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CARACTERIZACIÓN DE TUBOS DE FIBROÍNA PARA REGENERACIÓN NERVIOSA OBTENIDOS
MEDIANTE ELECTROSPINNING
S. Herrero1,2, G.V. Guinea1,2, J. Pérez1,2, G.R. Plaza1,2
1
Departamento de Ciencia de Materiales. E.T.S.I. de Caminos, Canales y Puertos
Universidad Politécnica de Madrid. C/ Profesor Aranguren s/n E-28040-Madrid
2
Centro de Tecnología Biomédica. Universidad Politécnica de Madrid
Campus de Montegancedo. E-28223 Pozuelo de Alarcón (Madrid)
RESUMEN
Los nervios periféricos tienen la particularidad de que pueden regenerarse si se dan las condiciones adecuadas.
Gracias a la Ingeniería de Tejidos se han desarrollado andamios que facilitan esta tarea. La seda es un material
excelente para este propósito puesto que sus propiedades mecánicas son inmejorables y, además, es biocompatible.
En el presente trabajo se estudian las propiedades mecánicas y microestructurales de andamios de seda de gusano
(Bombyx mori) regenerada para utilizarlos en la reparación de nervios periféricos.
ABSTRACT
Peripheral nerves can regenerate under the appropriate conditions. Scaffolds obtained by Tissue Engineering
techniques have made easier this issue. Silk is a biomaterial that is suitable for this purpose due to its outstanding
mechanical properties and its biocompatibility. In the present work we have studied the mechanical and
microstructural properties of tubular scaffolds, made of regenerated silkworm (Bombyx mori) silk, to use them in the
repair of peripheral nerves.
PALABRAS CLAVE: Fibroína, Electrospinning, Scaffold, Comportamiento mecánico, Tubos.
1. INTRODUCCIÓN
Existen múltiples causas (traumáticas, quirúrgicas,
tumorales, etc) que pueden dar lugar a una lesión de los
nervios periféricos implicando una pérdida de la función
motora o sensitiva. A diferencia del sistema nervioso
central, el sistema nervioso periférico tiene una cierta
capacidad regenerativa. Como respuesta a lesiones no
muy importantes, los nervios periféricos son capaces de
regenerarse bajo una serie de condiciones apropiadas,
siempre y cuando la separación producida por dicha
lesión no sea excesivamente grande [1].
Las dos técnicas quirúrgicas más comunes para la
reparación de nervios periféricos son la construcción de
puentes, que incluye técnicas de tunelización e injertos,
y la operación directa sobre el nervio [2].
En este contexto, la ingeniería de tejidos proporciona
una alternativa prometedora a través de injertos, tanto
artificiales como biológicos. Este campo, relativamente
nuevo y en auge, se basa en el reemplazo o la
restauración de la función del tejido dañado combinando
biomateriales que sirven de andamiaje (scaffold), células
y moléculas biológicamente activas.
La seda es un biomaterial muy estudiado debido a sus
excelentes propiedades mecánicas [3]. Desde hace unos
años, la seda regenerada se ha venido utilizando para
generar una amplia gama de biomateriales como geles,
esponjas o membranas [4]. Se trata de un material
biocompatible que favorece el crecimiento celular [5].
La única técnica que permite la fabricación de fibras
continuas
con
diámetros
micrométricos
y
submicrométricos de una manera fiable es el
electrohilado [6,7]. Se trata de una técnica que utiliza la
fuerza electrostática para producir fibras a partir de una
disolución del material. La aplicación de un potencial
del orden de kilovoltios es necesaria para poder generar
fibras continuas y homogéneas de diferentes diámetros
[7,8]. Una de las grandes ventajas del electrohilado es
que es posible conseguir materiales altamente porosos
[9].
El objetivo del presente trabajo es la fabricación y
caracterización, macroscópica y microscópica, de tubos
de seda regenerada obtenidos mediante electrohilado. El
siguiente paso será su implantación en ratas para
regeneración de nervios periféricos.
varilla de acero de 2.6 mm de grosor girando a una
velocidad de 1000 rpm.
2.3 Estabilización en etanol
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Obtención de la fibroína
Los capullos de gusano de seda (Bombyx Mori) se
desgomaron para eliminar su recubrimiento de sericina.
Para ello, se cocieron dos veces en una disolución de
NaCO3 con una concentración de 0.5% (p/v) durante
media hora cada vez, y después se aclararon con agua
destilada a 80 ºC durante diez minutos. Se dejó secar la
seda extraída a temperatura ambiente durante 24-48
horas y se disolvió en bromuro de litio (LiBr) 9.4M.
Una vez disuelta, se dializó la disolución en
polietileneglicol (PEG, 20% p/v) durante tres días en un
casete de diálisis (Fisher scientific, Slide-A-Lyzer
Dialysis Casette; 3,500 MWCO), con el fin de eliminar
completamente el LiBr. Seguidamente la disolución
acuosa obtenida se liofilizó, dando lugar a una esponja
de fibroína.
Una vez electrohilados, se sumergieron los tubos de
fibroína en etanol durante cinco minutos para favorecer
el cambio de estructura secundaria y, de esta manera,
hacerlos insolubles en agua.
2.4. Caracterización de la microestructura mediante
Resonancia Magnética Nuclear (RMN)
Se realizaron medidas de espectroscopía 13C NMR
CP/MAS en un espectrómetro Bruker Advanced
400MHz Wide Bore (9.39 T) operando a una frecuencia
de 100MHz para núcleos de 13C. Se empleó una
frecuencia de 12 Hz en un rotor de ZrO2 de 4 mm de
diámetro. Todos los experimentos se llevaron a cabo a
temperatura ambiente. Los desplazamientos del 13C se
representaron en relación a los del tetrametilsilano
(TMS).
2.5. Morfología de las fibras
Se utilizó un microscopio electrónico de barrido (JEOL
6300) para analizar la morfología de las fibras. Las
muestras fueron metalizadas con oro durante tres
minutos. Se aplicó un voltaje de 10V y una intensidad
de 6·10-11 A. Las imágenes se han obtenido a 4000
aumentos.
1 mm
Figura 1: Diagrama esquemático del sistema de electrohilado
2.2. Electrohilado
Para este propósito se utilizó una máquina NANON01A (by Mechanics Electronic Computer Corporation
MECC CO, LTD, Japón). Se presenta un esquema del
proceso de hilado en la Figura 1. Se rellenaron
jeringuillas de polipropileno con capacidad para 3ml
con una disolución de seda en hexafluoroisopropanol
(HFIP) a una concentración del 20% (p/v). El potencial
eléctrico, el bombeo de la disolución y la distancia de la
aguja hasta el colector se seleccionaron de manera que
el chorro fuera estable. Los parámetros utilizados,
obtenidos tras una serie de ensayos preliminares, fueron
20kV, 2.0ml/h y 150mm. Como colector se utilizó una
Figura 2: Tubos de fibroína obtenidos mediante electrohilado
y sometidos a un tratamiento posterior de etanol.
2.6. Ensayos mecánicos
Con el fin de caracterizar el comportamiento de los
tubos de fibroína en dirección longitudinal se realizaron
ensayos mecánicos de tracción simple. Se utilizó una
máquina Instron 4411, a la que se le acopló una balanza
AMD 1200g, para realizar los ensayos en aire. La
velocidad del ensayo se estableció en 0.2 mm/min. Los
ensayos mecánicos en agua se realizaron en una
máquina de tracción electromecánica Nanobionix MTS
con una célula de carga de 600 mN. La velocidad del
ensayo se estableció en 0.01 mm/min.
15µm
15µm
Figura 3: Imagen de microscopio electrónico de las fibras de
seda que componen los tubos obtenidos mediante
electrohilado sin tratamiento posterior.
Figura 4: Imagen de microscopio electrónico de las fibras de
seda que componen los tubos obtenidos mediante
electrohilado con inmersión posterior de etanol.
120
150
100
Número de Fibras
Número de Fibras
100
50
80
60
40
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Grosor(micras)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Grosor (micras)
Figura 5: Grosor medio de las fibras de seda que componen
los tubos obtenidos mediante electrohilado sin tratamiento
posterior.
Figura 6: Grosor medio de las fibras de seda que componen
los tubos obtenidos mediante electrohilado con inmersión
posterior de etanol.
Las probetas se cortaron directamente de los tubos
tratados con etanol y se sujetaron a las mordazas por los
extremos. El espesor de las mismas se determinó con un
medidor Mitutoyo 7301 que tiene una precisión de 10
µm. El largo y ancho de las probetas se midió con un
proyector de perfiles de precisión 1 µm.
La velocidad de rotación no fue suficientemente alta
como para producir fibras alineadas, obteniendo tubos
formados por fibras en una orientación aleatoria. Como
muestra la Figura 3, las fibras no son circulares sino
aplanadas.
Se realizaron al menos 10 ensayos por cada condición a
temperatura ambiente (20 ºC) con el fin de comparar las
propiedades del material antes y después de
humedecerlo con agua.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Morfología y distribución de grosores de fibras en
los tubos de fibroína
Los tubos obtenidos se ilustran en la Figura 2. El
proceso de electrohilado resultó ser óptimo para los
parámetros indicados anteriormente, dando como
resultado fibras homogéneas y continuas (Figura 3).
La razón por la cual las fibras tienen un aspecto
aplanado puede estar relacionada directamente con la
tasa de evaporación del disolvente durante el proceso de
electrohilado [10], ya que la evaporación del HFIP se
produce a un ritmo muy alto, haciendo que en la punta
de la aguja se forme una capa sólida de disolución con
un núcleo líquido. Debido a la presión atmosférica y a la
evaporación del disolvente de dicho núcleo, la fibra
colapsa pasando rápidamente de una forma circular a
una forma plana.
El aspecto de las fibras cambia significativamente
después de haberlas introducido en etanol. Las fibras se
ensanchan y la porosidad disminuye (Figura 4).
Como se muestra en las figuras 5 y 6, el grosor medio de
las fibras después del electrohilado es de 3.18±0.05 µm,
mientras que al introducir los tubos en etanol, el grsosor
de las fibras es 3.71±0.06 µm (media ± error estándar),
por lo que el grosor medio aumenta en un 16% con el
tratamiento. Este aumento, junto a una mayor
compactación como se ilustra en la Figura 4, tiene un
efecto directo en el descenso de la porosidad.
3.2 Resonancia Magnética Nuclear
En la Figura 7 se muestran los espectros de resonancia
magnética de la seda natural desgomada (a), después de
liofilizarla (b), del tubo de fibroína sin tratamiento (c) y
del tubo de fibroína tratado con etanol (d).
La fibroína puede asumir dos conformaciones diferentes
denominadas Silk I y Silk II. Diversas investigaciones
indican que la forma Silk I corresponde a una
conformación aleatoria con giros β, mientras que la
forma Silk II evidencia una estructura de hoja β
antiparalela. Los picos característicos correspondientes
a los carbonos asociados a la alanina (Cα, Cβ y
carbonilo) son suficientes para identificar las formas
Silk I y Silk II de la fibroína [11].
estructura tipo hoja β. La presencia de este tipo de
estructura está confirmada por su insolubilidad en agua,
cosa que no ocurre con el tubo sin tratamiento de etanol.
Asimismo los picos correspondientes a los carbonilos de
la alanina y la glicina están completamente separados en
el caso de la seda desgomada, lo que implica de nuevo
una gran presencia de estructura secundaria en forma de
hoja β. Esto no ocurre para la seda liofilizada o para el
tubo sin tratar. En el caso de las fibras tratadas con
etanol observamos una ligera separación, lo que sugiere
que existe esta estructura secundaria necesaria para la
cristalización, aunque no suficiente ya que el espectro es
diferente al de la seda natural desgomada.
3.3 Ensayos mecánicos
Las figuras 8 y 9 muestran las gráficas tensióndeformación de probetas longitudinales extraídas de los
tubos de fibroína ensayadas en aire y en agua,
respectivamente. La dispersión en ambos casos es muy
alta, sobre todo en el caso de los ensayos en seco.
Ala C=O II
Gly C=O II
12
Ala Cβ
10
II I
Tensión (MPa)
8
d
6
4
c
2
0
b
0
0.05
0.1
0.15
0.2
Deformación
a
200
150
100
50
0
Figura 8: Gráficas tensión-deformación de probetas
longitudinales obtenidas de tubos de fibroína ensayadas en
seco.
ppm
0
Los espectros de la seda desgomada y la seda lioflizada
son totalmente diferentes. La seda desgomada muestra
un pico claro en 22 ppm correspondiente a la estructura
de hoja β, mientras que en la seda liofilizada este pico
no aparece. Sin embargo aparece un pico en 18.5 ppm
que indica estructura desordenada o hélice α. En el caso
del tubo de fibroína sin tratar el espectro es similar al de
la seda liofilizada, lo que indica que no se ha formado
estructura secundaria. Una vez introducido el tubo de
fibroína en etanol la estructura cambia sustancialmente,
aproximándose el espectro al de la seda desgomada.
Aunque el pico más característico coincide con la
estructura desordenada, se observa un pico de baja
intensidad en 22 ppm, indicando que se ha formado
Tensión (kPa)
Figura 7: Espectro de resonancia magnética de a) seda
desgomada, b) seda regenerada liofilizada, c) fibras
obtenidas mediante electrohilado, d) fibras tratadas con
etanol.
1200
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
1200
1000
1000
800
800
600
600
400
400
200
200
0
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0
0.25
Deformación
Figura 9: Gráficas tensión-deformación de probetas
longitudinales obtenidas de tubos de fibroína ensayadas en
agua.
En la Tabla 1 se recoge la tensión media de rotura, la
deformación media de rotura y el módulo de elasticidad
medio de ambos tipos de ensayo.
Aunque, como hemos dicho antes, la dispersión es muy
alta, se observa una clara diferencia entre las dos
condiciones de ensayo. La tensión de rotura alcanzada
por las muestras ensayadas en seco es un orden de
magnitud mayor que en las humedecidas. Lo mismo
ocurre con el módulo de elasticidad, que es también
mayor en el caso de los ensayos en seco. La
deformación, en cambio, es ligeramente más alta en los
ensayos en agua.
Tabla 1: Tensiones de rotura, deformaciones y módulo de
elasticidad de los tubos húmedos y secos
Tubo
σR (kPa)
εR (mm/mm)
E (kPa)
Seco
4000±1000
0.07±0.02
60000 ±10000
Húmedo
400±80
0.13±0.01
3100±300
Aunque la inmersión en un medio acuoso afecta de
modo importante a las propiedades del material, los
tubos producidos mediante electrohilado presentan una
resistencia y flexibilidad suficiente para su introducción
en un modelo animal mediante cirugía.
4. CONCLUSIONES
En el presente artículo se han estudiado las propiedades
de tubos de fibroína obtenidos mediante la técnica de
electrohilado, bajo diferentes condiciones.
Se ha realizado un estudio de la morfología de las fibras
de seda que componen los tubos. Asimismo se ha
estudiado su microsestructura mediante resonancia
magnética nuclear, y su comportamiento mecánico en
agua y en aire.
Se ha encontrado que el grosor de las fibras que
componen los tubos de fibroína aumenta cuando se les
aplica un tratamiento de etanol, mientras que la
porosidad disminuye.
Los espectros de resonancia magnética nuclear muestran
que sólo después del tratamiento de etanol se obtiene
estructura secundaria en forma de hoja β, necesaria para
la insolubilidad del tubo.
Los tubos secos resisten mayores tensiones, pero son
muy frágiles. Los tubos humedecidos son más flexibles.
AGRADECIMIENTOS
Los autores desean agradecer la colaboración por la
financiación prestada, a la Fundación Marcelino Botín a
través del proyecto “Diseño y desarrollo de nuevos
biomateriales para medicina regenerativa”, al Ministerio
de Ciencia e Innovación a través del proyecto
MAT2009-10258 y a la Comunidad de Madrid por el
proyecto NEUROTEC S2011/BMD-2640.
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