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Universidad de Oviedo
Servicio de Proceso de Imágenes y Diseño Gráfico
I curso para usuarios de microscopía láser confocal
Microscopía Confocal: Aplicaciones
Marta Alonso Guervós
[email protected]
Universidad de Oviedo
Servicio de Proceso de Imágenes y Diseño Gráfico
¿ Cómo funciona ?
El microscopio confocal
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El microscopio confocal
Microscopio
Confocal
¿ Para qué sirve ?
¿ Para qué sirve ?
Secciones ópticas: Proyecciones
# sec. en z, #imágenes
y
z
x
Universidad de Oviedo
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¿ Para qué sirve ?
El microscopio confocal
Máxima Proyección
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¿ Para qué sirve ?
El microscopio confocal
Máxima Proyección
(SPI, SCTs, Univ. Oviedo)
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¿ Para qué sirve ?
El microscopio confocal
Máxima Proyección
(Leica microsystems)
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¿ Para qué sirve ?
El microscopio confocal
Microscopio
Confocal
Universidad de Oviedo
Servicio de Proceso de Imágenes y Diseño Gráfico
¿ Para qué sirve ?
El microscopio confocal
Microscopio
Confocal
Proyecciones con animación
Servicio de Proceso de Imágenes. SCTs. Univ. Oviedo
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¿ Para qué sirve ?
El microscopio confocal
Microscopio
Confocal
Proyecciones con animación
Servicio de Proceso de Imágenes. SCTs. Univ. Oviedo
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¿ Para qué sirve ?
El microscopio confocal
Microscopio
Confocal
Proyecciones con animación
Célula neuronal. (Leica Mycrosystems)
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¿ Para qué sirve ?
El microscopio confocal
Microscopio
Confocal
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¿ Para qué sirve ?
¿ Para qué sirve ?
El microscopio confocal
Microscopio
Confocal
Pares estereoscópicos
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¿ Para qué sirve ?
¿ Para qué sirve ?
El microscopio confocal
Microscopio
Confocal
Pares estereoscópicos
Células de tejido de miocardio. ( Servicio de Proceso de Imágenes. SCTs. Univ. Oviedo)
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¿ Para qué sirve ?
El microscopio confocal
Pares estereoscópicos
Célula neuronal de la retina
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Servicio de Proceso de Imágenes y Diseño Gráfico
¿ Para
qué
sirve
¿ Para
qué
sirve
? ?
El microscopio confocal
Microscopio
Confocal
Pares estereoscópicos
Pares estereoscópicos con animación
Estambre de mimosa. ( Servicio de Proceso de Imágenes. SCTs. Univ. Oviedo)
Universidad de Oviedo
Servicio de Proceso de Imágenes y Diseño Gráfico
¿ Para
qué
sirve
¿ Para
qué
sirve
? ?
El microscopio confocal
Microscopio
Confocal
Pares estereoscópicos
Pares estereoscópicos con animación
Materiales. (Leica Mycrosystems)
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Ventajas
1- Mayor resolución
2- Mayor contraste
3- Realización secciones ópticas
4- Reconstrucciones 3D
5- Reconstrucciones 4D
6- Procesamiento y análisis de imágenes
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Desventajas
1- Velocidad de captura baja
2- Señal inferior por el pinhole de detección
3- Utilización de láseres
4- Tiempos de exposición elevados
5- Anticuerpos secundarios buenos y a diluciones bajas
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¿ Para qué sirve ?
El microscopio confocal
ESTUDIOS DE COLOCALIZACIÓN
Colocalización
Identificación de dos meléculas con idéntica localización física.
Ejemplo:
Vinculina (complejo de las adhesiones focales): proteína del citoesqueleto
localizada en las placas de las adhesiones focales. Está involucrada en el
anclaje de las moléculas de integrina al citoesqueleto de actina.
Actina: proteína que forma los microfilamentos del citoesqueleto.
Alexa Fluor 568 (Vinculina)
Alexa Fluor 488 (Actina)
Colocalización
(OLYMPUS. Aplicaciones microscopio láser confocal)
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¿ Para qué sirve ?
Problemas:
El microscopio confocal
ESTUDIOS DE COLOCALIZACIÓN
* Resolución del equipo
* Fluorocromos (cruce de canales)
Ventajas uso del Confocal en estudios de colocalización
1-aumento de resolución: 200 nm.
(En la realidad es de 400-600 nm debido a alineación del equipo, fluctuaciones en el
índice de refracción, aberraciones ópticas y preparaciones incorrectas de la muestra.)
2- Confocalidad: secciones ópticas de un plano focal. No importa que la muestra sea de
un corte fino (5 micras) o un corte grueso.
3- Sistema de detección. Eliminar cruce de canales o realizar una detección simultanea.
4- Uso de objetivos Plan-apocromáticos: correcciones cromáticas
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El microscopio confocal
¿ Para qué sirve ?
ESTUDIOS DE COLOCALIZACIÓN
Mapa de colocalización
o
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Canal 1
o
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o
o
o
Canal 2
Colocalización
Universidad de Oviedo
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¿ Para qué sirve ?
El microscopio confocal
ESTUDIOS DE COLOCALIZACIÓN
Máscaras
Muestra: fibroblastos de piel de ciervo Muntiaco de la India. Alexa Fluor 488 (Actina) y
Alexa Fluor 568 (vinculina)
a) Citofluorograma: definir una región de interés (recuadro blanco).
b) Máscara de los píxeles con solapamiento de ambas señales.
c) Imágenes con dos colores con superposición de la máscara en blanco.
a
b
c
(OLYMPUS. Aplicaciones microscopio láser confocal)
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¿ Para qué sirve ?
Estudio de microrelieves
Luz reflejada. Campo de los materiales
Servicio de Proceso de Imágenes. SCTs. Univ. Oviedo
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¿ Para qué sirve ?
Estudio de microrelieves
Luz reflejada. Campo de los materiales
(Javier Rios. Dept. Física. Univ. Oviedo)
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¿ Para qué sirve ?
Estudio de microrelieves
Luz reflejada. Campo de los materiales
(Servicio de Proceso de Imágenes. SCTs. Univ. Oviedo)
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¿ Para qué sirve ?
Estudio de microrelieves
Luz reflejada. Microtopografía
(Servicio de Proceso de Imágenes. SCTs. Univ. Oviedo)
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¿ Para qué sirve ?
El microscopio confocal
FRET, FRAP y FLIP
* Interacciones moleculares:
FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer
(transferencia de energía “resonante” de fluorescencia)
* Difusión de proteínas en una célula:
FRAP: Fluorescence Recovery after Photobleaching
(recuperación de fluorescencia tras blanqueado)
FLIP: Fluorescence Loss in Photobleaching
(pérdida de fluorescencia en el blanqueado)
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El microscopio confocal
FRET-Fluorescence Resonance Energy Transfer
Principio:
Transferencia directa de energía de un fluorocromo (donante) a otro (receptor).
Donante: fluorocromo que se excita en una longitud de onda y emite una fluorescencia
Receptor: fluorocromo que se excita con la longitud de onda de emisión del donante y emite
una fluorescencia.
Excitación
Donante
Receptor
Emisión
Excitación
Emisión
(Leica Microsystems)
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FRET-Fluorescence Resonance Energy Transfer
(Wouters et al. (2001) Trends Cell Biol, 11;203-211)
Microscopía Confocal
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Universidad de Oviedo
Servicio de Proceso de Imágenes y Diseño Gráfico
Microscopía Confocal
FRET
APLICACIONES
* Interacciones en señales celulares
* Formación de complejos protéicos
* Interacciones proteína-proteína
* Dinámica de membranas
* Relaciones espaciales entre moléculas
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Microscopía Confocal
FRAP y FLIP
APLICACIONES:
Análisis de la dinámica de proteinas en células vivas: movilidad de receptores, señal celular,
continuidad de membranas (reticulo endoplásmico).
Láser
(Wageningen University and Research Centre, Paises Bajos))
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Microscopía Confocal
FRAP y FLIP
(Leica Microsystems)
(Leica Microsystems)
Photobleach
time
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Nuevas tecnologías
El microscopio confocal
Leica TCS SP5 X
Microscopio confocal con
laser de luz blanca
Líneas de excitación de
470 nm a 670 nm
(Leica microsystems)
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Nuevas tecnologías
El microscopio confocal
Leica TCS LSI
Microscopio confocal
Super zoom
(Leica microsystems)
Universidad de Oviedo
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Nuevas tecnologías
El microscopio confocal
Leica TCS LSI Super zoom
Columna vertebral de pez cebra
Ojo de una larva de Drosophila
(Leica microsystems)
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Nuevas tecnologías
El microscopio confocal
Leica TCS STED
Microscopio confocal con superresolución
menor de 100 nm
(Leica microsystems)
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Nuevas tecnologías
El microscopio confocal
Leica TCS STED
(Leica microsystems)
Universidad de Oviedo
Servicio de Proceso de Imágenes y Diseño Gráfico
Nuevas tecnologías
El microscopio confocal
Olympus FV-1000
(Olympus- Fluoview 1000)
Universidad de Oviedo
Servicio de Proceso de Imágenes y Diseño Gráfico
Información complementaria
www.sct.uniovi.es
(SPI. Universidad de Oviedo)
Universidad de Oviedo
Servicio de Proceso de Imágenes y Diseño Gráfico
Información complementaria
Información complementaria
* www.sct.uniovi.es: tutoriales sobre microscopía láser confocal
* SCTs: Servicio de proceso de imágenes o www10.uniovi.es/spi:
-Fluorescence and confocal microscopy
* Leica microsystems: www.leica-microsystems.com
* Olympus: www.olympusfluoview.com