en medio ácido, pero rápidamente
hidrolizable en medio alcalino.
CLASE
DE WHO (i.a.) II; ( 450 mg/Kg. ); EPA (formulado) II
TOXICIDAD
ESTRUCTURA
COMPUESTO
MODO DE ACCIÓN
Cl
O
C
CH O
CH
CH3 CH3
CN
CH
O
ANEXO 6
LAMBDA CIALOTRINA
Insecticida no sistémico con acción de contacto e ingestión.
Tiene propiedades repelentes.
PESO MOLECULAR
449.9
PUNTO FUSIÓN
49.2ºC (47.5 – 48.5 el producto técnico)
PRESIÓN VAPOR
2 x 10-4 mPa (20 ºC, est.); 2 X 10-1 mPa (60 ºC,
interpolado)
DENSIDAD
1.33 g/mL (25ºC)
SOLUBILIDAD
En agua 0,005 mg/L. En acetona, metanol, tolueno, nhexano, acetato de etilo 500 (todos en g/L).
ESTABILIDAD
Estable a la luz. Estable en condiciones de almacenamiento
por un término de 6 meses a temperatura 15-25ºC.
CLASE
DE WHO (i.a.) II; ( 56 mg/Kg. ); EPA (formulado) II
TOXICIDAD
ESTRUCTURA
COMPUESTO
MODO DE ACCIÓN
(S) (Z)-(1R)-cisH
O
H
CF3
C
C O
CN
C C
Cl H
H
CH3 CH3
O
+
H
H
Cl
CN
C O
C C CH CH
C
3O
3
CF3
H
H
(R) (Z)-(1S)-cis-
O
ANEXO 7
PERMETRINA
Insecticida no sistémico con acción de contacto e ingestión.
391.3
34 – 35ºC; los isómeros cis 63 – 65ºC; los isómeros trans 44
– 47ºC
PRESIÓN VAPOR
cis- 0.0025 mPa; trans- 0.0015 mPa (ambos 20 ºC) (D.
Wells et al., Pestic. Sci., 1986, 17, 473)
DENSIDAD
1.29 (20 °C)
SOLUBILIDAD
En agua 6 x 10-3 mg/L (pH 7, 20 ºC). En xileno, n-hexano >
1000, en metanol 258 (todos en g/Kg. a 25ºC)
ESTABILIDAD
Estable al calor ( > 2 años a 50ºC). Más estable en medio
ácido que en medio alcalino, con óptima estabilidad a pH 4.
DT50 (pH 9), estable (pH 5, 7) (atodos a 25 °C). Un poco
de degradación fotoquímica se observó en los estudios del
laboratorio, pero los datos del campo indican que esto no
afecta la actuación biológica adversamente.
CLASE
DE WHO (i.a.) II; ( 500 mg/Kg. ); EPA (formulado) II
TOXICIDAD
ESTRUCTURA
COMPUESTO
MODO DE ACCIÓN
PESO MOLECULAR
PUNTO FUSIÓN
Cl
C CH
Cl
O
CH2
C O
CH3 CH3
O
ANEXO 9
Resultados de las muestras analizadas para determinación de plaguicidas
piretroides en la miel de abejas.
Nr.
Plaguicidas
1
Tau-fluvalinato
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Deltametrina
Deltametrina
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
Cipermetrina
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
Cipermetrina
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
Tau-fluvalinato
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
ND
ND
ND
ND
ND
Cipermetrina
-ND
Tau-fluvalinato
Deltametrina
Resultados
mg/kg
0.005±0.002
0.069±0.003
0.022±0.003
0.018±0.002
0.021±0.002
0.022±0.002
0.024±0.002
0.014±0.002
0.024±0.002
0.01±0.002
0.035±0.002
0.050±0.002
0.023±0.002
0.031±0.002
0.016±0.002
0.147±0.001
0.008±0.002
0.013±0.002
0.098±0.002
0.022±0.002
0.020±0.001
0.023±0.002
0.031±0.002
0.035±0.002
0.025±0.002
0.125±0.001
0.197±0.002
0.048±0.003
LMR
mg/kg
0.01
0.03
0.03
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.05
0.01
0.01
0.01
0.01
0.05
0.01
0.01
0.01
0.01
0.05
0.01
0.03
ANEXO 8
Criterios de aprobación para métodos internos de laboratorio para análisis de
residuos plaguicidas y drogas veterinarias
Concentración
Repetibilidad
Reproducibilidad
Intervalo
mg.kg−1
Recobrado (%)
≤0.01
36
54
50-120
0.001-0.01
32
46
60-120
0.01-0.1
22
34
70-120
0.1-1
18
25
70-120
˃1
14
19
70-120
ANEXO 10