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TEC-26
ANÁLISIS DE COMPUESTOS FENÓLICOS EN MUESTRAS DE
ACEITE DE OLIVA CON ELECTROFORESIS CAPILARIONIZACIÓN POR ELECTROSPRAY-ESPECTROMETRÍA DE
MASAS
David Arráez Román, Alegría Carrasco Pancorbo, Antonio Segura Carretero* y Alberto
Fernández Gutiérrez*
Departamento de Química Analítica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, C/
Fuentenueva s/n, E-18071 Granada, España.
*
e-mail: [email protected]; [email protected].
FORO DE LA TECNOLOGÍA OLEÍCOLA Y LA CALIDAD
RESUMEN
En este trabajo se describe el primer método analítico que incluye una extracción en fase sólida
(SPE) y una metodología de electroforesis capilar en zona acoplada a una ionización por
electrospray-espectrometría de masas con trampa de iones (CZE-ESI-MS) para la identificación
y caracterización de compuestos fenólicos en muestras de aceite de oliva. Los parámetros del
método electroforético y del electrospray se optimizaron persiguiendo la máxima sensibilidad.
Para conseguir este propósito, el método empleado usó un capilar de sílice fundida y un
tampón acuoso que consistía en 60 mM de NH4OAc a un pH de 9.5 con un 5% de 2-propanol,
líquido adicional (make-up) que contenía 2-propanol/agua 60:40 (v/v) y 0.1% (v/v) de
trietilamina a una velocidad de flujo de 0.30 mL/h, un flujo de gas de secado de 5 L/min a 300
ºC, 5 psi de presión de gas nebulizador, empleando una estabilidad de compuesto del 25%.
Este método es simple, rápido, y selectivo comparado con otras técnicas convencionales, y por
ello, varios compuestos fenólicos importantes pueden ser detectados y caracterizados en
aceite de oliva extra virgen usando una etapa de extracción en fase sólida previa al análisis por
CZE-ESI-MS.
1 INTRODUCCIÓN
El aceite de oliva virgen es uno de los pocos aceites que se consume directamente sin ningún
tratamiento de refinado y es el único zumo de aceituna obtenido por presión. Por esta razón,
contiene varias sustancias de gran importancia [1,2]; compuestos que tienen una alta actividad
en la estabilidad autooxidativa de los aceites [3,4], y cuya cantidad puede ser relacionada con las
características sensoriales de estos aceites [5,6]. Las determinaciones cualitativas y cuantitativas
de las sustancias fenólicas son, como consecuencia, muy importantes, sean referidas a fenoles
simples, o bien, a fenoles complejos. Uno de los métodos empleados para la determinación
cuantitativa de los fenoles totales en aceite de oliva virgen es el ensayo colorimétrico, basado
en la reacción de Folin-Ciocalteu [7]; sin embargo, este método no es específico, y los fenoles
simples y complejos son detectados indistintamente. Algunos autores han desarrollado
métodos de extracción para aceites, así como separaciones por cromatografía de gases (GC)[8]
y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para el análisis de fenoles simples [9,10], y
sustancias fenólicas complejas [11,12,13]. A pesar de que la caracterización de los compuestos
fenólicos del aceite de oliva ha sido llevada a cabo con éxito, estas técnicas necesitan bastante
dedicación en el proceso de preparación de muestra y, generalmente, consumen un tiempo
bastante amplio en los análisis.
A consecuencia de todo lo hasta aquí expuesto, se recomienda el uso de técnicas analíticas
más rápidas y herramientas de "screening". La electroforesis capilar (CE) proporciona tiempos
de análisis cortos que la convierten en una poderosa alternativa a las separaciones
cromatográficas. Cuando la electroforesis capilar en zona se acopla a la espectrometría de
masas usando una ionización por electrospray (ESI-MS), se puede obtener una gran cantidad
de información, ya que la espectrometría de masas proporciona información estructural y
acerca de la masa molecular de los compuestos bajo estudio, que puede resultar muy útil para
1
la confirmación estructural de ciertas moléculas. En general, si una técnica separativa es
acoplada con MS, los límites de detección son mejores que si se acopla con detección ultravioleta y la interpretación de los resultados analíticos puede ser concluyente [14,15,16].
Así, la ionización por electrospray ha emergido como un acoplamiento muy útil que permite la
unión directa con las técnicas electroforéticas de separación [17].
Aunque la electroforesis capilar ofrece al analista una serie de ventajas para el análisis de
componentes de los alimentos, desafortunadamente, hasta la fecha, sólo unos pocos datos
están disponibles acerca del contenido fenólico en productos desecho de la industria olivarera
(aguas de desecho de almazaras [18] y alperujo [19]) y en aceite de oliva [12,20,21,22,23,24]
directamente con el uso de esta técnica. Entre todos estos artículos, sólo en uno de ellos se
usa la CE acoplada a un detector MS.
Ahora, el objetivo de este trabajo ha sido el desarrollo del primer método SPE-CE-ESI-MS
rápido y simple para la identificación y caracterización de compuestos fenólicos en muestras de
aceite de oliva. Tres alcoholes fenólicos (tirosol (TY), hidroxitirosol (HYTY) y 2-(4hidroxifenil)etil acetato (HYTY Ac)), dos lignanos ((+)-pinoresinol (Pin) y (+)-1acetoxipinoresinol (Ac Pin), y varios fenoles complejos (ligustrósido aglicona (Lig Agl),
oleuropeína aglicona (Ol Agl) y sus respectivos derivados descarboxilados (forma
descarboxilada-Lig Agl y forma descarboxilada-Ol Agl), y varias formas isoméricas de ellas
(forma dialdehídica de la oleuropeína aglicona (forma dialdehídica-Ol Agl), forma dialdehídica
del ligustrósido aglicona (forma dialdehídica-Lig Agl), forma dialdehídica descarboxilada de la
oleuropeína aglicona (forma dialdehídica-descarboxilada-Ol Agl), forma dialdehídica
descarboxilada del ligustrósido aglicona (forma dialdehídica-descarboxilada-Lig Agl) y 10hidroxi-oleuropeína aglicona (10-H-Ol Agl)) fueron detectados como los componentes
mayoritarios en aceite de oliva virgen extra con CE-ESI-MS.
El efecto de la concentración y tipo de tampón, así como el efecto de la adición de
modificadores orgánicos a la disolución reguladora fueron estudiados tratando de conseguir la
máxima selectividad y sensibilidad.
2 PARTE EXPERIMENTAL
2.1 EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS DEL ACEITE DE
OLIVA VIRGEN EXTRA
Para extraer los compuéstos fenólicos presentes en el aceite de oliva, se eligió una extracción
en fase sólida con columnas Diol. El protocolo de extracción fue el siguiente: El cartucho Diol
se colocó en la estación de vacío y fue acondicionado pasando a través de su fase sólida 10
mL de metanol y después 10 mL de hexano. Las muestras de aceite de oliva virgen extra (60 g)
se disolvieron en 60 mL de hexano y se pasaron a través del cartucho. Posteriormente, el
cartucho se lavó con tres porciones de 5 mL de hexano, el cual se deja eluir para arrastrar así
la fracción no polar del aceite. Finalmente, se pasaron ocho porciones de 5 mL de metanol que
se llevaron a sequedad en un rotavapor bajo presión reducida a una temperatura de 35ºC. El
residuo se reconstituyó en 2 mL de metanol/agua 50:50 (v/v) y se filtró con un filtro de nylon de
0.2 µm de tamaño de poro antes de su análisis en el equipo de CE.
2.2 ELECTROFORESIS CAPILAR
Los análisis se llevaron a cabo en un sistema de electroforesis capilar P/ACETM MDQ
(Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA) equipado con un detector UV-VIS que trabajó a
214 nm durante los análisis realizados, y acoplado a un espectrómetro de masas usando una
interfase ortogonal de electrospray.
Se emplearon capilares de sílice fundida con un diámetro interno de 50 µm, con una longitud
total de 100 cm y una longitud efectiva hasta el detector UV-Vis de 7 cm.
El acondicionamiento del capilar consistió en 2 min de lavado con agua, seguido de 5 min con
la disolución reguladora.
El instrumento fue controlado por medio de un ordenador con el software GOLD de Beckman.
2
2.3 ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Los experimentos fueron llevados a cabo en un espectrómetro de masas con trampa de iones
modelo Esquire 2000TM (Bruker Daltonik GmhG, Bremen, Germany), equipado con la interfase
de electrospray (model G1607A de Agilent Technologies, Palo Alto, CA. USA). El contacto
eléctrico con la aguja de la interfase se estableció mediante el líquido adicional (make-up)
usando una jeringa 74900-00-05 Cole Palmer (Vernon Hills, Illinois, USA).
Las condiciones a las que operó el electrospray se describen en la sección de resultados y
discusión.
El instrumento fue controlado por medio de un ordenador con el software Esquire NT de Bruker
Daltonics.
3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 DESARROLLO DEL MÉTODO CE-ESI-MS
Inicialmente, las condiciones electroforéticas se optimizaron en base al siguiente criterio:
comportamiento migratorio de las especies, sensibilidad, tiempo de análisis y forma de pico.
Así, se estudiaron diferentes tipos de disoluciones reguladoras compatibles con la interfase y el
sistema de detección que contenían distintas concentraciones de acetato amónico a altos
valores de pH; las concentraciones de acetato amónico variaron de 10 a 80 mM (en pasos de
10). Intentado mejorar la resolución y los tiempos de análisis, el pH se varió entre 8 y 11 (en
pasos de 0.5) y el modificador orgánico (2-propanol) se estudió en el rango entre 0-15% (en
pasos de 2.5). Finalmente, los parámetros óptimos fueron 60 mM de acetato amónico a pH 9.5
con 5% de 2-propanol. El voltaje varió de 10 a 30 kV, eligiendo 25 kV como valor óptimo. La
inyección se hizo en el extremo anódico usando N2 a una presión de 0.5 p.s.i. durante 10
segundos.
Elegidas estas condiciones de separación, se procedió a la optimización de los parámetros del
electrospray.
Se probaron seis tipos diferentes de líquido adicional. Estos consistían en 2-propanol/agua
50:50 (v/v), 2-propanol/agua 60:40 (v/v) y 2-propanol/agua 80:20 (v/v) añadiendo, y sin añadir,
0.1% de trietilamina. El uso del líquido adicional de composición 2-propanol/agua 60:40 (v/v)
con 0.1% de trietilamina proporcionaba alta estabilidad de corriente y satisfactoria intensidad de
señal en el MS.
A continuación, fueron optimizados el resto de parámetros del electrospray considerando la
altura de la señal como criterio de selección. Estos resultados pueden observarse en la figura
1: Temperatura del gas de secado (Figura 1A), flujo del gas de secado (Figura 1B), presión del
gas nebulizador (Figura 1C), estabilidad de compuestos (Figura 1D) y flujo del líquido adicional
(Figura 1E).
Como puede verse en la figura, una temperatura de 300ºC producía la mejor señal, y el valor
óptimo de la presión del gas nebulizador se obtenía a 5 p.s.i. Como flujo de gas de secado más
recomendable se eligió 5 L/min. Y se fijó como valor más adecuado de flujo de líquido adicional
0.30 mL/h. Este efecto ha sido mencionado en bibliografía en anteriores ocasiones, indicando
que a valores de flujo bajos, el campo de ionización se reduce a causa de la inestabilidad del
electrospray; mientras que a valores de flujo de líquido adicional altos, la gran dilución de las
bandas electroforéticas que emergen del capilar puede resultar excesiva y reducir así la
intensidad de la señal en MS.
Se observó también que la estabilidad de compuesto jugaba un papel importante para el
análisis de los compuestos fenólicos del aceite de oliva. Así, a altos porcentajes de este
parámetro, la señal disminuía debido a que el número de moléculas transferidas al
espectrómetro de masas es pequeño; mientras que usando porcentajes más bajos, la mayor
parte de los compuestos pasaba a ser más estable, hecho que estaba indicado por un aumento
de la señal. Por ese motivo, se eligió un valor de 25 % de estabilidad de compuesto.
3
Bajo estas condiciones, se obtuvieron separaciones electroforéticas de los extractos del aceite
de oliva virgen extra, tales como la que se muestra en la figura 2. La reproducibilidad del
método expresada como RSD% (desviación estándar relativa) de cinco inyecciones
consecutivas fue 1.26% para el tiempo de retención y 4.98% para el área de pico.
3.2 CARACTERIZACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS DEL ACEITE DE OLIVA
CON CE-ESI-MS
Basándonos en los datos obtenidos por espectrometría de masas, el orden de elución, los
datos recogidos en bibliografía y ciertos estándares obtenidos por HPLC, se llevó a cabo la
identificación de los compuestos fenólicos mayoritarios en aceite de oliva.
En la figura 3 se pueden observar los electroferogramas (extracted ion electropherograms) de
los compuestos identificados en un aceite de oliva virgen extra de la variedad Picual.
Entre los fenoles simples, resultaron ser mayoritarios en este tipo de aceite el hidroxitirosol y el
tirosol. El hidroxitirosol acetato, que ya ha sido anteriormente descrito en variedades españolas
[13]
, también ha sido identificado usando este método.
Como ha sido expuesto en varios artículos, el (+)-1-acetoxipinoresinol está presente en una
pequeña cantidad en esta variedad; de hecho, en algunas ocasiones este hecho ha sido
utilizado para autentificar aceite de oliva que procedía de aceitunas de variedad Picual [25]. El
(+)-pinoresinol fue hallado también en los aceites analizados procedentes de esta variedad. De
acuerdo con Owen y col. [26] estos compuestos, los lignanos, son los principales componentes
de la fracción fenólica de la semilla de la aceituna, estando prácticamente ausentes en la pulpa,
hojas y ramas; como consecuencia de ello, su presencia en aceite debe ser debida a la ruptura
de las pepitas cuando las aceitunas son molturadas.
Es interesante estudiar en profundidad las formas isoméricas de los secoiridoides. El posible
mecanismo que explica la formación de derivados de los secoiridoides tiene su punto de
partida en la oleuropeína o el ligustrósido, continuando con la actuación de la β-glucosidasa y
después de la metilesterasa. Dicho mecanismo ha sido explicado por varios autores [27]. La
oleuropeína está presente en los aceites como aglicona debido a la acción de las enzimas
hidrolíticas que intervienen durante la preparación de un aceite. Esta hidrólisis causa también la
modificación parcial de la aglicona debido al equilibrio de la tautomería ceto-enólica que
provoca la apertura del anillo de los secoiridoides.
Si observamos el ión extraído correspondiente a la oleuropeína aglicona (m/z 377.1), vemos 2
picos; uno de ellos corresponderá a la forma monoaldehídica de la Ol Agl, y el otro
corresponderá a la forma dialdehídica de la misma. En los casos en los que hemos encontrado
dos picos con el mismo espectro de masas, suponemos que el primer pico (el pico con menor
tiempo de retención) puede corresponder a la forma dialdehídica y el segundo, a la forma
aldehídica (estructura con el anillo cerrado). Así, en el caso de derivados de la oleuropeína
(que poseen en su estructura un fragmento de hidroxitirosol) estos dos picos poseen tiempos
de migración más distantes; este hecho puede ser explicado considerando la doble carga
negativa que al pH de trabajo aparece en el fragmento de hidroxitirosol de esta molécula.
La dualidad de picos con el mismo espectro de masas se observa, de igual modo, en el ión
extraído correspondiente al Ligustrósido aglicona (m/z 361.1).
Cuando se estudian las formas descarboxiladas de estos compuestos, dos picos aparecen en
cada ocasión. De nuevo, se pueden atribuir a las formas monoaldehídica y a la dialdehídica.
Como se ha mencionado superficialmente antes, varios autores han observado este fenómeno
empleando técnicas cromatográficas; por ejemplo, Angerosa y col. [8] comprobaron que aunque
en sus cromatogramas (obtenidos usando GC-MS) había un pico correspondiente a la forma
silanizada de la forma descarboxilada del ligustrósido aglicona, otros tres picos aparecían junto
a él y todos ellos tenían el mismo espectro de masas. Su conclusión fue que, probablemente,
dos de ellos poseen una estructura con anillo cerrado, y las otras dos son las formas enólicas
silanizadas que provienen de las formas mono o dialdehídicas de la parte elenólica del
ligustrósido aglicona descarboxilado.
4
Caruso y col. [28], de igual manera, observaron que en el cromatograma correspondiente al ión
m/z 377 (Ol Agl) estaban presentes 4 picos. Hay que tener también en cuenta cuando
hablamos de este fenómeno, otras investigaciones de notable relevancia [29,30,31].
CONCLUSIONES
Este trabajo recoge un estudio cualitativo de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen
extra de la variedad Picual empleando la técnica de electroforesis capilar acoplada a un
detector de espectrometría de masas por medio de una interfase de electrospray.
Los compuestos fueron identificados usando el peso molecular y la información estructural
proveniente del espectrómetro de masas, así como algunos patrones obtenidos con HPLCsemipreparativa.
Para extraer tanto los alcoholes fenólicos, como los lignanos y los derivados de secoiridoides
se empleó una extracción en fase sólida con cartuchos Diol.
Esta es la primera vez que las formas isoméricas de los derivados de los secoiridoides
presentes en el aceite de oliva se estudian empleando este técnica.
5
Figura 1. Optimización de los parámetros relativos a la interfase del espectrométro de masas
(Electrospray).
(A)
7000000
Intensidad MS
6000000
5000000
4000000
3000000
2000000
1000000
0
150
200
250
300
350
(B)
Temperatura (ºC)
80000000
Intensidad MS
75000000
(C)
70000000
65000000
60000000
55000000
18000000
50000000
16000000
45000000
Intensidad MS
14000000
0
12000000
2
4
6
8
10
Flujo gas de secado (L/min)
10000000
8000000
6000000
4000000
2000000
0
1
2
3
4
5
6
7
(D)
8
Presión gas nebulizador (psi)
88600000
88400000
Intensidad MS
88200000
88000000
87800000
87600000
87400000
87200000
87000000
(E)
86800000
0
90000000
70000000
Intensidad MS
40
60
80
Estabilidad de compuesto (%)
80000000
60000000
50000000
40000000
30000000
20000000
10000000
0
0.18
20
0.23
0.28
0.33
0.38
Flujo líquido adicional (mL/h)
6
100
120
Figura 2. Electroferograma CE-ESI-MS de un extracto de aceite de oliva virgen extra variedad
Picual.
7
Figura 3. Electroferogramas de iones extraídos pertenecientes a los distintos compuestos
fenólicos hallados en el aceite de oliva virgen extra de la variedad Picual.
Forma descarboxilada-Lig Agl
m/z 302.1
Lig Agl
m/z 361.1
m/z 136.8
m/z 194.9
TY
HYTY
Ac ma descarboxilada-Ol Agl
For
m/z 318.1
Pin
m/z 357.1
m/z 152.9
HYTY
Ac Pin
m/z 415.1
Ol Agl
m/z 377.1
10-H-Ol Agl
m/z 393.1
Ácido Elenólico
m/z 239.9
1
C. Vázquez Roncero, L. Janer del Valle, C. Janer del Valle, Grasas Aceites, 27 (1978) 185-191.
G. F. Montedoro, G. Servilli, Atti della Academia Nazionale dei Georgofili, Firenze, 1989, 337-354.
3
R. W. Owen, A. Giacosa, W. E. Hull, R. Haubner, B. Spiegelhalder, H. Bartsch. European Journal of
Cancer 36 (2000) 1235-1247.
4
F. Visioli, G. Bellomo, C. Galli. Biochemical and Biophysical Research Communications 247 (1998) 6064.
5
F. Gutiérrez-Rosales, J. J. Ríos, M. Gómez-Rey. J. Agric. Food Chem. 51 (2003) 6021-6025.
6
P. Andrewes, J. L. H. C. Busch, T. Joode, A. Groenewegen, H. Alexandre. J. Agric. Food Chem. 51
(2003) 1415-1420.
7
V. L. Singleton, J. A. Rossi. Am. J. Enol. Viticult. 16 (1965) 144-158.
8
F. Angerosa, N. D`Alessandro, F. Corana, G. Mellerio. J. Chromatogr. A 736 (1996) 195-203.
9
Solinas, A. Cichelli. Riv. Soc. Ital. Sci. Aliment. 11 (1982) 223-230.
10
N. Cortesi, E. Fedeli. Riv. Ital. Sostanze Grasse, 60 (1983) 341-351.
11
G. F. Montedoro, G. Servili, . Baldioli, E. Miniati. J. Agric. Food Chem. 40 (1992) 1571-1576.
12
A. Bendini, M. Bonoli, L. Cerretani, B. Biguzzi, G. Lercker, T. Gallina Toschi. J. Chromatogr. A 985
(2003) 425-433.
13
M. Brenes, A. García, P. García, J. J. Ríos, A. Garrido. J. Agric. Food Chem. 47 (1999) 3535-3540.
2
8
14
P. Schmitt-Kopplin, M. Frommberger, Electrophoresis 24 (2003) 3837.
A. brocke, G. Nicholson, E. Bayer, Electrophoresis 22 (2001) 1251.
16
A. Macià, F. Borrull, M. calull, C. Aguilar, Electrophoresis 25 (2004) 3441.
17
R.D. Smith, H.R. Udseth, Progress in Pharmaceutical and Biomedical Applications of Capillary
Electrophoresis, C.R. Riky, A.F. Fels (Eds.), Elsevier Science, Oxford 1996, p. 229.
18
F. Lafont, M. A. Aramendia, I. García, V. Borau, C. Jiménez, J. M. Marinas, F. J. Urbano, Rapid
Commun. Mass Spectrom. 13 (1999) 562-567.
19
F. Priego-Capote, J. Ruiz-Jiménez, M. D. Luque de Castro, J. Chromatogr. A. 1045 (2004) 239-246.
20
A. Carrasco Pancorbo, C. Cruces-Blanco, A. Segura Carretero, A. Fernández Gutiérrez, J. Agric. Food.
Chem. 52 (2004) 6687-6693.
21
F. Buiarelli, S. Di Berardino, F. Coccioli, R. Jasionowska, M. V. Russo, Annali di Chimica 94 (2004) 699705.
22
M. Bonoli, M. Montanucci, T. Gallina Toschi, G. Lercker, J. Chromatogr. A. 1011 (2003) 163-172.
23
M. Bonoli, A. Bendini, L. Cerretani, G. Lercker, T. Gallina Toschi, J. Agric. Food Chem. 52 (2004) 70267032.
24
A. Carrasco Pancorbo, A. Segura Carretero, A. Fernández Gutiérrez, J. Sep. Sci. (2005) (in press).
25
M. Brenes, A. García, J. J. Ríos, P. García, A. Garrido. Intern. J. Food Sci. Technol. 37 (2002) 615-625.
26
R. W. Owen, W. Mier, A. Giacosa, W. E. Hull, B. Spiegelhalder, H. Bartsch. Clin. Chem. 46 (2000) 976988.
27
M. Servili, R. Selvaggini, S. Esposto, A. Taticchi, G. Montedoro, G. Morozzi. J. Chromatogr. A. 1054
(2004) 113-127.
28
D. Caruso, R. Colombo, R. Patelli, F. Giavarini, G. Galli. J. Agric. Food. Chem. 48 (2000) 1182-1185.
29
J. R. Morelló, M. J. Motilva, M. J. Tovar, M. P. Romero. Food Chem. 85 (2004) 357-364.
30
S. M. Monti, A. Ritieni, R. Sacchi, K. Skog, E. Borgen, V. Fogliano. J. Agric. Food. Chem. 49 (2001)
3969-3975.
31
G. Montedoro, M. Servili, M. Baldioli, R. Selvaggini, E. Miniati, A. Macchioni. J. Agric. Food. Chem. 41
(1993) 2228-2234.
15
9