1. No category

Propagación in vitro de cactáceas amenazadas y/o en peligro de extinción del
estado de Coahuila
(1)
Ana Laura López Escamilla , Laura Patricia Olguín Santos(2), Judith Márquez Guzmán
Salvador Arias Montes (3), Joel Meza Rangel (4)
(2)
,
(1)
Laboratorio de Morfofisiología Vegetal. Centro de Investigaciones Biológicas. Universidad
Autónoma del Estado de Hidalgo, l [email protected]
(2)
Laboratorio del Desarrollo en Plantas. Facultad de Ciencias, UNAM, [email protected]
jm [email protected]
(3)
Jardín Botánico – Instituto de Biología UNAM. [email protected]
(4)
Centro de Investigaciones Forestales Instituto de Ciencias Agropecuarias, Universidad Autónoma
del Estado de Hidalgo. [email protected]
Resumen
Se ha logrado el establecimiento in vitro de semillas de diferentes especies de
cactáceas procedentes del estado de Coahuila. Para llevar a cabo los ensayos de
propagación se utilizaron explantes laterales, longitudinales y apicales de las
plántulas germinadas in vitro. Las especies empleadas pertenecen a los géneros de
Astrophytum, Epithelantha, Thelocactus y Mammillaria, las cuales se encuentran en
alguna categoría de riesgo según la NOM-059-ECOL-2001. Se exploró un barrido
hormonal para promover la formación de brotes adventicios empleando medio
Murashige y Skoog (MS) adicionado en un rango de 0 a 3 mg/l de Benc iladenina
(BA) o Kinetina (K) solo o en combinación con 0, 0.5, 0.1 y 1 mg/l de Acido
naftalénacético (ANA) o 2,4-diclorofenoxiacétic o (2,4-D).
Cada especie presentó diferentes porcentajes de germinación y el tipo de explante
mostró su capacidad y velocidad para la proliferación de brotes que está en función
de la combinación hormonal a la que es expuesto. El género Astrophytum a bajas
concentraciones de la auxina promovió la formación de callo y altas concentraciones
de citocininas brotes por organogénesis directa, en cambio en Thelocactus bicolor la
presencia de bajas concentraciones de auxinas son las que promueven la formación
de brotes, en el caso de Mammmillaria coahuilensis bajas concentraciones de la
citocinina en el explante apical es el que resulta más favorable. Actualmente se
están llevando los ensayos correspondientes para definir la combinación hormonal
más eficiente para Epithelantha micromeris y Thelocactus rinconensis .
Palabras clave
Cactáceas , micropropagación, cultivo de tejidos vegetales, especies en peligro de
extinción, Astrophytum, Thelocactus, Epithelantha, Mammillaria
1
Summary
The establishment in vitro of seeds of different species from cactaceous coming
from the state of Coahuila has been obtained. In order to carry out the propagation
tests they were used like source of lateral, longitudinal and apical explants of
seedlings germinated in vitro. Species belong to the genera Astrophytum,
Epithelantha, Thelocactus and Mammillaria, which are in some category of risk
according to the NOM-059-ECOL-2001, were used. A hormonal explored was done
to promote the formation of adventitious buds using Murashige and Skoog (MS)
medium added in a rank from 0 to 3 mg/l of Benc yladenin (BA) or Kinetin (K) alone or
in combination with 0, 0,5, 0,1 and 1 mg/l of naphtaleneacetic acid (NAA) or 2,4dichlorophenoxiac etic (2,4 -D). Each species demonstrated different percentage of
germination and different types of response of each explants to the hormonal
treatment that it was exposed. In Astrophytum low concentrations of auxins stimulate
formation of callus and high concentrations of citocinin promote the development of
adventitious buds by direct organogenesis, however for Thelocactus bicolor the
presence of low concentrations of auxin promote the formation of buds, in the case of
Mammmillaria coahuilensis low concentrations of the citocinin in combination with
apical explant is the most favourable. At this moment in Epithelantha micromeris and
Thelocactus rinconensis we are testing the best hormonal concentrations to promote
the formation of adventitious buds.
2
Introducción:
El Desierto Chihuahuense está conformado por varios estados de la República
Mexicana: Chihuahua, Coahuila, Nuevo León, Tamaulipas, Durango, Zacatecas, San
Luís Potosí, así como Nuevo México y Texas, por lo que es considerado el desierto
más grande con un área aproximada de 453 mil kilómetros cuadrados (Barbour y
Christensen, 1993).
Desde el punto de vista florístico esta zona es única e importante, debido a su
alto grado de endemismos que al parecer los eventos climáticos del Pleistoceno
jugaron un papel determinante en la conformación de áreas de alta concentración de
especies y en la proliferación de endemismos restringidos (Rzedowski, 1978,
Hernández y Bárcenas, 1995).
En particular el estado de Coahuila está compuesto por 38 municipios, con una
superficie total de 151,578.37 Km 2, ocupa el 7.8 % de la superficie nacional
(Villarreal, 2001).
Parte de la actividad forestal que se realiza en el estado se basa en la
explotación de carácter extractivo de especies no maderables, entre ellos la
“lechuguilla” Agave lechuguilla y la “candelilla” Euphorbia antisyphilitica el primero
como materia prima de fibras y el segundo como fuente de extracción de cera, así
como también el “mezquite” Prosopis sp el cual se comercializa como leña y carbón
(Flores,1992) y aunque no se tienen datos precisos, pero la extracción de cactáceas
ha de ser inminente.
Coahuila es el segundo estado más diverso con 126 sp de cactáceas (Guzmán,
Arias y Dávila, 2003), analizando los datos arrojados en el Listado florístico para el
estado, las cactáceas ocupan el cuarto lugar y dentro de las familias que presentan
mayor diversidad se encuentran los géneros Opuntia, con 30 especies, Coryphantha
y Mammillaria cada una con 25 especies (Villarreal, 2001).
Dentro de las cactáceas que se localizan en el estado de Coahuila se
encuentran miembros de los géneros Ariocarpus, Astrophytum, Coryphanta,
Echinomastus, Escobaria, Ferocactus, Hematocactus, Leuchtenbergia, Mammillaria,
Thelocactus que están catalogadas como especies amenazadas (A), sujetas a
protección especial (Pr) o en peligro de extinción (P) como se indica en la NOM-059ECOL 2001, debido al saqueo ilegal que han sido objeto por su alto valor ornamental
(Tabla 1).
3
Tabla 1. Listado de especies de cactáceas del estado de Coahuila que se encuentran dentro
de la Norma Oficial Mexicana 2001
Familia Cactácea
Genero
Especie
Ariocarpus
Astrophytum
Coryphanta
Echinocactus
Echinocereus
Echinomastus
Escobaria
Ferocactus
Hematocactus
Leuchtenbergia
Mammillaria
Thelocactus
kotschoubeyanus
retusus
trigonus
capricorne
myriostigma
durangensis
poselgeriana
pseudoechinus
ramillosa
sulcata
werdermanii
platyacanthus
delaetii
knippelianus
longisetus
nivosus
intertextus
mariposensis
ungispinus
warnockii
laredoi
hamatacanthus
pilosus
uncinatus
principis
bombycina
candida
carreti
coahuilensis
grusonii
lenta
moelleriana
pennispinosa
plumosa
bicolor
heterochromus
macdowelli
rinconensis
Protección
especial
Pr
Pr
NOM-059-ECOL 2001
Amenazada
En peligro de
extinción
A
A
A
Pr
A
Pr
A
A
P
Pr
A
A
Pr
Pr
A
A
A
Pr
Pr
Pr
Pr
A
A
Pr
A
Pr
Pr
Pr
A
Pr
Pr
A
A
A
A
A
La situación actual de estas especies muestran la imperiosa necesidad de
establecer estrategias de conservación tanto in situ como ex situ (Ford-Lloyd y
Jackson, 1986; Heywood, 1992), por lo que su propagación en Jardines Botánicos
con criterios científicos, así como su propagación desde el punto de vista comercial
4
estableciendo Unidades de Manejo y Aprovechamiento (UMA’s), serían métodos
para su conservación y una alternativa de ingresos para los integrantes de las
comunidades (Hernández y Bárcenas, 1995).
La otra vía propuesta para la conservación de germoplasma valioso es el
empleo de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales que hacen posible el cultivo de
estructuras vegetales asépticamente (in vitro) bajo condiciones nutricionales y
ambientales controladas para generar plantas completas, esta es una alternativa con
un alto potencial para lograr la propagación masiva de especies de interés comercial
y/o económico, la regeneración de nuevos individuos puede llevarse a cabo vía
organogénesis o embriogénesis somática (Attree y Fowke, 1991, Lu et al., 1991).
Con base a estudios experimentales ha sido posible durante los últimos 20 años la
multiplicación in vitro de más de 70 especies de angiospermas y de alrededor de 30
especies de gimnospermas contribuyendo al mismo tiempo a su estudio,
aprovechamiento y conservación (Thorpe et al., 1991).
En los últimos años diversos miembros de la familia Cactaceae han sido
propagados por medio de estas técnicas y se han tenido avances significativos, sin
embargo muchos de estos trabajos se han realizado en países como Alemania,
Estados Unidos, Japón, Inglaterra con especies mexicanas (Kolar et al.,1976; Vyskot
y Jara, 1984; Starling, 1985; Ault y Blackmon, 1987; Johnson y Emino, 1979;
Mauseth, 1979; Simth et al., 1991; Aparecida et al., 1995; Machado y Prioli, 1995;
Giusti et al., 2002), afortunadamente estas técnicas se están aplicando también en
nuestro país (Martínez-Vázquez y Rubluo, 1989; Rodríguez-Garay y Rubluo, 1992;
Arriaga, 1994; Olguín, 1994; Pérez -Molphe et al., 1998; Rosas et al., 2001; CastroGallo, 2002, Dávila -Figueroa et al., 2005). Estos trabajos han demostrado que es
factible su propagación masiva por la vía de la organogénesis directa (brotes
adventicios) y aunque son escasos los trabajos en los que se han obtenido
regenerantes a partir de la embriogénesis somática se ha observado que esta vía es
factible (Stupy y Nagl, 1992; Olguín, 1994; Moebius et al., 2003).
El objetivo de la presente investigación es establecer y desarrollar las técnicas
de micropropagación de por lo menos cinco especies de cactáceas procedentes del
estado de Coahuila para posteriormente ingresar los regenerantes en algún
invernadero de la zona. Las especies seleccionadas estuvieron en función de su
estatus dentro de la Norma Oficial Mexicana y de la disponibilidad de material
biológico que fue posible colectar en campo o ser donado por alguna institución.
5
El desarrollo de las metodologías y los resultados parciales descritos en el
presente escrito forman parte de los trabajos de tesis sobre la propagación de las
siguientes especies Astrophytum myriostigma (Lemaire), Astrophytum capricorne
(Dietrich) Britton & Rose, Ephitelantha micromeris (Engelm.) F.A.C. Weber ex Britton
& Rose, Thelocactus bicolor (Galeotti ex Pfeiff.) Britton & Rose, Thelocactus
rinconensis (Poselg.) Britton & Rose, Mammillaria coahuilensis (Boed.) Moran.
Materiales y Métodos
Colecta de individuos y/o donación de semillas
En campo:
Se realizó la identificación y ubicación en campo en julio de 2004 y Mayo de
2005
de:
capricorne,
Ariocarpus
kotschoubeyanus,
Astrophytum
myriostigma,
Ariocarpus
Echinocereus
fissuratus,
Astrophytum
nivosus,
Mammillaria
coahuilenses, Mammillaria potsii, Thelocactus bicolor, Thelocactus rinconensis
procedentes de diferentes localidades de los Municipios de Saltillo, Arteaga, General
Cepeda, Ramos Arizpe, Cuatro Ciénegas, Parras .
Se llevó a cabo la colecta de organismos vivos unos para su posterior
herborización y otros para ser colocados en macetas y mantenerlos como una
colección viva en condiciones de invernadero. Los organismos se colectaron
completos incluyendo sus raíces, se envolvieron en papel periódico y se guardaron
en bolsas de papel estraza con s us datos de colecta.
Se
colectaron
semillas
de:
Ariocarpus
kotschoubeyanus,
Astrophytum
capricorne, Astrophytum myriostigma, Ephitelantha micromeris, Thelocactus bicolor,
Thelocactus rinconensis, Mammillaria potsii en julio de 2004 y Mayo de 2005; los
frutos y semillas se colectaron con auxilio de unas pinzas de punta fina y se
colocaron en bolsas de papel estraza anotando sus datos de colecta. En algunos
casos los frutos ya se encontraban abiertos y se trató de recuperar las semillas
colectándolas del suelo o de entre las partes de las plantas. Las localidades fueron
posicionadas con auxilio de un geoposicionador.
Donaciones
Se obtuvo la donación de semillas de Astrophytum capricorne colectadas en
mayo del 2004, Mammillaria plumosa colectadas en marzo del 2000, Mammillaria
coahuilenses colectada en junio de 1999 y octubre del 2000, todas ellas
6
provenientes de la colección del Jardín Botánico del Instituto de Biología de la
Universidad Nacional Autónoma de México.
Herborización
Las plantas colectadas se cortaron transversal y longitudinalmente, se
deshidrataron en un tren de alcoholes graduales y se secaron en una estufa a 50°C
por dos o tres días, se montaron y se incorporaron a las colecciones del herbario del
Centro de Investigaciones Biológicas de la UAEH, con sus datos de colecta
correspondientes.
Semillas
Los frutos colectados se abrieron y se extrajeron las semillas, las cuales se
lavaron en pequeñas coladeras o tamices con agua corriente para eliminar el
mucílago, si fuese el caso. Posteriormente s e dejaron secar en papel absorbente, ya
completamente secas se guardaron en sobres de papel encerado, se almacenaron a
temperatura ambiente hasta el momento de ser utilizadas.
Plantas vivas
Las plantas colectadas se colocaron en macetas de diferentes capacidades
con una mezcla de sustrato 1:1 de piedra pómez y materia orgánica previamente
esterilizada, se rotularon con sus datos de colecta y se encuentran actualmente en el
invernadero del Centro de Investigaciones Biológicas de la Universidad Autónoma
del Es tado de Hidalgo.
Cultivo in vitro
Técnicas de desinfección
Astrophytum ornatum, (Ao) Astrophytum capricorne (Ac)
Las semillas se lavaron en 50 ml de agua destilada con tres gotas de jabón
líquido Dawn® durante 20 min., después se pasaron a 50 ml de agua destilada
adicionada con tres gotas de Microdyn® (0.35% de plata coloidal estable) por un
periodo de 30 min, posteriormente se desinfectaron en 50 ml de alcohol al 70% (v/v)
durante 20 min y por último con NaOCl al 30% (v/v, 6% cloro activo) adicionado con
tres gotas de Tween 80/50 ml de agua destilada 30 min. Todo el proceso se realizó
7
en agitación continua. En la campana de flujo laminar se realizaron cuatro enjuagues
con agua destilada esterilizada (1 min c/u)
Thelocactus bicolor (Tb), Thelocactus rinconensis (Tr)
Las semillas se escarificaron en ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado durante 4
min para Thelocactus bicolor y de 1 a 2 min para Thelocactus rinconensis,
posteriormente, se lavaron en una solución de detergente comercial (Dawn®) 3
gotas/50 ml de agua destilada, 20 min, después con una solución bactericida de
Microdyn® 3 gotas/50 ml agua destilada durante 30 min posteriormente fueron
desinfectadas en 50 ml de alcohol al 70%, 2 min y por último, en 50 ml de NaOCl al
30% mas 3 gotas de Tween 80, 30 min. Todo el proceso se llevó a cabo en agitación
continua. En la campana de flujo laminar se realizaron cuatro enjuagues con agua
destilada esterilizada (1 min c/u)
Mammillaria coahuilensis (Mc) Ephitelanta micromeris (Em)
Previo a la desinfección las semillas de Ephitelanta micromeris fueron
escarificadas 15 seg en ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado. Debido al diminuto
tamaño de las semillas de ambos géneros estas se colocaron dentro de un pequeño
paquete de papel filtro y se enjuagaron en 50 ml de agua destilada más 3 gotas de
detergente líquido (Dawn ) durante 20 minutos , posteriormente se desinfectaron con
alcohol al 70% durante 1 minuto y finalmente 30 minutos en NaOCl al 30% (6% cloro
activo) y al 20% para E. micromeris ambos adicionados con 3 gotas de Tween-80/50
ml de agua destilada. Todo el proceso en agitación continua. En la campana de flujo
laminar se realizaron cuatro enjuagues con agua destilada esterilizada (1 min c/u)
Siembra in vitro
Las semillas se germinaron en medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962)
al 50% de sus componentes para Astrophytum capricorne, A. myriostigma,
Ephytelantha micromeris, Thelocactus bicolor, T. rinconensis para Mammillaria
coahuilensis al medio se le agregó 1 g/l de carbón activado. Todos los medios se
ajustaron a pH 5.7-5.8 y se les agregó 8 g/l de agar bacteriológico. Se colocaron 5
semillas por frasco y se incubaron en cámaras de ambiente controlado a 25 ±2 °C,
fotoperiodo 16/8 h e intensidad luminosa de 30 µmol s -1 m -2. La germinación se
evaluó periódicamente para estimar el porcentaje acumulado.
8
Obtención de explantes
Plántulas de entre 4 y 5 meses de edad con un tallo de 0.5 a 1 cm. para M.
coahuilenses y T. bicolor y de 1–1.5 cm. de longitud para, A. myriostigma se les
eliminó la raíz y se disecaron longitudinalmente para el caso de A. capricorne, A.
myriostigma y Thelocactus bicolor (Fig. 1), para Mammillaria coahuilensis y A.
capricorne se obtuvieron explantes apicales y laterales (Fig. 2). En Thelocactus
rinconensis
las plántulas aún no alcanzan la talla requerida para obtener los
explantes
L L
Fig. 1. Disección de plántulas de A. capricorne, Thelocactus bicolor para la obtención de
explantes longitudinales (L). Tomado de Saby Vercamer e t al., 2004.
Figura 2. Tipos de explantes para la propagación in vitro de A. myriostigma, Ephytelantha
micromeris Mammillaria coahuilensis A- apical, L - lateral (Modificado de: Giusti et al ., 2002).
Barrido hormonal
Los distintos tipos de explantes se colocaron en frascos de vidrio de 110 ml de
capacidad conteniendo 30 ml de medio MS adicionado con las diferentes
combinaciones y proporciones de citocininas/auxinas según la especie (Tabla 2),
sacarosa 30 g/l, pH 5.7-5.8, agar 8 g/l.
En cada frasco se colocaron 2 explantes por frasco y se incubaron en cámaras de
ambiente controlado a 25 ±2 °C, fotoperiodo 16/8 h e intensidad luminosa de 30
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µmol s-1 m -2. El número de brotes por explante se registró después de 3 y 4 meses
de incubación.
Especie
Astrophytum capricorne
Astrophytum myriostigma
Ephitelanta micromeris
Mammillaria coahuilensis
Thelocactus bicolor
Citocinina
Auxina
0, 1, 2, 3 mg/l K
0, 1, 2, 3 mg/l BA
0, 1, 2, 3 mg/l K
0, 0.5, 1, 3, 8 mg/l K
0.5, 1 , 2 mg/l BA
0, 1, 2 mg/l BA
0, 0.1 mg/l 2,4-D
0, 0.1 mg/l ANA
0, 0.1 mg/l ANA
0, 0.5, 1 mg/l ANA
Tabla 2. Proporción de citocininas benciladenina, (BA) o Kinetina (K) y auxinas ácido naftalén
acético (ANA) o 2,4-diclorofenoxiacético (2, 4,-D) empleados para promover la proliferación de
brotes adventicios de las diferentes especies de cactáceas.
Resultados y discusión
Material herborizado, colección de semillas y plantas vivas
Como resultado de las visitas realizadas a las localidades visitadas en el estado
de Coahuila se ingresó al herbario del Centro de Investigaciones Biológicas de la
Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo para incrementar la colección, las
siguientes especie s herborizadas: Cylindropuntia kleiniae (DC.) F.M. Kunth in
Backeb. & F.M. Kunth, Cylindropuntia leptocaulis (DC.) F.M. Kunth in Backeb. & F.M.
Kunth, Echinocereus enneacanthus Engelm Grusonia bradtiana (J.M.Cuolt.) Britton
& Rose, Mammillaria pottsii Scheer ex Salm-Dyck, Opuntia engelmanii Slam-Dyck
subespecie lindheimeri (Engelm.) U. Guzmán & Mandujano, Opuntia mycrodasis
(Lem.) Pfeiff. subespecie rufida (Engelm.) U.Guzmán & Mandujano, Thelocactus
bicolor (Galleoti ex Pfeiff ) Britton & Rose, Opuntia macrocentra Engelm. Thelocactus
rinconensis (Poselg.) Britton & Rose sub rinconensis
Así mismo se ha conformado una pequeña colección de semillas de las
siguientes
especies:
Ariocarpus
kotschoubeyanus,
Astrophytum
capricorne,
Astrophytum myriostigma, Ephitelantha micromeris, Thelocactus bicolor colectadas
en julio del 2004 y Thelocacthus rinconensis var nidulans, Mammillaria potsii,
Mammillaria coahuilensis en mayo del 2005. En Ariocarpus kotschoubeyanus el
número de semillas colectadas en campo fue muy escaso entre 4 y 8 semillas.
En condiciones de invernadero se encuentran las siguientes especies:
Ariocarpus kotschoubeyanus , Ephitelantha micromeris , Ferocactus hamatocanthus
Thelocacthus rinconensis var nidulans, Mammillaria coahuilensis, Mammillaria
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chionocephala, Mammillaria potsii de los cuales desarrollaron sus frutos Ephitelantha
micromeris , Mammillaria coahuilensis , Mammillaria chionocephala, Mammillaria
potsii los frutos fueron colectados, limpiados y almacenados en las mismas
condiciones señaladas en la metodología.
Germinación
Los porcentajes de germinación de cada especie variaron en función del número de
semillas que se colocaron en cada ensayo, y también por que no siempre todas las
semillas logran germinar exitosamente. Se consideró y contabilizó como inicio de la
germinación cuando la radícula emergió de la semilla.
En la Tabla 3 se muestran los diferentes porcentajes de geminación obtenidos de las
especies ensayadas.
Especie
Astrophytum capricorne
Astrophytum myriostigma
Ephitelanta micromeris
Mammillaria coahuilensis
Thelocactus bicolor
Thelocactus rinconensis
No de
semillas
No de semillas
germinadas
% de semillas
germinadas
Tiempo en
días que
alcanza la
máxima
germinación
70
60
120
124
90
68
70
55
97
40
84
64
100
91
80
32
96
94
30
9
13
20
15
18
Tabla 3. Número de semillas sembradas in vitro, su proporción en porcentaje y tiempo en el
que alcanzó la máxima germinación.
Es posible observar que los porcentajes de germinación en Astrophytum
capricorne, Astrophytum myriostigma, Ephitelanta micromeris, Thelocactus bicolor,
Thelocactus rinconensis son altos en proporción al número de semillas sembradas y
es bajo (32%) en el caso de Mammillaria conahuilensis.
Esto probablemente esté ligado a la fecha de colecta de las semillas, ya que
para el caso de Mammillaria coahuilensis los ensayos se realizaron en el 2004 con
semillas colectadas en 1999 lo que probablemente se haya reflejado en el bajo
porcentaje de viabilidad.
Son pocos los artículos de cultivo de tejidos que señalan los porcentajes de
germinación de las semillas in vitro, estos datos en algunas ocasiones son
reportados en tesis sobre micropropagación de cac táceas o en resúmenes de
congresos.
11
Olguín en 1994, reportó el porcentaje de germinación in vitro de Ariocarpus
retusus en donde obtuvo el 66% de germinación utilizando medio MS y 63% en
medio MS 50% de sus componentes, ambos alcanzaron su máxima germinación
aproximadamente a los 25 días de incubación, en los ensayos correspondientes se
sembraron un total de 89 semillas en medio MS y 108 semillas en MS 50%.
Los resultados obtenidos nos demuestra que las semillas de cada especie
presentan sus particularidades específicas para iniciar la germinación, debido a que
requieren de condiciones luminosas individuales o pasar por un periodo de
postmaduración, es decir el embrión no se encuentra en su totalidad desarrollado y
requiere de un tiempo para completar su maduración el cual varia dependiendo de
cada especie (Rojas-Aréchiga y Batis, 2001).
Un aspecto importante es su viabilidad (Rojas-Aréchiga y Vázquez -Yanes, 2000
citados por Rojas-Aréchiga y Batis, 2001), señalan que bajo condiciones de
laboratorio se ha demostrado la pérdida de la viabilidad de semillas de cactáceas, la
cual puede ser muy variable entre las especies, en algunas ésta viabilidad puede
mantenerse por más de 5 años y en otras puede decrecer rápidamente durante un
año. Esto podría responder a lo registrado por Flores com. per 2005, donde obtuvo
en Mammillaria coahuilensis el 80% de germinación in vitro de las semillas
colectadas en 1999 que sembró en el mes de mayo del 2004 y posteriormente
realizó siembras puntales los siguientes meses y observó un decremento en la
germinación.
Otros factores que influyen en la germinación son los tiempos de desinfección
que es necesario establecer para cada especie así como las características de la
cubierta seminal debido a que algunas de ellas poseen vistosas y variadas
ornamentaciones en donde se alojan microorganismos que si no son removidos por
el proceso de desinfección se manifestarán en los cultivos in vitro, ambos factores
son importantes de considerar cuando se trata de establecer las semillas en
condiciones asépticas. Una desinfección severa en la concentración y/o tiempo de
alguna de las soluciones puede ocasionar la muerte del embrión, es por ello que se
requiere llevar a cabo pruebas preliminares con pocas semillas para establecer los
tiempos y concentraciones adecuadas para cada
una
de
las
especies,
posteriormente en función de las respuestas obtenidas se realizarán modificaciones
en la desinfección.
12
Otra probable causa por la cual no puedan germinar las semillas es por que
aparentemente presentan algún tipo de latencia como estrategia de adaptación a su
ambiente y
por ello se requiere utilizar métodos mecánicos o químicos para
romperla, como fue en Ephitelantha micromeris , Thelocactus bicolor y Thelocactus
rinconensis que se requirió de H2SO4 concentrado en diferentes tiempos de
exposición 4 min para Thelocactus bicolor y 2 minutos para las semillas de
Thelocactus rinconensis debido que un mayor tiempo ocasionó que se desintegraran
(Díaz com. per 2005).
Este proceso de escarificación fue necesario para estas especies y así dar
paso al proceso de germinación, lo que nos indica que probablemente una
característica de la testa es que no sea permeable, como reportó del Castillo en
1986 para Ferocactus histrix, que en condiciones de laboratorio obtuvo 96% de
germinación, el autor señala que dicho porcentaje se debe a que la testa es
permeable y no requieren las semillas de escarificación, además de que su
capacidad de imbibición es alta como consecuencia del pequeño tamaño de las
semillas, características que le permiten tener ventajas adaptativas en un medio
donde las condiciones de humedad son pocas.
Barrido hormonal y proliferación de brotes
La formac ión de brotes se presentó por organogénesis directa a partir de las
areolas principalmente para Astrophytum capricorne, Astrophytum myriostigma y
Thelocactus bicolor, para Mammillaria coahuilensis el desarrollo de los brotes se
manifestó por organogénesis indirecta en los explantes laterales y de manera directa
en los explantes apicales; en todos los tipos de explantes se observó un incremento
en su volumen y en la zona del corte se generó un callo como respuesta
probablemente a la herida provocada por la disección, lo que concuerda con lo
reportado por Pérez -Molphe et al.,1998.
Después de un mes en promedio de incubación las areolas de los explantes de
Astrophytum capricorne, Astrophytum myriostigma y Thelocactus bicolor, durante el
primer mes incrementaron su volumen mostrándose más anchos de la base y con
numerosos tricomas en el ápice, posteriormente se dio el proceso de diferenciación
y se desarrollaron los brotes adventicios.
En Mammillaria coahuilensis y Astrophytum myriostigma dependiendo de el tipo
de explante utilizado se presentaron diferentes respuestas morfogenéticas, en los
13
explantes laterales estos tendieron a incrementar su volumen y el tejido se
desorganizó formando una masa de color verde claro y de aspecto húmedo (callo),
posteriormente se formaron los brotes adventicios por organogénesis indirecta. Los
explantes apicales de A. myriostigma desarrollaron brotes adventicios por
organogénesis directa y los apicales de Mammillaria coahuilensis incrementaron
notablemente su volumen, los tubérculos se separaron entre si y de entre ellos se
desarrollaron pequeños abultamientos con numerosos tricomas de color blanco,
dichos abultamientos posteriormente dieron lugar a los brotes adventicios generados
por organogénesis directa.
En la Tabla 4 se muestran los m ejores tratamientos donde se obtuvieron los
brotes adventicios y las vías organogenéticas.
Especie
Astrophytum
capricorne
Astrophytum
myriostigma
Mammillaria
coahuilensis
Thelocactus
bicolor
Mejor
Tratamiento
(mg/l)
Fitohormona
Tipo de
explante
No de brotes
promedio por
explante
No de brotes
por tratamiento
Órgano
génesis
3/0
K/2,4-D
Longitudinal
10.6
64
Directa
2/0
K/2,4-D
Apical
5.6
28
Directa
0.5
0.5
0/0.5
0/1
BA
Lateral
Apical
Longitudinal
5.6
4.9
7.5
1.6
113
49
15
10
Indirecta
Directa
Directa
BA/ANA
BA/ANA
Tabla 4.- Numero de brotes promedio por explante generados en los mejores tratamientos de citocininas
benciladenina, (BA) o Kinetina (K) y auxinas ácido naftalén acético (ANA) o 2 ,4-diclorofenoxiacético (2,4,-D)
en las diferentes especies ensayadas
Las concentraciones empleadas para Astrophytum capricorne y Astrophytum
myriostigma se tomaron a partir de un barrido hormonal más amplio que se llevó a
cabo con Astrophytum ornatum (Mendoza-Madrigal y López-Escamilla, 2004) y las
que arrojaron los mejores resultados se aplicaron con los dos otros miembros del
género. Aunque la fitohormona benciladenina (BA) es la que se reporta
preferentemente para la proliferación de brotes en cactáceas (Satrling y Doods,
1983; Martínez -Vázquez y Rubluo, 1989, Rubluo et al., 1993; Pérez-Molphe et al.,
1998; Papafotiou et al. , 2001; Casto -Gallo et al., 2002; Giusti et al., 2002; DávilaFigueroa et al., 2005), en este caso Kinetina resultó ser mejor, generó brotes bien
definidos que al contrario de los provenientes de BA, estos se encuentran inmersos
en el tejido del explante y no se desarro llan tan claramente como los procedentes de
Kinetina (com. pers. Crisóstomo, 2005).
14
El genero Mammillaria ha sido estudiado ampliamente de lo cual se han
generado diversos trabajos sobre su propagación in vitro algunos de estos son:
Minocha y Mehra, 1974; Starling y Dodds, 1983, Martínez-Vázquez y Rubluo, 1989,
Fay y Gratton, 1992 Pérez -Molphe et al., 1998; Papafotiou et al., 2001; Giusti et al.,
2002; Poljuha et al., 2003; Olguín -Santos et al., 2004; es importante señalar que
para M c oahuilensis es el primer reporte . Los resultados obtenidos para este género
son prometedores ya que a pesar de ser una de las especies de las cuales el
porcentaje de germinación fue bajo, los explantes utilizados fueron potencialmente
regenerativos.
El género Thelocacthus recientemente ha sido estudiado para su propagación
in vitro, dentro de los primeros trabajos reportados está el de Castro–Gallo et al.,
2002 con Thelocactus hexaedophorus en el reportan la formación de brotes a partir
de explantes apicales y laterales en BA a 1 , 2 y 3 mg/l ó 2iP (N 6 dimetil alil
aminopurina) 1, 2, 3, 4, 5 y 6
mg/l solo o combinado con 0.1 mg/l de ANA,
reportaron la formación de brotes adventicios en explantes apicales y laterales en un
rango de 2 a 13 brotes, en Thelocactus bicolor la formación de brotes se presentó
en aquellas concentraciones ausentes de la citocinina y con bajas concentraciones
de la auxina en explantes longitudinales (Tabla 4), en un segundo ensayo se
explorarán explantes apicales y laterales en las concentraciones donde se obtuvo la
formación de brotes y determinar si la conjunción del tipo de explante y bajas
concentraciones de auxina hacen más eficiente el sistema.
En Ephitelantha micromeris los ensayos que se llevan hasta el momento solo
han promovido la formación de callo y escasos brotes sin definirse completamente
que tratamiento es el más adecuado.
15
Conclusiones
Los tiempos de desinfección establecidos para las diferentes especies resultaron
satisfactorios y promovieron altos porcentajes de germinación para c inco de las seis
especies ensayadas.
En Mammillaria coahuilensis donde se registró el porcentaje de germinación más
bajo (32%), se realizarán nuevamente siembras in vitro con semillas recién
colectadas para corroborar si es un factor de almacenamiento, de postmaduración
de los embriones o de viabilidad de la especie.
Debido a las pocas semillas colectadas de Ariocarpus kotschoubeyanus no se han
realizado ensayos para su establecimiento in vitro.
Los ensayos realizados en los barridos hormonales nos muestran la potencialidad
del tipo de explante que se utilice en la combinación adecuada de fitohormonas, lo
que da como resultado la proliferación de brotes adventicios.
En los miembros del género Ariocarpus con 2 y 3 mg/l de Kinetina se generaron
brotes adventicios bien definidos, a pesar de que con los tratamientos con BA se
forman más brotes estos son poco definidos y se encuentran embebidos en el tejido
inicial
Bajas concentraciones de auxina promueven la formación de brotes adventicios en
Thelocactus bicolor, las cuales se ensayarán en Thelocactus rinconsensis y se
evaluará su efecto.
Para Mammillaria coahuilensis este es el primer reporte con respecto a su
propagación in vitro y muestran los explantes apicales una gran capacidad
regenerativa.
Los brotes obtenidos serán sometidos a un proceso de enraizamiento para su
posterior establecimiento en condiciones ex vitro
Así mismo se llevarán a cabo los análisis histológicos y fisiológicos con los
regenerantes obtenidos
Agradecimientos
A los estudiantes Crisóstomo Simón Miriam (UAEH), Díaz Rodríguez Berenice
(UNAM), Flores Rentería Dulce Yaahid (UNAM), Mendoza Madrigal Gilberto (UAEH),
Loaiza Alanis Claudia (UAEH), Negrete Rubio Naxdllely (UNAM), Saby Vercamer
Louis (UNAM), Zamora Maldonado Hilda (UNAM) que con dedicación y entrega
están realizando sus tesis de licenciatura, al Biól. Ulises Guzmán Cruz UBIPRO-FES
16
Iztacala, UNAM por su apoyo en campo, al Ing. Juan Carlos Betancourt Hernández y
Biól. Graciela Arocha SEMARNAT -Coahuila por todas las facilidades otorgadas para
realizar el trabajo de campo.
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