1. Educación

Las Directrices sobre Validación de la OIE aportan información detallada y ejemplos que respaldan
la norma de validación de la OIE publicada como Capítulo 1.1.5 del Manual Terrestre, o como
Capítulo 1.1.2 del Manual Acuático. El Término “Norma de Validación de la OIE” de esta Directriz
hace referencia a estos capítulos.
La detección de anticuerpos generados como respuesta a agentes infecciosos o a sus
componentes constituye un medio indirecto de diagnóstico de las enfermedades en el laboratorio.
Los métodos de detección de anticuerpos más frecuentes son la prueba clásica de neutralización
vírica (VN), el enzimoinmunoanálisis (ELISA), la inhibición de la hemaglutinación (HI) y la prueba
de fijación del complemento (CF). Otras pruebas de detección de anticuerpos menos frecuentes
son la inmunodifusión en gel de agar (AGID), la prueba de la inmunofluorescencia indirecta (IFAT),
la prueba de la aglutinación en suero (SAT), la prueba de la aglutinación en látex (LAT) y la prueba
de la aglutinación microscópica (MAT). Otros métodos, novedosos y más recientes son los
biosensores, la bioluminometría, la polarización de la fluorescencia, la quimioluminiscencia y los
dispositivos de flujo lateral, también denominadas pruebas de diagnóstico inmediato o a pie de
explotación. Otras pruebas inmunológicas que utilizan anticuerpos en la detección de antígeno se
describen en la Directriz sobre Validación 3.6.2 de la OIE.
Si se desea escoger una prueba para el diagnóstico de una enfermedad, deben tenerse en cuenta
las pruebas de detección de anticuerpos, por su practicidad, facilidad de obtención y preparación
de las muestras, buenas características generales de rendimiento diagnóstico, idoneidad para la
automatización (capacidad de procesar gran cantidad de muestras por unidad de tiempo), bajo
coste y rapidez de los resultados. Son especialmente útiles para procesar grandes cantidades de
muestras en estudios epidemiológicos o poblacionales, o para los programas de diagnóstico
masivo y vigilancia. Las pruebas de detección de anticuerpos también se utilizan mucho para la
exportación, la importación y el comercio de animales, y siguen representando la mayoría de
pruebas recomendadas por la OIE para el comercio internacional.
Una característica de las pruebas de detección de anticuerpos es su capacidad de indicar una
exposición previa a un agente infeccioso en ausencia de microorganismos detectables o de sus
analitos. También son adaptables a gran variedad de matrices, como el suero, el plasma, la sangre
total, la leche, las secreciones lacrimales o la saliva. Los sistemas analíticos específicos de isotipo
o subclase de inmunoglobulina pueden detectar selectivamente respuestas inmunitarias tempranas
o tardías, por ejemplo, la IgM o la IgG, respectivamente. Los sistemas de detección diseñados
específicamente permiten diferenciar entre la respuesta a la vacuna y la respuesta a cepas
naturales, y se comercializan en forma de kit, como el de detección de anticuerpos contra el virus
de la peste porcina clásica del cerdo. Los formatos de competición y de bloqueo permiten utilizar la
misma prueba básica para gran variedad de especies de animales, mientras que otros formatos
son específicos de especie. Para indicar la presencia de un anticuerpos concreto en una muestra
se utilizan muchos tipos de indicadores, químicos o físicos (como cromógenos, fluorocromos o
aglutininas, entre muchos otros). Dada la gran cantidad disponible de métodos de detección de
anticuerpos, no es posible describir el mejor método de validación para cada uno de estos tipos de
pruebas en esta Directriz sobre Validación de la OIE. Por lo tanto, el sistema de detección de
anticuerpos más utilizado, el ELISA, será el que se utilizará como ejemplo para la aplicación de las
mejores prácticas en las pruebas de anticuerpos. La mayoría de procesos básicos que se utilizan
para validar otros tipos de sistemas analíticos resultarán evidentes por extrapolación de los que se
utilizan para validar los ELISA.
El primer paso para el desarrollo de una prueba es definir claramente el propósito y aplicación concretos de la
prueba en cuestión. Muchas de las decisiones que se tomen durante el desarrollo de las pruebas dependerán de
esta premisa inicial. En el caso de las pruebas de detección de anticuerpos (que a partir de ahora, en esta
Directriz sobre Validación de la OIE, se denominarán “pruebas de anticuerpos”), como el ELISA, tener clara esta
información permitirá elegir el tipo de sistema de detección de anticuerpos más adecuado para lograr el propósito
previsto. Deben tenerse en cuenta muchos factores relacionados con el propósito previsto, la utilización y la
idoneidad de la prueba (en el caso de otros posibles propósitos véase la Norma de Validación de la OIE).
Los seis propósitos previstos básicos para las pruebas de diagnóstico se establecen en la Norma de Validación
de la OIE, y se indican en la nota al pie de la Tabla 1. Dado que las pruebas de anticuerpos tienen tanta variedad
de aplicaciones, y que pueden configurarse para propósitos muy específicas, vale la pena tener en cuenta y
evaluar varios parámetros al establecer lo/s propósito/s prevista/s de la prueba candidata. En la Tabla 1 se
resumen las características de las pruebas de anticuerpos en función de dichos propósitos. Tener en cuenta
estas características ayudará a orientar el propósito concreto al cual se ajustará la prueba candidata.
Nota – Se aconseja al lector que consulte la Sección B.4. Implementación del programa, como prólogo de las
siguientes explicaciones. Esta sección describe las inter-relaciones entre la sensibilidad y la especificidad
diagnóstica, los falsos positivos y los falsos negativos, y los valores predictivos positivos y negativos. Jacobson,
1998, ofrece una explicación más detallada de los valores predictivos como función de la prevalencia.
Factores que influyen en la idoneidad de una prueba para el propósito
previsto
Características de la prueba
1*
2*
3*
4*
5*
6*
a
b
Sensibilidad diagnóstica (DSe)
+++
+++
+++
+++
+++
+
+
Especificidad diagnóstica (DSp)
+
+
+
+
+++
+
+++
Valor predictivo positivo (PPV)
+
+
+
+
+++
+
+++
Valor predictivo negativo (NPV)
+++
+++
+++
+++
+++
+
+
Capacidad de procesado de muestras por
unidad de tiempo
+
+++
++
+
–
++
++
Tiempo necesario para obtener los
resultados
+
+
+
+
+++
–
+
Capacidad de GC (garantía de calidad)
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
Reproducibilidad
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
Repetibilidad
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
Otras características, como la sofisticación técnica de la prueba y la habilidad necesaria para la interpretación dependerán de la
enfermedad o infección que se esté estudiando.
Símbolos: +++ = esencial; + = menos importante; – = no importante
*
Propósitos básicos para los cuales una prueba puede ser considerada idónea:
1.
Contribuir a demostrar la ausencia de infección en una población dada.
2.
Certificar la ausencia de infección o la presencia del agente en animales individuales o sus productos antes de la
comercialización o desplazamiento
3.
Contribuir a la erradicación de la enfermedad o a eliminar la infección de poblaciones dadas
4.
Diagnóstico confirmativo de casos clínicos (incluye la confirmación de resultados positivos obtenidos en pruebas de
cribado)
5.
Determinar la prevalencia de la infección o exposición para facilitar el análisis del riesgo
6.
Determinar el estado inmunitario en animales individuales o en poblaciones (post-vacunal)
Para los grupos de ausencia de enfermedad, que se indican en los propósitos 1a y 1b (Tabla 1), las
pruebas de detección de anticuerpos de alta sensibilidad diagnóstica (DSe) son las de elección. Como
se indica en los propósitos anteriores, estas pruebas se aplicarían a poblaciones que tienen una
prevalencia aparente de cero. Las pruebas de DSe alta tienen porcentajes bajos de falsos negativos
(FN) y cuando se aplican a poblaciones de baja prevalencia, el valor predictivo negativo (NPV) se
encuentra en su nivel máximo. No obstante, la DSe y la especificidad diagnóstica (DSp) suelen ser
inversamente proporcionales y, por lo tanto, una disminución en la DSp dará lugar a un aumento del
porcentaje de falsos positivos (FP). Otros aspectos a tener en cuenta, si se va a procesar un volumen
continuo de muestras para la vigilancia, serían una capacidad de procesar gran cantidad de muestras
por unidad de tiempo, un coste bajo y la simplicidad técnica. Todos resultados positivos de las pruebas
de cribado deberán someterse a algún tipo de prueba confirmativa, para asegurarse de que son
correctos. Las pruebas confirmativas suelen tener una DSp alta y, por lo tanto, una tasa de FP baja.
Estas pruebas suelen ser más sofisticadas, más caras y pueden exigir una mejora de las habilidades
de interpretación.
Si tras un brote debe demostrarse la ausencia de infección y se ha utilizado la vacunación como medio
de control de la enfermedad, suele ser necesario analizar grandes cantidades de sueros. Además de
los aspectos mencionados anteriormente, también será necesaria una prueba de detección de
anticuerpos que permita distinguir entre animales infectados y vacunados (es decir, una prueba DIVA
[que permita diferenciar entre animales infectados y vacunados]). Al mismo tiempo, en algunas
situaciones puede estar justificada una prueba de detección de antígeno o de ácido nucleico, para
demostrar que ha cesado la excreción y/o circulación del agente infeccioso.
Si el propósito es cualificar animales concretos para desplazamientos internacionales, las pruebas de
elección también son las de detección de anticuerpos con DSe alta. El mismo razonamiento es
aplicable al NPV. De nuevo, todos los animales que den resultados positivos tendrán que someterse a
algún tipo de prueba confirmativa para comprobar que dichos resultados son correctos, o bien pueden
excluirse del envío sin realizar ninguna otra prueba. En los casos en que se observen positivos
dudosos, puede ser aconsejable exigir una repetición de la toma de muestra en el/los animal/es tras
un intervalo de tiempo adecuado, para asegurarse de que el rebaño no haya contraído la infección
muy recientemente.
Si el propósito de la prueba es erradicar la enfermedad o eliminar la infección de poblaciones dadas, la
prueba de detección de anticuerpos de DSe moderada a alta es la de elección. No obstante, el
razonamiento es ligeramente distinto porque la prueba probablemente se realizará a nivel de rebaño o
de compartimiento. Al principio de la campaña, cuando la prevalencia de la enfermedad es alta, es
idóneo trabajar con DSe y DSp moderadas porque en este momento tanto el porcentaje de FP como el
de FN son menos relevantes y puede tolerarse un nivel moderado de error analítico. En función del
tipo de enfermedad y de la rapidez con que se propague, puede resultar crucial que una capacidad de
procesado de gran cantidad de muestras por unidad de tiempo y que los tiempos de espera de los
resultados sean cortos. Normalmente, en este momento se toman decisiones sin realizar pruebas
confirmativas.
En las últimas fases de la campaña, está justificada una DSe más alta porque el porcentaje de FN se
convierte en el factor más crítico. De forma muy similar a lo que ocurre con los Propósitos 1 y 2, los
animales que dan resultados positivos tendrán que someterse a algún tipo de prueba confirmativa para
comprobar si estos resultados son correctos. En estas últimas fases, se suelen aplicar pruebas de
detección de anticuerpos junto con sistemas de detección de antígeno y/o ácido nucleico para detectar
casos subclínicos y, posiblemente, portadores latentes.
Para el diagnóstico confirmativo de casos clínicos, las pruebas de anticuerpos de DSp alta son las de
elección. En estos casos, la idea es minimizar el porcentaje de FP y potenciar el PPV de la prueba.
Por normal general, la infección está bien instaurada y la respuesta inmunitaria suele haber
empezado. En algunas situaciones, puede ser preferible llevar a cabo una prueba de cribado de DSe
alta pero DSp baja, y realizar a continuación un seguimiento de los positivos con una prueba
confirmativa de DSp alta. En algunos casos clínicos, como enfermedades vesiculares de animales
terrestres, es posible que sean necesarias varias pruebas para descartar agentes patógenos
concretos que dan lugar a signos clínicos similares. En algunos casos, pruebas de detección de
antígeno y/o ácido nucleico pueden suponer una mejor opción confirmativa de los casos clínicos
siempre que ofrezcan tiempos cortos de espera de resultados. Un ejemplo claro sería el de las
infecciones por virus de la influenza aviar altamente patógeno, en que el animal puede morir antes de
que la respuesta inmunitaria sea detectable.
Para realizar estimaciones de la prevalencia de la infección o exposición con el fin de facilitar el
análisis del riesgo, por ejemplo para estudios sanitarios, para determinar el estado sanitario de un
rebaño o para realizar un seguimiento de las medidas de control de la enfermedad, las pruebas de
anticuerpos de DSe y DSp moderadas son las de elección. En general, esto compensaría tanto los
porcentajes de FN como de FP y daría lugar a una estimación más exacta de la verdadera prevalencia
de infección en la población estudiada. No obstante, si se han establecido estimaciones exactas tanto
de la DSe como de la DSp, pueden emplearse enfoques estadísticos para minimizar el sesgo
atribuible a los porcentajes de FN y de FP (véase la Directriz sobre Validación de la OIE 3.6.5
Enfoques estadísticos de la validación).
Puntos críticos que deben abordarse:
 ¿Se ha tenido en cuenta que las concentraciones de
analito en la matriz influyen significativamente en el
límite inferior del intervalo de detección de anticuerpos y
el de funcionamiento de la prueba?
 ¿Se dispone de los reactivos de anticuerpos necesarios
(mono/policlonales)?
 ¿Se dispone de antígeno suficientemente purificado?
 ¿Están a la venta los reactivos? Si no es así, ¿resulta
práctico producirlos internamente?
 ¿Se dispone de los reactivos patrón de referencia? Si no
es así, ¿cómo se resolverá esta carencia? (Véase la
Norma de Validación de la OIE, Sección A.2.6).
Para determinar el estado inmunitario en
animales concretos o poblaciones, por
ejemplo post-vacunación, son necesarias
pruebas de anticuerpos de DSp alta.
Estas pruebas tienen porcentajes de FP
muy bajos y, por lo tanto, aportan un
grado alto de confianza en el PPV del
resultado. En animales concretos, el uso
de pruebas de neutralización vírica (VN)
en cultivo celular para la detección de
anticuerpos neutralizantes contra el virus
de la rabia inducidos por vacunación en
perros y gatos sería un claro ejemplo de una prueba con DSp alta que se utiliza para expresar títulos
en unidades internacionales. Sin embargo, estas pruebas son técnicamente sofisticadas, caras de
mantener y ejecutar y requieren estrictas medidas de bioseguridad. Para la aplicación a volúmenes
más grandes, como programas regionales de control de la vacunación, las pruebas basadas en ELISA
serían más aplicables, dada su simplicidad, rentabilidad y la capacidad de procesar gran cantidad de
muestras por unidad de tiempo. Las consideraciones relativas a la DSp también son aplicables a estos
tipos de pruebas.
La experiencia del personal de diagnóstico de laboratorio no solo es crucial en la elección de una prueba
adecuada que logre el propósito deseado, sino que también se requiere para determinar de manera fiable las
limitaciones científicas de una prueba y aspectos prácticos como el coste, la disponibilidad de equipo y de
reactivos, la cantidad de muestras que el laboratorio es capaz de procesar por unidad de tiempo y los tiempos de
espera para la obtención de resultados.
Las muestras a analizar mediante pruebas de
anticuerpos deben manipularse como se describe en
el Capítulo 1.1.1 Recogida, presentación y
almacenamiento de muestras para el diagnóstico del
Manual Terrestre. La matriz de la muestra en la que
suelen detectarse anticuerpos es el suero, pero
también puede tratarse de plasma, sangre total,
leche, jugo cárnico, vitelo de huevo, secreciones
lacrimales o saliva.
Diseño del método
 ¿Se ha pensado el diseño en
función del propósito deseado
para la prueba?
 ¿Cuál es la aplicación concreta?
 ¿Qué tipos y cantidades
estadísticamente significativas de
muestras deben analizarse?
(Véase la Directriz sobre
Validación 3.6.5 de la OIE)
 ¿Será una prueba de campo o de
laboratorio?
Los antisueros contra la cepa de referencia de un agente patógeno se denominan sueros de
referencia o patrones de referencia (Wright et al., 1993; Norma de Validación de la OIE;
Sección 1.4 de la Directriz sobre Validación 3.6.6 de la OIE Elección y uso de muestras y
grupos de muestras de referencia). Cuando este tipo de sueros contienen anticuerpos de
concentración/actividad conocida son útiles en la fase inicial de desarrollo de una prueba. Para
ciertas enfermedades de la lista de la OIE (como la influenza aviar, la fiebre aftosa, la peste
porcina clásica, etc.) existen patrones de referencia internacional a los que se puede acceder a
través de los Laboratorios de Referencia y los Centros Colaboradores de la OIE. Cuando no se
consiguen patrones de referencia externos, puede ser necesario producir patrones de
referencia internos, respecto a los cuales se calibrarán los patrones de trabajo (controles del
proceso o de la calidad).
Estos sueros, que contienen concentraciones de anticuerpos que se sitúan en el intervalo de
funcionamiento previsto para la prueba (también denominado intervalo dinámico) deben
utilizarse a lo largo de todo el desarrollo y estandarización de la prueba de anticuerpos. Se
recomienda que se preparen en cantidades suficientes como para que puedan utilizarse en
distintos aspectos de la validación. Estas muestras deben derivar de animales infectados y no
infectados de la población en la que terminará utilizándose la prueba una vez validada.
Preferiblemente, cada suero debe derivar de un solo animal, pero puede también ser una
combinación de muestras de varios animales (Directriz sobre Validación 3.6.6 de la OIE).
La aparición de los anticuerpos monoclonales ha mejorado mucho los enzimoinmunoanálisis.
Mientras que los conjugados policlonales anti-inmunoglobulina se utilizan en la mayoría de
ELISA, los conjugados de anticuerpos monoclonales pueden dirigirse a isotipos de
inmunoglobulina específicos. En función del epítopo de inmunoglobulina al que se dirijan,
muchos de estos anticuerpos monoclonales pueden utilizarse de modo eficaz para detectar
anticuerpos en especies relacionadas, como los rumiantes. El uso de conjugados monoclonales
dirigidos a epítopos de cadena ligera o pesada puede modular eficazmente la DSp y la DSe del
ELISA indirecto.
Los anticuerpos monoclonales se conocen mejor por su aplicación a los ELISA de competición
o de bloqueo. En este caso, la especificidad monoclonal se dirige a epítopos de la superficie del
agente patógeno en cuestión. En función del epítopo al que se dirijan, puede modularse la
especificidad analítica de la prueba.
Los anticuerpos monoclonales también pueden utilizarse en los ELISA sándwich, o bien para
atrapar antígeno a la placa o bien para detectar posteriormente antígenos que hayan sido
atrapados. En función del tamaño y de la complejidad del antígeno en cuestión, a veces es
preferible utilizar una preparación de anticuerpos policlonales para el atrapamiento, puesto que
estas en general contienen anticuerpos de alta afinidad de unión.
Los antígenos que se utilizan en el ELISA son de importancia crucial para el rendimiento
diagnóstico en una aplicación concreta. Los antígenos que expresan epítopos altamente
conservados, como los que se encuentran en algunas matrices o nucleoproteínas víricas, en
general son útiles en pruebas específicas de grupo, como los ELISA de detección de
respuestas contra todos los virus de Influenza A. Otros epítopos de antígeno pueden utilizarse
para restringir la detección a ciertos
serotipos. La elección del antígeno debe
Aspectos que influyen en la elección de la prueba
 ¿Va a utilizarse la prueba para cribado, para confirmación, o
realizarse con suma cautela y reflexión.






para ambos fines?
¿Se utilizará para una o más especies? ¿Cuáles?
¿Va la prueba destinada a la detección de infección temprana o
tardía?
¿Se utilizará la prueba para medir anticuerpos específicos de
serotipo o de subtipo?
¿Se utilizará la prueba para confirmar la sero-conversión tras la
vacunación?
¿Será una prueba DIVA (que permita diferenciar entre animales
infectados y vacunados)?
¿Se aplicará la prueba al comercio?
Las pruebas de antígeno crudo, como los
lisados celulares, se han utilizado mucho en
el pasado y siguen utilizándose para ciertas
pruebas. No obstante, los antígenos han
mejorado mucho a medida que han avanzado
las técnicas de purificación, como la
cromatografía de afinidad, y se han logrado
otras mejoras mediante la aplicación de la
clonación molecular. Las tecnologías de
antígeno recombinante han mejorado en gran
medida todas las características de rendimiento del ELISA, desde las analíticas hasta las de
diagnóstico.
Al diseñar una prueba, la finalidad prevista
Aspectos prácticos al elegir un formato analítico
influirá en la elección del formato que mejor se
 ¿Es crucial que la prueba tenga la capacidad de
ajustará durante la utilización. Por ejemplo, si
procesar gran cantidad de muestras por unidad de
se prevé utilizar prueba principalmente para
tiempo? ¿Se automatizará?
 ¿Cuál es el tiempo previsto de espera de
fines de vigilancia, entonces el tipo de ELISA
resultados? ¿Es adecuado?
tiene que ser propicio para lograr una alta
 ¿Qué nivel de sofisticación se precisa para ejecutar
DSe, como se ha descrito anteriormente en
la prueba?
“Propósitos”. No obstante, si la DSe de la
 ¿Qué habilidades se precisan para interpretar la
prueba de cribado se deja tan alta que genera
prueba?
muchos falsos positivos, al mismo tiempo
 ¿Será esta prueba factible en mi laboratorio?
deberá plantearse una prueba confirmativa
 ¿Será fácilmente transferible a otros laboratorios?
acompañante. Existen muchos formatos de
ELISA, cada cual con sus ventajas e
inconvenientes que permiten personalizar las pruebas para fines muy específicos (Tabla 2).
Los factores importantes que influyen en la elección del formato de una prueba de anticuerpos son la
disponibilidad de reactivos y la probabilidad de continuidad en el suministro, no solo para la fase de
diseño y optimización sino también para cuando la prueba empiece a funcionar. Una limitación podría
ser la falta de disponibilidad de los reactivos de anticuerpos necesarios para un formato determinado;
por ejemplo, los formatos de competición o bloqueo en general requieren anticuerpos monoclonales
específicos de antígeno. Otro ejemplo sería la necesidad de un antígeno de captura efectivo: un
antígeno bastante crudo podría ser aceptable para un ELISA sándwich de cribado, mientras que para
una prueba confirmativa sería necesario un antígeno purificado. Otros aspectos a tener en cuenta para
elegir el formato de ELISA son los isotipos, las concentraciones, las avideces y las especificidades
antigénicas del anticuerpo pertinentes para el diagnóstico; qué antígeno, y en particular, qué epítopos
son pertinentes; y cuál es el intervalo de funcionamiento deseado para la prueba. Todo ello influye de
forma decisiva en la elección del tipo concreto de ELISA (Tabla 2). Si está previsto utilizar la prueba en
distintas especies, incluida fauna salvaje, puede ser útil un formato de competición/bloqueo. Para
escoger un formato analítico también es necesario tener en cuenta la aplicación de la prueba. Las
preguntas a resolver se indican en el recuadro anterior “Aspectos prácticos al elegir un formato
analítico” y en las preguntas prácticas que se detallan en la Tabla 2. Es fundamental afrontar estas
preguntas en esta fase del desarrollo de la prueba, porque son cruciales para el resultado y la
aplicación.
Tipo de ELISA
Ventajas
Indirecto – los Ab
unidos se detectan
mediante conjugado
anti-especie o
mediante conjugados
de Proteína A/G
Uso y disponibilidad de gran variedad de
conjugados específicos anti-especie a menudo
dirigidos a subgrupos de anticuerpos
particulares, como anti IgM, IgG1, IgG2, etc.
Variación en el grado de unión inespecífica
en sueros individuales
Conjugados de Proteína A y Proteína G
específicos de muchas especies y que pueden
dar señales de fondo más bajas que los
reactivos anti-Ig.
Ello puede comportar una disminución de
la DSe en comparación con los formatos
de competición/bloqueo
Se utiliza mucho para el cribado de grandes
cantidades de muestras
Sándwich – El Ag se
presenta sobre un
anticuerpo de captura
en fase de unión sólida
El anticuerpo de captura de la fase sólida
puede ayudar a orientar la molécula
antigénica, lo cual aumenta la probabilidad de
que el anticuerpo de la muestra se una.
Pueden utilizarse preparaciones de antígeno
no purificado porque el anticuerpo de captura
se une de forma selectiva al antígeno crudo.
El recubrimiento previo con anticuerpo de
captura puede reducir la posibilidad de uniones
posteriores de proteínas inespecíficas durante
la prueba.
Inconvenientes
Para compensar este problema se
requieren diluciones de inicio altas
Solo puede utilizarse para uno o unas
pocas especies al mismo tiempo
Los antígenos deben tener al menos dos
sitios antigénicos o epítopos, lo cual
restringe este tipo de ELISA a complejos
antigénicos relativamente grandes o
proteínas más complejas
El tamaño y las relaciones espaciales de
los epítopos pueden afectar a la prueba
Tipo de ELISA
De competición (de
tipo indirecto y
sándwich) – El
anticuerpo problema
de la muestra se
mezcla con anticuerpo
de detección
previamente titulado, y
a continuación se
añade a pocillos
recubiertos con
antígeno de captura,
en formato directo o en
formato de
inhibición/bloqueo.
Ventajas
Inconvenientes
Adaptación fácil para utilizar como pruebas de
detección de anticuerpos
En general, pueden ser necesarios más
pasos y más optimización, por ejemplo, la
pre-titulación y optimización para los
reactivos de fase líquida y sólida.
Cuando se utilizan anticuerpos monoclonales
altamente específicos, el antígeno no tiene que
estar altamente purificado
Puede utilizarse en distintas especies para las
cuales no existen anticuerpos conjugados
Exige un mayor nivel de sofisticación
técnica
La ventaja del tipo sándwich de
competición/bloqueo radica en la captura de
antígeno
Los sueros pueden analizarse a bajas
diluciones sin riesgo de interferencia debido a
la unión de anticuerpos inespecíficos. Esto
puede contribuir a una sensibilidad más alta en
este formato
Pueden utilizarse distintas concentraciones de
anticuerpos para favorecer la sensibilidad o la
especificidad analíticas. Esto es especialmente
relevante para las pruebas en las que se
utilizan anticuerpos policlonales, que resultan
mucho más afectados al variar las diluciones
de los sueros
* La fuente original es Crowther (2001).
Tras elegir un formato de ELISA, se diseñan estudios iniciales destinados a determinar si la prueba
propuesta es viable. Debe analizarse mediante el prototipo de prueba un grupo de muestras de
referencia como se describe en la Sección
Estudio preliminar de eficacia
A.2.1.3. Si va a utilizarse un patrón de
 ¿Se llevó a cabo el estudio de viabilidad con al menos
referencia para la normalización de los
4 a 5 muestras representativas de todo el intervalo de
datos analíticos, debe escogerse e
funcionamiento de la prueba?
incorporarse en este momento en el
 ¿Se incluyeron uno o más patrones de referencia si
desarrollo de la prueba. Para obtener
eran necesarios para la normalización de datos?
continuidad en los resultados de evaluación
 ¿Fue suficiente la separación de resultados entre
muestras negativas, positivas débiles y positivas
de los datos, tanto el grupo de muestras de
fuertes?
referencia como cualquier patrón de
referencia deben incluirse en todos los
demás aspectos de los estudios de validación. El grupo de muestras de referencia utilizado en el
estudio de viabilidad deberá ser representativo de todo el intervalo de funcionamiento previsto para la
prueba candidata y ejecutarse en réplicas a modo de comprobación rápida de la repetibilidad.
La prueba debe lograr una buena separación de los valores de OD, representando todo el intervalo de
funcionamiento de la actividad de anticuerpos. Es especialmente importante obtener una separación
suficiente entre las muestras negativas y las positivas débiles. El valor de OD en el extremo inferior del
intervalo de funcionamiento debe ser de 0,1 o menos para el control negativo en el ELISA indirecto, o
para el control positivo fuerte en el ELISA de competición/bloqueo. Los valores de OD en el extremo
superior del intervalo de funcionamiento no deben ser superiores a 2,0, puesto que por encima de este
valor los lectores de placa empiezan a ser bastante inexactos. Si la prueba parece prometedora, el
siguiente paso será la optimización.
Lo mejor es que las pruebas de anticuerpos se realicen en varias muestras de suero (como
mínimo cuatro o cinco) que oscilen entre negativas y con altas concentraciones de anticuerpos
contra el agente infeccioso en cuestión. Estas muestras se utilizan inicialmente en
experimentos diseñados para demostrar la eficacia de la prueba. Se adquiere un gran volumen
(por ejemplo, un mínimo de 10 ml) de cada muestra de suero y se divide en alícuotas de 0,1 ml
para almacenarlas a –20°C o menos. Se descongela una alícuota de cada muestra, se utiliza
para los experimentos y, teóricamente, se desecha. Si la alícuota no puede desecharse, puede
mantenerse a 4°C entre un experimento y otro durante un máximo de unas 2 semanas; no
obstante, es posible que en tales circunstancias la muestre se deteriore. A continuación, se
descongela otra alícuota para realizar otro experimento. Con este método se utiliza la misma
fuente de suero y el mismo número de ciclos de congelación-descongelación en todos los
experimentos (una congelación y descongelación reiteradas del suero puede desnaturalizar los
anticuerpos y, por tanto, debe evitarse). Además, la variación se reduce cuando el investigador
utiliza la misma fuente de suero para todos los experimentos en lugar de cambiar de suero
entre uno y otro. Este enfoque tiene la ventaja añadida de generar un conjunto de datos para
las muestras que se analizan repetidamente.
Tras terminar las fases iniciales de la validación de la prueba, una o más de las muestras
pueden ser adecuadas como patrón de referencia para la expresión de datos, y el conjunto de
muestras en total puede utilizarse para las evaluaciones de la repetibilidad tanto de una misma
ejecución como entre distintas ejecuciones de la prueba (Jacobson, 1998). También pueden
servir como patrones de trabajo internos, es decir, controles de la calidad o del proceso siempre
que se haya determinado bien su reactividad; estos controles aportan la garantía de que la
prueba está dando datos exactos (Wright et al., 1993).
En el ELISA, una lectura de la densidad óptica (OD) es una medición de la aparición de color,
que es función de la cantidad de anticuerpo presente en la muestra. Dado que la aparición de
color es función de una reacción entre una enzima y un sustrato en presencia de un
cromógeno, los resultados en cada momento dependerán de factores externos como la
temperatura, el tiempo de reacción, etc. La comparación de los resultados de OD obtenidos con
una misma muestra entre distintas ejecuciones de una prueba en el mismo laboratorio, o entre
distintos laboratorios, carece de precisión debido a la variación de los resultados de los
patrones de referencia utilizados en cada ejecución de la prueba. Por lo tanto, los resultados de
OD de las muestras problema tienen que ajustarse de acuerdo con la/s OD de uno o más
patrones de referencia de cada ejecución de la prueba. Este proceso se denomina
“normalización” de los resultados del ELISA (véase la Norma de Validación de la OIE; Sección
A.2.7 para más detalle). Deben determinarse el método de normalización y la expresión de los
datos, preferiblemente antes de que terminen los estudios de viabilidad.
Los valores de OD pueden expresarse de varias formas (Wright et al., 1993). Un método
sencillo consiste en expresar todos los valores de OD como porcentaje de un solo suero control
positivo fuerte que se incluye en cada placa. Para estos cálculos, este control debe dar
resultados que se encuentren en el segmento lineal del intervalo de funcionamiento de la
prueba. Por otra parte, un procedimiento de normalización más riguroso consiste en calcular los
resultados de una curva patrón generada a partir de los valores de OD observados frente a la
concentración (o dilución) de anticuerpos de varios sueros control que representen todo el
intervalo de actividad de anticuerpos de la prueba. Ello requiere un algoritmo más sofisticado,
como la regresión lineal, el log-logit, o 4 o 5 parámetros de análisis de regresión logística, entre
otros. Este enfoque es más preciso porque para la normalización de datos no se basa
solamente en una muestra de control fuertemente positivo, sino que utiliza varios sueros
control, ajustados a los valores esperados, para crear una curva patrón a partir de la cual pueda
extrapolarse el valor de la muestra. Este método también permite excluir un valor control que
pudiera caer fuera de los límites de confianza esperados.
Optimización y estandarización
 ¿Han sido todos los reactivos críticos analizados
respecto a los demás en titulaciones en tablero de
ajedrez?
 ¿Se ha hallado una concentración/dilución óptima
para cada reactivo?
 ¿Se han incorporado procedimientos y reactivos de
control de la calidad o del proceso?
 ¿Se han incorporado métodos para normalizar los
datos obtenidos con las pruebas?
En el caso del ELISA, las variables más
importantes
a
optimizar
son
la
concentración/dilución del antígeno adsorbido
a la fase sólida, la dilución de trabajo del
suero problema, la molaridad del enzima, la
dilución del anticuerpo-conjugado, y la
concentración de la solución de sustrato.
Estos parámetros se comprueban mediante
evaluaciones en tablero de ajedrez (cada
variable se compara con todas las demás realizando una misma ejecución de una prueba que se
repite varias veces). Otras variables que tienen que tenerse en cuenta son el pH y la ionicidad de los
reactivos, factores moleculares como la valencia y la densidad de epítopos de los antígenos, el isotipo
de los anticuerpos que se pretende detectar y la afinidad de los anticuerpos. La precisión de los
resultados analíticos puede mostrarse gráficamente o expresarse numéricamente mediante distintos
métodos estadísticos (Crowther, 2001). Los estudios basados en ELISA requieren que la
instrumentación (lavadores y lectores de placa, etc.) estén adecuadamente calibrados antes de ser
utilizados – ello forma parte del programa de control de calidad del laboratorio.
Aunque los sistemas de detección de anticuerpos mediante ELISA son bastante resistentes a los
factores inhibitorios, la Norma de Validación de la OIE, Sección A.2.4, así como Greiner et al. (1997)
aportan descripciones del tipo de inhibidores que podrían afectar a la prueba. Estas referencias deben
revisarse cuidadosamente para garantizar que todos los factores inhibitorios están justificados y
controlados.
Si se dispone de sueros de referencia internacional, nacional o de otra procedencia, la prueba debe
calibrarse para lograr la sensibilidad analítica, en términos de unidades metrológicas, asignada a los
sueros de calibración (Wright, 1998).
La repetibilidad es el grado de coincidencia
Características de rendimiento analítico
entre los resultados obtenidos con réplicas de
 ¿Se ha establecido la repetibilidad en un intervalo
una misma muestra, tanto para una misma
de muestras positivas y negativas para una misma
ejecución como entre ejecuciones del mismo
ejecución y entre distintas ejecuciones?
método y en un mismo laboratorio. Es
 ¿Se han establecido los límites superior e inferior
adecuado utilizar el mismo grupo de muestras
del control de la prueba?
que se ha utilizado en el estudio de viabilidad,
 ¿Se ha definido la ASe y la ASp para esta prueba?
 Según criterios cuantitativos y cualitativos objetivos
o bien un grupo similar. No deben utilizarse
¿Es la prueba candidata mejor que un método
menos de tres (preferiblemente 5) muestras
analítico de referencia?
representativas de todo el intervalo de
funcionamiento de la prueba, y de una
cantidad suficiente como para realizar al menos 20 ejecuciones de la prueba a lo largo de varios días.
Los detalles acerca de cómo deben prepararse y manipularse las muestras se indican en la Directriz
sobre Validación 3.6.6 de la OIE y en la Norma de Validación de la OIE, Sección B.1.1. Es útil incluir al
menos una muestra de referencia en un ELISA indirecto (un suero control positivo) respecto a la cual
puedan normalizarse las muestras problema, como porcentaje del control positivo. La variación entre
repeticiones de la misma ejecución puede determinarse por la media de la OD y el coeficiente de
variación (CV) de las réplicas de cada muestra. El CV no debe superar el 15% (con la posible
excepción de muestras negativas y muy débilmente positivas, que pueden tener CV más altos (y sin
sentido)). Si todas las muestras se han calibrado previamente respecto a patrones de referencia, y por
lo tanto se conocen sus OD esperadas, las OD observadas para cada muestra en cada ejecución
pueden normalizarse como función de sus OD esperadas en el análisis de regresión lineal. De este
modo se obtiene un coeficiente de correlación que indica el grado de dispersión respecto al valor
esperado, y permite representar los valores normalizados en gráficos control (Crowther, 2001).
La especificidad analítica (ASp) se determina analizando sueros de animales que se sabe que han
sido infectados o han estado expuestos a todas las especies/cepas que la prueba debe detectar
(Norma de Validación 3.6.6 de la OIE, Sección 2.1). La reactividad cruzada con sueros de animales
infectados por especies relacionadas se utiliza para evaluar la ASp. Los ELISA también dan falsos
positivos que se atribuyen a factores exógenos, como la unión inespecífica de suero o conjugado a la
superficie plástica, que puede requerir el uso de agentes de bloqueo. Debe procederse con cuidado de
eliminar esta causa de error. El ELISA de bloqueo y el de competición también pueden sufrir
problemas de especificidad debido a obstáculos estéricos que impiden la fijación de las proteínas a los
puntos de unión.
La sensibilidad analítica (ASe) es sinónimo del límite inferior de detección (LOD) de la concentración
de anticuerpos en una muestra. Los distintos tipos de pruebas de anticuerpos varían
considerablemente en cuanto al límite inherente de detección de anticuerpos. Por ejemplo, los LOD de
ocho tipos distintos de pruebas de anticuerpos oscilan entre 1000 ng/ml (inmunodifusión radial) y
0,01 ng/ml (quimioluminiscencia) (Nielsen et al., 1996). Los LOD suelen determinarse mediante
dilución a punto final en la cual se analizan mediante la prueba réplicas (preferiblemente 10) de cada
dilución de una serie de diluciones a log2.
El método analítico candidato debe ejecutarse simultáneamente a una prueba de referencia de la OIE
o de otro tipo siempre que esté aceptada, empleando el mismo grupo de muestras en ambos, para
determinar si el método candidato muestra las mismas características cuantitativas y cualitativas que
el método estándar. Un resultado favorable en esta comparación respalda la hipótesis de que el
método candidato será un buen sustituto del método de referencia (véanse también los estudios de
comparación de métodos, en la Directriz sobre Validación 3.6.5 de la OIE).
La DSe y la DSp son los principales indicadores de rendimiento del proceso de validación. Las pruebas de
anticuerpos se someten a los mismos procedimientos generales de estimación de la DSe y la Dsp que los
exigidos para otros tipos de pruebas (véase la Norma de Validación de la OIE, Sección B.2 para más detalle). La
cantidad de muestras necesarias para establecer estas estimaciones en una prueba de anticuerpos determinada
se calcula según un diseño de muestreo en el que se tienen en cuenta muchas variables. Ello incluye la creación
de un grupo de muestras que se ajusta según el propósito de cada prueba (por ejemplo, según si va a ser una
prueba de cribado o una prueba confirmativa). También requiere predeterminar los niveles deseados de DSe y
de DSp (indicando los niveles aceptables de falsos negativos y de falsos positivos), el error admisible en las
estimaciones de estas DSe y DSp, y el nivel de confianza exigido para estas estimaciones.
El número de animales necesario para estimar la DSe y la DSp aceptables está en función del nivel de confianza
deseado en las estimaciones de la DSe y la DSp y del error admisible que se acepte. Por ejemplo, en el caso de
una enfermedad como la fiebre aftosa, es necesario reducir la probabilidad de que los animales infectados se
clasifiquen erróneamente como no infectados, lo cual reduce el error admisible en el resultado de la prueba, lo
cual, a su vez, aumenta el número de muestras necesarias para establecer un nivel alto de confianza en las
estimaciones de la DSe. Por otra parte, en el caso de una prueba confirmativa es deseable reducir la
probabilidad de que animales no infectados se clasifiquen como infectados. Por lo tanto, es deseable una DSp
alta con un error admisible muy bajo, lo cual requiere un tamaño muestral mayor de animales no infectados.
Todos estos aspectos generales relacionados con el tamaño muestral, los intervalos de confianza y el error
admisible en las estimaciones de DSe y de DSp se describen en la Norma de Validación de la OIE, Sección B.2,
y en otras fuentes se indican otros detalles y tablas de los tamaños muestrales (Jacobson, 1998).
A menudo es difícil obtener un número suficiente de sueros bien caracterizados como para lograr estimaciones
de la DSe y la DSp que sean suficientes para el propósito de la prueba. Inicialmente, puede tratarse de un
compromiso entre lo que es estadísticamente significativo y lo que es factible en la práctica, en cuyo caso la
prueba será reconocida de forma provisional (Norma de Validación de la OIE, Sección B.2.6). No obstante, a lo
largo del tiempo, con la acumulación de muestras mejor caracterizadas, las estimaciones de la DSe y la DSp
pueden fortalecerse (véase la Sección 5.4, abajo).
Durante el proceso de validación de las pruebas de anticuerpos surge el problema de tener que reunir
muestras que se sepa que son positivas y muestras que se sepa que son negativas en cantidades
suficientes como para establecer las características de rendimiento de la prueba. El anticuerpo es un
indicador indirecto de la presencia de un agente infeccioso o de sus componentes, o bien de una
exposición previa a los mismos. En la detección o ausencia de anticuerpos interfieren factores que
dependen de la calidad y la cantidad de la respuesta del hospedador frente al microorganismo. Los
factores que afectan a la concentración y a la composición de anticuerpos en las muestras de suero
pueden ser inherentes al hospedador (por ejemplo, la edad, el sexo, la raza, el estado nutricional, la
gestación o la capacidad de respuesta inmunitaria) o adquiridos (por ejemplo, anticuerpos adquiridos
de forma pasiva, o una inmunidad activa desencadenada por una vacunación o infección).
Teóricamente, en los grupos de muestras que se utilizan para establecer las estimaciones de DSe y
DSp deben incluirse muestras de animales que sean representativas de todas estas variables, pero
obviamente esta labor resulta muy difícil, cuando no imposible. Ante este problema, bastará con que
los grupos iniciales de muestras sean representativos de más de la mitad de los animales de la
población de destino, con el fin de lograr estimaciones preliminares de la DSe y la DSp. Así pues, en
realidad será necesario mejorar las estimaciones de la DSe y la DSp tras haber implementado la
prueba, a medida que se disponga de más muestras caracterizadas (véase la Sección 5.4, abajo).
Dado que a menudo es deseable aplicar las
Características de rendimiento diagnóstico
pruebas de detección de anticuerpos a una
 ¿Están validados los criterios que se utilizan
cantidad enorme de animales de grandes áreas
para determinar las poblaciones de referencia
geográficas (como las pruebas de cribado que se
positiva y negativa?
aplican a todo un continente), reunir grupos de
 ¿Representan totalmente las muestras de
muestras totalmente representativos de un
referencia a la población de destino de la
intervalo tan amplio de ventanas diagnósticas
prueba?
 ¿Ha habido dificultades para obtener un
puede resultar prácticamente imposible. Una
número suficiente de muestras? En tal caso,
buena alternativa es estimar primero la DSe y la
¿cómo se ha resuelto el problema?
DSp para una población de animales bastante
homogénea. Si la prueba va destinada a
poblaciones de animales dispares, que pueden albergar distintos perfiles de agentes infecciosos (con
la posibilidad de reacciones cruzadas no observadas en la población de destino original), puede ser
necesario volver a evaluar la DSe y la DSp a partir de datos de nuevos grupos de muestras que sean
representativos de la/s población/es de destino.
Los animales de referencia de los que se sabe si están o no infectados son la fuente ideal de
muestras para determinar la DSe y la DSp. No obstante, estas muestras son muy infrecuentes
y difíciles de establecer. El hecho de que se considere a los animales o muestras de referencia
que se utilizan para establecer la DSe y la DSp como “patrón de referencia perfecto” es poco
apropiado, pero se emplea a menudo para clasificar casi cualquier animal de referencia como
infectado/expuesto o no infectado, cuyas muestras se clasifican como positivas o negativas
(véase la Norma de Validación de la OIE, Sección B.2.1–3).
Al desarrollar una prueba es necesario conocer las ventajas y, sobre todo, los inconvenientes
relacionados con los distintos métodos que se utilizan para clasificar los animales de referencia
como infectados o no infectados. Las muestras de estos animales se considerarán positivas o
negativas, y en conjunto constituirán el patrón de referencia en el que se basarán la DSe y la
DSp de la prueba candidata. Por lo tanto, es fundamental determinar cuidadosamente la validez
de los distintos patrones de referencia, como se ilustra en los cuatro ejemplos siguientes:
i)
Un patrón de referencia inequívoco: presencia del agente en el hospedador o evidencia de
signos histopatológicos definitivos (patognomónicos)
Si en un animal se detecta un agente infeccioso o se cumple un criterio histopatológico
definitivo, en general se considera un patrón de referencia inequívoco para dicho animal.
Las muestras de suero procedentes de estos animales suelen considerarse patrones de
referencia de suero inequívocos para determinar la DSe y la DSp de la prueba candidata.
No obstante, estas muestras pueden tener sus limitaciones. A nivel de la población, un
agente patógeno puede estar inequívocamente presente en algunos animales, pero si la
muestra de suero se ha extraído del animal muy al principio del proceso de infección, es
posible que la respuesta inmunitaria todavía no haya generado una concentración
detectable de anticuerpos. En este caso, estas muestras de suero utilizadas como
patrones de referencia habrían sido un FN en el subgrupo de animales que se encuentren
una fase temprana de la infección. Por el contrario, en el caso de las infecciones más
crónicas, si solo se emplean animales de referencia en los que se ha confirmado el
resultado con cultivo o histopatología se obtendrán estimaciones de la DSe superiores a lo
que sería razonable para la población de destino de la prueba, porque la respuesta
inmunitaria siempre estará ya bien desarrollada.
ii)
Un patrón de referencia compuesto: verificación de animales no infectados o no expuestos
Este patrón se logra escogiendo animales de referencia de zonas geográficas en que los
antecedentes, los perfiles clínicos, los resultados analíticos previos y otros parámetros del
rebaño sugieran la ausencia del agente patógeno, y por lo tanto la ausencia de
generación, por parte del hospedador, de anticuerpos específicos contra el agente
patógeno que se pretende detectar con la prueba candidata. Estos tipos de materiales de
referencia, sus fuerzas y debilidades, se describen en otra parte (Jacobson, 1998), y
deben evaluarse cuidadosamente cuando se utilicen muestras de estas procedencias
para establecer la DSe y la DSp de una prueba candidata.
iii)
Un patrón de referencia relativo: serología comparativa
Este patrón se caracteriza por animales de referencia que se han clasificado en función de
su estado respecto a la infección por comparación con los resultados analíticos de otra
prueba serológica realizada con las mismas muestras. A menudo es la única fuente viable
de material de referencia de que se dispone para evaluar una nueva prueba serológica. Si
los resultados de una prueba de referencia como esta se eligen como patrón para
determinar las características de rendimiento diagnóstico de la prueba candidata, las
estimaciones resultantes de la DSe y de la DSp serán útiles solo si la prueba de referencia
dispone de características de rendimiento documentables, establecidas y aceptables. Una
deficiencia de los patrones de referencia relativos es que tienen establecidos sus propios
niveles de FP y FN, que son fuentes de error que se agravarán en las estimaciones de la
DSe y la DSp de la prueba nueva. No obstante, en general el uso de otros métodos
analíticos bien descritos se considera una buena práctica para determinar el estado de los
animales de referencia respecto a la infección, pero solo si el sesgo inherente introducido
por el patrón de referencia relativo está justificado (Organización Mundial de Sanidad
Animal [OIE], 2008).
iv)
Un patrón de referencia adjunto: infección experimental o vacunación
(Véase la Norma de Validación de la OIE, Sección B.2.3 para conocer las limitaciones
principales de este tipo de patrón). En algunos casos, la única forma de obtener muestras
positivas es mediante la infección experimental. Este enfoque es muy adecuado para
mostrar la dinámica de la infección y para determinar la “ventana diagnóstica” de la
prueba nueva. Por ejemplo, es posible conseguir estimaciones del intervalo de tiempo
entre la exposición al agente patógeno y el momento en que los anticuerpos empiezan a
ser detectables, o en que un 25, 50, 75 y 100% de los animales infectados da un resultado
positivo en la prueba. No obstante, existen inconvenientes en el uso de datos seriados en
el tiempo que deben evitarse. Los datos resultantes de observaciones repetidas de los
mismos animales no pueden utilizarse en el cálculo de la DSe y la DSp porque los
modelos estadísticos que se emplean para establecer la DSe y la DSp requieren
observaciones independientes (solo una muestra de cada animal). En el caso de los
estudios a lo largo del tiempo estadísticamente validados, o cuando se utiliza una sola
muestra de cada uno de los muchos animales de experimentación, la cepa del
microorganismo cultivado, la vía y dosis de exposición y la infección por otros
microorganismos relacionados y que implican reacción cruzada, y por microorganismos no
relacionados que no impliquen reacción cruzada son variables que podrían producir
respuestas cuantitativa y cualitativamente atípicas que no se hallan en las infecciones
naturales de la población de destino. Las condiciones experimentales suelen dar lugar a
una sobreestimación de la sensibilidad y la especificidad, por ejemplo en el caso de dosis
de exposición artificialmente altas y al utilizar animales libres de patógenos específicos
como controles negativos.
Debe indicarse en qué momento se ha obtenido la muestra (cuántos días post-infección).
Deben describirse la procedencia y los antecedentes de los animales de experimentación.
La validación no debe basarse únicamente en los animales de experimentación porque no
representan poblaciones naturales de animales expuestas de forma natural a los agentes
patógenos.
En la Norma de Validación de la OIE, Sección B.2.5 y en la Directriz sobre Validación 3.6.5 de
la OIE se ofrece una explicación de este enfoque para la estimación del rendimiento
diagnóstico.
Los procedimientos para establecer el valor de corte entre resultados negativos y positivos de pruebas
de anticuerpos se describen en la Norma de Validación de la OIE, Sección B.2.4.
La reproducibilidad es el grado de precisión de una prueba cuando se utiliza en varios laboratorios situados en
distintas regiones o países empleando dicha prueba de forma idéntica (idénticos protocolo, reactivos y controles)
para analizar el mismo grupo de muestras. Las evaluaciones de la reproducibilidad en pruebas de anticuerpos no
son particularmente distintas de evaluaciones similares realizadas en cualquier otro tipo de prueba. Por lo tanto,
se recomienda al lector que consulte en la Norma de Validación de la OIE, Sección 3, los detalles sobre los
análisis de reproducibilidad, y en la Directriz de Validación 3.6.6 de la OIE los tipos y grupos de muestras de
referencia.
Las mejores prácticas para la implementación del programa son generales para todos los tipos de
pruebas (Norma de Validación de la OIE, Sección B.4). No obstante, dado que el ELISA suele ser la
prueba de elección en los programas de vigilancia utilizada para confirmar la ausencia de enfermedad,
o para la erradicación de la enfermedad o la eliminación de la infección de poblaciones definidas, los
falsos positivos pueden suponer un importante problema incluso cuando la especificidad diagnóstica
es muy alta.
Se suele interpretar equivocadamente que una prueba con una DSp y una DSe del 99% solo clasifica
erróneamente a los animales como FP o FN en un 1% de las ocasiones. Los porcentajes de FN y FP
varían en función de la prevalencia de la infección en la población de destino. Los falsos positivos en
una campaña de erradicación de la enfermedad pueden variar considerablemente entre el inicio de la
campaña, momento en que la prevalencia es relativamente alta (por ejemplo, del 10%), y el final de la
campaña, momento en que ha disminuido al 0,1%. Así pues, los valores predictivos de los resultados
de la prueba resultan muy importantes. Los valores predictivos son las probabilidades de que un
resultado de la prueba sea verdaderamente positivo o verdaderamente negativo. En nuestro ejemplo,
utilizando una prueba con un 99% de DSe y de DSp para analizar una población de animales con un
10% de prevalencia de la enfermedad, el valor predictivo de un resultado positivo (PPV) es del 91,7%,
lo cual significa que hay un 91,7% de probabilidad de que el animal esté realmente infectado. El valor
predictivo de un resultado negativo (NPV) es de 99,9. Cuando la prevalencia cae al 5%, el PPV y el
NPV son del 83,9% y del 99,9%, respectivamente. No obstante, si la prevalencia vuelve a caer hasta
el 0,1%, debido a una exitosa eliminación de animales infectados de la población, la misma prueba
producirá un PPV del 9% y un NPV del 99,9%, lo cual significa que hay solo un 9% de probabilidad de
que un resultado positivo esté detectando a un animal realmente infectado (de 1.000 animales
analizados, solo alrededor de 1 de cada 10 resultados positivos será indicativo de un animal infectado
– los otros 9 serán falsos positivos). Así pues, si la prueba va destinada a la erradicación de una
enfermedad o a la eliminación de infección en una población, es aconsejable que al desarrollarla se
plantee un segundo valor umbral que dé una DSp más alta al final de la campaña, para reducir así la
probabilidad de falsos positivos. Resulta instructivo examinar una gráfica de valores predictivos para
pruebas de distintas DSe y DSp, para visualizar los efectos que tiene una reducción de la prevalencia
en los valores predictivos de una prueba (Norma de Validación de la OIE, Tabla 2, y Jacobson, 1998).
Una vez la prueba se está utilizando de forma rutinaria, el control de calidad interno se lleva a cabo
realizando un seguimiento constante de la prueba con gráficas de control de calidad para la evaluación
de la repetibilidad y la exactitud. Las gráficas que representen al menos 30 ejecuciones mostrarán
tendencias o cambios en los valores de los controles y los patrones. Las líneas que representan el
valor medio de una muestra control en al menos 30 ejecuciones, más/menos 3 desviaciones estándar,
son útiles criterios de decisión para la inclusión o exclusión de una ejecución de la prueba. La
ejecución se rechaza si un control/patrón supera ± 3 desviaciones estándar (DE) o si 2 controles (o
más) superan ± 2 DE (Crowther, 2001). Los criterios de decisión tal vez tengan que adaptarse a cada
prueba en cuestión debido a diferencias inherentes entre pruebas atribuibles al sistema hospedadoragente patógeno. En la Directriz sobre Validación 3.6.4 de la OIE se ofrece un ejemplo de cómo
aplicar la incertidumbre de la medición en el caso de un ELISA de anticuerpos empleando una muestra
control interna positiva.
La reproducibilidad de los resultados de una prueba entre laboratorios debe ser evaluada por un
sistema de Garantía de Calidad Externa al menos una vez al año, y es un requisito esencial para que
el laboratorio pueda ser acreditado con la ISO 17025 (Organización Mundial de Sanidad Animal [OIE],
2008). Se valora positivamente el pertenecer a un consorcio de laboratorios que estén interesados en
evaluar sus resultados.
Cuando están a punto de acabarse las muestras de
control de calidad o del proceso, es fundamental
preparar y analizar repetidamente muestras de
reposición. Las muestras de reposición deben incluirse
en al menos 10 ejecuciones de rutina de la prueba, y
sus resultados deben normalizarse respecto al patrón
de referencia existente. La actividad del control de
reposición debe ser comparable a la del control que se
está terminando. Si el patrón de referencia precisa ser
repuesto, es necesario que el de reposición tenga unas
características que coincidan todo lo posible con las
del suero original, para que se pueda utilizar para
normalizar los resultados de la prueba de forma tal que
estos tengan una utilidad comparable (véase también
la Directriz sobre Validación 3.6.8 1 de la OIE
Comparabilidad entre pruebas tras pequeños cambios
en un método analítico validado).
Seguimiento del rendimiento de la prueba
 ¿Ha variado el propósito de la prueba?
 ¿Ha variado la epidemiología de la
enfermedad en cuestión, por ejemplo, la
prevalencia, nuevos serotipos o cepas,
etc.?
 ¿Han variado los reactivos críticos, y en
tal caso, se ha evaluado la
comparabilidad de los nuevos reactivos?
 ¿Se incluyen los indicadores de
rendimiento en el uso diario de la prueba
(gráficas de control, estadística básica)?
 ¿Se actualizan periódicamente los límites
superior e inferior de las gráficas de
control a medida que se acumula
experiencia con las muestras control?
 ¿Se comparten los grupos de pruebas
con otros laboratorios para evaluar su
reproducibilidad?
 ¿Se incluye el análisis de la competencia
como parte de la evaluación continua de
la prueba?
Cuando tengan que reponerse otros reactivos, como el antígeno para la captura de anticuerpo, estos
deben producirse u obtenerse utilizando los mismos protocolos o criterios que los empleados para los
reactivos originales. Tienen que evaluarse utilizando sueros de envíos rutinarios en 5–10 ejecuciones
paralelas que incluyan el/los reactivo/s actual/es y el/los nuevo/s. Un grupo de muestras
representativas, como por ejemplo un grupo de muestras destinado a evaluar la competencia de la
prueba, también es un medio útil para evaluar la comparabilidad de los reactivos (Directriz sobre
Validación 3.6.6 de la OIE).
Si la prueba va a pasar de ser, por ejemplo, un ELISA sándwich a un ELISA de competición/bloqueo,
tendrá que volver a validarse debido a las muchas variables que pueden afectar a las características
de rendimiento de la prueba. En el caso de una prueba destinada a ser implementada en otra región
geográfica, por ejemplo, del hemisferio norte al hemisferio sur, es fundamental volver a validarla
utilizando sueros de poblaciones de animales que habiten en las condiciones locales. La evaluación de
los sueros de referencia que representen estas poblaciones se lleva a cabo utilizando las etapas 3 a
5 de la Figura 1 de la Norma de Validación de la OIE. Es la única forma de garantizar que la prueba es
válida para poblaciones de composición distinta a la de la población original, para la cual estaba
pensada la prueba.
Debido a la gran cantidad de variables que influyen en el rendimiento de las pruebas de diagnóstico
serológico, es útil ampliar el número de sueros de referencia siempre que se pueda, admitiendo el
principio de que el error se reduce al aumentar el tamaño muestral. Los bancos de sueros de
referencia deben ampliarse con sueros bien caracterizados, y deben utilizarse periódicamente para
actualizar las estimaciones de la DSe y la DSp aplicables a la población de destino de la prueba.
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1
Nota para el lector: Una vez finalizada la Directriz sobre Validación 3.6.8 de la OIE Comparabilidad entre pruebas tras
pequeños cambios en un método analítico validado se publicará en la página web de la OIE.
NIELSEN K., GALL D., KELLY W., VIGLIOCCO A., HENNING D. & GARCIA M. (1996). Immunoassay Development:
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