TRANS-BLOT TURBO BLOTTING SYSTEM BIORAD PNI-036 TRANS-BLOT TURBO BLOTTING SYSTEM BIORAD Versió: Elaborat: Data d’entrada en vigor: Arxiu: 0. Maite Sanz Juny 2014 PNI 036 TRANS BLOT BIORAD Aquest document pot quedar obsolet una vegada imprés Pàgina 1 de 14 TRANS-BLOT TURBO BLOTTING SYSTEM BIORAD PNI-036 DADES PRÒPIES DEL PNI Títol: UTILITZACIÓ DEL TRANS-BLOT TURBO BLOTTING SYSTEM Autor: Càrreg: Càrreg: C 03 Tècniques instrumentals Signatura de l'autor: Vist- i-plau de la direcció del centre: Nom: Data: Signatura: Centre: institut BONANOVA. Data d'implantació del PNI : Juny 2014 Índex: 1. INTRODUCCIÓ .................................................................................................. 3 2. RESPONSABILITAT .......................................................................................... 4 3. DESCRIPCIÓ ................................................................................................ 3.1 Equipo y reactivos................................................................................... 5 3.2 Panel de mandos ..................................................................................... 6 4. PROCEDIMENTS D'UTILITZACIÓ ................................................................... 7 4.1 Transferencia utilizando pack del fabricante..........……...……………….. 4.2 colocación Pack de transferencia ......................................................... 4.3 Transferencia protocolo turbo ...........................................................… 4.4 Transferencia protocolo preprogramado ...........................................… 4.5 Transferencia protocolo Nuevo ..........................................................… 4.6 Transferencia sistema tradicional.......... ...........................................… 4.7 Mantenimiento......................................... ...........................................… 5. NORMES DE SEGURETAT ………………………………………………………. 7 8 11 11 12 12 13 13 6. ANEXES 6.1 Dades tècniques .................................................................................. 14 Versió: Elaborat: Data d’entrada en vigor: Arxiu: 0. Maite Sanz Juny 2014 PNI 036 TRANS BLOT BIORAD Aquest document pot quedar obsolet una vegada imprés Pàgina 2 de 14 TRANS-BLOT TURBO BLOTTING SYSTEM BIORAD PNI-036 1. INTRODUCCIÓ Semi-Dry Western blotting es una técnica muy empleada en los laboratorios de diagnostico. Los protocolos convencionales de ésta técnica requieren un tiempo de realización superior al sistema desarrollado por Bio-Rad. Con el sistema Trans-Blot turbo se acelera el proceso sin perder rendimiento. El sistema Trans-Blot turbo esta formado por el instrumento principal con dos casetes de transferencia y kits con el material adicional necesario, que contiene papeles/membranas impregnadas en tampón de transferencia. Ambos casetes de transferencia se pueden acoplar tanto a 2 mini geles como a 1 midi gel de Biorad. Una vez cargado el casete de transferencia se pueden seleccionar los protocolos de transferencia fácilmente a través del menú de la pantalla del aparato. Este sistema muestra una gran eficiencia reduciendo el tiempo del proceso a tan solo tres minutos, sin ser necesaria la equilibración del gel tras la electroforesis. Versió: Elaborat: Data d’entrada en vigor: Arxiu: 0. Maite Sanz Juny 2014 PNI 036 TRANS BLOT BIORAD Aquest document pot quedar obsolet una vegada imprés Pàgina 3 de 14 TRANS-BLOT TURBO BLOTTING SYSTEM BIORAD PNI-036 2. RESPONSABILITAT 2.1 Tota persona que utilitzi el trans-blot turbo blotting system en el laboratori de pràctiques de l'escola és responsable de fer-ho segons la norma que a continuació s'especificarà. És, per tant, responsable de llegir, entendre i complir tots els requisits del present PNI. 2.2 El professorat que durant una pràctica del seu crèdit faci utilitzar el trans-blot turbo blotting system, serà responsable de fer complir la normativa. Estant sempre el PNI a l'abast de tots els usuaris. 2.3 Un ús inadequat o que no segueixi la normativa serà objecte de sanció, obtenint-se una qualificació negativa en el crèdit en el qual s'hagi incomplert la norma. Versió: Elaborat: Data d’entrada en vigor: Arxiu: 0. Maite Sanz Juny 2014 PNI 036 TRANS BLOT BIORAD Aquest document pot quedar obsolet una vegada imprés Pàgina 4 de 14 TRANS-BLOT TURBO BLOTTING SYSTEM BIORAD PNI-036 3. DESCRIPCIÓ 3.1 Equipo y reactivos El trans blot turbo system es un instrumento que transfiere de forma eficaz rápida y reproducible. Cada pack de transferencia contiene los materiales necesarios para transferir un mini gel, un midi gel y/o dos mini geles a la vez. Este pack esta formado por dos montones de láminas impregnadas cada uno en un tampón iónico de transferencia y la membrana de nitrocelulosa o PVDF. Estas membranas no requieren tratamiento previo. El aparato consta de dos casetes de transferencia que pueden utilizarse simultáneamente siempre que en ambos se emplee el mismo protocolo según las combinaciones descritas en la tabla 1. El tiempo de inicio puede diferir. Versió: Elaborat: Data d’entrada en vigor: Arxiu: 0. Maite Sanz Juny 2014 PNI 036 TRANS BLOT BIORAD Aquest document pot quedar obsolet una vegada imprés Pàgina 5 de 14 TRANS-BLOT TURBO BLOTTING SYSTEM BIORAD PNI-036 Las ranuras de los casetes se definen como A y B (ver Fig. 2) y ambos casetes son intercambiables en dichas ranuras y una de ellas puede permanecer vacía mientras funciona la otra. 3.2 Panel de mandos El panel de mandos consiste en una pantalla LCD en la parte frontal del equipo. Hay tres botones bajo la pantalla que permiten navegar por el menú. Otros tres botones a la derecha de la pantalla se emplean para seleccionar protocolos. Por último el teclado alfanumérico se emplea para introducir texto y números. En el menú principal hay 3 opciones disponibles: New mode: crea, inicia y guarda un nuevo protocolo. List mode: Selección de protocolos a partir de la lista de biorad. Turbo mode: acceso rápido a protocolo de transferencia para muestras de proteínas entre 5-150kDa de peso molecular. Versió: Elaborat: Data d’entrada en vigor: Arxiu: 0. Maite Sanz Juny 2014 PNI 036 TRANS BLOT BIORAD Aquest document pot quedar obsolet una vegada imprés Pàgina 6 de 14 TRANS-BLOT TURBO BLOTTING SYSTEM BIORAD PNI-036 4. PROCEDIMENTS D'UTILITZACIÓ 4.1. Transferencia utilizando packs del fabricante Recomendaciones • • • usar guantes durante todo el procedimiento para prevenir contaminaciones en geles y/o membranas. los geles deben ser transferido directamente tras la electroforesis sin equilibración. Abrir el pack en el momento en que se vaya a utilizar. Seleccione el pack de transferencia apropiado según la tabla 2. Estos packs son estables durante varios meses a temperatura ambiente, sin embargo se recomienda su almacenaje a 4ºC. ningún componente del pack requiere pretratamiento. Mini transfer pack (Un mini Gel) Contiene dos montones de láminas apiladas impregnadas en tampón, el de la derecha contiene el tampón anódico (debajo del gel) y sobre éste se encuentra la membrana. El pocillo de la izquierda contiene el montón para el cátodo (se dispondrá sobre el gel). Versió: Elaborat: Data d’entrada en vigor: Arxiu: 0. Maite Sanz Juny 2014 PNI 036 TRANS BLOT BIORAD Aquest document pot quedar obsolet una vegada imprés Pàgina 7 de 14 TRANS-BLOT TURBO BLOTTING SYSTEM BIORAD PNI-036 Midi transfer pack (Un midi Gel o dos mini geles) Contiene dos montones de láminas apiladas impregnadas en tampón, uno sobre el otro, el de la parte superior tiene una pestaña en la parte derecha y es el anódico (debajo del gel). El que corresponde al catódico tiene la pestaña en la parte izquierda y se dispone sobre el gel. 4. 2 colocar pack de transferencia en el casete • • las membranas y pilas de láminas están diseñadas para pasar del envoltorio al casete. no invertir el orden. el pack de trasferencia se debe colocar lo más centrado posible sobre el ánodo del casete. (Fig. 7) Versió: Elaborat: Data d’entrada en vigor: Arxiu: 0. Maite Sanz Juny 2014 PNI 036 TRANS BLOT BIORAD Aquest document pot quedar obsolet una vegada imprés Pàgina 8 de 14 TRANS-BLOT TURBO BLOTTING SYSTEM BIORAD • PNI-036 no se recomienda mover las láminas una vez depositadas, puede generar burbujas de aire entre las capas. En la figura 8 se representa el ensamblaje final del pack de transferencia. En las figuras 9 y 10 se representa el paso a paso para el montaje de mini y midi transfer pack respectivamente, y a continuación (Fig. 11) la disposición del gel en función de su tamaño y el pack de transferencia empleado. Versió: Elaborat: Data d’entrada en vigor: Arxiu: 0. Maite Sanz Juny 2014 PNI 036 TRANS BLOT BIORAD Aquest document pot quedar obsolet una vegada imprés Pàgina 9 de 14 TRANS-BLOT TURBO BLOTTING SYSTEM BIORAD PNI-036 4.3 Transferencia usando el protocolo Turbo Versió: Elaborat: Data d’entrada en vigor: Arxiu: 0. Maite Sanz Juny 2014 PNI 036 TRANS BLOT BIORAD Aquest document pot quedar obsolet una vegada imprés Pàgina 10 de 14 TRANS-BLOT TURBO BLOTTING SYSTEM BIORAD PNI-036 El botón “turbo” accede directamente al programa “Mixed MW”, diseñado para transferencia eficiente de una gran variedad de mezclas de proteínas. Procedimiento: 1. encender el aparato. 2. Pulsar el botón turbo. 3. elegir la opción de número y tipo de gel que corresponda con los botones de la derecha. Mini protean TGX gel pueden transferirse utilizando el protocolo para 1 mini gel o el protocolo para 1 mini protean TGX gel. 4. Pulsa el botón A:RUN para el casete en la ranura A o B:RUN para el casete en la ranura de abajo, si se transfieren los dos casetes de forma simultanea debe ser con el mismo protocolo. 5. El protocolo se inicia de forma automática y las condiciones y progreso aparecen en la pantalla. 6. Cuando el protocolo termina aparece el mensaje “run complete”. 4.3.1 Desensamblaje y retirada de membrana Para retirar la membrana tener precaución, el casete puede quemar. 1. Abrir el casete, descartar el montón de láminas superior. 2. Retirar la membrana y proceder con ella según protocolo posterior (tinción , bloqueo, etc.) 3. Descartar montón de láminas inferior. 4. Retirar exceso de tampón. 5. lavar base y tapa con agua desionizada y secar con papel. 4.4 Transferencia usando un protocolo preprogramado. Todos los pasos son iguales a los descritos en el apartado 4.3 y 4.3.1 excepto el paso 2 del apartado 4.3: 2. Pulsar el botón LIST y escoger entre los protocolos disponibles descritos en la tabla 3. Versió: Elaborat: Data d’entrada en vigor: Arxiu: 0. Maite Sanz Juny 2014 PNI 036 TRANS BLOT BIORAD Aquest document pot quedar obsolet una vegada imprés Pàgina 11 de 14 TRANS-BLOT TURBO BLOTTING SYSTEM BIORAD PNI-036 4.5 Transferencia usando un nuevo protocolo. 1. En la pantalla principal pulsa el botón NEW. aparece la pantalla de edición. 2. Definir los parámetros voltaje (máximo 25V), corriente (máxima 2.5A) y tiempo (max 90minutos) usando el teclado alfanumérico. 3. Este protocolo se puede guardar bajo un nombre y aparecerá posteriormente en LIST , USER-DEFINED protocols. 4.6 Transferencia usando sistema semi-Dry tradicional. 1. Equilibrar el gel en tampón Towbin (25mM Tris, 192mM Glycina pH 8.3, 20% MeOH) durante 10 minutos. 2. Sumergir dos piezas de papel de filtro extra-Thick (2.4mm) o 6 de Thick (0.8mm) en tampón de transferencia. 3. sumergir la membrana en metanol durante 30 segundos. lavar 1 o 2 minutos con agua y equilibrar en tampón de transferencia en agitación 10 minutos. 4. montar el sandwich de transferencia. Fig. 19. 5. cerrar el casete de transferencia e introducirlo en la ranura. 6. seleccionar LIST del menú principal y protocolo STANDARD SD de la lista de protocolos pre programados de Bio Rad. 7. pulsar RUN. Versió: Elaborat: Data d’entrada en vigor: Arxiu: 0. Maite Sanz Juny 2014 PNI 036 TRANS BLOT BIORAD Aquest document pot quedar obsolet una vegada imprés Pàgina 12 de 14 TRANS-BLOT TURBO BLOTTING SYSTEM BIORAD PNI-036 4.7 Mantenimiento El trans blot turbo system requiere poco mantenimiento. Después de terminar de usarlo lavar cada casete, base y tapa, con agua desionizada hasta eliminar sales residuales y prevenir depósitos. Secar el casete ante de guardarlo. Esporádicamente se pueden limpiar los componentes con agua y detergente suave, no abrasivo ni solventes orgánicos y comprobar que el ventilador de refrigeración esta libre de residuos y suciedad. 5. NORMES DE SEGURETAT En principio el sistema de transferencia turbo Blot no es un aparato peligroso por lo que la única consideración a tener en cuenta es que su empleo debe seguir lo descrito en este protocolo. Versió: Elaborat: Data d’entrada en vigor: Arxiu: 0. Maite Sanz Juny 2014 PNI 036 TRANS BLOT BIORAD Aquest document pot quedar obsolet una vegada imprés Pàgina 13 de 14 TRANS-BLOT TURBO BLOTTING SYSTEM BIORAD PNI-036 6. ANNEXES 6.1. DADES TÈCNIQUES Trans-Blot ® Turbo TM Instrument Dimensiones: (L x W x H) 26 x 21.1 x 20.4 cm Peso: 8lb con casetes 4.5 lb sin casetes Potencia de entrada: 100-240 VAC, 276VA 50-60Hz 175 W max Fusibles: dos 6.3 A, 250V Fusibles localizados sobre la conexión de alimentación Puerto USB: Si, solo de entrada para actualizaciones del sistema. Ventilador de refrigeración: si Potencia de salida: 0-26 VAC (incremento de 1V), 0-2.6 A DC (incremento de 0.1A) para cada casete. Condiciones de uso: 15-31ºC de temperatura, 0-95% humedad relativa. Trans_Blot ® Turbo TM cassettes Dimensiones: (L x W x H) 20.2 x 16.0 x 4.5 cm Ánodo: electrodo en placa de titanio platinizado Cátodo: acero inoxidable Peso: 1.5lb N º sèrie 690BR006724 Nº etiqueta 2087 Versió: Elaborat: Data d’entrada en vigor: Arxiu: 0. Maite Sanz Juny 2014 PNI 036 TRANS BLOT BIORAD Aquest document pot quedar obsolet una vegada imprés Pàgina 14 de 14
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