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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
Trabajo de Tesis Doctoral
Síntesis de novo de glicerolípidos en
macrófagos
Tesista: Lic. Quiroga, Ivana Yoseli
Directora: Dra. GONZALEZ BARÓ, María del Rosario
Codirectora: Dra. Pellon Maison, Magalí
Año 2016
El presente trabajo de tesis, para optar al grado de Doctor de la Facultad de Ciencias
Médicas de la Universidad Nacional de La Plata, fue realizado en el Instituto de
Investigaciones Bioquímicas de La Plata (INIBIOLP) "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner", de la
Facultad de Ciencias Médicas, de la Universidad Nacional de La Plata, bajo la dirección de
la Dra. María del Rosario Gonzalez Baró y la co-dirección de la Dra. Magali Pellon Maison.
Mi reconocimiento
A las autoridades del INIBIOLP, el Dr. Horacio Garda y la Dra. Margarita García, por haberme
abierto las puertas del Instituto,
A la Cátedra de Anatomía B y al Dr. Julio Hijano por brindarnos amablemente un espacio para
poder trabajar con comodidad.
A la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica por otorgarme la beca de iniciación de
doctorado y al CONICET, por haberme otorgado la beca de finalización de doctorado que me
permitieron realizar este trabajo de Tesis Doctoral y por el apoyo que otorgaron a nuestro grupo de
investigación,
A BECAR, por otorgarme la beca de estadías en Estados Unidos para estudiantes de Doctorado que
me permitió realizar una buena parte de los experimentos que componen esta tesis.
A las autoridades de la Facultad de Ciencias Médicas que me permitieron inscribirme y realizar mi
trabajo para optar por el título de Doctor.
Mi agradecimiento
A mi directora de tesis, la Dra. María Gonzalez Baró (“Marita”), por haberme aceptado en su grupo
de investigación, por todo lo que me enseñó durante estos años, por todos sus consejos y su guía y
por haberme permitido desarrollar una relación que trasciende lo laboral caracterizada por la
empatía y el respeto mutuo.
A mi co-directora de tesis, la Dra. Magali Pellon Maison, por su gran ayuda dentro y fuera del
trabajo durante todos estos años, su excelente predisposición al trabajo, la discusión enriquecedora
de resultados y su constante guía fundamental para el desarrollo de este trabajo de tesis.
Al Dr. Mauro Montanaro, por sus consejos acerca de “la vida científica”, su constante
predisposición para resolver cuestiones relacionadas al buen funcionamiento del grupo, y por su
“buena onda” que más de una vez fue responsable de robarnos una sonrisa en momentos de
tensión y estrés.
A la Dra. Rosalind Coleman, por haberme permitido realizar una estadía de investigación en su
laboratorio de la Universidad de Carolina del Norte, por proveerme de todo lo necesario para
realizar mi trabajo, y sobre todo por sus generosos y enriquecedores consejos y guía durante ese
periodo.
A mis compañeros y amigos del laboratorio, Eli, Bel, Marian, Sole, Carli, Guille, Debo y Santi quienes
crearon en el laboratorio un ambiente de amistad y cooperación constante que trascendió el lugar
de trabajo. Gracias por todos sus consejos y por su alegría.
A mis compañeros del laboratorio de la Universidad de Carolina del Norte, Pam, Amanda, Zegning,
Liyang, Flor y Eric, por su compañerismo, su predisposición para ayudar y por hacer de mi estadía
en el exterior una experiencia maravillosa tanto en lo laboral como en lo personal.
A todo el personal del INIBIOLP, sobre todo a Horacio Garda, su director, Marina y Silvana, por
siempre estar dispuestos a colaborar.
A mi familia por siempre alentarme a perseguir mis sueños y apoyarme en cada paso, desde cerca o
a la distancia.
A mis amigos, son muchos para nombrarlos, gracias por hacer que todos estos años de esfuerzo
sean más lindos, gracias por escucharme en los momentos difíciles y festejar cada logro junto a mí.
A Federico, por apoyarme y alentarme a crecer en todo momento, por dejarme ser parte de su vida
y ser mi conexión a tierra, por sus abrazos, su contención y su compañía invaluable.
A Dios, por ser mi apoyo y fortaleza incondicional en todo tiempo, por darme la oportunidad de
haber llegado a cumplir este sueño y de seguir soñando aún más.
ÍNDICE DE CONTENIDO
ABREVIATURAS UTILIZADAS: ................................................................................................ 1
RESUMEN................................................................................................................................. 4
INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................... 5
Inmunometabolismo ............................................................................................................... 5
Macrófagos: Tipos y funciones .............................................................................................. 5
Polarización de macrófagos ................................................................................................... 6
Activación clásica de macrófagos en el contexto del proceso infeccioso............................... 7
Rol de los macrófagos en la formación de la placa aterogénica: transición de macrófago a
célula espumosa .................................................................................................................... 9
Metabolismo de lípidos durante la activación de macrófagos y su transición a células
espumosas........................................................................................................................... 11
Vía de síntesis de novo de glicerolípidos ............................................................................. 11
Glicerol-3-fosfato acil transferasa (GPAT) ........................................................................... 13
HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS.............................................................................. 15
MATERIALES Y MÉTODOS: .................................................................................................. 16
1. MODELOS EXPERIMENTALES ...................................................................................... 16
1.1. Cultivos celulares ...................................................................................................... 16
1.2. Animales: Mus musculus ........................................................................................... 17
1.3. Obtención de macrófagos primarios derivados de médula ósea de ratón (BMDM)... 17
2. ACTIVACIÓN DE MACRÓFAGOS MEDIANTE EL USO DE KLA2-LÍPIDO A ................ 18
3. DIFERENCIACION MACRÓFAGO-CÉLULA ESPUMOSA MEDIANTE EL USO DE LDL
OXIDADAS .......................................................................................................................... 18
4. DIFERENCIACION DE MONOCITOS A MACRÓFAGOS MEDIANTE EL USO DE
ESTERES DE FORBOL (PMA) ........................................................................................... 18
5. PROTOCOLOS GENERALES DE TRABAJO CON DNA ................................................ 18
5.1. Cepa utilizada de bacterias. ...................................................................................... 19
5.2. Medios de cultivos utilizados para bacterias. ............................................................ 19
5.3. Preparación de bacterias competentes. .................................................................... 19
5.4. Transformación de bacterias con DNA plasmídico. ................................................... 19
5.5. Obtención de plásmidos a pequeña escala (miniprep). ............................................. 20
5.6. Obtención de plásmidos a gran escala (maxiprep).................................................... 20
5.7. Cuantificación de DNA. ............................................................................................. 20
5.8. Digestión con enzimas de restricción. ....................................................................... 21
5.9. Electroforesis en geles de agarosa. .......................................................................... 21
5.10. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). ......................................................... 21
5.11. Transfección de células eucariotas. ........................................................................ 21
6. PROTOCOLOS GENERALES DE TRABAJO CON RNA. ............................................... 22
6.1. Obtención de RNA..................................................................................................... 22
6.2. Cuantificación de RNA. ............................................................................................. 22
6.3. Evaluación de la calidad de RNA. ............................................................................. 23
6.4. Obtención de DNA complementario (cDNA). ............................................................ 23
6.5. PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR). .................................................................. 23
7. SILENCIAMIENTO DE Gpat3 MEDIANTE shRNA. ......................................................... 26
7.1.shRNA utilizados. ....................................................................................................... 26
7.2. Generación de partículas lentivirales......................................................................... 27
7.3. Transducción de células RAW 264.7 con vectores lentivirales ................................. 28
8. PROTOCOLOS GENERALES DE TRABAJO CON PROTEÍNAS. .................................. 29
8.1. Obtención de homogenatos totales de células .......................................................... 29
8.2. Cuantificación de proteínas. ...................................................................................... 29
8.3. Medición de actividad enzimática de la glicerol-3-fosfato acil transferasa (GPAT).... 30
9. PROTOCOLOS GENERALES DE TRABAJO CON LÍPIDOS ......................................... 30
9.1. Tinción de gotas de lípido mediante la técnica de Oil Red O. ................................... 30
9.2. Extracción de lípidos mediante la técnica de Bligh y Dyer. ....................................... 31
9.3. Separación de lípidos por cromatografía de capa delgada (TLC). ............................ 31
9.4. Cuantificación de trigliceroles (TAG) totales. ............................................................. 31
9.5. Cuantificación de PL totales. ..................................................................................... 31
9.6. Ensayos de incorporación de [14C]-acetato y [14C]- ácido oleico ([14C]-OA) en lípidos.
......................................................................................................................................... 32
10. ENSAYOS FUNCIONALES ........................................................................................... 32
10.1. Ensayos de Fagocitosis ........................................................................................... 32
10.2. Medición de la liberación de citoquinas mediante método Luminex. ....................... 32
RESULTADOS Y DISCUSIÓN: ............................................................................................... 33
SECCIÓN 1: ESTUDIO DE LA SÍNTESIS DE GLICEROLÍPIDOS Y SU FUNCIÓN
DURANTE LA ACTIVACIÓN DE MACRÓFAGOS ............................................................... 33
1.1. SÍNTESIS DE NOVO DE GLICEROLÍPIDOS DURANTE LA ACTIVACIÓN DE
MACRÓGAGOS ............................................................................................................... 33
1.1.1. La activación de células RAW 264.7 con KLA produce la acumulación de gotas
de lípido, TAG y PL ....................................................................................................... 33
1.1.2. La activación de células RAW 264.7 con KLA produce un aumento en la síntesis
de novo de FA y glicerolípidos ...................................................................................... 34
1.1.3. Durante la activación de células RAW 264.7 con KLA aumenta la expresión de
las isoformas Gpat3 y Gpat4 mientras que disminuye la expresión de la isoforma Gpat1
...................................................................................................................................... 35
1.1.4. La expresión de GPAT3 y GPAT4 aumenta durante la transición de monocitos
THP1 a macrófagos luego del tratamiento con ésteres de forbol. ................................ 37
1.1.5. La actividad GPAT aumenta tras la activación de células RAW 264.7 con KLA . 38
1.1.6. La activación de macrófagos primarios derivados de médula ósea de ratón
produce la acumulación de gotas de lípido, TAG y PL. ................................................ 39
1.1.7. La activación de BMDM con KLA produce un incremento en la síntesis de novo
de FA y glicerolípidos.................................................................................................... 40
1.1.8. La actividad GPAT3/4 aumenta tras la activación de BMDM con KLA pese a la
disminución de la expresión del mRNA. ....................................................................... 41
1.2. ROL DE GPAT3 Y GPAT4 EN EL METABOLISMO DE GLICEROLÍPIDOS Y SUS
CONSECUENCIAS FUNCIONALES DURANTE LA ACTIVACIÓN DE MACRÓFAGOS. 44
1.2.1. El silenciamiento de Gpat3 en células RAW 264.7 provoca una disminución en la
acumulación de gotas de lípido, TAG y PL. .................................................................. 44
1.2.2. El silenciamiento de Gpat3 produce una disminución en la síntesis de novo de FA
y glicerolípidos en células RAW 264.7 activadas. ......................................................... 45
1.2.3. Los BMDM Gpat3-/- y Gpat4-/- poseen una menor actividad GPAT NEM-sensible y
acumulan menos gotas de lípido, TAG y PL luego de su activación............................. 47
1.2.4. La ausencia de GPAT3 o GPAT4 produce una disminución en la síntesis de novo
de FA y glicerolípidos en BMDM activados................................................................... 50
1.2.5. El silenciamiento o la ausencia de Gpat3 o Gpat4 en células RAW 264.7 y/o
BMDM afectan la capacidad fagocítica luego de la activación con KLA. ...................... 52
1.2.6. La ausencia de Gpat3 o Gpat4 en BMDM afecta la expresión y liberación de
citoquinas y quimioquinas al medio. ............................................................................. 55
Conclusiones parciales: ....................................................................................................... 58
SECCIÓN 2: ESTUDIO DE LA SÍNTESIS DE GLICEROLÍPIDOS Y SU FUNCIÓN
DURANTE LA TRANSICIÓN MACRÓFAGO-CÉLULA ESPUMOSA. ................................. 59
2.1. SÍNTESIS DE NOVO DE GLICEROLÍPIDOS DURANTE LA TRANSICIÓN
MACRÓFAGO-CÉLULA ESPUMOSA.............................................................................. 59
2.1.1. La incubación de células RAW 264.7 con oxLDL produce su transición a célula
espumosa. ........................................................................................................................... 59
2.1.2. El tratamiento de células RAW 264.7 con oxLDL produce un aumento en la
síntesis de novo de TAG. .............................................................................................. 61
2.1.3. Durante la transición célula RAW 264.7- célula espumosa aumenta la expresión
de Gpat3 y la actividad GPAT. ...................................................................................... 62
2.1.5. La incubación de BMDM con oxLDL produce su transición a célula espumosa. 63
2.1.6. La expresión de Gpat3 aumenta durante la transición BMDM- célula espumosa.
...................................................................................................................................... 64
2.2. ROL DE GPAT3 Y GPAT4 EN EL METABOLISMO DE GLICEROLÍPIDOS Y SUS
CONSECUENCIAS DURANTE LA TRANSICIÓN MACRÓFAGO-CÉLULA ESPUMOSA.
......................................................................................................................................... 65
2.2.1. El silenciamiento de Gpat3 en células RAW 264.7 atenúa la acumulación de
gotas de lípido, TAG y PL tras su transición a célula espumosa. ................................. 65
2.2.2. El silenciamiento de Gpat3 provoca una disminución en la síntesis de novo de
TAG durante la transición células RAW 264.7- célula espumosa. ................................ 66
2.2.3. Los BMDM Gpat3-/- y Gpat4-/- acumulan menos gotas de lípido, TAG y PL luego
de su transición a célula espumosa. ............................................................................. 69
2.2.4. La ausencia de Gpat4 en BMDM afecta la liberación de citoquinas y
quimioquinas al medio durante su transición a célula espumosa. ................................ 70
Conclusiones parciales:.................................................................................................... 72
CONCLUSIÓN......................................................................................................................... 73
BIBLIOGRAFÍA........................................................................................................................ 74
ABREVIATURAS UTILIZADAS:
AA: ácido araquidónico
acLDL: lipoproteína de baja densidad acetilada
ACSL: acil-CoA sintetasa para ácidos grasos de cadena larga
AGPAT: ácido lisofosfatídico aciltransferasa
BMDM: macrófagos derivados de médula ósea
CE: ésteres de colesterol
Cho: colesterol
CPT1: carnitina aciltransferasa 1
DGAT: acilCoA:diacilglicerol aciltransferasa
FA: ácidos grasos
FAS: ácido graso sintasa
FFA: ácidos grasos libres
G3P: glicerol-3-fosfato
GK: glicerol quinasa
GPAT: glicerol-3-fostato aciltransferasa
IL-10: Interleuquina 10
IL-1β: Interleuquina 1 beta
IL-6: Interleuquina 6
iNOS: óxido nítrico sintasa
KLA: kdo2-Lípido A (2-keto-3-deoxyoctonic acid lípid A)
KO: knock-out (referido al ratón deficiente en un gen)
LDL: lipoproteína de baja densidad
LPA: ácido lisofosfatídico
LPS: lipopolisacárido
1
MAPKs: proteínas quinasas activadas por mitógenos
MCP-1 o CCL2: proteína quimioatrayente de monocitos
M-CSF: macrophage colony stimulation factor (factor de estimulación de formación de
colonias de macrófagos)
MyD88: factor de diferenciación mieloide 88
NEM: N-etil maleimida
NF-κB: factor nuclear κB
OA: ácido oleico
oxLDL: lipoproteína de baja densidad oxidada
PA: ácido fosfatídico
PAMPs: patrones moleculares asociados con patógenos
PAP: fosfatidato fosfohidrolasa
PC: fosfatidilcolina
PE: fosfatidiletanolamina
PI: fosfatidilinositol
PL: fosfolípidos
PMA: 12-miristato, 13-acetato de forbol
PS: fosfatidilserina
qPCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real
ROS: especies reactivas de oxígeno.
RRP: receptores de reconocimiento de patrones
TAG: triacilgliceroles
Th1: linfocito T helper 1
Th2: linfocito T helper 2
TIR: receptor Toll-interleuquina 1
2
TLC: thin layer chromatography (cromatografía en capa delgada)
TLR: toll like receptor (receptor tipo Toll)
TNF-α: factor de necrosis tumoral alfa
TRIF: proteína contenedora de dominios TIR que activa interferón-β
3
RESUMEN
Los macrófagos son células involucradas en la inmunidad innata y el mantenimiento de
la homeostasis tisular. Tanto durante la activación de macrófagos por la exposición a patógenos
como en la transición macrófago-célula espumosa en el contexto de la formación de la placa
aterogénica se produce un aumento en la cantidad de gotas de lípido intracelulares. Los
mecanismos por los cuales se acumulan estos lípidos y la relevancia que éstos poseen para la
funcionalidad del macrófago no se conocen por completo. Por lo tanto, el objetivo general de
este trabajo fue determinar la contribución de la síntesis de novo de glicerolípidos a la
acumulación de gotas de lípido durante procesos de transición de macrófagos y en particular,
evaluar el rol que cumple la enzima limitante de este proceso, la glicerol-3-fosfato
aciltransferasa (GPAT). Se demostró que la inducción de la síntesis de novo de glicerolípidos
(triacilgliceroles y fosfolípidos) contribuye al aumento en la masa de lípidos en la línea celular
de macrófagos murinos RAW 264.7 y en macrófagos primarios derivados de médula ósea
tratados con KLA (componente activo del LPS bacteriano) o con LDL oxidadas. Particularmente
se comprobó que hay un incremento en la actividad GPAT correspondiente a las isoformas que
se expresan en retículo endoplásmico GPAT3 y GPAT4. Mediante la utilización de modelos de
silenciamiento de estas dos isoformas se demostró que ambas contribuyen a la activación de
la síntesis de glicerolípidos observada. En cuanto a la relevancia funcional de estos lípidos, se
comprobó que se requiere de la movilización de glicerolípidos mediante la actividad de lipasas
para que se produzca el proceso de fagocitosis en forma eficiente. Estos lípidos liberados
contribuyen no sólo energéticamente proveyendo de ácidos grasos para la β-oxidación, sino
que también son requeridos presumiblemente para la producción de señales que inicien el
proceso. La ausencia de GPAT3 o GPAT4 disminuye la eficiencia de la fagocitosis y en
particular la carencia de GPAT4 exacerba la liberación de citoquinas pro-inflamatorias,
sugiriendo para esta isoforma un rol en la atenuación de las señales infamatorias lo que la
posiciona como un potencial blanco terapéutico.
4
INTRODUCCIÓN
Inmunometabolismo
Durante los últimos años el campo de la inmunología ha empezado a interesarse en un
nuevo aspecto del sistema inmune: el “metabolismo del sistema inmune o
“inmunometabolismo”. Esta rama emergente del saber busca dilucidar nuevos conocimientos
acerca de dos aspectos principales: el primero se centra en el estudio del efecto de las células
inmunes en órganos que regulan el metabolismo del organismo completo, como en el caso del
rol de los macrófagos en el tejido adiposo de personas obesas, el exceso en la producción de
citoquinas pro-inflamatorias y el desarrollo de la resistencia a insulina (Romeo, et al., 2012;
Johnson and Olefsky, 2013), y el segundo explora el rol de las distintas vías metabólicas dentro
de las células del sistema inmune y cómo éstas regulan la respuesta inmunológica (Pearce, et
al., 2013). En lo referente a este último aspecto, existe un gran interés en dilucidar cómo y por
qué las células inmunes activan o desactivan ciertas vías metabólicas, cómo éstas se
interrelacionan y de qué forma aportan metabolitos intermedios que funcionan activando o
inhibiendo las vías de señalización que terminan por regular la respuesta biológica de cada una
de ellas. La ampliación de estos estudios resulta fundamental, ya que el conocer las enzimas
que regulan vías metabólicas clave en la capacidad de cada célula para efectuar su respuesta
inmune, permite individualizar blancos terapéuticos contra los cuales desarrollar fármacos
capaces de lograr una moderación, apagado o aumento en la intensidad de esa respuesta de
acuerdo a las necesidades de tratamiento en cada patología.
Macrófagos: Tipos y funciones
En los últimos años ha cobrado gran interés el estudio del inmunometabolismo de
macrófagos. Los macrófagos son células hematopoyéticas derivadas de monocitos
ampliamente distribuidas a lo largo del organismo que juegan un rol vital en el mismo. A pesar
de que durante muchos años se ha considerado a los macrófagos como meros efectores del
sistema inmune innato, estas células cumplen roles muy diversos. Como su nombre lo indica,
los macrófagos son fagocitos muy eficientes que contribuyen no sólo a la defensa contra
antígenos extraños en el contexto de la inmunidad innata, sino también al mantenimiento de la
homeostasis del organismo a través de la eliminación de células apoptóticas, senescentes y
dañadas generadas durante el recambio de tejidos, así como también de células cancerosas
(Gordon and Taylor, 2005). Además, esta capacidad de fagocitar y eliminar células apoptóticas
es utilizada por los macrófagos para cumplir un rol vital en el proceso de organogénesis y
desarrollo embrionario concentrándose en sitios de alta tasa de muerte celular como las
membranas interdigitales (Hopkinson-Woolley, et al., 1996). Esta función de remodelación de
tejidos se mantiene en el adulto, donde los macrófagos son cruciales en procesos de
regeneración luego de infecciones y lesiones (Koh and DiPietro, 2011).
Además de los monocitos circulantes con potencialidad de ser reclutados y diferenciarse
en macrófagos en sitios de lesiones e infecciones, existen macrófagos residentes en múltiples
órganos en donde cumplen diferentes funciones de acuerdo al microambiente en el cual se
5
encuentran (Gordon and Taylor, 2005). Ejemplos de ello son los macrófagos en el hígado
(células Kupffer) que ayudan en la remoción de toxinas circulantes (Roberts, et al., 2007), los
macrófagos alveolares, que en el pulmón se especializan en capturar y eliminar antígenos
ambientales luego de su inhalación (McCusker and Hoidal, 1989), los osteoclastos, que resultan
fundamentales en el proceso de remodelación del hueso (Hadjidakis and Androulakis, 2006),
los múltiples tipos de macrófagos que residen en el intestino, en donde participan en el
mantenimiento de la tolerancia hacia la flora bacteriana y los alimentos (Murray and Wynn,
2011), y las diferentes clases de macrófagos del sistema nervioso central, tales como la
microglía y los macrófagos meningeales, cuyas funciones incluyen la presentación de antígenos
y el mantenimiento de la barrera hematoencefálica (Hickey, 1999).
A pesar de que la captura de restos celulares sería la función principal de los macrófagos
en condiciones normales, estas células son capaces de secretar un conjunto de mediadores
solubles que también contribuyen al mantenimiento de la homeostasis, incluyendo enzimas,
citoquinas, quimioquinas, derivados del ácido araquidónico (AA) y glicoproteínas como la
fibronectina (Takemura and Werb, 1984).
Como miembros del sistema inmune innato, los macrófagos funcionan como centinelas
en todos los tejidos, proveyendo una defensa inmediata contra antígenos extraños gracias a su
ubicación estratégica cerca de las superficies epiteliales del organismo. De esta forma, la
respuesta inmune innata a cargo de los macrófagos se inicia con el reconocimiento de
estructuras moleculares muy conservados y presentes en grandes grupos de microorganismos
denominadas “patrones moleculares asociados con patógenos” (PAMP). La identificación de
PAMPs es llevada a cabo por los receptores de reconocimiento de patrones (RRP) presentes
en la superficie del macrófago. Uno de los RRP más comunes es el TLR4, perteneciente a la
familia de los TLR (Toll like receptors), receptores que identifican PAMPs presentes en bacterias
y algunos virus. TLR4 junto con CD14 reconocen al lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gramnegativas, específicamente el componente activo del mismo, el Kdo2-Lípido A (2-keto-3deoxyoctonic acid lípid A, KLA) (Kielian and Blecha, 1995; Dobrovolskaia and Vogel, 2002;
Raets, et al., 2006).
El reconocimiento de PAMPs permite que los macrófagos incorporen rápidamente a los
microorganismos invasores y los encapsulen en un compartimiento fagocítico. Luego, este
fagosoma se fusiona con el lisosoma, organela de pH muy ácido que promueve la degradación
y eliminación de las partículas incorporadas. Por último, la capacidad de los macrófagos de
adquirir antígenos y exponerlos a través del complejo mayor de histocompatibilidad clase dos
(MHC II), así como también la capacidad de producir citoquinas específicas, permite que estas
células contribuyan al sistema inmune adaptativo al influenciar el comportamiento de linfocitos
T.
Polarización de macrófagos
Los macrófagos son una población de células muy heterogénea en cuanto a su
polarización fenotípica ya que pueden ser activados adquiriendo fenotipos y funciones muy
diferentes de acuerdo a las condiciones presentes en su microambiente. Entre ellos
encontramos por un lado a los macrófagos activados en forma clásica o pro-inflamatoria (M1) y
por otro a aquellos que son activados en forma alternativa y que desarrollan un perfil antiinflamatorio (M2). Cada uno de los extremos fenotípicos M1 y M2 está asociado a un patrón de
expresión específico de receptores, citoquinas, quimioquinas y efectores proteicos marcadores
6
(Tabla 1). Los macrófagos activados de manera clásica son muy potentes en la eliminación de
microorganismos y células tumorales mientras producen citoquinas pro-inflamatorias y activan
respuestas inflamatorias mediadas por linfocitos T helper 1 (Th1). Los M2, por el contrario,
balancean las respuestas inflamatorias actuando a través de la respuesta adaptativa de clase
Th2. Además de estos extremos funcionales, en los últimos años se ha propuesto la existencia
de una amplia variedad de estados intermedios dependiendo del contexto en el que estas
células son activadas (Martínez, et al., 2008; Martínez and Gordon, 2014; Mosser and Edwards,
2008; Stout and Suttles, 2004 y Murray, et al., 2014).
Fenotipo
Macrófagos activados en
forma clásica (M1) proinflamatorios
Macrófagos activados en
forma alternativa (M2)
anti-inflamatorios
Receptores implicados
TLR2, TLR4, FcγRI, II, III
MrcI, SRA, SRB, CXCR1,
CXCR2
Citoquinas
IL-1, 6, 8, 12, TNFα,
IL-4, IL-10, TGFβ,
Quimioquinas
MCP1 (Ccl-2), Ccl-3, 5
MCP2, Ccl-1
Efectores
ROS, iNOS
Arginasa
Tabla 1.Propiedades básicas de macrófagos polarizados (modificado de Martinez, et al., 2008; Mantovani, et
al., 2003).
Activación clásica de macrófagos en el contexto del proceso infeccioso
El LPS es un inductor inflamatorio que activa macrófagos de forma clásica M1 y produce
la liberación de citoquinas y quimioquinas pro-inflamatorias tales como TNF-α, IL-1, IL-6 y MCP1 (Figura1A). Específicamente, este ligando se une a receptores TLR4, lo cual induce su
dimerización y subsiguiente unión tanto al factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88) como a
TRIF, proteína contenedora de dominios TIR (receptor Toll-interleuquina 1) que activa
interferón-β. Estas vías señalizadoras terminan activando a proteínas quinasas activadas por
mitógenos (MAPKs) y al factor nuclear κB (NF-κB), con la consecuente liberación de una
variedad de moléculas pro-inflamatorias y la inducción de los interferones tipo 1 y todos los
genes que son activados por ellos (Lu, et al., 2008) (Figura1B).
Luego de ser activados, los macrófagos salen de su estado quiescente, su metabolismo
se vuelve más glucolítico e incrementan su capacidad fagocítica y la liberación de óxido nítrico
y especies reactivas de oxígeno (ROS) para eliminar las partículas extrañas. Además, durante
este proceso se altera el metabolismo de lípidos, lo cual resulta de gran interés debido a su
relevancia en la inducción y resolución del proceso inflamatorio (Andreyev, et al., 2010). Por
ejemplo, la activación tipo M1 por acción del LPS lleva a un incremento en la producción de
moléculas señalizadoras derivadas de AA, incluyendo a leucotrienos y prostaglandinas
implicados en el desarrollo del proceso inflamatorio (Greene, et al., 2011).
7
Figura 1. Activación clásica de macrófagos con LPS. Durante una infección bacteriana, el LPS que compone la membrana
de las bacterias Gram-negativas se acopla a una proteína de unión a LPS (LBP). Este complejo es censado por los receptores
CD14-TLR4, lo cual provoca la dimerización de los TLRs y su fusión a MyD88 y a TRIF, en las que se denominan vía MyD88
dependiente y MyD88 independiente. Estas vías implican la activación de NF-κB y de las MAP quinasas (MAPK). El efecto final
de estas vías de señalización es la producción y liberación de proteínas pro-inflamatorias y la activación del Interferón tipo 1, lo
cual lleva la activación clásica de macrófagos o M1 y al proceso inflamatorio.
El proceso inflamatorio no resuelto en forma correcta muchas veces resulta en daño
tisular y por ello se lo considera blanco de múltiples terapias y ha cobrado especial interés en
enfermedades vinculadas al desarrollo de un episodio inflamatorio exacerbado, como es el caso
de la obesidad, la aterosclerosis, y diversas enfermedades autoinmunes (Flavell, 2002; Reed,
1999). Esto se produce, entre otras cosas, debido a que las especies reactivas de oxígeno y el
óxido nítrico producido por macrófagos activados en forma clásica son altamente tóxicos para
microorganismos invasores, pero también pueden ser dañinos para los tejidos que rodean la
zona de infección, llevando al desarrollo de procesos inflamatorios aberrantes y/o crónicos
(Serbina, et al., 2008). Es por ello que las respuestas pro-inflamatorias y antimicrobianas
desarrolladas por macrófagos M1 deben ser controladas para prevenir el daño colateral de los
órganos involucrados. En la regulación y atenuación de estas respuestas pro-inflamatorias los
macrófagos M2 cumplen un rol fundamental, ya que poseen un potente efecto anti-inflamatorio
y contribuyen a la regeneración de tejidos. Así, el balance entre las poblaciones de ambos tipos
de macrófagos resulta fundamental para mantener la homeostasis de los tejidos, y una
alteración en este balance es un patrón que se observa en forma reiterada en múltiples
patologías que involucran un proceso inflamatorio exacerbado (Murray and Wynn, 2011). En el
tejido adiposo, por ejemplo, los macrófagos M2 mantienen la funcionalidad de los adipocitos, la
sensibilidad a la insulina y la tolerancia a la glucosa, lo cual puede prevenir el desarrollo de
obesidad inducida por la dieta y diabetes tipo II (Lumeng, et al., 2007; Odegaard, et al., 2007).
Sin embargo, se ha reportado que a medida que la obesidad progresa, los macrófagos de tipo
M2 sufren una transformación hacia un fenotipo pro-inflamatorio M1, lo cual termina por inducir
resistencia a la insulina (Vandanmagsar, et al., 2011; Chawla, et al., 2011). Respecto a otras
patologías, también se han identificado a las citoquinas TNF, IL-18, IL-12 e IL-23 derivadas de
macrófagos M1 como importantes mediadores de varias enfermedades autoinmunes e
infecciones crónicas incluyendo la enfermedad de Crohn, la artritis reumatoidea, la esclerosis
8
múltiple y la hepatitis autoinmune (Murphy, et al., 2009; Smith, et al., 2009; Kawane, et al.,
2006).
Rol de los macrófagos en la formación de la placa aterogénica: transición de macrófago
a célula espumosa
La aterosclerosis es una patología caracterizada por la acumulación de material graso
en las paredes de las arterias, seguido por un progresivo deterioro y reducción del flujo
sanguíneo debido a un exacerbado proceso inflamatorio que muchas veces puede resultar en
la formación de un trombo y la oclusión del vaso (Ross, 1999; Lusis, 2000). Hasta el momento,
las principales aproximaciones terapéuticas destinadas a reducir la predisposición a sufrir
arterosclerosis se basan en la corrección del exceso de lipoproteínas tales como las LDL
(lipoproteínas de baja densidad) ricas en ésteres de colesterol (CE) y con un contenido menor
de triacilgliceroles (TAG) mediante el uso de fibratos, agonistas de los receptores activados por
proliferadores peroxisómicos (PPAR) α, y estatinas, inhibidores de la enzima reguladora de la
síntesis endógena de colesterol (Cho) (Glass and Witztum, 2001). Sin embargo, los avances en
la comprensión de las vías metabólicas y de los procesos celulares implicados en la
aterogénesis impulsan al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Una de estas
estrategias se basa en la manipulación de los procesos metabólicos que tienen lugar en las
propias células que formarán la placa de ateroma, entre las cuales destacan los monocitos y
los macrófagos. Estas células desempeñan un papel fundamental en todas las fases del
desarrollo de la aterosclerosis, por lo cual constituyen dianas terapéuticas idóneas para una
acción anti-aterogénica.
Durante el proceso de desarrollo de la placa aterogénica los monocitos son reclutados al
sitio de la lesión, luego se adhieren al endotelio, y por un proceso de transvasación migran hacia
la capa íntima (Figura 2). En este lugar, los monocitos se diferencian en macrófagos cuando
censan la presencia del factor de estimulación de formación de colonias de macrófagos (MCSF), una citoquina formada en la placa íntima del vaso dañado (Hansson, 2005). Al sufrir este
proceso de diferenciación, los macrófagos incrementan el nivel de expresión de receptores
TLRs y de tipo “scavenger” o “basurero” como los SR-A y CD-36 que internalizan lipoproteínas
modificadas, tales como LDLs acetiladas (acLDL) u oxidadas (oxLDL). La captación de estas
partículas induce la transición de macrófago a célula espumosa (Kunjathoor, et al., 2002). Estas
células reciben ese nombre debido a su fenotipo caracterizado por la acumulación de múltiples
gotas de lípido, organelas dinámicas rodeadas por una monocapa de fosfolípidos (PL) que
acumulan lípidos neutros, mayoritariamente CE provenientes de las LDL modificadas y también
TAG (Guo, et al., 2009). Además del rol de los receptores basurero en este proceso, los TLR
del macrófago desempeñan un papel relevante en la respuesta inmune que caracteriza el
proceso aterosclerótico, ya que están implicados en la activación de la respuesta inflamatoria
en estas células (Tobias and Curtiss, 2005). En las lesiones arteroscleróticas se han identificado
distintas poblaciones de macrófagos, M1, M2 y de fenotipos intermedios. Al parecer, en esta
patología al igual que en otras, el equilibrio entre la cantidad de macrófagos de cada tipo y las
citoquinas que cada uno libera es fundamental para la formación de la placa (McLaren, et al.,
2011). Se han caracterizado citoquinas que funcionan como estimuladoras de la formación de
la célula espumosa, como INF-γ, IL-1β y TNF-α (McLaren and Ramji, 2009; Li, et al., 2010;
Panousis and Zuckerman, 2000; Hsu and Twu, 2000; Persson, et al., 2008; Lei, et al. 2009;
Devlin, et al., 2002) así como también otras que actúan inhibiendo este proceso: TGF-β e IL-10
9
(Mallat, et al., 1999; Pinderski, et al., 2002; Rubic, et al., 2006; Han, et al., 2010) mientras que
el rol de otras citoquinas como la IL-6 es controversial (Liao, et al., 1999; Huber, et al., 1999;
Keidar, et al., 2001). Se conoce además, que en lesiones aterogénicas tempranas, los
macrófagos fagocitan células apoptóticas en forma eficiente y secretan citoquinas antiinflamatorias de forma tal que previenen la ocurrencia de necrosis secundaria (induciendo más
apoptosis temprana) y disminuyendo la progresión de la placa. Por el contrario, en situaciones
de aterosclerosis avanzada los macrófagos sufren apoptosis tardía o necrosis y la fagocitosis
de células apoptóticas no ocurre adecuadamente. En esta situación la resolución en el marco
inflamatorio falla y la concentración de citoquinas pro-inflamatorias tales como IL-1β, y TNF-α
aumentan. Entre otras consecuencias, estas citoquinas provocan la inducción de
metaloproteinasas vía la cascada de señalización NF-κB que favorece la degradación de la
matriz vascular con la consiguiente formación de una placa necrótica inestable y su ruptura
(Glass and Witztum, 2001; Gargiulo, et al. 2015).
Figura 2. Progresión de la placa aterogénica. La placa aterogénica se inicia con la acumulación de LDLs en los vasos sanos,
10
y la subsiguiente infiltración de monocitos. Luego estos monocitos se diferencian a macrófagos estimulados por el factor de
diferenciación de colonias de macrófagos (M-CSF). Por último, estos macrófagos incorporan lipoproteínas modificadas y sufren
una transición a célula espumosa. La placa progresa en el estado inflamatorio hasta su ruptura y formación del coágulo que en
casos graves llega a provocar una trombosis. Figura modificada de Libby, 2002.
Metabolismo de lípidos durante la activación de macrófagos y su transición a células
espumosas
Tanto en la respuesta inflamatoria inducida por la infección, como en la transición
macrófago-célula espumosa, el metabolismo de lípidos desempeña roles fundamentales en la
funcionalidad del macrófago. En ambos procesos, se acumulan gotas de lípido intracelulares.
En el caso de macrófagos activados con LPS, las gotas lipídicas están compuestas
mayoritariamente por TAG (Beutler, 2003; Fung, et al., 1993; Dennis, et al., 2010), mientras que
la célula espumosa formada en el contexto de la placa aterogénica contiene mayoritariamente
CE provenientes de las oxLDLs. Además, durante esta transición, se reportó la existencia de
un aumento en la masa de TAG, pero su función en estas células es aún objeto de estudio
(Guo, et al., 2009). Concomitantemente con el incremento en la cantidad de lípidos neutros,
durante la formación de la célula espumosa y su activación mediada por LPS se ha descripto
también un aumento en la síntesis de PL, mayormente de fosfatidilcolina (PC) (Tabas, 2000;
Dennis, et al., 2010).
Durante muchos años se consideraron a las gotas de lípido como simples depósitos de
reserva de lípidos neutros, sin embargo, en los últimos años se ha demostrado que la biogénesis
de estas organelas es un proceso altamente regulado que termina por producir un reclutamiento
de proteínas y lípidos específicos con roles en la señalización celular, la activación y la
regulación del metabolismo de lípidos, el tráfico de membranas y el control de la síntesis y
secreción de mediadores inflamatorios como citoquinas y eicosanoides (Fung, et al., 1993; S.,
Devlin and Haskill, 1989; Silva, et al., 2009, Bozza, et al., 2009). En particular, se ha propuesto
que la liberación de ciertas citoquinas pro-inflamatorias como IL-6 y TNF-α requieren de la
síntesis de PC, puesto que este PL resulta fundamental para la correcta remodelación de
membranas del aparato de Golgi que media la formación de vesículas de liberación de dichas
moléculas señal (Tian, et al., 2008). También se ha relacionado la cantidad de TAG acumulados
en gotas de lípido con el desencadenamiento de apoptosis de macrófagos (Aflaki, et al., 2011)
y el rol fundamental de la familia de fosfolipasas A2 en la formación y mantenimiento de la
homeostasis de gotas de lípido de macrófagos (Guijas, et al., 2014). Por último, se ha planteado
también que se requiere de una cierta cantidad de TAG para permitir la formación de gotas de
lípido típicamente mixtas (compuestas por TAG y CE), y que una disminución en la cantidad
de TAG provoca un acomodamiento estructural atípico de los CE (Lada, et al., 2002). Teniendo
en cuenta estos antecedentes, se requieren de más estudios tendientes a dilucidar los
mecanismos que llevan a esta acumulación de glicerolípidos (TAG y PL) en gotas de lípido de
macrófagos, y la influencia que éstos tienen en distintos aspectos de su fisiología y
funcionalidad.
Vía de síntesis de novo de glicerolípidos
El estudio de las enzimas implicadas en la síntesis de TAG y PL en un contexto
inmunológico podría no sólo develar nuevas vías de conexión entre inmunidad y metabolismo,
sino permitir también el desarrollo de nuevas estrategias en el control de los procesos
11
inflamatorios y, especialmente, de aquellos que tienen lugar durante la obesidad y otros
procesos patológicos complejos de origen multigénico.
La síntesis de novo de glicerolípidos a partir de sn-glicerol-3-fosfato (G3P) fue descripta
en los años 50 por el laboratorio de Eugene Kennedy (Kennedy and Weiss, 1956; Borkenhagen
and Kennedy, 1957; Kennedy, 1961) (Figura 3A). La vía comienza utilizando como sustrato
ácidos grasos (FA) sintetizados por la ácido graso sintasa (FASN, por sus siglas en inglés) y
activados mediante la unión a la coenzima A por acción las acilCoA sintetasas de cadena larga
(ACSL). En el primer y segundo paso, el G3P se esterifica secuencialmente con estos acilCoAs
en las posiciones sn-1 y sn-2 de la molécula, dando como productos el ácido lisofosfatídico
(LPA) y el ácido fosfatídico (PA). Estas reacciones de acilación están catalizadas por las
enzimas glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT) y acilglicerolfosfato aciltransferasa (AGPAT)
respectivamente. La principal fuente de G3P que alimenta esta vía metabólica proviene del
catabolismo de la glucosa, aunque también en menor medida contribuye la fosforilación directa
del glicerol mediante la glicerol quinasa (GK) (Christie, 2003). El grupo fosfato del PA, se
hidroliza en una reacción catalizada por la enzima fosfatidato fosfohidrolasa (PAP) para dar 1,2diacil-sn-glicerol (DAG), el cual se esterifica en la posición 3 dando TAG. Esta última reacción
está catalizada por la enzima acilCoA:diacilglicerol aciltransferasa (DGAT). Alternativamente,
tanto a partir de PA como de DAG, pueden ser sintetizados distintos PL, entre ellos, fosfatidil
colina (PC), fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI) y fosfatidiletanolamina (PE). De todas las
enzimas de la vía, la actividad GPAT es la que presenta una menor actividad específica y por
lo tanto es considerada como la enzima limitante (Bell and Coleman, 1980). Además este paso
es regulado recíprocamente con la beta oxidación de FA a través de modulación alostérica de
la carnitina aciltransferasa 1 (CPT1).
12
Figura 3. Vía de síntesis de novo de glicerolípidos. A) Los FA son primero activados mediante unión de una molécula de CoA a través de la acción de las ASCLs 1-6, luego el primer acil-coA es esterificado en la posición 1 del glicerol-3-fostato por acción
de las GPATs 1-4 dando LPA. La esterificación del segundo ácido graso en la posición 2 es catalizada por las AGPATs para
producir PA. Luego de ello las PAP eliminan el grupo fosfato para formar DAG que es acilado en la tercera posición por las DGAT
para producir TAG. La producción de PL en esta vía se da a partir del PA mayoritariamente, pero también a partir del DAG. La
CPT1 compite por los acil-CoA con las GPATs para dirigirlos hacia la beta oxidación. B) Reacción catalizada por la GPAT.
Glicerol-3-fosfato acil transferasa (GPAT)
Hasta el momento se han descripto cuatro isoformas de GPAT en mamíferos (GPAT1-4)
[EC 2.3.1.1]. Estas isoenzimas se diferencian por su ubicación subcelular y tisular, su
sensibilidad a sustancias reactivas a grupos –SH como la N-etilmaleimida (NEM) y por su
preferencia de sustrato (Wendel, et al., 2009). Se pueden resumir algunas de sus características
en la siguiente tabla:
.
Isoforma
N° Genebank
(Mus musculus)
GPAT1
NM_008149.3
GPAT2
NM_001081089
GPAT3
NM_172715.3
GPAT4
NM_018743
Ubicación
subcelular
Mitocondria
Retículo
endoplásmico
Hígado, Tejido
Adiposo, Corazón
Sustrato de
preferencia
Sensibilidad al
NEM
Palmitoil-CoA
Resistente
Testículo
AraquidonilCoA
Tejido Adiposo,
Intestino Delgado,
Riñón, Corazón
Hígado, Tejido
Adiposo, Testículo
Sin preferencia
Ubicación tisular
Sensible
Tabla 2. Características de las 4 isoformas de GPAT.
La GPAT1, producto del gen Gpam, fue la primera isoforma en ser clonada a partir de
tejidos de roedores (Paulauskis and Sul, 1988; Bhat, et al., 1999). Es una enzima mitocondrial
cuya expresión se da en tejido adiposo, corazón y mayoritariamente en hígado, en donde
cumple un rol fundamental en la síntesis de TAG (Wendel, et al., 2013).
GPAT2 se describió por primera vez en mitocondrias hepáticas en un modelo de ratón
Knock-out (KO) para Gpat1 (Gpat1-/-) (Lewin, et al., 2004). Esta enzima es similar a GPAT1
tanto en su estructura, peso molecular y en su localización sub-celular en la membrana
mitocondrial externa, pero su expresión se da casi en forma exclusiva en testículo en donde es
relevante para el desarrollo espermático (García-Fabiani, et al., 2015). Asimismo, esta isoforma
también se expresa en algunos tipos de tumores y se la ha relacionado con la progresión de los
mismos (Pellon-Maison, et al., 2014).
La GPAT3, también llamada AGPAT9, fue la primer GPAT microsomal en ser clonada
(Cao, et al., 2006), su expresión es alta en tejido adiposo, en donde representa el 80% de la
actividad GPAT según lo descripto en un modelo de ratón KO (Cao, et al., 2014). Además, se
expresa altamente en intestino delgado y cumple un rol relevante en la absorción de lípidos
provenientes de la dieta (Khatun, et al., 2016). Por otro lado, también se ha descripto que
GPAT3 se expresa en macrófagos y que su expresión aumenta 3 veces luego de que los
13
mismos son activados con LPS (Feingold, et al., 2012).
La GPAT4, inicialmente anotada como AGPAT6, es también una enzima microsomal, y
se expresa, al igual que GPAT3, en tejidos lipogénicos tales como hígado y tejido adiposo y en
testículo, en donde ha mostrado ser relevante para la síntesis de TAG (Vergnes, et al., 2006).
14
HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS
HIPÓTESIS: la síntesis de novo de glicerolípidos contribuye a la acumulación de estas
moléculas en macrófagos activados en respuesta a la infección y durante su
transformación patológica a célula espumosa; en estos procesos resulta crucial la
actividad de alguna isoforma específica de la enzima que cataliza el paso limitante de
esta vía, la GPAT. Además, se hipotetiza que éstos glicerolípidos cumplen un rol en
distintos aspectos funcionales del macrófago, entre ellos, la producción de moléculas
señal como citoquinas y quimioquinas y el proceso de fagocitosis.
Objetivo General:
• Estudiar la síntesis de novo de glicerolípidos en macrófagos durante procesos de
transición tanto fisiológicos (activación por patógenos) como patológicos (formación de
la célula espumosa) y evaluar el rol de esta vía metabólica en su funcionalidad.
Objetivos Específicos:
1) Determinar si la síntesis de novo de glicerolípidos se induce durante la activación de
macrófagos y durante su transición a célula espumosa.
2) Evaluar el nivel de expresión y actividad de enzimas iniciales de la vía de síntesis de
novo de glicerolípidos, principalmente de las 4 isoformas de GPAT durante la activación
del macrófago y su transición a célula espumosa.
3) Analizar el rol de las diferentes isoformas de GPAT sobre la acumulación de gotas de
lípido y la síntesis de novo de glicerolípidos durante la activación del macrófago y la
formación de la célula espumosa.
4) Evaluar el rol que cumplen la síntesis de novo de glicerolípidos y las diferentes
isoformas de GPAT en distintas funciones desempeñadas por el macrófago: su
capacidad fagocítica y la liberación de citoquinas y quimioquinas durante su activación
y transición a célula espumosa.
15
MATERIALES Y MÉTODOS:
1. MODELOS EXPERIMENTALES
1.1. Cultivos celulares
Para este trabajo, las diferentes líneas celulares utilizadas fueron obtenidas de ATCC y
mantenidas en condiciones de temperatura (37 °C), humedad (98 %) y tensión de CO2 (5 %)
constantes. Para el mantenimiento de las líneas celulares, los medios fueron suplementados
con suero fetal bovino (SFB) al 10 %, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina (de
ahora en más denominados como medio “completo”). En el caso particular de la línea celular
RAW 264.7, el medio DMEM de alta glucosa fue suplementado con 10% SFB libre de
endotoxinas y Hepes (4g/l) y no se le adicionaron antibióticos. Las células fueron subcultivadas
una vez por semana y mantenidas en placas de 100 mm. Para el subcultivo: se retiró el medio
de cultivo, la monocapa de células se lavó con 5 ml de PBS tibio y luego se agregó 0,5 ml de
tripsina 0,25% en EDTA 0,9 mM (Gibco). La acción de la tripsina se frenó con 5 ml de medio de
cultivo completo tibio y las células se dispersaron por pipeteo. Un décimo del volumen se colocó
en una placa de cultivo nueva y se completó con 10 ml de medio completo tibio. Sólo en el caso
de la línea RAW 264.7 se las subcultivó utilizando cell scrapers (Greiner). Para ello, partiendo
de placas de 100 mm, se levantó la monocapa raspándola suavemente con el scraper, para
luego dispersar las células por pipeteo. Luego, un décimo del volumen se colocó en una placa
nueva y se agregaron 10 ml de medio completo. Todo el material de cultivo fue esterilizado por
autoclave o por filtración en el caso de los medios de cultivo. En la tabla 2 se detallan las líneas
celulares utilizadas.
Nombre
RAW 264.7
HEK 293T
Código en ATCC
Origen
Medio de cultivo
TIB-71
Línea monocítica de ratón
(Mus musculus) obtenida a
partir de tumor ascítico
inducido por el virus de
Abelson
DMEM
CRL-3216
Línea celular derivada de HEK
293 que contiene el antígeno T
del virus SV40, permitiendo
replicar vectores que porten
con el sitio de replicación del
SV40
DMEM
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THP1
TIB-202
Línea de monocitos humanos
RPMI
Tabla 2. Líneas celulares utilizadas.
1.2. Animales: Mus musculus
Los experimentos con animales fueron realizados en su totalidad en la Universidad de
Carolina del Norte, Estados Unidos y aprobados por su IACUC (Institutional Animal Care and
Use Committee).
Se utilizaron ratones C57BL/6J wild type, KO para Gpat3 (Gpat3-/-) (Cao, et al., 2014), y
para GPAT4 (Gpat4-/-) (Vergnes, et al., 2006). Los animales fueron mantenidos en cuartos con
temperatura controlada (23 °C), ciclos de luz/oscuridad de 12 hs y la administración de agua y
alimento fue ad libitum.
1.3. Obtención de macrófagos primarios derivados de médula ósea de ratón (BMDM)
Para la obtención de macrófagos primarios derivados de médula ósea (BMDM por sus
siglas en inglés “Bone Marrow Derived Macrophages”) se utilizaron ratones hembras y machos
de entre 8 y 16 semanas de edad. En cada experimento se utilizó una misma cantidad de
animales de cada sexo de edades similares en cada grupo para evitar cualquier diferencia de
datos debido a la variabilidad etaria y/o sexual. Los animales fueron anestesiados y sacrificados
por dislocación cervical de acuerdo a los protocolos aprobados por el IACUC de la Universidad
de Carolina del Norte. Luego, se colectaron los fémures y tibias, teniendo especial cuidado de
eliminar cualquier resto de tejidos blandos y utilizando material estéril diferente para cada
genotipo. A partir de este momento se trabajó bajo campana de flujo laminar para conservar la
esterilidad del cultivo celular. La cabeza de los huesos fue cortada con tijeras de cirugía y se
extrajo la médula ósea utilizando jeringas con SFB 1% en PBS tibio para barrer el contenido
interno. Luego se dispersó la médula subiendo y bajando repetidas veces el contenido extraído
con pipeta de plástico. Las células se colectaron mediante centrifugación a 200g y se lisaron
los glóbulos rojos mediante el uso de buffer de lisis de acetato de potasio (GIBCO). Las células
restantes fueron re-suspendidas en RPMI con 10% SFB y antibióticos y el agregado de 20ng/ml
de M-CSF (Biolegend) y conservadas en placas de Petri para cultivos bacterianos durante 6
días. De esta forma las células que se diferencian en macrófagos son las únicas que logran
adherirse a la superficie de las placas de cultivo bacteriano sin pre-tratamiento. Luego de los 6
días, las células fueron lavadas exhaustivamente con PBS tibio para eliminar detritos y células
contaminantes, contadas y sembradas en placas para cultivos celulares en una densidad
adecuada para cada experimento. Al día siguiente se realizaron los ensayos correspondientes.
17
2. ACTIVACIÓN DE MACRÓFAGOS MEDIANTE EL USO DE KLA2-LÍPIDO A
Para lograr la activación tanto de células RAW264.7 como de BMDM, se las trató con
100ng/ml de Kdo2-Lípido A (KLA), el componente activo del lipopolisacárido bacteriano (LPS),
según lo descripto por Denis, et al., 2010, teniendo especial cuidado en sonicar la solución madre
10 minutos antes de cada uso para lograr una dispersión completa. En todos los casos, la
eficiencia de la activación se evaluó analizando el nivel de expresión de la citoquina proinflamatoria Tnf-α.
3. DIFERENCIACION MACRÓFAGO-CÉLULA ESPUMOSA MEDIANTE EL USO DE LDL
OXIDADAS
Los macrófagos fueron transformados en células espumosas mediante la incubación con
100µg/ml de oxLDL en medio libre de suero. Las LDL se obtuvieron mediante ultracentrifugación
en gradiente de densidad de plasma de individuos normolipidémicos. La oxidación de las mismas
se realizó mediante incubación con 5µM CuSO4 durante 8h a 37°C. Se eligió este tiempo de
tratamiento ya que fue aquel con el que se obtuvo un nivel de oxidación aceptable, según lo
controlado mediante sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, y con las cuales, además, las
células tratadas mostraron un nivel de supervivencia mayor al 80% (datos no mostrados). La
transformación efectiva en célula espumosa se monitoreó observando la clara aparición de una
gran cantidad de gotas de lípido en el interior celular, y a través de la medición de la expresión
del marcador Cd36, receptor basurero de LDL modificadas y FA que se sobre-expresa durante
esta transición (Kunjathoor, et al., 2002; Tsukamoto, et al., 2002).
4. DIFERENCIACION DE MONOCITOS A MACRÓFAGOS MEDIANTE EL USO DE ESTERES
DE FORBOL (PMA)
La diferenciación de la línea celular de monocitos humanos THP1 a macrófagos se llevó
a cabo mediante la incubación con palmitoil-miristoil forbol (PMA) durante una noche. Debido a
que la línea celular THP1 corresponde a monocitos que crecen en suspensión, y que al
diferenciarse se adhieren al sustrato, la optimización de este modelo se llevó a cabo siguiendo
la eficiencia de adherencia celular con distintas concentraciones y tiempos de incubación con
PMA. Se seleccionó la condición de siembra de 2x106 células/ml con 1µg/ml de PMA con la cual
se logró la adherencia del 90% de las células obteniendo una monocapa con una confluencia
del 70-80%.
5. PROTOCOLOS GENERALES DE TRABAJO CON DNA
Para todos los procedimientos de biología molecular o de trabajo con bacterias se utilizó
material (tips, microtubos, tubos de PCR, etc.) esterilizado por autoclave.
18
5.1. Cepa utilizada de bacterias.
Para los experimentos de expansión de vectores de silenciamiento se utilizó la cepa de
bacterias de Escherichia coli JM109. Esta cepa es fácilmente transformable y de fácil
crecimiento y es sensible a los antibióticos ampicilina y kanamicina, lo que permite la selección
de colonias que, por transformación, incorporen vectores con resistencia a dichos antibióticos.
5.2. Medios de cultivos utilizados para bacterias.
Para el crecimiento de bacterias se utilizó el medio Luria-Bertani (LB) liquído o medio LB
suplementado con 1,5% de agar (LB-Agar) como medio sólido. Ambos medios fueron
esterilizados en autoclave y en caso de requerir antibióticos, éstos fueron agregados una vez
que el medio alcanzó una temperatura igual o menor a 50 °C.
5.3. Preparación de bacterias competentes.
Para la preparación de bacterias JM109 químicamente competentes, se siguió el
protocolo descripto por Inoue, et al., 1990. A 250 ml de SOB [triptona (Britania) 2% p/v; extracto
de levadura 0,5% (Britania); NaCl 10 mM; KCl 2,5 mM; MgCl2 10 mM; MgSO4 10 mM] en un
erlenmeyer de 2l se le agregó la solución de Magnesio junto con 10 colonias de E.coli JM109
picadas de la placa de LB-Agar. Se dejaron crecer por aproximadamente 15 hs a 22 °C con
agitación vigorosa, hasta alcanzar una DO de 0,6. Luego, se colocó el erlenmeyer en hielo por
10 minutos y se centrifugó 10 minutos a 2100 x g a 4 °C. Se descartó el sobrenadante, el pellet
se re-suspendió en 80 ml de Buffer de Transformación (MnCl2 55 mM; CaCl2 15 mM; KCl 250
mM; HEPES 0,01 M; pH 6,7) y se incubó 10 minutos en hielo. Luego se centrifugó por 10
minutos a 2100 x g a 4 °C. Se retiró el sobrenadante y el pellet se re-suspendió en 20 ml de
buffer TB frío, al que se le adicionaron 1,4 ml de DMSO (7 % DMSO). Por último, las células resuspendidas se volvieron a incubar en hielo por 10 minutos, se alicuotaron, se congelaron en
nitrógeno líquido y se conservaron a -70 °C.
5.4. Transformación de bacterias con DNA plasmídico.
Para la transformación de bacterias competentes con DNA plasmídico se siguió el
protocolo de Sambrook, et al., 1989. Se agregaron aproximadamente 10 ng de DNA plasmídico
a 100µl de células competentes, se mezcló y se incubó en hielo por 30 minutos. Luego se
procedió a realizar el shock térmico a 42 °C durante 45 segundos. Luego de 5 minutos en hielo,
19
se le agregaron 600 µl de medio SOC (peptona 20 gr/L; extracto de levadura 5 gr/L; NaCl 0,584
gr/L; KCl 0,186 gr/L; glucosa 20 mM; pH 7,0) a temperatura ambiente y se llevaron a una
incubadora a 37 °C y agitación por una h. Por último, las bacterias fueron sembradas en placas
LB-Agar con el antibiótico correspondiente según el gen de resistencia que porte el plásmido
transformado e incubadas toda la noche en estufa a 37 °C. En caso de placas de LB-Agarampicilina la concentración del antibiótico fue de 100 µg/ml, en el caso de placas de LB-Agarkanamicina la misma fue de 50 µg/ml.
5.5. Obtención de plásmidos a pequeña escala (miniprep).
Para la obtención de plásmidos a pequeña escala se partió de cultivos bacterianos de 5
ml en medio LB líquido (con el antibiótico correspondiente) que se dejaron crecer toda la noche
a 37 °C y 180 rpm. Para la purificación del plásmido se utilizaron kits comerciales de Qiagen
(QIAprep Spin Miniprep Kit) o de GE Healthcare (illustra Plasmid Mini Spin Kit), siguiendo las
instrucciones del fabricante.
5.6. Obtención de plásmidos a gran escala (maxiprep).
Para la obtención de plásmidos a gran escala se siguió un protocolo adaptado de
Sambrook, et. al., 1989. Se partió de un cultivo de bacterias en 200 ml de LB líquido (con el
antibiótico correspondiente) que se dejó crecer toda la noche a 37 °C y 180 rpm. Luego de
centrifugarlo a 6000 x g por 10 minutos a 4°C, se resuspendió en 10 ml de glucosa 50 mM; Tris
25 mM pH 8,0; EDTA 10 mM; pH 8.0 y se agregó 0,5 ml de Lisozima (10 mg/ml). Se incubó 10
minutos a temperatura ambiente, se agregaron 10 ml de NaOH 0,2 M; SDS 1% y se incubó 5
minutos más a temperatura ambiente. Después se agregaron 10 ml de Solución acetato de
potasio 3M; ácido. Luego se centrifugó 20 minutos a 20000 x g a 4 °C, el sobrenadante se filtró
y se agregaron 0,6 volúmenes de isopropanol para luego dejar incubando 30 minutos a -20 °C.
Más tarde se centrifugó 30 minutos a 15000 x g y a 4 °C y se descartó el sobrenadante. Al
pellet obtenido se lo lavó con etanol 70 % y se centrifugó 10 minutos a 15000 x g. El
sobrenadante se descartó y se dejó secar al pellet. Este se resuspendió en 0,5 ml de agua
estéril, se agregaron 2 µl de Ribonucleasa A y se incubó 30 minutos a 37 °C. Una vez finalizada
esta incubación, se guardó a -20 °C.
5.7. Cuantificación de DNA.
Para medir la concentración de DNA se usó un espectrofotómetro marca Ultrospec 2100
pro (Amersham Bioscience) o un espectrofotómetro NanoDrop 2000c (Thermo). Los mismos
20
leen absorbancias a 260 nm, 280 nm, y 230 nm permitiendo así no sólo medir la concentración
del ácido nucléico, sino también detectar la presencia de proteínas y otros contaminantes. Se
consideraron como adecuados los cocientes: 260/280 > 1,8 y 260/230 > 2,0.
5.8. Digestión con enzimas de restricción.
En general, el corte con enzimas de restricción realizadas durante la expansión y
verificación de los vectores silenciadores para GPAT3 y SCR, se llevó a cabo en un volumen
final de 10 µl, durante 1-2 hs a la temperatura adecuada para la enzima utilizada, siguiendo el
siguiente protocolo provisto por el fabricante (New England Biolabs o Invitrogen).
5.9. Electroforesis en geles de agarosa.
Para la preparación de geles de agarosa se utilizó Certified Molecular Biology Agarose
(BioRad) en una concentración de 0,5-1 %, según el tamaño del producto a separar, en buffer
TBE (Tris 0,05 M; Ácido Bórico 0,05 M; EDTA-Na2.2H2O 1 mM). La corrida electroforética se
llevó a cabo a 100 V por 45-80 minutos en una cuba horizontal. Para la visualización de las
bandas, el gel fue teñido luego con bromuro de etidio y para el análisis del mismo se usó un
transiluminador Hoefer Macrovue UV-20 y se tomaron fotos con una cámara Kodak DC 210
Zoom Digital Camera y el software Gel-Pro Analyzer (Media Cybernetics, LP).
5.10. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Para el chequeo inicial de expresión de distintos genes relacionados al metabolismo de
glicerolípidos se utilizó la polimerasa iProof High-Fidelity DNA (BioRad). Las reacciones fueron
llevadas a cabo en un termociclador Veriti (Thermo). La secuencia de los primers utilizados se
detalla en la sección que describe las PCR en tiempo real.
5.11. Transfección de células eucariotas.
Para la transfección de células HEK 293T con vectores silenciadores o SCR, se trabajó
en placas de 60 mm. Se procedió a transfectar esta línea celular haciendo uso de cationes
lipídicos (Lipofectamine 2000, Invitrogen). Se agregó el DNA plasmídico de interés sobre células
80% confluentes. Para ello, se diluyó el DNA (10 µg) en medio de cultivo correspondiente
incompleto (500 µl) y la Lipofectamina 2000 (relación Lipofectamina 2000:DNA, 3:1, vol:µg) en
el mismo volumen de medio incompleto. Luego de una incubación de 5 minutos se mezclaron
21
y se dejaron a temperatura ambiente por 20 minutos. Al finalizar la incubación se retiró el medio
de cultivo de las células, se lavó la monocapa con PBS tibio y se agregaron 1,5 ml de medio
incompleto. Pasados los 20 minutos, se agregaron los complejos DNA-cationes lipídicos a las
células y se incubaron por 6 hs en estufa a 37 °C. Pasadas las 6 hs de incubación, se retiró el
medio y se agregó medio de cultivo completo. A las 24 y 48 hs se colectó el medio y se filtró
para transducir posteriormente las células RAW 264.7 con los lentivirus presentes en el medio.
En la sección “Producción de lentivirus” se describe detalladamente esta técnica.
6. PROTOCOLOS GENERALES DE TRABAJO CON RNA.
Para todos los procedimientos de trabajo con RNA todo el material fue esterilizado
previamente en autoclave y se utilizó agua MiliQ tratada con el inhibidor de RNAsas,
dietilpirocarbonato (DEPC, Sigma), tanto para re-suspender el RNA como para la preparación
de las mezclas de reacción para la síntesis de DNAc y para qPCR.
6.1. Obtención de RNA.
Para la obtención de RNA se utilizó el reactivo comercial TRIzol (Invitrogen) o TriReagent
(MRC) cuyo fundamento se basa en lo descripto por Chomczynski and Sacchi, 1987.
Brevemente, partiendo de células en cultivo en placas de 60 mm se agregó 1 ml del reactivo,
se pipeteó varias veces, se agregaron 200 µl de cloroformo y luego se agitó vigorosamente por
15 segundos y se dejó reposar por 10 minutos. Luego se centrifugó por 15 minutos a 12000 x
g a 4 °C, para obtener dos fases: una fase inferior rosa de fenol-cloroformo y una superior
acuosa incolora. Se separó la fase superior y se le agregó 500 µl de isopropanol. Se mezcló
por inversión y se dejó reposar por 15 minutos, para luego centrifugar 15 minutos a 12000 x g
a 4 °C. Se descartó el sobrenadante y el pellet de RNA se lavó tres veces con etanol 75%. El
pellet se dejó secar a 50 °C por 5 minutos y luego se re-suspendió en 20-60 µl de agua MiliQDEPC y se guardó a -70 °C.
6.2. Cuantificación de RNA.
Para medir la concentración de RNA se usó un espectrofotómetro marca Ultrospec 2100
pro (Amersham Bioscience) o un espectrofotómetro NanoDrop 2000c (Thermo). Se prestó
especial atención a los valores de los cocientes 260/280 y 230/260 para evaluar la presencia
de contaminantes.
22
6.3. Evaluación de la calidad de RNA.
Para determinar la integridad del RNA obtenido y la presencia o no de contaminación con
DNA, se corrieron 0,5 µg de cada muestra en un gel con 1 % de agarosa p/v en TBE, por 20
minutos a 120 V en una cuba electroforética horizontal. Se evaluó la presencia de las típicas
bandas 28S y 18S, siendo la intensidad de la primera el doble de la segunda. Sólo se trabajó
con las muestras cuya corrida electroforética resultó satisfactoria.
6.4. Obtención de DNA complementario (cDNA).
Para la obtención de cDNA se utilizaron los kits comerciales High Capacity cDNA
Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) y iScript cDNA Synthesis Kit (BioRad), siguiendo
las instrucciones del fabricante, usando 1 µg de RNA.
6.5. PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR).
Para la determinación de la cantidad de RNA mensajero (mRNA) de algún gen en
particular en algún tipo celular se utilizó el método de PCR cuantitativa (qPCR) a partir de DNAc.
Para esto se utilizaron las supermix comerciales iQ SYBR Green Supermix (BioRad) o ABsolute
QPCR SYBR Green Mix (Thermo Scientific) según las insctrucciones del fabricante. Como
molde se utilizó una dilución 1/5- 1/10 de cDNA. Para el ciclado y la lectura de la fluorescencia
se usó un equipo Stratagene Mx3000P. En general, el protocolo de ciclado y de lectura de
fluorescencia fue el siguiente:
La temperatura de annealing varió de 55 a 59°C dependiendo de la temperatura de
desnaturalización de cada par de primers. Para realizar los cálculos se utilizó el método de ∆∆Ct
23
o el software qBase que permite calcular las cantidades relativas de cada gen, teniendo en
cuenta la eficiencia de amplificación, varios genes housekeeping y la propagación de errores
debidos a los distintos cálculos.
Tabla 3. Primers utilizados para qPCR. Subrayados se muestran los genes housekeeping
usados:
Primer
Gpat1 ratón
GPAT1 humano
Gpat2 ratón
GPAT2 humano
Gpat3 ratón
GPAT3 humano
Gpat3 de ratón
análisis de
silenciadores 1
Gpat3 de ratón
análisis de
silenciadores 2
Gpat4 ratón
GPAT4 humano
Cpt1 ratón
Secuencia
Forward
TGGGCATCTCGTATGATCGC
Reverse
TTCTGATAACGCCTCTCGCC
Forward
GGTGAACAACTGGGCAAACC
Reverse
CGCTTGCTCCAGGGAAAGTA
Forward
ATCCTACTGCTGCTGCACCT
Reverse
ACAGCAGCTTTGCACTCAGA
Forward
ATCCTGCTGCTGATGCACCT
Reverse
ACAGCAGCTTTCTGCTCAAT
Forward
CTTTGAAATCGGAGGAACCA
Reverse
TTTGCAAACTGAACTGCGTC
Forward
CCTCTGAGGGTTACCTTGGC
Reverse
CCTCCCTTCTGGGGTCTGTA
Forward
GCGCTCAGAAATAAAGGACAGA
Reverse
GGGGTTATACTTTATGGCCACTG
Forward
ACTAGAGAGGAAGGAGAAGACG
Reverse
AGTTCTGCGAAGCCATGTTTA
Forward
GGCATGGTGACGTACCTTCT
Reverse
GCTTCAGCCAGCACAAGAC
Forward
TCCCATGACTAGAGAGGCAGA
Reverse
CTGCTCCTCCTTGAACGTGT
Forward
CACTGCAGCTCGCACATTAC
24
CPT1 humano
Gk ratón
GK humano
Tnfa ratón
Actb ratón
ACTB humano
RPL 4
Mcp-1 ratón
Reverse
CTCTGCTCTGCCGTTGTTGT
Forward
ATGTACGCCAAGATCGACCC
Reverse
TGACCACGTTCTTCGTCTGG
Forward
TGAACCTGAGGATTTGTCAGC
Reverse
CCATGTGGAGTAACGGATTTCG
Forward
CTGGGACAAGATAACTGGAGAGC
Reverse
TCAACGGTAGACTGGGTTCTTA
Forward
CTCTTCTGCCTGCTGCACTT
Reverse
GGCTACAGGCTTGTCACTCG
Forward
AAGAGCTATGAGCTGCCTGA
Reverse
TACGGATGTCAACGTCACAC
Forward
GGACTTCGAGCAAGAGATGG
Reverse
AGCACTGTGTTGGCGTACAG
Forward
TGAACACAACCCAAAAACGA
Reverse
TTCGCTGAGAGGCATAGACC
Forward
GGCTCAGCCAGATGCAGTTA
Reverse
CTGCTGCTGGTGATCCTCTTG
Forward
GCAACTGTTCCTGAACTCAACT
Reverse
ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT
Forward
GGGACTGATGCTGGTGACAA
Reverse
ACAGGTCTGTTGGGAGTGGT
Forward
GGTTGCCAAGCCTTATCGGA
Reverse
ACCTGCTCCACTGCCTTGCT
Forward
TGTAGCAGCTGCACCACATA
Reverse
TGGAACCAAACTGAGGAATGGA
Forward
TGAGTTTGGTTCCGTACCCTG
Il-1b ratón
Il-6 ratón
Il-10 ratón
Cd36 ratón
CD36 humano
25
Reverse
TGAGGCTGCATCTGTACCAT
7. SILENCIAMIENTO DE Gpat3 MEDIANTE shRNA.
Para estudiar el efecto de la expresión de Gpat3 en el metabolismo de lípidos durante la
activación del macrófago o su transición a célula espumosa, se trabajó con la línea celular de
macrófagos de ratón RAW 264.7. La expresión de Gpat3 se silenció por medio de vectores que
portan un RNA de interferencia contra el transcripto primario de esta enzima.
7.1.shRNA utilizados.
Se trabajó con los vectores de la compañía GIPZ Dharmacon shRNA Vectors, basados
en el silenciamiento con RNA pequeños en forma de horquilla (short hairpin RNA, shRNA).
Cuatro plásmidos con 30 nucleótidos específicos contra todas las distintas variantes de splicing
de GPAT3 (shGpat3) fueron adquiridos, junto con un vector control cuya secuencia blanco no
aparea con ningún mRNA de ratón (Non-effective 29-mer scrambled shRNA cassette, SCR)
(Tabla 4). Estos vectores poseen además el gen de resistencia a puromicina y a kanamicina
(gen de resistencia eucariota y procariota respectivamente) y el gen de la Proteína Fluorescente
Verde (Green Fluorescent Protein, GFP) regulado por el promotor del Citomegalovirus (CMVp).
Para seleccionar el vector shGPAT3 que mejor silenciara GPAT3, se intentó realizar una
transfección transitoria mediante el uso de lipofectamina de cada uno de los vectores en células
RAW 264.7, pero dado que la eficiencia en la transfección de esta línea celular es muy baja, se
procedió a producir lentivirus portadores de cada silenciador, y posteriormente infectar las
células RAW 264.7 con cada uno de ellos, seleccionar y expandir un clon y, por último,
seleccionar aquella línea que posea el mayor porcentaje de silenciamiento chequeando su
expresión mediante q-PCR.
Clon
N° de identificación del
clon
Secuencia
1
V2LMM_48102
TATCCACGATGCTTCAGTC
2
V3LMM_507380
3
V3LMM_50377
TGCCCACGATCATCTTGCT
ATTGTTGATGCAAGTACCT
26
4
V3LMM_507378
TTTTAAACATCATGACTGA
Tabla 4. Secuencia de silenciadores para Gpat3 utilizados
7.2. Generación de partículas lentivirales.
Para este trabajo de tesis se usó un sistema lentiviral de segunda generación, compuesto
por los siguientes tres vectores:
-
Vector con el transgen: los vectores con el DNA que codifica para un RNA de interferencia
(shRNA) contra en transcripto de Gpat3 de ratón descriptos más arriba, o para un shRNA
que no aparea con ningún transcripto (vector con secuencia scramble, SCR) poseen el
gen que codifica para la proteína TurboGFP (GFP: Green fluorescent protein) en un
mismo transcripto bicistrónico (permitiendo identificar microscópicamente a las células
que expresan el shRNA), genes de selección procariota (ampicilina) y eucariota
(puromicina), entre otras características.
-
Vector de empaquetamiento: psPAX2 (Addgene, # 12260). Contienen los genes virales:
gag, pol, tat y rev y también el gen de resistencia a ampicilina para la selección de
bacterias transformantes durante su amplificación.
-
Vector de envoltura: pMD2.G (Addgene, # 12259). Contiene el gen de la proteína de
envoltura VSV-G y el gen de resistencia a ampicilina.
Estos vectores fueron amplificados en bacterias JM109 como se describió anteriormente
y su purificación se llevó a cabo utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) o por medio de
la maxipreparación de plásmidos. Además, se chequeó la identidad de cada vector por medio
de análisis con enzimas de restricción como se describió con anterioridad.
La línea celular HEK293 y sus derivadas genéticamente modificadas son las principales
líneas celulares utilizadas para la producción de lentivirus. La forma más común de obtención
de lentivirus es la de transfección transitoria de los vectores lentivirales en una línea celular
empaquetadora y luego la purificación de los mismos por ultracentrifugación. Se usó la línea
celular HEK 293T (293T) que, además de ser alta y fácilmente transfectable, fue modificada de
manera tal que expresa constitutivamente el antígeno T grande del virus SV40, lo que permite
la replicación de los plásmidos que tengan el SV40 Ori en células eucariotas, aumentando así
el número de plásmidos por célula y permitiendo que estos se diseminen a través de la línea
celular cuando las células se dividen. Este origen de replicación eucariota está presente en dos
de los 3 vectores usados en la producción de lentivirus.
Para la obtención de partículas lentivirales se siguió el siguiente protocolo:
27
Día 1: se plaquearon las células 293T en placas de 100 mm en medio DMEM completo
(5% de SFB y antibióticos) de manera tal que su confluencia al día siguiente no fuera más que
de 40 % (entre 1-2 x 106 células/placa). Se plaquearon mínimo 2 placas de células: una para
producir lentivirus con el shRNA y otra para producir lentivirus SCR.
Día 2: se procedió a la transfección de las 293T mediante el uso de cationes lipídicos
como se describe más arriba.
Día 3: se observaron las placas al microscopio óptico invertido Olympus CKX41 equipado
con una lámpara fluorescente y se chequeó que las células se hayan transfectado
eficientemente (70-90 % de células verdes). Se retiró completamente el medio de cultivo
conteniendo partículas lentivirales, se colocó en tubos de 50 ml para conservarlo a 4 °C, y se
reemplazó por 10 ml de DMEM completo fresco. Esto se repitió con todas las placas, que luego
se devolvieron a la estufa de cultivo hasta el día siguiente.
Día 4: ídem anterior.
Día 5: se retiró el medio de cultivo de las placas, se juntaron todos los sobrenadantes
provenientes de placas 293T productoras de lentivirus shRNA y todos aquellos provenientes de
placas productoras de lentivirus SCR y se procedió a su concentración por ultracentrifugación.
Para ello, primero se centrifugaron los tubos de 50 ml a baja velocidad (10 minutos a 1800 rpm
4 °C) para sedimentar aquellas células que se hayan despegado de la placa y detritos celulares.
Luego, éstos sobrenadantes se ultracentifugaron a 21000 rpm en un rotor SW 32 Ti en una
ultracentrífuga Beckman Coulter LE-80K, por 2 hs y media a 4 °C. A continuación, los
sobrenadantes se descartaron y los tubos se invirtieron sobre gasas estériles para eliminar el
exceso de medio de cultivo. Luego se agregaron 150 µl de PBS frío sobre el pellet, se taparon
los tubos y se dejaron toda la noche a 4 °C, para permitir que el pellet de partículas lentivirales
se hidrate bien.
Día 6: dentro del flujo laminar, se pipeteó 30 veces el pellet de lentivirus en PBS y se
alicuotó de a 50 µl en microtubos de 500 µl y se guardaron inmediatamente a -70 °C.
7.3. Transducción de células RAW 264.7 con vectores lentivirales
Para lograr una línea estable con Gpat3 silenciada se incubaron células RAW 264.7 con
distintas cantidades de virus durante diferentes tiempos. La eficiencia de la transducción fue
evaluada mediante el conteo de células expresando GFP luego de 72h Las células transducidas
(5-10%) fueron seleccionadas utilizando puromicina durante varios pasajes y el método de
cloning ring para un mejor aislamiento de las colonias positivas. Luego de obtener poblaciones
enriquecidas en células transducidas (aproximadamente 90% de células positivas), se realizó
28
una dilución límite en placa de 96 pocillos y se obtuvo un clon puro de cada línea silenciada y
dos líneas SCR distintas para utilizar como control.
Luego de esto, se procedió a seleccionar aquella línea celular con el mayor porcentaje
de silenciamiento. Para ello se extrajo RNA de cada línea, se realizó la retrotranscripción y
cuantificación del nivel de mensajero de Gpat3 a través de qPCR utilizando primers
específicamente diseñados en torno a la zona complementaria a los RNAi. El nivel de
silenciamiento de la línea seleccionada se monitoreó regularmente por qPCR.
8. PROTOCOLOS GENERALES DE TRABAJO CON PROTEÍNAS.
8.1. Obtención de homogenatos totales de células
Las células fueron colectadas en buffer H (HEPES-KOH 10 mM; sacarosa 0,25 M; EDTA
1 mM; DTT 1 mM; pH 7,4) suplementado con un 0,002% v/v de cocktail inhibidor de proteasas
(Sigma), en hielo, centrifugadas para concentrarlas y luego re-suspendidas en un pequeño
volumen de buffer H dependiendo de la densidad celular. Luego, se disgregaron
mecánicamente con un homogeneizador de vidrio/teflón tipo Potter utilizando un sistema
motorizado (Tri-R Instruments, 1000 rpm).
8.2. Cuantificación de proteínas.
Se utilizó el método de Bradford (Bradford, 1976), el cual se basa en el cambio de color
del colorante Comassie Brilliant Blue G-250 en presencia de distintas concentraciones de
proteínas. Para determinar la concentración de proteínas de una determinada muestra, se
realizaron diluciones 1/100, 1/50 o 1/5 y, en paralelo, una curva de calibración con albúmina
1mg/ml y luego se leyó su absorbancia a 465 y 595 nm en un lector de placas DTX 880
Multimode Detector (Beckman Coulter). Luego se restó Abs 594nm-Abs 465nm y con ese valor
se construyó la curva de calibración y se determinó la concentración de proteínas de las
muestras. Sólo se utilizaron los valores de las muestras problema cuyo valor estuviera dentro
de los límites de la curva de calibración.
Alternativamente, se cuantificaron las proteínas utilizando la técnica de BCA (Pierce)
siguiendo las instrucciones del fabricante.
29
8.3. Medición de actividad enzimática de la glicerol-3-fosfato acil transferasa (GPAT)
La actividad GPAT (EC 2.3.1.15) se midió siguiendo un protocolo descripto previamente
(Gonzalez-Baro et al, 2001) con modificaciones. La cantidad apropiada de muestra se diluyó en
solución isotónica de sacarosa 0,25 M y se agregó a la mezcla de reacción, de modo de obtener
un volumen final de 200 µl. La composición final de la mezcla de reacción fue: buffer Tris-HCl
75 mM pH 7,4; MgCl2 4 mM; albúmina sérica bovina (BSA) 2 mg/ml; NaF 8 mM; DTT 1 mM;
glicerol-3-fosfato 0,8 mM (0,5 µCi [14C]Glicerol-3-fosfato, Amersham Biosciences) y palmitoilCoA 60 μM. La reacción se inició con el agregado de la muestra y al cabo de 10 minutos de
incubación a 37oC se frenó con 600 µl de HClO4 1%. Luego se realizaron dos lavados con
Metanol: Cloroformo (2:1), se separó el producto de los sustratos por formación de dos fases
luego del agregado de agua y cloroformo. La radiactividad presente en los productos de
reacción solubles en cloroformo se determinó en un contador de centelleo líquido.
Para determinar la actividad GPAT NEM sensible, se midió la actividad total (actividad
GPAT) y la actividad en presencia de NEM 2 mM (actividad GPAT NEM resistente). La actividad
NEM sensible se obtuvo por diferencia.
9. PROTOCOLOS GENERALES DE TRABAJO CON LÍPIDOS
9.1. Tinción de gotas de lípido mediante la técnica de Oil Red O.
Para realizar la tinción de gotas de lípido neutros, las células sembradas en cubre objetos
esterilizados por autoclave fueron fijadas en paraformaldehido 4% durante 1h y luego lavadas
tres veces con PBS. La tinción se realizó utilizando 6ml de una solución stock de Oil Red O
(0,5g en 100ml de isopropanol) con 4ml de agua destilada. Esta solución de trabajo fue
preparada fresca cada vez y filtrada con papel Whatman #1. Luego de 1h de incubación con el
colorante, las células fueron lavadas una vez con isopropanol 60% durante 10 segundos y de
tres a cinco veces con sacarosa 0,25M. Luego se procedió al montaje en porta objetos con
PBS-glicerol 1:1 y sellado con esmalte de uñas para la toma de fotos en microscopio óptico con
lente de inmersión 100X. Para el conteo del área de gotas de lípido se tomaron fotos de 10
campos al azar de cada tratamiento y se analizaron 10 células en cada campo. Alternativamente
se realizó la modificación para que la técnica sea cuantitativa en forma directa. Para esto, luego
de los lavados se retiraron los cubreobjetos con células teñidas y se los colocó en otra placa de
cultivo de células limpia (1 cubre objeto por pocillo). Luego se agregó 0,3ml de isopropanol por
pocillo para extraer el colorante incorporado en las células. Luego de 30 minutos de extracción
con agitación, se procedió a medir la cantidad de colorante liberado cuantificando la
absorbancia a 490nm.
30
9.2. Extracción de lípidos mediante la técnica de Bligh y Dyer.
La extracción de lípidos totales fue realizada según lo descripto por Bligh y Dyer (Bligh
and Dyer, 1959). Rápidamente, las células fueron colectadas por raspado con 0,8ml de metanol
y 0,2ml de H2O (por pocillo en placa de 12) en un tubo de vidrio. Luego se le agregaron 0,4ml
de cloroformo, se mezcló en vortex y se dejó toda la noche a -20°C. Al día siguiente los tubos
fueron centrifugados 5 minutos a 4°C a baja velocidad, el sobrenadante fue colectado y
guardado a -20°C mientras que se realizó una segunda extracción de lípidos sobre el
precipitado agregando 0,75ml de metanol:cloroformo (2:1) e incubando a -20°C durante 3 hs.
Más tarde se recuperó el sobrenadante de este segundo tubo y se juntó con el primer
sobrenadante para luego formar dos fases por el agregado de 0,55ml de cloroformo y 0,65ml
de H2O. Después de mezclar vigorosamente los tubos fueron dejados a -20°C durante toda la
noche. Al día siguiente se centrifugaron para lograr una separación completa de las fases y se
colectó la fase de cloroformo inferior. El cloroformo de las muestras fue evaporado en SpeedVac
y los lípidos fueron re-suspendidos en 0,1ml de metanol: cloroformo.
Los volúmenes de solventes fueron recalculados para otros tamaños de placas de
cultivos, conservando siempre la relación entre los mismos.
9.3. Separación de lípidos por cromatografía de capa delgada (TLC).
Para realizar la separación de lípidos se realizaron cromatografías en capa delgada
(TLC) de dos pasos en placas de sílica gel G150 20x20cm de 250 micrones de espesor de fase
estacionaria. El primer paso para separar lípidos polares se realizó hasta la mitad de la placa
con la mezcla de solventes: cloroformo: metanol: hidróxido de amonio (65:25:4 v/v/v), se dejó
secar la placa durante una hora y se realizó el segundo paso para separar lípidos neutros con
la mezcla heptano: éter isopropílico: ácido acético (60:40:4 v/v/v). La identidad de las manchas
de lípidos reveladas por vapores de iodo fue identificado por comparación con estándares
genuinos corridos simultáneamente.
9.4. Cuantificación de trigliceroles (TAG) totales.
La cuantificación de triglicéridos totales luego de la extracción de lípidos se realizó por el
método enzimático de Trinder utilizando el kit para determinación de TAG en plasma de SIGMA
según las instrucciones del fabricante.
9.5. Cuantificación de PL totales.
La cuantificación de los PL totales se realizó separando los lípidos extraídos por TLC con
la mezcla de solventes del segundo paso de separación de lípidos neutros antes mencionada.
En estas condiciones, los PL totales quedan en el punto de siembra. Las placas fueron
carbonizadas sumergiéndolas en una solución 5% de ácido sulfúrico en PBS durante 5
segundos e incubadas luego a 100°C en estufa durante 20 minutos. La intensidad de las
manchas obtenidas en el punto de siembra fue analizada y comparada con una curva estándar
de concentración conocida a través del análisis de imagen con el programa Image J.
31
9.6. Ensayos de incorporación de [14C]-acetato y [14C]- ácido oleico ([14C]-OA) en lípidos.
Los ensayos de marcado isotópico fueron llevados a cabo agregando los precursores
durante las últimas 3h del tratamiento correspondiente. Se agregó 0,1mCi/ml de [14C]-acetato
directamente en el medio de cultivo o se incubaron las células con una mezcla de AO frío (sin
marca) 200mM con 2,4µCi/ml de [14C]- OA previamente complejados con albúmina libre de FA
0,25% durante 1h a 37°C. Además se adicionó 1mM de carnitina durante la incubación. Se
extrajeron los lípidos y fueron re-suspendidos en 100µl de metanol: cloroformo (2:1), de ellos 2
alícuotas de 10µl se cuantificaron por centelleo líquido para el cálculo de la incorporación de
acetato en lípidos totales y 80µl se separaron por TLC como se describió con anterioridad. La
incorporación de [14C]-acetato en cada especie lipídica fue analizada mediante escaneo de
radioactividad en Bioscan y corregida por concentración de proteínas de cada muestra.
10. ENSAYOS FUNCIONALES
10.1. Ensayos de Fagocitosis
El ensayo de la capacidad fagocítica de macrófagos se llevó a cabo utilizando las
BioParticulas E. coli conjugadas con pHrodo® Red para fagocitosis (Molecular Probes, Life
Technologies). Estas E. coli, tienen la particularidad de estar conjugadas a una sonda que sólo
fluoresce cuando se la expone a pH bajo. Dado que el proceso de fagocitosis implica la fusión
del fagosoma con el lisosoma, y así se expone a las partículas incorporadas al bajo pH de esta
organela, estas bacterias conjugadas resultan muy eficientes para la medición de la capacidad
fagocítica eliminando pasos de lavado y falsos positivos de partículas adheridas a la superficie
celular pero no incorporadas, lo cual es un problema muy común en ensayos que utilizan sondas
convencionales y son analizados a través de imágenes. Este ensayo se realizó en placa de 96
pocillos con células 95% confluentes y se midió la fluorescencia (560/585) (Ex/Em) en
fluorómetro.
10.2. Medición de la liberación de citoquinas mediante método Luminex.
La determinación de la concentración de citoquinas en el sobrenadante de los
macrófagos fue hecha mediante el inmunoensayo multiplex Luminex-MAGPIX. Este ensayo se
basa en el uso de múltiples anticuerpos acoplados a bioesferas magnéticas presentes en un
pocillo de placa de 96 y permite el análisis de hasta 50 analitos en un único pocillo. Las placas
fueron diseñadas por el fabricante acoplando los anticuerpos que corresponden a los analitos
de nuestro interés (TNF-α, MCP-1 (CCL2), IL-1b, IL-6 e IL-10). Se colectaron sobrenadantes de
células BMDM wt, Gpat3-/- y Gpat4-/- tratados durante 8h con KLA u oxLDL, se las centrifugó
para eliminar restos celulares y se conservó a -80⁰C hasta realizar la determinación. Los
ensayos fueron llevados a cabo en el servicio de Luminex MAGPIX del Departamento de
Patología y Laboratorio de Medicina de la Universidad de Carolina del Norte, EEUU, según
instrucciones del fabricante.
32
RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
SECCIÓN 1: ESTUDIO DE LA SÍNTESIS DE GLICEROLÍPIDOS Y SU FUNCIÓN DURANTE
LA ACTIVACIÓN DE MACRÓFAGOS
1.1. SÍNTESIS DE NOVO DE GLICEROLÍPIDOS DURANTE LA ACTIVACIÓN DE
MACRÓGAGOS
1.1.1. La activación de células RAW 264.7 con KLA produce la acumulación de gotas de
lípido, TAG y PL
Con el objeto de estudiar la cinética de acumulación de glicerolípidos durante la
activación de macrófagos, se trataron células RAW 264.7 con 100ng/ml de KLA durante 4, 8,
12 y 24h. La validación del ensayo de activación se realizó midiendo la expresión de la citoquina
pro-inflamatoria Tnf-α; en este experimento se observó que la expresión de dicho marcador
aumenta significativamente 40 y 10 veces a las 4 y 8h de tratamiento (p<0,001 y p<0,01
respectivamente) (Figura 1A). Las gotas de lípidos aumentaron significativamente 4 veces a las
12 hs de tratamiento y este incremento se mantuvo a las 24 hs (p<0,001) (Figura 1B-C). Por
otro lado, se determinó la cantidad total de TAG y PL tras 24 hs de incubación y se observó un
aumento significativo (p<0,001) de aproximadamente 50% en la masa de TAG y 55% en la
masa de PL (Figura 1D-E). Estos resultados confirman que, en nuestro modelo de estudio de
activación de células RAW 264.7 con KLA, se produce un aumento en la cantidad de lípidos
almacenados en gotas de lípido, coincidiendo con lo reportado con anterioridad por Beutler,
2003; Fung, et al., 1993; Dennis, et al., 2010 y Tabas, 2000.
Figura 1. Activación y acumulación de lípidos en células RAW264.7 tratadas con KLA. Células RAW 264.7 fueron tratadas
con 100ng/ml KLA durante los tiempos que se indican. A) Se realizó la extracción de RNA y retrotranscripción seguida de qPCR
para cuantificar la expresión del marcador de diferenciación Tnf-α. B-C) Las células fueron fijadas y teñidas con Oil-Red O y se
33
cuantificó mediante análisis de imágenes el área de gotas de lípido por célula D) Se realizó la extracción de lípidos utilizando la
técnica de Bligh y Dyer de células tratadas con KLA durante 24h. Se cuantificaron los TAG totales mediante el método enzimático
de Trinder. E) Se realizó la extracción de lípidos utilizando la técnica de Bligh y Dyer de células tratadas con KLA durante 24h.
Los lípidos fueron separados mediante TLC y los PL totales fueron cuantificados mediante comparación con curva estándar. Los
resultados corresponden al promedio de tres experimentos independientes. **p <0,01, ***p<0,001.
1.1.2. La activación de células RAW 264.7 con KLA produce un aumento en la síntesis de
novo de FA y glicerolípidos
La acumulación de glicerolípidos en una célula puede darse como consecuencia de uno
o varios de los siguientes procesos: a) disminución de la degradación (llevada a cabo por
lipasas, fosfolipasas, o β-oxidación de FA), b) incorporación de lípidos pre-formados (por
ejemplo los glicerolípidos presentes en lipoproteínas endocitadas) o c) aumento de la síntesis
de novo a partir de precursores sencillos como el acetil-CoA y el glicerol.
En el presente trabajo de tesis se ha hecho hincapié en el estudio de la síntesis de novo
de glicerolípidos y de los genes y enzimas involucrados en este proceso durante la activación
de macrófagos. Para el estudio de esta vía metabólica, se trataron células RAW 264.7 con KLA
durante 24hs y en las últimas 3 hs de tratamiento se las incubó con [14C]-acetato (precursor de
la síntesis de novo de FA y Cho) o [14C]-ácido oleico exógeno (OA por sus siglas en inglés). El
análisis de la incorporación de estas dos moléculas marcadas, no sólo permite analizar si se
incrementa la síntesis de novo de glicerolípidos, sino que también, posibilita distinguir si los FA
utilizados provienen de fuentes exógenas (incorporación de [14C]-OA) o si son sintetizados de
novo (incorporación de [14C]-acetato). Como se observa en la Figura 2A, la incorporación de
[14C]-acetato en lípidos totales aumentó significativamente (p<0,05) un 37% luego de 24hs
de tratamiento con KLA. Al analizar la distribución de la marca en las distintas fracciones
lipídicas se observó un aumento significativo en los PL: 69% en PS/PI (p<0,05) y 2 veces en
PC (p<0,01). También la incorporación de [14C]-acetato aumentó un 50 % en los ácidos grasos
libres (FFA por sus siglas en inglés) (p<0,05), mientras que en los TAG la incorporación se
duplicó (p<0,05). Por último, no se observó un incremento en la incorporación de [14C]-acetato
en la fracción de Cho o CE, lo que demuestra que, por un lado, la síntesis de novo de Cho no
se activa en este proceso y por el otro, que los FA sintetizados de novo no resultan almacenados
en CE sino que son canalizados hacia la síntesis de PL y TAG. En lo referente a la incubación
con [14C]-OA, no se observó una diferencia estadísticamente significativa en la
incorporación de [14C]-OA en lípidos totales. Al analizar la distribución de la marca en las
distintas fracciones lipídicas sí se apreció un aumento significativo (p<0,01) de poco más del
50% en la incorporación de este ácido graso exógeno marcado en TAG, mientras que no se
observó que este sea utilizado para la síntesis de PL.
Estos resultados permiten concluir que la síntesis de novo de TAG y PL se induce
durante la activación de células RAW 264.7 con KLA y, en concordancia con reportes previos
(Ecker et al., 2009), la fuerza impulsora del proceso podría ser la inducción de la síntesis de
novo de FA. Los FA exógenos se incorporan en menor medida y lo hacen sólo en la fracción
de TAG, por lo que en este modelo, no serían los sustratos preferidos para la síntesis de novo
de PL.
34
Figura 2. Incorporación de [14C]-acetato y [14C]-ácido oleico en glicerolípidos durante la activación de células RAW 264.7.
Células RAW 264.7 fueron tratadas durante 24hs con KLA y en las últimas 3hs de tratamiento se las incubó con A) [14C]-acetato
o B) [14C]-ácido oleico (OA). Los lípidos totales fueron extraídos utilizando el método de Bligh y Dyer y separados por TLC. La
marca incorporada en cada tipo de lípido fue cuantificada en un equipo Bioscan y analizada por comparación con estándares.
Los resultados son promedio de 3 experimentos independientes. *p <0,05, **p<0,01.
1.1.3. Durante la activación de células RAW 264.7 con KLA aumenta la expresión de las
isoformas Gpat3 y Gpat4 mientras que disminuye la expresión de la isoforma Gpat1
Como se mencionó en la sección introductoria, el paso limitante en la síntesis de novo
de glicerolípidos está catalizado por la glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT), enzima que
cataliza la acilación del glicerol-3-fosfato para dar ácido lisofosfatídico (LPA). En células de
mamífero, se han descripto cuatro genes que codifican para GPATs. Con el objetivo de evaluar
la variación en la expresión de estos genes durante la activación de macrófagos, se trataron
35
células RAW 264.7 durante 4, 8, 12 y 24hs con KLA y se midió el nivel de mRNA mediante
qPCR. Como se muestra en la Figura 3, se observó una variación temporal en los niveles de
expresión de los distintos genes que codifican GPATs. El gen que codifica para la isoforma
mitocondrial GPAT1 presentó una disminución significativa (p<0.,05) de 4 y 2 veces en su
expresión respecto del control a las 12 y 24hs de tratamiento respectivamente, Gpat2 se
expresó basalmente sin mostrar cambios (datos no mostrados), mientras que los genes que
codifican para las isoformas de retículo endoplásmico Gpat3 y Gpat4 mostraron un aumento
significativo de su expresión (5 veces a las 8 hs de tratamiento (p<0,01), 2,5 veces a las 12hs
(p<0,05) y 2 veces a las 24 hs de tratamiento (p<0,05) para Gpat3 ,en concordancia con lo
descripto con anterioridad (Feingold, et al. 2012) y 4 veces luego de las 8hs de tratamiento para
Gpat4 (p<0,01) (Figura 3). Asimismo, también se determinó la expresión del gen que codifica
para la glicerol quinasa (Gk), enzima que cataliza la fosforilación del glicerol para dar glicerol3-fosfato y se observó un aumento del doble en el nivel de expresión de este gen al cabo de
4hs de tratamiento (p<0,05). Por último, el gen que codifica para la enzima carnitina palmitoil
transferasa 1 (Cpt1a), que cataliza el paso limitante en la β-oxidación de FA de cadena larga,
disminuye significativamente su expresión luego de 8 y 12hs de tratamiento (p<0,05) en
concordancia con lo descripto con anterioridad (Feingold, et al., 2012).
Estos resultados de expresión génica, indicarían que tras la activación de macrófagos
con KLA, se produce una disminución de la utilización de FA como fuente de energía (βoxidación), y un aumento de la esterificación de los mismos en glicerolípidos. La existencia de
múltilples isoformas de GPAT permite hipotetizar que cada una de ellas cumple un rol diferencial
en este proceso. Por ejemplo, GPAT1 cumple un rol específico en la incorporación de FA
exógenos en los TAG de hepatocitos (Wendel, et al., 2013; Coleman and Lee, 2004), GPAT3
sería la isoforma que desempeña un rol central en la adipogénesis en tejido adiposo (Cao et al.,
2014), mientras que GPAT4 limita la disponibilidad de FA para la β-oxidación en el tejido
adiposo marrón (Cooper et al., 2015) y desempeña un rol fundamental en la producción de TAG
en la glándula mamaria lactante (Beigneux, et al., 2006). Los resultados obtenidos en el
presente trabajo de tesis, indican que serían GPAT3 y GPAT4 las isoformas involucradas
en la síntesis de novo de glicerolípidos estimulada por la activación de macrófagos con
KLA. El hecho de que sean las isoformas microsomales de GPAT las inducidas en este proceso
podría explicar resultados de estudios de lipidómica que muestran un aumento en la masa de
varios PL (tales como PC y PA) particularmente en retículo endoplásmico tras la activación de
células RAW 264.7 (Andreyev, et al., 2010). Por otro lado, es llamativo que los perfiles
temporales de expresión de GPAT3 y GPAT4 son diferentes. Particularmente, Gpat3 aumenta
a las 8 hs de tratamiento y si bien se observa una disminución de la expresión en función del
tiempo, los niveles de expresión permanecen altos a las 24hs de tratamiento, mientras que el
aumento de expresión de Gpat4 es mucho más agudo, con un pico a las 8hs que desciende
bruscamente a los niveles basales a las 12 y 24hs. Esta respuesta podría sugerir roles
diferenciales para la actividad de las enzimas codificadas por estos genes.
36
Figura 3. Análisis de la expresión de genes relacionados al metabolismo de glicerolípidos durante la activación de
células RAW 264.7. Se realizó la extracción de RNA de células RAW 264.7 tratadas durante 4, 8, 12 o 24hs con KLA y luego de
realizada la retrotranscripción, se cuantificó la expresión por qPCR de los genes indicados. Los resultados fueron normalizados
por comparación con β-actina y son promedio de 3 experimentos independientes. *p <0,05, **p<0,01.
1.1.4. La expresión de GPAT3 y GPAT4 aumenta durante la transición de monocitos THP1
a macrófagos luego del tratamiento con ésteres de forbol.
Como se detalló en la sección introductoria, los macrófagos son células fagocíticas de
linaje mieloide que se diferencian a partir de monocitos bajo la acción de determinados
estímulos. Bajo la hipótesis de que en el proceso de diferenciación se expresarán
diferencialmente genes vinculados con la funcionalidad del macrófago, se estudió la expresión
de genes que codifican GPATs durante este proceso. Para ello se utilizaron monocitos humanos
THP1, los que fueron estimulados a la diferenciación mediante incubación durante diferentes
tiempos con ésteres de forbol (PMA). La diferenciación a macrófago se evidencia a simple vista
por la adhesión de los monocitos que inicialmente crecen en suspensión a la superficie de las
placas de cultivo.
En este modelo de diferenciación se observó que GPAT1 permaneció constante y
GPAT2 no se expresó, mientras que GPAT3 mostró un aumento de 4 y 5 veces luego de 12 y
24hs de tratamiento respectivamente (p<0,01) y GPAT4 se duplicó luego de 12hs (p<0,01)
(Figura 4). CPT1a disminuyó su expresión en alrededor de un 40% a las 8, 12 y 24hs (p<0,05,
p<0,05 y p<0,01, respectivamente) indicando una posible regulación negativa sobre la βoxidación de los FA. Estos resultados, fortalecen la idea de que tanto GPAT3 como GPAT4
desempeñan un rol relevante en el metabolismo de glicerolípidos de macrófagos, ya que los
genes que las codifican no sólo se inducen durante el proceso de activación, sino que también
lo hacen durante la diferenciación de macrófagos a partir de monocitos.
37
Figura 4. Expresión de genes relacionados al metabolismo de glicerolípidos durante la transición de monocitos THP1 a
macrófagos mediante el tratamiento con PMA. Se realizó la extracción de RNA de células THP1 tratadas durante 8, 12 o 24hs
con PMA y luego de realizada la retrotranscripción, se cuantificó la expresión por qPCR de los genes indicados. Los resultados
fueron normalizados por comparación con β-actina y son promedio de 3 experimentos independientes. *p <0,05, **p<0,01.
1.1.5. La actividad GPAT aumenta tras la activación de células RAW 264.7 con KLA
Si bien los niveles de expresión de genes sugieren ciertos cambios metabólicos, es
importante analizar la actividad de las proteínas que codifican para estudiar su rol a nivel
bioquímico. Es por ello que se analizó la actividad GPAT en lisados de células RAW 264.7
tratadas con KLA durante 4, 8, 12 y 24hs. Se observó que la actividad GPAT NEM sensible
atribuible a GPAT3 y GPAT4 fue 27% mayor (p<0,05) a las 8 hs con respecto al control
mientras que la actividad GPAT NEM resistente correspondiente a GPAT1 no se modificó
durante todo el tratamiento (Figura 5).
Figura 5. Actividad enzimática de GPAT3 y/o 4 durante la activación de células RAW 264.7. La actividad GPAT fue analizada
en lisados totales de células tratadas con KLA durante diferentes tiempos en presencia o ausencia de NEM 2 mM . Los resultados
38
son promedio de tres experimentos independientes. *p <0,05, **p<0,01.
1.1.6. La activación de macrófagos primarios derivados de médula ósea de ratón produce
la acumulación de gotas de lípido, TAG y PL.
Las células RAW 264.7 han sido ampliamente utilizadas como modelo de macrófagos
murinos en distintos tipos de estudios. Sin embargo, la utilidad de esta línea celular para el
análisis del metabolismo y la respuesta inflamatoria durante la activación es limitada, ya que se
ha descripto que las células RAW 264.7 presentan una respuesta mucho más atenuada en
comparación a la de macrófagos primarios luego de ser activados con KLA (Maurya, et al.,
2013). Esto podría deberse a que se trata de células inmortalizadas que después de múltiples
pasajes sufren desdiferenciación y adquieren rasgos similares a los de células tumorales,
alejándose gradualmente de las características fenotípicas de su tipo celular original. Por tal
motivo, y con el objetivo de utilizar otro modelo que permita verificar los resultados
obtenidos en células RAW 264.7, se utilizaron macrófagos murinos derivados de médula
ósea (BMDM). La activación de estas células mediante tratamiento con KLA se confirmó
también determinando el nivel de expresión de la citoquina pro-inflamatoria Tnf-α. Los
resultados indican que este marcador de diferenciación se sobre-expresa desde las 4h de
tratamiento (p<0,001), alcanzando un pico a las 8 hs de tratamiento donde el gen se sobreexpresa 35 veces (p<0,01) (Figura 6A). La acumulación de gotas de lípido en este modelo se
analizó tras 24 hs de tratamiento con KLA y se observó un aumento del 50% (p<0,001) (Figura
6B-C). Asimismo, la masa de TAG aumentó poco más de dos veces (p<0,01) (Figura 5D) y
la masa de PL también se duplicó tras 24 hs de tratamiento (p<0,001) (Figura 6E). Estos
resultados son coherentes con los obtenidos al activar células RAW 264.7 con KLA, ya que los
incrementos en la masa de TAG y PL son comparables en ambos modelos.
Figura 6. Activación y acumulación de glicerolípidos en BMDM tratados con KLA. Se realizó la extracción de médula ósea
de ratones C57 y su diferenciación en macrófagos (BMDM) mediante el uso de M-CSF. Posteriormente, las células fueron
tratadas con KLA 100ng/ml durante los tiempos que se indican. A) Se realizó la extracción de RNA y retrotranscripción seguida
39
de qPCR para cuantificar la expresión del marcador de diferenciación Tnf-α. B-C) Las células fueron fijadas y teñidas con OilRed O y se cuantificó el contenido de gotas de lípido por célula mediante la extracción del colorante incorporado con isopropanol.
D) Se realizó la extracción de lípidos utilizando la técnica de Bligh y Dyer de células tratadas con KLA durante 24h. Se
cuantificaron los TAG totales mediante el método enzimático de Trinder. E) Se realizó la extracción de lípidos utilizando la técnica
de Bligh y Dyer de células tratadas con KLA durante 24h. Los lípidos fueron separados mediante TLC y los PL totales fueron
cuantificados mediante comparación con curva estándar. Los resultados corresponden al promedio de tres experimentos
independientes. *p <0,05, **p <0,01, ***p<0,001.
1.1.7. La activación de BMDM con KLA produce un incremento en la síntesis de novo de
FA y glicerolípidos
A fin de evaluar si en este modelo también se activa la síntesis de novo de glicerolípidos,
se trataron BMDM con KLA durante 24h y en las últimas 3 hs de tratamiento se los incubó con
[14C]-acetato o [14C]-ácido oleico (OA) y se observó su incorporación en distintas clases de
lípidos. Los resultados mostraron un aumento significativo (p<0,001) de un 30% en la
incorporación de [14C]-acetato en lípidos totales luego de 24h de tratamiento y al analizar la
incorporación de marca en las distintas fracciones lipídicas, se observó un incremento
significativo de aproximadamente el doble en las fracciones PL, FFA y TAG (Figura 7A). Por
otro lado, no hubo diferencias en la incorporación de acetato en Cho o CE. Estos resultados
son coherentes con los obtenidos en las células RAW 264.7 (Figura 2A), ya que se aprecia un
aumento en la síntesis de novo de FA los cuales son canalizados hacia la síntesis de novo de
glicerolípiodos y así mismo no se aprecian diferencias en la incorporación de los mismos en
CE.
A diferencia de lo que ocurre en las células RAW 264.7, en este modelo sí se observó un
aumento significativo del 28% (p<0,01) en la incorporación de [14C]-OA exógeno en
lípidos totales. Además, si bien coincide con lo observado en esa línea celular, estos FA
exógenos son incorporados en TAG y DAG, en donde se ve un aumento de 2.4 veces (p<0,001)
y del 72% (p<0,05) respectivamente, en el caso de los BMDM el OA exógeno también se
incorpora en PL y en particular, aumenta su incorporación un 45% en PI/PS (p<0,01), y un 83%
en PC (p<0,001) (Figura 7B). Esto no ocurre en células RAW 264.7, en donde los FA exógenos
son canalizados mayormente hacia la síntesis de TAG (Figura 2B).
Estos resultados además coinciden con los reportados por Huang, et al., 2013, que
sostienen que luego de la activación de macrófagos primarios se produce una retención a largo
plazo de reservas de TAG en gotas de lípido alimentado por un aumento en la captación y
esterificación de FA exógenos en glicerolípidos, aumento en la síntesis de novo de FA y
glicerolípidos y disminución en la lipolisis y β-oxidación de lípidos reservados.
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Figura 7. Incorporación de [14C]-acetato y [14C]-ácido oleico en glicerolípidos durante la activación de BMDM. BMDM
fueron tratados durante 24hs con KLA y en las últimas 3hs de tratamiento se los incubó con A) [14C]-acetato o B) [14C]-ácido
oleico (OA). Los lípidos totales fueron extraídos utilizando el método de Bligh y Dyer y separados por TLC. La marca incorporada
en cada tipo de lípido fue cuantificada en un equipo Bioscan y analizada por comparación con estándares. Los resultados son
promedio de 3 experimentos independientes. *p <0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
1.1.8. La actividad GPAT3/4 aumenta tras la activación de BMDM con KLA pese a la
disminución de la expresión del mRNA.
Con el objetivo de evaluar la expresión de los genes que codifican para GPATs durante
la activación de BMDM, se midió mediante qPCR la cantidad de su mRNA en función del tiempo
de tratamiento con KLA. Al igual que lo que ocurre tras la activación de células RAW 264.7
(Figura 3), la expresión de genes que codifican para enzimas que metabolizan FA en la
mitocondria (Gpat1 y Cpt1) disminuye, y en este caso también se produce un incremento
41
significativo de la expresión de Gk, aunque en este modelo es de mayor magnitud (15 veces a
las 8 hs de tratamiento, p<0,001) (Figura 8A). Por otra parte, inesperadamente, los genes que
codifican para GPATs microsomales no aumentaron su expresión sino que por el
contrario disminuyeron.
Por otra parte, se midió la actividad GPAT atribuible a GPAT1 (NEM resistente) y a
GPAT3/4 (NEM sensible). Mientras que la actividad de GPAT1 se mantuvo constante durante
todo el tratamiento, la actividad atribuible a GPAT3/4 aumentó significativamente 3 veces
a las 8 hs de tratamiento (p<0,001), retornando subsecuentemente a los niveles basales
(Figura 8B). Estos resultados de aumento de actividad enzimática a pesar de la ausencia de un
aumento a nivel de mRNA sugieren algún tipo de activación post-transcripcional para alguna o
ambas isoformas microsomales con actividad NEM sensible.
42
Figura 8. Expresión y actividad de enzimas relacionadas al metabolismo de glicerolípidos durante la activación de
BMDM. A) Las células fueron tratadas con KLA durante 4, 8, 12 y 24hs y se cuantificó la expresión por qPCR de los genes
indicados. Los resultados fueron normalizados por comparación con β-actina y son promedio de 3 experimentos independientes
B) La actividad GPAT fue analizada en particulados totales de BMDM tratados con KLA durante diferentes tiempos en presencia
o ausencia de NEM 2 mM . Los resultados son promedio de tres experimentos independientes. *p <0,05, **p<0,01, ***p<0,001
43
1.2. ROL DE GPAT3 Y GPAT4 EN EL METABOLISMO DE GLICEROLÍPIDOS Y SUS
CONSECUENCIAS FUNCIONALES DURANTE LA ACTIVACIÓN DE MACRÓFAGOS
1.2.1. El silenciamiento de Gpat3 en células RAW 264.7 provoca una disminución en la
acumulación de gotas de lípido, TAG y PL.
Habiendo determinado que la síntesis de novo de glicerolípidos se ve incrementada tras
la activación de macrófagos con KLA y que particularmente la actividad GPAT aumenta, se
procedió a silenciar el gen que codifica para GPAT3 con el fin de analizar la contribución del
mismo al aumento en la masa de glicerolípidos. Para ello, se obtuvo una línea celular derivada
de la RAW 264.7 en la que se silenció Gpat3 mediante el uso de un shRNA específico
vehiculizado con partículas lentivirales (a partir de ahora shGpat3). Como control se utilizó una
línea celular RAW scramble (SCR) que contiene un shRNA que no silencia ningún gen conocido.
El silenciamiento produjo una reducción del 75% en la cantidad de RNA mensajero de Gpat3
(p<0,001) (Figura 9A). Las consecuencias fenotípicas del silenciamiento de Gpat3 fueron
contundentes: el silenciamiento del gen abolió la capacidad de las células RAW 264.7 de
responder con un aumento de la masa PL y de las gotas de lípido intracelulares frente al
tratamiento con KLA (Figura 9B-C), mientras que la masa de TAG luego de la activación
resultó significativamente menor a la de células SCR, lo que demuestra que GPAT3 tiene un rol
protagónico en la acumulación de glicerolípidos durante la activación de macrófagos.
44
Figura 9. Efecto del silenciamiento de Gpat3 sobre la acumulación de lípidos en células RAW264.7 tratadas con KLA. A)
Análisis mediante qPCR del nivel de expresión de Gpat3 en células RAW 264.7 (wt), SCR, y shGpat3. B-C) Células RAW 264.7
SCR y shGpat3 fueron tratadas con KLA durante 24hs, fijadas y teñidas con Oil-Red O y se cuantificó el contenido de gotas de
lípido por célula mediante el análisis de la incorporación del colorante,. D) Se realizó la extracción de lípidos utilizando la técnica
de Bligh y Dyer de células tratadas con KLA durante 24hs. Se cuantificaron los TAG totales mediante el método enzimático de
Trinder. E) Los lípidos de células tratadas durante 24hs con KLA fueron extraídos y separados mediante TLC y los PL totales
fueron cuantificados mediante comparación con curva estándar. Los resultados corresponden al promedio de tres experimentos
independientes. **p <0,01, ***p<0,001 respecto al control, †††p<0,001, ††p<0,01 con respecto al SCR+KLA.
1.2.2. El silenciamiento de Gpat3 produce una disminución en la síntesis de novo de FA
y glicerolípidos en células RAW 264.7 activadas.
A fin de determinar con mayor profundidad el impacto del silenciamiento de GPAT3 en
la síntesis de novo de glicerolípidos estimulada por tratamiento con KLA, se trataron células
RAW 264.7 SCR y shGpat3 con KLA durante 24h y en las últimas 3 hs de tratamiento se las
incubó con [14C]-acetato o [14C]-OA y se analizó la incorporación de marca en cada una de las
clases de lípidos como se describió con anterioridad. El tratamiento de las células SCR con
KLA, produjo un incremento significativo del 28% en la incorporación de [14C]-acetato en lípidos
45
totales (p<0,05) en coincidencia con lo reportado para las células RAW 264.7 wt (Figura 2A).
Sin embargo, el tratamiento de las células shGpat3 con KLA no produjo cambios
estadísticamente significativos en la incorporación de [14C]-acetato en lípidos totales, así
como tampoco en ninguna de las clases lipídicas analizadas. Asimismo, en estado basal
sin activar, las células shGpat3 incorporaron menos [14C]-acetato en PC y PE con respecto a
las células control. Con respecto a la incorporación de [14C]-OA exógeno, las células SCR no
muestran diferencias estadísticamente significativas entre células control y tratadas mientras
que las células shGpat3 exhiben una disminución de casi el 50% en la incorporación al ser
activadas (p<0,05).
Estos resultados permiten concluir que la actividad de GPAT3 es fundamental para
síntesis de novo de glicerolípidos, tanto de PL como de TAG, y que dicha isoforma contribuye
de manera contundente a la acumulación de los mismos tras la activación con KLA. Asimismo,
se puede inferir que el silenciamiento de Gpat3 produce un efecto sobre la síntesis de novo de
FA, ya que mientras que en las células SCR la incorporación de [14C]-acetato en FFA aumenta
luego de la activación, en las células silenciadas no se ve una diferencia significativa con
respecto al control. Esto sugiere que podría existir un acoplamiento de ambos procesos de
forma tal que ante la disminución de GPAT3 y la incapacidad de esterificar los FA en
glicerolípidos, el exceso de los mismos podría inhibir su síntesis de novo. Por último, la
observación que la incorporación de [14C]-acetato aumenta en PL durante la activación pero no
la de [14C]-OA, nos permite concluir que la fuente de FA para la síntesis de dichas biomoléculas
no es exógena, sino que proviene de la síntesis de novo a partir de acetil-CoA.
46
Figura 10. Efecto del silenciamiento de Gpat3 sobre la incorporación de [14C]-acetato y [14C]-AO en glicerolípidos durante
la activación de células RAW 264.7. Células SCR y shGpat3 fueron tratados durante 24hs con KLA y en las últimas 3hs de
tratamiento se los incubó con A) [14C]-acetato o B) [14C]-ácido oleico (OA). Los lípidos totales fueron extraídos utilizando el método
de Bligh y Dyer y separados por TLC. La marca incorporada en cada tipo de lípido fue cuantificada en un equipo Bioscan y
analizada por comparación con estándares. Los resultados son promedio de 3 experimentos independientes. *p <0,05, **p<0,01,
***p<0,001 con respecto al control sin tratar. # p<0,05, # #p<0,01 respecto al SCR control.
1.2.3. Los BMDM Gpat3-/- y Gpat4-/- poseen una menor actividad GPAT NEM-sensible y
acumulan menos gotas de lípido, TAG y PL luego de su activación
A partir de los resultados obtenidos al trabajar con células RAW 264.7, se pudo observar
que la actividad de GPAT3 resulta crucial para el aumento en la masa de glicerolípidos en
47
macrófagos activados. Con el objetivo de discernir si existe un rol diferencial en la actividad de
GPAT3 y GPAT4, se utilizaron como modelos experimentales BMDM obtenidos a partir de
ratones knock-out Gpat3-/- y Gpat4-/- y se procedió a estudiar el efecto de la ausencia total de
cada isoforma durante la activación de macrófagos primarios.
En principio fue posible comprobar que el aumento de 3 veces en la actividad GPAT
NEM-sensible correspondiente a GPAT3/4 que se ve en BMDM wt tratados con KLA a las 8h
(p<0,001), es significativamente menor en ambos macrófagos knock-out, siendo el efecto
mucho más marcado en los BMDM Gpat4-/- en donde se alcanza una reducción del 70% y se
pierde completamente el pico de aumento a las 8hs, en comparación con los BMDM Gpat3-/- en
los que la disminución es del 44% con respecto al wt (p<0,001) pero aún se conserva una
diferencia significativa (p<0,05) respecto a su control sin tratar (Figura 11A). Como se realizó
en los demás modelos experimentales, se procedió a analizar el efecto de la ausencia de
GPAT3 o GPAT4 sobre la acumulación de gotas de lípido a través de la tinción con Oil-Red O.
El tratamiento de BMDM wt con KLA produjo un aumento significativo de casi el doble en las
gotas de lípido, un aumento del 50% en la masa TAG y un aumento de aproximadamente un
70% en los PL totales tras 24h de tratamiento con KLA. Por el contrario, los BMDM derivados
de ratones Gpat3-/- y Gpat4-/-, acumularon menos gotas de lípido y estas fueron de menor
tamaño, en concordancia con un aumento más discreto en la masa de TAG y una masa
de PL que no se modificó (Figura 11B-C). Estos resultados, junto con los observados en
células RAW shGpat3 confirman que GPAT3 posee un rol fundamental en la acumulación de
ambos glicerolípidos, TAG y PL, durante la activación de macrófagos, pero que GPAT4 también
es necesaria para este proceso.
48
Figura 11. Efecto de la ausencia de Gpat3 o Gpat4 sobre la actividad GPAT NEM-sensible y la acumulación de lípidos en
BMDM tratados con KLA. A) Se midió el nivel de actividad GPAT en presencia o ausencia de NEM en BMDM wt, Gpat3-/- y
Gpat4-/- tratados con KLA durante los tiempos indicados. La actividad NEM-sensible se calculó por substracción. B-C) BMDM wt,
Gpat3-/- y Gpat4-/- fueron tratados con KLA durante 24hs, fijados y teñidos con Oil-Red O y se cuantificó el contenido de gotas de
lípido por célula mediante el análisis de la incorporación del colorante. D) Se realizó la extracción de lípidos utilizando la técnica
de Bligh y Dyer de células tratadas con KLA durante 24hs. Se cuantificaron los TAG totales mediante el método enzimático de
Trinder. E) Los lípidos de células tratadas durante 24hs con KLA fueron extraídos y separados mediante TLC y los PL totales
fueron cuantificados mediante comparación con curva estándar. Los resultados corresponden al promedio de tres experimentos
independientes. **p <0,01, ***p<0,001, †p<0,05 con respecto al control WT+KLA, ††p<0,01 con respecto al control WT+KLA,
†††p<0,001 con respecto al control WT+KLA.
49
1.2.4. La ausencia de GPAT3 o GPAT4 produce una disminución en la síntesis de novo
de FA y glicerolípidos en BMDM activados.
A fin de determinar el efecto de la ausencia de GPAT3 o GPAT4, no sólo en la
acumulación de glicerolípidos, sino particularmente en la síntesis de novo de los mismos, se
incubaron BMDM de ratones Gpat3-/- y Gpat4-/- con KLA durante 24hs y en las últimas 3 hs de
tratamiento se agregó [14C]-acetato o [14C]-OA y se analizó la incorporación de marca en cada
una de las clases de lípidos como se describió con anterioridad. Al igual que lo observado en
células RAW 264.7, los BMDM wt presentan un aumento del doble en la incorporación de [14C]acetato en lípidos totales luego de 24hs de tratamiento con KLA (p<0,001). Este aumento se ve
específicamente en PI/PS (96%), PC (2.5 veces), PE (2 veces), FFA (2 veces) y TAG (2 veces)
(p<0,001 en todos los casos) (Figura 12A). Los BMDM Gpat3-/- y Gpat4-/- activados
incorporaron un 30 y 40% menos acetato marcado en lípidos totales respectivamente en
comparación con los BMDM wt (p<0,001). Al analizar la incorporación en cada lípido en
particular, se puede ver que al igual de lo que sucede con las células RAW shGpat3 (Figura
10A), los BMDM Gpat3-/- activados presentaron una reducción del 62% en la incorporación de
[14C]-acetato en PC (p<0,001), del 50% en PE (p<0,001) y del 24% en TAG (p<0,05) respecto
de los BMDM wt activados, y además en estos casos, otra vez coincidiendo con lo observado
en células RAW 264.7 shGpat3, la incorporación de acetato marcado en células tratadas no
difiere significativamente de los controles, mostrando que la ausencia de GPAT3 provoca una
anulación en el aumento de la síntesis de novo de ambos PL y TAG durante la activación
de macrófagos. Los BMDM Gpat4-/-, por otro lado, mostraron una disminución en la
incorporación de [14C]-acetato del 45% en PC (p<0,001), del 24% en FFA (p<0,01) y del 51%
en TAG (p<0,01) luego del tratamiento con KLA. En este caso, a diferencia de lo observado en
BMDM Gpat3-/-, si bien se producen reducciones en la incorporación de marca en los PL (PC y
PE), éstas células activadas aún conservan diferencias significativas con respecto a sus
controles (p<0,01), no así en el caso de la incorporación en TAG. Estas observaciones nos
permitirían sugerir un comportamiento diferencial entre GPAT3 y GPAT4 en la síntesis de novo
de glicerolípidos. Si bien la ausencia de ambos afecta en la síntesis de PL y TAG, al parecer,
mientras GPAT3 es muy importante para la síntesis de ambos grupos de glicerolípidos, GPAT4
parece ser mucho más relevante para la síntesis de TAG en este contexto fisiológico.
En lo referente a la incorporación de [14C]-OA en lípidos totales, los BMDM wt
mostraron un aumento significativo del 28% (p<0,05) luego de 24hs de tratamiento con KLA,
mientras que la incorporación en los BMDM de ratones Gpat3-/- y Gpat4-/- no exhibe diferencia
significativa con respecto al control y es un 30% y 24% menor a la registrada en BMDM wt
(p<0,01 y p<0,05 respectivamente) (Figura 12B). Analizando la incorporación de marca en cada
clase de lípido se puede ver que los BMDM wt presentan un aumento significativo en la
incorporación de [14C]-OA en PI/PS (45%, p<0,01), PC (83%, p<0,001), DAG (72%, p<0,05), y
TAG (2.4 veces, p<0,001), observándose además, una incorporación de 3 veces mayor
(p<0,001) de FA marcados exógenos una vez que los macrófagos son activados, mostrando
nuevamente que en ingreso de FA exógenos a la célula aumenta cuando se produce esta
estimulación. En los BMDM Gpat3-/- en estado basal sin tratar, la incorporación de marca es
significativamente menor en PI/PS (42%, p<0,01), PC (32%, p<0,05), PE (24%, p<0,05) y DAG
(53%, p<0,05). En los BMDM Gpat4-/- en estado basal, la incorporación de marca es
significativamente menor en PI/PS (50%, p<0,01), PC (37%, p<0,01), PE (43%, p<0,01) y DAG
50
(52%, p<0,05). Los Gpat3-/- activados presentan una disminución en la incorporación de ácido
graso radioactivo en PI/PS (47%, p<0,001), PC (41%, p<0,001), PE (50%, p<0,05), DAG (29%,
p<0,05) y TAG (68%, p<0,001) respecto a los BMDM wt activados, y sólo la incorporación en
PC y la cantidad de FFA marcados muestran un aumento significativo (p<0,05) luego de la
activación. Los BMDM Gpat4-/-, por otro lado, también incorporan menos FA marcado que los
wt: un 53% en PI/PS, 52% en PC, 60% en DAG y 69% en TAG (p<0,001) luego de ser activados.
Estos resultados nos permiten fortalecer la conclusión de que tanto GPAT3 como GPAT4
poseen un rol fundamental en la síntesis de novo de TAG que contribuyen a la acumulación de
los mismos durante la activación de macrófagos, y basados en la incorporación de acetato
marcado, también podemos concluir que GPAT3 sería la isoforma que actuaría específicamente
en la síntesis de PL. Por último, al igual que lo observado en células RAW 264.7 shGpat3, y
como puede evidenciarse en la incorporación de acetato en FFA, la ausencia de alguna de
las GPATs produce una disminución en la síntesis de novo de FA, sugiriendo una
interacción este proceso y la síntesis de glicerolípidos.
51
Figura 12. Efecto de la ausencia de GPAT3 o GPAT4 sobre la incorporación de [14C]-acetato y [14C]-AO en glicerolípidos
durante la activación de BMDM. BMDM wt, Gpat3-/- y Gpat4-/- fueron tratados durante 24hs con KLA y en las últimas 3hs de
tratamiento se los incubó con A) [14C]-acetato o B) [14C]- OA. Los lípidos totales fueron extraídos utilizando el método de Bligh y
Dyer y separados por TLC. La marca incorporada en cada tipo de lípido fue cuantificada en un equipo Bioscan y analizada por
comparación con estándares. Los resultados son promedio de 3 experimentos independientes. *p <0,05, **p<0,01, ***p<0,001
con respecto al control sin tratar. †p<0,05 ††p<0,01, †††p<0,001 con respecto al WT+KLA. #p<0,05, ##p<0,01 respecto al WT
control.
1.2.5. El silenciamiento o la ausencia de Gpat3 o Gpat4 en células RAW 264.7 y/o BMDM
afectan la capacidad fagocítica luego de la activación con KLA.
Luego de concluir que tanto GPAT3 como GPAT4 son fundamentales para lograr una
52
síntesis y acumulación de glicerolípidos normal durante la activación de macrófagos, se
procedió a investigar cuál es la relevancia de estos glicerolípidos sintetizados por GPAT3 y
GPAT4 en un aspecto funcional fundamental del macrófago: su capacidad de efectuar el
proceso de fagocitosis una vez que se produce su activación. Para ello, los macrófagos se
incubaron con BioParticulas E. coli conjugadas a una sonda sensible a pH que les permite
fluorescer sólo luego de la fusión del fagosoma con el lisosoma una vez que las partículas fueron
ya incorporadas en la célula. La capacidad fagocítica se midió en función de la fluorescencia
por célula luego de 2hs de incubación y restando los blancos correspondientes. Más allá de la
evaluación del efecto del silenciamiento o ausencia de Gpat3 y Gpat4 sobre la capacidad
fagocítica, se decidió profundizar en el estudio de la influencia de los glicerolípidos acumulados
en gotas de lípido en general sobre el proceso de fagocitosis de macrófagos y analizar de qué
forma estos lípidos son necesarios para esta función primordial. En base a los antecedentes
antes reportados que describen el requerimiento de la hidrólisis de TAG mediado por lipasas
para que se lleve a cabo el proceso de fagocitosis en forma eficiente (Chandak, et al., 2010),
hipotetizamos que los glicerolípidos acumulados en gotas de lípido podrían ejercer un rol
fundamental para la fagocitosis como: A) fuente de energía a través de su consumo mediante
β-oxidación y/o B) fuente de moléculas lipídicas señal iniciadoras del proceso fagocítico
liberadas de las gotas de lípido a través de lipólisis (como eicosanoides sintetizados a partir del
AA, PA o DAG). Para poner a prueba estas hipótesis los macrófagos fueron tratados con KLA
durante 8hs y expuestos a las partículas de E.coli conjugadas durante las últimas 2hs de
tratamiento. Esto se realizó en presencia y ausencia de Etamoxir (Inhibidor de la CPT1a y por
lo tanto de la β-oxidación) o de Orlistat (Inhibidor general de la actividad lipasa). Los resultados
en células RAW 264.7 SCR (Figura 13A, izquierda) mostraron que la capacidad fagocítica
aumenta aproximadamente 2,5 veces luego de la activación con KLA. Cuando las células se
trataron con KLA en presencia de Etamoxir (Et), la capacidad fagocítica sólo se duplicó y resultó
ser significativamente menor a la alcanzada sólo con la activación con KLA, indicando que en
parte, es necesaria la β-oxidación de FA para alcanzar un nivel de fagocitosis normal, pero que
esta no es la fuente de energía primordial para dicho proceso. Cuando las células fueron
tratadas con KLA en presencia de Orlistat (Orl), los niveles de fagocitosis fueron iguales a los
del control, por lo que este compuesto bloqueó totalmente el incremento de la capacidad
fagocítica que se da en forma característica durante la activación. Este resultado indicaría que
es fundamental la actividad de ciertas lipasas para el normal funcionamiento de la fagocitosis.
Esto resultaría coherente con la observación de Balestrieri et al., 2006 que describe que la
ausencia de una fosfolipasa A2 secretoria afecta la capacidad fagocítica de macrófagos
primarios. Este patrón de comportamiento fue observado en todas las células evaluadas, tanto
en células RAW 264.7 (Figura 13A) como en BMDM (Figura 13B), sin embargo, las células
RAW shGpat3 y los BMDM Gpat3-/- y Gpat4-/-, presentaron una disminución significativa
de la capacidad fagocítica tras la activación con KLA. Esto podría deberse a que ante el
silenciamiento o ausencia de Gpat3 o Gpat4 la célula tendría una capacidad disminuida para
sintetizar y almacenar lípidos que posteriormente serían utilizados para activar o alimentar
energéticamente el proceso de fagocitosis. Esta observación permite concluir que GPAT3 y
GPAT4 son fundamentales para la síntesis de novo de glicerolípidos durante la activación de
macrófagos y que esta acumulación de lípidos resulta fundamental para el proceso de
fagocitosis de células activadas.
53
Figura
13.
Efecto
del
silenciamiento
o la ausencia de
GPAT3 y/o de
GPAT4 sobre la
capacidad
fagocítica
de
macrófagos. A)
Células
RAW
264.7 SCR y
shGpat3 o B)
BMDM wt, Gpat3/y
Gpat4-/fueron tratados
durante 8hs con
KLA, ayunados
durante
las
últimas 4hs de
tratamiento
e
incubados
con
E.coli conjugas
con
sonda
fluorescente
sensible a pH en
las últimas 2hs
de tratamiento.
Las células se
trataron además
en presencia de
Etamoxir
(Et)
(inhibidor de la βactivación) o de
Orlistat
(Orl)
inhibidor
de
lipasas durante
8hs.
Los
resultados
son
promedio de 3
experimentos
independientes.
***p<0,001
respecto
al
control, # p<0,05
respecto a las
células con KLA
##
p<0,01
respecto a las
células con KLA,
###
p<0,001
respecto a las
células con KLA
†p<0,05,
†††p<0,001
con
respecto
al
control SCR o wt.
54
1.2.6. La ausencia de Gpat3 o Gpat4 en BMDM afecta la expresión y liberación de
citoquinas y quimioquinas al medio.
Teniendo en cuenta publicaciones previas en las que se propone que las gotas de lípido
estarían asociadas a la producción de moléculas señalizadoras como eicosanoides y citoquinas
(Silva, et al., 2009; Bozza, et al., 2009) y en particular la observación de que la liberación de
ciertas citoquinas pro-inflamatorias como IL-6 y TNF-α requieren de la síntesis de PC debido a
que este PL resulta fundamental para la correcta remodelación de membranas del aparato de
Golgi que media la formación de vesículas de liberación de dichas moléculas señal (Tian, et al.,
2008), se procedió a estudiar la influencia de la ausencia de GPAT3 o GPAT4, y la consecuente
deficiencia en la síntesis y acumulación de glicerolípidos en gotas de lípido sobre la expresión
y liberación de citoquinas y quimioquinas pro-inflamatorias (TNFα, MCP1 o CCL2, IL-1β e IL-6)
y citoquinas anti-inflamatorias (IL-10) en BMDM. La expresión de citoquinas fue analizada
mediante qPCR, mientras que la liberación de citoquinas al medio de cultivo fue evaluado a
través de la técnica de inmunoensayo multiplex Luminex-MAGPIX. Al analizar los niveles de
expresión de citoquinas, observamos aumento de varios órdenes de magnitud en las células
tratadas con KLA con respecto al control, por lo cual los resultados se expresan como 2∆∆Ct, es
decir como cantidad de veces que las muestras tratadas aumentan su expresión respecto al
control. Se observó que la magnitud del aumento de la expresión de Tnf-α, Il-1β, Il-6 e Il-10 en
BMDM Gpat3-/-, fue menor al de los macrófagos wt y que sólo la expresión de Mcp-1 fue similar
(Figura 14A). Esta variación en la expresión de citoquinas debido a la disminución de Gpat3
podría deberse a que esta enzima induce la vía del blanco de rapamicina de mamíferos (mTOR)
(Tang, et al., 2006) y entre los efectos que caracterizan su función como promotor del
crecimiento y proliferación celular, se encuentra la estimulación de la expresión de citoquinas
pro-inflamatorias como IL-6 y TNF-α (Vangan, et al., 2016). En cuanto a los resultados de
liberación de citoquinas al medio en BMDM, se pudo observar que la liberación de la
quimioquina MCP-1 y de la citoquina antiinflamatoria IL-10 fue menor en Gpat3-/- en
comparación con los wt y no presentó diferencias significativas en el caso de la liberación de
citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α, IL-1β e IL-6) (Figura 14B). Por otro lado, respecto de la
expresión y la liberación de citoquinas en macrófagos Gpat4-/- se observó un patrón opuesto a
lo esperado en todas las citoquinas pro-inflamatorias, es decir, la magnitud del aumento de la
expresión en estos macrófagos es mayor al observado en las células wt (Figura 13 A y B). La
única citoquina que mostró un patrón diferente fue la citoquina anti-inflamatoria Il-10, cuyo
aumento en el nivel de expresión fue menor que el de las células wt y la cantidad liberada al
medio fue igual. Si bien los resultados de expresión y presencia de citoquinas liberadas en el
medio no son totalmente coincidentes, y esta discrepancia entre nivel de mRNA y proteína es
una observación que se produce con frecuencia, es posible observar ciertos patrones respecto
a la liberación al medio, determinación que resulta más relevante teniendo en cuenta su función.
Por un lado, cuando el gen que codifica para GPAT3 está ausente, los niveles de liberación
de citoquinas pro-inflamatorias al medio no cambian, lo que indicaría que la disminución en
la síntesis de glicerolípidos (TAG y PL) debido a la carencia de esta enzima no altera el circuito
de señalización. Por el contrario, la disminución en la síntesis de novo de glicerolípidos
debido a la ausencia de GPAT4 (principalmente TAG), sí produce un efecto claro: la
exacerbación en la expresión y liberación de citoquinas pro-inflamatorias. Se requieren
de más estudios a fin de dilucidar el mecanismo por el cual se produce este efecto, pero si
55
tenemos en cuenta nuestros resultados que indican que GPAT4 sería fundamental para la
síntesis de novo de TAG durante la activación de macrófagos, podemos hipotetizar que esta
enzima desempeñaría un papel importante en la captación y almacenamiento de FA
precursores de moléculas señal en los TAG almacenados en gotas de lípido, haciendo que
estos no se encuentren disponibles para la síntesis de señales pro-inflamatorias. Esta
característica de considerar a una enzima de la vía de sínteisis de novo de glicerolípidos como
“secuestradora” de señales pro-inflamartorias no es una idea nueva, ya que fue propuesta
previamente para la DGAT1, enzima posterior a la GPAT en dicha vía (Koliwad, et al., 2013).
Las causas de la diferencia en la respuesta ante la carencia de dos enzimas tan similares en
función y estructura deben ser aún estudiadas, pero podemos hipotetizar que se podría deber
a una diferencia en la capacidad de cada isoforma de GPAT para dirigir la síntesis de novo de
TAG o PL utilizando diferentes FA y que como se ha planteado, una diferencia en la composición
de gotas de lípido en macrófagos podría generar un cambio en la producción de citoquinas proinflamatorias (Persson, et al., 2006; Lammers, et al., 2011).
56
Figura
14.
Efecto de la
ausencia
de
Gpat3 o de
Gpat4 sobre la
expresión
y
liberación
de
citoquinas
y
quimioquinas
en BMDM. A)
BMDM
wt,
Gpat3-/- y Gpat4/tratados
durante 4hs con
KLA, se extrajo
el RNA y se
cuantificó
la
expresión
por
qPCR de los
genes
indicados. Los
resultados
se
presentan como
fueron
2∆∆Ct,
normalizados
por comparación
con β-actina y
son promedio de
4
ratones.
**p<0,01,
***p<0,001
respecto a las
células wt. B)
BMDM
wt,
Gpat3-/- y Gpat4/- fueron tratados
durante 8 hs con
KLA y se colectó
su
sobrenadante.
Se determinó la
concentración
de las citoquinas
liberadas
al
medio mediante
inmunoensayo
Luminex
MAGPIX.
.
*p<0,05,
***p<0,001
respecto
al
control,
††p<0,01,
†††p<0,001
con
respecto
al
SCR.
57
Conclusiones parciales:
•
La síntesis de novo de glicerolípidos se induce y contribuye al aumento de la masa de
PL, TAG y gotas de lípido durante la activación de macrófagos.
•
GPAT3 y GPAT4 son las isoformas de la enzima limitante en el proceso de síntesis de
novo de glicerolípidos que contribuyen a dicho aumento.
•
La síntesis de novo de FA se induce durante la activación de macrófagos.
•
El silenciamiento de GPAT3 o GPAT4 produce una disminución en la síntesis de novo
de FA.
•
Para la síntesis de novo de glicerolípidos durante la activación de macrófagos se utilizan
tanto FA exógenos como sintetizados de novo.
•
GPAT3 y GPAT4 son necesarias para que los macrófagos activados lleven a cabo el
proceso de fagocitosis.
•
Para alimentar energéticamente el proceso de fagocitosis, los macrófagos utilizarían la
β-oxidación de lípidos almacenados en gotas, aunque esta no sería la fuente de energía
mayoritaria.
•
La fagocitosis en macrófagos activados es dependiente de la acción de lipasas,
probablemente para la producción de alguna señal lipídica y/o para la biogénesis de las
gotas de lípido.
•
Se requiere de la presencia de GPAT3 y GPAT4 para que se produzca un patrón de
expresión y liberación de citoquinas normal luego de la activación clásica de macrófagos.
•
La ausencia de GPAT4 durante la activación del macrófago produce una exacerbación
en la producción de citoquinas pro-inflamatorias, por lo que GPAT4 actuaría como un
atenuador de la respuesta inflamatoria.
58
RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
SECCIÓN 2: ESTUDIO DE LA SÍNTESIS DE GLICEROLÍPIDOS Y SU FUNCIÓN DURANTE
LA TRANSICIÓN MACRÓFAGO-CÉLULA ESPUMOSA.
Durante el desarrollo de la placa aterogénica se produce un extenso proceso inflamatorio
que da inicio luego del reclutamiento de monocitos circulantes a la zona de la lesión. Estos
monocitos, después de diferenciarse a macrófagos por la acción del M-CSF incorporan
lipoproteínas modificadas como acLDL u oxLD. Mientras que en el resto de las células del
organismo las LDLs son incorporadas por un receptor específico de acuerdo al contenido
intracelular de Cho (Charlton-Menys and Durrington, 2007), en el macrófago estas partículas son
endocitadas mediante un proceso no regulado por la concentración de Cho intracelular
(Pennings, et al., 2006). La incorporación de estas lipoproteínas lleva a la transición de ésta
célula a la denominada célula espumosa, caracterizada por poseer grandes gotas de lípido
compuestas no sólo por CE, sino también por TAG (Babaei, et al., 2000). Las oxLDL son
reconocidas y endocitadas principalmente por receptores basurero como el CD36 (Endemann,
et al., 1993; Nozaki, et al., 1995; Febraio, et al., 2000). Estas lipoproteínas modificadas también
son ligandos de los mismos receptores TLR4 que reconocen el LPS bacteriano, aunque este tipo
de receptor no media la incorporación de la partícula completa (Tobias and Curtiss, 2005). Dado
que durante la activación de macrófagos vía TLR4 se activa la síntesis de novo de glicerolípidos
y que esta vía metabólica está implicada en la respuesta inflamatoria y en la capacidad fagocítica
de los macrófagos (SECCIÓN 1), se propuso determinar si las oxLDL son capaces de activar la
síntesis de novo de glicerolípidos y evaluar las consecuencias funcionales de esta activación.
Determinar las enzimas clave en las vías metabólicas que contribuyen a la transición de
macrófago a célula espumosa e influyen en el desarrollo del proceso inflamatorio, constituye un
conocimiento valioso en vistas a identificar dianas terapéuticas idóneas para una acción antiaterogénica. Se hipotetiza que durante esta transición se produce una inducción de la síntesis
de novo de glicerolípidos y que la activación de esta vía metabólica repercute en la respuesta
inflamatoria.
2.1. SÍNTESIS DE NOVO DE GLICEROLÍPIDOS DURANTE LA TRANSICIÓN MACRÓFAGOCÉLULA ESPUMOSA
2.1.1. La incubación de células RAW 264.7 con oxLDL produce su transición a célula
espumosa.
En la mayoría de los trabajos el estudio del metabolismo lipídico en el modelo de
transición de macrófago-célula espumosa se ha focalizado en el análisis del metabolismo del
Cho y sus ésteres (Rajamäki, et al., 2010; Xiao-Hua, 2013), mientras que el metabolismo de
glicerolípidos ha sido prácticamente ignorado. Si bien se ha reportado un aumento en la masa
de TAG y PL durante la formación de la célula espumosa, no se conocen aún las consecuencias
funcionales de este incremento ni las vías metabólicas involucradas en el mismo (Tabas, et al.,
2000; Guo, et al., 2009). Para validar el modelo experimental escogido en este trabajo (células
RAW 264.7 tratadas con oxLDL) se evaluó la acumulación de glicerolípidos luego del
tratamiento con 100µg/ml de oxLDL durante diferentes tiempos. La transición macrófago-célula
espumosa en función del tiempo fue monitoreada estudiando la expresión del receptor basurero
59
CD36 mediante qPCR (Tontonoz, et al., 1998; Nagy, et al., 1998; Pou, et al., 2007). Se observó
que la expresión de dicho marcador de célula espumosa se duplica luego de 8hs de tratamiento,
aumentó 5 veces luego de 12hs y nuevamente fue 2 veces mayor luego de 24hs (p<0,001)
(Figura 15A). Las gotas de lípido aumentaron 7 veces a partir de las 8hs de tratamiento
(p<0,001) (Figura 15B-C). A las 24hs se observó un aumento de 4 veces en la masa de CE
(p<0,001), del doble en la de TAG (p<0,01) y 1.5 veces en la de PL (p<0,05) con respecto
al control (Figura 15D). Estos resultados confirman que en este modelo experimental se
produce la acumulación de glicerolípidos y CE. Es importante destacar que un aumento del
doble en la masa de TAG en la célula espumosa no puede deberse únicamente a la
incorporación de TAG presentes en las oxLDL, ya que estas lipoproteínas sólo poseen
aproximadamente un 4-6% de TAG en su composición total (McNamara, et al., 1996).
Figura 15. Transición macrófago-célula espumosa y acumulación de lípidos en células RAW264.7 tratadas con oxLDL.
Células RAW 264.7 fueron tratadas con 100µg/ml de oxLDL durante los tiempos que se indican. A-B) Las células fueron fijadas
y teñidas con Oil-Red O y el área de gotas de lípido por célula se cuantificó mediante análisis de imágenes C) Se realizó la
extracción de RNA y retrotranscripción seguida de qPCR para cuantificar la expresión del marcador de célula espumosa Cd36.
D) Se realizó la extracción de lípidos utilizando la técnica de Bligh y Dyer de células tratadas con oxLDL durante 24hs. Se
cuantificaron los TAG totales mediante el método enzimático de Trinder y para la cuantificación de PL y CE, los lípidos fueron
separados mediante TLC y la intensidad de cada mancha carbonizada fue cuantificada mediante comparación con curva
estándar. Los resultados muestran la diferencia con respecto al control (TAG: 0,487 µg/µg de proteína, PL: 96,11 ng/µg de
proteína). Los resultados corresponden al promedio de tres experimentos independientes. **p <0,01, ***p<0,001.
60
2.1.2. El tratamiento de células RAW 264.7 con oxLDL produce un aumento en la síntesis
de novo de TAG.
A fin de evaluar si los lípidos acumulados durante el proceso de transición de macrófagocélula espumosa son sintetizados de novo, se incubaron células RAW 264.7 con [14C]-acetato
o [14C]- OA en las últimas 3hs de tratamiento con oxLDL y se analizó su incorporación en lípidos
totales y en las distintas clases lipídicas. La incorporación de [14C]-acetato en lípidos totales
disminuyó un 27% (p<0,05) tras el tratamiento con oxLDL y esta disminución ocurrió a
expensas de una disminución de la incorporación en PI/PS (22%, p<0,05), PC (49%, p<0,001),
PE (32%, p<0,01), Cho (45%, p<0,05) y en FFA (50%, p<0,05). Por el contrario, el tratamiento
con oxLDL incrementó 5 veces la incorporación de [14C]-acetato en TAG (p<0,01) (Figura
16A). Asimismo, se observó un patrón muy similar en la incorporación de [14C]-OA, la cual
disminuye (25%, p<0,05) en los lípidos totales tras la incubación con oxLDL. Al desglosar la
incorporación de [14C]-OA en cada lípido, también se observa una disminución en los PL (PI/PS
y PC) (55%, p<0,05 y 60%, p<0,01 respectivamente), mientras que en los TAG, y en este caso
también en CE, la incorporación es significativamente mayor (10 veces, p<0,001 y 5 veces
p<0,05 respectivamente) (Figura 16B). Estos resultados permiten concluir que, en coincidencia
con lo que ocurre en macrófagos activados con KLA, durante la transición de macrófagocélulas espumosa hay un aumento en la síntesis de novo de TAG. Sin embargo en este
caso se produce una disminución, y no un incremento, en la síntesis de novo de PL.
61
Figura 16. Incorporación de [14C]-acetato y [14C]-AO en glicerolípidos durante la transición célula RAW 264.7-célula
espumosa. Células RAW 264.7 fueron tratadas durante 24h con oxLDL y en las últimas 3h de tratamiento se los incubó con A)
[14C]-acetato o B) [14C]- OA. Los lípidos totales fueron extraídos utilizando el método de Bligh y Dyer y separados por TLC. La
marca incorporada en cada tipo de lípido fue cuantificada en un equipo Bioscan y analizada por comparación con estándares.
Los resultados son promedio de 3 experimentos independientes. *p <0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
2.1.3. Durante la transición célula RAW 264.7- célula espumosa aumenta la expresión de
Gpat3 y la actividad GPAT.
Con el objetivo de identificar a las enzimas que contribuyen al incremento en la síntesis
de novo de TAG durante la transición macrófago- célula espumosa, se trataron células RAW
264.7 durante 4, 8, 12 y 24hs con oxLDL y se midió el nivel de mRNA de genes que codifican
para distintas GPATs. Se observó que Gpat1 disminuye en un 15% su expresión a las 8 y 12hs
de tratamiento, Gpat2 se expresó basalmente sin mostrar cambios (datos no mostrados),
mientras que Gpat3 mostró un importante aumento en su expresión (de 9 veces a las 4hs
de tratamiento, 35 veces a las 8hs, 12 veces luego de 12hs y 3 veces a las 24hs de
tratamiento). Gpat4 no presentó variaciones significativas (Figura 17). Por otro lado, se
analizó la expresión de Cpt1a, la cual mostró un aumento significativo luego de 4, 8 y 12hs
de tratamiento (5, 7 y 3 veces respectivamente), sugiriendo una inducción en la β-oxidación
durante la transición macrófago-célula espumosa en coincidencia con lo reportado
anteriormente (Takahashi, et al., 2013). Por último, a diferencia de lo que ocurre durante la
activación de macrófagos inducida por tratamiento con KLA, la expresión de Gk no cambió
durante la transición macrófago-célula espumosa.
Figura 17. Expresión de genes relacionados al metabolismo de glicerolípidos durante la transición célula RAW 264.7célula espumosa. Se realizó la extracción de RNA de células RAW tratadas durante 4, 8, 12 o 24hs con oxLDL y luego de
realizada la retrotranscripción, se cuantificó la expresión por qPCR de los genes indicados. Los resultados fueron normalizados
por comparación con β-actina y son promedio de 3 experimentos independientes. *p <0,05, **p<0,01.
A los mismos tiempos de tratamiento se cuantificó la actividad enzimática GPAT. La
actividad NEM-resistente atribuible a GPAT1 bajó entre un 40 y un 60% a las 8 y las 24hs de
tratamiento (p<0,01) (Figura 18), en coincidencia con los niveles de expresión del mRNA (Figura
62
16), mientras que la actividad GPAT NEM sensible aumentó 3 y 5 veces luego de 12 y 24hs
respectivamente (p<0,01). Estos resultados y los de expresión génica son coherentes con un
rol de GPAT3 en la activación de la síntesis de novo de TAG que se produce durante la
formación de la célula espumosa.
Figura 18. Actividad enzimática GPAT durante la transición célula RAW 264.7- célula espumosa. Las células fueron
tratadas con oxLDL durante los tiempos indicados y la actividad GPAT fue analizada en particulados totales en presencia o
ausencia de NEM 2 mM . Los resultados son promedio de tres experimentos independientes. **p<0,01 con respecto a las 4hs.
2.1.5. La incubación de BMDM con oxLDL produce su transición a célula espumosa.
De igual manera a lo realizado en el estudio de activación de macrófagos, se procedió a
corroborar los resultados obtenidos en células RAW 264.7 utilizando BMDM. Estos macrófagos
primarios se incubaron con oxLDL durante 24hs y se analizó la acumulación de lípidos. Se
observó un aumento de 2.5 veces en gotas de lípido (p<0,001) (Figura 19A-B), de 27 veces
en la masa de CE (p<0,001), de 11 veces en TAG (p<0,001) y los PL sólo se duplicaron
(p<0,001) (Figura 19C). Es interesante destacar que los BMDM mostraron un mayor incremento
en la masa de CE y TAG luego de su transición a célula espumosa en comparación a las células
RAW 264.7. Esta mayor sensibilidad y mayor grado de respuesta a los tratamientos de los
macrófagos primarios en comparación con la línea celular establecida, es coherente con
observaciones propias anteriores y lo reportado previamente (Maurya, et al., 2013).
63
Figura 19. Acumulación de glicerolípidos en BMDM tratados con oxLDL. BMDM provenientes de ratones C57 wt fueron
tratados con oxLDL durante 24hs. A-B) Las células fueron fijadas y teñidas con Oil-Red O y se cuantificó la cantidad de lípidos
neutros por célula mediante extracción con isopropanol del colorante incorporado. C) Se realizó la extracción de lípidos totales
utilizando la técnica de Bligh y Dyer. Los TAG fueron cuantificados utilizando el ensayo enzimático de Trinder, mientras que los
PL y CE se cuantificaron separando los lípidos totales por TLC, carbonizando y determinando la intensidad de manchas mediante
comparación con curva estándar. Los resultados se expresan como el incremento en la cantidad de cada lípido con respecto al
control sin tratar (TAG: 0,77ng/µg de proteína, PL: 0,73 µg/µg de proteína). Los resultados corresponden al promedio de tres
experimentos independientes. ***p<0,001.
2.1.6. La expresión de Gpat3 aumenta durante la transición BMDM- célula espumosa.
Con el objetivo de cuantificar la variación en la expresión de genes involucrados en la
síntesis de novo de TAG, se analizó por qPCR el mRNA de los genes que codifican para las 4
isoformas de GPAT en células tratadas con oxLDL. Se observó que Gpat1 disminuyó su
expresión 40% (p<0,05) y 30% (p<0,01) luego de 12 y 24hs de tratamiento respectivamente y
que Gpat3 aumentó su expresión 4 veces (p<0,01) luego de 24hs de tratamiento. Gpat2 y
64
Gpat4 no mostraron variaciones significativas en su expresión (Figura 20). Estos resultados
concuerdan con los obtenidos en células RAW 264.7 (Figura 17).
Figura 20. Análisis de la expresión de las 4 isoformas de GPAT durante la transición BMDM- célula espumosa. Se realizó
la extracción de RNA de BMDM tratados durante 4, 8, 12 o 24h con oxLDL y luego de realizada la retrotranscripción, se cuantificó
la expresión por qPCR de los genes indicados. Los resultados fueron normalizados por comparación con β-actina y son promedio
de 3 experimentos independientes. *p <0,05, **p<0,01
2.2. ROL DE GPAT3 Y GPAT4 EN EL METABOLISMO DE GLICEROLÍPIDOS Y SUS
CONSECUENCIAS DURANTE LA TRANSICIÓN MACRÓFAGO-CÉLULA ESPUMOSA.
2.2.1. El silenciamiento de Gpat3 en células RAW 264.7 atenúa la acumulación de gotas
de lípido, TAG y PL tras su transición a célula espumosa.
A fin de determinar el rol de GPAT3 en la acumulación de lípidos durante la formación
de la célula espumosa, se trataron células shGpat3 y SCR con oxLDL durante 24h y se analizó
la acumulación de gotas de lípido, la masa de CE, TAG y de PL. Mientras que el tratamiento
de células SCR con oxLDL produjo un incremento del doble (p<0,001) en las gotas de
lípido, en las células silenciadas el aumento fue sólo de un 40% (p<0,05) y las gotas de
lípido observadas en estas células fueron más escasas y pequeñas (Figura 21 A-B). Además,
si bien el contenido de CE tras la incubación con oxLDL no varió entre las células SCR y
shGpat3, el contenido de TAG y PL disminuyó significativamente en las células
silenciadas (p<0,05) (Figura 21C). Estos resultados, permiten concluir que Gpat3 es necesaria
para el incremento en las gotas de lípido que se produce durante la transición macrófago-célula
espumosa.
Previamente se ha descripto que los TAG son necesarios para la formación de gotas de
lípido típicamente mixtas (TAG y CE) y que los macrófagos con bajo contenido de TAG
presentan un cambio en el estado físico de los CE, lo que provoca una disminución en la
65
hidrólisis de los mismos y en el eflujo de Cho (Lada, et al., 2002). En este trabajo se ha
determinado que GPAT3 es necesaria para que se produzca el incremento en la masa de TAG
tras la incubación con oxLDL y por lo tanto se puede especular que la manipulación de la
actividad de esta enzima podría influenciar el eflujo de Cho de los macrófagos.
Figura 21. Efecto del silenciamiento de Gpat3 sobre la acumulación de lípidos en células RAW264.7 tratadas con oxLDL.
A-B) Células RAW 264.7 SCR y shGpat3 fueron tratadas con oxLDL durante 24hs, fijadas y teñidas con Oil-Red O y se cuantificó
el contenido de gotas de lípido. C) Se realizó la extracción de lípidos utilizando la técnica de Bligh y Dyer de células tratadas con
oxLDL durante 24hs. Los TAG totales se cuantificaron mediante el método enzimático de Trinder, mientras que los PL y CE se
midieron separando los lípidos totales por TLC, carbonizando y determinando la intensidad de manchas mediante comparación
con curva estándar. Los resultados se expresan como incremento en la cantidad de cada lípido con respecto al control sin tratar
(TAG SCR: 0,53 ng/µg de proteína, TAG shGpat3: 0,52 ng/µg de proteína PL SCR: 0,96 µg/µg de proteína, PL shGpat3: 0,97
µg/µg de proteína). Los resultados corresponden al promedio de tres experimentos independientes. ***p<0,001, respecto a las
células sin tratar, ††p<0,01 con respecto a las células control+KLA y †p<0,05 con respecto a las células SCR.
2.2.2. El silenciamiento de Gpat3 provoca una disminución en la síntesis de novo de TAG
durante la transición células RAW 264.7- célula espumosa.
En el apartado anterior se demostró que el silenciamiento de Gpat3 disminuyó la
acumulación de glicerolípidos. A fin de comprobar si esta disminución se debe a una alteración
en la síntesis de novo de TAG y PL, se analizó la incorporación de [14C]-acetato o [14C]-OA en
lípidos totales y en las distintas clases lipídicas durante las últimas 3hs de tratamiento con
oxLDL. Los resultados obtenidos al tratar células SCR con oxLDL fueron similares a los
observados en células wt (Figura 16): La incorporación de marca en lípidos totales disminuyó a
expensas de una disminución en la incorporación de marca en PL, mientras que la única clase
lipídica en la que se detectó un aumento de la incorporación [14C]-acetato fueron los TAG
(3 veces, p<0,001) (Figura 22A). En las células shGpat3 tratadas con oxLDL se perdió el
incremento en la incorporación de marca en TAG, mientras que se mantuvo la disminución en
66
la incorporación de [14C]-acetato en PL, Cho, DAG y FFA. En cuanto a la incorporación de [14C]OA en células SCR se observó un patrón similar: una disminución en la incorporación en lípidos
totales y PL mientras que se detectó un aumento en la incorporación de [14C]-OA en TAG
y en este caso también en CE (6 veces, p<0,001 y 5 veces p< 0,01 respectivamente) (Figura
22B). El silenciamiento de Gpat3 afectó la síntesis de novo de PL en estado basal pero no así
luego de la transición a célula espumosa. Por último, si bien las células silenciadas aumentaron
la incorporación de marca en TAG luego de su transición a célula espumosa, este incremento
fue significativamente menor en las células shGpat3 tratadas en comparación con las SCR
(p<0,001).
Estos resultados permiten concluir que GPAT3 es necesaria para el incremento en la
masa de TAG sintetizados de novo tras la incubación con oxLDL.
67
Figura 22. Efecto del silenciamiento de Gpat3 sobre la incorporación de [14C]-acetato y [14C]-ácido oleico en
glicerolípidos durante la transición células RAW 264.7- célula espumosa. Células SCR y shGpat3 fueron tratados durante
24hs con oxLDL y en las últimas 3hs de tratamiento se los incubó con A) [14C]-acetato o B) [14C]- OA. Los lípidos totales fueron
extraídos utilizando el método de Bligh y Dyer y separados por TLC. La marca incorporada en cada tipo de lípido fue cuantificada
en un equipo Bioscan y analizada por comparación con estándares. Los resultados son promedio de 3 experimentos
independientes. *p <0,05, **p<0,01, ***p<0,001 con respecto al control sin tratar. †p<0,05, ††p<0,01, †††p<0,001 con respecto al
SCR + oxLDL, # p<0,05, ##p<0,01, ###p<0,001 respecto al SCR control.
68
2.2.3. Los BMDM Gpat3-/- y Gpat4-/- acumulan menos gotas de lípido, TAG y PL luego de
su transición a célula espumosa.
Los mismos experimentos descriptos en los apartados anteriores se realizaron utilizando
BMDM de ratones Gpat3-/- y Gpat4-/-. El tratamiento con oxLDL produjo un aumento de
aproximadamente 2.5 veces en las de gotas de lípido en los BMDM wt mientras que el
aumento fue mucho menor en los BMDM Gpat3-/- (40%) y BMDM Gpat4-/- (26%), resultando
estas gotas mucho más numerosas pero más pequeñas (Figura 23A-B). Respecto a la
acumulación de CE, al igual que lo observado en células RAW 264.7 (Figura 20), no se
observaron diferencias significativas en los BMDM Gpat3-/- y Gpat4-/- con respecto a los wt
(Figura 23C). En cuanto a la acumulación de TAG, se vio que mientras que los BMDM
presentan un aumento de 11 veces respecto al control, este aumento es
significativamente menor en BMDM Gpat3-/- y Gpat4-/- (7 veces, p<0,05 y poco más de 5
veces, p<0,01 respectivamente). Por último, se observó un incremento de
aproximadamente el doble en la masa de PL totales luego de 24hs de tratamiento con
oxLDL en células wt, y este aumento fue prácticamente nulo en los BMDM Gpat3-/- y
Gpat4-/-. Estos resultados permiten concluir que la expresión de ambas isoformas de GPAT es
necesaria para la formación de gotas de lípido mixtas. La ausencia de estas enzimas en BMDM
provoca la formación de gotas de lípido con una relación TAG: CE diferente lo cual podría alterar
su tamaño y su funcionalidad.
69
Figura 23. Efecto de la ausencia de Gpat3 o Gpat4 sobre la acumulación de lípidos en BMDM tratados con oxLDL. A-B)
BMDM wt, Gpat3-/- y Gpat4-/- fueron tratados con oxLDL durante 24hs, fijados y teñidos con Oil-Red O y se cuantificó la cantidad
de gotas de lípidos mediante análisis de liberación de colorante. C) Se realizó la extracción de lípidos utilizando la técnica de
Bligh y Dyer de células tratadas con oxLDL durante 24hs. Los TAG totales se cuantificaron mediante el método enzimático de
Trinder, mientras que los PL y CE se midieron separando los lípidos totales por TLC, carbonizando y determinando la intensidad
de manchas mediante comparación con curva estándar. Los resultados se expresan como incremento en la cantidad de cada
lípido con respecto al control sin tratar (TAG wt: 0,77 ng/µg de proteína, TAG Gpat3-/-: 0,62 ng/µg de proteína, TAG Gpat4-/-: 0,82
ng/µg de proteína, PL wt: 0,73 µg/µg de proteína, PL Gpat3-/-: 0,32 µg/µg de proteína, PL Gpat4-/-: 0,52 µg/µg de proteína). Los
resultados corresponden al promedio de tres experimentos independientes. **p <0,01, ***p<0,001 respecto al control sin tratar,
†p<0,05, ††p<0,01, †††p<0,001 con respecto al control wt.
2.2.4. La ausencia de Gpat4 en BMDM afecta la liberación de citoquinas y quimioquinas
al medio durante su transición a célula espumosa.
A fin de evaluar el efecto de la ausencia de Gpat3 o Gpat4 y el consecuente defecto en
la síntesis y acumulación de glicerolípidos en un aspecto funcional del macrófago durante su
transición a célula espumosa, se procedió a evaluar la liberación de citoquinas y quimioquinas
pro-inflamatorias (TNFα, MCP1 o CCL2, IL-1β e IL-6) y anti-inflamatorias (IL-10) en BMDM
tratadas con oxLDL.
Se observó que los BMDM Gpat3-/-, liberaron más TNF-α y menos MCP-1 respecto a los
BMDM wt luego de su transición a célula espumosa. (Figura 24). Los BMDM Gpat4-/-, por otro
lado, mostraron un incremento significativo en la liberación de todas las citoquinas
analizadas luego del tratamiento. Estos resultados indican que la ausencia de cualquiera de
70
las dos isoformas de GPAT produce una alteración en el perfil de liberación de citoquinas luego
de la transición macrófago-célula espumosa. Si bien el efecto de la ausencia de GPAT3 no es
del todo claro, se puede concluir que GPAT4 tendría un rol relevante en la atenuación de la
liberación de citoquinas al medio durante la transición macrófago-célula espumosa, puesto que
su ausencia provoca una exacerbación en la liberación de las mismas en concordancia con lo
observado durante la activación de los macrófagos con KLA (Sección 1). Este efecto podría
tener relación al rol que ejerce GPAT4 en la acumulación de TAG en gotas de lípido y el papel
de éstas en la producción de citoquinas pro-inflamatorias, puesto que, como se mencionó con
anterioridad, se ha planteado que una disminución en la cantidad y diferencia en la composición
de gotas de lípido en macrófagos produce un aumento en la producción de citoquinas proinflamatorias (Persson, et al., 2006; Lammers, et al., 2011). La comprensión de los mecanismos
que conducen a este efecto requiere de un mayor número de estudios y resulta relevante
considerando la potencialidad de GPAT4 como blanco terapéutico capaz de controlar el proceso
inflamatorio en el contexto del desarrollo de la placa aterogénica.
Figura 24. Efecto de la ausencia de Gpat3 o Gpat4 sobre la liberación de citoquinas y quimioquinas en BMDM. BMDM
wt, Gpat3-/- y Gpat4-/- fueron tratados durante 8hs con oxLDL y se colectó su sobrenadante. Se determinó la concentración de
las citoquinas liberadas al medio mediante inmunoensayo Luminex MAGPIX. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 respecto al control,
††p<0,01, †††p<0,001 con respecto al wt tratado con oxLDL.
71
Conclusiones parciales:
•
Durante la transición de macrófago a célula espumosa se induce la síntesis de novo de
TAG y ésta contribuye a la acumulación de gotas de lípido.
•
GPAT3 y GPAT4 son las isoformas de la enzima limitante en el proceso de síntesis de
novo de TAG que contribuyen a dicha acumulación.
•
Durante la transición de macrófago a célula espumosa los ácidos grasos sintetizados de
novo se canalizan hacia la formación de TAG, mientras que los exógenos son utilizados
tanto en la síntesis de TAG como de CE.
•
Se requiere de la presencia de GPAT3 y GPAT4 para que se produzca un patrón de
expresión y liberación de citoquinas normal luego de la transición de macrófago-célula
espumosa.
•
La ausencia de GPAT4 durante la transición de macrófago-célula espumosa produce
una exacerbación en la producción de citoquinas pro-inflamatorias, por lo que GPAT4
actuaría como un atenuador de la respuesta inflamatoria.
72
CONCLUSIÓN
Tanto durante la activación del macrófago como en su transición a célula espumosa se
induce la síntesis de novo de TAG, con el consecuente incremento de las gotas de lípido
intracelulares. Sin embargo, la síntesis de novo de PL sólo se induce en el modelo de activación
con KLA. El primer paso de la síntesis de novo de glicerolípidos contribuye al incremento en
estos lípidos, ya que la actividad GPAT aumenta durante los tratamientos con KLA y oxLDL.
Los resultados indican que son las isoformas NEM-sensibles (GPAT3 y GPAT4) las que
contribuyen a dicho aumento de actividad. El mecanismo mediante el cual se produce este
aumento de actividad no puede ser dilucidado por completo en base a este trabajo, ya que en
uno de los modelos experimentales utilizados (células RAW 264.7 activadas) se observó un
aumento en la expresión de los genes que codifican para GPAT3 y GPAT4, mientras que en
otros modelos (BMDM activados y transición a célula espumosa) la expresión de estos genes
disminuyó o no mostró cambios, indicando que el aumento de actividad observado en ambos
casos sería producto de múltiples mecanismos de regulación, probablemente a nivel posttranscripcional o post-traduccional.
El rol de GPAT3 y GPAT4 en la activación de la síntesis de novo de glicerolípidos resulta
evidente en los distintos modelos de silenciamiento utilizados. Ambas isoformas son necesarias
para que se produzca la acumulación de gotas de lípido y el aumento en la masa de TAG y/o
PL en respuesta a la exposición a KLA u oxLDL, sin embargo existen diferencias fundamentales
tras el silenciamiento de uno u otro gen. Si bien el silenciamiento o ausencia de ambas
isoformas altera la capacidad fagocítica de los macrófagos, sólo la carencia de GPAT4 exacerba
la liberación de citoquinas pro-inflamatorias, sugiriendo para esta isoforma un rol en la
atenuación de las señales infamatorias.
Por todo lo expuesto anteriormente se puede especular que mediante la manipulación
de la expresión de GPAT4 en macrófagos, se podría atenuar la respuesta inflamatoria de estas
células tanto en procesos de inflamación en un contexto fisiológico como patológico,
constituyendo esta enzima un potencial blanco terapéutico.
A futuro se requieren de más estudios tendientes a dilucidar la cascada de señalización
responsable de vincular la activación de los receptores TLR4, ya sea por el contacto con el KLA
como con oxLDL, con la alteración en el metabolismo de lípidos reportado no sólo en este
trabajo sino en múltiples publicaciones antes mencionadas. Por otro lado, también es imperativo
conocer el mecanismo mediante el cual la actividad GPAT afecta la producción de moléculas
pro-inflamatorias. Por último, sería de gran utilidad la producción de ratones doble knock-out
GPAT4-/- y ApoE-/- (con mayor tendencia al desarrollo de placas aterogénicas) para evaluar in
vivo el efecto del silenciamiento de GPAT4 sobre la probabilidad de desarrollar aterosclerosis,
así como también estudiar el desarrollo de distintas infecciones virales y bacterianas en ratones
libres de patógenos GPAT4-/- y modelos en donde esta proteína se encuentre sobre expresada
en forma estable.
73
BIBLIOGRAFÍA
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