PROCESO CAS N° 005-2015

XXX Congreso Nacional de la Sociedad
Española de Trombosis y Hemostasia
Ponencias y Comunicaciones
Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
6-8 de noviembre de 2014
Local handout produced and distributed
in Spain with the permission of:
Thrombosis
and
Haemostasis
International Journal
for Vascular Biology and Medicine
Cómo acceder a la revista
de ponencias y comunicaciones
de la SEHH y la SETH
L
a
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Carlos Solano Vercet
Vicepresidentes
Vicepresidente
Pedro Sánchez Godoy
Pilar Llamas Sillero
Ginés Escolar Albaladejo
Vocales
Carlos Solano Vercet
Presidente
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José Rafael Cabrera Marín
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† Jesús María Cesar Pérez
Joaquín Díaz Mediavilla
José Luis Díez Martín
Ángela Figuera Álvarez
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María Jesús Gómez Vázquez
José Ángel Hernández Rivas
Víctor Jiménez Yuste
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Javier Loscertales Pueyo
Carmen Martínez Chamorro
Rafael Martínez Martínez
Francis Oña Compan
F. Javier Peñalver Parraga
Jaime Pérez de Oteyza
Juan Luis Steegmann Olmedillas
José Francisco Tomás Martínez
Presidente
Presidente del Comité Científico de la SEHH
Vocales de la SEHH
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Felipe Arriba de la Fuente
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Programa educacional)
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Ángela Figuera Álvarez
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Ataulfo González Fernández
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Eduardo Olavarria López Aróstegui
Miguel Lozano Molero
Gemma Ramírez Ramírez
Guillermo Sanz Santillana
Jordi Sierra Gil
M.ª José Terol Casterá
Presidente del Comité Científico de la SETH
Ginés Escolar Albaladejo
Vocales de la SETH
Carmen Altisent
† Jesús María Cesar Pérez
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Programa educacional)
Vanessa Roldán Schilling
Juana Vallés Giner
Francisco Velasco Gimena
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Presidente
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Vicepresidentes
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Pere Domenech Santasusana
Secretaria
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Tesorera
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Vocales
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Víctor Jiménez Yuste
José Mateo Arranz
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Vanessa Roldán Schilling
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Ramón Lecumberri
Expresidentes
Justo Aznar Lucea
Francisco Javier Batlle Fonrodona
† Antonio López Borrasca
Fernando Martínez Brotons
Miguel Rutllant Bañeres
Carlos Alonso Villaverde Grote
Pascual Marco Vera
Índice SETH
Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
XIII LECCIÓN CONMEMORATIVA RICARDO CASTILLO - ANTONIO LÓPEZ BORRASCA....1
• La hemofilia en las casas reales europeas
C. Altisent Roca....................................................................................................................... 3
PONENCIAS............................................................................................................... 9
• Laboratorio. Problemas prácticos diagnósticos en la hemostasia....................................... 11
• Trombosis.............................................................................................................................. 35
• Coagulopatías hemorrágicas: pasado, presente y futuro de la hemofilia........................... 51
• Cuestiones abiertas en tratamiento antitrombótico............................................................ 66
• Plaquetas y endotelio............................................................................................................ 80
• Avances y controversias en hemostasia y trombosis.......................................................... 95
SESIÓN PLENARIA................................................................................................ 113
COMUNICACIONES ORALES.................................................................................. 123
• Conceptos básicos en hemostasia/métodos de diagnóstico y marcadores...................... 125
• Diátesis hemorrágica........................................................................................................... 128
• Trombosis............................................................................................................................ 131
• Plaquetas/biología vascular................................................................................................. 137
• Tratamientos antitrombóticos............................................................................................ 142
PÓSTERES............................................................................................................. 147
• Conceptos básicos en hemostasia...................................................................................... 149
• Diátesis hemorrágica........................................................................................................... 150
• Trombosis............................................................................................................................ 165
• Plaquetas/biología vascular................................................................................................. 194
• Métodos de diagnóstico y marcadores............................................................................... 205
• Tratamientos antitrombóticos............................................................................................ 210
PUBLICACIÓN........................................................................................................ 223
• Conceptos básicos en hemostasia...................................................................................... 225
• Diátesis hemorrágica........................................................................................................... 225
• Trombosis............................................................................................................................ 228
• Plaquetas/biología vascular................................................................................................. 235
• Métodos de diagnóstico y marcadores............................................................................... 236
• Tratamientos antitrombóticos............................................................................................ 237
XIII LECCIÓN CONMEMORATIVA
RICARDO CASTILLO ANTONIO LÓPEZ BORRASCA
Ponencias
La hemofilia en las casas reales europeas
Carmen Altisent Roca
Unitat d’Hemofíla. Hospital Universitari Vall d’Hebron. Barcelona
Agradecimientos: Al Dr. José Félix Lucía por la revisión de los aspectos históricos y al Dr. Francisco Vidal por su colaboración en los estudios genéticos.
Introducción
las zonas de lesión de los vasos y cuando se introducía en un tubo de
cristal. Al inicio del siglo xix se conocía la existencia de la fibrina y se
consideraba que la coagulación era una propiedad del plasma. Wright,
en 1893, observó que en los pacientes con hemofilia el tiempo de coagulación en sangre total estaba alargado13. En el año 1905, Morawitz
sentó las bases de la considerada teoría clásica de la coagulación en
base a cuatro sustancias que intervenían en el proceso14: la trombocinasa proveniente del tejido lesionado, la protrombina, el fibrinógeno
y el ion calcio. En la primera etapa de la coagulación la protrombina
se convierte en trombina mediante la acción de la trombocinasa y
en presencia de calcio, y en la segunda, el fibrinógeno se convierte
en fibrina por la acción de la trombina. A mediados de la década de
1930, Armand Quick desarrolló un método de laboratorio conocido
con el nombre de tiempo de protrombina o tiempo de Quick y, hasta
la actualidad, ha sido una prueba hemostática básica15. Quick también
demostró en 1954 que la protrombina en pacientes con hemofilia era
normal16,17. En el año 1936 Patech y Taylor descubrieron la sustancia
deficiente en los pacientes con hemofilia y la denominaron factor o
globulina antihemofílica al observar que una fracción globulínica del
plasma normal corregía el defecto de coagulación del plasma hemofílico pero no pudieron comprobar si el defecto plasmático era debido
a la ausencia o la inactividad de la proteína responsable18. En el año
1947, Pavlovsky observó que la mezcla de sangre de dos pacientes con
hemofilia se comportaba como sangre normal y que la transfusión de
sangre de un hemofílico a otro corregía el tiempo de coagulación en
el receptor lo que orientaba hacia la presencia de un nuevo factor19.
En el año 1952, Biggs describió la enfermedad de Christmas (nombre
del paciente afectado)20, lo que sirvió para diferenciar los dos tipos de
hemofilia21. En el año 1964 se revisó la primera teoría de Morawitz
y MacFarlane propuso el término cascada de la coagulación estableciendo que se inicia de dos maneras: una por activación del factor de
contacto (FXII), denominada la vía intrínseca, y otra a través del FVII
y el factor tisular, denominada la vía extrínseca; ambas confluyen
en la vía común con la activación del FX22,23. En los años ochenta se
demostró que el principal mecanismo para el inicio de la coagulación
era el factor tisular unido a los fosfolípidos y el FVIIa y que todas las
reacciones ocurren en la superficie celular para generar trombina; es
el denominado modelo celular de la coagulación24.
La hemofilia es la coagulopatía congénita grave más frecuente y la más
conocida; ha sido denominada enfermedad de reyes1. El hecho de que
la reina Victoria de Inglaterra haya sido la portadora más famosa, a la
vez que diez de sus varones descendientes padecieran la enfermedad
en un periodo de la historia en que era poco conocida y sin una opción
terapéutica eficaz, la hacen extremadamente interesante para conocer la
evolución en cuanto al diagnóstico, al tratamiento y a su posible curación2,3. Probablemente el hecho de estar presente en tantos miembros de
la realeza europea contribuyó al mejor conocimiento de la enfermedad
y favoreció el desarrollo de la investigación científica, además de un
interés general con publicaciones literarias o cinematográficas4.
Antecedentes históricos
La primera referencia escrita de la enfermedad se halla en el Talmud babilónico del siglo v d.C., que contiene la esencia de la ley y ética judaicas,
así como tradiciones, leyendas e historias. Una norma del patriarca Rabbí
Judah eximía al tercer hijo de ser circuncidado si los dos anteriores habían
muerto por hemorragia5,6. En el siglo x de nuestra era, Albucasis describió
varios varones de un pueblo que murieron por hemorragia después de
mínimos traumatismos y en el siglo xii, Maimónides los eximió de la circuncisión en base a la misma regla de los rabinos pero aplicada también
aunque la mujer esposara un nuevo marido7. En América, en 1791, en el
obituario de Isaac Zoll se citaba el caso de la muerte de seis hermanos
después de mínimos traumatismos, dato que constituye la primera referencia de la enfermedad en Estados Unidos8. El trastorno hemorrágico
recibió varias denominaciones hasta que en el año 1828, en el tratado de
Hopff, aparece el término de hemofilia9.
La hemofilia A es la más prevalente; se estima un caso por cada 5.000
varones nacidos y la B uno por cada 30.000. En función de los niveles de
factor VIII o IX se clasifica en grave (<1%), moderada (1-5%) o leve (>540%). Las manifestaciones clínicas de la hemofilia leve son las hemorragias postraumáticas o quirúrgicas, a diferencia de los casos graves,
que son espontáneas o después de mínimos traumatismos; el promedio
anual es de 20-30 hemorragias, de localización preferentemente articular
o muscular. Las hemorragias articulares reiteradas dan lugar a una grave
artropatía en edades muy tempranas10,11. Dado que las manifestaciones
hemorrágicas están relacionadas con la hemostasia y su tratamiento con
la transfusión, es de interés recordar cómo ha evolucionado su concepto
antes de abordar el impacto de la enfermedad sobre la realeza europea12.
Las primeras transfusiones
James Blundell, obstetra del Guy’s Hospital de Londres, fue el primero
en introducir la transfusión en la práctica médica al comprobar sus
beneficios en un caso de hemorragia posparto en 182825,26. En 1840,
Samuel Lane, profesor de anatomía y cirugía del St George’s Hospital
Medical School de Londres, practicó una transfusión de sangre a un
niño hemofílico por una hemorragia posquirúrgica27. A finales del siglo
Breve historia de la hemostasia
Durante muchos años se observaron los mecanismos que mantenían
la sangre fluida en los vasos así como la formación de los coágulos en
3
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
las necropsias de los pacientes no corroboraban tal anomalía en los
órganos. Para el tratamiento recomendó evitar los traumatismos y las
intervenciones quirúrgicas, aplicar compresión y frío en la zona de
las heridas y vivir en climas cálidos. A la edad de 31 años, Leopoldo
murió en Cannes probablemente debido a una hemorragia cerebral
postraumática; en efecto, además de la hemofilia también padecía de
epilepsia. Las dos revistas británicas más prestigiosas, The Lancet y
British Medical Journal44,45, dejaron constancia de su muerte y a partir
de entonces proliferó el número de publicaciones relacionadas con la
hemofilia, tanto en Europa como en Estados Unidos46 (Figura 2). A
pesar de la dificultad para encontrarle esposa, consiguió casarse, y
fruto del matrimonio nacieron una hija portadora, que concibió un hijo
con hemofilia fallecido a la edad de 3 años (Ruperto), y otro hijo sano.
Alicia, la segunda de las hijas de la reina Victoria, también fue portadora y sufrió tanto o más que su madre puesto que tuvo una amplia
descendencia (siete hijos). Uno de sus hijos, Federico, murió a los 3
años de una hemorragia cerebral después de sufrir un traumatismo cra-
xix la mayoría de los esfuerzos iban dirigidos a evitar la coagulación
de la sangre en los tubos o recipientes de la extracción conectados
con el receptor, a la vez que se observaban las reacciones de incompatibilidad. En el año 1901, Landsteiner describió los tres diferentes
grupos sanguíneos A, B, y O, a los que un año después von Decastello
y Sturli añadieron el cuarto grupo AB28-30. En el año 1940 Landsteiner
y Wiener describieron el grupo Rh reconociéndolo como causa de
una posible reacción hemolítica31. Durante el siglo xx, los conflictos
bélicos en Europa marcaron el progreso en cuanto a la manipulación
de la sangre para la transfusión. La utilidad del citrato sódico como
anticoagulante y el primer banco con reserva de sangre fueron debidos
a Oswald Robertson en 191832.
La historia del tratamiento sustitutivo en la hemofilia se inicia a
principios de los años cuarenta cuando Edwin J. Cohn consiguió el
fraccionamiento del plasma con diferentes concentraciones de etanol33.
En el año 1964, Judith Pool reportó que la fracción crioprecipitada del
plasma contenía una gran cantidad de FVIII, lo que sirvió como base
para la obtención de los concentrados liofilizados al inicio de los años
setenta34. La disponibilidad de tratamiento sustitutivo es el gran paso
cualitativo para el cambio en la calidad de vida de estos pacientes ya
que puede administrarse de forma inmediata en su domicilio (autotratamiento) al inicio de la hemorragia, con lo que se consigue una
gran mejoría del dolor o de forma profiláctica para la prevención de la
artropatía35,36. A este salto cualitativo le siguió un periodo de grandes
sombras por las complicaciones derivadas de las infecciones por el
virus de la hepatitis C y de la inmunodeficiencia humana. La secuenciación del gen del factor IX en el año 198237,38, así como del factor
VIII dos años después39, fueron el punto de partida para la obtención
de nuevos productos mediante ingeniería genética, a la vez que de
forma progresiva han incrementado la seguridad del tratamiento40,41.
La reina Victoria y su descendencia
La reina Victoria (1819-1901), única hija de Eduardo de Hannover,
duque de Kent, y Victoria de Sajonia-Coburgo-Saalfeld, tuvo nueve
hijos que propiciaron la transmisión de la hemofilia a gran parte de
la realeza europea incluyendo las familias reales española, alemana
y rusa sin que existiera ningún antecedente en su familia (Figura 1).
Leopoldo (1853-1884), duque de Albania y octavo hijo de la reina
Victoria, fue el primer hemofílico de la estirpe. El Dr. John Snow administró cloroformo a la reina en el momento del parto, anécdota que
sirvió como superstición al atribuir el defecto hemorrágico descubierto
a la edad de 6-7 años a esta circunstancia. La historia de Leopoldo es
la primera detallada que se conoce de un paciente hemofílico. Se lastimaba fácilmente y siempre tenía las rodillas y los codos tumefactos,
motivo por el cual no podía participar en las actividades de representación de la familia y fue nombrado secretario personal de la reina.
Sir William Jenner fue el médico de Leopoldo, por lo que investigó
la enfermedad. En el año 1876 comunicó en la Clinical Society of
London que la sangre de los pacientes con hemofilia coagulaba más
lentamente y postuló que era debido a un exceso de producción de
sangre y a un aumento del número de vasos sanguíneos42. Su discípulo,
el Dr. John Wickham Legg, trató a Leopoldo el año antes de su muerte
y publicó un importante trabajo titulado A treatise on Haemophilia43;
en sus 158 páginas recogía toda la información conocida destacando
en especial la dificultad para la actividad física cotidiana pero seguía
relacionando el sangrado con anomalías vasculares a pesar de que
Figura 1. Árbol familiar de la reina Victoria.
Figura 2. Evolución del número de artículos y de libros sobre hemofilia en el
siglo xix y principios del xx.
4
Ponencias
afueras de la ciudad de Ekaterimburgo. La madrugada del 17 de julio
de 1918, la familia real, tres sirvientes y el médico personal fueron
conducidos a los sótanos de la casa y fusilados. Los propios ejecutores
fueron los encargados de hacer desaparecer los cadáveres.
Seis décadas más tarde, en 1979, el geólogo Alexander Avdonin y
el escritor y cineasta Gely Ryabov, analizando documentos históricos
y entrevistando a algunos de los testigos presenciales de los hechos,
hallaron la tumba de la familia imperial en el bosque de Koptiakí y
no hicieron público el descubrimiento hasta diez años más tarde. En
la tumba abierta en el año 1991 se hallaron nueve cadáveres. La identificación de los esqueletos se realizó mediante el análisis genético
del ADN mitocondrial53, de los microsatélites y de los cromosomas
sexuales54,55. El análisis antropológico y forense de los restos hallados
en la tumba de la familia Romanov indicaba que estos correspondían
a nueve cadáveres: cuatro mujeres y cinco hombres. El estudio comparativo del ADN mitocondrial de parientes vivos por vía materna,
tanto de la zarina (Príncipe Felipe, duque de Edimburgo) como del
zar (rebisnieta de Luisa de Hesse-Kassel), corroboró la existencia de
cuatro cadáveres no relacionados, asignados a los tres sirvientes y al
médico. Cuatro de los cadáveres tenían secuencias de ADN mitocondrial compatibles con su pertenencia a la zarina y tres de sus cuatro
hijas y uno de los cadáveres de varón se relacionaba perfectamente con
los descendientes del zar por vía materna. Además, el análisis del ADN
mitocondrial de un pañuelo con restos de sangre del zar conservado en
uno de los palacios reales permitió confirmar el haplotipo asignado a
Nicolás II56. Por otra parte, el análisis mediante microsatélites resultó
compatible con la presencia, entre los restos hallados en la tumba, de
un padre, una madre y tres hijas57. En resumen, los primeros análisis
genéticos demostraron que se trataba de huesos y dientes de nueve
personas: el zar Nicolás II, la zarina Alexandra, tres de sus hijas, el
médico y los tres sirvientes.
En julio de 2007 se descubrió otra tumba situada a unos pocos
kilómetros de la primera y fueron hallados los restos de otros dos
cadáveres que se supuso que también eran miembros de la familia
real. Dos años más tarde se publica el estudio en el que, siguiendo la
misma metodología empleada para los cadáveres de la primera tumba,
se confirmaba que los restos pertenecían a la gran duquesa María y el
zarevich Alexis58.
neoencefálico, una de las complicaciones más graves de la hemofilia,
al precipitarse desde una ventana47. Otras dos hijas, Irene y Alexandra,
también fueron portadoras y tuvieron hijos hemofílicos. La última de
las hijas de la reina Victoria, Beatriz, tuvo tres hijos varones, dos con
hemofilia (Leopoldo y Mauricio), los cuales no tuvieron descendencia,
y una hija, la reina Victoria Eugenia, casada con Alfonso XIII y abuela
paterna del rey Juan Carlos I. Dos hijos de la reina Victoria Eugenia
fueron hemofílicos: Alfonso, nacido en 1907, tuvo una vida azarosa y
murió a los 31 años en un accidente de coche. Gonzalo falleció a los
20 años, también en un accidente de coche48,49.
Para valorar los conocimientos sobre la enfermedad a principios
del siglo xx, son de gran interés los capítulos V y VI del libro Treasury
of Human Inheritance, de los autores William Bulloch y Paul Fildes,
quienes recopilan 949 citas bibliográficas, además de 235 pedigrís
de familias con hemofilia50. En un tratado de hematología alemán,
traducido al castellano en 192751, se cita que la hemofilia no es una
enfermedad sino una verdadera disposición anormal congénita, una
diátesis en el verdadero sentido de la palabra; los primeros síntomas
aparecen en la edad infantil y una particularidad es la tendencia a las
hemorragias articulares; el tiempo de coagulación es muy prolongado
y es característico que después de grandes hemorragias el tiempo de
coagulación no se halle prolongado mientras que el tiempo de hemorragia es normal; su patogenia es desconocida y es una enfermedad
extremadamente peligrosa en la infancia por la aparición de hemorragias mortales; el peligro mengua a partir de los 4 años. Y proseguía: la
hemofilia es un estado tan serio que desde el punto de vista profiláctico
debería tomarse alguna medida; las personas del sexo femenino pertenecientes a una familia de hemofílicos no deberían contraer matrimonio; a los niños hemofílicos se les debería prohibir la gimnasia, los
juegos que implicaran movimiento y evitar las intervenciones que no
fueran de indicación vital; debería tenerse un cuidado especial en la
higiene de los dientes y elegir una profesión que no requiriera esfuerzos corporales. Las sangrías practicadas de tiempo en tiempo inducen
un enriquecimiento de la trombocinasa; las inyecciones subcutáneas o
intravenosas de suero humano normal reciente o de sangre íntegra o de
suero antidiftérico mejoran las hemorragias mientras que las soluciones hipertónicas de ClNa intravenosas y las sales de calcio y la gelatina
no son útiles. En las hemorragias articulares se indicaba el reposo y
un vendaje compresivo para, más tarde, iniciar movimientos activos y
pasivos cuidadosos. El Dr. Carlos Elósegui, discípulo del Dr. Pittaluga,
se trasladó a vivir con la familia real en el año 1925 para el cuidado de
Alfonso y Gonzalo y publicó la eficacia de un concentrado vitamínico
para el tratamiento de las hemorragias (Nantina antihemorrágica®)52.
La mutación real y el tipo de hemofilia
A partir de los restos que estaban mejor conservados, los de la zarina
Alexandra, los investigadores extrajeron el ADN genómico. Los genes
F8 y F9 fueron amplificados, secuenciados y analizados con técnicas de bioinformática sin que hallaran ningún cambio en las regiones
codificantes de ninguno de los dos genes. No obstante, detectaron un
cambio en la posición -3 del intrón tres del gen F9 (IVS3-3A>G). Los
análisis del resto de la familia indicaron que Alexei y la zarina tenían
la mutación y que, de las cuatro hijas, únicamente la gran duquesa
Anastasia era portadora de esta anomalía59,60. Al tratarse de mutación
de empalme (splicing), los autores argumentan que es la mutación
responsable de la hemofilia y no un polimorfismo en base a algunas evidencias: a) las pruebas funcionales in vitro que demuestran el
empalme aberrante de un ARN portador de la mutación; b) el hecho
de no encontrar ninguna otra mutación en los genes F8 y F9; c) la
mutación se hereda con la enfermedad ya que la presenta Alexis y también su madre, portadora obligada de la mutación por los antecedentes
La enfermedad en la familia real rusa
Alexandra de Hesse, hija de Alicia y nieta de la reina Victoria, se
convirtió en zarina de Rusia al casarse con Nicolás II en 1894. Tuvo
cuatro hijas, Olga, Tatiana, María y Anastasia, y un hijo varón, Alexei,
nacido en 1904 y heredero de la corona. Los dramáticos días finales de
su familia y la consiguiente producción literaria y cinematográfica lo
han convertido, sin lugar a dudas, en el hemofílico más famoso de la
historia. El zar de Rusia intentó mejorar los síntomas de le enfermedad
contactando con varios médicos pero fue el monje Rasputín el que
mejoraba los síntomas del niño probablemente con la hipnosis. Tras
el triunfo de la revolución rusa, toda la familia sufrió un exilio forzoso
a partir de agosto de 1917 y vivieron en la casa Ipatiev, situada a las
5
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
familiares; y d) que esta mutación ha sido reconocida como mínimo en
tres casos de pacientes graves de hemofilia B con una actividad coagulante residual inferior al 1%, uno de ellos reportado en España61,62.
Debido a la mayor frecuencia de la hemofilia A en relación con la
B, se especulaba que el tipo de hemofilia que afectó a la realeza europea
debió ser de tipo A grave, aunque sorprendían la larga supervivencia de
algunos de los miembros. El hemofílico más longevo de la descendencia
de la reina Victoria fue su biznieto Waldemar (1889-1945) que vivió 51
años. En el periodo de 1831-1920, la esperanza de vida se estimaba en
unos 11 años; aumentó hasta 20-30 años en el siguiente medio siglo
hasta alcanzar casi los 57 años en el periodo 1961-198063. La epidemia
de sida de la década de los ochenta (seroconversión elevada en el bienio
1981-1983 entre los pacientes tratados frecuentemente) comportó un
retroceso en cuanto al pronóstico de la enfermedad64,65.
¿Pueden establecerse diferencias entre ambos tipos de hemofilia66,67? En la de tipo B existe una menor incidencia de mutaciones
graves, hay un mayor número de pacientes con antígeno positivo y se
ha descrito un papel protector del factor IX intrarticular en modelos
animales. Además se conoce que la artropatía es menos grave y menor
el porcentaje de pacientes que requieren prótesis en comparación con
la hemofilia A68. Se conoce también que el fenotipo en la hemofilia no
depende únicamente del tipo de mutación en el gen F8 o F9 sino que
existen otros condicionantes que regulan la expresión de la enfermedad, como es la presencia de un factor protrombótico69-71.
Figura 3. Árbol genealógico de un paciente español con idéntica mutación a la
de las familias reales europeas.
destacaba el reto de conseguir líneas celulares estables que incorporen
vectores retrovirales, además de la posibilidad de manipular sistemas
de células autólogas74. Los mejores resultados de la terapia génica se
han obtenido en la hemofilia B con un adenovirus asociado, trabajo
que justificó la publicación de un editorial en la revista New England
Journal of Medicine en diciembre de 201175,76.
Caso clínico con la misma mutación real
Conclusión
Se trata de un niño sin antecedentes familiares de hemofilia nacido por
cesárea en el año 1998. El estudio de hemostasia debido a hematomas
espontáneos desde los 6 meses de edad permitió llegar al diagnóstico de hemofilia B grave debida a una mutación de empalme (IVS33A>G). Recibió el primer tratamiento sustitutivo a los 9 meses a raíz
de un traumatismo craneal y de la historia clínica destacaba la primera
hemartrosis en el codo a los 9 meses de edad. A los 3,5 años, a partir de
la segunda hemartrosis de una cadera, se inició tratamiento profiláctico
2 días a la semana y en la actualidad está incluido en un ensayo clínico
de factor IX de larga vida media sin haber desarrollado artropatía.
Con el fin de determinar el origen de la mutación IVS3-3A>G en
esta familia, se investigó su transmisión genética en los familiares del
paciente mediante secuenciación directa de F9 y mediante análisis de
ligamiento del cromosoma X; el análisis concluyó que la mutación
estaba asociada al cromosoma X heredado del abuelo del paciente y
se interpretó como consecuencia de una mutación somática de novo
ocurrida en la madre del paciente o a un mosaicismo germinal en el
abuelo72 (Figura 3).
La hemofilia es una de las enfermedades monogénicas más frecuentes
con referentes históricos de cientos de años. En las tres últimas décadas, la disponibilidad de factores de la coagulación eficaces y seguros para la prevención y tratamiento de las hemorragias ha permitido
mejorar la calidad de vida de los pacientes con una esperanza de vida
similar a la de la población. No obstante, debido a su elevado coste,
solo una tercera parte de los pacientes tiene acceso a este tratamiento
y conseguirlo para todos es la prioridad de la World Federation of
Haemophilia. El objetivo para el futuro es conseguir que la mayoría
de pacientes tengan acceso al tratamiento sustitutivo o la terapia génica, que permitiría la curación de la enfermedad. Desconocemos si la
incidencia de la enfermedad en miembros de la realeza europea habrá
contribuido a conseguirlo; en cualquier caso, este sería el mejor “regalo
de reyes” para los pacientes y sus familias.
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En el año 1949, Quick publicó los aspectos pediátricos de la hemofilia,
y en cuanto al tratamiento afirmaba que, a pesar de tratarse de una
enfermedad incurable, no estaba justificada una actitud derrotista 73.
En efecto, una tarea importante de los médicos era no informar a los
padres de que se trataba de una enfermedad desesperante porque había
pacientes hemofílicos que llevaban una vida útil y productiva y algunos
con carrera profesional. Cincuenta años después, en una revisión sobre
hemofilia A publicada en el New England Journal of Medicine, Hoyer
concluye que la enfermedad podría ser curada por la terapia génica y
6
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8
Ponencias
Ponencias
Laboratorio. Problemas prácticos diagnósticos en la hemostasia
Coordinadores: Vicente Vicente García. Centro Regional de Hemodonación. Murcia
Joan Carles Reverter Calatayud. Servicio de Hemoterapia y Hemostasia. Hospital Clínic. Barcelona
El simposio está dedicado a una revisión de algunas posibles dudas, de novedades y una valoración prospectiva en el campo del
laboratorio especializado de hemostasia aplicado a diferentes áreas de conocimiento que han conocido un desarrollo relevante en
los últimos años.
El simposio se inicia con la ponencia de la Dra. Pilar Llamas (Hospital Fundación Jiménez Díaz, Madrid) de título “Diagnóstico
de laboratorio del anticoagulante lúdico”. En ella comenta las similitudes y diferencias de las recomendaciones hechas por sociedades y comités internacionales para la determinación del anticoagulante lúpico, necesarias dado que no hay un gold standard para su
identificación y por la variedad de pruebas que se han empleado para su diagnóstico. Analiza primero el efecto, muy importante, de
las variables preanalíticas. Posteriormente, evalúa la utilidad del panel de pruebas diagnósticas a emplear, que debe estar estructurado
en las fases sucesivas de pruebas de escrutinio, de mezclas y confirmatorias. También evalúa la absoluta necesidad de una correcta
estandarización con intervalos de referencia y puntos de corte adecuados. Finalmente, analiza las posibilidades de su determinación en
los pacientes anticoagulados tanto con antivitaminas K como con heparinas o con inhibidores directos. De su ponencia se puede concluir que la determinación del anticoagulante lúpico continúa representando un reto diagnóstico para los laboratorios de hemostasia.
La segunda ponencia, “Aplicabilidad clínica de las técnicas de estudio de la función plaquetaria”, presentada por la Dra. Juana
Vallés (Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia), empieza revisando los puntos en que puede centrarse el estudio de la
función plaquetaria: activación de receptores, capacidad de adherirse y de interaccionar con diferentes tipos de células y liberación
de componentes bioactivos. Analiza después las técnicas de laboratorio disponibles, su potencialidad para uso clínico y sus ventajas
y desventajas. También valora las metodologías actualmente en desarrollo y su eventual aplicabilidad en problemas de sangrado o
en enfermedades tromboinflamatorias. Valora, asimismo, la relevancia clínica del laboratorio de hemostasia en la orientación diagnóstica de las trombocitopatías, con las dificultades que suelen aparecer, y la cuestión permanentemente de la monitorización de la
terapéutica antiplaquetaria, donde no hay actualmente consenso para su uso rutinario con valor clínico. Concluye que los avances
tecnológicos en microfluídica, secuenciación masiva o proteómica, junto al desarrollo de sistemas informáticos más avanzados, van
a suponer un gran avance en el diagnóstico de las alteraciones del funcionalismo plaquetario.
El Dr. Joan Carles Reverter (Hospital Clínic, Barcelona), en la tercera ponencia “Generación de trombina: utilidad y limitaciones en la evaluación de la hemostasia, trombosis y tratamientos anticoagulantes”, explica, primero, las múltiples funciones de
la trombina en la hemostasia, donde desempeña un papel central y clave modulando las interacciones entre mecanismos procoagulantes y anticoagulantes. A partir de estas funciones se deduce el potencial interés de su medición de una forma dinámica en las
denominadas pruebas de generación de trombina. Posteriormente, la ponencia revisa la historia de los métodos de medición de la
generación de trombina hasta llegar a las más sofisticadas técnicas actuales. Finalmente, aborda las potenciales utilidades clínicas
y las limitaciones técnicas y de medición de la generación de trombina con las metodologías disponibles hoy día para la evaluación
del riesgo trombótico o hemorrágico individual, la estimación del riesgo de recidiva de la enfermedad tromboembólica y el manejo
en situaciones especiales en pacientes con tratamiento con los diferentes anticoagulantes. Como comentario final destaca que la
facilidad de realización de la técnica, lo que requiere un amplio nivel de automatización, es clave para su futuro desarrollo como
parámetro analítico útil en la atención a los pacientes.
En la ponencia final, la Dra. Adriana Woods (Instituto de Medicina Experimental –IMEX– CONICET-Academia Nacional de
Medicina, Argentina), en una ponencia coordinada con CLATH, se ocupa del tema “Problemas prácticos en el diagnóstico de la
enfermedad de von Willebrand; utilidad y limitaciones de los métodos diagnósticos”. En su ponencia, la Dra. Woods revisa cada
uno de los pasos requeridos para llegar al diagnóstico de enfermedad de von Willebrand. Comenta el empleo de bleeding scores, la
importancia de la preanalítica con los errores en la toma de muestras y en su procesamiento y la fase analítica propiamente dicha. En
la fase analítica revisa las técnicas de orientación diagnóstica, las específicas y las de tipificación de variantes. Posteriormente, valora
y comenta las dificultades específicas que habitualmente se presentan en el diagnóstico de los tipos 1, 2B y 2N de la enfermedad
de von Willebrand, en la diferenciación entre las formas congénitas y las adquiridas, en el diagnóstico de la forma plaquetaria de la
enfermedad y en la identificación de portadores. Con todo ello nos presenta una visión global del estado del arte en el diagnóstico
de la enfermedad de von Willebrand.
11
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Diagnóstico de laboratorio del anticoagulante lúpico
Pilar Llamas Sillero, Silvia Monsalvo Saornil, Rosa Vidal Laso
Servicio de Hetamología y Hemoterapia. Hospital Universitario Fundación Jiménez Díaz. Madrid
Introducción
Tabla 1. Selección de pacientes para estudio del anticoagulante
lúpico (ISTH 2009)
El anticoagulante lúpico (AL) es un grupo heterogéneo de inmunoglobulinas de isotipos IgG y/o IgM que prolongan in vitro uno o varios de
los tiempos de coagulación dependientes de fosfolípidos. In vivo, estos
anticuerpos se asocian de forma significativa a eventos tromboembólicos y/o complicaciones gestacionales recurrentes. Su presencia
raramente se asocia con manifestaciones hemorrágicas.
Estos autoanticuerpos heterogéneos se dirigen directa y específicamente contra una variedad de proteínas de unión a fosfolípidos,
entre las cuales se encuentra la b2-glicoproteína 1 y la protrombina.
Las pruebas utilizadas en la determinación del AL se basan, por tanto,
en que los anticuerpos antifosfolípido: a) compiten con los factores
vitamina K dependientes por los sitios de unión en los fosfolipidos
aniónicos, aumentando los tiempos de coagulación; b) actúan como
inhibidores inespecíficos que son neutralizados por fosfolípidos en
exceso. Un test de AL positivo indica la presencia de un inhibidor de
la coagulación con la característica de que no afecta, de forma habitual,
las actividades de los factores de la coagulación de forma individual.
Se han empleado diferentes reactivos dependientes de fosfolípidos
para la determinación de laboratorio del AL. Debido a la heterogeneidad de inmunoglobulinas que constituyen el AL no hay una prueba gold
standard, ni hay un único test que pueda identificar el 100% de los AL1,2.
La determinación del AL continúa representando un reto diagnóstico
en el laboratorio de hemostasia. Los métodos para identificarlo están sujetos a un gran número de variables (reactivos, concentración y composición
de fosfolípidos, instrumentos, tiempos de coagulación utilizados, presencia
de plaquetas en la muestra, etc.). Esto condiciona el que continúe habiendo
puntos de controversia en el diagnóstico de AL: la detección de AL débiles,
falsos positivos, falsos negativos, etc. Sería interesante la participación de
los diferentes laboratorios en programas de calidad interna y externa.
Esta complejidad requiere que la determinación del AL esté regulada por sociedades y comités internacionales. En 1995 el subcomité
de AL/aFL (SSC) de la ISTH propuso recomendaciones para estandarizar el diagnóstico del AL, que siguen siendo la base del diagnóstico
de laboratorio. En 2009 se realizó una última actualización de estas
recomendaciones3,4, y además la ISTH emitió recomendaciones para
seleccionar los pacientes con criterio de estudio de estudio de AL
(Tabla 1). Posteriormente, el British Commite for standards in Haematology elaboró una actualización de sus guías para el estudio del
síndrome antifosfolípido (BSCH 2012)5. Finalmente, el Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI 2014) publicará este año sus
primeras guías de detección de AL6.
Aunque las guías más recientes son claras e incluyen mejoras de
las versiones anteriores, todavía hay puntos relacionados con los tests
de laboratorio y con la interpretación de AL que están pendientes de
resolver o son controvertidos (Tabla 2). En esta revisión daremos una
Baja
probabilidad
• Pacientes mayores con trombosis venosa y/o arterial
Moderada
probabilidad
• Pacientes asintomáticos con aPTT prolongado
• Mujeres con abortos precoces de repetición
• Pacientes jóvenes con ETV secundaria
Alta
probabilidad
• Pacientes jóvenes con ETV espontánea
• Trombosis arterial en pacientes jóvenes (<50 años)
• Pacientes con trombosis en lugares inusuales
• Mujeres con pérdidas fetales tardías
• Trombosis o complicaciones obstétricas en pacientes
con enfermedades autoinmunes (LES, PTI, AHAI, …)
aPTT, tiempo de tromboplastina parcial activado; ETV, enfermedad tromboembólica; LES,
lupus eritematoso sistémico; PTI, púrpura trombopénica inmune; AHAI: anemia hemolítica
autoinmune.
Tabla 2. Puntos controvertidos en el diagnóstico de laboratorio
del anticoagulante lúpico
• No existe un gold estandard actualmente disponible.
• Aunque los tests de laboratorio pueden proporcionar un grado
semicuantitativo de positividad, no proporcionan un resultado cuantitativo.
• Variabilidad en la sensibilidad de los análisis y reactivos usados para el
test debido a:
– Anticoagulación terapéutica (heparinas, AVK, anticoagulantes orales
de acción directa como rivaroxabán, apixabán o dabigatrán.
– Deficiencias de factores.
– Inhibidores de factores.
• Variabilidad significativa en la detección de AL débil.
• Elevadas tasas de detección de falsos negativos y falsos positivos.
• No hay criterio establecido para definir y distinguir la positividad débil,
moderada y fuerte.
• Es desconocido si “AL fuerte” representa mayor factor de riesgo
trombótico frente a “AL débil”.
• Variabilidad en la interpretación de resultados entre distintos laboratorios.
• Incumplimiento de las guías actuales ISTH SCC.
• No estandarización y no coordinación en el test interlaboratorio:
– Utilización de distintos paneles del test por distintos laboratorios.
– Utilización de métodos no estandarizados (ej. PNP o dTP).
– Variabilidad en el uso del test de mezclas.
– Uso de distintos valores de punto de corte definidos por distintos
procedimientos (media ±2 o 3 DS, percentil 99 o 95…).
– Distintas interpretaciones en la positividad de estudios de mezclas (ej.
Índice de Rosner, correcciones en %, corrección en el rango normal).
ISTH, Scientific Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and
Haemostasis; AL, anticoagulante lúpico; PNP, procedimiento de neutralización de plaquetas;
dPT, tiempo de protrombina diluido. Fuente: Modificado de Adams et al.2
12
Ponencias
Panel de pruebas diagnósticas
visión crítica de lo que nos aportan las tres últimas guías en el campo
del diagnóstico del AL, centrándonos en los temas más controvertidos
en relación con la detección de AL, como son: el efecto de las variables
preanalíticas, la elección de las pruebas (escrutinio y confirmación),
la interpretación de los resultados y cómo influyen los diferentes anticoagulantes en los resultados de esta prueba.
Dado que no hay un test gold standard1 disponible, el diagnóstico
de laboratorio de AL se basa en un panel de pruebas, que de forma
resumida se exponen en la Figura 1.
Tabla 3. Recomendaciones según la ISTH 2009 para el diagnóstico
del anticoagulante lúpico
Diagnóstico de laboratorio de anticoagulante lúpico
El diagnóstico de laboratorio del AL conlleva la realización de una
serie de pruebas cuyos resultados deben incluir una interpretación
final, indicando si los hallazgos son consistentes con la presencia o
ausencia de detección de AL. En ocasiones el diagnóstico no está claro.
ISTH 2009 no está de acuerdo con el uso del término “límite” (borderline) mientras que CLSI 2014 sugiere que el uso de “indeterminado”
puede ser útil cuando en un panel de pruebas el resultado no permite
claramente distinguir entre detección o falta de detección de AL.
Las tres guías que vamos a revisar apoyan la recomendación de
repetir un test positivo con un mínimo de 12 semanas para confirmar
la presencia del anticuerpo.
Tomando como base las recomendaciones de la ISTH de 2009
(Tabla 3), a continuación se plantea una visión actualizada del diagnóstico de laboratorio de AL, teniendo en cuenta las aportaciones de
las dos últimas guías5,6.
Recogida de la muestra en ausencia de tratamiento anticoagulante
• Sangre venosa en 0,109 M citrato sódico 9:1.
• Doble centrifugación. No filtración.
• Congelar el plasma a -70° C si se pospone. Descongelar mediante
inmersión a 37° C en 5 minutos.
Dos pruebas para la detección del AL basadas en diferentes ensayos
• dRVVT: debe considerarse el test principal.
• Un aPTT sensible (sílice como activador y baja concentración de fosfolípidos).
• Establecer el rango de normalidad de ambas pruebas en cada laboratorio
Expresión de los resultados: se expresan en ratio: valor paciente/valor PPN.
Interpretación de resultados: test de escrutinio potencialmente sugestivo
de AL: ratio superior al rango de referencia local del laboratorio.
Pruebas confirmatorias de la presencia del AL
• Realizar los mismos tests de escrutinio usando alta concentración de
fosfolípidos (FL).
• Utilizar fosfolípidos hexagonales para aumentar la concentración de FL.
• Las plaquetas no son recomendadas como fuente de fosfolípidos.
• Establecer el rango de normalidad de ambas pruebas en cada laboratorio.
Expresión de los resultados: se expresan en ratio: valor paciente/valor PPN.
Variables preanalíticas
Las plaquetas residuales en el plasma pueden acortar los tiempos de
coagulación y enmascarar la presencia de AL, particularmente si el
plasma estaba previamente congelado. Hay acuerdo común en que
la sangre debe ser recogida en citrato sódico 0,109 mol/L. Además,
es altamente recomendable que la muestra se someta a un proceso
de doble centrifugación para conseguir un recuento plaquetario final
menor a 10x109/L3-9.
ISTH 2009 recomienda realizar una primera centrifugación de
la muestra a 2000 g durante 15 minutos a temperatura ambiente, y
posteriormente una segunda centrifugación durante 10 minutos a más
de 2.500 g. El BSCH 2012 y el CLSI 2014 discrepan en realizar una
segunda ultracentrifugación a más de 5.000 g porque se pueden generar micropartículas. Hoy día tampoco se recomienda la filtración con
filtros de acetato de celulosa de 0,22 mm porque introducen variables
como la pérdida de factor de von Willebrand y de otros factores de la
coagulación.
Otro tema son las pruebas iniciales utilizadas en estudio básico
de coagulación dentro de la determinación del AL, y que incluyen el
tiempo de protrombina, el tiempo de tromboplastina parcial activada
(aPTT) y el tiempo de trombina. Estas pruebas son imprescindibles
como etapa previa a la realización del test del AL para excluir coagulopatías no filiadas o descartar que el paciente esté recibiendo terapia
anticoagulante.
Por otro lado, el CLSI 2014 recomienda el empleo de rutina de un
reactivo de aPTT insensible a AL en pacientes con aPTT prolongado,
como prueba adicional, permitiendo de forma eficaz hacer un diagnóstico diferencial rápido entre una deficiencia real de factores de la
coagulación y una deficiencia “simulada” por la presencia de un AL y,
por tanto, sin repercusión clínica. Un ejemplo sería realizar un aPTT
que emplee ácido elágico como activador de contacto10.
Expresión de los resultados del AL
• Ratio normalizada dRVVT: ratio escrutinio dRVVT/ratio confirmatorio dRVVT.
• Ratio normalizada aPTT sensible: ratio escrutinio aPTT/ratio
confirmatorio aPTT.
• Establecer el rango de normalidad de ambas pruebas en cada laboratorio.
Interpretación de los resultados
• AL positivo: ratio normalizada superior al rango de referencia local del
laboratorio.
• AL negativo: ratio normalizada dentro del rango de referencia local del
laboratorio.
Informe de los resultados o conclusión del estudio
• Presencia de AL: una o dos pruebas positivas. Confirmar en 12 semanas.
• Ausencia de AL: las dos pruebas negativas.
dRVVT, tiempo de veneno de víbora de Russell diluido; aPTT, tiempo de tromboplastina parcial
activado; PPN: plasma de paciente normal.
Figura 1. Panel de pruebas recomendadas en el diagnóstico del anticoagulante
lúpico.
13
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Tests de escrutinio
consideran que no hay suficiente evidencia para retirarlo del
panel de escrutinio, ya que en ocasiones detecta anticuerpos no
reactivos para el dRVVT ni para el aPTT.
• Otros tests: el empleo de otros venenos de serpiente además
del dRVVT no se recomienda por parte de la ISTH 2009. Se
encuentran disponibles comercialmente la textarina, el reactivo
para el tiempo de veneno de serpiente taipán (TVST) y el tiempo
de ecarina (TE). CLSI 2014 menciona el tiempo de veneno de
Vipera lebetina como posible alternativa al dRVVT.
Qué tests de escrutinio se recomiendan
Se ha recomendado que al menos se empleen dos métodos antes de
clasificar una muestra como negativa para AL. Las tres guías recomiendan que uno de los test a utilizar sea el dRVVT ya que ha demostrado
ser sensible a anticuerpos-β2-glicoproteína 1 y se correlaciona con el
desarrollo de trombosis3,4,6. Otras sugerencias son:
En resumen, la pareja dRVVT/aPTT es la estrategia diagnóstica
más sensible para confirmar la detección/exclusión de AL en la mayoría de las muestras.
• ISTH 2009 establece que el riesgo de resultados falsos positivos está aumentado si se realizan más de dos tests, y restringe
la elección al dRVVT por su especificidad y al aPTT con baja
concentración en fosfolípidos por su sensibilidad. No aconseja
la realización de otros tests adicionales. Se recomienda un punto
de corte que se encuentre entre el percentil 97,5-99, ya que individuos normales pueden formar parte de los valores extremos
del test resultando falsos positivos.
• BSCH 2012 indica que el dRVVT debe ser uno de los tests
utilizados en el escrutinio de AL, siendo el otro test un aPTT
sensible a AL (ALS-aPTT), un aPTT modificado o el tiempo de
protrombina diluido (dPT).
• CLSI 2014 recomienda el dRVVT y un ALS-aPTT como primera línea de análisis en el escrutinio, pero no excluye el empleo
de otros tests durante el análisis inicial o en una segunda etapa.
Estudios de mezclas
Los estudios de mezclas son parte del diagnóstico del laboratorio del
AL, aunque existe discrepancia en cuándo y en qué momento son
necesarios realizarlos. Determinan la presencia de un inhibidor por
la persistencia de un tiempo de coagulación anormal tras realizar una
mezcla “plasma del paciente + pool de plasmas normales” (PPN) en
una proporción 1:1. El tiempo de coagulación se corrige si es debido
a una deficiencia de factor y permanece prolongado en presencia de
un inhibidor. El PPN deberá ser preparado pobre en plaquetas. El AL
generalmente prolonga inmediatamente el tiempo de coagulación en el
estudio de mezclas, aunque un 10% pueden ser tiempo-dependiente12.
Hay diferencia entre las tres guías en la descripción de los reactivos
de aPTT utilizados en esta etapa. ISTH 2009 es la única que especifica
la dilución de fosfolípidos, mientras que el modo de expresar los reactivos de las otras dos guías incluye reactivos aPTT sin fosfolípidos o
reconocidos como ALS-aPTT. Existe riesgo de pérdida de AL débiles
con esta técnica si los fosfolípidos están muy concentrados.
• ISTH 2009 propone realizar el test de mezclas inmediatamente
después de encontrar un test de escrutinio alargado. El test de
confirmación solo se llevará a cabo si se documenta un inhibidor
en el estudio de mezclas. El test de mezclas es sugestivo de AL si
el tiempo de coagulación de la mezcla es más largo que el valor
del punto de corte local o si el índice del anticoagulante circulante (ICA) es más largo que el valor del punto de corte local.
Estas mismas recomendaciones las hace CLSI 2014.
• BSCH 2012 refiere que el test de mezclas mejora la especificidad
pero introduce un factor de dilución que puede hacer que los AL
débiles aparezcan como negativos. Establece que en ausencia de
otras causas de tiempo de coagulación prolongado, las muestras
con test de mezclas negativo, pero test de escrutinio y confirmatorio positivo en plasma, se considerarán AL positivo.
• CLSI 2014 cambia el orden del panel de tests iniciales. Aconseja realizar primero el test de escrutinio y confirmatorio, y
solo realizar el test de mezclas si los tests anteriores presentan
limitaciones analíticas que puedan dar lugar a resultados falsos
negativos.
Otros tests
BSCH 2012 y CLSI 2014 proponen otros tests además del dRVVT y
del aPTT para poder detectar anticuerpos clínicamente significativos
que no se detecten con las pruebas anteriores.
• Tiempo de coagulación con caolín (KCT): era uno de los tests
más sensibles por su baja concentración en fosfolípidos. Sin
embargo ISTH 2009 no lo recomienda por su baja reproductibilidad y las dificultades técnicas en la realización de la prueba.
CLSI 2014 considera que si se realiza por personas con experiencia puede ser un test a considerar. Una limitación importante
del KCT es la falta de disponibilidad del análisis de confirmación, por lo que la especificidad disminuye al no poderse evidenciar la dependencia a fosfolípidos11.
• Tiempo de coagulación con sílice (SCT): es similar al test de KCT
con la ventaja de que es compatible con los analizadores automáticos, empleando la detección del coágulo foto-óptico, por lo que se
resuelven los problemas de reproductibilidad que presentaba previamente KCT. El SCT está disponible como test integrado, con
alta y baja concentración de fosfolípidos, por lo que es una buena
herramienta diagnóstica para usarlo con el sistema dRVVT.
• Tiempo de protrombina diluido (dPT): no lo apoya la ISTH por
la variabilidad en los reactivos de tromboplastina. BCSH y CLSI
En la reunión del 14th International Congress on Antiphospholipid
Antibodies Task Force celebrada en Río de Janeiro uno de los puntos
a debatir fue cuándo realizar el test de mezclas. Las conclusiones se
resumen en la Figura 213.
Test de confirmación
Las tres guías están de acuerdo en que el test de confirmación usado
para demostrar la dependencia de fosfolípidos debe basarse en un test
de escrutinio anormal.
14
Ponencias
ISTH 2009 indica que el test de confirmación se debe realizar
aumentando la concentración de fosfolípidos con la fase de fosfolípidos bicapa o hexagonal. BSCH 2012 sugiere emplear una alta concentración de fosfolípidos sin especificar el tipo y con neutralización
de plaquetas (PNP) o un reactivo insensible a AL. ISTH y BCSH
recomiendan realizar un cálculo para demostrar o excluir la dependencia a fosfolípidos.
ISTH 2009 recomienda la aplicación del percentil 99 como punto
de corte, lo cual equivale a la media del IR ± 2,3 DS para los datos
en una distribución normal, lo que disminuye los resultados falsos
positivos, incrementando la especificidad, a expensas de reducir la
sensibilidad.
BSCH 2012 se centra en la infraestimación obtenida en el IR generado con muestras pequeñas, y cita la opción de validar los puntos
de corte previamente establecidos en pequeños números de donantes
normales (20-60 donantes).
Aunque esta herramienta estadística no es perfecta, CLSI 2014 mantiene la media del RI ± 2 DE como una propuesta válida para el diagnóstico de laboratorio, así como el uso del percentil 97,5, ya que genera
menos falsos negativos que si se considera el percentil 99. Generalmente,
cada reactivo aporta su punto de corte preestablecido por la casa comercial, que puede servir de base para establecer el punto de corte en cada
laboratorio en función de sus métodos y reactivos utilizados7,8.
% de corrección del ratio = Escrutinio ratio – Confirmatorio ratio x 100
Escrutinio ratio
CLSI 2014 plantea alternativas de expresión de los resultados del
test en función de la prueba. En concreto recomienda realizar una
ratio normalizada para dRVVT, SCT y dPT cuando se utilicen juntos
escrutinio y confirmatorio. El BCSH también plantea como alternativa
utilizar la ratio nomalizada para el dRVVT.
Normalización de la ratio escrutinio: confirmatorio =
Confirmatorio ratio
Escrutinio ratio
Diagnóstico del anticoagulante lúpico en pacientes
anticoagulados
Tests integrados
Con frecuencia el test del AL se solicita en pacientes anticoagulados,
y muchas veces este hecho se desconoce cuando llega la petición de
la prueba al laboratorio, por lo que es necesario contemplar unas recomendaciones en este tipo de pacientes. Las tres guías están de acuerdo
que la determinación del AL en pacientes que reciben antagonistas de
la vitamina K (AVK) y dosis terapéuticas de heparina no fraccionada
(HNF) debería ser pospuesta hasta que se suspenda la anticoagulación
durante un periodo de tiempo apropiado3,5,6.
Incluyen el test de escrutinio y el confirmatorio (por ejemplo con alta
y baja concentración de fosfolípidos) de forma simultánea en cada
paciente y directamente calculando el porcentaje de corrección en forma de ratio, independientemente de si el escrutinio es positivo. Una
ventaja de estos tests es que hay mayor posibilidad de detectar AL
débiles, ya que de forma basal el tiempo de coagulación puede estar
alargado, pero no lo suficiente como para superar el punto de corte,
mientras que la discrepancia entre escrutinio y confirmatorio puede
poner de manifiesto el anticuerpo.
Antagonistas de la vitamina K (AVK)
Intervalos de referencia/puntos de corte
ISTH 2009 indica que dRVVT y aPTT pueden realizarse si el INR es
menor de 1,5. Si el INR se encuentra entre 1,5-3,0 se puede realizar en
una mezcla 1:1 con PPN, teniendo en cuenta el efecto de la dilución.
Los tests integrados y los que empleen el dRVVT “insensibles a AVK”
no están recomendados porque todavía no se ha confirmado su validez
y requieren estudios adicionales.
BSCH 2012 y CLSI 2014 proponen realizar el test de escrutinio y
confirmatorio en mezclas 1:1 con PPN pero no restringen esta práctica
a INR menores o iguales a 3. Sin embargo, los resultados con INR
mayores de 3 hay que tomarlos con cautela. BSCH 2012 establece
que un escrutinio positivo en la mezcla puede tomarse como base
para sospechar un inhibidor, y el corfirmatorio puede demostrar una
dependencia a fosfolípidos.
Ambos documentos establecen un punto importante, que el test
de mezclas negativo no excluye la presencia de AL por el efecto de
dilución. Los ensayos en plasma sin diluir pueden dar lugar a falsos
positivos o falsos negativos por lo que no se recomiendan11,14-16. Sugieren que en pacientes con AVK podrían ser útiles el TVST junto con
el TE como tests de escrutinio y el test de neutralización plaquetaria
como test de confirmación.
La variabilidad de reactivos precisa un intervalo de referencia (IR) para
la interpretación de los resultados. Históricamente se ha considerado
la media del IR de poblaciones de donantes normales ±2 desviaciones
estándar (DS). En una distribución de Gauss genera un punto de corte
en el percentil 97,5 para determinar la positividad, por lo que un 2,5%
de pacientes con valores normales se encontrarían en valores extremos
y obtendrían un resultado falso positivo.
Heparinas
ISTH 2009 y CLSI 2014 transmiten la necesidad de precaución cuando
se interpreten resultados en pacientes que reciben HNF. BSCH 2012
especifica que el test no debe realizarse si el paciente recibe dosis
Figura 2. Algoritmo para realizar el test de mezclas. Basado en las recomendaciones
del 14th International Congress on Antiphospholipid Antibodies Task Force13.
15
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Conclusión
terapéuticas ya que puede ser causa de resultados erróneos. CLSI 2014
analiza qué reactivos neutralizadores de heparina (como los encontrados en muchos reactivos comerciales de dRVVT) se podrían añadir
previamente al plasma. Estos reactivos neutralizadores de heparina
pueden mitigar el efecto hasta un nivel determinado, normalmente
entre 0,8-1,0 U/mL, lo que se deberá tener en cuenta en la interpretación del resultado.
Los análisis de AL con HBPM se afectan mucho menos, particularmente con los reactivos de dRVVT. En cualquier caso, los reactivos
neutralizadores de heparina suelen ser capaces de neutralizar las dosis
profilácticas14.
Las semejanzas y puntos de controversia entre las tres guías comentadas (Tabla 4) muestran que aún faltan aspectos por unificar para llegar
a un consenso y prácticas comunes en los diferentes laboratorios de
hemostasia. Parece que hay unanimidad en que la pareja de pruebas
dRVVT y aPTT constituye una estrategia diagnóstica sensible y específica que no ha sido superada por otras técnicas alternativas. Es tema
de debate, como se ha planteado, el lugar que ocupa dentro de las
estrategias diagnósticas del AL el test de mezclas, así como el papel
de otros tests adicionales.
En relación con la determinación del AL en pacientes en tratamiento anticoagulantes, el AL podría ser medido en pacientes en tratamiento con AVK en plasma diluido 1:1 para aumentar la sensibilidad de la
técnica, teniendo en cuenta las limitaciones. En plasmas que contengan
anticoagulantes orales de acción directa no es posible la determinación
de AL con los ensayos habituales.
Es importante que los laboratorios de hemostasia conozcamos las
recomendaciones publicadas por las diferentes sociedades y comités
internacionales, y seamos críticos con la determinación del AL en
nuestro laboratorio. La adherencia a programas de calidad externa
e interna puede ayudar a identificar problemas y ayudar a establecer
mejoras en el diagnóstico de laboratorio de AL.
Anticoagulantes orales de acción directa
Solo las guías de CLSI 2014 dan detalle de las potenciales interferencias de estos anticoagulantes. Los inhibidores directos de la trombina (IDT) como el dabigatrán interfieren con todos los análisis de
AL e introducen un elevado riesgo de resultados falsos positivos. A
diferencia de la situación con los AVK, donde existe una deficiencia
adquirida de los factores de coagulación que puede ser corregida con
el test de mezclas y revelar el AL, los tests de mezclas no corrigen el
efecto de los IDT o de los inhibidores directos del Xa ya que no hay
una deficiencia del factor subyacente.
Los inhibidores del factor Xa, rivaroxabán o apixabán, interfieren más con el dRVVT que con el aPTT, teniendo un efecto variable
dosis-reactivo dependiente en los análisis basados en el tiempo de
protrombina. Un estudio reciente ha demostrado que TVST junto con
ET es un test sensible para detectar AL en pacientes que reciben terapia
con rivaroxabán, porque ambas fracciones del veneno son activadores
de protrombina y no se ven afectados por la inhibición del factor Xa
por el rivaroxabán14.
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Tabla 4. Resumen de las diferencias entre las guías ISTH, BCSH, CLSI para la detección del anticoagulante lúpico
Área de recomendación
Preparación de la muestra
Ensayos de uso
Orden del test
Derivación de ratio
IR/punto de corte
Cálculo dependencia
fosfolípidos
Test mezclas
Test pacientes con AVK
Test pacientes HNF
ISTH 2009
BCSH 2012
CLSI 2014
Doble centrifugación
Doble centrifugación
Doble centrifugación
dRVVT + aPTT
dRVVT + aPTT+ otros
dRVVT + aPTT y/u otros
Escrutinio-mezcla-confirmatorio
Escrutinio-mezcla-confirmatorio
Escrutinio-confirmatorio-mezcla
PPN denominador
PPN denominador
Media IR denominador
Percentil 99
Percentil 97,5 si gaussiano
Percentil 97,5 si gaussiano
% corrección de escrutinio por
confirmatorio o AL ratio (escrutinio/
confirmatorio)
% corrección de escrutinio por
confirmatorio o AL ratio (escrutinio/
confirmatorio)
% corrección de escrutinio por
confirmatorio o AL ratio (escrutinio/
confirmatorio)
Mezcla 1:1 con PPN; interpretar con ICA o
punto de corte específico
Mezcla 1:1 con PPN
Mezcla 1:1 con PPN; interpretar con
ICA o punto de corte específico
Plasma concentrado si INR<1,5; mezcla
con PPN si INR>1,5 <3,0
Escrutinio y confirmatorio en mezcla
1:1 con PPN; TVST + TE o PNP
Escrutinio y confirmatorio en mezcla
1:1 con PPN; TVST + TE o PNP
Precaución en la interpretación
No recomendado
Puede detectar AL en algunos casos
donde es efectivo el neutralizador de
heparina
aPTT, tiempo de tromboplastina parcial activada; BSCH, British Committee for Standards in Haematology; CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute; dRVVT, tiempo de veneno de víbora de Russell; TE,
tiempo de ecarina; ICA: índice de anticoagulante circulante; INR, ratio normalizada internacional; ISTH, International Society of Thrombosis and Haemostasis; AL, anticoagulante lúpico; PPN, pool de plasma
normal; PNP, procedimiento con neutralización de plaquetas; IR, intervalo de referencia; TVST, tiempo de veneno de serpiente taipán; HNF, heparina no fraccionada; AVK, antagonistas de la vitamina K.
Fuente: Modificado de Moore GW9.
16
Ponencias
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17
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Aplicabilidad clínica de los tests de función plaquetaria
Juana Vallés1, Antonio Moscardó2, Ana Latorre2, Ana Cid3, Isabel Madrid4, M..ª Teresa Santos1
Centro de Investigación. 2IIS La Fe. 3Unidad de Hemostasia y Trombosis. 4Unidad de Cuidados Intensivos. Hospital Universitario y Politécnico La Fe. Valencia
1
de adenina, serotonina, proteínas adhesivas, factores de la coagulación,
factores de crecimiento, etc.) y productos metabólicos como ácido
araquidónico libre (AA), tromboxano A2 (TXA2) y otros eicosanoides.
Algunas de estas sustancias son agonistas plaquetarios secundarios que
amplifican la activación de las plaquetas que los liberan e interaccionan
con otras plaquetas y células del entorno induciendo el reclutamiento
o agregación plaquetaria1,2. Concomitantemente, el daño al endotelio
induce la exposición en el mismo de factor tisular (FT), una glucoproteína integral de membrana que se localiza en algunas células de la
pared vascular, como en los fibroblastos y en las células del músculo
liso. La unión de FT al FVIIa, que se encuentra en pequeña cantidad
en el plasma, inicia la generación de trombina, otro potente inductor
de la activación plaquetaria, que potencia y refuerza la activación y el
reclutamiento de las plaquetas inducido por el colágeno y promueve la
formación de fibrina que estabiliza el trombo3. Las plaquetas participan
también en la etapa final de consolidación del trombo por su papel en la
retracción del coágulo, que está mediada por la unión del fibrinógeno
al receptor GPIIbIIIa y a las proteínas contráctiles del citoesqueleto4,5.
Las distintas manifestaciones funcionales de la respuesta plaquetaria al estímulo requieren la coordinación y el control de múltiples
mecanismos de señalización que conducen a la respuesta funcional
apropiada de las plaquetas (secreción, agregación), las proteínas G,
el metabolismo del fosfatidil inositol, la síntesis de eicosanoides, los
movimientos de calcio y las distintas vías de fosforilación de proteínas
en las plaquetas6, aunque las conexiones entre los distintos mecanismos de señalización no están todavía totalmente esclarecidas.
En la formación del tapón hemostático la alteración de alguna
de estas funciones plaquetarias puede producir una sintomatología
hemorrágica cuya gravedad depende del mecanismo afectado. Por el
contrario, la activación plaquetaria excesiva o en lugares no deseados
puede conducir a procesos trombóticos.
Las plaquetas son células anucleadas que tienen un papel crucial en la
hemostasia, donde contribuyen a la formación del tapón hemostático
y a su estabilización. En la actualidad también se reconoce su participación en otros procesos importantes en la fisiopatología, entre los
que se encuentran: la trombosis, la aterosclerosis, los mecanismos de
defensa innata, o la inflamación, y están relacionadas con la progresión
y metástasis en el cáncer. Esta diversidad de funciones se debe a varios
factores: a) el gran número de receptores que expresan en su membrana, que pueden modular su respuesta a múltiples estímulos; b) su
capacidad de adherirse e interaccionar con diferentes tipos de células
como neutrófilos, monocitos, eritrocitos y células endoteliales, y c) la
capacidad de las plaquetas de liberar, de una manera coordinada, un
gran número de componentes contenidos en sus gránulos citoplasmáticos o producidos metabólicamente en el curso de su activación, que
poseen diversas actividades biológicas. Estas sustancias liberadas, al
interaccionar con las células de su entorno y/o con los factores plasmáticos de la coagulación, contribuyen al desarrollo de patologías con
componente inflamatorio y trombótico. Todo ello está despertando un
creciente interés en el desarrollo de diversas técnicas de medida de la
función plaquetaria concebidas para controlar y estandarizar un aspecto específico de la reactividad plaquetaria. Los estudios de función
plaquetaria en el laboratorio han estado tradicionalmente orientados a
la detección y caracterización de trombocitopatias congénitas o adquiridas que pueden cursar con diátesis hemorrágica. Sin embargo, en los
últimos años la utilización de tests clásicos o de nuevo desarrollo se
ha incrementado de manera importante con los estudios orientados a
monitorizar la eficacia de la terapia antiplaquetaria con el objeto de
identificar a pacientes con riesgo a padecer un nuevo accidente vascular o un problema de sangrado. Las técnicas de la función plaquetaria
también se han propuesto como ayuda perioperatoria en la predicción
del sangrado y para monitorizar la eficacia de varias terapias prohemostáticas.
Nuestro objetivo es revisar las técnicas actuales de medida de la
función plaquetaria de uso clínico, sus ventajas y desventajas, así como
la posible aplicación de nuevas tecnologías que, aunque se realizan en
laboratorios especializados, pueden ayudar en el estudio de pacientes
que padezcan de problemas de sangrado o enfermedades tromboinflamatorias.
Técnicas de medida de la función plaquetaria
En los estudios de la función plaquetaria, el control adecuado de las
condiciones preanalíticas de la muestra a estudiar es muy importante
para obtener resultados exactos y reproducibles, ya que actualmente no
existen controles de calidad internos o externos que ayuden a estandarizar los resultados entre diferentes laboratorios. En la mayoría de los
estudios, como la agregometría, los análisis se realizan en sangre fresca
dentro de las cuatro horas siguientes a la extracción de la muestra, por
lo que los laboratorios tienen que establecer a partir de sujetos “sanos”
sus propios rangos de normalidad. Por ello la industria está tratando de
automatizar diversos enfoques experimentales que permitan estudiar
la función plaquetaria con mayor facilidad. Esto permite su aplicación
en estudios clínico-epidemiológicos más amplios. La automatización
favorece la estandarización y la posibilidad de comparar resultados
Las plaquetas en la formación del tapón hemostático:
respuestas funcionales
La formación del tapón hemostático se inicia tras la rotura de un vaso al
exponerse a la sangre circulante sus estructuras subendoteliales. Sobre
este vaso dañado las plaquetas se adhieren al factor von Willebrand y
al colágeno expuesto, que inicia la activación. A su vez, las plaquetas
activadas liberan sustancias contenidas en sus gránulos (nucleótidos
18
Ponencias
por parte de la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia
(ISTH)10,11. Este debería ser un objetivo principal, que permita reducir
la variabilidad entre laboratorios y aproximar las interpretaciones de
los resultados.
La aportación de esta técnica a los conocimientos de la biología
y bioquímica de las plaquetas y su utilidad para la detección de trombocitopatías es inestimable12,13. En el contexto de la monitorización
de los fármacos antiplaquetarios, la agregación inducida por ácido
araquidónico es muy informativa sobre el efecto de la aspirina en las
plaquetas, ya que esta se produce por el TXA2 formado. No obstante,
hay que tener en cuenta que a la respuesta agregatoria final del araquidónico también contribuye el ADP liberado de los gránulos liberados
de las plaquetas activadas, por lo que su especificidad para monitorizar
el efecto de la aspirina es menor que la cuantificación directa de la
síntesis de TXA2 por métodos bioquímicos, a la que nos referiremos
más adelante. Asimismo, la agregación en PRP con concentraciones
de ADP (5-20 mM) es indicativa del efecto de los antagonistas del
receptor P2Y12 (clopidogrel, pasugrel, ticagrelor) y del efecto de bloqueantes de GPIIbIIIa (abciximab, tirofiban, eptifibatide). Para esto
último, una alta concentración del mimético de trombina (TRAP) es
también de utilidad14,15.
Una modificación del agregómetro tradicional es el lumiagregómetro, el cual es capaz de determinar la liberación de ATP de los
gránulos en paralelo con la agregación, de forma que sería preferible
su empleo en pacientes en los que se sospeche un defecto relacionado
con la liberación de gránulos densos.
entre laboratorios, uno de los problemas de los estudios manuales de
la función plaquetaria.
Tiempo de hemorragia
Consiste en realizar una pequeña incisión y determinar el tiempo que
tarda en detenerse la hemorragia, el cual depende casi exclusivamente
de la adhesión y agregación plaquetarias. Es la técnica más global
de estudio de función plaquetaria, y la única que se realiza in vivo.
Además de ser crítica la habilidad de la persona que la realice, también variables del paciente como sexo, edad, número de plaquetas,
hematocrito, espesor o temperatura de la piel afectan al resultado7.
Se han realizado intentos de disminuir la variabilidad de la técnica
debida a diferencias en la incisión con el sistema Simplate II. Detecta
el efecto de distintos fármacos antiplaquetarios o defectos plaquetarios7,8, aunque el elevado coeficiente de variación de la técnica, la
pobre sensibilidad y el tratarse de una técnica invasiva han llevado a
su progresivo abandono.
Agregometría óptica
La agregometría óptica continúa siendo el estándar para el estudio de
la función plaquetaria. La técnica mide el paso de luz a través de un
plasma rico en plaquetas (PRP) frente a un plasma pobre en plaquetas
(PP, control). Tras la adición de un agonista plaquetario las plaquetas
cambian de forma, lo que se traduce en una disminución en la luz
transmitida. Si la muestra está agitada y están presentes fibrinógeno o
factor von Willebrand las plaquetas agregarán, lo que se traducirá en
un incremento de la luz transmitida9. Además de la intensidad máxima de la agregación, también se puede obtener información valiosa
de otros parámetros como el tiempo de latencia hasta que se inicia la
agregación, la velocidad de agregación (pendiente de la curva) o el
porcentaje de desagregación. La clave de la agregometría es el empleo
de los agonistas adecuados y en las concentraciones correctas. La agregación plaquetaria puede ser inducida por una gran variedad de agonistas plaquetarios tanto fisiológicos (ADP, colágeno, trombina, ácido
araquidónico, epinefrina, PAF, serotonina, etc.) como no fisiológicos
(el análogo del TXA2 U46619, ionóforos de calcio, forbol miristato
acetato [PMA], thrombin receptor agonista peptide [TRAP-6], etc.).
Además, la aglutinación de las plaquetas puede lograrse empleando
ristocitina o botrocitina7. Como hemos comentado, existen una serie
de variables preanalíticas que afectan a la calidad de los resultados
obtenidos de una agregometría, como son la correcta extracción de
la muestra, la temperatura, el tiempo tras la extracción o el ajuste
o no del número de plaquetas para el ensayo. Un factor clave en el
estudio de la agregación es la elección del anticoagulante empleado,
ya que podemos encontrar resultados distintos, relacionado con las
distintas concentraciones de calcio que se obtienen en cada caso. Este
problema se puede evitar utilizando anticoagulantes que no secuestren
el calcio como son los inhibidores directos de la trombina como la
hirudina, lipuridina o D-phenylalanyl-L-prolyl-larginina (PPACK)7.
Una limitación de la agregometría óptica es que el ensayo se realiza en
ausencia de otras células sanguíneas y a una velocidad de cizalladura
baja. Además, su empleo está limitado en el caso de pacientes con
trombocitopenia o en plasmas lipémicos.
Se están realizando intentos de estandarizar la agregometría óptica,
tanto en los parámetros preanalíticos como los propios del análisis
El método Optimul
Estudia la agregación de las plaquetas en un una placa (Greiner BioOne; Stonehouse, Gloucestershire UK) de 96 pocillos recubiertos con
gelatina para impedir la activación de las plaquetas. Los agonistas se
añaden a los pocillos y se liofilizan. El PRP o el PP se añaden con una
pipeta multicanal en los pocillos apropiados colocándose sobre un
agitador a 37° C y se mantiene durante 5 minutos a 1.200 revoluciones
por minuto; la lectura final se realiza por absorbancia a una longitud de
onda de 595 nm. La agregación se expresa como el porcentaje máximo
en la trasmisión de luz entre el PRP y PPP en respuesta al agonista. Las
ventajas de la técnica es que permite el estudio de un panel amplio de
agonistas y múltiples muestras al mismo tiempo. Dada la semejanza
con la agregación plaquetaria las limitaciones de esta técnica serán
similares entre sí. La técnica se encuentra en nivel experimental y la
experiencia en la clínica es reducida16.
Agregometría de impedancia
El sistema consiste en la variación en la resistencia que se produce
al depositarse las plaquetas sobre un electrodo introducido en PRP o
sangre total7. Presenta la ventaja sobre la agregometría óptica de que
la función plaquetaria se ensaya en sangre total sin manipular, lo que
evita la pérdida de subpoblaciones plaquetarias o la activación plaquetaria por la centrifugación. Además utiliza pequeños volúmenes de
sangre. No obstante, para aumentar la sensibilidad, la sangre se diluye
1:1 con solución salina, lo que se asocia con dilución de proteínas
plasmáticas y componentes celulares de la sangre. La agregometría de
impedancia se ve afectada por las mismas variables que la agregación
óptica, como el anticoagulante, el tiempo de extracción, el número de
19
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
plaquetas y en este caso del hematocrito, etc. Cuando se compara con
la agregometría óptica se observa que el coeficiente de variación entre
pacientes obtenido por esta técnica es mayor que el observado con
la agregometría óptica, existiendo una correlación baja entre ambas.
Ambas técnicas necesitan personal con experiencia.
El sistema se ha empleado para detectar defectos en la función
plaquetaria y monitorizar los tratamientos antiplaquetarios. Una actualización facilitada de esta técnica es el Multiplate® (H. Hoffmann-La
Roche Ltd., Basel, Switzerland) que permite el uso de cubetas con
electrodos desechables, y que empleando diferentes combinaciones de
agonistas permite detectar disfunciones plaquetarias y monitorizar los
fármacos antiplaquetarios7,14. Por otra parte, la agregación en sangre
total asociada a un lumiagregómetro es capaz de identificar defectos
de liberación de las plaquetas7.
fisiológico. Para ello se realiza un doble contaje de plaquetas en sangre
total en un tubo anticoagulado con EDTA (para evitar la agregación)
y en otro tubo anticoagulado con citrato, en presencia de un agonista
plaquetario. La diferencia de contaje de plaquetas entre los dos tubos
daría el porcentaje de agregación7,14. Aunque el sistema se ha empleado
para la detección del efecto antiplaquetario de aspirina y clopidogrel20,
son necesarios más estudios para demostrar su utilidad clínica. La
principal ventaja de este método es que es fácil de realizar y puede ser
utilizado ampliamente en laboratorios clínicos ya que solo se necesita
un contador de células. Los factores que afectan a la técnica no se
conocen a pesar de las ventajas, ya que los laboratorios prefieren sus
propias versiones del método.
PFA-100®
Valora la cinética de generación de fibrina, firmeza del coá­gulo y efecto de la fibrinólisis21. Existen varios equipos semiautomáticos point-of
care, entre ellos el Thromboelastography Platelet Mapping® (Hemoscope Corp) y el HemoStatus Test® (Medtronics Blood Management),
que permiten analizar, en sangre total, estas cinéticas gráficamente, lo
que ayuda a una rápida interpretación del resultado. Una modificación
de la técnica –en la que se añade heparina para evitar la generación de
trombina y se inicia por la adición de un agonista plaquetario como
ADP o ácido araquidónico– puede permitir monitorizar el efecto de
los tratamientos plaquetarios22, aunque este tema está actualmente en
discusión, al igual que su papel en el diagnóstico de los desórdenes
hereditarios de sangrado23.
Tromboeslastografía
El PFA-100 es un aparato ampliamente utilizado en laboratorios clínicos y de investigación que emula in vitro el tiempo de sangría. El
sistema detecta el tiempo que tarda en cerrarse un poro realizado en una
membrana recubierta de colágeno+ADP (CADP) o colágeno+epinefrina
(CEPI) al hacer pasar sangre citratada a un elevado flujo17,18. La prueba
finaliza cuando se ocluye el flujo, o al superar los 300 segundos. Ofrece
una mejor estandarización que el tiempo de sangría, aunque también está
afectada por factores como el anticoagulante, la obtención de la muestra, el tiempo entre la extracción y la prueba, el número de plaquetas,
hematocrito, FVW, etc.8. Actualmente se ha desarrollado un cartucho
que permite medir el efecto de los bloqueantes de P2Y12 denominado INNOVANCE PFA P2Y12. El cartucho contiene una apertura más
pequeña que los anteriores de 100 mm y la membrana está recubierta por
una combinación de ADP prostaglandina E1 suplementada con calcio7.
Recientemente se ha publicado que su utilización es útil para detectar
trombocitopatias severas y moderadas del receptor P2Y1219.
Citometría de flujo
Es con toda probabilidad una de las técnicas con más potencial para
el estudio de las plaquetas, debido a su enorme versatilidad y al volumen extremadamente reducido de muestra que requiere comparado
con otras técnicas. La citometría de flujo permite la detección simultánea de múltiples características (tamaño, forma y fluorescencia de
un marcador) en un elevado número de células individuales. Permite
medir tanto el nivel de activación de las plaquetas circulantes como su
reactividad al ser expuestas a un agonista. La aplicación más extendida
de la citometría de flujo para el estudio de la función plaquetaria es la
detección de epítopos en la superficie de la plaqueta, como P-selectina
(CD62, marcador de liberación de gránulos α) y CD63, asociada a la
liberación de gránulos densos y lisosomas14, la conformación activa de
la integrina αIIbβ3 (PAC-1)24 o de su bloqueo por tratamiento anti-αIIbβ3,
la exposición de fosfatidilserina mediante su unión a anexina V y la
unión de factores de la coagulación utilizando factores de la coagulación marcados directamente o la combinación del factor y el anticuerpo
específico25. Un ejemplo de estas aplicaciones es la detección del nivel
de fosforilación de la proteína intracelular VASP en plaquetas; para
ello se mide la proteína fosforilada VASP en presencia de PGE1 y tras
la adición de PGE1 y ADP26. Esta técnica permite determinar el nivel
de bloqueo del receptor P2Y12 por los fármacos antagonistas de este
receptor27 y ayuda en el diagnóstico de trombocitopatias severas y
disfuncionales del receptor P2Y12, pero es menos sensible en la detección de pacientes P2Y12 heterocigotos28. También se ha empleado la
citometría de flujo para monitorizar la terapia con aspirina, empleando el ácido araquidónico como agonista29. Un campo de aplicación
de la citometría es el estudio de los mecanismos de transmisión de
VerifyNow®
El sistema mide la capacidad de las pla­quetas para aglutinar bolitas
recubiertas de fibrinógeno en sangre total, cuando se estimulan con
agonistas específicos de la función plaquetaria. Frente a la agregometría óptica en PRP, presenta las ventajas del menor volumen de
sangre empleado y la completa automatización del proceso. Permite
monitorizar el efecto de la aspirina y los bloqueantes de P2Y12 y
αIIbβ314 empleando diversos cartuchos. En el caso de la aspirina el
agonista utilizado es el ácido araquidónico, mientras que la combinación de ADP y prostaglandina E1 se utiliza para estudiar el efecto de
las bloqueantes de P2Y12, y el TRAP se utiliza para monitorizar los
fármacos anti-aIIbβ3. Cuando se compara con la agregometría óptica
en PRP, los resultados no son unívocos, pero presenta las ventajas del
menor volumen de sangre empleado y la completa automatización del
proceso. Los factores que pueden influenciar los resultados incluyen el
tiempo desde la obtención de la muestra y los niveles de triglicéridos
y de fibrinógeno en sangre7.
Plateletworks®
El método consiste en la detección cuantitativa de agregados plaquetarios en sangre total circulante ex vivo o inducidos por un agonista
20
Ponencias
Medida del “Sheddome plaquetario”
señales que implican fosforilación de proteínas, mediante el empleo
de anticuerpos específicos de la forma fosforilada. Otros mecanismos
de transmisión de señales en los que se puede emplear la citometría
de flujo son los movimientos de calcio citoplasmático, los procesos
oxidativos, los cambios de pH, el flujo de iones, etc.30. También se ha
empleado la citometría de flujo para la detección de plaquetas reticuladas31, la determinación del contenido en gránulos densos empleando
mepacrina7, la formación de agregados plaquetarios32 o la detección de
uniones heterotípicas plaqueta-leucocito o plaqueta-monocito, las cuales son un marcador de activación plaquetaria. Por último, un campo
que actualmente suscita gran interés es la detección de micropartículas
de origen plaquetario, ya que se ha descrito su implicación en varias
patologías vasculares33. Un problema subyacente a las técnicas citométricas es que requieren un equipamiento caro y personal especializado
y estandarización. Una ventaja importante de esta técnica es que permite medir la activación plaquetaria en los pacientes con trombopenia.
Durante los últimos años se está demostrando que por acción de las
proteinasas ADAM17 o ADAM10 se produce una rotura proteolítica
de diferentes receptores de la membrana plaquetaria, entre los cuales se
encuentran la GPIb, soluble CD62P, soluble CD40L, GPVI y CD3612.
La medida de estas proteínas circulantes in vivo está emergiendo como
un nuevo mecanismo que pueda reflejar la función de las plaquetas.
Su determinación se debe realizar en plasma, ya que en suero la liberación de estos receptores se produciría por la activación plaquetaria
al coagularse la sangre. Aunque muchas de estos marcadores pueden
utilizarse como medida de la activación plaquetaria in vivo su implicación clínica es poco conocida.
Metabolitos de la ciclooxigenación del ácido
araquidónico
Calcio citosólico
La estimulación plaquetaria aumenta, como hemos comentado, la
concentración de calcio citosólico y la activación de la fosfolipasa A2
citosólica (cPLA2). Estos procesos se regulan por la actividad de las
serina/treonina fosfatasas PP1/PP2A34. La cPLA2 activada libera el ácido araquidónico de los fosfolípidos, que posteriormente se metaboliza
por la vía lipooxigenasa para formar el hidroxiácido 12-HETE y por
la ciclooxigenasa-1 (COX‑1) para sintetizar endoperóxidos cíclicos
PGG2/PGH2, que por la acción de la tromboxano sintetasa formarán
tromboxano A2. También se forman pequeñas cantidades de otras prostaglandinas y otros eicosanoides.
El TXA2 es un mediador lipídico de vida media corta (30 segundos), por lo que su medida en muestras biológicas no es fácil; sin
embargo, los metabolitos estables del TXA2 se pueden medir en sangre
y orina. Los más comunes son el TXB2 y el 11-dehydro-TXB2. . El
TXB2 tiene una vida media en circulación de 7 minutos y es convertido
en 11-dehydro-TX, que posee una vida media de 60 minutos.
La determinación del TXB2 en las pla­quetas es, en nuestra opinión,
la medida más específica para controlar el efecto farmacológico de
la aspirina. Puede realizar­se en suero (en condiciones específicas de
incubación inmediata a 37° C) o en sangre total citratada estimulada
con ácido araquidónico o colágeno. También se han determinado los
metabolitos del TXA2 en la orina. No obstante, en la ori­na la presencia
de metabolitos del TXA2 puede tener su origen no solo en las pla­quetas,
sino también en otras células (riñón, leucocitos, etc.). La determinación
del TXA2 en sangre citratada estimulada con ácido araquidónico o colágeno es la más específica para determinar el efecto de la aspirina, sobre
todo con este último agonista, ya que el ácido araquidónico podría ser
utilizado por otras células capaces de metabolizar este compuesto, dando
resultados muy orientativos pero menos específicos del TXB2 de origen
plaquetario. La forma más habitual de determinar la síntesis de TXA2
es mediante el empleo de ELISAS, aunque puede realizarse también
mediante técnicas de HPLC, menos sensibles. El empleo de esta medida
ha permitido la detección de pacientes con síndrome coronario agudo
en los que el efecto de la aspirina es menor del esperado, lo que se ha
correlacionado con un mayor daño miocárdico36,37.
El incremento de la concentración citoplásmica de calcio es una de las
respuestas más rápidas de las plaquetas tras el estímulo, y regula distintos aspectos funcionales de la plaqueta como la activación de integrinas, la síntesis de TXA2, la liberación de gránulos o la exposición de
fosfatidilserina, entro otros procesos34. Aunque su detección es posible
empleando la citometría de flujo, como se ha explicado más arriba,
ese método no permite un resultado cuantitativo, sino cualitativo. El
marcaje de plaquetas con sustancias que cambian su fluorescencia
ante los cambios en la concentración de calcio como el FURA 2/AM
permite, empleando un fluorímetro, determinar la concentración de
calcio y su variación por los distintos estímulos o tratamientos34. Sin
embargo, habrá que tener en cuenta que si un resultado cualitativo es
suficiente, la citometría sería la técnica de elección, ya que la fluorimetría implica la necesidad de lavar las plaquetas, lo que requiere
volúmenes mayores de sangre.
Medida de marcadores solubles de activación
plaquetaria
La activación plaquetaria puede determinarse por valoración de la
liberación del contenido granular en los gránulos a (b-tromboglobulina, factor plaquetario-4, etc.) y gránulos densos utilizando técnicas
bioquímicas como ELISAS. La liberación de gránulos densos es muy
específica en plaquetas cargadas con 14C-serotonina35, o determinando
la liberación de ATP en un lumiagregómetro o mediante HPLC o
citometría de flujo. Estas determinaciones son de interés cuando se
sospechan defectos de liberación de gránulos plaquetarios, ya que en
estos casos la agregación plaquetaria no es completamente indicativa
de estos defectos, por lo que la medida de la agregación y productos
liberados durante la misma permitirá un diagnóstico más completo.
Para poder comparar los resultados entre sujetos es necesario ajustar
el número de plaquetas. También se ha empleado como medida de
la activación plaquetaria la determinación de otros metabolitos como
sCD40L, sP-selectina, Gas6, etc. En este sentido, un avance importante puede venir de la aplicación de técnicas Multiplex al estudio de
los marcadores de activación plaquetaria, ya que permiten, en pequeños volúmenes de muestra, la cuantificación simultánea de diversos
metabolitos.
Generación de trombina
Las plaquetas tienen un papel importante en la generación de
trombina. La adhesión, activación, agregación y reclutamiento de
21
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Sistema de activación-reclutamiento
las plaquetas en el lugar del daño al endotelio, además de ser parte esencial en el inicio de la formación del trombo, son también
aspectos importantes en la localización y control de la sub­siguiente
generación de trombina en ese lugar, evitando la activación sistémica de la coagulación. Esta función localizadora y reguladora de la
generación de trombina por las plaquetas activadas depende de sus
receptores adhesivos a componentes del endotelio, posibilidad de
exponer fosfolípidos procoagulantes, disponer de puntos de unión
de alta afinidad en su membrana para algunos factores de la coagulación y contener y liberar de sus gránulos substancias activadoras
e inhi­bidoras de la formación de trombina, participando así en la
regulación del pro­ceso.
La aparición del sistema CAT (Calibrated Automated Thrombography) como sistema facilitado ha permitido una rápida determinación del potencial de formación de trombina, así como evaluar el papel
de las plaquetas en el proceso38.
Consiste en un sistema dual de células: el sistema generador y el sistema de ensayo, que nos permiten estudiar de forma separada dos
procesos de la función plaquetaria como la activación y el reclutamiento. En el sistema generador se estimula PRP o sangre total con
colágeno fibrilar por mezclado (3 inversiones del tubo, 10 segundos)
y rápidamente se centrifuga (13.000 xg, 1 minuto) para obtener un
liberado celular. En este liberado se cuantifican diversos pará­metros
de activación plaquetaria: liberación de gránulos densos (14C-5HT),
gránulos α (β-tromboglobulina) y síntesis de TXA2. Adicionalmente,
una alícuota del liberado se utiliza como inductor de la agregación de
otras plaquetas (sistema de ensayo) y la respuesta agregatoria (reclutamiento) se detecta por agregometría óptica42 o ci­tometría de flujo43.
Proteómica
Retracción del coágulo
La proteómica engloba una serie de técnicas, con un elevado potencial, que pueden ser aplicadas al estudio tanto de posibles defectos
plaquetarios, como al efecto de los tratamientos o a los mecanismos
de activación plaquetaria. Se trata de técnicas muy especializadas, que
requieren personal adiestrado y unas instalaciones muy costosas, por
lo que, al menos de momento, su uso en el estudio de la plaqueta está
bastante restringido44.
La tecnología se basa en la combinación de la espectrometría de
masas con diferentes métodos de separación de proteínas como electroforesis bidimensional o cromatografía líquida multidimensional44.
Aunque es una técnica que está en sus inicios, se presenta con un gran
potencial en el área de investigación y diagnóstico. Empleando un
enfoque proteómico se ha detectado la expresión diferencial de una
serie de proteínas entre pacientes en los que la aspirina realiza o no
un efecto correcto45, y se ha estudiado el contenido granular y las vías
de transmisión de señales en las plaquetas46,47.
La retracción del coágulo es la última etapa en el proceso de formación del trombo, y participan en él factores plasmáticos y las plaquetas. A su vez, en las plaquetas la retracción del coágulo está dirigida
por la interacción entre integrinas de superficie, reorganizaciones
de las proteínas del citoesqueleto y fosforilación de proteínas en
tirosina que dirigen estas reorganizaciones. Por tanto, una aproximación interesante para diseccionar un posible problema es realizar el
estudio de la retracción del coágulo tanto en PRP como en plaquetas
lavadas, estimulando con trombina. Hay que señalar que en caso de
ensayarse con plaquetas lavadas, deberá añadirse al medio calcio y
fibrinógeno para permitir la formación de un coágulo39. El proceso
de retracción del coágulo puede seguirse a distintos tiempos (5-60
minutos) bien midiendo el volumen del coágulo, o fotografiándolo
a intervalos y calculando su tamaño mediante programas de tratamiento de imágenes.
Estudios genéticos
Sistemas de flujo
El diagnóstico genético se obtiene por la amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del ADN o ADN copia del ARN
plaquetario, de los genes candidatos de estudio, seguido por la secuenciación de los mismos. Estos métodos de diagnóstico son robustos y
ayudan a la identificación de la alteración molecular subyacente en las
trombocitopatías hereditarias con un fenotipo severo como el síndrome
de Bernard-Soulier y la enfermedad de trombastenia de Glazmann48.
Sin embargo, las trombocitopatías hereditarias también incluyen
pacientes con disfunciones plaquetarias menos severas, entre los que
se encuentran defectos en otros receptores plaquetarios que participan
en la adhesión, defectos receptores de agonistas solubles y mecanismos
de señalización, etc. En estos casos la utilización de diversas técnicas de medida de la función plaquetaria puede ayudar a identificar la
proteína alterada y por lo tanto el gen candidato. Esta estrategia ha
sido efectiva para identificar alteraciones en los genes GP6, P2RY12
y TXA2R estudiados en familias con defectos de los receptores de la
GPVI, P2Y12 y tromboxano A213,49.
En el caso de defectos en la trasmisión de señales, aunque el
estudio de la función plaquetaria nos indique una vía de señalización
específica, la complejidad de estas vías de señalización dificulta la
selección de un solo gen candidato. Las nuevas técnicas de secuen-
Se han empleado diversas aproximaciones para estudiar la adhesión
plaquetaria y la participación de los factores reológicos en la formación
de un trombo. En general consisten en perfundir un volumen de sangre
total o PRP (previamente marcado con un producto fluorescente) a un
flujo determinado sobre una superficie trombogénica (subendotelio,
células vasculares, moléculas adhesivas, etc.) y evaluar por métodos
morfológicos la interacción de las plaquetas con las distintas superficies. En los últimos años se están desarrollando una serie de dispositivos analíticos de pequeño tamaño (“biochips”) de fácil manejo y gran
versatilidad debido a que su diseño puede ser personalizado según la
finalidad del estudio a realizar, clínico o de investigación. Aunque son
técnicas en desarrollo ya existen datos utilizando estos diseños para
observar la adhesión plaquetaria. Entre ellos el desarrollado por Cellix
Vena 8Fluoro-TM biochip, que puede estar recubierto por colágeno,
y la adhesión se mide utilizando tinción fluorescente y microscopia
confocal a un flujo de 60 dynas/cm2.
Estos “biochips” contienen varios capilares situados paralelamente
que se pueden recubrir con diferentes moléculas adhesivas. La disminución del volumen de sangre para el estudio permite la obtención de
resultados mas rápidamente y de manera más estandarizada40,41.
22
Ponencias
hemostáticos, aunque los estudios incluidos mostraban una elevada
heterogeneidad en los métodos empleados57. Un aspecto importante a
tener en cuenta es la frecuente aparición en población sana de tiempos
alargados para el cartucho CEPI, la cual muy frecuentemente está
relacionada con el consumo de aspirina no declarado.
La agregometría óptica se ha utilizado para el diagnóstico de trastornos en la función plaquetaria10,11, tanto congénitos como adquiridos.
Aunque su sensibilidad a defectos medios en la función es escasa, sin
embargo, su capacidad de medir la respuesta plaquetaria a un gran
número de agonistas a diferentes concentraciones permite establecer
diferentes tablas orientativas que apoyen al diagnóstico de los pacientes10,11. El empleo de un lumiagregómetro puede mejorar la capacidad
de detección de defectos relacionados con el contenido o liberación
de los gránulos58. De forma paralela, el estudio de la agregación por
agregometría óptica o en sangre total, tanto con el sistema clásico
como con el facilitado (Multiplate), detecta fácilmente la trombastenia
de Glanzmann o el síndrome de Bernard-Soulier, así como desórdenes
en el proceso de liberación, aunque los resultados son menos concluyentes en el caso de defectos intermedios.
La citometría de flujo permite de una forma rápida y fácil la detección de defectos en las glucoproteínas plaquetarias, empleando anticuerpos específicos para cada una de ellas. También es posible usarla para
la detección de defectos de almacenamiento. Sin embargo, en nuestra
experiencia, la detección de defectos de almacenamiento resulta más
sensible empleando técnicas de HPLC para cuantificar el contenido de
nucleótidos en plaquetas lisadas, ya que la citometría de flujo empleando
mepacrina solo detecta defectos severos de almacenamiento. En cuanto
a los defectos en la liberación de gránulos debidos a alteraciones metabólicas, la medida del TXA2 ayudará a su diagnóstico.
Las alteraciones de las vías de señalización son más difíciles de
diagnosticar, aunque, como hemos indicado, la citometría de flujo está
desempeñando un papel importante en la detección de estos defectos
plaquetarios. El diagnóstico molecular de estos pacientes se realizará
mediante las técnicas de secuenciación antes indicadas.
ciación masiva pueden ayudar, ya que permite simultáneamente la
secuenciación de varios genes. Recientemente la secuenciación masiva
de diferentes paneles de genes plaquetarios, en conjunción con los
datos de su fenotipo, ha sido utilizada con buenos resultados en la
identificación de los defectos genéticos en algunas disfunciones plaquetarias hereditarias no severas50,51. Aunque estos resultados obtenidos con la secuenciación masiva son un gran avance en el diagnóstico
de estas alteraciones, hay que tener en mente que los exomas de cada
individuo sano y paciente con una disfunción plaquetaria no severa
contienen aproximadamente 20.000 variaciones de nucleótidos de las
cuales solamente un 5% son únicas para un individuo, por lo que por
ahora la detección por este método de un único gen candidato responsable de la disfunción no es muy práctica. En estos casos se necesitarán
realizar estudios de ligamiento genómico en familias numerosas con
varios miembros afectados y no afectados, o grupos de pacientes con
disfunciones plaquetarias que compartan características comunes.
En relación con los procesos trombóticos y fármacos antiplaquetarios se están realizando distintos estudios prospectivos para intentar
correlacionar marcadores genéticos con enfermedad coronaria. De
igual forma, se han identificado polimorfismos que afectan al efecto
de los fármacos antiplaquetarios, como es el caso del alelo 2C19*2
y *3 del citocromo P450, cuya presencia afecta al metabolismo del
clopidogrel y reduce la inhibición de la agregación al ADP producida por este52,53, Por el contrario, se ha descrito que el polimorfismo
CYP2C19*17 aumenta la metabolización del clopidogrel y disminuye
la reactividad plaquetaria54. También se han descrito polimorfismos de
la ciclooxigenasa 155 o de diversas integrinas plaquetarias56 que afectan
a la acción de la aspirina.
Relevancia clínica de las técnicas de función
plaquetaria
Relevancia en la orientación diagnóstica
de las trombocitopatías
Relevancia en la monitorización de la terapéutica
antiplaquetaria
En los pacientes en que se sospecha esta patología es importante disponer de una historia clínica lo más completa posible. Se debe prestar
especial atención a los posibles tratamientos farmacológicos que puedan afectar a la función plaquetaria, descartando un posible trastorno
de la coagulación, fibrinólisis, enfermedad de von WF, o una trombocitopenia, aunque no es infrecuente que desórdenes plaquetarios
coexistan en pacientes con trastornos de la coagulación.
El tiempo de hemorragia se ha empleado tradicionalmente para la
detección de trastornos plaquetarios, encontrándose tiempos alargados
en la trombastenia de Glanzmann o el síndrome de Bernard-Soulier.
Sin embargo, la técnica resulta escasamente sensible a defectos medios
de la función plaquetaria, donde el tiempo de hemorragia puede ser
normal o ligeramente alargado8. La variabilidad inherente a la técnica
ha impulsado el desarrollo de métodos facilitados de ensayo de la
función hemostática global como el PFA-100. El PFA-100 detecta
fácilmente los defectos severos de la función plaquetaria, caracterizados por tiempos >300 segundos con ambos cartuchos. Sin embargo,
los resultados con defectos intermedios están peor caracterizados,
con los tiempos de oclusión para el cartucho CEPI normalmente más
alargados que para el cartucho CADP. Un reciente metaanálisis encontraba una elevada sensibilidad del cartucho CEPI para los desórdenes
Durante los últimos años el reconocimiento de la existencia de una
respuesta individual a la administración de la aspirina, el clopidogrel o su asociación (terapia dual) ha despertado un gran interés en la
comunidad médica debido su posible relevancia clínica. Después de
numerosas publicaciones y debates que trataron de comparar los diferentes métodos clásicos con técnicas de nuevo desarrollo que medían la
función plaquetaria de forma más sencilla, se establecieron puntos de
corte predictores de aparición de accidentes vasculares para cada uno
de los métodos15,59. Por su facilidad de manejo y su estandarización los
más utilizados en los estudios clínicos son el Multiplate y el VerifyNow
para medir el efecto de los fármacos antiplaquetarios. Actualmente,
debido a la presencia no solo de accidentes vasculares trombóticos sino
de problemas de sangrado durante los tratamientos, se han establecido
con los diferentes métodos ventanas terapéuticas que ayudan en la
predicción de ambos procesos60,61. Dada la complejidad de la situación
clínica de los pacientes tratados con fármacos antiplaquetarios se han
llevado a término diferentes consensos que ayudan a la aplicación de
estos métodos dependiendo de la situación clínica del paciente61,62.
Además, las guías europeas y americanas han abordado este tema en
23
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
relación con su utilización en pacientes sometidos a intervencionismo
coronario y en pacientes que vayan a cirugía cardíaca y no cardíaca63,64.
Aunque se ha avanzado en el conocimiento de la implicación de la
medida de la función plaquetaria con determinados métodos en la
aparición de accidentes vasculares así como su utilidad en diferentes
situaciones perioperatorias, el estudio del control de la terapéutica
antiplaquetaria debe considerarse en la actualidad con prudencia, ya
que no existe actualmente un acuerdo internacional para la monitorización rutinaria. Es un área de estudio de “investigación traslacional”
que debe seguir explorándose por su implicación clínica.
7.
8.
9.
10.
Conclusiones
11.
Hasta principios de los 90 las técnicas disponibles de estudio de la
función plaquetaria eran el tiempo de sangría, la agregación plaquetaria y algunos ensayos bioquímicos. Posteriormente se introdujeron
nuevas técnicas como la citometría de flujo y nuevos aparatos que
facilitaban la medida de la función plaquetaria de una manera global,
como el PFA o la agregación en sangre total, o diseñados para conocer la respuesta específica de fármacos antiplaquetarios. Pero ha sido
durante los últimos años cuando se ha producido una mayor evolución,
debido a numerosos avances tecnológicos y su aplicación en el diseño
de nuevos sistemas comerciales como técnicas microfluídicas, aparatos
de secuenciación masiva, sistemas proteómicos, etc., algunos de ellos
aún en desarrollo, que unidos a poderosos sistemas informáticos van
suponer un gran avance en el conocimiento y diagnóstico de pacientes
con problemas de sangrado o procesos trombóticos. Aunque también
es cierto que la introducción de estas nuevas técnicas requerirá un
tiempo para demostrar su utilidad en la clínica, y que en un laboratorio
clínico las técnicas de diagnóstico o de control de los fármacos antiplaquetarios han de ser de fácil manejo, deben permitir la obtención de
resultados rápidamente y mostrar una alta sensibilidad, especificidad
y reproductibilidad para los objetivos clínicos deseados. Actualmente
la medida de la función plaquetaria está en un momento interesante
debido al gran desarrollo de nuevas tecnologías, tanto en lo que se
refiere al área de investigación como a su aplicación en la clínica.
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26
Ponencias
Generación de trombina: utilidad y limitaciones en la evaluación de la hemostasia, trombosis
y tratamientos anticoagulantes
Joan Carles Reverter
Servicio de Hemoterapia y Hemostasia. Hospital Clínic. Barcelona
La trombina en la hemostasia
En la fase inicial de la coagulación plasmática se forma una pequeña cantidad de trombina, la cual inicia la activación “explosiva” de
la coagulación (fase de amplificación) mediante la activación por la
misma de las plaquetas, que se convierten en el soporte necesario
para los factores IX, VIII, X, V y II, y la activación de los factores V
y VIII, dando lugar a la formación de gran cantidad de trombina y a
la consiguiente formación del coágulo de fibrina3. Al mismo tiempo
que se desarrolla la fase de amplificación de la coagulación, esta se ve
contrarrestada por la activación por la propia trombina de los anticoagulantes fisiológicos, en especial el sistema de la proteína C, los cuales
al final se imponen finalizando la formación de fibrina.
Por otra parte, las acciones de la trombina se ven reguladas por
otros mecanismos de inhibición directa de la misma, fundamentalmente la antitrombina, con la que la trombina forma complejos inactivos
trombina-antitrombina. Otras moléculas como la alfa-2-macroglobulina, son de acción más lenta.
Además de las acciones sobre la hemostasis, aunque parcialmente
ligadas a estas, se han descrito también acciones de la trombina sobre
la inflamación, tanto pro como antiinflamatorias a través de citocinas
de la activación de receptores PAR2. Su formación también se relaciona
con la inmunidad innata. La trombina está, con todo ello, relacionada
con la patofisiología de los procesos de arteriosclerosis.
La trombina es una enzima que se encuentra en el centro de los procesos de la coagulación. La trombina tiene acciones en algún punto
de prácticamente todas las acciones relacionadas con la coagulación.
Así, debido al clásico efecto procoagulante por su acción en el paso
de fibrinógeno a fibrina, tiene funciones en las vías de la anticoagulación fisiológica, de la inhibición de la fibrinólisis y de la activación
plaquetaria1.
La trombina tiene múltiples sustratos sobre los que actúa1. El sustrato más clásico y conocido es el fibrinógeno, donde, con la liberación
de dos fibrinopéptidos, el fibrinopéptido A y el fibrinopéptido B, de
las cadenas del fibrinógeno, lleva a la polimerización espontánea del
mismo con formación de monómeros de fibrina que forman mallas
inestables. También actúa sobre el factor XIII en el que rompe la subunidad FXIIIA exponiendo un locus activo que lleva la estabilización
de las mallas de fibrina a través de la unión cruzada (cross linking)
de las fibras de fibrina. La trombina realiza también una acción procoagulante de feedback positivo activando el factor XI y los factores
X y V. En esta línea, la trombina influye en la aparición de NETs, lo
que lleva a la expresión de factor tisular con la consiguiente de factor
VIIa y de complejos factor VIIa y factor XII, que causan activación
de la coagulación2.
Por otra parte, la trombina actúa sobre los mecanismos de la anticoagulación fisiológica1, en especial sobre el sistema anticoagulante
de la proteína C, que en su forma activada fragmenta e inutiliza los
factores Va y VIIIa de la coagulación. La activación de la proteína C
requiere de su unión al receptor endotelial de la proteína C (EPCR) y
se activa por el complejo trombina-trombomodulina.
En la activación de las plaquetas la trombina actúa mediante su
acción de activación sobre los receptores PAR (protease activated receptors) que llevan a la señalización intracelular por la vía de las proteínas
G con la subsecuente activación plaquetaria1. La glucoproteína V es un
segundo mecanismo por el que la trombina actúa en la activación de las
plaquetas. Su proteólisis causa el aumento de la respuesta de activación
por parte del complejo glucoproteína Ib-IX-V plaquetario.
Por lo que se refiere a la fibrinólisis, la trombina actúa sobre el
TAFI (thrombin-activated fibrinolysis inhibitor) a través de su unión a
la trombomodulina2. La acción del TAFI activado elimina por proteólisis los residuos lisina terminales de la fibrina. Esta acción disminuye
la capacidad catalítica de la plasmina sobre el coágulo.
La trombina procede de la acción catalítica del complejo protrombinasa sobre las moléculas de protrombina, o factor II. Este complejo
está formado por la unión sobre una superficie fosfolipídica en presencia de calcio de los factores Xa, Va y el propio factor II. En este
proceso de activación a trombina, de la molécula de protrombina se
libera un fragmento con dos partes, el fragmento 1.2.
Historia y métodos de medición de la generación
de trombina
Siendo como es la trombina la enzima clave de la coagulación, no es
de extrañar que su determinación haya sido un objetivo prioritario en
el desarrollo de pruebas de laboratorio de la hemostasia. De hecho, las
pruebas coagulométricas y bastantes de las cromogénicas, al final, lo
que pretenden en realidad es la medición de la aparición de trombina
generada de novo. Con las pruebas globales, como el tiempo de protrombina o el tiempo de tromboplastina parcial activado, se consigue
valorar el período de tiempo transcurrido desde que se introducen los
activadores en el plasma a estudiar hasta que se alcanza una producción
suficiente de trombina. Sin embargo, a pesar de su gran valor diagnóstico, hay que señalar que en el proceso de la coagulación la mayoría de
la trombina se genera en la fase de amplificación y las determinaciones
de las pruebas habituales de laboratorio con los tests coagulométricos
únicamente identifican la trombina en la fase de iniciación de la coagulación, por lo que ignoran más del 90% de la trombina total formada.
Por ello, entre las pruebas clásicas no disponemos de una que mida la
cantidad de trombina que se forma.
Con la finalidad de poder cuantificar la cantidad de trombina total
que se genera durante la formación del coágulo se recurrió inicialmente a biomarcadores, que, indirectamente, identifican la cantidad de
trombina. Con biomarcadores, por un lado se puede medir el resultado
27
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
determinación cinética de la trombina generada. Primero, y como ya
pasaba con los ensayos anteriores cromogénicos, el efecto proteolítico
residual de la trombina unido a su inhibidor alfa-2-macroglobulina de
ser restado del total de trombina generada, lo que se realiza con aplicaciones informáticas específicas7. Más relevante resulta el hecho de
que la intensidad de fluorescencia no es lineal con la concentración del
fluoróforo, y que la velocidad de conversión del sustrato disminuye al
disminuir la concentración del mismo, lo que hace necesario que el
software lo considere para discernir estas situaciones. Además, otras
características de la muestra como el color de la muestra de plasma, que
podría causar una interferencia, o la variabilidad entre instrumentos,
hacen que sea imprescindible una adecuada calibración. Un paso decisivo en la resolución de estos últimos problemas ha sido la incorporación
como calibrador en el ensayo de una forma de trombina modificada,
que es capaz de actuar sobre el sustrato fluorogénico pero que no actúa
en las vías de la coagulación y no se inhibe por los inhibidores plasmáticos. Este calibrador se incorpora directamente a la muestra. Una
vez obtenidas las curvas de formación de trombina se necesita calcular
por software los parámetros a analizar que, habitualmente, son el área
total bajo la curva o potencial endógeno de trombina, el tiempo hasta
el inicio de la formación de trombina o lag time, el pico máximo, el
tiempo transcurrido hasta el pico máximo y, con menos frecuencia, el
tiempo hasta la cola (Figura 1). El valor de cada uno de estos parámetros está en discusión y no se puede afirmar de forma contundente cuál
ha de ser el más relevante. Posiblemente será diferente en función de la
situación clínica que se pretenda evaluar. La evolución tecnológica nos
permite disponer actualmente de todo ello, ensayo y análisis, de una
forma casi completamente automatizada, automatización completa a la
que se dirigirá seguramente la evolución tecnológica futura.
Asimismo, se ha introducido otro ensayo, en esta ocasión cromogénico, de medición continua y con un buen nivel de automatización.
Este ensayo, el ETP (Endogenous Thrombin Potential), ha sido poco
utilizado a pesar de haber obtenido resultados interesantes10.
metabólico de las acciones proteolíticas que llevan a la formación de la
trombina, en concreto el fragmento 1.2 de la protrombina4. Asimismo,
también se han medido los complejos de la trombina ya formada con
su inhibidor, la antitrombina, los complejos trombina-antitrombina.
El empleo de estos biomarcadores resulta útil para una visión global
de la cantidad de trombina formada, con la ventaja intrínseca de que
pueden reflejar la cantidad global de trombina generada in vivo en
un período de tiempo. Sin embargo, la información que aportan es
muy general y actualmente se conoce que la cinética de la formación
de trombina no sigue un patrón lineal y su efecto biológico puede
depender mucho de la concentración momentánea de la misma. Por
ello, el poder disponer de la determinación directa de la cinética de la
trombina que se va generando durante la formación del coágulo ha sido
desde hace años un deseo no satisfecho que se ha pensado que podría
ser muy útil para entender la coagulación plasmática fisiológica y en
situaciones patológicas.
La búsqueda de una prueba o metodología específica que pudiese
dar respuesta a la identificación de la generación de trombina se inició
en los años 50. En unos primeros ensayos de tipo coagulométrico,
de los que derivaron ensayos coagulativos en dos tiempos, se intentó
medir la cinética de la aparición de trombina en determinadas situaciones de la hemostasia, como hemofilia o trombocitopenia5,6.
Años después se pasó al desarrollo de una primera metodología,
ya más avanzada y viable, basada en la determinación de la actividad
proteolítica de la trombina en un ensayo con detección cromogénica.
Este ensayo se basa en la obtención de alícuotas sucesivas durante el
proceso de formación del coágulo en las que se determina de forma
seriada la trombina presente. Estos datos son tratados matemáticamente para convertirlos en una curva que refleja la velocidad de aparición
de nueva trombina a lo largo del tiempo durante la formación del
coágulo. En este proceso de cálculo se corrige el efecto de la trombina
unida a la alfa-2-macroglobulina con su cinética específica de neutralización7. Sin embargo, a pesar de su gran utilidad como la primera
forma razonablemente sensible y específica para la evaluación cinética
de la generación de trombina, este ensayo presentaba algunas complicaciones. Por un lado, derivado de la necesidad de procesar muchas
submuestras consecutivas en un tiempo breve y la rigurosa precisión
requerida en la medición manual de los tiempos, resulta muy exigente
en las necesidades de dedicación de personal. Por otro, este ensayo
precisa de la ausencia de fibrina, para lo cual se idearon varias estrategias, desde su eliminación manual con una pequeña espátula hasta
la desfibrinación previa del plasma por veneno de serpiente. Todas
estas manipulaciones y la importancia de la actividad diferencial de
la trombina unida al coágulo provocan que el ensayo se realice en un
modo no del todo fisiológico. Más adelante, este método cromogénico
se modificó al incorporarse la posibilidad de realizar la medición continua8, sin necesidad de submuestras, de la actividad de la trombina en
un ensayo, asimismo, de detección cromogénica. Esta modificación
supuso un gran avance hacia la posibilidad de la automatización del
procedimiento.
Un paso decisivo posterior fue la incorporación de los sustratos
fluorogénicos como forma de medición de la actividad de la trombina
generada en lugar de la detección por sustratos cromogénicos9. En esta
forma de determinación se mide de manera continua la señal fluorescente del sustrato a lo largo del ensayo. Con ello, la fibrina deja de ser
un problema, pero la determinación simple de la actividad enzimática
de la trombina no resuelve todos los problemas para una adecuada
Figura 1. La gráfica muestra una curva típica de generación de trombina con
el tiempo en minutos en ordenadas y el nM de trombina. En ella se señalan los
parámetros que se pueden determinar para valorarla: el área total bajo la curva
o potencial endógeno de trombina, el tiempo hasta el inicio de la formación de
trombina o lag time, el pico máximo, el tiempo transcurrido hasta el pico máximo
y el tiempo transcurrido hasta el inicio de la cola.
28
Ponencias
Potenciales utilidades y limitaciones de la medición
de la generación de trombina
Conclusión
Como reflexión final el estudio analítico de la generación de trombina es un parámetro que resulta teóricamente muy prometedor desde
hace ya años. Sin embargo, por las dificultades técnicas, con el coste
que comportan, los estudios que se han realizado han abarcado, en
general, aspectos muy específicos y de poca población. Parece que
se trata de una prueba aparentemente muy buena a la búsqueda de la
situación clínica en que pueda ser útil. La posibilidad de que en un
futuro próximo se pueda disponer de metodología con un alto grado
de automatización puede servir para que por fin pueda evaluarse en
series amplias y las situaciones en las que su valor clínico sea relevante.
La monitorización de la trombina generada tiene amplias aplicaciones
potenciales11. Sin embargo, las complejidades técnicas presentes durante muchos años han llevado a la ausencia de una adecuada estandarización en cuanto a la forma de determinar y de considerar los diferentes
parámetros que se pueden obtener. De una forma general, se podrían
destacar como campos en los que un ensayo de generación de trombina
podría ser potencialmente interesante: la evaluación del riesgo trombótico o del riesgo hemorrágico individual; la estimación del riesgo de
recidiva de la enfermedad tromboembólica; el manejo en situaciones
especiales de los anticoagulantes, incluyendo los inhibidores directos,
como podría ser en presencia de anticoagulante lúpico, de gestación,
de insuficiencia renal, de pesos extremos, de edad pediátrica o muy
avanzada, de la valoración de la eficacia de los posibles antídotos de los
inhibidores directos, y la evaluación de interacciones potencialmente
graves. Hoy en día hay poca experiencia en series grandes para juzgar
adecuadamente su valor, aunque los resultados resultan muy ilusionantes. En hemofilia parece que podrá tener una utilidad definida en breve.
En el estudio de la cirrosis ha servido para desmontar el paradigma del
elevado riesgo de sangrado del cirrótico12 a pesar de los valores de los
parámetros generales de la coagulación, siendo incluso la cirrosis una
situación más cercana a ser protrombótica,
La facilidad de uso de la prueba para su introducción en los laboratorios
clínicos, con un amplio nivel de automatización, es la clave para su futuro
desarrollo como un biomarcador importante en la atención a los pacientes.
Como limitación a su uso clínico, a parte de una, por ahora, insatisfactoria automatización, se deben citar las complicaciones que está
teniendo para obtener una adecuada estandarización.
Además, otra limitación de los métodos disponibles se debe a que
la formación de trombina es diferente en el plasma que en el interior
del coágulo en formación13, donde se acumulan los elementos celulares y se incrementa la concentración de factores procoagulantes,
entre ellos la trombina recién formada. En el coágulo en formación los
elementos celulares integrantes, especialmente las plaquetas, interaccionan con la fibrina y la trombina presente, activándose y aportando
los fosfolípidos necesarios para sustentar la actividad de los factores
de la coagulación, entre los que están los que llevan a la amplificación
de la generación de trombina. Esta localización intracoágulo de la
formación de trombina, la cual parece tener una gran importancia en la
resistencia de los coágulos, hace que quede prácticamente apartada de
las posibilidades de detección de los métodos de medición de trombina
usuales, requiriéndose recurrir a modificaciones mayores y a manipulación de los coágulos13. Este punto ha mejorado de manera notable con
los ensayos de metodología fluorogénica. También es una limitación,
o mejor aún, una falta de ampliación de la evolución a un contexto
analítico lo más parecido al fisiológico, lo complejo que resulta por
ahora la medición de la generación de trombina en sangre total14.
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29
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Problemas prácticos en el diagnóstico de la enfermedad de von Willebrand; utilidad
y limitaciones de los métodos diagnósticos
Adriana I. Woods1, Ana C. Kempfer1, A. N. Blanco2, Juvenal Paiva2, Emilse Bermejo2, Analía Sánchez-Luceros 1,2, M. A. Lazzari1
Laboratorio de Hemostasia y Trombosis, IMEX-CONICET. Instituto de Investigaciones Hematológicas. 2Academia Nacional de Medicina. Buenos Aires (Argentina)
1
anovulatorios. Dado que el VWF aumenta en el embarazo se estudiará
en el 7.º-8.º mes para determinar conductas terapéuticas, a menos que
se sospeche VWD severo, en cuyo caso se estudia anticipadamente.
La enfermedad de von Willebrand (VWD) es un desorden hemorrágico congénito autosómico, con heterogeneidad clínica y genética y,
en la variante tipo 1, incompleta penetrancia y expresión variable en
la familia. De acuerdo a la severidad de la enfermedad se diagnostica
durante la primera infancia, la adolescencia o la edad adulta. La clasificación más reciente de la Sociedad Internacional de Hemostasia y
Trombosis (ISTH) reconoce seis tipos diferentes de VWD1: los tipos
1 y 3 se refieren respectivamente a la deficiencia cuantitativa parcial y
total del VWF; el tipo 2 refiere a un grupo heterogéneo de deficiencias
cualitativas de acuerdo a detalles específicos del fenotipo: los tipos
2A, 2B y 2M se caracterizan por VWF:RCo/VWF:Ag < 0,6, y el tipo
2N por FVIII/VWF < 0,7. Tiene una prevalencia del 0,01 al 1% en la
población general. La frecuencia en nuestra institución es: posible tipo
1 (VWF:RCo 31-49 UI/dL): 69,6%, tipo 1 definido (VWF:RCo 15-30
UI/dL): 13,5%, tipo 1 severo (VWF:RCo 5-15 UI/dL): 0,35%; tipo 3:
0,55% ; tipo 2A: 9,5%, tipo 2B: 0,6%, tipo 2M: 2,5% y tipo 2N: 3,4%2.
El diagnóstico comienza con la historia clínica personal y familiar
y el laboratorio básico. Las pruebas más usadas, el TTPA y VWF:Ag,
son las que menos información brindan, dado que en la mayoría de
los casos los resultados pueden ser normales o levemente reducidos.
Frente a la alteración de una o varias de las pruebas básicas (pruebas
orientadoras), se procede a realizar pruebas confirmatorias para lograr
el diagnóstico. Luego se realizan otros ensayos más específicos para
lograr la clasificación final, definiendo así la variante (Tabla 1). No
siempre el fenotipo de laboratorio se corresponde con el fenotipo de
sangrado.
Errores en la toma de muestras y su procesamiento
Los errores en la obtención de sangre suelen ser frecuentes: uso de
anticoagulantes incorrectos, difícil extracción, inapropiado enrase
de los tubos y una alterada relación sangre-anticoagulante que lleva
a la activación de la muestra, con niveles falsamente elevados de
factores e inclusive coagulación de la muestra. Frente a pacientes
con hematocritos <25% y >55% se debe corregir el volumen de
citrato en el tubo de extracción de la sangre. Es importante recoger
la sangre en al menos dos tubos; así se pueden verificar los resultados en el segundo tubo. La sangre debe mantenerse a temperatura
ambiente hasta su centrifugación, idealmente no más de 1 hora. El
plasma pobre en plaquetas (PPP) debe obtenerse por doble centrifugación, separado del paquete globular y mantenido a 4° C y
procesado dentro de las 4 horas de extracción4. En caso de transporte de las muestras a laboratorios distantes, se recomienda enviar
el PPP del paciente y de un control congelados en un recipiente
adecuado con hielo seco. Si se debe enviar sangre entera, debe ser
a temperatura ambiente5. En caso de estudios que se realizan otro
día, como el VWF:Ag y VWF:RCo, el PPP se guarda en alícuotas
de pequeño volumen, a -20° C por 15 días o -70° C por 3 meses,
y se descongelará rápidamente a 37° C en el momento de usar. No
deben analizarse muestras congeladas y descongeladas más de una
vez. Las muestras con visible hemólisis pueden procesarse6.
Problemas para establecer el diagnóstico
de la enfermedad: uso del bleeding score
Tabla 1. Pruebas de laboratorio para el estudio de pacientes bajo
sospecha de VWD
Un punto importante es el uso del bleeding score (BS) para estandarizar la medición del sangrado. Existen diversos métodos para medir
el BS, incluso uno pediátrico. Nosotros usamos el recomendado por
ISTH. Un BS > 10 y un VWF:RCo < 10 UI/dL se relacionan significativamente con sangrado y alto requerimiento de régimen terapéutico
intenso3.
Orientadoras
Variables preanalíticas
Confirmatorias
La extracción de sangre conviene realizarla entre las 7 y las 9 horas
de la mañana. Se aconseja que el paciente permanezca media hora en
reposo antes de la toma de muestra. Es importante controlar el nivel
de estrés, especialmente en los niños. Es recomendable un ayuno de
8 horas, pero se permite tomar infusiones sin leche ni sólidos. En
mujeres, el estudio se hará de preferencia dentro de los días 1-4 del
ciclo menstrual, donde el VWF está en sus niveles más bajos, y esperar dos ciclos menstruales después de un parto o de la suspensión de
Para
clasificación
final
(variantes)
30
TS (Ivy, Simplate)
Recuento de plaquetas en sangre entera
Retención plaquetaria a las perlas de vidrio
TTPA prolongado con corrección con PPP-N
FVIII
VWF:Ag
VWF:RCo
VWF:CB
Patrón multimérico: electroforesis en gel de SDS-agarosa,
de baja y alta resolución
VWF:FVIIIB
VWF plaquetario
VWF propéptido (VWFpp)
RIPA a baja concentración de ristocetina
Búsqueda de mutación responsable del fenotipo
Ponencias
Determinación de FVIII
se recomiendan. Los métodos de quimioluminiscencia tienen mayor
sensibilidad que el LIA. Sin embargo, estos métodos deben ser refrendados a través de estudios en pacientes con VWD tipos 2. El VWF:RCo
por citometría de flujo12 puede ser promisorio.
El método coagulométrico en una etapa es el más utilizado. El método
amidolítico es el método de referencia, recomendado por el SSC/ISTH,
tanto para plasma como concentrados.
Los resultados obtenidos por ambos métodos no presentan diferencias significativas. Las muestras para FVIII no deben congelarse; si es necesario, estandarizar las condiciones: congelar rápidamente en volúmenes pequeños y a -70° C. Descongelar rápidamente
y analizar antes de las 2 horas, junto con un control procesado de
igual manera.
Determinación del VWF:CB
El método de elección es ELISA. Nosotros hemos descrito un método
por citometría de flujo como técnica alternativa, con alta sensibilidad7.
No todos los laboratorios incluyen el VWF:CB en el estudio de VWD.
Debido a su sensibilidad por la presencia de multímeros de alto peso
molecular puede usarse para distinguir VWD 2M con mutaciones en
el dominio A1 o en el A3. El colágeno tipo I-III tiene alta afinidad
por el dominio A3 del VWF y menor afinidad por el dominio A113,
mientras que el colágeno tipo VI se une específicamente al dominio
A114. Por lo tanto, en pacientes con síntomas hemorrágicos y VWF:Ag
y VWF:RCo normales debemos considerar la presencia de mutaciones
en el dominio A3, que no son diagnosticados inicialmente al no ser
detectados por el VWF:RCo; de esta forma se perderían sino se realiza
el VWF:CB en ellos con el colágeno I-III14.
En resumen, tanto el VWF:RCo y el VWF:CB son útiles para
detectar VWD. El VWF:CB es más útil para chequear concentrados
de VWF pues no existe interferencia por la dilución de las muestras.
Determinación del VWF
La medición del VWF es importante en la confirmación del diagnóstico de VWD. Esto involucra la determinación de la cantidad por medio
del VWF:Ag y de su funcionalidad a través del cofactor de ristocetina
(VWF:RCo) y del enlace del VWF al colágeno (VWF:CB), apropiadamente estandarizadas.
Determinación del VWF:ag plasmático
El VWF:Ag mide la cantidad de VWF presente. Los métodos de
elección son el ELISA, con un límite de detección de 0-5 UI/dL y
el inmunoensayo con látex automatizado (LIA) (límite de detección:
5-10 UI/dL). Ambos métodos son altamente reproducibles y tiene una
imprecisión del 5-15%. El método por citometría de flujo es bueno
pero no está al alcance de muchos laboratorios7.
Análisis multimérico
La visualización del patrón multimérico es crucial para distinguir el
tipo 2M de los tipos 2A y 2B. Este ensayo es complejo y laborioso. En
gel de SDS-agarosa de baja resolución (1%) se observa todo el perfil
multimérico. A alta resolución (1,7%) no se observan los multímeros
grandes, se observan los intermedios y pequeños y se puede distinguir
la estructura de los tripletes de cada multímero.
Determinación del VWF:RCo
El VWF:RCo es el más utilizado para medir actividad; es un ensayo de
aglutinación por agregometría. Difícil de estandarizar, tiene alto coeficiente de variación intra e interlaboratorio que va del 10% al 40%, sobre
todo en valores inferiores a 15 UI/dL, y tiene baja sensibilidad a niveles
de VWF < 10 UI/dL. Los lípidos elevados interfieren en la prueba.
Las plaquetas del ensayo pueden introducir errores; si bien pueden ser frescas o fijadas, estas últimas son más estables a lo largo del
ensayo. Siempre es necesario repetir puntos de la curva de calibración
a lo largo del ensayo. La actividad durante el almacenamiento a 4° C
no supera los 10 días. Se pueden utilizar plaquetas liofilizadas pero
son menos sensibles.
La ristocetina puede introducir otra fuente de variabilidad, ya que
variaciones en la secuencia del gen VWF (p.D1472H) pueden conducir
a una alteración en la unión a la ristocetina8, no asociada a aumento en
el score de sangrado. En el caso de otro SNP, el p.A1381T, se detectó
que los individuos homocigotas T mostraban mayor afinidad por la
GPIb causando niveles artificialmente altos de VWF:RCo9.
Los métodos automatizados tienen mejores coeficientes de variación intra e interensayo. La presencia de hemólisis, bilirrubina y
lípidos elevados no interfiere. Sin embargo, los resultados son más
elevados que con los ensayos por agregometría10.
El VWF:Act, basado en técnicas de ELISA y LIA, utiliza diferentes anticuerpos monoclonales anti-VWF o anti-GPIb que reconocen
el sitio de unión a la GPIb o al VWF respectivamente. Si bien estas
técnicas son más reproducibles y sencillas que el VWF:RCo, no parecen detectar alteraciones estructurales o funcionales del VWF11 y no
Propéptido del VWF (VWFpp)
La medición del VWFpp provee información relacionada con la síntesis y el clearance del VWF. Se ensaya un ELISA, con un anticuerpo
de captura anti VWFpp. El resultado se compara con el VWF:Ag del
paciente. Un cociente VWFpp/VWF:Ag elevado (>2) responde a un
aumento del clearance del VWF tanto en algunos subtipos como en
VWD adquirido.
RIPA
Otra de las pruebas es medir la aglutinación plaquetaria del plasma
rico en plaquetas, inducida por ristocetina (RIPA). Según los niveles
plasmáticos del VWF, el RIPA resulta disminuido o ausente en las
variantes cuantitativas, en el VWD 2A y 2M, o aumentada, en el VWD
2B y en el PT-VWD.
Diagnóstico genotípico
Es mandatorio comenzar la genotipificación en el exón 28 dado que es
el más rico en mutaciones de la mayoría de variantes.
Es útil para diferenciar el tipo 2N de la hemofilia A leve o moderada, el tipo 2B del PT-VWD, y el VWD congénito del adquirido. Si
bien el diagnóstico del tipo 3 es relativamente fácil, a través de los
31
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
patrón multimérico normales, fácilmente clasificable como tipo 1; en
este caso, el RIPA a bajas dosis y el estudio del exón 28 resuelven el
dilema diagnóstico.
resultados fenotípicos, el estudio genético de estos pacientes podría ser
útil para consejo genético, estudios prenatales y predecir el desarrollo
de inhibidores en caso de presencia de grandes deleciones del gen. Se
pueden utilizar métodos de screening como el Conformation Sensitive
Gel Electrophoresis (CSGE), que permite el chequeo rápido de varios
exones y pacientes. Si bien es sencillo y económico, hay que validar
el método vs la secuenciación; en nuestra experiencia, los exones 17
al 27 pueden estudiarse por screening, a excepción del exón 22 y 28.
Diagnóstico diferencial entre VWD hereditario
y adquirido
El diagnóstico diferencial entre VWD adquirido y congénito es importante por el diferente tratamiento, aunque en muchos casos es difícil
(falta de antecedentes personales y familiares; aparición de síntomas en
adultos). El VWFpp y la detección de inhibidores son necesarios. Estos
pueden identificarse con tests de neutralización usando VWF:RCo,
VWF:Ag o VWF:CB, pero estos tests no pueden detectar anticuerpos
no neutralizantes, que son los más frecuentes. Con el VWF:RCo la
incidencia de detección es de alrededor del 15% de los casos; con el
VWF:CB aparentemente los resultados son más promisorios20. Por
ELISA, utilizando VWF purificado o semipurificado y con anti IgG,
IgM o IgA humanos, se pueden detectar los anticuerpos libres neutralizantes y no neutralizantes. La presencia de mutaciones define la
diferencia entre ambas entidades, sobre todo en ausencia de anticuerpos detectables.
Problemas para el diagnóstico de la variante tipo 1
El tipo 1 no es sencillo de diagnosticar, dado que el rango normal del
VWF es amplio y suele superponerse con niveles considerados representativos de VWD, de tal modo que niveles disminuidos de VWF y
síntomas de sangrado inespecíficos pueden coexistir con alta frecuencia15. Por lo tanto, frente a un primer estudio normal se hace necesario
reestudiar al paciente al menos tres veces antes de descartar VWD.
Otro problema que se presenta es diferenciar un tipo 1 severo
de un tipo 2M, donde, en ambos casos, por la baja sensibilidad del
VWF:RCo, podemos tener VWF:RCo/VWF:Ag < 0,6. En este caso, se
debe realizar VWF:CB; si VWF:CB/VWF:Ag es < 0,6, confirmamos
el resultado (VWF:RCo/VWF:Ag < 0,6 ) y estamos frente a un VWD
2M, mientras que si es > 0,6 se trata de un tipo 1 severo. La diferente
respuesta al DDAVP también ayuda a diferenciar ambas entidades, ya
que a los 60 y 120 minutos, el VWF:RCo/VWF:Ag será < 0,6 en el
VWD 2M. La presencia de mutaciones en el exón 28 nos confirmará
el diagnóstico de VWD 2M.
Hay otros factores que complican el diagnóstico del tipo 1 al ser
modificadores de los niveles de VWF y son el grupo sanguíneo ABO,
la edad, polimorfismos, factores raciales, embarazo, ingesta de fármacos como el ácido valproico, el hipotiroidismo o el ejercicio físico.
El más importante es el grupo sanguíneo; los individuos con grupo O
tienen niveles 25% más bajos de VWF y FVIII16 que aquellos no O, con
aumento significativo (p < 0,05) del VWF:Ag a partir de los 40 años17.
Sin embargo, no establecemos rangos de normalidad ajustados, dado
que habría que considerar no solo el grupo sanguíneo sino también la
edad o el grupo étnico, entre otros factores. Individuos con descenso
de VWF:RCo y síntomas hemorrágicos deberían considerarse como
VWD independientemente del grupo sanguíneo2. Respecto de la edad,
se ha descrito18 que en pacientes con tipo 1, el VWF aumenta 3,5 UI/
dL y el FVIII 7,1 UI/dL por década, sin disminución del sangrado.
Se calcula que más del 35% de los pacientes tipo 1 no tienen mutaciones responsables. La probabilidad de hallar mutaciones es mayor
cuando el VWF es <30 UI/dL.
Diagnóstico diferencial entre VWD 2N y hemofilia leve:
enlace del FVIII al VWF (VWF:FVIIIB) y genotipificación
El VWD puede ser confundido con hemofilia A leve, en especial frente
a un VWD tipo 3 si solo se pide la determinación de FVIII o el VWD
tipo 2N. Es necesario el VWF:FVIIIB y el análisis genético de la
región comprendida entre los dominios D’ y parte del D3 (exones 17
al 27). Si no se encuentran mutaciones, se deberá estudiar el gen F8.
Diagnóstico diferencial entre PT-VWD y VWD 2B
Ambos desórdenes se caracterizan por una aumentada afinidad de
unión entre la GPIbα y el VWF que se evidencia por hiperrespuesta
a la ristocetina (RIPA). Los pacientes tienen un fenotipo clínico y de
laboratorio muy similar, El tipo VWD 2B se caracteriza por mutaciones
en el exón 28. En cambio, el tipo PT-VWD se caracteriza por la presencia de mutaciones en el gen GP1BA. Un 15% de casos diagnosticados
como VWD 2B en realidad son PT-VWD. Como la conducta terapéutica es diferente en cada caso, el diagnóstico diferencial es esencial.
Las pruebas discriminatorias incluyen: RIPA mixing assay, prueba de
desafío con crioprecipitados, RIPA utilizando citometría de flujo y el
análisis genotípico del exón 28 del gen VWF y del gen GP1BA. Hemos
descrito la sexta mutación conocida en el gen GP1BA21.
Problemas para el diagnóstico del VWD2B
Detección del estado portador de VWD
Federici et al.19 describen RIPA positiva (que produzca ≥30% de aglutinación) a una concentración de ristocetina <0,8 mg/mL, y sugieren
buscar la concentración umbral, mientras que otros autores solo utilizan ristocetina 0,5 mg/mL. En 27 pacientes con VWD 2B, nosotros
hemos encontrado que un 20,5% de los mismos tienen RIPA positiva
a una concentración umbral de 0,7 mg/mL. De otro modo, si solo se
usa RIPA 0,5 mg/mL, se perderá la posibilidad de detectar un número
importante de pacientes con VWD 2B o PT-VWD.
Otro problema es el correcto diagnóstico del VWD 2B atípico que
se presenta con VWF:RCo/VWF:Ag > 0,6, recuento de plaquetas y
En VWD recesivo, los portadores son generalmente asintomáticos. Un
ejemplo es la aparición de mutaciones de novo. Mutaciones en la línea
germinal son raras y su presencia en un individuo puede impactar en
su descendencia. Pueden ocurrir esporádicamente o en mosaicismo
durante la embriogénesis temprana, en cualquiera de los gametos. En
esta situación, padres no afectados pueden tener niños afectados, y por
lo tanto sintomáticos, o bien recesivamente, con lo cual serán asintomáticos, pero quienes a su vez trasmitirán la mutación a su descendencia. El análisis genotípico a partir de sangre no arrojará resultados
32
Ponencias
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esclarecedores. Por lo tanto, en estos casos, no se podrán detectar
portadores, a menos que se estudien células germinales.
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Conclusiones
Uno de los problemas en el diagnóstico de VWD reside en que los laboratorios periféricos solo estudian el FVIII, y solo algunos el VWF:Ag.
Considerando que muchos de los pacientes tienen FVIII normal y otros
tienen ambos normales o en el límite inferior, el diagnóstico correcto
no se realiza. Está en manos del médico tratante derivar al paciente a
un centro especializado para su estudio adecuado.
El amplio rango normal del VWF puede enmascarar a pacientes
con formas leves de VWD, pero también considerar VWD a individuos
normales, sobre todo en aquellos con grupo sanguíneo O.
El tiempo de sangría no es específico ni sensible para detectar VWD.
El VWF:RCo por agregometría sigue siendo el test de elección
para el diagnóstico de VWD a pesar de su baja sensibilidad y reproducibilidad.
El VWF:CB agrega información ayudando al diagnóstico en
pacientes con VWF:RCo por debajo del límite de sensibilidad y en el
diagnóstico diferencial de VWD tipo 1 severo y 2M, y, junto con el
VWF:RCo, ensayando con colágeno I-III y VI, podremos tener una
aproximación acerca de qué dominio está afectado en casos de VWD
2M, sobre todo cuando no se puede realizar estudios moleculares. Es
más preciso para el chequeo de concentrados.
Los multímeros son fundamentales en la discriminación entre
VWD 2A y 2M y entre algunos tipos de VWD 2B atípico y 2A.
El VWF:FVIIIB ayuda a identificar VWD 2N.
El VWFpp da información de la sobrevida del VWF acortada, por
clearance o proteólisis; es útil para discriminar el VWD congénito del
adquirido y ayudar en la elección del tratamiento.
El RIPA discrimina entre VWD 2A y 2B, pero es indispensable
buscar la concentración umbral de ristocetina que produce aglutinación
plaquetaria.
Las pruebas RIPA mixing assay y desafío con crioprecipitado ayudan a discriminar entre VWD 2B del PT-VWD, sobre todo cuando no
se pueden realizar estudios moleculares.
La biología molecular constituye el método definitivo para discriminar entre VWD congénito y adquirido, entre VWD 2N y hemofilia
leve o moderada, y entre VWD 2B y PT-VWD.
También es útil cuando se requiere consejo genético, estudios prenatales y predecir el desarrollo de inhibidores en caso de presencia de
grandes deleciones del gen.
La respuesta al DDAVP ayuda al diagnóstico cuando el análisis
fenotípico no es claro: 1) Frente a un paciente con VWF:RCo/VWF:Ag
> 0,6, patrón multimérico y recuento de plaquetas normales, pero
RIPA positivo a bajas dosis: si se hace evidente la trombocitopenia
y VWF:RCo/VWF:Ag < 0,6 se trata de VWD 2B atípico. Estudiar
genotípicamente el exón 28. 2) Cuando el VWF:Ag es muy bajo y el
VWF:RCo < 10 UI/dL, discrimina entre tipo 1 severo y tipo 3 dado que
el tipo 3 no responde; y entre tipo 1 severo y 2M, en donde el tiempo
de sangría y VWF:RCo no corrigen el valor basal. Estudiar genotípicamente el exón 28. 3) Cuando a los 60 minutos el VWF no alcanza
valores normales y a los 120 minutos desciende a niveles basales, se
evidencia sobrevida acortada del VWF: orienta a pensar en un tipo 1
Vicenza; hacer patrón multimérico para ver presencia de multímeros
extragrandes. Estudiar genotípicamente el exón 27.
33
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
18. Sanders YV, Giezenaar MA, Laros-van Gorkom BA, Meijer K, van der
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34
Ponencias
Trombosis
Coordinadores: Francisco Velasco Gimena. Servicio de Hematología. Hospital Universitario Reina Sofía. Córdoba
Amparo Estellés Cortés. Unidad de Hemostasia, Trombosis, Arteriosclerosis y Biología Vascular. Hospital Universitario y Politécnico La Fe. Valencia
Este simposio va a tratar de diversos temas relacionados con la trombosis, tanto arterial como venosa, y algunos agentes antitrombóticos. Se estudian los aspectos básicos de la trombosis, así como su asociación con diversas situaciones clínicas.
En la primera ponencia, la Dra. Maureane Hoffman, del Departament of Pathology del Duke University Medical Center (Durham, North Carolina, Estados Unidos), profundiza en el estudio de las complicaciones hemorrágicas de los NOAC “non-vitamin
K-antagonist oral anticoagulants”. Se investiga el efecto de dabigatrán sobre la hemostasia, in vitro e in vivo, así como el efecto del
FVIIa o de los concentrados del complejo protrombínico (PCC) en revertir el efecto del dabigatrán. Para ello utiliza el método de
generación de trombina modificado “Cell-Based CAT® Model”, tanto en presencia de dabigatrán como con FVIIa o 4-factor PCC.
Por último, el efecto del dabigatrán solo o asociado con FVIIa o PCC se valora en un modelo animal.
En la segunda ponencia, la Dra. Rosario López Pedrera y sus colaboradores, del Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC)-Hospital Reina Sofía-Universidad de Córdoba, trata el tema titulado “Factor tisular, estrés oxidativo
y trombosis”. En primer lugar, se plantea la importancia de la aterotrombosis en patologías autoinmunes como el síndrome antifosfolípido (SAF) y el lupus eritematoso sistémico (LES). Se expone la investigación llevada a cabo por su grupo en relación al estrés
oxidativo y aterotrombosis en la patología autoinmune y el efecto de la coenzima Q10, así como el tratamiento con estatinas en
pacientes con SAF y LES. Por último, se indican los mecanismos epigenéticos involucrados en la regulación de la aterotrombosis
en dichas patologías autoinmunes y el papel de los microRNA.
La tercera ponencia es expuesta por el Dr. Ramón Lecumberri, del Servicio de Hematología de la Clínica Universidad de Navarra. En ella indica la relación que existe entre el cáncer y la trombosis, exponiendo los nuevos mecanismos fisiopatológicos de la
trombosis en el cáncer. Se destaca, posteriormente, los resultados de la prevención del tromboembolismo venoso (TEV) en dicha
patología, tanto en pacientes hospitalizados como aquellos que están con quimioterapia ambulatoria. Por otra parte, se incide también en el tratamiento de la trombosis, una vez establecida en los pacientes con cáncer. Se expone, a continuación, la controversia
en relación al cribado de una neoplasia oculta en pacientes con TEV idiopático. Por último, se evalúa el impacto de las HBPM en
la supervivencia de pacientes con cáncer.
Finalmente, la Dra. Dolores Tàsssies, del Servicio de Hemoterapia y Hemostasia del Hospital Clínic de Barcelona, expone el
tema de embarazo, hipercoagulabilidad y trombosis. Durante la gestación normal se producen modificaciones del sistema hemostático
que tienen como finalidad fundamental garantizar una correcta hemostasia durante el parto y el alumbramiento. Dichas modificaciones afectan simultáneamente a la coagulación, dando lugar a una hipercoagulabilidad, y al sistema fibrinolítico, produciendo
una disminución de la actividad fibrinolítica, lo que ocasiona un incremento del riesgo de tromboembolismo venoso en la mujer
gestante. Se exponen también los nuevos avances en relación a los problemas de la hemostasia asociados con las complicaciones
de la gestación y el papel de los agentes antitrombóticos. También se indican las posibles complicaciones trombóticas en el campo
de las técnicas de reproducción asistida.
35
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
The effects of dabigatran in a cell-based model of hemostasis
Maureane Hoffman
Departament of Pathology. Duke University Medical Center. Durham. North Carolina (USA)
Acknowledgments: This work was supported by the US Department of Veterans Affairs and by research grants from CSL-Behring (King of Prussia, PA) and Boehringer-Ingelheim GmbH
(Ingelheim am Rhein, Germany).
Introduction
not accurately reflect the anticoagulant effects of dabigatran, and the
ability of an agent to normalize the PT, aPTT or thrombin time is
not a good measure of whether it can normalize hemostasis in vivo.12
Thrombin generation assays appear to correlate better with hemostatic
function. However, thrombin generation assays are not well standardized and not easy to employ in a clinical setting.13 In spite of these
issues, the literature suggests that attempting to “bypass” the effects
of a direct thrombin inhibitor by administration of PCCs may be useful
in managing bleeding (reviewed in Dickneite G, 201412). By contrast,
the literature is contradictory on the potential of FVIIa to reverse the
effects of dabigatran.
The goals of our current studies were: 1) to systematically assess
the effects of FVIIa and a 4-factor PCC (Beriplex®/Kcentra®) in a
cell-based model of thrombin generation in the presence of dabigatran,
and 2) correlate the effects on thrombin generation with hemostasis in
an animal model that is sensitive to the effects of anticoagulants.14,15
Until quite recently vitamin K antagonists (VKAs), such as warfarin, have been the only orally active anti-coagulants. In the past few
years several orally active small molecule coagulation inhibitors have
come on the market to compete with VKAs. These inhibitors had been
termed “novel oral anticoagulants” or “NOACs”. With the passage of
time that name has become less and less appropriate. More recently,
it has been suggested to keep the term “NOAC”, but use it to refer to
“non-vitamin K-antagonist oral anticoagulants”1. The NOACs each
inhibit one of the proteases in the coagulation process; either thrombin
or FXa. The first of this class of drugs to be approved was Pradaxa®
(Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany) which contains the inactive prodrug, dabigatran etexilate.2 After absorption, it is metabolized
to the thrombin inhibitor, dabigatran. Dabigatran was followed closely
by several FXa inhibitors, including apixaban, rivaroxaban and edoxaban, with more on the way.
Key clinical trials have shown that the NOACs as a group are as effective as warfarin in preventing strokes in patients with atrial fibrillation,
and are associated with a lower risk of life-threatening bleeding than is
warfarin. A meta-analysis including the RE-LY, ROCKET AF, ARISTOTLE and ENGAGE trials concluded that overall the patients on one of
the NOACs had a 19% lower risk of stroke or embolic events compared
to warfarin.3 This benefit was mainly due to a reduction in hemorrhagic
stroke. Patients on NOACs also had a lower all cause mortality, though a
higher risk of GI bleeding.3 In addition, patients on dabigatran were more
likely to stay on their anticoagulant regimen that patients on warfarin.4
In spite of the potential advantages of the NOACs, they have a
significant drawback. This is that there are no reliable reversal agents
for any of them. Dabigatran has a relatively short half-life (7 to 17
hours) in patients with adequate renal function.5,6 Thus, many bleeding
episodes can be managed by withholding the drug until it is cleared.
However, this approach is not adequate for some patients. Patients with
life-threatening bleeding or who urgently need an invasive procedure
can be difficult to manage due to the lack of a validated antidote.7
A specific humanized antibody antidote for dabigatran is in clinical
trials8, but is not yet commercially available. Thus, other strategies
have been attempted to reverse its effects. Most commonly, nonactivated prothrombin complex concentrates (PCC), recombinant FVIIa
(NovoSeven®, Novo Nordisk) or activated PCC (FEIBA®, Baxter) have
been administered in attempts to restore hemostasis.9-11 No clinical
trials of these agents in bleeding human subjects on dabigatran have
been conducted. Data in support of reversal strategies come from case
studies, animal studies and reversal of dabigatran effects on various
coagulation tests in blood from normal subjects.
The published results have been somewhat contradictory. However, they do suggest that the common plasma coagulation tests do
Effects of dabigatran in a cell-based CAT® model
Assays of thrombin generation were performed using the Calibrated
Automated Thrombogram (CAT®) method as previously described16
with the following modifications. Monocytes cultured overnight with
LPS were used as a TF source.17 The number of monocytes was adjusted to a level of approximately 1 pM TF activity. Platelet rich plasma
(PRP) was used, with platelets adjusted to 200 x 109/L by addition of
platelet poor plasma from the same blood donor.
The active form of dabigatran was purchased from Selleck Chemicals (Houston, TX). It was added to PRP to final concentrations designed
to mimic a peak therapeutic level (0.4 µM; 189 ng/mL), a mildly supratherapeutic level (1 µM, 472 ng/mL) and a severely supratherapeutic
level (2 µM, 944 ng/mL). In reversal experiments, 0.25 to 1.0 U/mL of a
4-factor PCC (Beriplex® in the EU or Kcentra® in the US, CSL-Behring)
or 25 to 100 nM recombinant FVIIa (NovoSeven®, Novo Nordisk) were
also added before initiating thrombin generation.
We found that dabigatran progressively prolonged the lag before
onset of thrombin generation, to 194 + 44% (mean + sd; p<0.005
compared to control) of the control level at a therapeutic level, 311
+ 84% (p<0.005 compared to control) at a supratherapuetic level
and 356 + 100% (p<0.005 compared to control) at a severely supratherapeutic level. Dabigatran also progressively reduced the total
amount of thrombin activity measured (AUC) to 68 + 4% (p<0.005
compared to control) of the control level at a therapeutic level, 48 +
9% (p<0.005 compared to control) at a supratherapuetic level and 26
+ 14% (p<0.005 compared to control) at a severely supratherapeutic
level. The peak was not significantly reduced at a therapeutic level
of dabigatran (93 + 13%), but was significantly reduced at supratherapeutic (66 + 13%; p<0.005) and severely supratherapeutic levels
36
Ponencias
While the dosing of FVIIa is very different in mice and humans, the
steep dose-response relationship was also seen with FVIIa.
(37 + 16%; p<0.005). Our results are generally similar to reports in
the literature utilizing a standard CAT® assay system. Representative
data showing the thrombin generation curves from a single experiment are shown in Figure 1.
Conclusions
The effect of PCC and FVIIa on thrombin generation in
the presence of dabigatran
We draw the following conclusions from this work:
• In a cell-based CAT® assay PCC (Beriplex®/Kcentra®) increases the peak, rate and total amount of thrombin generated
(AUC) at all concentrations of dabigatran tested, from therapeutic to severe overdose. However, PCC does not improve
the lag time.
• FVIIa improves the lag time, peak and rate of thrombin generation, but does not increase the AUC.
• FVIIa only has a beneficial effect on thrombin generation if the
dabigatran level is not too high (not > about 1 µM or 480 ng/
mL in this model).
• Neither FVIIa or PCC normalizes all parameters of thrombin generation in the presence of dabigatran. However, each can normalize
We found that PCC at 1.0 U/mL (equivalent to about 50 U/kg in vivo)
normalizes the rate, peak and AUC in the cell-based CAT® model at
all levels of dabigatran tested. However, PCC does not improve the
prolonged lag time. By contrast, FVIIa at 100 nM shortens the lag and
increases the rate and peak. However, FVIIa does not improve the AUC
at any concentration tested.18
Examples of the effects of PCC and FVIIa on thrombin generation
at a concentration of 1 µM dabigatran (mildly supratherapeutic) are
shown in Figure 2. Each agent increased the peak thrombin level in a
dose-dependant fashion in the absence or presence of dabigatran with
one notable expection. PCC had a beneficial effect at all concentrations
of dabigatran tested, but FVIIa no longer had a beneficial effect if
dabigatran was increased to a severely supratherapeutic level.
Results in a mouse bleeding model
The in vivo assessment of bleeding was carried out using a mouse
saphenous vein bleeding model.14,15,19 This model performs well for the
assessment of coagulation abnormalities, including hemophilia and the
effects of anticoagulants.20 Mice were randomly assigned to receive i.v.
injection of buffer, dabigatran alone or dabigatran plus 25 or 50 U/kg of
PCC or 124, 270 or 540 µg/kg FVIIa. Hemostasis was then assessed by
determination of serial bleeding times from a saphenous vein incision.
In the presence of a therapeutic level of dabigatran we found that
either FVIIa or PCC could restore hemostasis in this model. However,
the dose response relationship was extremely steep. At 25 U/kg the PCC
had no effect on hemostasis, but at 50 U/kg hemostasis was normalized.
Figure 2. Effect of PCC and FVIIa on thrombin generation curve in the presence
of 1 µM dabigatran in a cell-based CAT® assay. These curves are representative
of the different effects of PCC (1 U/mL) and FVIIa (100 nM) on the pattern of
thrombin generation in the presence of a mildly supratherapeutic level of
dabigatran. PCC does not shorten the prolonged lag, but does increase the
rate, peak and AUC. FVIIa shortens the lag and increases the rate and peak,
but does not increase the AUC.
Figure 1. Effects of dabigatran on thrombin generation curves in a cell-based
CAT® model of thrombin generation. Dabigatran progressively prolongs the lag
before onset of thrombin generation, as well as depressing the peak, rate and
total amount of active thrombin in the model system. This is representative
data from one experiment. The concentration of dabigatran in each treatment
is indicated in the figure.
37
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
hemostasis in a mouse bleeding model in the presence of a therapeutic level of dabigatran.
• There is an extremely steep dose-response relationship between
the dose of PCC or FVIIa administered and shortening of the
hemostasis time that suggests a threshold effect. Thus little benefit
is seen unless the concentration of the “reversal” agent is above
a critical threshold.
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We think our results explain some of the inconsistencies in published literature. The ability of either PCC or FVIIa to restore hemostasis in the presence of dabigatran depends on the dose of reversal
agent used and the level of dabigatran present. Thus, the conclusion
of a particular study can depend greatly on the precise conditions
employed. Only results from bleeding human subjects can validate
the results from the presently available studies.
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38
Ponencias
Factor tisular, estrés oxidativo y trombosis
Rosario López Pedrera, Francisco Velasco Gimena, Carlos Pérez Sánchez, Nuria Barbarroja, Patricia Ruiz Limón, M.ª Ángeles Aguirre,
M.ª José Cuadrado
Servicio de Reumatología. Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC). Hospital Universitario Reina Sofía. Universidad de Córdoba
Financiado por: Instituto de Salud Carlos III (PI12/01511), Consejería de Salud, Junta de Andalucía (CTS-7940) y Sociedad Española de Reumatología (Fundación Española de
Reumatología - FER)
Introducción
munes sistémicas se han propuesto numerosas teorías para explicar
dichos mecanismos, aunque la patogénesis parece ser multifactorial.
La activación monocítica inducida por los anticuerpos antifosfolípido (AAF), presentes en un alto porcentaje de pacientes con SAF y
LES, resulta de una compleja interacción entre numerosos efectores
intracelulares, responsables últimos del desarrollo de trombosis. Hace
algunos años nuestro grupo describió que un proceso esencial es la
inducción de la actividad procoagulante, mediante la activación del
factor tisular (TF), el principal iniciador de la coagulación sanguínea3.
La señalización intracelular asociada a dicha activación está mediada
por los receptores activados por proteasas (PAR, mediadores de respuestas críticas para la trombosis, hemostasia y procesos inflamatorios
y participantes en el desarrollo de arteriosclerosis), cuya expresión se
encuentra incrementada en los monocitos de los pacientes con SAF4.
Estudios posteriores permitieron demostrar que dicha señalización
intracelular, inducida por los AAF, implica la activación constitutiva
de MAPK y NFkB5, así como la promoción de la expresión del factor
de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y su receptor Flt1 en monocitos de estos pacientes6. De modo adicional, estudios proteómicos
desarrollados en nuestro laboratorio han conducido a la identificación
de nuevas proteínas (cuya expresión se encuentra alterada por efecto
directo de los AAF) implicadas en el desarrollo de trombosis y la
activación de la respuesta inmune (p. ej., protein disulfuro isomerasa,
anexina I, anexina II, catalasa, ubiquitin-Nedd8, proteínas RhoA y
Hsp60)7. La imbricación de todas estas proteínas y mecanismos intracelulares resultaba pues en la inducción de un estado procoagulante y
proinflamatorio en estos pacientes.
Los anticuerpos antifosfolípido y otros autoanticuerpos presentes
en SAF (como los anti-HDL y anti-apolipoproteína I) son también
responsables del desarrollo de enfermedad cardiovascular y aterosclerosis a través de otros mecanismos complementarios que incluyen
la formación de complejos anti-LDLox/anti-ß2GPI, lo que facilita o
acelera la absorción de LDLox por los macrófagos y su consecuente
conversión en células espumosas. Además, tanto macrófagos como
células endoteliales adhieren ß2GPI durante el proceso aterosclerótico,
de modo que los anticuerpos promueven la adhesión de los macrófagos al endotelio mediada por moléculas de adhesión como ICAM-1,
VCAM-1 o e-selectina8. De hecho, se ha demostrado una correlación
positiva entre los títulos de anticuerpos anticardiolipina y anti-ß2-glicoproteína 1 y la incidencia y severidad del síndrome coronario agudo,
el infarto de miocardio o el accidente cerebrovascular9.
En un estudio reciente desarrollado en nuestro laboratorio, en
una cohorte de 43 pacientes con SAF10, pudimos demostrar, como en
estudios previos, una correlación positiva entre los títulos de anticuerpos anticardiolipina y la ocurrencia de eventos trombóticos en estos
pacientes. También demostramos una asociación positiva significativa
entre los títulos de estos anticuerpos y la presencia de aterosclerosis
La enfermedad vascular aterotrombótica representa un problema global de salud pública de importancia creciente. A pesar de los avances
que se han realizado en el tratamiento de las manifestaciones clínicas
de esta enfermedad (infarto de miocardio, accidentes cerebrovasculares, aneurisma aórtico, vasculopatía periférica, etc.) las recidivas son
frecuentes y la morbimortalidad continúa siendo elevada. Un aspecto
importante de la prevención y tratamiento de la aterotrombosis consiste
en identificar precozmente a los sujetos con riesgo vascular aumentado, susceptibles de desarrollar episodios trombóticos.
Los nuevos conceptos relacionados con la patogenia de la aterotrombosis (AT), donde la inflamación generada por un mecanismo
inmunológico se considera determinante, han permitido considerar
que un proceso autoinmune esté involucrado en su inicio y perpetuación1. Las enfermedades autoinmunes más estudiadas en relación con
la AT son aquellas que presentan una mayor incidencia, como el lupus
eritematoso sistémico (LES) y el síndrome antifosfolípido primario
(SAF). El desarrollo de enfermedad cardiovascular en estas patologías
implica factores genéticos, así como otros factores de riesgo adquiridos (p. ej. hipercolesterolemia, diabetes mellitus e hipertensión). Los
componentes protrombóticos e inflamatorios de la respuesta inmune
(principalmente el factor tisular y diversas citocinas), el estrés oxidativo, así como elementos autoinmunes (p. ej. autoanticuerpos, autoantígenos y linfocitos autorreactivos) parecen estar también implicados
en estos procesos2.
Aterotrombosis en patologías autoinmunes: síndrome
antifosfolípido y lupus eritematoso sistémico
En las enfermedades autoinmunes, como el SAF y el LES, se presentan
eventos coronarios agudos sin que medien factores de riesgo tradicionales previos que los justifiquen. El análisis de los mecanismos que
llevan al desarrollo de una aterotrombosis prematura y/o acelerada en
estas patologías permite establecer similitudes entre la aterogénesis
y los procesos inflamatorios crónicos que caracterizan a estas enfermedades: incremento en la expresión de moléculas de adhesión en
el endotelio, aumento del reclutamiento de células proinflamatorias
y activación de macrófagos, aumento en la expresión de citocinas,
factores de crecimiento y otros factores inflamatorios que interrelacionan los distintos tipos celulares. Así la presencia de una enfermedad
autoinmune constituye un factor de riesgo aterogénico de gran peso, ya
que aumenta la probabilidad de un evento trombótico en mayor grado
y en menor tiempo que los factores de riesgo tradicionales.
Estudios celulares y moleculares recientes han demostrado que
dentro de la placa arteriosclerótica los mecanismos proinflamatorios y
protrombóticos están íntimamente asociados. En enfermedades autoin-
39
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
lipina, y la expresión de moléculas de adhesión que favorecería el
reclutamiento de monocitos y linfocitos. Los monocitos activados
migran hacia la íntima arterial, donde por acción de los complejos
ß2GPI/LDLox se vería incrementada la adsorción de LDLox, conduciendo a la formación de células espumosas. Estas células junto
con los linfocitos T producirían citocinas, factores de crecimiento, TF,
etc., promoviendo la proliferación de las células musculares lisas y la
potenciación del proceso aterotrombótico.
precoz, medida como engrosamiento de la íntima media carotídea.
Nuestros resultados confirman estudios previos desarrollados por el
grupo de Ames et al.11, que también demuestran un aumento en el
engrosamiento de la íntima media carotídea asociada al título de antiaCL de isotipo IgG. Es más, nuestros datos apuntan a la existencia
de una aterosclerosis prematura asociada al desarrollo de trombosis,
de forma que en nuestra serie de pacientes 11 de los 12 pacientes
SAF que mostraban placas ateroscleróticas habían sufrido al menos
un evento trombótico previo. La formación del trombo es un proceso clave en el desarrollo del engrosamiento de la carótida interna.
Numerosos estudios han demostrado que el TF está presente en las
lesiones ateroscleróticas y contribuye a la aterogénesis. El TF media
respuestas críticas para la hemostasis y la trombosis, así como para
las reacciones inflamatorias12. Por tanto el TF, cuya expresión se halla
significativamente incrementada en monocitos de pacientes con SAF,
junto a otros factores de la cascada coagulativa y el sistema activado
por PAR2, podría actuar como un regulador multifactorial adicional
de la aterogénesis.
El desarrollo de una aterosclerosis temprana podría verse igualmente facilitado por la existencia de un estatus inflamatorio en estos
pacientes, que parece no estar coordinado por la citocinas “clásicas”
como el TNF o la IL-1, sino por mediadores inflamatorios como el
VEGF, el tPA o diversas quimiocinas (IL-8, MCP-1, MIP1alfa) cuya
función principal es el reclutamiento de neutrófilos, monocitos y linfocitos B y T a las zonas de inflamación.
De modo resumido, la secuencia de inicio de formación de la placa
aterosclerótica en estos pacientes implicaría (Figura 1): la activación
de las células endoteliales por efecto de los anticuerpos anticardio-
Estrés oxidativo y aterotrombosis en la patología
autoinmune. Efecto de la coenzima Q10
Más recientemente se ha demostrado que el estrés oxidativo ejerce
un papel fundamental en la patogenia de la aterotrombosis. El estrés
oxidativo podría definirse como el desequilibrio bioquímico propiciado por la producción excesiva de especies reactivas y radicales libres
que generan daño oxidativo en las biomoléculas y que no puede ser
contrarrestado por los sistemas antioxidantes.
En condiciones fisiológicas normales, las especies reactivas de
oxígeno y nitrógeno son producidas por la mitocondria como resultado
del metabolismo aerobio, los peroxisomas celulares en procesos de
detoxificación o la NADPH oxidasa de las células fagocíticas, como
sistemas de señalización celular y como medio del sistema inmunitario
para eliminar patógenos. Estas especies reactivas y radicales libres son
luego eliminados o neutralizados por las defensas antioxidantes del
organismo, tales como las enzimas catalasa o superóxido dismutasa y
algunas vitaminas. Sin embargo, cuando este equilibrio se pierde, por
procesos inflamatorios o autoinmunes, por ejemplo, se incrementa la
concentración de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, conduciendo a un daño en los componentes celulares, tales como los lípidos
o las proteínas, alterando el metabolismo y crecimiento celular normal
y dando lugar a alteraciones en el sistema de defensa, el envejecimiento o numerosas enfermedades.
En patologías autoinmunes como el SAF o el LES se ha demostrado que los anticuerpos anticardiolipina parecen jugar un papel
relevante en la inducción de un estatus prooxidativo, a través de la
inducción de la producción de óxido nítrico y anión superóxido,
con la consecuente generación de peroxinitritos, potentes sustancias
prooxidantes asociadas con disfunción vascular y aterogénesis13. Los
títulos de ACA también se han correlacionado con los niveles plasmáticos de F2-isoprostanos, marcadores de peroxidación lipídica in
vivo. Otro mecanismo proaterogénico promovido por los anticuerpos
antifosfolípido es la inducción de la absorción de LDL oxidada por
parte de los macrófagos. Este efecto concuerda con la reducción de la
actividad paraoxonasa encontrada en estos pacientes. La paraoxonasa
es una enzima antioxidante asociada a lipoproteínas de alta densidad
que previenen la oxidación de las LDL. Es más, la actividad de esta
enzima se ha asociado a la presencia de alteraciones estructurales y
funcionales del sistema arterial en pacientes APS. A nivel molecular
estos autoanticuerpos promueven la activación constitutiva de NFkB, y
consecuentemente la activación de la óxido nítrico sintasa, ambas responsables de la disfunción endotelial característica de estos pacientes.
A nivel celular, varios estudios han demostrado que la producción excesiva de radicales de oxígeno y nitrógeno daña biomoléculas
tales como lípidos, proteínas y ADN, así como componentes celulares,
siendo la maquinaria mitocondrial particularmente sensible al daño
oxidativo. Es más, las especies reactivas de oxígeno derivadas de la
Figura 1. Secuencia de formación de la placa aterosclerótica en pacientes
con síndrome antifosfolípido primario mediada por anticuerpos anti-ß2glicoproteína 1. De modo resumido, la secuencia de inicio de formación de la
placa aterosclerótica en estos pacientes implicaría: la activación de las células
endoteliales por efecto de los anticuerpos anticardiolipina, y la expresión
de moléculas de adhesión que favorecería el reclutamiento de monocitos y
linfocitos. Los monocitos activados migran hacia la íntima arterial, donde por
acción de los complejos ß2GPI/LDLox se vería incrementada la adsorción de
LDLox, conduciendo a la formación de células espumosas. Estas células, junto
con los linfocitos T, producirían citocinas, factores de crecimiento, TF, etc.,
promoviendo la proliferación de las células musculares lisas y la potenciación
del proceso aterotrombótico.
40
Ponencias
mitocondria actúan como moléculas intracelulares de señalización que
regulan numerosas funciones celulares.
En la mitocondria, la coenzima Q10 (CoQ10 o ubiquinona) es un
componente vital de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, con un papel crucial en la producción de ATP. Proporciona propiedades estabilizadoras a la membrana celular y actúa como antioxidante, con efectos celulares protectores. Entre dichos efectos inhibe la
oxidación de LDL y de este modo la progresión de la aterosclerosis. Es
más, la CoQ10 reduce la producción de citocinas proinflamatorias, así
como la viscosidad sanguínea, efectos ambos beneficiosos en pacientes
con fallo cardíaco y enfermedad arterial coronaria. Diversos estudios
han mostrado los efectos terapéuticos de la suplementación con CoQ10
en distintas condiciones clínicas, con especial énfasis en la enfermedad
cardiovascular14. Sin embargo, los posibles efectos beneficiosos de la
CoQ10 en pacientes autoinmunes con alto riesgo de aterotrombosis aún
no han sido evaluados.
Con esta premisa, en nuestro equipo nos planteamos como objetivos: 1) investigar la disfunción mitocondrial y el estrés oxidativo en
leucocitos de pacientes con SAF y su asociación con el desarrollo de
trombosis y aterosclerosis; 2) analizar el efecto del tratamiento in vitro
con autoanticuerpos en presencia/ausencia de coenzima Q10.
El estudio, realizado en muestras de 43 pacientes SAF y 38
donantes sanos10, demostró, en primer lugar, la presencia de un estatus oxidativo celular, con producción incrementada de peróxidos y
anión superóxido en monocitos y neutrófilos, junto con una reducción
significativa en los niveles de GSH intracelular. Se observó también
elevado el porcentaje de monocitos y neutrófilos circulantes con el
potencial de membrana mitocondrial (PMM) incrementado.
Los estudios de correlación y asociación demostraron que los títulos de anticuerpos anticardiolipina se hallaban positivamente correlacionados con el porcentaje de células con alteración de su potencial de
membrana mitocondrial. Los niveles de peróxidos en monocitos correlacionaron con la expresión de TF. También los niveles de peróxidos en
monocitos y neutrófilos correlacionaron positivamente con los niveles
plasmáticos de tPA. Finalmente, los niveles de actividad antioxidante
total en plasma se correlacionó negativamente con los niveles plasmáticos de VEGF. Los estudios de asociación mostraron que la ocurrencia
de eventos trombóticos en pacientes APS se asoció con factores previamente descritos como los títulos de anticuerpos anticardiolipina o
la expresión de TF, pero también con marcadores de estrés oxidativo
como el potencial de membrana mitocondrial o la capacidad antioxidante total del plasma. Se evidenció asimismo que la AT incipiente
encontrada en estos pacientes se asociaba al aumento en el porcentaje
de células con alteración del potencial de membrana mitocondrial. Se
ponía de manifiesto de este modo la gran relevancia de la actividad
mitocondrial en la patología aterotrombótica de estos pacientes. Para
evaluar la implicación de la mitocondria en estos procesos y el efecto
de la CoQ10, realizamos diversos estudios in vitro en monocitos de
donantes sanos a los que se incubó con anticuerpos anticardiolipina
de isotipo IgG en presencia o ausencia de CoQ10.
La preincubación de monocitos con CoQ10 redujo el estrés oxidativo, el porcentaje de células con el PMM alterado y la expresión
inducida de TF, VEGF y Flt1. Asimismo, la CoQ10 favoreció la preservación de la ultraestructura mitocondrial. Así, las mitocondrias de
monocitos tratados con ACA-IgG mostraban un tamaño menor y una
pobre preservación ultraestructural, mientras que el pretratamiento con
CoQ10 indujo un incremento en el tamaño mitocondrial y también una
mejora en la preservación ultraestructural. Observamos asimismo, en
estudios de microscopía confocal, que estas alteraciones dependían de
procesos de fisión o ruptura mitocondrial, mediada por proteínas Drp-1
y Fis-1. La adición de CoQ10 inhibía la expresión de estas proteínas.
En suma, el estudio desarrollado nos permitió concluir que: 1) existe
una alteración del estado redox intracelular en leucocitos de pacientes
APS (mediado por los autoanticuerpos característicos del síndrome)
que regula el estado inflamatorio y proaterotrombótico, y se halla directamente asociado a la dinámica y el metabolismo mitocondrial; 2) el
tratamiento con CoQ10 previene la disfunción mitocondrial y el estrés
oxidativo y reduce la expresión de marcadores protrombóticos/proinflamatorios, por lo que podría ser considerado un tratamiento prometedor
utilizado como aditivo a la terapia estándar en pacientes APS (Figura 2).
Los monocitos como protagonistas del proceso
aterotrombótico. Efecto del tratamiento in vivo con
estatinas en pacientes con SAF y LES
La patogénesis de la aterotrombosis implica varios tipos celulares del
sistema inmune, habiéndose demostrado que los monocitos/macrófagos juegan un papel esencial.
Los monocitos son no obstante un grupo celular hetereogéneo, con
funciones divergentes en inmunidad, aterogénesis y procesos repa-
Figura 2. Ilustración esquemática de los posibles mecanismos intracelulares
ligados a la activación monocítica inducida por anticuerpos antifosfolípido. La
unión de anticuerpos anticardiolipina (aPL-IgG) a la superficie celular promueve,
por mecanismos aún no identificados, una disfunción mitocondrial que implica
una reducción del potencial de membrana mitocondrial y el incremento en la
fisión mitocondrial. La mitocondria disfuncional promueve la generación de
ROS, responsables a su vez de la activación de rutas dependientes de p38 MAPK
que conducen a un estado protrombótico y proinflamatorio. El pretratamiento
con CoQ10 previene la disfunción mitocondrial y el estrés oxidativo promovido
por los anticuerpos antifosfolípido, y la expresión de las rutas intracelulares
que conducen a la expresión de marcadores protrombóticos relevantes en la
fisiopatología del SAF.
AnxII, annexina II; β2GPI, β2-glycoproteina I; MAPK, kinasa activada por
mitógenos; NF-κB, factor nuclear-κB; PAR, receptor activado por proteasas;
TF, factor tisular; VEGF, factor de crecimiento vascular endotelial; Flt1, Fmslike tyrosine kinase 1; ROS, especies reactivas de oxígeno; iNOS, óxido nítrico
sintasa inducible; NO, óxido nítrico; Drp1, dinamina 1; Fis-1, proteína de fisión 1.
41
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
por efecto del tratamiento con fluvastatina se encontraban asociados
a enfermedad cardiovascular y trombosis (inflamación, metabolismo
lipídico, enfermedad vascular y hematológica, e interacción y señalización célula-célula, estrés oxidativo y actividad mitocondrial). El
análisis de expresión mediante RT-PCR de diversos genes seleccionados entre los descritos (GPX1, SOD2, NFKBIA, WNT5A, C1QTNF7, NRP1 y TGFB1) en monocitos de una cohorte independiente
de pacientes LES permitió validar los resultados obtenidos. Adicionalmente, en estudios de microscopía electrónica pudimos demostrar
que la fluvastatina inducía biogénesis mitocondrial en los monocitos
de los pacientes con LES, con la consiguiente mejora de la respiración
y del metabolismo celular.
Estos resultados subrayan la eficacia del tratamiento con fluvastatina en los pacientes LES, particularmente en aquellos con un riesgo
incrementado de aterotrombosis.
rativos; así, en respuesta a estímulos específicos pueden promover la
fagocitosis de lipoproteínas citotóxicas, la eliminación de cuerpos apoptóticos, la secreción de citocinas antiinflamatorias o la síntesis de proteínas reparadoras de la matriz que estabilizan las placas ateroscleróticas
vulnerables. Pero también pueden promover efectos deletéreos: además
de modular el metabolismo lipídico, los monocitos secretan citocinas
inflamatorias, quimiocinas y especies reactivas de oxígeno que dirigen
la patogenia. También producen TF y proteasas que contribuyen a la
trombosis y la ruptura de la placa aterosclerótica15. Por tanto, la modulación farmacológica de la actividad monocito/macrofágica representa una
estrategia terapéutica potencial para la prevención de la aterotrombosis.
Numerosos estudios llevados a cabo en los últimos años sugieren
que las estatinas, potentes inhibidores de la enzima 3-hidroxi-3-metil
glutaril coenzima A reductasa (HMG-CoA), e inicialmente asociadas a
la reducción del metabolismo del colesterol, poseen efectos beneficiosos sobre numerosas enfermedades cardiovasculares y autoinmunes.
Estos efectos serían debidos a sus pleiotrópicas funciones sobre la
disfunción endotelial, sus propiedades antiinflamatorias, sus efectos
inmunomoduladores, etc.16.
Con esta premisa, en nuestro equipo de investigación nos planteamos evaluar, en monocitos de pacientes con SAF, los efectos del
tratamiento con fluvastatina sobre la expresión y regulación de las
proteínas implicadas en el estado proinflamatorio/procoagulante característico de este síndrome17. Dicho estudio se realizó en una cohorte
de 42 pacientes con SAF e historia previa trombosis, que recibieron
fluvastatina (20 mg/día) durante un mes. Se obtuvieron muestras de
sangre periférica antes del tratamiento y después de uno y tres meses.
Tras un mes de tratamiento con fluvastatina, los monocitos de pacientes con SAF mostraron una inhibición significativa en la expresión
TF, PAR1, PAR2, VEGF y Flt1. A nivel molecular, esta inhibición
se asoció con la reducción de la proteólisis de IkBalfa y la inhibición
de la actividad de NFkB. Los niveles medios de la forma fosforilada
de p38-MAPK mostraron una reducción paralela. El análisis proteómico demostró cambios significativos en los patrones de expresión
de proteínas implicadas en el desarrollo de trombosis: la fluvastatina
inhibió la expresión de Annexin II y de RhoA e indujo la expresión de
la proteína disulfuro isomerasa.
En su conjunto, nuestros datos sugerían que las estatinas pueden
regular, in vivo, la expresión de proteínas procoagulantes y proinflamatorias en monocitos de pacientes con SAF. El análisis proteómico
contribuyó a la elucidación de los mecanismos subyacentes a dichos
efectos reguladores. La fluvastatina podría por tanto constituir una terapia alternativa con resultados prometedores en el tratamiento del SAF.
En un estudio posterior18 nos planteamos como nuevo objetivo
evaluar la efectividad de la fluvastatina como fármaco antiinflamatorio/antioxidante en pacientes lúpicos, en los que se ha demostrado
igualmente una alteración del estado redox intracelular en monocitos
asociada al efecto de los autoanticuerpos del LES e implicado en el
desarrollo de eventos cardiovasculares. Seleccionamos 27 pacientes,
a los que se administró fluvastatina a una dosis de 20 mg/día durante
un mes. Se obtuvieron muestras de sangre antes del tratamiento y al
final del mismo y se realizó un array de expresión a partir de ARN
extraído de monocitos purificados.
El estudio de microarray mostró que alrededor de 800 genes
sufrieron un cambio significativo en su perfil de expresión en monocitos de pacientes LES en respuesta al tratamiento con fluvastatina.
Aproximadamente un 38% de los genes alterados en su expresión
Mecanismos epigenéticos involucrados en la
regulación de la aterotrombosis en el síndrome
antifosfolípido primario y el lupus eritematoso
sistémico. Papel de los miRNA
La complejidad de la aterotrombosis en los pacientes SAF/LES probablemente requiera de un sistema integrado de análisis de factores
de riesgo cardiovascular y biomarcadores para identificar y tratar a
los pacientes con alto riesgo. En este sentido diversos estudios a nivel
molecular han mostrado que existe una familia de RNA, denominada
microRNA (miRNA) con una función esencial en un número creciente
de procesos biológicos, a través de la regulación de la expresión proteica. Los miRNA son RNA cortos, de 21-25 nucleótidos, no codificantes, e implicados en la regulación génica, aunque el papel preciso de
muchos de ellos es aún desconocido. Se han identificado más de 1.500
miRNA en la especie humana, habiéndose demostrado su participación
clave en numerosos procesos fisiológicos y patológicos (cardiogénesis,
diferenciación hematopoyética, inmunidad innata y adquirida, oncogénesis, etc.)19. Estudios recientes, desarrollados en colaboración con
el grupo de investigación dirigido por el Dr. Constantino Martínez, de
la Universidad de Murcia, han demostrado que diversos miembros del
cluster miR 17-92 (miR-20a y miR-19b), inicialmente identificados
como reguladores de la angiogénesis tumoral, regulan la expresión
de TF en monocitos de pacientes con SAF y LES, de modo que se
ha observado una reducción en los mismos significativamente correlacionada con la sobreactivación del TF20. La reducción en la expresión de estos miRNA podría pues contribuir al estado protrombótico
característico de pacientes SAF y LES. Se trata del primer trabajo
que muestra que los miRNA pueden ser importantes moduladores del
sistema hemostático y estar implicados en procesos fisiopatológicos
en enfermedades autoinmunes sistémicas. Por tanto, la identificación y
caracterización de los miRNA implicados en el control de la expresión
de proteínas proinflamatorias y protrombóticas asociadas a la aterotrombosis en patologías autoinmunes podría contribuir a la identificación de biomarcadores para delinear el fenotipo de dicha patología, así
como la valoración de respuesta a nuevas modalidades terapéuticas.
Consideraciones finales
En suma, la aterotrombosis en SAF y LES constituye una patología de
carácter sistémico en cuyo desarrollo interviene una compleja red de
42
Ponencias
mediadores inmunológicos, procoagulantes (p. ej., TF) estrés oxidativo
y citocinas que conducen a la aparición de células espumosas en la
pared vascular con la posterior formación de estrías grasas y de placas
que derivan en la inducción de procesos trombóticos.
Numerosas herramientas terapéuticas se hallan en estudio para su
uso en la prevención de la AT y la patología cardiovascular asociada a
estas enfermedades autoinmunes, tales como las estatinas, la hidroxicloroquina, los péptidos miméticos de ApoA1, inhibidores de IFNalfa,
la coenzima Q10, etc. Dichas herramientas deben considerar la compleja
red de factores implicados en la patología aterotrombótica, de modo
que probablemente la mejor estrategia implicaría una combinación
de fármacos inmunosupresores, antiinflamatorios y antioxidantes que
debería ser administrada teniendo en cuenta el perfil patológico/molecular específico de cada paciente autoinmune.
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43
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Trombosis y cáncer
Ramón Lecumberri, Ana Alfonso
Servicio de Hematología. Clínica Universidad de Navarra. Pamplona
Introducción
a cáncer presentan un mayor riesgo de recurrencia, hemorragias y
mortalidad durante el tratamiento anticoagulante6. Más aún, el hecho
de sufrir un episodio tromboembólico se asocia con un peor pronóstico
de la propia enfermedad tumoral7. Por tanto, la prevención es fundamental en esta población tan sensible.
En la actualidad existe uniformidad entre las distintas guías de
práctica clínica en la recomendación de profilaxis farmacológica con
heparina de bajo peso molecular (HBPM) en pacientes con cáncer activo hospitalizados con proceso médico agudo o inmovilización8-10. Sin
embargo, esta recomendación se basa en gran medida en extrapolación
de los resultados de los principales ensayos clínicos que evaluaron
la eficacia y seguridad de la tromboprofilaxis, en comparación con
placebo, en pacientes hospitalizados con patología médica aguda. En
estos estudios la proporción de pacientes oncológicos osciló entre el
4-15%. Un metaanálisis reciente de los resultados de estos estudios
en la subpoblación con cáncer encontró que el riesgo relativo de TEV
fue 0,91 (IC 95%, 0,2-4,0) en los pacientes que recibieron tromboprofilaxis frente a placebo11.
Cabe la posibilidad de que las dosis utilizadas no sean las óptimas,
y que en muchos pacientes con cáncer se precisen dosis profilácticas
superiores a las empleadas en el resto de pacientes. En este sentido,
nuestro grupo, evaluando el impacto de un sistema de alerta electrónica
para la prevención del TEV en pacientes hospitalizados, hemos descrito un impacto mucho menor en los pacientes con cáncer activo que
en el resto de pacientes hospitalizados por patología médica aguda12.
Un porcentaje importante (>70%) de eventos tuvo lugar en pacientes
que había recibido una adecuada profilaxis con HBPM. En cualquier
caso, la eficacia y seguridad de empleo de “dosis intermedias” debería
ser evaluada en estudios diseñados a tal efecto.
Otra cuestión controvertida es la administración de tromboprofilaxis
en pacientes en tratamiento quimioterápico ambulatorio. Los estudios
PROTECHT y SAVE-ONCO demostraron una reducción estadísticamente significativa de TEV que recibieron profilaxis con nadroparina o
semuloparina13,14, respectivamente. Sin embargo, la baja incidencia de
eventos observada en el grupo control de ambos estudios y la ausencia de
impacto en la supervivencia, ha motivado que por el momento ninguna
guía clínica recomiende actualmente tromboprofilaxis sistemática en
este contexto. El desarrollo de escalas de estratificación del riesgo de
TEV en pacientes oncológicos en tratamiento quimioterápico (la más
validada es la propuesta por A. Khorana) puede ser de ayuda a la hora de
seleccionar aquellos pacientes con mayor riesgo de TEV, que en teoría
más se beneficiarían de la tromboprofilaxis farmacológica15. Así, en el
estudio con nadroparina, el número necesario para tratar (NNT) para
prevenir un episodio tromboembólico disminuyó de 50 en la población
global a 15 en los pacientes de alto riesgo. De la misma forma, en el
estudio con semuloparina, la reducción de la incidencia de trombosis
en los pacientes de alto riesgo (1,4% vs 5,4%) fue mayor que en los
En los últimos años estamos asistiendo a un creciente interés en el
estudio de la asociación entre cáncer y trombosis, descrita por primera
vez en la primera mitad del siglo xix. Este interés se ha traducido en
un mejor conocimiento de los mecanismos fisiopatológicos implicados así como en importantes avances en el manejo clínico de estos
pacientes. En las siguientes líneas abordaremos algunos de los temas
más candentes de la asociación bidireccional existente entre cáncer y
trombosis, con especial énfasis en aquellas cuestiones más próximas
a la práctica clínica habitual.
Nuevos mecanismos fisiopatológicos de la trombosis
en cáncer
Es bien conocido que el cáncer induce un estado de hipercoagulabilidad, que sumado a otros factores (cirugías, inmovilización, tratamientos de quimioterapia/hormonoterapia, etc.) contribuye a la alta
incidencia de tromboembolismo venoso (TEV) en esta población.
La incidencia de trombosis asociada a cáncer es aproximadamente
de 13 casos por 1.000 personas-año, pero dependiendo del tipo de
neoplasia y otros factores concurrentes, se han descrito tasas próximas
al 20%1.
Varios trabajos recientes han mostrado que alteraciones (mutaciones) en algunas vías de señalización oncogénicas (RAS, HER2, EGFR,
PTEN, MET, P53) juegan un papel en la disregulación hemostática que
acompaña al cáncer, influyendo en la expresión, entre otros, de factor
tisular (FT)2. Así, el perfil de expresión de genes relacionados con la
coagulación puede diferir entre subgrupos molecularmente diferentes
de una neoplasia determinada.
Por otra parte, la generación de neutrophile extracellular DNA
traps (NETosis) se postula como un nuevo mecanismo tanto en los
procesos de progresión tumoral como en el desarrollo de trombosis
asociada a cáncer. Se ha observado un aumento en la generación de
NET en modelos animales de cáncer, y un incremento en la concentración plasmática de marcadores de generación de NET en pacientes
con complicaciones trombóticas asociadas al cáncer3,4. Además, la
demostración de que algunos quimioterápicos inducen la liberación
de NET proporciona un nuevo mecanismo para explicar el riesgo de
trombosis asociado al tratamiento5.
Prevención del tromboembolismo venoso en pacientes
con cáncer
Además de la importancia derivada de su elevada incidencia, merece
la pena destacar que la trombosis constituye la segunda causa de mortalidad en los pacientes con cáncer. Los pacientes con TEV asociado
44
Ponencias
TEV idiopático. Aunque el número de pacientes era reducido, dicha
exploración como herramienta única mostró una sensibilidad, valor
predictivo positivo y valor predictivo negativo del 77,8%, 22,6% y
97,7%, respectivamente19. La determinación de la actividad plasmática de FT resultaba de utilidad a la hora de seleccionar pacientes con
mayor probabilidad de neoplasia oculta, con la consiguiente reducción
de costes. La utilidad de la PET/TC para esta indicación debería ser
evaluada en futuros estudios.
pacientes de riesgo bajo (1% vs 1,3%)16. En la actualidad está en marcha
un estudio prospectivo que evalúa la tromboprofilaxis ambulatoria en
función de la estratificación del riesgo.
Tratamiento del tromboembolismo venoso en pacientes
con cáncer
Nuevamente, existe uniformidad en las distintas guías clínicas acerca
de la preferencia de la HBPM como tratamiento inicial y a largo plazo
(6 meses) del TEV en pacientes con cáncer activo.
Pasado este tiempo, en caso de persistencia de enfermedad activa,
se sugiere continuar el tratamiento anticoagulante, aunque está menos
claro el fármaco de elección. Asimismo, en caso de recurrencia trombótica durante el tratamiento anticoagulante existen diversas posibilidades, aunque la más aceptada hoy en día es escalar la dosis de HBPM
frente a la implantación de un filtro en la vena cava17.
Los ensayos realizados con los nuevos anticoagulantes orales de
acción directa como tratamiento inicial y a largo plazo del TEV incluyeron una población muy limitada (<10%) de pacientes con cáncer. Si
además tenemos en cuenta que el brazo control en estos estudios fue
warfarina (en los pacientes con cáncer el tratamiento de elección es
HBPM), la mayoría de expertos coinciden en señalar que se precisan
nuevos estudios específicos en esta población antes de recomendar la
utilización de estos anticoagulantes para este fin.
Heparina de bajo peso molecular y supervivencia
en pacientes con cáncer
El sistema hemostático juega un importante papel en varia etapas
del proceso de progresión tumoral. La administración de fármacos
antitrombóticos podría ejercer un efecto beneficioso en pacientes con
cáncer más allá de la mera prevención de complicaciones trombóticas.
Numerosos estudios in vitro e in vivo han sugerido una acción antitumoral de las heparinas, principalmente de las HBPM.
Sin embargo, los estudios realizados hasta la fecha, dirigidos a
evaluar el impacto en la supervivencia de la administración de HBPM
en pacientes con cáncer sin trombosis, han mostrado resultados poco
uniformes. La heterogeneidad en el diseño de dichos estudios (tipo de
tumor, estadio, dosis y posología de HBPM) dificulta la obtención de
conclusiones claras20.
Todas las guías clínicas recomiendan no administrar HBPM
a pacientes con cáncer sin trombosis con el objeto de aumentar la
supervivencia en condiciones de práctica clínica habitual. No obstante, se debe seguir dedicando esfuerzo y recursos a esta línea de
investigación. El recientemente publicado estudio ABEL (bemiparina en pacientes con carcinoma microcítico de pulmón en estadio
localizado) mostró una supervivencia muy superior en pacientes que
recibieron esta HBPM21. Estos resultados apoyan la teoría de que el
beneficio de las HBPM para la supervivencia en pacientes con cáncer
se daría particularmente en pacientes con enfermedad en estadios no
avanzados, esto es, sin metástasis a distancia. Al igual que en puntos
anteriores, los resultados de estudios actualmente en marcha ayudarán
a clarificar esta cuestión.
Cribado de neoplasia oculta en pacientes
con tromboembolismo venoso idiopático
En ocasiones, un episodio tromboembólico puede ser la primera manifestación clínica de una neoplasia que había permanecido oculta o
asintomática hasta ese momento. La prevalencia de un cáncer oculto
aumenta con la edad, siendo claramente superior en el caso de TEV
idiopáticos en comparación con TEV secundarios (10% vs 2%). En los
pacientes que han sufrido un episodio de TEV idiopático la posibilidad
de desarrollar una neoplasia es mayor a la de la población general hasta
los 24 meses siguientes al episodio trombótico.
En este contexto, la realización de pruebas diagnósticas dirigidas
a la detección de un posible tumor oculto parece enormemente atractiva, ya que, al menos en teoría, podría favorecer un diagnóstico más
temprano, y por consiguiente, disminuir la mortalidad por cáncer. Sin
embargo, hasta la fecha ningún estudio ha demostrado un impacto
positivo de la realización de un cribado de cáncer oculto en pacientes
con TEV idiopático en términos de supervivencia. Además de limitaciones metodológicas, algunos de estos estudios evaluaron estrategias
con sensibilidad subóptima o, por el contrario, incluyeron un abanico
de pruebas difícilmente trasladables a la práctica clínica habitual.
Aunque la mayoría de las guías que han abordado esta cuestión se
han posicionado en contra de la realización de despistaje de neoplasia
oculta, por primera vez las guías NICE (National Institute for Health
and Clinical Excellence) recomiendan el despistaje de neoplasia oculta
en pacientes con TEV idiopática con una estrategia limitada (historia
clínica, exploración física, radiografía de tórax, bioquímica básica y
análisis de orina) y considerar otras exploraciones (TC abdominopélvica y/o mamografía) en pacientes mayores de 40 años18.
Sin duda, esta es una cuestión todavía abierta. En un trabajo
reciente, Alfonso et al. han evaluado la utilidad de la PET/TC para
el cribado de cáncer oculto en pacientes con un primer episodio de
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Ponencias
Embarazo, hipercoagulabilidad y trombosis
M.ª Dolores Tàssies Penella
Servicio de Hemoterapia y Hemostasia. Hospital Clínic. Barcelona
Introducción
riesgo trombótico permanece elevado como mínimo hasta aproximadamente seis semanas posparto.
Además del estado protrombótico que caracteriza al embarazo,
el riesgo de ETV depende de otros factores genéticos o adquiridos
que incluyen factores personales y asociados al embarazo. Factores
generales de riesgo tales como la obesidad, la inmovilización, el hábito tabáquico, la cirugía, el cáncer o las enfermedades inflamatorias
pueden concurrir con el embarazo y contribuir a incrementar el riesgo
trombótico. A su vez, factores específicos relacionados con el embarazo, como las técnicas de reproducción asistida, gestaciones múltiples,
retraso de crecimiento intrauterino, preeclampsia, cesárea urgente o
hemorragia posparto, se han descrito como factores de riesgo de ETV3.
Aparte de la historia personal de trombosis previa, la trombofilia es
el factor individual más importante para ETV en la gestación2,3. Aproximadamente la mitad de las ETV que ocurren en el embarazo y el
puerperio se asocian a trombofilia. El riesgo que confiere cada tipo de
trombofilia se ha evaluado recientemente en un metaanálisis de nueve
estudios7. Todas las trombofilias genéticas, excepto la metilén-tetrahidrofolato-reductasa (MTHFR) C677T homocigota se asociaron con
un incremento del riesgo de ETV en la gestación. De ellas, la que
se asoció a un mayor riesgo fue la presencia homocigota del factor
V Leiden, seguida del factor V Leiden heterocigoto y protrombina
G20210A heterocigota, el déficit de antitrombina y el de proteína C y
el déficit de proteína S7 (Tabla 1).
La heparina de bajo peso molecular (HBPM) es el tratamiento de
elección para la ETV en el embarazo. Debe mantenerse durante toda
la gestación y al menos seis semanas tras el parto, con una duración
mínima de seis meses de tratamiento. La HBPM parece ser segura y
eficaz en este contexto, tal como se desprende de un metaanálisis que
En aproximadamente la mitad de las mujeres en edad reproductiva que
presentan un primer episodio trombótico, este está relacionado con un
factor de riesgo hormonal. La enfermedad tromboembólica venosa
(ETV) relacionada con el embarazo ocurre en aproximadamente 1-2
de 1.000 gestaciones y es una de las causas más importantes de mortalidad materna en los países desarrollados con una mortalidad estimada
de 1,2 a 4,7 por 100.000 embarazos. A lo largo de la gestación el riesgo
de desarrollar trombosis es cinco veces mayor que en las mujeres en
edad fértil no gestantes1-3.
En el embarazo suceden una serie de cambios en el sistema de
la coagulación que forman parte de una adaptación fisiológica para
asegurar la formación de una correcta circulación uteroplacentaria y
el control de la hemorragia en el momento del parto. Estos cambios
comportan un estado de hipercoagulabilidad en el que la trombofilia
adquirida o genética parece tener un papel un papel en el desarrollo
de ETV durante el embarazo4,5.
Existe evidencia acumulada del papel de las alteraciones del flujo
placentario y cambios protrombóticos en los vasos placentarios en
las complicaciones vasculares gestacionales. Las trombofilias también se han relacionado con complicaciones vasculares placentarias
tales como abortos de repetición, preclampsia, retraso de crecimiento
intrauterino y desprendimiento prematuro de placenta5.
A continuación se revisan los mecanismos de hipercoagulabilidad
relacionados con la gestación y el papel que la trombofilia genética o
adquirida puede tener en el desarrollo de ETV, abortos de repetición
y otras complicaciones vasculares placentarias.
Hipercoagulabilidad y enfermedad tromboembólica
venosa en el embarazo
Tabla 1. Riesgo de trombosis en el embarazo en relación con
la presencia de trombofilia genética
Como resultado de los cambios hormonales en el embarazo se produce
una elevación de factores de coagulación como los factores VII, VIII,
X, von Willebrand y fibrinógeno. A su vez, la resistencia a la proteína
C activada se incrementa durante el segundo y tercer trimestre y se
produce una disminución de la actividad de la proteína S. Simultáneamente hay un incremento de los inhibidores de la fibrinólisis, como el
TAFI, el PAI-1 y el PAI-24. Se han demostrado cambios en la estructura de la malla de fibrina a lo largo de la gestación con respecto a
mujeres no gestantes, y estos cambios persisten como mínimo hasta
ocho semanas posparto6.
El incremento de la estasis sanguínea en las extremidades inferiores como consecuencia del incremento de presión del útero grávido
sobre el sistema vascular pélvico puede influir en el riesgo trombótico.
Tanto los cambios fisiológicos como los anatómicos tardan varias
semanas después del parto en volver a la normalidad, por lo que el
Alteración
OR (intervalo de confianza 95%)
Factor V Leiden homocigoto
34,4 (9,8-120,1)
Protrombina G20210A homocigota
26,4 (1,2-559,3)
Factor V Leiden heterocigoto
8,3 (5,4-12,7)
Protrombina G20210A heterocigota
6,8 (2,5-18,8)
Déficit de proteína C
4,8 (2,1-10,6)
Déficit de proteína S
3,2 (1,5-6,9)
Déficit de antitrombina
4,7 (1,30-16,9)
MTHFR C677T homocigota
0,7 (0,2-2,5)
MTHFR, metilén-tetrahidrofolato-reductasa
Modificada de Robertson et al.7
47
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
incluye casi 1.000 pacientes, no hallándose diferencias significativas
en cuanto a la incidencia de sangrado antenatal, sangrado tras el parto
o recurrencias de la ETV durante el embarazo8.
de los estudios caso-control mostró relación del factor V Leiden y
de los anticuerpos antifosfolípido con los fallos de implantación. Sin
embargo, en el subanálisis de los estudios de cohortes no se pudo
confirmar dicha asociación.
Hipercoagulabilidad y enfermedad tromboembólica
venosa en relación con las técnicas de reproducción
asistida
Hipercoagulabilidad y abortos de repetición
Aunque la etiopatogenia del aborto de repetición (AR) es heterogénea
y no atribuible a una sola causa, las alteraciones en el sistema hemostático parecen tener algún papel. Los factores genéticos o adquiridos
de trombofilia se han asociado con los abortos de repetición7. Los
mecanismos patogénicos que se han sugerido incluyen la formación de
trombos en los vasos placentarios en formación dando lugar a infartos
placentarios y la subsecuente insuficiencia uteroplacentaria.
Entre los factores adquiridos, es ampliamente aceptado que los
anticuerpos antifosfolípido son un factor de riesgo para AR así como
para pérdidas fetales de segundo y tercer trimestre15. Se estima que
un 20% de mujeres con AR tiene anticuerpos antifosfolípido. Los AR
pueden ser la única manifestación clínica en el síndrome antifosfolipídico (SAF), constituyendo un criterio diagnóstico por sí mismo. Entre
los criterios clínicos diagnósticos16 de SAF se encuentra la presencia
de tres o más abortos espontáneos consecutivos antes de la semana 10
de gestación, o una o más muertes fetales más allá de la semana 10 de
gestación. La muerte fetal parece ser más específica del SAF, donde
tiene un mayor riesgo de recurrencia17.
Se ha sugerido que los antecedentes de AR deben considerarse como
marcador de hipercoagulabilidad y de un estado protrombótico. En este
sentido, en nuestro grupo pudimos evidenciar en mujeres con anticuerpos antifosfolípido con historia de AR la existencia de un estado protrombótico con hipofibrinólisis en estado basal, fuera de la gestación18.
Asimismo, desde el punto de vista clínico, que entre las pacientes con
historia de AR la presencia de anticuerpos antifosfolípido era el principal
determinante para presentar eventos trombóticos posteriores. Entre las
mujeres con historia de AR, aquellas portadoras de anticuerpos antifosfolípido tenían cinco veces más riesgo de presentar trombosis en el
futuro que las pacientes con trombofilias genéticas19.
La relación de las trombofilias genéticas y los AR ha sido inconsistente. Entre los factores hereditarios que se han relacionado con
AR se incluyen los déficits de antitrombina, proteína C y proteína S,
así como, las más frecuentes, alteraciones genéticas factor V Leiden y
protrombina G20210A. También se ha sugerido que el estado portador
de trombofilia en el feto podría contribuir a las pérdidas fetales, atribuyéndose al estado de portador de factor V Leiden paterno un riesgo seis
veces superior de pérdida fetal recurrente20. En un estudio que incluyó
más de 1.000 pacientes21 no se halló relación del factor V Leiden con
los AR, resultado similar al hallado en otros estudios. Por el contrario,
Rey et al.22, en un metaanálisis de 31 estudios, hallaron relación de los
AR con el factor V Leiden, protrombina G20210A y déficit de proteína
S. Los resultados de otro metaanálisis más reciente7 que incluye más
de 7.000 pacientes apoyan la relación de las trombofilias hereditarias
con el AR. En este estudio, el factor V Leiden homocigoto, la protrombina G20210A heterocigota y los anticuerpos antifosfolípido se
asociaron de manera significativa con los abortos antes de la semana 24
de gestación. Las pérdidas fetales tardías se asociaron con el déficit de
proteína S, el factor V Leiden heterocigoto, la protrombina G20210A
heterocigota y los anticuerpos antifosfolípido. El polimorfismo de la
MTHFR C677T homocigoto no se asoció a AR.
Las técnicas de reproducción asistida han supuesto un avance significativo en el campo de la infertilidad. Sin embargo, como consecuencia de la inducción de la ovulación requerida se pueden presentar
complicaciones como el síndrome de hiperestimulación ovárica o el
tromboembolismo.
La estimulación ovárica controlada durante la fecundación in vitro
(FIV) causa incrementos muy importantes en los niveles de estradiol
que pueden influir en la hemostasia y en el desarrollo del síndrome
de hiperestimulación ovárica (SHO). Se ha descrito un estado protrombótico durante la FIV con incremento de factores procoagulantes,
incremento del potencial de generación de trombina y disminución
de la fibrinólisis9. Estos cambios se magnifican cuando se desarrolla
un SHO. El SHO es una complicación yatrogénica y potencialmente
mortal de las FIV que se observa hasta en un 33% de ciclos de forma
clínicamente moderada, pero que puede llegar a ser grave en el 3-8%
de ciclos. Las alteraciones de la hemostasia junto con la hemoconcentración contribuyen a un estado de hipercoagulabilidad con incremento
del riesgo de presentar trombosis10.
En cuanto a las características de las trombosis relacionadas con
técnicas de reproducción asistida, dos tercios afectan al territorio
venoso y un tercio son arteriales11. Globalmente el 40% se asocian
a trombofilia, aunque las trombosis arteriales se asocian con menor
frecuencia que las venosas. Las trombosis venosas relacionadas con
FIV se asocian a SHO en un 78%, el territorio más frecuentemente
afectado son las venas de cuello o extremidades superiores. Pueden
suceder tardíamente (entre 2 días y 11 semanas de la resolución del
SHO) y no suele haber mortalidad relacionada. Por el contrario, las
trombosis arteriales relacionadas con FIV se asocian prácticamente
todas a SHO, suceden tempranamente y de manera concurrente con
síntomas de SHO. La mayoría se manifiestan como ictus isquémicos
(60%) y se asocian a una mortalidad del 9%11.
El riesgo de ETV en las gestaciones conseguidas por FIV es mayor
que en aquellas espontáneas. La incidencia de trombosis en el primer trimestre en relación con FIV se ha estimado en un estudio en
el 0,2%10, representando globalmente un incremento de diez veces
en comparación con las gestaciones sin FIV. En las gestaciones por
FIV que se complicaron con SHO el riesgo de trombosis fue 100
veces superior, mientras que en ausencia de SHO fue de 5 veces10. Un
reciente estudio transversal12 que incluye más de 23.000 mujeres con
gestaciones tras FIV y 117.000 con gestaciones espontáneas confirma
un riesgo de 4 y 7 veces de trombosis venosa y de embolia pulmonar
respectivamente durante el primer trimestre de la gestación.
La relación de las trombofilias con los resultados de las FIV es
controvertida. En un estudio prospectivo de cohortes no se halló relación del factor V Leiden ni la mutación de la protrombina G20210A
con los fallos de implantación, el riesgo de desarrollar SHO o el riesgo
de trombosis en el embarazo en pacientes sometidas a FIV sin otros
factores de riesgo13. En un metaanálisis14 que incluyó más de 6.000
pacientes sometidas a técnicas de reproducción asistida el subanálisis
48
Ponencias
No se halló asociación con otros grupos de genes analizados. En otro
metaanálisis que evalúa el factor V Leiden y la protrombina G20210A
no se halla relación de dichas mutaciones con el riesgo de preeclampsia
ni de retraso de crecimiento intrauterino29.
En cuanto al SAF como trombofilia adquirida, su asociación con
patología maternofetal es más consistente que con las trombofilias
genéticas. De hecho, diversas manifestaciones de patología maternofetal se incluyen en los criterios clínicos de diagnóstico del síndrome
antifosfolípido16. El síndrome antifosfolípido se asocia a trombosis
venosa y arterial, y en la gestación puede asociarse a lesiones vasculares en la placenta que den lugar a una insuficiencia placentaria
con sus diversas manifestaciones clínicas. Se han sugerido diversos
mecanismos por los que los anticuerpos antifosfolípido podrían alterar
la función placentaria, tales como la interferencia con la anexina V, un
anticoagulante natural presente en los villi placentarios. Las complicaciones obstétricas más claramente asociadas al SAF son el retraso
de crecimiento intrauterino grave, la prematuridad, la preeclampsia
grave y las muertes fetales tardías, complicación que tiene un mayor
riesgo de recurrencia17. Se estima que hasta un 30% de las gestantes
con preeclampsia tienen anticuerpos antifosfolípido. Sin el tratamiento profiláctico adecuado, el porcentaje de embarazos a término en el
SAF se estima inferior al 20%, y, aun con tratamiento, la incidencia
de complicaciones como el retraso de crecimiento intrauterino, el desprendimiento de placenta normalmente inserta, la preeclampsia grave
y los partos pretérmino es superior al de la población sana23.
El tratamiento y profilaxis de las recurrencias de las complicaciones vasculares placentarias en gestaciones siguientes es objeto de debate. En un metaanálisis reciente30 se sugiere que la HBPM puede reducir
el riesgo de presentar nuevas complicaciones vasculares placentarias
en mujeres con antecedentes de haberlas presentado en anteriores gestaciones, aunque harán falta más estudios para confirmar dicho efecto.
El haber desarrollado una preeclampsia parece influir en la morbilidad
cardiovascular posterior, como sugieren estudios retrospectivos, en los que
se halla un mayor riesgo a largo plazo de hipertensión, muerte de causa
cardiovascular, síndrome metabólico y enfermedad cerebrovascular31.
Existe evidencia de que en pacientes con SAF y AR el tratamiento
con HBPM junto a dosis bajas de ácido acetilsalicílico (AAS) en la
gestación aumenta las probabilidades de éxito. No obstante, el estudio
observacional NOH-APS, que compara los resultados de gestaciones
en pacientes con SAF obstétrico tratadas con HBPM y AAS con los de
gestantes sanas, concluye que las pacientes con SAF y pérdidas fetales
previas, aun recibiendo tratamiento, tienen un mayor riesgo de presentar nuevas pérdidas fetales, preeclampsia, nacimientos prematuros
y otras complicaciones vasculares placentarias en las siguientes gestaciones23. No existen evidencias de que el tratamiento anticoagulante
mejore el pronóstico para AR en pacientes con trombofilias hereditarias o sin trombofilia24. Los resultados de ensayos clínicos controlados
que se están llevando a cabo en la actualidad, como el estudio ALIFE2,
que evalúa la eficacia de la HBPM en mujeres con AR y trombofilia
hereditaria, aportarán evidencia de calidad en este aspecto.
Hipercoagulabilidad y complicaciones vasculares
placentarias
La circulación uteroplacentaria se asemeja a la circulación venosa en
cuanto a su baja presión y baja velocidad y puede ser especialmente susceptible a presentar trombosis25. La placenta expresa y produce componentes de la coagulación que intervienen en el desarrollo
placentario. Los trofoblastos placentarios son procoagulantes por la
expresión de factor tisular y fosfatidilserina. Esta capacidad procoagulante está compensada por inhibidores como el TFPI, la trombomodulina, la anexina V e inhibidores de la fibrinólisis25.
El grado en que las trombofilias genéticas contribuyen al mal funcionamiento placentario y a los malos resultados obstétricos está en
discusión. En general los estudios publicados son de series pequeñas y
heterogéneas en cuanto a los criterios de inclusión utilizados. A pesar
de ello, diversas entidades en cuya patogenia intervienen las alteraciones vasculares placentarias se han relacionado con la presencia de
trombofilia. Entre ellas, la preeclampsia, el desprendimiento prematuro
de placenta y el retraso de crecimiento intrauterino.
La preeclampsia es una patología multisistémica caracterizada
por hipertensión y proteinuria que afecta a un 8% de gestaciones.
Alrededor de un 6% de estas pacientes desarrollan una forma grave de
preeclampsia que conlleva un aumento de la mortalidad materna y se
asocia a un riesgo de hasta un 16% de muerte perinatal26.
En la preeclampsia existe un estado de hipercoagulabilidad aumentado en comparación con las gestaciones que no presentan esta complicación26. En esta línea se han descrito alteraciones en las fibrinólisis persistentes en pacientes con antecedentes de preeclampsia grave,
indicando un estado de hipercoagulabilidad basal en estas pacientes27.
Las manifestaciones clínicas de la preclampsia se considera que son
secundarias a la hipoperfusión que resulta de la formación de microtrombos y el depósito de fibrina que afecta a múltiples órganos maternos y a
la placenta. La activación de la coagulación en la preeclampsia ocurre
ya en los estadios iniciales y a menudo antecede a las manifestaciones
clínicas. Se han descrito incrementos en los niveles de factor VIII y von
Willebrand, de los complejos trombina-antitrombina, del dímero D, de la
fibrina soluble y de la trombomodulina, así como resistencia a la proteína
C activada. En un reciente metaanálisis28 se evaluaron 50 genotipos en
5.049 casos y 16.989 controles. Se halló casi dos veces más riesgo de preclampsia grave en relación con el factor V Leiden, protrombina G20210A
y un polimorfismo en el gen del receptor de la leptina (LEPR rs1137100).
Consideraciones finales
Durante la gestación ocurren de manera fisiológica alteraciones del sistema hemostático que son procoagulantes. La concurrencia de factores
genéticos o adquiridos de trombofilia puede incrementar el riesgo de
presentar trombosis durante la gestación. Por otra parte, las técnicas de
reproducción asistida suponen una inducción hormonal de la ovulación
que supone un mayor riesgo de presentar complicaciones trombóticas.
Las complicaciones vasculares placentarias parecen compartir mecanismos fisiopatológicos que implican alteraciones isquémicas en la circulación uteroplacentaria. Los abortos de repetición y la preeclampsia se han
asociado de manera más consistente con el síndrome antifosfolipídico
aunque también se sugiere un posible papel de las trombofilias genéticas.
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50
Ponencias
Coagulopatías hemorrágicas: pasado, presente y futuro de la hemofilia
Coordinadores: Carmen Altisent Roca. Unidad de Hemofilia. Hospital Universitari Vall d’Hebron. Barcelona
Eduardo Tizzano Ferrari. Área de Genética Clínica y Molecular. Hospital Universitari Vall d’Hebron. Barcelona
En los años setenta, la disponibilidad de concentrados de factores de la coagulación permitió un mejor control de las hemorragias de
los pacientes hemofílicos; ello posibilitó administrar dosis terapéuticas con volúmenes muy reducidos comparados con el tratamiento
con plasma o crioprecipitados, además de permitir su administración por el propio paciente. La obtención de los concentrados a
partir de una mezcla de plasmas de un gran número de donantes fue la causa de que la mayoría de pacientes tratados antes de los
años 80 se infectaran con el virus de la hepatitis C y, después, con el virus de la inmunodeficiencia humana. La coinfección por
ambos virus precisa de un enfoque especial por el efecto nocivo de ambos virus entre sí. En la actualidad, la mayoría de los pacientes
han realizado tratamientos para la erradicación del virus C y siguen tratamiento con terapia antirretroviral de gran eficacia para el
control del virus de la inmunodeficiencia, con lo que se ha alcanzado una notable reducción del número de infecciones oportunistas
y de la mortalidad por el sida.
El Dr. Vicente Soriano, en su ponencia sobre la cuarta década postinfección, revisa los nuevos retos como son la búsqueda de
posibles terapias que permitan la erradicación del virus y el control de la comorbilidad asociada al largo periodo de tratamiento
antirretroviral.
La profilaxis es un tratamiento ampliamente aceptado para los niños con hemofilia grave. El Dr. Ramiro Núñez revisará los efectos
beneficiosos de la profilaxis con especial atención a los puntos más controvertidos: a quién indicarla, cuándo iniciarla y con qué dosis.
El inicio de la profilaxis en edades muy tempranas en ocasiones se ve dificultado por la disponibilidad de accesos venosos.
Disponer de factores que incrementen la vida media al fusionar el FVIII o FIX con diferentes moléculas abre unas nuevas perspectivas terapéuticas en un futuro muy cercano. El Dr. Víctor Jiménez-Yuste revisa en profundidad los estudios en curso, así como la
investigación de nuevas moléculas.
A partir de la caracterización de los genes involucrados en la hemofilia A y B a mediados de los años ochenta, ha habido un
notable progreso en los conocimientos de las alteraciones moleculares responsables de esta enfermedad. El Dr. Eduardo Tizzano
efectúa una puesta al día de estos avances y analiza cuáles son las perspectivas futuras para conciliar el rápido e incesante avance
de la tecnología con los criterios clínicos tradicionales y la efectividad de los fármacos disponibles, sin olvidar los resultados de la
terapia génica en la hemofilia B, primer eslabón de una potencial curación.
51
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
La infección por el VIH en su cuarta década
Vicente Soriano Vázquez
Hospital Universitario La Paz. Madrid
Resumen
Nuevo perfil de la infección por VIH
La irrupción del sida en los ochenta supuso un revulsivo sin precedentes para las enfermedades infecciosas, erróneamente consideradas
en remisión gracias al descubrimiento de antimicrobianos y vacunas.
Se tardó más de una década en convertir la infección por el virus
de la inmunodeficiencia adquirida (VIH) en una enfermedad crónica, mediante la prescripción de combinaciones de antirretrovirales.
Sin embargo, por el momento no hay posibilidad de erradicación del
VIH de los portadores. La obtención de una vacuna preventiva no está
en el horizonte próximo. Los 35 millones de personas infectadas por
VIH en el mundo se enfrentan ahora a nuevos procesos médicos, la
mayoría derivados de una exposición prolongada a los antivirales y
al envejecimiento. En la actualidad, las complicaciones metabólicas
(diabetes), el elevado riesgo cardiovascular, los cánceres, la disfunción renal, hepática y ósea, así como los trastornos neurocognitivos y
psiquiátricos, constituyen un amplio repertorio de patologías que han
reemplazado a las infecciones y neoplasias oportunistas como causa
de enfermedad en los pacientes VIH positivos.
El control sostenido y máximo de la replicación viral con la medicación antirretroviral no permite erradicar la infección por VIH, de modo
que persisten una activación inmune y un estado proinflamatorio que,
en última instancia, ocasionan un recambio celular aumentado en el
organismo, con envejecimiento precoz.
Las complicaciones médicas en las personas infectadas por el VIH
que tienen suprimida la replicación viral forman un amplio abanico de
procesos (Tabla 1) y su mayor frecuencia se explica en gran parte por
la exposición prolongada a los antivirales y el envejecimiento acelerado
del que hemos hablado.
El estudio D:A:D ha demostrado que en el mundo desarrollado
las infecciones y neoplasias oportunistas que definían el sida hasta
la irrupción de la terapia triple en 1996 han sido reemplazadas como
causa de enfermedad por cánceres no-sida (pulmón, cuello y cabeza,
linfoma de Hodgkin), procesos cardiovasculares (infarto de miocardio,
accidentes vasculares cerebrales) y enfermedad hepática (Figura 1).
Introducción
Tabla 1. Rising complications in controlled HIV infection
• Non-AIDS cancers (lung, head & neck, Hodgkin)
La OMS estima que más de 35 millones de personas en el mundo viven
infectadas por el VIH, más del 75% en países en desarrollo. A pesar
de conocerse bien los mecanismos de prevención, cada año continúan
ocurriendo más de 2 millones de nuevas infecciones.
La eficacia del tratamiento antirretroviral ha permitido reducir
drásticamente tanto las complicaciones oportunistas como la mortalidad asociada al sida. Además, la supresión de la replicación viral con
antirretrovirales es muy eficaz para evitar el contagio, tanto por vía
sexual como perinatal.
En la medida en que los diferentes fármacos antirretrovirales han
mejorado el perfil de efectos secundarios y se ha reducido su precio
(incluyendo la disponibilidad de genéricos), la indicación de tratamiento ha pasado a ser cada vez más amplia, sin limitarse a los pacientes
con una cifra reducida de linfocitos T CD4+. En la actualidad se tratan
casi todos los pacientes con infección por VIH, siendo la única excepción los progresores lentos y los “elite controlers”.
• Metabolic disease (diabetes)
• Cardiovascular disease (heart, stroke)
• Liver disease (hep C, OH, drugs)
• Neuropsychiatric complications (neurocognitive dysfunction, psychiatric)
• Kidney disease (HCV, TDF)
• Bone disease (demineralization, avascular necrosis)
Rising complications in controlled HIV infection
Causes of death in HIV (DAD study)
34%
16%
14%
Tratamiento antirretroviral
9%
En el momento actual las coformulaciones de inhibidores de la transcriptasa reversa, que incluyen dos análogos de nucleósidos (tenofovir/
emtricitabina o abacavir/lamivudina) y un no nucleósido (efavirenz o
rilpivirina) o un inhibidor de la integrasa (elvitegravir/cobicistat o dolutegravir) son los más utilizados. Tienen un perfil favorable de efectos
secundarios y se administran como un comprimido una vez al día.
Period 1999-2000
Mortality
17.5
(Pt-1000y)
Figura 1.
52
AIDS
IDS
Non-A
rs
cance
Liver
CVD
23%
22%
10%
8%
2009-2011
9.1
Lancet 2014;384:241-48
Ponencias
Por todo ello, el próximo y definitivo escalón en la lucha frente
al sida pasa por el desarrollo de estrategias erradicativas. Los conocimientos actuales y algunos casos anecdóticos de curación hacen prever
que estas probablemente serán el resultado de la combinación sinérgica
de antivirales e inmunoterapia.
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53
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Profilaxis primaria: ¿a quién, cuándo y cómo?
Ramiro Núñez, Rosario Pérez
Unidad de Hemofilia. Hospitales Universitarios Virgen del Rocío/Virgen Macarena. Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS). Sevilla
Introducción
con 4,9 para el grupo a demanda10. En el estudio ESPRIT se comparó la
eficacia de la profilaxis con el tratamiento a demanda para prevenir los
hemartros y la afectación radiológica articular en 45 niños con hemofilia grave de edades comprendidas entre 1 y 7 años. Los pacientes en
profilaxis presentaron menos hemartros (0,20 vs 0,52 por paciente y
mes, p<0,02) y signos radiológicos de artropatía (29% vs 74%, p<0,05),
mostrándose la profilaxis más efectiva cuando se iniciaba de forma
temprana, antes de los 36 meses de vida11.
Existe, por tanto, un consenso en relación a la superioridad de la
profilaxis como la modalidad de tratamiento para pacientes con hemofilia grave para prevenir hemorragias, preservar el estatus articular y
garantizar la mejor calidad de vida posible12,13.
Aunque la mayoría de los datos relativos a la profilaxis primaria
proceden de estudios en pacientes con hemofilia A y que, por tanto,
no pueden hacerse afirmaciones definitivas para niños con hemofilia
B, estas recomendaciones son generalmente extensibles y aplicadas
en ambos tipos de hemofilia.
La profilaxis es la modalidad de tratamiento recomendada para pacientes con hemofilia A grave. Se entiende como profilaxis el tratamiento
sustitutivo continuado de larga duración, consistente en la administración intravenosa regular de concentrados del factor deficitario, con
el objetivo de prevenir la aparición de hemorragias espontáneas y el
desarrollo de la artropatía hemofílica1.
Entre las experiencias pioneras que avalan su empleo encontramos
las llevadas a cabo desde los años cincuenta y sesenta primero en Suecia y después en Holanda, en las que ya se indicaba la conveniencia de
elevar la actividad de factor en hemofilia grave por encima del 1%2,3.
Posteriormente se han documentado muchos intentos de prevención de episodios hemorrágicos, la mayoría en estudios de corta duración y cohortes pequeñas, junto con otros estudio controlados y doble
ciego en los que los resultados indicaban que la profilaxis era superior
al tratamiento a demanda, más aún en los regímenes que utilizaban una
mayor frecuencia de dosis4,5.
En 1992 se publicó el primer y más amplio estudio sobre profilaxis
y su influencia en el estado articular de los pacientes hemofílicos6.
Nilsson et al. analizaron el seguimiento de 60 pacientes durante 25
años y concluyeron que la profilaxis precoz podía prevenir la patología articular. Estos resultados fueron confirmados en un gran estudio
internacional posterior7. En otro estudio que comparaba cohortes de
dos países, Suecia con pacientes en profilaxis y Noruega con pacientes
a demanda, los primeros necesitaron cuatro veces menos cirugías ortopédicas aunque con un consumo superior de concentrados de factor8.
Tanto la OMS como la WFH recomendaron la profilaxis como
tratamiento de primera elección desde 19949.
A pesar de la aceptación generalizada de la profilaxis como modalidad de tratamiento de elección en pacientes con hemofilia grave
varias interrogantes pueden presentarse sobre su forma de aplicación.
¿Cuándo?
Varios estudios han demostrado que la profilaxis debe comenzar de
forma precoz, antes del inicio de una artropatía. Ya en la experiencia sueca se describe cómo los pacientes adultos (24-32 años) en el
momento de la evaluación que habían iniciado la profilaxis entre los 3
y los 13 años de edad con un régimen de dosis bajas y un intervalo de
administración de entre 3 y 5 días, presentaron entre 1,5 y 16 eventos
articulares por año. Los resultados fueron similares en pacientes de
13-17 años que empezaron la profilaxis entre 1 y 4,5 años con un
régimen más intensivo. Únicamente la cohorte de niños de 3-12 años
que iniciaron la profilaxis antes de los 2 años con un régimen intensivo
(25-40 IU/kg de peso tres veces/semana) no presentaron hemartros y
tampoco signos de artropatía6. Otros estudios también han confirmado
la ausencia de artropatía en pacientes que iniciaron la profilaxis antes
de los 2 años o después del primer hemartros14.
A partir de estas experiencias diversos grupos de expertos han propuesto definiciones sobre profilaxis que recogen el momento idóneo
para su inicio, generalmente vinculado a la edad o a la aparición del
primer hemartros. El grupo PEDNET (European Pediatric Network
for Haemophilia) definió el concepto de profilaxis según los siguientes
criterios15:
¿A quién?
En los últimos años varios estudios clínicos prospectivos han aportado
evidencia científica sobre la capacidad de la profilaxis para reducir la
afectación articular y otros eventos hemorrágicos. En el trabajo de Manco-Johnson, 65 niños con hemofilia A grave menores de 30 meses de
edad fueron asignados aleatoriamente a recibir profilaxis con concentrados de FVIII a 25 UI/kg 3 días por semana o tratamiento a demanda
de episodios hemorrágicos con 40 UI/kg y dos dosis subsecuentes de 20
UI/kg a las 24 y 72 horas. Los pacientes del grupo en profilaxis consumieron durante el mismo periodo tres veces más FVIII en comparación
con los pacientes en tratamiento a demanda, pero con un promedio de
1,2 sangrados/año versus 17,1. Respecto a los episodios articulares el
grupo en profilaxis registró una media de 0,6 episodios/año comparado
• Profilaxis primaria A: tratamiento continuo regular iniciado después del primer hemartros y antes de la edad de 2 años.
• Profilaxis primaria B: tratamiento continuo regular iniciado
antes de los 2 años de edad y sin sangrado articular previo.
• Profilaxis secundaria A: tratamiento continuo regular iniciado
después de 2 o más hemartros o a una edad mayor de 2 años.
54
Ponencias
necesidad de accesos venosos centrales, además de ajustar el consumo
de forma que en los pasos 1 y 2 el consumo de factor es similar al de
los regímenes de dosis intermedias, mientras que en el paso 3 el consumo es equiparable al esquema sueco de altas dosis. Con una media
de 10 años de seguimiento, el 9% de los pacientes de 15 años sigue
recibiendo una sola dosis de factor a la semana21. Sin embrago, a los
8,8 años de media la resonancia de tobillos, rodillas y codos mostró
que el 50% de los pacientes tenía evidencia de lesión ósea subcondral y
pérdida de cartílago y en todos los casos las lesiones osteocondrales se
produjeron en articulaciones que habían presentado sangrado durante
el periodo de estudio22.
Es poco probable que un esquema único sea el apropiado para
todos los pacientes. Collins et al. proponen que cada hemofílico debería tener un régimen “personalizado” según un acuerdo entre él o su
familia y el centro de tratamiento, teniendo presentes el acceso venoso,
el patrón de sangrado y el nivel de actividad física. El nivel de factor
a mantener durante la profilaxis es objeto de debate ya que sabemos
que pacientes con dosificaciones por encima del 1% van a presentar
episodios hemorrágicos mientras otros no tendrán este tipo de complicaciones, incluso con niveles de factor indetectables.
Como ya se ha comentado es una práctica habitual infundir el factor lunes, miércoles y viernes en hemofilia A, y dos veces por semana
en hemofilia B. Administrar una dosis mayor los viernes e incluso una
dosis extra durante el fin de semana si se prevé una actividad física más
intensa va a reducir los periodos “valle” y con ello el potencial riesgo de sangrado. Los estudios farmacocinéticos contribuyen a diseñar
estrategias de profilaxis individualizada, que no debería considerarse
fija sino modificable en función de los cambios inevitables de las circunstancias personales23.
La vida media del FVIII es aproximadamente de 8-16 horas, aunque puede variar hasta dos veces en pacientes con hemofilia grave.
Pacientes con menor vida media pueden requerir dosis más frecuentes
para prevenir hemorragias. Por el contrario, los cambios fisiológicos
propios de la edad, que aumentan la vida media del FVIII, pueden
permitir una reducción del régimen profiláctico en niños mayores y
adultos24.
En cualquier caso, la profilaxis se administrará preferentemente
por la mañana con el objetivo de cubrir los periodos de mayor actividad, y siempre será recomendable antes de participar en actividades
que supongan un riesgo de lesión aumentado. Aunque la vía periférica
será de elección, los accesos venosos centrales son con frecuencia
necesarios especialmente en niños de corta edad con un acceso venoso difícil. En estos casos serán preferibles los catéteres totalmente
implantables tipo Port-a-Cath por su menor tasa de complicaciones
trombóticas e infecciosas25. También se ha utilizado la opción de una
fístula arteriovenosa como posibilidad en pacientes con acceso difícil26.
Una vez iniciada la profilaxis primaria el estudio de inhibidor debe
investigarse cada 5 exposiciones hasta la número 20; posteriormente,
entre la 21 y 50 exposiciones se recomienda hacerlo cada 10 infusiones
y al menos dos veces al año hasta la 150 exposición12.
Hay gran interés en los nuevos concentrados de FVIII/FIX de vida
media prolongada y su potencial para modificar las pautas actuales de
profilaxis al aumentar los intervalos entre infusiones. Por otro lado,
se puede especular si los niveles bajos de factor durante más tiempo
(incluidos los periodos diurnos) supondrán un mayor riesgo de hemorragias subclínicas y de daño articular secundario, comparado con el
mayor número de administraciones y niveles pico de la profilaxis con-
• Profilaxis secundaria B: tratamiento regular intermitente debido
a frecuentes sangrados.
En base a que el daño articular puede ocurrir después de muy
pocos sangrados o incluso secundariamente a episodios subclínicos,
algunos autores consideran apropiado definir la profilaxis primaria
como la infusión de concentrados de factor que se inicia antes de la
existencia de daño articular y con la intención de administrarla de
forma regular durante 45 semanas al año como mínimo16.
Recientemente Valentino ha definido la profilaxis primaria como
el tratamiento continuo regular iniciado antes de la edad de 3 años y
del segundo evento hemorrágico articular clínicamente evidente en una
gran articulación, en ausencia de alteración osteocondral documentada
por el examen físico o estudios radiológicos de imagen17.
Si la profilaxis debería iniciarse antes del primer hemartros, generalmente en torno a los 2 años de edad, o un poco después continúa
siendo objeto de debate. En todo caso, está claramente establecida la
importancia de no retrasar el inicio del tratamiento después de unos
pocos eventos articulares, especialmente después del primero.
¿Cómo?
La profilaxis en pacientes con hemofilia se ha aplicado siguiendo
diversos esquemas. Entre ellos, encontramos el modelo sueco de
“dosis altas”, en el que se administra FVIII o FIX a 25-40 UI/kg de
peso en días alternos, con un mínimo de tres veces a la semana para
hemofilia A y dos veces a la semana en casos de hemofilia B, iniciada
generalmente antes de los 2 años de edad o en el momento del primer
hemartros si se produce antes de los 2 años. El objetivo es alcanzar
concentraciones de factor superiores al 1% de forma continua para
evitar hemorragias intercurrentes18.
En el conocido como modelo holandés de “dosis intermedias”
las dosis administradas son de 15-25 UI/kg de FVIII 2-3 veces por
semana en hemofilia A y 30-50 UI/kg de FIX 1-2 veces por semana en
hemofilia B. La intensidad de la profilaxis se ajusta según los eventos
hemorrágicos espontáneos y no solo por el peso corporal19.
Se ha realizado la comparación entre ambos regímenes profilácticos empleados en Suecia y Holanda entre 1970 y 1990, con las limitaciones de un estudio observacional retrospectivo20. Cuarenta y dos
pacientes con dosis altas fueron comparados con 86 pacientes con
dosis intermedias. De forma global la profilaxis se inició antes en
la cohorte sueca de dosis altas (2 años vs 5 años). Los pacientes que
recibieron dosis altas presentaron 0,2 sangrados articulares anuales
comparados con los 3,7 en los pacientes adscritos a las dosis intermedias. En este grupo también se constató una mayor proporción de
pacientes sin sangrados y con una puntuación cero en la escala radiológica de Petterson18.
Como alternativa a estos regímenes de dosis completas, el estudio
canadiense “Hemophilia-Dose-Escalation Prophylaxis Trial” persigue
ofrecer a los niños hemofílicos una profilaxis con un ajuste individual del intervalo de infusión en función de la frecuencia de episodios
hemorrágicos. En un primer paso los pacientes inician la profilaxis
con una dosis de 50 UI/kg de FVIII semanal. En un segundo paso los
pacientes que han presentado sangrados articulares aumentan a 30
UI/kg dos veces a la semana y en un tercer paso a 25 UI/kg cada 48
horas si continúa la sintomatología. Esta estrategia permite al niño y a
los padres familiarizarse con las inyecciones intravenosas y reducir la
55
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
vencional. Probablemente los datos farmacocinéticos tendrán un papel
más preponderante con estos nuevos concentrados.
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Conclusiones
En resumen, el efecto beneficioso de la profilaxis primaria en niños
con hemofilia grave no puede ser cuestionado y debería iniciarse precozmente y siempre antes del desarrollo de una artropatía. Los ensayos
clínicos aleatorizados de la última década han venido a contestar las
dudas sembradas por la revisión Cochrane de 200627. Desde el punto
de vista económico la profilaxis primaria supone un alto coste, que
estaría justificado en función de los beneficios en salud al evitar morbilidades a medio y largo plazo en la población hemofílica. Algunos
análisis han mostrado que la profilaxis es una estrategia coste-efectiva
comparada con el tratamiento a demanda28. Los esquemas basados en
el ajuste de dosis según el peso junto con variables personales y datos
farmacocinéticos que permitan una individualización de la profilaxis
son recomendables para optimizar el tratamiento y conseguir el objetivo perseguido de prevenir la aparición de episodios hemorrágicos y
preservar el estatus articular de los pacientes con hemofilia.
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56
Ponencias
Nuevas moléculas para el tratamiento sustitutivo de las coagulopatías hemorrágicas
Víctor Jiménez Yuste, María Teresa Álvarez, Mónica Martín Salces, Isabel Rivas, Ihosvany Fernández Bello, Nora Butta
Unidad de Hemostasia. Servicio de Hematología y Hemoterapia. Hospital Universitario La Paz. Madrid
Introducción
hidrofílicas del polietilenglicol (PEG) incrementando el tamaño de la
nueva proteína conjugada y evitando así la filtración a nivel glomerular. En el caso del FVIII esto no suponía un gran avance dado que la
molécula en sí es lo suficientemente grande para no ser filtrada por el
riñón. Las ventajas que se buscaban se basaban en la disminución de su
interacción con los receptores de aclaramiento celular a nivel hepático
a través de una serie de proteínas relacionadas con el receptor de las
lipoproteínas de baja densidad y proteoglicanos heparán-sulfato, entre
otros receptores4. Sin embargo, estas modificaciones podrían tener
como desventaja que el FVIII pudiera interferir de manera negativa
con otras proteínas fundamentales para ejercer su acción como el factor
von Willebrand (FVW), la trombina o el factor IX activado (FIXa)5.
Una de las primeras experiencias en la utilización de nuevas formulaciones de FVIII fue la pegilación de liposomas, pero no de la
molécula del FVIII, la cual se reconstituía unida de forma no covalente
en el liposoma6. Se presuponía que los liposomas, dada su composición
lipídica, podrían aumentar la fijación del FVIII asociado en las membranas de plaquetas y por consecuencia incrementar la respuesta del
FVIII de forma local y así incrementar su vida media plasmática. Sin
embargo, ni la vida media ni la eficacia se incrementó con esta nueva
formulación del FVIII, finalizándose los ensayos clínicos dirigidos a
explorar esta nueva alternativa.
El tratamiento de la hemofilia tal y como es hoy abordado comienza en
los años setenta con la disponibilidad de los concentrados plasmáticos
de la coagulación (Figura 1). El uso generalizado del autotratamiento
domiciliario propició un control más precoz de las hemorragias y la
instauración de esquemas de profilaxis con la consiguiente disminución de las complicaciones musculoesqueléticas. En los últimos 20
años la seguridad de los concentrados de factores de la coagulación
ha sido mejorada, sin embargo sigue existiendo una alta incidencia de
aparición de inhibidores, constituyendo la complicación más importante del tratamiento de la hemofilia. Otra gran limitación del tratamiento
actual de la hemofilia es el elevado número de infusiones de factor
necesarias en los esquemas de profilaxis, que pueden variar de 156 a
182 en la hemofilia A (3 a 3,5 infusiones semanales) a 104 infusiones
de factor IX en la hemofilia B (2 infusiones semanales)1. Este artículo
resume las tendencias actuales y futuras en el tratamiento de la hemofilia, con especial interés en lo que se ha denominado bioingeniería de
los concentrados de factores de la coagulación2.
Bioingeniería de los concentrados de la coagulación
para prolongar la vida media
Pegilación
Quizá fuera sorprendente que modificaciones en la estructura de los
concentrados de la coagulación no hubieran sido desarrolladas hace
tiempo dada su implantación en otros campos de la terapéutica3. Sin
embargo, las ventajas que podrían ofrecer estas técnicas como la pegilación era la de incorporar moléculas de agua dentro de las estructuras
Las moléculas de polietilenglicol (PEG) son estructuras hidrofílicas
lineares polieterdiol HO-(CH2CH2O)n-H de varios pesos moleculares3. Se unen a los residuos de lisina expuestos en la superficies de la
moléculas (pegilación aleatoria o random) o través de un sitio de unión
específico a residuos de cisteína libres o a través de ingeniería proteica
(pegilación dirigida). Esta unión incrementa el tamaño de la proteína
y su forma disminuyendo su filtración glomerular, degradación proteolítica y aclaramiento por diferentes receptores proteicos. La combinación de estos efectos conduce a un incremento de la vida media de
las proteínas unidas a PEG. La eliminación del PEG del organismo se
produce por una combinación de excreción renal y hepática, aunque
en animales se ha detectado vacuolización tubular a nivel renal debido
a la acumulación de PEG en los riñones. La relación de los productos
pegilados en los diferentes estudios se muestra en la Tabla 1 junto con
los resultados de otras tecnologías.
FVIII recombinante (FVIIIr)
NovoNordisk ha desarrollado un FVIIIr pegilado (N8-GP) donde una
molécula de 40 kDa de PEG se une de forma específica a una secuencia
de 21 aminoácidos del dominio B. Durante la activación por la trombina el dominio B es escindido y permite la formación de FVIIIa. Los
Figura 1. Evolución en la manufacturación de los concentrados de factores
de la cogulación.
57
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Proteínas de fusión
diferentes estudios han demostrado una vida media del N8-GP de 19
horas (rango 11,6-27,3 horas), lo que supone una prolongación de la
vida media de 1,6 superior a los productos utilizados previamente por
los pacientes en el estudio7.
Bayer ha creado un FVIIIr pegilado (BAY 94-9027) usando una
mutagénesis dirigida. Se modifica un FVIII con el dominio B delecionado a través de la introducción de un residuo de cisteína en el
aminoácido 1804 específicamente conjugado con una molécula de 60
kDa de PEG. En los estudios clínicos con BAY 94-9027 se observó una
recuperación equivalente y una mejora en el patrón farmacocinético en
comparación con FVIIIr-Fs, con una vida media de aproximadamente
19 horas (frente a 13,0 horas del FVIIIr-Fs)8.
Baxter es la única compañía que está trabajando con una molécula
completa de FVIIIr (BAX855) a la que se unen dos moléculas de 20
kDa a las lisinas expuestas en la superficie del FVIIIr (pegilación aleatoria). Los datos de los ensayos clínicos aún no han sido publicados.
Los resultados preclínicos en varios modelos animales han demostrado
una prolongación de la vida media de entre 1,5-2 veces comparado
con el rFVIII9.
Unión a la fracción constante de la IgG1
Otra de las estrategias utilizadas para incrementar la vida media de
los concentrados es la unión covalente a proteínas que tengan mayor
vida media. Actualmente las que han tenido mayor éxito es la fusión
a la fracción constante (Fc) de la IgG1, que tiene una vida media de
aproximadamente 3 semanas, y a la albúmina, cuya vida media es
de aproximadamente 20 días5. El incremento en la vida media de la
proteína de fusión FC es el resultado de su interacción con el receptor
Fc neonatal (FcRn), que se encuentra en diferentes tipos de células
(endoteliales, macrófagos, monocitos, etc.), y un menor aclaramiento
a nivel renal tras la creación de una molécula mucho mayor. Todas
las proteínas, incluidas las de fusión Fc, son internalizadas dentro de
las células endoteliales por pinocitosis, formándose un endosoma.
Durante este proceso el endosoma es acidificado para favorecer la
unión de la proteína de fusión FC al receptor FcRn y continuar su
ciclo hacia la superficie celular. La proteína de fusión Fc es liberada
a la circulación bajo condiciones de pH neutro. De este modo, las
proteínas de fusión escapan de la degradación de los lisosomas. Este
mecanismo es el que podría explicar la mayor vida media de la IgG
frente a otros isotipos de inmunoglobulinas13. Fármacos en el mercado como el etanercept o romiplostim son ejemplos de proteínas
de fusión Fc efectivas.
La tecnología de fusión a Fc ha sido liderada por Biogen Idec. El
FVIIIr unido a la fracción constante de Fc, rFVIIIFc, ha sido comercializado recientemente en Estados Unidos, y los datos de los estudios
fase III han demostrado una vida media de 19,0 horas, lo que supone
un aumento de 1,5 veces respecto al FVIIIr (12,4; p=0,001). La mediana de las tasas de sangrado anualizadas (ABR) en los pacientes en la
rama 1 de profilaxis (profilaxis individualizada: 25-65 UI/kg cada 3-5
días) fue de 1,6 frente a 3,6 de la rama 2 (profilaxis semanal 65 UI/kg)
y muy inferior a los 33,6 en la rama 3 de tratamiento a demanda. Al
final del estudio se encontraban 29 pacientes en profilaxis cada 3 días
con un ABR (de los 3 últimos meses) de 0,0, 23 pacientes 2 veces a la
semana con ABR 0,0, cada 4 días 4 pacientes con 2,0 ABR y cada 5
días de administración de FVIIIrFc con ABR 2,014.
FIX recombinante (FIXr)
El FIX es una molécula más pequeña y menos compleja que el FVIII,
con aproximadamente una vida media dos veces superior al FVIII10. A
pesar de ello, la vida media sigue siendo insuficiente. Dada su menor
complejidad los esfuerzos por prolongar su vida media se encuentren
en fases más avanzadas en relación con el FVIII.
N9-GP es un FIXr de Novo Nordisk en el cual una molécula
de PEG de 40 kDa es fijada al péptido de activación mediante una
glicopegilación directa. Cuando el N9-GP es activado por el FXIa,
el péptido de activación es escindido dejando la forma completa de
la molécula de FIXa11. Los estudios clínicos han demostrado un vida
media de 93 horas, lo que supone que es hasta cinco veces superior
al producto previo de los pacientes. Pero no solo se prolonga la vida
media sino que de los datos publicados de N9-GP se aprecia una
recuperación tras la infusión del factor superior al 94% comparado
con los productos recombinantes y de un 20% comparado con los
plasmáticos12.
Tabla 1. Concentrados de FVIII y FIX con vida media alargada en desarrollo
MOLÉCULA
TECNOLOGÍA APLICADA
ESTUDIOS PRECLÍNICOS
ESTUDIOS CLÍNICOS
N8-GP
Pegilación dirigida en la porción residual del dominio B. PEG:
40 kDa
Incremento 2 veces la vida
media
Fase I: 19 h de vida media (1,6 veces)
BAX855
Pegilación aleatoria a las móleculas de superficie de lisina.
PEG: 20 kDa
1,5 a 2 veces la vida media
En desarrollo
BAY 94-9027
Pegilación dirigida a cisteína 1804 (mutagénesis). PEG: 60 kDa
1,8 veces la vida media
Fase I: 19 h de vida media (1,5 veces)
rFVIII-Fc
Fusión a IgG1
2 veces la vida media
Fase I y III: 19 h de vida media (1,5 a 1,7 veces)
N9-GP
Pegilación dirigida en el péptido de activación. PEG: 40 kDa
7-11 veces la vida media
Fase I: 93 h de vida media (5 veces)
rFIX-Fc
Fusión a IgG1
2,7 a 6 veces la vida media
Fase I y III: 82 h de vida media (2,5 veces)
CSL 654/rFIX-FP
Fusión a albúmina
1,2 a 4,7 veces la vida media
Fase I: 5 veces la vida media
FVIII
FIX
58
Ponencias
las alternativas. Dos ejemplos son el anticuerpo ACE910 desarrollado
por Chugai, que tiene una doble especificidad frente al FIXa y FX y
que desempeña la misma función de cofactor del FVIII consiguiendo
in vivo la hemostasia19, o el anticuerpo monoclonal 2021, desarrollado
por Novonordisk, que bloquea la interacción entre FXa y TPFI, limitando las acciones inhibitorias del TFPI sobre el FXa y promoviendo
la formación de la hemostasia20.
Alnylam Pharmaceuticals ha desarrollado un ARN capaz de interferir en la síntesis de antitrombina (AT) silenciando su producción por
los hepatocitos. Este ALN-AT3 ha demostrado en modelos animales
ser capaz de disminuir la producción de AT de manera dosis-dependiente hasta en un 90%2.
En desarrollo se encuentran diferentes moléculas como una proteína
de fusión del rFVIIa-Fc-TF, otro FVIIa fusionado a albúmina, rFVIIa-FP,
un FVW recombinante unido a albúmina y un rFVIIa y FIX de vida
media prolongada mediante una proteína de fusión denominada CTP
que consiste en la unión de la hCG a las proteínas de la coagulación2.
Finalmente cabe destacar otros productos innovadores recientemente
introducidos en el mercado o en fases muy avanzadas de desarrollo, como
la subunidad A del FXIII recombinante de Novo Nordisk, el rFVIII de
origen humano de Octapharma, el rFIX de Baxter, el rFVIII (N8) de
Novo Nordisk, el rFVW de Baxter y el factor VIII porcino de Baxter2.
En relación al rFIXFc aún no está comercializado pero se espera
su introducción en el mercado en la segunda mitad del año 2014. De
los estudios clínicos se observa que la vida media es de 82,1 horas. La
mediana de ABR en el brazo 1 del estudio (dosis semanal, profilaxis
ajustada iniciando en 50 UI/kg) fue de 3,0, en grupo 2 (ajustada por
tiempo, 100 UI/kg cada 10 días inicialmente) fue de 1,4 y finalmente
en brazo 3 de tratamiento a la demanda fue de 17,715.
Unión a la albúmina
Otra aproximación en la creación de proteínas de fusión es la unión covalente de los factores de la coagulación a la albúmina. La tecnología de
unión a albúmina está liderada por CSL Behring y se ha realizado en el
rFVIIa (rFVIIa-FP) y el rFIX (rFIX-FP)16. La unión recombinante de la
albúmina al FIX se obtiene mediante una zona de unión que contiene una
secuencia escindible idéntica a la región de activación del FIX. Tras la
activación de la proteína de fusión, la albúmina y el péptido de unión son
escindidos formando una molécula activa de FIX (Figura 2). De los estudios farmacocinéticos fase I se puede concluir que el rFIX-FP (CSL654)
tiene un incremento de 5 veces la vida media y un 44% de recuperación
mayor que el rFIX. Los niveles valle se mantenían por encima del 5%
tras 7 días cuando se administraba 25 UI/kg y tras 14 días cuando se
administraba a 50 UI/kg, sugiriendo la posibilidad de administraciones
semanales o cada 2 semanas para mantener una profilaxis óptima17.
Consideraciones finales
Modificaciones en la secuencia proteica
El FVIII libre en el torrente circulatorio tiene apenas una vida media
de una hora comparado con las 12 horas cuando se une al factor von
Willebrand (FVW). El FVIII circula en la sangre en forma de heterodímero compuesto por una cadena pesada y otra ligera unidas por
una unión lábil. CSL Behring ha diseñado un FVIII con ausencia del
dominio B con una unión covalente entre ambas cadenas que hace que
circule como una sola cadena (single-chain FVIII, rFVIII-SC). Esta
modificación hace que el FVIII aumente significativamente su unión
al FVW incrementándose su vida media en 1,5 veces en relación con
el rFVIII. Los estudios iniciales han observado un incremento en diferentes especies animales entre 1,6 a 2 en la vida media del rFVIII-SC
en relación al rFVIII18.
En los últimos años se ha producido un importante avance en el tratamiento de las coagulopatías congénitas. El desarrollo de productos de
origen plasmático más seguros y la introducción de concentrados de origen recombinante han sido decisivos en la implementación de las diferentes modalidades terapéuticas. Sin embargo, una de las limitaciones
más importantes es su vida media corta, que conduce a frecuentes administraciones intravenosas con objeto de mantener niveles plasmáticos
adecuados. En el momento actual están en desarrollo nuevas moléculas,
que posiblemente cambien de forma radical el tratamiento de la hemofilia. Estos nuevos agentes, denominados de forma general como concentrados de larga duración, reducirán el número de infusiones requeridas
en esquemas de profilaxis. Un tema pendiente es la búsqueda de nuevos
concentrados con menor capacidad inmunogénica, capaces de disminuir
el desarrollo de inhibidores frente a los factores de la coagulación.
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Otros desarrollos diferentes a la prolongación de la vida media se
están investigando en el campo de las coagulopatías. El desarrollo
de nuevos anticuerpos dirigidos frente a diferentes elementos de la
coagulación que permitan la formación de una hemostasia adecuada
sin necesidad de las proteínas o en presencia de inhibidores es una de
Figura 2. Lugares de activación del complejo FIX y albúmina y sus productos.
59
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
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60
Ponencias
Avances, retos y perspectivas en el diagnóstico molecular de la hemofilia
Eduardo Tizzano Ferrari
Área de Genética Clínica y Genética Molecular. Hospital Universitario Vall d’Hebrón. Barcelona
Introducción
abarcan uno o más exones y que ocurren en el 5-10% de los pacientes
y duplicaciones parciales en el gen en un 1%4. En los casos restantes la
patología molecular consiste en mutaciones puntuales de una o pocas
bases5. Hasta la fecha, se han comunicado más de 2.000 mutaciones
diferentes del gen del factor VIII en pacientes hemofílicos en la base
de datos HAMSTeRS (http://europium.csc.mrc.ac.uk), que excluye las
inversiones mayoritarias pero en la que se registran la grandes deleciones (10%), las pequeñas deleciones (16%), las inserciones (5%) y
las sustituciones (69%).
A pesar del análisis sistemático por secuenciación completa,
incluyendo la región promotora, se ha observado que no es posible
identificar la mutación responsable en un porcentaje minoritario de
pacientes con diagnóstico de hemofilia A (aproximadamente 2%)6,7. La
aplicación de las técnicas de secuenciación masiva es potencialmente
útil para la identificación del defecto molecular de estos pacientes.
En los pacientes con diagnóstico de hemofilia A confirmada en los
que no se detecta la mutación del gen del FVIII después de las inversiones y la secuenciación completa, es posible recurrir a otros métodos
más sofisticados de diagnóstico genético con el objetivo de detectar o
descartar otro tipo de mutaciones, mucho menos frecuentes, pero que
también pueden ser causa de déficit del factor VIII (Tabla 2 y Figura 1).
La búsqueda de mutaciones por secuenciación directa en las hemofilias ha sido siempre laboriosa, teniendo en cuenta que los genes son
grandes (particularmente el del FVIII) y que existen limitaciones en el
tamaño de los fragmentos a analizar. Es decir, son sistemas de bajo rendimiento pero de alta especificidad, constituyendo el método de elección
en el estudio de una mutación conocida en la familia. En los últimos
años han hecho su aparición aparatos que realizan secuenciación masiva,
A partir de la caracterización de los genes involucrados en las hemofilias A y B a mediados de los años ochenta se ha producido en estos 30
años un gran avance en los conocimientos de la patología molecular
que ocasiona estos trastornos. Conocer la patología molecular de un
paciente ofrece información de valor para correlacionar el genotipo
con el fenotipo, determinar la susceptibilidad de desarrollar inhibidores
y predecir las alteraciones funcionales de determinados sectores de
la proteína involucrada. Sin embargo, tanto las correlaciones genotipo-fenotipo como los factores genéticos que influyen en el desarrollo
de inhibidores no son absolutos y aún es un campo de investigación
que debe seguir expandiéndose. Asimismo, aplicando las metodologías
más de rutina de diagnóstico genético, existe un porcentaje mínimo de
pacientes hemofílicos en los cuales no es posible llegar a una confirmación de su patología molecular. Las nuevas técnicas de secuenciación
masiva están contribuyendo a la resolución de muchos de esos casos
y a un estudio más profundo de las correlaciones genotipo-fenotipo
dado que son capaces de generar una importante cantidad de información del genoma. Sin embargo, y a pesar de la amplia y sofisticada
tecnología disponible actualmente para realizar estudios moleculares,
el contar con información clínica exhaustiva del paciente y el realizar
un adecuado análisis genealógico continúan siendo fundamentales a la
hora de completar un diagnóstico molecular y ofrecer asesoramiento
genético a la familia de un paciente hemofílico. Esta información y
la adecuada interpretación de los datos genómicos son claves para
optimizar el seguimiento de cada paciente y lograr una medicina más
personalizada.
El gen del factor VIII y la hemofilia A
Tabla 1. Características de los genes de los factores VIII y IX
La caracterización del gen del FVIII por Anne Gitschier y colaboradores en 1984 demostró que dicho gen, con una longitud de 186 kilobases (kb), era uno de los de mayor tamaño conocido (Tabla 1). El gen
contiene 26 exones (zonas que codifican para proteína) y 25 intrones
(zonas que no codifican para proteína porque son eliminadas del ARN
mediante el proceso de splicing). Dado su gran tamaño, la probabilidad
de que exista un gran número de mutaciones o alteraciones en el gen
del FVIII es muy alta. Otra característica es que tiene zonas intrónicas
muy grandes que albergan secuencias homólogas idénticas a otras que
se ubican por fuera del gen y que son propensas a recombinar. Tal es
el caso de la secuencia homóloga F8A en el intrón 22 y la int1h en el
intrón 1, cuya recombinación entre las copias intragénica y extragénica resulta en sendas inversiones que dividen al gen del FVIII en dos
partes. Se ha establecido que un 45-50% de los casos graves de hemofilia presentan inversión del intrón 221 y un 2-5% una inversión en el
intrón 12,3. Existen otros rearreglos como las grandes deleciones que
Factor VIII
Localización
cromosómica
Xq28
Xq28
Tamaño total
186 kb
35 kb
26 exones
9 kb ARN
8 exones
2,8 kb ARN
Inversiones recurrentes
en los intrones 22 y 1;
mutaciones puntuales;
deleciones; duplicaciones
Mutaciones puntuales
y deleciones
Enfermedad
Hemofilia A
Hemofilia B
Frecuencia
1/7.500 RN varones
1/30.000 RN varones
Región
codificante
Características
de las mutaciones
kb, kilobases.
61
Factor IX
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
efectuando centenares a miles de lecturas repetidas de cada una de las
bases en estudio y dando información exhaustiva de las moléculas analizadas8. Esto ha aumentado considerablemente el rendimiento dado que
los secuenciadores tradicionales resolvían pocas kilobases al día y ahora
pueden estudiar cientos de megabases en el mismo tiempo. Asimismo, es
posible estudiar más genes a la vez así como la totalidad de las regiones
exónicas e intrónicas de estos genes. Dependiendo del tipo de aparato
de que se disponga y de la información que se quiera obtener se analizan
genomas completos, exomas, paneles de genes o genes completos o
regiones génicas que se quieran caracterizar.
Para definir la estrategia de análisis a seguir es importante preguntarse qué otros sitios del gen pueden tener mutaciones. Por ejemplo, así
como hay inversiones que afectan los dos grandes intrones 22 y 1, el
gen del FVIII posee otros intrones de gran tamaño como el 6, 13, 14 y
25, y es posible plantear la hipótesis de que algún paciente pudiera presentar una alteración rara que involucre alguno de ellos u otros grandes
rearreglos aislados9. Recientemente se ha confirmado la existencia de
cambios mutacionales en zonas internas de los intrones que afectan
el proceso de splicing generando un sitio de unión no convencional
(sitio de unión críptico)10,11. Finalmente, como los estudios de mutación se aplican al ADN procedente de leucocitos de sangre periférica
y el gen del FVIII actúa en el hígado, que es el lugar de síntesis más
importante, sería posible que existiera una línea celular mutada en el
hígado pero casi ausente en sangre periférica. Esto se conoce como
mosaicismo somático de baja frecuencia y fue demostrado en algunas
madres de casos esporádicos de hemofilia A con mutación identificada
y que habían sido diagnosticadas, erróneamente, como no portadoras12.
La metodología de secuenciación de Sanger puede llegar a detectar
casos de mosaicismo pero casi nunca cuando es menor del 15%13. La
secuenciación masiva permitiría estudiar en profundidad estos casos
para determinar la presencia de un alelo mutado aun con muy bajo porcentaje (alrededor del 1%) de representación en el ADN de linfocitos.
Cabe insistir en el hecho de que un gen puede estar indemne en su
estructura pero albergar una alteración en sus zonas reguladoras y, por
lo tanto, no transcribirse ni funcionar. La zona promotora del FVIII
abarca unas 2 kb y pocos cambios descritos como posiblemente patológicos en el promotor o zona 3’UTR en pacientes con hemofilia A14,15.
Se ha descrito también la ausencia o disminución del ARNm del gen
del FVIII en sangre periférica de un paciente con hemofilia A grave.
Este hallazgo es compatible con el concepto de gen no funcionante, ya
sea por mutaciones en zonas reguladoras o por otros factores epigenéticos como la metilación de zonas promotoras que actúan silenciando los
genes16. El estudio del ARNm para detectar alteraciones en su tamaño
y/o cantidad es esencial para descubrir estos hallazgos de la patología
molecular del gen del FVIII.
Por último, hay que señalar que en el diagnóstico diferencial de
la hemofilia A se deben descartar la enfermedad de von Willebrand,
particularmente los casos con niveles de factor VIII moderados o leves
(2N), y el déficit combinado de FV y FVIII. Este último ocurre por
mutaciones en los genes que codifican las proteínas LMAN1 (antes
ERGIC-53) y MCFD2, localizados en los cromosomas 18 y 2, respectivamente, que transportan el FV y el FVIII desde el retículo endoplásmico hasta el aparato de Golgi. Las mutaciones encontradas predicen
la falta de función de estas proteínas y provocan un déficit moderado
a leve de FV y FVIII. Este trastorno constituye un ejemplo de enfermedad por déficit de proteínas cuyos genes están intactos y subraya la
importancia de los procesos postraduccionales.
Tabla 2. Mutaciones que podrían ser causa de hemofilia A y que no
son detectadas mediante los métodos rutinarios de secuenciación
en ADN genómico
Mutaciones en
el gen del FVIII
• Alteraciones splicing por mutaciones intrónicas
• Mosaicismo somático de baja frecuencia
• Posibles inversiones en intrones 6, 13, 14 y 25 u
otros rearreglos
Regulación de la
expresión del gen
del FVIII
• Mutaciones en zonas promotoras o región 3’ no
traducida (UTR)
• Factores epigenéticos no conocidos
Mutaciones en
otros genes
• Genes de las proteínas de transporte del FVIII
• Genes que actúan en la modificación
postraduccional de la proteína
Figura 1. Algoritmo de diagnóstico molecular en la hemofilia A. A partir del ADN
de un paciente hemofílico se inicia el estudio con las inversiones de los intrones
22 y 1. A continuación el método de secuenciación automática de Sanger permite
obtener resultados fiables de los exones y las zonas de unión intrón-exón y
promotor. Si es negativo es posible detectar deleciones o duplicaciones exónicas
con métodos cuantitativos, ya sea con la amplificación selectiva de exones o
estudiando la totalidad de los exones en un solo experimento como la Multiplex
Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA). Si todo es negativo y la hemofilia
es leve o moderada es necesario descartar enfermedad de von Willebrand 2N (que
cursa con niveles bajos de FVIII) y el más raro déficit combinado de FV y FVIII por
alteración del transportador común de ambos factores. Estudios más complejos
incluyen el análisis de ARN mensajero para determinar alteraciones raras del
splicing, estudios de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) y CGH (Comparative
Genome Hybridization) para detectar grandes rearreglos estructurales, y la
secuenciación masiva (NGS) para descubrir mutaciones intrónicas o en regiones
menos estudiadas del gen. La confirmación genética del paciente permite
el estudio de portadoras y el adecuado asesoramiento genético de la familia
incluyendo las opciones reproductivas. Siempre es aconsejable realizar el estudio
indirecto con marcadores polimórficos intragénicos que permiten identificar el
cromosoma X de riesgo en la familia en caso de no encontrar la mutación o de
ser necesario un diagnóstico de portadoras con rapidez. Los marcadores también
son necesarios para definir el haplotipo de riesgo en los estudios prenatales y
preimplantatorios. En la hemofilia B puede seguirse un razonamiento similar pero
no hay inversiones, por lo que el diagnóstico empezaría por la secuenciación y
los estudios cuantitativos.
62
Ponencias
El gen del factor IX y la hemofilia B
Finalmente los ensayos de terapia génica en relación con la hemofilia se han realizado en pacientes afectados de hemofilia B con resultados muy prometedores. Una única inyección de vector (un virus
adenoasociado 2/8) con el gen humano del factor IX administrada a 6
pacientes afectados de hemofilia B grave logró unos niveles de factor
IX que oscilaban del 2% al 8%18, y el uso en más pacientes está en
fase de experimentación.
El gen del factor IX tiene un tamaño inferior al del factor VIII (35
kb o 35.000 pares de bases) y se localiza también en el brazo largo
del cromosoma X. En la hemofilia B un 3-5% de los pacientes presentan grandes deleciones, la mitad de las cuales abarcan la totalidad
del gen aunque no se han detectado rearreglos recurrentes como
las inversiones de los intrones 1 y 22 de la hemofilia A. Esto puede
deberse a que el factor IX tiene intrones más pequeños y a que está
ubicado más cerca del centrómero que el factor VIII, siendo quizás
menos vulnerable en la meiosis para que ocurra una recombinación.
Casi todas las mutaciones del gen del factor IX son puntuales y muy
heterogéneas, siendo la gran mayoría sustituciones aminoacídicas.
En este gen es recomendable comenzar su búsqueda en el exón 8,
que representa casi la mitad de la región codificante y el número de
mutaciones es mayoritario. Así como casi no existen mutaciones descritas en la región promotora del gen del factor VIII, en los pacientes
con hemofilia B, estas mutaciones son frecuentes. Particularmente las
ubicadas entre –21 y +13 de acuerdo con el inicio de la transcripción
del gen se han asociado con una mejoría del fenotipo con la edad del
paciente (fenotipo Leiden). Esto se debe al aumento de testosterona
que mejoraría la transcripción aumentando los niveles de factor IX.
Existe una base de datos de las mutaciones en el gen del factor IX
en la dirección: http://www.factorix.org/.
Un aspecto interesante de la hemofilia B se publicó en el año 2009,
cuando el análisis genético de los restos de la zarina Alejandra, esposa
del zar Nicolás II de Rusia y portadora de la hemofilia real (era nieta
de la reina Victoria), demostró que la hemofilia que padecía su hijo
Alexis y tantos otros hemofílicos de las casas reales europeas (incluida
la española) se trataba de una hemofilia B. La mutación es un cambio
de adenina por guanina en el intrón 3 que altera el splicing entre el
exón 3 y el exón 4 del gen del factor IX, prediciendo una hemofilia B
grave, como era el caso de los afectados de la familia real17.
Asesoramiento genético y opciones reproductivas
Aunque en la mayoría de los casos de hemofilia A y B es posible
confirmar el diagnóstico genético, es necesario tener en cuenta ciertas
circunstancias o contextos para poder evitar errores en la interpretación
de los resultados moleculares (Tabla 3). En un caso típico de hemofilia
familiar, de clara herencia ligada al cromosoma X, suele haber más
de un afectado en una generación, así como portadoras obligadas,
por lo que el diagnóstico genético no ofrece, en general, demasiados
problemas, sobre todo si la mutación del gen del FVIII corresponde a
una de las inversiones habituales o bien afecta a las secuencias características. Pero hay casos en que el diagnóstico genético de la hemofilia,
por distintos motivos, presenta diversos niveles de complicación. De
acuerdo a como se puedan resolver los mismos, podremos llegar al
diagnóstico de las portadoras en la familia, ofrecer un adecuado asesoramiento genético y explicar las alternativas de reproducción y prevención disponibles como el diagnóstico prenatal o preimplantatorio
(Tabla 4). Por lo tanto, el asesoramiento genético de las familias con
hemofilia debe incluir todo un proceso por el cual es posible asegurar
que la familia consultante conoce las implicaciones de la enfermedad,
la forma en que se hereda, qué mujeres tienen riesgo de ser portadoras,
los factores de error en los cálculos de riesgo y las alternativas que
existen para que, disponiendo de todos estos elementos, se pueda elegir
el camino a seguir. Esto implica que el asesoramiento reproductivo de
estas portadoras debe ser un proceso educativo e informativo, pero
Tabla 3. Casos especiales de hemofilia para diagnóstico molecular
Caso esporádico
Ausencia de afectado
disponible para el estudio
Dos coagulopatías
en la misma familia
Dos mutaciones en la misma
familia o en el mismo paciente
• Es aquel que se presenta sin antecedentes familiares.
• La mutación puede haberse originado de novo en el óvulo materno, por mosaicismo germinal (la mutación no se
detectaría en el estudio genético de sus linfocitos en sangre periférica pero más de un óvulo podría llevarla) o se
segregó en silencio desde generaciones anteriores.
• En el 10-15% de los casos esporádicos no se detecta la mutación en la madre del paciente.
• Las inversiones se pueden detectar en estado heterocigoto en las mujeres; ese es el primer análisis a realizar.
• El estudio indirecto mediante marcadores polimórficos puede resultar especialmente útil, sobre todo si hay otros hijos
varones sanos, para hacer diagnóstico de exclusión.
• La enfermedad de von Willebrand es más frecuente que las hemofilias y pueden aparecer en una misma familia.
• Se han descritos algunos primos con hemofilia A y diferente mutación o individuos con hemofilia A o B con más de una
mutación en el gen del factor VIII o IX.
Paciente hemofílico
sin mutación detectada
• En un 1-2% de los pacientes pueden no detectarse las mutaciones causantes de la enfermedad (ver texto).
Mujeres con hemofilia
• Si tienen las dos copias de su gen de factor VIII o IX mutados.
• Si tienen una copia mutada del gen y una inactivación extrema del alelo sano en tejido hepático para que produzca
menos o escaso factor.
• Si presentan una anomalía cromosómica ya sea numérica (monosomía del X) o estructural (translocación X-autosoma).
63
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Tabla 4. Características del diagnóstico prenatal y preimplantatorio de la hemofilia
Diagnóstico prenatal
Fecundación
Material analizado
Limitaciones metodológicas
Embarazo
Comprobación posterior del resultado
Éxito de la prueba
Aspectos económicos
Aspectos éticos
Diagnóstico preimplantatorio
Natural
In vitro previa estimulación hormonal
Vellosidad corial (11 s)
Células embrionarias (3 d)
Permite realizar diagnóstico directo e indirecto
Limitaciones en diagnóstico directo según la mutación
Generalmente único
Se implantan habitualmente dos embriones
No es necesaria
Por biopsia del corion (11 s) o amniocentesis (14-16 s)
Bajo porcentaje de complicaciones al ser
embarazo natural
Complicaciones inherentes a las técnicas de
reproducción asistida
Accesible
Costoso
Interrupción del embarazo
Descartar embriones
s, semanas; d, días.
taciones clínicas, en el seguimiento de pacientes hemofílicos se han
caracterizado otros aspectos fenotípicos. Por ejemplo, los episodios de
sangrado, que están en relación directa a si el paciente recibe factor a
demanda o en régimen de profilaxis. Existen pacientes con el mismo
nivel de factor que pueden variar en la frecuencia y manifestaciones
del sangrado. La búsqueda de factores genéticos que expliquen estas
diferencias fenotípicas no es nueva. Por ejemplo, el papel de factores de
riesgo protrombóticos, especialmente el FVL y la variante PT20210A,
ha sido estudiado por varios grupos investigadores con respecto a la
hemofilia23 y actualmente se investigan los factores procoagulantes como
alternativas terapéuticas24. Otro aspecto es el desarrollo de inhibidores
a la terapia sustitutiva, que también depende de varios factores entre los
que destacan la etnia, el tipo de mutación, el producto de FVIII usado,
la edad y la dosis en la primera exposición al factor FVIII25. Se han estudiado diferentes subtipos de HLA y polimorfismos de distintas citocinas
en la búsqueda de marcadores pronósticos de desarrollo de inhibidores.
Sin embargo, los resultados hasta la fecha no son categóricos para definir
un paciente en riesgo claro de desarrollarlos26.
de ningún modo coercitivo ni directivo. Es posible que una pareja
joven sin problemas de fecundidad pueda beneficiarse de un primer
embarazo natural y de un diagnóstico prenatal, que ha mostrado en las
últimas décadas ser un procedimiento eficaz, rápido, y relativamente
simple para las portadoras. Por el contrario, una pareja con problemas
reproductivos y que además haya pasado por casos de hijos afectados
podría elegir la opción del diagnóstico preimplantatorio, que implica
una preparación hormonal problemática para la paciente, que es técnicamente más complejo y económicamente más costoso.
El análisis por polimorfismos (que son variantes normales de la
secuencia de ADN que permiten identificar uno u otro cromosoma con
la mutación, aunque no la mutación en sí misma) puede ser particularmente útil en casos sin mutación detectada y constituye un método de análisis alternativo para diagnóstico de portadoras, prenatal y
preimplantatorio, aplicable a la gran mayoría de casos de hemofilia19.
En los últimos años, y gracias a la PCR en tiempo real, la PCR
digital y la secuenciación masiva, se han desarrollado métodos para
el diagnóstico prenatal no invasivo en sangre materna. Dado que existen células fetales que pasan a la circulación materna, la muerte de
estas células libera ADN circulante que puede ser aprovechado para
demostrar el sexo fetal evitando así los métodos invasivos en el caso
de tratarse de niñas. La PCR digital y la secuenciación masiva están
también experimentándose para realizar posibles diagnósticos prenatales no invasivos de afectados20,21.
Conclusiones
En la actualidad estamos en una nueva era de investigación al disponer
de las nuevas técnicas de secuenciación masiva que están demostrando
su utilidad para completar el diagnóstico de pacientes especiales con
hemofilia y que abren una nueva perspectiva en la investigación de
la enfermedad. Estas metodologías van cambiando constantemente
ofreciendo cada vez más alternativas de análisis. Así, de la secuenciación en paralelo de muchas moléculas de ADN ahora se está llegando a los estudios de una sola molécula a través de nanoporos. Todas
estas metodologías son capaces de generar una importante cantidad
de información sobre variantes en el mismo factor VIII o IX y en el
resto del genoma que puedan explicar o asociarse a todas las diferencias fenotípicas observadas en los pacientes hemofílicos, y asimismo
pueden potencialmente aplicarse a otros campos como el de la farmacogenética y la terapéutica sustitutiva para lograr una medicina
más personalizada. A pesar de todos estos recursos, para continuar
avanzando en estos campos es imprescindible continuar jerarquizando
la información clínica del paciente. La generación de datos genéticos
Correlación fenotipo-genotipo: la búsqueda de
modificadores y marcadores genéticos en el genoma
Los avances de la genética molecular nos indican que no siempre la
secuencia alterada de un gen es suficiente para producir un fenotipo. A
medida que se han encontrado mutaciones en diversos genes causantes
de trastornos monogénicos, se ha descubierto que las correlaciones
entre el genotipo y el fenotipo son casi siempre incompletas debido al
efecto modificador de otros genes y a la asociación de polimorfismos,
factores epigenéticos, celulares o de tejido, algunos de ellos todavía
no bien estudiados22.
Además de la clasificación de los pacientes en graves, moderados
y leves de acuerdo con el nivel de actividad del factor y las manifes-
64
Ponencias
a través de la secuenciación masiva no es ya un problema. El máximo
desafío lo constituye ahora la interpretación de esos datos en el contexto de cada paciente.
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XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Cuestiones abiertas en tratamiento antitrombótico
Coordinadores: Vanessa Roldán Schilling. Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital Universitario Morales Messeguer. Murcia
José Antonio Páramo Fernández. Servicio de Hematología y Hemoterapia. Clínica Universidad de Navarra. Pamplona
Durante los últimos años se ha producido una auténtica revolución en el tratamiento antitrombótico con la irrupción de nuevos fármacos que se perfilan más eficaces y sobre todo más seguros. Sin embargo, seguimos teniendo muchas situaciones aún no resueltas.
En el simposio que hoy nos ocupa vamos a intentar dar respuesta a algunas de ellas.
En primer lugar, la duración del tratamiento anticoagulante sigue siendo un problema no resuelto. ¿Qué pacientes se benefician
de la prolongación del tratamiento anticoagulante con un balance riesgo-beneficio aceptable? el Dr. Domènech revisa la evidencia
científica publicada al respecto, la cual junto con su experiencia personal podrá aclararnos en gran medida esta cuestión que frecuentemente nos planteamos en la práctica clínica diaria.
El tratamiento anticoagulante es efectivo a la hora de reducir los eventos trombóticos, tanto en prevención primaria como en
prevención secundaria. Sin embargo, a pesar de este, una tasa no despreciable de pacientes sigue teniendo eventos. Por otra parte,
de todos es conocido que el principal efecto secundario de dicho tratamiento son las hemorragias. Por tanto, la estratificación del
riesgo es fundamental a la hora de una correcta indicación del mismo. Actualmente se emplean criterios clínicos, pero ¿puede la
biología mejorar dicha estratificación? Ese es el tema que ocupa a nuestro segundo ponente, la Dra. Roldán.
Otro gran reto al cual nos enfrentamos, desde el punto de vista del tratamiento antitrombótico, es el manejo de la población
anciana, especialmente aquella por encima de los 80 años, situación cada vez más frecuente por el aumento de la esperanza de vida
y especialmente la mejora de la calidad de la misma. La edad es un factor de riesgo para el tromboembolismo, tanto venoso como
arterial, y a su vez es un factor de riesgo para la hemorragia asociada al tratamiento antitrombótico. El Dr. Mateo expondrá cómo
conseguir el equilibrio en estos pacientes en términos de seguridad y eficacia.
Por último, la creación de las Unidades de Ictus ha mejorado el tratamiento agudo de los pacientes con un episodio isquémico
cerebral, tanto trombótico como hemorrágico. La creación del sistema “Código Ictus” permite una atención más temprana al paciente,
reduciendo la morbimortalidad de forma significativa. Por otro lado, no debemos olvidar que el efecto secundario más devastador del
tratamiento anticoagulante es la hemorragia intracraneal. La aparición de los anticoagulantes de acción directa supone una reducción
muy importante de esta complicación, manteniendo e incluso mejorando la eficacia del tratamiento anticoagulante. El Dr. Masjuan
será el encargado de cerrar este simposio con una actualización de la patología cerebrovascular aguda.
66
Ponencias
Duración del tratamiento anticoagulante en la enfermedad tromboembólica venosa
Pere Domènech, Elena Pina, Joan Peris, Elena Rosselló
Unidad de Trombosis y Hemostasia. Hospital Universitario de Bellvitge. Barcelona
trombótica es mayor y sin un factor de riesgo transitorio, el tratamiento
activo del TEV agudo puede alargarse hasta los 6 meses.
El tratamiento anticoagulante del tromboembolismo venoso (TEV)
está distribuido en dos fases que se superponen1.
Una de ellas es el tratamiento del episodio de TEV reciente que
va dirigido a controlar el fenómeno trombótico activo. La finalidad
del tratamiento en esta fase es evitar la progresión del trombo favoreciendo la lisis del mismo, así como evitar la embolización pulmonar.
Esta fase se desarrolla durante los 3-6 primeros meses, principalmente
el primer mes.
La segunda fase es la de la profilaxis secundaria del TEV, y va
dirigida a prevenir las recurrencias TEV no relacionadas con el proceso
trombótico inicial. Esta se desarrolla desde el inicio del proceso trombótico, solapándose al tratamiento activo, y puede alargarse indefinidamente. La profilaxis secundaria es el motivo por el cual se administra
anticoagulación a partir de los 3-6 meses y bajo la denominación de
tratamiento ampliado.
Tratamiento ampliado del tromboembolismo venoso
(profilaxis secundaria)
La ampliación del periodo de anticoagulación más allá de los 6 meses
tiene como finalidad evitar las recurrencias TEV no relacionadas con
el episodio TEV inicial.
Una anticoagulación adecuada con fármacos antivitamina K
(AVK), con un INR diana 2-3, resulta extraordinariamente eficaz para
prevenir las recurrencias. Un metaanálisis de 4 estudios2 situaba la
reducción del riesgo en cerca del 90%. Cabe decir que la mitad de las
recurrencias detectadas en los pacientes de los grupos con anticoagulación mantenida acontecieron en individuos que, de hecho, habían
interrumpido la misma. Ello significa que el grado de protección de
realizar correctamente la anticoagulación es todavía superior.
Por otro lado, prolongar la anticoagulación más allá del periodo de
tratamiento activo (3-6 meses) frente al tratamiento limitado a esta fase
únicamente comporta el retraso, que no la reducción, de las recurrencias TEV. Esto se ha demostrado en varios estudios4,5 que compararon
AVK 3 meses frente a 6 meses o 1 año, e hicieron un seguimiento de
1-3 años tras la interrupción de la anticoagulación. Un metaanálisis
de dichos estudios permite situar en 1,05 (IC95% 0,78-1,39) el RR de
recurrencia TEV del grupo de tratamiento corto (3 meses) frente a los
grupos prolongados.
El coste en seguridad de mantener la anticoagulación es fundamentalmente el incremento en la tasa de hemorragias. Así pues, la
gran cuestión en la duración del tratamiento anticoagulante del TEV
es: ¿a qué pacientes se debe prolongar la anticoagulación más allá de
los 3-6 meses y con carácter indefinido, para evitar recurrencias TEV
con un balance riesgo-beneficio aceptable?
Para responder esta pregunta debemos intentar ponderar riesgos y
beneficios en diversos contextos.
Duración mínima de la anticoagulación (tratamiento
activo)
Varios estudios han abordado tratamientos más cortos a los 3-6 meses.
Un metaanálisis de estos estudios observó que después de 9-24 meses
de seguimiento, los pacientes sometidos a tratamiento corto (4-6 semanas) presentaron el doble de recurrencias (6,4% vs 11,7% [IC95%
del incremento 2,5-9,1%] [RR 1,83; IC95% 1,39-2,42])2. Estas cifras
incluyen todos los eventos TEV tras la interrupción de la anticoagulación en la rama de tratamiento corto. Si únicamente cuantificamos las
recurrencias a partir de la interrupción de la anticoagulación en ambos
grupos el RR es de 1,52 (IC95% 1,14-2,02).
A diferencia de lo que sucede con la localización habitual de las
recurrencias en pacientes tratados por trombosis venosas profundas
(TVP) durante un periodo mínimo de 3 meses (contralaterales en dos
tercios de los casos), los pacientes tratados menos tiempo presentan un
incremento en la tasa de recurrencias ipsilaterales, y observable hasta
los 6 meses. Este dato evidencia un insuficiente control del proceso
trombótico reciente de los pacientes tratados entre 1 y 1,5 meses.
Así pues, el periodo mínimo para anticoagular un paciente tras un
TEV es de 3 meses.
En algunos TEV particularmente extensos, no provocados o con
un factor de riesgo prologado, este periodo de tratamiento activo puede
extenderse algo más. Un metaanálisis realizado de siete estudios3 analizando TEV no provocados y provocados más extensos (TVP proximales y embolismos pulmonares), detectó una tendencia a mayor incidencia de recurrencias en los 6 meses que siguieron a la interrupción
de la anticoagulación en los pacientes tratados durante 3 meses frente
a los tratados durante >6 meses (HR 1,57; IC95% 0,94-2,61). Aunque
la diferencia no sea estadísticamente significativa, estos datos sugieren que en algunas ocasiones, fundamentalmente cuando la afectación
Riesgo de hemorragias
A partir de datos de estudios randomizados2, el incremento del riesgo
de padecer hemorragias graves ante el mantenimiento de la anticoagulación con AVK es de 2,6 veces (RR 2,63; IC95% 1,02-6,78).
Datos obtenidos del registro RIETE6 sobre población con TEV
más próxima a la vida real (n ≈ 41.000) sitúan la tasa de hemorragias
graves en el 3,27% pacientes-años en los afectos de embolismo pulmonar (EP) (IC95% 3,02-3,53) y en 2,41% pacientes-años (IC95%
2,19-2,64) en los afectos de TVP. La mortalidad por hemorragia
en este registro es de 0,62 pacientes-años (IC95% 0,52-0,74) y de
0,49 (IC95% 0,40-0,60) en los pacientes con EP y con TVP res-
67
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Riesgo de tromboembolismo recurrente
pectivamente. Cabe resaltar de la publicación de Lecumberri et al.
citada sobre el registro RIETE, que la tasa de caso-fatalidad de las
hemorragias graves se mantiene estable a lo largo del tiempo, entre
un 12,9% y un 26,5%.
Algunos factores se relacionan con un incremento del riesgo de
hemorragia. Es el caso de la edad avanzada, los antecedentes hemorrágicos, la presencia de insuficiencia renal o hepática, el uso concomitante de fármacos antiagregantes, la intensidad de la anticoagulación
y su duración.
Existen varios scores para evaluar el riesgo de hemorragia en el
paciente anticoagulado (Tabla 1)7-10; sin embargo, ninguno de ellos ha
sido validado en la fase de anticoagulación ampliada. Es más, incluso
en la fase de tratamiento activo (los 3 primeros meses) han demostrado
escaso poder discriminante del riesgo hemorrágico11. En las Tablas 2A
y 2B se exponen varios factores de riesgo hemorrágico, y los riesgos de
hemorragia grave asociados a la presencia de más o menos de dichos
factores2.
Una población tipo de “bajo riesgo hemorrágico” incluiría pacientes <65 años, sin comorbilidades remarcables, que no requieren antiagregantes ni AINE y que han presentado un buen control de la anticoagulación (sin excesos).
Un estudio observacional12 situó la incidencia acumulada de recurrencias TEV tras un evento agudo, en pacientes anticoagulados 3 meses,
en un 8,6% a los 6 meses, en un 17,5% a los 2 años y en un 24,6%
a los 5 años, con una tasa anual más o menos estable y sin llegar a
un plateau. A los 30 años la incidencia acumulada de recurrencias se
sitúa en el 30%.
En una publicación del registro RIETE6, la tasa de EP recurrente
tras un EP se sitúa en 1,63% pacientes-años, y tras una TVP en el
0,9% pacientes-años. La tasa de TVP recurrente tras un EP y una
TVP es del 0,92% pacientes-años y del 1,97% pacientes-años respectivamente, confirmándose lo ya observado por otros grupos de que las
EP recorren más como una nueva EP y las TVP recorren más como
una nueva TVP. La tasa de EP fatal como evento recurrente es muy
superior en los pacientes que debutaron con EP que en aquellos que
debutaron como TVP (0,47 [IC95% 0,52-0,74] vs 0,18 [IC95% 0,130,25]). A diferencia de lo observado con la tasa de caso-fatalidad tras
una hemorragia grave que se mantiene estable a lo largo del tiempo, la
tasa de caso-fatalidad por EP fatal recurrente decae progresivamente,
pasando a ser de un 20,4% el primer mes a un 0% a los 6-8 meses.
Tabla 2A. Factores de riesgo de hemorragia grave entre los
pacientes anticoagulados por TEV2
Tabla 1. Scores de riesgo hemorrágico en el TEV
Score
Variables
Puntos
Riesgo de
hemorragia grave
• Edad > 65 años
• Hemorragia
gastrointestinal previa
• Ictus previo
• IAM reciente y/o
hematocrito <30% y/o
diabetes y/o creatinina
> 1,5 mg/dL
1
1
1
1
Bajo: 0
Intermedio: 1-2
Alto: >3
Kuijer8
• Edad > 65 años
• Mujer
• Cáncer
1,6
1,3
2,2
Bajo: 0
Intermedio: 1-3
Alto: >3
1
1
1
1
Kearon9
• Edad > 65 años
• Ictus previo
• Ulcus péptico previo
• Hemorragia
gastrointestinal previa
• Insuficiencia renal
• Anemia
• Trombopenia
• Enfermedad hepática
• Diabetes
• Antiagregantes
plaquetarios
• Hemorragia grave
reciente
• Creatinina > 1,2 mg/dL
• Anemia
• Cáncer
• EP sintomático
• Edad > 75 años
2
Outpatient
Bleeding
Risk Index7
RIETE10
1
1
1
1
1
1
1,5
1,5
1
1
1
• Edad > 65 años
• Edad > 75 años
• Hemorragia previa
• Cáncer
• Cáncer metastásico
• Insuficiencia renal
• Insuficiencia hepática
• Trombopenia
• Ictus previo
• Diabetes
• Anemia
• Tratamiento antiagregante
• Mal control de la anticoagulación
• Comorbilidades y reducción de la capacidad
funcional
• Cirugía reciente
• Caídas frecuentes
• Alcoholismo
Tabla 2B. Riesgo estimado de hemorragia grave en pacientes
de bajo, medio y elevado riesgo2
Riesgo absoluto estimado
de hemorragia grave (%)
Bajo: 0
Intermedio: 1-3
Alto: >4
Estratificación del riesgo de sangrado
Bajo
(sin FR)
Moderado
(1 FR)
Elevado
(≥2 FR)
Anticoagulación 3 meses
Basal
0,6
1,2
4,8
Incremento
1,0
2,0
8,0
Total
1,6
3,2
12,8
Basal
0,3
0,6
>2,5
Incremento
0,5
1,0
>4,0
Total
0,8
1,6
>6,5
Anticoagulación a partir de los 3 meses
Bajo: 0
Intermedio: 1-4
Alto: >4
FR, factores de riesgo.
68
Ponencias
No todos los pacientes con TEV presentan el mismo riesgo de
recurrir tras la suspensión de la anticoagulación13.
En pacientes con TEV (TVP proximal y EP) no provocados el
riesgo anual de presentar una recurrencia TEV tras la supresión de la
anticoagulación es >5%.
En pacientes que presentaron un TEV debido a cirugía, una vez
realizados los 3 meses de anticoagulación, el riesgo anual de presentar
una recurrencia es marcadamente menor (<1%).
El riesgo de presentar recurrencias tras TEV debido a factores de
riesgo (FR) transitorios no quirúrgicos es intermedio (1-5%) y variable.
A FR menos potente mayor tasa de recurrencias.
Aparte de la presencia o no de un FR transitorio otros factores
pueden incidir en el riesgo de recurrencia:
Tabla 3. Modelos de predicción clínica para evaluar el riesgo
de recurrencia TEV
Modelo
predictivo
Viena
• La localización distal (por debajo de la vena poplítea) de una
TVP va asociada a una tasa menor de recurrencias que la TVP
proximal o el EP (HR 0,49; IC95% 0,34-0,71)3.
• La presentación de un TEV en una mujer que sigue tratamiento
hormonal también se asocia a una reducción del 50% de la tasa
de recurrencias tras suprimir la anticoagulación y en ausencia
del tratamiento hormonal14.
• El género masculino se asocia a un riesgo superior de recurrir
(x1,8).
• La presencia de secuela postrombótica se asocia a un incremento
del riesgo de recurrencia de x2,6 veces15.
• La presencia de trombo residual detectado por ecodoppler sigue
teniendo un papel incierto, con datos contradictorios16.
• Un segundo episodio de TEV incrementa en aproximadamente
un 50% el riesgo de una nueva recurrencia.
• Los marcadores biológicos de trombofilia con algunas excepciones
(déficit de antitrombina III, marcadores de síndrome antifosdolípidico) no son buenos predictores del riesgo de recurrencia después
de un primer episodio de TEV. Sin embargo, sí parece determinante
la existencia de una historia clínica familiar abigarrada de TEV.
• Un marcador que sí posee relevancia como factor de riesgo de
recurrencia tras un TEV no provocado es el dímero D. Un valor
por encima del umbral al mes de suspender la anticoagulación
se asocia a una tasa anual de recurrencia en ausencia de anticoagulación del doble respecto a los que presentan dímero D por
debajo del umbral (9% vs 4%)17.
18
Criterios
Score
• Género masculino
• TVP proximal
• EP
• Dímero D (valor continuo durante AVK)
1
HERDOO19
• Hiperpigmentación, edema o enrojecimiento
de la pierna
• Dímero D ≥ 250 μg/L
• Índice de masa corporal ≥ 30 kg/m2
• Edad ≥ 65 años
DASH20
• Dímero D (encima/debajo del umbral sin AVK)
• Edad (cuartiles)
• Género masculino
• Terapia hormonal
2
1
1
-2
1
1
1
Como se puede apreciar, en individuos de riesgo elevado de sangrar (según la Tabla 2) que han sufrido una TVP proximal o un EP
no provocados se recomienda limitar la duración del tratamiento a 3
meses. Ello se debe a que el riesgo de hemorragia grave y de muerte
por hemorragia, debido al mantenimiento de la anticoagulación, excede el beneficio en reducción de TEV recurrentes y en reducción de la
mortalidad por EP.
Más dudas hay sobre la indicación de mantener indefinidamente la
anticoagulación en pacientes que han sufrido una TVP proximal o un
EP no provocados en pacientes de riesgo bajo o intermedio de sangrar
(Tabla 2). En esta decisión probablemente se deberían ponderar más
pormenorizadamente los factores que pueden incrementar el riesgo
de recurrencia, y fundamentalmente del riesgo de recurrencia fatal,
y que permiten suponer superioridad del beneficio, en reducción del
riesgo de recurrencias, frente al riesgo de hemorragia grave y muerte
por hemorragia fatal.
En la Tabla 7 Kearon et al.21 ofrecen un algoritmo de toma de
decisión en función de los riesgos de recurrencia y de hemorragia
en pacientes con una TVP proximal o un EP no provocados y que no
presentan un elevado riesgo hemorrágico. En la toma de decisión sobre
parar a los 3-6 meses o prolongar indefinidamente la anticoagulación
deberá participar el propio paciente. Este debería ser informado de los
riesgos y beneficios a asumir en su situación específica, considerando
sus temores y otras particularidades de su vida, como profesión, facilidad de acceso al hospital, etc. La prolongación debería hacerse con
carácter indefinido, reevaluando periódicamente si aparecen nuevos
factores que modifiquen el balance estimado inicial de riesgo-beneficio.
La irrupción de los anticoagulantes orales de acción directa
(DOAC), que presentan un perfil de seguridad superior al de los AVK,
podría, en un futuro, incrementar el número de pacientes candidatos
a anticoagulaciones ampliadas. En la Tabla 8 se ofrece un resumen
de recurrencias TEV y hemorragias clínicamente relevantes que se
han observado en los estudios publicados que comparan DOAC con
placebo22-24.
Se han desarrollado algunos scores para evaluar el riesgo de recurrencia
(Viena18, HERDOO19, DASH20) que se muestran en la Tabla 3. Sin embargo, estos scores no han sido todavía validados por grupos independientes.
Análisis global de beneficios y riesgos,
y recomendaciones
En las Tablas 4 y 5 se muestran las estimaciones en riesgo relativo y
absoluto, a 1 y a 5 años, de sufrir eventos adversos graves comparando
la anticoagulación limitada a 3 meses frente a la ampliada. Dichas
estimaciones se realizan en base a datos de estudios randomizados y a
tasas de eventos en diversos subgrupos, incluidas las de caso-fatalidad,
recogidas en diversas publicaciones.
En la Tabla 6 se resumen las recomendaciones/sugerencias de la
ACCP (9.ª ed.) sobre duración de la anticoagulación tras un evento
TEV2.
69
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Tabla 4. Anticoagulación ampliada vs no ampliada para diferentes grupos de pacientes con TEV y sin cáncer2
Criterios
Mortalidad
Calidad de la
evidencia
Moderada
Efecto relativo
Riesgo sin anticoagulación
ampliada
Riesgo diferencial con anticoagulación ampliada
RR (IC95%)
‰ pacientes
Reducción de eventos ‰ pacientes (IC95%)
0,57 (0,31-1,03)
63
27 (44 a -2)
Primer TEV provocado por cirugía
10
10 (6 a 9)
Primer TEV provocado no quirúrgico / Primera TVP distal no provocada
Recurrencia TEV
a 1 año
Elevada
0,12 (0,09-0,38)
50
44 (31 a 45)
Primer TEV no provocado
100
88 (62 a 91)
Segundo TEV no provocado
150
132 (93 a 137)
RR (IC95%)
‰ pacientes
Incremento de eventos ‰ pacientes (IC95%)
Riesgo hemorrágico bajo
3
Hemorragia mayor
a 1 año
Moderada
2,63 (1,02-6,76)
5 (0 a 15)
Riesgo hemorrágico medio
6
10 (1 a 29)
Riesgo hemorrágico elevado
25
40 (3 a 122)
RR (IC95%)
‰ pacientes
Reducción de eventos ‰ pacientes (IC95%)
Primer TEV provocado por cirugía
30
26 (19 a 27)
Primer TEV provocado no quirúrgico / Primera TVP distal no provocada
Recurrencia TEV
a 5 años
Elevada
0,12 (0,09-0,38)
150
132 (93 a 137)
Primer TEV no provocado
300
264 (186 a 273)
Segundo TEV no provocado
450
396 (279 a 409)
RR (IC95%)
‰ pacientes
Incremento de eventos ‰ pacientes (IC95%)
Riesgo hemorrágico bajo
15
Hemorragia mayor
a 5 años
Moderada
2,63 (1,02-6,76)
24 (2 a 73)
Riesgo hemorrágico medio
30
48 (4 a 146)
Riesgo hemorrágico elevado
125
199 (17 a 609)
Modificada de Kearon et al.2
70
Ponencias
Tabla 5. Diferencia absoluta estimada en TEV recurrentes, hemorragias graves y muertes por ambos, con 5 años de anticoagulación
con AVK vs anticoagulación no ampliada2
Riesgo de hemorragia
Eventos a 5 años con AVK
Bajo
Medio
Alto
‰ pacientes (IC95%) [fatales]
Primer TEV provocado por cirugía
Primer TEV provocado no quirúrgico / Primera TVP distal
no provocada
Primera TVP proximal o EP no provocados
Segundo TEV no provocado
Reducción de TEV recurrente
↓26 (19-27) [1]
Incremento hemorragia grave
↑24 (2-73) [3]
Reducción de TEV recurrente
↓132 (93-137) [5]
Incremento hemorragia grave
↑24 (2-73) [3]
Reducción de TEV recurrente
↓264 (186-273) [10]
Incremento hemorragia grave
↑24 (2-73) [3]
Reducción de TEV recurrente
↓396 (279-409) [14]
Incremento hemorragia grave
↑24 (2-73) [3]
↑49 (1-173) [5]
↑98 (1-346) [11]
↑49 (1-173) [5]
↑98 (1-346) [11]
↑49 (1-173) [5]
↑98 (1-346) [11]
↑49 (1-173) [5]
↑98 (1-346) [11]
Modificada de Kearon et al.2
Tabla 6. Resumen de las recomendaciones del tratamiento del TEV según la ACCP 9.ª ed.2
Factor de riesgo
TVP proximal EP
TV distal
TEV
Riesgo hemorrágico*
Duración
INR
Cirugía
3 meses
2-3
Transitorio. No quirúrgico
3 meses
2-3
Bajo o moderado
Extendida*
2-3
Alto
3 meses**
2-3
FR transitorio
3 meses
2-3
No provocada
3 meses
2-3
Cáncer
Extendida (HBPM)
No provocada (1.ª o recurrente)
Como sintomática
TEV incidental
2-3
*Grado de recomendación 2B (se sugiere).
**Grado de recomendación 1B (se recomienda).
Tabla 7. Riesgo de recurrencia TEV después de interrumpir la anticoagulación que justifica una recomendación fuerte o débil de parar
la anticoagulación a los 3 meses o de mantener la anticoagulación indefinida en pacientes con una TVP proximal o un EP no provocados21
Riesgo de TEV recurrente sin anticoagular (%)
Bajo riesgo hemorrágico
1.er año
5 años
Riesgo hemorrágico medio
5 años
1.er año
Efecto sobre la mortalidad
de la anticoagulación a 5 años
Recomendación
<9
<3
<18
<6
Cualquier incremento
Fuerte para 3 meses
9-24
3-8
18-33
6-11
Reducción 0-0,5%
Débil para 3 meses
24-39
8-13
33-48
11-16
Reducción 0,5-1%
Débil para indefinido
>39
>13
>48
>16
Reducción > 1%
Fuerte para indefinido
Modificada de Kearon et al.21
Tabla 8. Estudios clínicos con los DOAC vs placebo en el tratamiento ampliado del TEV
Estudio
DOAC
Reducción recurrencia TEV (%)
Hemorragia grave (%)
Activo
Placebo
Hemorragia grave o HNGCR (%)
Activo
Placebo
HRa o RRb (IC95%)
RE-SONATE22
Dabigatrán 150 mg bid
92
0,3
0
5,3
1,8
a
EINSTEIN Ext23
Rivaroxabán 20 mg qd
82
0,7
0
6,0
1,2
a
Apixabán 5 mg bid
80
0,1
0,5
4,3
2,7
b
Apixabán 2,5 mg bid
81
0,2
AMPLIFY Ext24
HR, cociente de riesgos; RR, riesgo relativo; HNGCR, hemorragia no grave clínicamente relevante.
71
3,2
2,92 (1,52-5,60)
5,19 (2,3-11,7)
1,62 (0,96-2,73)
1,20 (0,69-2,10)
b
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
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72
Ponencias
Estratificación del riesgo, integrando biología y clínica
Vanessa Roldán1, Francisco Marín2
1
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital Universitario Morales Meseguer. Murcia. 2Servicio de Cardiología. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. Murcia. IMIB.
Universidad de Murcia
Introducción
fielmente la vida real, ya que los pacientes que entran en un ensayo
son cuidadosamente escogidos y el seguimiento es más estrecho. En
este sentido, se ha confirmado cómo en una cohorte de pacientes con
FA bajo tratamiento anticoagulante oral de la vida real, los valores de
troponina, en este caso T ultrasensible, fueron predictores de eventos
cardiovasculares y mortalidad, mejorando la capacidad predictiva de
las escalas de riesgo8.
La fibrilación auricular (FA) es la arritmia cardiaca más frecuente,
y está asociada a una gran morbimorbilidad1. La prevalencia de la
FA aumenta con la edad, afectando aproximadamente al 10% de los
sujetos mayores de 80 años2. Además, estos pacientes tienen una alta
incidencia de otras complicaciones cardiovasculares, sobre todo síndrome coronario agudo y muerte vascular, por la coexistencia de otros
factores de riesgo cardiovascular como son la hipertensión arterial o
la diabetes mellitus3.
La anticoagulación oral (ACO) es muy eficaz en la reducción
del riesgo tromboembólico en la FA así como la mortalidad4. Para
ayudar a la toma decisiones respecto a la tromboprofilaxis de estos
pacientes, se han desarrollado varios esquemas de estratificación del
riesgo utilizando factores de riesgo clínicos. Actualmente es la escala CHA2DS2-VASc (añade un punto por la presencia de enfermedad
vascular, edad entre 65-74 y sexo femenino, y dobla la puntuación de
la edad superior a 75 años) la recomendada por la guía de manejo de
la FA de la Sociedad Europea de Cardiología. Junto a ella, la misma
Sociedad recomienda el uso de la escala HAS-BLED (1 punto por
la presencia de hipertensión arterial no controlada, edad superior a
65 años, antecedentes de ictus, antecedentes de sangrado, INR lábil,
insuficiencia renal o hepática y la toma de fármacos que afecten a la
hemostasia o alcohol) para la estratificación del riesgo hemorrágico
asociado a la ACO5.
Sin embargo, el poder discriminatorio de estas escalas clínicas
sigue siendo moderado, y es ahí donde la medida de distintos biomarcadores sanguíneos que abarquen diferentes aspectos fisiopatológicos
de la FA podría jugar un excelente papel en la mejora de la estratificación del riesgo de estos pacientes.
Péptidos natriuréticos
Los péptidos natriúreticos tipo B (BNP) y la porción N-terminal de la
prohormona (NT-proBNP) son sintetizados por los miocitos, principalmente en el ventrículo izquierdo, en respuesta a un elevado estrés
de pared ventricular, por lo que se han propuesto como un marcador
de disfunción del ventrículo izquierdo9. De igual forma, un subestudio
del ensayo RE-LY6 y otro del ARISTOTLE10 vuelven a demostrar que
los valores de NT-proBNP eran predictivos de nuevos eventos tromboembólicos así como de mortalidad cardiovascular, tras ajustar por
los factores de riesgo clínico y mejorando la capacidad predictiva de
estos. Dichos resultados se confirman en un estudio de pacientes con
FA anticoagulados de la vida real, en el que NT-proBNP fue predictivo de nuevo episodio isquémico y mejoraba de forma significativa
la capacidad predictiva de la escala CHA2SDS2-VASc para el ictus y
la mortalidad11.
Marcadores inflamatorios
Se ha descrito un estado proinflamatorio en asociación con el estado
protrombótico descrito en la FA12. La proteína C reactiva (PCR) es
el biomarcador inflamatorio más utilizado. Se sintetiza en el hígado
como un reactante de fase aguda. En la población del ensayo SPAF III
(Stroke prevention in Atrial Fibrillation III) se mostró el valor predictivo de la PCR para la mortalidad global y un combinado entre ictus
isquémico, infarto agudo de miocardio y muerte vascular13.
El marcador proinflamatorio que mejor se ha relacionado con la FA
es la interleucina 6, una citocina circulante producida por monocitos,
macrófagos, linfocitos T y células endoteliales, que puede producir un
estado protrombótico14. Un reciente estudio de nuestro grupo ha sido el
primero en demostrar que valores elevados de interleucina 6 tienen un
valor pronóstico añadido y complementario a las escalas de estratificación de riesgo utilizadas en la FA, pudiendo dicho marcador utilizarse
para redefinir el riesgo en la FA más allá de la estratificación clínica8.
Biomarcadores cardiacos
Daño miocárdico
Las troponinas cardiacas son proteínas contráctiles de los cardiomiocitos que se liberan durante la necrosis miocárdica, y por lo tanto
son biomarcadores sensibles y específicos de lesión miocárdica. Un
subestudio del ensayo RE-LY (dabigatrán vs warfarina en la prevención del ictus en FA) demostró que en pacientes con FA y factores
de riesgo para ictus, se podía detectar la presencia de TnI, cuya elevación se asociaba a un mayor riesgo de ictus y mortalidad. Además, la concentración de TnI mejoraba la capacidad predictiva de las
escalas CHADS2 y CHA2DS2-VASc de muerte cardiovascular6. De
forma similar, dichos resultados se confirmaban en el ensayo ARISTOTLE (apixabán vs warfarina en la prevención del ictus en FA)7. Sin
embargo, los datos obtenidos de los ensayos clínicos pueden no reflejar
Marcadores de hipercoagulabilidad
Se ha descrito un estado hipercoagulable en paciente con FA, cumpliendo los tres brazos de la famosa tríada de Virchow: cambios en el
73
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
flujo (evidenciado por la estasia sanguínea en la aurícula), en la pared
vascular (dilatación auricular progresiva, daño endotelial y edema e
infiltración fibroelástica de la matriz extracelular) y en los componentes sanguíneos (marcadores de hipercoagulabilidad, función plaquetaria y fibrinólisis)15.
El dímero D (un producto de la degradación de la fibrina y un
marcador de trombogénesis) ha demostrado su valor pronóstico en
predecir eventos tromboembólicos en pacientes con FA, incluso bajo
tratamiento anticoagulante oral16,17, aunque dichos resultados son controvertidos, ya que en una larga cohorte de pacientes con FA anticoagulados, el dímero D no se asoció a ningún evento adverso18. En sendos
subestudios de los ensayos RE-LY y ARISTOTLE, se ha descrito una
asociación entre el dímero D y el riesgo de ictus, muerte cardiovascular
y sangrado independientemente de los factores de riesgo clínicos19.
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Marcadores de daño endotelial
El factor von Willebrand (fvW) es el marcador mejor caracterizado y
más ligado a pronóstico en pacientes con FA15. El fvW es un biomarcador de disfunción/daño endotelial y su elevación plasmática se ha
observado en enfermedades inflamatorias y ateroscleróticas reflejando
el daño en el endotelio. En el ensayo SPAF III se mostró una asociación independiente del fvW con los factores de riesgo tromboembólico
clínicos en pacientes con FA, y cómo dicha concentración fue predictiva para un nuevo episodio trombótico o vascular20. Posteriormente, en
una larga cohorte de pacientes consecutivos con FA bajo tratamiento
anticoagulante oral, se ha visto que el fvW es predictor de nuevos eventos cardiovasculares, mortalidad y sangrado, pudiendo usarse dicho
biomarcador para mejorar la capacidad predictiva tanto de las escalas
trombóticas como de sangrado18.
Conclusiones
Los biomarcadores pueden ser útiles a la hora de reestratificar el riesgo
con las clásicas escalas de riesgo clínicas, identificando pacientes de
alto riesgo trombótico. También son útiles para un mejor conocimiento
de la fisiopatología de la FA y de sus complicaciones. Sin embargo, es
importante tener en cuenta que las actuales guías de manejo clínico de
estos pacientes van dirigidas a la identificación del paciente de bajo
riesgo que no necesita terapia antitrombótica, en vez del paciente de
alto riesgo.
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74
Ponencias
Optimización del tratamiento anticoagulante oral en el anciano
José Mateo Arranz
Unitat d’Hemostàsia i Trombosi. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Barcelona
Introducción
datos de pacientes ancianos o subanálisis en función de la edad, lo que
permite extraer información de este tipo de pacientes.
En los últimos años se han publicado diversos ensayos clínicos
que incluyen más de 25.000 pacientes, aunque no en todos los casos
se muestran los resultados en pacientes con más de 75 años, por lo
que no se incluyen15-25.
En la Tabla 1 se recogen los ensayos clínicos que han evaluado
ACOD y que separan los pacientes por edad. Se muestran los que
en el momento de la inclusión tenían 75 años o más. En algunos
estudios no se ofrecían datos separados por edad, por lo que no se
han incluido.
La prevalencia del tromboembolismo venoso y arterial se incrementa
notablemente con la edad1,2. En los individuos de entre 80 y 90 años
el riesgo de ictus relacionado con fibrilación auricular (FA) también
se incrementa con la edad. En el estudio Framingham, el 23,5% de
los ictus en mayores de 80 podía atribuirse a fibrilación auricular3.
La edad superior a 75 años se considera como factor de riesgo en
los esquemas de estratificación de riesgo embólico. Por ejemplo,
en la puntación CHA2DS2-VASc los mayores de 75 años reciben
2 puntos sobre un máximo de 94,5. La prevalencia de otros factores
de riesgo, como la hipertensión, diabetes e insuficiencia cardiaca 2,
es mayor también en ancianos. Por otra parte, el envejecimiento se
considera como uno de los factores de riesgo más importantes y
más prevalentes en el tromboembolismo venoso (TEV)1,6. Adicionalmente, los factores de riesgo convencionales, las neoplasias o
la presencia de comorbilidades en ancianos incrementan el riesgo
de TEV y de hemorragia que pueden complicar y dificultar el tratamiento anticoagulante.
Los anticoagulantes como las heparinas y los antagonistas de la
vitamina K (AVK) se mantienen como los pilares del tratamiento y
la prevención del TEV y de la embolia en pacientes con FA, aunque
presentan limitaciones importantes7,8.
En los últimos años se han desarrollado una nueva clase de fármacos anticoagulantes con acción inhibidora directa sobre factores
de la coagulación activados (ACOD), que representan una alternativa a los AVK y en algunos casos a las heparinas. Son fármacos
que no precisan de cofactores para realizar su efecto, son activos
vía oral, no precisan monitorización rutinaria y sus dosis son fijas,
con algún ajuste dependiendo de la edad o del filtrado glomerular.
Existe un amplio desarrollo clínico de tres inhibidores del factor
Xa, (apixabán, edoxabán y rivaroxabán) y de un inhibidor de la
trombina (dabigatrán)9,10. Aunque representan una alternativa a los
anticoagulantes clásicos, su perfil de eficacia y seguridad no se ha
establecido específicamente en ancianos y persiste cierta preocupación en relación con el riesgo de hemorragia en ancianos tratados
con ACOD1,10,11.
Los factores de riesgo que se proponen son la presencia habitual un
índice de masa corporal bajo en pacientes frágiles y muy ancianos, la
alteración muscular, grasa, proporción de agua y la frecuencia elevada
de deterioro de la función renal1,11.
Recientemente se han publicado trabajos que sugieren un elevado
riesgo de hemorragia con ACOD en ancianos12-14.
No se han realizado hasta la fecha ensayos clínicos aleatorizados
específicamente en ancianos que comparen los ACOD con los AVK
o heparinas en esta población de pacientes, aunque los ensayos clínicos principales de la mayoría de los estudios en este ámbito incluyen
ACOD en ancianos (edad ≥ 75 años)
Los ACOD no producen un incremento de la hemorragia mayor (HM)
o no mayor clínicamente relevante (HCR). En la Tabla 2 se muestran
los diferentes datos separados por anticoagulante. Están considerados
globalmente los estudios que evaluaban los fármacos en fibrilación
auricular o en tromboembolismo venoso, dado que lo que interesa
mostrar es la tasa de hemorragias a partir de una determinada edad
por el hecho de utilizar el fármaco. De manera global, la tasa combinada de hemorragia mayor más hemorragia no mayor clínicamente relevante es del 5,71% en pacientes tratados con ACOD frente al
6,33% en pacientes que recibían anticoagulación convencional (OR =
0,90; IC95% 0,82-0,9). No se apreció un exceso de hemorragia en los
estudios que solo evaluaban tromboembolismo venoso comparado con
el tratamiento convencional26.
En cuanto al riesgo de ictus o embolia sistémica, fueron significativamente inferior de manera global (2,94% contra 4,13%; OR =
0,70; IC95% 0,62-0,80).
También se observa un menor riesgo de TEV recurrente o muerte
relacionada con TEV (3,31% vs 6,05%; OR = 0,53; IC95% 0,27-0,77).
Efectos según ACOD de manera individual
En las Tablas 2-4 se desglosan los datos obtenidos para cada tipo de
anticoagulante, aunque debido a que la población que se incluyó era
diferente y los diseños diferentes, no se pueden realizar comparaciones
entre los diferentes fármacos26.
Rivaroxabán
En ancianos no se ha observado un incremento de la HM o HCR
(4,51% contra 4,54%; OR = 1,18; IC95% 0,64-2,19). En cuanto a la
eficacia, no fue inferior a la terapia convencional en ancianos, pero
sí en el tratamiento y profilaxis del TEV o muerte relacionada con
el TEV.
75
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Tabla 1. Características de los ensayos clínicos principales con ACOD en fibrilación auricular y en tromboembolismo venoso en los pacientes
con más de 75 años
Ensayo
Intervención
Control
Grupo ACOD
(edad ≥ 75 a)
Grupo control
(edad ≥ 75 a)
Edad (mediana)
ACOD/comparador
Hombres (%)
ACOD/comparador
Seguimiento
Fibrilación auricular
ROCKET-AF
Rivaroxabán
Warfarina
3.082
3.082
73/73
60,3/60,3
590 días
ARISTOTLE
Apixabán
Warfarina
2.743
2.752
70/70
64,5/65
1,8 años
AVERROES
Apixabán
Aspirina 81-321 mg/d
909
983
70/70
58/59
1,1 años
RE-LY
Dabigatrán
Warfarina
4.828
2.360
71,4/71,6
63,8/63,3
2,0 años
ENGAGE-AF
Edoxabán
Warfarina
5.654
2.820
72/72
61,2/62,5
2,8 años
Tromboembolismo venoso
EINSTEIN DVT
Rivaroxabán
Enoxaparina+AVK
215
225
55,8/56,4
57,4/56,3
3, 6, 12 m
EINSTEIN PE
Rivaroxabán
Enoxaparina+AVK
441
402
57,9/57,5
54,1/51,7
3, 6, 12 m
AMPLIFY
Apixabán
Enoxaparina+warfarina
389
360
57,2/56,7
58,3/59,1
6m
HOKUSAI
Edoxabán
Enoxaparina+warfarina
560
544
57,9/55,9
57,3/57,2
3-12 m
EINSTEIN Ext
Rivaroxabán
Placebo
89
99
58,8/57,1
73,1/74,2
6-12 m
AMPLIFY Ext
Apixabán
Placebo
220
109
56,4/57,1
58,0/56,5
12 m
RE-MEDY
Dabigatrán
Warfarina
140
119
55,4/53,9
60,9/61,1
6-36 m
Tabla 2. Pacientes de más de 75 años: hemorragia mayor o hemorragia clínicamente relevante en fibrilación auricular y tromboembolismo venoso
ACOD
Eventos
Control
Total
%
Eventos
OR (IC95%)
Total
%
Rivaroxabán
241
5.346
4,51
243
5.347
4,54
1,18 (0,64-2,19)
Apixabán
177
3.451
5,13
248
3.376
7,35
0,80 (0,43-1,51)
Dabigatrán
450
4.828
9,32
206
2.360
8,73
1,07 (0,90-1,28)
Edoxabán
264
6.214
4,25
218
3.364
6,48
0,64 (0,53-0,77)
1.132
19.839
5,71
915
14.447
6,33
0,90 (0,82-0,90)
Total
Tabla 3. Pacientes de más de 75 años en estudios de pacientes con fibrilación auricular no valvular: ictus o embolia sistémica
ACOD
Eventos
Control
Total
%
Eventos
OR (IC95%)
Total
%
Rivaroxabán
125
3.082
4,06
154
3.082
5,00
0,80 (0,63-1,02)
Apixabán
99
3.652
2,71
175
3.753
4,66
0,57 (0,44-0,73)
Dabigatrán
156
4.828
3,23
101
2.360
4,28
0,75 (0,59-0,96)
Edoxabán
126
5.654
2,23
65
2.820
2,30
0,97 (0,71-1,31)
Total
506
17.216
2,94
495
11.997
4,13
0,70 (0,62-0,80)
Tabla 4. Pacientes de más de 75 años en estudios de pacientes con tromboembolismo venoso
ACOD
Eventos
Control
Total
%
Eventos
OR (IC95%)
Total
%
Rivaroxabán
76
1.829
4,16
136
1.875
7,25
0,55 (0,35-0,87)
Apixabán
7
398
1,76
13
370
3,51
0,50 (0,20-1,29)
Dabigatrán
0
140
0,00
0
119
0,00
NE
Edoxabán
14
560
2,50
27
544
4,96
0,49 (0,26-0,95)
Total
97
2.927
3,31
176
2.908
6,05
0,53 (0,27-0,77)
76
Ponencias
Apixabán
El análisis de apixabán y rivaroxabán en ancianos tampoco ha
mostrado exceso de sangrado con el uso de estos fármacos27,28.
Las razones que se esgrimen para sugerir el exceso de riesgo de
sangrado en estos pacientes son el deterioro de la función renal, el bajo
peso, las interacciones medicamentosas y la no disponibilidad rutinaria
de pruebas de laboratorio para monitorizar el nivel de los ACOD1,11.
Tampoco se dispone de información clara sobre cuáles son los niveles
plasmáticos óptimos de eficacia y seguridad, ni en qué momento en
relación con la dosis debe realizarse el muestreo.
Prácticamente todos los artículos que refieren aumento de sangrado en ancianos incluyen individuos con comorbilidades, especialmente
insuficiencia renal12,13, pero la mayoría son estudios observacionales
o casos aislados. Es posible que la edad no sea un factor determinante
en sí, sino las comorbilidades que asocia.
El riesgo de HM o HCR no fue diferente con apixabán (5,13% contra
7,35%; OR = 0,80; IC 95% 0,42-1,51). El riesgo de ictus o embolia
sistémica se reducía en ancianos tratados con apixabán respecto a warfarina (OR = 0,57; IC95% 0,44-0,73). El TEV recurrente o muerte por
TEV fue igual o inferior que el tratamiento clásico.
Dabigatrán
La HM o la HCR fue similar con dabigatrán que con tratamiento
convencional (9,32% contra 8,73%; OR = 1,07; IC95% 0,90-1,28).
Dabigatrán resultó más efectivo en la prevención del ictus o embolia
sistémica en ancianos (3,2% contra 4,3%; OR = 0,75; IC95% 0,580,96). No se ha podido realizar análisis en tromboembolismo venoso
por la escasa información en pacientes ancianos.
Implicaciones prácticas
Edoxabán
El beneficio del tratamiento antitrombótico en ancianos está claramente establecido, incluidos los pacientes en los que existe un riesgo elevado de caídas o de sangrado7,8. Los análisis por separado de
los pacientes ancianos en un metaanálisis reciente26 sugieren que los
ACOD serían más efectivos que los anticoagulantes convencionales
en esta población. La edad avanzada no debería ser por sí sola una
contraindicación de los ACOD. En la mayoría de fármacos se produce
un ajuste debido a la edad. Por ejemplo, apixabán se reduce a la mitad
(2,5 mg/12 h v.o.) en pacientes con alguna comorbilidad asociada a
la edad (dos o más de las siguientes: edad ≥ 80 años, peso ≤ 60 kg o
creatinina sérica ≥ 1,5 mL/dL2. También se recomienda una dosis inferior de dabigatrán (110 mg/12 h v.o.) en Europa en los pacientes con
edad ≥ 80 años, aunque la FDA no recomienda ajuste de dosis por la
edad2,29. Rivaroxabán tampoco precisa ajuste de dosis solo por el hecho
de envejecer, sí se recomienda si el filtrado glomerular disminuye por
debajo de 30 mL/min/1,73 m2 2,29.
Existen algunos datos publicados sobre la práctica en la vida
real fuera de los ensayos clínicos. En Estados Unidos, la FDA ha
realizado un seguimiento estrecho de las hemorragias en pacientes
tratados con dabigatrán y no ha encontrado ningún factor no reconocido o con una frecuencia superior a la que se halló en los ensayos
clínicos30. Asimismo, una cohorte amplia de pacientes daneses mostraba datos similares31. Tampoco se observó un exceso de sangrado
en una cohorte de pacientes daneses que eran anticoagulados por
primera vez32.
Estos datos no contradicen la idea de que se debe ser muy cuidadoso a la hora de prescribir ACOD en ancianos con otras comorbilidades,
en especial si presentan insuficiencia renal o bajo peso. Serían deseables ensayos clínicos prospectivos con ACOD en pacientes ancianos.
En cuanto a los datos de edoxabán, el perfil de seguridad en ancianos
es favorable. La HM o la HCR fue inferior en pacientes que recibieron edoxabán (4,25% contra 6,48%; OR = 0,64; IC95% 0,53-0,77).
En cuanto a la eficacia en prevención del ictus o embolia sistémica
en ancianos los datos fueron similares (2,23% contra 2,30%; OR =
0,97; IC95% 0,71-1,31). En TEV sí que muestra un perfil de eficacia
superior al tratamiento convencional (2,50% contra 4,96%; OR = 0,49;
IC95% 0,26-0,95).
De manera global, los datos obtenidos de los ensayos clínicos principales en pacientes ancianos (≥75 años) muestran que los ACOD no
producen un incremento de la HM o HCR respecto al tratamiento
convencional, si acaso una leve disminución del riesgo. Sí que parecen mostrar una disminución del riesgo de ictus o embolia sistémica
en ancianos con FA y también son más efectivos en la reducción del
riesgo de TEV o de la muerte relacionada con TEV que el tratamiento
convencional. No parece haber diferencias remarcables entre los diferentes ACOD, aunque algunos pueden mostrar un perfil más favorable
según la indicación o según el perfil de riesgo hemorrágico o trombótico concreto de cada paciente.
Preocupación sobre el sangrado
Existen publicaciones recientes que remarcan una cierta preocupación sobre la seguridad en ancianos de los ACOD12-14. Se ha sugerido que podrían causar más complicaciones hemorrágicas y más
hemorragia con riesgo vital o fatal en pacientes con edad avanzada12,13. En un registro neozelandés y australiano se identificaron 78
episodios de sangrado en pacientes tratados con dabigatrán. La edad
fue uno de los parámetros más importantes. Dos tercios tenían más
de 80 años y el 58% mostraban un deterioro de la función renal
moderado o severo13. Se ha argumentado que los hallazgos de los
ensayos clínicos más relevantes no son extrapolables a poblaciones
más ancianas, aunque un reciente metaanálisis muestra que no se
aprecia un exceso de sangrando con los ACOD ni con dabigatrán
específicamente26.
Los datos también muestran que los ACOD son significativamente
más efectivos en esta población.
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78
Ponencias
Patología cerebrovascular aguda, del ictus a la hemorragia
Jaime Masjuan Vallejo
Servicio de Neurología. Hospital Universitario Ramón y Cajal. Madrid
venosa o tratamiento endovascular) así como para poder ofrecer los
mejores cuidados a las hemorragias intracraneales.
El tratamiento de reperfusión con tPA intravenoso dentro de las
primeras 4-5 horas se ha convertido en una rutina en nuestras unidades
de ictus. El beneficio que proporciona es muy significativo, prácticamente doblando la posibilidad de que un paciente sea independiente
a los 3 meses. Además, para aquellos pacientes que no respondan a
lo anterior o no se les pueda administrar disponemos del tratamiento
endovascular. Este puede realizarse dentro de las 8 primeras horas
del infarto cerebral y la técnica más utilizada en la actualidad es la
trombectomía mecánica.
Las hemorragias cerebrales también se benefician de una atención urgente neurológica, en especial con el control de la hipertensión arterial. Aunque desgraciadamente el ensayo clínico con factor
VII no demostró beneficio clínico ni hay ensayos clínicos que hayan
demostrado la utilidad del complejo de protrombina en hemorragias
por AVK. Es por esto que el pronóstico de las mismas sigue siendo
muy malo. Los anticoagulantes de acción directa proporcionan una
gran ventaja respecto a los AVK al producir un 50% menos de hemorragias intracraneales.
El ictus es uno de los principales problemas sociosanitarios de España.
Es la primera causa de muerte en la mujer española pero además es la
primera causa de dependencia y la segunda de demencia tras la enfermedad de Alzheimer. Estas dos características unidas al progresivo
envejecimiento de la población y a que los ictus están aumentando
en pacientes en edad laboral hacen que debamos poner todo nuestro
empeño en su prevención. El control de la hipertensión arterial así
como la utilización de anticoagulantes en la fibrilación auricular con
riesgo de ictus unido siempre a la modificación de los hábitos de vida
deben ser las líneas maestras de su prevención.
La atención urgente al ictus ha cambiado radicalmente en la última
década. De ser unos pacientes que eran atendidos los últimos han pasado a ser una emergencia vital al mismo nivel que los politraumatismos
o el síndrome coronario agudo, donde la rapidez en la actuación y la
capacitación profesional son las claves para poder salvar la vida o
devolverle la independencia a un paciente.
Las Unidades de Ictus han traído consigo una auténtica revolución
en esta atención creando el sistema sanitario Código Ictus, que permite
que los pacientes lleguen rápidamente a un hospital capacitado para
aplicar las técnicas más novedosas de reperfusión (trombólisis intra-
79
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Plaquetas y endotelio
Coordinadoras: María Teresa Santos. Instituto de Investigación Sanitaria La Fe. Hospital Universitario y Politécnico La Fe. Valencia
Maribel Díaz-Ricart. Servicio de Hemoterapia y Hemostasia. Hospital Clínic. Barcelona
La hemostasia y la trombosis son fenómenos complejos en los que es necesaria la cooperación del endotelio, las células sanguíneas,
los factores plasmáticos de la coagulación, el flujo en la sangre y otros factores reológicos. A su vez, cada uno de estos aspectos
individuales son de por sí complejos y tenemos un largo camino por delante para comprender del todo los aspectos biológicos,
bioquímicos y clínicos que los determinan y, más aun, su interrelación.
El contenido de este simposio trata de actualizar aspectos analíticos de la función plaquetaria como la aplicación de los nuevos sistemas
microfluídicos, presentar avances en los sistemas de señalización de las plaquetas activadas revisando el papel de la acetilación de proteínas y
revisar las herramientas clínicas disponibles para la evaluación de la patología hemorrágica. También hay que tener en cuenta las singularidades
de la hemostasia y la trombosis en las distintas etapas de la vida, lo que añade un nivel de complejidad adicional al tema. En este simposio
también se tratará sobre distintos aspectos distintivos de la funcionalidad plaquetaria y hemostasia en el periodo neonatal.
Específicamente, la primera ponencia “Microfluidic assessment of platelet function” será presentada por el Dr. Di Paola, del
Department of Pediatrics, Hemophilia and Thrombosis Center de la Universidad de Colorado. El uso de sistemas microfluídicos para
la evaluación de la función plaquetaria intenta acercarse más que los sistemas estáticos a la fisiopatología ya que incluye el efecto
del flujo sobre la función. Este sistema es de potencial aplicabilidad clínica debido a la utilización de pequeñas cantidades de sangre
y dispositivos más reproductibles que las cámaras de flujo que hasta ahora conocemos.
La segunda ponencia, a cargo del Dr. Moscardó y colaboradores del IIS La Fe y el Centro de Investigación del Hospital Universitario y Politécnico La Fe de Valencia, titulada “Acetilación de proteínas en las plaquetas: un nuevo mecanismo de señalización
con implicaciones terapéuticas”, pone al día el conocimiento sobre la acetilación de proteínas no histonas en general y particularmente en las plaquetas. La acetilación como modificación postraduccional de proteínas en las plaquetas podría constituir un nuevo
mecanismo de señalización intracelular, en la actualidad muy poco explorado, pero con potencialidad para desvelar nuevas dianas
farmacológicas para el tratamiento antiplaquetario.
La ponencia “Herramientas para la evaluación del sangrado (BAT)” del Dr. Cesar y colaboradores, del Servicio de Hematología y Hemoterapia del Hospital Ramon y Cajal de Madrid, incluye los conceptos esenciales a tener en cuenta para distinguir entre
distintos tipos de sangrado en los pacientes, haciendo referencia especial a los aspectos clínicos y destacando la importancia de la
realización de una buena anamnesis del paciente. Para ello, recomienda el uso de cuestionarios clínicos estandarizados, destacando
el recientemente publicado por la ISTH/SSC como paso previo esencial al proceso de evaluación diagnóstica del paciente en el
laboratorio de hemostasia primaria. Desgraciadamente, el Dr. Jesús Cesar nos ha dejado el pasado 24 de agosto después de una brillante trayectoria personal, científica y clínica. La Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia siempre le recordará con respeto,
aprecio y gratitud por su gran dedicación a la Sociedad, su siempre amable disponibilidad a contribuir con sus conocimientos y su
talante humano cordial que favorecía la amistad con compañeros y colegas, por lo que siempre será recordado.
Pero la vida y la ciencia tienen que seguir, y aunque las ideas científicas sobre el tema de la ponencia del Dr. Cesar y colaboradores
están reflejadas en el suplemento del congreso, la ponencia sobre sangrado será impartida por el presidente del Comité Científico del
Congreso de la SETH, el Dr. Ginés Escolar, que generosamente ha aceptado hacerlo aun con tan poco tiempo por delante para prepararlo.
El simposio se cierra con la ponencia “Funcionalidad plaquetaria y hemostasia en el periodo neonatal: mecanismos reguladores y
potenciales implicaciones clínicas” de la Dra. Ferrer Marín y colaboradores, del Hospital Universitario Morales Meseguer de Murcia. Los
autores hacen una interesante revisión sobre la agregación, adhesión, secreción y mecanismos de señalización hasta ahora conocidos en
las plaquetas de los neonatos, distinguiendo además las singularidades de reactividad plaquetaria entre neonatos a término, neonatos pretérmino y personas adultas. Las plaquetas de neonatos a término presentan reducción de la agregación plaquetaria y niveles reducidos de
algunos receptores de membrana como GPIIbIIIa, PAR1, PAR4 y receptores adrenérgicos respecto a las de los adultos, y niveles normales
de otros receptores. En cambio, las plaquetas de los neonatos a término presentan una mayor adhesividad plaquetaria que las de los adultos,
lo que, en opinión de los autores, podría justificar el que los neonatos a término no tengan una hemostasia global alterada. Los neonatos
pretérmino presentan una reducción de la reactividad plaquetaria, tanto en la agregación como en la adhesión, respecto de los neonatos a
término, diferencias que se mantienen durante días o semanas, respectivamente. Aunque los estudios sobre los mecanismos de transducción
de señales que determinan la singularidad en la respuesta de las plaquetas de neonatos son escasos, parece que además en los receptores
hay alguna diferencia en la señalización vía proteínas G. Además de por la importancia clínica de los estudios de la reactividad plaquetaria
en neonatos, los autores sugieren que estos podrían ser de utilidad para identificar nuevas dianas terapéuticas.
Las coordinadoras de este simposio deseamos agradecer la valiosa colaboración de todos los ponentes y su amable participación.
80
Ponencias
Microfluidic assessment of platelet function
Jorge Di Paola
Pediatrics and Genetics. University of Colorado Anschutz Medical Campus. Denver (USA)
for the analysis of hemostatic function under a wide range of shear
stresses with low blood volume requirements. To date, this technology
has been primarily used in the basic science setting to study the interactions between platelet signaling pathways, receptor-ligand binding,
and hemodynamics, often in conjunction with coagulation. Multiple
options for the patterning of prothrombotic substrates and proteins
on microfluidic devices provide the versatility needed for accurate
simulations of vascular injury, allowing for further elucidation of
normal hemostatic pathways. Furthermore, strategic arrangement of
membrane-based devices to control flow of soluble pro- or anti-hemostatic factors has advanced our knowledge of the role of these factors in normal hemostasis and thrombus formation. For example, this
approach led to the demonstration that both flux-dependent thrombin concentration and wall shear rate regulate fibrin polymerization
and deposition under flow. A similar method was used to show that
ADP-induced platelet aggregation under flow is directly proportional
to the agonist flux.
Many standardized in vitro assays exist to allow for the purposes of analyzing platelet-function in suspected bleeding disorders or
to monitor antiplatelet therapy. These include platelet aggregometry,
flow cytometry evaluation of surface activation markers, electron microscopic evaluation of platelet spreading, clot retraction, and Western blot
analysis of platelet signaling protein phosphorylation. Many of these,
however, lack true physiologic relevance due to their static nature that
does not allow for certain interactions, such as that of GP1bα and VWF,
which have primary significance under shear stress. It can be argued
that biologically representative assays must include a component of
flow, since disorders of bleeding and thrombosis are modulated in many
cases by flow-dependent mechanisms.
Our presentation will provide a summary of the recent contributions of microfluidics for clinical applications in hemostasis and
thrombosis from our laboratory and others, and will focus on the
unique opportunities offered by microfluidic devices to add a flowbased component to current hemostatic evaluations, particularly platelets, in patients with bleeding and thrombotic disorders.
Assessment of platelet function and coagulation under flow conditions
in which the presence of wall shear stress mimics in vivo interactions between blood components and the vessel wall, can improve the
traditional static assays used to evaluate of patients with suspected
hemorrhagic or thrombotic disorders. Among the available flow-based
assays, microfluidic devices require the smallest blood volume and
provide the highest throughput. These devices can yield essential
information regarding homeostatic regulation of platelet activation
and subsequent engagement of the coagulation cascade leading to
fibrin formation. Emerging data suggest microfluidics may also reveal
consistent patterns of hemostatic or thrombotic pathology, and may
aid in assessing and monitoring patient-specific effects of coagulation-modifying therapies.
Hemostasis occurs when a combination of cellular, soluble, and
structural factors interact in a coordinated response at a site of vascular injury to stem blood loss. Alterations in the normal regulation
of this process, whether in the setting of a pro-thrombotic state or
bleeding tendency, create significant clinical pathology. Currently,
assessment of patients with disorders of hemostasis involves a multifaceted evaluation of the various components of clot formation including coagulation factors, platelets, and ancillary thrombotic and lytic
proteins. Activity assays for specific coagulation factors and adjuvant
proteins, as well as various platelet function tests, are available to
evaluate components separately. In an effort to measure many or all of
the components of the hemostatic system in concert, so called “global
assays” have been developed such as calibrated automated thrombogram (CAT) and thromboelastography (TEG). Rational use of these
assays can yield a fairly thorough representation of a patient’s hemostatic potential. However, the static nature of these assays neglects the
effect of blood flow and the contribution of endothelium on hemostasis. While platelet adhesion and aggregation and von Willebrand factor (VWF) are shear stress-dependent; coagulation, fibrin formation,
and fibrinolysis are shear rate dependent. Endothelial cells promote
and inhibit clot formation by many mechanisms including secretion of
soluble agents (VWF, PGI2, ADPases) and surface bound molecules
(thrombomodulin, P- and E-selectin).
The development of parallel-plate assays over 40 years ago, which
was an open, single pass system to complement cone-plate viscometers, allowed for assessment of the interactions of blood cells and vessel wall components under physiologic flow conditions. Flow assays
designed to evaluate platelet rolling, adhesion, and aggregation on
immobilized ligands have provided critical insights into shear-dependent receptor-ligand interactions These devices were never translated
into clinical assays, in part, because of relatively large blood volume
requirements and low throughput.
Microfluidics addresses some of the limitations of larger flow
chambers by offering disposable and reproducible devices that allow
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82
Ponencias
Acetilación de proteínas en las plaquetas: un nuevo mecanismo de señalización
con implicaciones terapéuticas
Antonio Moscardó, María Teresa Santos, Ana Latorre, Juana Vallés
Instituto de Investigación Sanitaria La Fe y Centro de Investigación. Hospital Universitario y Politécnico La Fe. Valencia
Agradecimientos: Este trabajo se ha realizado en parte con fondos del Instituto de Investigaciones Sanitarias Carlos III y Fondos FEDER [PI13/00016] y la Red Cardiovascular [RD12/0042/0003]
etc. De esta forma, las distintas modificaciones que pueden sufrir las
proteínas potencialmente podrían dan lugar a más de un millón de
variantes diferentes, frente a los aproximadamente 20.000 genes codificantes de proteínas que encontramos en el genoma humano. Por tanto,
esta interacción entre genotipo y fenotipo, reflejada en las distintas
modificaciones postraduccionales que puede sufrir una proteína, supone un prometedor campo de estudio en la enfermedad cardiovascular.
Las plaquetas juegan un papel central en la hemostasia y la trombosis, pero también participan en la inflamación, la aterosclerosis, el
cáncer, etc.1 Para poder realizar estas variadas funciones las plaquetas
disponen de una gran cantidad de receptores en su superficie que les
permiten responder a múltiples estímulos. Tras la activación plaquetaria, se da lugar a las distintas respuestas funcionales de las plaquetas:
adhesión, agregación, liberación de gránulos, reclutamiento, exposición de fosfolípidos procoagulantes o retracción del coágulo, entre
otras. Uno de los componentes plaquetarios más destacados para la
comunicación con su entorno es a través de la liberación del contenido
de sus gránulos que forma parte del secretoma plaquetario. Los gránulos a contienen sustancias como proteínas adhesivas, factores de la
coagulación, factores fibrinolíticos, proteasas y antiproteasas, factores
de crecimiento y mitogénicos, citocinas, proteínas antimicrobiales,
glicoproteínas de membrana y otras1. De esta forma, a través de la
liberación del contenido de sus componentes granulares, las plaquetas
pueden participar en múltiples procesos fisiopatológicos. La integración de estas diversas respuestas requiere de un complejo sistema de
transmisión de señales, entre los que la fosforilación de proteínas tanto
en tirosina2 como en serina/treonina3,4, los movimientos de calcio y la
reorganización del citoesqueleto ocupan un lugar central5.
Aunque sin duda el componente genético juega un papel importante en el desarrollo de las enfermedades cardiovasculares, el avance
en la predicción del riesgo cardiovascular ofrecido por marcadores
genéticos puede considerarse modesto en el mejor de los casos6. Como
enfermedad con causas genéticas concretas, la enfermedad cardiovascular está relacionada con alteraciones en múltiples genes, y sus interacciones con diversos factores ambientales. En este sentido, técnicas
como la proteómica o la lipidómica pueden ofrecer una perspectiva
más realista de la situación global de un organismo, integrando genotipo y fenotipo. A su vez, los estudios proteómicos se han centrado en
muchas ocasiones en una simple, aunque extensa, enumeración de las
proteínas presentes en un tipo celular o un compartimento subcelular
determinado7. Estos resultados, aunque muy interesantes, y que han
permitido la identificación de proteínas con papeles importantes no
previamente descritas8, no reflejan la verdadera complejidad subyacente. En este sentido, el estudio de las modificaciones postraduccionales de proteínas puede aportar una instantánea más acertada de los
procesos que están teniendo lugar en un momento determinado, y de
las complejas interacciones entre genotipo y fenotipo.
Las modificaciones postraduccionales de proteínas tienen lugar
una vez sintetizada la proteína, y constituyen un mecanismo esencial
de regulación de su actividad biológica. Pueden tener lugar tanto por
mecanismos enzimáticos como no enzimáticos. Estas modificaciones
pueden ser de naturaleza muy variada, e incluyen oxidaciones, glicosilaciones, proteólisis, unión de moléculas lipídicas, unión covalente de
proteínas pequeñas como la ubiquitina, fosforilaciones, acetilaciones,
Regulación de la acetilación de proteínas
por acetilasas y deacetilasas
La acetilación de una proteína puede tener lugar en distintos aminoácidos. En el campo de la enfermedad cardiovascular, la acetilación más
estudiada es sin lugar a dudas la inducida por el tratamiento con aspirina sobre la ciclooxigenasa 1 (COX-1) en las plaquetas9,10, la cual tiene
lugar en la Ser529, y provoca la inhibición irreversible de la síntesis de
tromboxano A2 al bloquear el acceso al centro activo de su substrato,
el ácido araquidónico11. Por tanto, la acetilación de la COX-1 por la
aspirina es una modificación postraduccional inducida por mecanismos
no enzimáticos.
Por su parte, la acetilación regulada por mecanismos enzimáticos
más ampliamente estudiada es la acetilación de residuos de lisina en
las proteínas12. El nivel de acetilación de los residuos de lisina en las
proteínas está determinado por el equilibrio entre las enzimas que
añaden grupos acetilos, las histonas acetiltransferasas (HAT) y las que
eliminan el grupo acetilo de los residuos de lisina, las enzimas con
actividad deacetilasa13 (HDAC) (Figura 1).
Las HAT catalizan la transferencia de un grupo acetilo del acetil-CoA al grupo Ɛ-NH2 de la cadena lateral de aminoácidos de los
residuos de lisina. Resulta interesante que el donante del grupo acetilo
para esta reacción es el acetil-CoA, molécula clave en la regulación del
metabolismo, lo que podría justificar, como veremos más adelante, el
papel que parece jugar la acetilación de proteínas en la regulación del
metabolismo. Las HAT pueden clasificarse según su localización subcelular, siendo las de clase A nucleares y las de clase B citoplasmáticas.
Entre las más estudiadas se encuentran las familias GNAT, MYST,
p300/CBP y SRC, las cuales presentan diferentes especificidades de
sustrato, regulación, etc.14
Por otro lado, las HDAC se pueden agrupar en dos familias15: las
HDAC clásicas, dependientes de zinc como cofactor, y que incluyen a
las clases I, II y IV, y las sirtuinas o clase III, dependientes del cofactor
NAD+ 16,17. De nuevo una molécula central en la regulación del metabolismo como es el NAD+ aparece como clave para la regulación de
las HDAC. En los seres humanos de momento se ha demostrado la
presencia de 18 enzimas deacetilasas: las histonas deacetilasas de la
HDAC1 a la HDAC11 y las sirtuinas de la SIRT1 a la SIRT7. Todas
ellas son responsables de la eliminación de los grupos acetilo, man-
83
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
factores de transcripción18. Por su parte, las HDAC eliminan los grupos
acetilo, incrementando la carga positiva de las histonas y por tanto la
afinidad de estas por el ADN. Este incremento de la unión condensa
la estructura del ADN, impidiendo la transcripción.
teniendo el equilibrio de la acetilación en los residuos de lisina de las
distintas proteínas. Como veremos más adelante, un aspecto importante de las sirtuinas es su localización subcelular. Mientras que la
mayoría de las HDAC clásicas, a excepción de HDAC6, se encuentran
preferentemente en el núcleo, por el contrario, las sirtuinas se encuentran ampliamente representadas en el citoplasma y especialmente en
las mitocondrias, lo que sugiere un papel más allá del control de la
acetilación de histonas.
Entre las proteínas en las que la acetilación se ha demostrado que
influye en su función, las más estudiadas son las histonas, aunque
como veremos a continuación también otras proteínas pueden estar
reguladas por procesos de acetilación/deacetilación.
Acetilación de proteínas no histonas
En un reciente estudio empleando un enfoque proteómico, Choudhary
et al.19 identificaron 3.500 puntos de acetilación en aproximadamente
1.700 proteínas distintas en hepatocitos, lo que ha dado en denominarse
el “acetiloma” de la célula. Además, la acetilación de proteínas parece
ser un fenómeno altamente conservado, lo que pone de manifiesto la
existencia de una presión evolutiva para mantener estos puntos de acetilación20, y apoya la idea de la importancia de esta ruta de modificación
de proteínas. De esta forma, la acetilación de proteínas se ha sugerido
que puede presentar una importancia y complejidad semejante a la
fosforilación de proteínas21,22. Además, debido al intrigante descubrimiento de que en muchas proteínas los puntos de fosforilación y las
lisinas susceptibles de ser acetiladas se encuentran muy próximos, se
ha sugerido que puede existir algún tipo de cooperación o interferencia
entre estas dos vías de transmisión de señales21,23.
Acetilación de histonas
La acetilación de histonas es un proceso ampliamente estudiado y
estrechamente relacionado con la expresión génica, así como con
distintas patologías, como el cáncer18. Las histonas son proteínas de
muy bajo peso molecular, alrededor de las cuales se enrolla el ADN,
dando lugar a la formación de nucleosomas. Las histonas suelen estar
cargadas positivamente debido a los grupos amino presentes en los
residuos de lisina y arginina. Estas cargas positivas afianzan la interacción con las cargas negativas de los grupos fosfato del esqueleto
carbonado del ADN. La acetilación de los grupos amino de las lisinas
neutraliza las cargas positivas de las histonas, convirtiendo las aminas
en amidas y reduciendo así la capacidad de las histonas para unirse
al ADN. Esta reducción de la afinidad de unión favorece una conformación “abierta” de la cromatina y facilita la transcripción genética
de esa región cromosómica permitiendo el acceso a la misma de los
Acetilación de proteínas y metabolismo
La acetilación/deacetilación de histonas, debido a su relación con la expresión génica, se ha relacionado estrechamente con los procesos oncológicos, lo que ha llevado al desarrollo de distintos activadores e inhibidores
de acetilasas y deacetilasas como terapia oncológica24. Por su parte, la acetilación de proteínas no histonas parece estar especialmente relacionada
con el control del metabolismo energético de la célula25,26, aunque también
aparece implicada en otros procesos como el cáncer o el envejecimiento24.
Son varias las pruebas que sugieren que la acetilación de proteínas juega
un papel clave en el control metabólico energético. En primer lugar, estudios proteómicos han mostrado que la práctica totalidad de las enzimas
implicadas en el metabolismo energético, incluyendo la glicólisis, gluconeogénesis, metabolismo del glucógeno, ciclo de Krebbs, metabolismo
de ácidos grasos y ciclo de la urea, son susceptibles de acetilarse, dependiendo de las condiciones metabólicas19,25. Además, su nivel de acetilación
varía de acuerdo con el estado energético de la célula, lo que en algunos
casos se ha demostrado que afecta a la función de la enzima19. En segundo
lugar, y tal como se ha indicado más arriba, las enzimas encargadas de
regular la acetilación de proteínas (especialmente HAT y sirtuinas) son
dependientes para su función de las concentraciones de dos metabolitos
que son claves para la regulación del metabolismo energético, como son
el acetil-CoA y el balance NADH/NAD+. De esta forma, HAT y sirtuinas
están muy bien situadas para actuar como sensores del estado energético
de la célula, regulando a su vez la acetilación de enzimas, modificando
su función y adaptándose a las necesidades energéticas de la célula. En
tercer lugar, diversos estudios sobre el papel de la restricción calórica en
el proceso de envejecimiento celular han sugerido que la acetilación de
proteínas, y especialmente su regulación por las sirtuinas, puede ser el
punto clave que relacione el metabolismo con el envejecimiento27, lo que
ha llevado a denominar en algunos casos a las sirtuinas como las moléculas de la juventud27,28. Por último, la actividad de las sirtuinas parece
estar alterada en trastornos metabólicos como la obesidad, la diabetes o
el síndrome metabólico29, sugiriéndose que la modulación de su actividad
podría ser una diana interesante para el tratamiento de estas patologías29.
Figura 1. Regulación de la acetilación en lisina de proteínas. La acetilación
de proteínas en aminoácidos lisina (Lys) está regulada por la actividad
contrapuesta de dos tipos de enzima, las histona deacetilasas (HDAC) y
las histonas acetiltranferasas (HAT). Las HAT introducen en la proteína un
grupo acetilo proveniente del acetil-CoA, molécula central del metabolismo
energético, dando como producto CoA. Por su parte, las HDAC son las
encargadas de eliminar el grupo acetilo de una proteína, dando lugar a una
molécula de acetato. Las HDAC pueden clasificarse en dos grandes familias,
clásicas y sirtuinas, atendiendo a los cofactores que requieren. Las HDAC
requieren como cofactor Zn2+. Por su parte, las sirtuinas requieren nicotinamida
adenina difosfato en su forma oxidada (NAD+), dando lugar a NADH, también
ambas moléculas claves en el metabolismo energético de la célula.
84
Ponencias
Acetilación de proteínas en plaquetas
cómo la activación farmacológica de la calreticulín transacetilasa, un
tipo de HAT, inhibe la activación plaquetaria a través de la acetilación
y activación de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) en las plaquetas. Sin embargo, no se conocen los mecanismos que regulan la
actividad de las HAT en las plaquetas.
Pese a su aparente sencillez, las plaquetas son “células” sorprendentemente complejas, capaces de participar no solo en la hemostasia
y la trombosis como se pensaba tradicionalmente, sino que también
pueden participar en otros procesos incluyendo el cáncer, la inflamación, la respuesta inmune, la angiogénesis, etc. Para poder realizar
estas variadas funciones, las plaquetas poseen un complejo sistema de
transmisión de señales, en el cual la fosforilación de proteínas, tanto en
tirosina3 como en serina/treonina4, juega un papel clave. Por otra parte,
aunque es un tema escasamente estudiado, el metabolismo energético
de las plaquetas es importante para su función30. De hecho, es bien
conocido que en la diabetes se produce una hiperfunción plaquetaria,
por causas no bien determinadas, que pueden incluir alteraciones de la
función mitocondrial. En este sentido, un estudio reciente demostró la
importancia de la función mitocondrial en las plaquetas sobre su participación en la generación de trombina31. Sin embargo, no se conoce
nada sobre el papel que pueden tener las acetilaciones de proteínas en
la relación entre el metabolismo energético y la función plaquetaria,
por lo que constituye un interesante campo de investigación futura.
Las plaquetas, que en condiciones normales circulan en forma
de disco, cuando se adhieren y activan sufren un drástico cambio de
forma, con extensión de pseudópodos. En este proceso, las reorganizaciones de proteínas del citoesqueleto y de la estructura de microtúbulos juegan un papel clave. Una de estas proteínas es la a-tubulina,
la cual tiene la capacidad de polimerizarse formando largas fibras, que
contribuyen en la emisión de pseudópodos, proceso importante en la
adhesión y agregación plaquetaria32,33. En otros tipos celulares, la polimerización de la a-tubulina se ha sugerido que puede estar regulada
por procesos de acetilación/deacetilación controlados preferentemente
por la HDAC634. En un estudio reciente, Sadoul et al.35 demostraron que en ratones carentes de HDAC6 la función plaquetaria estaba
reducida, produciéndose una reducción de la adhesión de plaquetas
al colágeno. Estos resultados se relacionaron con una incrementada
acetilación de a-tubulina, lo que sugería que la acetilación de a-tubulina regulada por HDAC6 podría participar en la función plaquetaria35. Estos resultados fueron posteriormente confirmados por Aslan et
al.36, que mostraron que el control de la acetilación de a-tubulina por
HDAC6 puede contribuir a mantener a las plaquetas en un estado de
reposo. Resultados no publicados de nuestro laboratorio demuestran
que no solo la adhesión, sino también la agregación plaquetaria, pueden estar reguladas por HDAC6, aunque este efecto solo tiene lugar a
bajas concentraciones de agonista (enviado a publicar). Es interesante
que existen tratamientos oncológicos que actúan inhibiendo HDAC6,
como es el caso del panobistat, el cual induce trombocitopenia con
cierta frecuencia37. Este proceso se ha relacionado con la inhibición
de HDAC6 en el megacariocito, lo que estabilizaría el citoesqueleto
dificultando la generación de nuevas plaquetas37.
En lo que respecta al papel de las sirtuinas en las plaquetas, es
muy escasa la información disponible en este momento. Resultados
no publicados de nuestro laboratorio demuestran que las sirtuinas,
especialmente sirt2, tienen un papel muy importante en la función
plaquetaria (enviado a publicar). Son necesarios más estudios para
determinar los mecanismos regulados por las sirtuinas en las plaquetas,
y cómo ejercen su función reguladora.
Por su parte, mucho menos se conoce sobre el papel que puedan
tener las HAT en la función plaquetaria. Kumar et al.38 describieron
Acetilación y aspirina
La acetilación de la COX-1 plaquetaria por la aspirina y el consecuente
bloqueo de la síntesis de tromboxano A2 constituyen la base del beneficio clínico obtenido por el tratamiento con aspirina en la prevención
secundaria de la enfermedad cardiovascular. Sin embargo, ya los primeros trabajos que buscaban cuál era la diana farmacológica de la aspirina encontraron que el tratamiento con aspirina provocaba también la
acetilación de otras proteínas, incluyendo la hemoglobina, la albúmina
o el fibrinógeno39. Posteriormente se describió que la aspirina también
es capaz de acetilar NF-kB, un factor de transcripción, efecto que podría
estar relacionado con su potencial efecto antitumoral40. Más recientemente se ha descrito cómo la aspirina es capaz de acetilar la eNOS en célula
endotelial, produciendo un incremento en la síntesis de óxido nítrico
(NO), efecto que se revierte por la acción de HDAC341. También en plaquetas se ha descrito que la acetilación de eNOS por la aspirina provoca
la síntesis de NO42, aunque no se ha explorado si este proceso puede
estar también regulado por HDAC. Resultados preliminares de nuestro
laboratorio muestran que la aspirina, de forma dependiente de dosis,
provoca la acetilación de múltiples proteínas en las plaquetas (enviado a
publicar). Además, una de estas proteínas la hemos identificado como la
a-tubulina. Todavía hay que explorar cuáles son los efectos funcionales
de la acetilación de estas otras proteínas plaquetarias por la aspirina.
Conclusiones
La acetilación de proteínas no histonas, regulada por el equilibrio entre
las actividades HDAC y HAT, ha emergido recientemente como un
mecanismo de transmisión de señales con un potencial similar a la
fosforilación de proteínas, especialmente relacionado con el control
del metabolismo, aunque también puede participar en muchos otros
procesos. La participación de la acetilación de proteínas en la función
plaquetaria ha sido escasamente explorada, aunque existen datos que
sugieren que pueden tener un importante papel regulador. Sin embargo, numerosas cuestiones permanecen abiertas. ¿Qué procesos están
regulados en las plaquetas por la acetilación de proteínas? ¿Pueden
los procesos de acetilación actuar como nexo entre alteraciones metabólicas y función plaquetaria? ¿Cuál es el papel de la acetilación de
proteínas distintas de COX-1 inducida por la aspirina en las plaquetas?
Con toda seguridad nuevos estudios aportarán interesante información
sobre la participación en las plaquetas de este nuevo mecanismo de
modificación postraduccional de proteínas.
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86
Ponencias
Herramientas para la evaluación del sangrado (BAT)
Jesús M.ª Cesar, A. G. Avello, Carmen Botella, María Caro, Saskia Praska
Servicio de Hematología y Hemoterapia. Hospital Ramón y Cajal. Madrid
Introducción
del factor von Willebrand, una trombopatía, o un defecto en las proteínas
de la coagulación son los diferentes elementos que deben ser tenidos en
mente como candidatos para llegar a un diagnóstico final del problema4.
La existencia de un sangrado patológico es el síntoma que define la
presencia de un trastorno de la hemostasia, es decir, una enfermedad
hemorrágica. Entendemos por enfermedad hemorrágica una situación
anómala que permite a la sangre salir de un lecho vascular no alterado
o que aporta una competencia deficiente ante un daño vascular. La
manera con el que el sangrado puede producirse es variable y no existe
un tipo de hemorragia que sea específico de una enfermedad concreta.
Por ello, la anamnesis es crítica para responder a la pregunta de si sufre
o no el paciente una enfermedad hemorrágica, mientras que la determinación de la entidad responsable resultará de un proceso de evaluación
diagnóstica en el laboratorio. Lo segundo es una tarea que corresponde
al hematólogo, pero la sospecha de una enfermedad hemorrágica suele
generarse a nivel de otros especialistas. Por ello es conveniente que los
médicos de Atención Primaria o los pediatras estén familiarizados con
la anamnesis de este problema. Más importante aún es que se realice
correctamente por los profesionales de Anestesia antes de abordar un
proceso invasivo ya que la analítica del preoperatorio no excluye una
patología hemorrágica1-3. Una vez sospechado el problema, el hematólogo es el más capacitado para enfocarlo y decidir las pruebas más
convenientes para el diagnóstico.
Llegar a un diagnóstico en una enfermedad hemorrágica puede ser
una tarea sencilla cuando el paciente pertenece a una familia con una
anomalía hemorrágica ya conocida, por ejemplo, hemofilia. En estos
casos la principal cuestión es determinar si la intensidad del defecto es
suficiente como para decidir si porta la enfermedad, por ejemplo en los
pacientes con von Willebrand. Sin embargo, en muchas ocasiones no
existen antecedentes familiares y el proceso diagnóstico está abierto
a cualquier posibilidad. Dentro de este escenario existen problemas
hemorrágicos asociados a diferentes patologías intercurrentes donde la
hemorragia es una consecuencia circunstancial, por ejemplo una coagulación intravascular diseminada asociada a una sepsis, y otros donde
la enfermedad hemorrágica es una situación primaria y mantenida en
el tiempo. Esta última condición es la que se abordará en este texto.
Aspectos básicos en la anamnesis de la diátesis
hemorrágica
El primer aspecto es considerar que en muchas ocasiones lo que pueda
deducirse en una anamnesis no tiene alta sensibilidad o especificidad
para asumir o descartar la existencia de una enfermedad hemorrágica.
Un porcentaje estimable de la población tiene sintomatología hemorrágica sin que se pueda encontrar un motivo5,6, y en contraste, muchos
defectos leves de la hemostasia cursan asintomáticos o se ponen de
manifiesto ante eventos que exigen una gran competencia del sistema
como un proceso quirúrgico o un traumatismo7,8. Este solapamiento
complica el descubrir, ante síntomas hemorrágicos leves, la existencia
o no de una enfermedad hemorrágica usando solamente los datos obtenidos en la anamnesis. Con independencia de estas consideraciones, el
interrogatorio debe ser riguroso y con una metodología preestablecida.
Siguiendo esas pautas se debe llegar con una razonable seguridad a la
toma de decisión de continuar o no con un estudio de laboratorio. Hay
diferentes cuestiones que deben ser dilucidadas:
• Si hay, o no, un fracaso de la hemostasia. Existen hemorragias
que son ostensibles pero obedecen a una causa local, mientras
que la presencia de diferentes tipos de sangrado es sugerente de
un problema hemostático.
• Realizar un primer enfoque diagnóstico. Aunque no de forma
patognomónica, las hemorragias que afectan a piel y mucosas se
consideran propias de defectos en la hemostasia primaria y del
factor V, mientras que las hemartrosis y los hematomas musculares son más propios de las hemofilias (también de un defecto
de Fc V). La hemorragia de la ligadura del cordón umbilical o
cerebral se ha asociado con el defecto del factor XIII, así como
la equimosis periorbitaria es más propia de la amiloidosis.
• Historia familiar. Una buena historia familiar, incluyendo posible consanguinidad y género de los afectados, ayuda a establecer el carácter de herencia. En problemas constitucionales de
la hemostasia es habitual que la clínica sea similar en los que
padecen la enfermedad.
• Es imprescindible evaluar problemas generales que se asocian
con una hemostasia deficiente como la insuficiencia renal, la
hepatopatía y especialmente la prescripción de fármacos particularmente anticoagulantes y antiagregantes plaquetarios así
como antiinflamatorios o antidepresivos.
• Cronología del sangrado. Orientará sobre un problema constitucional frente a una enfermedad adquirida.
Fisiopatología de la diátesis hemorrágica
No es el objetivo de este manuscrito realizar una revisión exhaustiva de
las causas de una diátesis hemorrágica, pero sí recordar que esta es el
resultado del fracaso de cualquiera de los eventos que a nivel fisiológico
y bioquímico se han diseñado biológicamente para evitarla. Si se conocen los elementos que intervienen en el proceso hemostático, se pueden
deducir, dado que todo lo que existe es susceptible de fallo, las diferentes
enfermedades que pueden resultar en un sangrado patológico. Un defecto en la vasculatura o en la generación de las fuerzas de fricción por los
hematíes, la trombopenia severa, un colágeno anómalo, una alteración
87
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Esta labor necesita de una metódica que incluya el interrogatorio
de las diferentes posibilidades de sangrado tanto espontáneo como ante
situaciones que ponen a prueba la competencia de la hemostasia. Además, es un requisito imprescindible intentar cuantificar la magnitud del
sangrado. Ha habido diferentes intentos de recoger la sintomatología
hemorrágica de manera sistemática y con una calificación que resultara en una puntuación lo más objetiva posible con independencia del
evaluador. Desde hace más de 30 años se han publicado diferentes
cuestionarios que han abordado este aspecto, ya de manera general o
para cuantificar el sangrado en enfermedades concretas.
Tabla 1. Puntuación asignada a diferentes síntomas de sangrado
Epistaxis
0. Ausente o insignificante
1. Presente
2. Requiere asistencia
3. Requiere trasfusión
Hemorragia cutánea
0. Ausente o insignificante
1. Petequias o equimosis
2. Hematomas
3. Requiere atención médica
Antecedentes del BAT. El BS (bleeding score).
Cuestionarios para la evaluación de la sintomatología
hemorrágica
Sangrado patológico de pequeñas heridas
0. Ausente
1. 1-5 veces por año
2. Necesita atención
3. Precisa trasfusión o cirugía
En los años 1980 y 1982 se publican los resultados de la aplicación de
un cuestionario9 en las familias afectas de enfermedad de von Willebrand (EVW) de las islas Aland10 y entre portadores de hemofilia11.
El cuestionario consta de 10 preguntas con respuestas binarias (SÍ/
NO), de las que se obtiene un cociente a partir del que se calcula un
“Indicador” y un “Predictor” que permiten conocer la sensibilidad y
la especificidad de cada variable y del cuestionario.
En 1995 se publica un cuestionario de recogida de datos en pacientes con sospecha de un proceso hemorrágico12. Es el resultado de un
consenso de expertos que evaluaron la idoneidad de 10 preguntas para
la identificación de enfermedades hemorrágicas, aunque el grado de
acuerdo fue muy bajo13. El cuestionario propone puntuaciones desde
un mínimo de 1 (familiares afectados) hasta un máximo de 5 (sangrado cutáneo o postexodoncias). Su aplicación permite discriminar con
cierta efectividad entre individuos sanos y aquellos con una enfermedad hemorrágica ya reconocida, con el importante sesgo de que
estos últimos, conocedores de su problema, tienden a enfatizar el peso
de sus síntomas. El cuestionario se comporta mal cuando se aplica a
sujetos que ya se han etiquetado de tener una probable enfermedad
hemorrágica para discernir si son o no portadores de esta patología.
Cuestionarios similares se elaboran también para estimar severidad, no
diagnóstico, de la púrpura trombopénica idiopática en niños14, pacientes con deficiencia de factor XI15, afectados del síndrome de Quebec16
y evaluación preoperatoria3.
Entre las diátesis hemorrágicas, la EVW es la de mayor incidencia17. El diagnóstico, especialmente entre los pacientes con sintomatología muy leve, es complicado por la variabilidad de los niveles de
proteína en plasma en un mismo individuo o entre el grupo O y otros
grupos sanguíneos, y por las dudas para establecer un punto de corte
de normalidad. En esta tesitura, surge la conveniencia de elaborar un
cuestionario (Tabla 1) para evaluar el número y la intensidad de síntomas hemorrágicos en estos enfermos y estudiar su capacidad para
discriminar pacientes de no afectados18. Se proponen puntuaciones
desde 0 (ausencia) a 3 (presencia con severidad) de diferentes síntomas
hemorrágicos o complicaciones de sangrado después de una maniobra
invasiva. La suma total de cada una de las variables se considera como
la “puntuación de sangrado” (Bleeding Score/BS) de cada paciente. Una variante al cuestionario evalúa las mismas categorías pero
ampliando la franja ausencia/severidad de 0 a 4 puntos y asignando
un valor negativo (-1) ante la ausencia de un sangrado esperado en una
situación de agresión hemostática como la cirugía19. La aplicación del
BS en el estudio europeo MCMDM-1VWD (Molecular and Clinical
Hemorragia de cavidad oral
0. Ausente o insignificante
1. Presente
2. Necesita atención médica
3. Necesita cirugía o trasfusión
Hemorragia digestiva
0. Ausente
1. Presente
2. Necesita atención médica
3. Necesita cirugía o trasfusión
Hemorragia posparto
0. Insignificante
1. Necesita terapia con preparados de hierro
2. Precisa sutura o trasfusión
3. Requiere histerectomía
Hematomas musculares o hemartros
0. Ausente
1. Presente
2. Necesita atención médica
3. Precisa trasfusión
Hemorragia después de exodoncia (valorar la más severa)
0. Ausente
1. Presente
2. Necesita sutura
3. Precisa trasfusión
Hemorragia después de cirugía
0. Insignificante
1. Presente
2. Necesita sutura o reintervención
3. Precisa trasfusión
Menorragia
0. Ausente o insignificante
1. Presente
2. Necesita consulta, anticonceptivos o terapia con preparados de hierro
3. Precisa histerectomía o trasfusión
Existe una versión posterior que amplía la severidad de 0 a 4 y que barema como -1 la ausencia
de sangrado en una situación donde se espera que ocurra (cirugía en general o posparto).
88
Ponencias
Tabla 2. Sensibilidad y especificidad de la aplicación del BS en el diagnóstico de la EVW
Criterio
Sensibilidad (%)
Especificidad (%)
VPP (%)
VPN (%)
Cualitativo (>2 síntomas)
50,0
99,5
52,1
99,5
Cuantitativo (puntuación >3 en varones o >5 en mujeres)
64,2
99,1
41,1
99,6
Ambos
45,2
100
100
99,5
Evaluación de los 5 indicadores de mayor potencia
80,1
91,6
8,9
99,8
VPP, valor predictivo positivo; VPN, valor predictivo negativo. Modificado de Rodeghiero F et al.
tionario de 14 preguntas referentes a sangrado (Figura 1B) y que se
corresponden con las recomendadas por el SSC/ISTH22.
Hay una serie de consideraciones que deben tenerse en mente
sobre el BAT. La primera es que el cuestionario (BS) constituye una
herramienta básica que tiene tres aspectos muy positivos, es fácil de
recordar, es sencilla y, sobre todo, tiene la capacidad de cuantificar
de forma muy objetiva la sintomatología hemorrágica. Es verdad que
no recoge todas las posibilidades de sangrado, pero también es cierto
que, aplicada a patologías donde predominan las hemorragias mucocutáneas, es muy completo. Hay que tener presente algunos aspectos
prácticos de interés. Uno de ellos es que está poco estudiado en infantes. Esto es particularmente importante porque el cuestionario gana
poder discriminativo cuantas más variables puedan ser cubiertas, algo
que se va incrementando a lo largo de la vida, dado que la oportunidad
de sangrar es mayor. Otro tema a considerar es que deja lagunas de
especificidad y sensibilidad que serán difíciles de resolver8. No es un
Markers for the Diagnosis and Management of Type 1 von Willebrand
Disease) concluyó que el cuestionario podría tener una gran utilidad
para el diagnóstico y seguimiento de pacientes con EVW. El uso del
BS en portadores obligatorios de la EVW (al menos un descendiente
y un familiar de primer grado con la EVW) ofrece unos resultados
muy fiables para considerar la existencia de la enfermedad (Tabla 2).
Un reciente estudio20 realizado en afectados de EVW demostró
una buena capacidad del cuestionario para discriminar entre pacientes con niveles límite de actividad (factor von Willebrand cofactor de
ristocetina –FVWCoR– entre 30-55 U/dl) y aquellos con enfermedad
clínicamente relevante (FVWCoR <30 U/dl) según criterios de consenso internacionales21. A pesar de ello, hasta un 5% de los pacientes con
valores límite tuvo episodios hemorrágicos, lo que representó un 17%
del total de sangrados. El BS tuvo una correlación lineal e inversa a los
niveles de FVWCoR, hasta una puntuación de 3,5 a partir de la cual
la frecuencia de sangrado y la actividad de FVW no guardan relación.
Además, una alta puntuación del cuestionario puede identificar a los
pacientes con alta probabilidad de recidiva hemorrágica y aconsejar
una propuesta de tratamiento.
BAT (Bleeding Assessment tool): instrumentación
evaluadora de la sintomatología hemorrágica
Con el criterio de que el diagnóstico de la patología hemorrágica es
un proceso bifásico –1) considerar o no la enfermedad y 2) definirla
en el laboratorio–, el Scientific and Standardization Committee de la
International Society on Thrombosis and Haemostasis (SSC/ISTH)
propone en el año 2010 la estandarización del cuestionario mencionado anteriormente para ser empleado en la evaluación inicial de los
pacientes con sospecha de padecer un trastorno hemorrágico22. La entidad considera probado que esta estrategia es de gran utilidad cuando
se aplica a la EVW y propone que su aplicación puede ampliarse para
discriminar pacientes que pudieran estar afectados por cualquier otra
enfermedad hemorrágica. La combinación del BS y unos criterios bien
definidos para su aplicación se denomina BAT (Bleeding Assessment
Tool) y establece líneas de corte para considerar o desestimar la presencia de un trastorno hemorrágico. La recomendación para ponderar la hemorragia puede encontrarse y descargarse en la información
suplementaria del trabajo original22. La propuesta de procesamiento
de la información (BAT) tiene el acceso a través de la página web
(Figura 1A) de la ISTH/SSC (https:bh.rockefeller.edu/ISTH-BATR/).
La página de entrada se autodefine como: “Un instrumento de recogida
de datos a través de la red que permite al investigador administrar un
cuestionario de historia hemorrágica desde cualquier equipo conectado”. En ella se puede encontrar un manual de instrucciones (versión
2.0) para facilitar la introducción y procesamiento de datos de un cues-
Figura 1. Instrumentación en pantalla de la aplicación BAT. A. Página de
entrada. B. Cuestionario.
89
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
gran problema buscar una enfermedad hemorrágica en sujetos donde
no se encontrará ninguna deficiencia en la hemostasia. Esto puede
representar un grupo importante5,6 y también un coste no despreciable
pero llevará un sello de una buena práctica. Obviamente no se estudia la hemostasia si no hay clínica, pero parece prudente hacerlo en
familiares directos asintomáticos de sujetos diagnosticados de una
enfermedad hemorrágica de transmisión autosómica, como la EVW.
Este es un tema de debate especialmente ante una cirugía, donde la
realización de una buena anamnesis se recomienda, por su utilidad,
desde hace más de 30 años1-3. Conviene recordar que en ausencia de
esta herramienta, la recogida de la historia clínica puede ser inadecuada, pero también que algunos pacientes tienden a trivializar su
sintomatología, que algunas situaciones pueden ser adquiridas en un
momento reciente, como una trombopenia o un inhibidor de la coagulación, y finalmente queremos insistir en que muchas deficiencias
leves cursan asintomáticas y es razonable al menos intentar detectarlas
en posibles portadores.
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90
Ponencias
Funcionalidad plaquetaria y hemostasia en el periodo neonatal: mecanismos reguladores
y potenciales implicaciones clínicas
Francisca Ferrer Marín, Eva Caparrós Pérez, José Miguel Torregrosa, José Rivera
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital Universitario Morales-Meseguer. Murcia. Centro Regional de Hemodonación. IMIB. Murcia
Introducción
nuestro laboratorio aportan datos que sugieren un potencial control
de ADRA2A por microRNA.
Experimentos de inmunobloting han mostrado también un descenso en los receptores de trombina (PAR1 y PAR4) en las plaquetas
neonatales6. Se desconoce si, junto a las diferencias en los niveles de
expresión de ADRA2A y PAR 1/4, existen también diferencias en la
traducción de señal mediada por estos receptores que contribuyan a la
pobre respuesta de las plaquetas neonatales a dichos agonistas.
Respecto a otros activadores plaquetarios, como tromboxano
(TxA2)2 o colágeno3,7, no se han observado diferencias entre neonatos
y adultos en el número de receptores o en su afinidad. Igualmente,
niveles de fosfolípidos esenciales en la membrana plaquetaria como
fosfatidilcolina, fosfatidilserina o la composición de ácidos grasos no
se modifican durante el desarrollo8.
Existe una amplia evidencia científica de que una reactividad plaquetaria elevada incrementa el riesgo de sufrir enfermedad trombótica
arterial, y a la inversa, una función plaquetaria disminuida favorece la
tendencia a padecer trastornos hemorrágicos. Las irregularidades en
la reactividad plaquetaria se han asociado también a patologías tales
como arteriosclerosis, inflamación y cáncer. Se sabe que existen variaciones interindividuales en reactividad plaquetaria entre la población
adulta sana, cuya base molecular y mecanismos genéticos responsables
están pobremente caracterizados.
En las últimas tres décadas múltiples estudios de agregometría (en
plasma rico en plaquetas –PRP– primero, y en sangre total después)
(Figura 1) y de citometría de flujo demostraron de forma consistente
que las plaquetas de los neonatos son hiporreactivas en respuesta a la
mayoría de agonistas (ADP, epinefrina, colágeno, trombina, análogos
del tromboxano [U46619])1-3 haciendo de ellas un modelo idóneo donde investigar los mecanismos reguladores de la reactividad plaquetaria
e identificar nuevas dianas terapéuticas.
A pesar de lo atractivo de la aproximación, los mecanismos responsables de las diferencias en la funcionalidad plaquetaria entre
neonatos y adultos están pobremente caracterizados. Los estudios de
funcionalidad plaquetaria neonatal tienen la dificultad añadida de conseguir suficientes volúmenes de sangre. Como resultado, la mayoría
de los estudios de funcionalidad plaquetaria neonatal se han realizado
sobre muestras extraídas en cordón umbilical (CU) y, menos frecuentemente, sobre muestras obtenidas directamente del neonato.
Función y adhesión plaquetaria en el periodo neonatal
Aunque las plaquetas de los neonatos son hiporreactivas en respuesta a la mayoría de agonistas1,3,9 (Figura 1), el grado de agregación
es específico de cada agonista, siendo las mayores diferencias con
epinefrina y ADP y las menores con trombina8. Como se mencionó,
los mecanismos responsables de estas diferencias no están totalmente
claros, pero se ha sugerido que la hiporrespuesta a la epinefrina es
probablemente debida a la disminución de sus receptores ADRA2A1,
la respuesta reducida a colágeno podría reflejar alteraciones en el pro-
Figura 1
Receptores y características de la membrana
plaquetaria neonatal
El estudio de receptores de proteínas adhesivas mediante citometría
de flujo ha mostrado que los niveles de GPIIb-IIIa (integrina aIIbb3:
receptor de fibrinógeno, fibronectina y FVW) son un 15-20% más
bajos en neonatos que en niños más mayores o adultos, mientras que
los niveles de GPIb-IX-V (receptor de VWF) son similares en todos
los grupos de edad4,5.
Respecto a los receptores de membrana de los agonistas plaquetarios, un único estudio llevado a cabo con el ligando radiactivo DHE
demostró que los neonatos tenían en sus plaquetas la mitad de receptores adrenérgicos-α2A (ADRA2A) que los adultos1, lo que podría
justificar su pobre respuesta a la epinefrina. A pesar de que este estudio
fue realizado hace más de tres décadas, ningún otro estudio posterior
ha valorado si las diferencias en la expresión de ADRA2A entre las
plaquetas de neonato o adulto se deben a diferencias en los niveles
de expresión del mRNA de ADRA2A o, por el contrario, son consecuencia de diferencias en la traducción. Estudios preliminares de
Figura
Resultados de agregometría plaquetaria por impedancia usando
Figura1. 2a
el sistema Multiplate® siguiendo la estimulación con TRAP, ADP, colágeno o
ristocetina. Las barras grises representan muestras de cordón umbilical (cord
blood, CB) y las barras negras sangre periférica de adulto (peripheral-blood, PB).
91
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
dependen solamente del medio (plasma/sangre) donde circulan, sino
que son intrínsecas a las plaquetas20.
Confirmando estos hallazgos, nuestro grupo demostró la contribución
de1la disfunción plaquetaria neonatal per se en ensayos donde
Figura
Figura 1
comparamos
plaquetas aisladas de CU y resuspendidas en sangre de
adulto deplecionada de plaquetas, con plaquetas de adulto resuspendidas en sangre de cordón deplecionada de plaquetas. Nuestros estudios
demostraron que las plaquetas de adulto agregaban significativamente
mejor que las plaquetas de CU independientemente de la sangre en la
que fueran resuspendidas. Las plaquetas de adulto dentro de la sangre
CU acortaban significativamente los tiempos de oclusión-EPI en comparación con las plaquetas de neonato17 (Figura 2).
Mientras las diferencias en adhesión plaquetaria persisten durante
al menos 10 semanas, las diferencias en la reactividad y en los tiempos
de sangrado desaparecen aproximadamente en el día 10-14 de vida11.
ceso de movilización de calcio3,7, y la disminución en la respuesta a
TxA2 parece depender de una alteración en las vías de señalización
debajo de su receptor2,10.
A pesar de esta hiporreactividad plaquetaria, no existen evidencias
clínicas de que los neonatos a término tengan una hemostasia global
alterada. De hecho, los neonatos presentan tiempos de sangrado más
cortos que los adultos11. De forma similar, estudios de hemostasia
primaria global usando el Analizador de Función Plaquetaria (PFA100) encontraron tiempos de oclusión más cortos en sangre de CU
que en sangre periférica de adultos12. Este hallazgo aparentemente
paradójico de una hemostasia normal o incluso incrementada en el
contexto de una reactividad plaquetaria disminuida se ha atribuido a
factores en la sangre neonatal que incrementan la adherencia de las
plaquetas a la pared del vaso (como son el mayor hematocrito, el más
alto volumen corpuscular medio, los mayores niveles de factor von
Willebrand –FWV–13 y la predominancia de multímeros de alto peso
molecular en la sangre neonatal)14. Las concentraciones más altas de
FVW en la sangre neonatal contribuyen a la mayor capacidad de adhesión de las plaquetas neonatales, medida con el Analizador de Cono y
Placa o Sistema Impact (el cual examina la adhesión de las plaquetas
de la sangre total a una placa cubierta sobre una matriz extracelular
sobre condiciones de flujo arterial fisiológico)11. Estos resultados son
consistentes con los estudios sobre el tiempo de sangría y el tiempo
de oclusión del PFA-100 en neonatos. Así, la hiporreactividad de las
plaquetas en recién nacidos a término se entiende hoy en día como
parte de un delicado equilibrio en el sistema hemostático, el cual,
bajo circunstancias normales, podría ser ligeramente hipercoagulable.
En contraste con la pobre respuesta de las plaquetas neonatales a
los agonistas fisiológicos, la aglutinación del PRP neonatal a la ristocetina está incrementada en comparación con el PRP de individuos
adultos15,16. Así, en adultos, la aglutinación inducida por ristocetina
aumenta tras la adición de plasma neonatal15,16. A diferencia de lo que
ocurre en PRP, los estudios de agregación inducida por ristocetina en
sangre total, usando el agregómetro Multiplate® (Dynabite medical,
Munich), no mostraron diferencias respecto al adulto17. Nuestro grupo
fue el primero en validar el uso del Multiplate®, en sangre total neonatal. Este sistema tiene la ventaja de usar volúmenes de sangre muchos
menores (hasta 175 ml para las células mini) que los empleados en un
sistema de agregometría para PRP o para sangre total convencional17.
Figura 2a
Figura 2a
Figura2A.
2b Agregación plaquetaria media (±DE) de plaquetas neonatales (CB-Plt)
Figura
o de adulto (PB-Plt) resuspendidas en sangre deplecionada de plaquetas de
cordón umbilical (cord blood, CB) (barras grises) o sangre periférica de adulto
(peripheral-blood, PB) (barras negras). Las plaquetas de adulto agregan mejor que
las neonatales independientemente de la sangre en la que son resuspendidas, en
respuesta a TRAP, ADP y colágeno. *p<0,001; † p<0,01; ‡ p<0,05.
Figura 2b
Función y adhesión plaquetaria en neonatos pretérmino
Aunque se han realizado pocos estudios sobre fisiología plaquetar en
neonatos pretérmino, precisamente la población con mayor riesgo de
sangrado, los estudios tanto de agregometría por transmisión de luz
(LTA) como de citometría han mostrado que la hiporreactividad de las
plaquetas neonatales es más pronunciada en neonatos pretérmino que
a término, estableciendo una correlacion entre reactividad plaquetaria
y edad gestacional18,19.
Además, dos estudios independientes usando el Impact demostraron que las plaquetas de neonato pretérmino, en comparación con las
de los neonatos a término, tenían disminuida su capacidad de adhesión,
aunque esta aún era superior a la de los adultos20. Es de interés resaltar
que esta menor capacidad de adhesión de las plaquetas de los neonatos
a término sobre los pretérmino no se relacionó con diferencias en los
niveles antigénicos de FVW o de su cofactor de ristocetina (FVW funcional), sugiriendo que las diferencias en la capacidad de adhesión no
Figura 2B. Tiempo de oclusión del PFA-100 siguiendo la estimulación con colágeno
y epinefrina (CT-Epi). Muestras de cordón umbilical (cord blood, CB) (barras grises)
generan tiempos de oclusión más cortos que las muestras de sangre periférica de
adulto periférica de adulto (peripheral-blood, PB) (barras negras). Dentro de cada
tipo de sangre, las plaquetas de neonato (CB-Plt) alargan significativamente los
CT-Epi comparadas con las plaquetas de adulto (PB-Plt). *p<0,05.
92
Ponencias
diferencias de expresión de las proteínas G en plaquetas neonatales
respecto a las de adulto. Los autores de este estudio encontraron diferencias discretas no significativas en los niveles de Gq entre plaquetas
de neonato pretérmino, neonato a término y adulto, sugiriendo que
las alteraciones en la señalización plaquetaria neonatal en respuesta a
TxA2 son debidas a defectos en la actividad GTPasa de la subunidad
a de la proteína Gq10. Ello conllevaría la disminución de la traducción
de señal mediada por la fosfolipasa Cb10. Agonistas que eviten las vías
de activación mediadas por receptor, tales como ionóforo de calcio
o ésteres forbol, producen una activación comparable entre neonato
y adulto3. Datos preliminares de un array de expresión génica entre
plaquetas de neonato y adulto realizado por nuestro grupo sugieren
diferencias en las expresión de proteínas G, más allá de Gaq (la única
estudiada).
Finalmente, no se conoce bien si esta hiporreactividad de las plaquetas neonatales ex vivo tiene repercusión in vivo, en condiciones
de daño vascular, en una disfunción plaquetaria. Solo tres estudios
han evaluado el grado de activación de las plaquetas neonatales in
vivo, por ejemplo, durante el bypass cardiopulmonar, con resultados
contradictorios11,21. In vivo, las plaquetas circulantes son continuamente expuestas tanto a factores adhesivos y/o activadores (fibrinógeno,
ADP, FVW, trombina, TxA2) como a factores inhibidores derivados del
endotelio como el óxido nítrico (NO) y la prostaciclina (PG-I2)22. Es
necesario un equilibrio entre estos dos procesos para evitar desórdenes
tanto de sangrado como de trombosis22. Desafortunadamente, ningún
estudio hasta la fecha ha evaluado en profundidad las vías de inhibición
plaquetaria en este grupo de edad.
Secreción plaquetaria
Potenciales implicaciones en la práctica clínica
Las plaquetas neonatales presentan defectos en la secreción granular
(tanto de gránulos densos como de gránulos a) que no se pueden justificar por diferencias en el número o contenido de sus gránulos, el cual
es semejante a las plaquetas de adulto16. Clásicamente, los defectos
en la secreción plaquetaria se han atribuido a la inmadurez de las vías
de traducción de señales en el neonato23,24.
En los últimos años numerosos estudios han mostrado cómo la
secreción plaquetaria está mediada por el ensamblaje entre proteínas
de la membrana de los gránulos plaquetarios, conocidas como v-SNARE (de vesicular-Soluble NSF Attachment Protein Receptor) o VAMP,
y la membrana plasmática (t-SNARE). En plaquetas este complejo
fusogénico está formado por una v-SNARE (VAMP8) y dos t-SNARE
(SNAP23 y sintaxina-11). Datos preliminares de nuestro grupo sugieren diferencias en los niveles de expresión de algunas de las proteínas
que forman parte de este complejo fusogénico25.
Las plaquetas son los principales efectores de la hemostasia. Una
activación aberrante puede provocar una formación del trombo patológica y, a la inversa, una hiporreactividad puede facilitar desórdenes
hemorrágicos. La elevada prevalencia de los eventos trombóticos y
hemorrágicos en la población general, así como en su elevada morbimortalidad, justifica el abordaje profundo en los mecanismos que
controlan la reactividad plaquetaria, sin cuyo conocimiento previo no
se puede abordar su prevención.
La heterogeneidad en la reactividad plaquetaria no solo se observa
entre neonatos y adultos. La ruptura de una placa de aterosclerosis
puede conducir a la oclusión del vaso por un trombo plaquetario en
unos adultos y no en otros. Las variaciones individuales extremas en
reactividad plaquetaria pueden contribuir a la variación del riesgo y
del pronóstico en la enfermedad vascular isquémica. Las plaquetas
de neonato, intrínsecamente hiporreactivas a la mayoría de agonistas,
constituyen un buen modelo donde investigar los mecanismos que
regulan diferencias en reactividad plaquetaria e identificar nuevas dianas terapéuticas.
El estudio de la función plaquetaria en los neonatos tiene, además,
una alta relevancia clínica en este grupo de población infantil. Los
neonatos pretérmino muestran la incidencia más alta de hemorragia
intraventricular (HIV) que cualquier otro grupo de edad (hasta un 25%
de los recién nacidos <1.500 g)26. Un tercio de estas hemorragias son
fatales, y las no fatales se asocian con secuelas neurológicas graves.
Dado que la mayoría de estas HIV ocurren en neonatos con cifras
de plaquetas normales, históricamente esta alta incidencia de HIV ha
sido atribuida históricamente a, entre otros factores, la inestabilidad
cardiorrespiratoria o cambios en las presiones de perfusión vascular27,
o a la hiporreactividad de las plaquetas neonatales, que también es más
pronunciada en neonatos pretérmino14. Todo ello, junto con la llamada
“inmadurez del sistema hemostático” de los neonatos, ha condicionado
la extendida creencia de que los neonatos trombocitopénicos deberían
ser transfundidos profilácticamente con contajes de plaquetas superiores a los de los adultos, lo que ha contribuido a la amplia variabilidad
existente entre países e instituciones en el manejo transfusional de
los neonatos27.
El aumento del número de trasplantes y el uso de la quimioterapia
intensiva ha condicionado un incremento constante de la demanda
de concentrados de plaquetas, mientras que el número de donantes
de sangre permanece estable, por lo que la disponibilidad de estos
Traducción de señales
Todos los agonistas plaquetarios, salvo el colágeno, inducen activación uniéndose a receptores específicos acoplados a proteínas G.
Las proteínas G son heterotrímeros formados por una subunidad α
(Gα) con GDP unido en situación de reposo, y dos subunidades β/γ
que forman un complejo dimérico indisociable. La subunidad que
define las propiedades básicas de la proteína G heterotrimérica es
la α. Existen cuatro familias de subunidades Gα: Gs, Gi, Gq/G11 y
G12/G13, cada una de las cuales está constituida a su vez por varios
miembros. En plaquetas, las proteínas Gαq son intermediarios de la
traducción de señal para los receptores de TxA2, trombina y ADP
(P2Y1); Gαi2 y Gαz para los de ADP (P2Y12) y epinefrina, respectivamente; y Gαs y Gαi2 para los receptores de prostaciclina.
El papel relevante de las proteínas G se ha evidenciado en modelos
murinos deficientes y en un número reducido de enfermos con déficit
congénito de estas proteínas.
La interacción agonista-receptor provoca el cambio GDP¨GTP
en Ga, su disociación del dúo bg y la subsiguiente interacción de Ga
y bg con sus enzimas efectores (ciclasas, fosfolipasasas, etc.).
A pesar de que todos los agonistas plaquetarios salvo el colágeno
inducen activación uniéndose a receptores específicos acoplados a proteínas G, y de que en plaquetas neonatales solo se ha podido demostrar
menores niveles de receptores de epinefrina y de trombina, únicamente
un estudio, con un número reducido de muestras, ha evaluado si existen
93
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
hemoderivados está empezando a ser un verdadero problema médico
y social. La generación de plaquetas in vivo tras la infusión de progenitores megacariocíticos (MK) generados ex vivo desde células CD34+
de CU se ha planteado como una posible alternativa a la transfusión
de plaquetas tradicional (dependiente de donantes). Recientemente,
se ha publicado el primer ensayo clínico (fase 1) de infusión de progenitores MK generados in vitro desde células progenitoras de CU
en pacientes trombocitopénicos con hemopatías malignas28. Aunque
los resultados relativos a su seguridad son prometedores, no existen
datos sobre su eficacia transfusional. Dado que estas plaquetas serían
fenotípica y genéticamente idénticas a las neonatales, son necesarios
más estudios que investiguen la fisiología plaquetaria neonatal antes
de extender este procedimiento a la práctica clínica en el área de la
medicina transfusional.
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Ponencias
Avances y controversias en hemostasia y trombosis
Coordinadores: Pascual Marco Vera. Servicio de Hematología y Hemoterapia. Hospital General Universitario de Alicante. Alicante
Javier Batlle Fonrodona. Servicio de Hematología y Hemoterapia. Complejo Hospitalario Universitario A Coruña. A Coruña
En una primera intervención, el Dr. Vidal Pérez, de la Unitat de Diagnòstic i Teràpia Molecular, Coagulopaties Congènites, del Banc
de Sang i Teixits, expone la innovadora metodología de secuenciación masiva, dentro de los llamados nuevos sistemas de generación
de secuenciación (Next generation sequencing, NGS). Presenta su experiencia en esta incipiente estrategia que facilita, tanto por su
rapidez como por su eficiencia, los diferentes estudios genéticos. En este caso se centra en la enfermedad de von Willebrand (EVW)
empleando la plataforma Illumina Genome Analyzer, cuyos resultados precisan del uso de diferentes programas de análisis (CLC
Genomics Workbench y VariantStudio), que permiten el alineamiento de las secuencias resultantes frente al genoma humano y el
análisis in silico concurrente. De esta forma se facilita la identificación de las potenciales variantes patogénicas, discriminando las
secuencias pertenecientes al pseudogén e identificando los polimorfismos descritos hasta el momento en diferentes bases de datos
moleculares. Esta metodología es la que se está empleando en el análisis de los pacientes incluidos dentro del proyecto “Perfil clínico
y molecular de pacientes con enfermedad de von Willebrand. Registro español (PCM-EVW-ES)”, cuyo objetivo es el de establecer
un registro nacional para la EVW y en el que participan la mayoría de los grandes hospitales del país, y que se encuentra en su fase
final en el presente momento. Si bien existe todavía un importante desconocimiento de las bases moleculares de la EVW, es evidente
que el futuro pasa por el aprovechamiento de lo que nos ofrecen las nuevas tecnologías de secuenciación masiva.
La segunda presentación, que corre a cargo del Dr. Constantino Martínez, del Servicio de Hematología y Oncología Médica del
Hospital Universitario Morales Meseguer, expone una revisión muy interesante relativa al papel de los microRNA en la regulación
del sistema hemostático. Se trata de un fenómeno detectado en enfermedades oncológicas y es menos conocido en hemostasia y
trombosis. Los microRNA (miRNA) intervienen en prácticamente todos los procesos biológicos, y un aspecto muy prometedor es el
de constituir dianas potenciales de nuevos fármacos. El papel de los miRNA endógenos en la función plaquetaria es en gran medida
desconocido, pero parecen ser útiles como marcadores de reactividad plaquetar frente a determinados fármacos antitrombóticos.
También actúan sobre el fibrinógeno influyendo tanto en trombosis como hemorragia. Su equipo investigador ha observado que
algunos están implicados en el estado de hipercoagulabilidad observado en pacientes con enfermedades autoinmunes. En la actualidad se dispone de evidencia científica muy preliminar, pero cabe señalar el interés de la identificación de miRNA que participan
en la hemostasia y también en descifrar el papel de los miRNA en su regulación, dado que probablemente puede permitir el empleo
de miRNA como herramientas pronósticas, diagnósticas y terapéuticas.
La tercera presentación de este simposio la realiza el Dr. David Jiménez, especialista en Neumología en el Hospital Ramón y
Cajal de Madrid. Expondrá un tema muy clínico, la tromboembolia de pulmón , pero se centrará en aquellos puntos controvertidos
que las guías no resuelven pero que representan un reto en la práctica clínica. La charla se centra en tres puntos: el uso del tratamiento
fibrinolítico en la embolia pulmonar , pero en pacientes estables hemodinámicamente; el uso de los filtros de cava más allá de las
indicaciones ya aceptadas en la literatura, y la duración del tratamiento anticoagulante en la tromboembolia de pulmón. Respecto
a la fibrinólisis deja abierto para la discusión si en los pacientes con estabilidad hemodinámica esta aporta algún beneficio en la
mortalidad, o si realmente es la anticoagulación convencional el tratamiento más adecuado. Los filtros de cava, en pacientes que no
tienen contraindicación para la anticoagulación, han sido probados en algunos ensayos, discutiéndose si el descenso de la mortalidad
se ve compensado por la incidencia de trombosis venosa profunda en miembros inferiores. La duración del tratamiento anticoagulante
es otro reto importante, dándole mucha importancia a la identificación de los factores de riesgo de recurrencia, las tromboembolias
idiopáticas y el posible papel de los nuevos anticoagulantes orales directos en el tratamiento a largo plazo.
La ponencia que cierra el simposio será presentada por la Dra. María Fernanda López, hematóloga del Hospital Teresa Herrera
de A Coruña. Su tema es la reversión de los clásicos y nuevos anticoagulantes. Un asunto sin duda que nos inquieta a todos y de
un enorme interés práctico. En primer lugar analiza los factores de riesgo de sangrado de los diferentes anticoagulantes, incidiendo
en la importancia del buen control en los anticoagulantes clásicos y exponiendo los datos de que disponemos para los nuevos fármacos. Tras esta introducción presenta la reversión por grupos farmacológicos, repasando el efecto del sulfato de protamina en las
diferentes heparinas, y del posible uso del factor VII activado recombinante en la reversión del fondaparinux, y de la avidina para el
idraparinux biotinizado. Respecto al segundo grupo farmacológico, los anticoagulantes antivitamina K y su reversión, la literatura
presenta amplios estudios acerca del uso de la vitamina K, el plasma fresco y los concentrados del complejo protrombínico activado.
95
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Discute el uso estas medidas terapéuticas en relación con el INR, y la situación clínica del paciente respecto al tipo de hemorragia,
sin olvidar el riesgo trombótico asociado a una reversión enérgica especialmente cuando se usa el complejo protrombínico y el
factor VII activado recombinante. Y acaba su presentación con el grupo de los nuevos anticoagulantes orales directos, disponibles
en España: dabigatrán , rivaroxabán y apixabán. Hay pocos datos en la literatura, y la mayoría no se refieren a pacientes reales si
no a voluntarios sanos o modelos animales. Estos estudios muestran la eficacia in vitro o ex vivo de los concentrados de complejo
protrombínico (especialmente en los anti-Xa), factor VII activado, asociado al carbón activado, o la hemodiálisis en el caso del
dabigatrán. La amplia revisión presentada de la literatura promoverá una interesante discusión de la que los asistentes podrán extraer
recomendaciones para la práctica clínica.
Deseamos agradecer la valiosa colaboración de todos los ponentes y su amable aceptación para participar en el simposio. Es
nuestro deseo que genere un amplio y enriquecedor debate participativo entre todos los asistentes.
96
Ponencias
Impacto de la secuenciación masiva en la enfermedad de von Willebrand
Francisco Vidal Pérez, Irene Corrales Insa
Unitat de Diagnòstic i Teràpia Molecular. Coagulopaties Congènites. Banc de Sang i Teixits. Barcelona
Agradecimientos: Es necesaria una especial mención y agradecimiento a todos los profesionales y hospitales integrantes del grupo “Perfil Clínico y Molecular de pacientes con EVW.
Registro Español” (PCM-EVW-ES). Parte del trabajo presentado en esta ponencia ha sido financiado con un proyecto de investigación en salud (PI1201494) del Instituto de Salud Carlos III,
Ministerio de Economía y Competitividad y con un proyecto del programa Baxter Bioscience Grants de Baxter Healthcare Corporation. Agradecemos a la Fundación Privada Catalana de
l’Hemofília su apoyo y confianza en nuestro trabajo.
Avances recientes en las técnicas de secuenciación
Willebrand (VWF) mediante: a) PCR convencionales de los exones y
las regiones intrónicas flanqueantes adaptando la técnica desarrollada
para la secuenciación tradicional9; b) Long Range-PCR (LR-PCR) con
tamaños de entre 5 y 9,5 kb que cubren el 70% del total del locus. La
secuenciación con la plataforma Illumina Genome Analyzer mostró que
ambas estrategias permitían identificar las mutaciones presentes en las
muestras utilizadas como controles. Sin embargo, la estrategia basada en
LR-PCR, además de comportar ciertas dificultades técnicas durante la
amplificación y normalización, identificó nuevas variaciones intrónicas
no descritas como polimorfismos y cuya implicación en la clínica de
los pacientes todavía resultaba difícil de interpretar. Por estos motivos
se optó por la estrategia de PCR cortas para realizar un estudio piloto
para el análisis simultáneo de 40 pacientes con EVW. Con el objetivo
de minimizar los costes, las librerías necesarias se realizaron a partir
de pools de ADN de cinco pacientes y se amplificó el VWF por PCR
convencional a los que se añadió una etiqueta molecular diferente para
cada mezcla de PCR. El análisis de las secuencias obtenidas permitió
la identificación de un número variable de potenciales mutaciones que
fueron validadas y asignadas a cada paciente por secuenciación tradicional11. El abordaje descrito permite reducir los costes de las librerías de
forma significativa, pero tiene el inconveniente de que la combinación
de varios ADN genómicos antes de la amplificación supone la pérdida
de información de los polimorfismos presentes en cada paciente.
Afortunadamente, las tecnologías de preparación de librerías
también han evolucionado significativamente en los últimos años y
existen ahora innovadores enfoques como los basados en la tecnología
de microfluidos12. Estos se han mostrado como una excelente herramienta ya que posibilitan la construcción de librerías individualizadas,
añadiendo una etiqueta molecular a cada muestra a un precio razonable13. Esta alternativa también ha sido explorada en nuestro laboratorio
introduciendo modificaciones en el protocolo original basado en PCR
convencionales. La construcción de librerías es simple y rápida gracias
a un sistema de doble amplificación o PCR de fusión (Figura 1) que
permite la adición simultánea de los índices para discriminar los amplicones derivados de cada paciente. La validación de este protocolo con
muestras previamente caracterizadas demostró una serie de ventajas
evidentes: permite una reducción significativa de material fungible
y de reactivos con la consiguiente reducción de costes; simplifica la
creación de librerías ya que se hace de forma simultánea para cada
ADN durante la amplificación, y evita la necesidad de una posterior
normalización de las muestras. Por contra, requiere de un equipamiento específico para realizar el proceso de amplificación.
Para la adaptación de esta tecnología a la secuenciación del VWF
se optó por el Access Array™ System (Fluidigm Corporation), que
permite 2.304 reacciones de PCR diferentes, por combinación de 48
muestras con 48 combinaciones de primers. Se han diseñado 61 parejas de oligonucleótidos para la amplificación de todos los exones del
A partir del año 2005 se produce una auténtica revolución en las técnicas de secuenciación del ADN con la aparición de las plataformas de
secuenciación masiva o NGS (del término en inglés Next-Generation
Sequencing). Con una capacidad de secuenciación superior en varios
órdenes de magnitud y a un coste muy inferior a la secuenciación tradicional de Sanger representan, sin ninguna duda, un nuevo paradigma
para el análisis genético1,2. Si bien es cierto que las primeras aplicaciones de la NGS estaban muy ligadas a la secuenciación de genomas
completos, durante los últimos años el abanico de aplicaciones se ha
ampliado considerablemente. El interés en aplicaciones diagnósticas
es creciente3-5, incluyendo el análisis de poblaciones afectas de enfermedades causadas por genes grandes y altamente polimórficos como es
el caso de la enfermedad de von Willebrand (EVW)6. Para aprovechar
completamente la capacidad de estas plataformas, cuando el objetivo
se centra en el estudio de un gen o grupo de genes, es necesario estudiar una gran cantidad de muestras simultáneamente y la región de
interés debe ser enriquecida antes de su secuenciación. Asimismo, es
necesario indexar las muestras con un “código de barras” molecular
(secuencias cortas añadidas a los extremos de los fragmentos de ADN
de cada paciente)7. Finalmente, hay que destacar que la reciente aparición de nuevos equipos NGS “de sobremesa”, tales como MiSeq Personal Sequencer, 454 Junior GS o Ion Torrent PGM, más económicos,
con protocolos más sencillos y con un análisis de datos simplificado,
está acelerando la aplicación clínica generalizada de la NGS.
Diagnóstico molecular de la EVW
Durante años el estudio molecular de la EVW se ha limitado a la investigación básica, y su aplicación en la práctica clínica habitual se ha
retrasado significativamente debido al gran tamaño y complejidad del
gen, a que es muy polimórfico y a la existencia de un pseudogén parcial situado en el cromosoma 228. A pesar de estos inconvenientes, en
los últimos años en nuestro laboratorio hemos diseñado y optimizado
protocolos propios para el diagnóstico molecular de la EVW basados
en secuenciación tradicional que nos han permitido estudiar un significativo número de familias e identificar las mutaciones responsables
en un elevado porcentaje de los casos9. Parte de los resultados de estos
estudios pueden ser consultados en el registro VWFdb@Hemobase
(http://www.hemobase.com/vwf)10.
Paralelamente, en 2009, y coincidiendo con la llegada del primer
secuenciador de NGS a España, proyectamos la posibilidad de aprovechar el potencial de la NGS en el diagnóstico molecular de la EVW,
desarrollando un procedimiento para el estudio de un gran número de
muestras de forma rápida y económica. Inicialmente se diseñó una
prueba de concepto que consistía en la amplificación del factor de von
97
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
En esta primera fase, el registro se ha cerrado con 557 pacientes
sobre los que se ha llevado a cabo el estudio genético mediante la técnica descrita y se han identificado prácticamente un millar de potenciales
mutaciones responsables de la EVW. La validación técnica del procedimiento fue realizada con muestras de pacientes previamente estudiados por secuenciación tradicional, provenientes del Área de Xestión
Integrada de A Coruña y del Hospital Universitario Vall d’Hebron de
Barcelona. Los resultados de esta validación, que fueron presentados
en el XXIX Congreso Nacional de la SETH (Sevilla, 2014), resultaron
muy positivos y esperanzadores y sentaron las bases para su aplicación
a todas las muestras del registro. Asimismo, hay que tener en cuenta
que un número significativo de pacientes también han sido estudiados
previamente mediante técnicas clásicas de secuenciación y ello nos
servirá para comprobar si la nueva tecnología tiene una sensibilidad
igual o superior a los métodos empleados hasta el momento.
La información obtenida del análisis de los resultados del estudio
genético constituirá sin duda una formidable fuente de información
acerca de los mecanismos fisiopatológicos de la EVW. En este sentido,
el objetivo y extensión de la presente ponencia no permite avanzar
resultados concretos, pero sí es interesante reseñar la trascendencia
prevista del proyecto gracias a las características y volumen de información que tendremos en nuestras manos y deberemos interpretar
durante los próximos meses y años.
Tal como está diseñado el procedimiento cabe esperar que podamos identificar todo tipo de mutaciones puntuales (splicing, nonsense,
missense, silent, indel, etc.), habitualmente responsables de la EVW,
y a lo largo de todo el gen (incluidos exones, regiones intrónicas flanqueantes y promotor). Es evidente que esta información supondrá una
ayuda inestimable, y en algunos casos determinante, en la clasificación
clínica de algunos de los pacientes con EVW, especialmente en los
de tipo 1 y tipo 2. Así, la caracterización del defecto genético podrá
unirse a los datos fenotípicos y clínicos para la asignación a un subtipo
concreto, ya sea por que la mutación se había descrito previamente o
por su localización en un dominio concreto de la proteína que permita
explicar características fenotípicas peculiares.
Por otra parte, dado que el registro cuenta con estudios familiares,
la potencialidad de los resultados podría ser aún mayor ya que las
familias en las que se identifique más de una variante podrían ofrecer
información adicional acerca de la contribución fenotípica de cada
una de ellas. En este sentido, en estudios multicéntricos previos ya se
ha puesto de manifiesto que la probabilidad de encontrar mutaciones
candidatas aumenta con niveles más bajos de VWF. Así, en el estudio
canadiense se encontraron variantes del VWF en el 75% de los casos,
índice con niveles antigénicos de VWF inferiores a 30 U/mL, pero
solo en el 50% de los casos con niveles superiores a 30 U/mL14. Son
precisamente estos pacientes, en el límite para su clasificación como
EVW, los que pueden resultar manifiestamente favorecidos de estudios
genotípicos que pueden ser más amplios gracias a la reducción de los
costes que supone la NGS.
Otro aspecto muy interesante del estudio es la posibilidad de
obtener una imagen más nítida de la epidemiologia molecular de la
EVW en la población española. El estudio nos permitirá identificar, por
ejemplo, las mutaciones más abundantes en nuestra población, lo que
puede responder a la presencia de hotspots en el VWF que originen una
mayor tasa de mutación en residuos concretos y, por tanto, resultarían
de eventos independientes. Asimismo, podremos analizar la distribución geográfica de las mutaciones y ello aportará una información
VWF y las regiones intrónicas flanqueantes, así como la región del
promotor, en PCR de tamaños similares (entre 376 y 450 pb). Los
productos resultantes de la amplificación, provenientes de hasta 192
pacientes, se pueden secuenciar simultáneamente en una plataforma
MiSeq de Illumina. Finalmente, el uso de diferentes programas de
análisis (CLC Genomics Workbench y VariantStudio) permite el alineamiento de las secuencias resultantes frente al genoma humano y
el análisis in silico concurrente, facilitando la identificación de las
potenciales variantes patogénicas, discriminando las secuencias pertenecientes al pseudogén e identificando los polimorfismos descritos
hasta el momento en diferentes bases de datos moleculares.
Aplicación de la NGS al PCM-EVW-ES
El potencial de una tecnología como la descrita tiene sentido a la hora de
plantear estudios epidemiológicos poblacionales. Por este motivo, el protocolo desarrollado tomó especial relevancia dentro del proyecto “Perfil
Clínico y molecular de pacientes con enfermedad de von Willebrand.
Registro español (PCM-EVW-ES)”, cuyo objetivo es el de establecer
un registro nacional para la EVW y en el que participan la mayoría
de los grandes hospitales del país. Consta de tres fases principales:
a) caracterización fenotípica de los pacientes; b) análisis genético del
VWF mediante técnicas de NGS con intención de poner de relieve las
diferentes mutaciones y polimorfismos genéticos en cada paciente; c)
correlación de los datos fenotípicos y genotípicos con el fin de establecer
en cada paciente una caracterización lo más consistente posible.
Figura 1. Esquema de la PCR de fusión utilizada en los chips de Fluidigm. A)
Los primers específicos para la amplificación del VWF contienen en sus
extremos dos secuencias comunes (Tag1 y Tag2). B) Los primers externos
contienen los adaptadores específicos de la plataforma NGS, los índices y las
secuencias complementarias a las Tags. C) Los índices y los adaptadores se
incorporan a los amplicones del gen mediante una amplificación secundaria
concurrente; de este modo se fusionan todos los elementos necesarios para
su secuenciación mediante NGS. D) Los primers específicos se dispensan en
48 pocillos independientes del chip mientras que las muestras y los primers
externos se dispensan conjuntamente con los componentes de la reacción de
amplificación en otros 48 pocillos independientes. Durante la carga del chip
los componentes se mezclan matricialmente y se desarrollan 2.304 reacciones
de PCR en las que cada muestra es amplificada independientemente por cada
pareja de primers. E) Una vez realizada la PCR, todos los amplicones derivados
de cada muestra se recogen conjuntamente en los pocillos iniciales. Imagen
modificada de Moonsamy et al.17
98
Ponencias
Bibliografía
muy interesante cuando el estudio mutacional sea completado con el
análisis de ligamiento a partir de marcadores de tipo STR o SNP que
nos permitirán identificar y trazar el origen de los alelos portadores de
dichas mutaciones15 y establecer si existe un origen común (efecto fundador) para alguna de ellas. En este sentido, la secuenciación completa
del VWF de pacientes y familiares proporcionará información genotípica de más de 100 polimorfismos frecuentes en región codificante del
VWF (dbSNP build 137). Estos datos permitirán la investigación de
una hipótesis que prácticamente no ha sido explorada, la participación
de los polimorfismos genéticos en la modulación de la gravedad y las
manifestaciones clínicas de la EVW16.
Finalmente, hemos de señalar algunas limitaciones de la técnica:
hay que tener en cuenta que la secuenciación no es capaz a de detectar
todo tipo de mutaciones, sino solo aquellas que dan lugar a cambios
puntuales que afectan entre una y unas decenas de bases. Por tanto,
aquellos pacientes con manifestaciones clínicas bien establecidas en
los que no se detecte mutación o en los que las mutaciones detectadas
no puedan explicar el fenotipo serán candidatos a otro tipo de análisis,
como estudios de MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification), dado que pueden ser portadores de inserciones o deleciones
que podrían explicar su fenotipo.
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Valoración y conclusiones del impacto de la NGS
en la EVW
Las mutaciones responsables de la EVW son recogidas de manera
sistemática en una base de datos internacional (ISTH-VWF Database)
cuyo contenido ha variado significativamente durante los últimos años
en número y tipo, siendo un fiel reflejo de la evolución en el conocimiento de las bases moleculares de esta enfermedad. Si revisamos la
aportación actual de los laboratorios españoles a estos datos, observamos que tan solo representa un 7,5% del total (53 mutaciones). Teniendo en cuenta el número de pacientes reclutados en el PCM-EVW-ES,
es previsible que los resultados que se obtengan sean de una relevancia
extraordinaria no tan solo por el número de mutaciones que se pueden
llegar a describir, sino porque es el mayor estudio multicéntrico sobre
EVW (con estudio genético incluido) realizado hasta la fecha. Únicamente el potencial de la tecnología NGS permite el desarrollo de este
tipo de estudios genéticos sobre cohortes tan amplias. La secuenciación mediante la tecnología tradicional de semejante número de muestras conllevaría una tarea formidable en cuanto a volumen de trabajo,
tiempo y dinero. Sin embargo, hay que seguir teniendo presente que
la complejidad de la EVW requiere, para su correcta administración y
diagnóstico preciso, de una exhaustiva evaluación fenotípica y genotípica llevada a cabo por profesionales con amplia experiencia clínica
y de laboratorio17. Aunque todavía es largo el camino que nos llevará
a dilucidar totalmente las bases moleculares de la EVW, es evidente
que el futuro pasa por el aprovechamiento de las herramientas que nos
ofrecen las nuevas tecnologías de secuenciación masiva.
99
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Papel de los microRNA en la regulación del sistema hemostático
Constantino Martínez, Salam Salloum-Asfar, Ana Belén Arroyo, Raúl Teruel-Montoya, Eva Caparrós-Pérez, Vicente Vicente, Rocío González-Conejero
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital Universitario Morales Meseguer. Murcia. Centro Regional de Hemodonación. Universidad de Murcia. IMIB
Introducción
La hemostasia tiene el doble reto de mantener la sangre en un estado
fluido en condiciones fisiológicas y lograr una activación repentina
y autolimitada para detener la pérdida de sangre en el contexto de la
lesión vascular pero sin formar trombos indeseados1. El componente
funcional que regula la hemostasia consiste en un número relativamente reducido de factores proteicos y celulares, una maquinaria altamente
conservada, que asume esta complicada tarea por medio de una red de
procesos rápida y finamente interconectados2. Sus principales actores
son las plaquetas, los factores de coagulación, los factores anticoagulantes y los elementos fibrinolíticos, con funciones dispares pero
con el objetivo común de mantener el equilibrio dinámico propio de
la hemostasia1.
En este simposio se discutirá la participación de los microRNA
(miRNA) como reguladores del sistema hemostático. Los miRNA,
descritos por primera vez en 1993, son reguladores postranscripcionales de la expresión génica en eucariotas superiores3 e intervienen en
prácticamente todos los procesos biológicos, desde el desarrollo hasta la
tumorigénesis4,5. Dada su función biológica, los miRNA son potenciales
dianas para el diseño de nuevos fármacos6. De hecho, la regulación de
una vía fisiológica o patológica por miRNA puede ser extremadamente compleja, ya que puede implicar una interacción directa de uno o
varios miRNA con su mRNA diana o una regulación indirecta a través
de factores de transcripción, receptores o proteínas implicadas en las
modificaciones posteriores a la traducción de la proteína estudiada.
miRNA también puede unirse a las regiones 5’ UTR provocando la
degradación18 o estabilización19 de su mRNA diana o incluso unirse a
la su región codificante20,21. De hecho, el grado de complementariedad
entre un miRNA y su diana determina cómo esta será silenciada, ya sea
a través de la inhibición de la traducción o su degradación22.
En humanos, se han descrito 2.578 secuencias distintas de miRNA
maduros (v20 miRBase, junio de 2013; http://www.mirbase.org). El
primer ámbito patológico en el que se describió la participación de
miRNA fue en cáncer, cuando el grupo de Croce publicó el posible
papel de miR-15 y miR-16 en la leucemia linfocítica crónica23. Desde entonces, un gran número de estudios ha demostrado la profunda
implicación de los miRNA en cáncer (para una revisión, véase Iorio,
2012).
En los últimos años, los miRNA han sido intensamente estudiados y se han aceptado como moléculas clave en muchos procesos
fisiológicos tales como regulación del ciclo celular, diferenciación,
desarrollo, apoptosis, metabolismo y envejecimiento24, así como en
procesos patológicos, como las enfermedades cardiovasculares 25 o
enfermedades autoinmunes26.
Los algoritmos predictivos estiman que un tercio del genoma
humano puede contener uno o varios sitios putativos de unión a miRNA; como tal, un solo miRNA puede potencialmente regular cientos
de genes, o un solo gen podría ser el blanco de diferentes miRNA27-30.
Estas propiedades confieren a los miRNA la posibilidad de participar
en la regulación de muchos mecanismos complejos o sistemas fisiológicos, como es el sistema hemostático.
Biogénesis y función de los miRNA
Los miRNA como reguladores del sistema hemostático
Papel de los miRNA en la biogénesis y la función
de las plaquetas
Los miRNA son una familia de genes pequeños no codificantes, conservados, que codifican para productos de unos ~ 22 nt de longitud
en su forma madura7. Estos genes se encuentran en regiones intergénicas, exónicas e intrónicas8,9, y su transcripción ocurre en el núcleo
por la acción de la RNA polimerasa II10, dando como producto los
miRNA primarios (pri-miRNAs), que se escinden por un microprocesador complejo compuesto principalmente por DGCR8/Drosha11 para
liberar precursores de miRNA con forma de horquilla (pre-miRNA
de unos ~ 70 nt) que son transportados al citoplasma a través de la
vía de la exportina 512. Posteriormente, los pre-miRNA son procesados por
​​ Dicer para generar miRNA maduros13. El miRNA maduro se
asocia selectivamente con un miembro de la familia de las proteínas
Argonautas14,15 y con una serie de proteínas adicionales16,17, formando
un complejo de silenciamiento (miRISC), que regula la expresión de
genes, a través de un apareamiento no complementario entre el miRNA y el RNA mensajero (mRNA) diana. Generalmente, miRISC se
une a la región no traducida 3’ (3’ UTR) del mRNA. Sin embargo, el
Las plaquetas son cruciales en hemostasia primaria. La activación
plaquetaria es seguida por su agregación provocando el inicio de la
formación del coágulo de forma conjunta con la formación de las fibras
insolubles de fibrina1. Los gránulos a plaquetarios almacenan varios
factores de coagulación clave (fibrinógeno, FV, FVIII, VWF), proteínas fibrinolíticas (PAI-1) y anticoagulantes (TFPI) que contribuyen
localmente a controlar el sangrado.
Aunque ya en 2006 se propuso un papel importante de los miRNA en megacariopoyesis31 no fue hasta dos años después cuando se
demostró por primera vez la presencia de miRNA en plaquetas de
pacientes con neoplasias mieloproliferativas crónicas32. Durante los
siguientes cinco años, varios grupos describieron la presencia de un
gran número de miRNA en plaquetas. Así, Kannan et al. realizaron
un análisis exhaustivo de miRNA asociados a apoptosis y estudiaron
los cambios globales en sus perfiles de expresión durante el almace-
100
Ponencias
mayores niveles intraplaquetarios de miR-223 que aquellos que responden al tratamiento farmacológico46.
namiento de plaquetas33. Al mismo tiempo, Landry et al.34, no solo
detectaron la expresión de 170 miRNA en plaquetas, sino también la
presencia de toda la maquinaria necesaria que permite la maduración
de los pre-miRNA (Dicer, TRBP2 y Ago2).
Sin embargo, el papel de los miRNA endógenos en la función
plaquetaria es aún en gran medida desconocido. Esta incertidumbre
también es válida en relación con la funcionalidad de mRNA endógenos de las plaquetas. El paradigma de este debate, la expresión de
FT en las plaquetas, ilustra fácilmente la controversia entre autores
que defienden la traducción de novo en plaquetas35,36 y autores que
demuestran lo contrario37,38. Por lo tanto, estos y otros estudios señalan
la compleja tarea de demostrar el papel de los miRNA en plaquetas aun
cuando el papel de sus dianas todavía está por aclarar.
La posibilidad de que los miRNA tengan papeles alternativos en
las plaquetas también se ha considerado. Así, Landry et al. sugirieron
que miR-223 regula P2Y12, dando un primer punto de vista funcional
a la presencia de miRNA en las plaquetas34. Sin embargo, Leierseder
et al. restaron credibilidad a estos resultados al describir que los ratones deficientes en miR-223 tienen una función y reactividad plaquetarias normales39. Una idea interesante y que podría reconciliar ambos
hallazgos fue propuesta por Halken y De Windt, quienes sugieren que
ciertos miRNA plaquetarios pueden actuar en células dianas distintas
de aquellas en las que se producen, propuesta que merece sin duda
una mayor investigación40. En este sentido, un estudio reciente publicado poco después mostró que microvesículas plaquetarias formadas
después de la activación plaquetaria con trombopoyetina o trombina
contienen altos niveles de miR-223 capaces de inducir la formación
de productos glicados que provocan la apoptosis en HUVEC a través
de la regulación del receptor de IGF-141. Este mismo año, los laboratorios de Bray y de Shaw han descrito que el contenido de miRNA
de plaquetas varía con la edad y el género42. En concreto, miR-223 es
uno de los nueve miRNA que difieren entre hombres y mujeres42. Así,
tres de los siete mRNA que también varían con el sexo son objetivos
potenciales de miR-22342.
miR-96 también ha sido relacionado con función plaquetaria.
Kondkar et al. mostraron su papel en la regulación de la expresión
de VAMP8, molécula implicada en la secreción de gránulos de las
plaquetas43. Los autores mostraron que el mRNA de VAMP8 era 2,5
veces mayor en plaquetas hiperreactivas a epinefrina en comparación
con plaquetas hiporreactivas, observando una expresión inversa de
miR-96. El mismo grupo también mostró que en plaquetas con diferente reactividad a epinefrina, otros genes también eran regulados por
miRNA (miR-200b, mi-495 y miR-107 regulaban PRKAR2B, KLHL5
y CLOCK, respectivamente)44. Sin embargo, la función de estas proteínas es desconocida y deben realizarse más estudios con el fin de
demostrar que los miRNA regulan su expresión in vivo y esto tiene un
impacto en la función plaquetaria.
En la contribución más reciente, Bray et al. describen una mayor
expresión de la proteína de transferencia de fosfatidilcolina (GCPC)
que se correlaciona con una menor expresión de miR-376c en líneas
megacariocíticas. GCPC se expresa de forma diferente en personas de
raza negra lo que podría explicar la alta reactividad de las plaquetas
de estos sujetos a través de PAR-445. Estos datos generan preguntas
relevantes, tal como el efecto de la raza sobre el efecto de fármacos
antitrombóticos. Un trabajo reciente mostró que miR-223 también puede servir como un marcador de reactividad plaquetaria a clopidogrel,
ya que pacientes con enfermedad coronaria no respondedores tienen
miRNA y factores de coagulación
El fibrinógeno fue el primer factor hemostático descrito como diana
de miRNA47. El fibrinógeno juega un papel importante en coagulación, fibrinólisis e inflamación48, y la gran variabilidad de los niveles
plasmáticos entre individuos se ha relacionado con alteraciones de la
hemostasia. Así, los sujetos con niveles por debajo del rango normal
(1,5-3,5 g/L) pueden tener trastornos de la coagulación, mientras que
niveles superiores a valores normales pueden estar asociados con el
desarrollo de trombosis49. El fibrinógeno se compone de tres cadenas
transcritas por tres genes diferentes (FGA, FGB, FGG que codifican
las cadenas Aa, Bb y g, respectivamente) dirigidos por un promotor común que controla hasta cinco transcritos. Fort et al. mostraron
que miR-409-3p tiene como diana el mRNA de FGB mientras que
miR-29c se dirige específicamente contra FGB-aE. Curiosamente, los
miembros de la familia miR-29 (a, b y c) son capaces de regular indirectamente los cinco transcritos de fibrinógeno. Esto es debido a que
HNF4a, un factor de transcripción hepático implicado (entre otros)
en la transcripción de fibrinógeno, es diana potencial de miR-29a y
miR-29b, lo cual explicaría el mecanismo indirecto de acción de estos
miRNA sobre FGB50,51. Estudios adicionales para evaluar este punto
pueden ayudar a aclarar el mecanismo de acción de los miRNA sobre
FGB y sus consecuencias en trombosis y/o hemorragia52.
Por su parte, el FT, codificado por el gen F3, es el iniciador fisiológico principal de la cascada de la coagulación. Se expresa constitutivamente en diferentes tipos celulares, tales como células de músculo liso
y fibroblastos, células que solo entran en contacto con la sangre durante
el daño vascular. Además, su expresión es inducible en monocitos circulantes. De hecho, varios estudios han demostrado una mayor expresión
de FT en monocitos de pacientes con enfermedades cardiovasculares
(revisado en Steffel et al.53). Nuestro grupo, con el objetivo de evaluar
la regulación de FT por miRNA, llevó a cabo una búsqueda in silico
con diferentes algoritmos que permitieron la selección del clúster miR17-92 como candidato potencial54. Los estudios in vitro validaron que
miR-19b se une a un sitio del 3’ UTR de F3 mientras que miR-20a
y miR-106b se unen a un sitio diferente. Conjuntamente, estos miRNA provocan una inhibición significativa del FT en cultivos celulares
(MDA-MB-231 y THP-1). Además, la sobreexpresión o la inhibición de
miR-20a en THP-1 afectaba a la actividad procoagulante en la superficie
de estas células54. Finalmente, medimos los niveles de miR-19b y miR20a en monocitos de pacientes con síndrome antifosfolipídico (SAF) y
de lupus eritematoso sistémico (LES), siendo significativamente más
bajos en comparación con sujetos sanos e inversamente correlacionados
con los niveles de FT. Por tanto, nuestros resultados sugieren un papel
de miR-19b y miR-20a en el estado de hipercoagulabilidad observado
en pacientes con SAF y LES. Sin embargo, no encontramos ninguna
relación directa entre la expresión del clúster miR-17-92 y el desarrollo
de episodios trombóticos. Deben realizarse estudios adicionales para
demostrar tal vínculo en estas y otras patologías. Curiosamente, otros
dos trabajos han descrito que la expresión de FT podría estar regulada
por el clúster miR-17-92 en otras líneas celulares55,56, con una implicación más allá de la trombosis y hemostasia.
Otro factor hemostático regulado por miRNA es el factor XI de
la coagulación (FXI). Recientemente, nuestro grupo ha mostrado que
101
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Nuestro grupo también se centró en la potencial regulación de la
principal diana de anticoagulantes orales, VKORC1. Demostramos que
parte de la regulación hepática de su expresión se debe a la interacción
directa con miR-133a. Así, los niveles de este miRNA se correlacionan inversamente con los niveles de mRNA de VKORC1 en muestras
de hígado humano, independientemente de los genotipos funcionales
de VKORC166. Por tanto, esta regulación puede tener una potencial
importancia en la farmacogenética de la terapia anticoagulante oral.
en la búsqueda in silico de miRNA hepáticos que tienen como potencial diana al F11, destacan cuatro miRNA como candidatos potenciales (Salloum-Asfar et al. 2014). Los ensayos in vitro mostraron que
solo miR-181a-5p participa en la regulación de FXI. La correlación
negativa entre la expresión de mRNA de F11 y miR-181a-5p en 114
hígados humanos sanos sugiere que los miRNA actúan como parte
de la maquinaria que en los hepatocitos regula la expresión de FXI
y que, en particular, miR-181a-5p podría contribuir a la variabilidad
interindividual de este factor hemostático.
miRNA implicados en fibrinólisis
Anticoagulantes naturales y miRNA
El PAI-1, codificado por el gen SERPINE1, es el principal inhibidor
del sistema fibrinolítico67. El PAI-1 regula la fibrinólisis mediante la
inhibición de t-PA y u-PA. Además de su función en hemostasia, PAI-1
desempeña múltiples funciones en diversos procesos fisiopatológicos
tales como la inflamación, la arteriosclerosis y el cáncer (para una
revisión ver Iwaki et al.67). Varios miRNA ejercen un efecto regulador
sobre la expresión de PAI-1: miR-421 y miR-30c inhiben PAI-1 en
HUVEC68 y en células endoteliales pulmonares69 ejerciendo una inhibición directa de la traducción de SERPINE1. Se ha descrito que los
niveles plasmáticos de miR-421 eran más altos en plasma de pacientes
con trombosis venosa (n=20) y con altos niveles de PAI-1 (40,5±13 UI/
ml) en comparación con pacientes con niveles bajos (1,6±1 UI/mL)68.
Más recientemente se ha mostrado que let-7g modula la expresión de
PAI-170. Los autores demostraron que, en pacientes con infarto lacunar,
los niveles plasmáticos de let-7g se asociaban de forma inversa con
los de PAI-1. Además, la inhibición de let-7g en ratones deficientes
en Apo-E sometidos a una dieta rica en grasas provocaba un aumento
de PAI-1 en las arterias carotídeas70.
Entre los factores anticoagulantes, la AT (codificada por el gen SERPINC1) se considera el anticoagulante natural más importante ya que
inhibe a la trombina y al factor Xa, entre otras proteasas de la coagulación1,57. El papel clave de la AT en la hemostasia se ilustra tanto por el
alto riesgo trombótico observado en pacientes con niveles reducidos58
como por la letalidad embrionaria de ratones que carecen de esta serpina59. Es interesante destacar que durante el desarrollo humano los niveles de AT plasmática (y otras proteínas hemostáticas) van aumentando
hasta alcanzar los niveles normales en la edad adulta 60. En modelo
murino ocurre una regulación similar ya que los niveles plasmáticos de
AT alcanzan los niveles de adulto en el día 13 posnacimiento5. En este
sentido, nuestro grupo demostró un patrón diferencial de expresión
de miRNA en el hígado de ratones recién nacidos vs adultos5. Así,
miR-18a y miR-19b, dos potenciales reguladores de AT in silico, se
correlacionaban inversamente en hígado con los niveles de mRNA de
SERPINC1 durante el desarrollo posnatal5. Esta regulación puede ser
aún más compleja ya que los cambios cualitativos observados en AT
durante el desarrollo también pueden estar regulados por miRNA61, lo
cual puede tener consecuencias funcionales en la hemostasia. La AT de
ratones recién nacidos tiene un contenido incompleto de ácido siálico
que puede ser explicado por una menor expresión de dos sialiltransferasas. Nuestros datos sugieren que miR-200a, un miRNA expresado en
el hígado e inversamente correlacionado con la expresión de esas dos
sialiltransferasas, puede estar, en parte, implicado en su regulación61.
Así, el papel de los miRNA en hemostasia no se limitaría al control
directo de proteínas, sino que podría extenderse a un efecto indirecto
al afectar elementos que intervienen en los procesos de transcripción
o posteriores a la traducción.
La proteína S (PS), codificada por el gen PROS1, es un cofactor de
la proteína C activada y del TFPI. Durante el embarazo, los niveles de
PS se reducen drásticamente lo que contribuye a un mayor riesgo de
trombosis observado durante este periodo62,63. Se ha demostrado que
el estradiol regula a la baja la expresión de PS en células hepáticas
(HepG2) a través del receptor de estrógeno (ERa)-SP1 que recluta
a varios factores represores tras la activación con 17b-estradiol para
unirse al promotor de PROS164. Además, en las células de hepatocarcinoma (HuH7), el 17b-estradiol también aumenta los niveles de
miR-494, miRNA implicado en los procesos de proliferación celular y
de apoptosis65. Este miRNA se une a diferentes sitios en el mRNA de
PROS1 provocando la regulación negativa de la expresión de PS. Así,
en condiciones en las que los estrógenos están elevados, los miRNA
pueden contribuir a los bajos niveles de PS observados en el plasma65.
Hasta la fecha, no se han realizado estudios para evaluar el potencial papel de miRNA en los niveles o en la función de otros anticoagulantes tales como HCII, TFPI, PC o ZPI.
Conclusión
Aunque varios trabajos sugieren que los miRNA son reguladores de los
distintos componentes del sistema hemostático, todavía queda mucho
trabajo por realizar. El primer reto es demostrar claramente que la
desregulación de miRNA en órganos o tejidos que expresan factores
hemostáticos puede estar implicada en el desarrollo de trombosis o
hemorragia. Sin embargo, la investigación debe centrarse en la descripción de una visión integrada de cómo los miRNA regulan globalmente
distintos factores hemostáticos en los diferentes tejidos (por ejemplo,
hígado, células endoteliales, plaquetas, monocitos, neutrófilos, etc.)
y el impacto global que una desregulación de ciertos miRNA puede
tener en patologías hemostáticas.
En resumen, identificar los miRNA que participen en la hemostasia y descifrar el papel que tienen en su regulación probablemente
ayudaría en el uso de los miRNA como herramientas pronósticas,
diagnósticas y terapéuticas.
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104
Ponencias
Controversias actuales en el tratamiento de la tromboembolia de pulmón
David Jiménez Castro
Servicio de Neumología y Departamento de Medicina. Hospital Universitario Ramón y Cajal. Madrid. IRYCIS y Universidad de Alcalá
Introducción
anticoagulante convencional y monitorización estrecha, reservándose
la fibrinólisis para aquellos pacientes que presenten deterioro hemodinámico posterior.
No hay consenso sobre la mejor prueba (o combinación de pruebas) para identificar a los pacientes estables con TEP y alto riesgo
de mala evolución. Un metaanálisis de datos individuales publicados
recientemente encontró que la combinación de hipotensión leve,
taquicardia, disfunción del ventrículo derecho y daño miocárdico
identifica a los pacientes normotensos con TEP y alto riesgo de
deterioro precoz4.
A pesar de los avances en el diagnóstico y tratamiento de los pacientes
con tromboembolia de pulmón (TEP) aguda sintomática, el pronóstico de la enfermedad ha permanecido prácticamente inalterado en las
últimas décadas1.
Entre las distintas controversias terapéuticas para la TEP, en esta
revisión se considerará el papel del tratamiento trombolítico en el subgrupo de pacientes estables hemodinámicamente con TEP, las evidencias sobre la utilidad de los filtros de vena cava inferior y la duración
del tratamiento anticoagulante.
Utilidad de los filtros de vena cava inferior
Tratamiento fibrinolítico de la tromboembolia
de pulmón hemodinámicamente estable
Aunque los filtros de vena cava están indicados en pacientes con
TEP y contraindicación para la anticoagulación, la evidencia que
avala su uso no es alta. Decousus et al. publicaron un ensayo clínico
que evaluó la utilidad de los filtros de vena cava, como complemento a la anticoagulación convencional, en pacientes con trombosis
venosa profunda (TVP) proximal y alto riesgo de TEP5. Los filtros
redujeron la frecuencia de TEP durante los primeros 12 días de
tratamiento, y se detectó una tendencia a un menor número de
episodios mortales. A los 2 años no hubo diferencias entre los dos
grupos en términos de mortalidad o de recurrencias trombóticas,
debido a un incremento de la frecuencia de TVP en el grupo tratado
con filtros. De forma indirecta, estos hallazgos apoyan el uso de los
filtros de vena cava en pacientes en los que la anticoagulación está
contraindicada en la fase aguda. Recientemente se han publicado
los resultados de un estudio observacional con datos del registro
RIETE que comparó la evolución de 344 pacientes con TVP o
TEP que recibieron un filtro de vena cava por contraindicación
(absoluta o relativa) para la anticoagulación, con 344 pacientes que
no recibieron un filtro pero con el mismo riesgo de sangrado 6. La
inserción de un filtro redujo de forma significativa la muerte por
TEP en el mes posterior al seguimiento (1,7% vs 4,9%; p=0,03), y
aumentó las recurrencias trombóticas no mortales (6,1% vs. 0,6%;
p<0,001). Siempre que sea posible se deberá colocar un filtro recuperable, y este deberá ser retirado tan pronto como se pueda iniciar
la anticoagulación.
El tratamiento trombolítico acelera la lisis del coágulo cuando se
compara con el tratamiento con heparina no fraccionada (HNF),
aunque no hay diferencias en la trombosis residual después de 5 a
7 días. El análisis de un subgrupo de pacientes del ensayo UPET,
que comparó urocinasa seguida de heparina o heparina solamente,
demostró que el tratamiento fibrinolítico disminuye la mortalidad en
pacientes con shock secundaria a TEP masiva. En función de estos
hallazgos, y en ausencia de riesgo de sangrado alto, el tratamiento
trombolítico está indicado en pacientes con TEP aguda sintomática
e inestabilidad hemodinámica (TEP de riesgo alto). Este grupo de
pacientes supone menos del 5% de las TEP. Aunque la inestabilidad
hemodinámica es poco frecuente, hasta la mitad de los pacientes con
TEP sin inestabilidad hemodinámica tienen signos clínicos o ecocardiográficos de disfunción del ventrículo derecho. Un ensayo clínico
evaluó la eficacia y seguridad de la fibrinólisis en pacientes estables
hemodinámicamente con TEP y disfunción ecocardiográfica de cavidades derechas2. No hubo diferencias estadísticamente significativas
en la mortalidad global ni en la proporción de sangrados mayores. En
el grupo sometido a fibrinólisis fue estadísticamente menos frecuente
la necesidad de escalada del tratamiento. Se ha publicado recientemente el ensayo clínico PEITHO, que evaluó la eficacia y seguridad
de la tenecteplasa en 1.006 pacientes estables con TEP, elevación
de las troponinas cardiacas y disfunción ecocardiográfica de cavidades derechas (TEP de riesgo intermedio)3. El estudio demostró la
superioridad de tenecteplasa para el evento primario de eficacia, que
consistió en muerte por todas las causas o deterioro hemodinámico
durante los 7 primeros días tras la aleatorización. Sin embargo, no
hubo diferencias en la mortalidad entre los dos brazos del ensayo
(1,2% vs 1,8%; p=0,42). Además, se produjeron significativamente
más sangrados mayores en el brazo que recibió tenecteplasa (11,5%
vs 2.4%; p<0,001). Los resultados de este estudio sugieren que los
pacientes con TEP de riesgo intermedio deberían recibir tratamiento
Duración del tratamiento anticoagulante
El riesgo de recurrencia trombótica depende de 1) la eficacia del tratamiento del episodio agudo, 2) de una duración mínima del tratamiento
a largo plazo, y 3) de la posibilidad de que el paciente tenga un factor
de riesgo intrínseco para sufrir un nuevo episodio de TVP o TEP.
Aunque duraciones de tratamiento inferiores a 3 meses se asocian
a un riesgo inaceptable de recurrencias, la duración exacta del trata-
105
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Bibliografía
miento para pacientes con eventos idiopáticos no se conoce, y debería balancear el riesgo de recurrencia al suspender la anticoagulación
con el riesgo de sangrado al mantenerla. Aunque se han desarrollado
varios modelos predictivos que podrían identificar a pacientes con TEP
no provocada y bajo riesgo de recurrencia, ninguno ha sido validado
prospectivamente. Es probable que la identificación de pacientes con
TEP idiopática y alto riesgo de recurrencia, así como los resultados
prometedores de los estudios de extensión con los anticoagulantes
orales directos, modifiquen la práctica clínica en cuanto a la duración
del tratamiento.
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Conclusiones
Podemos afirmar que nos encontramos en el umbral de una nueva
era en el tratamiento de la TEP: la aparición de nuevos anticoagulantes que pueden sustituir al acenocumarol en un futuro próximo; el empleo de filtros recuperables en pacientes seleccionados; la
extensión del tratamiento fibrinolítico a ciertos pacientes estables con
embolia de pulmón; o la mejor caracterización del riesgo de recurrencia de nuestros pacientes. Todo ello contribuirá, a buen seguro,
a mejorar de forma sustancial el manejo de los pacientes diagnosticados de TVP o TEP.
106
Ponencias
Reversión de los clásicos y nuevos anticoagulantes
M.ª Fernanda López Fernández, Javier Batlle Fonrodona
Unidad de Hemostasia y Trombosis. Servicio de Hematología y Trasfusión. Complejo Hospitalario Universitario A Coruña. A Coruña
Introducción
estudios efectuados en la “vida real” sin selección previa de pacientes
varía entre 1,5% y 3,4% por año para las hemorragias mayores totales y
0,4% y 0,6% por año para las HIC1. En los estudios pivotales, el riesgo
hemorrágico de los NAO fue en líneas generales inferior al de los AVK2-4
(Tabla 1), sin embargo, su riesgo real todavía no ha sido establecido5.
El factor de riesgo hemorrágico más importante es la intensidad de
la anticoagulación. Con AVK e INR >3 la incidencia de hemorragias
mayores es el doble a la observada con rangos de INR comprendidos
entre 2 y 36. El riesgo de HIC se duplica por cada incremento de 1 unidad
del INR. Las dosis de HNF y heparinas de bajo peso molecular (HBPM)
también se asocian con el incremento del riesgo hemorrágico. En un
estudio retrospectivo efectuado en pacientes con síndrome coronario
agudo se observó que por cada 10 segundos de prolongación del tiempo
parcial de tromboplastina activada (TTPa) la incidencia de hemorragias
mayores aumentaba un 7%. También existe una clara relación entre las
dosis y las complicaciones hemorrágicas de los nuevos anticoagulantes.
Las características clínicas del paciente como la edad, la presencia de
comorbilidades y el uso de determinadas medicaciones concomitantes,
son otros factores determinantes del incremento del riesgo hemorrágico6.
El principal efecto adverso de los clásicos y nuevos anticoagulantes
son las complicaciones hemorrágicas. Si se producen episodios hemorrágicos o son necesarios procedimientos invasivos es necesario revertir el tratamiento anticoagulante. Dependiendo de la situación clínica
(gravedad de la hemorragia o el riesgo de cirugía urgente) puede ser
necesario revertir el efecto en unas horas o de forma inmediata. Los
anticoagulantes clásicos o convencionales como los antagonistas de
la vitamina K (AVK) pueden revertirse con vitamina K (VK), plasma
fresco congelado (PFC) o concentrados del complejo protrombínico
(CCP), mientras que la heparina no fracciona (HNF) y sus derivados se
neutralizan con sulfato de protamina. Recientemente se han introducido en la práctica clínica, una nueva generación de anticoagulantes orales (NAO) con mayor especificidad frente a factores de la coagulación
activados con resultados prometedores en los estudios clínicos. Una
importante limitación de estos nuevos agentes y de los estudios clínicos efectuados es la ausencia de estrategias apropiadas para revertir el
efecto anticoagulante si los pacientes presentan hemorragias, aunque
los resultados de estudios experimentales son alentadores.
Reversión de los clásicos anticoagulantes
Incidencia y factores de riesgo hemorrágicos
en pacientes con clásicos y nuevos anticoagulantes
Heparina no fraccionada y heparinas de bajo peso
molecular
En estudios bien controlados, los AVK incrementan el riesgo de hemorragias mayores totales un 0,5% por año de tratamiento y el de hemorragias
intracraneales (HIC) un 0,2% por año. Sin embargo, la incidencia en
La vida media de la HNF es relativamente corta (60-90 minutos) por lo
que su efecto anticoagulante se elimina a las 3-4 horas de la suspensión
Tabla 1. Incidencia de complicaciones hemorrágicas mayores con los nuevos anticoagulante orales
Anticoagulante
Hemorragias mayores
%/año
HIC
%/año
Hemorragia gastrointestinal
%/año
Hemorragias mayores
y menores
Dabigatrán
150 mg/12 h
RE-LY
3,11
(Warfarina 3,36)
p=0,003
0,30
(Warfarina 0,74)
p<0,001
1,51
(Warfarina 1,02)
p<0,001*
16,42
(Warfarina 18,15)
p<0,05
Dabigatrán
110 mg/12 h
RE-LY
2,71
(Warfarina 3,36)
p=0,31
0,23
(Warfarina 0,74)
p<0,001
1,12
(Warfarina 1,02)
p=0,43
14,62
(Warfarina 18,15)
p<0,05
Rivaroxabán
20 mg/24 h
ROCKECT
3,6
(Warfarina 3,4)
p=0,58
0,5
(Warfarina 0,7)
p=0,02
3,2
(Warfarina 2,2)
p<0,0001*
14,9
(Warfarina 14,5)
p=0,44
Apixabán
5 mg/12 h
ARISTOTLE
2,13
(Warfarina 3,09)
p<0,001
0,33
(Warfarina 0,8)
p<0,001
0,76
(Warfarina 0,86)
nds
18,1
(Warfarina 25,8)
p<0,001
HIC, hemorragia intracraneal; nds, no diferencias significativas. *Menos hemorragias en el grupo de warfarina.
107
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
de valorar si el rFVIIa es capaz de revertir el efecto anticoagulante.
La administración de 90 µg kg-1 de rFVIIa después del fondaparinux
normaliza el TTPa, el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de generación de trombina (TGT) a las 6 horas (Tabla 2). No existen estudios
controlados en pacientes con hemorragias relacionadas con el pentasácarido aunque algunas experiencias aisladas sugieren que puede ser
eficaz. Recientemente se ha desarrollado una variante de antitrombina
recombinante que específicamente se une al pentasacárido y neutraliza
su actividad anti-FXa in vivo. También se ha desarrollado una forma
biotinilada del idraparinux, la idrabiotaparinux, que permite su rápida
eliminación cuando se administra avidina.
de la infusión continua7. En la mayoría de los casos la suspensión de
la HNF es la única medida necesaria. Si se precisa una neutralización
inmediata, el antídoto de elección es el sulfato de protamina. La protamina, derivada del esperma de los peces, se une a la heparina formando
un complejo inactivo estable. Cada miligramo (mg) de protamina neutraliza aproximadamente 100 unidades de heparina. Por tanto, en un
paciente que reciba una dosis de heparina de 1.000-1250 U h-1, 25-30
mg de protamina son suficientes para neutralizar su efecto.
La reversión de las HBPM es más compleja, debido a que el sulfato
de protamina neutralizará solo la actividad anti-IIa y solo tiene un
pequeño efecto parcial sobre los fragmentos de heparina responsable
de la actividad anti-Xa. Un acercamiento práctico es administrar 1 mg
de sulfato de protamina por cada 100 unidades anti-FXa administradas
en las últimas 8 horas. Si persiste la hemorragia se puede administrar
una segunda dosis de 0,5 mg por cada 100 U de anti-FXa1 (Tabla 2).
Antagonistas de la vitamina K
Los AVK son análogos sintéticos de la vitamina K que interfieren en
su metabolismo causando fallo en la γ-carboxilación de los factores
de la coagulación II, VII, IX y X y proteínas C, S, Z. Polimorfismos
genéticos, la dieta, interacciones medicamentosas y comorbilidades
como la enfermedad hepática u otros factores de riesgo hemorrágico
incrementan el riesgo de rangos de anticoagulación supraterapéuticos y subsiguientemente la hemorragia. Las opciones para revertir su
efecto incluyen: 1) suspensión de la anticoagulación y observación;
2) administrar vitamina K1 (fitonadiona) por vía oral o intravenosa
(i.v.); 3) administrar tratamientos sustitutivos que aporten y normalicen los factores deficitarios como el PFC y los CCP; y 4) en última
instancia y en ausencia de respuesta a medidas previas, administrar
agentes baipás, como los concentrados del complejo protrombínico
activado (CCPa) o el factor VII activo recombinante (rFVIIa). Antes
de interrumpir la administración de AVK deben tenerse en cuenta los
Pentasacáridos
Es un compuesto sintético que se une eficazmente a la antitrombina
bloqueando al factor Xa (FXa). Como carece de otros residuos glicosaminoglicanos no se une a la trombina y su efecto es exclusivamente
sobre el FXa. El fondaparinux, con una vida media de 15-20 horas,
es el preparado actualmente disponible. El idraparinux es otro pentasacárido de vida media muy prolongada (5,5 días). La vida larga de
los pentasacáridos hace necesario disponer de antídotos para tratar las
complicaciones hemorrágicas de estos agentes, ya que la protamina es
ineficaz. El único agente evaluado para revertir el efecto anticoagulante
es el factor VII activo recombinante (rFVIIa). Se han efectuado dos
estudios controlados frente a placebo en voluntarios sanos con el fin
Tabla 2. Agentes utilizados para la reversión de los diferentes anticoagulantes
Tiempo hasta la restauración
de la hemostasia después de
suspender el tratamiento
Agente reversor
Comentarios
3-4 h
25-30 mg de sulfato de protamina (reversión
inmediata)
1 mg de protamina por 100 U anti-FXa
administradas en las 2-3 h previas
12-24 h
25-30 mg de sulfato de protamina (reversión
parcial inmediata)
1 mg de protamina por 100 U anti-FXa
administradas en las 8 h previas
Fondaparinux: 24-30 h
rFVIIa 90 µg kg-1
Basado en resultados de laboratorio
Sin experiencia sistemática en pacientes
Acenocumarol: 18-24 h
Warfarina: 60-80 h
Fenprocumon: 8-10 días
Vitamina K oral: 24 h
Vitamina K i.v.: 12-16 h
PFC: 10-20 mL/kg (reversión parcial inmediata)
CCP: 20-50 UI/kg (reversión inmediata)
Las dosis de vitamina K, PFC y CCP
dependen del INR y el peso del paciente
Inhibidores directos
del factor Xa
Carbón activado si toma en las 2 h previas
CCPa ¿50 UI/kg?
rFVIIa: ¿90 µg/kg?
Basado en resultados de laboratorio
Sin experiencia sistemática en pacientes
Inhibidores directos
del IIa
Carbón activado si toma en las 2 h previas
Hemodiálisis
CCPa: ¿50 UI/kg?
rFVIIa: ¿90 µg/kg?
Basado en resultados de laboratorio
Sin experiencia sistemática en pacientes
HNF
HBPM
Pentasacárido
AVK
HNF, heparina no fraccionada; HBPM, heparina de bajo peso molecular; AVK, antagonistas de la vitamina K; PFC, plasma fresco congelado; CCP, concentrado del complejo protrombínico; rFVIIa,
factor VII activado recombinante; INR, cociente internacional normalizado; FXa, factor X activado; h, hora; i.v., intravenosa Adaptado de Levi1.
108
Ponencias
rio incrementar levemente los niveles de los factores para restaurar
concentraciones compatibles con una hemostasia eficaz. Por tanto, la
infusión de PFC tiene poco efecto en valores de INR levemente prolongados y se requerirían grandes volúmenes de plasma para corregir INR
supraterapéuticos12. Por este motivo habitualmente solo se consigue,
en estos casos, una corrección parcial. Además, la infusión rápida de
grandes volúmenes es difícil, sobre todo en pacientes mayores con
problemas cardiovasculares e insuficiencia renal. Cuando se utiliza
en pacientes con complicaciones hemorrágicas graves debe administrarse también vitamina K ya que la vida media del FVII exógeno es
aproximadamente de 7 horas y el factor IX tiene un gran volumen de
distribución. Si no se administra vitamina K los niveles de los factores
VII y IX volverán a declinar12. Otras potenciales desventajas del PFC
son: el tiempo empleado en su descongelación, la necesidad de utilizar plasma ABO compatible, el riesgo de reacciones transfusionales
(alérgicas, TRALI, hemólisis) y la transmisión de patógenos virales.
Los CCP son derivados plasmáticos que se empezaron a utilizar
hace más de 30 años para la reversión del efecto de los AVK. La ACCP
sugiere como tratamiento de elección para revertir los AVK los CCP
de 4 factores (grado de recomendación 2C)13. Este bajo grado de evidencia refleja la heterogeneidad y limitación de las publicaciones disponibles en gran medida debidas al empleo de diferentes concentrados
y al contenido de factores en ellos. La composición de los preparados
durante muchos años ha sido confusa, lo que dificulta todavía más la
compresión de los resultados obtenidos. Actualmente se diferencian
dos tipos de concentrados: los denominados como “3 factores”, más
conocidos como concentrados de factor IX, que carecen de factor VII
(contienen factores II, IX y X), y los conocidos como “4 factores”, que
contienen los 6 factores vitamina K dependientes inactivados (factores
II, VII, IX, X y las proteínas C y S). Dado que los CCP con “3 factores”
no contienen factor VII, que es el factor más severamente deplecionado
en pacientes que reciben AVK, estos preparados no son adecuados para
revertir el efecto anticoagulante12. En muchos de los trabajos disponibles, cuando se utilizaban preparados con “3 factores” se infundía
simultáneamente plasma para mejorar su eficacia. Los CCP con “4
factores” y su composición disponibles en nuestro país se muestran
en la Tabla 3. Además de los factores vitamina K dependientes presentes de forma inactiva contienen trazas de antitrombina y heparina
que reducen su potencial trombogénico. Otro factor de confusión en
la evidencia disponible es que en la mayoría de las publicaciones se
utiliza warfarina, cuya vida media es significativamente más larga que
siguientes aspectos: la vida media de los diferentes agentes (9 horas
para el acenocumarol, 36-42 horas para la warfarina y 90 horas para
el fenprocumon), el INR y la dosis semanal que recibe el paciente8.
La actuación más frecuente en la práctica diaria es la corrección de
INR supraterapéuticos en pacientes asintomáticos. La American College
of Chest Physicians (ACCP)9 se manifiesta en contra del uso de fitonadiona
para revertir el efecto anticoagulante de la warfarina en pacientes asintomáticos, basándose en los resultados de un estudio aleatorizado controlado
en el que no se observaron diferencias en el número de complicaciones
hemorrágicas en pacientes con INR comprendidos ente 4,5 y 10 y tratados
con vitamina K o placebo10. En estos casos se debe suspender el AVK hasta
que el INR decline y continuar con una dosis menor. Cuando el INR es >10
se sugiere administrar 2-2,5 mg por vía oral de fitonadiona. Con las dosis
bajas de vitamina K no se observa refractariedad a los AVK.
En pacientes con hemorragias, sea el INR excesivo o no, la administración de vitamina K es crucial para revertir el efecto anticoagulante de
los AVK. Dosis de 5-10 mg oral o i.v. están indicadas en esta situación. Si
se administra i.v., el INR empieza a disminuir a las 2 horas consiguiéndose su normalización a las 12-16 horas, mientras que si se utiliza la vía oral
la completa normalización se obtiene a las 24 horas. La vía subcutánea es
la menos eficaz y no debería utilizarse en estos casos. En pacientes quirúrgicos, sobre todo si se espera restaurar pronto la anticoagulación, debe
tenerse en cuenta que las dosis de 5-10 mg pueden producir refractariedad
e incrementan la necesidad y duración de las terapias puente11 (Tabla 2).
En hemorragias graves que comprometan la vida, o ante intervenciones urgentes, la corrección del INR es obligatoria y puede conseguirse inmediatamente mediante la reposición de los factores de la
coagulación deficitarios con productos de acción rápida (PFC y CCP)
combinados con la administración de vitamina K de acción lenta8.
El PFC se obtiene de la sangre humana y contiene todos los factores presentes en el plasma, por lo cual ha sido utilizado durante años
para revertir el efecto de los AVK. La dosis se calcula teniendo en
cuenta el peso del paciente y se expresa en volumen o número de unidades del producto. Cada unidad de PFC contiene aproximadamente
200-250 mL. Las dosis habituales son 10-20 mL/kg que producen un
incremento del 20-30% de los niveles de factores plasmáticos8. En la
práctica clínica se infunden habitualmente dosis fijas de 2 unidades,
aunque esta dosis puede ser inadecuada para pacientes con sobrepeso.
Los rangos de anticoagulación estándar (INR 2,3) se corresponden con un estrecho margen en la concentración de los factores de la
coagulación (20-30% aproximadamente), por lo que solo es necesa-
Tabla 3. Concentrados de complejo protrombínico: proporción de factores procoagulantes y anticoagulantes
FII UI/mL (UI*)
Beriplex
®
Octaplex
®
Prothromplex®
FVII UI/mL (UI*)
FIX UI/mL (UI*)
FX UI/mL (UI*)
20-48 (400-960)
10-25 (200-500)
20-31 (400-620)
22-60 (440-1.200)
14-38 (280-760)
9-24 (180-480)
25 (500)
18-30 (300-600)
30 (600)
25 (500)
30 (600)
30 (600)
Proteína C UI/mL (UI*)
Proteína S UI/mL (UI*)
Antitrombina UI/mL
Heparina (UI/mL)
Beriplex®
15-45 (300-900)
13-26 (200-520)
0,2-1,5
Octaplex®
13-31 (260-620)
12-32 (240-640)
NFT
0,2-0,5 UI/UFIX
>20
NFT
0,75-1,5
0,5UI/UFIX
Prothromplex®
NFT, no especificado en ficha técnica; UI*, unidades internacionales por vial resuspendido.
109
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
aunque las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de los
NAO permiten obviar la necesidad de controles repetidos para ajustar
la intensidad de la anticoagulación. Por tanto, en la actualidad no existe
ninguna evidencia sólida sobre la reversión de los NAO con ninguno
de los agentes procoagulantes disponibles. Afortunadamente, su vida
media corta permite revertir el efecto anticoagulante simplemente con
la suspensión del fármaco en la mayoría de los casos. Sin embargo, en
determinadas situaciones como las hemorragias graves o intervenciones
quirúrgicas que no pueden aplazarse, es necesario revertir el efecto anticoagulante de forma inmediata. Cuando el NAO se ha ingerido recientemente (<2 horas), la administración de carbón activado para impedir
su adsorción puede ser de ayuda. En espera de que estén disponibles
los ensayos con antídotos específicos actualmente en fase de desarrollo,
la hemodiálisis para el dabigatrán y los concentrados de factores de la
coagulación son los únicos acercamientos disponibles.
la del acenocumarol habitualmente utilizado en nuestro medio, por lo
que los resultados pueden no ser superponibles.
La concentración de factores vitamina K dependientes es 25 veces
superior a la del plasma y el volumen requerido para una correcta
reversión es 25 veces inferior, lo que supone una ventaja al evitar la
sobrecargas de volumen. La administración inmediata tras la resuspensión de los CCP es otra ventaja sobre el plasma, que precisa ser
descongelado y demora la instauración de la reversión. Posibles efectos adversos de los CCP son las reacciones de hipersensibilidad, que
pueden ser graves, su trombogenicidad, la coagulación intravascular
diseminada y el síndrome nefrótico.
Los resultados de varios estudios, tres de ellos prospectivos no aleatorizados, demuestran la eficacia de los CCP evaluada en base al cese
inmediato de la hemorragia y la rápida corrección del INR en más del 85%
de los pacientes14. En otro estudio observacional prospectivo en pacientes
con HIC se demuestra que la administración, sin esperar a conocer los
resultados analíticos, de dos bolos consecutivos de 10 UI/kg cada uno de
CCP permitió efectuar la neurocirugía en un periodo de tiempo similar a
la de pacientes no anticoagulados. La evolución fue favorable en el 73% de
los pacientes incluidos en este estudio. También se ha analizado la eficacia
de una o más dosis de CCP en pacientes que precisaban intervenciones
quirúrgicas o procedimientos invasivos. Estudios heterogéneos y con escaso número de pacientes, comparando los CCP y el plasma, demuestran
que los CCP son más eficaces en la corrección del INR y en el tiempo
necesario para normalizar el TP. Sin embargo, no se ha analizado la repercusión de estos resultados sobre el cese de la hemorragia o la mortalidad12.
Aunque las dosis fijas son las más habitualmente utilizadas, no están bien
definidas y oscilan entre 20-50 U/kg. En algunos estudios se sugiere que
la dosificación individualizada de los CCP, teniendo en cuenta el peso, el
preparado, el INR y la gravedad del episodio hemorrágico, es el método
más rápido y coste-efectivo. Para pacientes con INR de 2-3,9 pueden ser
suficientes dosis de 20-25 UI/kg, y cuando el INR sea > 4, dosis de 30-50
UI/kg, dependiendo o no de la presencia de hemorragia grave.
En la última década, se ha utilizado el rFVIIa en pacientes con
hemorragias críticas no resueltas con los tratamientos convencionales. Bolos repetidos de 10-90 μg/kg normalizan rápidamente el TP en
pacientes con INR elevados y diversos tipos de hemorragias, pero carecemos de estudios clínicos que avalen su eficacia. En un estudio en fase
II prospectivo aleatorizado y doble ciego frente a placebo en pacientes
con HIC no se observó un beneficio significativo de la mortalidad pero
sí un incremento del 7% de complicaciones tromboembólicas. Debe
utilizarse como producto no aprobado en su ficha técnica.
Los concentrados del complejo protrombínico activado (CCPa) también se han utilizado esporádicamente para revertir el efecto de los AVK,
sin que conozcamos su eficacia o sus posibles ventajas sobre el CCP en
pacientes que reciben AVK. El FEIBA®, que contiene factores II, IX y X
inactivos y factor VII mayoritariamente activado, no ha sido aprobado
para esta indicación e incrementa el riesgo de complicaciones trombóticas.
Modelos animales
El impacto de la reversión del efecto anticoagulante inducido por inhibidores directos de la trombina o del factor Xa en modelos animales se
ha valorado mediante pruebas de laboratorio y reducción de las hemorragias. El PFC no es útil para revertir el efecto del dabigatrán y no disponemos de datos en relación al rivaroxabán. Los CCP con “4 factores”
mejoran los índices de coagulación alargados por el rivaroxabán, sin
embargo no reducen las hemorragias. Por el contrario, sí reducen las
hemorragias relacionadas con el dabigatrán8. En relación al rFVIIa los
resultados son confusos. La administración de 210 µg/kg de rFVIIa en
primates pretratados con dosis altas de rivaroxabán (prolongación del TP
2,54 veces) solo redujo parcialmente el tiempo de hemorragia (34%) a
los 30 minutos. Respecto al dabigatrán, la administración de 0,1 o 0,5 mg
/kg reduce significativamente el tiempo de hemorragia y la prolongación
del TTPa en ratas que recibían dosis altas del anticoagulante (bolo de
1µM/kg seguido de una perfusión de 0,5 µM/kg/h durante 25 minutos).
El efecto de ambos anticoagulantes parece revertirse con CCPa.
Estudios en humanos
La evidencia es extremadamente limitada. Eerenberg et al.15 efectuaron
un estudio aleatorizado doble ciego y controlado frente a placebo efectuado en 12 sujetos sanos que habían recibido 20 mg al día de rivaroxabán, 150 mg de dabigatrán dos veces al día o placebo, previamente a la
administración de 50 UI/kg de CCP. El efecto anticoagulante inducido
por el anti-FXa y determinado por el TP se corrigió de forma inmediata,
casi completa y significativa tras la administración del CCP de “4 factores”. Observaron también que la generación de trombina (TGT) inhibida
por el rivaroxabán (51%±22%, basal 92%±22%; p<0,002) se normalizaba a los 15 minutos de la infusión del CCP (114%±26%; p<0,001).
Por el contrario, el CCP no restauró el TTPa, el tiempo de ecarina o el
tiempo de trombina en los sujetos normales anticoagulados con dabigatrán. Estos resultados obtenidos en sujetos sanos con rivaroxabán son
consistentes con los obtenidos en modelos animales, mientras que los
datos en el caso del inhibidor directo de la trombina son inconsistentes.
También falta por demostrar que, además de la corrección de los índices
de laboratorio observados en este estudio, el CCP sea capaz de detener
la hemorragia en los pacientes anticoagulados con rivaroxabán.
En un estudio ex vivo efectuado en 10 sujetos sanos se obtuvo sangre
citratada antes y a las 2 horas de ingerir una única dosis de 150 mg de
Nuevos anticoagulantes orales
Las estrategias para revertir los efectos de los anticoagulantes con dianas terapéuticas específicas son en gran medida teóricas y basadas en
modelos animales, aunque existen algunos estudios efectuados en sujetos sanos o casos clínicos de pacientes con resultados satisfactorios.
Curiosamente, en estos estudios, la eficacia en la reversión de la anticoagulación se mide por la corrección de los parámetros de laboratorio,
110
Ponencias
dabigatrán o 20 mg de rivaroxabán16. Después de 2 semanas los mismos
voluntarios tomaron el NAO que no habían recibido inicialmente y se
les extrajeron nuevas muestras de sangre. Para valorar la reversión del
efecto anticoagulante se utilizó el TGT después de que las muestras fueran expuestas a CCP, rFVIIa y CCPa. En las muestras con rivaroxabán
el CCPa normalizó todos los parámetros analizados, el CCP corrigió el
potencial endógeno de la trombina (PET), mientras que el rFVIIa solo
modificó los parámetros cinéticos. En el caso del dabigatrán solo se modificaron los parámetros cinéticos del TGT, consiguiéndose la corrección
del prolongado tiempo de latencia con el CCPa y en menor medida con
el rFVIIa. Los resultados sugieren que los CCPa pueden revertir el efecto
del rivaroxabán y que su impacto es menor para el dabigatrán. Dado que
los NAO se utilizan con el fin de prevenir las complicaciones tromboembólicas y que los CCPa incrementan el riesgo trombótico, antes de su utilización debe efectuarse una meticulosa valoración del riesgo-beneficio.
La reversión del apixabán inducida por concentrados procoagulantes
ha sido investigada in vitro por Escolar et al.17, que analizaron la inhibición
del efecto anticoagulante del anti-Xa mediante TGT, los parámetros de la
tromboelastometría (TEM) y la actividad plaquetaria en sangre circulante
sobre superficies vasculares dañadas a una velocidad de cizalladura de
600s-1. Muestras de sangre de 10 sujetos sanos con concentraciones moderadamente elevadas de apixabán (200 ng/mL) fueron analizadas antes y
después de añadirles CCP (50 U/KG), CCPa (50 o 75 U/kg) y rFVIIa (270
µg/kg). Las alteraciones indicadas por el apixabán se corrigieron de forma
variable según el concentrado y el método utilizado. El CCPa fue el más
eficaz en la normalización del TGT y el rFVIIa el más eficaz en corregir
los parámetros del TEM y los estudios de perfusión.
La contribución de la hemodiálisis en reversión de dabigatrán (dosis
única de 50 mg) ha sido evaluada en un estudio farmacocinético. Los
resultados observados en seis pacientes con insuficiencia renal sugieren
que 2 horas de hemodiálisis retiran el 62% del fármaco y 4 horas el 68%18.
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Conclusiones
El sulfato de protamina (para la heparina) y la fitonadiona conjuntamente
con CCP (para los AVK) son las mejores opciones para revertir de forma
inmediata el efecto de los anticoagulantes convencionales. La evidencia
limitada sobre la eficacia y seguridad de los concentrados de factores en
la neutralización del efecto anticoagulante de los NAO hace necesaria
una valoración individualizada del riesgo-beneficio en cada situación
clínica. Estudios ex vivo, in vitro, modelos animales y casos clínicos
aislados sugieren que los CCPa pueden ser eficaces y parecen la mejor
opción con los datos disponible en este momento. Las dosis parecen
ser superiores a las requeridas con los AVK. Es difícil determinar cuál
es la dosis idónea extrapolando datos obtenidos in vitro o de modelos
animales a humanos. La reversión puede facilitarse si se utilizan, combinados con los concentrados de factores, otros acercamientos, como la
hemodiálisis para el dabigatrán, o el carbón activado si el fármaco se la
tomado en un periodo de tiempo inferior a 2 horas.
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111
Sesión Plenaria
Coordinadores:
José María Moraleda Jiménez
Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. Murcia
Vicente Vicente García
Hospital Universitario Morales Meseguer. Murcia
Carlos Solano Vercet
Hospital Clínico Universitario. Valencia
Ginés Escolar Albadalejo
Hospital Clínic. Barcelona
Sesión Plenaria
SP-001 El patrón evolving y otros factores
pronósticos relacionados con el riesgo
de progresión en 218 pacientes con
mieloma quiescente
Tabla 1.
Características
Isola I.1, Fernández De Larrea C.1, Cibeira M.T.1, Rosiñol L.1,
Tovar N.1, Elena M.2, Magnano L.1, Aróstegui J.I.3, Yagüe J.3,
Bladé J.1
1
Servicio de Hematología, 2Servicio de Bioquímica y 3Servicio de Inmunología.
Unidad de Amiloidosis y Mieloma. Hospital Clínic. IDIBAPS. Barcelona
Edad (años), mediana (rango)
64 (32-92)
Género, M/F (%)
38/62
Componente M en suero (g/L), mediana (rango)
24 (0-55)
Isotipo de cadena pesada, n (%)
IgG
IgA
Solo cadenas ligeras
Biclonal
150 (68)
62 (28)
3 (2)
3 (2)
Isotipo de cadena ligera, n (%)
Fundamentos y objetivos: El mieloma múltiple quiescente (MQ) es una discrasia plasmocelular definida por la presencia
de un componente monoclonal en suero (CMs) =30 g/L y/o una
infiltración medular plasmocelular (CPMO) =10%, en ausencia
de síntomas atribuibles a la gammapatía. El riesgo de progresión
a enfermedad sintomática de los pacientes con MQ es variable y
heterogéneo, habiéndose identificado en los últimos años diversos
marcadores pronósticos asociados a riesgo de progresión precoz.
El objetivo de este estudio ha sido analizar los factores asociados
a la progresión a mieloma múltiple (MM) en una serie de 218
pacientes con diagnóstico de MQ en un único centro.
Pacientes y/o métodos: Se revisaron sistemáticamente las
historias clínicas de 218 pacientes con diagnóstico de MQ (International Myeloma Working Group, 2003) evaluados en nuestro
centro entre enero de 1973 y diciembre de 2012. Se definió como
comportamiento evolving el aumento progresivo en el valor del
CMs en las dos visitas tras el diagnóstico, y como inmunoparesis
la disminución de alguna de las dos inmunoglobulinas en suero
no involucradas.
Resultados: Las características clínicas de los pacientes se
resumen en la Tabla 1. El comportamiento evolving se asoció
más frecuentemente al isotipo IgA (p=0,046). Durante los 1.748
años-persona de seguimiento (mediana de seguimiento de los
pacientes vivos de 6,8 años), 108 (49,5%) enfermos progresaron
a MM excepto un caso de amiloidosis AL. La probabilidad estimada de progresión a los 2 y 5 años fue de 19% y 44% respectivamente, y un tiempo libre de progresión (TP) con una mediana
de 7,3 años. En el momento de la progresión, las manifestaciones
clínicas fueron principalmente anemia (51%) y lesiones esqueléticas (40%). La mediana de supervivencia tras la progresión fue
de 5 años. El comportamiento evolving se asoció a una probabilidad de progresión del 45% y 78% a los 2 y 5 años (Figura 1).
En el análisis univariado resultaron significativos como factores
de riesgo al diagnóstico para el TP el valor de CMs (< o =30 g/L;
mediana 16,9 frente a 3,1 años; p<0,001), la presencia de cadenas
ligeras libres en orina (13,4 frente a 3,9 años; p=0,039), la proporción de CPMO (< o =20%; 17,1 frente a 2,9 años; p<0,001),
la presencia de inmunoparesis (4,3 frente a 16,9 años; p<0,001)
y el comportamiento evolving (2,9 frente a 19,3 años; p<0,001).
En el análisis multivariado retuvieron la significación estadística
el comportamiento evolving (HR 4, IC 95% 2,3-7,1; p<0.001),
la plasmocitosis medular (HR 2,3, IC 95% 1,2-4,4, p=0,01) y la
presencia de inmunoparesis (HR 2,2, IC 95% 1,2-4,2, p=0,011).
Considerando estas últimas tres variables, se construyó un modelo
de estratificación de riesgo (Figura 2), siendo la probabilidad de
k
l
Biclonal
127 (58)
89 (41)
2 (1)
Presencia de componente M en orina, n (%)
66 (40)
Inmunoparesis, n (%)
92 (53)
Comportamiento evolving, n (%)
52 (27)
Células plasmáticas en médula ósea (%), mediana
(rango)
15 (2-100)
Criterios diagnósticos MQ, n (%)
CMs ≥30 g/L y CPMO ≥ 10%
CMs < 30 g/L y CPMO ≥ 10%
CMs ≥ 30 g/L y CPMO < 10%
66 (31)
141 (65)
9 (4)
CMs: componente monoclonal sérico; CPMO: células plasmáticas en médula ósea.
Figura 1. Probabilidad de progresión a gammapatía sintomática en pacientes con mieloma quiescente de acuerdo al patrón “evolving” del componente monocional sérico.
progresión a los 2 años del 75% para los pacientes con los 3 factores presentes frente a únicamente del 4% para los pacientes en
el grupo 4 (ningún factor de riesgo).
115
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
hereditarias (TH), son muy complejos (costosos, laboriosos) y de
poca estandarización quedando en muchas ocasiones sin filiar. El
diagnóstico confirmatorio se consigue con el análisis genético y
la identificación de la alteración molecular subyacente. Clásicamente, este se hacía mediante secuenciación de genes candidatos,
pero esta aproximación es muy laboriosa y no aplicable a DHH
de base genética desconocida o con muchos genes candidatos. La
secuenciación masiva representa una alternativa tecnológica cada
vez más barata, accesible y precisa.
Objetivo: Nuestro objetivo fue el diseño y validación de un
panel de secuenciación masiva (NGS) para al diagnóstico de las
DHH y su uso para la potencial identificación de nuevas mutaciones en este tipo de patologías.
Pacientes y métodos: Se diseñó un panel personalizado
mediante el software DesignStudio en el que se incluyeron 106
genes implicados en trombopatías y coagulopatías hereditarias
(Tabla 1). El tamaño total del panel fue de 400 kb y se emplearon más de 2.500 sondas para la captura de 1.570 regiones
diana. Se estudiaron un total de 48 pacientes. Para el proceso
de validación, utilizamos las muestras de ADN de 8 pacientes
no relacionados con TH y la mutación responsable de la enfermedad ya conocida (Tabla 2). Se trababan de dos pacientes
con Tromboastenia Glanzmann (ITGA2B, p.Ala989Thr, p.Val982Met y p.Glu538Ter; ITGB3, p.Leu222Pro y p.Tyr216Cys),
uno con Sd. Hermansky-Pudlak (HPS1, p.Glu204Ter), otro con
Sd. de Bernald-Souliner (GPIX, p.Phe71Ser), un caso de Trombocitopenia amegacariocítica congénita (MPL, p.Arg102Cys)
y 2 pacientes con síndrome de Chediak Higashi (LYST, p.Gly3725Arg y p.Cys258Arg) (Tabla 2). Una vez validado, utilizamos el panel para realizar el diagnóstico molecular en 40
Figura 2. Probabilidad de progresión a gammapatía sintomática en pacientes con mieloma quiescente según la presencia de factores de riesgo
(patrón “evolving”, inmunoparesis e infiltración plasmocelular medular
mayor de 20%).
Conclusiones: En esta serie de pacientes con MQ, el comportamiento evolving, la proporción de células plasmáticas en médula
ósea y la presencia de inmunoparesis pueden predecir la evolución
a enfermedad sintomática. SP-002 Diseño y validación de un panel
de secuenciación masiva dirigida
al diagnóstico de las diátesis
hemorrágicas hereditarias
Tabla 1. Genes secuenciados en el estudio
Bastida J.M.1, del Rey M.2, Benito R.2, Sánchez-Guiu I.3,
Peñarrubia M.J.4, Fisac R.5, García-Frade L.J.6, Aguilar C7,
Cebeiro M.J.4, Martínez M.P.8, Fontecha E.6, Pérez B.9,
Aguilera C.10, Rivera J.3, Lozano M.L.3, Hernández-Rivas J.M.2,
González-Porras J.R.1
Unidad de Trombosis y Hemostasia. Servicio de Hematología. Hospital
Universitario de Salamanca-IBSAL. Salamanca. 2Hospital Universitario
Salamanca. IBMCC. Centro de Investigación del Cáncer. Universidad de
Salamanca-CSIC. IBSAL. Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca.
Salamanca. 3Centro Regional de Hemodonación de Murcia-IMIB. Murcia.
4
Hospital Clínico de Valladolid. Valladolid. 5Hospital General de Segovia.
Segovia. 6Hospital Río Hortega. Valladolid. 7Complejo Asistencial de Soria. Soria.
8
Complejo Asistencial de Ávila. Ávila. 9Complejo Asistencial de León. León.
10
Hospital de El Bierzo. Ponferrada, León
1
Fundamentos: Los estudios fenotípicos y funcionales de diátesis hemorrágicas hereditarias (DHH), como son las trombopatías
116
Sesión Plenaria
SP-003 La mutación MYD88 L265P es un factor
pronóstico independiente en pacientes
con linfoma difuso de células B
grandes (LDCBG)
Tabla 2. Principales mutaciones observadas en el estudio
Fernández Rodríguez C., Bellosillo Paricio B., García García M.,
Sánchez González B., Gimeno Vázquez E., Vela Ortiz M.C.,
Senín Magán A., Pairet García S., Camacho Díaz L.,
Serrano Figueras S., Besses Raebel C., Salar Silvestre A.
IMIM-Hospital del Mar. Barcelona
Introducción: En varios linfomas de células B se ha descrito la presencia de mutaciones en el gen myeloid differenciation
primary response 88 (MYD88). El cambio más recurrente y con
mayor efecto biológico es la sustitución de la leucina en la posición 265 por una prolina (L265P), hallado en cerca del 30% de los
LDCBG de subtipo célula B activada (ABC), siendo infrecuente
en el subtipo centro germinal (GCB).
Objetivo: Estudiar la incidencia de la mutación MYD88 L265P
en pacientes con LDCBG y su correlación con las características
clínico-biológicas, así como con la respuesta al tratamiento.
Métodos: Se estudiaron 175 pacientes con LDCBG diagnosticados en nuestra institución entre 2000 y 2013. Los criterios
de inclusión fueron: disponibilidad de datos clínicos completos,
tratamiento con intención de remisión, suficiente material para
extracción de ADN y ausencia de infección por VIH. La presencia
de la mutación MYD88 L265P se determinó mediante PCR alelo-específica en ADN obtenido de la biopsia parafinada.
Resultados: La mutación MYD88 L265P se halló en 17 de 175
casos (10%) y se observó más frecuentemente en hombres (P=0,019),
casos sin síntomas B (P=0,006) y aquellos con afectación primaria
extranodal (P=0,02). La mutación de MYD88 se observó principalmente en el subtipo ABC (14% frente a 6% en el GCB, P=0,214).
Para el total de la población estudiada, la mediana de seguimiento
fue de 41 meses (rango, 2- 171 meses), con una supervivencia global
(SG) a los 4 años del 69% y una supervivencia libre de progresión
(SLP) a los 4 años del 57%. El análisis univariado mostró que tanto
la mutación MYD88 L265P (P=0,001) como el IPI intermedio-alto (P=0,001) se asociaron de forma significativa a peor respuesta y
menor SG independientemente del origen primario extranodal y del
fenotipo ABC, determinado según el algoritmo de Hans. Un total
de 129 pacientes (74% del total) recibió tratamiento con rituximab
más CHOP o CHOP-like. Los factores que se hallaron asociados
a un mayor riesgo de progresión en este grupo fueron: edad ≥60
años (P=0,026), estadio avanzado (P=0,001), ECOG 2-4 (P=0,002),
LDH elevada (P=0,001), albúmina MYD88 L265P (P=0,011). En el
análisis multivariado, tanto el IPI (P<0,0001) como la mutación de
MYD88 (P=0,023) se correlacionaron significativamente con mayor
riesgo de progresión y también con un mayor riesgo de muerte.
Conclusión: La mutación MYD88 L265P está asociada a un
mayor riesgo de progresión y a una más elevada mortalidad y, aunque este hallazgo requiere de validación en estudios prospectivos,
sugiere que su detección podría ser de utilidad en la práctica clínica
habitual en pacientes con LDCBG.
pacientes afectos de DHH. A partir de 50 ng de ADN de cada
muestra se llevó a cabo la secuenciación masiva mediante el
sistema Nextera Rapid Custom Enrichment. El análisis de los
resultados se realizó mediante las aplicaciones Variant Studio
y Sequencing Analysis Viewer.
Resultados: Obtuvimos un 100% de éxito en el proceso de
validación, al detectar nuestro panel las 11 mutaciones identificadas previamente en otro centro por secuenciación convencional.
Una vez validado, estudiamos a una familia (n=6) con dos miembros afectos de hemorragias mucocutáneas desde la infancia y
megatrombocitopenia. Encontramos alteración en el gen NBEAL2,
compatible con un Sd. de Plaqueta Gris. Además, identificamos la
mutación responsable de la DHH en 3 pacientes con enfermedad
de von Willebrand, 2 con hemofilia C y uno con deficiencia de
FXIII (tabla 2). Encontramos 7 mutaciones que no estaban descritas previamente en la literatura. En este momento, se realiza el
análisis de otros 24 pacientes.
Conclusiones: Hemos validado este panel de NGS para detección de mutaciones en DHH. Esta metodología permite la detección de manera rápida y automatizada, de mutaciones nuevas o ya
conocidas relacionadas con la patogenia de la enfermedad, y por
tanto facilita el diagnóstico molecular de los enfermos con DHH
y su manejo clínico.
117
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
SP-004 Lenalidomida en combinación con
R-ESHAP como régimen de rescate
pre-trasplante en pacientes con linfoma
difuso de células grandes B refractario
o en recaída: ensayo clínico fase Ib
del grupo GELTAMO
Conclusiones: La DMT de lenalidomida en combinación con
R-ESHAP es de 10 mg. El régimen LR-ESHAP tiene un perfil de
seguridad aceptable y una actividad antitumoral prometedora en
pacientes con LDCGB en recaída o refractario pre-tratados con
rituximab, por lo que está justificado realizar nuevos estudios con
este régimen.
Redondo Guijo A.M.1, López-Guillermo A.2, Salar A.3,
González-Barca E.4, Canales M.5, Caballero D.1, Martín A.1
SP-005 Infraexpresión de la deubiquitinasa
BAP1 en neoplasias mieloides: nuevo
mecanismo predominante en leucemia
mielomonocítica crónica
Hospital Clínico Universitario de Salamanca. IBSAL. Salamanca. Hospital
Clinic. Barcelona. 3Hospital del Mar. Barcelona. 4ICO Barcelona. Barcelona.
5
Hospital Universitario La Paz. Madrid
1
2
Introducción y objetivos: Con el empleo de regímenes de
primera línea altamente efectivos que combinan rituximab y quimioterapia, los pacientes con linfoma difuso de células grandes B
(LDCGB) que son refractarios o recaen son difíciles de rescatar
con los tratamientos habituales. Por ello, hemos realizado un ensayo clínico fase I, multicéntrico, para investigar la seguridad y la
dosis máxima tolerada (DMT) de lenalidomida en combinación
con R-ESHAP (LR-ESHAP) como tratamiento de rescate para
pacientes con LDCGB. Se evaluó también la eficacia como objetivo secundario. Número de EUDRACT: 2010-018463-41.
Pacientes y métodos: Se incluyeron en el ensayo pacientes
candidatos a trasplante autólogo de progenitores hematopoyéticos
(TAPH) con LDCGB refractario o en recaída tras una primera línea
que incluyera rituximab y antraciclinas. Los pacientes tenían que
recibir un total de 3 ciclos de lenalidomida (5, 10 o 15 mg) los días
1 al 14 de cada ciclo de 21 días, en combinación con R-ESHAP
a dosis estándar. En el caso de alcanzarse respuesta, los pacientes
debían recibir TAPH con BEAM como acondicionamiento.
Resultados: Durante la fase de escalada de dosis, 3 pacientes
en la cohorte de 15 mg tuvieron toxicidad limitante de dosis:
1 angioedema grado 3 y 2 fallos en la primera movilización,
por lo que se estableció la DMT en 10 mg, expandiéndose esta
cohorte. Se incluyeron un total de 20 pacientes (3, 13, y 4 en
las cohortes de 5, 10, y 15 mg, respectivamente), de los que 19
pacientes fueron evaluables (17 con LDCGB y 2 con linfoma con
características intermedias entre LDCGB y linfoma de Burkitt).
La mediana de edad era de 58 (rango 23–70) años. El estado del
linfoma al LR-ESHAP era: enfermedad refractaria primaria en 13
pacientes y recaída en 6 (3 precoz y 3 tardía). Se han registrado
un total de 17 eventos adversos graves, incluyendo 6 episodios
de neutropenia febril, 3 neumonías, 2 sepsis, 1 alteración iónica,
1 toxicidad renal, 1 angioedema, 2 trombosis (asociadas a catéter
venoso central) y un 1 fallo de injerto tras el TAPH, todos ellos
reversibles, excepto el fallo de injerto, y no se han producido
muertes relacionadas con el tratamiento. 17 pacientes (90%)
completaron los 3 ciclos de tratamiento y 1 paciente 2 ciclos. La
respuesta global con LR-ESHAP fue del 73.7% (42.1% remisión
completa [RC]). 14 pacientes (74% de la serie global) recibieron
el TAPH de acuerdo al protocolo establecido. Con una mediana
de seguimiento de 11.9 (5.9 a 30) meses, la supervivencia libre
de progresión y supervivencia global estimadas a 1 año fueron
del 61% y 63%, respectivamente.
Hurtado A.M.1, Caparrós E.1, Torregrosa J.1, Luengo G.1,
Toderici M.1, de la Morena M.E.1, Muiña B.3, Lozano M.L.1,
Martínez C.1, Amigo M.L.1, de Arriba F.1, Ortuño F.J.1, Vicente V.1,
Ferrer F.1, Jerez A.1
1
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital Universitario Morales
Meseguer. Centro Regional de Hemodonación. IMIB. Universidad de Murcia.
Murcia. 3Unidad de Hematología. Hospital Rafael Méndez. Lorca, Murcia
Fundamentos: En un estudio murino reciente, la depleción
absoluta de BAP1, una deubiquitinasa fundamental en la regulación epigenética de factores de transcripción, relacionada funcionalmente con ASXL1, generó ejemplares con características
similares a los síndromes mielodisplásicos/mieloproliferativos
en humanos (hematopoyesis ineficaz y mieloproliferación), fundamentalmente a la leucemia mielomonocítica crónica (LMMC)
(Dey, et al. Science 2012).
Objetivos: Cuantificar la expresión génica de BAP1 y su posible relación con mutaciones en ASXL1 en pacientes con LMMC.
Comparar dichos niveles con los presentes en una serie de controles y en una cohorte amplia de pacientes con otras neoplasias
mieloides, evaluando su potencial impacto clínico. Determinar la
correlación de los niveles de expresión de BAP1 en sangre periférica y en médula ósea en pacientes con LMMC.
Métodos: Se incluyeron aquellos pacientes diagnosticados
entre 2008-2014 de LMMC, síndromes mielodisplásicos (SMD),
leucemia mieloide crónica (LMC) y leucemia mieloide aguda
(LAM) de los cuales se dispusiese de ADN y ARN de medula
ósea del diagnóstico. Como control se utilizaron 6 donantes sanos
de medula ósea. Los niveles de expresión de BAP1 y BRCA1
se cuantificaron por RT-qPCR, utilizando una misma muestra
de médula ósea de donante sano como calibrador-normalizador
inter-ensayo. El estudio de mutaciones somáticas de ASXL1 en
LMMC se llevó a cabo por el método de Sanger. Para los estudios estadísticos se utilizó el test T de Student, la correlación de
Pearson y/o el test de U Mann-Whitney según correspondiese.
Para el análisis de supervivencia utilizamos la regresión de COX,
y el análisis de curvas COR. Se consideró como estadísticamente
significativo una p<0,05.
Resultados: Se incluyeron muestras de 116 pacientes:
LMMC=26; SMD=15; LAM=50; LMC=25 y seis controles. Nuestro estudio muestra que los niveles de expresión de BAP1 aparecen
disminuidos respecto a los controles a lo largo de todo el espectro
118
Sesión Plenaria
de DCFVK, se administra vitamina K intravenosa y/o oral a dosis
altas (10 mg/d), pero apenas se modifican los parámetros coagulométricos, manteniéndose con INR >7. El estudio genético se realiza secuenciando el promotor, los exones y regiones flanqueantes
de los genes VKORC1 y GGCX. No se encuentran mutaciones en
VKORC1. Sin embargo, el paciente presenta una mutación puntual
en homocigosis que afecta la secuencia aceptora del intrón 1 del
gen GGCX: IVS1 -1G>A. La simulación in silico del efecto de
esta mutación se realizó con el programa Human Splicing Finder
V2.4.1 y muestra un efecto muy severo en el procesamiento del
intrón 1. Esta mutación no ha sido descrita previamente. Estudios
de validación en la familia confirmaron la mutación en heterocigosis en el padre, pero sorprendentemente la madre es homocigota
normal. Resultados de secuencia en padre y madre sugieren que el
alelo materno podría perderse en el paciente. La haploinsuficiencia se objetivó mediante q-PCR con amplicones que abarcan los
exones 1, 5 y 9 empleando dos genes de referencia (SERPINC1
y PMM2).
Conclusiones: Hasta la fecha solo hay descritas 27 mutaciones en GGCX asociadas con DCFVK2. Nuestro estudio describe la primera haploinsuficiencia asociada al desarrollo de esta
enfermedad. Además identificamos la cuarta mutación que afecta al procesamiento de intrones. La haploinsuficiencia del alelo
materno junto al alelo dañado del padre que impide un correcto
procesamiento del intrón 1 (IVS1 -1G>A) justifica la ausencia de
gamma glutamil carboxilasa y por tanto el desarrollo de DCFVK2
en el paciente, así como la ausencia de respuesta al tratamiento
con vitamina K.
Financiación: (ISCIII&FEDER RD12/0042/0050; PI11/1256).
de enfermedades mieloides. En la comparación entre entidades, la
LMMC mostró los valores más bajos (porcentaje respecto a calibrador), significativamente inferiores al resto de grupos, excepto
a los pacientes con LMC: LMMC vs SMD, p=0,001; LMMC vs
LAM, p<0,001; LMMC vs CONTROLES, p<0,001; LMMC vs
LMC, p=0,346. No se encontraron diferencias entre pacientes con
LMMC variante displásica o mieloproliferativa, LMMC tipos I o
II o en función de la presencia de mutaciones en ASXL1 (33% de
los pacientes con LMMC mutados). De potencial interés práctico,
la expresión de BAP1 en médula ósea y sangre periférica mostró
una correlación directa fuerte y significativa (r=0.884, p=0.001).
La expresión de BRCA1 resultó uniformemente disminuida a
lo largo de las distintas enfermedades mieloides, lo que sugiere
que los diferentes niveles de expresión de BAP1 podrían ser los
responsables de distintos niveles proteicos BRCA1 mediante una
regulación postraduccional.
Conclusión: Mostramos por vez primera que la expresión disminuida de BAP1 es un mecanismo común a todas las neoplasias
mieloides, afectando particularmente a la LMMC. Dicho mecanismo es independiente de la presencia de mutaciones en ASXL1
y podría constituir una nueva diana terapéutica en leucemia mielomonocítica crónica. SP-006 Nuevas alteraciones moleculares
en el gen de gammacarboxylasa como
causa de deficiencia combinada de
factores vitamina k dependiente tipo 1
Dasi M.A.1, González-Conejero R.2, Izquierdo S.1, Padilla J.2,
Argiles B.1, Corral J.2
SP-007 Evaluación de los índices pronósticos
de supervivencia (IPSET) y de riesgo
trombótico (IPSET-trombosis) en
una serie de 366 pacientes con
trombocitemia esencial
Unidad de Hematología Pediátrica. Hospital Universitario La Fe. Valencia.
2
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital Universitario Morales
Meseguer y Centro Regional de Hemodonación. IMIB. Universidad de Murcia
1
Introducción: La deficiencia combinada de factores de la
coagulación vitamina K dependientes (DCFVK) es enfermedad
autosómica recesiva muy poco frecuente (GGCXen DCFVK1) y
vitamina K epóxido reductasa (VKORC1 en DCFVK2). Estas dos
proteínas son claves en el proceso de gammacarboxilación, una
modificación postranscripcional que condiciona la funcionalidad
de los factores de coagulación dependientes de la vitamina K.
Presentamos un nuevo caso de esta rara enfermedad y la base
molecular responsable.
Caso clínico: Estudiamos un varón de 13 meses de edad, que
presenta un hematoma 2x3 cm en brazo tras la administración
de una vacuna. No hay antecedentes personales ni familiares de
tendencia al sangrado. No consanguinidad. No dismorfias ni alteraciones esqueléticas. Presenta una comunicación interventricular
y episodios de bronquiolitis. El estudio de coagulación muestra:
I. Quick <10%. TTPA 53,1 s, TT 15,4 s, fibrinógeno Clauss 288
mg/dL, FII 2%; FVII 1,7%; FIX 4,7%; FX 2 %; PC funcional 3%;
PS funcional 3,6%. Se descarta patología adquirida (enfermedad
hepática o malabsortiva) La tasa de VK plasmática es normal, así
como el estudio de coagulación de los padres. Con el diagnóstico
Mosquera Ceballos D.P.1, Gómez M.1, Angona A.2, Álvarez-Larrán
A.2, Senín A.2, Navarro B.1, Hernández-Boluda J.C.1, Besses C.2
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Valencia. 2Servicio de
Hematología. Hospital del Mar. Barcelona
1
Fundamentos y objetivos: Las complicaciones vasculares
son las principales causas de morbimortalidad en los pacientes
con trombocitemia esencial (TE). La edad (≥60 años) y los antecedentes trombóticos, definen clásicamente un grupo de pacientes
de alto riesgo trombótico, en los cuales el tratamiento citorreductor
ha demostrado beneficio clínico. Recientemente, se han publicado
nuevos índices pronósticos de supervivencia (IPSET; Passamonti,
Blood 2012) y trombosis (IPSET-T; Barbui, Blood 2012) en la TE.
El objetivo del presente estudio es aplicar de forma retrospectiva
dichos índices en una serie de pacientes con TE.
Material y métodos: Se incluyeron 366 pacientes (edad
mediana: 64 años, extremos: 9-93; 243 mujeres) diagnosticados
de TE entre 1985 y 2014 en dos hospitales. La mediana de segui-
119
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Conclusiones: Una proporción significativa de los pacientes
con TE son reasignados por el IPSET-T a un grupo de riesgo totalmente distinto al determinado por los criterios convencionales.
Con ello el IPSET-T contribuye a discriminar mejor el riesgo de
trombosis en los pacientes catalogados como de alto riesgo clásico,
pero no aporta información útil en el grupo de bajo riesgo clásico.
Por su parte, el IPSET permite diferenciar tres grupos con distinta
supervivencia.
Agradecimientos: PI10/01807, PI13/00557, PI13/00636,
PI13/00393, 2014SGR/567 y RD12/0036/0010.
miento es de 7,3 años (extremos: 0-27). La Tabla 1 muestra la
distribución de factores de riesgo vascular.
Resultados: Durante el seguimiento 62 (17%) pacientes presentaron trombosis (arterial: 45, venosa: 17), tras una mediana de
5,5 años desde el diagnóstico de la TE, siendo la supervivencia
(SRV) libre de trombosis a los 10 años del 77%. La Tabla 2 muestra la distribución de los pacientes según los índices de riesgo
clásico e IPSET-T, así como la incidencia de eventos trombóticos.
Un 29% de los pacientes catalogados de bajo riesgo por los criterios estándar son de alto riesgo según el IPSET-T. Sin embargo,
la incidencia de trombosis de este subgrupo no es mayor que la
del resto de pacientes de bajo riesgo. En cambio, un 31% de los
pacientes considerados de alto riesgo clásico se ubican en los
grupos de riesgo bajo e intermedio del IPSET-T, siendo su incidencia de trombosis significativamente menor que la de aquellos
catalogados de alto riesgo por ambas escalas. La mediana de SRV
de la serie fue de 24 años, con 64 fallecidos en el momento del
análisis (infección: 14, leucemia aguda: 8, neoplasia: 7, mielofibrosis: 5, trombosis: 5, hemorragia: 3, otras/desconocidas: 22). La
SRV a los 10 años de los grupos de riesgo bajo, intermedio y alto
del IPSET fue del 98%, 78% y 58%, respectivamente (p<0,0001).
SP-008 Papel de las variantes genéticas
constitucionales del miR-146a-5p
en el desarrollo de mielofibrosis
Ferrer-Marín F.1, Torregrosa J.M.1, Arrollo A.1, Bellosillo B.2,
Estrada N.3, Kerguelen A.4, Vélez P.5, Luño E.6, Gómez M.7,
Ayala R.8, Fiallo Dolly V.9, García-Gutiérrez V.10, Arrizabalaga B.11,
Gómez-Casares T.9, Hernández-Boluda J.C.7, Boqué C., Zamora
L.3, Besses C., Vicente V.1, González-Conejero R.1, Martinez C.1
Hospital Morales Meseguer. Centro Regional de Hemodonación. IMIB. Murcia.
Hospital del Mar. IMIM. Barcelona. 3ICO. Hospital Germans Trias i Pujol. IJC
Badalona, Barcelona. 4Hospital La Paz. Madrid. 5Hospital Duran i Reynals. ICO.
Hospitalet de Llobegrat, Barcelona. 6Hospital Central de Asturias. Oviedo.
7
Hospital Clínico de Valencia. 8Hospital 12 de Octubre. Madrid. 9Hospital
Universitario Dr. Negrín. Las Palmas de Gran Canaria. 10Hospital Universitario
Ramón y Cajal. Madrid. 11Hospital de Cruces. Barakaldo, Vizcaya
1
2
Tabla 1. Distribución de factores de riesgo vascular de la serie
Fundamento: Las neoplasias mieloproliferativas crónicas
(NMPc) son enfermedades clonales caracterizadas por hiperproducción de una o más líneas celulares hematopoyéticas. Estas
células clonales producen citocinas que darían lugar a un estado
de inflamación crónica, el cual podría iniciar o conducir la evolución clonal desde fases tempranas de la enfermedad hasta el
estadio final de mielofibrosis (MF). La vía común que relaciona
inflamación y cáncer es NFkb, siendo el miR-146a-5p uno de
sus reguladores (regulador negativo de inflamación). Ratones
deficientes en miR-146a-5p desarrollan, con la edad, un fenotipo de MF. Además, granulocitos de pacientes con MF presentan
infraexpresión de este miRNA. Sin embargo, ningún estudio ha
valorado el papel del miR-146a o de sus polimorfismos funcionales (miRSNP) en el desarrollo de esta enfermedad.
Objetivo: Evaluar el papel de dos polimorfismos funcionales
de miR146a-5p, rs2431697 (~1kb 5´ de MIR146A) y rs2910164
(en el gen MIR146A) en el desarrollo de MF.
Pacientes y métodos: De los pacientes genotipados para
ambos miRSNP (mediante sondas Taqman), fueron evaluables
100/101 con policitemia vera (PV), 149/155 con trombocitemia
esencial (TE) y 172/174 con MF, para rs2431697 y rs2910164
respectivamente. De los pacientes genotipados para rs2431697 y
diagnóstico de PV o TE, disponíamos de seguimiento en 173 casos
(mediana de seguimiento de 16,6 años, RIQ 13,3-23,1). El grupo
control lo formaban 600 sujetos sanos de la misma edad y área
geográfica. El análisis estadístico se realizó con los programas
SNPstats y SSPS 15.0.
Tabla 2. Distribución de los 349 pacientes con trombocitemia
esencial en función de los criterios de riesgo de trombosis
clásicos y el IPSET-T
120
Sesión Plenaria
Tabla 1. Análisis de asociación de genotipos de NMPc para el MiSNP rs 2431697 en NMPc
rs 2431697
Controles
PV
TE
MF
MF secundarias
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
C/C
126
0.21
20
0.2
36
0.24
40
0.23
9
0.19
T/C
309
0.51
51
0.51
74
0.5
74
0.43
20
0.41
T/T
165
0.28
29
0.29
39
0.26
58
0.34
19
0.4
Total
600
100
149
Resultados: Las frecuencia de ambos polimorfismos fue
similar entre pacientes con PV o TE y controles. Con respecto
a los controles, no observamos asociación entre rs2910164 y el
desarrollo de MF. En cambio, observamos una mayor frecuencia
del genotipo TT de rs2431697 (que condiciona menor expresión
de miR-146a-5p) en pacientes con MF (Tabla 1). Al considerar
las MF como primarias y secundarias, el genotipo TT fue más
frecuente en MF secundarias que en controles (TT vs. TC+CC,
p=0.08), sugiriendo que rs2431697 es un factor de riesgo para
el desarrollo de MF secundarias. Así, investigamos el papel de
rs2431697 en la transformación a MF desde otras NMPc comparando la frecuencia de portadores TT en pacientes con MF
secundarias (n=48) y aquellos con PV o TE y seguimiento conocido (n=173). Observamos que, entre pacientes con PV o TE, el
genotipo TT aumenta el riesgo de progresión a MF (OR: 2.11; IC:
1.07-4.15; p=0.03). Además, el tiempo hasta la transformación,
desde el diagnóstico de PV o TE, es inferior en los portadores TT
(mediana de 173 vs. 200 meses, p=0.07).
Conclusión: Nuestros resultados sugieren que, entre los
pacientes con NMPc, el polimorfismo rs2431697 de miR-146a
aumenta el riesgo a desarrollar MF secundarias. De confirmarse
nuestros hallazgos en una serie más amplia, el miRSNP rs2431697
podría tener un valor pronóstico en el seno de las NMPc.
172
48
Introducción: Los pacientes con trombosis venosa profunda
(TVP) idiopática tienen un riesgo considerable (30% a los 5 años)
de sufrir una recurrencia tras la finalización del tratamiento anticoagulante (TAO) habitual. La prolongación del TAO disminuye
esta incidencia pero la tasa anual de hemorragia mayor supera
el 2%, con una mortalidad asociada a evento de hasta el 20%.
La identificación de factores predictores de recurrencia ayudará
a seleccionar aquellos pacientes que más se beneficien de la prolongación del TAO.
Objetivo y métodos: Identificar nuevos marcadores genéticos de recurrencia trombótica evaluando el transcriptoma
a partir de cDNA de sangre periférica de dos poblaciones de
pacientes. Casos: pacientes con un primer episodio de TVP
idiopática que sufrieron una recurrencia en el primer año tras la
finalización del TAO habitual (6-12 meses). Controles: pacientes con una TVP idiopática que no han sufrido recurrencia tras
al menos 2 años de seguimiento tras la finalización del TAO.
Se realizó un análisis mediante un array de expresión [GeneChip
Human Gene 1.0 ST array de Affymetrix] en una población inicial
de 15 casos y 18 controles. Los genes diferencialmente expresados
se validaron en una segunda población independiente de 16 pacientes y 28 controles mediante RT-PCR cuantitativa (sondas de IDT
en plataforma ViiATM 7 Real-Time PCR de Applied Biosystems).
Resultados: En el análisis inicial, ajustado por sexo, se encontró una expresión diferencial (p<0,01) en 45 genes. El estudio
realizado en la población de validación confirmó la expresión
diferencial de ACSF2 (inhibido en casos, p=0,004) y EPOR
(inducido en casos, p=0,045). El análisis mediante curvas ROC
reveló que la combinación de la expresión de ambos genes podría
emplearse como marcador para la predicción de recurrencia
trombótica [área bajo la curva=0,74 (p<0,01) y 0,80 (p<0,001)
en las poblaciones inicial y de validación respectivamente].
Conclusiones: Tanto ACSF2 (implicado en el metabolismo de
ácidos grasos) como EPOR (que codifica para el receptor de la
eritropoyetina) se expresan de forma diferencial en sujetos con
TVP idiopática con y sin recurrencia trombótica. Se precisan estudios adicionales para confirmar estos hallazgos y profundizar en
los posibles mecanismos fisiopatológicos implicados. En caso de
confirmación, además de su valor predictivo (a sumar al de la TVP
residual, dímero-D o sexo) para la predicción de las recurrencias,
cabría plantearse su potencial como futura diana terapéutica.
Financiación: Trabajo financiado por una ayuda a proyectos
de investigación del FIS (PS09/00700).
SP-009 Identificación de nuevos marcadores de
recurrencia en pacientes con trombosis
venosa profunda idiopática. Estudio
retro
Lecumberri R.1, Montes R.2, Guruceaga E.2, González-Porras
J.R.3, Reverter J.C.4, Marco P.5, Pina E.6, Trujillo J.7, Bernardo A.8,
Llamas P.9, Lorenzo A.10, Fernádez-Capitán C.10, Jiménez D.11,
Alfonso A.1, Páramo J.A.1, Hermida J.2
Clínica Universidad de Navarra. Pamplona. 2Centro de Investigación Médica
Aplicada. Pamplona. 3Hospital Universitario de Salamanca. Salamanca. 4Hospital
Clìnic. Barcelona. 5Hospital General Universitario de Alicante. Alicante. 6Hospital
Universitario de Bellvitge. Hospitalet de Llobegrat, Barcelona. 7Hospital Santa
Lucía. Cartagena. 8Hospital Central de Asturias. Oviedo. 9Fundación Jiménez
Díaz. Madrid. 10Hospital Universitario La Paz. Madrid. 11Hospital Universitario
Ramón y Cajal. Madrid
1
121
Comunicaciones
Orales
Comunicaciones Orales
Conceptos básicos en
hemostasia/métodos
de diagnóstico y
marcadores
trombina, en ausencia de heparina. Sin embargo, este impedimento
estérico para la interacción con trombina, fue eliminado cuando la
variante fue activada por heparina. Este comportamiento diferencial con sus dos principales proteasas diana, hace que el mutante
G392N sea una interesante molécula anticoagulante, ya que, al
igual que las heparinas de bajo peso molecular, es más eficaz ante
el FXa que ante la trombina. Además, la presencia de un glicano
adicional en los mutantes N73T y G392N podría incrementar su
vida media. Finalmente, estos resultados avalan que mutaciones
que generaran nuevos sitios de N-glicosilación en el RCL producirían deficiencias de antitrombina tipo IIa.
Financiación: PI12/00657, RD12/0042/0050.
CO-119 Glicoingeniería en antitrombina:
conocimientos básicos y posibilidades
terapéuticas
CO-120 La heparanasa interacciona y activa
la antitrombina a través del dominio
de unión a la heparina
Martínez-Martínez I., Rivera J., Bohdan N., García-Barberá N.,
Vicente V., Corral J.
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario
Morales Meseguer. Centro Regional de Hemodonación. IMIB Universidad de
Murcia. Murcia
Espín S., Águila S., Vicente V., Corral J., Martínez-Martínez I.
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario
Morales Meseguer. Centro Regional de Hemodonación. IMIB Universidad de
Murcia. Murcia
La antitrombina (AT), principal anticoagulante endógeno,
tiene un mecanismo inhibitorio por suicidio, durante el cual su
loop reactivo (RCL), se inserta en la lámina A central formando
una nueva hebra, traslocando la proteasa diana (FXa o trombina)
al polo opuesto, formando complejos covalentes. Esta actividad
inhibitoria se potencia por la unión de su cofactor, la heparina. La
AT presenta una única modificación post-traduccional, la N-glicosilación. Dicha modificación es crucial para la función, el plegamiento, el transporte intracelular, la estabilidad y la vida media
de muchas proteínas. De hecho, diferentes estudios han mostrado
que modificando el contenido de glicanos se puede conseguir un
incremento de la vida media o una mayor especificidad en diferentes proteínas (Brooks et al. JTH 2013, Ní Áinle et al., JBC 2011).
Nuestro objetivo fue evaluar el efecto de glicanos adicionales sobre
la especificidad de proteasa y la vida media de esta proteína anticoagulante. Para ello, realizamos mutagénesis dirigida, producción
de AT recombinante en células HEK-EBNA y su posterior purificación, estudios cinéticos, análisis de la formación de complejos
covalentes mediante SDS-PAGE y estudio in vivo del aclaramiento
de la proteína en un modelo animal. Generamos tres mutaciones en
AT, N73T, A384N y G392N. El mutante N73T, se diseñó buscando
una posición alejada de los dominios clave para la funcionalidad
de la AT (sitio de unión a heparina y RCL) que contuviera glicano
en otras serpinas. De esta forma, se generó un glicano adicional
que no afectaba a la reactividad de esta variante. Por el contrario,
las mutaciones A384N y G392N, introdujeron un nuevo glicano en
el RCL, región por la cual esta serpina contacta con sus proteasas
diana. En ambos casos se redujo la capacidad anticoagulante de
estas variantes, pero por mecanismos distintos. El glicano localizado en posición 384, permitió el reconocimiento de la proteasa, pero
enlenteció la inserción del RCL en la lámina A, comportándose la
AT como sustrato. En cambio, el glicano localizado en posición
392, muy próximo al residuo diana de proteasas (P1), determinó
especificidad, ya que permitió la interacción con FXa, pero no con
Introducción: La heparanasa es una endoglicosidasa que
participa en la morfogénesis, la reparación tisular, el remplazo
de heparán sulfatos de la membrana y la vigilancia inmune. Sin
embargo, se sobre-expresa en las células tumorales favoreciendo
la metástasis, ya que penetra en la capa de células endoteliales
que tapiza los vasos sanguíneos. Esto facilita la diseminación de
las células tumorales hacia otros órganos donde penetran gracias
a la degradación, entre otros elementos, de los proteoglicanos con
heparán sulfato (HSPGs) de la matriz extracelular. La antitrombina (AT) es el principal inhibidor de la cascada de la coagulación,
pero también tiene una función anti-inflamatoria, anti-angiogénica,
anti-apoptótica y anti-viral. Nuestro grupo ha demostrado recientemente que la AT también puede tener un papel anti-metastásico.
Puesto que la heparanasa es bloqueada por las heparinas, que activan a su vez a la AT, quisimos comprobar si la heparanasa es capaz
de interaccionar con la AT y modular su función.
Métodos: Evaluamos la interacción de la heparanasa con la
AT, utilizando proteínas purificadas, mediante electroforesis en
geles de SDS en condiciones reducidas y no reducidas y mediante
geles nativos. La función anti-FXa de la AT fue analizada mediante
ensayos cromogénicos. Utilizamos mutantes recombinantes de AT
que tienen afectado el sitio de unión a heparina (R47C y P41L)
producidos en HEK-EBNA y posteriormente purificados, para
evaluar el potencial sitio de unión de la heparanasa.
Resultados: La heparanasa es capaz de interaccionar con la
AT mediante interacciones electrostáticas o hidrofóbicas que se
pierden con SDS. Esta interacción provoca la activación específica de la AT de forma dosis dependiente. La interacción entre
heparanasa y AT ocurre en el sitio de unión a heparina, ya que la
heparanasa activa sólo ligeramente al mutante R47C. Puesto que la
activación del mutante P41L es nula, este residuo debe ser crucial
en la interacción con la heparanasa.
125
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Conclusiones: Demostramos por primera vez la interacción
entre AT y heparanasa, y la activación de la AT que resulta de
esta interacción. Este efecto podría producirse sólo en condiciones
fisiológicas, donde la heparanasa no tiene actividad endoglicosidasa. Sólo en condiciones de hipoxia, y por tanto de pH ácido, la
heparanasa degrada los heparán sulfatos de los proteoglicanos.
Puesto que estas condiciones, unidas a la sobre-expresión de heparanasa, sólo ocurren en el tejido tumoral, la activación de la AT
en estas condiciones podría no ocurrir. La relevancia fisiológica y
patológica de esta interacción aún está por descubrir.
Financiación: CP13/00126, PI12/00657, RD12/0042/0050.
significativa los niveles de mRNA de SERPINC1 de forma dosis
dependiente (80-100 ng/ml). Estas dosis son muy superiores a las
terapéuticas y el tratamiento de pacientes con paricalcitol (0.4 ng/
ml) no elevó los niveles de AT. El tratamiento con UDCA, tanto
de células HepG2 (hasta 78,5 mg/ml) como de pacientes (90 mg/
ml), no afectó a los niveles de mRNA de SERPINC1 o de AT.
Tampoco se observó efecto sinérgico del UDCA con paricalcitol
en HepG2. Sin embargo, el CDCA (hasta 39,2 mg/ml), uno de los
dos principales ácidos biliares, incrementó 1,5 veces los niveles de
mRNA de SERPINC1 en HepG2 y la combinación con paricalcitol
triplicó estos valores.
Conclusiones: Hemos identificado la primera situación asociada con niveles anormalmente elevados de AT. La acumulación
de un ácido biliar (CDCA) y la suplementación con vitamina D
incrementan la tasa transcripcional de SERPINC1, lo que podría
justificar los niveles circulantes elevados de AT pese a la cirrosis.
Estos resultados junto a la ausencia de complicaciones hemorrágicas en estos pacientes, abren nuevas perspectivas al desarrollo
de fármacos para inducir la expresión de AT con fines antitrombóticos.
Financiación: PI12/00657, RD12/0042/0050.
CO-121 Identificación de estados asociados
con niveles anormalmente elevados
de antitrombina: nuevos elementos
reguladores y potencial aplicación
terapéutica
De la Morena-Barrio M.E.1, Toderici M.1, Miñano A.1, Roldán V.1,
Castilla, C.1, Zuazu I.2, Ramos F.2, Vicente V.1, Corral J.1
1
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario
Morales Meseguer. Centro Regional de Hemodonación. IMIB Universidad de
Murcia. Murcia. 2Servicio de Nefrología. Hospital Universitario Reina Sofía.
Murcia
CO-122 Regulación de los niveles de TFPI
por testosterona a través de miR-27a/b
Arroyo A.B.1, Salloum A.S.1, Pérez Sánchez C.2, Teruel Montoya
R.1, García Barberá N.1, Navarro S.3, Medina P.3, López Pedrera
C.2, Vicente V.1, Gónzalez-Conejero R.1, Martínez C.1
Introducción: El estudio de pacientes con deficiencia de antitrombina (AT) ha permitido identificar dominios funcionales de
este potente anticoagulante endógeno y ha propiciado el desarrollo
de terapias anticoagulantes. Sin embargo, apenas se ha prestado
atención a situaciones donde los niveles de AT son superiores a
la normalidad.
Objetivo: Identificar y caracterizar pacientes con niveles anormalmente elevados de AT y estudiar los mecanismos implicados.
Material y métodos: Análisis de AT plasmática y otras proteínas hepáticas (protrombina, PC, PS, FVII, albúmina, a1-antitripsina) mediante western blot, inmunoelectroforesis y/o
métodos funcionales o coagulantes en 3 pacientes con niveles
elevados de AT. Secuenciación de SERPINC1 (exones, regiones
flanqueantes y 1500pb de la región promotora). Además, se estudió la AT de 6 pacientes tratados con paricalcitol (forma activa
de vitamina D) y 7 con ursochol (UDCA) (ácido biliar con efecto
hepatoptrotector por mecanismos no conocidos). La respuesta
transcripcional del gen SERPINC1 en células HepG2 se evaluó
mediante qRT-PCR.
Resultados: Tres pacientes en lista de espera de trasplante
hepático por atresia de vías biliares (ALT: 140; AST: 161; GGT:
634) presentaban niveles de AT inesperadamente elevados (antiFXa: 150-195%). Estos valores se confirmaron mediante diferentes sistemas inmunológicos o funcionales. Los valores de otras
proteínas hepáticas eran normales o reducidos. No encontramos
alteraciones genéticas relevantes en SERPINC1. Dado que los tres
pacientes estaban tratados con UDCA y vitamina D, planteamos
que estos agentes pudieran contribuir al incremento de AT. De
hecho, en HepG2 el paricalcitol elevó de forma moderada pero
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario
Morales Meseguer. Centro Regional de Hemodonación. IMIB Universidad
de Murcia. Murcia. 2Unidad de Investigación. IMIBIC Hospital Universitario
Reina Sofía. Murcia. 3Unidad de Investigación en Hemostasia, Trombosis,
Arteriosclerosis y Biología Vascular. IIS Hospital La Fe. Valencia
1
Introducción: La expresión del inhibidor de la vía del factor
tisular (TFPI) está regulada en adultos por los niveles de testosterona. Esta regulación contribuye a explicar el efecto protector de
eventos cardiovasculares de la testosterona, y por qué su disminución a partir de los 50 años incrementa la disfunción endotelial y
el riesgo de trombosis. Los mecanismos celulares que subyacen a
esta regulación se desconocen. Nuestro grupo y otros han demostrado la regulación de varios factores hemostáticos entre ellos el
factor tisular por microRNA (miRNA). Sin embargo, el papel de
los miRNA en la regulación del TFPI no se conoce.
Objetivo: Evaluar la regulación de TFPI por testosterona a
través de miRNA.
Métodos: Utilizamos 4 algoritmos para seleccionar miRNA
potenciales reguladores de TFPI. Transfectamos células endoteliales EA.hy926 con precursores e inhibidores de los miRNA (mimic
y antimiR; 100nM), y se trataron con 5a-dihidrotestosterona (DHT)
(30nM, dosis fisiológica, y 15nM durante 24h y 72h). Los niveles de
TFPI se cuantificaron por qRT-PCR y western blot y los de miRNA
por qRT-PCR. La validación de los resultados ex vivo se realizó analizando niveles de TFPI y miRNA en 74 células endoteliales de vena
de cordón umbilical humano (HUVEC). La actividad anticoagulante
126
Comunicaciones Orales
nucleadas y células sin núcleo. Combinando la masa de ARN/
célula y el porcentaje de miRNA, estimado con el uso de un bioanalizador, sobre el total de ARN, calculamos la masa de miRNA/
célula, siendo esta diferente entre los diferentes tipos celulares:
10,23 fgr/granulocito, 3,28 fgr/linfocito T, 3,16 fgr/linfocito B,
0,05 fgr/plaqueta y 0,04 fgr/eritrocito. Cabe destacar el bajo contenido de miRNA en las células sin núcleo.
El análisis por hierarchical cluster no supervisado del perfil de
expresión de los 20 miRNA más abundantes en las diferentes células (un total de 39 miRNA), mostro un heatmap y un dendrograma
muy similares entre linfocitos T y B, y estos a su vez diferentes
a las células mieloides (granulocitos, eritrocitos y plaquetas). A
partir de este análisis pudimos identificar miRNA con una expresión diferencial en alguna de las células: let-7b-5p, miR-106a5p/17-5p, miR-106b-5p, miR-144-3p, miR-26b-5p, miR-374a-5p
y miR-93-5p en eritrocitos, miR-19b-3p en linfocitos T, miR-1260a
en linfocitos B, miR-199a-3p/199b-3p y miR-24-3p en plaquetas;
y miR-148a-3p y miR-191-5p en granulocitos.
Finalmente, utilizando la masa de miRNA/célula y conociendo
el porcentaje de abundancia de cada miRNA, estimamos la cantidad de cada miRNA/célula. Además conociendo el número de
células/µL de sangre, estimamos para todos los tipos celulares, la
cantidad de cada miRNA/µL de sangre. Centrándonos en los 39
miRNAs anteriormente seleccionados, estos resultados mostraron
que los eritrocitos eran las células que más contenido de miRNA
aportaban a la sangre periférica. La reducida cantidad de miRNA/
eritrocito es sensiblemente compensada por el alto número por
volumen de sangre. No obstante, destacamos excepciones que
merecen estudios adicionales, como el hecho de que el 50% del
contenido por µL de sangre de miR-126-3p y miR-24-3p lo aportan
las plaquetas.
Conclusión: Este estudio descriptivo puede ser una herramienta en hematología, que ayude a identificar el origen de miRNA
circulantes en plasma en condiciones fisiológicas y por lo tanto
podrán arrojar pistas sobre su mecanismo y función biológica en
situaciones patológicas.
del TFPI en sobrenadantes de EA.hy926 y HUVEC se determinó
con el kit Actichrome® TFPI activity assay (Sekisui).
Resultados: Encontramos 4 miRNA posibles reguladores del
TFPI: miR-19b, miR-24a, y miR-27a/b. Sólo miR-27a/b produjeron
una disminución del TFPI (RNA y proteína extracelular (100% vs.
75±23%; p=0,04 y 100% vs. 45±12%; p<0,01, respectivamente). Los
anti-miR-27a/b incrementaron tanto el TFPI extracelular (100% vs.
126±19%; p=0,02) como el mRNA (100% vs.146±29%; p=0,02).
Los ensayos de luciferasa demostraron una interacción directa entre
miR-27a/b y el 3’UTR del TFPI. El estudio ex vivo mostró una correlación inversa y significativa entre los niveles de mRNA de TFPI y
miR-27a. La DHT tuvo un efecto dosis-dependiente, aumentando
los niveles de TFPI ~40% (mRNA y proteína) y disminuyendo miR27a/b ~50% con 30 nM DHT. Por último, la actividad funcional del
TFPI aumentó o disminuyó ~20-50% en células transfectadas con
anti-miR27a o precursor de miR-27a, respectivamente.
Conclusión: Nuestros resultados muestran que la expresión
de TFPI está regulada directamente por miR-27a/b en células
endoteliales, con consecuencias funcionales. Además, miR-27a/b
están involucrados en el mecanismo de regulación positiva de TFPI
mediado por testosterona de manera dosis-dependiente. Futuros
estudios son necesarios para evaluar la implicación potencial de
la regulación del TFPI por miRNA en patologías cardiovasculares.
Financiación: ISCIII y FEDER (PI11/00566, PI11/00019,
PI12/01511 y RIC RD12/0042/0050 y RD12/0042/0029), Generalitat Valenciana (Prometeo 2011/027). PM es Investigadora en
el SNS Miguel Servet (ISCIII CP09/00065).
CO-123 Perfil de expresión de microRNA
en componentes celulares de sangre
periférica
Teruel Montoya R., Kong X., Ma L., Edelstein L., Bray P.
Cardeza Foundation for Hematologic Research and Department of Medicine.
Thomas Jefferson University. Philadelphia, USA
CO-124 La adición de la determinación de
factor von Willebrand y N-terminal
pro-BNP a la escala CHA2DS2-VASc
mejora la predicción de riesgo de
eventos tromboembólicos en pacientes
con fibrilación auricular no valvular
bajo tratamiento anticoagulante oral
Introducción: Los microRNA (miRNA) juegan un papel importante en el sistema hemostático. En enfermedad cardiovascular, se
han identificado miRNA circulantes en plasma como biomarcadores. También se ha probado la transferencia de miRNA bioactivos
entre diferentes células, a través de microvesículas. Además, el perfil
de expresión de miRNA circulantes en plasma y suero revela que la
mayoría de miRNA procede de células sanguíneas y endoteliales.
Por ello, es necesario un mayor conocimiento del contenido normal
de miRNA en sangre periférica pues ayudaría a identificar el origen
de los miRNA, ofreciendo la posibilidad de conocer posibles mecanismos que participen en el desarrollo de enfermedades.
Métodos y resultados: Linfocitos B, linfocitos T, plaquetas,
granulocitos y eritrocitos fueron purificados, a partir de sangre
periférica de 5 donantes sanos, mediante centrifugación de gradiente de densidad e immunoselección, obteniendo una pureza
celular de al menos un 98%.
El ARN se extrajo empleando Trizol®. El cálculo de la masa
de ARN/célula mostró una diferencia significativa entre células
Roldán V.1, Marín F.2, Gallego P.1, Vilchez J.A.2, Jover E.2, Valdés M.2,
Vicente V.1
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario
Morales Meseguer. IMIB Universidad de Murcia. Murcia. 2Servicio de Cardiología.
Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. IMIB Universidad de Murcia
1
Introducción: La fibrilación auricular (FA) es la arritmia cardiaca
más frecuente, con una prevalencia global cercana al 1%, llegando a
estar presente en más de un 10% de las personas de edad avanzada.
127
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Introducción: Las complicaciones perinatales en el paciente
con coagulopatías, aunque infrecuentes, presentan una alta morbi-mortalidad, sobre todo la hemorragia intracraneal. En muchos
casos se desconoce la existencia de antecedentes familiares de
hemofilia, y hasta en un 30% de los casos no existen antecedentes.
Sin embargo, ante la sospecha de coagulopatía, se hacen necesarios
protocolos de actuación multidisciplinares, con el fin de minimizar
la aparición de estas complicaciones.
Objetivos: Evaluar los resultados obtenidos en nuestro centro
tras la implantación de un protocolo multidisciplinar que comprende las especialidades de ginecología, neonatología y hematología
en el manejo perinatal de pacientes con sospecha de hemofilia.
Pacientes y métodos: Se han analizado 72 casos de pacientes
con hemofilia nacidos desde el año 2005, tanto en nuestro centro
hospitalario (cuando se implantó el protocolo multidisciplinar),
como en otros centros y que han sido derivados a nuestras consultas para seguimiento. Se ha analizado la existencia de antecedentes
familiares, y la aparición y tipo de complicaciones.
En dicho protocolo se recomienda el parto programado por cesárea, o al menos evitando el parto instrumental. Se indican las especiales precauciones a tener en el manejo neonatal (evitar inicialmente
prueba del talón, evitar vacunación y administración de vitamina K
por vía intramuscular, realizar ecografía cerebral y abdominal).
Resultados: De los 72 pacientes hemofílicos nacidos desde 2005
seguidos en nuestras consultas 26 nacieron en nuestro centro. 60 diagnosticados de hemofilia A (36 grave, 3 moderada y 21 leve) y 12 con
hemofilia B (1 grave, 5 moderada y 6 leve). En los pacientes atendidos
desde la implantación del protocolo en nuestro centro se observó una
única complicación hemorrágica (hematoma post punción venosa en
mano, que no requirió tratamiento sustitutivo). De los 46 pacientes
nacidos en otros centros 8 presentaron complicaciones hemorrágicas.
De estos 8 (2 con antecedentes familiares) 4 presentaron complicaciones hemorrágicas graves (2 hemorragia cerebral, 1 hematoma subgaleal y 1 laceración hepática tras parto instrumental que produjeron
shock hemorrágico). Nuestra experiencia histórica en pacientes nacidos y no nacidos en nuestro centro fue de un 17,5% complicaciones
hemorrágicas (4% hemorragias craneales) durante el período neonatal.
Conclusiones: Con la aplicación de protocolos de manejo perinatal multidisciplinares en pacientes con coagulopatías es posible
reducir la incidencia de complicaciones hemorrágicas, que implican una elevada morbi-mortalidad en estos pacientes.
La complicación más temida de la FA es el infarto cerebral isquémico.
Se ha demostrado como el tratamiento anticoagulante oral reduce en
aproximadamente un 60% el riesgo de ictus, sin embargo, a pesar de
este tratamiento la población de pacientes con FA no valvular (FANV)
sigue siendo una población de muy alto riesgo trombótico, amén del
riesgo hemorrágico que lleva implícito el tratamiento anticoagulante
oral. Las guías de práctica clínica recomiendan el uso de la escala
de riesgo clínica CHA2DS2-VASc, pero su valor en la predicción
de eventos embólicos tras el inicio del tratamiento anticoagulante
oral permanece controvertido. El papel del uso de los biomarcadores
podría ser útil en este sentido, ya que apenas hay datos sobre la información pronostica que pueden aportar biomarcadores, especialmente
en pacientes bajo tratamiento anticoagulante oral (TAO).
Métodos: Estudiamos a 949 pacientes (50% varones; mediana
de edad 76 años) con FANV permanente bajo tratamiento anticoagulante oral con INR 2,0-3,0 al menos durante los 6 meses previos
y clínicamente estables. Se determinó la concentración de troponina T ultrasensible (TnT-us, como marcador de daño miocárdico),
N-terminal pro-BNP (NT-pro-BNP, como marcador de incremento
de la presión intraventricular), interleucina 6 (IL6, como marcador inflamatorio), factor von Willebrand (FvW, como marcador de
daño endotelial) y los monómeros de fibrina (MF, como marcador
protrombótico). Los pacientes fueron seguidos durante 4 años y
registraron los eventos tromboembólicos.
Resultados: En una mediana de seguimiento de 1741 días
(1261-2285), 66 pacientes tuvieron un evento tromboembólico
(tasa anual de 0.14%/año). En el análisis multivariado, fueron
predictores de eventos embólicos la concentración elevada de
FvW (HR 2,36[1,42-3,90], p=0,001), NT-proBNP (HR 1,97[1,193,27], p=0,008) y la escala CHA2DS2-VASc (HR 1,19[1,02-1,40],
p=0,030). El estadístico c de la escala CHA2DS2-VASc para
predecir eventos embólicos bajo tratamiento anticoagulante fue
0,58±0,04, p=0,023. Se observó una mejoría en la capacidad predictora tras la adición de estos dos biomarcardores, estadístico c
del modelo 0,66±0,04 (test De Long, p<0,001).
Conclusiones: La adición a la escala CHA2DS2-VASc de una
estrategia multimarcador, incluyendo el factor von Willebrand y
NT-proBNP, podría ser útil para predecir nuevos eventos tromboembólicos en pacientes ya bajo tratamiento anticoagulante estable.
Financiación: ISCIII y FEDER (P11/1256).
Diátesis hemorrágica
CO-126 Enfermedad de von Willebrand
congénita y angiodisplasia
Blum Domínguez M.A., Suito Alcántara M.A.,
Núñez Vázquez R.J., Pérez Garrido R.
CO-125 Importancia de la aplicación de un
protocolo multidisciplinar en el manejo
perinatal en hemofilia
Hospital Universitario Virgen del Rocío. Sevilla
Fundamentos: Desde hace más de 40 años se ha descrito la
posible asociación entre enfermedad de von Willebrand (EvW) y
angiodisplasia. Recientemente el déficit cuali o cuantitativo del
Factor de von Willebrand en las células endoteliales se ha asociado
al aumento en la neovascularización. También se ha descrito que
la angiodisplasia aumenta con la edad.
Rivas Pollmar M.I., de Ramón Ortiz C., Martín Salces M.,
Álvarez Román M.T., Fernández Bello I., Butta Coll N.,
Jiménez Yuste V.
Hospital Universitario La Paz. Madrid
128
Comunicaciones Orales
Tabla 1.
TPTA (25-37)
Nivel
FVIII:C
Nivel
vWF: Ag
Nivel vWF
R:Co
Agregación plaquetaria
Plaquetas
Paciente 1
Ocasional alargamiento
TTPA (40s)
45
43.3
22
Compatible con EvW 2B
37x10e9/L
Paciente 2
39s
53.5
37
16
Compatible con EvW 2B
22 x10e9/L
Paciente 3
42s
22
52
36
Normal
220 x10e9/L
Paciente 4
Normal
38
34
24
Compatible con EvW 2B
41 x10e9/L
Patrón multimérico
Ausencia multímeros de
alto peso molecular
Fundamentos y objetivo: La existencia de materiales artificiales implantados en la circulación se asocia frecuentemente a la
aparición de un síndrome de von Willebrand adquirido (AvWS).
Este hecho se ha atribuido a un consumo acelerado de los multímeros de mayor peso molecular (HMW) del factor von Willebrand
(vWF) circulante debido al shear stress sobre las superficies no
fisiológicas, pero existen adicionalmente patologías crónicas en las
que la propia enfermedad de base está relacionada con alteraciones
cuanti y cualitativas del vWF. En este estudio se intenta objetivar si
el AvWS en los implantes de un dispositivo de asistencia ventricular izquierda (LVAD) se halla ocasionado por el propio implante,
o pueden existir alteraciones previas al mismo.
Pacientes y métodos: Hemos estudiado 12 pacientes con
insuficiencia cardíaca crónica (ICC), con edades entre 39 y 79
años (mediana 62.8) a los que se implantó un LVAD, bien como
tratamiento de destino, bien como puente para trasplante ortotópico de corazón. Las muestras fueron extraídas sobre citrato,
antes de la implantación y después de 7 días de la misma. Sobre
el plasma pobre en plaquetas obtenido, se cuantificaron, mediante
técnicas de ELISA, el antígeno asociado al vWF (vWF:Ag, µg/
mL) y la capacidad de unión al colágeno (vWF:CBA, %/dL). El
análisis multimérico fue realizado por electroforesis discontinua
sobre gel de agarosa, y las bandas reveladas mediante fluorescencia
directa en el propio gel en un sistema de imagen infrarroja (Li-Cor
Odyssey SA scanner®). La cuantificación de cada banda fue realizada a través de un posterior análisis densitométrico mediante
dos software consecutivos (Image-J and Image Studio Lite 3.x),
y sus datos expresados como porcentaje de la intensidad de cada
banda contra la suma de todas las intensidades. Los HMW han
sido definidos como asociados a las bandas de migración más
lenta (11.ª y superiores).
Resultados: Los pacientes con ICC antes de la implantación de
LVAD presentaban un descenso de los multímeros de HMW comparados con los controles (n=12; 18.1±9.9 vs 31.4±5.8 %; p=0.001,
ANOVA). Una semana después, el porcentaje de multímeros de
HMW se hallaba descendido respecto a las muestras pre-LVAD
(11.2±8.7%, p=0.003, paired t-test). Las ratios vWF:CBA/vWF:Ag
también fueron inferiores a los controles antes del implante, y descendían aún más 1 semana después (normal 0.97±0.09; pre-LVAD
0.45±0.28, p<0.001; post-LVAD 0.39±0.22, p<0.001).
Conclusiones: Los pacientes con ICC sometidos a inserción de
un LVAD ya presentan una disminución de los multímeros de HMW
antes de la implantación del dispositivo, alteración que se intensifica
más profundamente tras una semana de operatividad del LVAD.
Presentamos una serie de cuatro casos en los que ambas entidades coexistieron, con episodios de hemorragia digestiva.
Material y método: Analizamos cuatro casos diagnosticados
de enfermedad de von Willebrand (tres de una misma familia) tres
varones y una mujer, que han presentado eventos hemorrágicos del
tubo digestivo y presencia de angiodisplasias corroboradas por estudio
endoscópico y anatomopatológico. Se recoge el tratamiento realizado.
Resultados: El subtipo de enfermedad de von Willebrand
predominante fue el 2B (75%), mientras que el paciente restante
presenta el subtipo 2.ª (Tabla 1). Tres pacientes presentaron en el
estudio genético la mutación R1306W (3916 C>T). La media de
edad al diagnóstico de la angiodisplasia de los pacientes fue de
56 años (rango 47-74).
Los cuatro pacientes presentaron 14 lesiones angiodisplásicas
en total, localizadas en yeyuno (28%), antro gástrico (14%), duodweno (14%), colon (14%), íleon terminal (14%) y ciego (14%). La
mediana en número de angiodisplasias por paciente fue de 3 (rango
1-8). En todos los pacientes los episodios hemorrágicos digestivos precisaron tratamiento sustitutivo con concentrados de FVIII/
FvW y antifibrinolíticos para su control. Dos pacientes requirieron
tratamiento endoscópico: uno con argón plasma y colocación de
hemoclips y otro electrocoagulación y resección intestinal. Los pacientes realizaron periodos de profilaxis intermitente
con concentrados de FVIII/FvW tres veces en semana durante los
episodios hemorrágicos.
Conclusiones: En pacientes con EvW el sangrado gastrointestinal secundario a angiodisplasia es uno de los eventos hemorrágicos de más difícil control. Todos nuestros pacientes son del
EvW tipo 2. En nuestros pacientes las angiodisplasias se diagnosticaron a partir de la quinta década de la vida en relación con el
evento hemorrágico. El tratamiento profiláctico, que implica un
gran aumento del coste, no siempre impide nuevos resangrados.
CO-127 Síndrome de von Willebrand adquirido
en los dispositivos de asistencia
ventricular izquierda: alteraciones
multiméricas preexistentes
Monteagudo J.1, Ahamed J.1, Mancini D.2, Coller B.S.1
1
Laboratory of Blood and Vascular Biology. Rockefeller University. New York,
USA. 2The Heart Transplantation Center. Columbia University. New York, USA
129
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
CO-128 Curación de un paciente con
enfermedad de von Willebrand tras
un trasplante de pulmón
Se ha descrito la corrección de la coagulopatía en cerdos con
EvW tipo 3 tras un TP (Broulan JP et al. Arterioscler Thromb Vasc
Biol. 1999), aunque existían dudas sobre si estos datos podrían
ser extrapolables al TP en humanos, en el que el rechazo o el TIS
podrían alterar el endotelio vascular y la producción de FvW.
En nuestro caso, al ser los pulmones órganos muy ricos en
células endoteliales, productoras de FvW y presentar el paciente una EvW tipo 1 el trasplante ha resultado en la curación de
la enfermedad, siendo en nuestro conocimiento, el primer caso
publicado en el que un TP cura una EvW (Tabla 1).
Lario Arribas A.1, Gil S.1, Forés R.1, Campo-Cañaveral J.L.1,
Gómez de Antonio D.1, Laporta R.1, Martín M.2,
Anze G.1, Dorado N.1, Bueno J.L.1, Cabrera J.R.1
Hospital Universitario Puerta de Hierro Majadahonda. Madrid. 2Hospital
Universitario La Paz. Madrid
1
La enfermedad de von Willebrand (EvW), la diátesis hemorrágica congénita más frecuente, está causada por una anomalía del
factor de von Willebrand (FvW), una glicoproteína multimérica
producida en células endoteliales y megacariocitos responsable
de la adhesión y agregación plaquetaria así como de la protección
del factor VIII (FVIII) de la proteinólisis. El tipo 1, el más frecuente, presenta una deficiencia parcial cuantitativa de FvW, con
distribución de multímeros cualitativamente normal. En modelos
experimentales de trasplante de pulmón (TP) en animales se ha
sugerido que este procedimiento podría curar la EvW, por la gran
riqueza en FvW del árbol vascular pulmonar.
Presentamos el primer caso de TP en humanos que ha resultado en la curación de un paciente con EvW tipo 1.
Se trata de un varón de 26 años, diagnosticado de EvW tipo
1 en noviembre/2012 (FvW:Ag 39%; FvW:RCo: 44U/dL; FVIII:
99%). Fue remitido a nuestro centro para la realización de un TP
por fibrosis quística. Tras confirmar el diagnóstico de EvW tipo1
(descenso de FvW y estructura multimérica normal), el paciente
fue sometido a la cirugía en abril/2013. Durante la misma y en el
post-TP, se administró profilácticamente FVIII y FvW (Haemate-P®), sin complicaciones hemorrágicas relevantes. Desarrolló
como complicaciones post-TP: disfunción primaria del injerto
grado 2, fracaso renal agudo, lesiones isquémicas cerebelosas de
probable origen hemodinámico y posible rechazo pulmonar, que
respondió al tratamiento con plasmaféresis y esteroides. Fue dado
de alta en junio/2013, sin problemas añadidos y permaneciendo en
tratamiento inmunosupresor (TIS) con tacrolimus, micofenolato
mofetilo y prednisona hasta el momento actual (+ 14 meses). La
evolución de los valores de APTT, FVIII, FvW: Ag, FvW:RCo y
TO pre- y post-TP, están recogidos en la Tabla 1.
Los estudios analíticos realizados a los 5, 11 y 14 meses postTP, revelaron una corrección mantenida de todos los parámetros,
pudiendo afirmar que el paciente se encuentra actualmente curado
de su EvW.
CO-129 Descubrimiento de CM-352, un nuevo
antifibrinolítico para controlar la
hemorragia y reducir las transfusiones
de sangre
Orbe J., Rodríguez J.A., Sánchez J.A., Montori L., Salicio A.,
Belzunce M., Ugarte A., Chang H.C.Y., Rabal O., Oyarzabal J.,
Páramo J.A.
Atherothrombosis Laboratory. Division of Cardiovascular Science. Center for
Applied Medical Research. Universidad de Navarra. Pamplona
Fundamentos: La hemorragia es una complicación importante tras cirugía o trauma que requiere transfusiones, conlleva
elevada morbi-mortalidad y alto coste sociosanitario. La hiperfibrinólisis es un mecanismo importante de hemorragia en estas
situaciones, por lo que la administración de antifibrinolíticos tipo
ácido tranexámico (TXA) es una alternativa eficaz a las transfusiones de sangre. Sobre la base del efecto profibrinolítico de
las metaloproteasas (MMPs), nuestra hipótesis se basa en que su
inhibición puede representar una nueva estrategia para el control
de la hemorragia.
Métodos: Hemos sintetizado y caracterizado una nueva serie
de compuestos químicos con efecto antifibrinolítico e inhibición
de MMPs mediante estudios de tromboelastometría (ROTEM) y
análisis bioquímicos de actividad de MMPs. Aquellos que mostraron una reducción de un 50% del tiempo de lisis del coágulo
in vitro fueron testados en dos modelos de hemorragia en ratones:
hemorragia moderada (medida como tiempo de hemorragia en
la cola tras administración de t-PA) y hemorragia severa (hepatectomía parcial), comparando los resultados con los de TXA.
Se realizaron estudios de ADME/toxicidad y seguridad con dosis
elevadas de los compuestos para descartar la aparición de fenómenos trombóticos.
Resultados: El compuesto CM-352, pan-inhibidor de MMPs,
redujo significativamente el tiempo de hemorragia (89%) en el
modelo de hiperfibrinólisis/hemorragia moderada, a una dosis de
10 µg/Kg, 30.000 veces inferior a la de TXA. Además redujo en
un 30% la hemorragia en el modelo de hepatectomía, mientras
que TXA no mostró ningún efecto. CM-352 presentó un perfil de
eficacia y seguridad óptimo, sin efectos cardiovasculares. Finalmente, se realizaron estudios anatomopatológicos empleando una
dosis 1000 veces superior (10 mg/kg), sin observarse formación
de trombos en pulmón, cerebro, riñón e hígado.
Tabla 1.
130
Comunicaciones Orales
Conclusiones: Hemos descubierto y caracterizado el compuesto CM-352 que inhibe la fibrinólisis y reduce las pérdidas sanguíneas a través de un nuevo mecanismo de acción. Este estudio
preclínico puede constituir la base para el empleo de este agente
en diferentes condiciones médicas o quirúrgicas, para controlar la
hemorragia y reducir las transfusiones de sangre.
Financiación: FIMA-Universidad de Navarra.
a PGE1 (IC50: 0.08 µM vs. 0.39 para LTA-Col; p<0.01; 0.04 vs.
0.18 µM para LTA-ADP; p=0.06). Por el contrario, la inhibición
con PGE1 de LTA-TRAP y LTA-U46619 fue similar en neonatos
y adultos. En los test de CF, la inhibición con PGE1 (25 y 250
nM) de la expresión de selectina-P tras estimular con TRAP y
ADP, fue similar en neonatos y adultos (61% en TRAP y 48% en
ADP, para PGE1 250 nM). Tampoco apreciamos diferencias en la
fosforilación de VASP inducida con PGE1 entre sangre total de
neonato y adulto.
Conclusión: Nuestro estudio revela, por primera vez, la hipersensibilidad de las plaquetas neonatales a PGE1. Aunque el efecto
inhibidor de la PGE1 en la secreción granular y su capacidad de
fosforilar a VASP es comparable en adulto y neonato, la PGE1
inhibe más eficazmente la LTA en neonatos que en adultos. Estos
hallazgos son de interés en sujetos de edad infantil puesto que
tratamientos antiagregantes plaquetarios como el dipiridamol actúa
aumentando los niveles de AMPc.
CO-130 La hipersensibilidad de las plaquetas
neonatales a la PGE1 revela un nuevo
mecanismo regulador de la reactividad
plaquetaria del recién nacido
Torregrosa Díaz J.M.1, Caparrós-Pérez E.1, Delgado J.L.2,
Blanco J.E.2, Lozano M.L1, Vicente V.1, Rivera J.1, Ferrer-Marín F.1
1
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario
Morales Meseguer. Centro Regional de Hemodonación. IMIB Universidad de
Murcia. Murcia. 2Unidad de Medicina Materno-Fetal. Servicio de Ginecología
y Obstetricia. Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca. IMIB
Universidad de Murcia. Murcia
Trombosis
Fundamento: Las plaquetas neonatales son hiporreactivas in
vitro frente a la mayoría de agonistas fisiológicos, pero los mecanismos subyacentes no son totalmente conocidos y es controvertido si este fenotipo tiene relevancia in vivo, particularmente en
condiciones de daño vascular. Las plaquetas circulan expuestas a
agentes activadores e inhibidores derivados del endotelio, como
prostaciclina (PGI2) u óxido nítrico (NO). El balance entre su
sensibilidad a agentes activadores e inhibidores, determinará su
reactividad in vivo. La protaglandina E1 (PGE1) es un antiplaquetario que, como la PGI2, actúa estimulando la síntesis de AMPc, y
subsiguiente activación de proteína kinasa A (PKA) y fosforilación
de proteínas como VASP (vía inhibitoria AMPc/PKA). Hasta la
fecha, ningún estudio ha valorado el papel de esta vía inhibitoria
en la hiporreactividad plaquetaria neonatal.
Objetivo: Evaluar la vía AMPc/PKA en plaquetas neonatales
y de adulto.
Pacientes y métodos: Obtuvimos plasma rico en plaquetas (PRP) de sangre de cordón umbilical (CU) (n=8) o de sangre periférica de adulto (n=6); el PRP se preincubó (5 min, T.ª
ambiente) con dosis crecientes de PGE1 (0-1 µM), y se realizó:
1). Agregación plaquetaria (LTA) con distintos agonistas (TRAP
25 µM, ADP 5 µM, colágeno 5 µg/mL, ristocetina 1,25 µM, ácido
araquidónico 1,6 mM y U46619 2,5 µM); 2) Valoración por citometría de flujo (CF) de Selectina-P y GPIIb/IIIa en forma activa
(PAC-1), basalmente y tras activar con TRAP. También, mediante
CF, se valoró la fosforilación de VASP en sangre total de neonato
y adulto estimulada con PGE1 (PLT VASP/P2Y12, Biocytex®).
Resultados: En ausencia de PGE1, la LTA con todos los agonistas,
y la expresión de selectina-P fueron menores en neonatos vs. adultos. Llamativamente, no observamos unión de PAC-1 en plaquetas
neonatales estimuladas con TRAP, y sí en plaquetas de adulto.
En los ensayos de inhibición con PGE1 de LTA inducida con colágeno y ADP, vimos que las plaquetas neonatales son más sensibles
CO-131 Modelos de estimación de riesgo de
enfermedad tromboembólica venosa
en oncología: optimización de la
capacidad predictiva
López Moreno S.1, Muñoz A.J.3, Ziyadinov A.1, Souto J.C.2,
Castellón V.4, Pachón V.5, Martínez V.6, Calzas J.7, Salgado M.8,
Martínez de Castro E.9, Luque R.10, Martín M.3, Soria J.M.1,11
Unitat de 1Genómica de Malalties Complexes y de 2Trombosis i Hemostasia.
Institut d’Investigació Biomèdica Sant Pau. Barcelona. 3Hospital General
Universitario Gregorio Marañón. Madrid. 4Complejo Hospitalario Torrecárdenas.
Almería. 5Hospital Universitario Ramón y Cajal. Madrid. 6Hospital Universitario
La Paz. Madrid. 7Hospital Universitario de Fuenlabrada. Madrid. 8Complejo
Hospitalario Universitario de Ourense. Ourense. 9Hospital Marqués de Valdecilla.
Santander. 10Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada. 11En nombre
del Grupo de Trabajo en Cáncer y Trombosis, de la Sociedad Española de
Oncología Médica (SEOM)
La enfermedad tromboembólica venosa (ETV) es una complicación grave y muy común en pacientes con cáncer, siendo una de
las principales causas de muerte en estos pacientes. La mayoría de
los casos de ETV asociados a cáncer ocurren en pacientes ambulatorios y el riesgo de trombosis varía notablemente entre los pacientes. Actualmente, el score de Khorana es un modelo validado de
estimación de riesgo de ETV basado en variables clínicas, pero
presenta una capacidad predictiva mejorable. Es importante destacar que la ETV es una enfermedad multifactorial que resulta de
la interacción de factores genéticos y ambientales, con un elevado
componente genético (heredabilidad ~60%). Por ello, los factores
genéticos de susceptibilidad a la trombosis deberían ser esenciales
en el desarrollo de modelos de predicción. Sin embargo, el riesgo
131
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
genético sustancial a la trombosis en pacientes oncológicos no se
ha tenido en cuenta en los modelos existentes. En abril de 2013
iniciamos el estudio ONCOTHROMB, diseñado para optimizar
los algoritmos de estimación de riesgo de ETV en pacientes con
cáncer que reciben quimioterapia sistémica en un medio ambulatorio. Es un estudio prospectivo, traslacional, observacional y
longitudinal. Incluye 400 pacientes con cáncer localmente avanzado o metastásico (colon, estómago, páncreas y pulmón) que se
monitorizarán durante dos años para determinar la aparición o
recurrencia de trombosis sintomática o asintomática. Los pacientes
se dividirán en casos y controles, según sean diagnosticados de
ETV o no, respectivamente. Se están recogiendo datos demográficos, clínicos (incluyendo score de Khorana) y genéticos de cada
paciente. Se determinará el perfil genético asociado a ETV en
todos los pacientes mediante genotipación usando ThromboinCode
(TiC) y se incluirá en el algoritmo de predicción. La capacidad
predictiva de dicho algoritmo se definirá de acuerdo a la capacidad de discriminación de las diferentes funciones de riesgo de
ETV expresadas como el área bajo la curva (AUC) y a los índices
de reclasificación NRI (net reclassification improvement index) e
IDI (integrated discrimination improvement index) que estiman la
mejora predictiva al incluir biomarcadores adicionales al modelo.
De los 49 pacientes con cáncer monitorizados durante los
primeros 6 meses, 9 (18.4%) sufrieron trombosis sintomática. El
score de Khorana mostró una AUC=57.4, mientras que el score
TiC mostró una AUC=67.9 (P<0.001). La adición del parámetro
‘estadio del cáncer’ (cancer disease status, CDS) mejoró la capacidad predictiva en ambos modelos, siendo el score TiC el que
mostró una mejora superior (scoreTiC-CDS AUC=83.3 vs scoreKhorana-CDS AUC=73.8; P<0.001).
Nuestros resultados indican que el score basado en el perfil
genético de susceptibilidad a la ETV (scoreTiC) mejora de forma
significativa la capacidad predictiva de los modelos de estimación
de riesgo actuales, basados en variables clínicas (scoreKhorana).
Además, la adición de información acerca del estadio del cáncer
(CDS) mejora la capacidad predictiva en ambos modelos, presentando el scoreTiC-CDS una mejora superior. Hay que tener
en cuenta que se trata de un estudio preliminar limitado a un porcentaje pequeño de la muestra ONCOTHROMB, lo cual destaca
el potencial del scoreTiC en la mejora preventiva, diagnóstica y
terapéutica de la ETV en pacientes oncológicos.
Financiación: TiC ha sido desarrollado por Ferrer inCode, España. Estudio parcialmente financiado por Leo-Pharma, Ferrer inCode
y la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia (SETH).
Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín. Las Palmas de Gran Canaria. 4Hospital
Clínico Universitario. Valencia. 5Hospital San Jorge. Huesca. 6Hospital Insular.
Las Palmas de Gran Canaria
Fundamentos: Se han observado niveles elevados del inhibidor del activador tisular del plasminógeno (PAI-1) en pacientes
sépticos. Sin embargo, no se ha establecido su asociación con la
gravedad, mortalidad y estado inflamatorio en el curso de la hospitalización.
Métodos: Estudio multicéntrico, observacional en seis Unidades de Cuidados intensivos (UCI) incluyendo 260 pacientes con
sepsis grave. Se determinó el índice de severidad SOFA (Sepsis.
related Organ Failure Assessment) y se determinaron los niveles
circulantes de PAI-1 (ELISA, Imubind), factor de necrosis tumoral
(TNF)-a (ELISA, Immulite), ácido láctico y estudio básico de coagulación los días 1, 4 y 8, tras su admisión en la UCI y se analizó
la mortalidad en el día 30.
Resultados: Los pacientes sépticos que fallecieron (n=89)
presentaron niveles de PAI-1 significativamente más elevados
que los que sobrevivieron (n=171) en los días 1 (58,4 vs 36,5
ng/mL; p<0.001), 4 (34,0 vs 16,2 ng/mL; p<0.001) y 8 (30,6 vs
18,9 ng/mL; p=0.004), tras su ingreso en la UCI. Observamos una
correlación positiva de los niveles de PAI-1 con el índice SOFA,
ácido láctico, TTPA, INR y TNF-a, y negativa con el recuento de
plaquetas los días 1, 4 y 8. El análisis de regresión logística mostró que los niveles de PAI-1 los días 1 (p<0.001), 4 (p<0.001) y 8
(p=0.001) se asociaron de manera significativa con la mortalidad
en el día 30. El análisis mediante curvas ROC del área bajo la curva
de PAI-1 en la predicción de mortalidad los días 1, 4 y 8 fue 0,65
(IC 95%=0,58-0,72; p<0.001), 0,69 (IC95%=0,60-0,78; p<0.001)
y 0,65 (IC95%=0,54-0,75; p=0.005) respectivamente.
Conclusiones: Se trata de la serie más numerosa determinando
los niveles circulantes de PAI-1 en el curso evolutivo de la sepsis. Las concentraciones de PAI-1 durante la primera semana de
hospitalización en la UCI se asociaron significativamente con la
inflamación, la severidad y la mortalidad en pacientes sépticos, por
lo que el PAI-1 representa un importante biomarcador pronóstico
en estos pacientes.
CO-133 Next Generation Sequencing para
abordar los determinantes genéticos
de la vía intrínseca de la coagulación:
proyecto GAIT-2
Martín-Fernández L.1, Corrales I.3, Ramírez L.3, Souto J.C.2,
Vidal F.3, Soria J.M.1
CO-132 El aumento progresivo de PAI-1 durante
la hospitalización en la UCI se asocia
con peor pronóstico y mortalidad en
pacientes sépticos
Unitat de 1Genòmica de Malalties Complexes y de 2Hemostàsia i Trombosi.
Institut d´Investigació Biomèdica Sant Pau. Barcelona. 3Unitat de Diagnòstic i
Teràpia Molecular. Banc de Sang i Teixits. Barcelona
Fundamentos: La enfermedad tromboembólica venosa (ETV) es
común y multifactorial con interacción de factores de riesgo genéticos
y adquiridos. Como parte del proyecto Genetic Analysis of Idiopathic
Trombophilia 1 (GAIT-1), se ha determinado la importancia de la vía
Martín M.M.1, Borreguero León J.M.2, Solé-Violán J.3,
Ferreres J.4, Labarta L.5, Díaz C.6, Jiménez A.2, Lorente L.2
Hospital Universitario Nuestra Señora de Candelaria. Santa Cruz de Tenerife.
Hospital Universitario de Canarias. La Laguna, Santa Cruz de Tenerife. 3Hospital
1
2
132
Comunicaciones Orales
Introducción: El sistema de GAS6/TAM es un importante
regulador de la respuesta inmunitaria. El sistema está formado por
dos ligandos, GAS6 y proteína S, pertenecientes a la familia de
proteínas dependientes de vitamina K, y tres receptores tirosina
quinasa, Tyro3, Axl y MerTK. Las células presentadoras de antígeno, los macrófagos y las células dendríticas emplean receptores
de este sistema y sus ligandos para detectar células en apoptosis
y eliminarlas por fagocitosis. Además, la estimulación de estos
receptores inhibe la respuesta de los macrófagos a LPS y de las
células dendríticas a IFN alfa. Estas características confieren al
sistema GAS6/TAM propiedades antiinflamatorias.
Los ratones deficientes en los tres receptores TAM y específicamente el receptor MerTK tienen claros signos de enfermedad
autoinmune en edades avanzadas, sugiriendo un papel de este
sistema en la autoinmunidad. Además, sus componentes están
ligados con la regulación de la coagulación. Recientemente se ha
demostrado que los pacientes con trombosis venosa profunda tienen niveles elevados de GAS6. Con estos datos, nos propusimos
determinar la concentración de GAS6 y las formas solubles de
los receptores TAM en pacientes con síndrome antifosfolipídico
(SAF). El síndrome es un desorden autoinmune que conduce a la
producción de auto-anticuerpos dirigidos contra fosfolípidos de las
membranas celulares y se asocia con trombosis venosa y arterial.
Métodos: GAS6, sMerTK y sAXL fueron medidos en plasma
obtenido a partir de muestras de sangre recogidas en citrato de
un grupo de 44 pacientes de SAF y 44 controles sanos. La concentración fue medida mediante la técnica de ELISA empleando
anticuerpos adecuados (R&D Systems).
Resultados: En un grupo de 44 pacientes con SAF, de los que
conocíamos su perfil antifosfolipídico y 44 controles sanos, determinamos la concentración plasmática de GAS6, sAXL, y sMerTK.
Los valores fueron significativamente superiores en pacientes con
SAF para los tres valores, siendo la concentración de GAS6 en
plasma de pacientes con SAF 23,7±8,5 ng/mL respecto a 17,1±4,1
ng/mL en controles (P<0.0001). Las diferencias fueron también
significativas en sMerTK (8,8±4,5 vs. 14,0±8,0; P<0.0001); y sAxl
(35,8±13,2 vs. 69,1±39,2; P<0.0001). Los valores de estos parámetros se correlacionaron con diferentes patrones de anticuerpos
antifosfolípidicos detectados en los pacientes.
Conclusión: La concentración de GAS6 y sus receptores está
aumentada en plasma de pacientes con síndrome antifosfolipídico.
Esta inducción del sistema podría indicar un papel de la actividad
reguladoras de la inmunidad por la señalización por Axl y/o MerTK en el síndrome antifosfolipídico.
intrínseca de la coagulación (VIC) mediante el estudio de la heredabilidad de fenotipos intermediarios implicados y su asociación con el
riesgo de ETV. Además, a partir de análisis genéticos de ligamiento
y asociación, se han identificado genes candidatos implicados en la
variabilidad de los parámetros de la VIC.
Objetivo: Nuestra estrategia consiste en secuenciar mediante
Next Generation Sequencing (NGS) los genes candidatos e identificar todas las variantes genéticas que influyen en los niveles de
los fenotipos intermediarios seleccionados de la VIC.
Métodos: Se han amplificado mediante SequalPrep Long PCR
kit (Life Technologies) y FastStart High Fidelity PCR System
(Roche) los genes F11, KNG1, CIB4 y HNF1A, sus respectivos promotores y el promotor del gen FGB en una primera selección de 15
individuos no emparentados entre sí y seleccionados de las colas de
distribución normal de los fenotipos FXI, aPTT, FVIII y fibrinógeno.
Estos individuos forman parte del proyecto GAIT-2, que consiste en
935 individuos de un nuevo grupo de 35 familias con trombofilia.
Los amplicones creados se han normalizado teniendo en cuenta las
cantidades equimolares, seguido por la creación de la librería (Nextera XT, Illumina) y su secuenciación mediante el sistema Miseq
(Illumina). El análisis de los resultados se ha realizado mediante los
programas bioinformáticos CLC Genomics Workbench (CLC bio,
Qiagen) y VariantStudio (Illumina).
Resultados: A partir de la creación de 23 amplicones se han
secuenciado 143,8 kb en 15 individuos. Mediante análisis bioinformático, se han detectado un total de 1.047 variantes génicas, de
las cuales el 95,51% son variantes no exónicas, el 88,16% son tipo
SNV y el 11,84% son tipo indels. En concreto, 460 variantes de
estos 5 genes son nuevas (no descritas ni anotadas previamente).
Conclusiones: Hemos completado con éxito la primera fase
de puesta a punto de la metodología NGS para analizar 5 genes de
la VIC implicados en el riesgo de trombosis.
Los resultados de la NGS de estos 15 primeros individuos nos
confirman la alta variabilidad genética presente en los 5 genes
analizados, poniendo de manifiesto las limitaciones de la estrategia
de GWAS utilizada en la actualidad (con especial atención a la
identificación de variantes raras o poco frecuentes).
El proyecto, mucho más ambicioso, contempla la secuenciación de 110 individuos del GAIT-2 y la genotipación de todas las
variantes genéticas identificadas en el resto de las muestras del
proyecto GAIT-2. A partir de estos datos, analizaremos toda la
variación genética para determinar su implicación en la variabilidad de los fenotipos de la VIC y su importancia como factores
genéticos de riesgo de ETV.
Financiación: FIS PI11/00184, PFIS FI12/00322 y Red Investigación Cardiovascular RD12/0042/0032.
CO-134 El sistema GAS6/TAM en pacientes
con síndrome antifosfolipídico
CO-135 Modificación del ensayo de generación
de trombina para identificar nuevos
cofactores de la proteína C activada
en plasma
Tàssies D.1, Espinosa G.1, Menéndez A.2, Reverter J.C.1,
García de Frutos P.
Martos L.1, Bonet E.1, Deguchi H.2, Medina P.1, Ramón L.A.1,
Ferrando F.1, Mira Y.1, Vayá A.1, Laiz B.1, Bonanad S.1, Griffin J.H.2,
España F.1, Navarro S.1
Hospital Clínic. Barcelona. 2Instituto de Investigaciones Biomédicas de
Barcelona-CSIC. IDIBAPS. Barcelona
1
1
Hospital Universitari i Politècnic La Fe de Valencia. Valencia. 2The Scripps
Research Institute. La Jolla CA, USA
133
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Introducción y objetivos: La mayoría de los factores de riesgo trombótico conocidos forman parte de la vía anticoagulante
de la proteína C (PC) o modulan su actividad, y es muy posible
que factores plasmáticos aún desconocidos modulen esta vía. El
trombograma automatizado y calibrado (CAT) es un ensayo que
cuantifica la capacidad de generar trombina in vitro en presencia de
un calibrador de trombina. Nos planteamos poner a punto y desarrollar un ensayo de generación de trombina modificado, con la
finalidad de hacerlo sensible a las variaciones en la concentración
plasmática de nuevos cofactores de la vía de la PC, y que podrían
estar asociados con el riesgo trombótico.
Métodos: Incubamos durante 15 min 60 µl de plasma de 251
pacientes con tromboembolismo venoso (TEV) y 303 controles,
con 20 µl de tampón o una mezcla de PC activada (APC) 5nM +
proteína S (PS) 50 nM. Iniciamos el ensayo CAT tras adición de 20
µl de factor tisular 4 pM, 20 µl de sustrato fluorogénico y CaCl2,
sin adición de fosfolípidos. Analizamos 5 parámetros: tiempo de
latencia (TL), potencial endógeno de trombina (ETP), altura del
pico (PK), tiempo hasta el pico (TTPK) y velocidad inicial (V0).
Los resultados se analizaron empleando Thrombinoscope V.5.0.
Resultados: Las curvas de generación de trombina mostraron mayores PK (P<0,001), ETP (P=0,0048) y V0 (P<0,001) en
pacientes que en controles. La adición de APC y PS prolongó el
TL y TTPK (P<0,001), y descendió tanto ETP, como PK y V0 en
pacientes frente a controles (P<0,001). Sin embargo, el descenso
en TL y en TTPK fue mayor en los controles que en los pacientes
(P<0,001). Para estos parámetros identificamos que entre un 9-3%
de los controles y un 5-1% de los pacientes no respondieron al
efecto de la adición de APC+PS, tomando como punto de corte
la media-1,5 DS (P<0,001), mientras que entre un 2-1% de los
controles y un 4-2% de los pacientes respondieron al efecto de la
adición de APC+PS por encima de la media+1.5 DS (P<0,001).
Siendo estos los individuos candidatos para analizar nuevos cofactores (Figuras 1 y 2).
Conclusiones: Estos resultados sugieren que la presente modificación del ensayo puede ser de utilidad para identificar individuos
Figura 2. Distribución de la diferencia del TTPK con tampón menos TTPK
con la mezcla APC+PS en pacientes y controles.
con un mayor riesgo de trombosis, así como para la identificación
de nuevos cofactores moduladores de la vía anticoagulante de la
PC en plasma.
Financiación: ISCIII (PI12/00027), FEDER y Red RIC
(RD12/0042/0029), Consellería de Educación, Generalitat Valenciana (ACIF/2013/137 y Prometeo 2011/027), SETH. SN es investigadora postdoctoral del IIS La Fe. PM es investigadora Miguel
Servet (FIS-CP09/00065). Los autores contribuyeron equitativamente en la realización del estudio.
CO-136 Purificación, identificación y
caracterización computacional
y funcional de ARN diana de
antitrombina
Luengo Gil G.1, Miñano A.1, Bohdan N.1, Vicente V.1, Corral J.1,
Martínez-Martínez I.1
1
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario
Morales Meseguer y Centro Regional de Hemodonación. IMIB Universidad de
Murcia. Murcia
Introducción: El ARN es capaz de interaccionar con proteínas de
forma secuencia-específica, generalmente por interacción electrostática. Nuestro grupo demostró que el ARN de pequeño tamaño (ARNnc)
era capaz de interaccionar con el sitio de unión a heparina de la antitrombina (AT) y que esta interacción podría tener efectos biológicos
y patológicos. Sin embargo, se desconocen las bases moleculares de
la interacción ARN-AT. Los objetivos del estudio fueron purificar,
identificar y caracterizar los ARN con afinidad por AT.
Métodos: Lisamos células EA.hy926 y purificamos ARNnc
utilizando mirPremier (Sigma-Aldrich). Mediante cromatografía
de afinidad (FPLC y columna de níquel acoplada con AT por una
cola de histidinas insertada en su extremo C-terminal), extensivos
Figura 1. Distribución de la diferencia del LT con tampón menos LT con la
mezcla APC+PS en pacientes y controles.
134
Comunicaciones Orales
CHA2DS2-VASc (añade un punto por la presencia de enfermedad
vascular, edad entre 65-74 y sexo femenino, y dobla la puntuación
de la edad superior a 75 años) la aceptada para la indicación de
tromboprofilaxis, según recomendación de la guía de manejo de la
FA de la Sociedad Europea de Cardiología. Se ha demostrado que
una concentración plasmática elevada de la fracción N-terminal del
péptido natriurético cerebral (NT-proBNP) es un importante marcador de morbimortalidad en pacientes con insuficiencia cardiaca
y recientemente también de la población general. El objetivo de
nuestro trabajo fue estudiar el valor pronóstico del NT-pro-BNP
en una serie consecutiva de pacientes con fibrilación auricular no
valvular (FANV) en tratamiento anticoagulante oral.
Métodos: incluimos 1172 pacientes (49% varones, mediana
edad 76 años) con FANV en tratamiento anticoagulante oral con
INR en rango terapéutico los 6 meses previos a la inclusión en
el estudio y adicionalmente estables clínicamente. Medimos los
valores de NT-proBNP mediante electroquimioluminiscencia. Los
pacientes fueron seguidos durante más de 2 años y se registraron
los eventos adversos (eventos tromboembólicos, sangrado y mortalidad). Se calculó el punto de corte óptimo para cada evento
adverso usando curvas ROC.
Resultados: la mediana (rango intercuartílico) de NT-proBNP
fue 610 (318-1037) pg/mL. La mediana de seguimiento fue de
1007 (806-1279) días. En el análisis multivariado (Regresión de
Cox, ajustando por escala CHA2DS2-VASc) los valores elevados
de NT-proBNP se asociaron significativamente al riesgo de ictus
(HR, HR 2.71, 1.54-4.75; p=0.001) y al end-point combinado de
eventos cardiovasculares (HR 1.85, 1.12-3.04; p=0.016) así como
a la mortalidad (1.66, 1.16-2.37; p=0.006). No se asoció al sangrado (p=0.637). Atendiendo a la capacidad de reclasificación del
parámetro estudiado, (analizada mediante el índice de discriminación, IDI), la concentración elevada de NT-proBNP mejora la
capacidad predictiva de CHA2DS2-VASC para el ictus (IDI relativo 2.8%; p=0.001) y para la mortalidad asociada (IDI relativo,
1.8%; p=0.001).
Conclusión: en una población de pacientes con FANV, el
NT-proBNP proporciona una información pronóstica complementaria y adicional a la escala clínica establecida (CHA2DS2-VASc)
para la predicción de ictus y mortalidad, lo que sugiere que este
biomarcador puede ser usado para reestratificar clínicamente a los
pacientes con FANV.
Financiación: ISCIII y FEDER (P11/1256).
lavados, y elución con 3M NaCl, obtuvimos el ARN que se unía a
AT. El ARN eluído se concentró y dializó (Amicon Ultra MWCO
3kDa) y se secuenció empleando small RNA-seq (LC-Sciences).
Las secuencias obtenidas se identificaron con mirTools 2.0. El
alineamiento múltiple se realizó con ClustalW y el análisis de
componentes principales (PCA) se realizó con Jalview, para búsqueda de homologías e identificar posibles secuencias consenso.
La molécula con mayor representación que contenía dicha secuencia consenso se sintetizó en dos tipos de ácidos nucleicos: ARN
y ADN (Dharmacon Inc). Como control sintetizamos un ARN
con secuencia aleatoria que no guarda relación con la secuencia
consenso. Se estudió la capacidad de unión a AT de estas moléculas por docking estructural (UCSF Chimera/Rosetta/PathDock) y
funcionalmente evaluando la actividad anti-FII y FXa de la AT en
presencia de estas moléculas y de heparina.
Resultados: Obtuvimos 898 secuencias únicas (2.256.096 lecturas, rango de expresión 165-178.609) de 16 a 32 nucleótidos pertenecientes a diferentes familias de ARN. El análisis PCA demostró
que existen al menos tres grupos de secuencias, dos homogéneos
y un tercero de gran heterogeneidad. Identificamos una secuencia
consenso con 11 bases conservadas. El estudio estructural sugiere
que la secuencia seleccionada se une al sitio de unión a heparina.
Experimentalmente validamos la unión específica de este ARN a la
AT y su efecto funcional, pues activa a la AT como la heparina. La
secuencia de ADN o el ARN control no activan a la AT.
Conclusiones: Un número elevado y heterogéneo de ARNnc son capaces de unirse a la AT. La unión parece ser secuencia específica y tiene efectos funcionales relevantes. El estudio
computacional podría ayudar a sentar las bases moleculares que
permitan el diseño racional de fármacos antídoto de heparinas o
pentasacáridos y de nuevos anticoagulantes eficaces y económicos
basados en ARN.
Financiación: PI12/00657, RD12/0042/0050 (ISCIII&FEDER).
CO-137 La utilidad del fragmento N-terminal
del proBNP en la predicción del ictus y
mortalidad en pacientes con fibrilación
auricular no valvular en tratamiento
anticoagulante oral
Roldán V.1, Marín F.2, Vilchez J.A.2, Manzano-Ernández S.2,
Jover E.2, Galvez J.1, Puche C.M.2, Valdés M.2, Vicente V.1
CO-138 Papel de los microRNA de la grasa
epicárdica en la muerte súbita por
cardiopatía isquémica. Su relación
con la dislipemia y la esteatohepatitis
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario
Morales Meseguer. IMIB Universidad de Murcia. Murcia. 2Servicio de
Cardiología. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. IMIB Universidad de
Murcia. Murcia.
1
Introducción: La anticoagulación oral (ACO) es muy eficaz
en la reducción del riesgo tromboembólico en la fibrilación auricular (FA) así como en la mortalidad asociada. Para ayudar a la
toma decisiones respecto a la tromboprofilaxis de estos pacientes,
se han desarrollado varios esquemas de estratificación del riesgo
utilizando factores de riesgo clínicos. Actualmente, es la escala
Braza-Boils A.1, Marí-Alexandre J.1, Molina P.2, Domingo D.3,
Sancho J.2, Abellán Y.2, Olcina M.1, Arnau M.A.4, Giner J.2,
Estellés A.1, Zorio E.4
Instituto de Investigación Sanitaria La Fe. Valencia. 2Instituto de Medicina
Legal. Valencia. 3Servicio Cardiología. Instituto de Investigación Sanitaria La Fe.
Valencia. 4Servicio Cardiología. Hospital La Fe. Valencia
1
135
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Fundamentos: La cardiopatía isquémica (CI) es la primera
causa de muerte súbita cardiaca (MSC). Se ha descrito recientemente el papel de la grasa epicárdica como un factor de riesgo
cardiovascular. Se han relacionado los miRNAs con el metabolismo lipídico, la adipogénesis y la esteatohepatitis. A día de hoy, no
se han publicado estudios que evalúen el papel de los miRNAs en
grasa epicárdica y su relación con la enfermedad coronaria.
Objetivo: el presente estudio quiere caracterizar los perfiles de
expresión de miRNAs en la grasa epicárdica adyacente a la arteria
coronaria (con o sin placa aterosclerótica) con el fin de relacionar el perfil de miRNAs con la generación de aterosclerosis y la
desestabilización de la placa que pudiera causar la muerte súbita
cardiaca por cardiopatía isquémica (MSC-CI).
Métodos: Se han estudiado 41 fallecidos por MSC-CI y 15
fallecidos por muerte súbita por causas no cardiacas (MSC-no-C).
Los arrays de expresión de miRNAs se realizaron en grasa epicárdica contigua a arteria coronaria con placa y sin placa en controles.
Para validar los resultados de los arrays se cuantificaron 5 miRNAs
por qRT-PCR y se cuantificó el miR-34a-5p en el hígado de estos
fallecidos.
Resultados: El estudio de los componentes principales del
array (PCA) indicó que los perfiles de expresión de miRNA eran
diferentes en la grasa epicárdica de arterias coronarias comparadas con arterias coronarias sin placa de controles. 35 miRNAs
estaban diferentemente expresados (p<0.05, 1,5 veces de cambio)
(17 sobre y 18 infra-expresados). El estudio “in silico” permitió
seleccionar 5 miRNAs relacionados con la aterosclerosis (miR34a-3p, -34a-5p, -124-3p, -125a-5p, y -628-5p). Los niveles de
los miR-34a-3p y 34a-5p estaban aumentados (p<0.05) en la grasa
epicárdica contigua a las coronarias con placa en comparación con
la grasa de las coronarias de los controles. Se observó correlación
entre los niveles del miR-34a-5p en grasa epicárdica y en hígado
de sujetos fallecidos por MSC-no-C. Por otra parte, se observó
un descenso del miR-628-5p en la grasa de coronaria con placa
comparado con la grasa de coronaria sin placa del mismo sujeto.
Conclusión: Este es el primer estudio que describe el perfil
de expresión de miRNAs en grasa epicárdica en fallecidos por
muerte súbita cardiaca de origen isquémico. El aumento en los
niveles del miR-34a parece tener relación con la arteriosclerosis
en la coronaria adyacente. Se precisan más estudios para elucidar
el papel del miR-34a en la enfermedad coronaria.
Financiación: ISCIII - FEDER (PI011/00091; FI12/00012),
RIC (RD12/0042/0029), IIS La Fe, Prometeo 2011/027, Contrato
Sara Borrell CD13/0005.
González-Sarmiento R.4, González-Porras J.R.1, Blasco M.3
Servicios de 1Hematología y de 2Cardiología. IBSAL Hospital Universitario.
Salamanca. 3Grupo de Telómeros y Telomerasa. Centro Nacional de
Investigaciones Oncológicas. Madrid. 4Departamento de Medicina. IBSAL,
IBMCC. CIC Universidad de Salamanca-CSIC. Salamanca
Fundamentos y objetivos: Estudios de casos-control han
demostrado que el acortamiento de los telómeros, evaluado
mediante tecnología PCR, puede ser un factor de predisposición
a desarrollar arteriosclerosis. Sin embargo, la asociación entre
acortamiento leucocitario telomérico y eventos cardiovasculares
no ha sido claramente confirmada en los estudios prospectivos,
probablemente, entre otras cosas, por la utilización de técnicas
diagnósticas poco precisas.
La evaluación de la longitud telomérica mediante highthroughput QFISH (HT QFISH) ha demostrado ser una técnica precisa,
automatizada y menos costosa que la evaluación mediante PCR.
Nuestros objetivos fueron: a) conocer la longitud telomérica mediante HT QFISH de los pacientes con síndrome coronario agudo (SCA) y compararlo a un grupo control; b) determinar
prospectivamente el papel pronóstico del acortamiento telomérico
leucocitario en pacientes con SCA.
Pacientes y métodos: Estudio de casos-control constituido
por 198 pacientes con SCA (edad media = 70 años) y 109 sujetos
sanos (edad media = 69 años).
El SCA a su vez fue divido en SCA con elevación del segmento ST (SCACEST, n=99) o sin elevación del ST (SCASEST,
n=99). La revascularización mediante ACTP fue realizada en el
85,5% de los casos. Analizamos de manera prospectiva el impacto
de la longitud telomérica leucocitaria en la aparición de eventos
cardiovasculares en los casos. Definimos evento a la aparición de
un nuevo SCA, ictus, revascularización tras el alta hospitalaria,
ingreso por insuficiencia cardiaca o muerte.
Resultados: Como era de esperar la presencia de diabetes,
dislipemia y tabaco fue más frecuente en los casos que en controles
CO-139 El acortamiento telomérico leucocitario
evaluado mediante High Throughput-QFISH se asocia al síndrome coronario
agudo y es predictor de mortalidad
cardiovascular
Bastida J.M.1, Gallardo M.3, Pérez-Rivera J.A.2, Durán-Bobin O.2,
Lugo-Godoy C.2, Martín-Herrero F.2, Pabón P.2, Alberca I.1,
Figura 1. Supervivencia global (SG) según los terciles de longitud telomérica leucocitaria.
136
Comunicaciones Orales
menores niveles solo para los receptores de epinefrina y de trombina,
quedando por aclarar los mecanismos que subyacen a la hiporreactividad plaquetaria neonatal de otros agonistas fisiológicos. Todos los
agonistas plaquetarios, salvo colágeno, inducen activación uniéndose a receptores específicos acoplados a proteínas G. Las proteínas G
son complejos heterotriméricos (subunidades Ga, Gb, Gg), siendo la
subunidad Ga la que determina las propiedades del heterotrímero.
En plaquetas, las proteínas Gaq son intermediarios de la traducción
de señal para los receptores de TxA2, trombina y ADP (P2Y1); Gai2
y Gaz para los de ADP (P2Y12) y epinefrina, respectivamente; y
Gas y Gai2 para los receptores de prostaciclina. En modelos murinos
la ablación de Gai2 y Gaz genera agregación reducida en respuesta
a ADP y epinefrina, respectivamente, y el ratón Gaq-/- muestra tendencia a la hemorragia y ausencia de agregación.
Objetivo: Comparar la expresión de proteínas G entre plaquetas neonatales y de adulto, dado que se desconoce su potencial
implicación en la hiporreactividad plaquetaria neonatal.
Métodos: Plaquetas leucodeplecionadas (PLD) mediante filtración e inmunoselección (anti-CD45+) fueron obtenidas de PRP
de sangre de cordón umbilical y de sangre periférica de adultos
(N=12/grupo). El ARN total de las PLD fue aislado mediante TRIzol®. La ausencia de contaminación leucocitaria fue evaluada por
qRT-PCR (CD45). Se cuantificaron los niveles de ARNm y de
proteína de Gaq, Gai2, Gas y Gaz mediante qRT-PCR y western
blot, respectivamente.
Resultados: Respecto a plaquetas de adulto, las plaquetas neonatales mostraron niveles inferiores de ARNm de Gaq (40%, p<0.05) y
Gaz, (60%, p<0.01) y superiores para ARNm de Gas (40%, p<0.01)
y Gai2 (70%, p<0.01). En concordancia, en lisados de plaquetas neonatales, vs. adulto, detectamos menos Gaq y Gaz (20 y 30%) y más
Gas y Gai2 (30 y 25%), siendo las diferencias significativas (p<0.05)
para Gaz y Gas. La infra-expresión de Gaq en plaquetas neonatales
podría contribuir a su respuesta deficiente a TxA2, ADP o trombina.
Dado que Gas aumenta y Gai2 inhibe la síntesis de AMPc, potente
regulador de la reactividad plaquetaria, el aumento simultáneo en los
niveles de ambas podría constituir un mecanismo mutuamente compensatorio. La menor expresión de Gaz unida a la menor expresión
de receptores adrenérgicos a2A en plaquetas neonatales justificaría
la pobre respuesta de éstas a la epinefrina.
Conclusión: Nuestros resultados muestran que las plaquetas neonatales presentan, respecto a las de adulto, diferencias en la expresión
de proteínas G, las cuales podrían contribuir a explicar las diferencias
en la reactividad plaquetaria entre neonatos y adultos.
Financiación: ISCIII y FEDER (PI11/00566 y RIC
RD12/0042/0050).
(p < 0.001 para todos ellos). Los pacientes con SCA presentaron
una longitud telomérica más corta que los controles (6.69 kb vs.
7.84 kb, p < 0.001).
La mediana de seguimiento del estudio prospectivo fue de 11
meses (2-16). El evento combinado precoz (durante la hospitalización por el SCA) ocurrió en 25 pacientes (21 pacientes murieron). Durante el seguimiento, 20 pacientes sufrieron un evento
(10 muertes).
La mortalidad cardiovascular aumentaba conforme disminuían
los terciles de longitud telomérica, de forma que la probabilidad
de muerte fue significativamente mayor en los pacientes del tercil
1 (< 5.86 kb) que en los del tercil 2 (Figura 1).
El análisis multivariante mostró, tras ajustar por otras covariables (edad, diabetes, revascularización coronaria y presencia
de insuficiencia cardiaca al ingreso), como la longitud telomérica
leucocitaria se mantenía como un predictor independiente para la
mortalidad cardiovascular: HR 2.89 (IC 95% 1.03 - 8.13; p=0.04).
Conclusiones: El acortamiento de los telómeros medido
mediante HISF-Q se asocia al SCA y puede constituir un factor
de riesgo cardiovascular emergente. Tras un episodio de SCA, el
acortamiento telomérico leucocitario se asocia a un incremento
de la mortalidad. Estos pacientes se pueden identificar fácilmente
mediante una técnica automatizada, y podrían beneficiarse de una
terapia antitrombótica más agresiva y/o selectiva.
Financiación: Gerencia Regional de Salud de Castilla y León
(GRS 614/A/11).
Plaquetas/biología
vascular
CO-140 La expresión diferencial de proteínas G
contribuye a la distinta reactividad de
las plaquetas de neonato y de adulto a
diferentes agonistas
Caparrós-Pérez E.1, Teruel-Montoya R.1, Delgado J.L.2,
Torregrosa J.M.1, Blanco E.2, Vicente V.1, Rivera J.1, Martínez C.1,
Ferrer-Marín F.1
Unidad de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario
Morales Meseguer. Centro Regional de Hemodonación. IMIB Universidad
de Murcia. 2Unidad de Medicina Materno-Fetal. Servicio de Ginecología y
Obstetricia. Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca. IMIB. Murcia
1
CO-141 Las rutas implicadas en el metabolismo
proteico están diferencialmente
expresadas entre plaquetas de neonato
y de adulto
Introducción: Desde hace décadas se sabe que las plaquetas
neonatales son hiporreactivas a la mayoría de agonistas plaquetarios (ADP, trombina, tromboxano A2 [TxA2], epinefrina, colágeno,
etc.); sin embargo, los mecanismos moleculares implicados no se
conocen del todo. El estudio de los receptores de membrana de
los agonistas plaquetarios ha mostrado, en plaquetas neonatales,
Caparrós-Pérez E.1, Teruel-Montoya R.1, Delgado JL.2, Llanos
MC.2, Torregrosa J.M.1, Rivera J.1, Vicente V.1, Martínez C.1,
Ferrer-Marín F.1
137
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
teica cambia en respuesta a la activación plaquetaria y también con
el género o la senectud. Nuestros datos muestran que las 5 rutas
de expresión más distintas entre plaquetas de neonato y de adulto
son aquellas involucradas en maduración de pre-ARNm y síntesis/
degradación de proteínas. Las plaquetas neonatales podrían tener,
a la luz de estos resultados, un metabolismo proteico exacerbado.
Futuros estudios podrán evaluar la(s) causa(s) de estas diferencias, si son o no reflejo de lo que ocurre a nivel del megacariocito
neonatal y su potencial implicación en la reactividad plaquetaria.
Financiación: ISCIII y FEDER (PI11/00566 y RIC
RD12/0042/0050).
1
Unidad de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario
Morales Meseguer. Centro Regional de Hemodonación. IMIB Universidad de
Murcia. Murcia. 2Unidad de Medicina Materno-Fetal. Servicio de Ginecología y
Obstetricia. Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca. IMIB. Murcia
Introducción: Las plaquetas son esenciales para el mantenimiento de la hemostasia y una reactividad plaquetaria alterada
contribuye al desarrollo de situaciones patológicas tales como
hemorragias o trombosis. Existen variaciones inter-individuales
en reactividad plaquetaria entre la población adulta sana, cuya base
molecular y mecanismos genéticos responsables están pobremente
caracterizados. Dada la conocida hiporreactividad de las plaquetas
neonatales a la mayoría de agonistas fisiológicos, el estudio comparado de la expresión génica en plaquetas de neonato y plaquetas
de adulto podría ayudar a desvelar los mecanismos moleculares
que influencian la reactividad plaquetaria.
Objetivo: Estudiar in silico las diferencias en la expresión
génica entre plaquetas neonatales y de adulto.
Métodos: Plaquetas leucodeplecionadas mediante filtración
y separación celular magnética con anti-CD45+ fueron obtenidas
de PRP procedente de sangre de cordón umbilical (CU) o sangre
periférica de adultos (A). La extracción de ARN se realizó con
TRIzol®. A partir de 6 CU y 6 A obtuvimos 2 muestras pool/grupo,
con las que realizamos un array de expresión génica (HG-U133
Plus 2.0). El análisis estadístico de los datos del array fue realizado
mediante el software Partek Genomics Suite.
Resultados: Encontramos 500 genes con diferente expresión (1.5 < fold change < -1.5 y p<0.05), 110 infra-expresados
y 390 sobre-expresados en plaquetas de neonato frente a adulto.
Al agrupar estos genes por rutas moleculares, encontramos 12 de
ellas significativamente enriquecidas en genes sobre-expresados
en neonatos. Las 5 rutas con mayores diferencias corresponden
a vías implicadas en el metabolismo proteico: genes que codifican proteínas ribosomales, genes implicados en el transporte de
ARN, componentes del espliceosoma (maduración de pre-ARNm)
y finalmente la vía ubiquitina/proteasoma (una de las vías principales de degradación de proteínas en plaquetas) (Tabla 1).
Conclusión: Desde hace más de 40 años se sabe que las plaquetas son capaces de biosintetizar proteínas. El megacariocito
precursor dota a la plaqueta de pre-ARNm y ARNm y de la maquinaria necesaria para madurarlos y traducirlos de forma regulada.
Numerosos estudios han demostrado que el patrón de síntesis pro-
CO-142 El medio urémico induce cambios en la
expresión de genes relacionados con
inflamación y aterotrombosis
Martín-Rodríguez S.1, Vera M.2, Cases A.2, Escolar G.1,
Díaz-Ricart M.1
1
Servicio de Hemoterapia y Hemostasia. Hospital Clínic. Barcelona. Centro de
Diagnóstico Biomédico. Instituto de Investigaciones Biomédicas August Pi i
Sunyer. Universidad de Barcelona. Barcelona. 2Servicio de Nefrología. Hospital
Clínic. Barcelona. Centro de Diagnóstico Biomédico. Instituto de Investigaciones
Biomédicas August Pi i Sunyer. Universidad de Barcelona. Barcelona
Fundamentos y objetivos: La insuficiencia renal crónica
(IRC) es un ejemplo de patología de etiología multifactorial, en
la que se asocia un componente epigenético. Existe un riesgo
elevado de aterotrombosis en pacientes con IRC, relacionado
con el desarrollo de inflamación, estrés oxidativo y disfunción
endotelial.
Material y métodos: Utilizamos un modelo de disfunción
endotelial in vitro mediante la incubación de células endoteliales
con medio suplementado con suero de pacientes urémicos. Investigamos cambios en la expresión génica mediante la utilización
de arrays específicos de genes relacionados con aterosclerosis e
inflamación (rt2 Profiler PCR Array Systems; SAbiosciences).
Los genes expresados diferencialmente fueron recomprobados
por RT-PCR, utilizando primers diseñados específicamente, y las
proteínas mediante western-blot.
Tabla 1.
Nombre vía
p-valor
(Enriquecimiento)
% genes de la vía
detectados en
array
N.º genes de la
vía detectados
en array
N.º genes en vía
Sobre-expresados
en plaqueta
neonatal
Infra-expresados
en plaqueta
neonatal
Ribosoma
5,81E-07
32,58
43
31
1
Transporte de ARN
9,27E-05
26,99
44
35
4
Espliceosoma
2,11E-03
25,38
33
27
0
Proteasoma
5,00E-03
31,82
14
9
0
Proteolisis mediada por ubiquitinación
2,28E-02
22,22
30
22
8
138
Comunicaciones Orales
Resultados: Observamos cambios en la expresión de genes
relacionados con aterotrombosis (KLF2), proliferación (PDGFA, PDFGB), fibrinólisis (SERPINE1), angiogénesis (PPARD) e
inflamación (CCL2, VCAM1 y NFκB). Mediante RT-PCR, observamos un aumento muy significativo en la expresión génica de
VCAM1 y CCL2, un incremento moderado de NFκB, PDFGA y
KLF2, y un aumento más tardío de PDFGB. La expresión proteica
de VCAM1, NFκB y KLF2 confirmó los resultados de expresión
génica (Tabla 1).
Conclusiones: El endotelio expuesto de forma mantenida a los
componentes tóxicos del medio urémico experimenta una desregulación en la expresión de genes relacionados con inflamación
y aterosclerosis, alterándose hacia un fenotipo proinflamatorio.
Incrementos en la expresión de KLF2, que actúa como protector
frente a la aterotrombosis, indica una reacción de la CE frente a
la agresión que supone la condición urémica. Estos cambios en la
expresión génica podrían estar involucrados en el desarrollo de
las complicaciones cardiovasculares secundarias a la Insuficiencia
renal crónica.
Financiación: FIS-PI13/00517, SAF2011-28214 y RETIC-FEDER-RIC RD12/0042/0016 del Gobierno Español. de ROS respecto a la situación control. La presencia de flavonoides no previno cambios ni en la expresión de ICAM-1 ni en la
generación de ROS, mientras que el pretratamiento con Ebselen,
EUK118 y EUK134 resultó en una disminución significativa de
ambos parámetros. La activación de p38MAPK fue inhibida por
el flavonoide quercetina y los antioxidantes EUK134, EUK118 y
Ebselen. Solo el antioxidante EUK134 redujo significativamente
la activación de NFκB.
Conclusiones: El modelo de disfunción endotelial en la IRC
es válido para el ensayo de nuevas estrategias preventivas y terapéuticas. Los resultados obtenidos indican que las sustancias
antioxidantes químicamente sintetizadas evaluadas presentan no
solo un efecto antioxidante claro sino también un efecto anti-inflamatorio, mientras que solo uno de los flavonoides mostró un
efecto anti-inflamatorio en las condiciones estudiadas. Este estudio
pone de manifiesto la eficacia in vitro de las moléculas Ebselen,
EUK118 y EUK134 en la prevención del desarrollo y progresión
de la disfunción endotelial.
Financiación: FIS-PI13/00517, SAF2011-28214, y RETICFEDER-RIC RD12/0042/0016 del Gobierno Español. CO-144 El líquido peritoneal disregula el
perfil de expresión de microRNA
y los parámetros angiogénicos y
fibrinolíticos en cultivos de células
endometriales de mujeres con
endometriosis
CO-143 Protección del endotelio en la uremia
con sustancias nutricéuticas y
antioxidantes
Martín-Rodríguez S.1, Vera M.2, Cases A.2, Rivera J.3, Escolar G.1,
Díaz-Ricart M.1
Servicio de 1Hemoterapia y Hemostasia y de 2Servicio de Nefrología. Hospital
Clínic. Barcelona. Centro de Diagnóstico Biomédico. Instituto de Investigaciones
Biomédicas August Pi i Sunyer. Universidad de Barcelona. Barcelona. 3Servicio
de Hematología. Hospital General Universitario Morales Meseguer y Centro
Regional de Hemodonación. Murcia
Marí-Alexandre J.1, Gilabert-Estellés J.2, Sánchez-Izquierdo D.1,
Juan Gilabert3, Estellés A.1, Braza-Boïls A.1
Instituto de Investigación Sanitaria La Fe. Valencia. 2Hospital General
Universitario. Valencia. 3Hospital Arnau de Vilanova. Valencia
1
Fundamentos y objetivos: Existe disfunción endotelial en la
insuficiencia renal crónica (IRC), con un fenotipo inflamatorio,
protrombótico y de estrés oxidativo, que conlleva un riesgo aterotrombótico acelerado. Hemos evaluado el posible efecto protector
de distintas sustancias anti-inflamatorias y antioxidantes en células
endoteliales (CE) expuestas a medio urémico.
Material y métodos: CE fueron incubadas con los flavonoides
apigenina, genisteína y quercetina, y los antioxidantes químicamente sintetizados Ebselen, EUK-134 y EUK-118 y posteriormente expuestas a medio de cultivo suplementado con suero procedente de pacientes urémicos. Las concentraciones óptimas fueron
determinadas mediante estudios de viabilidad (MTT). Cambios en
la expresión del receptor de adhesión ICAM-1 y en la producción
de especies reactivas de oxígeno (ROS) fueron explorados mediante inmunofluorescencia. La activación de proteínas relacionadas
con la inflamación, p38 MAPK y NFkappaB (NF?B), fue evaluada
mediante ELISA.
Resultados: La exposición de CE a los medios urémicos produjo un incremento significativo en la expresión de ICAM1 en la
superficie celular, la activación de p38 y NFκB y la generación
Fundamento: La endometriosis se caracteriza por la presencia
de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina y están implicados los sistemas angiogénico y fibrinolítico, pudiendo contribuir
a su desarrollo tanto factores peritoneales como endometriales.
Nuestra hipótesis es que el líquido peritoneal (LP) de pacientes
puede modificar la expresión de miRNA que regulan la angiogénesis y proteólisis y contribuir al desarrollo de la endometriosis.
Objetivo: evaluar la influencia del LP de pacientes en el perfil de expresión de miRNAs y algunos parámetros angiogénicos y
fibrinolíticos en cultivos de células endometriales y endometriósicas.
Métodos: Los cultivos se trataron con LP de pacientes o de
controles. Los arrays de expresión de los miRNAs se realizaron
en la plataforma Affymetrix. Para validar los resultados de los
arrays se cuantificaron los miRNAs por qRT-PCR, y los niveles
proteicos y mRNA de VEGF-A, TSP-1, uPA y PAI-1 por ELISA
y qRT-PCR, respectivamente.
Resultados: El Análisis de Componentes Principales indicó
que el LP patológico indujo una modificación del perfil de miRNA:
82 miRNAs se expresaron diferentemente (p<0.05) (72 infra y 10
sobreexpresados) en cultivo de células endometriales de pacientes
139
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
la secuencia de unión de los miRNA deleccionada junto con los
mimics o el scrambled mimic en la línea celular HCT116-Dicer
KO. El RNA total se extrajo de las células de cultivo y los niveles
de mRNA y proteína de VEGFA se cuantificaron por qRT-PCR e
inmunotransferencia o ELISA, respectivamente.
Resultados: En las células EA.hy926, la transfección de miR16, 29c y 424 indujo una reducción de la expresión proteica del
VEGF-A del 76%, 75% y 82% respectivamente. Cuando se realizaron las mismas transfecciones en los cultivos de células endometriales se observó una reducción de la expresión del VEGF-A
del 87%, 90% y 90% en los cultivos de células procedentes de
controles y del 96%, 79% y 78% en las células procedentes de
endometrio de pacientes. Sin embargo, los niveles de mRNA de
VEGFA no se modificaron significativamente. Los resultados de
los ensayos demostraron que miR-29c se unía de forma específica
al 3’UTR de VEGFA.
Conclusión: Los estudios funcionales indican que miR-16,
29c y 424 regulan la traducción de VEGF-A no solo en la línea
celular EA.hy926 sino en cultivos primarios de células endometriales de mujeres con o sin endometriosis. Estos resultados abren
nuevas estrategias terapéuticas en el tratamiento de la endometriosis a través de la regulación de los miRNA.
Financiación: ISCIII y FEDER (PI11/00566, PI011/00091
y FI12/00012), RIC (RD12/0042/0029 y RD12/0042/0050), IIS
La Fe 2011-211, Prometeo 2011/027, Contrato Sara Borrell
CD13/0005.
comparado con cultivo de células del mismo paciente sin exposición a LP. Después del estudio “in silico” de las dianas de los
miRNAs diferentemente expresados seleccionamos 10 miRNAS
relacionados con angiogénesis o fibrinólisis (miR-17-5p, -20a-5p,
-21-5p, -29c-3p, -106b-5p, -130a-3p,-185-5p, -195-5p, -149-5p,
-424-5p). El LP patológico indujo una reducción significativa de
los miRNAs en los cultivos primarios. Por otra parte, ambos LP
aumentaron significativamente los niveles proteicos de VEGF-A,
uPA y PAI-1 sin aumento significativo de los niveles de mRNA.
Las mayores diferencias se observaron en los cultivos de células
endometriales y endometriósicas de las pacientes tratados con LP
patológico. También se observó una correlación inversa y significativa entre los cambios en los niveles proteicos de VEGF-A y
miR-17-5p (r=-0,739, P=0,001) y miR-20a (r=-0,676, P=0,001)
en cultivos de células endometriósicas, tras el tratamiento con LP.
Conclusión: Este estudio indica que el líquido peritoneal de
mujeres con endometriosis modula la expresión de miRNAs que
podría contribuir al desequilibrio angiogénico y fibrinolítico observado en esta enfermedad.
Financiación: ISCIII - FEDER (PI011/00091;FI12/00012),
RIC (RD12/0042/0029), IIS La Fe, Prometeo 2011/027, Contrato
Sara Borrell CD13/0005.
CO-145 La traducción de VEGF-A es regulada
por los microRNA 16, 29C Y 424 en
células endometriales de mujeres
con endometriosis
CO-146 Identificación de la GPVI como diana
de interacción de una aglutinina fría
de tipo IgM: mecanismo de activación
plaquetaria
Braza-Boils A. , Saloum-Asfar S. , Marí-Alexandre J. ,
Arroyo A.B.2, González-Conejero R.2, Vicente V.2,
Estellés A.1, Gilabert-Estellés J.3, Martínez C.2
1
2
1
Instituto de Investigación Sanitaria La Fe. Valencia. 2Centro Regional de
Hemodonación. Murcia. 3Hospital General Universitario. Valencia
1
Sánchez-Guiu M.I.1, Martínez-Martínez I.1, Plaza E.1,
Navarro-Fernández J.1, Martínez C.1, García-Candel F.2,
Roldán V.1, Ferrer-Marín F.1, Vicente V.1, Lozano M.L.1,
Watson S.P.3, Gardiner E.E.4, Rivera J.1
Fundamentos: La endometriosis es una de las enfermedades
ginecológicas más prevalentes. Se caracteriza por la presencia de
tejido endometrial fuera de la cavidad uterina. El tejido ectópico tiene la capacidad de invadir y proliferar dentro de la cavidad
abdominal. Nuestro grupo de trabajo ha descrito alteraciones de
la angiogénesis, fibrinólisis y del perfil de expresión de miRNA en
tejidos endometriales y endometriósicos y en líquido peritoneal de
mujeres con endometriosis. Dentro de los miRNA desregulados se
encuentran los miR-16, 424 y 29c.
Objetivo: investigar la regulación de VEGF-A por miR-16,
29c y 424 en cultivos primarios de células estromales endometriales de mujeres con y sin endometriosis.
Métodos: Para realizar los experimentos funcionales se
utilizaron cultivos procedentes de endometrio de pacientes con
endometriosis (n=4), de controles sanos (n=4) y la línea celular
EA.hy926. Las transfecciones con miRNA se llevaron a cabo por
triplicado, utilizando precursores (mimics) de miR-16, 29c y 424
y un mimic scrambled como control negativo. Los ensayos de
luciferasa se realizaron cotransfectando el fragmento de la región
3’ no codificante (3’UTR) de VEGFA o el mismo fragmento con
1
Centro Regional de Hemodonación. Hospital General Universitario Morales
Meseguer. IMIB Universidad de Murcia. Murcia. 2Hospital Universitario Virgen
de la Arrixaca. Murcia. 3Birmingham Platelet Group. College of Medical and
Dental Sciences. University of Birmingham. Reino Unido. 4Australian Centre for
Blood Diseases. Monash University Melbourne. Australia
La pseudotrombocitopenia, presente en 0,15% de los hemogramas, suele deberse a aglutininas plaquetarias frías (APF) temperatura y EDTA dependientes, y es considerada un proceso irrelevante
clínicamente e inerte para las plaquetas. Previamente, comunicamos una paciente con trombocitopenia crónica (˜100x109/L), con
una APF de tipo IgM que causa activación-agregación plaquetaria
ex vivo, dependiente de temperatura e independiente de EDTA.
Este estudio pretende caracterizar el mecanismo de acción y
la diana de esta rara APF.
Para ello, incubamos plaquetas alogénicas (PRP de voluntarios
o muestras de concentrados de plaquetas) con plasma/suero de la
proposita, en ausencia o presencia de distintos inhibidores plaque-
140
Comunicaciones Orales
tarios, aspirina, apirasa, cangrelor, PRT318, dasatinib, y anticuerpo
IV.3, y medimos el recuento plaquetario y la activación plaquetaria
por citometría de flujo (CF)(CD62 y/o CD63). Tan solo PRT318 y dasatinib (inhibidores de Syk y Src kinasas,
respectivamente), bloquearon la caída del recuento y la activación
inducida con suero/plasma de la paciente. Syk y Src son claves en
la señalización de FcgRIIa, Clec-2 y GPVI. La falta de efecto del
anticuerpo IV.3, que descarta a FcgRIIa, y la poco conocida función
de Clec-2 en plaquetas, nos llevó a proponer GPVI, receptor plaquetario de colágeno tipo inmunoglobulina, como la diana de esta
APF. Para evaluar la hipótesis, y dado que la hidrólisis de GPVI
liberando GPVI soluble (GPVIs) ocurre al activar plaquetas con
colágeno u otros agonistas de GPVI, obtuvimos suero y plasma de
la paciente y de un control paralelo (pareado en edad, sexo y grupo
ABO), y medimos niveles de GPVIs por ELISA. En plasmas de la
paciente (citrato, EDTA, y heparina), la concentración de GPVIs
fue un 30-50% mayor que en los del control. Sin embargo, GPVIs
en suero de la enferma fue un 25% menor vs. control, acorde con
la trombocitopenia de la enferma. Por otra parte, sensibilizamos
PRP control con suero de la enferma en presencia de una proteína
de fusión formada por la fracción soluble de GPVI y del Fc. Esta
proteína, que compite por GPVI, inhibió la expresión de CD62 y
la unión del anticuerpo PAC-1, en plaquetas tratadas con suero de
la paciente o con 1G5, anticuerpo activador de GPVI. Por último,
el suero de la paciente no indujo caída del recuento en PRP de una
enferma con déficit severo de GPVI, demostrado por CF con 1G5 y
ausencia de agregación con convulxina y colágeno.
En conclusión, demostramos que la APF tipo IgM de esta
paciente con trombocitopenia leve, causa activación plaquetaria
interaccionando con GPVI. Esta es la primera identificación de
este inmunorreceptor como diana de una AFP. Financiación: ISCIII y FEDER (PI11/00566, PI10/02594 y
RIC RD12/0042/0050).
respuesta plaquetaria a T, hemos investigado los posibles mecanismos implicados.
Métodos: Suspensiones de plaquetas aisladas fueron incubadas con distintas concentraciones de SCIT (0-200 µg/ml) durante
15 min, y activadas con T (0.1U/mL) para evaluar agregación,
secreción y liberación de CD63 (citometría), y cambios en las
proteínas del citoesqueleto y vías de señalización asociadas a
proteínas G (Gα12/13: RhoA, Gαq: PKC y Erk ½, Gβγ: PI3K),
mediante SDS-PAGE, western-blot y ELISA. También realizamos
estudios de agregación con TRAP, activador exclusivo de PAR1.
Resultados: SCIT inhibió la agregación plaquetaria por T y
TRAP de forma dosis-dependiente, siendo bloqueada a concentraciones =100 µg/mL. La expresión de CD63 en la superficie de
las plaquetas activadas con T disminuyó de forma significativa
con SCIT a 20 µg/mL (% eventos positivos: 7.7±1.6 vs. 17.9±5.1),
siendo bloqueada a =100 µg/mL. Los estudios de señalización
demostraron una afectación general en las vías asociadas a proteínas G. RhoA, implicada en el cambio de forma de la plaqueta y
mecanismos de internalización-secreción, se activó en respuesta
a T, asociándose a la fracción polimerizada del citoesqueleto. La
incubación con concentraciones crecientes de SCIT redujo tanto
la activación de RhoA como su translocación. PKC, Erk ½ y p85PI3K siguieron la misma tendencia.
Conclusiones: SCIT inhibe la activación y agregación plaquetarias a la T al interferir con vías de señalización asociadas a
proteínas G. Los estudios con TRAP sugieren un papel de PAR1
en este proceso. Nuestros resultados podrían estar relacionados con
las acciones antitrombóticas atribuidas a los inhibidores selectivos
de la recaptación de la serotonina y ofrecen una posible estrategia
antiplaquetaria basada en estas moléculas.
Financiación: FIS-PI13/00517, SAF2011-28214, RETIC-FEDER-RIC RD12/0042/0016 y CIBERSAM CB07/09/0005-G25, del
Gobierno Español. Premio Especial Proyecto SETH 2012.
CO-147 El inhibidor selectivo de la recaptación
de la serotonina escitalopram interfiere
con la transducción de señal de la
trombina vía proteínas G en plaquetas
CO-148 El efecto protrombótico de los
eritrocitos está mediado por el
tromboxano A2 de origen plaquetario
Moscardó Martínez A.1, Valles Giner J.2, Latorre Campos A.M.1,
Madrid López I.3, Santos Díaz M.T.3
López-Vilchez I.1, Jerez-Dolz D.1, Díaz-Ricart M.1, Molina P.1,
Pino M.1, Sanz V.1, Navarro V.2, Gasto C.2, Escolar G.1
1
Instituto de Investigación Sanitaria, 2Centro de Investigación y 3Unidad de
Cuidados Intensivos. Hospital Universitario y Politécnico La Fe. Valencia
Servicio de Hemoterapia-Hemostasia. Hospital Clínic. Barcelona. Centro de
Diagnóstico Biomédico. Instituto de Investigaciones Biomédicas August Pi i
Sunyer. Universidad de Barcelona. Barcelona. 2Instituto Clínic de Neurociencias.
Hospital Clínic. Barcelona
1
Introducción: Existe una evidencia creciente del papel de los
eritrocitos en la hemostasia y la trombosis, aunque los mecanismos
implicados no están bien establecidos. En este sentido, nuestro
grupo ha demostrado con anterioridad que los eritrocitos son capaces de incrementar diversos aspectos de la función plaquetaria. Nos
planteamos ahora dos objetivos: 1) estudiar el papel de diversos
receptores en el diálogo entre plaquetas y eritrocitos y 2) analizar
si alguno de los productos liberados por las plaquetas activadas
puede inducir un fenotipo protrombótico en los eritrocitos.
Desarrollo: Plaquetas ± eritrocitos lavados se incubaron
con bloqueantes de los receptores: P2Y12 (2MeSAMP), P2Y1
Fundamentos y objetivo: Las plaquetas juegan un papel
clave en los eventos cardiovasculares. Existen evidencias de que
la serotonina induce un fenotipo protrombótico en las plaquetas,
que es corregido por el inhibidor selectivo de la recaptación de la
serotonina, escitalopram (SCIT). Por otro lado, la trombina (T) es
uno de los agonistas plaquetarios más potentes, y actúa a través
de los receptores PAR 1 y PAR4 (asociados a proteínas G) y el
complejo GPIb/V/IX. Dado que El SCIT parece interferir con la
141
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
(A2P5P), TXA2 (SQ29, 548), 5HT (cyproheptadine), integrina
IIbIIIa (RGDS) o sus solventes. Se estimularon con colágeno y
se centrifugó (1 min 10.000 rpm) para obtener un liberado sin
células. En este liberado la activación plaquetaria se determinó
por liberación de 14C-5HT. Como respuestas de los eritrocitos
al estímulo de sustancias liberadas por las plaquetas se evaluó:
liberación de nucleótidos de adenosina (HPLC), AMPc (ELISA),
calcio citosólico (fluorescencia) y exposición de fosfatidilserina
(citometría de flujo) en los eritrocitos.
En ausencia de bloqueo de receptores, los eritrocitos incrementan
3 veces la liberación de 5HT por las plaquetas activadas. Solamente
el bloqueo del receptor del tromboxano, y no el resto de receptores,
redujo la activación plaquetaria y el incremento producido por los eritrocitos. Resultados semejantes se obtuvieron al bloquear la síntesis
de TX2 con aspirina. Para valorar el efecto del bloqueo del receptor
del TX2 sobre los eritrocitos, estos se incubaron con el bloqueante
del receptor de TX2 y se lavaron para eliminar el exceso de bloqueante antes de incubarlos con las plaquetas. En estas condiciones, se
redujo un 50% el efecto eritrocitario sobre la activación plaquetaria
monitorizado por liberación de 5HT, sugiriendo que el TX2 plaquetario es un efector para los eritrocitos. Para confirmar esta hipótesis,
los eritrocitos se trataron con U46619, análogo estable del TX2. El
TX2, de modo dosis-dependiente incrementó los niveles citosólicos
de calcio y AMPc, la exposición de fosfatidilserina en la membrana
eritrocitaria y la liberación de ATP por los eritrocitos.
Conclusiones: El TX2 plaquetario actúa sobre los eritrocitos
y les confiere un fenotipo protrombótico que a su vez refuerza la
activación plaquetaria.
Financiación: IIS Carlos III. Fondos FEDER PI13/00016; Red
Cardiovascular [RD12/0042/0003].
es la base del tratamiento con aspirina. Sin embargo, hay pocos
datos en la literatura sobre la eficacia del bloqueo de la síntesis
de TX2 por el tratamiento con aspirina en pacientes con síndrome
coronario agudo (SCA) y sus consecuencias clínicas.
Desarrollo: En un estudio prospectivo realizado en 295 pacientes
consecutivos con SCA tratados con aspirina y clopidogrel ingresados
en nuestro centro, se han evaluado la síntesis de TX2 y otros aspectos
de la función plaquetaria. Las pruebas se realizaron en las primeras
48 horas tras el evento e incluyeron: agregometría óptica inducida
por ADP, ácido araquidónico, colágeno y epinefrina; reclutamiento
plaquetario y síntesis de TX2 inducido por colágeno en sangre total
(1); fosforilación de VASP mediante citometría de flujo. Se recogieron
los datos demográficos y clínicos. Se efectuó el seguimiento clínico
de los pacientes durante 1 año. Otras variables analizadas fueron:
hemograma, bioquímica rutinaria, marcadores de daño miocárdico
(TnT, CK-MB, CK), ProBNP, marcadores de inflamación (proteina C
reactiva, leucocitos). La inhibición de la síntesis de TX2 se consideró
parcial si el valor era =3.5 ng/ml.
En comparación con los pacientes con adecuada inhibición
del TX2, los pacientes con inhibición parcial de TX2 (91/295,
31%) presentaban una significativa elevación de la agregación plaquetaria con ácido araquidónico, colágeno y epinefrina (p<0.01),
del reclutamiento plaquetario (p<0.001) y una elevación de los
marcadores de daño miocárdico TnT (p<0.01), CK-MB (p<0.01),
CK (p<0.01) y pro BNP (p<0.01), así como de los marcadores de
inflamación (PCR y número de leucocitos). En contraste, el nivel
de inhibición de la síntesis de TX2 no influyó en el efecto del
clopidogrel determinado mediante VASP. Al año de seguimiento
24/295 pacientes (8.1%) murieron por causas cardíacas. El riesgo
de muerte cardíaca fue superior en los pacientes con inhibición
parcial del TX2 (13.2%) que en aquellos con buen control (5.9%)
(p=0.034). En un análisis de regresión múltiple incluyendo datos
demográficos, factores de riesgo y tratamientos cardiovasculares,
la inhibición parcial del TX2 por la aspirina se asoció con la muerte cardíaca a 1 año (OR=3.78; IC [1.36-10.45] p<0.011).
Conclusiones: La inhibición parcial de la síntesis de TX2 en
las primeras 48 horas tras el SCA se asocia a hiperfunción plaquetaria e incremento en marcadores inflamatorios y de mionecrosis.
El mal control de la síntesis de TX2 se asoció a un incremento en
el riesgo de muerte cardíaca. La medida de la síntesis de TX2 en
los primeros estadios del SCA podría ayudar a una mejor estratificación de los pacientes y mejorar la evolución clínica.
Financiación: IIS Carlos III. Fondos FEDER PI13/00016; Red
Cardiovascular [RD12/0042/0003].
Bibliografía
Tratamientos
antitrombóticos
CO-149 El efecto insuficiente de la aspirina para
bloquear la síntesis de tromboxano A2
en pacientes con síndrome coronario
agudo se asocia con la muerte por causas
cardiovasculares a un año
Santos MT et al Am J Cardiol. 2009; 104:1618-23.
CO-150 Inhibición de la generación de
trombina por apixaban o rivaroxaban
en un modelo celular de la coagulación
facilitada por plaquetas
Moscardó Martínez A.1, Madrid López I.2, Fuset Cabanes M.P.2,
Latorre Campos A.M.1, Bonastre J.2, Ruano M.2, Santos Díaz
M.T.3, Valles Giner J.3
Instituto de Investigaciones Sanitarias, 2Unidad de Cuidados Intensivos y
Centro de Investigación. Hospital Universitario y Politécnico La Fe. Valencia
1
3
López-Vilchez I., Pujadas L., Rincón-Tomé N.,
Arellano-Rodrigo E., Sanz V., Reverter J.C., Galán A.M.,
Díaz-Ricart M., Escolar G.
Introducción: La inhibición de la síntesis de tromboxano A2
(TX2) por el bloqueo de la cicloxigenasa-1 (COX-1) plaquetaria
142
Comunicaciones Orales
CO-151 Influencia de asociar o no heparina de
bajo peso molecular a acenocumarol
en pacientes con fibrilación auricular
de reciente diagnóstico
Servicio de Hemoterapia-Hemostasia. Hospital Clínic. Barcelona. Centro de
Diagnóstico Biomédico. Instituto de Investigaciones Biomédicas August Pi i
Sunyer. Universidad de Barcelona. Barcelona
Fundamentos y objetivo: Los anticoagulantes orales directos
(AODs) tienen una eficacia similar y mejor perfil de seguridad que
los anticoagulantes clásicos. Los AODs reducen la generación de
trombina, un potente activador de la función plaquetaria. Las plaquetas tienen un papel destacado en las fases de amplificación y propagación del modelo celular de la coagulación. La acción de los AODs
sobre la respuesta plaquetaria no ha sido analizada en detalle. Hemos
evaluado el efecto de apixabán (APIX) o rivaroxabán (RIV), AODs
con acción anti-Xa, sobre la generación de trombina en un modelo
celular de la coagulación mediado principalmente por plaquetas.
Métodos: Investigamos el efecto de APIX o RIV a concentraciones de 4 a 10 veces inferiores a las Cmax (APIX 128.0 ng/
mL; RIV 249,0 ng/mL) alcanzadas en pacientes sometidos a dicho
tratamiento. Adaptamos un ensayo fluorimétrico de generación de
trombina y establecimos las condiciones óptimas del modelo: compuesto por plaquetas (1,2x106/µL), las cuales aportan al proceso
fosfolípidos aniónicos y factores liberados de los gránulos tras su
activación; y 10% de plasma, que aporta factores de coagulación
suficientes para iniciar y mantener la generación de trombina.
Estas muestras se incubaron durante 15 min con APIX o RIV. La
reacción del ensayo de generación de trombina se inició con una
preparación de factor tisular (50 pM), FVII activado (5 µg/mL),
calcio y un substrato fluorigénico (Technothrombin). Se registró
la fluorescencia generada durante 90 min (λ ex/em: 390/450 nm).
Resultados: APIX o RIV afectaron de forma dosis-dependiente
la capacidad del sistema de generar trombina, alargando los tiempos
de latencia y obtención del pico máximo de trombina, y disminuyendo la concentración máxima de trombina generada (Tabla 1).
Conclusiones: Nuestro modelo celular de generación de trombina facilitada por plaquetas permite valorar la contribución de la
trombina generada para realimentar la activación plaquetaria. Las
concentraciones de APIX o RIV inferiores a las Cmáx alcanzadas
tras dosis habituales son capaces de inhibir parcialmente la aportación de las plaquetas a la generación de trombina. Este modelo
puede ser útil para determinar las concentraciones óptimas de los
AODs en la prevención del riesgo trombótico en el territorio arterial.
Financiación: FIS-PI13/00517, SAF2011-28214 y RETIC/
FEDER-RD12/0042/0016 del Gobierno Español.
Botella C., Praska S., Caro M., Méndez G., Saavedra I., López J.,
García-Avello A., Cesar J.
Hospital Universitario Ramón y Cajal. Madrid
Objetivo: No existe consenso sobre la utilidad de asociar
heparina de bajo peso molecular (HBPM) a los antivitaminas K
(AVK) en la profilaxis antitrombótica de los pacientes con Fibrilación Auricular (FA) de reciente diagnóstico. Presentamos un
estudio prospectivo en estos enfermos, en los que la conveniencia
de asociar HBPM a acenocumarol (ACO) fue diferente, de forma
no aleatorizada, dependiendo del criterio de los facultativos implicados en el diagnóstico.
Metodología: Desde el 25 de Marzo de 2013 hasta el 30 de
mayo de 2014, se evaluaron 355 pacientes con FA de reciente diagnóstico. Todos ellos acudieron a la Consulta de Tratamiento Anticoagulante Oral hasta la estabilización de la dosis de ACO siendo
entonces derivados a AP. La decisión de asociar o no HBPM vino
determinada por el facultativo que efectuó el diagnóstico y consideró el inicio de ACO. Cuando se administró, la HBPM se mantuvo hasta la consecución de un INR en rango (2-3). Los pacientes,
después de un tiempo de seguimiento medio de 32,6 semanas (rango: 2-56) fueron contactados telefónicamente y preguntados sobre
incidencias especialmente episodios tromboembólicos.
Resultados: En 220 de los 355 pacientes incluidos en el
estudio no se había asociado HBPM, habiéndola recibido 135.
La edad de estos dos grupos fue similar ( 77,5±8,1 vs75,7±8,5)
pero no la procedencia, ya que la mayoría de los enfermos con
HBPM se derivaron desde el Servicio de Urgencias (SUR). Esta
diferencia tuvo más relación con los protocolos de asistencia que
con el riesgo trombótico, ya que el valor del CHADS2VASC fue
similar en ambos grupos (3,1±1,3 vs 3,1±1,2). Sí fue significativo el predominio de mujeres en el grupo derivado desde el SUR
(57,0% vs 48,6%). El tiempo medio hasta la estabilización del
INR fue más corto en los pacientes recibiendo HBPM (8,7±6,9
vs. 11,7±7,3 días) lo que se interpretó como la consecuencia de
un acercamiento de los controles para evitar el riesgo hemorrágico. Pudo contactarse con 149 pacientes en el grupo sin
HBPM y con 81 en el grupo que la recibió. Se detectaron 2 y 3
éxitus respectivamente, por causas ajenas a la anticoagulación
y ala FA. No se produjeron eventos embólicos en ninguno de
los dos grupos.
Conclusiones: Este estudio pone de manifiesto la falta de
consenso sobre la conveniencia de asociar HBPM en el tratamiento antitrombótico del paciente con FA de reciente diagnóstico. También sugiere que, administrando acenocumarol, la
influencia de HBPM en la incidencia de eventos embólicos es
inapreciable.
Tabla 1.
CON
[AOD] ng/mL
APIX
APIX
RIV
RIV
10,0
35,0
17,0
45,0
Tiempo latencia (min)
3,7
4,8*
6,5*#
5,6*
7,1*§
Pico Trombina (nM)
176,7
161,2
134,3
152,6
141,6*
Tiempo pico (min)
8,0
11,0
12,3*
13,8*
14,7*
p<0,05 vs. CON; # p<0,05 vs. APIX 10,0 ng/mL; § p<0,05 vs. RIV 17,0 ng/mL
143
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
CO-152 Valor predictivo de la escala SAMETT2R2 del tiempo en rango terapéutico
y eventos adversos en pacientes con
fibrilación auricular no valvular bajo
tratamiento anticoagulante
CO-153 Un nuevo algoritmo de predicción
de dosis mejora el control de los
pacientes al inicio de la terapia
con acenocumarol
Cerezo Manchado J.J.1, Roldán V.1, Corral J.1, Rosafalco M.2,
Antón Ana I.1, Martínez A.B.1, Padilla J.1, Vicente V.1,
González-Conejero R.1
Roldan Schilling V.1, Marín F.2, Gallego P.1, Gálvez J.1, Valdés M.2,
Vicente V.1
1
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario
Morales Meseguer y Centro Regional de Hemodonación. IMIB Universidad de
Murcia. Murcia. 2Instrumentation Laboratory SpA
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario
Morales Meseguer. IMIB Universidad de Murcia. Murcia. 2Servicio de Cardiología.
Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. IMIB Universidad de Murcia. Murcia
1
Fundamentos y objetivos: Se han diseñado diferentes algoritmos que combinan factores clínicos y genéticos para calcular
la dosis estable de la terapia oral anticoagulante (TAO), con el
fin de mejorar su control y reducir sus complicaciones (sangrado
y trombosis) especialmente al inicio de la misma. Sin embargo,
sólo dos ensayos con warfarina y uno con acenocumarol (AC)
han evaluado la efectividad de estos algoritmos, con resultados
conflictivos. Nuestro objetivo ha sido evaluar la dosificación de
AC en el inicio de la TAO mediante un algoritmo farmacogenético,
desarrollado por nuestro grupo 1 (Thromb Haemost 2013; 109:
146) frente a la práctica clínica habitual.
Pacientes y métodos: Se aleatorizaron 179 pacientes consecutivos con fibrilación auricular que iban a iniciar la TAO, en
un grupo control (GC) y grupo guiado por genotipo (GG). La
primera dosis se administró a todos los pacientes de acuerdo con
el criterio del hematólogo. A las72h, la dosis se calculó en función del valor de INR en el GC, mientras que en el GG también
se consideraron además el genotipo de VKORC1, CYP2C9 y
CYP4F2, de acuerdo con un algoritmo previamente validado en
2683 pacientes1. Los pacientes de ambos grupos fueron seguidos
hasta alcanzar la dosis estable o hasta un máximo de 24 semanas. Se valoró el porcentaje de pacientes que alcanzaron la dosis
estable, el tiempo para lograrlo y el porcentaje de INRs en rango
terapéutico (TTR).
Resultados: Se incluyeron 92 pacientes en el GC y 87 en GG.
Después de 12 semanas, un 25% de los enfermos alcanzó la dosis
estable en el GC, frente al 39% en GG (p = 0.038). El análisis de
Kaplan-Meier mostró que el GG necesitaba menos días para alcanzar un INR estable (p=0.033). Además, el GC tenía un tiempo en
rango terapéutico menor que GG (45% vs 50%, respectivamente;
p=0.046). Después de 24 semanas, en el análisis de Kaplan-Meier
el tiempo para alcanzar una dosis estable en el GG seguía siendo
significativamente menor (p=0.013).
Conclusiones: La aplicación de nuestro algoritmo farmacogenético al inicio de la terapia con AC fue superior a la práctica
clínica habitual, ya que consiguió un mayor porcentaje de pacientes que alcanzaron la dosis estable y, además, en menor tiempo.
El protocolo planteado facilita el genotipado de las variantes con
peso farmacogenético y reduce el riesgo de excepciones genéticas. Queda por determinar la relación coste-efectividad de este
procedimiento.
Financiación: ISCIII&FEDER RD12/0042/0050; PI11/1256.
Introducción: El tratamiento anticoagulante es eficaz tanto en
la prevención del ictus como en la reducción de la mortalidad de
pacientes con fibrilación auricular no valvular (FANV). Sin embargo, la eficacia y seguridad de la principal familia de fármacos
anticoagulantes utilizados en estos pacientes, los anti-vitamina K,
depende del mantenimiento de un estrecho margen terapéutico (INR
2-3). La calidad de dicho tratamiento anticoagulante se mide a través
del tiempo en rango terapéutico (TTR).La posibilidad de poder predecir un buen o mal control del tratamiento anticoagulante, podría
guiar el uso de antagonistas de la vitamina K o de nuevos anticoagulantes. Recientemente se ha propuesto, y validado una escala que
pretende ser útil para alcanzar este objetivo, la escala SAME-TT2R2
[sexo, edad (<60 años), antecedentes médicos (al menos 2 de los
siguientes: hipertensión, diabetes, enfermedad coronaria, vasculopatía periférica, insuficiencia cardiaca, ictus previo, enfermedad pulmonar crónica, insuficiencia renal o hepática), tratamiento (fármacos
que puedan interferir). Su valoración se realiza teniendo en cuenta
todos estos factores 1 punto, excepto el tabaquismo activo 2 puntos,
y raza (los no caucásicos 2 puntos)]. Nuestro objetivo fue analizar
el valor de dicha escala para predecir la calidad de anticoagulación
(estimada con TTR los primeros 6 meses de seguimiento) y como
herramienta pronóstica para la aparición de eventos adversos.
Métodos: Se incluyeron 972 pacientes (49% varones; mediana
de edad 76 años) con FANV permanente bajo tratamiento anticoagulante oral con acenocumarol los 6 meses previos (INR 2,0-3,0)
estables clínicamente. Los pacientes fueron seguidos durante 4
años y se registró el desarrollo de eventos adversos.
Resultados: Los pacientes con una mayor puntuación de la
escala SAME-TT2R2 en el momento de la inclusión en el estudio presentaron un peor TTR a los 6 meses de seguimiento (p:
0,043). La incidencia de sangrado mayor, eventos cardiovasculares
adversos (incluyendo ictus y embolismos sistémicos) y mortalidad
global fue mayor, al incrementar la puntación SAME-TT2R2. La
puntuación de la escala SAME-TT2R2 se asoció con el desarrollo
de eventos adversos (HR 1,32[1,17-1,50], p<0,001), eventos cardiovasculares (HR 1,52 [1,28-1,83], p<0,001), y mortalidad global
(HR 1,41[1,16-1,67], p=0,001). Además se observó una tendencia
a su asociación con una mayor frecuencia de sangrado mayor (HR
1,23[0,99-1,53], p=0,059).
Conclusión: En una población consecutiva de pacientes con
FANV, una mayor puntuación de la escala SAME-TT2R2, predice
un peor grado de anticoagulación, así como la aparición de eventos
adversos.
Financiación: ISCIII y FEDER (P11/1256).
144
Comunicaciones Orales
CO-154 Impacto de un sistema de alertas
electrónicas para la prevención
del tromboembolismo venoso en
pacientes oncológicos en tratamiento
quimioterápico ambulatorio
pacientes con cáncer; 2) Post-intervención: en los sujetos estratificados como de alto riesgo trombótico se generó una e-alerta,
recomendándose tromboprofilaxis.
Se comparó la utilización de tromboprofilaxis y la incidencia
de TEV a los 90 días en ambos periodos. También se analizaron
las variables relacionadas con la prescripción de profilaxis y desarrollo de TEV.
Resultados: La fase pre-intervención se llevó a cabo entre
noviembre de 2008 y septiembre de 2009, incluyendo a 699 pacientes (edad media 57,7 años; 48,4% varones; 49,8% alto riesgo). La
fase post-intervención transcurrió entre octubre de 2009 y diciembre
de 2010, incluyendo a 409 pacientes (edad media 58,8 años; 50,4%
varones; 48,7% alto riesgo). En la fase pre-intervención 153 pacientes
(21,9%) recibieron tromboprofilaxis mientras que en la fase post-intervención la recibieron 111 pacientes (27,1%), (p=0,048). La incidencia de TEV durante el seguimiento fue 5,3% y 5,1%, respectivamente
(p=0,97), no apreciando diferencias entre los grupos de alto o bajo
riesgo. Además de las e-alertas, la historia previa de TEV, tratarse
de primera línea de quimioterapia y la localización gastrointestinal,
resultaron factores independientes para una mayor prescripción de
profilaxis. Las neoplasias pulmonares o de páncreas resultaron los
únicos factores de riesgo independientes para desarrollar TEV.
Conclusiones: La implementación de un sistema de e-alerta
en pacientes oncológicos ambulatorios aumentó la prescripción de
tromboprofilaxis, pero no conllevó una reducción en la incidencia
de TEV. Se precisan esfuerzos adicionales para identificar correctamente a los pacientes de alto riesgo de TEV que más se podrían
beneficiar de tromboprofilaxis ambulatoria. Panizo E.1, Alfonso A.1, García-Mouriz A.2, López-Picazo J.M.3,
Gil-Bazo I.3, Páramo J.A.1, Lecumberri R.
Servicios de 1Hematología, 2Informática y 3Oncología. Clínica Universidad de
Navarra. Pamplona
Fundamentos: La utilización de alertas electrónicas (e-alertas) se ha asociado con una reducción en la incidencia de tromboembolismo venoso (TEV) en pacientes hospitalizados. Sin
embargo, una proporción importante de eventos trombóticos tienen lugar en pacientes en tratamiento quimioterápico ambulatorio.
Aunque la indicación de profilaxis antitrombótica sistemática en
este contexto es motivo de controversia, muchos expertos la recomiendan en caso de factores de riesgo adicionales.
Objetivos: Valorar el impacto de un nuevo sistema de e-alertas
para la estratificación del riesgo trombótico, sobre la prescripción
de tromboprofilaxis y la incidencia de TEV, en pacientes oncológicos en tratamiento quimioterápico ambulatorio. Métodos: Estudio prospectivo, con 2 fases: 1) Pre-intervención: se evaluó el riesgo individual de TEV de los pacientes según
una escala propia, desarrollada por consenso a partir de las guías
clínicas ASH/ASCO para profilaxis y tratamiento del TEV en
145
Pósteres
Pósteres
Conceptos básicos
en hemostasia
con la metástasis tumoral. Este efecto podría deberse a la inhibición
de proteasas implicadas en estos procesos, ya que es la antitrombina
activada por heparina la que ejerce un mayor efecto. Estos resultados
refuerzan los datos del papel anti-tumoral de la antitrombina.
Financiación: CP13/00126, PI12/00657, RD12/0042/0050.
PO-372 La antitrombina inhibe la migración
e invasión de células de glioblastomaastrocitoma en presencia de heparina
PO-373 Regulación indirecta de proteínas
hemostáticas por miR-24 y miR-34a
a través de HNF4A
Águila S. 1, Martín-Villar E.2, Quintanilla M.2, Bohdan N.1,
Luengo-Gil G.1, Vicente V.1, Corral J.1, Martínez Martínez I.1
Arroyo A.B., Teruel-Montoya R., García-Barberá N., Luengo-Gil G.,
Vicente V., González-Conejero R., Martínez C.
1
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario
Morales Meseguer. Murcia. 2Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto
Sols. CSIC-UAM. Madrid
Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario
Morales Meseguer. Centro Regional de Hemodonación. IMIB. Universidad de
Murcia. Murcia
Introducción: La antitrombina es el principal inhibidor de
la cascada de la coagulación, pero también se le han atribuido
diversos papeles más allá de la hemostasia. Se ha descrito que la
antitrombina tiene una función anti-inflamatoria, anti-angiogénica,
anti-apoptótica y anti-viral. Recientemente, hemos estudiado el
efecto de la antitrombina en el control de enteropeptidasa, una
serín proteasa transmembrana que podría contribuir al potencial
metastásico de las células tumorales en las que se expresa.
Objetivos: Evaluar el efecto de la antitrombina en presencia
y en ausencia de heparina en procesos de proliferación, migración
e invasión de células de glioblastoma-astrocitoma (U87-MG), que
expresan enteropeptidasa en su membrana.
Métodos: Para evaluar el efecto en la proliferación se utilizó un
ensayo colorimétrico con sal de tetrazolio (XTT). La migración se
estudió mediante ensayos de reparación de heridas (wound healing).
La invasión fue analizada a través de la formación de invadopodios
(proyecciones de la membrana plasmática con capacidad proteolítica
de la matriz extracelular). Los invadopodios son capaces de degradar
una matriz de gelatina que contiene rodamina, de manera que mediante la incubación con faloidina y DAPI, es posible cuantificar el área
de degradación de la gelatina mediante microscopía de fluorescencia
y el software de análisis de imágenes FIJI. En todos los ensayos,
evaluamos el efecto de antitrombina (150 ng/µL), de la heparina de
bajo peso molecular (HBPM) (200U), y de la combinación de ambas.
Resultados: Nuestros resultados demuestran que la antitrombina, la HBPM y la combinación de ambas no tienen efecto en la
proliferación de las células U87-MG. Sin embargo, en todos los
casos observamos una inhibición del proceso de reparación de
heridas (wound healing), siendo más significativo el tratamiento
con la combinación de antitrombina y HBPM. Cuando analizamos
la formación de invadopodios, no se observó efecto con ninguno de los tratamientos en el número de invadopodios por célula.
Sin embargo, el tratamiento combinado de antitrombina y HBPM
produjo un efecto sinérgico en la actividad de los invadopodios,
al inhibir de forma estadísticamente significativa la degradación
de la matriz de gelatina.
Conclusiones: La antitrombina en presencia de HBPM es capaz
de inhibir procesos tales como la migración y la invasión, asociados
Introducción: El factor nuclear 4a del hepatocito (HNF4a)
es clave en la transcripción de muchas proteínas hepáticas. En
modelo murino, tanto el silenciamiento de HNF4A como su supresión reducen la expresión de diferentes factores hemostáticos. Por
otra parte, estudios in vitro han demostrado que la expresión de
HNF4A se regula por miR-34a y miR-24 (que se unen al extremo
3’UTR y zona codificante del gen conservada en modelo murino,
respectivamente). Sin embargo, se desconoce el efecto que puede
tener la regulación de HNF4A por estos miRNA sobre los factores hemostáticos. Se han descrito regulaciones por miRNA tipo
CIS (directas) de diferentes proteínas hemostáticas, pero nunca
se ha evaluado la regulación tipo TRANS (indirecta) a través de
la modulación de factores de transcripción.
Objetivo: Estudiar el papel de miR-34a y miR-24 en la regulación de expresión de las proteínas hemostáticas hepáticas a través
de la modulación de HNF4A.
Métodos: Transfectamos células HepG2 y hepatocitos primarios de ratón con precursores de miR-34a, miR-24 y control negativo (100nM). Como criterios de selección de las proteínas hemostáticas seleccionamos: i) gen con sitios de unión a HNF4a, ii)
referencias in vitro del efecto funcional en la expresión de HNF4a.
Los niveles de ARNm de HNF4A, F7, F10, F11, F12, SERPINC1,
PROC y PROS1 se cuantificaron por qRT-PCR. Analizamos la
expresión de HNF4A, F9, F11 y SERPINC1 en 114 hígados humanos sanos (Biobanco Hospital La Fe, Valencia y Hospital St. Jude
Children’s Research, Memphis, USA), correlacionando los niveles
de HNF4A con F9, F11 y SERPINC1. El análisis estadístico se
realizó empleando pruebas no paramétricas.
Resultados: La transfección de HepG2 con miR-34a y miR-24
provocó una reducción significativa respecto al control en la expresión de todos los genes seleccionados, mientras que solo miR-34a
redujo los niveles de F10, F12, PROS1 y PROC (Tabla 1). La
transfección de hepatocitos primarios de ratón con miR-24 confirmó la reducción de los dos únicos mRNA evaluados hasta la
fecha: HNF4A (13±3%; p<0.002) y SERPINC1 (20±4%; p<0.001).
En tejido hepático sano observamos una correlación significativa
entre los niveles de HNF4A y F11 (r=0.47; p<0.001), F9 (r=0.30;
p<0.001) y SERPINC1 (r=0.62; p<0.001).
149
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
y 4 (13.3%) graves. Edad media: 33.8 años (1-86 años), 8 casos
(26.7%) pediátricos (<14 años). 10 (43.5%) posibles portadoras en
edad fértil (<45años). 5 pacientes con HA (2 leves, 1 moderado y
2 graves) están en profilaxis, su edad media es de 13 años (8-15).
Un niño con HA e historia de inhibidor en profilaxis con factor
VIII de origen plasmático, el resto con concentrados de FVIII
recombinante. 3 pacientes con HA han desarrollado inhibidor, 2
transitorios y uno refractario al tratamiento inmunomodulador (en
tto con Feiba®). Catorce pacientes (46.7%) infectados por virus:
1 caso de infección por VIH, 3 VHB y 13 VHC, coinfección en 3
pacientes (2 VHB-VHC y 1 VIH-VHC), cuya edad media es de 45
años (28-64), es decir, nacidos entre los años 1950 a 1986. Ningún
caso de virus hepatitis en edad pediátrica.
El gasto por consumo de factores se ha mantenido estable en
estos últimos 4 años, en torno a 560000 € anuales. Desde la última
revisión (congreso AEHH 2011) hay 5 casos nuevos: 4 infantiles y 1 en edad adulta, todos con hemofilia leve. La edad media
al diagnóstico en los nuevos casos: 17 años (recién nacido-61).
Los motivos de consulta fueron: 1 en recién nacido por madre
portadora, 1 por estudio familiar (tío), 1 por epistaxis frecuente
con anemización, 1 por hematomas musculares, 1 por sangrado
excesivo tras extracciones dentales.
Conclusiones: La hemofilia tiene un carácter hereditario, pero
un tercio de los casos son de “novo”. La hemofilia leve, la más frecuente en nuestra provincia, puede pasar sin diagnosticarse hasta
la edad adulta. Hemos tenido 9 casos nuevos desde el año 2010, 6
(66.7%) de ellos no conocían antecedentes familiares de hemofilia
y 5 (55.6%) casos fueron diagnosticados en edad adulta. Es preciso
también el seguimiento y registro de pacientes con hemofilia leve,
para evitar la pérdida de pacientes y realizar los estudios y consejo
genético adecuado en pacientes y portadoras, y en las siguientes
generaciones.
Tabla 1.
Gen
miR-34a#
p
miR-24#
p
HNF4A
21±20
<0.04
20±4
<0.001
F7
46±16
<0.04
12±4
<0.02
F11
33±4
<0.001
21±9
<0.03
F12
42±7
<0.001
30±26
<0.09
F10
36±15
<0.06
84±14
0.200
SERPINC1
44±18
<0.02
30±14
<0.01
PROS1
56±26
<0.04
99±18
0.200
PROC
25±24
<0.04
99±8
0.400
Porcentaje de expresión respecto al control negativo (100 %).
#
Conclusión: Nuestros datos indican que miR-24 y miR-34a
podrían regular en TRANS la expresión de múltiples proteínas
hemostáticas hepáticas a través de HNF4a. Además este estudio
describe por primera vez una potente relación entre los niveles de
expresión de HNF4A y de F11, F9 y SERPINC1 en hígados humanos sanos. Por tanto, nuestros resultados sugieren que pequeñas
variaciones en los niveles de estos miRNA reguladores de HNF4a,
podrían contribuir cambios significativos de diferentes factores
de coagulación. El papel de la variación de estos dos miRNA en
patologías hemostáticas está por caracterizar.
Financiación: ISCIII y FEDER (PI11/00566, RIC RD12/
0042/0050).
Diátesis hemorrágica
PO-375 Alteraciones genéticas en pacientes
hemofílicos con inhibidor en la región
de Murcia
PO-374 Actualización de los datos de hemofilia
en la provincia de Guadalajara
García F., Melero A., Cabañas V., Berenguer M., Moraleda J.M.
Herrero Martín S., Santamaría E., Méndez M.B.
Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca. Murcia
Hospital Universitario de Guadalajara. Guadalajara
Introducción: La aparición de inhibidores contra el concentrado de factor administrado constituye la principal complicación
relacionada con el tratamiento de la Hemofilia en la actualidad.
Su aparición está relacionada, entre otras, con determinados tipos
de mutaciones que afectan al gen F8/F9, siendo el principal factor
de riesgo en Hemofilia A, mientras que en Hemofilia B no se ha
determinado con claridad la influencia del tipo de mutación. Las
grandes deleciones, mutaciones sin sentido y la inversión del intrón
22 son las que más riesgo presentan, mientras que las de tipo missense, pequeñas deleciones e inserciones presentan un riesgo bajo.
Material y métodos: En la Región de Murcia existen 80
pacientes con Hemofilia, de los que 65 corresponden a Hemofilia A y 15 a Hemofilia B. Hemos estudiado a nuestra población
(mediana y rango) y detectado aquellos pacientes con historia de
Introducción: En España hay registrados 2527 hemofílicos,
2192 afectos de Hemofilia A (HA) (87%) y 335 Hemofilia B (HB)
(13%). 579 (23%) en edad pediátrica. El 32% son hemofílicos
graves, 16% moderados y un 52% leves. Nuestro centro atiende
259537 habitantes, con datos centralizados de toda la provincia.
Objetivo: Actualizar los datos de hemofilia de nuestra provincia.
Pacientes y métodos: Los pacientes afectos de HA y HB, así
como portadoras, de nuestra provincia. Datos obtenidos de base
datos de nuestro servicio y de Farmacia, laboratorio e historias
clínicas. No se han incluido pacientes fallecidos.
Resultados: 30 pacientes: 29 (96.7%) HA y 1 (3.3%) HB y
23 posibles portadoras. 25 casos (83.3%) leves, 1(3.3%) moderada
150
Pósteres
Métodos: Se analizan los datos de 52 lesiones sufridas por 31
pacientes hemofílicos, controlados en la Unidad de Hemostasia y
Trombosis del Hospital Universitari i Politècnic La Fe de Valencia.
En la Tabla 1 se detallan las características de los pacientes (tipo
de hemofilia y gravedad de sinovitis, así como el tipo y número de
articulaciones exploradas). Para obtener las relaciones existentes
entre todas las variables analizadas y extraer características poblacionales se analizaron los datos registrados mediante una técnica
visual conocida como mapas autoorganizados (SOM).
Resultados: Se analizaron 52 lesiones, 43 de ellas hemorrágicas con requerimientos de factor. En el 67,3% de los casos se
evaluó el progreso de la lesión durante una semana (tres visitas),
periodo en el que remitió el hemartros. En la Figura 1 se muestran
los resultados obtenidos mediante el SOM. La distinción de diferentes zonas del SOM permite extraer las relaciones entre variables. Destacamos a modo de ejemplo la esquina superior izquierda de los diferentes mapas observando que, cuando el hinchazón
articular (en cm) es alto (nodos rojos), la pérdida de movilidad (en
grados) es alta (nodos azules) y el dolor (escala EVA) es también
alto (nodos rojos). Además, estos casos se corresponden con una
hemofilia grave (variable HF, nodos rojos), la aparición del hemar-
Tabla 1. Afectados con historia de inhibidor
Tipo de
hemofilia
Mutación
Inhibidor
transitorio (sí/no)
HAG
p.Pro2153Leu
Sí
HAG
Inv. intron 22
No
HAG
Inv. intron 22
Sí
HAG
Inv. intron 22
No
HAG
p.Trp393Stop
No
HAG
Deleción completa de exon 26
No
HAG
Inv. intron 22
No
HAG
p.Trp585Cys
Sí
HAG: Hemofilia A Grave
inhibidor. Tras firmar consentimiento informado se les realizó
estudio genético mediante PCR para detectar el tipo de mutación.
Resultados: Se muestran en la Tabla 1.
Todos los pacientes estudiados correspondían a HAG, y la
mayoría presentaron inhibidores de alta respuesta, estando relacionados con mutaciones de alto riesgo como inversión del intrón 22
y grandes deleciones. Se observaron inhibidores de alta respuesta
en dos mutaciones missense. Y un inhibidor transitorio en un caso
con inversión del intrón 22.
Conclusiones: La mayoría de los inhibidores de alta respuesta
se relacionan a alteraciones de alto riesgo, aunque se dio un caso
de inhibidor transitorio en un caso de inversión del intrón 22 y dos
casos de inhibidor de alta respuesta en dos casos de mutaciones
missense.
Tabla 1. Características pacientes y lesiones
Hemofilia
Articulación
PO-376 Análisis mediante redes neuronales
del diagnóstico ecográfico y control
evolutivo del hemartros en pacientes
hemofílicos
Sinovitis
Valor
N
%
Grave
27
90,0
Moderada
2
6,7
Leve
1
3,3
Codo
7
23,3
Tobillo
12
40,0
Rodilla
11
36,7
GIII
7
23,3
GII
10
33,3
GI
7
23,3
No
6
20,0
Pérez Alenda S.1, Carrasco J.J.1, Soria Olivas E.1, Bonanad Boix
S.2, Querol Fuentes F.1
Universitat de Valencia. Valencia. 2Hospital Universitari i Politècnic La Fe.
Valencia
1
Introducción: En el paciente con hemofilia las hemartrosis
recurrentes provocan artropatía, causando dolor crónico y discapacidad funcional de la articulación. En este contexto, la ecografía
resulta una herramienta muy útil en el diagnóstico y monitorización del hemartros. La precocidad del diagnóstico de la lesión y
su valoración objetiva, aumenta la eficacia del tratamiento y, en
consecuencia, mejora la calidad de vida de los pacientes.
Objetivos: Analizar las relaciones existentes entre las variables evaluadas en el diagnóstico y terapéutica de las lesiones
hemorrágicas constatadas en una población hemofílica.
Figura 1. Relaciones entre las variables obtenidas mediante el SOM.
151
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
en sujetos a demanda. Encontramos mejoría en CV (p<0.0001)
de los sujetos que pasan de demanda a profilaxis tras cambio de
FVIII. Esto parece relacionado con la disminución en la tasa de
sangrados anual (78,5%), no con PK.
Conclusión: En nuestra experiencia, la aplicación de programas de farmacocinética en el tratamiento de la hemofilia A severa
reduce el consumo de factor y optimiza los esquemas de profilaxis.
Este ahorro se produce manteniendo la reducción del número de
sangrados y la calidad de vida del paciente.
tros es espontánea (variable E/P, nodos azules) y se tiene líquido
en la articulación (variable líquido, nodos rojos).
Conclusiones: La ecografía permite el diagnóstico objetivo
de la lesión y su monitorización evolutiva, lo que repercute en la
eficacia terapéutica y presumiblemente en la profilaxis de secuelas
funcionales. Los mapas SOM se han mostrado como un modelo
válido para la extracción de características poblacionales a partir
de la visualización conjunta de las variables clínicas y ecográficas,
estudiadas en relación con el hemartros en el paciente hemofílico.
PO-378 Cirugía cardiaca en pacientes con
hemofilia B moderada: a propósito
de un caso
PO-377 Aplicación de la farmacocinética
en la optimización del tratamiento
de la hemofilia A severa: modificación
del consumo, resultados clínicos
y de la calidad de vida
Rodrigo Álvarez M.E.1, Pérez de Oteiza J.2
Hospital Montepríncipe. Madrid. 2Hospital Sanchinarro. Madrid
1
Introducción: La terapia de reemplazo con factores de coagulación y la prevención de las hemorragias, han mejorado la calidad
y expectativa de vida de los pacientes hemofílicos, aproximándola
a la de la población general. Con ello se ha propiciado la aparición de comorbilidades propias de edades avanzadas de la vida,
incluyendo valvulopatías cardiacas degenerativas, en este grupo
de pacientes.
Describimos el caso de un paciente con hemofilia B moderada (Factor IX 4.9%), sometido a cirugía electiva de recambio de
válvula aórtica con infusión continua de FIX.
Caso clínico: Se trata de un paciente de 80 años y 73Kg de
peso, diagnosticado de HB moderada a los 40 años de edad. Como
antecedentes presentaba sangrado tras biopsia de piel y extracciones dentales sin administración previa de terapia sustitutiva.
Sin embargo, había sido sometido sin complicaciones a cirugía de
hernia inguinal con administración previa de PFC y a CPRE con
administración previa de FIX.
De cara a la cirugía cardiaca, administramos inicialmente un
bolo de 7000 UI para alcanzar niveles de factor IX en torno al
100%, siguiendo la fórmula peso corporal (Kg) x aumento deseado
de factor IX, seguida de infusión continua de 8 UI/Kg/h (14000U
IV/24 h), asumiendo un aclaramiento teórico de FIX de 7.5 ml/h,
según la literatura revisada.
La cuantificación de factor IX previa a la cirugía fue de 240%,
durante la cirugía 115% y postcirugía 129%. Con el objetivo de
mantener en el postoperatorio inmediato, niveles de factor IX superiores al 80%, decidimos mantener infusión continua. El ajuste de
dosis se basó en las mediciones diarias de factor IX.
La determinación de factor IX en los días sucesivos fue siempre superior al 100%, lo que nos permitió ajustar la dosis administrada, manteniendo niveles medios de 153% (rango 129% -176%)
permitiéndonos una infusión final de 3.000 UI/24 h.
Al sexto día postoperatorio, ante buena evolución clínica, se
suspende la infusión continua y se inicia la administración de factor IX en bolo de 3000UI cada 24 horas. En ese momento el objetivo era mantener los niveles superiores al 50% hasta la curación
adecuada de la herida.
Díaz Canales D., Tamayo Bermejo R., Heiniger Mazo A.I.
Hospital Regional Universitario de Málaga. Málaga
Fundamentos: El tratamiento sustitutivo con factor VIII (FVIII) en sujetos con hemofilia A severa tiene un alto coste. Optimizar
este consumo resulta del máximo interés para cualquier Sistema de
Salud. Nuestro objetivo es evaluar la repercusión de un programa
de ajuste de dosis a través de farmacocinética (PK).
Objetivos: Evaluar el consumo de factor en diferentes esquemas de tratamiento (profilaxis y demanda) antes y después de ajustar dosis por farmacocinética. En los sujetos tratados en esquema
de profilaxis, valorar si este ajuste modifica la tasa anual de sangrados. Valorar cambios en la calidad de vida tras aplicar PK.
Pacientes: Entre enero de 2006 y diciembre de 2013, hemos
realizado estudio de farmacocinética a todos los adultos con hemofilia A severa y sin historia de inhibidor que han cambiado de
tipo de FVIII en nuestro centro. Entrar en este programa implica
durante al menos un año registrar todas las infusiones de factor
y causa. El programa de PK es poblacional. Los niveles de FVIII se han determinado por método de one-stage. La información
del consumo de factor procede de los diarios de pacientes (DP)
y registros del Servicio de Farmacia. La calidad de vida (CV) se
analiza utilizando el cuestionario A36 Hemophilia-QoL. El proyecto ha sido autorizado por el Comité Ético de nuestro Centro y
los pacientes han consentido por escrito.
Resultados: De los 16 pacientes incluidos en el programa solo
14 son evaluables (excluidos por no cumplimentar DP ni CV).
Media de edad de los pacientes analizados fue 31,7+/- 9,4 años.
Media del volumen de distribución (VD), vida media (t1/2) y aclaramiento (Acl) 56,2±19 ml/kg, 12,9±5,9 h y 3,4±1,4 ml/kg. Existe
correlación de la edad del paciente (p 0.03) y niveles de FvW:
RCo (p 0.02) con el aclaramiento de los FVIII. No encontramos
correlación con superficie corporal o los niveles de FvW: Ag. Los
pacientes en tratamiento con FVIII plasmático tienen un menor
aclaramiento y mayor vida media (p 0.01). Ahorro de FVIII 20.3%
en los sujetos en profilaxis (p 0.005), sin modificaciones en la tasa
anual de sangrado. No encontramos modificaciones del consumo
152
Pósteres
Desde enero de 2012 a enero de 2014 se han llevado a cabo
en nuestro centro un total de 35 procedimientos quirúrgicos en 28
pacientes con diagnóstico previo de coagulopatía.
Seis pacientes fueron intervenidos en varias ocasiones con
distintas indicaciones (Tabla 1).
En todos los casos se realizó un estudio preoperatorio para
determinar los niveles plasmáticos de factor deficitario y la terapia
de sustitución se realizó según procedimiento estándar, siguiendo
las recomendaciones para el tratamiento de la hemofilia y de la
enfermedad de Von Willebrand de la sociedad de hematología.
Dos pacientes tenían hemofilia A (7.14%), dos hemofilia B
(7.14%), quince EvW (53.53 %), cuatro tenían déficit de factor VII
(14.28 %), dos pacientes déficit de factor X (7.14%), uno presentaba una trombopatía (3.57%) y tres déficits combinados (10.71%).
Se realizaron determinaciones antes y después de cada administración, con una mediana de dosificaciones de 57.75% antes
(rango 48%-82%) y 88.3% después (rango 87%- 93%).
Tras el alta, mantuvimos administración en bolo de 3000UI/24h
de forma ambulatoria con el objetivo de mantener niveles superiores al 50%, hasta cicatrización de las heridas (tiempo estimado
por unidad de cardiología y que fue de aproximadamente un mes).
Transcurrido este tiempo, bajamos la dosis de factor a
3000UI/48h para mantener valores superiores al 30% hasta completa resolución. Nuevamente el tiempo fue estimado por la unidad
de cirugía cardiaca, siendo éste de aproximadamente 2 meses más.
En cuanto al manejo anticoagulante, dados los niveles de factor
IX alcanzados, se siguió el protocolo habitual de cirugía cardiaca,
con dosis e intervalos semejantes a pacientes no hemofílicos; anticoagulación con heparina sódica durante la cirugía y circulación
extracorpórea, sulfato de protamina para revertirla al finalizar la
intervención y posteriormente, anticoagulación con clexane 1 mg/
Kg/12h. Por el tipo de válvula implantada, el paciente no precisó
anticoagulación a largo plazo.
En ningún momento el paciente presentó complicaciones
hemorrágicas ni infecciosas ni desarrollo de inhibidores. Tanto
la estancia en UCI como la estancia hospitalaria, fue similar a la
de pacientes no hemofílicos: 48 horas y 10 días respectivamente.
Discusión: La cirugía cardiaca es un procedimiento factible y
seguro en pacientes hemofílicos, siempre y cuando se mantenga
un tratamiento multidisciplinar integrado por hematología, anestesia, cirugía y enfermería, una adecuada terapia de reemplazo y
una adecuada monitorización de factor IX peri y post-operatoria.
La infusión continua de factor IX, nos permitió alcanzar niveles constantes de factor, además de una disminución de la dosis y
ahorro en los costes.
Tabla 1. Procedimientos quirúrgicos realizados en pacientes
con coagulopatías
Procedimiento quirúrgico
Número de pacientes
Cirugía mayor
PO-379 Cirugía general en pacientes
con coagulopatías: experiencia
en nuestro centro
Rodrigo Álvarez M.E.1, Bengochea Casado M.L.2,
Panizo Morgado E.2, Serrano Maestro A.2, Calderón López M.T.3,
Gasior Kabat M.2, Varea S.2, Pérez de Oteiza J.2
Fracturas óseas
2
Escoliosis
2
Craneotomía
2
Achalasia
1
Valvuloplastia cardiaca
1
Colecistectomía laparoscópica
1
Resección intestinal (Crohn)
1
Apendicectomía
1
Amigdalectomía
2
Tiroidectomía
1
Histerectomía total + doble anexectmia
1
Cesárea
1
Cirugía menor
Hospital Montepríncipe. Madrid. 2Hospital Sanchinarro. Madrid. 3Hospital
Torrelodones. Madrid
1
Introducción: Los pacientes con coagulopatías pueden requerir cirugías electivas y en ocasiones de emergencia. Hace años,
dichas intervenciones suponían transfusiones de hemoderivados,
sangrado y hospitalizaciones prolongadas. Sin embargo, en la
actualidad la terapia de reemplazo ha permitido la realización de
intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos sin complicaciones hemorrágicas importantes.
Casos clínicos: Realizamos un estudio retrospectivo recogiendo el número de cirugías realizadas en nuestro centro (Grupo HM-Hospitales) en los últimos dos años, sobre pacientes con
coagulopatía de base, así como el tipo de coagulopatía, el tipo de
cirugía realizada, el tratamiento instaurado y las complicaciones.
153
Osteosíntesis
1
Artroscopia
2
Masa lingual
1
Cordales
3
Cornetes
1
CPRE
1
Abceso perianal
1
Biopsia mama
1
Embarazo ectópico
1
Partos vaginales con episiotomía
7
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Tabla 2. Déficit, gravedad del mismo y tratamiento instaurado en 28 pacientes y 35 cirugías
Coagulopatía
Grado
n
% de Factor
Tratamiento (1)
Hemofilia A
(n=2)
(Qx=5)
Grave (<1%)
--
--
--
Moderada (1-5%)
--
--
--
Leve (6-40%)
2
30% y 42%
FVIII previo a las 5 Qx
Hemofilia B
(n=2)
(Qx= 4)
Grave (<1%)
--
--
--
Moderada (1-5%)
1
5%
F IX en todos los casos
Leve (6-40%)
1
26
FIX en todos los casos
EvW
(n=15)
(Qx =16)
Tipo I
13
--
Desmopresina en 10 Qx y F VIII en 4 (2)
Tipo 2
2
--
F VIII en ambos casos.
Tipo 3
--
--
--
Déficit F VII
(n=4)
(Qx=4)
Grave (<1%)
--
--
--
Moderada (1-5%)
--
--
--
Leve (6-40%)
4
25,16,33 y 42%
Novoseven en 3 Qx y ac tranexánico x1
Déficit FX
(n=2)
(Qx=2)
Grave (<1%)
--
--
--
Moderada (1-5%)
--
--
--
Leve (6-40%)
2
50% y 62%
Solo ac tranexánico y tranexánico + PFC
Déficits combinados
(n=3)
(Qx=3)
FV+F VII
1
PFC
FV+FVII
1
PFC
Evw I+XI
1
F VIII
--
1
Trombopatía
(n=1)
(Qx=n1)
--
Transfusión de plaquetas
(1): prácticamente en todos los casos, además del factor deficitario se usó ácido tranexánico.
(2): se decidió FVIII por la localización de la Qx (cervical).
la realización de estos procedimientos en dichos pacientes, de forma segura, con buenos resultados y escasa comorbilidad.
Prácticamente en todos los casos, además del factor deficitario
se usó ac tranexánico.
Se decidió FVIII por la localización de la Qx (cervical).
La gravedad de cada déficit se detalla en la Tabla 2. Señalar
que ninguno de los pacientes padecía déficits graves de ninguna
de las coagulopatías.
Dieciséis procedimientos fueron cirugías mayores (45.72 %),
doce cirugías menores (34.28 %) y siete partos vaginales con episiotomía (20%) (Tabla 1).
En cuanto al tratamiento instaurado, en la mayoría de los casos
se empleó, además del factor deficitario, tratamiento con ácido
tranexánico. De hecho, dos pacientes con déficits leves y sometidos a cirugía menor, recibieron únicamente tratamiento con ácido
tranexánico. El resto de pacientes sometidos a cirugía menor, solo
precisaron una dosis del factor deficitario administrada previamente a la cirugía.
La mayoría de los pacientes con EvW tipo I fueron tratados
con desmopresina, excepto en 4 intervenciones (28.58% de las
Qx en pacientes con EvW tipo I) en que se empleó F VIII rico en
Willebrand (Tabla 2).
En cuanto a los pacientes que precisaron administración de
dosis repetidas de factor, señalar que solo en uno de los casos se
empleó infusión continua.
Conclusiones: Los procedimientos invasivos en pacientes con
coagulopatías son una realidad creciente de nuestra práctica clínica. Una adecuada monitorización pre y postquirúgica del factor
deficitario, junto con una adecuada terapia de sustitución, permiten
PO-380 Comorbilidades en un paciente
hemofílico A de edad avanzada
Solano Tovar J., Dueñas Hernardo V., Bernardo Gutiérrez A.,
Fernández Rodríguez M.A., Soto Ortega I.
Servicio de Hematología y Hemoterapia. Hospital Universitario Central de
Asturias. Oviedo
Introducción: La hemofilia A es una coagulopatía congénita
ligada al cromosoma X que en su forma moderada se caracteriza
por niveles de factor VIII entre el 1 y el 5% y presenta manifestaciones hemorrágicas de distinta gravedad entre pacientes.
En los países desarrollados los pacientes afectados disponen
de una terapia sustitutiva adecuada que les permite alcanzar una
edad avanzada y similar a la de la población general de forma que
experimentan y cada vez más, las patologías propias del enveje-
154
Pósteres
cimiento: neoplasias, enfermedades cardiovasculares, patologías
degenerativas, en relación con lo que se presenta el siguiente:
Caso clínico: Varón de 78 años diagnosticado de hemofilia A
moderada a los 36 años (Factor VIII: C: 6%) en el contexto de un
traumatismo en el muslo izquierdo que requirió cirugía.
Desde entonces ha sufrido varios episodios hemorrágicos
mayores que precisaron tratamiento sustitutivo con concentrados
de Factor VIII: sangrado gastrointestinal, hematoma subdural, craneotomía parietal derecha, hematoma dorsolumbar, hemartrosis
rodilla derecha postraumático, múltiples episodios de hematomas
musculares.
Además de la hemofilia, el paciente tiene una historia de
hipertensión arterial, hepatitis B con enfermedad hepática crónica, coxartrosis, hiperuricemia, osteoporosis, úlcera gástrica y
hernia hiatal.
En el año 2009 presentó un episodio de hemorragia digestiva
baja y fue diagnosticado de adenocarcinoma de colon moderadamente diferenciado estadio III-A. Se le realizó hemicolectomía
derecha bajo tratamiento sustitutivo con factor VIII (Fandhi®),
manteniendo niveles de Factor VIII entre 80-100%. El tratamiento
se completó con capecitabina bajo profilaxis con factor VIII y no
se reportaron complicaciones hemorrágicas.
Al mismo tiempo, el paciente fue valorado por el servicio de
neurología a causa de deterioro de la memoria. Los únicos hallazgos fueron ateromatosis carotídea leve y leucoaraiosis, descartando
enfermedad neurológica.
En el año 2011, el paciente presentó un infarto talámico lacunar izquierdo de etiología microangiopática. Recibió trifusal como
agente antiagregante, anticoagulación con HBPM y tratamiento
sustitutivo con FVIII (Fandhi®) para mantener niveles de Factor
VIII durante la hospitalización de 30 a 80%.
Se decidió interrumpir el tratamiento antiagregante debido a los
antecedentes de úlcera gastroduodenal, múltiples complicaciones
hemorrágicas y la necesidad de terapia de reemplazo mantenida.
El paciente continúa con controles periódicos en nuestra Unidad de Hemostasia y sin nuevos episodios hemorrágicos o trombóticos hasta ahora.
Discusión: La hemofilia es una enfermedad crónica cuya
supervivencia en el mundo occidental se aproxima a la de la población general y así se asiste a una mayor prevalencia de las comorbilidades propias de envejecimiento en cuyo abordaje en el paciente
hemofílico se debe considerar el riesgo hemorrágico inherente a la
propia coagulopatía y el riesgo adquirido de las terapias aplicadas.
Serviço de Hematologia. Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra. Coimbra,
Portugal
Introducción: Micropartículas (MP) son pequeñas vesículas
libertadas por las células circulantes como respuesta a estímulos de
activación o durante la apoptosis y pueden originarse de plaquetas
(MPP), eritrocitos, leucocitos y células endoteliales.
En pacientes con trombopenía inmune (TI) se verifica una incidencia aumentada de complicaciones cardiovasculares precoces, lo
que ha sido asociado a que las MPP proporcionan una superficie procoagulante adicional. ¿Podrá este mecanismo explicar que pacientes
con TI y trombopenia grave no tengan hemorragias más severas?
Objetivos: En un grupo de TI evaluar el número de MPP y su
asociación con el fenotipo hemorrágico.
Material y métodos: Pacientes adultos (PA): n=14 (7♂,7♀),
edad 56.8±16.6; 11 TI crónicas, 2 TI no crónicas (1 persistente y
1 aguda) y 1 TI en remisión; 7 en terapéutica corticoide (Tc) y 7
sin terapéutica (sT).
Pacientes pediátricos (PP): n=20(9♂,11♀); edad 9.4±5.2; 11
TI crónicas, 3 TI no crónicas (todas persistentes) y 6 en remisión;
8 en terapéutica Tc y 12 sT.
Grupo control (GC): n= 12 (5♂,7♀); edad 19±14; Plt mediana
261.5 x109/L (154-348).
Muestras separadas por centrifugación y analizadas por citometria de flujo de acuerdo con Robert S. et al (2008). MPP definidas por tamaño (<1µm) y positividad para CD61. Se determinó
el score hemorrágico SMOG (Rodeghiero et al, 2013) de los 6
meses previos al estudio. Para todos fue calculado el ratio MPP/N.º
Plaquetas (rMPP). Se compararon los grupos PA y PP con GC; TI
con trombopenía grave (Plt<50) vs TI con trombopenía moderada/
leve (Plt>50) vs TI en remisión; TI crónica vs TI no crónica; TI
en Tc vs TI sT.
Resultados: SMOG idéntico entre PA vs PP y entre Plt<50 vs
Plt>50. El n.º de MPP no varía entre pacientes TI vs GC, pero es
diferente entre TI en remisión vs GC (p= 0,0002). En los PA hay
una correlación directa entre n.º Plt y MPP (p<0,0001, r= 0,86),
no observada en PP y GC.
El rMPP es aumentado en: pacientes vs GC (p= 0,0004),
Plt<50 vs Plt>50 (p= 0,02), en pacientes Tc vs sT (p=0,05) y en
TI en remisión vs GC (p= 0,0001). Entre TI crónica y no crónica no
hay diferencias en el rMPP. Los pacientes Plt<50 sT en comparación con los pacientes Plt>50 sT tiene un rMPP significativamente
mayor (p= 0,02).
Conclusión: El fenotipo hemorrágico es similar entre pacientes, lo que hace pensar que algo compensa fenotípicamente el
grupo Plt<50. El rMPP es significativamente más elevado en este
grupo, independientemente de ser PA o PP o ser TI crónica o no
crónica. Las TI en remisión tienen un aumento de rMPP vs GC,
probablemente debido a un mayor turnover plaquetario. La Tc
parecía tener alguna influencia, pero si analizamos solamente los
pacientes sT, el grupo Plt<50 sigue teniendo más rMPP.
Así, el rMPP si aumentado puede ser un factor modulador de
fenotipo y será una característica del paciente Plt<50 sin sintomatología hemorrágica importante, independientemente de ser adulto
o niño con o sin Tc. Sería importante incluir un mayor de pacientes
en fase aguda y pacientes con scores hemorrágicos distintos.
PO-381 El número de micropartículas
plaquetares en pacientes con
trombopenia inmune grave es un factor
protector del fenotipo hemorrágico
Seara Sevivas T., Coucelo M., Mendes M.J., Oliveira A.C.,
Marques D., Martinho P., Silva Pinto C., Goncalves E., Fidalgo T.,
Salvado R., Martins N., Ribeiro M.L.
155
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
PO-382 Estudio de incidencia de hemorragia
severa en un área de asistencia
sanitaria
Caso clínico: Niña de 6a con déficit grave de FX, controlada en otro centro, que acude a urgencias por dolor e impotencia
funcional en EID de 48 hr de evolución sin traumatismo previo.
Múltiples episodios hemorrágicos previos que requirieron tratamiento sustitutivo. No profilaxis actual.
E. Física normal salvo dolor en FID. EID en flexión interna
con dolor e impotencia funcional a la movilización, fundamentalmente a la hiperextensión.
Analítica: hemograma y bioquímica normales. Hemostasia:
TTPa 77’4 seg, Tiempo de Quick 46’9 seg, A. protrombina 16%.
Factores II, V, VII, VIII, IX y XI normales. Factor X <1%. Estudio
de inhibidores negativo.
Ecografía: Hematoma de psoas ilíaco derecho de 7 x 3 cm.
Desestructuración de las fibrillas musculares, hematoma evolucionado que llega a improntar al riñon ipsilateral.
Evolución: Al ingreso, y tras constatar ecográficamente la presencia de hematoma de PID se inicia tratamiento con complejo
protrombínico a dosis de 40-45 UI/kg/36 hr y reposo absoluto e
inmovilización pasiva de EID. Tras la primera dosis, importante
mejoría clínica, desapareciendo la posición antiálgica en EID, el
dolor y la impotencia funcional. Dada la óptima respuesta clínica
se procede a las 72 horas del ingreso a ajuste de dosis de complejo
protrombínico (20-25 UI/kg cada 48 horas) hasta completar una
semana de tratamiento.
En el control ecográfico a las 96 horas de ingreso, se observa
una involución del hematoma con organización del mismo, no
detectándose en el momento de su realización signos de progresión
del sangrado y/o complicaciones, por lo que es dada de alta.
Diagnóstico molecular: implica la secuenciación de las regiones
claves del gen del FX, que se encuentra en el cromosoma 13 y posee
8 exones (Figura 1). Se entiende como región clave a la codificante
del gen, la intrónica que flanquea a los exones y la zona del promotor. No existe una descripción detallada acerca de la amplificación
de estas regiones por lo que se diseñaron nuevos primers mediante
ExonPrimer. La amplificación con los primeros diseñados fue todo
un éxito ya que todos los exones son amplificados con una temperatura de hibridación común. Utilizando diversos softwares para
la interpretación de las reacciones de secuenciación, se dio con la
mutación responsable. La paciente presenta una mutación en homocigosis en el exón 1, g.118g>a, que da lugar a una mutación a nivel
Pinto G., Méndez G., Aranda Y., Roldán F., López J.,
García-Avello A., César J.M.
Hospital Universitario Ramón y Cajal. Madrid
Objetivo: Estudio descriptivo de las hemorragias severas (que
precisaron asistencia en un Servicio de Urgencias) en un área de
asistencia sanitaria.
Metodología: Se recogieron de forma prospectiva, durante
todo el año 2013, las hemorragias que acudieron al Servicio de
Urgencias de un Hospital de referencia que atiende a 500.000
usuarios. No se incluyeron casos pediátricos.
Resultados: Se recogieron 450 casos (57,6% varones), que
corresponden a una incidencia estimada de 90 casos por cada
100.000 habitantes/año. El promedio de edad fue de 76 años (rango20 a 98). La hemorragia más habitual (45%) fue la que afectó a
tracto digestivo (de las cuales un 62,1% afectaron a colon y recto),.
seguido de genitourinaria (28.4%), hematomas (14%), epistaxis
(12%) y hemoptisis (0.2%).
La mayoría de los pacientes estaban medicados con fármacos
antitrombóticos incluyendo acenocumarol (39%), ASA (21,3%),
clopidogrel 6,9%, ASA + clopidogrel (4%) y nuevos anticoagulantes orales (NACO, 4,1%). Un 17,3% de los pacientes no tenían
tratamiento antitrombótico. En todos estos grupos, salvo en los
tratados con clopidogrel, la hemorragia del tracto digestivo fue predominante, especialmente en los pacientes con NACO en los que
alcanzó un 76,8%. La mayoría de estos últimos estaban medicados
con Dabigatran (DE) y Rivaroxaban. Todos los pacientes con DE,
excepto uno, tuvieron un TTPa prolongado (57,3±9,3 sg). En el
grupo del clopidogrel la incidencia de sangrado genitourinario fue
la predominante (54,8%), seguida de la digestiva (41,9%).
Conclusiones: La hemorragia espontánea que requiere asistencia no es infrecuente. La mayoría de los casos está en relación
con tratamientos antitrombóticos, especialmente los clásicos. La
localización más usual es el tracto digestivo, seguido del genitourinario. Aunque la penetración en mercado de los NACOs es escasa,
los casos de DE se asociaron a TTPas notoriamente prolongados.
PO-383 Estudio molecular de un caso de déficit
grave de factor X de la coagulación
De Rueda Ciller B., Arias Moreno X., Santa-Catalina Ágreda S.,
Tercero-Mora M., Lucía Cuesta J.F., Delgado Beltrán P.
Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza
Introducción: El FX es una serín proteasa dependiente de Vit
K con herencia autosómica recesiva cuyo déficit es <1/500.000
individuos vivos. Los sangrados se controlan de forma conservadora y/o administración de plasma fresco. Se considera déficit
grave cuando la actividad del FX es <1% y la actividad del Ag
<5% 1.
Figura 1. Estructura del Factor X.
156
Pósteres
Materno Infantil de Málaga. Málaga. 15Hospital Jerez de la Frontera. Cádiz.
16
Hospital Carlos Haya. Málaga
Introducción: Con FIXr (BenefiX®) se ha constatado una
recuperación más baja que la obtenida con concentrados de FIX
plasmáticos. La posología reflejada en su ficha técnica tanto para
adultos como niños se ajusta en función de la recuperación. Este
hecho es recogido por la Federación Mundial de Hemofilia en las
guías terapéuticas mediante la aplicación de un factor de corrección (1,25 en adultos y 1,43 en niños). Sin embargo, existe la
percepción de que no hay grandes diferencias en las dosis usadas
en la práctica clínica entre los pacientes tratados con factor recombinante versus plasmático.
Método: Estudio observacional para la recogida retrospectiva durante un año de los tratamientos realizados con FIXr en
pacientes con HB perteneciente a 16 centros en España. Se recogieron datos demográficos, gravedad, estudio genético, pautas de
tratamiento en profilaxis y a demanda y consumo total. Objetivo
primario: conocer las pautas de profilaxis y tratamiento de episodios hemorrágicos con FIXr en pacientes con HB.
Resultados: Se analizaron 87 pacientes con HB, 14 leves, 29
moderados y 44 graves. La mediana de edad fue de 20 años (1,671), peso de 60 kg (8-130). El 50% de los pacientes tenían antecedentes familiares. El estudio genético se realizó en 59 pacientes,
con una mayoría de mutaciones con sentido (82%). En tres pacientes no se encontró la mutación.
Durante el periodo de observación el 48% de los pacientes recibieron tratamiento a demanda y el 52% en profilaxis. El 77% de
los pacientes con hemofilia grave estaban en profilaxis. De los 45
pacientes en profilaxis, 18 estaban en profilaxis primaria y 27 en
profilaxis secundaria. La pauta más empleada fue la de dos días en
semana (80%) con una dosis diaria de 35 UI/kg (12-65) y una dosis
semanal de 64,7UI. La edad media de los pacientes en profilaxis fue
de 8.9 años. El 82% de los pacientes en profilaxis primaria no presentaron ningún hemartros. En los pacientes a demanda la media de
dosis empleada fue de 50,42 UI/kg/día (24-125). El consumo total
anual de los pacientes a demanda fue de 36.850 UI comparado con
el de los pacientes en profilaxis que fue de 150.080 UI (p< 0,001).
Conclusiones: En la práctica clínica las dosis utilizadas con
FIXr no fueron superiores a las reflejadas en la literatura para FIX
plasmático. Aunque el número de la muestra es pequeña, estas
dosis demostraron su eficacia en pacientes en profilaxis primaria,
donde el 82% de los pacientes no padecieron ningún hemartros, y
en el control de los episodios tratados a demanda. Al ser un estudio
observacional de pacientes tratados durante un año, el porcentaje
de pacientes graves (50%), no es representativa de la población
global de hemofílicos.
Figura 2. Árbol genealógico de la familia, donde se observa la condición
de portadores de los progenitores.
de proteína de p.G-20R. Esta mutación ya descrita con anterioridad
es conocida como factor X Santo Domingo.
Estudios a nivel celular indican que esta mutación provoca
una escisión incompleta del péptidoseñal del FX, de tal forma que
se favorece su degradación intracelular. La consecuencia final
es que el factor X maduro nunca llega a ser secretado al medio
extracelular, y por extensión, al torrente circulatorio.
El análisis molecular en los progenitores detectó la mutación
en heterocigosis, corroborándose la condición de portadores obligados de ambos (Figura 2).
Discusión: La mutación en homocigosis, g.118g>a, es la responsable de la patología de la paciente y que fue transmitida por
sus progenitores los cuales son portadores de la misma. Dicha
mutación es conocida como FX Santo Domingo, y en homocigosis
es responsable de formas graves de déficit de FX.
PO-384 Estudio observacional, retrospectivo
y multicéntrico sobre las pautas
de tratamiento en España con factor IX
recombinante (FIXr) en pacientes
con hemofilia B (HB)
Pérez Garrido R.1, Altisent C.2, Jiménez-Yuste V.3, Fernández N.4,
García F.5, Fernández Fontecha E.6, Bonanad S.7, León A.8,
Pérez N.9, Canaro M.10, Gutiérrez Pimentel M.J.11, Velasco F.12,
Bermejo N.13, Palomo A.14, Campos R.15, Mingot E.16
Hospital Universitario Virgen del Rocío. Sevilla. 2Hospital Vall d’Hebron.
Barcelona. 3Hospital Universitario La Paz. Madrid. 4Hospital Universitario Miguel
Servet. Zaragoza. 5Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca. Murcia.
6
Hospital Universitario Río Hortega. Valladolid. 7Hospital Universitari i Politècnic
La Fe de Valencia. Valencia. 8Hospital La Candelaria. Tenerife. 9Hospital
Torrecárdenas. Almería. 10Hospital Universitari Son Espases. Palma de Mallorca.
11
Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada. 12Hospital Universitario
Reina Sofía. Córdoba. 13Hospital San Pedro de Alcántara. Cáceres. 14Hospital
1
PO-385 Eventos cardiovasculares en pacientes
hemofílicos: experiencia de un centro
de referencia
Reyes J.1,2, Balaguer A.1, Haya S.1, Cid A.R.1, Mira Y.1, Ferrando
F.1, Bonanad S.1, Sanz M.1
157
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
se continuó anti agregación con AAS 100 mg y Clopidogrel 75 mg
a largo plazo sin complicaciones hemorrágicas.
Conclusiones: No hay un estándar de tratamiento para tratar los eventos cardiovasculares en los pacientes hemofílicos, las
actuaciones están basadas en opinión de expertos. De esta forma
han seguido el tratamiento nuestros pacientes Con los tratamientos
llevados a cabo ha habido un buen control sin excesivas complicaciones hemorrágicas, solo en uno de nuestros pacientes requirió
la retirada de AAS.
Hospital Universitari i Politècnic La Fe. Valencia. 2Hospital de San José.
Fundación Universitaria de Ciencias de la Salud. Bogotá, Colombia
1
Introducción: Con las mejoras de los tratamientos en las últimas décadas los pacientes hemofílicos han conseguido una mayor
esperanza de vida, esto ha originado que en el momento actual se
den con más frecuencia eventos cardiovasculares en estos pacientes. La diátesis hemorrágica basal hace especialmente complicado
el manejo de estos pacientes El enfoque terapéutico de estas complicaciones está basado en nivel de evidencia de recomendación
de expertos. El presente estudio tiene como objetivo comunicar la
serie de casos de hemofílicos que han presentado eventos cardiovasculares en nuestro medio y valorar los tratamientos pautados y
sus posibles complicaciones.
Pacientes y métodos: Se realiza un estudio descriptivo tipo
serie de casos reportando los pacientes con eventos cardiovasculares en la población hemofílica en un hospital de referencia en
el periodo comprendido de 2004 a 2014. Se efectuó una revisión
de historias clínicas de forma retrospectiva con recogida de datos
demográficos, factores de riesgo cardiovascular y manejo terapéutico con valoración de su eficacia y complicaciones.
Resultados: En los últimos 10 años se encontraron seis hemofílicos A que presentaron diferentes eventos cardiovasculares. Las
características de los pacientes, tipo de enfermedad cardiovascular
y factores de riesgo se detallan en la Tabla 1.
Se diagnosticó fibrilación auricular en un hemofílico grave y 3
leves. El hemofílico grave se encuentra antiagregado con AAS 100
mg/24h con control de Verify-now de 438 ARU (valor para adecuada antiagragación <550) y profilaxis con FVIII 1500 UI tres días
por semana, manteniendo valores de FVIII valle de 3.9%. De los
tres pacientes con hemofilia leve, el paciente n.º 2 está antiagregado
y controlado con Verify-now, de 418 ARU, los dos siguientes anticoagulados con acenocumarol manteniendo rangos de INR entre
2-3, sin complicaciones hemorrágicas en ninguno de los tres. Dos
pacientes con hemofilia moderada, el paciente n.º 5 se presentó
con accidentes cerebro vascular (ACV) isquémico no requiriendo
ningún manejo intervencionista neuroquirúrgico y se consideró cardioembólico, inicialmente tratado con AAS 100 mg/24h pero por
complicaciones hemorrágicas se pasó a ser tratado con dipiridamol.
El otro paciente con hemofilia moderada, paciente 6.º, presentó un
síndrome coronario agudo tipo SCACEST llevado a angioplastia
primaria a quien se le administró reposición de factor durante la
evaluación angiografía y 24 horas posteriores, dado la presencia
de hematoma en la zona de inserción del catéter. Posteriormente
PO-386 Hemofilia de tipo esporádico y familiar
en Aragón
Santa Catalina S., de Rueda B., Arias X., Costilla L., Recasens V.,
Delgado P., Lucía J.F.
Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza
Introducción: Una deficiencia o pérdida de funcionalidad de
los factores de coagulación VIII o IX dan lugar a hemofilia A (HA)
o hemofilia B (HB), respectivamente.. En estudios anteriores se ha
observado que la prevalencia de casos esporádicos en hemofilia es de
1/3 del total de casos y que en el 82-85% de estos, la madre resulta
ser portadora de la enfermedad. El objetivo de este estudio es valorar
la prevalencia de casos esporádicos y familiares, así como describir el
perfil de la población de ambos grupos en el área geográfica de Aragón.
Desarrollo: Se elaboraron genogramas de 48 familias de HA
y 10 familias de HB, identificando la mutación causal en los casos
índice y la condición de portadora o no en todas las pacientes de
interés con muestra disponible mediante el análisis de ADN de células nucleadas en sangre periférica. No se observaron diferencias
entre ambas hemofilias en la prevalencia de casos esporádicos (60%)
y familiares (40%) siendo muy semejantes en todos los fenotipos.
Por otro lado, teniendo en cuenta el alto número de casos esporádicos en nuestra población, hay que destacar que en su mayoría
(83%) se tratan de casos aislados en la familia, mientras que en un
17% ambos hijos de una misma pareja resultaron ser los primeros
casos de hemofilia en la familia. Un 90% (36/40) de las madres
de casos esporádicos de hemofilia resultaron ser portadoras de la
enfermedad. Mientras que a diferencia de otros estudios, un 72%
de las abuelas maternas estudiadas (8/11), resultaron portadoras.
Por ello, a pesar de ser tratados como casos esporádicos, en estos
Tabla 1.
Paciente
Edad
Valores FVIII (UI/dL)
Enfermedad CVs
HTA
DM
DL
Obesidad
Tabaco
Tto
Otros
1
45
<1
ACxFA
No
No
No
2
41
10
ACxFA
Sí
No
No
Sí
Sí
ASA
Insuf. Mitral
Sí
No
ASA
Insuf. Mitral
Def. Factor XII
3
81
35
ACxFA
Sí
No
No
No
Sí
Inh Vit K
4
72
40
ACxFA
No
No
Si
No
No
Inh Vit K
5
68
3
ACV
No
Sí
Sí
No
Sí
AAS Dipiridamol
6
71
3
SCACEST
Sí
Sí
Sí
Sí
No
Sí
158
FA
Pósteres
Introducción: Tanto la Hemofilia A adquirida como la Enfermedad de von Willebrand adquirida son coagulopatías raras, cuya
prevalencia no se sabe exactamente y que representan un reto diagnóstico y terapéutico para el hematólogo clínico.
Casos clínicos: Presentamos 4 casos con diferente contexto
clínico, etiopatogenia y tratamiento, ya que dada la escasa prevalencia, consideramos que es importante la difusión de la experiencia de cada centro.
Caso clínico 1: mujer de 44 años con hematoma retrofaríngeo espontáneo que se interpretó inicialmente como un absceso e
ingreso en otorrinolaringología, se evidencia un TTPa de 64,2” y
tras el diagnóstico de hemofilia adquirida se comenzó tratamiento para el sangrado con FEIBA y posteriormente erradicación de
los inhibidores con prednisona + ciclofosfamida. Con control del
sangrado y recuperación de los niveles normales de FVIII, sin
recurrencia de la enfermedad tras 15 meses de seguimiento.
Caso clínico 2: varón de 77 años con antecedente de neoplasia
vesical desde hace 6 años, con múltiples hemorragias subcutáneas
de 1 mes de evolución y alargamiento de TTPa aislado, con un
FVIII del 4%. Se comienza con tratamiento con antifibrinolíticos,
corticoides y ciclofosfamida. Se confirma la presencia de inhibidores (4 U. Bethesda). Tras un mes de tratamiento se controlaron
las hemorragias y se normalizó el nivel de FVIII.
Caso clínico 3: varón de 79 años de edad, con antecedente de
anemia ferropénica crónica secundaria a hemorragia digestiva alta, que
tras agudización importante de la anemia es remitido a las consultas
de hematología. Se hace el diagnóstico de déficit de factor XI, sin que
esto justifique los sangrados, y de gammapatía monoclonal de significado incierto IgG, tras el estudio inicial. Se completa el estudio y se
diagnostica de enfermedad de von Willebrand adquirida (Tabla 1). Las
inmunoglobulinas endovenosas fueron el tratamiento elegido, con control de la hemorragia digestiva y menor requerimiento transfusional.
Caso clínico 4: varón de 77 años diagnosticado de mieloma
múltiple (MM) smoldering, que presenta hemorragia digestiva aso-
pacientes la mutación se ha transmitido de forma silente mediante
portadoras en al menos 3 generaciones. En el 10% de las madres de
casos esporádicos en los que no se detectó la mutación, no hay que
descartar su condición de portadoras puesto que puede tratarse de
un mosaicismo oculto. La presencia de un mosaicismo en nuestra
población, se pudo confirmar en 1 de las 4 madres cuya mutación
causal no se presentaba en sus células somáticas. Entre los 22 casos
de hemofilia familiar, un 5% tienen 1 hemofílico en la familia, 41%
dos hemofílicos y un 54% tienen tres o más hemofílicos en la familia. La media de transmisión de la enfermedad en hemofilia familiar
es de 3 generaciones. Un 13% de los casos familiares tienen un
antecesor masculino directo con hemofilia y mientras que en los
pacientes con hemofilia grave, tan solo lo poseen un 5%.
Conclusiones: En la población de estudio hay una mayor prevalencia de casos esporádicos para todos los fenotipos de hemofilia. Lo que quizá se deba a una baja estimación de casos familiares
como consecuencia de la tendencia a familias de menor tamaño,
escaso registro de datos de las historias clínicas familiares y del
desarrollo en los últimos años de un buen consejo genético y técnicas reproductivas. Por este último motivo puede deberse que la
propagación de hemofilia tanto en casos esporádicos como familiares, sea principalmente a través de portadoras.
PO-387 Inhibidores de la coagulación
adquiridos: heterogeneidad clínica
y terapéutica
Villegas da Ros C., Ortiz Zuluaga S., Javier González K.,
Pérez Rodríguez P., Orero Castello M.T., Miguel Sosa A.,
Carbonell Ramón F.
Hospital General Universitario de Valencia. Valencia
Tabla 1.
Caso 1
Caso 2
Caso 3
Caso 4
Diagnóstico
Hemofilia adquirida
Hemofilia adquirida
Enfermedad de von Willebrand
Adquirida + déficit de F XI
Enfermedad de von Willebrand
Adquirida
Edad (años)
43
77
79
77
Femenino
Masculino
Masculino
Masculino
Ninguna
Ninguna
Gammapatía Monoclonal de
Significado Incierto
Mieloma Múltiple
Hematoma retrofaríngeo +
equimosis cutáneas
Hemorragias subcutáneas
en EID
Hemorragia digestiva alta
Hemorragia digestiva alta
• FEIBA (3 dosis)
• Prednisona 1 mg/kg/día
• Ciclofosfamida 1 mg/kg/día
• Prednisona 1 mg/kg/día
• Ciclofosfamida 1 mg/kg/día
• Igs 1gr/kg cada 4 semanas
• Melphalan + prednisona 6
ciclos.
• FVIII 4.5 UI/Dl
• Inhibidor 4.00 U.Bethesda
• FXI 37UI/dL
• FVIII 11UI/dL
• FVW:Ag 15.4UI/dL (VN:47-197)
• FVW:RCo no coagula
• FVW:CB 4.1UI/dL (VN: 60-130)
• FVIII 13.9UI/dL
• FVW:Ag 11UI/dL (VN:47-197)
• FVW:RCo <3.5%
• FVW:CB 2.2UI/dL (VN: 60-130)
Sexo
Enfermedad
asociada
Clínica
Tratamiento
Valores al
diagnóstico
• FVIII 4.5 UI/Dl
• Inhibidor 1.80 U.Bethesda
159
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
ciada a alteración de la coagulación, diagnosticándose de enfermedad de von Willebrand adquirida. Dado que la coagulopatía era
sintomática y con requerimiento transfusional, se decide realizar
tratamiento del MM, con melphalan – prednisona. Tras 6 ciclos de
tratamiento el paciente presenta normalización de los niveles de
factores y control de hemorragia digestiva asociada.
Conclusiones: Ambas diátesis hemorrágicas están infradiagnosticadas en la práctica clínica diaria a pesar de que se piensa que
su prevalencia va en aumento. Dado que sus síntomas son reversibles con tratamiento adecuado, aunque potencialmente mortales,
es que es muy importante considerarlas dentro de los diagnósticos
diferenciales ante una coagulopatía adquirida inexplicable por otras
causas. Sobre todo junto a patologías que habitualmente suelen
acompañarlas. En la enfermedad de von Willebrand adquirida el
tratamiento siempre que se pueda debe estar dirigido a la enfermedad de base como en el caso número 3 y 4. En cambio en la hemofilia adquirida, el tratamiento está dirigido a controlar la hemorragia
y a erradicar los inhibidores como en los casos 1 y 2, cuya gravedad
es diferente y por lo tanto también su manejo terapéutico.
Tabla 1.
Mutación
hemofilia A
PO-388 Mutaciones de los pacientes con
hemofilia diagnosticados en los últimos
10 años en la provincia de Málaga
Documentada
Grave
Mod
Leve
Total
%
p.R1997W
3
1
0
4
17.39
Inversion
intron 22
4
0
0
4
17.39
p.W1817X
1
0
0
1
4.34
F276L exon 7
0
1
0
1
4.34
p.T87P, exón3
1
0
0
1
4.34
Deleccion
exon 11
1
0
0
1
4.34
p.G70V
0
1
0
1
4.34
IVS20-1G>A
del intro 20
1
0
0
1
4.34
p.I1194fs
1
0
0
1
4.34
1588-1590 insA
(exon 14)
1
0
0
1
4.34
Inversion
intron 1
1
0
0
1
4.34
No
determinadas
0
1
0
2
8.69
Pendientes
1
1
0
4
17.39
TOTAL
15
5
3
23
100
Rivas Luque M.1, Fuentes Gálvez P.A.2, Palomo Bravo M.A.3,
Heininger Mazo A.I.2
Hospital Universitario Virgen de la Victoria. Málaga. 2Hospital Carlos Haya.
Málaga. 3Hospital Materno Infantil. Málaga
1
la inversión del intrón 1 (4.36%), también afecto de Hemofilia A grave.
En nuestra serie, la mutación p.R1997W se describe en 4 pacientes
(17.39%), 3 con Hemofilia a grave y 1 con Hemofilia A leve. Otras 8
mutaciones (Tabla 1) se han identificado en 8 pacientes diferentes, 6
con hemofilia A grave y 2 con hemofilia A moderada. En 2 pacientes
(de origen asiático) no se ha podido determinar la mutación. En los 4
pacientes restantes están aun pendientes los resultados.
Conclusiones: A pesar de que la inversión del intrón 22 está
descrita hasta en el 30-50% de los pacientes con Hemofilia A,
en nuestra serie no se cumplen estas cifras, puesto que solo la
presentan el 17.39% de los pacientes. Este mismo porcentaje lo
presenta la mutación p.R1997W, que sin embargo no está contemplada como una de las mutaciones más frecuentes. La mayoría de
nuestros pacientes, en conjunto un 34.72%, presentan mutaciones
distintas de las consideradas prevalentes.
Introducción: La hemofilia A es una coagulopatía infrecuente
(1 de cada 5000-10000 nacimientos en varones), hereditaria ligada
al sexo, que se produce por un defecto en el gen del factor VIII,
localizado en el cromosoma X. Este desorden produce un déficit
de dicha proteína, que actúa como cofactor del FIX para la activación del FX de la coagulación, aumentando, por tanto, el riesgo
hemorrágico de estos pacientes. El gen FVIII es extremadamente
largo, ya que tiene unos 186000 pares de nucleótidos (186 kb), y
estructuralmente complejo. Consta de 26 exones y 25 intrones. Se
han descrito un gran número de mutaciones que afectan a dicho
gen, recogidas en HAMSTEReRS y HGMD. Las más frecuentes
son la inversión del intrón 22 en el 30-50% de los pacientes, y la
inversión del intrón 1 en aproximadamente un 2-5%. En el resto
de pacientes se han descrito mutaciones puntuales, delecciones, e
inserciones en diferentes proporciones. En el 5-10% de los casos
no se detecta la mutación originaria.
Material y métodos: En los últimos 10 años hemos diagnosticado un total de 23 pacientes con Hemofilia A en nuestro centro.
Hemos clasificado a los pacientes en función del nivel del FVIII.
En todos ellos hemos realizado el análisis genético. En 4 de ellos
están aun pendientes los resultados.
Resultados: De los 23 pacientes diagnosticados, 15 presentan
Hemofilia A grave, 5 hemofilia A moderada y 3 hemofilia a leve. La
inversión del intron 22 se ha encontrado en 4 de los pacientes (17.39%),
todos ellos con hemofilia A grave. En 1 de los pacientes se ha detectado
PO-389 Mutaciones de novo y con historia
familiar en los pacientes hemofílicos
diagnosticados en la provincia de
Málaga en los últimos 10 años
Fuentes Gálvez P.A.1, Rivas Luque M.2, Palomo Bravo M.A.3,
Heiniger Mazo A.I.1
Hospital Carlos Haya. Málaga. 2Hospital Universitario Virgen de la Victoria.
Málaga. 3Hospital Materno Infantil. Málaga
1
160
Pósteres
Introducción: La hemofilia A es una coagulopatía infrecuente
(1 de cada 5000-10000 nacimientos en varones), hereditaria ligada
al sexo, que se produce por un defecto en el gen del factor VIII,
localizado en el cromosoma X. Este desorden produce un déficit de dicha proteína, aumentando el riesgo hemorrágico de estos
pacientes. El gen FVIII tiene unos 186000 pares de nucleótidos, y
es estructuralmente complejo. Consta de 26 exones y 25 intrones.
Las más frecuentes son la inversión del intrón 22 en el 30-50%
de los pacientes, y la inversión del intrón 1 en aproximadamente un 2-5%. En el resto de pacientes se han descrito mutaciones
puntuales, delecciones, e inserciones en diferentes proporciones.
En el 5-10% de los casos no se detecta la mutación originaria.
Alrededor de 1/3 de dichas mutaciones son espontáneas, sin antecedentes familiares. Estas mutaciones de novo, suelen originarse
en la madre, que transmitirá la enfermedad a sus hijos varones.
Material y métodos: En los últimos 10 años hemos diagnosticado un total de 23 pacientes con Hemofilia A en nuestro centro.
Hemos clasificado a los pacientes en función del nivel del FVIII.
En todos ellos hemos realizado el análisis genético. En 4 de ellos
están aun pendientes los resultados.
Resultados: De los 23 pacientes diagnostidos de Hemofilia
A en los últimos 10 años en nuestro centro, solo 13 presentaban
historia familiar de la enfermedad. La mayoría de ellos, el 30.7%
presentan la mutacion p.R1997W, seguido de 15.3% en los que
se identifica la inversión del intrón 22. Dos pacientes presentan
mutaciones de las no descritas como más prevalentes p.W1817X y
F276L exon 7. En dos de los pacientes no se ha identicazo la mutación, y tampoco en su madre. Hay tres pacientes pendientes de
determinar. De los 10 pacientes que no presentaban historia familiar, se han identificaron mutaciones de novo en 8 de las madres.
En un caso, no se ha podido identificar la mutación en la madre,
y sí en el niño. En uno de los casos queda pendiente de detectar
la alteración en madre e hijo. Dos de dichas mutaciones fueron
inversión del intrón 22. En 6 casos se han objetivado mutaciones
de las no descritas como más prevalentes, todas ellas presentando
hemofilia A grave (Tablas 1 y 2).
Conclusiones: Está descrito que hasta en el 66% de las mutaciones en Hemofilia A existe historia familiar de la enfermedad
y hasta el 33% son de novo. En nuestra serie el porcentaje de las
mutaciones con historia familiar es del 56.52 %, y de mutaciones
Tabla 2.
Grave
Mod
Leve
Total
%
Inversion intron 22
2
0
0
2
20
p.T87P, exón3
1
0
0
1
10
Deleccion exon 11
1
0
0
1
10
p.G70V
0
1
0
1
10
IVS20-1G>A del intro 20
1
0
0
1
10
p.I1194fs
1
0
0
1
10
1588-1590 insA (exon 14)
1
0
0
1
10
Inversion intron 1
1
0
0
1
10
Pendientes
0
0
1
1
10
TOTAL
8
1
1
10
100
Grave
Mod
Leve
Total
%
p.R1997W
3
1
0
4
30.76
Inversion intron 22
2
0
0
2
15.38
p.W1817X
1
0
0
1
7.69
F276L exon 7
0
1
0
1
7.69
No determinadas
0
1
1
2
15.38
Pendientes
1
1
1
3
23.07
TOTAL
7
4
2
13
100
de novo es del 43.47%. La mutación de novo más frecuente es la
p.R1997W, y la inversión del intrón 22 en los casos de historia
familiar.
PO-390 Prasugrel, microangiopatía trombótica
y apendicitis aguda
Torres Miñana L.1, Plaza M.L.2, de la Iglesia S.1, Carrión S.2,
Gómez-Casares M.1, Rodríguez C.1, Sánchez V.3, Molero T.1
1
Servicios de Hematología, 2Anatomía Patológica y 3Radiodiagnóstico. Hospital
Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín. Las Palmas de Gran Canaria
Introducción: La púrpura trombótica trombocitopénica es una
entidad de baja frecuencia que asocia una alta mortalidad y en la cual
no existen exámenes de laboratorio de urgencias que permitan confirmar el diagnóstico. Una alta sospecha clínica ante anemia hemolítica microangiopática junto con trombopenia, obliga a la realización
de exámenes selectivos, e iniciar su manejo de manera rápida con
recambios plasmáticos; posponer el inicio de los mismos puede tener
consecuencias graves, con una tasa de mortalidad mayor de 90%.
Caso clínico: Varón de 64 años con antecedentes de IAM
anterior, tratado con fibrinolisis y revascularización percutánea.
Tratamiento al alta, prasugrel.
Tras un mes y medio del IAM, vuelve a urgencias por cuadro
de dolor progresivo en epigastrio irradiado hacia FID, náuseas,
vómitos alimenticios y posteriormente biliosos. Con empeoramiento del cuadro rápido, síndrome diarreico, orinas colúricas
y posteriormente oliguria. Exploración: tinte ictérico, abdomen
doloroso a la palpación profunda en FID con defensa y blumberg
dudoso. Presentaba abundantes petequias en piel.
Analítica urgencias: trombocitopenia (20.000 /uL) sin anemia,
LDH e índice ictérico elevados, test de Coombs negativo. Amilasa
en rango normal; CK, procalcitonina y PCR elevadas. Fracaso
renal agudo (creatinina de 3,6 mg/dL). Alteración de ambas vías
de la coagulación con hiperfibrinógemia. En el frotis de urgencias
no se observaron esquistocitos. La TAC presentó hallazgos compatibles con apendicitis aguda.
Ante estos hallazgos, se planteron los diagnósticos de sepsis
secundaria a apendicitis aguda y trombopenia severa (microangiopatía trombótica vs trombopenia secundaria a sepsis). Con
Tabla 1.
Mutación de novo hemofilia A
Mutación con H.ª Familiar
hemofilia A
161
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
calculamos en forma de porcentaje (número de semanas al año
tratamiento correcto entre el número de semanas del año en el que
el sujeto no tiene una hemorragia activa o está sometido a procedimiento invasivo). Todos los pacientes han consentido. Estudio
avalado por el Comité Ético de nuestro centro.
Resultados: Evaluamos 18 pacientes (mediana edad inicio
profilaxis 30 años, RIQ 17 a 40.5 años). Tipo de profilaxis: 2 primaria, 2 secundaria y 14 terciaria. Motivo de inicio de profilaxis
terciaria: 1 hemorragia intracraneal, 1 antiagregación y 11 prevención progresión de artropatía hemofílica. 16 pacientes tratados con
productos recombinantes. Reducción de la tasa anual de sangrados
88.3% en sujetos en profilaxis terciaria (media 2.3 profilaxis vs
20.8 demanda, p<0.0001). Mediana de consumo anual de factor en
sujetos en profilaxis terciaria 2,557.8 UI/kg/año vs. 1,696.8 UI/kg/
año del periodo a demanda (p=0.312). Este incremento es menor si
la indicación de la profilaxis es la prevención de artropatía (50.7%
vs 24.5%). La mediana de la adherencia fue 84% (RIQ, 69-95%),
sin diferencia entre los distintos tipo de profilaxis (p 0.125). No
hemos descrito eventos adversos de la profilaxis.
Conclusiones: La mayoría de la profilaxis en adultos es terciaria y reduce ostensiblemente la incidencia de eventos hemorrágicos aunque a un alto coste. La justificación de la indicación
de profilaxis puede modificar el coste-eficacia. Los pacientes
adultos presentan una buena adherencia, similar a la publicada
en niños.
todo, se decidió intervención quirúrgica previa optimización del
paciente por parte de hematología, con tratamiento transfusional
pre, durante y post cirugía.
El paciente presentó una evolución clínica tórpida y 72h tras
la IQ desarrolló trombocitopenia severa, hemólisis activa, deterioro progresivo de la función renal y 6% de esquistocitos. Con
la alta sospecha de PTT se obtuvo muestra para determinación de
ADAMTS13 y se inició plasmaféresis, no mejorando y produciéndose el exitus 3 días después. Posteriormente, el resultado del
ADAMTS13 (0’13%) confirmó el diagnostico de PTT.
La necropsia a nivel macroscópico reveló petequias en serosas
y signos de isquémia miocárdica. A nivel microscópico se observaron signos de shock, como la necrosis tubular aguda y daño alveolar difuso. Se encontraron trombos de fibrina focales (sobretodo
en suprarrenales) sin verse en SNC, piel ni riñones.
Discusión: Puesto que el paciente no mejoró tras la IQ y
que actualmente están apareciendo nuevos fármacos que como
reacción adversa rara describen PTT (uno de ellos el prasugrel).
Nosotros relacionamos nuestro caso de PTT con el reciente inicio
de prasugrel.
A pesar de la ausencia de trombos hialinos, el resto de datos
en cambio nos apoyaron nuestro diagnostico de PTT.
PO-391 Profilaxis en pacientes adultos
con hemofilia A severa: indicación,
optimización del consumo y resultados
clínicos
PO-392 Representación mental de la
enfermedad en jóvenes con hemofilia.
Un estudio prospectivo de seis años
Mingot Castellano M.E., González Díaz L., Tamayo Bermejo R.,
Heiniger Mazo A.I.
Torres-Ortuño A.1, Cuesta-Barriuso R.2, Nieto-Munuera J.1
Hospital Regional Universitario de Málaga. Málaga
Universidad de Murcia. Murcia 2Universidad Católica San Antonio. Murcia
1
Fundamentos: La profilaxis es el tratamiento de elección en
sujetos con hemofilia severa para prevenir el desarrollo de la artropatía hemofílica. En sujetos adultos, no existe consenso sobre la
indicación, dosis y frecuencia de la profilaxis. Su alto coste exige
optimizar los resultados. Nuestros objetivos son:
Introducción: Los adolescentes con hemofilia deben adaptarse a las limitaciones y al cambio que se produce en la atención
a su enfermedad. La experiencia de enfermedad, las expectativas
terapéuticas y la repercusión en la esfera personal o interpersonal
son determinantes en el grado de satisfacción y adherencia a los
tratamientos y en la calidad de vida.
Objetivos: El objetivo del presente estudio de tipo prospectivo, observacional, longitudinal y no aleatorio, es valorar la percepción y representación mental de enfermedad y la calidad de vida
en jóvenes con hemofilia.
Material y métodos: Han sido evaluados 22 pacientes, (en
julio de 2007, y septiembre de 2013), que participaron en 3 Talleres de Formación bienales con el mismo formato y estructura. Se
emplearon el Cuestionario de calidad de vida (A36-Hemofilia Qol)
y el Cuestionario de Percepción de enfermedad (IPQ-R).
Resultados: La mayor parte de los jóvenes en el momento de
la primera evaluación se encontraban en tratamiento profiláctico, disminuyendo en la segunda evaluación, de forma paralela al
aumento del desarrollo de artropatías hemofílicas. Sin embargo,
este empeoramiento en el estado físico no ha influido en su práctica
de deporte, la cual ha aumentado a lo largo del tiempo.
• Describir el perfil de pacientes adultos tratados en esquema
de profilaxis y el tipo de esquema.
• Valorar la tasa anual de sangrados en pacientes en esquema de profilaxis terciaria y compararla con la del periodo
a demanda.
• Valorar si la aplicación de programas de farmacocinética y
ajuste de niveles valle optimiza los resultados.
• Valorar la adherencia al tratamiento y seguridad del tratamiento.
Pacientes: Sujetos adultos con hemofilia A severa, sin historia
de inhibidor tratados en nuestro centro en esquema de profilaxis de
larga duración entre enero de 2006 y diciembre de 2013. La dosis
se establece en base a estudio de farmacocinética (modelo bayesiano monocompartimental) y posterior optimización con niveles
valle (diana 1 y 3% en ausencia de sangrado). La adherencia la
162
Pósteres
El ensayo consta de: una extracción basal, la administración
de DDAVP y extracciones a los 30 min, 60 min, 2 horas y 4 horas,
observando así el tipo de respuesta de cada paciente según la
corrección de los siguientes parámetros, análisis de la función plaquetar (PFA®100), aglutinación plaquetar inducida por ristocetina
(RIPA), niveles de FVIII y FVW.
Criterios de respuesta: 1. Buena respuesta: normalización de
todos los parámetros estudiados. 2. Respuesta parcial: si no se normalizan todos los parámetros, la respuesta es breve o insuficiente.
3. Mala respuesta: no se normaliza ninguno de los parámetros
post-infusión del DDAVP.
Resultados: En la Tabla 1 se presentan los distintos tipos de
respuesta al DDAVP según la clasificación diagnóstica. Los datos
aparecen como valor absoluto y porcentaje con respecto al total
de pacientes (104).
HF, hemofilia; FRH, factor de riesgo hemorrágico (incluye
niveles de FVW desde 30% hasta el nivel inferior del rango de
normalidad).
Conclusiones: Como se había descrito previamente, la desmopresina es eficaz en pacientes con EVW tipo 1 y con hemofilia
A leve. El 50% de los pacientes de nuestro centro presentan buena
respuesta a la desmopresina.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en nuestro laboratorio, se recomienda el uso terapéutico del DDAVP en la mayoría
de pacientes con hemofilia A leve, portadoras de hemofilia con
clínica hemorrágica, EVW tipo 1, 2N (heterocigotos) y 1/2N.
Para cirugías menores, sin alto riesgo de hemorragia, este tratamiento es adecuado en pacientes con respuesta parcial como es
el caso de la EVW 2A (69,2%).
En la hemofilia A moderada, EVW 2M, 2A/2M y EVW 2B donde la respuesta al DDAVP es mala, este tratamiento no debe usarse.
Observamos que en algunas formas variantes de EVW y portadoras de hemofilia con clínica hemorrágica pueden ser de bastante
Respecto a la percepción de enfermedad hay diferencias significativas desde la primera a la segunda evaluación, en la identidad y
la representación emocional, de la enfermedad. La calidad de vida
experimenta un aumento global a expensas de su valoración de la
salud física y de la mejora y el aumento de las relaciones sociales,
aun cuando el dolor y el daño producido en las articulaciones son
más evidentes.
En la primera evaluación, solo las variables de tratamiento y de
secuelas de la hemofilia (tipo de tratamiento, número de hemartrosis en el último mes y diagnóstico de artropatía) correlacionaron
con las variables dependientes. En la segunda evaluación, a pesar
de que el número de hemartrosis aumenta significativamente, y al
contrario que en la evaluación inicial, la práctica deportiva correlaciona con la representación emocional y sus relaciones sociales.
Igualmente, el número de días que hacían deporte correlaciona con
su comprensión de la enfermedad, la percepción de salud física y
las relaciones y actividades sociales.
El análisis de regresión indica que las variables que más influyen en la percepción de enfermedad y en la calidad de vida de los
son trabajar, el número de días de práctica deportiva y la práctica
de ésta.
Los resultados indican que la práctica deportiva ayuda a un
mejor reconocimiento de los síntomas, comprensión de su enfermedad, a una menor afectación emocional. Igualmente ayuda a
resolver sus dificultades con el tratamiento, a afrontar mejor el
dolor y los problemas en sus articulaciones, mejorando sus relaciones y actividades sociales y su calidad de vida.
Conclusión: Programas de formación e información a jóvenes con hemofilia, mejoran la percepción de enfermedad de los
mismos. La actividad física y deportiva debe ser integrada como
parte del tratamiento de los PcH para mejorar su adaptación física
y emocional.
PO-393 Respuesta al DDAVP: experiencia
en un único centro
Tabla 1. Respuesta a la infusión de desmopresina
Diagnóstico
Pérez Rodríguez A., Loures Fraga E., Rodríguez Trillo A.,
Gómez del Castillo Solano M.C., Echeverria Mecoleta P., Iglesias
Lema T., Gestal Gómez P., Costa Pinto J., Herrero Maeso B.,
Carnero Pereiro J., Batlle Fonrodona F.J., López Fernández M.F.
HA leve
Respuesta
Buena
Parcial
Mala
16 (55,2%)
11 (37,9%)
2 (6,9%)
HA moderada
Portadora HA
Xerencia de Xestión Integrada A Coruña. A Coruña
Introducción: La desmopresina (DDAVP) es comúnmente usada en el tratamiento de pacientes con enfermedad de von
Willebrand tipo 1 (EVW 1 y hemofilia A leve. La capacidad de
respuesta de un paciente al DDAVP, basado en una dosis de 0.3
µg/kg de peso determina una terapia eficaz.
Objetivo: Revisión de la respuesta a la infusión de DDAVP en
condiciones basales en pacientes de nuestro centro con distintos
defectos de factor von Willebrand (FVW) o factor VIII (FVIII).
Material y métodos: Estudio retrospectivo desde 1999 a 2014
de la respuesta a la infusión en condiciones basales de 0.3 µg/kg de
peso de DDAVP en pacientes con hemofilia A (leve, moderada y
portadora), EVW (EVW 1, EVW 2). El número total de pacientes
revisados fue de 104.
3
8
TOTAL HA
24 (60%)
11(27,5%)
5 (12,5%)
EVW1
6 (46,1%)
5 (38,5%)
2 (15,4%)
9 (69,2%)
4 (30,8%)
5 (33,3%)
9 (60%)
EVW2A
EVW 2M
EVW 2A/2M
2
1 (6,7%)
EVW 2B
EVW2N
EVW1/2N
TOTAL EVW
FRH
TOTAL (104)
163
1
4
1
12 (24,5%)
19 (38,8%)
18 (36,7%)
30 (28,8%)
23 (22,1%)
15
51 (49,0%)
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
utilidad el DDAVP, de ahí que se recomiende el test de respuesta
a este tratamiento.
PO-395 Uso del factor VIIr activado
en el Hospital Universitario
de Getafe (2008-2013)
PO-394 Trombopenia inmune en pediatría
Chica Gullón E., Pérez Domínguez H., Peralta P., Duro H.,
García Molina C., Oña Compan F.
Mendes M.J., Sevivas T., Barreira R., Martinho P., Simões A.T.,
Salvado R., Martins N., Ribeiro M.L.
Hospital Universitario de Getafe. Madrid
Introducción: El Factor VIIr se desarrolló inicialmente para
el tratamiento de pacientes con hemofilia A o B con inhibidores,
Tromboastenia de Glanzman y déficit de Factor VII, pero dada su
capacidad prohemostática el “off license use” ha ido aventajando a
las otras indicaciones. En las últimas guías europeas, su uso compasivo en caso de hemorragia incoercible, es una recomendación
2C dada la falta de evidencia que apoye su utilización y el riesgo
demostrado de complicaciones tromboembólicas, además del alto
coste que supone.
Objetivos: Realizar un análisis retrospectivo de su uso en
nuestro centro en el periodo 2008-2013 para comprobar indicaciones, complicaciones y si su uso ha ido disminuyendo paralelamente a las recomendaciones.
Material y métodos: se solicitó a la farmacia hospitalaria los
datos sobre la administración de Factor VII durante esos años,
se analizó la historia clínica de cada caso individualmente. Se
recogieron en tabla Excell variables demográficas y de resultado
clínico.
Resultados: En estos años se ha utilizado en 110 pacientes (23
en 2008, 21 en 2009, 32 en 2010, 19 en 2011, 10 en 2012 y solo 5
en 2013), 71 varones (64%) y 39 mujeres. Media de edad: 54 años.
En 24 casos (22%) fue en profilaxis prequirúrgica en pacientes
con déficit, en los que no hubo complicaciones. De los 86 casos
restantes (78%):41 (37.3%) fueron por transfusión masiva de los
que solo 17 pudieron ser dados de alta, 33 (30%) por sangrado
incoercible (7 asociados a anticoagulación, 13 a coagulopatía por
cirrosis y 13 a procesos intercurrentes), 10 pacientes (9%) por
sangrado neuroquirúrgico que pese a la escasa cuantía compromete
rápidamente la vida del paciente y en 2 casos no queda clara la
indicación. Están vivos el 53%, y fallecieron el 47%(22% en las
primeras 24 horas). Solo en 3 casos (3,5%) han existido complicaciones tromboembólicas, no pudiendo ser atribuibles claramente
al fármaco.
Conclusiones: El uso del Factor VIr ha decrecido sustancialmente en el último año, coherentemente con las recomendaciones
actuales, ya que la mayor indicación para su uso ha sido “off label”
y en pacientes anticoagulados ha sido desplazado por la introducción del concentrado de complejo protrombínico. La mortalidad
precoz y tardía es alta como corresponde al uso compasivo que
es el mayoritario, en situaciones graves sin alternativas claras. El
número de complicaciones trombembólicas es bajo en nuestra
serie.
Bibliografía
Serviço de Hematologia. Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra.
Coimbra, Portugal
Introducción: La trombopenia inmune en la edad pediátrica
se presenta más frecuentemente antes de los 5 años de edad, por lo
general con inicio súbito, pródromo infeccioso o vacunal y evolución hacia la remisión completa. Es un diagnóstico de exclusión.
La actitud terapéutica está pendiente de la severidad de la sintomatología hemorrágica y del contexto clínico/familiar.
Objetivos: Caracterizar la población con trombopenia inmune
diagnosticada en el Hospital Pediátrico de Coimbra en los últimos
5 años.
Métodos: Fueron revisados los registros clínicos completos
de todos los niños con edad entre 0 e 13 años diagnosticados con
Trombopenia Inmune en el Serviço de Hematologia Clínica.
Resultados: Durante este periodo fueron diagnosticados 41
niños, 18 sexo femenino y 23 sexo masculino. La mayoría (53,7%)
eran menores de 5 años. El contaje plaquetar medio al diagnóstico
fue 22.6x109/L (mín=0; máx=87), la gran mayoría (58.5%) tenía plaquetas <20x109/L. En el episodio inaugural el 75,6% presentaba, al
menos, una manifestación hemorrágica. Las hemorragias cutáneas
(petequias y equimosis) fueron las más frecuentes (75,6%), seguidas de las hemorragias mucosas - epistaxis (21,9%) y mucosa oral
(17%). La hematuria y la menorragia fueron las manifestaciones
menos frecuentes (4,9% y 2,4%, respectivamente). No se registró
ninguna hemorragia con riesgo vital. El 51,2% de los casos había
tenido episódios infecciosos recientes, más frecuentemente del tracto
respiratorio superior. El 9,8% de los casos referían vacunación reciente. En el 39% restante no fue posible identificar un contexto causal. En
el episodio inaugural la actitud terapéutica fue de vigilancia clínica en
el 51,2% de los niños e infusión de inmunoglobulina intravenosa en el
46,3% por presentaren hemorragia activa importante. En el transcurso
de la enfermedad 65,9% necesitó de algún tipo de tratamiento, la
mayoría inmunoglobulina i.v. y corticoterapia (51,2%). Un niño fue
esplenectomizado 2 años después del diagnóstico. Actualmente se
encuentran en fase de PTI persistente 2 niños (4,9%). En la mayoría
(56,1%) se registro remisión completa, el 34,8% de forma espontánea.
El porcentaje de enfermos en fase crónica es del 34,1%. Desconocemos la evolución de dos enfermos que abandonaron nuestra consulta.
Conclusiones: La mayoría de los niños con trombopenia
inmune se presentaron inicialmente con manifestaciones hemorrágicas cutáneas. No se registro ninguno caso de hemorragia major.
La mayoría presentaba antecedentes infecciosos o vacunales. En el
episodio inaugural la mayoría no necesitó intervención terapéutica.
El 56,1% de los niños está en remisión completa y en 34,8% la
remisión ha sido espontanea, lo que confirma la benignidad de la
Trombopenia Inmune en la edad pediátrica.
Bardon J., et al. Off-label use of recombinant factor VII in teaching hospitals in Paris in 2010. Annales Françaises dÁnesthésie et de Réanimation 2013; 32:659-664. Welsby J., et al. Recombinant activated factor
VII and the anesthetist. Anaesthesia 200;60:1203-12.
164
Pósteres
Trombosis
PO-397 Análisis descriptivo de los pacientes
con enfermedad tromboembólica
venosa incluidos en el registro RIETE
en nuestro centro
PO-396 Actividad procoagulante de
micropartículas: un nuevo marcador
pronóstico en pacientes con
enfermedad arterial periférica
García-Navarro I., Luis-Hidalgo M., Mena-Rodríguez F.,
García-Ballesteros C., Cánovas-Giménez V., Navarro-Cortina I.,
Ferrer-Cerverón C., Mayáns-Ferrer J.R.
Hospital Arnau de Vilanova. Valencia
Introducción: La enfermedad tromboembólica venosa (ETV)
es un conjunto de epifenómenos patológicos que producen trombos en el interior del sistema venoso profundo (TVP), su propagación y su posible fragmentación al torrente sanguíneo puede
producir enclavamiento en el lecho arterial pulmonar (TEP). La
ETV sigue siendo un problema trascendental por su alta incidencia, tasa de complicaciones (tanto inmediatas como tardías), y el
elevado coste personal y social que conlleva.
Métodos: Realizamos un estudio retrospectivo de los pacientes
con ETV incluidos en el registro RIETE de nuestro hospital desde
junio de 2002 hasta junio de 2014. Se recogieron sus características clínicas, manejo terapéutico, complicaciones y tratamiento.
Resultados: Se analizaron un total de 175 pacientes (50,3%
mujeres), con una mediana de edad 64 años (rango: 23-94).
El 8,6% se había realizado algún tipo de cirugía en los dos
últimos meses previo al ETV. De éstos, al 6,3% se le administró
tromboprofilaxis con heparina de bajo peso molecular (HBPM).
El 27% de los pacientes estuvo inmovilizado, en los dos últimos
meses, cuatro días o más por motivos no quirúrgicos. El 17,7%
de los diagnosticados de ETV presentaba algún tipo de cáncer.
El diagnóstico se confirmó con prueba de imagen (Ecografía
doppler o TC helicoidal). Se realizó Eco-doppler en el 80,6% de
los pacientes, de los que el 94% presentó TVP siendo en el 44,7%
TVP derecha; el 50,4% TVP izquierda y en el 4,9% restante TVP
bilateral. Se encontró TVP proximal en el 67,4% y TVP distal
en 11,4%. Se solicitó TC helicoidal ante la sospecha de embolia
pulmonar (EP) con resultado positivo en 51,7% de los pacientes.
La trombosis venosa de extremidad superior se diagnosticó en un
1,7% de etiología relacionada con el catéter solo en 0,6%.
Destacar que 10,1% de los pacientes con Eco-doppler positiva tuvieron valores analíticos de dímero-D negativos (sin alcanzar significación estadística). En el 4,6% la ecografía resultó
anodina con dímero-D positivo. El 83,7% presentó ambas pruebas positivas.
Requirió tratamiento a largo plazo (= 6meses) el 45% de los
pacientes (siendo los antivitaminas K los fármacos de elección
empleándose en el 85,8% de los pacientes). En cambio, en el tratamiento agudo se utilizó HBPM en el 93%.
Conclusiones: A los efectos de esta revisión, la relevancia
del valor del dímero-D es como factor predictivo negativo. Existe
Paramo J.A.1, Martínez-Aguilar E.3, Gómez-Rodríguez V.2,
Fernández-Alonso L.3, Rodríguez J.A.2, Orbe J.2, Roncal C.2
Servicio de Hematología. Clínica Universidad de Navarra. Laboratorio de
Aterosclerosis y 2Laboratorio de Aterotrombosis. CIMA Universidad de Navarra.
Pamplona. 3Departamento de Cirugía Vascular. Complejo Hospitalario de
Navarra. Pamplona
1
Introducción: La enfermedad arterial periférica (EAP) se
asocia con un pronóstico desfavorable en términos de morbi-mortalidad cardiovascular. Las micropartículas (MPs) son pequeñas
vesículas liberadas tras activación o apoptosis celula, que aumentan en situaciones protrombóticas, ya que al exponer fosfatidilserina en su superficie promueven la iniciación y propagación de la
coagulación.
Métodos: Se determinó la actividad procoagulante de
MPs circulantes (STA ®-Procoag-PPL, Stago) en 88 pacientes
con EAP (71±11 años) y 20 controles sanos (75±5 años). Se
establecieron dos categorías (clasificación de Rutherford) de
pacientes: claudicación intermitente (CI, n=49) e isquemia crítica (IC, n=39). Asimismo, se midieron parámetros inflamatorios
(fibrinógeno y PCR-us), y pruebas funcionales (índice tobillo/
brazo, ITB).
Resultados: Los pacientes con EAP presentaron niveles
elevados de fibrinógeno (520±121 mg/dL vs. 448±61 mg/dL;
P<0,001) y PCR-us (17,5±30 mg/L vs. 4,6±5,1 mg/L; P<0,001)
indicando un estado proinflamatorio. Se observó aumento significativo de la actividad procoagulante de las MPs en los sujetos
con EAP en relación a los controles (tiempo de coagulación:
68±15 seg vs. 76±14 seg; P<0.01), que correlacionó con el ITB
(r=0.256, P=0,037), indicando una asociación con la reducción
de la funcionalidad en la extremidad. En comparación con los
pacientes con CI, aquellos con IC presentaron aumento de los
niveles de fibrinógeno (567±135 mg/dL vs. 481±95 mg/dL;
P<0,01)y PCR-us (31.0±41.7 mg/L vs. 7.3±11.5 mg/L; P<0.01),
y un tiempo de coagulación de las MP procoagulantes significativamente menor en comparación con los controles (.65±18 seg
vs 70±13, P<0,05).
Conclusiones: La determinación de MPs procoagulantes en
pacientes con EAP puede representar un nuevo biomarcador de
funcionalidad reducida y mayor severidad.
165
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
grupo de pacientes que pese a obtener valor negativo de dímero-D
por Eco-doppler se documenta ETV. De ahí la importancia de
la correcta anamnesis y exploración clínica para hacer un buen
diagnóstico precoz e inicio de tratamiento anticoagulante, evitando
complicaciones que pueden ser fatales.
Conclusiones: Debido a la alta especificidad de los anticuerpos anti-b2GPI-dominio I la inclusión de éstos en el panel diagnóstico de SAF podría ser recomendable para descartar el riesgo
trombótico de los pacientes y se necesitan estudios multicéntricos
que aporten resultados relevantes al respecto.
PO-398 Anticuerpos antifosfolípidos contra
el dominio I de la B-2 glicoproteína:
valoración por quimioluminiscencia
PO-399 Antitrombina Ala382Ala: una nueva
mutación silenciosa que puede
interferir en el diagnóstico genético
de la antitrombina Cambridge tipo I y II
Mauricio A.1, González V.2, Puig J.2, Marco A.3, Cabrera V.1,
Orduna M.T.1, Marco P.1
Coll Torrents I., Mateo Arranz J., Vilalta Seto N.,
Carrasco Expósito M., Millon Caño J., Cuevas Eduardo B.,
Souto Andrés J.C., Fontcuberta Boj J.
Hospital General Universitario de Alicante. Alicante. 2Coagulación-Laboratorio
Izasa. Barcelona. 3Hospital de San Juan. Alicante
1
Servei d’Hematologia. Unitat d’Hemostàsia i Trombosi. Hospital de La Santa
Creu i Sant Pau. Barcelona
Introducción: Alrededor del 60% de pacientes con anticuerpos antifosfolípidos (AAF) no desarrollan trombosis. La presencia
de anticoagulante lúpico (AL) o anticuerpos IgG anti-b2 glicoproteína (b2GPI) están asociados con mayor frecuencia a trombosis respecto a otros AAF. Estudios recientes mencionan que los
anticuerpos contra el dominio I de la b2GPI (anti-b2GPI-dominio
I) son más específicos de trombosis. Sin embargo, éstos no se
deteminan en la práctica clínica habitual y no están incluídos en
los criterios de Sydney, por lo que nuestro objetivo es valorar su
significado clínico en pacientes con AAF.
Métodos: Incluimos 33 pacientes con anticuerpos IgG antib2GPI positivo, con o sin AAF/LA. 24% eran asintomáticos, 12%
presentaban lupus eritematoso sistémico (LES), 15% tenía síndrome antifosfolípido (SAF) obstétrico y 48,5% padecía SAF trombótico. El AL fue determinado por el tiempo del veneno de víbora de
Russell y neutralización con antifosfolípidos hexagonales (Staclot
LA). Los AAF, anti-b2GPI y los anticuerpos anti-b2GPI-dominio
I se determinaron de forma novedosa a través del analizador automatizado por quimioluminiscencia (ACL AcuStar IL). El análisis
estadístico se hizo con SPSS v.20, valorando la sensibilidad y
especificidad de las pruebas para trombosis.
Resultados: Los anticuerpos IgG anti-b2GPI fueron positivos
en el 87% de pacientes con SAF trombótico, 60% en pacientes
con SAF obstétrico, 100% en pacientes con LES y 43% en los
asintomáticos.
Los anticuerpos contra el dominio I de la b2GPI fueron positivos en el 50% de los pacientes con SAF trombótico, en el 40%
de los casos de SAF obstétrico, en el 50% de los casos de LES y
en el 12% de los pacientes asintomáticos.
Los anticuerpos anticardiolipina IgG fueron positivos en el
56% de los pacientes con SAF trombótico, en el 40% de SAF
obstétrico, en el 75% de pacientes con LES y en el 28% de asintomáticos.
En el análisis de resultados no encontramos relación entre la
presencia de AL y anticuerpos anti-b2GPI-domino I. La sensibilidad evaluada para los anticuerpos anti-b2GPI-dominio I en relación a la presencia de trombosis fue del 50%, con una especificidad
del 71%. Mientras que la sensibilidad de los anticuerpos IgG antib2GPI fue del 87%, con una especificidad del 37%.
Fundamentos y objetivo: La antitrombina (AT) es un inhibidor de serin proteasas que inactiva el Factor IIa y el Factor Xa y
otros. Los pacientes con deficiencia de AT tienen un mayor riesgo
de tromboembolismo venoso (TEV) y de pérdida del embarazo.
Nuestra unidad está desarrollando un estudio para determinar los
factores de riesgo en mujeres sanas que reciben tratamiento hormonal con anticonceptivos orales (ACO). El objetivo fue estudiar
una nueva mutación identificada en el gen de la antitrombina (SERPINC1) en una mujer sana sin antecedentes previos de trombosis
y que recibía tratamiento de ACO.
Pacientes y métodos: la propositus era una mujer sana de 26
años de edad. No presentaba antecendentes previos de trombosis.
Se analizaron las mutaciones Factor V Leiden, F2G20210A,
F12C46T y mutación AT Cambridge tipo II (SERPINC1 G13268T;
p.Ala384Ser). La AT Cambridge se analizó mediante PCR y posterior digestión con enzima de restricción PvuII (Biolabs). Para discriminar la presencia de la mutación AT Cambridge I (G13268C;
p.Ala384Pro) que presenta un patrón de digestión similar a la AT
Cambridge tipo II (G13268T) se realizó secuenciación directa.
Estudio plasmático: AT, Proteína C, Proteína S, anticuerpos
antifosfolípidos y anticoagulante tipo lúpico.
Resultados: La paciente presentaba niveles normales de AT
funcional, 108 % por sustratos cromogénicos con exceso de FXa.
Con el análisis de restricción se observó un patrón de portador
heterozigoto para la mutación AT Cambridge tipo II. Al realizar
el análisis por secuenciación directa se observó que se trataba
de una nueva variante genética en el exón 6 del gen SERPINC1,
A13264T. Esta nueva variante genética es una mutación silenciosa
que causa un cambio de codón (GCA-GCT) pero que codifica para
el mismo aminoácido Ala382 y por lo tanto no altera la secuencia
de la proteína. Esta nueva variante genética no se detectó en 100
controles sanos ni en los pacientes estudiados hasta el momento en
nuestro centro de manera rutinaria en el perfil de estudio biológico
de trombosis.
Conclusiones: Esta nueva mutación silenciosa Ala382Ala no
se detectó en 100 controles sanos y probablemente se trate de
una mutación rara en nuestra población. Aunque la prevalencia
166
Pósteres
de esta nueva variante (A13264T) es baja, su localización cercana
al nucleótido G13268 del gen de la antitrombina podría enmascarar el diagnóstico genético de la mutación AT Cambridge II
(G13268T) o AT Cambridge I (G13268C).
Financiación: Red Investigación Cardiovascular RD12/0042/0032.
trombomodulina exógena los pacientes presentan ETP menores
que los controles. En nuestro trabajo de forma análoga, sin añadir
trombomodulina, observamos la misma disminución estadísticamente significativa tanto del Peak como del ETP. En el grupo de
TE solo dos parámetros alcanzan la significancia estadística: la
edad y el antecedente personal de trombosis. La toma de hydrea y
el estado mutacional de JAK2 tienen una tendencia no significativa
que precisará ser confirmada en futuros trabajos. Los resultados de
nuestro trabajo precisan ser contrastados en muestras más amplias
en futuros proyectos.
PO-400 Aplicación del test de generación
de trombina en pacientes
con trombocitemia esencial
Giménez Richarte A., García Hernández M.C., Cabrera V.,
Orduna M.T., Bernal J., Marco Vera P.
PO-401 Biomarcadores en el despistaje
de neoplasia oculta en pacientes
con enfermedad tromboembólica
venosa idiopática
Hospital General Universitario de Alicante. Alicante
Introducción: La trombosis es la causa de muerte más relevante en pacientes con Trombocitemia Esencial (TE), y se ha
relacionado con una disminución en la supervivencia global y
con mayor transformación a leucemia aguda. La tasa de eventos
trombóticos oscila entre 2-4 pacientes/año. Los eventos arteriales
constituyen un 60-70% del total. La edad avanzada y la historia de
trombosis previa son los factores de riesgo (FR) trombóticos clásicos establecidos. El estado mutacional de JAK2V617F también
se ha relacionado con el riesgo trombótico. El mecanismo último
responsable de la activación de la coagulación se desconoce.
Métodos y pacientes: En un primer análisis comparamos
los parámetros estándares de la generación de trombina (Lagtime, Peak, ETP y ratio Peak/Lagtime) entre el grupo de pacientes
(n=20 TE confirmadas por biopsia MO) y el grupo de controles
sanos(n=42). En un segundo paso, dentro del grupo de pacientes
comparamos mediante el ETP y la ratio Peak/LagTime: JAK2V617F mutado o no mutado, la toma o no de AAS, hydrea, anagrelide; la afectación clínica a nivel microvascular, el antecedente
de episodio tromboembólico, y finalmente la correlación con la
cifra de plaquetas, de leucocitos y de Hb. El TGT se ha determinado utilizando el método fluorogénico (Thrombinoscope, Synapse BV, Maastricht, the Netherlands) y se ha realizado sobre PPP.
El análisis de datos se realizó con la versión 22.0 del programa
estadístico SPSS, con la prueba T de Student para muestras independientes. Todos los contrastes de hipótesis se han validado con
nivel de significación de p<0,05. Los resultados se han expresado
como la media y su desviación estándar.
Resultados: Los pacientes con TE tienen tanto un Peak, un ETP
y una ratio Peak/Lagtime disminuida de forma estadísticamente significativa respecto a los controles. En el grupo de pacientes observamos resultados estadísticamente significativos en los pacientes con
antecedente de ETE y en aquellos con edad = 60 años.
Conclusiones: Entre la escasa literatura que encontramos
sobre los TGT en TE, se describe un fenotipo adquirido de resistencia a la proteína C activada, provocado por una resistencia a la
trombomodulina (indicativa de un balance procoagulante) y por
una disminución en los niveles de proteína S plasmática. En el
estudio de Duchemin et al. los pacientes presentan una disminución en los TGT en presencia de trombomodulina por una pérdida
de sensibilidad a la misma. En el estudio de Tripodi et al. sin añadir
Alfonso A.1, Redondo M.2, Rubio T. 2, del Olmo B.3,
Rodríguez-Wilhelmi P.4, Martínez N.1, Franco S.1, Figueroa R.1,
Páramo J.A.1, Lecumberri R.1
Clínica Universidad de Navarra. Pamplona. 2Complejo Hospitalario de Navarra.
Pamplona. 3Hospital San Juan de Dios. Pamplona. 4Banco de Sangre y Tejidos de
Navarra. Pamplona
1
Introducción: Los pacientes con tromboembolismo venoso
(TEV) idiopático tienen un mayor riesgo de cáncer oculto. En la
actualidad, no existe consenso sobre el conjunto de exploraciones
necesarias para realizar el despistaje de un tumor oculto en estos
pacientes, ni sobre su verdadera utilidad.
Diversos trabajos han sugerido la utilidad de algunos parámetros de laboratorio relacionados con la hemostasia para estratificar el riesgo de TEV en pacientes con cáncer. Sin embargo, son
escasos los trabajos que han evaluado su papel como predictores
de cáncer en TEV idiopático.
Objetivo y métodos: Evaluar el papel del dímero-D (DD),
factor VIII (FVIII), factor XII (FXII), factor tisular (FT) (antigénico y actividad), a2-antiplasmina (a2-AP), test de generación de
trombina (TGT), fragmento 1+2 de la protrombina (F1+2), inhibidor de la fibrinolisis activable por trombina (TAFI), inhibidor
del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1) y monómeros de
fibrina (MF) en el despistaje de neoplasia oculta en pacientes con
un primer episodio de TEV idiopático.
Se incluyeron 99 pacientes >50 años.. Analizamos la concentración plasmática de dichos biomarcadores en la 3.ª-4.ª semana
tras el diagnóstico del TEV (coincidiendo con la realización de
un PET-CT). Los pacientes fueron seguidos de forma prospectiva
durante 24 meses.
Resultados: Tras la realización del PET-CT o durante el seguimiento 9 pacientes fueron diagnosticados de una neoplasia.
No se encontraron diferencias significativas entre los niveles
plasmáticos de DD, FVIII, FXII, FT antigénico, TGT, F1+2, TAFI,
PAI-1 y MF entre pacientes con o sin neoplasia oculta.
La mediana de actividad del FT en pacientes con y sin cáncer
oculto fue 5,4 pM (IQR 2,9-44,6 pM) y 2,4 pM (IQR 0-9,4), respectivamente (p=0,03). La curva ROC mostró un área bajo la curva
167
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
estudios no estaban correctamente indicados y de estos un 25%
provenían de los servicios de Atención primaria y un 19,8% de
Cirugía vascular.
De los 201 estudios de trombofilia realizados, el 40,6% resultaron normales, los diagnósticos más frecuentes dentro de los estudios patológicos fueron: déficit de proteína S (10,9%), mutación
del factor V de Leiden (7,9%), mutación G20210A de la protrombina (6,9%) y presencia de anticoagulante lúpico (6,9%).
Conclusiones: Un importante número de solicitudes de estudios de trombofilia no están correctamente indicadas. Esto genera
un gran esfuerzo asistencial para los servicios de Hematología
además de un gasto económico innecesario.
Es fundamental la redacción de una guía de consenso de
trombofilia a nivel nacional con el fin de contribuir al mejor aprovechamiento de los recursos humanos y económicos disponibles.
de 0,72 (IC 95% 0,58-0,86) y estimó el valor de 2,8 pM como el
mejor punto de corte con una S de 88,9% y una E de 56,1%.
En cuanto a la a2-AP, los pacientes con neoplasia oculta tendían
a presentar menores niveles que aquellos sin cáncer (p = 0,068).
La realización del PET-CT para despistaje de neoplasia oculta
únicamente a pacientes con FT antigénico >2,8pM permitía reducir sensiblemente el coste de esta estrategia, manteniendo un alto
valor predictivo negativo.
Conclusiones: El FT podría constituir un biomarcador útil en
el despistaje de neoplasia oculta en pacientes con TEV idiopático.
Existe una tendencia a un descenso de a2-AP que reflejaría
una mayor actividad de la plasmina y podría constituir otro biomarcador de cáncer oculto.
Se precisan más estudios con mayor número de pacientes para
confirmar el papel de estos biomarcadores en el despistaje de neoplasia oculta.
PO-403 Déficit de antitrombina III con mutación
T147A del gen SERPINC1 no descrita
en la literatura
PO-402 Características de las solicitudes
de estudios de trombofilia en
un hospital de nivel III de Madrid
Lluch García R., Aleixandre Górriz I., Llopis Calatayud I.,
Vicente Sánchez A.I., Arnao Herráiz M., Zúñiga Cabrera A.
Rodríguez Rodríguez M., Mesas Mariñán C., Quiroz Cervantes K.S.,
Castro Quismondo N., Martín Mola M.A., Gilsanz Rodríguez F.
Hospital Universitario La Ribera. Alzira, Valencia
Hospital Universitario 12 de Octubre. Madrid
Introducción: El déficit de antitrombina III (AT) es una
trombofilia con elevado riesgo trombótico. La herencia es autosómica dominante (AD). Se han descrito más de 200 mutaciones en
el gen de la AT (SERPINC1).
Presentamos el caso clínico de un paciente con déficit de ATIII
portador heterocigoto de la mutación T147A en el exón 3 del gen
SERPINC1, no descrita previamente en la literatura.
Caso clínico: Varón de 40 años de Senegal. Entre sus antecedentes destaca hepatitis crónica por virus B. Fumador sin otros
factores de riesgo cardiovascular. Consulta por cefalea temporal,
disartria y hemiparesia izquierda. El TAC craneal muestra área
hipodensa frontoparietal derecha correspondiente al territorio de
la arteria cerebral media compatible con infarto agudo extenso.
La RNM confirma infarto en dicho territorio. Analíticamente no
presenta alteraciones destacables. El electrocardiograma muestra
ritmo sinusal. Se realiza ecocardiograma que descarta valvulopatía asociada. Inicia tratamiento con aspirina 100 mg presentando
recuperación de los déficits neurológicos, quedando una pérdida de
fuerza 4/5 en miembro superior izquierdo. El estudio de trombofilia muestra déficit ATIII con un nivel del 53%, confirmado en 2
ocasiones. Se procede a estudio molecular que confirma que es
portador heterocigoto de la mutación T147A en el exón 3 del gen
SERPINC1. Ante dicho hallazgo inicia anticoagulación permanente. El paciente no presenta nuevos episodios tromboticos.
Discusión: El déficit de ATIII es una trombofilia con elevado riesgo trombótico, de herencia AD. Hay descritas más de 200
mutaciones del gen de la AT (SERPINC1). La mutación T147A en
el exón 3 del gen SERPINC1 no ha sido descrita previamente en
la literatura, a pesar de ello se considera responsable del fenotipo
de deficiencia de ATIII que presenta el paciente. Esto es debido
Introducción: Los fenómenos trombóticos y tromboembólicos son una causa importante de morbimortalidad en nuestro
medio. La trombofilia es una condición genética o adquirida que
predispone a los sujetos a desarrollar eventos trombóticos. Es
importante identificar adecuadamente a los pacientes que puedan
padecer una trombofilia y para esto es importante conocer las indicaciones para solicitar adecuadamente un estudio de trombofilia.
Objetivo: Analizar las características de las solicitudes de
estudios de trombofilia y su correcta indicación en un Hospital
de Nivel III de Madrid en el período comprendido entre junio de
2013 y abril de 2014.
Material y métodos: Se analizaron las características de 202
solicitudes de trombofilia realizadas en el Servicio de Hematología
de un hospital de Nivel III de Madrid entre junio de 2013 y abril de
2014. Para determinar la correcta indicación de las solicitudes se
utilizó como referencia la guía de trombofilia del Servicio Nacional de Salud del Reino Unido (National Health Service), ya que
actualmente no existe una guía de consenso española.
Resultados: Las 202 solicitudes de estudios de trombofilia
fueron realizadas por 17 especialidades distintas. Atención primaria realizó el 19,3% de las solicitudes, Cirugía vascular un 15,8%
y Ginecología un 14,9%.
Los principales motivos de solicitud fueron los episodios trombóticos con un 34,1% (Trombosis venosa profunda en miembros
inferiores 16,3%, tromboembolismo pulmonar 5,9%, TVP MMII
y TEP 6,4%, trombosis abdominales 4,5%, TVP miembros superiores 1%) y los estudios familiares con un 31,2%.
El 52,5% de las solicitudes cumplían con los criterios de indicación de las guías utilizadas como referencia. El 47,5% de los
168
Pósteres
pero también inhibe a los factores VIIa, IXa, Xa, XIa y XIIa. El
déficit de ATIII es una trombofilia con alto riesgo trombótico. Se
define por niveles de ATIII < 70%. Se estima que está presente
en el 0,5% de los pacientes y en el 5% de los pacientes menores
de 40 años con ETEV (enfermedad tromboembólica venosa).
Clínicamente produce ETEV entre los 25-35 años en el 50% de
los casos. Se estima que el riesgo de ETEV aumenta 10 veces
respecto a los pacientes sin el déficit. Las trombosis se pueden
presentar de forma espontánea o en situaciones de riesgo. El déficit puede ser de dos tipos: tipo I (la proteína está disminuida pero
es normofuncionante) y tipo II (la proteína es disfuncional). Las
localizaciones más frecuentes son las venas iliacas, mesentéricas
y la trombosis pulmonar.
La herencia AD, y con muy pocas excepciones, los sujetos
deficientes son heterocigotos. Se han descrito más de 200 mutaciones en el gen de la AT (SERPINC1), localizadas por todo el gen.
SERPINC1 (MIM 107300), se localiza en el cromosoma 1q23-25
y comprende 7 exones (1, 2, 3A, 3B, 4, 5, 6), abarca 13,5 Kb de
ADN genómico.
A continuación se presenta el caso de 3 familias con déficit de
ATIII, con distintas mutaciones (Tabla 1).
El déficit de ATIII es una trombofilia de herencia AD con
elevado riesgo trombótico. Se han descrito más de 200 mutaciones del gen SERPIN1. Es importante el estudio familiar dado
el riesgo trombótico de dicho déficit. En los tres casos descritos
se detectaron en heterocigosis mutaciones sin sentido en dicho
gen: dos de ellas descritas anteriormente en la literatura (L131F1
y S394L2) como causantes del déficit de ATIII y una tercera no
descrita (T147A).
Bibliografía
a que el gen SERPINC1 admite pocas variaciones que no sean
funcionales, ya que presenta varios dominios funcionales (sitio
de unión a la heparina, RCL…) y es una molécula muy sensible
conformacionalmente.
La mutación T147A afecta a un residuo poco conservado de
las serpinas, cerca de la hélice D. Una mutación que afecta a este
mismo residuo ha sido identificada en otro paciente con deficiencia
de ATIII en un estudio realizado por Picard et al (Picard et al.2006)
1
, aunque con diferente consecuencia: T147I. En cualquier caso, el
efecto esperado es una deficiencia tipo II con defecto en el dominio
de unión a la heparina (tipo IIb). Estas mutaciones son más moderadas desde el punto de vista trombótico, ya que la actividad progresiva no se pierde, pero si su capacidad de activarse con heparina.
Bibliografía
Picard,V.Nowak-Gottl,U.,Biron-Andreani,C.Fouassier,M.Frere,C.
Goualt-Heilman,M. et al. Molecular bases of antithrombin deficiency: twenty-two novel mutations in the antithrombin gene. Hum. Mutat.
2006;27:600.
PO-404 Déficit de antitrombina III.
Características clínicas y moleculares
de tres familias
Lluch García R., Aleixandre Górriz I., Vicente Sánchez A.I.,
Llopis Calatayud I., Arnao Herráiz M., Zúñiga Cabrera A.
Hospital Universitario La Ribera. Alzira, Valencia
Introducción: El déficit de antitrombina III (ATIII) es una
trombofilia con elevado riesgo trombótico. La herencia es autosómica dominante (AD). Se han descrito más de 200 mutaciones en
el gen de la AT (SERPINC1). Presentamos tres familias con dicho
déficit, con las características clínicas y el estudio molecular. Una
de las mutaciones no ha sido descrita previamente en la literatura.
Desarrollo: La ATIII es un inhibidor natural de la coagulación del grupo de las serpinas. Su principal diana es la trombina,
1. Homozygous antithrombin deficiency: report of two new cases (99 Leu
to Phe) associated with arterial and venous thrombosis. Chowdhury
V, Lane DA, Mille B, Auberger K, Gandenberger-Bachem S, Pabinger
I, Olds RJ, Thein SL. Thromb Haemost 1994;722:198-202.
2. Antithrombin III Milano 2: a single base substitution in the thrombin
binding domain detected with PCR and direct genomic sequencing. R J
Olds, D Lane, R Caso, A Tripodi, P M Mannucci, and S L Thein Nucleic
Acids Res. 1989;17(24):10511.
Tabla 1.
Familia
Sujeto
Nacionalidad
Indice (Hijo)
1
Madre
Tia
Española
Hermana
2
Indice (hijo)
Padre
Senegalesa
Indice (Padre)
3
Hija 1
Hija 2
Italiana
Niveles ATIII
Trombosis
Otros FR trombosis
55%
TVP extensa
Fumador
60%
TVP
NO
60%
NO
Anticonceptivos
56%
NO
NO
53%
ACV
Fumador
-----
NO
NO
58%
TVP
HTA
64%
NO
Anticonceptivos
90%
NO
NO
169
Mutación
S394L exón 6 gen SERPINC1
T147A exón 3 gen SERPINC 1
L131F exón 2 gen SERPINC1
NO
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
PO-405 El aumento de la capacidad funcional
plaquetaria, determinada mediante
el analizador PFA-100®, se asocia al
riesgo de trombosis venosa. Resultados
preliminares del proyecto RETROVE
Tabla 1. Prueba U Mann-Whitney para comparación de medias
Vázquez Santiago M.1, Morera A.1, Pujol Moix N.1,2, Ziiyatdinov A.3,
Murillo J.1, Llobet D.1, Vallvé C.1, Cuevas B.1, Macho R.1, Vilalta N.1,
Carrasco M.1, Mateo J.1, Souto J.C.1
Casos
Controles
p-valores
PFAepi (media ± DE)
110,3 ± 28,8
128,5 ± 36,2
<0,01
PFAadp (media ± DE)
74,1 ± 15,7
83,3 ± 18,1
<0,01
Tabla 2. Riesgo de ETEV
Valores
acortados
Unitat d´Hemostàsia i Trombosi. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Barcelona.
2
Departament de Medicina. Universitat Autònoma de Barcelona. Barcelona.
3
Unitat de Genòmica de Malalties Complexes. IIB-Sant Pau. Barcelona
1
PFAepi
Introducción: Las plaquetas tienen un efecto reconocido
en la fisiopatología trombótica arterial. Recientemente se han
relacionado también con la enfermedad tromboembólica venosa
(ETEV). Nuestra hipótesis de trabajo es que el aumento de la
capacidad funcional de las plaquetas tiene relación con el riesgo
de ETEV.
Objetivo: Evaluar la capacidad funcional plaquetaria en
pacientes con ETEV.
Métodos: El proyecto RETROVE (Riesgo de Enfermedad
TROmboembólica VEnosa), ha permitido estudiar 208 individuos
con ETEV y 203 controles. La capacidad funcional plaquetaria
se ha medido con el analizador PFA-100® (Siemens) en el cual
los tiempos de obturación (TO), en segundos, obtenidos con los
cartuchos de colágeno-epinefrina (PFAepi) y de colágeno-ADP
(PFAadp) son inversamente proporcionales a la capacidad funcional de las plaquetas. Se definen grupos de valores acortados
(<110”), valores normales (110” - 160”) y valores aumentados
(>160”) para PFAepi y valores acortados (<85”), valores normales
(85” - 120”) y valores aumentados (>120”) para PFAadp.
El test U Mann-Whitney calcula las diferencias para PFAadp
y PFAepi entre casos y controles. Las Odds ratios (OR), ajustadas
por edad y sexo, con intervalos de confianza del 95% han sido
calculadas mediante una regresión lineal binaria, para evaluar el
riesgo de ETEV según la presencia del factor de riesgo.
Resultados: Pacientes, 101 varones y 107 mujeres, con edad
media de 60,7 ± 19,1. Controles, 70 varones y 133 mujeres, con
edad media de 48,7 ± 17,7. Los pacientes presentaron TO acortados respecto a los controles (Tabla 1).
En comparación con el grupo de referencia, el PFAepi acortado presentó un riesgo de ETEV 4,9 veces mayor (2,0 - 11,8) y el
PFAadp acortado un riesgo 3,1 veces mayor (0,7 - 12,9) (Tabla 2).
Conclusiones y comentarios: Los TO son significativamente
más cortos en pacientes con ETEV que en controles. Esto sugiere
un aumento de la capacidad funcional plaquetaria. Parece existir una relación inversa entre el riesgo de ETEV y los TO. Esta
relación resultó significativa para PFAepi y muy sugestiva para
PFAadp.
Los tiempos de PFA utilizados habitualmente en el estudio
de enfermedades hemorrágicas, pueden ser también un fenotipo
intermediario del ETEV con utilidad diagnóstica o pronóstica en
el campo de la trombofilia.
Financiación: Siemens Healthcare Diagnostics S.L., Becas
FIS PI12/00612 y RIC RD12/0042/0032
PFAadp
Valores
normales
Valores
aumentados
N = 34
N = 219
N = 158
OR = 4,9 (2,0 - 11,8)
OR = 2,3 (1,5 - 3,6)
OR = 1
N = 283
N = 118
N =10
OR = 3,1 (0,7 - 12,9)
OR = 1,3 (0,3 - 5,8)
OR = 1
PO-406 Enfermedad tromboembólica venosa
(ETEV) asociada al tratamiento
anticonceptivo hormonal (AH).
Estudio sobre 186 casos
Revilla Calvo N., García Avello A., Tenorio Núñez M.C.,
Saavedra Tapia I., César Pérez J.M.
Hospital Universitario Ramón y Cajal. Madrid
Fundamentos y objetivos: La ETEV es una complicación
en mujeres tratadas con AH. Su impacto puede ser mayor en las
mujeres con defectos trombofílicos preexistentes.
El objetivo de este análisis es evidenciar las alteraciones clínicas y analíticas asociadas a la trombosis en estas situaciones.
Pacientes y métodos: Estudio retrospectivo de 555 casos de
trombosis en territorio venoso entre 1994 y 2013, en un único
centro. Incluye mujeres en edad fértil, con una mediana de edad
de 31 años (15-42).
Se analizaron los siguientes factores de riesgo (FR) de trombosis: tratamiento AH, cirugía, trauma, inmovilización y periodo
obstétrico; la localización de la trombosis y la existencia de antecedentes familiares (AF).
En todos los casos se realizó un estudio de trombofilia hereditaria incluyendo proteínas C (PC) y S (PS), Antitrombina (AT),
Factor V Leiden (FVL) y Protrombina 20210A (PT20210A).
Resultados: 186 de 555 casos tuvieron ETEV asociada a tratamiento AH (33.5%). La distribución del resto de los FR fue:
cirugía 6%, trauma 5%, inmovilización 3%, periodo obstétrico
19% e idiopática un 33.5%. Las localizaciones de la trombosis
asociada al tratamiento AH y sus respectivos riesgos relativos (RR)
fueron: TVP: 57% (RR 1.01), TEP: 27% (RR 1.35), Tromboflebitis
superficial: 8% (RR 0.66), Trombosis de senos cerebrales: 6% (RR
2), Trombosis en extremidades superiores: 2% (RR 0.4).
La incidencia de trombofilia en la población con ETEV es
de un 20%. En nuestra muestra, un 33,1% de las pacientes con
trombosis asociada al tratamiento AH tenían trombofilia, de las
170
Pósteres
cuales un 20.1% tenían trombofilia leve (FVL y PT202101A heterocigote) y 13% trombofilia grave.
La recidiva de trombosis en pacientes con trombofilia fue un
23%, frente a 12% en las pacientes con test de trombofilia negativos (p<0.05), en ausencia de nueva exposición a AH. El 69%
fueron idiopáticas.
Un 35% de las trombosis asociadas a AH tenían antecedentes
familiares de ETEV positivos, de las cuales un 57% de las mismas no tenían defectos trombofílicos reconocidos (el restante 43%
tenían AF con trombofilia).
Conclusiones: Los defectos trombofílicos no reconocidos
pueden aumentar el riesgo de tromboembolismo venoso en las
mujeres expuestas a tratamiento AH. De ahí la importancia de
realizar una correcta anamnesis de la historia familiar.
Tabla 1.
PO-407 Estudio de trombofilia en mujeres
con esterilidad primaria y fallo de
implantación embrionaria mediante
técnicas de reproducción asistida
Edad: media (intervalo)
35,2 (24-47)
Trombosis previa: Sí/No (%)
No (100)
FRCV: n (%)
• HTA
• Dislipemia
• Tabaquismo
• Diabetes
1 (5)
2 (10)
7 (35)
0
Enfermedades asociadas:
Lupus: 1
Vitíligo: 1
Hipotiroidismo: 1
Estimulación ovárica controlada: n (%)
• Un ciclo
• Dos ciclos
• Tres o más ciclos
1 (5)
11 (55)
8 (40)
Tabla 2.
Balaguer Rosello A., Romero Domínguez S.,
Lacoboni García-Calvo G., Renard Meseguer J., Mira Fornés Y.,
Cid Haro A., Ferrando Gosp F., Haya Guaita S., Bonanad Boix S.,
Sanz Alonso M.A.
Estudios positivos: n (%)
• PT G20210A
• Factor V Leiden
• ACA IgG positivo
• ACA IgM + AL
6 (30)
2 (10)
1 (5)
2 (10)
1 (5)
• Lpa elevada
5 (25)
(embriones en fresco o vitrificados) 3,7 (2-6). En ningún caso se
produjo síndrome de hiperestimulación ovárica. De los dos casos
que alcanzaron gestación una fue en el segundo ciclo de FIV y otra
en el tercero, mediante transferencia de embriones congelados.
El ET (Tabla 2) fue positivo en 6/20 (30%) mujeres. Una paciente
portadora de PT G20210A presentó un evento vascular (AIT) desaconsejando nueva FIV e iniciando profilaxis con AAS. Otra con FV
Leiden inició AAS y HBPM en el siguiente ciclo de EOC. Las dos
mujeres que gestaron tenían estudio de trombofilia normal.
Conclusión: La asociación entre trombofilia y FIE mediante
técnicas de FIV o ICSI no está clara. En nuestro estudio la incidencia de alteraciones de trombofilia es elevada, coincidente con alguna de las series publicadas. Aunque los resultados no son concluyentes, sugieren la conveniencia de realizar ET en estas pacientes
con la finalidad de establecer medidas que puedan facilitar el éxito
del procedimiento de reproducción a la vez que evitar complicaciones trombóticas mediante el uso de profilaxis antitrombótica.
Hospital Universitari i Politècnic La Fe. Valencia
Introducción: El fallo de implantación embrionaria (FIE) en
las terapias de reproducción asistida (TRA) sucede hasta en un
70% de los casos. Se postula entre las causas del FIE una alteración de la circulación úteroplacentaria debido a un estado de
hipercoagulabilidad, y aunque no hay evidencia clara de asociación entre trombofilia e infertilidad, el uso de anticoagulantes es
cada vez más frecuente en pacientes con FIE.
Nuestro objetivo es valorar los resultados de los estudios de
trombofilia (ET) realizados a mujeres con FIE sometidas a técnicas
de fecundación in vitro (FIV) o su variante ICSI (microinyección
espermática intracitoplasmática) remitidas a nuestras consultas
desde la Unidad de Reproducción Asistida (URA).
Casos clínicos: Estudiamos 20 mujeres remitidas por FIE
(definido por ausencia de embarazo tras dos o más ciclos de FIV/
ICSI con transferencia de 1 o 2 embriones), entre junio de 2012
y junio de 2014. De forma general se realizaron dos ciclos de
estimulación ovárica controlada (EOC) mediante la combinación
de gonadotropinas humanas (FSH/LH) y HCG. No se administró
profilaxis antitrombótica excepto en una mujer con lupus que llevó HBPM profiláctica durante la estimulación y la implantación.
En todas ellas se realizó un ET previo al inicio de un nuevo
ciclo de EOC en situación basal: AT, PC, PS (funcional y libre
antigénica), mutaciones PT G20210A y FV Leiden, anticoagulante
lúpico (AL), ACA IgM/IgG, anti-glicoproteína B2 IgM/IgG, valores de lipoproteína a (Lpa) y homocisteína.
Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Un 65% fueron sometidas a FIV y un 35% a ICSI. La media
de ciclos de EOC fue 2,57 (2-5) y de transferencias embrionarias
PO-408 Evaluación del riesgo trombótico
en mujeres con abortos de repetición
Blas C.1, García Raso A.2, Miranda C.3, Llamas P.1
Fundación Jiménez Díaz. Madrid. 2Instituto de Investigación Sanitaria de la
Fundación Jiménez Díaz. Madrid. 3Hospital Universitario Rey Juan Carlos.
Móstoles, Madrid
1
Introducción: No se conoce con exactitud la etiología de las
complicaciones vasculares gestacionales (CVG), pero se ha pro-
171
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
de que los factores de riesgo modificables fueran eliminados. El
mayor riesgo trombótico se observa en las pacientes embarazadas
y en aquellas que siguen tratamiento con anticonceptivos orales.
En el 27,6% (n=8) de los casos el riesgo trombótico resultó superior al 12%, llegando al 88% en una de las pacientes.
Conclusiones: El kit comercial Thrombo inCode permite de
una forma sencilla, rápida y eficaz la determinación de 12 variantes alélicas relacionadas con el riesgo trombótico. Asimismo, nos
permite calcular el riesgo trombótico teniendo en cuenta algunos
de los principales factores de riesgo implicados en la trombosis
venosa.
puesto que la activación de la hemostasia podría provocar, además
de trombosis durante el embarazo, un desarrollo placentario deficiente y asociarse a otras complicaciones. Mediante la evaluación
genética del riesgo trombótico empleando Thrombo in Code Kit
Universal podemos mejorar las estrategias de prevención en estas
pacientes.
Objetivos: Analizar mediante el uso de un kit comercial
(Thrombo in Code Kit Universal) el riesgo trombótico de un grupo
de pacientes con abortos de repetición.
Pacientes y métodos: Se ha estudiado un grupo de 29 pacientes remitidas ala Unidadde Trombosis y Hemostasia desde las consultas de Ginecología e Infertilidad por haber sufrido abortos de
repetición. En cada caso se recogieron los siguientes datos: edad,
n.º de abortos, toma de anticonceptivos orales, embarazo, consumo
de tabaco, historia familiar de trombosis, diabetes mellitas tipo II
e IMC. De cada paciente se obtuvo una muestra de SP con anticoagulante EDTA para la extracción de ADN, que se empleó en
las determinaciones genéticas.
Para llevar a cabo el análisis de las distintas variables genéticas se
empleó Thrombo in Code Kit Universal, es un kit comercial basado
en una PCR alelo específica múltiple que se desarrolla a tiempo real.
En cada caso se calculó el riesgo trombótico en función de los
factores de riesgo y las variables genéticas. Las variables genéticas
estudiadas se recogen en la Tabla 1.
Resultados: La edad media del grupo de pacientes fue de
38±4 años. Una de las pacientes estudiadas había sufrido una pérdida fetal intraútero durante el tercer trimestre de gestación, 4
mujeres (13,8%) habían tenido dos abortos previos, 12 (41,4%)
habían sufrido 3 abortos, el 24,1% (n=7) habían tenido 4 abortos
y el 17,2% (n=5) restante habían abortado 5 veces. El 20,7%(n=6)
de las mujeres acudieron a la consulta embarazadas, igualmente el
20,7% eran fumadoras y el dos de ellas tomaban anticonceptivos
orales (6,9%). El 55 % (n=16) de ellas tenían sobrepeso (IMC>25).
La Tabla 2 muestra el riesgo trombótico calculado para cada
una de las pacientes, así como la estimación del riesgo en el caso
Tabla 2. Riesgo trombótico calculado a partir de los datos de
los FR y las variables genéticas
Riesgo
trombótico (%)
FXII
ABO
Variante
WT
HT
Riesgo trombótico al
eliminar los FR (%)
fumador, obesidad
1,3
3,6
fumador, embarazo,
sobrepeso
16
4,2
fumador
3,6
5,3
obesidad
3,6
5,3
obesidad
3,6
5,3
fumador
4,9
0,6
2,4
3,6
3,6
3,6
4,6
4,6
Tabla 1. Variantes genéticas analizadas, presencia de las
mutaciones en la población estudiada
Gen
Factores de riesgo
HM
5,3
obesidad
3,6
5,3
obesidad
3,6
6,8
obesidad
4,6
6,8
obesidad
4,6
6,8
obesidad
4,6
46C>T
13
13
3
7,8
obesidad
3,6
rs8176719
15
10
4
7,8
obesidad
3,6
rs7853989
4
3
22
7,9
fumador, sobrepeso
5
rs8176743
5
3
21
8,6
fumador, obesidad
5
rs8176750
2
1
26
12,3
embarazo, obesidad
3,6
Serpin A10
rs2232698
1
1
27
13,4
embarazo
1,1
Serpin C1
rs121909548
29
0
0
15,8
embarazo
1,3
FV Leiden
27
2
0
17
ACO
6
FV
FV Cambridge
29
0
0
31,4
ACO
3,6
embarazo, obesidad
16
embarazo, sobrepeso
19,7
FV Hong Kong
29
0
0
52
FXIII
Val34Leu
16
10
3
56,2
Prothrombin
G20210A
24
5
0
88
172
Pósteres
Son necesarios más estudios que definan los factores de riesgo y
determinen los pacientes potenciales a beneficiarse de estrategias
de tromboprofilaxis.
Por otro lado en el grupo estudiado el riesgo trombótico mayor
se encontró en las mujeres embarazadas y en aquellas que seguían
tratamiento con anticonceptivos orales. Destaca el riesgo encontrado en una de las mujeres embarazadas en la que se estimo un
riesgo del 88%, debido a la presencia del FVL.
PO-410 Factores asociados a retrombosis:
experiencia de un centro
PO-409 Eventos trombóticos de la vena cava:
distinta etiología según la edad
Godoy Molias A.C.1, Aguilar Franco C.2, Lao Romera J.1,
Costilla Barriga L.1, Mayayo Artal M.P.1, Delgado Beltrán P.1
Pons Escoll V., Valcarce Romero I., Artaza Miñano G.,
López Andreoni L., Olivera Sumire Pavel E.,
García Consuegra R., Bosch Albareda F., Santamaría Ortiz A.
Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza. 2Hospital Santa Bárbara. Soria
1
Introducción: A pesar de los avances en la profilaxis antitrombótica, el tromboembolismo venoso sigue generando una
morbi-mortalidad importante. El objetivo de nuestro estudio es
determinar qué factores (trombofílicos o clínicos) modifican el
riesgo de padecer retrombosis en pacientes que han presentado
un episodio de tromboembolismo venoso previo, considerando
el tiempo transcurrido en meses desde que se produjo el primer
episodio trombótico hasta que se produce el segundo episodio.
Material y métodos: Estudio de cohortes retrospectivo, con
199 pacientes con antecedentes de trombosis venosa, pertenecientes al área de Soria desde enero de 1998 a diciembre de 2010.
Los criterios de selección fueron los siguientes: 1) Diagnóstico
de tromboembolismo venoso realizado por métodos objetivos al
menos tres meses antes del estudio. 2) La trombosis se consideró
espontánea en pacientes no expuestos en los 60 días previos, a
factores de riesgo como: traumatismo, inmovilización, cirugía,
embarazo/puerperio o toma de anticonceptivos orales. 3) No historia previa de enfermedad hepática crónica o insuficiencia renal. 4)
No estar recibiendo anticoagulación oral en los 30 días previos al
estudio. En todos los pacientes, se determinaron en coagulómetro
STA-R: antitrombina, proteína C (PC) y proteína S (PS) coagulantes, proteína S (PS) libre, resistencia a la proteína C activada,
factor VIII: C (FVIII: C) y anticoagulante lúpico (AL).
También se realizaron por PCR, las mutaciones del Factor V
Leiden y G20210A de la protrombina. Por último, se analizaron
los niveles de homocisteína plasmática en ayunas. Las muestras
positivas, excepto las mutaciones, se confirmaron mediante su
repetición a los 3 meses.
Resultados: 199 pacientes (p) fueron incluidos en el estudio.
113 (56,8 %) varones y 86 (43,2 %) mujeres. La mediana de edad
al diagnóstico del primer episodio fue de 42 años (9-80). La mediana del número de episodios fue de 1. 116 p (58,3%) presentaron
como primer evento una trombosis espontánea, mientras que 83
(41,7%) p debutaron con una trombosis secundaria. 103 p (51,8%)
trombosis venosa profunda distal (TVP d), 56 p (28,1%) trombosis
venosa profunda proximal (TVP p), 25 p (12,6%) tromboembolismo pulmonar (TEP), 10 p (5%) trombosis venosa cerebral, 4 p
(2%) trombosis venosa mesentérica y 1 p (0,5%) trombosis venosa
renal. Con una mediana de seguimiento de 72 meses (50-144), los
factores que se asociaron con un mayor incidencia de retrombosis
fueron el déficit de PS libre (45,83% vs 23,42%; p= 0,011), niveles elevados de FVIII: C (>150%) (35,93% vs 18,75%; p=0,011),
AL positivo (62,5% vs 24,60%; p=0,012), edad mayor a 55 años
Servicio de Hematología. Hospital Vall d’Hebron. Barcelona
Introducción: Los fenómenos trombóticos de la vena cava
(TVC) son poco frecuentes y sus características no están bien
definidas.
Objetivos: Describir la presentación clínica y el tratamiento
de una cohorte de pacientes con diagnóstico de TVC en un centro
de tercer nivel.
Métodos: Análisis retrospectivo de todos los casos consecutivos
de TVC registrados en la base de datos de la Unidad de Hemostasia
en nuestro centro desde enero de 2007 a febrero de 2014.
Resultados: Se identificaron 95 casos, observándose 2 grupos de presentación; 52 casos (55%) en población pediátrica y 43
(45,2%) en adultos.
En la población infantil la mediana de edad al diagnóstico fue
de 4 meses (1-192), siendo un 63.5% varones. El 65,4% de los
casos fueron incidentales. Según la localización de la trombosis,
un 61,5% (n=32) correspondían a trombosis en vena cava inferior
(VCI) suprarrenal, un 23% (n=12) en vena cava superior (VCS)
y un 15.4% (n=8) en VCI infrarrenal. Los pacientes con TVCI
suprarrenal fueron asintomáticos en un 75%; siendo diagnosticados en un 35,5% por ecocardiografía y asociándose a cirugía por
cardiopatías congénitas en un 62,5%. En la TVCS el 58% se asoció
a catèter. En cuanto al tratamiento anticoagulante un 90,6% recibió
heparina de bajo peso molecular (HBPM) con controles anti-Xa
al menos tres meses.
En los adultos la mediana de edad fué de 51 años (18-84), siendo
un 58,1% varones. En este grupo, un 48,8% fueron sintomáticos al
diagnóstico. El tipo de trombosis más frecuente fué de VCS en un
53,4% y un 9% presentó TEP concomitante. En un 86% se utilizó
el TAC o AngioTAC para el diagnóstico. Se relacionaron con catéter
en un 45% y neoplasias en un 65.2%, destacando los síndromes
linfoproliferativos, las neoplasias de mama y pulmón. La mayoría
(90%) recibió HBPM con una mediana de duración de 6 meses que
se suele prolongar en caso de enfermedad oncológica activa.
En la cohorte general se realizó estudio de trombofilia en 30
casos (32%) siendo positivo en un 9,5%.
Conclusiones: La TVC es una entidad poco frecuente y cuyo
manejo no está establecido. En nuestra cohorte se diferencian dos
poblaciones. En la edad pediátrica son frecuentes las TVCI asociadas a cirugía por cardiopatías congénitas y en la población adulta
destacan las TVCS asociadas a catéteres y a procesos neoplásicos.
173
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
medidas preventivas, terapéuticas y profilácticas necesarias en
cada caso concreto.
Pacientes y métodos: Se incluyeron en el estudio 510 pacientes con ETEV. El seguimiento de los pacientes se llevo a cabo en
la Unidad de Trombosis de la Fundación Jiménez Díaz. De cada
paciente se recogieron los datos demográficos (edad y sexo), y
los factores de riesgo (obesidad, HTA, consumo de tabaco, DM,
inmovilización, embarazo, neoplasia, viaje de larga duración,
trombofilia, quimioterapia, infección aguda, EPOC, enfermedad
vascular, traumatismo y cirugía). Se recogieron también los datos
relativos al evento trombótico (localización de la trombosis, tipo
de tratamiento anticoagulante y duración del mismo). Asimismo,
se recogió la información relativa al tratamiento hipolipemiante
y las distintas variables relacionadas con el metabolismo lipídico
(niveles de CT, C-HDL, C-LDL y TG).
Resultados: La edad media del grupo estudiado fue de
55,54±17,69, y estaba formado por un 56,1% de mujeres (n=286). Los
pacientes fueron tratados durante una media de 7,35±12,41 meses, y
seguidos en la consulta durante un periodo medio de 40,81±26,68
meses desde el primer evento trombótico. La Tabla 1 recoge las características de la población a estudio y la distribución de las distintas
variables. La tasa de recurrencia fue del 40,4% (n=206). En la Tabla 2
se muestran las características de los eventos trombóticos y del tratamiento recibido en pacientes con y sin recurrencia.
(45,83% vs 19,86%; p=0,000) y la trombosis espontánea como
primer episodio (29,31% vs 21,68%; p=0,038)
Conclusiones: Nuestro estudio demuestra que los pacientes con
déficit de PS libre, AL positivo, niveles de FVIII: C>150%, edad
mayor a 55 y trombosis espontánea como debut tienen una supervivencia libre de retrombosis menor a aquellos sin factores de riesgo.
PO-411 Factores de riesgo de recurrencia
trombótica
García Raso A.1, Jiménez Crespo M.J.2, Yuste M.2, Sánchez S.2,
Rodríguez M.V.2, Miranda C.3, Llamas P.2
Instituto de Investigación Sanitaria de la Fundación Jiménez Díaz. Madrid. 2Hospital
Fundación Jiménez Díaz. Madrid. 3Hospital Rey Juan Carlos. Móstoles, Madrid
1
Introducción: El riesgo de recurrencia de la enfermedad tromboembólica venosa (ETEV) persiste durante algunos años tras la
retirada del tratamiento anticoagulante por ello es importante identificar los pacientes en los que la presencia de diferentes factores pueden aumentar la probabilidad de aparición de eventos recurrentes.
Objetivo: Identificar en nuestra población los pacientes con
mayor de recurrencia trombótica, con el fin de poder tomar las
Tabla 1. Distribución de los factores de riesgo y características demográficas de la población
ETEV (n=510)
Recurrencia (n=206)
No recurrencia (n=304)
p
Edad
55,54±17,69
58,07±14,85
53,83±19,21
0,007
Sexo (H/M)
43,9/56,1 (224/286)
46,6/ 56,4 (96/110)
57,9/42,1 (128/176)
0,361
CT
204,8±42,10
207,5±41,98
203,0±42,16
0,247
C-HDL
52,52±15,27
52,10±14,31
52,81±15,92
0,646
C-LDL
131,8±35,89
136,2±35,78
128,7±35,72
0,041
TG
204,0(177,0-231,0)
107,0(80,75-141,0)
109,0(78,25-150,8)
0,468
Tabaco
26,3 (134)
26,2 (54)
26,3 (80)
0,979
Obesidad
18,8 (96)
19,9 (41)
18,1 (55)
0,608
HTA
32,0 (163)
34,0 (70)
30,6 (93)
0,421
DM
6,1 (31)
6,8 (14)
5,6 (17)
0,578
Inmovilización
14,1 (72)
13,1 (27)
14,8 (45)
0,588
Anticonceptivos
11,0 (56)
6,8 (14)
13,8 (42)
0,011
Embarazo/puerperio
3,9 (20)
3,4 (7)
4,3 (13)
0,613
Neoplasia
9,2 (47)
12,6 (26)
6,9 (21)
0,030
Quimioterapia
2,5 (13)
4,9 (10)
1,0 (3)
0,006
Traumatismo
4,5 (23)
6,3 (13)
3,3 (10)
0,111
Cirugía
11,0 (56)
13,1 (27)
9,5 (29)
0,209
EPOC
3,5 (18)
3,9 (8)
3,3 (10)
0,722
Infección aguda
1,4 (7)
0,5 1
2,0 (6)
0,129
Trombofilia
7,8 (40)
27,2 (56)
24,0 (73)
0,420
Viaje larga duración
5,1 (26)
3,9 (8)
5,9 (18)
0,297
174
Pósteres
Palomera Bernal L.3, Gavín Sebastián O.3, Alkadi Fernández N.3,
Cornudella Lacasa R.3
Tabla 2. Localización del evento trombótico y tratamiento
anticoagulante en pacientes con y sin recurrencia
TVP-MMII
TEP
TEP+TVP
TV-LI
TVP-MMSS
47,1 (97)
19,9 (41)
7,8 (16)
3,9 (8)
1,0 (2)
No
recurrencia
45,4 (138)
28,3 (86)
9,5 (29)
10,5 (32)
2,3 (7)
TVS
20,4 (42)
3,9 (12)
1,0 (3)
0,7 (2)
80,8 (244)
0,3 (1)
2,3 (7)
13,9 (42)
0,7 (2)
1,00 (0,00-6,00)
12,3±20,3
36,8 (75)
1,0 (2)
1,5 (3)
75,1 (154)
Recurrencia
Tto
Inicial
Acenoc + AAS
Acenoc +HBPM
Acenocumarol
AAS+HBPM
AAS
HBPM
Rivaroxaban
Duración del tto
SPT
1
Servicio de Obstetricia. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
Servicios de 2Obstetricia y 3Hematología. Hospital Clínico Universitario Lozano
Blesa. Zaragoza
p
Introducción: El riesgo trombótico general de una mujer es
1/10000 y durante la gestación se sitúa en 1/1000, considerado
por lo tanto diez veces superior a la población en general, siendo
la primera causa de morbimortalidad materna. Es muy importante
identificar los factores de riesgo que pueden favorecer un episodio trombótico o de complicaciones vasculares gestacionales
asociadas a trombosis para realizar una profilaxis antitrombótica
adecuada.
Objetivos: Minimizar la posibilidad de que una gestante tenga una trombosis o complicaciones vasculares gestacionales con
la ayuda de las nuevas tecnologías de información y telecomunicación (TIC) como puede ser una aplicación informática que
nos ayude a detectar el riesgo trombótico y mediante un árbol de
recomendaciones terapéuticas de forma individualizada elegir la
mejor opción terapéutica.
Material y métodos: Se ha desarrollado un programa informático en html5 en base a los protocolos más importantes a nivel
nacional e internacional (SEGO, RCOG y CHEST) y comité
Arthe, que nos guía mediante un árbol de consulta por los factores de riesgo trombótico de una gestante. El acceso se localiza
en la página web www.anticoagulaciónyembarazo.com. Existe
además aplicación para móvil para iOS y Android con las mismas
funciones. En la aplicación se puede acceder desde la etapa: preconcepcional hasta puerperio.
Resultados: En la parte preconcepcional permite valorar indicaciones de realizar estudios de trombofilia y valorar indicaciones
de tratamientos antitrombóticos según antecedentes trombóticos o
complicaciones vasculares gestacionales. En la gestante se obtiene
información en pacientes según antecedentes trombóticos, trombofilia hereditaria o adquirida y aquellas pacientes con otros factores
de riesgo, incluyendo pacientes con prótesis valvulares mecánicas.
En el postparto se obtienen las indicaciones pertinentes según los
factores de riesgo asociados. Con la base de este programa y los
datos de la paciente se puede realizar un informe en PDF individual, mostrando si precisa el tratamiento anticoagulante o profilaxis en cada caso. Se incluyen las pautas de Heparina de bajo peso
molecular (HBPM) con Enoxaparina, Bemiparina, Dalteparina y
Tinzaparina.
Conclusiones: Los hematólogos y obstetras tenemos que
tener en cuenta de forma individualizada los factores de riesgo
que intervienen en la patología trombótica de la mujer gestante
desde la etapa preconcepcional hasta el postparto. La utilización de
las nuevas tecnologías de la información y telecomunicación (TIC)
nos ha ayudado a plantear el desarrollo de este programa informático, por acceso web y en aplicaciones Apps. Consideramos una
herramienta innovadora, práctica y accesible por no existir una
aplicación previa con estas características.
<0,0001
0,4147
1,5 (3)
20,5 (42)
6,00 (0,00-12,00)
11,7±9,3
19,1(58)
<0,0001
0,7788
<0,0001
La edad media fue mayor en grupo de pacientes con recurrencia (p = 0,007), y no se encontraron diferencias significativas entre
hombres y mujeres. No hubo diferencias en relación con los FRCV,
a excepción de los niveles medios de C-LDL, que fueron superiores en el grupo de pacientes con recurrencia. Entre el resto de
factores de riesgo encontramos una menor tasa de recurrencia en
el grupo de mujeres que seguían tratamiento con anticonceptivos
orales (6,8% vs 13,8%; p=0,011). Además, en el grupo de pacientes con recurrencia existe una mayor incidencia de SPT (Tabla 2).
Comentarios: En el grupo de paciente estudiado los principales FR para la aparición de eventos recurrentes fueron la edad y la
presencia de neoplasia. No se encontraron diferencias en función
del sexo. Los pacientes en los que se diagnosticó SPT recurrieron
más que los que no presentaron síntomas. La menor tasa de recurrencia en las mujeres tratadas con anticonceptivos orales se puede
explicar por la mayor profilaxis antitrombótica en este grupo.
PO-412 Herramienta informática para
el manejo de la tromboprofilaxis
en la paciente gestante. Aplicación
de nuevas tecnologías en informática
y comunicación (TIC)
Savirón Cornudella R.1, Lou Mercadé A.C.2, Leza Bruis D.P.3,
Campillos Maza J.M.1, Castán Mateo S.1, Fabre González E.2,
175
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
PO-413 Incidencia de eventos tromboembólicos
en pacientes diagnosticados de linfoma
no Hodgkin. Experiencia
en nuestro centro
PO-414 Indicaciones y contraindicaciones
del estudio de trombofilia
hereditaria (TH)
García Avello A., Revilla Calvo N., Tenorio Núñez M.C.,
César Pérez J.M., López Jiménez J.
Payamps Marte C., Amores Contreras G., Requena Rodríguez M.J.,
Sánchez Fontarigio N., Riaza Grau R., Rodríguez González R.,
Berberana Fernández M., Peñalver Díaz M.A., Sánchez Godoy P.
Hospital Universitario Ramón y Cajal. Madrid
Fundamentos y objetivos: Al considerar los candidatos
para realizar un estudio de trombofilia hereditaria (TH), se suelen establecer unas limitaciones teóricas que proceden de un
malentendido: Se limita a veces el estudio a aquellas circunstancias clínicas en las que es más frecuente en términos relativos la presencia de TH. El presente estudio pretende definir las
circunstancias concretas en las que se debe y no se debe pedir
el estudio de TH.
Pacientes: Se ha evaluado en 3035 pacientes diagnosticados de trombosis en territorio venoso las circunstancias teóricas
que podrían ser limitaciones para su estudio. Éstas serían: edad
“joven”, trombosis de repetición, antecedentes familiares positivos
y trombosis idiopática. Asimismo se han evaluado los diagnósticos
específicos de trombosis, y la pertinencia de estudios familiares.
También se han estudiado 1239 casos de trombosis en territorio
arterial.
Resultados: El porcentaje de trombofilia respecto de la edad
de la primera trombosis es creciente a lo largo de las décadas
y únicamente no es signficativo a partir de los 80 años. Los
pacientes con trombosis de repetición y trombofilia son el 25%
de los casos de trombofilia, el 75% restante de los casos son
trombosis única. Los casos con antecedentes familiares positivos
y trombofilia son el 42% del total, el 58% restante son pacientes
con trombofilia sin antecedentes familiares de trombosis. Las
trombosis idiopáticas con trombofilia son el 59% de las mismas,
mientras que el 41% restante son trombosis secundarias. En los
pacientes con cáncer y trombosis el estudio no dio resultados
diferentes a los controles como tampoco en los pacientes con
trombosis arterial. Se han estudiado también 1533 familiares
en primer grado de pacientes con trombofilia resultando que el
50% de los mismos tenían el gen familiar y el otro 50% estaban
libres de él.
Conclusiones: El estudio de TH esta plenamente justificado en las trombosis de senos cerebrales, en trombosis venosas
profundas y superficiales, en el tromboembolismo pulmonar,
en las trombosis de extremidad superior, en trombosis únicas
o de repetición, idiopáticas o secundarias y en pacientes con o
sin antecedentes familiares de trombosis. Se deben hacer estudios de TH a los familiares en primer grado de los pacientes
o familiares afectos ya que es extremadamente rentable en la
obtención de resultados con estas alteraciones. El estudio de
TH no está justificado en pacientes mayores de 80 años ni en
trombosis de venas portales, mesentéricas o retinianas, tampoco
en trombosis arterial, ni cuando la causa de la trombosis fue
un cáncer.
Hospital Universitario Severo Ochoa. Leganés, Madrid
Introducción: Las neoplasias están asociadas con un estado
de hipercoagulabilidad que influye en el incremento de riesgo de
desarrollar episodios de trombosis con una incidencia anual del
5% frente al 1% observado en la población general. Los pacientes diagnosticados de Linfoma no Hodgkin (LNH) tienen un alto
riesgo de desarrollar eventos tromboembólicos y se han asociado
múltiples factores de riesgo relacionados con la patogenia del propio linfoma y a proceos autoinmunes relacionados con este último.
Se estima que la incidencia de trombosis en pacientes con LNH
varía de 5 a 12%.
Objetivo: Determinar la incidencia de eventos tromboembólicos en pacientes con LNH tanto al diagnóstico como durante la
evolución de la enfermedad.
Pacientes y métodos: Se estudió de forma restrospectiva un
total de 120 pacientes diagnosticados de LNH entre 2006 y 2014.
La edad media de los pacientes fue de 63 años y la distribución
por sexos 46% hombres y 54% mujeres. La distribución por tipo
de linfoma fue: LNH BDCG 47%, LNH folicular 21%, LNH T
peroférico 9%, LNH del manto 4%, LNH tipo MALT 11% y LNH
marginal 5 %.
Resultados: Se observó evento tromboembólico en un
13,8% (17 casos) de los pacientes diagnosticados de LNH. Un
30%(5 pacientes) debutó al diagnóstico. Dos de ellos con TEP y
tres con TVP. El resto (12 pacientes) desarrolló la trombosis durante el periodo de tratamiento de la enfermedad y la mayoría (66%)
antes del cuarto ciclo de quimioterapia. Ninguno de los pacientes
había desarrollado episodio de trombosis previo al diagnóstico de
la enfermedad y tampoco habían recibido tratamiento anticoagulante con anterioridad. Ningún paciente había recibido tratamiento
profiláctico tras el diagnóstico de LNH. En análisis univariado el
tipo histológico BDCG como factor de riesgo mostró significación
estadística mediante chi cuadrado (p:<0,018; RR: 2.97: IV95% de
1.134 a 7.824). En análisis multivariante incluyendo edad, sexo,
histología, estadio e IPI, ninguna variable se mostró significativa para el desarrollo de trombosis. El tipo histológico BDCG se
aproximó con p: 0.052.
Conclusiones: En nuestra experiencia los pacientes diagnosticados de linfoma no Hodgkin tienen un mayor riesgo de desarrollo
de enfermedad tromboembólica durante su enfermedad con un gran
número de eventos que coinciden con el diagnóstico de esta última.
La histología parece tener relación con el desarrollo de trombosis
siendo la incidencia mayor en LNH BDCG. La edad, sexo, estadio
e IPI no influyeron como factor de riesgo en nuestro estudio.
176
Pósteres
PO-415 La agregabilidad a dosis bajas de
ADP y de epinefrina correlaciona
negativamente con el funcionalismo
plaquetar (PFA-100®). Resultados
preliminares del proyecto RETROVE
can que tiempos más cortos de obturación se asocian a una
mayor agregabilidad, patrón sugestivo de un posible estado
protrombótico.
La hiperagregabilidad a dosis bajas de ADP y epinefrina pueden medir la función plaquetar asociada a trombosis de manera
complementaria al PFA-100.
Agradecimientos: Siemens Healthcare Diagnostics S.L., Roche
Diagnostics, Red Investigación Cardiovascular RD12/0042/0032
y FIS PI12/00612
Llobet Lorente D., Vallvé Fornieles C., Murillo Escoda J.,
Vilalta Setó N., Carrasco Expósito M., Mateo Arranz J.,
Fontcuberta Boj J., Souto Andrés J.C.
Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Barcelona
PO-416 La ausencia de TAFI aumenta el daño
postrombólisis en ictus isquémico:
papel potencial de micropartículas
Introducción: La agregabilidad a dosis bajas de epinefrina
y/o de ADP en la población normal se produce de forma bimodal dando lugar a individuos con hiperreactividad plaquetar
(agregación >60%) y individuos con hiporreactividad plaquetar
(agregación <40%). Dicha hiperreactividad plaquetar ha sido
asociada a trombosis. Según resultados obtenidos por nuestro
laboratorio recientemente, tiempos de obturación cortos de funcionalismo plaquetar pueden estar también asociados a riesgo
trombótico.
Objetivo: Valorar si la reactividad plaquetar es un buen parámetro para medir la función plaquetar asociada a trombosis.
Material y métodos: Se estudiaron 213 controles sanos (75♂
y 138♀) y 206 pacientes con trombosis (107♂ y 99♀) reclutados
en el proyecto RETROVE (riesgo de enfermedad tromboembólica
VEnosa), ninguno de ellos habían recibido aspirina ni AINE en los
10 días anteriores a la extracción sanguínea.
Agregaciones en plasma rico en plaquetas: se realizaron
con una concentración de 250 x 109 plaquetas con los inductores
ADPy Epinefrina a 0,5µM pues es la concentración de inductor
que separa claramente las dos poblaciones (hiper e hiporreactivas). La agregación máxima se expresa como el porcentaje de la
transmisión de la luz de cada muestra a los 5 minutos después de
añadir el inductor.
Agregaciones en sangre total (Multiplate®): se recolectó la
sangre en tubos con hirudina 25 µg/ml, se analizó con el inductor
ADP a 0.5 µM. Se midió el área balo la curva a los 6 minutos.
Funcionalismo Plaquetar PFA-100®: Se midió el tiempo de
obturación en segundos obtenidos con los cartuchos de Colágeno/
Epinefrina (PFA EPI) y de colágeno/ADP (PFA ADP).
Análisis estadístico: se estudió la correlación (Rho de Spearman, p<0,01) entre los niveles de agregación en PRP y funcionalismo plaquetar, agregaciones en sangre total, edad y sexo.
Resultados: La agregabilidad a 0,5µM de EPI correlacionó
significativamente con: edad (0.225), sexo (-0,126), agregabilidad
a 0,5 µM de ADP (0.656), agregabilidad en sangre total (0.224) y
funcionalismo plaquetar con PFA EPI (-0.213).
La agregabilidad a 0,5µM de ADP correlacionó significativamente con los mismos parámetros: edad (0.282), sexo (-0,242),
agregabilidad en sangre total (0.254) y PFA EPI (-0.169).
Al seleccionar los individuos con tiempos de obturación de
PFA EPI cortos, se observó que había un porcentaje mayor de
hiperagregabilidad en los pacientes que en los controles.
Conclusiones: La correlación negativa entre la agregabilidad a dosis bajas de epinefrina y ADP con el PFA EPI indi-
Roncal C.1, Gómez-Rodríguez V.1, Alexandru N.2, Georgescu A.2,
Meijers J.3, Rodríguez J.A. 1, Orbe J.1
CIMA Universidad de Navarra. Pamplona. 2Instituto de Biología Celular y
Patología Nicolae Simionescu. Burcarest, Rumanía. 3Departamento de Medicina
Vascular Experimental. Ámsterdam, Holanda
1
Introducción: El inhibidor fibrinolítico activado por trombina (TAFI) juega un papel importante en la coagulación y fibrinolisis, pero también en los procesos inflamatorios. Mientras
que la deficiencia de TAFI conlleva una tendencia hemorrágica,
los datos en ratones knockout (TAFI-/-) son controvertidos en el
ámbito del ictus. Tampoco se ha establecido el papel de micropartículas (MP) en relación a la enfermedad cerebrovascular en
TAFI -/-.
Métodos: Se empleó un modelo murino de ictus isquémico
mediante inyección local de trombina en la arteria cerebral media
en ratones TAFI-/ - y salvajes (WT) para analizar el efecto de
t-PA (10mg/kg) o salino sobre el tamaño del infarto y la presencia
de hemorragia (tinción de Perls y DAB). Se realizó inmunofluorecescencia (Fluoro Jade C) y CD11 (microglia) sobre muestras
de tejido cerebral para analizar el grado de inflamación y daño
neuronal. Se aislaron MPs de sangre de los ratones mediante doble
centrifugación y se calculó el contenido de MP por citometría de
flujo. Finalmente se determinó la actividad fibrinolítica de las MP
mediante sustratos cromogénicos.
Resultados: Comparado con el grupo que recibió salino, el
t-PA aumentó significativamente el tamaño del infarto en el modelo de ictus en los ratones TAFI-/-. Si bien la actividad fibrinolítica
(mediante turbidimetría y placa de fibrina) fue superior en TAFI/- no se observó hemorragia macro o microscópica en este modelo.
Se detectó una mayor señal positiva para CD11b en el área del
infarto en los TAFI -/- que en los WT, así como un aumento significativo en la degeneración neuronal en los TAFI-/- tratados con
tPA. Un hallazgo de interés fue la mayor concentración de MPs
en situación basal y tras el ictus en los TAFI-/ en comparación
con los ratones WT.
Conclusiones: La deficiencia de TAFI resultó en un incremento del tamaño del ictus tras trombolisis, no relacionado con
hemorragia, pero asociado con inflamación, degeneración neuronal
y generación de MP.
177
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
PO-417 La inmovilización como factor de riesgo
en la enfermedad tromboembólica
venosa. Diferencias según el sexo
y la edad
Tabla 2. Asociación de la inmovilización con la ETEV. Análisis
por sexos y por subgrupos de edad
García-Raso A.1, Arquero T.2, Monsalvo S.2, Mata R.2, Vidal R.2,
Blas C.2, Llamas P.2
Instituto de Investigación Sanitaria de la Fundación Jiménez Díaz. Madrid.
Hospital Fundación Jiménez Díaz. Madrid
1
Grupo
OR
IC (95%)
p
Mujeres
2,40
(0,84-2,58)
0,1054
Hombres
3,33
(1,21-11,7)
0,0181
< 55 años
6,90
(1,95-43,8)
0,0013
≥ 55 años
1,53
(0,60-4,42)
0,3822
2
Introducción: Son muchos los estudios que reconocen la importancia de la inmovilización como factor de riesgo parala ETEV, las
OR varían entre 5,5-11,1 en función de las series. Estudios retrospectivos han demostrado que el 59% de los casos de ETEV suceden
en pacientes ingresados (el 35% por causas no quirúrgicas). También
se ha descrito que el 42% de los TEP se inician durante la hospitalización. El flujo sanguíneo en la zona de las válvulas venosas es
lento, especialmente en los miembros inferiores, efecto que se ve
acentuado con la inmovilización. Esta es la razón por la cual un
encamamiento prolongado puede ser un factor de riesgo.
Pacientes y métodos: Se recogieron los datos correspondientes a la inmovilización por causa médica no quirúrgica ni traumática en un grupo de 438 pacientes con ETEV. Se definió la
inmovilización en pacientes no quirúrgicos como la permanencia
en cama durante al menos cuatro días en un periodo de dos meses
anterior al diagnóstico del evento trombótico.
Resultados: El 53% (n=232) de los pacientes incluidos en
el estudio eran hombres y 47% (n=206) mujeres, con una edad
media de 55,2 (±17,9) años. La distribución de los pacientes según
la localización de la trombosis fue: TVP-MMII 49,4% (n=217),
TEP 26,9% (n=118), TVP+TEP 8,8% (=39), TVP-MMSS 2,3%
(n=10), TVS 3,9% (n=17) y TV-LI 8,7% (n=38). Todos los pacientes incluidos eran de raza caucásica.
Se determinó la inmovilización como FR en desarrollo del
evento trombótico en 32 pacientes (7,4%), y se asoció al desarrollo de trombosis venosa con una OR de 2,84 (IC95%: 1,35-6,71;
p=0,0048). La relación conla ETEVsegún el tipo de trombosis se
muestra en la Tabla 1. No se registró la inmovilización como FR en
los casos de pacientes con TVS y TVP-MMSS. La inmovilización
resultó un FR trombótico en los hombres pero no en las mujeres
(Tabla 2). Además, fue un FR en los pacientes menores de 55 años
pero no en los de más edad (Tabla 2).
Conclusiones: La inmovilización es un importante factor de
riesgo en el desarrollo de eventos trombóticos, con mayor relevancia en los hombres y los pacientes jóvenes.
PO-418 Las mutaciones del gen de la
calreticulina no están implicadas
en la patogenia de trombosis venosa
esplácnica
Castro Quismondo N., Martínez López J., Jiménez Ubieto A.,
Ayala Díaz R.
Hospital Universitario 12 de Octubre. Madrid
Introducción: La trombosis venosa esplácnica (síndrome
Budd Chiari, trombosis portal y mesentérica) es una patología en
la que se pueden ver implicados factores locales: cirrosis hepática,
tumor en territorio abdominal, lesiones inflamatorias locales, cirugías abdominales, trasplante hepático; y/o sistémicos: neoplasias
mieloproliferativas crónicas (NMPC), trombofilias hereditarias o
adquiridas, hemoglobinuria paroxística nocturna, gestación, puerperio.
El objetivo de nuestro estudio es caracterizar la etiología de las
trombosis venosas en territorio esplácnico así como la prevalencia
de NMPC en dichos pacientes y valorar la presencia de mutaciones
del gen de la Calreticulina (CALR).
Pacientes y métodos: Se ha realizado un estudio retrospectivo
de una serie de 40 pacientes que han presentado trombosis esplácnica entre los años 1998 y 2013. Se han recogido los datos analíticos más relevantes y se ha analizado la presencia de mutaciones
de JAK2 y de CALR en muestras de sangre periférica. Se realizó
el análisis de inserciones/deleciones en CALR por análisis de fragmentos en un 3100 xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems),
los resultados fueron analizados usando Gene Mapper software
version 4.0 (Applied Biosystems). El estudio de las mutaciones de
JAK2 V617F se llevó a cabo mediante PCR cuantitativa en tiempo
real en un analizador Applied 7900HT.
Resultados: En un 45% de los pacientes (n=18) se identificó
una causa local, siendo la más frecuente la presencia de cirrosis hepática. Un 12,5% de los pacientes (n=5) presentaba una
mutación protrombótica (mutación de factor V Leiden o mutación G20201A del gen de la protrombina). Un 32,5% de pacientes (n=13) fueron diagnosticados de NMPC tipo Trombocitemia
esencial o Mielofibrosis primaria. De los pacientes con NMPC,
se detectó mutación de JAK2 V617F en un 69% y un 31% fueron
JAK2 negativos. En los pacientes JAK2 negativos (n=31) no se
detectaron mutaciones en CALR. En cuanto a los datos analíticos
la cifra de leucocitos fue inferior en los pacientes JAK2 negativos
frente a los JAK2 positivos (4,83 vs 9,97 x 103/mm3; p 0,011).
Tabla 1. Asociación de la inmovilización con la localización
de la trombosis
Grupo
OR
IC (95%)
p
TVP-MMII
3,46
(1,54-8,53)
0,002
TEP
1,60
(0,48-4,90)
0,427
TVP-MMII+TEP
6,94
(2,16-21,3)
0,02
TV-LI
1,99
(0,29-8,43)
0,425
178
Pósteres
Conclusiones: En la serie estudiada, los casos de trombosis
venosa esplácnica secundaria a neoplasias mieloproliferativas
JAK2 negativas no se han asociado en ningún caso con la mutación en el gen CALR. Con estos resultados no podemos proponer
el estudio de mutaciones del gen CALR dentro del screening de
NPM asociada a trombosis esplácnica.
Tabla 1.
Perfil profilaxis de CVP
n
%
Recidiva episodio tromboembólico
1
1,12
Recidiva de complicación vascular gestacional
7
9,86
0
0,0
Pacientes tratadas con Heparina (116)
Pacientes no tratadas con Heparina (38)
Recidiva episodio tromboembólico
PO-419 Manejo de mujeres embarazadas
con trombofilia conocida o con
complicaciones vasculares
gestacionales. Uso de la tromboprofilaxis
en estas situaciones. Resultados
preliminares del proyecto TEAM
(trombosis en el ámbito de la mujer)
Recidiva de complicación vascular gestacional
1
5,26
n
%
Recidiva episodio tromboembólico
1
1,12
Recidiva de complicación vascular gestacional
9
10,23
Recidiva episodio tromboembólico
0
22
Recidiva de complicación vascular gestacional
22
16,9
Perfil profilaxis de trombosis
Pacientes tratadas con Heparina (81)
Pacientes no tratadas con Heparina (36)
Martí Sáez E.1, Redondo Izal A.M.2, de Diego Jalemskaya I.3,
Rodríguez Huerta A.4, Llamas Sillero P.5, Rodríguez Martorell J.6,
Martínez Pérez O.4, Casellas Caro M.7, Ramírez Polo I.M.8,
Gutiérrez Pimentel M.J.9, Tàssies Penella D.10, Santamaría Ortiz A.7
con o sin AAS y en 25% no se realizó profilaxis con HBPM. En el
manejo de CVP en el 69% de los episodios se empleó HBPM con
o sin AAS y en 31% no se usó heparina. Los resultados clínicos
en forma de recaída de trombosis o CVP en ambos grupos en función de si recibieron profilaxis con HBPM o no, se muestran en la
Tabla 1. En el grupo de profilaxis de trombosis el uso de HBPM
parece efectiva en la prevención de CVP. En el grupo de profilaxis
de CVP no hubo diferencias en ambos grupos.
Conclusiones: Los resultados preliminares del proyecyo
TEAM reflejan la práctica clínica y las diferencias entre investigadores en cuanto a tromboprofilaxis. Se empleó profilaxis con
HBPM para la prevención de trombosis y CVP en más del 50%
de las pacientes. Estos resultados parecen indicar que el uso de
heparina disminuye la incidencia de CVP. El registro continúa en
marcha para aumentar el número de casos y confirmar los hallazgos encontrados.
Agradecimientos: El proyecto TEAM está parcialmente patrocinado por Leopharma TM.
Hospital Manises. Manises, Valencia. 2Hospital de Navarra. Pamplona. 3Mútua
de Terrassa. Barcelona. 4Hospital Gregorio Marañón. Madrid. 5Fundación Jiménez
Díaz. Madrid. 6Hospital Universitario Virgen del Rocío. Sevilla. 7Hospital Vall
d’Hebron. Barcelona. 8Unidad de Gestión Clínica. C.S. Cayetano Roldán. Cádiz.
9
Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada. 10Hospital Clínic. Barcelona
1
Fundamentos y objetivos: Existe una falta de información
para la práctica clínica en relación al la ETE, la trombofilia y el
manejo en diferentes escenarios clínicos, como complicaciones
vasculares gestacionales. En este contexto, estamos llevando a
cabo un estudio observacional de cohortes multicéntrico, llamado
proyecto TEAM. (Ver web: www.proyectoteam.com). Se trata de
un registro nacional de pacientes en estas situaciones clínicas, que
refleja el manejo en la práctica clínica habitual.
Métodos: Desde 2009 hasta hoy, casi 60 centros españoles y, también ahora de Uruguay, han incluído pacientes de forma prospectiva
en el registro. Los criterios de inclusión son: pacientes con trombosis
secundaria a tratamiento hormonal o embarazo, con complicaciones
vasculares placentarias (CVP), fallos de implante repetidos y mujeres
con trombofilia que reciban o no profilaxis durante el embarazo o técnicas de reproducción asistida (TRA). El estudio ha sido aprobado por
el Comité de Ética de cada centro. Los objetivos primarios del registro
son el estudio del tratamiento o profilaxis de la ETE durante el embarazo, terapias hormonales o TRA; así como el manejo de las CVP.
Resultados: Se han reclutado 438 pacientes de 30 centros
y registrado un total de 457 episodios, de los cuales 5% fueron
trombosis durante el embarazo y 6% durante tratamientos hormonales, 34% profilaxis de trombosis durante el embarazo, 25% CVP,
27% profilaxis de estas complicaciones y 2% de fallos de implante
repetidos. El estudio de trombofilia reveló que los defectos más
comunes fueron el polimorfismo F12 46C/T homocigoto, Factor
V Leiden y niveles elevados de Factor VIIIc.
Para la profilaxis de trombosis durante el embarazo en el 75%
de episodios se empleó heparina de bajo peso molecular (HBPM)
PO-420 Nueva consulta de anticoagulantes
orales directos (ACOD): resultados tras
dos años de seguimiento
Luis-Hidalgo M.M., García-Navarro I., Mena-Rodríguez F.,
Bautista-Claver T., Cárcel Corella P., Cánovas-Giménez V.,
Mayáns-Ferrer J.R.
Hospital Arnau de Vilanova. Valencia
Introducción: Los anticoagulantes orales directos (ACODs)
son una alternativa aprobada para la prevención de la embolia sistémica y del ictus isquémico en pacientes con fibrilación auricular
179
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
Quince pacientes (8,47% del total) han sufrido incidencias
que han requerido ajuste de dosis o cambio del fármaco (Tabla 2).
Otros eventos que no han requerido cambios en la pauta son: anemización en 5 pacientes (3 con rivaroxabán de 20mg; 1 con rivaroxabán de 15mg y 1 con dabigatrán de 150mg), y deterioro en la función
renal en 3 (2 con rivaroxabán de 15mgy 1 con apixabán de 2.5mg).
En 9 pacientes se ha retirado el ACOD. Actualmente 168
pacientes se mantienen en tratamiento con ACOD, correspondiendo al 3,37% de los pacientes anticoagulados en el departamento.
Conclusiones: La experiencia de uso de los ACOD en la población aún es limitada, así como el conocimiento de las incidencias
a largo plazo. A pesar de la aparente menor incidencia de eventos
adversos frente a los antagonistas de la vitamina K. Nuestro trabajo
permite justificar la necesidad del seguimiento clínico-analítico de
estos pacientes, con el fin de evitar las complicaciones y mejorar la
no valvular (FANV). Los datos actuales europeos cifran el uso de
ACOD en el 6% del total de anticoagulados. Debido a su reciente
extensión clínica y la escasa casuística fuera de ensayo clínico, son
pocos los trabajos que describen las consecuencias de su empleo
en la población general.
En nuestro centro se ha creado una consulta específica para la
selección, tratamiento y seguimiento de los pacientes con ACODs.
Presentamos los resultados descriptivos de la cohorte de pacientes
con el objetivo de comunicar nuestra experiencia en el empleo de
los ACODs.
Metodología: Desde junio de 2012 a junio de 2014 se ha iniciado anticoagulación con ACOD en los sujetos con FANV que
reúnen los criterios aceptados por el Ministerio de Sanidad para
ser subsidiarios de este tratamiento.
Se realiza control clínico-analítico basal y transcurridos 1, 3,
6 y 12 meses. Al cumplimentar el año de terapia, si no ha existido
incidencia trombótica ni hemorrágica, el control pasa a ser semestral.
Se registra la aparición de hemorragias y otros efectos adversos, así como la posibilidad de interacciones farmacológicas o la
preparación de los pacientes en caso de requerir intervenciones
quirúrgicas u otros procedimientos invasivos, que precisen o no
cambio de fármaco o posología. El estudio de laboratorio incluye:
hemograma; hemostasia; metabolismo férrico y carencial (en caso
de anemia previa); estudio de la función hepática y renal.
Resultados: Se ha registrado e iniciado tratamiento en 177 pacientes, 94 mujeres (53,1%) y 83 varones (46,9%). La edad media es de
78.04 años. Se inició tratamiento con dabigatrán en 55 casos (31,1%),
rivaroxabán en 97 (54,8%), y apixabán en 25 (14,1%) (Tabla 1).
Tabla 1. Pacientes con ACODs recogidos en la consulta
Dabigatrán
Rivaroxabán
Apixabán
Dosis
N.º de pacientes
Porcentaje
150 mg/12 h
28
15.82 %
110 mg/12 h
27
15.25 %
20 mg/24 h
62
35.03 %
15 mg/24 h
35
19.77 %
5 mg/12 h
9
5.08 %
2.5 mg/12 h
16
9.04 %
Tabla 2. Pacientes que han precisado cambio de pauta terapéutica
Motivo del ajuste de dosis
o el cambio de tratamiento
Proceso oncológico activo
Evento hemorrágico
Número total
de pacientes
4
3
Fármaco que llevaba
Fármaco por el
que se sustituye
Rivaroxabán 20 mg/24 h
HBPM
Carcinoma broncogénico (1),
adenocarcinoma de mama (1) y carcinoma
laríngeo (1)
Rivaroxaban 15 mg/24 h
HBPM
Neoplasia ureteral
Rivaroxabán 20 mg/24 h
Apixabán 2.5 mg/12 h
Rivaroxaban 15 mg/24 h
Suspensión
Rivaroxaban 20 mg/24 h
HBPM
Rivaroxabán 20 mg/24 h
Dabigatrán 150 mg/12 h
Dabigatrán 110 mg/12 h
HBPM
Motivo específico
Hematoma subdural
Ictus hemorrágico
Hemorragia digestiva aguda
Ictus isquémico carotídeo izquierdo
Evento trombótico
2
Alteración de la función
renal
1
Rivaroxabán 20 mg/24 h
Rivaroxabán 15 mg/
24 h
Toxicodermia grado 4
1
Dabigatrán 150 mg/12 h
Acenocumarol
Necrosis cutánea**
Dabigatrán 150 mg/12 h
Acenocumarol
Iniciaron dabigatrán 150 para cardioversión
eléctrica y 1 no se realizó por entrar el
paciente en ritmo sinusal y la otra fue fallida
pero el paciente tenía CHADSVASC1 y
nunca había recibido acenocumarol
Dabigatrán 150 mg/12 h
Acenocumarol
Sentimiento de mayor seguridad
Apixabán 5 mg/12 h
Acenocumarol
Sentimiento de mayor seguridad
No aprobado visado por
inspección
2
Abandono por iniciativa
propia del paciente
2
180
TVP vena femoral común en contexto de
fractura subcapital de fémur derecho
Deterioro en filtrado glomerular
Pósteres
En la Tabla 1 se observa la distribución de los defectos hallados en los estudios de trombofilia.
Conclusiones: La prevalencia de trombofilia en pacientes con
trombosis no difiere mucho de los resultados en otros escenarios. Nuevos factores de riesgo biológico como el FVIIIc o el polimorfismo en
homocigosis del F12 46C/T están muy presentes en pacientes con
adherencia al tratamiento. De ahí la importancia de crear protocolos, guías de consenso y el deber de comunicar efectos no deseados
que puedan surgir con su empleo.
PO-421 Nuevos factores de trombofilia en
pacientes con complicaciones
vasculares placentarias (CVP) y trombosis
relacionada con embarazo o tratamiento
hormonal. Resultados preliminares del
proyecto TEAM de la SETH
Tabla 1.
Diagnóstico biológico en pacientes con trombosis
Martí Sáez E.1, Redondo Izal A.M.2, de Diego Jalemskaya I.3,
Rodríguez Huerta A.4, Llamas Sillero P.5, Rodríguez Martorell J.6,
Martínez Pérez O.4, Casellas Caro M.7, Ramírez Polo I.M.8,
Gutiérrez Pimentel M.J.9, Tàssies Penella D.10, Santamaría Ortiz A.7
Hospital Manises. Manises, Valencia. 2Hospital de Navarra. Pamplona. 3Mútua
de Terrassa. Barcelona. 4Hospital General Universitario Gregorio Marañón.
Madrid. 5Hospital Fundación Jiménez Díaz. Madrid. 6Hospital Universitario
Virgen del Rocío. Sevilla. 7Hospital Vall d’Hebron. Barcelona. 8Unidad de Gestión
Clínica. C.S. Cayetano Roldán. Cádiz. 9Hospital Universitario Virgen de las
Nieves. Granada. 10Hospital Clínic. Barcelona
1
Fundamentos y objetivos: Existe cada vez más información
sobre complicaciones trombóticas y vasculares gestacionales, que
apunta hacia la relación entre estos dos tipos de complicaciones.
La presencia de trombofilia como factor de riesgo en estas pacientes es importante de cara a la elección del tratamiento y/o profilaxis. El proyecto TEAM es un registro nacional de mujeres con
complicaciones trombóticas durante el embarazo o tratamientos
hormonales y con CVP. Se trata de un estudio de cohortes observacional multicéntrico (ver página web en www.proyectoteam.com).
Dentro de este proyecto hemos analizado los factores de
trombofilia que pueden asociarse a este tipo de complicaciones.
Pacientes y métodos: Desde 2009 hasta hoy, casi 60 centros
españoles y, también ahora de Uruguay, han incluido pacientes de
forma prospectiva en el registro. Los criterios de inclusión son:
pacientes con trombosis secundaria a tratamiento hormonal o embarazo, con complicaciones vasculares gestacionales, fallos de implante repetidos y mujeres con trombofilia que recibirán o no profilaxis
durante el embarazo o técnicas de reproducción asistida (TRA). El
estudio ha sido aprobado por el Comité de Ética de cada centro.
Del total de 457 episodios incluídos, se analizaron los episodios
de trombosis (55) durante el embarazo, técnicas de reproducción
asistida o tratamiento hormonal, y los episodios de CVP (117).
Resultados: Se analizaron 55 episodios de trombosis, de los
cuales 24 se relacionaba con el embarazo, 1 con técnicas de reproducción asistida y 30 con tratamiento hormonal. La edad mediana
en este grupo fue de 32 años (20,73). Catorce pacientes (27%)
presentaban antecedentes familiares de trombosis. Nueve pacientes
(18%) presentaban una historia obstétrica desfavorable (Tabla 1).
Se registraron 117 episodios de CVP. La edad mediana del
grupo fue de 36 años (20-45). Dieciocho pacientes (16%) presentaban historia familiar de trombosis y 96 (86%) historia obstétrica
desfavorable (Tabla 2).
50
%
Disfibrinogenemia
0
0
Hipofibrinogenemia
0
0
Anticoagulante lúpico positivo
7
14
Anticuerpos antifosfolipídicos positivos
1
2
Aumento de los niveles de factor VIII: C (>200%)
3
6
Déficit de antitrombina
0
0
Déficit de proteína C
2
4
Déficit de proteína S
2
4
Resistencia a la proteína C activada
6
12
Hiperhomocisteinemia
4
8
Factor V Leiden
9
18
Mutación F2 G20210A
10
20
Mutación F12C46T
4
8
Mutación C677T de la MTHFR
2
4
Mutación antitrombina Cambridge II
0
0
Mutación Factor V Cambridge
0
0
Mutación Factor V Hong Kong
0
0
96
%
2,1
Tabla 2.
Diagnóstico biológico en pacientes con CVP
181
Disfibrinogenemia
2
Hipofibrinogenemia
1
1
Anticoagulante lúpico positivo
7
7,3
Anticuerpos antifosfolipídicos positivos
9
9,4
Aumento de los niveles de factor VIII: C (>200%)
9
9,4
Déficit de antitrombina
5
5,2
Déficit de proteína C
1
1
Déficit de proteína S
7
7,3
Resistencia a la proteína C activada
5
5,2
Hiperhomocisteinemia
2
2,1
Factor V Leiden
9
9,4
Mutación F2 G20210A
8
8,3
Mutación F12C46T
17
17,7
Mutación C677T de la MTHFR
11
11,4
Mutación antitrombina Cambridge II
1
1
Mutación Factor V Cambridge
1
1
Mutación Factor V Hong Kong
1
1
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
CVP. Actualmente se continúa aportando información a este registro
que confirme los resultados preliminares y nos ayude a realizar la
traslación entre la práctica clínica y la investigación biológica.
Agradecimientos: El proyecto TEAM está parcialmente patrocinado por Leopharma TM.
PO-422 Perfil de trombofilia en mujeres
con abortos de repetición
Romero Domínguez S., Lacoboni García-Calvo G.,
Balaguer Roselló A., Mira Fornés Y., Herrero Vicente G.,
Medina Badenes P., Ferrando Gosp F., Cid Haro A.R.,
Haya Guaita S., Bonanad Boix S., Sanz Alonso M.A.
Figura 1. Casos según número de abortos.
Hospital Universitari i Politècnic La Fe. Valencia
Introducción: La asociación entre trombofilia (TF) y abortos
de repetición (AR) no está bien establecida, salvo en pacientes con
síndrome antifosfolípido (SAF) debido a la presencia de anticuerpos antifosfolípido (AF).
No existe unanimidad para definir el AR (2 o =3 abortos), ni si
realizar el estudio de trombofilia (ET) completo tras el 2.º o 3.º aborto.
De forma habitual cada vez son más las pacientes remitidas tras un
2.º aborto.
El objetivo primario de este trabajo es analizar retrospectivamente la frecuencia de TF en pacientes con al menos 2 abortos (sin
alteración anatómica, hormonal o genética). El objetivo secundario
es analizar las diferencias entre las pacientes con 2 o =3 abortos.
Material y métodos: Realizamos el ET (AT, PC, PS, mutaciones FVL y PT G20210A y perfil de AF) a un grupo de 179
mujeres con al menos 2 abortos. A un grupo de 150 mujeres sanas
sin antecedentes de AR determinamos PC, FVL y PT G20210A.
Realizamos un subanálisis entre el grupo de mujeres con 2 abortos
(93 casos) frente a las de =3 abortos (86 casos). La mediana de
edad en el grupo de AR fue 35 años. La distribución de pacientes
por número de abortos se muestra en la Figura 1. El 92% de los
abortos ocurrieron en el 1.º trimestre de gestación (Figura 2).
Resultados: Los resultados del ET en mujeres con AR se
muestran en la Tabla 1 (los valores porcentuales corresponden a
casos con alteración del parámetro).
No encontramos diferencias en cuanto a mutaciones FVL y PT,
ni porcentaje de pacientes con PC disminuida en el grupo de AR
frente al grupo control. Al analizar el grupo de pacientes con AR,
no observamos diferencias en el ET completo entre mujeres con
2 y =3 abortos, aunque sí una mayor presencia no significativa de
AL en pacientes con =3 abortos (5,38% vs 9,30% P=0,31).
Figura 2. Semana del aborto.
Conclusiones: La prevalencia en el porcentaje de defectos
trombofílicos en nuestra serie de mujeres con AR es bajo al compararla con la literatura publicada, aunque en ella encontramos
resultados dispares. Solo la frecuencia de alteraciones en la PT es
mayor (poner porcentajes). Tampoco se observa mayor frecuencia
de FVL, PT y PC en las pacientes con AR comparados con el
grupo control. Todo ello concuerda con las dudas existentes en la
relación entre TF y AR.
Aunque parece existir una tendencia a presentar más presencia de AL positivos en mujeres con =3 abortos, en una serie más
amplia se podría esclarecer la diferencia con las que presentan 2
abortos y, lo cual ayudaría a decidir si se deben realizar los ET de
forma precoz en estas pacientes.
Tabla 1.
Variable
AL
ACA
IgG
b2 GP
IgM
IgG
IgM
FVL PT 20210A
PC
PS
AT
Homocisteína
Media
4,41
3,03
2,82
2,96
122,1
75,94
103,63
9,86
IC 95%
0,38-8,44
0,82-5,24
1,56-4,08
2,51-3,41
117,83-126.37
73,07-78,81
101,27- 105,99
9,42-10,30
3,40
4,73
1,44
2,17
0,00
4,46
0,75
2,13
%
7,27
3,35
182
4,46
Pósteres
PO-423 Perfil trombótico y hemorrágico
en pacientes con trombocitemia
esencial (TE)
PO-424 Prevalencia del polimorfismo 46 C/T
en pacientes con déficit de factor XII
detectado en estudio preoperatorio.
Significación clínica
Yus Cebrián M.F., Coello de Protugal Casana C., Lacalle Aicua L.,
Tercero-Mora Rodríguez M., De Rueda Ciller B.,
Fernández Mosteirín N., Caballero Navarro G., Mayayo Artal M.P.,
Delgado Beltrán, M.P.
Vidal Laso R., Blas C., Llamas Sillero P.
Hospital Fundación Jiménez Díaz. Madrid
Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza
Introduccion: El factor XII es un complejo proteico que forma parte de la homeostasis de la coagulación, prescindible para el
equilibrio de la misma. Responsable del inicio de la fase de contacto después de su unión al quininógeno de alto peso molecular
(HMWK). Un descenso en los niveles del mismo no implica un
aumento de las complicaciones hemorrágicas. Recientes investigaciones sugieren que tiene un papel en la formación y propagación
del trombo. El polimorfismo del gen 46 C/T del factor XII, se
considera una trombofilia de bajo riesgo, el estado heterocigoto
se asocia a un menor riesgo trombótico que el estado homocigoto.
Objetivos: Determinar la prevalencia del polimorfismo 46 C/T
en pacientes con déficit de factor XII detectado en estudio preoperatorio. Significación clínica de los hallazgos descritos.
Material y métodos: Estudio descriptivo retrospectivo en el
que se ha revisado la historia clínica de 28 pacientes diagnosticados de déficit de factor XII en estudio preoperatorio por TTPa
alargado. Periodo comprendido entre enero de 2012 y diciembre de
2013. Se han analizado las siguientes variables: edad, sexo, tabaquismo, antecedente personal tromboembólico vs hemorrágico,
historia de abortos, tipo de intervención quirúrgica y complicación
tromboembolica vs hemorrágica a los tres meses de la cirugía. En
cuanto a datos analíticos se ha recogido la cuantificacion del TTPa,
Factor XII y resultado del polimorfismo.
La determinación del polimorfismo 46 C/T del gen del factor
XII se realiza por reacción en cadena de la polimerasa a partir de
ADN extraído de muestras de sangre periférica.
Resultados: En el grupo de pacientes estudiados un 53,57%
son hombres y un 46,43% son mujeres, de edad media 45 años
(21-74).
La mayoría de los pacientes presenta un déficit leve de Factor
XII con una mediana de 50,3 sg y un TTPa alargado con una
mediana de 39,1 sg (rango 31,2 a 87,3)
En un 92,86% se detecta el polimorfismo en homocigosis. En
un 7,14% no se detecta y no se detecta ninguno en heterocigosis.
Como factor de riesgo trombótico añadido un 25% son fumadores.
Del total de mujeres un 38,46% tiene antecendente de abortos.
Del total de pacientes un 64,29% fueron sometidos a una cirugía mayor y un 35% a intervenciones menores. Se realizó una
tromboprofilaxis adecuada en el postoperatorio según pauta habitual y no se objetivó ninguna complicación tromboembólica ni
hemorrágica en un periodo de tres meses tras la cirugía.
Conclusiones: Según este estudio podemos concluir que la
mayoría de los pacientes con déficit de factor XII se asocian a un
estado homocigoto del polimorfismo del gen 46 C/T del factor
XII; Existe controversia en cuanto al significado clínico. A pesar
de estar considerado como una trombofilia de bajo riesgo, a tres
meses post-intervención no se ha documentado ningún evento
trombótico. Si bien, han recibido una adecuada tromboprofilaxis.
Introducción: La TE es una neoplasia mieloproliferativa crónica, marcada por la presencia de eventos trombo-hemorrágicos
(ETH), la evolución a mielofibrosis y leucemia aguda mieloide. La
mutación V617F del exón 14 del JAK2 se detecta en un 70% de
los pacientes y se relaciona con más ETH y una cifra más elevada
de leucocitos y plaquetas.
Objetivos: Analizar el perfil clínico-analítico trombótico (T)
y hemorrágico (H) en pacientes con TE.
Pacientes y métodos: Se estudió una muestra del total de
pacientes diagnosticados de TE entre 1990 y 2014 en nuestro
centro, y que fueron valorados en nuestras consultas durante 12
meses. Se analizaron variables demográficas y analíticas, el tipo
y localización de ETH, y el tratamiento recibido.
Resultados: Fueron valorados 101 pacientes, 34 ♂ (33,7%)
y 67 ♀ (66,3%). Edad media al diagnóstico 59,32 (♂ 56,53 y ♀
60,73). Se observó un predominio de ♂ (38,2% vs 19,4%) en el
grupo de edad de 45-65 años, frente al grupo de =65 años en el
que predominaban las ♀ (65,7% vs 52,9%). 39 eventos T en 35
pacientes, 29 arteriales (74,3%) y 10 venosos (25,7%) y 2. 51
pacientes (50,5%) eran JAK2 positivos (+) y de ellos 24 presentaron T (61,5% del total de T), frente a 7 en el grupo JAK2 negativo
(-) (en 8 pacientes no se disponía de resultado). 16 T (41,02%)
tuvieron lugar a lo largo de la evolución de la enfermedad en 12
pacientes (11,9%), de ellos 4 pacientes no recibían tratamiento
citorreductor, 14 recibían tratamiento antiagregante y 2 anticoagulante. Se observaron 16 (5 JAK2 +/11 JAK2 -) episodios H de
localización mucosa fundamentalmente ORL y genitourinaria.
Al diagnóstico no se objetivaron diferencias significativas en las
cifras hematimétricas y la aparición de T; no obstante, en los
pacientes que habían desarrollado eventos H la cifra de plaquetas
fue superior a 900 x 109/L.
Conclusiones: Los ETH marcan la evolución natural de la
TE. Los eventos H, y al igual que en la literatura, han sido más
frecuentes a nivel de mucosas y en pacientes con cifras de plaquetas más elevadas. Observamos una mayor frecuencia de estos
eventos en pacientes JAK2-. Un tercio desarrollaron eventos T
en nuestra serie, alcanzando valores en torno al 50% en JAK2+,
con una incidencia de T arterial similar a la referida en estudios
prospectivos. Tras el diagnóstico y a lo largo de la evolución
de la enfermedad, a pesar de recibir tratamiento antitrombótico
profiláctico, un 10% de los pacientes desarrollaron T. Este hecho
indica la necesidad de llevar a cabo una mejor estratificación y
control del riesgo T.
183
XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
y en miembros superiores respectivamente, p=0,008). Sin embargo cuando se controla la edad estas diferencias estadísticamente
significativas desaparecen.
Conclusiones: La prevalencia de las trombosis en lugares
inusuales es baja. El lugar de la trombosis más frecuente es el
territorio esplácnico. A menos de la mitad se le realiza estudio de
trombofilia, que es positivo en 1 de cada 5 pacientes. Todos los
pacientes que recurrieron lo tenían positivo. La realización del
estudio de trombofilia no depende del lugar de la trombosis sino
de la edad del paciente.
A pesar de que la serie es pequeña es de destacar los antecedentes de abortos en las pacientes homocigotas para esta variante.
PO-425 Prevalencia, factores asociados
y evolución de las trombosis
en lugares inusuales
Fernández Rodríguez M.A., Dueñas Hernando V., Solano Tovar
J., Bernardo Gutierrez A., Corte Buelga J.R., Soto Ortega I.,
García Menéndez-Tevar F.
Hospital Universitario Central de Asturias. Oviedo
PO-426 Proteína S Heerlen y polimorfismos
moduladores negativos. Estudio de
prevalencia en la población normal
en déficits de proteína S
Introducción: El término trombosis en lugares inusuales define un grupo heterogéneo de fenómenos tromboembolicos venosos
que ocurren en lugares distintos a miembros inferiores y pulmón.
Presentan una fisiopatología y una clínica particular definida por
el órgano afectado. La escasa evidencia en este grupo de patología
trombótica, condicionada por su la baja frecuencia, hace necesario
realizar estudios para mejorar el conocimiento de su epidemiología
y su evolución, pronóstico y factores asociados.
Objetivo: Conocer la prevalencia de las trombosis en lugares
inusuales en nuestra población. Definir las características demográficas y clínicas de este subgrupo de pacientes, determinar los factores
asociados y valorar los tratamientos recibidos y el pronóstico.
Material y métodos: Estudio analítico, observacional y transversal de los pacientes anticoagulados por trombosis en lugares
inusuales desde el 1 de enero de 1991 hasta el 31 de Marzo de
2014. Variables: datos demográficos, factores de riesgo, localización, estudio de trombofilia, datos clínicos, tratamiento recibido y
evolución. Se analizaron los datos con el paquete estadístico SPSS.
Resultados: Se estudiaron 20095 pacientes de los cuales están
anticoagulados por ETEV 3622 (18,02%) y de estos 149 (4,1%)
eran trombosis en lugares inusuales. La media de edad es 50,7
(19,6) años. El 12,1% de los pacientes eran diabéticos, el 20,8%
dislipémicos, el 38,3% fumadores, el 26,2% hipertensos y el 6,7%
tenían un síndrome mieloproliferativo crónico. Estos últimos
hacen trombosis en el territorio esplacnico con mayor frecuencia.
Las localizaciones de la trombosis eran: SNC 22 (14,8%) esplacnica 66 (44,3%), retina 1 (7,4%), miembros superiores 49 (32,9%).
Se hizo tratamiento anticoagulante 147 (98,7%) pacientes (6 (4%)
con HBPM y 141 (94,6%) con antivitaminas K). A 73 pacientes
se les realizó un estudio de trombofilia, de los que 34 (22,8%) fue
positivo. La alteración más frecuente fue la hiperhomocisteinemia [14 pacientes (9,4%)] seguido del síndrome antifosfolípido [7
(4,7%)]. En 16 (10,7%) de los pacientes hubo una recurrencia de la
trombosis, y de ellos todos habían tenido el estudio de trombofilia
positivo. Fallecieron 13 (8,7%) de los pacientes, 47 (31,5%) persisten anticoagulados y en 69 (46,3%) se retiró la anticoagulación.
Los que han tenido una trombosis en el SNC son más jóvenes
con diferencias estadísticamente significativas (32 años en SNC
vs 55,6, 70,9, 47,8 a nivel esplacnico, ocular y en miembros superiores respectivamente, p<0,0001). Los estudios de trombofilia se
realizan con mayor frecuencia en los pacientes con trombosis en el
SNC (81,8% vs. 41,1%, 4,1% y 30,1% a nivel esplacnico, ocular
Martinho P.1, Oliveira A.C.1, Fidalgo T.1, Silva Pinto C.1,
Rodrigues D.1, Tomásio R.1, Gonçalves E.2, Marqués D.2,
Sevivas T.1, Salvado R.2, Martins N.2, Ribeiro M.L.1
Serviço de Hematologia. 1Hospital Pediátrico. 2Hospital General. Centro
Hospitalar e Universitário de Coimbra. Coimbra, Portugal
Introducción: La proteína S (PS), anticoagulante natural que
actúa como cofactor de PCA y TFPI, circula en plasma ligada a
la C4b-bindingprotein (60%) y en la forma libre (PSL) (40%).
La deficiencia congénita de PS es rara, prevalencia <0.5 % en
población general, tiene herencia autosómica dominante y resulta
de mutaciones en gen PROS1. Los déficits cuantitativos –tipo I
(PSL y PST disminuidas) y tipo III (solo PSL disminuida) son los
más frecuentes. La PSHeerlen (Ser501Pro) es la mutación PROS1
más frecuente, de entre más de 200 mutaciones puntuales descritas, y se asocia a deficiencia de PS tipo III. Varios estudios europeos encontraran una correlación directa entre PSHeerlen (PSH)
y trombosis venosa y arterial. Han sido también descritos algunos
polimorfismos (SNPs) moduladores negativos de los niveles de
PS: PROS1 c.2001A>G, p.P667P (rs6123) y g.23343243A>G
(rs1437135) en gene NQO1, que codifica una enzima involucrada
en el metabolismo de la vitamina K.
Objetivo: Analizar la prevalencia relativa de la PSH en
pacientes con trombosis y déficit de PS o con PS en el límite
inferior de la normalidad; la prevalencia de los SNPs moduladores
negativos rs6123 y rs1437135 en la población general; evaluar el
efecto cumulativo de estos SNPs en los niveles de PSL en pacientes con la variante PSH.
Material y métodos: Fueran estudiados: 51 controles (CTR)
no relacionados y sin trombosis; 108 pacientes no relacionadas
con historia personal y/o familiar de trombosis; 49 con deficiencia
de PS (PSL 23-71) - dPS; iii) 59 con niveles de PSL en el límite
inferior normalidad (PSL 55-80) - <NPS. Estudios funcionales:
PSL Ag-LIA y PST-ELISA, antic. Lupico- dRVVT, niveles de
PC y AT. Estudios moleculares: ASPCR, PCR/RFLP, HRM, PCR/
secuenciación nucleotídica y MLPA.
Resultados: En los 49 dPS, 19 eran heterocigotos para mutaciones en gen PROS1. Encontramos 8 mutaciones distintas: 2 inser-
184
Pósteres
Tabla 1.
Exón
Nucleótido
Efeito
Polyphen/Score
PSL (%)
PST (%)
N.º propósitos
1
37G>C
2
200A>C
Ala13Pro#
Benign/ 0.014
53
52
1
Glu67Ala
Probably damaging/ 0.999
18
35
1
2
227C>T
Pro76Leu
Probably damaging/ 1.000
52
56
1
6
496A>C
Asn166His
Probably damaging/ 0.998
13
33
1*
6
570dupT
Val191Cysfs*6#
-
26
38
1
9
918dupT
Ala 307Cysfs*22
-
15.3
28.7
3
13
1501T>C
Ser501Pro
Benign/ 0.014
49.6
65.4
11
15
1916G>T
Cys639Phe
Probably damaging/ 0.999
14
25
1
Mutaciones no descritas en HGMD; * con otra mutación (Ala307Cysfs*2)
#
Proteína C o S mediado por un mecanismo autoinmune, histológicamente se caracteriza por una trombosis venosa extensa de
la dermis con infarto hemorrágico de los tejidos adyacentes. Se
desc