1. No category

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE NICARAGUA
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLOGICAS
SECCION DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR
PRIMER SEMESTRE 2015
COLECTIVO DOCENTE DE BIOQUIMICA
Y BIOLOGIA MOLECULAR
REVISION: ENERO, 2015
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Estimado estudiante (a):
El colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular te damos la bienvenida y te
invitamos a la comprensión de los procesos metabólicos a nivel del organismo desde el
punto vista molecular.
La Bioquímica lleva a profundizar en los componentes de la vida, el funcionamiento de la
célula y sus respuestas ante un cambio en las condiciones intra y extracelulares. Es una
asignatura que les permitirá comprender el funcionamiento del ser humano en
situaciones de salud y enfermedad.
El conocimiento de la Bioquímica es una base indispensable para el desarrollo de
capacidades, habilidades y destrezas que van adquirir los futuros médicos(as) en el
cuidado de la salud, dado que cada vez es más frecuente que las enfermedades se
refieran en términos moleculares.
En la asignatura de Bioquímica el estudiante desarrolla las capacidades de análisis y
explicación de los procesos metabólicos de los componentes fundamentales del
organismo, para la comprensión de los aspectos moleculares, metabólicos, fisiológicos y
patológicos del cuerpo humano.
En las Prácticas de Laboratorio de Bioquímica se toma en cuenta la filosofía del
Aprendizaje Cooperativo (AC) ya que en la conformación de tres estaciones de trabajo
por cada subgrupo,
fomenta la construcción colectiva de conocimiento y, permite
construir juntos, aprender juntos, cambiar juntos, mejorar juntos.
Los y las estudiantes deben asumir responsabilidades en su propio proceso de
aprendizaje. Esta metodología concede un papel muy relevante al estudiante en la
construcción del conocimiento a partir de pautas, actividades propuestas en cada una de
las prácticas a realizarse.
Las tareas que se realizan en el Aprendizaje Cooperativo buscan establecer relaciones
de interdependencia, solidaridad y conjunción de esfuerzos entre los miembros de cada
estación de trabajo y a nivel de cada subgrupo, de manera que se tenga conciencia, tanto
de pertenecer a un ―algo‖ común, como de la necesidad de trabajar por el bien del mismo,
de forma ética y responsable
1
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
En definitiva, en las prácticas no se pretende solamente consolidar aspectos teóricos sino
también se quiere favorecer la llamada ―transferencia del aprendizaje‖, es decir, que los
conocimientos adquiridos en las mismas pueda ser útil en otras situaciones de la vida.
Lo que se pretende en cada uno de los escenarios del proceso de enseñanza aprendizaje es lograr
la implicación de todos los estudiantes en su propio proceso de aprendizaje a través de un objetivo
de aprendizaje común.
Por lo tanto, los estudiantes deben estar claros y conscientes que al finalizar una práctica no sólo
es presentar un informe, sino que cada estudiante conozca mejor su propio estilo de aprendizaje,
confrontado con los estilos de otros compañeros, y desarrollando otras formas de pensamiento,
métodos de trabajo y organizativos de los utilizados por otros miembros del grupo.
Un informe de laboratorio de bioquímica bien escrito es vital para los y las estudiantes, esto
demostrará la comprensión de la práctica, así como la forma en que el laboratorio se aplica a los
principios aprendidos durante el desarrollo de los aspectos teóricos.
El resultado final del trabajo cooperativo, es fruto de una elaboración conjunta, que debe recoger
el proceso de aprendizaje vivido por el grupo. Por eso en la construcción del informe se trata de
las aportaciones de todos y cada uno de los miembros del equipo; no es una ―adición de las
partes‖, sino de la complementariedad e integración de las mismas.
El informe se debe presentar en hojas de papel blanco tamaño utilizando un procesador de texto
como Word. Si el informe es hecho a mano, la letra debe ser legible, sin enmendaduras y debe
evitarse el uso de correctores. El informe no debe de exceder de 5 páginas.
Contenido:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Portada
Objetivos
Procedimiento (Breve descripción de la realización de la práctica en párrafo)
Resultados
Análisis y discusión de los resultados
Conclusiones
Bibliografía
2
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Descripción breve del contenido
1. Portada: La información que se debe anotar en la portada es la siguiente:
a. Nombre de la Universidad, facultad, departamento, sección
b. Título de la práctica realizada
c. Nombres y número de carnet de los estudiantes que presentan el informe
d. Nombre del profesor responsable del subgrupo
e. Ciudad y fecha
2. Objetivos: Son los propósitos que se persiguen al realizar la práctica de laboratorio.
3. Introducción
Antecedentes previos relacionados con el experimento, teoría o descripción simple de la práctica
a realizar. La extensión de esta sección se recomienda hacerla de media página.
4. Procedimiento
Descripción clara de cómo realizaran la práctica para obtener los resultados. La extensión de esta
sección depende de la práctica de laboratorio. La redacción debe estar en párrafos. No copiar
literalmente los que aparecen en cada una de las prácticas.
5. Resultados
Presentación de los resultados obtenidos, en la forma de figuras, tablas y/o gráficos si es
necesario. Las tablas y gráficos deben ser enumerados secuencialmente de acuerdo a la práctica
realizada. Es importante tomar en cuenta que en el informe debe contener solamente resultados
que contribuyan a la discusión y análisis posterior.
6. Análisis y discusión de resultados
Deben ser en función del o los objetivos propuestos. Es importante que la discusión considere la
calidad de los datos obtenidos y sus intereses, de modo tal que se pueda comparar los mismos en
diferentes condiciones fisiológicas y patológicas; esto dependerá de la práctica de laboratorio a
realizarse. Debe estar escrita con frases simples y sustantivas, que no abunden en demasiados
adjetivos.
7. Conclusiones
Parte final que resalta los resultados obtenidos, en confrontación con los que permitan
eventualmente mejorar los objetivos propuestos.
3
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Aquí se trata del análisis de los resultados obtenidos a la luz de los comportamientos o valores
esperados teóricamente. Específicamente las conclusiones se hacen con base en la comparación
entre los resultados obtenidos y los valores teóricos que muestra la literatura Bioquímica,
exponiendo las causas de las diferencias y el posible origen de los datos obtenidos.
8. Bibliografía
Se consigna la bibliografía consultada y de utilidad en la elaboración del informe. La bibliografía de
libros y/o artículos debe ajustarse a las normas establecidas por el estándar elaborado por la
Asociación Estadounidense de Psicología (American Psychological Association), APA versión 6.
4
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Práctica 1: Laboratorio Introductorio
1. Temas de Autoestudio:
 Normas Básicas de seguridad del laboratorio
 Clasificación de la cristalería
 Uso de equipos y cristalería del laboratorio
 Preparación de soluciones porcentuales
2. Objetivos:
 Familiarizar al estudiante con las prácticas de laboratorio de Bioquímica.
 Apropiarse de las normas de seguridad utilizadas en el laboratorio de Bioquímica.
 Identificar los distintos tipos de cristalería y equipos utilizados en un laboratorio de
Bioquímica.
 Aprender a manipular los distintos tipos de cristalería utilizados en un laboratorio
para la preparación de soluciones.
3. Introducción
El laboratorio se considera un lugar donde el trabajo en equipo se facilita, da lugar a un
proceso de constante integración, comunicación, investigación, construcción de ideas,
surgimiento de preguntas en fin, donde las actividades experimentales propiciarán la
reorganización de conocimientos y alcanzar un aprendizaje significativo.
Durante el desarrollo de las Prácticas de Laboratorios en Bioquímica se pueden llegar a
utilizar sustancias o muestras biológicas que en ocasiones representan riesgos
potenciales a la salud, debido a que pueden ser corrosivas, reactivas, explosivas, tóxicas,
inflamables o biológicas infecciosas.
Aunque los laboratorios se consideran en general lugares de trabajo seguros esto es así
cuando conocemos las normas de seguridad existentes en la materia, esto nos permite
identificar los peligros y disminuir los riesgos.
5
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
4. Metodología
Previa la realización del laboratorio se les recomienda a los estudiantes leer y analizar la
guía, apropiarse de las normas básicas de seguridad del laboratorio, luego completar el
cuadro de la cristalería y equipos con sus respectivos usos de tal forma que le facilite el
reconocimiento de los mismos durante la práctica.
Al inicio del laboratorio se conformaran 3 estaciones de trabajo por cada subgrupo, los
cuales de manera alternada harán las actividades propuestas de tal forma que todos y
todas las estudiantes tengan la oportunidad de aprender a manipular los distintos tipos de
cristalería, equipos y se logre la mayor participación de los mismos en pro de un
aprendizaje significativo y cooperativo.
Normas de Seguridad:
1. Siempre utilizar gabachas.
2. Cuando se trabaja con ácidos, álcalis o sustancias que desprenden vapor, utilizar
guantes y anteojos.
3. No oler los reactivos en forma directa, hacerlo usando la mano.
4. No saborear sustancia alguna.
5. No frotarse los ojos con las manos contaminadas.
6. No pipetear directamente con la boca, especialmente sustancias tóxicas.
7. No comer, beber ni fumar en el laboratorio.
8. No mezclar reactivos sin antes conocer sus propiedades.
Las soluciones son mezclas estables homogéneas formadas por la disolución de los
constituyentes en proporciones variables. Están formados por dos componentes
fundamentales: Soluto y Solvente. El solvente más común e importante es el agua.
Concentración: Podemos decir que expresa la cantidad de sustancias disueltas en una
determinada cantidad de solución. Existen las siguientes formas principales de expresar la
concentración:
Concentración en por ciento: Es el número de gramos de soluto diluido en 100 gramos de
la solución. También puede ser el número de gramos de soluto, diluido en 100 mililitros de
la solución (% peso/volumen).
6
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
5. Materiales y equipos
Materiales: Tubos de ensayos, gradilla, soporte universal, espátula, vaso de precipitado,
matraz de Erlenmeyer mechero, balones, matraces, probetas, pipetas, micropipetas,
puntas de plásticos descartable para las micropipetas, gradilla, morteros, embudos, vidrio
de reloj, tubo vacutainer 4 ml, con EDTA, jeringa descartable de 5cc, torniquete de hule,
algodón, sal, sacarosa y alcohol.
Equipos: Horno, baño María, centrífuga, balanza manual.
6. Procedimientos
1. Uso de la balanza manual: Preparación de una solución NaCl al 5% y sacarosa
al 2%
 Verifique que la balanza se encuentra sobre una superficie perfectamente
nivelada.
 Coloque el vidrio reloj y péselo en la balanza manual.
 Tome una espátula pequeña limpia y deposite poco a poco los 5 gramos de NaCl
a pesar.
 Los 5 gramos de NaCl deposítelos en un matraz aforado de 100 ml y adicione
H2O hasta completar la preparación de la solución.
 Realice el mismo procedimiento para la preparación de la sacarosa al 2%.
2. Uso de centrífuga clínica: Obtención de plasma sanguíneo







Extraer 3 ml de sangre por cada estación de trabajo y depositarlo en el tubo que
contiene EDTA (Vacutainer).
Introduzca el tubo con sangre debidamente rotulado en una de las camisas de la
centrífuga.
Introduzca un tubo con igual volumen de agua en laposición opuesta.
Mueva la manija reguladora de velocidad hasta la posición que indica 4000 rpm.
Espere 5 minutos.
Regrese la manija reguladora hasta cero.
Espere hasta que la centrífuga haga alto total.
7
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
 Saque ambos tubos y cierre la tapa de la centrífuga.
 Desconecte de la red eléctrica.
3. Uso de pipetas de volumen ajustable: Dispensado de 10ul, 20ul, 50ul, 100ul de
agua destilada.
Nota: Estos instrumentos son sumamente delicados y muy costosos. Si usted
muestra negligencia en la aplicación de las instrucciones que se indican y daña
alguna micropipeta, usted tiene que asumir el costo.

Tome la micropipetacuyo rango mejor se corresponda con el volumen que va a
dispensar.
Ajuste muy suavemente al volumen correspondiente, girando muy suavemente el
pistón.
Tome la punta de pipeta que mejor se corresponda con el volumen a dispensar e
inserte a presión moderada.
Introduzca el extremo de la punta en el líquido (unos 5 mm, nunca toda la
punta).
Para medir el volumen deseado presione el pistón suavemente hasta el primer
tope (usted sentirá una pequeña resistencia), libere suavemente el pistón!!
Ahora, para transferir el volumen medido, apoye la punta de la pipeta sobre la
pared del tubo.
Presione el pistón muy suavemente hasta el fondo (segundo tope).
Sin retirar el dedo del pistón retire la punta del tubo y libere el pistón.







7. Preguntas para orientar la discusión
1. ¿Por qué es importante conocer las normas de seguridad básicas del laboratorio de
Bioquímica?
2. ¿Cómo se clasifica la cristalería?
3. ¿Cuál es el uso de los equipos y cristalería que se le presenta en la práctica?
4. ¿Por qué es necesario la medición correcta en la preparación de las soluciones?
5. Investigue: ¿Cuáles son los componentes del plasma? Diferencia entre suero y
plasma, ejemplos de pruebas clínicas que pueda usar con el plasma y/o suero.
6. ¿Cuáles son las ventajas del uso de micropipetas en los laboratorios de Bioquímica?
7. ¿Cuáles son los pasos para el uso correcto de las micropipetas
8
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
8. Realice un CQA del laboratorio (C- ¿Qué conocía? Q- ¿Qué quería aprender? A¿Qué aprendió?
8. Evaluación
Esta actividad tiene un valor de 100 puntos, sobre la base de los siguientes criterios: 20%
preparación previa, 30% ejecución de la práctica, 30% discusión de resultados y
correlación teórica y 20% entrega de reporte.
9. Bibliografía
4. http://books.google.com/books?id=9bxGX9SGJvIC&pg=PA9&dq=cristaleria+quimica&
hl=es&ei=EFNtTePWH8fogQev3biMBA&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=9&v
ed=0CFIQ6AEwCDgK#v=onepage&q&f=false
5. www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/file.php/84/...1.../Bioseguridad.pdf
6. sistemamid.com/panel/uploads/.../2014-07-21_03-57-39107474.pdf
7. http://cvb.ehu.es/open_course_ware/castellano/salud/tecnicasmol/guia-sobre-normasde-trabajo-problemas-habituales-y-su-solucion.pdf (Normas de trabajo)
8. http://www.medvet.una.ac.cr/carrera/mva505_Practica1.pdf (Uso de micropipetas
9
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y MATERIALES
BÁSICOS EN BIOQUIMICA
NOMBRE
FUNCIÓN
MINICENTRÍFUGA
CENTRIFUGA
HORNO
ESPECTROFOTÓMETRO
UV-VIS
10
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
BALANZA MANUAL
pH-METRO
MICROPIPETAS
11
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
PUNTAS PARA
MICROPIPETAS
BAÑO MARÍA
GRADILLA
PROBETA
12
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
PIPETA
MATRAZ ERLENMEYER
MATRAZ AFORADO
BEAKER
VARILLA DE VIDRIO
13
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
1.
ESPATULA
VIDRIO DE RELOJ
MORTERO
GRADILLA
GRADILLA
COMPLETE LA INFORMACIÓN FALTANTE!!!
14
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Unidad I. Bioquímica Descriptiva
Práctica 2: Propiedades de los Carbohidratos
1. Temas de Autoestudio:




Aspectos generales de los carbohidratos
Estructura y función de los principales monosacáridos
Propiedades químicas de los monosacáridos
Importancia biológica de los carbohidratos complejos
2. Objetivos



Integrar los conocimientos adquiridos acerca de loscarbohidratos mediante la demostración
experimental de algunas de suspropiedades.
Fomentar el trabajo en equipo.
Contribuir a la formación de una conciencia crítica.
3. Introducción
Los carbohidratos son los compuestos orgánicos más abundantes de la biosfera. La mayoría
pueden ser representados con la fórmula general Cx(H2O) y por lo que son literalmente, hidratos
de carbono. Gran parte de sus funciones biológicas dependen de esta estructura química tan
particular y versátil. Ellos son componentes fundamentales de muchos alimentos y su degradación
durante el proceso de digestión genera la energía necesaria para las funciones vitales del
organismo. Cuando se encuentran combinados con otras biomoléculas, dan origen
a moléculas más complejas cuyas funciones pueden ser estructurales o de soporte celular y tisular,
de comunicación entre células, de reconocimiento o de señalización. Químicamente se definen
como polihidroxialdehídos o polihidroxiacetonas cíclicas o sustancias queluego de hidrolizarse dan
origen a los mismos. Un carbohidrato que no puede ser hidrolizado en uno más simple es llamado
monosacárido.
Los monosacáridosmás comunes son la glucosa, la fructosa, la galactosa y la manosa. Un
carbohidrato que puede ser hidrolizado en dos moléculas de monosacáridos esllamado disacárido.
Los más importantes son la lactosa (presente en la leche), la sacarosa (presente en el azúcar
común) y la maltosa. Por su parte, aquellos carbohidratos que pueden ser hidrolizados en varias
15
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
moléculas de monosacáridos son llamados polisacáridos. Los más comunes son el almidón y la
celulosa, este últimoes componente estructural de las plantas.
La determinación de glucosa es de importancia médica ya que niveles sanguíneos alterados
pueden ser signo de una enfermedad metabólica común conocida como diabetes mellitus.
4. Metodología
Previa la realización del laboratorio se les recomienda a los estudiantes leer y analizar la guía,
preparar los contenidos teóricos indicados, preparar las preguntas que se indican en la sección
correspondiente de la guía, y elaborar las tablas para vaciado de resultados.
Para la realización de las actividades de laboratorio cada mesa de laboratorio se subdividirá en
tres estaciones de trabajo, según lo indique el docente de la mesa. Cada una de éstas estaciones
de trabajo contara con todos los equipos, reactivos y materiales necesarios para la ejecución de
todas las actividades planteadas en esta guía, de tal forma que todos y todas las estudiantes
tengan la oportunidad de participar activamente en las mismas.
Al final de la actividad se socializarán las experiencias de las tres estaciones de cada subgrupo.
Para evitar exposición a sustancias tóxicas, y para que todas las actividades puedan realizarse
dentro de los 90 minutos de la actividad, todas las soluciones ya estarán previamente preparadas y
dispuestas en las estaciones de trabajo
5. Materiales, Reactivos y Equipos
Materiales:













Mechero de alcohol
Espátulas de acero inoxidable
Pinzas para tubos de ensayo
Goteros de plástico desechables
Guantes de nitrilo
Gradillas para tubos de 13 x 100 mm
Papel aluminio
Frascos para recolección de orina
Erlenmeyer de 1000 ml
Beaker de 400 ml
Tubos de borosilicato de 13 x 100 mm
Papel secante (papel toalla)
Guantes termoresistentes
16
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA




Pipetas volumétricas graduadas de vidrio, de diferentes volúmenes
Peras de gomas para pipetas de vidrio de diferentes volúmenes
Marcadores para cristalería
Agua destilada
Equipos:





Baño María
Hornilla eléctrica de un plato
Pesa semianalítica
Cronómetros
Autoclave de mesa
Reactivos:








Reactivo de Benedict
Reactivo de Lugol
Glucosa
Galactosa
Lactosa
Fructosa
Sacarosa
Almidón
6. Principio del método
Prueba de Benedict
Algunos azúcares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes oxidantes suaves como
el ion Fe3+o Cu2+. Esta característica radica en la presencia de un grupo carbonilo libre, el cual es
oxidado y genera un grupo carboxilo. Por lo tanto, aquellos azúcares con un grupo carbonilo libre
son llamados azúcares reductoresy aquellos en los que elgrupo carbonilo se encuentra combinado
en unión glicosídica se conocen como azúcares no reductores. Existen varias reacciones
químicasque permiten determinar si se está en presencia de un azúcar reductor o no. La prueba de
Benedict es una de ellas y se basa precisamente en la reacción o no de un azúcar con el ion Cu2+.
El reactivo de Benedict contiene soluciones de carbonato de sodio, sulfato de cobre, y citrato de
sodio. El Na2CO3confiere a la solución un pHalcalino necesario para que la reacción pueda llevarse
a cabo. El citrato de sodio mantiene al ion Cu2+en
solución, ya que tiene la propiedad de formar complejos coloreados poco ionizados con algunos
de los metales pesados. Con elcobre produce un complejo de color azul. Si se le agrega al reactivo
17
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
una solución de azúcar reductor y se calienta hasta llevar la mezcla a ebullición, el azúcar en
solución alcalina a elevadas temperaturas se convertirá en D-gluconato y su ene-diol, rompiéndose
luego en dos fragmentos altamente reductores, los cuales con sus electrones expuestos,
reaccionarán con el Cu++. Se obtiene entonces un azúcar oxidado y dos iones Cu+.
Posteriormente el Cu+producido reacciona con los iones OH-presentes en la solución para formar
el hidróxido de cobre:
Cu++ OH -→Cu(OH) + H2O (precipitado amarillo)
2Cu(OH) →Cu2O (precipitado rojo ladrillo)
La aparición de un precipitado amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo evidencia la presencia de
un azúcar reductor.
Prueba de Lugol
La prueba del yodo es una reacción química usada para determinar la presencia o alteración de
almidón u otros polisacáridos. Una solución de yodo - diyodo disuelto en una solución acuosa de
yoduro de potasio - reacciona con almidón produciendo un color púrpura profundo.
Esta reacción es el resultado de la formación de cadenas de poliyoduro a partir de la reacción del
almidón con el yodo presente en la solución de un reactivo llamado Lugol. La amilosa, el
componente del almidón de cadena lineal, forma hélices donde se juntan las moléculas de yodo,
formando un color azul oscuro a negro. La amilopectina, el componente del almidón de cadena
ramificada, forma hélices mucho más cortas, y las moléculas de yodo son incapaces de juntarse,
obteniéndose un color entre naranja y amarillo. Al romperse o hidrolizarse el almidón en unidades
más pequeñas de carbohidrato, el color azul-negro desaparece. En consecuencia, esta prueba
puede determinar el final de una hidrólisis, cuando ya no hay cambio de color constituyendo una
evidencia experimental ampliamente utilizada.
La solución de yodo también reacciona con el glucógeno, aunque el color producido es más
castaño y mucho menos intenso.
7. Procedimientos
a)




Preparación de las Soluciones: (ya están preparados por el responsable del laboratorio)
Pesar 18 gramos de glucosa y llevar a 1000 ml con agua destilada.
Pesar 18 gramos de galactosa y llevar a 1000 ml con agua destilada.
Pesar 34.2 gramos de lactosa y llevar a 1000 ml con agua destilada.
Pesar 18 gramos de fructosa y llevar a 1000 ml con agua destilada.
18
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA



Pesar 34.2 gramos de sacarosa y llevar a 1000 ml con agua destilada.
Solución de almidón al 1% p/v: pesar 1 g de almidón y llevar a 100 ml con agua destilada
caliente.
Amilasa salival: Enjuagar la boca con 10 ml de agua destilada, por 2 minutos, depositar en un
frasco estéril para recolección de orina. Rotular.
b) Demostración de Azúcares Reductores
Deposite 2.5 ml de reactivo de Benedict en un tubo de ensayo. Repita este paso en 6 tubos más.
Luego, a cada tubo, añada 6 gotas de una y solo una de las siguientes soluciones: glucosa,
galactosa, lactosa, fructosa, sacarosa, orina, y almidón según el siguiente cuadro:
Nombre del tubo
Solución de Benedict (ml)
Carbohidratos (gotas)
Glucosa
2.5
6
Galactosa
2.5
6
Lactosa
2.5
6
Orina
2.5
6
Fructosa
2.5
6
Sacarosa
2.5
6
Almidón
2.5
6
Coloque los tubos en un baño de agua hirviendo por 5 minutos. Tenga cuidado de no quemarse.
USAR GUANTES TERMORESISTENTES!!
Observe cualquier cambio de color durante el calentamiento. Saque el tubo y póngalo en una
gradilla y después de un corto tiempo observe si se ha formado un precipitado, el cual puede ser
rojo, anaranjado o verdoso.
19
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
c) Demostración de la Hidrólisis del Almidón

Ponga en tubos de ensayo 2 ml de las mismas soluciones que se utilizaron en la prueba
de Benedict.

Añada 1 gota de solución de Lugol a cada tubo. Incubar a temperatura ambiente hasta
que aparezca el color.

Sujete cada tubo con una pinza y flamee usando un mechero de alcohol hasta que
desaparezca el color.

Espere a que los tubos regresen a temperatura ambiente.

Agregue 1 ml del agua de enjuague bucal a cada tubo. Incube a 37 Cen un baño María,
o
hasta que desaparezca el color.
d) Registro de Resultados:
1. Elabore un cuadro con las soluciones que utilizó para la prueba de Benedict, e indique si
se formó un precipitado y de qué color es el mismo. Explíquelos.
2. Indique los cambios de color observados en los pasos 2 al 5, en la prueba con la solución
de Lugol. Explíquelos
8. Análisis de los resultados y preguntas para orientar la discusión
1. Diga usted cómo concuerdan sus resultados con lo esperado teóricamente sobre
carbohidratos reductores? Explique.
2. Diga usted cómo concuerdan sus resultados con lo esperado teóricamente sobre el
experimento con la solución de Lugol? Explique.
3. Diga usted qué otro reactivo se puede usar para análisis de azúcares reductores? Cuál es
su fundamento?
4. Diga usted por qué es necesario el citrato de sodio en el reactivo de Benedict?
5. Explique el término azúcar reductor.
6. Explique el fundamento de la reacción de Benedict.
7. Explique el fundamento de la solución de Lugol.
8. Diga usted qué resultado observaría si agregáramos solución de Benedict a plasma
humano. Explique.
9. Diga usted qué método sustituyó la solución de Benedict para el diagnóstico de la diabetes
mellitus. Cuál método es mejor? Explique.
10. Defina carbohidrato, monosacárido.
11. Diga usted cómo se clasifican los monosacáridos.
20
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
12. Diga cuáles son las funciones biológicas de los monosacáridos.
13. Diga por qué la glucosa en tan importante en clínica.
14. Diga usted cómo se relacionan la mutarrotación, la reacción hemiacetálica, la reacción
acetálica, el anomerismo, y los carbonos asimétricos con el poder reductor de los
azúcares.
1. Evaluación
Esta actividad tiene un valor de 100 puntos, sobre la base de los siguientes criterios: 20%
preparación previa, 30% ejecución de la práctica, 30% discusión de resultados y correlación teórica
y 20% entrega de reporte.
2. Bibliografía





Apuntes de las conferencias magistrales.
Bioquímica médica de Harper. Cualquier edición.
Bioquímica de Van Holde. 2da. Ed.
Bioquímica médica de Montgomery. 5ta. Ed.
Principios de Bioquímica de Lehninger. 5ta. Ed.
21
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Unidad I: Bioquímica Descriptiva
Práctica 3. Determinación de la actividad enzimática de la glucosa oxidasa
1. Temas de Autoestudio:




Aspectos generales de las enzimas
Cinética de Michaelis-Menten
Regulación enzimática
Inhibición enzimática
2. Objetivos




Evidenciar la actividad enzimática de la glucosa oxidasa.
Determinar la temperatura óptima de la glucosa oxidasa.
Establecer relación entre los aspectos teóricos y prácticos.
Adquirir habilidades en las prácticas de laboratorio.
3. Introducción:
Las enzimas son moléculas de proteínas que tienen la capacidad de facilitar y acelerar las
reacciones químicas que tienen lugar en los organismos vivos, disminuyendo el nivel de
la "energía de activación" propia de la reacción.
Las enzimas no reaccionan químicamente con las sustancias sobre las que actúan (que
se denominan sustrato), ni alteran el equilibrio de la reacción. Solamente aumentan la
velocidad con que estas se producen, actuando como catalizadores. La velocidad de las
reacciones enzimáticas dependen de la concentración de la enzima, de la concentración
del sustrato (hasta un límite) y de la temperatura y el pH del medio.
22
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
4. Metodología
Se recomienda a los y las estudiantes leer y analizar todos los aspectos teóricos sobre
enzimas, de tal manera que le facilite lapráctica, discusión y un mejor aprendizaje.
Al inicio del laboratorio se conformaran 3 estaciones de trabajo por cada subgrupo los
cuales de manera alternada harán las actividades propuestas de tal forma que todos y
todas las estudiantes participen en pro de un aprendizaje significativo y cooperativo.
Al finalizar el laboratorio se socializará los resultados y se discutirán los mismos para
finalmente ser evaluados.
5. Materiales, equipos y reactivos
Materiales: tubos de ensayo, gradillas, jeringas descartables, algodón y torniquete, agua
destilada, alcohol
Equipos: Espectrofotómetro, centrifuga, Baño María, termómetro, micropipetas.
Reactivos: Kit para la determinación colorimétrica de glucosa
6. Principio Del método
Colorimétrico
FUNDAMENTOS TEORICOS:
La actividad enzimática – es la eficiencia, con que una enzima procesa a su sustrato.
Entre más moléculas de sustrato es convertido a producto en un periodo de tiempo,
mayor es la actividad enzimática. Existen varias unidades para expresar actividad
enzimática. Una de las unidades de mayor uso es UI – Unidad Internacional. UI se
define como cantidad de micromoles de sustrato, transformados en producto en un
volumen de 1 ml y en un periodo de 1 minuto.
En el presente laboratorio se va a trabajar con las muestras de un volumen igual y
constante. Por otro lado el tiempo en que la enzima ejerce su acción también va a ser
igual en todos los casos. De esa manera, la actividad enzimática va a ser
proporcional solamente a la concentración del producto de la acción enzimática (no
va a depender del tiempo ni volumen por ser éstos constantes).
23
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
La enzima GLUCOSAOXIDASA pertenece a los oxidoreductasas. Es una enzima de
origen vegetal, producida por una especie del hongo microscópico Aspergillus niger. Es
una enzima con especificidad absoluta con respecto a su único sustrato – glucosa.
La glucosa oxidasa cataliza la siguiente reacción:
glucosa
O
H
O
HO
C
H
-gluconolactona
ácido glucónico
O
C
O2, H2O
C
OH
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
H2C
OH
H
C
C
OH
HO
C
H
H
C
H
C
H
C
OH
HO
C
H
OH
H
C
OH
OH
H
C
O
glucosa oxidasa
H2O2
H2C
OH
CH2
OH
El Peróxido de hidrogeno, es tóxico y es degradado con ayuda de la otra enzima –
peroxidasa, según esquema:
4-aminofenazona
(4-aminoantipirina)
fenol
quinonaimina
2 H2O2
H3C
N
H3C
CH3
N
+
N
NH2
O
4 H2O
(coloreada, máx=505 nm)
OH
CH3
N
peroxidasa
N
O
O
PRODUCTO COLOREADO
La concentración del producto coloreado fácilmente se mide con la ayuda de un aparato,
llamado espectrofotómetro.
24
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Entre más glucosa se oxida en un periodo determinado, más oxigeno es producido y más
producto coloreado es formado.
Se puede calcular la cantidad de glucosa procesada siempre y cuando conocemos la
cantidad de producto coloreado formado. En la práctica, para tener un valor de
referencia, se prepara primero una solución con el contenido de glucosa conocido, por
ejemplo una solución que contiene 100 mg de la glucosa en 100 ml de la solución. Esta
solución, llamada solución patrón, es procesada con la enzima. La cantidad de producto
coloreado se mide en el espectrofotómetro y se expresa mediante una unidad, llamada
ABSORBANCIA. Para medir la ABSORBANCIA del patrón se usa una solución de
referencia que se llama solución blanco.
El método de espectrofotometría es considerado el más usado para determinar la
concentración de compuestos en experimentos bioquímicos y química sanguínea.
El fundamento del método consiste en que si se pasa luz blanca a través de una
solución coloreada, algunas longitudes de onda se absorben de preferencia sobre las
otras. Cada sustancia absorbe energía radiante de una u otra longitud de onda, se trata
de una propiedad característica de todas las sustancias, tan invariable como los puntos de
ebullición o de fusión. Muchos compuestos no son coloreados pero pueden absorber luz
en la región visible si se someten a la acción de un reactivo apropiado.
El espectrofotómetro consta de una fuente de luz y un selector de longitud de onda, el que
deja pasar sólo la luz con longitud de onda determinada. Esta luz se divide en dos haces
iguales, un haz sirve de control y el otro pasa por el tubo o cubeta que contiene la
muestra. La diferencia en intensidad entre uno y otro haz es registrada por un fotómetro;
esa diferencia será proporcional a la concentración del soluto en la muestra.
Solución Patrón: Es un valor de referencia. En este caso, la solución patrón contiene
100 mg de la glucosa en 100 ml de la solución.
25
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
7. Procedimientos
Experimento 1: Evidenciar la Actividad enzimática de la glucosa oxidasa
Obtención de las muestras de sangre

Obtenga 1 muestra de sangre de 3 ml (en tubos con EDTA) de uno o una de sus
compañeros de su mesa de trabajo. Identifíquelos debidamente.

Centrifugue la muestra a 4000 rpm, por 5 minutos. Balancee el rotor ubicando los
tubos en posiciones opuestas. Si el tubo de ensayo queda totalmente dentro de la
camisa, utilice una aguja para extraer el tubo.
Preparación de los reactivos:
Los reactivos ya han sido previamente preparados por el responsable del laboratorio, y
están listos para su uso. En su mesa hay tres tubos con solución reactiva para la
medición de la glucosa. Identifique los tubos para evitar confusiones.

En el tubo 1(blanco) no agregue nada.

En el tubo 2 (patrón) agregue 10 microlitros de patrón.

En el tubo 3 (muestra) agregue 10 microlitros de muestra.

Luego de la preparación del equipo para la medición, inserte el tubo con la muestra en
la celda de lectura del espectrofotómetro a los 0, 2, 4, 6, 8 y 10 minutos.
Medición:
1. Verifique que el equipo está conectado al estabilizador.
2. Encienda el estabilizador.
3. Encienda el equipo presionando el botón en el panel trasero.
4. Espere que la pantalla indique 37 oC.
5. Presione la tecla ―AUX‖.
6. Digite el número ―29‖ + Enter.
26
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
7. Cuando el equipo le pida la concentración del estándar digite ―100‖ + Enter.
8. Todos usarán el mismo tubo de blanco y de patrón.
9. Todos los tubos deben ser limpiados (frótelos con su gabacha) cada vez antes de
ser insertados en la celda de medición.
10. Inserte el tubo del blanco cuando el equipo se lo pida.
11. Cuando aparezca la lectura en la pantalla retire el tubo y regréselo al bloque
calefactor.
12. Inserte el tubo del patrón cuando el equipo se lo pida.
13. Cuando aparezca la lectura en la pantalla retire el tubo y regréselo al bloque
calefactor.
14. Inserte el tubo de la muestra cuando el equipo se lo pida.
15. El resultado aparecerá en pantalla.
16. Anote primero el resultado y después retire el tubo.
17. El equipo ya queda listo para seguir midiendo la siguiente muestra.
Experimento 2: Acción de la temperatura sobre la actividad enzimática de la
glucosa oxidasa
PROCEDIMIENTO:
1. Cada estación de trabajo debe preparar 4 tubos de ensayo:
2. Agregue 1ml de la solución enzimática a cada tubo
3. Colocar el primer tubo en el hielo, segundo en agua hirviendo 70 grados y 37 grados,
el tercer tubo dejarlo con la temperatura del ambiente.
4. Incuban los tubos en sus medios respectivos durante 5 minutos.
5. Añaden a cada tubo la solución patrón.
6. Medir la absorbancia de cada uno de los tubos.
7. Observen los cambios que ocurren en cada tubo.
27
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
8. Análisis de resultados y preguntas para orientar la discusión
Experimento 1.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
¿Por qué la coloración de la solución cambia en el tiempo?
¿Por qué la absorbancia en las primeras mediciones es menor que en las posteriores.
¿Por qué la absorbancia en las últimas mediciones es la misma?
De acuerdo a la cinética de MichaelisMenten, explique de que depende la actividad
enzimática.
¿Qué indica el Km de una enzima?
¿Cómo se puede cambiar la cinética si alcanza la velocidad máxima de la enzima?
¿Cómo se interpreta el dato obtenido de la muestra? Justifique
Describa las reacciones para la medición de la glucosa en sangre.
¿Cuál es utilidad clínica de la medición de la glucosa?
Experimento 2.
1. Represente en una gráfica los cambios de la glucosa oxidasa a diferentes
temperaturas.
2. ¿Para qué dejaron de reposar los tubos de ensayo durante 5 minutos antes de añadir
la solución enzimática?
3. ¿A qué se deben las diferencias en el comportamiento de la reacción enzimática en
cada tubo?
4. ¿Cuál es la temperatura óptima para la enzima glucosa oxidasa? ¿Por qué?
5. ¿A qué se debe la baja actividad enzimática en la temperatura del hielo?
6. ¿Qué otros factores del medio pueden afectar la reacción enzimática?
7. ¿Qué pasa en estado de fiebre con las actividades de las enzimas?
28
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
9. Evaluación
Esta actividad tiene un valor de 100 puntos, sobre la base de los siguientes criterios: 20%
preparación previa, 30% ejecución de la práctica, 30% discusión de resultados y
correlación teórica y 20% entrega de reporte.
10. Bibliografía




Apuntes de las conferencias magistrales
Bioquímica Ilustrada de Harper
Bioquímica de Montgomery, 6ta edición, pág. 94-101 (aplicaciones clínicas de las
enzimas)
Bioquímica de Montgomery, 6ta edición, contratapa al inicio y al final del libro. (valores
normales)
29
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Unidad II: Metabolismo Energético
Práctica 4: Demostración de actividad glucolítica en eritrocitos
1. Tema para el Autoestudio:
Glucólisis




Reacciones y enzimas.
Funciones biológicas.
Regulación hormonal de la captación de glucosa.
Regulación de la glucólisis.
2. Objetivos:


Demostrar que las enzimas de la glucolisis no son enzimas extracelulares.
Demostrar que los eritrocitos usan glucosa como sustrato energético.
3. Introducción
La glucolisis es un proceso bioquímico catabólico de los carbohidratos con el fin de obtener
adenosintrisfosfato (ATP), nucleótido fundamental en la obtención de energía celular.
Para llegar al ATP el proceso es acompañado por una serie de enzimas, que favorecen las
reacciones redox que se suceden durante el proceso, el cual se generan al interior de la célula
específicamente en el citoplasma, continuando en la mitocondria hasta la cadena respiratoria, esto
si la célula cuenta con núcleo y orgánulos. En el caso de los eritrocitos que son células carentes de
estos compartimientos, sus procesos metabólicos son reducidos y su consumo energético inferior
al resto de las células del organismo, esto no quiere decir que el proceso de glucolisis no se lleve a
cabo; si se realiza pero únicamente en presencia de glucosa, esto por su incapacidad de procesar
otro tipo de sustrato.
En esta práctica de laboratorio podrás confirmar a través de la determinación de la glucosa que las
reacciones enzimáticas en el proceso glucolítico se llevan a cabo a nivel intracelular en los
eritrocitos.
30
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
4. Metodología




Cada mesa de trabajo se dividirá en tres estaciones de trabajo.
Cada subgrupo realizara la parte práctica del test.
Cada subgrupo debe registrar sus resultados en el cuaderno.
Unificar y discutir los resultados obtenidos de los subgrupos de trabajo.
5. Materiales, equipos y reactivos
Materiales.





Tubos vacutainer con EDTA 5 ml
Tubos de ensayos limpios de 5 mL
Puntas para micropipetas de 100 y de
1000 uL
Gradilla
Kleenex






Jeringa de 5 mL
Torniquete
Marcadores para tubos
Guantes
Alcohol
Algodón
Equipos:




Espectrofotómetro UV
Centrifuga
Micropipeta de 10-100uL
Micropipeta de 100-1000 uL
Reactivo:

Kit para determinación colorimétrica de Glucosa en sangre por espectrofotometría UV.
5. Procedimiento de análisis en el laboratorio
Determinación de:
a) Concentración de glucosa en suero o plasma.
b) Concentración de glucosa en sangre entera.
31
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Obtención de la muestra:




Obtenga dos muestras de sangre de 4 ml (en tubos con EDTA) de dos compañeros (mujer
y varón preferiblemente) de su mesa de trabajo e identifíquelos con A y B.
Centrifugue ambas muestras a 4000 rpm, por 5 minutos. (No olvides balancear el volumen
de los tubos y ubicarlos en posiciones opuestas en el rotor de la centrifuga).
Transfiera (sin revolver) el plasma del tubo A en un tubo de ensayo limpio. (identifique el
tubo como ―plasma separado‖).
La muestra del tubo B déjela tal y como sale de la centrifuga.
Nota: Recuerde que el plasma debe ser libre de hemolisis
6. Principio del método
MÉTODO ENZIMÁTICO/COLORIMÉTRICO
a) Determinación de la concentración de glucosa en plasma o suero

Principio analítico de la prueba
GOD
Glucosa + O2 + H2O
H2O2 + Fenol + 4-Aminofenazona
Acido glucònico + H2O2
POD
Quinonaimina + H2O
La reacción de la glucosa-oxidasa produce ácido glucónico y peróxido de hidrógeno. Este último es
convertido a H2O y un producto coloreado, cuya concentración es directamente proporcional a la
cantidad de glucosa en la muestra.
7. Procedimiento
Preparación de los reactivos:
32
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA




El reactivo utilizado en esta práctica vienen preparado en kit llamado GLUCOSE LIQUICOLOR
(Human), de soluciones listas para el trabajo, por lo tanto no necesitarás preparar reactivos.
Las mediciones de volúmenes de reactivos a utilizaren el ensayo, es realizada por el técnico
del laboratorio, y están listos para su uso en tu mesa de trabajo
Verificar que hay 4 tubos con solución reactiva para la medición de la glucosa.
Identifica los 4 tubosa utilizar con la denominación siguiente: A1 y A2; B1 y B2.
Preparación de la muestra:





En el tubo A1 agregue 10µL de plasma separado, incube 10min. y lea la abs. a una longitud
de onda de 505 nmen el espectrofotómetro,y registre el dato de la concentración de glucosa en
pantalla.
En el tubo B1 agregue 10µL de plasma no separado, incube 10min. y lea en el
espectrofotómetro la concentración de glucosa.
Realice simultáneamente el paso 1 y 2.
Después de haber extraído los 10µLde plasma del tubo B, de inmediato mezcle por inversión
suave el contenido del tubo, espere 30min., centrifugue y tome 10µLde plasma para una
segunda lectura de la concentración de glucosa (use el tubo B2).
Realice simultáneamente la segunda medición de glucosa utilizando el plasma separado del
tubo A2.
Medición
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Verifique que el equipo está conectado al estabilizador.
Encienda el estabilizador.
Encienda el equipo presionando el botón en el panel trasero.
o
Espere que la pantalla indique 37 C.
Presione la tecla ―AUX‖.
Digite el número ―29‖ + Enter.
Cuando el equipo le pida la concentración del estándar digite ―100‖ + Enter.
Todos los grupos usarán el mismo tubo de blanco y de patrón.
Limpie el tubo con papel kleenexantes de ser insertado en la celda de lectura!!!
Inserte el tubo del blanco cuando el equipo se lo pida.
Cuando aparezca la lectura en la pantalla retire el tubo y regréselo al bloque calefactor.
Inserte el tubo del patrón cuando el equipo se lo pida.
Cuando aparezca la lectura en la pantalla retire el tubo y regréselo al bloque calefactor.
Inserte el tubo de la muestra cuando el equipo se lo pida.
El resultado aparecerá en pantalla.
Anote primero el resultado y después retire el tubo.
33
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
17. El equipo ya queda listo para leer las siguientes muestras.
Nota: Para la protección del instrumento el responsable de laboratorio calibrará y dejará listo el
instrumento para la lectura de la muestra.
8. Análisis de resultados y preguntas de orientación a la discusión
1. Establezca si hay o no hay diferencia en la cantidad de glucosa medida entre los tubos A1 y A2
y entre los tubos B1 y B2.
2. Si usted observó diferencias, explique a qué se deben esas diferencias.
3. Si usted no observó diferencias, diga cuálpodría ser la explicación.
4. Diga usted, en el caso de que hubiésemos utilizado células hepáticas, quépodríamos haber
observado (teóricamente)?Explíquese!
5. Diga usted, en el caso de que hubiésemos utilizado células musculares, quépodríamos haber
observado (teóricamente)?Explíque
6. Diga usted, si hubiésemos podido medir el pH de los tubos a los cero y a los 30 minutos,
habríamos observado alguna diferencia? Más alcalino o másácido? Por qué?
7. Diga usted, logró observar alguna evidencia de la glucólisis en nuestro experimento?Cómo?
9. Evaluación
Esta actividad tiene un valor de 100 puntos, sobre la base de los siguientes criterios: 20%
preparación previa, 30% ejecución de la práctica, 30% discusión de resultados y
correlación teórica y 20% entrega de reporte.
10. Bibliografía:






Apuntes de las conferencias magistrales
Bioquímica de Montgomery, 6ta edición,
Bioquímica de Harper
Bioquímica de Mathews Van Holde, 3a edición
http://www.biologia.edu.ar/metabolismo/met3glicolisis.htm
http://html.rincondelvago.com/glucolisis.html
34
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Unidad II: Metabolismo Energético
Práctica 5: Demostración de la presencia de cuerpos cetónicos en la orina
1. Temas de autoestudio:



Beta- oxidación
Metabolismo de los Cuerpos Cetónicos
Homeostasis calórica
2. Objetivos

Evidenciar la presencia de cuerpos cetónicos en la orina,
sometidos a dieta baja en CHO.

Explicar el funcionamiento de cada ruta, haciendo énfasis en el papel de las
condiciones de emergencia y en condiciones patológicas.
en estudiantes
3. Introducción:
La formación excesiva de cuerpos cetónicos da como resultado un aumento de las
concentraciones de cetonas en sangre (cetonemia) y un aumento de la excreción de cetonas en la
orina (cetonuria). Este proceso se observa en condiciones asociadas con una disminución de la
disponibilidad de carbohidratos, tales como inanición, vómitos frecuentes, diabetes mellitus,
enfermedades por almacenamiento de glucógeno o alcalosis. Las dietas altas en grasas y bajas en
carbohidratos son cetogénicas y aumentan los cuerpos cetónicos circulantes. Las dietas
cetogénicas y el ejercicio prolongado también se asocian con cetosis fisiológica. Las dietas
cetogénicas, que son utilizadas en ciertos programas de reducción de peso contienen por lo menos
un 50% de sus calorías en forma de grasa.
Durante los períodos de deficiencia de glucosa, los cuerpos cetónicos desempeñan un papel clave
en el ahorro de la utilización de glucosa y la reducción de la proteólisis. A diferencia de la mayoría
de los demás tejidos, el cerebro no puede utilizar los ácidos grasos para obtener energía cuando
los niveles de glucosa en la sangre llegan a estar comprometidos. En este caso, los cuerpos
cetónicos le proporcionan al cerebro una fuente alternativa de energía, que representa casi las dos
terceras partes de los requerimientos de energía del cerebro durante el ayuno prolongado y la
inanición.
35
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
4. Metodología
El Docente solicitara a los estudiantes de forma voluntaria a realizar una dieta rica en
proteínas y grasas, pero pobre en CHO, (por dos días antes del laboratorio) quienes serán
los donadores de orina para la práctica.
En éste laboratorio los estudiantes evidenciarán la presencia de cuerpos cetónicos en la
orina haciendo uso de tiras reactivas (Reacción de Legal). Al finalizar la práctica se
socializará los resultados y se discutirán los mismos para consolidar los conocimientos
teóricos por medio de esta actividad. Se recomienda a los y las estudiantes leer y
analizar los temas de autoestudio en pro de alcanzar un aprendizaje significativo.
Cada subgrupo será dividido en tres estaciones de trabajo.
5. Materiales y reactivos
Materiales: Vasos recolectores de orina, guantes, papel toalla.
Reactivos: Tiras reactivas para uroanàlisis.
6. PROCEDIMIENTOS
Obtención de las muestras orina

Obtener las muestras de orina de dos compañeros(as) de su mesa de trabajo que se
hayan sometido a la dieta baja en carbohidratos, rica en proteínas y grasas.

Se recomienda llenar ¾ de orina en el vaso de toma de las muestras.
Mediciòn cualitativa de la concentración de cuerpos cetònicos en orina
7.Principio del método:
Reacción de Legal: La Acetona y el Ácido acetoacètico reaccionan con el
Nitroprusiatosòdico (en medio alcalino) formando Cianhidrinas, que poseen un color
violáceo. Este color es un indicador de la presencia de cetonas en orina.
36
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Medición:

Introduzca la cinta reactiva en el frasco con la muestra de orina fresca, de modo
que se humedezcan completamente las áreas reactivas. Evite tocar con los dedos
las áreas reactivas.

Espere 3 segundos y retire, eliminando el exceso de orina de la cinta.

Compare la cinta contra la referencia impresa en el frasco de las cintas.

Anote el resultado.
8.Análisis de resultados y preguntas para orientar la discusión:
1. Presente sus resultados y explique.
2. De acuerdo a la práctica realizada: elabore un esquema de las rutas metabólicas
comprometidas bajo esa condición alimentaria. ¿Cómo hace el organismo para
mantener la homeostasis calórica?
3. Elabore un esquema del uso de moléculas combustibles por el musculo
esquelético, hígado, tejido adiposo y cerebro en condición de ayuno prolongado.
4. ¿Por qué el Beta-hidroxibutirato no es detectable con este reactivo?
5. Investigue qué importancia tiene la medición del Beta-hidroxibutirato en sangre?
6. ¿Cómo explica la aparición de los cuerpos cetónicos en la orina; si en condiciones
fisiológicas son indetectables
7. ¿Cómo se explica la cetoacidosis diabética en la diabetes Tipo I?
8. ¿Por qué una dieta rica en proteínas y baja en carbohidratos conlleva a cetosis?
37
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
9. Evaluación
Esta actividad tiene un valor de 100 puntos, sobre la base de los siguientes criterios: 20%
preparación previa, 30% ejecución de la práctica, 30% discusión de resultados y
correlación teórica y 20% entrega de reporte
10. Bibliografía



Apuntes de clases
Bioquímica de Harper.
Bioquímica de Montgomery

Baynes, W. John y Dominiczak, H. M. (2011). Bioquímica Médica (3° ed.). España:
Elvesier.
Champe, P.; Harvey, R. y Ferrier, D. (2006). Bioquímica (3° ed.).México: McGrawHill. Interamericana Editores.

38
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Unidad 3: Mecanismo de detoxificación hepática
Práctica 6: Determinación de productos de eliminación del catabolismo de las proteínas y de
las bases nitrogenadas en sangre
1. Temas para el autoestudio:





Catabolismo de las purinas.
Ruta de rescate de las purinas.
Ciclo de la urea.
Hiperamonemias.
Hiperuricemias.
2. Objetivos:


Calcular la concentración plasmática de urea.
Calcular la concentración plasmática de ácido úrico.
3. Introducción
El Nitrógeno (N) junto a otros elementos, como Carbono, Oxigeno e Hidrogeno participan en la
constitución de las moléculas orgánicas fundamentales de la materia viva. Entre los compuestos
constituyentes del organismo, el N forma parte de un grupo de compuestos orgánicos de gran
jerarquía biológica a los cuales están asignadas funciones muy importantes, como lo son las
proteínas y los nucleótidos. Este elemento constituye por sí solo el 3% del peso corporal.
El catabolismo de los nucleótidos purinicos y proteínas generan residuos como ácido úrico y urea,
y se requiere de la eliminación de estos, si el cuerpo por ejemplo produce demasiado ácido úrico o
no lo elimina lo suficiente, la persona se puede enfermar. Los altos niveles de ácido úrico en el
cuerpo se denominan hiperuricemia.
Es importante detectar niveles de ácido úrico en sangre, ya que altos niveles podrían constituir un
signo de un trastorno conocido como gota, también a nivel de la orina en la evaluación los niveles
altos representan la litiasis (formación de piedras, cálculos) renal y como monitorización del
tratamiento de la gota en individuos con propensión a formar cálculos renales.
39
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Por esta razón es importante controlar la cantidad de nitrógeno en la sangre. El nitrógeno está
presente en otro químico llamado urea. La urea es un producto de desecho, producido cuando el
cuerpo ha digerido las proteínas. La urea es llevada a través de la sangre a los riñones, los cuales
filtran la urea de la sangre y la depositan en la orina.
Por lo general esta prueba se realiza para saber qué tan bien están funcionando los riñones. Las
enfermedades renales muchas veces dificultan el filtrado correcto de la urea. Esto causa niveles
altos de urea en sangre.
4. Metodología





Cada subgrupo se dividirá en tres estaciones de trabajo.
Cada estación de trabajo realizará la parte práctica del test.
Cada estación de trabajo registrará sus resultados por separado en su cuaderno.
Unificar y discutir los resultados obtenidos por las estaciones de trabajo.
Cada una de las determinaciones urea y ácido úrico se harán por separado.
5. Materiales, equipos y reactivos
Materiales:





2-Tubos vacutainer con EDTA4mL
8-Tubos de ensayos limpios de 4mL
Puntas para micropipetas para 100 y
1000 uL.
Gradilla
Algodón






2-Jeringa de 5 mL
1-Torniquete
2-Marcadores para tubos
Gabacha y guantes
Alcohol
Kleenex
Equipos:




Espectrofotómetro UV
Centrifuga
Micropipeta de 10-100 uL
1-Micropipeta de 100-1000 uL
40
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Reactivos:


Kit colorimétrico para la determinación de Ácido Úrico
Kit Colorimétrico para la determinación de Urea
6. Principio del método
MÉTODOS ENZIMÁTICOS/COLORIMÉTRICOS
a) Determinación de la concentración de ácido úrico en sangre.

Principio analítico la determinación de la concentración de ácido úrico en sangre
Ácido úrico + 2 H2O + O2
Uricasa Alantoina + CO2 + 2 H2O2
a
OPD
2 H2O2 + 4-Aminofenazona + 2,4-Diclorofenol-Sulfonato
+ 4 H2O
Quinonaimina
La Quinonaimina es un producto coloreado, y su concentración es directamente proporcional
a la concentración del ácido úrico en la muestra.
b) Determinación de la concentración de urea en sangre.

Principio analítico de la determinación de la concentración de UREA en sangre
Urea + 2 H2O Ureasa
2 NH4 + CO3
NH4 + Alfa-cetoglutarato + NADH,H Glu-DH
L-Glu + NAD+ H2O
La disminución de la absorbancia por disminución de la concentración de NADH, H es
directamente proporcional a la concentración de la urea en la muestra.
41
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
7. Procedimiento
Determinación de:


Determinación de la concentración de urea en sangre.
Determinación de la concentración de ácidoúrico en sangre.
Obtención de la muestra es única para las dos determinaciones:

Obtenga dos muestras de sangre de 4 ml (en tubos con EDTA) de dos compañeros (mujer y
varón preferiblemente) de su mesa de trabajo e identifíquelos con A y B.
 Centrifugue ambas muestras a 4000 rpm, por 5 minutos. (No olvide balancear el volumen de
los tubos y ubicarlos en posiciones opuestas en el rotor de la centrifuga).
 Identifique el tubo.
Nota: Recuerde que el plasma debe ser libre de hemolisis.
Preparación de los reactivos para ÁcidoÚrico:



Los reactivos que se utilizan en esta determinación ya se compran preparados en
presentaciones de kit/ACIDO URICO MR, que contiene todos los reactivos necesarios para la
determinar la concentración del ácido úrico.
Las mediciones de volúmenes de reactivos a utilizar en el ensayo, es realizada por el técnico
del laboratorio, y están listos para su uso en tu mesa de trabajo.
Verificar que hay 2 tubos con solución reactiva para la medición del ácido úrico y rotula para
evitar confusiones.
Preparación de la muestra con el reactivo:




Agregar 25uL de plasma al tubo con solución reactivo.
Mezclar e incubar 10min. a T ambiente.
Proceder leer la absorbancia de la muestra y registre la concentración en mg/mL
Este método requiere de la preparación de un blanco y un patrón usando los siguientes
volúmenes.
42
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA

Recuerde que los tubos ya fueron previamente preparados por el responsable del laboratorio.

Mediciones
Determinación de la concentración de
ÁCIDO ÚRICO en sangre
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Verifique que el equipo está conectado al
estabilizador.
Encienda el estabilizador.
Encienda el equipo presionando el botón en
el panel trasero.
Espere que la pantalla indique 37 °C.
Presione la tecla ―AUX‖.
Digite el número“6” + Enter.
Cuando el equipo le pida la concentración del
estándar digite “6”+ Enter.
Todos los grupos usarán el mismo tubo de
blanco y de patrón.
Limpie el tubo con papel kleenex antes de ser
insertado en la celda de lectura!!!
Inserte el tubo del blanco cuando el equipo se
lo pida.
Cuando aparezca la lectura en la pantalla
retire el tubo y regréselo al bloque calefactor.
Inserte el tubo del patrón cuando el equipo se
lo pida.
Cuando aparezca la lectura en la pantalla
retire el tubo y regréselo al bloque calefactor.
Inserte el tubo de la muestra cuando el
equipo se lo pida.
El resultado aparecerá en pantalla.
Anote primero el resultado y después retire el
tubo.
El equipo ya queda listo para seguir midiendo
las siguientes muestras.
Determinación de la concentración de
UREA en sangre
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
43
Verifique que el equipo está conectado al
estabilizador.
Encienda el estabilizador.
Encienda el equipo presionando el botón en el
panel trasero.
Espere que la pantalla indique 37 °C.
Introduzca sus tubos con solución reactiva en
el bloque calefactor.
Deje incubar por 5 min.
Presione la tecla ―AUX‖.
Digite el número“54” + Enter.
Todos los grupos usarán el mismo tubo de
blanco y patrón.
Limpie el tubo con papel kleenex antes de ser
insertado en la celda de lectura!!!
Inserte el tubo del blanco cuando el equipo se
lo pida.
Cuando aparezca la lectura en la pantalla
retire el blanco y regréselo al bloque
calefactor.
Inserte el tubo del patrón cuando el equipo se
lo pida.
Cuando aparezca la lectura en la pantalla
retire el patrón y regréselo al bloque
calefactor.
Cuando el equipo le pida insertar el tubo de la
muestra, agregue primero 10uL de muestra al
tubo con la solución reactiva, mezcle rápido e
inserte en la celda.
Espere que el equipo ejecute el programa.
El resultado aparecerá en pantalla.
Anote primero el resultado y después retire el
tubo.
El equipo ya queda listo para seguir midiendo
las siguientes muestras.
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Preparación de los reactivos para Urea:



Los reactivos que se utilizan en esta determinación ya se compran preparados en
presentaciones de kit/UREASE, que contiene todos los reactivos necesarios para la determinar
la concentración de Urea en sangre.
Las mediciones de volúmenes de reactivos a utilizar en el ensayo, es realizada por el técnico
del laboratorio, y están listos para su uso en tu mesa de trabajo.
Verificar que hay 2 tubos con solución reactiva para la medición de la Urea y rotule para evitar
confusiones.
Preparación de la muestra con el reactivo:




Agregar 10uL de plasma al tubo que contiene 1 mL de solución reactiva.
Mezclar e incubar 10min. a T ambiente.
Este método requiere de la preparación de un blanco y un patrón. En este caso el blanco sólo
contiene 1 ml de la solución reactiva, mientras que el patrón contiene además 25uL de la
solución patrón. Ambos tubos, blanco y patrón ya fueron previamente preparados por el
responsable del laboratorio, ya que todos usarán el mismo blanco y el mismo patrón.
Proceder leer la absorbancia de la muestra y registre la concentración en mg/mL.
8. Análisis de resultados y preguntas de orientación a la discusión
1.
Diga qué resultados obtuvo en su práctica! Interprételos!
2.
Diga de qué manera usted podría influenciar los resultados obtenidos.
3.
Diga qué es hiperuricemia y cómo se clasifican las hiperuricemias.
4.
Explique diferentes causas de hiperuricemias primarias.
5.
Explique diferentes causas de hiperuricemias secundarias.
6.
Diga cómo se relacionan las hiperamonemias con el ciclo de la urea.
7.
¿Cómo se clasifican las hiperamonemias?
8.
Explique la encefalopatía hepática
44
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
9. Evaluación
Esta práctica de laboratorio tiene un valor de 100 puntos.
El 20% se evaluará la
preparación previa del estudiante, 30% en la ejecución de la práctica. 30% vale el análisis
de los resultados y discusión. Y el 20% restante será el valor del reporte escrito.
10. Bibliografía:








Apuntes de conferencias magistrales
Bioquímica de Harper
Bioquímica de Mathews Van Holde, 3a edición, pág. 812-817, 898-902, 890-893.
Bioquímica de Mongomery, 6ta edición, pág. 254-259, 288-289, 293, 446-452, 458-459.
http://www.fuedin.org/Publicacion/Manual_Fisiopatologia/Capitulos/capitulo13.
http://www.sochire.cl/filemanager/download/648/Artritis_inducida_cristales_DraLorenaSoto.pdf
http://guillermo.garciav.googlepages.com/ciclourea.pdf
http://www.ae3com.org/protocolos/protocolo1.pdf
45
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Unidad III. Mecanismos de Detoxificación hepática
Práctica 7: Uso de la relación AST (GOT) /ALT (GPT) como
marcador de hepatopatía alcohólica
1. Tema de Autoestudio

Mecanismos de eliminación del nitrógeno proteico.
2. Objetivos:

Aprender a realizar las mediciones de AST Y ALT utilizando los equipos y
materiales existentes en el laboratorio.

Interpretar los diferentes resultados de las mediciones realizadas.

Calcular e interpretar los valores de la relación AST/ALT, como marcador en
hepatopatías.
3. Introducción
La Aspartato-Aminotransferasa AST (GOT) es una enzima bilocular (citoplasmática y
mitocondrial) que está ampliamente difundida en el organismo, en tejidos tales como
músculo esquelético, riñón, cerebro y, fundamentalmente, en hígado y corazón, donde se
encuentra en mayor concentración.Cualquier alteración de estos tejidos produce un
aumento en los niveles de AST circulante, en forma proporcional al grado del daño. En
general, altos niveles séricos de AST son índices de lesión profunda. En el infarto agudo
46
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
de miocardio, se observa un aumento moderado de la enzima (5 a 10 veces los valores
normales) que comienza a las 6 u 8 horas de ocurrido el episodio, alcanza niveles
máximos alrededor de las 48 horas y retorna a la normalidad entre el 4° y el 6° día. En
afecciones hepáticas se observan las mayores elevaciones de AST, sobre todo en los
casos de hepatitis con necrosis. Esta determinación ayuda al diagnóstico cuando sus
valores se comparan con los de otras enzimas de similar origen tisular, es decir, que
permite completar el perfil enzimático de órganos tales como corazón e hígado.
La Alanino-Transferasa, ALT (GPT) está presente en elevada concentraciones en el
hígado y en menor grado en los riñones, en el corazón y en los músculos esqueléticos,
en el páncreas, en el bazo y en los pulmones. No obstante, en general los niveles
elevados de la ALT son el resultado de una enfermedad hepática asociada con algún
grado de necrosis hepática tal como la cirrosis, el carcinoma, la hepatitis viral o tóxica y la
ictericia obstructiva. De forma característica, la ALT es generalmente superior a la AST en
la hepatitis viral o tóxica, mientras que para la mayor parte de los pacientes con
enfermedad hepática crónica, generalmente los niveles de ALT son inferiores a los niveles
de AST. De igual forma, se han encontrado elevados niveles de ALT en politraumatismos
y en enfermedades musculares, en el fallo circulatorio con shock, en la hipoxia, en el
infarto de miocardio y en la enfermedad hemolítica.
4. Metodología
El docente solicitará de forma voluntaria la donación de dos muestras de sangre de un
estudiante varón y de una estudiante mujer, para cada donante se hará la medición de
AST y ALT, utilizando el método de espectrofotometría. En este laboratorio, se harán tres
estaciones de trabajo por cada subgrupo. Los estudiantes obtendrán dos valores los
cuales deberán ser interpretados, y posteriormente se calculará la relación AST/ ALT y se
discutirán dichos resultados. Se recomienda a los y las estudiantes leer y analizar los
temas de autoestudio en pro de alcanzar un aprendizaje significativo.
47
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
5. Materiales, equipos y reactivos:
Materiales:













Tubos sin anticoagulante para toma de muestra de sangre, 4 ml.
Tubos de ensayo 13 x 100 mm
Tubos de borosilicato de 12 x 75 mm
Agujas Vacutainer.
Motas de algodón con alcohol.
Torniquetes.
Curitas.
Papel toalla.
Gradillas.
Micropipetas
Puntas para micropipeta
Guantes de nitrilo.
Alcohol.
Equipos:

Espectrofotòmetro.
Reactivos:

Kit para la determinación colorimétrica de AST

Kit para la determinación colorimétrica de ALT
Precauciones particulares para el uso de estos reactivos





Evitar el contacto con ojos y piel .
No tirar los residuos por el desagüe.
Usar indumentaria protectora adecuada.
Contiene azida de sodio que puede ser explosivo al contacto con tubería de plomo,
utilizar un procedimiento adecuado para su desecho.
48
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
6. Principio del método
a) Principio para la determinación de laAST (GOT)
Análisis Cinético.
L-aspartato + 2-oxoglutarato + AST

L-glutamato + oxalacetato
oxalacetato + NADH + H+ MDH  L-malato + NAD+
La disminución de la absorbancia debido a la oxidación de NADH,H a NAD+ es
directamente proporcional a la actividad de la AST en la muestra. La absorbancia se mide
a una longitud de onda de 340 nm. La lactato deshidrogenasa (LDH) incluida en el
reactivo elimina la interferencia debida al piruvato presente en el suero. El agregado de
piridoxal-5-fosfato (PLP) asegura que toda la transaminasas sea completamente activada.
b) Principio para la determinación de la ALT (GPT)
Análisis Cinético.
1. L-Alanina + 2-Oxoglutarato + GPT ————> Piruvato + L-Glutamato
2. Piruvato + NADH + LDH ————> L-Lactato + NAD
3. Piruvato de la muestra + NADH + LDH ————>
49
L-Lactato + NAD
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Se transfiere el grupo amino enzimáticamente por medio de la ALTpresente en la muestra
desde la alanina hasta el átomo de carbono del 2-oxoglutarato produciendo piruvato y Lglutamato.
El piruvato se reduce a lactato por medio de la LDH presente en elreactivo con la
oxidación simultánea de NADH a NAD. La reacción se sigue midiendo la velocidad de
disminución de la absorbancia a 340 nm debida a la oxidación de NADH.
El piruvato endógeno de la muestra se reduce rápida y completamente por medio de la
lactato deshidrogenasa (LDH) durante el período de incubación inicial de tal forma que no
interfiera con el ensayo.
7. Procedimiento:
Los reactivos serán preparados por el responsable del laboratorio, y estarán listos para su
uso. En cada mesa habràn 6 tubos con 1ml. de solución reactiva para la medición de la
ALT (GPT) y 6 tubos con 1ml. de solución reactiva para la medición de AST (GOT).
Divididos en tres estaciones de trabajo. Se extraerá una muestra de 4ml, de sangre en un
varón y otra igual en una mujer, en tubo de ensayo libre de cualquier anticoagulante, Se
dejarán coagular y se utilizará el suero. Se utilizarán 100 microlitros de suero de cada
donante, para medir AST y 100 microlitros de suero para medir ALT, los cuales se
agregarán a cada tubo que contiene 1ml. de solución reactiva y se medirán en el
Espectrofotómetro. Se calculará la relación AST/ALT de cada donante, y se analizarán
los resultados destacando las diferencias encontradas entre el hombre y la mujer.
Intervalo de Referencia para AST (GOT)
Hombres: < 37 U/L
Mujeres: < 31 U/L
Intervalos de Referencia ( a 37°C) Para ALT (GPT)
Adultos: 10 - 35 U/L
Neonatos/Lactantes: 7 - 40 U/L
50
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios rangos de referencia, debido
a que éstos pueden variar con la edad, dieta, género, y área geográfica.
8. Análisis de resultados y preguntas para orientar la discusión:
1. Qué significado tienen los resultados obtenidos en las dos diferentes mediciones?
2. Explique cómo se interpreta la relación AST/ ALT con los resultados obtenidos en
este caso.
3. ¿Qué reacciones catalizan la AST y la ALT? ¿Cuál es la coenzima
4. Por qué el hígado está expuesto a hepatotoxicidad?
5. Realice una comparación de la utilidad clínica de los diferentes marcadores
bioquímicos de hepatopatías
6. Revise los pros y los contras de cada marcador.
7. Revise otras aplicaciones clínicas de la medición de la AST sérica.
9. Evaluación
Esta práctica de laboratorio tiene un valor de 100 puntos.
El 20% se evaluará la
preparación previa del estudiante, 30% en la ejecución de la práctica. 30% vale el análisis
de los resultados y discusión. Y el 20% restante será el valor del reporte escrito.
10. Bibliografía:
 Apuntes de las conferencias magistrales
 Bioquímica de Harper.
 Bioquímica de Montgomery.
 http://encolombia.com/medicina/gastroenterologia/gastro15400practica2.htm
nota: Exàmenes para valorar falla hepàtica. Interesante artìculo.
 http://www.alfa1.org/info_alfa1_higado_pruebas_funcion_hepatica.htm
nota: Pruebas de funciònhepàtica, presentadas de forma sencilla.
 http://www.uv.es/jcastell/Funcion%20hepatica.pdf
nota: Excelente presentaciòn de ppt sobre estudios de funciònhepàtica y biliar
51
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Unidas IV. Metabolismo del colesterol
Práctica 8. Determinación del Colesterol Total en sangre
1. Temas de Autoestudio:




Metabolismo del colesterol
Transporte de lípidos
Formación de la placa ateromatosa
Indice de Castelli
2. Objetivos


Determinar la concentración de colesterol en sangre.
Explicar los eventos metabólicos involucrados en la formación de la placa
ateromatosa.
3. Introducción
El colesterol se deriva del ciclopentanoperhidrofenantreno, se encuentra ampliamente
distribuido en todas las células del organismo. Es un componente indispensable de las
membranas celulares y de las lipoproteínas plasmáticas. Es el compuesto precursor de
los esteroides que se sintetizan en el organismo como: corticosteroides,
mineralocorticoides, sexuales, así como de los ácidos biliares y la vitamina D.
Desde el punto de vista nutricional no es un nutriente que la dieta debe aportar (excepto
en los infantes). El organismo humano pasada la infancia puede sintetizar colesterol para
satisfacer sus necesidades a partir de un compusto llamado Acetil-CoA que se deriva de
los carbohidratos.
Para cuidar nuestra salud debemos evitar ingestas con exceso de colesterol.
Alimentos ricos en colesterol: yema de huevo, hígado, leche entera, crema, mantequilla,
carne, pollo, etc.
52
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
¡CUIDADO! Los alimentos ricos en colesterol pueden provocar aterosclerosis, patología
que se caracteriza por la acumulación de esteres de colesterilo y otros lípidos en el tejido
conjuntivo de las paredes arteriales, causando enfermedades cardiovasculares y
cerebrovasculares.
Utilidad diagnostica
El colesterol se transporta en el plasma en las lipoproteínas. Se excreta a la bilis como tal
o tras su transformación a ácidos biliares. Como ya se indicó anteriormente, las
concentraciones elevadas de colesterol se asocian con un riesgo progresivamente
creciente de aterosclerosis y enfermedades coronarias. Sin embargo, el diagnóstico
clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un único ensayo, sino que
debe integrar los datos clínicos y de laboratorio.
4. Metodología
En este laboratorio se determinará la concentración del colesterol en sangre de un
estudiante por cada estación de trabajo. Al finalizar la práctica se socializará los
resultados y se discutirán los mismos para consolidar los conocimientos teóricos
relacionados con esta actividad. Se recomienda a los y las estudiantes leer y analizar los
temas de autoestudio en pro de alcanzar un aprendizaje significativo.
5. Materiales, equipos y reactivos:
Materiales





Tubos de ensayo
Gradilla
Micropipetas
Jeringas descartables
Algodón
53
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA





Torniquete
Alcohol
Tubovacutainer, 4 ml, con EDTA.
Puntas de micropipetas
Papel absorbente
Equipos


Espectrofotómetro
Baño María
Reactivos
 Kit para determinación colorimétrica de colesterol total
6. Principio del método
Medición de la concentración de colesterol total en sangre
Fundamento del método: Colorimétrico:
Tanto el colesterol libre como el esterificado presente en la muestra originan, según las
reacciones acopladas descritas a continuación, un complejo colorado que se cuantifica
por espectrofotometría.
Ésteres de colesterol + H2O + Colesterol-Esterasa →
Colesterol +1/2 O2 + H2O +Colesterol-Oxidasa →
54
Colesterol + ácidos grasos libres
Colestenona + H2O2
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
2 H2O2 + Fenol + 4-Aminofenazona + POD → Quinonaimina + 4 H2O
La Quinonaimina es un producto coloreado, cuya concentración
proporcional a la concentración del colesterol en la muestra.
es directamente
Esta muestra se tiene que mantener a temperaturas de 2-8 grados Celsius.
Preparación de los reactivos:
Los reactivos ya han sido previamente preparados por el responsable del laboratorio, y
están listos para su uso. En su mesa hay 2 tubos por cada estación de trabajo con
solución reactiva para la medición de colesterol total.
7. PROCEDIMIENTO

Obtenga dos muestras de sangre de 4 ml (en tubos con anticoagulantes) de dos
compañeros de su mesa de trabajo: un varón y una mujer en ayunas!

Centrifugue ambas muestras a 4000 rpm, por 5 minutos. Balancee el rotor
ubicando los tubos en posiciones opuestas. Si el tubo de ensayo queda
totalmente dentro de la camisa, utilice una aguja para extraer el tubo.
55
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
Preparación de las mezclas reactivas:

Agregar 10 microlitros de plasma al tubo con solución reactiva.

Mezclar e incubar 10 minutos a T ambiente.

Este método requiere de la preparación de un blanco y un patrón. En este caso el
blanco sólo contiene 1 ml de la solución reactiva, mientras que el patrón contiene
además 10 microlitros de la soluciónpatrón. Ambos tubos, blanco y patrón ya
fueron previamente preparados por el responsable del laboratorio, ya que todos
usarán el mismo blanco y el mismo patrón.

Proceder a medir.
.Medición:
1. Verifique que el equipo està conectado al estabilizador.
2. Encienda el estabilizador.
3. Encienda el equipo presionando el botòn en el panel trasero.
4. Espere que la pantalla indique 37 oC.
5. Presione la tecla ―AUX‖.
6. Digite el nùmero ―11‖ + Enter. Cuando el equipo le pida la concentración del
estàndar digite ―200‖+ Enter.
7. Todos los grupos usarán el mismo tubo de blanco y de patròn.
8. Todos los tubos deben ser limpiados (frótelos con su gabacha) cada vez
antes de ser insertados en la celda de medició)
9. Inserte el tubo del blanco cuando el equipo se lo pida.
56
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
10. Cuando aparezca la lectura en la pantalla retire el tubo y regréselo al bloque
calefactor.
11. Inserte el tubo del patròn cuando el equipo se lo pida.
12. Cuando aparezca la lectura en la pantalla retire el tubo y regréselo al bloque
calefactor.
13. Inserte el tubo de la muestra cuando el equipo se lo pida.
14. El resultado aparecerá en pantalla.
15. Anote primero el resultado y después retire el tubo.
16. El equipo ya queda listo para seguir midiendo las siguientes muestras.
Valores de referencia:
Los siguientes valores han sido establecidos por el US National Colesterol Educaction
Programa y también aceptados en otros países para la evaluación de riesgo de
enfermedades coronarias.
Hasta 200 mg/dl - Aceptable
200-250 mg/dl
- Moderado
Mayor 250 mg/dl - Elevado
57
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
8. Análisis de resultados y preguntas para orientar la discusión.
1. Presente los resultados y explique.
2. ¿Qué son valores normales o valores de referencia?
3. ¿Pudo usted observar diferencias entre los resultados de varones y mujeres?
¿Cómo se explican?
4. ¿A qué se le llama colesterol ―bueno‖ y ―malo‖?
5. Elabore una propuesta de una dieta saludable en pro de disminuir los valores
sanguíneos del colesterol.
6. ¿Cuál es la importancia de la esterificación del colesterol? ¿Qué enzimas lo hacen
y dónde?
7. ¿Cómo podrían afectar a largo plazo al paciente los altos niveles plasmáticos de
colesterol?
8. Explique desde el punto de vista bioquímico por qué se recomienda disminuir el
consumo de carbohidratos en pacientes con hipercolesterolemia.
9. Explique los principales eventos metabólicos involucrados en la formación de la
placa ateromatosa.
10. Diga usted quélógica tiene
tambiéníndiceaterogénico?
que
al
índice
de
Castelli
se
le
llame
A
NIVEL
INFORMATIVO,
EL
ÍNDICE
DE
CASTELLI
SE
CALCULA :
(COLESTEROL TOTAL / HDL TOTAL) = INDICADOR DE RIESGO DE ENFERMEDADES
CARDIOVASCULARES . USANDO LOS DATOS DE ESTE CASO , DIGA CUÁL ES EL RIESGO
DE ESTE PACIENTE . (VER TABLA)
58
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
9. EVALUACIÓN
Esta actividad tiene un valor de 100 puntos, sobre la base de los siguientes criterios:
20% preparación previa, 30% ejecución de la práctica, 30% discusión de resultados y
correlación teórica y 20% entrega de reporte.
10. Bibliografía:



Apuntes de las conferencias magistrales
Bioquímica de Harper 28° edición.
Bioquímica de Montgomey

Baynes, W. John y Dominiczak, H. M. (2011). Bioquímica Médica (3° ed.). España:
Elvesier.
Champe, P.; Harvey, R. y Ferrier, D. (2006). Bioquímica (3° ed.).México: McGrawHill. Interamericana Editores.
http://www.geosalud.com/Nutricion/colesterol.htm (excelente artículo sobre ìndice
de Castelli)
http://crf.medynet.com/contenido/2000/2/75-89.pdf
(excelente artículo sobre
aterogènesis)



59
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
ANEXO 1. TABLA PREGUNTA 11
Castelli ha sugerido los siguientes índices del riesgo asociados con los niveles de
colesterol y HDL colesterol.
Colesterol
(mg/dl)
Riesgo
HDL (mg/dl)
Sexo
Masculino
Riesgo
Sexo
Femenino
Riesgo
150 o menos
------
75 o más
------
------
185
0.67
70
------
0.52
200
0.75
65
0.45
0.64
210
0.80
60
0.55
0.80
220
0.90
55
0.67
1.00
225
1.00
50
0.82
1.25
244
1.50
45
1.00
1.55
260
2.00
40
1.25
1.94
300
3.00
35
1.50
------
…
…
30
1.75
------
25 o menos
2.00
------
Basado en estos índices, el factor de riesgo para desarrollar enfermedades
cardiovasculares se puede calcular para cada individuo. Por ejemplo un paciente del
sexo masculino con un colesterol total de 225 mg/dl (índice de riesgo de 1.00) y un HDL –
Colesterol de 45 mg/dl (índice de riesgo de 1.00) tiene un factor de riesgo total de 1.00 x
1.00 = 1.00, el cual se considera un riesgo normal o standard; mientras que un paciente
60
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas
PRÁCTICAS DE LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
del sexo masculino con un colesterol total de 300 mg/dl (factor de riesgo de 3.00) con un
nivel de HDL – Colesterol de 35 mg/dl (índice de riesgo de 1.5) tiene un factor de riesgo
total para desarrollar enfermedades cardiovasculares de 3.00 x 1.50 = 4.50 ó 4.5 veces
(450%) el riesgo considerado normal.
VALORES DE REFERENCİA
Hombres:
30 - 70 mg/dl
Mujeres:
35 - 85 mg/dl
Paciente con valores de HDL – Colesterol altos de 55 mg/dl son considerados con un
riesgo bajo en desarrollar enfermedades cardiovasculares, con niveles de 35 – 55 mg/dl,
el riesgo es intermedio y con valores menores de 35 mg/dl, el riesgo es alto. Cuando los
riesgos debido a los niveles del colesterol total se combinan con los riesgos debido a los
niveles de HDL – colesterol se obtiene una mejor indicación del riesgo general.
Nota: Existen otras formas de calcular el riesgo cardiovascular como Framingham,
Regicor, SCORE; que nos ayudan como una herramienta más y no como el único
elemento para la toma de decisiones.
61
Colectivo Docente de Bioquímica y Biología Molecular Dpto. Ciencias Fisiológicas