1. Educación

Microbiología General
Analista BiológicoTecnicatura en Esterilización
Trabajo Práctico N°6. Microbiología General.
Reacciones Antígeno- Anticuerpo.
Objetivos:


Introducir al alumno en el uso de técnicas inmunológicas basadas en reacciones
inmunes primarias y secundarias
Dar a conocer la aplicación de tales técnicas en el campo de la investigación y en el
diagnostico clínico
Reacciones inmunes Secundarias
Técnica de Aglutinación
Ag
Ag
P
Ag
P
P
P
Aglutinación Directa
Aglutinación Pasiva o indirecta
Ag: Antigeno (Particulado)
P: Particula de latex o Glóbulo Rojo
: Antigeno soluble adsorbido
: Anticuerpo
b)
a)
P
P
P
P
P
P
P
P
Aglutinación Reversa
P: Particula de latex
: Anticuerpo adsorbido
: Antigeno
P
Inhibición de la aglutinación
a)Suero sin el antigeno Ej: GCh (Aglutinación positva: Ausencia de Ag)
b)Suero con antigeno Ej: GCh (Aglutinación Negativa: de Ag
: Particula de latex con antigeno soluble adsorbido
: Anticuerpo anti – Antigeno problema Ej: Ac anti GCh
: Antigeno
Aglutinación Directa.
Determinación de grupo sanguíneo y factor Rh (determinación cualitativa): Esta
determinación está basada en los siguientes Kits comerciales: Determinación de grupo
ABO. REDIAR. Elaborado por diagnstics Scotland. Edinburgh; Anti – D (Rho) monoclonal
para la detección de antigeno D (Rho). Wiener lab.
Materiales
o
Placa de toque
o
Agujas o lancetas
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o
Palillos descartables
o
Muestra: Sangre entera
Reactivos
o
Anticuerpos monoclonales anti-A (Mab anti – A)
o
Anticuerpos monoclonales anti-B (Mab anti – B)
o
Anticuerpos monoclonales anti-D (Mab anti – D)
Procedimiento
a) Muestra: Sangre. La muestra se obtiene por punción en un dedo con aguja o
lanceta, previa desinfección con alcohol. Es importante masajear al dedo antes
de la desinfección para aumentar la circulación y facilitar la salida de la sangre.
Descargar una gota en cada uno de los pocillos de la placa (3 en total).
Cuidando de que solo la sangre y no el resto del dedo entre en contacto con la
placa.
b) Colocar en el primer pocillo una gota de Mab anti-A, en el segundo una gota de
Mab anti – B y en el tercero una gota de Mab anti – D
c) Mezclar cada pocillo con un palillo distinto y observar la presencia o ausencia
de aglutinación.
d) Conclusión: La aglutinación (formación de grumos) indica la presencia del
antígeno sobre la superficie del eritrocito.(Ver Tabla 1).
Tabla 1: Determinación de Grupo y Factor
Grupo
Mab
Sanguíneo
anti – A
Mab anti
RH
–B
0
-
-
A
+
-
B
-
+
AB
+
+
+: Presencia de aglutinación
- : Ausencia de aglutinacion
Aglutinación Indirecta
Determinación de Factor Reumatoideo (Aglutinación indirecta en placa): Esta
determinación está basada en el Kit comercial: Artritest directo. Prueba de aglutinación en
placa para el diagnóstico de artritis reumatoidea, Wiener Lab.
Materiales
o
Placa de Vidrio con fondo negro
o
Palillo o varilla de vidrio
o
Cronómetro
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o
Fuente de Luz
o
Pipetas automáticas
o
Muestra: Suero
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Reactivos
o
Reactivo de Látex: suspensión de partículas de latex-poliestireno, que tienen
adsorbidas moléculas termoagregadas de gamma – inmunoglobulina o Fracción
II de Cohn. Este es el antígeno que será reconocido por el factor reumatoide.
o
Control positivo: Dilución de suero positivo
o
Dilución de suero negativo
Procedimiento
a) Llevar los reactivos a usar a temperatura ambiente
b) Colocar en uno de los sectores de la placa una gota del suero (50 μl) con pipeta
automática. Colocar en los otros dos sectores una gota (50 μl) de control
positivo y negativo respectivamente, usando el gotero provisto por el kit.
c) Agitar bien el reactivo de látex y colocar una gota en cada sector.
d) Mezclar con palillo o varilla de vidrio cada sector de la placa hasta obtener una
suspensión uniforme. Usar palillos distintos para la muestra y para los distintos
controles.
e) Disparar el cronómetro y balancear la placa y observar la placa bajo una fuente
luminosa dentro de los dos minutos después del mezclado.
Conclusión e interpretación de los resultados
o
Positivo: aglutinación que aparece dentro de los 2 minutos. (Indica la presencia
de factor reumatoide).
o
Negativo: Suspensión homogénea
o
Para que el resultado sea válido el control negativo debe dar una suspensión
homogénea, mientras que el control positivo debe dar una aglutinación clara.
Esto indicaría que el reactivo de látex se encuentra en óptimas condiciones.
Nota: se podría obtener un título si a las muestras positivas se le realizan diluciones seriadas
utilizando para ello solución fisiológica. Para la obtención del titulo se utiliza el mismo criterio
que en las técnicas anteriores.
Aglutinación Reversa
Determinación de gonadotrofina coriónica (hCG) por aglutinación en placa: Esta
determinación esta basada en el Kit comercial: Fecuntest directo. Prueba de aglutinación
directa en placa para diagnóstico de embarazo. Wiener Lab.
Materiales
o
Placa de vidrio
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o
Goteros
o
Palillos mezcladores
o
Cronómetro
o
Fuente luminosa
o
Muestra: orina de 24 hs
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Reactivos
o
Reactivo de látex – anti – hCG: suspensión de partículas de látex que tienen
absorbidas moléculas de anti – hCG
o
Control positivo: Solución buffer que tiene hCG conteniendo conservantes
o
Control negativo: Solución buffer sin hCG conteniendo conservantes
Procedimiento
a) Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente antes de usar
b) Colocar en uno de los sectores de la placa una gota de muestra. Utilizar los
otros dos sectores para el control positivo y para el negativo (hacer de cuenta
que se trata de dos muestras más). Colocar una gota de cada uno en su sector
correspondiente.
c) Agitar bien el reactivo de látex y colocar una gota en cada sector. (muestra,
control positivo, control negativo)
d) Mezclar con los palillos descartables y accionar el cronometro
e) Observar la placa utilizando una fuente de luz por encima de la misma y
realizando movimientos circulares.
Conclusión:
o
Positivo: Aglutinación macroscópica que aparece dentro de los dos minutos.
Cualquier aglutinación que aparezca pasados los dos minutos debe considerarse
negativa ya que se deben a aglutinaciones inespecíficas.
o
Negativo: Suspensión homogénea.
o
Para que el resultado sea válido el control positivo debe dar una aglutinación
clara y el negativo una suspensión homogénea.
Nota: se podría obtener un título si a las muestras positivas se le realizan diluciones seriadas
utilizando para ello solución fisiológica. Para la obtención del titulo se utiliza el mismo criterio
que en las técnicas anteriores.
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Reacciones inmunológicas Primarias
Tecnica de Inmunofluorescencia
F
F
F
F
F
F
Ac fluorescentes
F
Ac del suero del paciente
Impronta
IFD: inmunofluorescencia directa
IFI:Inmunofluorecencia indirecta
Figura 1. Inmuofluorescencia directa e indirecta
IFI: Deteccion de anticuerpos anti – Trypanosoma cruzi. Esta determinación está basada
en el kit comercial para la determinación de anticuerpos séricos anti - Trypanosoma cruzi por
inmunofluorescencia indirecta : IFIFLUOR PARASITEST CHAGAS. Laboratorios IFI. IFI
Vers 101001
Fundamento: Esta técnica permite determinar Ac séricos anti – Tripanosoma cruzi por IFI.
Para ello se enfrenta el suero del paciente con una impronta que posee el parásito fijado, y
luego de lavar, con el fin de eliminar los componentes no unidos, se enfrenta la misma a un
antisuero anti-γ globulina humana marcado con FICT. Si el suero del paciente posee Ac anti
Tripanosoma cruzi se observará una fluorescencia característica utilizando un microscopio
para tal fin.
Materiales
o
Microscopio de fluorescencia
o
Improntas (portaobjetos con T. cruzi fijados)
o
Tubos de ensayos
o
Pipetas de 5 ml
o
Cámara húmeda: pueden utilizarse cajas de Petri con papel o algodón
humedecido en agua
o
Frascos tipo Coplin
o
Pipetas automáticas
o
Cubreobjetos
o
Cronómetro
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o
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Muestra: Suero obtenido por coagulación e inactivado por calor a 56ºC por 30
min. Realizar dilución 1/30 en PBS. Por ejemplo 100μl de suero en 2,9ml de
PBS colocar la dilución en un tubo.
Reactivos:
o
Buffer fosfosalino (PBS) pH 7,2: Reconstituir el contenido del sobre en un litro
de agua destilada. Conservar en heladera hasta cuatro semanas
o
Anti – γ globulina humana marcada con FICT: Diluir, según las indicaciones
del frasco, el volumen a utilizar
o
Suero humano control positivo (listo para usar)
o
Suero humano control negativo (listo para usar)
o
Medio de Montaje
o
Azul de Evans
Procedimiento
a)
Retirar las improntas de los envases y dejar secar a temperatura ambiente
b) Sembrar 5 μl de las diluciones de las muestras, y de los controles en las
improntas (en las áreas circulares delimitadas para tal fin)
c) Incubar a temperatura ambiente (18-25ºC) por 20 minutos en cámara húmeda
d) Lavar abundantemente descargando PBS sobre las áreas sembradas utilizando
una pipeta. Esto es para evitar las contaminaciones entre las áreas. Sumergir las
improntas
por 5 minutos en un frasco Coplin conteniendo PBS y agitar
suavemente. Luego Retirar el PBS del frasco y reemplazarlo por PBS limpio,
dejar en reposo por 5 minutos más.
e) Retirar las improntas del frasco Coplin y secar los espacios entre las áreas
sembradas utilizando papel de filtro.
f) Cubrir con la dilución de anti – γ globulina las áreas sembradas utilizando para
ello una pipeta automática de 100 μl
g)
Incubar a temperatura ambiente por 20 minutos en cámara húmeda
h) Repetir los pasos de lavado indicados en el punto d)
i)
Cubrir las áreas sembradas con Azul de Evans durante dos minutos. Luego
lavar con PBS y secar suavemente con papel de filtro los espacios entre las
áreas sembradas
j)
Sacudir suavemente la impronta sobre el papel de filtro y secar nuevamente los
espacios las áreas evitando tocar las áreas sembradas.
k) Colocar sobre las áreas una gota de liquido de montaje y cubrir con un
cubreobjeto perfectamente limpio evitando la formación de burbujas
l)
Leer en microscopio de fluorescencia en lo posible dentro de las primeras
horas. En caso de no poder hacerlo; las improntas se pueden conservar en
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heladera (2-8ºC) por algunos días. En este último caso conviene sellar los
bordes del cubreobjetos con esmalte para uñas.
m) Interpretación de los resultados: Los parásitos fluorescentes (muestras reactivas
y controles positivos) poseen una fluorescencia amarillo verdosa intensa. El
control negativo no debe colorearse o solo muy levemente. Si se utilizó azul de
Evans los parásitos se tiñen con un tinte rojizo.
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