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Respuestas esperadas
Problema 1.
a) i. Falso. Es en el TP de extracción de ADN cromosómico que se realiza una lisis suave, con
sacarosa, lisozima y tritón para no dañar el ADN cromosómico, mientras que en el TP de
extracción de ADN plasmídico se utiliza SDS y NaOH, produciendo una lisis brusca que no
afecta al ADN plasmídico.
ii. Falso. Las sales son solubles en etanol 70% mientras que el ADN no, razón por la cual el ADN
permanece insoluble (precipita), mientras que la mayoría de las sales son “lavadas” al ser
disueltas en el etanol 70%.
b) TAE 50X: Tengo que pesar 242 g de Tris, agregar 100 mL de EDTA 0.5M y llevar a 1 l con
agua destilada y mezclar.
Agarosa 0.8%: Necesito 0.8 gramos de agarosa cada 100 mL de solución en TAE 1X, para 200
mL entonces voy a pesar 1.6 gramos de agarosa y agregar TAE 1X hasta 200 mL, luego caliento
en microondas hasta disolver la agarosa completamente.
c) ET= UFC/µg ADN => 2x105=UFCx5/5x10-3µg. => UFC=200 (El número de colonias
obtenidas se multiplica por 5 dado que se sembró la quinta parte de las bacterias transformadas y
se divide por la cantidad total de ADN (5 µL, a razón de 1 ng/ µL, son 5x10-3µg).
d) Las bacterias incubadas en ausencia de IPTG no producen globolina por tener el represor
pegado al operador (en ausencia de inductor, control negativo). En presencia de IPTG (inductor
gratuito), tenemos inducción del sistema: el IPTG se une al represor y éste deja de unirse al
operador, mientras que CAP unido a AMPc estimula la transcripción de la globolina (control
positivo), lo cual genera fluorescencia y actividad de la misma.
Para mostrar que se trata de un fenómeno de inducción se debe repetir la incubación bacteriana en
presencia de IPTG y un inhibidor de la traducción como Cloranfenicol, lo cual impediría la
síntesis de novo y la visualización de fluorescencia y actividad de globolina (en un fenómeno de
activación enzimática, en cambio, la presencia de globolina no se vería afectada por el
Cloranfenicol). Alternativamente, en el caso de bacterias incubadas sin IPTG, se puede agregar
IPTG al lisado bacteriano y corroborar que seguiríamos observando ausencia de globolina (en
cambio, en un fenómeno de activación enzimática, el solo agregado del activador al lisado sería
suficiente para ver presencia de globolina). Se tomará como válida cualquiera de las dos
respuestas.
e) A pH 5 observamos fluorescencia cian pero no verde y no observamos actividad de globolina.
Evidentemente el cambio conformacional de la proteína debido al pH, es capaz de afectar el sitio
activo y la emisión de fluorescencia verde pero no la cian. A pH 8, también se encuentra afectada
la actividad de globolina pero el cambio conformacional es perjudicial para la fluorescencia cian.
A 0ºC se pierde actividad enzimática por disminución de la energía cinética de las moléculas y
baja en el número de choques entre sustrato y enzima pero al no afectarse la conformación, la
molécula sigue dando fluorescencia cian y verde. A 90ºC, la enzima pierde su conformación de
tal modo que no puede fluorescer ni tener actividad enzimática. Para evaluar la naturaleza
química de la enzima se debe realizar un pretratamiento con Proteinasa K (o alguna proteasa),
RNasa, medir la actividad residual y ver cuál de ellas o si ambas afectan la actividad de la enzima
f) El TAE 1X debe tener pH neutro (en realidad 8, para ser preciso). Entonces, de ninguna manera
debería haber solo fluorescencia cian (pH 5). Debería haber fluorescencia verde y cian (pH 7, si
dicen que el pH del TAE debe ser neutro) o solo verde (si recuerdan que es precisamente pH 8).
No se debería utilizar este TAE 1X.
Se puede evaluar ambas fluorescencias (o una relación o cociente entre ellas) como sensor de pH
en el rango de 5 a 9.
1 Problema 2
a) La función del isopropanol es disminuír la polaridad del medio. De esta manera, la disminución
de la polaridad y la presencia de cationes provistos por una sal, en este caso, K+ de la solución 3,
determinan conjuntamente la precipitación de los ácidos nucleicos. Pueden reemplazar el
isopropanol con etanol absoluto, pero deben utilizar más cantidad porque si bien el etanol es
menos polar que el agua, es más polar que el isopropanol.
Ninguna de las otras opciones puede reemplazarlo ya que el buffer TAE es una solución acuosa
polar por lo que el plásmido seguiría en solución. Por otra parte, el fenol es un solvente no polar
que no se mezclaría con la solución acuosa, sino que se formarían dos fases y el ADN seguiría
quedando en solución en la fase acuosa.
b) M es la calle 6. La banda que más migra corresponde al fragmento de 1 kpb y la que menos
migra, más cerca del origen de siembra, es el fragmento de 10 kpb, ya que las moléculas migran
de manera inversamente proporcional al logaritmo de su tamaño.
1: C (dos cortes que generan un fragmento de 7 kpb y otro de 1 kpb)
2: D (dos cortes que generan dos fragmentos distintos, pero del mismo tamaño, 4 kpb, que se
observan como una única banda)
3: A (único corte: banda correspondiente al plásmido en su forma lineal, fragmento de 8 kpb)
4: E (plásmido sin digerir: se observan los tres topoisómeros: círculo abierto (OC), generado por
ruptura de una de las hebras por lo que se liberan las tensiones que producen el
superenrollamiento, es la forma más retrasada; forma lineal (L), generada por ruptura de ambas
hebras, única conformación que migra de acuerdo a su peso molecular, comparable con el
marcador, coincide con el fragmento de 8 kpb y con el fragmento obtenido por digestión con
EcoRI y finalmente, la forma superenrollado (CCC), es la que posee mayor movilidad y es
mayoritaria, por lo tanto más intensa).
5: B (dos cortes que generan dos fragmentos, uno de 5 kpb y otro de 3 Kbp).
c) F: 3 fragmentos: 4, 3 y 1 kpb
G: Es probable que se obtenga un patrón de digestión parcial porque 15 minutos puede ser un
tiempo insuficiente para que se corten todas las moléculas de plásmido. En este caso se observaría
un incremento de la intensidad de la banda correspondiente al fragmento lineal y disminución de
la forma superenrollada. Seguramente deja de detectarse la forma de círculo abierto por ser tan
pocas moléculas y muchas de ellas habrán sido digeridas en este proceso.
H: En este caso es probable que se obtenga un patrón similar al del caso anterior, pero por un
motivo distinto. Una menor temperatura de incubación durante la digestión enzimática puede ser
la causa de menor probabilidad de encuentro enzima sustrato.
I: Dado que EcoRI es de naturaleza proteica, si fue previamente tratada con proteinasa K por 1
hora a 37°C, es probable que no hayan quedado moléculas de EcoRI funcionales, por lo tanto se
obtendría un patrón igual al del plásmido sin digerir.
d) El fragmento pequeño en la calle 1 se observa más tenue que el más grande, porque si bien se
producen iguales cantidades molares de cada uno de ellos por cada corte, las moléculas más
largas pegan más cantidad de moléculas de Bromuro de etidio. La intensidad de la banda es
directamente proporcional a la masa de ácido nucléico en cada banda, lo cual tiene en cuenta tanto
el número de moléculas como su longitud.
e) Si el gel de agarosa fuese 2% en lugar de 0.8%, las bandas de ADN de mayor peso molecular o
longitud no se hubiesen separado bien, ya que es un gel más concentrado, por lo que su trama es
más compacta y permite resolver fragmentos de menor tamaño.
f) - Si no hubiese agregado RNAsa a la preparación plasmídica, el plásmido estaría contaminado
con RNA de las bacterias, parcialmente degradado durante la preparación. Este se vería como un
2 chorreado intenso en la parte inferior del gel, dado que son muchos fragmentos de diferentes
tamaños y pequeños, producto de la degradación parcial por RNasas contaminantes, presentes
durante la extracción.
- Si no hubiese mezclado las muestras con buffer de siembra, éstas hubiesen difundido durante la
siembra porque este buffer tiene glicerol, que aumenta la densidad de las muestras para que se
vayan al fondo del pocillo al sembrarlas. Además, tiene uno o más colorantes que permiten
visualizar la muestra mientras se siembra y monitorear el transcurso de la corrida, ya que son
moléculas cargadas negativamente que migran en el mismo sentido que el ADN y son coloreadas.
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