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Protocolo de iniciación
PCR
a tiempo real
CERTEST Biotec, S.L.
Pol. Industrial Río Gállego II, Calle J, Nº 1,
50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPAIN)
www.certest.es
Protocolo de iniciación PCR a tiempo real
Objetivo
El objetivo de este protocolo es facilitar la formación de personal técnico de laboratorio en
la realización de pruebas diagnósticas moleculares basadas en la técnica PCR a tiempo
real o qPCR a partir de muestras fecales. El uso de los test “RNA-DNA Viasure Extraction
Kit” y “Viasure Pathogen Real Time PCR Detection Kit”, en combinación con los signos
y síntomas presentados por los pacientes, permitirá al personal sanitario especializado
establecer un diagnóstico clínico.
Para una información más detallada puede consultarse las instrucciones de cada kit:
“RNA-DNA Viasure Extraction Kit” y “Viasure Pathogen Real Time PCR Detection Kit”.
Para desarrollar de manera correcta las actividades mencionadas es necesario adaptar
las instalaciones con el equipamiento adecuado y establecer áreas diferenciadas donde se
realizarán cada una de las diferentes etapas del proceso. Es recomendable mantener un
flujo de trabajo unidireccional.
La unidad de diagnóstico molecular se compone de 4 zonas:
Área Extracción
Ácidos Nucleicos
Área Pre - PCR
Área amplificación
e interpretación de
resultados
Área “Set-­up” PCR
Procesamiento de
muestras.
Reconstituir el número
de pocillos necesarios.
Reconstituir control
positivo liofilizado.
Extracción de DNA/RNA
con kit comercial manual
o sistema automático
(Opcional).
Añadir control negativo.
Añadir DNA/RNA
extraído de cada
muestra.
Colocar las tiras en el
equipo de PCR a tiempo
real.
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Añadir control positivo.
Sellar los pocillos
con tapones ópticos.
Programar termociclador
e iniciar el protocolo.
Análisis de resultados
con sofware propio del
equipo.
Recomendaciones
Es importante destacar que la PCR a tiempo real o qPCR es una herramienta de diagnóstico molecular
altamente sensible y específica por lo que es estrictamente necesario mantener unas normas de higiene,
orden y seguridad, con el fin de evitar posibles contaminaciones que podrían afectar gravemente al
desarrollo de la prueba.
El personal del Laboratorio de Biología Molecular debe contar con una indumentaria exclusiva en cada
una de las zonas de trabajo.
Es recomendable la desinfección al inicio del proceso y tras el uso de los equipos.
• Soluciones desinfectantes comerciales.
• Etanol 70%.
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Área Extracción Ácidos Nucléicos
Esta primera área
tiene como objetivo
el procesamiento
de muestras
potencialmente
infecciosas y su
posterior extracción
y purificación de
ácidos nucleicos con
el kit “RNA-DNA
Viasure Extraction
Kit”. Por ello se
establece como zona
de riesgo biológico
y se recomienda
situar todos los
equipos en cercanía
para minimizar los
desplazamientos.
El equipamiento requerido
para esta área se divide en
dos grupos:
A
Equipamiento
básico:
•Campana de bioseguridad
•Material
EPI:
Guantes
desechables (sin polvo),
bata, mascarilla, gorro.
•Micropipetas (20 – 200 µL
y 100 – 1000 µL) (Uso
exclusivo para zona de
riesgo biológico).
•Puntas con filtro.
•Gradillas tubos 1,5 – 2,0 ml
(Uso exclusivo para zona de
riesgo biológico).
B
Equipamiento
asociado al kit de
extracción:
•Vórtex.
•Microcentrífuga viales 2 ml
(>11.000 rpm).
•Termobloque.
En esta área utilizaremos
el “RNA-DNA Viasure
Extraction Kit”.
El orden de ejecución y los
componentes que usaremos
se detallan en el cuadro
adjunto.
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS FECALES
• Homogeneizar la muestra fecal y transferir 100 µL / 100 mg en un
vial de 2 ml con 200 µL de agua libre de RNAsa/DNAsa, PBS o suero
fisiológico.
• Vortear la muestra 30 s y centrifugar 1 min a 13.000 x g (13.000 rpm).
PROTOCOLO “Viasure RNA/DNA Extraction Kit”
PASO 1. LISADO DE MUESTRAS
• Transferir 200 µl del sobrenadante al tubo “2.0 ml Collection-Tube”
(Evitar la aspiración de partículas en suspensión).
• Añadir 200 µl de “Lysis Buffer” y 20 µl de “Proteinase K”, vortear
vigorosamente.
• Incubar 10 min a 65°C y posteriormente 10 min a 95ºC.
PASO 2. UNIÓN DNA/RNA A LA COLUMNA
• Añadir 260 µl de “Binding Buffer” y mezclar por pipeteo o vórtex.
• Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 5 min.
• Transferir el lisado a la columna “Mini Spin Column Set”.
• Centrifugar 1 min a 11.100 x g (11.000 rpm).
• Descartar el filtrado y el “RTA Collection Tube”.
• Colocar la columna “Mini Spin Column” en un nuevo “RTA Collection
Tube”.
PASO 3 y 4. PRIMER Y SEGUNDO LAVADO
• Añadir 600 µl de “Wash Buffer I”.
• Centrifugar 1 min a 11.100 x g (11.000 rpm).
• Descartar el filtrado y el “RTA Collection Tube”.
• Colocar la columna “Mini Spin Column” en un nuevo “RTA Collection
Tube”.
• Añadir 700 µl de “Wash Buffer II”.
• Centrifugar 1 min a 11.100 x g (11.000 rpm). Descartar el filtrado y
colocar la columna “Mini Spin Column” en el mismo ”RTA Collection
Tube”.
• Repetir el paso de lavado con 700 µl de “Wash Buffer II”.
• Centrifugar 1 min a 11.100 x g (11.000 rpm). Descartar el filtrado y
colocar la columna “Mini Spin Column” en el mismo ”RTA Collection
Tube”.
PASO 5. ELIMINACIÓN DE RESIDUOS DE ETANOL
• Centrifugar 5 min a 11.100 x g (11.000 rpm) para eliminar el etanol
residual.
• Descartar el filtrado y el “RTA Collection Tube”.
PASO 6. ELUCIÓN DE DNA/RNA
• Colocar la columna “Mini Spin Column” en el tubo estéril “1,5 ml
Collection Tube”.
• Añadir 100 µl de “Elution Buffer” (previamente precalentado a 65°C).
• Incubar 1 min a temperatura ambiente.
• Centrifugar 1 min a 11.100 x g (11.000 rpm).
• Descartar la columna “Mini Spin Column”.
• Cerrar el “1.5 ml Collection Tube” y almacenar la muestra de DNA/RNA
a 4°C para un uso inmediato o preservar de -20°C a -80°C para períodos
mas prolongados.
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Área Pre-PCR
El área de pre-PCR se
recomienda mantener
libre de cualquier tipo
de material biológico,
para evitar así posibles
contaminaciones que
interfieran en los
resultados del test.
El equipamiento requerido
para esta área es el siguiente:
• Separar el número de reacciones/pocillos
necesarios (incluyendo las muestras
y los dos pocillos reservados para el
control positivo y negativo que deben ser
siempre incluidos en cada ensayo).
• En caso necesario, recortar con unas
tijeras el número de pocillos requeridos.
• Retirar el aluminio protector.
Equipamiento básico:
•Campana de flujo laminar.
•Material
EPI:
Guantes
desechables (sin polvo),
bata, mascarilla, gorro.
•Micropipeta (2 – 20 
µL)
(Uso exclusivo para la
rehidratación de los pocillos
y la adición del control
negativo).
•Puntas con filtro.
•Tijeras.
•Gradillas tubos 0,1 – 0,2 ml.
• Reconstituir cada uno de los pocillos con
15 µL del tampón de rehidratación (vial
azul).
• Añadir 5 µL del control negativo (vial
morado) en el pocillo reservado para
control negativo.
En esta área utilizaremos
el test “Viasure Pathogen
Real Time PCR Detection
Kit”.
El orden de ejecución y los
componentes que usaremos se
detallan en el cuadro adjunto.


Tras este proceso trasladaremos los pocillos rehidratados
al área “Set-up” PCR.
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Área “Set-up” PCR
El área “Set-Up” PCR es la
zona donde se realizan dos
procesos independientes:
A
Rehidratación del control
positivo.
B
Adición a los pocillos
rehidratados de los ácidos
nucleicos y el control
positivo.
El riesgo biológico no es potencialmente
infeccioso para el personal del
laboratorio,
pero
se
aconseja
mantener esta zona correctamente
limpia y desinfectada para evitar
contaminaciones que comprometan
el resultado del test.
Aunque es recomendable mantener
zonas diferenciadas (Extracción de
ácidos nucleicos, pre-PCR y “SetUp” PCR), esta área podría ser
compartida con el área pre-PCR (área
2) manteniendo la precaución de
limpiar correctamente la campana
entre ambos procesos y diferenciar el
uso de pipetas (1ª Pipeta 2 – 20 µL:
Uso para el tampón de rehidratación y
control negativo, 2ª Pipeta 2 – 20 µL:
Uso para ácidos nucleicos y control
positivo).
Equipamiento básico:
•Campana de flujo laminar.
•Material EPI: Guantes desechables
(sin polvo), bata, mascarilla, gorro.
•Micropipeta
(2 – 20 µL)
(Uso
exclusivo para la adición de los
ácidos nucleicos y el control
positivo).
•Puntas con filtro.
•Tijeras.
•Gradillas tubos 0,1 – 0,2 ml.
En esta área utilizaremos el test
“Viasure Pathogen Real Time
PCR Detection Kit”.
El orden de ejecución y los
componentes que usaremos se
detallan en el cuadro adjunto.
A- REHIDRATACIÓN DEL CONTROL
POSITIVO
El test “Viasure Pathogen Real Time
PCR Detection Kit” suministra un control
positivo que es necesario rehidratar
para su posterior uso en cada ensayo.
Debido a que contiene una gran cantidad
de copias molde del patógeno, se
recomienda abrirlo y manipularlo antes
de comenzar el ensayo.
Posteriormente, limpiar la zona con
soluciones desinfectantes comerciales
y/o etanol 70%.
No olvidar desechar los guantes
empleados al finalizar esta tarea.
• Reconstituir el control positivo (vial rojo)
con 100 µL de agua libre de RNAsa/
DNAsa (vial blanco) y mezclar con la
ayuda del vórtex.
• Almacenar a -20ºC tras su resuspensión.
• Separar en alícuotas para minimizar los
ciclos de congelación y descongelación.
B- Adición a los pocillos
rehidratados de los ácidos
nucleicos y el control
positivo
• Añadir 5 µL del DNA/RNA extraído
de cada muestra en los pocillos
rehidratados (a excepción de los dos
pocillos reservados para añadir el
control negativo y positivo).
• Añadir 5 µL del control positivo
reconstituido (vial rojo) en el pocillo
reservado para control positivo.
• Separar el número de tapones ópticos
necesarios y cerrar los pocillos.
• En caso necesario, recortar con unas
tijeras el número de tapones ópticos
requeridos con la precaución de no
tocar la parte interna con los guantes.
Tras este proceso trasladaremos nuestra placa/tira,
ya cerrada, al equipo de PCR a tiempo real.
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Área Amplificación e Interpretación de Resultados
El área de amplificación
e interpretación de
resultados es la zona
donde se encuentran
ubicados el equipo
y sus componentes
asociados. Se
recomienda situarlo en
cercanía al área
“Set-Up” para minimizar
los desplazamientos.
• Colocar la tira/placa en el termociclador.
• Se recomienda colocar el mismo número de tiras/pocillos a ambos lados
del bloque del termociclador con el fin de compensar el equipo.
• Programar el termociclador e iniciar el protocolo.
Equipamiento básico:
•Equipo PCR en tiempo real.
•Ordenador.
En esta área utilizaremos
el test “Viasure Pathogen
Real Time PCR Detection
Kit”.
El orden de ejecución y los
componentes que usaremos
en esta área se detallan en el
cuadro adjunto.
PROTOCOLO TÉRMICO DNA
PROTOCOLO TÉRMICO RNA
Nº Ciclos
Tiempo
Temperatura
Nº Ciclos
Tiempo
Temperatura
1
2 min
95ºC
1
15 min
45ºC
10 s
95ºC
1
2 min
95ºC
50 s
60ºC* 
10 s
95ºC
50 s
60ºC* 
45
45
* Recolección de datos
Análisis de los resultados
con el software propio del equipo
Patógeno
Control
interno
Control
negativo
Control
positivo
+
+
-
+/- *
+
+
-
+
-
+
+
+
-
Interpretación
Patógeno Positivo
Patógeno Negativo
Inválido
Inválido
* La detección del control interno no es necesaria en caso de muestras
altamente positivas. Un elevado número de copias del patógeno
presentes en la muestra puede conducir a una señal débil o ausente
en el control interno.
CERTEST Biotec, S.L.
Pol. Industrial Río Gállego II, Calle J, Nº 1,
50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPAIN)
www.certest.es
Real Time PCR Detection Kits • Version: SP 1507