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DISEÑO DE MICROARREGLOS PARA LA DETECCIÓN DE HAPLOGRUPOS HUMANOS EN RESTOS OSEOS
ANTIGUOS DE POBLACIONES AMERINDIAS
Juan-José Alcalá-Huerta1,2, María de Lourdes Muñoz Moreno*2
1.-Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología, Instituto Politécnico Nacional (IPN).
2.-Departamento de Genética y Biología Molecular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), Instituto Politécnico
Nacional. Av. Instituto Politécnico Nacional 2508, San Pedro Zacatenco, Gustavo A. Madero, México D. F. 07360, Tel. 57473335, Fax. 57473392.
Palabras clave: microarreglos, antropología molecular, haplogrupos, SNP, ADNmt, mitocondrial.
Introducción. Un microarreglo, según el diseño, permite obtener
información sobre el comportamiento transcripcional de miles de
genes simultáneamente y/o la composición genómica de los
organismos en estudio en un área de superficie reducida. Su
sensibilidad, especificidad y capacidad de discriminación entre las
moléculas involucradas (3) permitió diseñar un microarreglo para la
identificación de los principales haplogrupos mitocondriales de
nativos americanos. La baja reproducibilidad en cualquier proceso
eleva los costos y dificulta la interpretación de los resultados. Por ello
para evitar las variaciones que se presentan normalmente durante la
deposición de las muestras en los microarreglos se probaron
diferentes
soluciones
con
sustancias
detergentes
y/o
desnaturalizantes para la deposición de material genético.
Metodología. El material óseo fue sometido a limpieza por abrasión
mecánica y radiación UV para eliminación de restos orgánicos y
material genético exógeno. La muestras corresponden a: Entierro B,
Cueva del Tecolote (Huapacalco, Hidalgo; m1); Peñon III, (Ciudad de
México; m2). La extracción de ADN total antiguo y moderno se realizó
por los método de fenol-cloroformo, alcohol isoamílico y de Chelex
respectivamente descritos previamente (1). Los individuos control en
estudio presentaron alguno de los 4 haplogrupos de interés. Las
regiones para cada haplogrupo en ADN antiguo como moderno se
amplificaron de acuerdo a previos reportes (2), para después
depositarlos en la laminilla del microarreglo usando diferentes
soluciones: CHAPS 1.6 mM, CHAPS 16 mM, DMSO, formamida,
DMSO/ formamida, DMSO/CHAPS 1.6 mM, DMSO/CHAPS 16 mM,
formamida/CHAPS 16 mM. Para las pruebas de hibridación se
utilizaron sondas previamente diseñadas específicas para determinar
los haplogrupos mitocondriales humanos A, C y D.
Resultados y discusión. Los estudios en ADN antiguo se confrontan
con problemas de degradación, contaminación y baja concentración
disponible. Se pudo extraer y amplificar ADN antiguo de muestras
óseas de alrededor de 12500 años de antigüedad. Para la deposición
se eligieron las soluciones que mostraron una señal homogénea en
su forma, intensidad y reproducibilidad. La formamida permitió mayor
reproducibilidad y homogeneidad en la señal en comparación con el
DMSO. El CHAPS como detergente no incremento de manera
apreciable la fluorescencia inespecífica. Se descartaron
contribuciones debidas al robot en las diferencias morfológicas al
comparar resultados entre laminillas duplicadas. Las soluciones con
detergentes como aditivo produjeron la mayor homogeneidad en la
morfología de los depósitos. La reproducibilidad se mejoró con la
combinación de detergentes y solventes como CHAPS y DMSO
(Figura 1). Los mejores resultados se presentaron con las soluciones
de DMSO/ formamida y DMSO/CHAPS 1.6 mM, prefiriendo la última
por las propiedades teratogénicas de la formamida.
Figura 1. Ejemplo de la señal generada para la deposición de
muestras con diferentes soluciones. Izquierda, DMSO/Chaps 1.6 mM;
centro, control negativo; derecha, DMSO 100%.
Finalmente se realizaron pruebas de hibridación con ADN mkoderno
y antiguo, logrando obtener el haplogrupo en
ADN de orígen
contemporáneo, de individuos control, y antiguo (Figura 2) obteniendo
la identificación del haplogrupo C..
F4
Figura 2. Resultados de la hibridación con las sondas. Lectura
realizada para la sonda marcada con HEX (532 nm,550LP). Muestras
E3, E4, F1, F2: ADN moderno; muestra F4: ADN antiguo.
Conclusiones y perspectivas. La solución óptima para la deposición
de ADN antiguo fue DMSO/CHAPS 1.6 mM. El microarreglo diseñado
es capaz de determinar los haplogrupos mitocondriales A, C y D. Las
perspectivas son validar el microarreglo para comprobar la veracidad
de los resultados y diseñar un microarreglo capaz de identificar todos
los polimorfismos mitocondriales utilizados para análisis filogenéticos
en poblaciones nativas americanas.
Agradecimientos. Dra. Ma. De Lourdes Muñoz M. °, Dr. Álvaro Díaz
B. °, Lic. Miguel Moreno G. °, Dra. Guadalupe Ramírez S., M. en C.
Mauro López A. °, Dr. Víctor Altuzar °°, Lic. Ma. Concepción Morales
°, Lic. Diana Bustos R.° ° CINVESTAV-IPN, °° Universidad
Veracruzana.
Referencias.
1. Muñoz M.L., Moreno-Galeana, M., Díaz-Badillo A., LozaMartínez, I., Macías-Juárez, V.M., Márquez-Morfín, L., JiménezLópez, J.C. y Martínez-Meza, A. En Aluja Pilar, Malgosa
Asunción, y Nogués Ramón (Coord.), Antropología y
Biodiversidad. Volumen 2, Barcelona España 2003. Ediciones
Bellaterra pp.170-182.
2. Torroni, A.; Schurr, T.; Yang, C., Szathmary, E.; Williams, R.;
Schanfield, M.; Troup, G.; Knowler, W., Lawrence, D.; Weiss, K.
y Wallace, D. 1992. Genet. 130: 153-162.
3. Urakawa, H.; Noble P.A.; El-Fantroussi, S.; Kelly, J.J. y Stahli,
D.A. 2002.. Appl. Environ. Microbiol. 68: 235-244.
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
DISEÑO DE MICROARREGLOS PARA LA DETECCIÓN DE
HAPLOGRUPOS HUMANOS EN RESTOS OSEOS ANTIGUOS
DE POBLACIONES NATIVAS AMERICANAS
INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA
MODALIDAD DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN.
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERO BIOTECNÓLOGO.
PRESENTA:
JUAN JOSÉ ALCALÁ HUERTA
DIRECTOR DE PROYECTO: Dra. María de Lourdes Muñoz Moreno (CINVESTAV-IPN).
ASESOR INTERNO: Dra. María Guadalupe Ramírez Sotelo (UPIBI-IPN).
EVALUADOR: M. en C. Patricia Vázquez Lozano (UPIBI-IPN).
México, DF., Mayo del 2008
CONTENIDO
CONTENIDO
Pág.
RESUMEN
I.
1
INTRODUCCIÓN
1.1 MICROARREGLOS
1.1.1 ELABORACIÓN DE MICROARREGLOS
2
2
2
1.1.1.1 Sondas
3
1.1.1.2 Fabricación de Microarreglos
3
1.1.1.2.1 Microarreglos por síntesis in situ
3
1.1.1.2.2 Microarreglos por deposición
3
1.1.1.3 Soporte
4
1.1.1.4 Recubrimiento del soporte
4
1.1.1.5 Impresión
4
1.1.1.6 Deposición
4
1.1.1.7 Robot
4
1.1.1.7 Aplicadores
5
1.1.1.8 Fijación
5
1.1.2 HIBRIDACIÓN
5
1.1.3 LAVADO
5
1.1.4 LECTURA
5
1.2 ADN ANTIGUO
6
1.2.1 ADN MITOCONDRIAL
9
1.2.2 RECOMBINACIÓN
10
1.2.3 POLIMORFISMOS
10
1.2.4 HAPLOGRUPOS
10
1.2.5 CONTAMINACIÓN
10
1.2.6 INHIBIDORES
11
II.
JUSTIFICACIÓN
12
III.
OBJETIVOS
14
IV.
METODOLOGÍA
15
4.1
OBTENCIÓN DE ADN
15
4.2
AMPLIFICACIÓN DE ADN
15
4.3
ELECTROFORESIS
16
4.4
DETERMINACIÓN DE HAPLOGRUPOS
16
4.5
INICIADORES DE LA PCR
16
4.6
DEPOSICIÓN DEL ADN
16
4.7
INMOVILIZACIÓN
17
4.8
DESNATURALIZACIÓN
17
4.9
HIBRIDACIÓN
17
4.10 LAVADO
17
4.11 ADQUISICIÓN DE LA IMAGEN
18
V.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
20
5.1 ADN ANTIGUO
21
5.2 SOLUCIONES PARA IMPRESIÓN
26
5.3 SONDAS
30
5.4 PURIFICACIÓN DEL ADN
38
5.5 PROCESO DE FABRICACIÓN DEL MICROARREGLO
39
5.6 HIBRIDACIÓN
40
VI.
CONCLUSIONES
45
VII.
PERSPECTIVAS
46
ANEXOS
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla
Tabla 1
Página
Distribución general de las muestras en la laminilla para
28
prueba con las diferentes soluciones para la inmovilización
del ADN.
Tabla 2
Temperaturas de fusión teóricas para cada una de las
35
sondas.
Tabla 3
Marcas fluorescentes evaluadas para el marcaje de
36
oligonucleótidos
Tabla 4
Equipo disponible para evidenciar la hibridación.
37
Tabla 5
Características de los fluoróforos destinados al marcaje de
37
las sondas.
Tabla 6
Fluoróforos compatibles con los láseres disponibles.
38
Tabla 7
Longitud, secuencia y marcaje de las sondas para
38
determinar los
polimorfismos
de
característico de cada haplogrupo.
un
sólo nucleótido
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
Página
Figura 1
Mapa del ADN mitocondrial humano.
11
Figura 2
Procedimiento experimental.
19
Figura 3
Amplificados de ADNmt.
22
Figura 4
Amplificados de ADNmt.
22
Figura 5
Optimización de la amplificación de ADN moderno.
24
Figura 6
Extracción de ADN antiguo.
24
Figura 7
Visualización de la calidad del ADN a partir de las
25
extracciones. Presencia de contaminantes.
Figura 8
Electroforesis. Presencia de contaminantes en el ADN
25
antiguo.
Figura 9
Vista general de la impresión de ADN para la
26
optimización de la inmovilización.
Figura 10
Distribución del Microarreglo de la Figura 9.
27
Figura 11
Acercamiento del Microarreglo elaborado para la
29
optimización de la inmovilización.
Figura 12
Acercamiento del Microarreglo elaborado para la
30
optimización de la inmovilización
Figura 13
Elección de fluoróforos. Acoplamiento de los picos de
35
absorción.
Figura 14
Distribución de las muestras anterior a la deposición para
41
el Microarreglo destinado a la hibridación con las sondas.
Figura 15
Microarreglo A33. Vista general.
42
Figura 16
Microarreglo A33. Acercamiento.
42
Figura 17
Microarreglo B35. Vista general.
44
Figura 18
Microarerglo B35. Acercamiento.
44
RESUMEN
En este trabajo se aplica la tecnología de Microarreglos a estudios de polimorfismos en el ADN
mitocondrial humano con aplicaciones en la antropología, arqueología, medicina forense y medicina
genética. Como en medicina forense y genética de poblaciones para estudios de medicina preventiva,
en lo que refiere a antropología de la salud; estudios migracionales, por medio de análisis filogenéticos,
y estudios de evolución.
Se presenta el diseño de Microarreglos para la detección de los haplogrupos mitocondriales
humanos A, C y D en el ADN de origen actual y de restos antiguos, permitiendo, dada la gran cantidad
de información que es posible obtener, facilitar la detección de estos marcadores biológicos para un
análisis verás, rápido y a costo menor a los métodos empleados actualmente, favoreciendo el análisis de
pequeñas cantidades de ADN. Con ello estos marcadores se pueden analizar en forma masiva y con
una gran sensibilidad.
La tecnología de Microarreglos se aplica sobrellevando las dificultades que confieren el trabajo
con ADN antiguo (Pääbo S. y col., 1989) en particular el estudio de haplogrupos mitocondriales en
poblaciones prehispánicas.
El presente proyecto tiene como propósito contribuir con la tecnología de Microarreglos al área
de la antropología, particularmente en lo que se refiere a la detección de haplogrupos mitocondriales
utilizados en análisis forenses, filogenéticos, movimientos migracionales y estudios de evolución.
Se presenta un estudio de los procedimientos para la extracción y amplificación por PCR de ADN
antiguo y sus diferencias de este con el ADN moderno; el diseño de Microarreglos de ADN para la
detección de los haplogrupos mitocondriales A, C y D utilizados en estudios filogenéticos de poblaciones
nativas americanas; la variación y repetibilidad de la morfología e intensidad de la señal generada en los
depósitos del Microarreglo con respecto a las sustancias para la deposición utilizadas en la
inmovilización de ADN antiguo y moderno; el diseño de sondas para la detección de polimorfismos de un
solo nucleótido correspondientes a los haplogrupos mitocondriales A, C y D; la metodología de elección
de los fluorófos adecuados para el marcaje de las sondas; las condiciones de hibridación para las
sondas diseñadas.
I.
INTRODUCCIÓN
1.1
MICROARREGLOS
1.1.1 ELABORACIÓN DE MICROARREGLOS
Este capítulo comprende los antecedentes y conceptos necesarios para introducirse a la
tecnología de Microarreglos.
Un Microarreglo de ADN consiste en una superficie sólida en la que han sido inmovilizadas
ordenadamente moléculas
de ADN por unión química en áreas definidas y localizables. Su
funcionamiento se basa en la propiedad de las bases nitrogenadas de hibridar sólo cuando son
complementarias. Se detecta la hibridación por medio de un lector óptico, el cual recibe una señal
generada por un marcador adherido a una de las cadenas que participan en la conformación de la
molécula de ADN.
Esta tecnología tiene antecedentes desde finales de los setentas del siglo XX, en las bibliotecas
de ADN recombinante hechas en bacterias o levaduras y almacenadas en placas tipo ELISA. Las clonas
que conformaban una biblioteca se analizaban para identificar segmentos traslapados y generar así los
mapas físicos de segmentos genómicos o incluso de genomas bacterianos completos. Kafatos y col.
(1979) introdujeron la idea original de analizar múltiples secuencias simultáneamente, aplicándolas
sobre papel filtro, técnica conocida actualmente como dot blot. Hoheisel y col. (1994) propusieron la
idea de usar las bibliotecas de ADN recombinante arregladas sobre papel filtro a una elevada densidad
como herramientas para identificar secuencias relacionadas. Una importante innovación introducida por
estos autores fue reemplazar el procedimiento manual de picar e imprimir clonas sobre el papel filtro, por
un procedimiento robotizado. La automatización incrementó la velocidad del análisis, eliminó errores
humanos, permitió analizar una muestra determinada a una mayor densidad (se pudieron imprimir miles
de clonas) y mejoró la calidad de las placas de papel así preparadas.
Si bien el papel filtro presentaba algunas ventajas como el permitir cargar grandes cantidades de
ADN en una pequeña área, proporcionar una gran superficie de unión y permitir cargar la muestra en
grandes volúmenes de líquido, presentaba también algunas desventajas, por ejemplo, los límites y la
forma de los depósitos no eran definidos y la cantidad de ADN cargado era difícil de controlar,
adicionalmente, no era posible reducir el tamaño de los depósitos más allá de cierto límite, esto sumado
al hecho de que el papel se expande cuando se humedece y se deforma cuando se seca. El tener una
cantidad conocida de ADN, así como depósitos con tamaño y forma definidos, es crucial para el análisis
automatizado de las señales de hibridación. Con la tecnología actual, cuando se colocan sobre un
soporte sólido, las moléculas de ADN forman una monocapa que satura la superficie, esto permite que
la cantidad de muestra unida al soporte sea consistente entre diferentes regiones del Microarreglo.
Actualmente esta tecnología se esta aplicado entre otros al análisis de la expresión génica,
detección de mutaciones y polimorfismos, secuenciación, seguimiento de terapia, medicina preventiva,
búsqueda y toxicología de fármacos, y diagnóstico molecular.
1.1.1.1
Sondas
Existen diferentes formas de nombrar al ADN en el arreglo y al ADN en solución al momento de
la hibridación. En este trabajo se referirá al oligonucleótido marcado como “reportero” (comúnmente
denominado sonda) y al ADN inmovilizado en el arreglo como “extracto de hibridación” de acuerdo a la
MGED.
1.1.1.2
Fabricación de Microarreglos.
Actualmente existen dos principales vías para la fabricación de Microarreglos: por deposición
automatizada y por síntesis in situ.
1.1.1.2.1 Microarreglos por síntesis in situ.
En este tipo de arreglos los oligonucleótidos son sintetizados base por base en la superficie del
arreglo; por la exposición subsecuente de la superficie con diferentes máscaras. Esto se lleva acabo por
medio de reacciones covalentes entre el grupo OH 5´ del azúcar del último nucleótido y el grupo fosfato
del siguiente nucleótido. Cada nucleótido agregado al oligómero posee un grupo protector en la posición
5´ para prevenir la adición de más de una base durante cada paso de síntesis. Posteriormente el grupo
protector es convertido en un grupo hidroxilo con ayuda de un ácido o por medio de un rayo de luz antes
del siguiente paso de síntesis.
Los métodos de desprotección de los nucleótidos definen a tres principales tecnologías para la
elaboración de arreglos in situ:
1) Fotodesprotección utilizando máscaras: la base de los Microarreglos de Affymetrix.
2) Fotodesprotección sin la utilización de mascaras: método utilizado por Nimblegen y Febit.
3) Desprotección química con síntesis vía inkjet: método utilizado por Rosetta, Agilent y Oxford
Gene Technology.
1.1.1.2.2 Microarreglos por deposición.
Es la tecnología por la cual fueron elaborados los primeros Microarreglos. Se realiza el arreglo
utilizando un brazo robótico con movimiento en los ejes X, Y y Z para la deposición de las muestras, la
cual se realiza en tres pasos:
a) Elaboración de las sondas.
b) Deposición del ADN objetivo en la superficie sólida destinada para el arreglo con un
robot.
c) Hibridación de la sonda y el ADN arreglado ordenadamente en la superficie sólida.
1.1.1.3
Soporte
Las superficies sobre las que se pueden imprimir los Microarreglos de ADN son dos, las
membranas de materiales como la nitrocelulosa o el nylon y las laminillas de vidrio o polipropileno,
semejantes a las que se utilizan para microscopía. Estas últimas son los de mayor uso, ya que permiten
tener un mejor control sobre el diámetro de las aplicaciones y la distancia entre ellas. Los soportes
sólidos ofrecen estabilidad dimensional y rigidez.
1.1.1.4
Recubrimiento del soporte.
Las laminillas utilizadas como soporte se pueden conseguir con diferentes recubrimientos como:
poli-L-lisina, aminas y aldehídos, las cuales permiten la unión química del ADN con la superficie.
1.1.1.5
Impresión.
La unión del oligonucleótido o cadena de ADN puede ser por medio de enlaces covalentes y
enlaces no covalentes.
Con la unión covalente, el ADN es adicionado a un grupo amino alifático primario sobre la
superficie sólida. El oligonucleótido adicionado al grupo amino normalmente se une por el lado 5´ tanto
en oligonucleótidos como en ADN de doble cadena.
En la unión no covalente, el enlace es del tipo de atracciones electrostáticas entre el esqueleto
de fosfato del ADN y el grupo NH2 perteneciente a la superficie sólida. La interacción toma lugar en
varios puntos de la cadena de ADN. La unión no covalente es preferida en las arreglos de ADNc (Stekel,
2003), y oligonucleótidos, que comúnmente son muy pequeños como para que la fuerza electrostática
sea suficiente para mantenerlos adheridos a la superficie se prefiere la unión covalente.
1.1.1.6
Deposición.
Las muestras de ADN son organizadas en bandejas con micropozos. Un robot que es capaz de
acceder sucesivamente a cada uno de los pozos toma muestra por medio de una serie de agujas
(aplicadores) organizadas en red. Las agujas son utilizadas para la transferencia del líquido de los
micropozos a la superficie sólida utilizada para el arreglo.
Durante la deposición se deben controlar la humedad y la temperatura.
1.1.1.7
Robot.
Se trata de un brazo robótico con movimiento en los ejes X, Y y Z, siendo su característica más
importante el poderse desplazar en cualquiera de estas direcciones con una resolución de una décima
de milímetro. Existen dos tipos de estos robots: los primeros y más sencillos en los que una superficie
conteniendo las laminillas sobre las que se va a imprimir, se desplaza en los ejes (X, Y) y la cabeza con
los aplicadores sube y baja en el eje Z depositando la muestra sobre la laminilla. En el otro tipo de robots
las laminillas permanecen estáticas y un brazo mecánico se desplaza en los tres ejes aplicando las
muestras. Los robots impresores de contacto cuentan con una cabeza en la que se pueden colocar de 1
a 48 aplicadores.
1.1.1.8
Aplicadores.
Los aplicadores, son pequeñas agujas con una ranura en la punta similar a la punta de una
pluma fuente y al igual que en ésta, la muestra se toma y se deposita por capilaridad. Los aplicadores
más comunes tienen una capacidad de 0.25 μl y pueden hacer al menos 100 aplicaciones, es decir
0.0025 μl por aplicación. También existen aplicadores con capacidad de hasta 300 aplicaciones y
aplicadores sólidos, es decir sin ranura, y que pueden hacer hasta 10 aplicaciones (Ramírez y col.,
2003).
1.1.1.9
Fijación.
Una vez impresas las laminillas, el ADN debe ser fijado a la superficie. Esto se puede lograr
horneando los Microarreglos a 80°C por cuatro horas o con un entrecruzador de luz ultravioleta.
1.1.2 HIBRIDACIÓN
El procedimiento consiste en aplicar la solución de hibridación con las sondas sobre la laminilla y
cubrirla con un cubreobjetos para permitir que la solución cubra todo el Microarreglo de igual forma que
se hace una preparación para microscopía. La reacción es capilar, por lo tanto requiere de muy poco
volumen. Sin embargo es importante señalar que se debe tener cuidado con la evaporación. Para evitar
que esto suceda, los microrreglos se colocan en cámaras húmedas diseñadas para éstos propósitos.
1.1.3 LAVADO
Al igual que la hibridación, el lavado de un Microarreglo utiliza reglas similares de temperatura y
astringencia que se siguen en los experimentos tipo Southern o Northern, con una pequeña diferencia
que es, el secado de las laminillas. Para secar las laminillas es recomendable utilizar la centrifugación ya
que cualquier residuo de sales por evaporación puede afectar la lectura.
1.1.4 LECTURA
Los lectores utilizan un láser para excitar las moléculas fluorescentes unidas ADN, para obtener
la imagen de cada una de las muestras contenidas en el Microarreglo. Este procedimiento se hace para
cada uno de los fluoróforos existentes en el Microarreglo obteniéndose una imagen para cada fluoróforo.
Para la obtención de estas imágenes se debe ajustar la intensidad del láser y la sensibilidad de la
cámara o de los fotomultiplicadores, de tal forma que todas las imágenes den valores semejantes de
fluorescencia total. Una vez obtenidas estas imágenes, pueden ser combinadas para obtener un aspecto
visual del Microarreglo.
1.2
ADN ANTIGUO
Los primeros estudios en los que se determinaron variaciones genéticas entre los grupos
humanos se encaminaron a la detección de los grupos sanguíneos ABO y la presencia de variantes
alélicas que determinan el tipo de sangre. La importancia de estas investigaciones se acentuó aun más
cuando Fisher (1918) mostró que podía trazarse la historia evolutiva, a través de estudios realizados,
atendiendo a la expresión genotípica de diversos cromosomas presente en poblaciones, donde dicha
expresión se perpetúa a través de mecanismos hereditarios.
Cuando se compara la secuencia de aminoácidos de la albúmina o el citocromo c en diversos
animales, se puede observar que entre más cercanas sean dos especies, más parecidos son sus
proteínas (Wilson, A., y col., 1987). Se pueden obtener medidas cuantitativas del parecido de unas
especies con otras de acuerdo con las alteraciones que sufren sus proteínas en regiones o residuos
específicos. Este tipo de estudios permitió el establecimiento de un conocimiento medio de las bases
moleculares del proceso evolutivo. Al igual que en el caso de estos relojes proteicos, las diferencias
comparativas en las secuencias de nucleótidos se convierten en distancias genéticas y establecen
relaciones entre especies emparentadas.
Los trabajos de Hutchinson y col. (1974), Potter y col. (1975) y Upholt y Dawid (1977) pusieron
de manifiesto la utilidad del ADNmt para estudios de genética de poblaciones.
Conjuntamente con los análisis del ADN mitocondrial (ADNmt), se han utilizado marcadores del
cromosoma Y que han probado tener un inestimable valor en la generación de modelos utilizados para
delinear cómo fue la evolución humana (Cavalli-Sforza y Feldman, 2003). A partir de este tipo de
estudios se puede incrementar el conocimiento acerca del pasado, presente e incluso futuro evolutivo
del ser humano.
El ADNmt se ha convertido en una herramienta privilegiada en estudios evolutivos, como la
reconstrucción de los orígenes del hombre, la historia de las poblaciones, el análisis de migraciones
humanas y los estudios filogenéticos de poblaciones extintas en restos de ADN antiguo, entre otros
(Stoneking, 1993).
Los polimorfismos del ADN mitocondrial son herramientas en el estudio comparativo de
poblaciones modernas y antiguas. Entre los más usados están los haplogrupos mitocondriales basados
en la presencia o ausencia de sitios de restricción (RFLP, polimorfismo de longitud de fragmentos de
restricción) específicos y un sistema de inserción/deleción (Sandoval J. y col., 2004).
Los análisis filogenéticos de estos polimorfismos específicos para cada etnia definen grupos de
ADNmt denominados haplogrupos o linajes. En la genética los haplogrupos están determinados por las
variaciones encontradas en el ADNmt. Los estudios que analizan el ADNmt por variación de sitios de
restricción han permitido establecer que las poblaciones humanas nativas están definidas por uno o más
linajes específicos de cada continente. La incidencia de estas mutaciones específicas en la secuencia
del ADNmt humanos de cada continente y su especificidad en cada grupo humano, los hace marcadores
genéticos importantes para inferir el origen étnico y geográfico de la especie humana (Johnson y col.,
1983; Reed y Takezaki, 1995).
En la mayoría de los ADNmt de poblaciones nativas americanas tanto contemporáneas como
antiguas prevalecen cuatro linajes de ADNmt descritos como haplogrupos fundadores: A, B, C, D
(Wallace y col., 1985; Torroni y col., 1992, 1993, 1994; Horai y col., 1993), siendo que la frecuencia de
cada uno varía en las diferentes poblaciones. Estos haplogrupos trazan la ascendencia y descendencia
matrilineal de la especie humana.
En ocasiones, la identificación de cadáveres mediante las técnicas clásicas de la medicina
forense (huellas dactilares, fórmula dentaria, medidas antropológicas, etc.) no permite definir con
precisión la identidad del sujeto en cuestión y es necesario recurrir a técnicas de análisis de ADN.
Existen dos factores como son el tiempo transcurrido y las condiciones medioambientales que ocasionan
la degradación del material genético. Esta circunstancia hace que al quedar afectado el ADN, su análisis
mediante marcadores genéticos nucleares sea en ocasiones inviable, tal es así que para la medicina
forense se dispone del ADNmt dadas ciertas características que le confieren ventaja con respecto al
ADN nuclear al paso del tiempo. En lo que respecta a restos humanos de conflictos bélicos, es posible
vislumbrar la posible identidad de estos a través del uso de los haplogrupos mitocondriales
de los
individuos en cuestión, de tal modo que se de su posible procedencia geográfica.
La determinación de haplogrupos en poblaciones humanas tanto antiguas como modernas es
una herramienta que permite aproximarse a la historia de la humanidad.
Dentro del campo de la antropología, los estudios de parentesco y movimientos poblacionales se
han visto extraordinariamente enriquecidos por los avances de la biología molecular. Por medio de la
identificación del posible origen genético de poblaciones prehispánicas presentes en entes de carácter
arqueológico se facilita el estudio de la sociedad mexicana, principalmente respecto a su origen, tópicos
socioeconómicos y rituales. Igualmente en este punto se toman como ventajas las características del
ADNmt en lo que respecta del ADN nuclear.
El estudio científico de las poblaciones del pasado permite el abordaje de cuestiones de alto
interés para reconstruir los caminos evolutivos y adaptativos de nuestra especie (Buikstra y Ubelaker,
1994). Los análisis de ADN antiguo junto con otras herramientas permiten establecer estimaciones de
las relaciones genéticas existentes entre poblaciones del pasado.
Los resultados de estos análisis
toman importancia desde el punto de vista de la historia evolutiva de la población, buscando estimar la
importancia relativa de fenómenos como la deriva génica, la selección, el flujo génico y la influencia de la
separación geográfica y otros mecanismos de aislamiento. Además los análisis del ADN antiguo pueden
aportar información sobre aspectos arqueológicos e históricos, en donde se dilucida acerca de la
asociación de los cambios biológicos con los cambios culturales. De tal modo que contribuye a conocer
los límites geográficos o temporales de la población, los patrones de residencia post-marital, grupos de
parentesco, agrupamientos sociales o eventos de contacto entre dos grupos biológicamente bien
diferenciados.
El ADN antiguo presenta un conjunto de características que lo diferencian del ADN extraído de
muestras actuales como lo son la escasez, fragmentación y modificaciones moleculares.
La extracción de ADN procedente de algunos animales extintos supuso el comienzo de las
investigaciones en ADN antiguo (Higuchi y col., 1984). Esta línea de investigación utiliza las técnicas de
la biología molecular por lo que experimentó, a finales de los años 80, un gran desarrollo gracias a la
invención de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). La década siguiente sufrió un relativo
estancamiento, debido, sobre todo, a una serie de limitaciones técnicas en el campo del ADN antiguo.
Sin embargo,
se han alcanzado avances de extrema importancia, sobre todo relacionados con la
recuperación de ADN, análisis de calidad y cantidad, así como con la mejora en el procesamiento de los
datos genéticos obtenidos. Como resultado de esta combinación de factores, el estudio del ADN antiguo
es un campo preparado para empezar a ofrecer grandes resultados científicos, inimaginables hace tan
solo unos años.
Una prueba de estos avances lo constituye el estudio del material genético procedente de
Neandertales. Mientras que la recuperación de las primeras secuencias de ADN mitocondrial de
Neandertales, de menos de 400 pares de bases, supusieron un hito científico en los años 1997 y 2000
(Krings M y col., 1997; Ovchinnikov IV y col., 2000), se ha logrado recuperar ADN nuclear de un millón
de pares de bases de longitud de Neandertal (Green, 2006). A pesar de los avances recientes, su
aplicación ha sido muy limitada, por lo que su potencial sigue siendo aún muy grande.
La recuperación de material genético de restos antiguos combina la fascinación del estudio del
pasado con la potencialidad para establecer genealogías. Al mismo tiempo, presenta numerosas
dificultades técnicas debido a la degradación del material genético y contaminantes presentes en la
muestra a analizar, lo que lo convierte en un campo de estudio con problemas a resolver.
Es en este punto donde se aborda el presente trabajo, donde se aplica la tecnología de
Microarreglos, sobrellevando las dificultades que confieren el trabajo con ADN antiguo (Pääbo S. y col.,
1989) en particular el estudio de haplogrupos mitocondriales en poblaciones prehispánicas.
1.2.1 ADN MITOCONDRIAL
El ADNmt posee características que le hacen ideal para estudios de restos antiguos:
¾
Es una molécula circular cerrada de doble cadena (Figura 1), rasgo que le confiere mayor
estabilidad frente a fenómenos degradativos respecto al genoma nuclear.
¾ Consta de 16,569 pares de bases (pb) en la cual su secuencia se conoce en toda su longitud
(Anderson S. y col., 1981; Andrews y col., 1999). La numeración del genoma, establecida por
Anderson en 1981, comienza arbitrariamente cerca del punto medio de la región control, de
forma que esta región se extiende desde la posición 16,024 a la 16,569, continuando
después de la posición 1 hasta la posición 576.
¾ Presenta alrededor de 3000 a 5000 copias por célula (Shuster y col. 1998) facilitando su
análisis.
¾ El ADNmt codifica para 13 polipéptidos del complejo respiratorio mitocondrial y para los
genes correspondientes al ARN ribosomal (ARNr) y ARN de transferencia (ARNt) de la
síntesis de proteínas mitocondriales (Shoffner y Wallace 1990). Estas regiones codificantes
se alteran con una tasa de 2 a 4% por millon de años (Cann y col. 1987; Stoneking y col.
1990), mientras que la secuencia no codificante, conocida como región control o región Dloop (displacement-loop), se altera alrededor de un 8% por millón de años (Greenberg y col.
1983; Horai and Hayasaka 1990; Vigiliant y col. 1989). La tasa de mutación es la frecuencia
con que ocurren cambios en la secuencia nucleotídica del ADN. De esta forma, conociendo
cada cuánto tiempo se produce una alteración, y cuántas diferencias hay entre dos individuos
que se quieran comparar, se pueden determinar hace cuánto tiempo tuvieron un antepasado
en común. Lo mismo sucede en el caso de realizar comparaciones entre poblaciones.
¾ Es heredado por vía materna (Case y Wallace 1981; Giles y col. 1980) y no se recombina a
partir de la fecundación (Schurr y col. 1990), por lo tanto los cambios son desarrollados por
una acumulación de mutaciones a través de la línea materna (Jonson y col. 1983). A
diferencia del ADN nuclear que se hereda de ambos progenitores, el ADN de la mitocondria
se hereda como un bloque de madre a sus descendientes. De este modo únicamente los
descendientes del sexo femenino podrán transmitir su herencia mitocondrial. Esta
circunstancia se debe a que las mitocondrias contenidas en los espermatozoides no
intervienen directamente en el proceso de fecundación.
¾ Adicionalmente su secuencia tiene una tasa de mutación con una frecuencia 10 veces más
rápida que el ADN nuclear (Brown y col. 1979, 1982; Miyata y col. 1982; Neckelmann y col.
1987; Wallace y col. 1987), permitiendo hacer distinciones entre poblaciones muy
relacionadas.
1.2.2 RECOMBINACIÓN
La recombinación es el proceso por el cual dos cromosomas homólogos pueden intercambiar
material genético (González A., 2006). Este proceso, de suma importancia en la generación de la
variabilidad y de nuevas recombinaciones genéticas en la descendencia puede ser problemático al
realizar la búsqueda del origen en la secuencia de una porción del material genético. Si no ha habido
recombinación y la herencia es uniparental, como es el caso de ADN mitocondrial, como ya se recalcó,
se puede reconstruir la genealogía por la línea materna de un individuo y de una especie. De tal modo
con todo lo antes mencionado el único sistema por el cual se puede introducir variaciones serán, por lo
tanto, las mutaciones.
1.2.3 POLIMORFISMOS
Las variaciones en la secuencia del ADNmt pueden ser analizadas haciendo uso de los
polimorfismos. Los polimorfismos del ADN mitocondrial son herramientas en el estudio comparativo de
poblaciones modernas y antiguas. Entre los más usados están los haplogrupos mitocondriales basados
en RFLP
y un sistema de inserción/deleción. El estudio de los RFLPs radica en el corte con
endonucleasas de restricción de los productos amplificados por PCR. Si dos amplicones presentan una
variación de la secuencia nucleotídica, en los sitios de reconocimientos de las enzimas de restricción,
generarán distintos patrones de fragmentos.
1.2.4 HAPLOGRUPOS
Los estudios de ADNmt de poblaciones nativas americanas han definido cuatro haplogrupos
principales. Estos cuatro haplogrupos pueden ser perfectamente distinguidos con análisis de RFLPs por
la ganancia o pérdida de uno o más sitios de restricción o por la presencia o ausencia de una deleción
de
9 pb de la región intergénica COOO-tARNlys (Schurr, 1990). En la Figura 1 se muestra la
localización en el genoma mitocondrial humano de los polimorfismos característicos de los cuatro
principales haplogrupos en poblaciones nativas de América.
1.2.5 CONTAMINACIÓN
La contaminación con ADN de origen diferente a la muestra, aunado a las características del
ADN antiguo, produce la amplificación preferente del primero de los dos tipos durante el proceso de
PCR, incrementando los problemas dada la elevada sensibilidad de dicha técnica. La contaminación de
la muestra puede producirse en el momento de la deposición en el lugar de entierro; antes, durante y
después del aislamiento de su material genético en el laboratorio. La contaminación con ADN de la
misma especie a las muestras a analizar puede resultar problemática debido al objetivo del estudio
realizado en el presente proyecto. El ADN contaminante puede introducirse directamente en la muestra
mientras esta es manipulada por arqueólogos, personal de museo o por los propios investigadores; por
ejemplo a través de la descamación de la piel o de los aerosoles de la respiración. Otros vehículos de
contaminación pueden ser el material y reactivos empleados para su análisis genético. En el laboratorio,
durante las fases de extracción y amplificación, puede darse también contaminación por otras fuentes
mucho más difíciles de detectar y erradicar: el ADN extraído con anterioridad y las amplificaciones de
anteriores experimentos. Estos contaminantes pueden flotar en forma de aerosoles en el ambiente, o
quedar adheridos tras una amplificación y/o extracción a las superficies o al material de trabajo no
desechable. Este tipo de contaminación se conoce comúnmente con el nombre de contaminación de
arrastre.
1.2.6 INHIBIDORES
Adicionalmente, la mayor parte de los extractos de ADN antiguo, pueden contener otras
moléculas que inhiben la reacción de PCR y que han pasado a ser conocidas bajo el nombre de
inhibidores. Esta denominación agrupa un conjunto de moléculas de naturaleza diversa, que no son la
misma en todos los extractos, todo depende del origen y modo de preservación de la muestra. Dichos
inhibidores pueden tratarse de compuestos del suelo: ácidos húmicos y/o fúlvicos, residuos de porfirinas
y/o productos de su degradación y taninos; de subproductos de degradación orgánica: productos de
Maillard, productos de degradación del ADN entre otros (Pääbo y col., 1989).
.
663
Ganancia de un sitio de
restricción para la enzima Hae
III en la posición 663
corresponde al haplogrupo A
Pérdida de un sitio para la
enzima Alu I en la posición 5176
conferirá el haplogrupo D
13259
5176
Ganancia de un sitio de
restricción para la enzima
Hinc II en la posición 13259
será para el haplogrupo C
Figura 1. Mapa del ADN mitocondrial humano. Localización de los polimorfismos que determinan los
cuatro principales haplogrupos de poblaciones nativas americanas (tomado de López, 2007).
II.
JUSTIFICACIÓN
Contribuir al esclarecimiento de los flujos migratorios, origen, asentamiento y estructura genética
de poblaciones antiguas. Lo que habrá de apoyar el trabajo antropológico y arqueológico referente a
grupos humanos.
La ventaja de utilizar el ADNmt surge cuando se tienen muestras comprometidas de las que
apenas se suele tener restos óseos o pelo, en cantidades mínimas. Esta tecnología no sólo se podría
utilizar con muestras óseas sino inclusive con otro tipo de tejidos.
Se puede estudiar de manera directa la composición genética de las poblaciones del pasado,
compararlas con las del presente, e inferir los procesos evolutivos que han tenido lugar a lo largo de la
historia.
El diseño de Microarreglos para la determinación de haplogrupos humanos no únicamente se
puede aplicar en poblaciones antiguas sino incluso en poblaciones contemporáneas, en especial en
investigaciones forenses cuando el material biológico se asocia a un presunto criminal. La genética
forense es una especialidad de las ciencias forenses
que se ocupa del estudio de los caracteres
hereditarios y el análisis del polimorfismo o variabilidad genética humana aplicada a problemas de orden
legal.
Tradicionalmente la reconstrucción de nuestro pasado ha sido una tarea desarrollada por
antropólogos, historiadores, arqueólogos y paleontólogos, mientras que la evidencia indirecta de las
poblaciones humanas modernas la ofrecen los lingüistas y más recientemente los biólogos moleculares.
La reconstrucción del pasado de una población permite un mayor sentido de pertenencia, y así,
reafirmar su identidad. Los valores que han unido a los mexicanos a lo largo de siglos se vuelven
presente vivo a través de la investigación, la recuperación y el cuidado de ese universo patrimonial;
proyectan el futuro del país con solidez, afirmando la viabilidad de la nación.
El análisis por medio de Microarreglos de poblaciones en específico podría ayudar en la
predicción de la asociación de los haplogrupos mitocondriales con enfermedades determinadas.
Una peculiaridad del ADN mitocondrial es que procede en su totalidad de la madre, mientras que
el ADN cromosómico procede de los dos progenitores en partes equivalentes. Esto es importante para
los estudiosos de la antropología humana, pero también para los genetistas humanos, puesto que un
buen número de enfermedades genéticas son causadas por mutaciones que afectan a este pequeño
número de genes mitocondriales. La investigación de los polimorfismos mitocondriales podría dar alguna
relación posible entre poblaciones determinadas y enfermedades de origen mitocondrial.
La vanguardia, eficacia y competitividad requieren de un costo; costo que sería mayor si se
carece de tecnología que facilite los procesos de investigación.
Por otra parte la utilización de Microarreglos en lugar o al mismo tiempo que los métodos
comunes (secuenciación y reacciones de restricción) para la determinación de haplogrupos conlleva
muchas ventajas sobre ellos, entre las que se encuentran: la posibilidad de analizar un número de
mucho mayor de secuencias a la vez y de manera simultánea, disminución de errores de manipulación
durante el ensayo, debido a la automatización del proceso, generación de resultados en menor tiempo,
por lo mismo del manejo de varias muestras y diferentes ensayos para cada muestra en una sola
laminilla, y lo mas importante de esto,
evitar a futuro en la medida de lo posible el uso de PCR,
eliminando los problemas que se presentan con los llamados inhibidores de las polimerasas utilizadas; y
los requerimientos mínimos de ADN (picomoles), considerando la cantidad de muestra disponible para
tomar de los restos antiguos con carácter de patrimonio cultural, así como las mínimas cantidades de
ADN presentes en la propia muestra debido a su degradación al paso del tiempo y condiciones de
conservación.
III.
OBJETIVOS
OBJETIVOS GENERALES:
o Diseño de Microarreglos para la detección de haplogrupos del ADN mitocondrial humano
en restos óseos antiguos de poblaciones amerindias.
OBJETIVOS PARTICULARES:
o Obtención de ADN de restos óseos prehispánicos.
o Obtención de los fragmentos de ADN correspondientes a cada haplogrupo.
o Amplificación de regiones conteniendo el sitio de restricción para cada haplogrupo.
o Diseño de las sondas especificas para la detección de haplogrupos.
o Prueba de diferentes soluciones para fijado en la laminilla de Microarreglos.
o Búsqueda de las condiciones óptimas de hibridación.
o Pruebas preliminares de los Microarreglos diseñados en ADN moderno y ADN antiguo.
IV.
METODOLOGÍA
En este capítulo se describe cada punto del procedimiento experimental llevado acabo, y que se
resume en la Figura 2.
4.1
Obtención de ADN.
Para la obtención del ADN de los restos óseos antiguos primeramente se procedió a la limpieza
por abrasión mecánica con la finalidad de remover las partículas presentes en la parte externa de la
muestra. La muestra posteriormente es sometida a -70 °C por lo menos una hora y molienda en mortero
hasta obtener un polvo fino.
La cantidad de muestra disponible para su estudio fue la que determinó la cantidad utilizada para
la extracción del ADN antiguo.
Para la extracción del ADN antiguo se utilizaron 3 vías: fenol-cloroformo, Chelex y sílica (Vigilant
L y col. 1989; Muñoz y col.; González A 2006; Merriwether D y col., 2005).
Para la obtención del ADN moderno se realizó
la búsqueda de individuos en los que se
encontrara la secuencia deseada correspondiente a los haplogrupos deseados. Las muestras de las que
se extrajo el ADN fueron de células epiteliales bucales, sangre y/o cabello de acuerdo a la disposición de
los individuos. La extracción del ADN moderno se realizó mediante Chelex
4.2
Amplificación de ADN.
Se pretende la obtención de los fragmentos que contienen las regiones para cada haplogrupo a
partir de ADN moderno con la finalidad de tener controles positivos para la laminilla de Microarreglos.
El ciclo de PCR se presenta a continuación:
HAPLOGRUPO A
HAPLOGRUPO C
HAPLOGRUPO D
Fase del ciclo
Temperatura Tiempo
Desnaturalización Inicial
94 °C
5´
Desnaturalización
94 °C
55´´
Alineamiento
4 °C
***
Elongación
72°C
50´´
Elongación Final
72°C
5´
Almacenamiento
4 °C
∞
Número de ciclos utilizados: 40 Ciclos
***Temperaturas de Alineamiento
HAPLOGRUPO A
59 °C
HAPLOGRUPO C
59 °C
HAPLOGRUPO D
59 °C
4.3
Electroforesis.
Para evidenciar la amplificación se realiza una electroforesis en agarosa al 2% y 4 μl de bromuro
de etidio por cada 100ml de azarosa utilizando un voltaje de 60 V.
4.4
Determinación de haplogrupos.
Una vez amplificados los fragmentos tanto de ADN moderno o antiguo se procede a realizar
pruebas de determinación de haplogrupos mediante la secuenciación de los amplificados con la finalidad
de corroborar los resultados
en la determinación de haplogrupos que se obtengan mediante los
Microarreglos para validar el proyecto en un futuro. Posteriormente los resultados obtenidos mediante
los Microarreglos se validarán mediante PCR tiempo real.
4.5
Iniciadores de la PCR.
Los iniciadores a utilizar para la amplificación en la PCR de las regiones que definen los
haplogrupos son:
ƒ Iniciadores para amplificar la región que define el haplogrupo A.
L590
5-TGA,AAA,TGT,TTA,GAC,GGG,CTC,ACA-3
H760
5-TAG,AGG,GTG,AAC,TCA,CTG,G-3
ƒ Iniciadores para amplificar la región que define el haplogrupo C.
L13209
5-CGC,CCT,TAC,ACA,AAA,TGA,C-3
H13420
5-GGG,AGG,TTG,AAG,TGA,GAG,G-3
ƒ Iniciadores para amplificar la región que define el haplogrupo D.
L5110
5-TAA,CTA,CTA,CCG,CAT,TCC,TA-3
H5250
5-AAA,GCC,GGT,TAG,CGG,GGG,CA-3
5.1
Impresión de la laminilla.
Se emplearon placas de vidrio recubiertas químicamente con aminosilano para unir
covalentemente las moléculas de ADN.
5.1
Inmovilización
a) Se rehidrató la superficie impresa con vaporizaciones por 3 segundos.
b) E sometió a calentamiento directo de la laminilla por el lado no impreso en una
plancha a 85°C por 10 segundos.
c) Se expuso el lado impreso en un entrecruzador de rayos UV a 260 mJ.
5.1
Desnaturalización
Este paso es requerido dado que el arreglo de ADN es de cadenas dobles.
a) Inmersión del arreglo en dodecil sulfato de sodio (SDS) por 30 segundos, seguido
de un baño en agua por 3 minutos y otro en etanol por 2 minutos.
b) Secado del arreglo con aire libre de aceite para eliminar los residuos de agua en la
superficie de la laminilla.
5.1
Hibridación.
Preparación de solución de hibridación: 35 a 50% de formamida. 5X SSC, 0.1% SDS, 0.1
mg/mgL de bloqueador de fondo (esperma de salmón). Determinar el área de la laminilla que
será expuesta a la solución de hibridación y calcular el volumen a utilizar (alrededor de 2.5 a 3
microlitros por centímetro cuadrado). Disolución del ADN reportero en la solución de hibridación.
Bloqueo de la superficie no utilizada del Microarreglo (con una solución compuesta por SDS 1%,
5x SSC, 0.1 mg/mL BSA) previo a la aplicación de la solución de hibridación.
Lavado de la laminilla con agua libre de nucleasas, seguido de un lavado con etanol. Secado de
la laminilla con aire libre de aceites y polvo.
Aplicar cuidadosamente la solución de hibridación con el ADN reportero en la superficie del
arreglo. Incubar el arreglo en una cámara de hibridación a la temperatura elegida.
5.1
Lavado.
a) Sacar el arreglo de la cámara de hibridación.
b) Sumergirlo en una solución de SSC 2X y 0.1% de SDS. Permitir que el
cubreobjetos se separe suavemente.
c) Realizar los siguientes lavados, en el orden descrito:
i.
Solución SSC 2X por 5 minutos a 42°C con agitación ligera.
ii.
Solución SSC 0.2 X a 25°C por un minuto.
iii.
Solución SSC 0.05 X a 25°C por 5 segundos.
d) Secado del arreglo con aire libre de aceite.
e) Guardar el arreglo protegiendo la superficie de la luz, polvo y abrasión hasta que
se realice la lectura.
5.1
Adquisición de la imagen.
La adquisición de la imagen se llevó a cabo por un lector óptico utilizando la longitud de
onda apropiada de acuerdo a cada fluoróforo.
1
1
,
1
,
,
'-..
Figura 2. Procedimiento experimental.
........
V.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los estudios en ADN antiguo se confrontan con problemas de degradación, contaminación y baja
concentración disponible. Se pudo extraer y amplificar ADN antiguo después de repetidos ensayos de
dos muestras óseas de alrededor de 12500 años de antigüedad (Fig. 6). Para la deposición en el se
utilizaron diferentes soluciones con la finalidad de obtener una señal homogénea en su forma, intensidad
y reproducibilidad. La formamida permitió mayor reproducibilidad y homogeneidad en la señal en
comparación con el DMSO. El CHAPS como detergente no incremento de manera apreciable la
fluorescencia inespecífica. Se descartaron contribuciones debidas al robot en las diferencias
morfológicas al comparar resultados entre laminillas duplicadas. Las soluciones con detergentes como
aditivo produjeron la mayor homogeneidad en la morfología de los depósitos. La reproducibilidad se
mejoró con la combinación de detergentes y solventes como formamida y DMSO. Los mejores
resultados se presentaron con las soluciones de DMSO/ formamida y DMSO/CHAPS 1.6 mM. Se prefirió
el uso de CHAPS 1.6 mM como agente detergente debido a las propiedades teratogénicas de la
formamida. Se piensa que los resultados obtenidos son debidos a que el CHAPS por no poseer carga
formal (a pH de 1 a 13),
estabiliza el ambiente altamente cargado por la contribución de cargas
negativas del esqueleto de ADN y las cargas positivas de la superficie de la laminilla.
Se obtuvieron amplificados para los haplogrupos A, C y D de fuentes contemporáneas. En la
Figura 3 se muestran particularmente los amplificados que contienen la región correspondiente al
polimorfismo característico del haplogrupo A, en donde se realizaron amplificaciones de la misma
muestra con diferentes diluciones de ADN. El producto de PCR posiblemente presentó estas diferencias
al manejar diferentes concentraciones ADN debido a que en el caso de existir una gran cantidad de ADN
en la reacción de amplificación se presenta un impedimento estérico que no permite una adecuada
polimerización por parte de la enzima utilizada (PFU; proveniente de Pyrococcus furiosus.), y en caso de
haber una cantidad mínima de ADN no es suficiente el amplificado de las pocas moléculas para
visualizarlas en el gel a simple vista. De tal modo que se buscó una dilución adecuada del ADN a utilizar
en la amplificación, de acuerdo a la fuente que se tratase. Finalmente se obtuvo como resultado que
para las muestras de cabello no era necesario realizar diluciones y para extracciones a partir de células
epiteliales una dilución 1:10 era suficiente posiblemente por las diferencias en cantidad del ADN
presente en las fuentes.
En la parte de la amplificación de ADN antiguo no se realizó esta optimización dado que es
imposible tener muestras con características homogéneas.
5.1
ADN ANTIGUO
Las muestras óseas antiguas que fueron sometidas a estudio fueron:
„
M6) CUEVA DEL
TECOLOTE, HUAPALCALCO, HIDALGO.
ENTIERRO “B”. EPOCA
PRECERÁMICA*
„
„
„
M7) PEÑON III. EPOCA PRECERÁMICA*
MA) ENTIERRO 2E_TC_35. TEHUACAN, PUEBLA,
MB) ENTIERRO 1, PEÑON DEL MARQUEZ, SANTA MARTA ACATITLA. IZTAPALAPA
(DISTRITO FEDERAL), 650 A 750 AÑOS DE ANTIGÜEDAD
„
MC) ENTIERRO 2, PEÑON DEL MARQUEZ, SANTA MARTA ACATITLA. IZTAPALAPA
„
(DISTRITO FEDERAL), 650 A 750 AÑOS DE ANTIGÜEDAD
M4D) ENTIERRO 3, PEÑON DEL MARQUEZ, SANTA MARTA ACATITLA. IZTAPALAPA
(DISTRITO FEDERAL), 650 A 750 AÑOS DE ANTIGÜEDAD
„
„
„
„
MVB) PREDIO 89, POZO 3, ENTIERRO 1(2). LA PEÑA, PROYECTO VALLE DE BRAVO
MMA) MONTE ALBAN
CT7) MONTE ALBAN
CT8) MONTE ALBAN
*Las muestras precerámicas corresponden a promedio de entre 5000 y 12500 años de
antigüedad.
Cabe recalcar que dado que el ADN antiguo presenta tanto degradación de la molécula como
alteración de las bases y la presencia de los ya mencionados contaminantes el proceso de amplificación
conllevas dificultades que no se presentan para el ADN moderno.
En la Figura 6 se muestran las extracciones de restos óseos antiguos y en las Figuras 7 y 8
donde se observan los llamados contaminantes, presentes en toda muestra de carácter antiguo.
1
2
3
4
5
6
7
8 9 10 11 12 13
Carril
Muestra
1
MA (Chelex)
2
MB (Chelex)
3
MC (Chelex)
4
MD (Chelex)
5
MA (Dilución 1:10)
6
MB (Dilución 1:10)
7
MC (Dilución 1:10)
8
MA (Isot)
9
MB (Isot)
10
MC (Isot)
11
Control (+)
12
(-)
13
Contemporáneo
Figura 3. Amplificado de ADN a partir de restos óseos antiguos utilizando iniciadores de
PCR para el haplogrupo A. Extracción utilizando diferentes metodologías.
400 pb
300 pb
Figura 4. Amplificación de muestras contemporáneas y de restos antiguos. Uso de
iniciadores de PCR para haplogrupo C. 1)Marcador de peso molecular 2)Muestra de
ADN contemporáneo 3)Muestra de restos antiguos M7, extracción por fenol
cloroformo 4)Muestra de ADN contemporáneo 5)Muestra de ADN contemporáneo.
En los ensayos de extracción y amplificación de ADN antiguo se utilizaron diferentes métodos de
extracción. Los resultados de amplificación difieren entre las muestras, lo que resulta en pensar que es
necesario ensayar todos los métodos que sea posible hasta lograr obtener un amplificado de la muestra
de interés.
Este hecho se pudo deber a la diferente naturaleza y características particulares de cada
muestra. Es decir, que los contaminantes presentes en cada una de las muestras difiere entre sí. Estos
contaminantes son inhibidores de la PCR como ya se mencionó. En cuanto a la procedencia u origen de
dichos inhibidores, se ha propuesto con anterioridad (Pavo S., 1989) que puede tratarse de compuestos
del suelo (ácidos húmicos y/o fúlvicos, residuos de porfirinas y/o productos de su degradación y taninos
entre otros) y/o de subproductos de degradación orgánica (productos de Maillard, productos de
degradación del propio ADN, etc.). Adicionalmente se debe considerar que el ADN obtenido puede diferir
cualitativamente, obteniéndose la gran mayoría, sino es que la totalidad del ADN, alterado
molecularmente, lo que puede llegar e evitar el correcto trabajo de la polimerasa durante la PCR, en
fragmentos muy pequeños y a concentraciones muy escasas, lo que afecta la visualización posterior a la
electroforesis.
Posteriormente se procedió a purificar los amplificados de ADN antiguo después de pasar por
una electroforesis en gel de agarosa, utilizando columnas de matriz de sílica (QIAquick Gel Extraction
Kit, Qiagen, Santa Clara, CA, U.S.A.) a la cual se une el ADN, en presencia de altas concentraciones de
tiocianato de guanidinio como sal caotrópica, la cual también ayuda a disolver la agarosa.
1
2
3
4
5
6
7
400 pb
300 pb
Figura 5. Visualización de la electroforesis de amplificados de ADN moderno de
células de epitelio bucal utilizado diferentes diluciones en la PCR. La amplificación
fue para la región correspondiente al haplogrupo A. 1)marcador de peso molecular
2)control negativo 3) dilución 1:100 4) 1:50 5)1:40 6)1:1 7)1:10.
Figura 6. Extracción de ADN antiguo de restos óseos. La figura muestra las
diferentes fases que se forman en al extracción con el método fenolcloroformo y con ello la separación de una gran cantidad de contaminantes.
ADN total
Figura 7. Prueba para observación de la presencia de ADN en la
extracción de restos antiguos. ADN total (flechas negras). También
se observan los contaminantes (flecha azul). Fotografía tomada con
luz ultravioleta.
Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa para ADN antiguo. Se muestra
la presencia de contaminantes en el extracto de ADN (manchas oscuras).
Fotografía tomada con luz blanca.
Posterior a la amplificación tanto del ADN moderno como del ADN antiguo se procedió a realizar
el Microarreglo.
5.2
SOLUCIONES PARA IMPRESIÓN
La deposición o impresión del ADN a la laminilla se realizo utilizando diferentes soluciones de
impresión (Figura 4): DMSO, formamida, CHAPS 1.6 mM, CHAPS 16 mM, DMSO/formamida,
DMSO/CHAPS 1.6 mM, DMSO/CHAPS 16 mM y formamida/CHAPS 16 mM.
DEPOSITO DE MUESTRA.
LAMINILLA DE CORNING
(12479471). MARCADO CON
SYBRGREEN (DILUCION 1: 2000).
•DMSO
•FORMAMIDA
•CHAPS 1.6 mM
•CHAPS 16 mM
•DMSO + FORMAMIDA
•DMSO + CHAPS 1.6 mM
•DMSO + CHAPS 16 mM
•FORMAMIDA + CHAPS 16 mM
DEPOSITO DE MUESTRA . LAMINILLA
DE SCHOTT (SIN CODIGO DE BARRAS).
MARCADO CON SYBRGREEN
(DILUCION 1: 2000).
Figura 9. Visualización de las laminillas impresas para la determinación de la solución
óptima para la deposición del ADN. Arreglos idénticos se realizaron en laminillas
comerciales de diferentes compañías. Los resultados fueron similares.
1
2
3
4
A
B
C
D
E
F
G
H
Figura 10. Distribución del Microarreglo elaborado para la
prueba y optimización de las soluciones utilizadas durante la
inmovilización del ADN.
Tabla 1. Distribución general de las muestras en la laminilla para prueba con las diferentes
soluciones para la inmovilización del ADN.
ADN
ADN
MODERNO MODERNO
DMSO
FORMAMIDA
CHAPS 1.6 mM
CHAPS 16 mM
DMSO +
FORMAMIDA
DMSO +
CHAPS 1.6 mM
DMSO +
CHAPS 16 mM
FORMAMIDA +
CHAPS 16 mM
ADN
ADN
ANTIGUO. ANTIGUO.
Muestra 6. Muestra 7.
A3
A4
B3
B4
C3
C4
D3
D4
A1
B1
C1
D1
A2
B2
C2
D2
E1
E2
E3
E4
F1
F2
F3
F4
G1
G2
G3
G4
H1
H2
H3
H4
La inmovilización del ADN en la laminilla se evidenció por medio de SYBR Green I en dilución
1:2000. El colorante SYBR Green I se une al surco menor del ADN bicatenario, pero no al ADN
monocatenario, y dado que el ADN impreso en la laminilla hasta este momento es de doble cadena, las
características de este colorante son ideales. A consecuencia de esta unión la fluorescencia es muy alta
comparada con otros agentes utilizados para el mismo propósito, como el bromuro de etidio, siendo
menos tóxico, mas específico y sensible (entre 10 y 25 veces) que este último (Haugland, 2002). La
excitación de este fluoróforo se encuentra aproximadamente a 488nm y 254nm; y la emisión aproximada
a 560 nm. En la impresión de la laminilla se realizó un pegado tanto de ADN moderno como de ADN
antiguo (Tabla 1 y Figura 4), encontrando diferente comportamiento tanto en la intensidad y como en la
definición de los depósitos al observar la impresión. La diferencia en la intensidad como en la
consistencia morfológica se puede explicar por impedimentos estéricos de los contaminantes con la
intercalación del SYBR Green I en la doble cadena de ADN,
En lo que respecta a las soluciones de impresión utilizadas se encontraron dos situaciones
óptimas para la impresión de ADN antiguo (Figura 6):
•
CHAPS 1.6 mM + formamida
•
CHAPS 1.6 mM + DMSO
El detergente zwitteriónico CHAPS 16mM
y el mismo con una concentración de 1.6mM en
combinación con DMSO reducen la variación de los resultados de pegado del ADN de doble cadena, por
el incremento de homogeneidad y reproducibilidad de la morfología de los depósitos. Estos resultados
se evaluaron en tres diferentes laminillas:
•
Laminilla de CORNING (Código de barras: 12479471). Marcado con SYBR Green
(Dilución 1: 2000).
•
•
Laminilla de SCHOTT (Sin código de barras).Marcado con SYBR Green (1: 2000).
Laminilla fabricada en CICATA-IPN (Sin código de barras). marcado con SYBR Green
(1:2000)
Los resultados se debieron posiblemente a que mientras el CHAPS no posee una carga formal,
puede presentar interacciones electrostáticas acompañadas de un momento dipolar, a la par de que
permite reducir la tensión superficial. De este modo logra estabilizar el medio fuertemente cargado del
ADN depositado (la carga negativa proporcionada por el esqueleto de azúcar-fosfato del ADN
acompañado de una carga positiva perteneciente a la superficie de la laminilla durante el proceso de
secado) permiten la
formación de
depósitos con
mayor homogeneidad, incrementando la
reproducibilidad de los resultados.
1
2
3
Figura 11. Acercamiento de la Figura 4 para la señal generada en la deposición de
muestras con diferentes soluciones; se muestra mayor homogeneidad en la
morfología de las deposiciones y mayor intensidad de la señal en el grupo 1, donde
se utilizó una mezcla 50/50 de DMSO y CHAPS 1.6 mM. Para la evidenciación del
ADN se utilizó SYBRGreen I. 1)DMSO/CHAPS 1.6 mM, 2) control negativo, 3)
DMSO 100%.
F1
F2
F3
A
B
Figura 12. Acercamiento de uno de los Microarreglos. F1) ADN moderno, F2)
Control negativo, F3) ADN antiguo; A) CHAPS 1.6 mM/ DMSO; B) DMSO 100%
5.3 SONDAS
La sondas para la determinación de los haplogrupos se diseñaron a partir de la secuencia del
ADNmt humano de referencia (Human Mitochondrial DNA Revised Cambridge Reference Sequence)
registrada en el Gene Bank del NCBI
como REFSEQ AC_000021.2 gi:115315570 y HUMMTCG
J01415.2 gi:113200490 y las especificaciones moleculares correspondientes de cada haplogrupo.
Se consideró el amplificado teórico para cada haplogrupo teniendo en cuenta los iniciadores de PCR
utilizados.
Para el haplogrupo A la PCR el amplificado teórico resultó en la siguiente secuencia:
611 GAAAATGTTT AGACGGGCTC ACATCACCCC ATAAACAAAT AGGTTTGGTC
661 CTAGCCTTTC TATTAGCTCT TAGTAAGATT ACACATGCAA GCATCCCCGT
711 TCCAGTGAGT TCACCCTCTA
Para el haplogrupo C:
5101 TAACTACTAC CGCATTCCTA CTACTCAACT TAAACTCCAG CACCACGACC
5161 CTACTACTAT CTCGCACCTG AAACAAGCTA ACATGACTAA CACCCTTAAT
5221 TCCATCCACC CTCCTCTCCC TAGGAGGCCT GCCCCCGCTA ACCGGCTTTT
Para el haplogrupo D:
5101 TAACTACTAC CGCATTCCTA CTACTCAACT TAAACTCCAG CACCACGACC
5151 CTACTACTAT CTCGCACCTG AAACAAGCTA ACATGACTAA CACCCTTAAT
5201 TCCATCCACC CTCCTCTCCC TAGGAGGCCT GCCCCCGCTA ACCGGCTTTT
Como resultado de la labor de diseño de las sondas para la determinación de los haplogrupos se
obtuvo lo que se lee a continuación.
El haplogrupo A está definido por medio de RFLPs mediante la ganancia del sitio de corte en la
posición 663 por la enzima Hae III (Torroni y col., 1992),, y de acuerdo al mecanismo de la enzima se
presenta una transición de A por G en el sitio 663.
El haplogrupo C
está definido por medio de RFLPs mediante la ganancia de un sitio de
restricción por la enzima Alu I en el nucleótido 13262 y la pérdida de un sitio de restricción por la enzima
Hinc II en el nucleótido 13259 (Torroni y col., 1992), y de acuerdo al mecanismo de la enzima se
presenta una transición de A por G en el sitio 13263.
El haplogrupo D está definido por medio de RFLPs mediante la pérdida del sitio de corte en la
posición 5178 por la enzima Alu I, y de acuerdo al mecanismo de la enzima se presenta una
transversión de C por A en el sitio 5178.
Considerando la región en que se encuentra cada una de las mutaciones se consideró la longitud
de la sonda y la posición de la mutación con la finalidad de obtener una alta especificidad y temperatura
de fusión similar entre todas las sondas considerando que la temperatura óptima tiene que ser lo
suficientemente baja para permitir la hibridación específica entre la sonda y su secuencia
complementaria, y lo suficientemente alta, como para impedir hibridaciones no específicas.
Muchas fórmulas útiles y prácticas se han desarrollado para calcular la Tm para experimentos de
PCR, Southerns, Northerns, y para hibridaciones in situ. La ecuación mas simple para calcular la Tm la
proporcionada por Wallace y col. (1979) en donde A, G, C, y T corresponden al número de cada
nucleótido presentes. Esta ecuación se desarrolló para oligonucleótidos de 14 a 20 bases:
Tm=4(G+C)+2(A+T)
(1)
En el diseño de cada una de las sondas la Tm teórica se igualó con la finalidad de realizar los
ensayos de hibridación a la misma temperatura de incubación durante la etapa misma de hibridación. La
Tm teórica influyó en la longitud seleccionada del oligonucleótido, debido a que la ecuación utilizada
para su cálculo considera la cantidad y proporción de
Se optimizó la posición del nucleótido en que se presentaba la mutación de las sondas ya que en
investigaciones anteriores (Suzuki S., 2007) se ha mostrado que la mayor capacidad de discriminación
la presentan sondas en donde la mutación está ubicada en el centro de la secuencia.
De acuerdo a Zhen (1994) la longitud de la secuencia es el factor que más influye en la
estabilidad de la doble cadena. En general, las secuencias cortas poseen mayor capacidad de
discriminación cuando se presentan bases no complementarias, pero con el costo de una menor
estabilidad de la doble cadena, lo que probablemente causaría resultados negativos falsos. En cambio
en l caso de secuencias largas la estabilidad de la cadena doble es alta y la capacidad de discriminación
es baja lo que posiblemente ocasionaría resultados positivos falsos. Otro factor que podría influir en la
elección e la longitud del oligonucleótido es la formación de estructuras secundarias (Saiki, 1989)
formadas en la propia cadena sencilla. Si la estabilidad termodinámica de las estructuras secundarias es
mayor que la estabilidad de la doble cadena formada entre la sonda y el ADN inmovilizado es poco
factible que la sonda tenga acceso al sitio para el que esta diseñada a hibridar. Esto último se puede
evitar aumentando la longitud de las sondas para tener la posibilidad de aumentar al temperatura
durante la hibridación.
El contenido de GC también tiene fuerte influencia sobre la estabilidad de la doble cadena. En el
presente trabajo para las sondas diseñadas se procuró un contenido del 50 al 60% de GC.
Sonda del haplogrupo A:
Con 15 nucleótidos de longitud
TGGTCCTGGCCTTTC
TTGGTCCTGGCCTTT
TTTGGTCCTGGCCTT
GTTTGGTCCTGGCCT
GGTTTGGTCCTGGCC
AGGTTTGGTCCTGGC
TAGGTTTGGTCCTGG
ATAGGTTTGGTCCTG
TGGTCCTGGCCTTTC
GGTCCTGGCCTTTCT
GTCCTGGCCTTTCTA
TCCTGGCCTTTCTAT
Tm= 48
Tm= 46
Tm= 46
Tm= 48
Tm= 50
Tm= 48
Tm= 46
Tm= 44
Tm= 48
Tm= 48
Tm= 46
Tm= 44
CCTGGCCTTTCTATT
CTGGCCTTTCTATTA
TGGCCTTTCTATTAG
GGCCTTTCTATTAGC
Tm= 44
Tm= 42
Tm= 42
Tm= 44
Con 17 nucleótidos de longitud
TTGGTCCTGGCCTTTCT
TGGTCCTGGCCTTTCTA
TTTGGTCCTGGCCTTTC
GGTCCTGGCCTTTCTAT
GTTTGGTCCTGGCCTTT
GTCCTGGCCTTTCTATT
GGTTTGGTCCTGGCCTT
TCCTGGCCTTTCTATTA
AGGTTTGGTCCTGGCCT
CCTGGCCTTTCTATTAG
TAGGTTTGGTCCTGGCC
CTGGCCTTTCTATTAGC
ATAGGTTTGGTCCTGGC
TGGCCTTTCTATTAGCT
AATAGGTTTGGTCCTGG
TGGCCTTTCTATTAGCT
AATAGGTTTGGTCCTGG
Tm= 52
Tm= 52
Tm= 52
Tm= 52
Tm= 52
Tm= 50
Tm= 54
Tm= 48
Tm= 54
Tm= 50
Tm= 54
Tm= 50
Tm= 52
Tm= 48
Tm= 50
Tm= 48
Tm= 50
Para el haplogrupo C:
Con 15 nucleótidos de longitud
CAAGTCAGCTAGGAC
AAGTCAGCTAGGACT
AGTCAGCTAGGACTC
GTCAGCTAGGACTCA
TCAGCTAGGACTCAT
AGCTAGGACTCATAA
GCTAGGACTCATAAT
CAAGTCAGCTAGGAC
TCAAGTCAGCTAGGA
TTCAAGTCAGCTAGG
CTTCAAGTCAGCTAG
ACTTCAAGTCAGCTA
CACTTCAAGTCAGCT
CCACTTCAAGTCAGC
TCCACTTCAAGTCAG
Tm=46
Tm=44
Tm=46
Tm=46
Tm=44
Tm=42
Tm=42
Tm=46
Tm=44
Tm=44
Tm=44
Tm=42
Tm=44
Tm=46
Tm=44
Con 16 nucleótidos de longitud
TCAAGTCAGCTAGGAC
CAAGTCAGCTAGGACT
AAGTCAGCTAGGACTC
AGTCAGCTAGGACTCA
GTCAGCTAGGACTCAT
Tm=48
Tm=48
Tm=48
Tm=48
Tm=48
CAGCTAGGACTCATAA
AGCTAGGACTCATAAT
CAAGTCAGCTAGGACT
TCAAGTCAGCTAGGAC
TTCAAGTCAGCTAGGA
CTTCAAGTCAGCTAGG
ACTTCAAGTCAGCTAG
CACTTCAAGTCAGCTA
CCACTTCAAGTCAGCT
TCCACTTCAAGTCAGC
Tm=46
Tm=44
Tm=48
Tm=48
Tm=46
Tm=48
Tm=46
Tm=46
Tm=48
Tm=48
Para el haplogrupo D
Con 17 nucleótidos de longitud
GAAACAAGATAACATGA
AAACAAGATAACATGAC
AACAAGATAACATGACT
ACAAGATAACATGACTA
CAAGATAACATGACTAA
AAGATAACATGACTAAC
AGATAACATGACTAACA
GATAACATGACTAACAT
GAAACAAGATAACATGA
TGAAACAAGATAACATG
CTGAAACAAGATAACAT
CCTGAAACAAGATAACA
ACCTGAAACAAGATAAC
CACCTGAAACAAGATAA
GCACCTGAAACAAGATA
CGCACCTGAAACAAGAT
Tm=44
Tm=44
Tm=46
Tm=44
Tm=44
Tm=44
Tm=44
Tm=44
Tm=44
Tm=44
Tm=44
Tm=46
Tm=46
Tm=46
Tm=48
Tm=50
Con 18 nucleótidos de longitud
TGAAACAAGATAACATGA
GAAACAAGATAACATGAC
AAACAAGATAACATGACT
AACAAGATAACATGACTA
ACAAGATAACATGACTAA
CAAGATAACATGACTAAC
AAGATAACATGACTAACA
AGATAACATGACTAACAT
GAAACAAGATAACATGAC
TGAAACAAGATAACATGA
CTGAAACAAGATAACATG
CCTGAAACAAGATAACAT
ACCTGAAACAAGATAACA
CACCTGAAACAAGATAAC
GCACCTGAAACAAGATAA
CGCACCTGAAACAAGATA
Tm=46
Tm=48
Tm=48
Tm=46
Tm=46
Tm=48
Tm=46
Tm=46
Tm=48
Tm=46
Tm=48
Tm=48
Tm=48
Tm=50
Tm=50
Tm=52
Las temperaturas de fusión teóricas obtenidas para cada sonda se observan en la siguiente
tabla:
Tabla 2. Temperaturas de fusión teóricas para cada una de las sondas.
SONDA
Temperatura
de
fusión
teórica (Tm)
Haplogrupo A
5´ TGG-TCC-TGG-CCT-TTC 3'
48 °C
Haplogrupo C
5´ TCA-AGT-CAG-CTA-GGA-C 3'
48°C
Haplogrupo D
5´ TGA-AAC-AAG-ATA-ACA-TGA-C 3´
50°C
Posteriormente se eligieron las moléculas fluorescentes más adecuadas al equipo disponible en
el centro de trabajo para el marcaje de las sondas, con la finalidad de evidenciar la hibridación de las
sondas con el ADN inmovilizado en las laminillas. Se consideraron los espectros de absorción y emisión
de diferentes moléculas fluorescentes disponibles comercialmente para marcaje de oligonucleótidos
considerando las especificaciones del equipo disponible, filtros y láseres (Tabla 4), para evidenciar la
hibridación. En este punto se buscó que los picos máximos de absorción coincidieran con los láseres y
los picos máximos de excitación coincidieran con los filtros, como se observa para el caso del Texas
Red en la Figura13. Asimismo se consideraron los espectros de absorción y emisión para poder
distinguir entre cada una de las sondas, que se marcaron con diferentes moléculas.
Fluorescencia
Absorbancia
Incidencia del
láser de 594
Longitud de onda (nm)
Figura 13. Acoplamiento del pico de absorción de la molécula
fluorescente Texas Red con uno de los láseres disponibles
Tabla 3. Marcas fluorescentes más comunes disponibles comercialmente
para oligonucleótidos. * Grupos de moléculas fluorescentes, marcas registradas
de Molecular Probes.
5’ Conjugados de
forforoamidita
5’ o 3’ Conjugados
NHS-éster
3’ Conjugados CPG
(5' o 3')
Molécula
Absorción
máxima (nm)
Emisión
máxima (nm)
Fluoresceina
492
520
6-FAM
494
525
TET
521
536
HEX
535
556
Cy3
552
570
Cy5
643
667
Cy5.5
675
694
TAMRA
565
580
ROX
585
605
JOE
520
548
Cy3
552
570
Cy5
643
667
6-FAM
494
525
TAMRA
565
580
Dabcyl
Opacador de fluorescencia
Black HoleTM-1
Black HoleTM-2
Opacador de fluorescencia
Texas Red®
583
603
*Alexa Dyes
-
-
Oregon GreenTM
492
517
*Bodipy Dyes®
-
-
QSYTM-7
Opacador De fluorescencia
Una vez considerada la compatibilidad entre los picos máximos de absorción y emisión de las moléculas
fluorescentes disponibles se mejoró la elección considerando el coeficiente de extinción molar y
rendimiento cuántico de las moléculas fluorescentes, así como el precio y capacidad de la empresa
proveedor para un pronto abastecimiento. El coeficiente de extinción molar (E) y el rendimiento cuántico
(QY) fueron considerados con detalle (Tabla 5) con la finalidad de elegir aquellos fluoróforos con
posibilidad de presentar mayor intensidad en la señal generada al realizar la lectura del Microarreglo.
Estos dos últimos factores considerados al ser multiplicados dan una idea de la intensidad de señal que
generan al hacer incidir la misma cantidad de energía sobre diferentes fluoróforos.
Tabla 4. Equipo disponible para
Evidenciar la hibridación.
FILTROS
505 LP
512 BP
550 LP
560 BP
605 LP
LÁSER
488nm
532nm
594nm
633nm
615 BP
675 BP
Tabla 5. Características de los fluoróforos elegidos en primer instancia para
el marcaje de las sondas.
Dye
6-FAM
Fluorescein-dT
TET
HEX
TAMRA
Cy3
Cy3.5
Cy5
Cy5.5
Texas Red
Yakima Yellow
Redmond Red
Emission max - E
(nm)
520
522
541
553
580
563
604
662
707
603
549
595
QY
(QY*E)
0.9
0.9
0.9
0.7
0.7
0.1
0.35
0.2
67500
67500
77400
67200
62300
13600
40600
50000
0.9
0.96
0.84
100800
80448
62160
De este análisis resultaron como los mejores para los propósitos del trabajo los siguientes
fluoróforos:
Tabla 6. Fluoróforos compatibles
con los láseres disponibles
Fluoróforo
6 FAM
HEX
Texas Red
Láser
adecuado
488
532
594
Las sondas resultantes considerando los factores mencionados anteriormente (Para el
oligonucleótido: longitud, posición de la mutación, temperatura de alineamiento, secuencia. Para el
fluoróforo: compatibilidad de los picos de absorción y emisión con los láseres y filtros respectivamente,
rendimiento cuántico, coeficiente de extinción molar, disponibilidad y precio) se muestran en la Tabla 6.
Tabla 7. Longitud, secuencia y marcaje de las sondas para determinar los
polimorfismos de un sólo nucleótido característico de cada haplogrupo.
SONDAS
Clave
Marcaje 5'
Secuencia
Número de
nucleótidos
15
HAPLOA
6FAM
5´ TGG-TCC-TGG-CCT-TTC 3'
HAPLOC
HEX
5´ TCA-AGT-CAG-CTA-GGA-C 3'
16
HAPLOD
Texas Red
5´ TGA-AAC-AAG-ATA-ACA-TGA-C 3´
19
5.4 PURIFICACIÓN DEL ADN
Se purificó el amplificado ADN obtenido por medio de columnas columnas de matriz de sílica
(QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Santa Clara, CA, U.S.A.) sin embargo se observó un decremento
drástico en la concentración del ADN al observarlo por electroforesis en gel de agarosa al 1.5% (no se
muestra imagen), por lo que se procedió a purificar los amplificados por precipitación con etanol. Este
hecho pudo ser causado por la saturación de la columna debido a los altas concentraciones de ADN
(moderno) amplificado para realizar repetidos ensayos, lo que impide recuperar todo el ADN e implica
utilizar varias columnas para recuperarlo.
5.5 PROCESO DE FABRICACIÓN DEL MICROARREGLO
Del proceso de diseño del Microarreglo resultó un protocolo para la inmovilización de
amplificados de ADN, el cual permitió obtener una adecuada reproducibilidad de los resultados. Este
protocolo se presenta a continuación:
IMPRESIÓN
Una vez amplificado y purificado el ADN de fuentes contemporáneas como antiguas (de las que
fue posible) se procedió a la deposición de este utilizando la solución previamente definida como óptima
para este paso durante el trabajo (DMSO/CHAPS 1.6 mM).
INMOVILIZACIÓN DE ADN
Para la inmovilización de ADN se utilizó un primer paso de calentamiento directo en
pancha caliente de la laminilla por el lado no impreso y un segundo paso con luz UV hasta 260
mJ por el lado impreso.
PREHIBRIDACIÓN
El objetivo del paso de prehibridación es el obtener la mayor especificidad posible durante
la hibridación, al tiempo de minimizar la fluorescencia de fondo, la cual afecta negativamente los
resultados.
La cubierta de aminosilano de la lámina que se eligió para la inmovilización permite la
unión del ADN con un alta eficiencia. Sin embargo previo a la hibridación los grupos amino que
quedaron libres de ADN se bloquearon con la finalidad de evitar señales inespecíficas debidas a
la posible unión de las sondas con estos. Diferentes investigadores (Erie Scientific Company,
2003) utilizan bloqueos químicos con anhídrido succínico (Núm. CAS 108-30-5) sin embargo se
implementó una solución fácil de elaborar y no tóxica (5X
SSC, 0.1% SDS y 1% BSA),
incubando a 42°C durante de 45 min a 60 min, lo que resultó efectivo, pues se eliminaron las
uniones inespecíficas en el área donde no se inmovilizó ADN intencionalmente.
La prehibridación tiene como ventaja adicional la remoción de ADN que no se unió a la
superficie de la lámina, lo cual puede interferir en el proceso de hibridación al impedir el
adecuado acercamiento de la sonda al ADN inmovilizado, lo cual se apoya de acuerdo a previos
estudios realizados por Flikka K. (2004) en los que inclusive la longitud de los amplificados
inmovilizados influyen en la eficiencia de hibridación.
Posterior a la incubación dentro del mismo paso de prehibridación se transfirieron las
laminillas a una solución de 0,1X SSC, incubando a temperatura ambiente (25°C) durante 5 min.
Este paso se realizó por segunda vez.
Se sumergieron las laminillas en agua desionizada por 30 segundos. Y finalmente se
secaron por centrifugación a 1200 rpm por 1.5 min.
DESNATURALIZACIÓN
Este paso se utilizó para separar la doble cadena de los amplificados de PCR y permitir
consecuentemente la
hibridación.
El
proceso
de
calentamiento
utilizado
durante
la
inmovilñización tiene efecto sobre la apertura de la doble cadena, sin embargo para mejores
resultados y una mayor cantidad de hebras sencillas se implemento este paso, que consistió en
el calentamiento de la laminilla en agua hirviendo durante 1 minuto. En este punto además se
evitan los entrecruzamientos entre las cadenas inmovilizadas. Posteriormente se sumergió la
laminilla en etanol enfriado en hielo al 95% por un minuto y se secó la laminilla con aire seco
limpio.
5.6 HIBRIDACIÓN
Se realizaron los ensayos de hibridación utilizando una solución de 1.5 pmol/microlitro de la
sonda; se necesitaron 20 microlitros de la solución para cubrir
la superficie impresa. Se utilizaron
temperaturas de incubación de 42 °C, 37 °C y 33 “C por 16 horas Se obtuvieron resultados únicamente
a 33 °C, lo que significa una temperatura de hibridación de alrededor de 15 °C por debajo de la
temperatura de fusión, lo que concuerda con (Botwell, 2003) que menciona el manejo de temperaturas
de hibridación entre 15 °C y 20°C por debajo de la temperatura de hibridación. Los resultados obtenidos
se muestran en la Figura 15. Las muestras depositadas fueron las siguientes:
„ A2
OLIGONUCLEÓTIDO A2; 0.01 pmol (Clave: OLA_0.01)
„ A3
OLIGONUCLEÓTIDO A2; 0.1 pmol (Clave: OLA:_0.1)
„ A4
OLIGONUCLEÓTIDO A2; 1 pmol (Clave: OLA_0.1)
„ B1
OLIGONUCLEÓTIDO A2; 0.005 pmol (Clave: OLA_0.005)
„ B2
OLIGONUCLEÓTIDO A2; 0.05 pmol (Clave: OLA_0.05)
„ B3
OLIGONUCLEÓTIDO A2; 0.003 pmol (Clave: OLA_0.003)
„ B4
OLIGONUCLEÓTIDO A2; 0.03 pmol (Clave: OLA_0.03)
„ C1
OLIGONUCLEÓTIDO A2; 0.3 pmol (Clave: OLA_0.3)
„ C2
OLIGONUCLEÓTIDO A2; 3 pmol (Clave: OLA_3)
„ C3
MUESTRA ADN MODERNO (Clave: MGaPUR1_1)
„ C4
MUESTRA ADN MODERNO (Clave: MGaPUR1_10)
„ D1
MUESTRA ADN MODERNO (Clave: MGaPUR1_50)
„ D2
MUESTRA ADN MODERNO (Clave: MGaPUR1_100)
„ D3
MUESTRA ADN MODERNO (Clave: CNTPCRUR1_1)
„ D4
MUESTRA ADN MODERNO (Clave: CNTPCRUR1_10)
„ E1
MUESTRA ADN MODERNO (Clave: CNTPCRUR1_100)
„ E2
MUESTRA ADN MODERNO (Clave: CNTPCRUR1_1)
„ E3
MUESTRA ADN MODERNO (Clave: CNTRa1_10)
„ E4
MUESTRA ADN MODERNO (Clave: CNTRa1_100)
„ F1
MUESTRA ADN MODERNO (Clave: CNTRa1_1)
„ F2
MUESTRA ADN MODERNO (Clave: MGAc1_10)
„ F3
MUESTRA ADN MODERNO (Clave: MGAc1_100)
„ F4
MUESTRA ADN ANTIGUO CT7
(Clave: AMPhAT7CONC)
„ G1
MUESTRA ADN ANTIGUO CT7
(Clave: AMPhAT71_5)
„ G2
MUESTRA ADN ANTIGUO CT7
(Clave: AMPhAT71_10)
„ G3
MUESTRA ADN ANTIGUO CT7
(Clave: AMPhAT71_20)
„ G4
MUESTRA ADN ANTIGUO CT7
(Clave: AMPhAT7NEG)
„ H1
MUESTRA ADN ANTIGUO CT8
(Clave: AMPhAT71_5)
„ H2
MUESTRA ADN ANTIGUO CT8
(Clave: AMPhAT71_10)
„ H3
MUESTRA ADN ANTIGUO CT8
(Clave: AMPhAT7NEG)
A1
B1
C1
D1
E1
F1
G1
H1
A2
B2
C2
D2
E2
F2
G2
H2
A3
B3
C3
D3
E3
F3
G3
H3
A4
B4
C4
D4
E4
F4
G4
///
Figura 14. Distribución de las muestras
en placa de pozos anterior a la deposición.
Figura 15. Porción del Microarreglo A33*. Vista general. Hibridación del ADN inmovilizado
con las tres sondas. Lectura realizada para la sonda marcada con HEX (532 nm, 550LP).
E3
E4
F1
F2
Figura 16. Acercamiento del Microarreglo A33 con las tres sondas. Lectura realizada para la
sonda marcada con HEX (532 nm, 550LP). Se muestran 4 repeticiones por cada muestra. E3)
ADN moderno, amplificado purificado 1:10; E4) ADN moderno, amplificado purificado diluido
1:100; F1) ADN moderno, amplificado purificado 1:1. Se observa diferente intensidad de señal
y calidad para cada dilución. F2) ADN moderno, dilución 1:10.
En los Microarreglos realizados se observan diferentes intensidades de acuerdo a la cantidad
de ADN inmovilizado. La capacidad de las sondas par discriminación de los polimorfismos de un sólo
nucleótido en estudio en este trabajo es de importancia vital para garantizar la funcionalidad del
Microarreglo diseñado. En los Microarreglos mostrados (Figuras 15 a 18) se realizó la lectura de la
laminilla con 3 de los láseres disponibles, uno para cada sonda (Tablas 7 y 8). El ADN inmovilizado E3,
E4, F1 y F2 (Figura 16) fue inmovilizado con la finalidad de conocer la capacidad de discriminación de
las sondas y consecuentemente la selectividad de las mismas, conociendo previamente el haplogrupo
de este ADN (haplogrupo C). Es así que al realizar la lectura con los láseres de longitud de onda de 488
nm, 532 nm y 594 nm no se obtuvo señal alguna para 488 nm y 594 nm; los resultados de la señal
obtenida a 532 nm como se esperaba se muestran en las Figuras 15 a 18. Por lo anterior se deduce que
las sondas son específicas y poseen una adecuada capacidad de discriminación.
Se realizaron inmovilizaciones de ADN a diferentes concentraciones de ADN inmovilizado (muestras C3
a F3) encontrando mejor intensidad de señal a concentraciones de aproximadamente 30 nM (Figura 16,
muestra E3). Mientras que a una concentración de ADN inmovilizado diez veces mayor (300 nM) se
observa un decremento drástico en la intensidad de la señal, pudiendo haber sido causado por
impedimentos estéricos para el adecuado acercamiento y consecuente hibridación de las sondas al ADN
inmovilizado.
Por otro lado se observó una señal débil señalando una posible hibridación con ADN antiguo (Figura 18)
en la que se realizaron 6 repeticiones para esta muestra (F4). Lo anterior indica que el Microarreglo es
capaz de determinar haplogrupos para ADN de origen antiguo en primer instancia. Sin embargo es
necesario realizar la validación del Microarreglo para aseverar esta observación y eliminar los ruidos de
fondo de cada una de las imágenes obtenidas (Figuras 15 a 18).
Figura 17. Vista general de la Microarreglo B35* con las tres sondas. Arreglo
de 5 x 4 (20 depósitos por grupo). Lectura realizada para la sonda marcada
con HEX (532 nm, 550LP).
F4
Figura 18. Acercamiento de una porción del Microarreglo B35. Lectura realizada para
la sonda marcada con HEX (532 nm, 550LP). Seis repeticiones para cada muestra.
VI.
CONCLUSIONES
Los extractos de ADN antiguo pueden contener otras moléculas que inhiben la reacción de PCR
y que han pasado a ser conocidas bajo el nombre de inhibidores o contaminantes. Esta denominación
agrupa un conjunto de moléculas de naturaleza diversa, que no son la misma en todos los extractos,
todo depende del origen y modo de preservación de la muestra.
La principal ventaja de esta tecnología reside en la alta densidad de integración (cantidad) de
material biológico que se consigue inmovilizar, es decir, la posibilidad de analizar simultáneamente miles
de fragmentos de ADN.
Hasta el momento es factible la aplicación de la tecnología en el presente trabajo a ADN antiguo,
con potencial para emplearse en análisis de ADN de fuentes contemporáneas y medicina forense.
El desarrollo que se lleva acabo en CINVESTAV-IPN es equiparable a sistemas comerciales en
lo que respecta a pruebas de otra índole en el mismo sistema (Microarreglos).
De las soluciones que se están evaluando se identificaron dos como óptimas para ADN antiguo:
CHAPS 1.6mM + formamida y una combinación de CHAPS 1.6mM + DMSO.
El
Microarreglo diseñado es suficientemente selectivo para determinar haplogrupos
mitocondriales en ADN de muestras contemporáneas.
El Microarreglo es capaz de determinar el haplogrupo C para ADN de origen antiguo.
VII.
PERSPECTIVAS
El presente proyecto podría tener aplicaciones futuras en el campo de estudios antropológicos en
lo que respecta tanto en la generación de esquemas hipotéticos del desplazamiento de poblaciones a
través del tiempo (migraciones), en estudios filogenéticos como en probables procedencias étnicas de
asentamientos humanos.
En lo que toca a la arqueología facilitaría enormemente la identificación de restos en un entierro
común, así como el origen de éstos, y de tal modo a interpretar adecuadamente las prácticas culturales
involucradas en su momento en los restos de carácter arqueológico.
En la parte forense en lo que respecta a conflictos bélicos facilitaría el proceso de asignación de
origen de los restos de individuos involucrados.
Dado que una población en específico puede se caracterizada en una primer instancia por la
frecuencia existente de los haplogrupos mitocondriales, su podría advertir la relación entre una población
en particular y enfermedades a las que se encuentre propensa, información que puede ser utilizada por
las compañías farmacéuticas interesadas en lo que respecta a estudios de mercado.
Esta tecnología adicionalmente puede emplearse para la detección de mutaciones de un sólo
nucleótido involucradas en la aparición de enfermedades de origen genético.
Adicionalmente, siendo que, las bases de datos de ADNmt son bastante limitadas en cuanto al
número de datos, y esta circunstancia explica los bajos índices de probabilidad que se obtienen cuando
se trabaja en estudios filogenéticos con la opción del ADNmt. Con la ayuda de los Microarreglos se
facilitaría el recopilar datos de ADNmt
y ofertar así a la comunidad antropológica y forense una
herramienta fundamental en el tratamiento estadístico de las muestras analizadas mediante ADNmt.
En la parte del diseño se tiene como perspectiva complementar el diseño con la finalidad de que
el Microarreglo capaz de identificar todos los polimorfismos mitocondriales utilizados para análisis
filogenéticos en poblaciones nativas americanas, específicamente en las regiones mitocondriales HIV1 e
HIV2.
Disminuir los costos de análisis comparado a los existentes en el mercado para definir
haplogrupos en humanos.
Facilitar la detección de marcadores biológicos que permitan el análisis verás y de modo rápido y
costo menor a los métodos empleados actualmente, dada la gran cantidad de información que es
posible obtener.
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ANEXOI
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA
IECRETAAIA
IX
fOU(.OQI)HMUtAMéxlco., D. F.. a 10 de Septiembre de 2007.
Of.No.SA·UPIBI-1523/07
ALCALA HUERTA JUAN JOSE
7f SEMESTRE DE LA CARRERA DE
INGENIERIA BIOTECNOLÓGICA
Pr ese nte.
Comunico a u.sted, que como resultado de la evaluación del Comité de Proyecto Terminal,con
esta fecha queda registrado su proyecto terminal en la modalidad de "PROYECTO DE
INVESTIGACION" denominado "Diaeí\o de mlcroarregloa para la detección de haplogrupoa
humanoa en reato• óaeoa antlguoa de poblaclonea natlvaa amerlcanaa• bajo la asesorfa
externa de la Ora Maria do Lourdes Muño2: Moreno. e lntema de la Ore. Maria Guadalupe
Aamirez SoteiO.
De cumplir oon las condiCiones que abajo ae Indican, seré acredrtada la opción curricular de
tkulaclón. Asimismo me permito recordarle que el trabajo experimental deberá concluir en el
octavo semestre y entregar elInforme técnico final, de conformidad con los lineamienlos que
para talfln establezca el Comité mencionado.
CONDICIONES
1. Permanecer en la misma opción y actividad en elProyecto Terminal!,11 y 111.
2. Obtener una caiHicaclón Igual o superior a 8.0 en Proyecto Terminall.11 y 111.
3. Cumplir con el90% de asistencia a las actividades asignadas.
4. Cumplir con los demás requisitos que se fijanen elprograma de estudios de la asignatura.
ATE N T A M E N TE.
"LA TÉCNICA AL SEJJ'_O OE LA PATRIA"
SJITU ro POUTE"NICI
N-CION 'L
ING.YESICA M NGUEZ GALICIA.
SUBDIRECTORA ACADÉMICA.
up
tilDAD norr.s1om
iUIUilCIPLU
I IIA 11
IIOTOIROtOOil
11tillltl01ltl IY'
p_ .
M.en C. LEOIIARO OOROAZ OON'IRI:AA S Jolt dt lo Unod..dt Toonolo9lo E-llvo y Compuo Vl"utl Clt lo UPIBVIPN
.,_..,.c1t
Terminal
Av.Acueducto aln Col. Barrio te Laguna Tlcomán C P.07340 M6xklo, O F. Tot.:5729-6000 Exts.; 56347 y46117 Fu 58305
ANEXO 11
trv
Coloquio Internacional de Antropología Física
Juan Comas
t:l
&timado colega:
Por este conducto,elComité OrguUudor: del XlV Cohqll.io Jfllltnla(iqwaJ tk .A111rrJpilbfo FísitP ']11a11
úmal.. (11-16 de noviembre de 2007) :a.cus¿ recibo de su ponencia tirub.da "'Diceño de
microauegloe de ADN mitocondtial pata la deumtinación de haplogrupoc en rutoc
antiguoe oc"", de 1a autom. de Juan Jocé Alcali Huerta.María Concepción Motakt
Cómez y Ak'aro Diaz BadiD.o, jncluich en la. meu temitio "'Análi:tit de DNA mirocondrlal
de poblacionee prehitpinicar:",la cual que ha sido acepuda m el pmgnnu acadimioo del Co·
1oquio dado que recibió dictámenes positivos.
Colllli- dor
hd:tl5 cW A.t;soll f¡uJo:.a
fu:ci.lw D Gumc..rua
1..aut;l Huic.ochoJ.Goc:n
x..tút Liw:JI¡¡•Cn:cht.p
FJoncc:i& Na Sal= Muli:
1..- AzlloaioPw:liplJ Pldilll
!tOA: Mam.l=oc llodr:IJ'I)H
Ya.et-SM.u Pr:.:lhlbclt
Culo. Sem110<Saod:.et
CoedOt(.-,.okrLoul
Mipll.Ubwa OaiU.o
.r.wMonl•Btn::Odü
ra :np,
Recorduoos a Udque pu:a que el tubajo pueda ser incorpoado de DUlleU definióva. ¡J proga.nu
del Coloquio.el ozganizador y por lo menos uno de los comtores de cada. ponenci.l deben luber
p¡gado las cuotas oouespondientes a mis wd:u el 5 de ocrubre de 2007. Eldebe remurse
con la tesoreu de la AMAB: - Rosa M1. Rmlos Rodrigue.z.. tel. (55) 5622 9548,Instituto de Invesó-gttiones Anuopológicn, tJNAlt-o depositulo en la cuenta bmcui:a número 7558467 del Banco
Buu.mex, su0049 (CLABE 002180034975584671, pan depósitos inte.rba.ncuios).a nombre
de la. AsocUción Mexicana. de Antropología Biológica A. C.,y eJltliu copia del depósito adhedda ¡J
fonnato de pago de la A!.lAB ilooueo electrónico f11111@Jm'khr.lln111!1.m.Y o al fax número (55) 5622
9651.Dicho fOUJUto puede obtenerse enh pigina web ;ab;ajo refetida.
que tabajo pueda presentme en la mesa ooaespondiente.
por lo menos uno de los autores de cada ponencia debe esur presente. Se entregacln consuncin
de panicipu:ión únicamente a los autores que h;ayan pagado su cuou de insai.pción ¡JColoquio.
Asimismo, le reoot<hmos que paa
Las nomus editotiales pan la pre tacióo de los textos escritos pueden collStlla.rse en la cürecciÓ!I oJ•cnóniCllmp:/ /J'W.páJilr.,.../
oc Agndocimdo su piiticip>cién y ll do sus p<l001tes1mismas que sin duda ClO!ltribuirin de maneta imporunte iléxito de) cmoqwo.queda de Ud.,
Pci¡
Atentamente
México, D. F., 21de teptiembre de 2007
Por el Comité Organizador
T.t()
'f.V!u(')) St5229U4
jcoeuolo:.
cub_l«CD
A,.6;:¿Q,'hQeC2
Anttop. Andréc del Ángel E.
San Cristóbal de la• Casas, Chiapas, México,
11-16de noviembre 2007
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