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15/07/2015
Experiencias de estudios de campo en
cisticercosis del LRNZP
Blgo. Eduardo Renato Ayala Sulca
HOMOLOGADO por Min.Educ.-España
Dr(c) – Mg(c) BIOTECNOLOGÍA
Laboratorio Ref. Nac. de Zoonosis Parasitaria
DEET-CNSP/INS
E-mail: [email protected]
[email protected]
[email protected]
INTRODUCCIÓN
♦ La teniosis/cisticercosis: zoonosis producida por T. solium, es una
parasitosis que afecta principalmente a personas pobres del mundo,
pertenece al grupo de enfermedades desatendidas u olvidadas, pero
son erradicables, considerado un problema de gran impacto en la
salud pública con pérdidas económicas.
♦ La neurocisticercosis (NCC) es “la enfermedad neurológica más
importante causada por parásitos en humanos” (OMS).
♦ En Perú esta zoonosis es endémica, cuya prevalencia oscila entre
0.72-12%(hospitales de Lima) y 8%(Selva-Tarapoto).
INTRODUCCION
Ciclo biológico
Hombre-Porcino
Porcino-Hombre
Puerta de entrada:
Vía oral x huevo T.sol.
Diseminación:
Vía sanguínea x cist.
Localización:
1.- SNC
2.- Ojo
3.- Tejido subcutáneo
(pocos casos Sud A.)
4.- Músculo
5.- Otros
INTRODUCCIÓN
♦ En la Red de Labs. del INS, el diagnóstico de cisticercosis por IB no
se realiza por el costo elevado y no estar implementado el programa
de vigilancia y control por el MINSA.
♦ En nuestro país a la fecha no se ha reportado el rango de los valores
de la [Prot] antigénica LVC.T.solium, los cuales sirvan como
referencia a los investigadores.
♦ MINSA no cuentan con Kit de Dx. cisticercosis humana. El Lab.
R.N.Zoon.Paras.-INS produce kit in house con Ag.nativo Total
LVC.T.solium
RECOLECCIÓN DE LÍQUIDO VESICULAR DE
CISTICERCO (LVC)
1.- Coordinaciones con autoridades
2.- Recolección de material biológico (LVC) de zonas endémicas
3.- Procesamiento de LVC en LRN.ZP-INS, mediante Lowry para [prot],
y preparación de Ag. nativo T.
4.- Determinar la curva estándar de seroalbúminabobina (BSA) y LVC
5.- Realizar corrida electroforética Ag. nativo T. para perfil protéico
6.- Preparar Tiras reactivas IB - kit Ag.nativo Total LVC.T.sol.
7.- La [prot] Ag.nativo Total (LVC.T.sol.) es 1µg/µL. para
inmunodiagnóstico (prueba de ELISA o de Inmunoblot).
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RECOLECCIÓN DE LÍQUIDO VESICULAR DE
CISTICERCO (LVC)
1.- Coordinaciones con autoridades :
LRR, DIRESA, Municipio, Camal municipal o particular, la
Universidad, autoridades locales y comunales.
2.- Recolección de material biológico (LVC) de zonas endémicas:
Obtención de Ag.nativo-Total y producir el kit in house.
Junín; Huánuco; Cajamarca; Ayacucho; Ucayali; Abancay;
Cusco
Cortesía CDC
FLUJOGRAMA
San Juan de Occollo, cerca a Andahuaylas, Peru 1998
CISTICERCOSIS: PREPARACIÓN DE ANTÍGENO
Musculatura naturalmente infectado de porcino
Extracción de cisticercos
Obtención del LVC
(Aspirar con jeringa tuberculina
Centrif.refrig. a 40000 g x 60 mins.
Cortesía CDC
CERDO: Coprofagia
Cisticercos en tejidos de cerdo
infectado naturalmente
En lengua
En corazón
En músculo
En costillar
En cerebro
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Obtención del LVC
OBTENCIÓN DEL LVC
Disección de musculatura de cerdos provenientes de zonas endémicas:
Huancayo, Huánuco, Ayacucho, Ucayali. Participaron Lab.Ref.Reg. y
Lab.Ref.Nac.Zoon.Paras.-INS (LRNZP-INS)
♦ LVC.T.sol. (traslúcido), principal fuente antigénica para preparar
kits in house de inmunodiagnóstico, en zonas de alta endemicidad.
♦ Los kits son utilizados en el diagnóstico de la cisticercosis humana.
larva o cisticerco de T.solium. C: canal espiral, Ex: escólex,
P: pared vestibular, Pv: pared vesicular y V: espacio vestibular.
PROCEDIMIENTO
RECOLECCIÓN DE LÍQUIDO VESICULAR DE
CISTICERCO (LVC)
* Recolectar el fluido vesicular de cisticerco (LVC) T.sol.
* LVC centrifugar a 40,000 rpm. a 4°C x 60’
* Sobrenadante conservar a - 20°C.
3.- Procesamiento de LVC en LRN.ZP-INS, mediante Lowry para
determinar [prot.] antigénica del LVC.T.solium, procedente de
cerdos naturalmente parasitados de zonas endémicas del Perú y
preparar Ag. nativo T.
* Determinar [proteica] antigénica x Lowry
(1) Corrida electroforética Perfil proteico, SDS-PAGE
15% (160 V x aprox.70’)
(2) Corrida electroforetica Transferencia a membrana
nitrocelulosa (55 V x 1 hr.)
4.- Determinar la curva estándar de seroalbúminabobina(BSA) y
LVC.
PROCESAMIENTO DEL LVC
* Rx. Inmunoenzimática Pool de sueros (+) y (-)
1.
2.
MÉTODO LOWRY
Procedimiento
Obtención de la curva estándar y determinación de la concentración de proteína de la muestra problema.
Rotular 6 tubos para las diluciones de acuerdo a los cuadros siguientes:
A.
Para la curva estándar (todos los volúmenes se dan en µl.)
Blanco
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
BSA(1mg/
ml
0
32
64
160
320
640
H20 bid
1000
968
936
840
680
360
React.
B.alcalino
1000
1000
1000
1000
1000
1000
R.de Cu
400
400
400
400
400
400
Reposar x
10
Minut.
Folin (1:4)
800
800
800
800
800
800
Dejar
Reposar
10
Minutos,
agitar en
el vórtex
y leer a
700nm
.
Para las muestras (todos los volúmenes se dan en µl)
B.
Muestra 1
Muestra 2
Muestra
20
20
H20 bid
980
980
Reactivo
B.alcalino
1000
1000
R.de Cu
400
400
Reposar 10 minuto
Folin (1:4)
800
800
Dejar reposar por 10 minutos, vortexear y leer a 700nm.
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RESULTADOS
RESULTADOS
Tabla N° 1: DATOS PARA LA CURVA ESTANDAR DE ALBUMINA
MÉTODO: LOWRY
Gráfico N° 1: Curva Estándar BSA
Absorvancia (DO)
µg experimental
BSA µg
r1
r1-b
r2
r2-b
10
0,392
0,089
0,412
0,109
0,099
3,619
20
0,504
0,201
0,484
0,181
0,191
17,285
50
0,761
0,458
0,75
0,447
0,452
56,128
100
1,125
0,822
1,115
0,812
0,817
110,271
200
1,65
1,347
1,7
1,397
1,372
192,711
Promedio
RESULTADOS
b (blanco)= 0.3035
Curva estandar ploteada: Absorvancia ó DO vs. Masa de proteínas ó [prot]
en µg. El factor de calibración R es 0,9899 y está en el rango de aceptable
PRUEBA DE ELISA
RESULTADOS
Tabla N° 4: CUANTIFICACIÓN PROTEICA DEL ANTÍGENO DE CISTICERCO DE
Taenia solium (LVC. T.solium)
Método : Lowry
Concentración protéica del Antígeno de Cisticerco
por el método Lowry
Antígenos
HCO
UCAY
HCYO.L
AYAC
HCYO.M
Procedencia
Vol. utilizado en
la reacción en µL
protéica en µg/µL
Huanuco
Ucayali
Huancayo (lengua)
Ayacucho-Huanta
Huancayo (músculo)
20
20
20
20
20
Concentración
0,937
0,806
0,520
0,782
3,596
RECOLECCIÓN DE LÍQUIDO VESICULAR DE
CISTICERCO (LVC)
PERFIL PROTEICO Ag.T.LVC.T.solium
5.- Realizar corrida electroforética Ag. nativo T. para perfil protéico
6.- Preparar Tiras reactivas IB - kit Ag.nativo Total LVC.T.sol.
7.- La [prot] Ag.nativo Total (LVC.T.sol.) es 1µg/µL. para
inmunodiagnóstico (prueba de ELISA o de Inmunoblot).
Electroforesis del Ag.T.LVC.T.sol. en Gel de Poliacrilamida
con bandas diagnósticas (13 a 97 Kda)
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PRUEBA DE INMUNOBLOT
LECTURA DE RESULTADOS
Dx. Cist. humana IB (+) con LVC-T.solium,
condicionadas al reconocimiento de 1 ó más
bandas (50-13 kDa),
42, 35, 31, 24, 23, 18, 17, 14 y 13 kDa.
Electroforesis del Ag. en Gel de Poliacrilamida con
bandas diagnósticas (13 a 35 Kda) para Transferencia
Fig.1. La mejor resolución para el Ag.LV.T.solium Huancayo (HCYO.M) total
es 1.15 µg/mm, para el antígeno total Ayacucho (AYAC) es 0.82 µg/mm y para
el antígeno HCYO.L es 0.62µg/mm.
LECTURA DE IB
Encuesta de pacientes neurológicos
para la cisticercosis (EITB)
Ubicación del Hospital
% positivos
Beijing, Rep.Pop.China (convulsiones)
44
198
Beijing, Rep.Pop.China(todo Adm.neurol. 8
500
Bombay,
32
India (convulsión +?)
21
34
11
271
19
578
Ruanda (epilepsia)
Mexico
Peru
(epilepsia)
(epileptic)
PROGRAMA PARA CISTICERCOSIS
campo-laboratorio integrado y sistemático
- producir tests eficaces
- Desarrollar una gestión eficaz del paciente
- determinar la prevalencia
- desarrollar fármacos eficaces
- desarrollo eficaz y sostenible
- prevención / estrategia de control
- desarrollar vacuna para cerdos
- desarrollar una asociación local para los programas de
control
Mexico
- objetivo final = eliminación / erradicación
(epileptic)
Encuesta total
107
OBSERVASIÓN:
•
La concentración proteica del material antigénico o Ag.T. va
depender de muchos factores: el LVC no debe contener líquido
intersticial ni restos de tejido, el LV debe ser incoloro, se debe
tener en cuenta la cadena de frío, se debe observar la asepsia.
•
Realizar estudios de tipo genético de la cisticercosis de cerdos
parasitados naturalmente.
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GRACIAS
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