1. No category

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LAS HOJAS DE Pentacalia corymbosa y
Pentacalia nitida (ASTERALES: ASTERÁCEAE)
CAMILA URIBE-HOLGUÍN
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
2010
1
ANÁLISIS FITOQUÍMICO DE LAS HOJAS DE Pentacalia corymbosa y P.nitida (ASTERALES:
ASTERÁCEAE) Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE.
CAMILA URIBE-HOLGUÍN
APROBADO
INGRID SCHULER, PhD
Decano Académico
ANDREA FORERO
Directora carrera de Biología
Facultad de ciencias
2
ANÁLISIS FITOQUÍMICO DE LAS HOJAS DE Pentacalia corymbosa y P.nitida (ASTERALES:
ASTERÁCEAE) Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE.
CAMILA URIBE-HOLGUÍN
APROBADO
LUIS GONZALO SEQUEDA, MSc
Director
ALBA NOHEMI TELLEZ, PhD
Jurado
3
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la
moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
Artículo 23 de la Resolución Número 13 de julio de 1946.
4
ÍNDICE DE CONTENIDO
PG.
Abreviaturas……………………………………………………………………………………………………………
6
Resumen………………………………………………………………………………………………………………..
7
Introducción……………………………………………………………………………………………………………
7
Referentes conceptuales
1. Radicales libres y antioxidantes………………………………………………………………………….......
8
1.1 Antioxidantes naturales y comerciales…………………………………………………………………….
9
Los flavonoides……………………………………………………………………………………………………………
10
Las cumarinas………………………………………………………………………………………………………………
10
los Quinoles…………………………………………………………………………………………………………………
11
1.1.2. El romero……………………………………………………………………………………………………………
11
1.1.3. Clasificación taxonómica de Pentacalia………………………………………………………………
12
1.1.3.1. Las Asteráceas o compuestas …………………………………………………………………………
12
1.1.3.2. La tribu Senecioneae………………………………………………………………………………………..
12
1.1.3.3. El género Pentacalia………………………………………………………………………………………….
13
Pentacalia corymbosa…………………………………………………………………………………………………….
13
Pentacalia nítida……………………………………………………………………………………………………………
13
Antecedentes
2. Métodos para la evaluación de la actividad antioxidante……………………………………………
14
2.1 Método ABTS……………………………………………………………………………………………………………
15
2.1. Método DPPH…………………………………………………………………………………………………………
15
3. Métodos para la identificación de metabolitos secundarios………………………………………
16
3.1. Cromatografías……………………………………………………………………………………………………….
16
Objetivo general y específicos……………………………………………………………………………………..
17
Materiales y métodos…………………………………………………………………………………………………
17
Identificación de metabolitos secundarios…………………………………………………………………..
17
4. El material vegetal y obtención de extractos totales………………………………………………..
17
4.1. Pruebas químicas preliminares………………………………………………………………………………
18
5. Técnicas de separación…………………………………………………………………………………………….
19
5.1. Cromatografía de capa fina (C.C.F) ………………………………………………………………………..
19
5.2. Fraccionamiento líquido-líquido……………………………………………………………………………..
20
Evaluación de la actividad antioxidante…………………………………………………………………………
21
6. Por medio del método DPPH………………………………………………………………………………………
21
7. GC/MS a las fracciones con mayor actividad antioxidante………………………………………….
22
Resultados y Discusión………………………………………………………………………………………………….
22
Identificación de metabolitos secundarios…………………………………………………………………..
22
8. Material vegetal y obtención de extractos totales……………………………………………………..
22
8.1. Pruebas químicas preliminares………………………………………………………………………………..
23
9. Técnicas de separación………………………………………………………………………………………………
24
9.1. Cromatografía en capa fina (C.C.F) de extractos totales…………………………………………
24
9.2. Fraccionamiento líquido-líquido…………………………………………………………………………….
26
9.3. Cromatografía en capa fina (C.C.F) de fracciones…………………………………………………
26
10. Resultados de la actividad antioxidante……………………………………………………………….
27
5
11. GC/MS de las fracciones con mayor actividad antioxidante……………………………………
31
Conclusiones…………………………………………………………………………………………………………………
33
Recomendaciones………………………………………………………………………………………………………….. 33
Bibliografía ……………………………………………………………………………………………………………………
34
Anexos……………………………………………………………………………………………………………………………. 38
ABREVIATURAS
ABTS
AcOEt
AAO
AE
BHT
CCF
CHCl3
CG/EM
DCM
DPPH
EC50
ET
EtOH
FeCl3
HAT
HCL
H2SO4
MeOH
Petrol
Rem.
Rf
ROS
TEAC
tEC
TROLOX
UV
Radical ácido 2,2’azinobis-(3-etilbenzotiazolina)-6 sulfónico
Acetato de etilo
Actividad antioxidante
Eficiencia antiradical
Butil Hidroxitolueno, un antioxidante sintético
Cromatografía en capa fina
Cloroformo
Cromatografia de gases acoplada a espetrometría de masas
Diclorometano
Radical 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo
Concentración efectiva al 50%
Métodos para la evaluación de AAO por transferencia de electrones
Etanol
Cloruro férrico
Métodos para evaluación AAO por transferencia de átomos de hidrógeno
Ácido clorhídrico
Ácido sulfúrico
Metanol
éter de petróleo
Remanente
Relación de frente
Especies reactivas del oxígeno
Capacidad antioxidante equivalente TROLOX
Tiempo para alcanzar la concentración efectiva
Análogo de la vitamina E
Ultravioleta
6
RESUMEN
Los radicales libres, debido a su electrón desapareado, son átomos inestables, que al intentar
estabilizarse capturan electrones de las moléculas que tienen a su alrededor y las desestabilizan
(Youngston, 2005). A pesar de que el cuerpo humano, en su metabolismo normal y al combatir
infecciones produce radicales libres, el exceso de contaminación y estrés, generan un exceso de
radicales libres, que al intentar estabilizarse, generan una reacción oxidativa, que genera grandes
daños en nuestras células, lo que termina en enfermedades degenerativas, como cardiomiopatías
y diferentes tipos de cáncer (Avello & Suwalsky, 2006). Según los estudios de Choi y colaboradores
(2002), los radicales libres pueden detener su acción oxidativa por medio de antioxidantes,
quienes donan electrones y/o hidrógeno logrando estabilizar los radicales libres. Estas sustancias
antioxidantes se pueden encontrar de forma natural en nuestro cuerpo y en los metabolitos
secundarios de diferentes plantas, con propiedades antioxidantes, como es el caso de las
Asteráceas de la tribu Senecioneae, del género Pentacalia, que según los estudios de Sklenár &
Balslev (2004) y de Tene y colaboradores (2007) se han registrado en los páramos de la región
andina, y se han caracterizado por sus usos medicinales y por la presencia de metabolitos
secundarios con estructura polifenolica, como quinoles y flavonoides, que le pueden atribuir una
alta actividad antioxidante (Pedrozo et al. 2006). En este proyecto, se realizó un estudio
fitoquímico y se evaluó la actividad antioxidante de las hojas de Pentacalia corymbosa y Pentacalia
nítida, la cual fue comparada frente a la actividad antioxidante del romero, que según diferentes
estudios (Wang et al., 2008& Mahmoud et al., 2005) ha sido aceptada como una de las especies
con mayor actividad antioxidante presente en sus hojas. Y finalmente todos los resultados fueron
comparados frente a la actividad antioxidante de antioxidantes sintéticos como el Trolox y el BHT.
PALABRAS CLAVE
Antioxidante, Actividad antioxidante, radicales libres, método DPPH, Pentacalia
INTRODUCCIÓN
El cuerpo humano en su metabolismo normal produce radicales libres, átomos con un electrón
desapareado, que al estabilizarse, pueden ceder su electrón o capturar un electrón de alguna otra
molécula (Youngston, 2005). En presencia del oxígeno, los radicales libres son denominados
especies reactivas del oxígeno (ROS), como el del peróxido de hidrógeno (H2O2), el anión
superóxido (O-2) y el radical hidroxilo (HO·), entre otros (Choi et al, 2002). Según los estudios de
Aruoma (1996) cuando estos radicales se producen en exceso pueden llegar a ser tóxicos o
dañinos para nuestras células. La contaminación atmosférica, la falta de ejercicio, el estrés y la luz
ultravioleta, generan un exceso de radicales libres que al intentar estabilizarse capturan electrones
de las moléculas estables, convirtiéndolas al mismo tiempo en radicales libres (Aruoma, 1996). Lo
que termina por generar una reacción oxidativa, que produce grandes daños en nuestras células.
Al alterar la funcionalidad normal de las células, se desarrollan enfermedades degenerativas como
caridiomiopatias, enfermedades neurológicas y diferentes tipos cáncer (Avello & Suwalsky, 2006).
7
Los radicales libres pueden detener su acción oxidativa por medio de los antioxidantes, que
estabilizan su electrón desapareado (Choi et al, 2002). Según los estudios de Youngston (2005), las
sustancias antioxidantes, previenen el daño o la destrucción generada por una oxidación, al ceder
átomos de hidrógeno. Las sustancias naturales como la vitamina E y la vitamina C, se pueden
encontrar en plantas cuyos frutos sean de color amarillo, naranja o rojo, y en frutos ácidos
respectivamente; Igualmente, este tipo de sustancias provienen del metabolismo secundario de
diversas plantas, ejemplo de ello son los polifenoles (Aruoma, 1996). Los estudios deWang y
colaboradores (2008), junto con los de Mahmoud y compañía(2005), demuestran la alta actividad
antioxidante de las hojas del romero, una de las razones por las cuales ha sido aceptada como una
de las especies con mayos actividad antioxidante. Así mismo, según los estudios de Pedrozo y
colaboradores (2006), junto con los estudios de Deuschle et al. (2006), las especies del género
Pentacalia, se han caracterizado por la presencia de metabolitos secundarios con estructura
polifenólica, como flavonoides y quinoles, a quienes se les atribuye una alta actividad antioxidante
(Aruoma, 1996). El trabajo propuesto se enfocó en determinar la actividad antioxidante de los
extractos y fracciones obtenidas de las hojas de Pentacalia nítida y P.corymbosa, donde
previamente se realizó su estudio fitoquímico y posteriormente se identificó la composición de las
fracciones con mayor actividad por medio de la cromatografía de gases acoplada a la
espectrometría de masas.
REFERENTES CONCEPTUALES

MARCO CONCEPTUAL
1. Radicales libres y antioxidantes
Los radicales libres son compuestos que poseen un electrón desapareado, una característica que
los hace realmente inestables y altamente activos químicamente. Al intentar estabilizarse, los
radicales libres pueden ceder su electrón desapareado o capturar un electrón de otra molécula o
de otro radical (Youngston, 2005). Según estudios de Aruoma (1996), este tipo de reacciones
depende de las concentraciones de radicales libres y de sitios activos en las moléculas, como
dobles enlaces, en donde los radicales libres pueden interactuar. Los Radicales libres como las
especies reactivas del oxígeno (ROS), están constantemente formándose como producto del
metabolismo normal del cuerpo humano, debido a que muchas ROS participan en las funciones
fisiológicas del cuerpo humano, pero cuando éstas especies son generadas en exceso, pueden
generar daños en nuestras células y en el ADN (Aruoma, 1996).
Las ROS causan el mayor daño oxidativo sobre el cuerpo humano son, el peróxido de hidrógeno
(H2O2), el anión superóxido (O-2) y el radical hidroxilo (HO·),quienes reaccionan con cualquier
célula del cuerpo, dañando membranas celulares, enzimas y otras biomoléculas, son tan activos
que en menos de un segundo atacan a otros átomos convirtiéndolos en radicales libres, lo que
termina en una reacción oxidativa (Youngston, 2005). Los radicales libres pueden ser originados de
diversas maneras; las radiaciones de luz ultravioleta, la toxicidad de los productos químicos, el
8
estrés, la falta de sueño y de ejercicio son las principales causas que conllevan a un exceso de
radicales libres (Aruoma, 1995). Según los estudios de Youngston, 2005, las radiaciones rompen
los enlaces existentes entre los átomos y liberan un exceso de radicales libres en nuestras células,
asimismo, según los estudios de Huang y colaboradores (2005),cuando el peróxido de hidrógeno
(H2O2), reacciona con el hierro, se generan una alta cantidad de radicales libres altamente
reactivos, como el radical hidroxilo (HO·), lo que se conoce como la reacción de Fenton.
1.1 Antioxidantes naturales y comerciales
Los radicales libres pueden neutralizar su acción oxidativa por medio de antioxidantes que
estabilizan su radical desapareado. Existen antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos, en nuestro
cuerpo, la enzima superóxido dismutasa (SOD), convierte el superóxido (O-2) en peróxido de
hidrógeno (H2O2), y la enzima catalasa, descompone el peróxido de hidrógeno en agua y en
oxígeno (Castañeda et al., 2008). Sin embargo, según los estudios de Huang y colaboradores
(2005), no se conoce reacción enzimática que estabilice al radical hidroxilo (HO·), lo que hace
necesario el suministro de antioxidantes no catalíticos.Según los estudios de Youngston (2005), las
sustancias antioxidantes, previenen el daño oxidativo al ceder átomos de hidrógeno al radical
hidroxilo, lo que conlleva a la formación de agua, este tipo de moléculas que neutralizan la acción
de los radicales libres de forma directa, no catalítica, se encuentran en la vitamina E (tocoferol),
en la vitamina C, en diferentes compuestos de plantas y en microelementos escenciales como zinc,
cobre y selenio (Hercberg et al., 1998). Según los estudios de Krishnaiah y colaboradores (2010),
así como existen antioxidantes naturales, se han desarrollado diferentes antioxidantes sintéticos
como el BHT y el Trolox, que además de ser utilizados por su acción antioxidante, también sirven
para comparar la actividad antioxidante de diferentes compuestos o extractos de plantas. El BHT,
butil hidroxitolueno, es un antioxidante sintético, que a pesar de ser ampliamente utilizado como
antioxidante para prevenir la ranciedad de los alimentos, puede ser el causante de diferentes
problemas de hígado, mientras que el Trolox, es un análogo de la vitamina E, soluble en agua, que
debido a su alta actividad antioxidante muchas veces es utilizado como control de la actividad
antioxidante de diferentes extractos y compuestos (Krishnaiah et al., 2010).
Según los estudios de Huang y colaboradores (2005), dependiendo del fin de los antioxidantes,
existen una gran variedad de definiciones establecidas para éste término, por ejemplo, en la
industria química, los antioxidantes son compuestos que retardan la auto oxidación de productos
químicos; en la industria de alimentos, los antioxidantes son compuestos que previenen la
ranciedad de los alimentos; pero la definición más adecuada biológicamente, es que son
sustancias naturales ó sintéticas, que previenen o retrasan el deterioro causado por el oxígeno en
el aire.
Según los estudios de Wei & Ho (2006), la mayoría de los antioxidantes en su estructura molecular
incluyen un anillo aromático con uno o más grupos hidroxilos, lo que permite atrapar el electrón
desapareado o ceder protones para estabilizar el radical. El tipo de compuesto, el grado de
metoxilación y el número de grupos hidroxilo son algunos de los parámetros que determinan la
actividad antioxidante de los metabolitos secundarios (Fukumoto& Mazza, 2000). La gran mayoría
9
de antioxidantes naturales son derivados de flavonoides, cumarinas, y carotenoides (Wei & Ho,
2006). Sin embargo, hay que tener en cuenta que los metabolitos secundarios se generan bajo
causas de estrés, por lo cual su concentración depende de los factores medio ambientales
(Aruoma, 1996).
Los Flavonoides
Según los estudios de Rice-Evans y colaboradores (1996), junto con Fukumoto& Mazza (2000), los
compuestos de mayor actividad antioxdante son los de estructura flavonoidea. Según los estudio
de Martínez-Flórez y colaboradores (2002) los flavonoides son pigmentos naturales, que se
encuentran en los vegetales y protegen al organismo de los daños causados por la oxidación y
evitan la toxicidad de los metales pesados. Esto se debe a que en su estructura química presentan
buena cantidad de grupos hidroxilo fenólicos, pues su esqueleto químico de difenilpirano (C6-C3C6) se encuentra compuesto por dos anillos de fenilo (A y B), unidos por un anillo C de pirano, lo
que le confiere una alta polaridad y una gran propiedad antioxidante. Los flavonoides se han
caracterizado por ser compuestos polifenólicos que estabilizan los radicales hidroxilo y superóxido
(Hodek et al., 2001). En las plantas, además de que intervienen como pigmentos y de filtros
solares, actúan como antioxidantes, inhibidores enzimáticos y precursores de sustancias tóxicas
(Tenorio et al., 2006). Debido a que el ser humano no produce flavonoides, los debe obtener
mediante diferentes alimentos o bebidas vegetales, como cítricos, vino y frutos rojos.
Figura 1. Estructura básica de los flavonoides. (Martínez-Flórez y colaboradores, 2002)
Las Cumarinas
Son compuestos fenólicos que proceden de la vía del ácido shiquímico, son 2H1-benzopiran-2onas, por lo cual son consideradas como lactonas de los ácidos 2-hidroxi-z-cinámicos. Las
cumarinas, han sido utilizadas con pacientes con cánceres avanzados, gracias a su actividad
inmunoestimulante, antioxidante y citotóxica (Bruneton, 2001).
10
Figura 2.Estructura general de las cumarinas (Pedrozo, 2001).
Los Quinoles
O también denominados hidroquinonas, son un grupo de fenoles simples, que son poco comunes
en la naturaleza y proceden de la vía del ácido shiquímico (Pedrozo, 2001). Se originan a partir de
la reducción de la quinona, las altas concentraciones de quinoles pueden ser de alta actividad
antioxidante, siendo que reaccionan directamente con los radicales libres volviéndolos estables
(Crane, 2001).
Figura 3. Estructura general de los quinoles (Pedrozo, 2001).
El ser humano puede obtener antioxidantes, mediante diferentes medios, especialmente
vegetales, mediante la obtención de extractos provenientes de las hojas de romero (Wang et
al.,2008&Mahmoud et al., 2005) y muy probablemente por medio de las hojas de las Asteráceas
de la tribu Senecioneae, del géneroPentacalia, que según los estudios de Pedrozo y colaboradores
(2006) y de Torrenegra et al (2004), presentan flavonoides y quinoles, que le pueden atribuir una
alta actividad antioxidante.
1.1.2. El romero
Clasificación taxonómica del romero (www.infojardin.com)







Reino: Plantae
División: Magnoliphyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Lamiales
Familia: Lamiaceae
Género: Rosmarinus
Especie: R. officinalis
11
Se ha demostrado que el romero, tiene una gran cantidad de propiedades medicinales, como
antiulcerogénico, anticancerígeno, antitumoral y con una alta actividad antioxidante (Mahmoud et
al., 2005).
Diferentes estudios, han reportado que el extracto del romero es muy efectivo para retardar la
ranciedad de la papa, y por lo menos se han aislado 12 fenoles diterpenos de ésta misma planta,
tales como carnosol, ácido carnósico, rosmanol y rosmaridifenol, lo que le atribuye su alta
actividad antioxidante (Wei & Ho, 2006).
Los estudios de Wang y colaboradores (2008), junto con los de Mahmoud y compañía (2005),
muestran que las hojas del romero presentan una alta actividad antioxidante, por la presencia de
metabolitos secundarios con alta actividad antioxidante, como quinoles y flavonoides, razón por la
cual, es aceptado como una de las especias vegetales con mayor actividad antioxidante.
1.1.3. Clasificación taxonómica de Pentacalia(Díaz-Piedrahita & Cuatrecasas, 1999).







Reino: Plantae
División: Magnoliphyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Asterales
Familia: Compositae – Asteraceae
Tribu: Senecioneae
Género: Pentacalia
1.1.3.1. Las Asteráceaso compuestas
Según los estudios de Albrecht (2003), las asteráceas son una de las familias más grandes y
diversas de angiospermas, normalmente son herbáceas, pero puede haber arbustos y árboles; se
encuentra distribuida de forma cosmopolita, debido a que las especies se han adaptado a todo
tipo de hábitats. Las hojas, que normalmente son alternas, pueden variar, desde simples a
compuestas, hasta en roseta; ésta familia se divide en subfamilias y tribus dependiendo del tipo de
inflorescencia, que suelen encontrarse en capítulo, con un receptáculo común, las flores son
altamente especializadas y reducidas, de formas tubulares o en forma acicular (Albrecht, 2003).
1.1.3.2. La tribu Senecioneae
Fue propuesta por Cassini en 1819, a pesar de encontrarse distribuida de forma cosmopolita; las
especies de ésta tribu se encuentran más frecuentes y más diversas en Suramérica, América
central, el sur de Africa y en las zonas tropicales (Díaz-Piedrahita & Cuatrecasas, 1999). Ésta tribu
se caracteriza por su hábito herbáceo, sus hojas que siempre alternas, con capítulos florales
homogamos de flores hermafroditas, o heterógamos con flores terminales femeninas, y con
corolas de color siempre amarilloso (Díaz-Piedrahita & Cuatrecasas, 1999).
En la tabla 1. Se pueden observar las especies pertenecientes a la tribu Senecioneae, a las cuales
se les han realizado pruebas de actividad antioxidante (AAO), junto con sus metabolitos
mayoritarios.
12
Tabla 1. Especies pertenecientes a la tribu Senecioneae a las cuales se les han realizado pruebas de
actividad antioxidante (AAO), junto con sus metabolitos mayoritarios.
Especie vegetal
Tribu: Senecioneae
Emilia sonchifolia
Gynoxys psilophylla
Lasiocephalus ovatus
Pentacalia americana
Psacalium radulifolum
Senecio argunensis
Senecio squalidus
Senecio gibbosus
Werneria poposa
Metabolito
Pruebas de
mayoritario
AAO
Flavonoides
DPPH
flavonoides
DPPH
Cumarinas
DPPH
Flavonoides
DPPH
Cacacol
DPPH
Flavonoides
DPPH
polifenoles
ABTS
Flavonoides
DPPH
Cumarinas y flavonoides
DPPH
Fuente
Patnibul et al., 2008
Rosas-Romero & Saavedra, 2005
Aquino et al., 2002
Mosquera et al.,2007
Garduño & Delgado, 2003.
Zhou et al., 2008
Mclnnis et al., 2006
Conforti et al., 2006
Lock Sing, 2004
1.1.3.3.El género Pentacalia, se ha registrado en los páramos de la región andina, las especies de
éste género, suelen ser un arbusto pequeño que alcanza hasta los 4m de altura, con hojas simples
y alternas; pecioladas, elípticas y coriáceas, con inflorescencia terminal o lateral, con capítulos
discoideos con flores radiadas, dónde las flores se insertan sobre un receptáculo común y suelen
presentar un color amarillo o blanco (Robinson & Cuatrecasas, 1993)(Ver anexo 1). Según los
estudios de Pedrozo (2001), de las plantas de Pentacalia en Colombia se han aislado cumarinas y
quinoles.
Pentacalia corymbosa, se distribuye entre los 2000 y 3500 metros de altitud, sin embargo, es más
abundante en el páramo, que en el subpáramo, es un arbusto de 0.80 a 4m de altura, se
caracteriza por sus inflorescencias terminales en racimo con aproximadamente 20 a 25 flores
hermafroditas ligeramente pubescentes en el dorso, con hojas alternas espatuladas de márgenes
enteros, y con ápice foliar agudo y de punta corta (Díaz-Piedrahita & Cuatrecasas, 1999). Según los
estudios de Torrenegra y colaboradores (2004), del extracto de hojas de la especie Pentacalia
corymbosa se ha obtenido el compuesto citotóxico jacarona, junto con otro tipo de quinoles.
Asimismo, en estudios realizados sobre ésta especie, se han obtenido quinoles, cumarinas y los
flavonoides quercetina y rutina (Pedrozo, et al. 2006), que se han caracterizado por sus altas
propiedades antioxidantes frente a los radicales libres del oxígeno, debido a que no sólo previenen
el daño oxidativo causado por el radical hidroxilo (HO·), por medio de la formación de agua, sino
que también se ha demostrado que previenen el daño causado por el superóxido (O-2) (Perez,
2003). Los quinoles o hidroquinonas, consisten en polifenoles que debido a la presencia de OH, se
oxidan fácilmente y presentan actividad antioxidante; se presentan como cristales con un punto
de fusión de 170°C. y al oxidarse, se va transformando a un color pardo oscuro (Yamaguchi et al.,
2006)
Pentacalia nitida, se distribuye entre los 2700 y 3800 metros de altitud, y se encuentra en el
páramo y en el subpáramo de Cundinamarca y de Arauca, que caracteriza por sus hojas opuestas y
13
anchas, con nervio prominente en el envés, siempre descubierto, y con un haz muy brillante; sus
inflorescencias se encuentran en racimos terminales muy ramificados, con aproximadamente 33 a
58 flores tubulosas, hermafroditas, blancas o amarillas (Díaz-Piedrahita & Cuatrecasas, 1999).
Según los estudios de Trillos (1992), de Pentacalia nitida, se han obtenido flavanonas, una mezcla
de ácidos grasos, un hidrocarburo y un esteroide. Las flavanonas, son un tipo de flavonoides que
debido a la presencia de OH en su estructura presentan una alta actividad antioxidante (Asai et al.
2008) Además los estudios de la joven investigadora del grupo de fitoquímica de la Pontificia
Universidad javeriana Diana A. Varela (2010), demostraron la presencia de glicósidos de
flavonoides y cumarinas en éstas plantas. En la tabla 2, se pueden observar las generalidades tanto
de Pentacalia corymbosa, como de P.nitida, como el nombre común, sus usos y los metabolitos
secundarios.
Tabla 2. Generlidades de P. corymbosa y P. nítida. (Díaz-Piedrahita & Cuatrecasas, 1999, Pedrozo,
et al. 2006, Trillos 1992, Varela 2010).
P. corymbosa
huashuin, panque,
chitaca, romero de
monte, romerillo
P. nitida
basguin, guasguin
Usos
antisifilítico
para contrarrestar
perturbaciones
Menstruales,
desinfectante
Metabolitos secundarios
quinoles, cumarinas, los
flavonoides quercetina
flavanonas, ácidos grasos
Hidrocarburo, esteroides.
Glicósidos de quinoles y
cumarinas.
Nombre común
y rutina.

ANTECEDENTES
2. Métodos para la evaluación de la actividad antioxidante
Debido a las consecuencias causadas por los radicales libres, se han realizado diferentes métodos
para evaluar la actividad antioxidante de diferentes componentes, a través de fuentes
generadoras de radicales libres, esto es debido a que un gran porcentaje de la oxidación es
inhibida por medio de la captura de los radicales libres (Mosquera et al., 2005). Según los estudios
de Huang y colaboradores (2005), existen diversos métodos para monitorear la actividad
antioxidante de diferentes compuestos,algunos basados en la transferencia del átomo de
hidrógeno denominados (HAT) y otros basados en la transferencia de electrones, denominados
(ET), donde se establece la capacidad del antioxidante, en la reducción del oxidante, el cual,
cambia su color al ser reducido.
14
Entre los métodos (ET) existe el 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH), el ácido 2,2’azinobis-(3etilbenzotiazolina)-6 sulfónico (ABTS) y la reacción con el óxido nitroso (test NO), entre otros.
Entre los métodos más empleados se utilizan el ABTS y el DPPH, debido a que ambos métodos
presentan una gran estabilidad, son simples y de rápido análisis (Fukumoto& Mazza, 2000), esto es
debido, a que ambos métodos presentan una reacción simple, que sólo involucran una reacción
entre el radical y el antioxidante; además ambos métodos tienen la ventaja de que pueden ser
utilizados en solventes orgánicos acuosos y nos polares, como es el caso del benzeno ( Cheng et
al., 2006). Sin embargo, se debe tener en cuenta que ambos métodos son artificiales, y que no
representan situaciones in vivo, pero se ha comprobado que ambos métodos sirven para
establecer un rango de actividad antioxidante (Villaño et al., 2007).
2.1. Método ABTS
Según los estudios de Antolovich y colaboradores (2002), éste método, es la versión mejorada del
método de capacidad antioxidante equivalente trolox (TEAC), principalmente establecido por
Miller y colaboradores (1993), el cual refleja la actividad relativa de los antioxidantes de donar
electrones al radical ABTS⁺ y donde los resultados son comparados frente al antioxidante sintético
Trolox, el método ABTS presenta una alta solubilidad en agua y una alta estabilidad química, es un
sustrato que al oxidarse con la presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2) genera el radical catión
ABTS⁺. Al establecer la habilidad del antioxidante para secuestrar el radical catión en la fase
acuosa, se debe monitorear por medio del espectrofotómetro a 734 nm, hasta el punto que la
absorbancia se vuelva estable(Antolovich et al. ,2002). Sin embargo, según los estudios de
Castañeda y colaboradores (2008), a diferencia en método DPPH, el método ABTS⁺ requiere de
una reacción previa.
2.2. Método DPPH
Éste método principalmente establecido por Brand-Williams y colaboradores (1995), es un método
colorimétrico simple, que reacciona directamente con el compuesto, por lo cual la reacción
depende de la conformación estructural del compuesto (Fukumoto& Mazza, 2000). El
fundamento de ésta prueba consiste en que el radical libre presenta un electrón de nitrógeno
desapareado, y se muestra de color azul-violeta, y cuando este radical libre se reduce por acción
del antioxidante y se estabiliza su acción oxidativa, su color se va decolorando hasta quedar de
color amarillo pálido ( Cheng et al., 2006). Según los estudios de Brand-Williams y colaboradores
(1995), el DPPH es un radical estable donde la reacción es:
DPPH⁺ + AH
DPPH-H + A⁺
AH hace referencia al antioxidante que va a donarle electrones al radical.
Según los estudios de Rao y colaboradores (2009), el DPPH funciona a temperatura ambiente,
acepta electrones de los antioxidantes para volverse estable, y hasta el momento, es el mejor
método para evaluar la actividad antioxidante de los polifenoles. Los resultados se pueden
observar entre 515 y 517nm, pasados unos 30 minutos aproximadamente, siendo que el cambio
15
del color del radical se puede observar en el pico de absorbancia de DPPH (Huang et al., 2005). La
eficiencia del antioxidante es medida a temperatura ambiente, de tal manera que se elimina el
riesgo de degradación térmica de las moléculas (Bondet et al., 1997).
El método utilizado, no debería gastar mucho tiempo, pero sí debería ser lo suficientemente
sensible para captar la actividad antioxidante sobre el radical (Choi et al, 2002).
3. Métodos para la identificación de los metabolitos secundarios
Según los estudios de Guzman y colaboradores (2008) todas las metodologías para la extracción e
identificación de metabolitos secundarios presentan las mismas etapas. Donde principalmente
por medio de la extracción continua con éter de petróleo se obtienen los compuestos de baja
polaridad, mientras que con la extracción continua con etanol, se obtienen los compuestos de baja
polaridad. Posteriormente, por medio de las pruebas químicas preliminares establecidas por Wall
y colaboradores (1952), se identifican los tipos de metabolitos secundarios presentes tanto en los
compuestos de alta polaridad, como en los compuestos de baja polaridad, y finalmente por medio
de la cromatografía se identifican los metabolitos secundarios presentes.
3.1. Cromatografías
Según los estudios de Domínguez (1975), la cromatografía proviene del griego Chroma-graphos,
Color-escritura, es un procedimiento físico-químico que permite separar los componentes de una
mezcla en movimiento, por adsorción o depósito y retención de los mismos sobre una superficie
estacionaria que puede ser un sólido o un líquido. Algunos componentes pueden ser adheridos
con mayor facilidad que otros y en distintas velocidades sobre la fase estacionaria, lo que permite
que estos se vayan separando. Para la separación e identificación de los metabolitos secundarios
de ambas especies de Pentacalia, se va a empleoel método de cromatografía en capa delgada,
donde se separan los compuestos por migración diferencial sobre una capa fina, teniendo en
cuenta, que los colores observados con la ayuda del revelador o por medio de la luz UV tienden a
ser morados ó amarillos cuando el extracto contiene flavonoides (Parra, 1980). Y que los quinoles
al oxidarse se van transformando a un color pardo oscuro (Yamaguchi et al., 2006). Para los
compuestos con mayor actividad antioxidante se empleó el método de cromatografía de gases
acoplado con espectrometría de masas (GC/MS), siendo que la cromatografía de gases, para la
separación junto con la espectrometría de masas para la identificación de los componentes del
extracto, es un método muy favorable para identificar los metabolitos secundarios del extracto
(Santos & Galceran, 2003).La mayor ventaja del método (GC/MS) consiste en separar e identificar
los compuestos mediante tiempos de retención, y por comparación de los espectros de masas
obtenidos, junto con los reportados en la base de datos como Wiley y Nist (McMaster, 1998).
16
OBJETIVO GENERAL
 Evaluar la actividad antioxidante de los extractos y de las fracciones extraídas de las hojas
de Pentacalia corymbosa y Pentacalia nítida.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Evaluar la actividad antioxidante de extractos y fracciones obtenidas de las hojas de
Pentacalia corymbosa y Pentacalia nítida, que va a ser compararla junto con la actividad
antioxidante de las hojas del rosmarinus officinalis y antioxidantes sintéticos como BHT y
Trolox.

Identificar los metabolitos secundarios mayoritarios de las hojas de Pentacalia corymbosa
y Pentacalia nitida en la fracción con mayor actividad antioxidante.
MATERIALES Y MÉTODOS. (Ver anexo 2.)
 IDENTIFICACIÓN METABOLITOS SECUNDARIOS.
4. El material vegetal y obtención de extractos totales
Para extraer los diferentes metabolitos secundarios de Pentacalia nítida y P. corymbosa,se realizó
la metodología utilizada por Guzman y colaboradores (2008) en el laboratorio de fitoquímica de la
Pontificia Universidad Javeriana (PUJ), mediante la cual, posterior a la recolección del material
vegetal, éste fue secado a temperatura ambiente, y posteriormente fue deshojado y triturado en
el molino de la universidad, para lograr así reducir el tamaño de las partículas de las hojas con las
que se iba a trabajar .Luego, el material vegetal obtenido fue pesado y posteriormente, por medio
de la extracción sólido líquido en soxhlet con éter de petróleo (petrol), se removieron las grasas
sobrantes y se obtuvieron los extractos de baja polaridad. Luego, con el material vegetal sobrante
en el soxhlet con etanol, se obtuvieron los extractos de alta polaridad.
En la siguiente etapa, cada extracto fue tratado independientemente, y se lleva a cabo el método
de filtración mediante el rotaevaporador a 40°C. Finalmente, el compuesto concentrado se pesó
en la balanza, para registrar los gramos obtenidos de cada extracto, y así obtener el % de
extracción : (peso inicial/ peso final) X 100.
El romero, debido a su alta actividad antioxidante (Wang et al., 2008& Mahmoud et al., 2005), fue
utilizado como control de la actividad antioxidante de las hojas de Pentacalia nítida y P.
corymbosa. Para esto, el romero triturado en el molino y pesado posteriormente, fue colocado en
un frasco con etanol, para así lograr una extracción discontinua (maceración) de sus compuestos al
mismo tiempo que se extraían los compuestos de las hojas de ambas Pentacalias.
17
4.1. Pruebas químicas preliminares
Posteriormente, tanto a los extractos en etanol, como a los de petrol, y al del romero, se le
realizaron pruebas químicas y físicas para determinar y comparar los metabolitos secundarios
aislados. Las pruebas químicas preliminares propuestas por Wall y colaboradores (1952), tanto
para los extractos de etanol, como para los extractos de petrol, para determinar los compuestos
encontrados en cada extracto, se resumen en las tablas 3 y 4 dependiendo del extracto
Tabla 3. Pruebas químicas preliminares propuestas por Wall y colaboradores (1952), para el
extracto en éter de petróleo.
Prueba
Lieberman Buchard
Salkowski
Baljet
Hidroxamato férrico
Reacción
Cambio de color a rosa (0´),
violeta (1´), azul (5´) y verde (20´)
Cambio de color a amarillo o rojo
Cambio de color a amarillo
Cambio de color café o violeta
compuestos
Esteroides y esteroles
Terpenos
terpenos y esteroles
sesquiterpenolactonas
Para realizar las pruebas químicas preliminares de la tabla 3 los extractos sedisolvieron en CHCl3,
hasta el punto que las reacciones químicas fueran lo suficientemente observables. El reactivo que
se leagrego a la muestra para la prueba de Lieberman Buchard consiste en 1 mL de CHCl3 + 1 mL
de anhídrido acético + 2 gotas de H2SO4. La prueba de Salkowski consistió en agregarle unas
gotas de H2SO4 a la muestra. Para la prueba de Baljet a la muestra se le agregó ácido pícrico +
NaOH, y para la prueba de hidroxamato férrico se leagregaron 2 gotas de solución MeOH 2N de
clorhidrato de hidroxilamina + 2 gotas de solución MeOH 2N de KOH, la muestra posteriormente
fue calentada en el baño de María y se acidulo con HCl 0.5N + 2 gotas de FeCl3 1%.
Tabla 4.Pruebas químicas preliminares propuestas por Wall y colaboradores (1952), para el
extracto en etanol.
Shinoda
Cloruro férrico FeCl3
Antrona
Dragendorff
Espuma
Flavonoides y
fenoles
Flavonoides y
Cambio de color a verde intenso
fenoles
Formación de anillo verde en la
Glicósidos de
interfase
flavonoides
Formación de un precipitado naranja
Alcaloides
Formación de espuma por más de (15´) Saponinas
Cambio de color a naranja o rojizo
18
Para realizar las pruebas químicas preliminares de la tabla 4, los extractos deben se disolvieron en
etanol. Para la prueba de Shinoda, se le agrego 1 cm. de Mg. + 2 gotas de HCl 2N. Para la prueba
del cloruro férrico, se le agregaron unas gotas de FeCl3. La prueba de Antrona, consistió en
agregarle Antrona disuelta en H2SO4 concentrado por pared. Para la prueba de Dragendorff, a la
muestra se le agregaron unas gotas del reactivo de Dragendorff + HCl. Y finalmente para la prueba
de espuma, a la muestra se leagrego agua, y posteriormente se agitó fuertemente. Lasreacciones
químicas que dieron como resultado el cambio de color, la formación de un precipitado o de
espuma, indicaron la presencia de los compuestos anteriormente nombrados.
5.Técnicas de separación
Las pruebas que se realizaron para determinar los metabolitos secundarios, consistieron en la
cromatografía de capa fina y de gases acoplada a espectrometría de masas, que permitieron
separar los componentes del extracto. La CG/MS únicamente se le realizó a las fracciones que
demostraron mayor actividad antioxidante.
5.1.Cromatografía de capa fina (C.C.F)
También denominada TLC por sus iniciales en inglés (Thin layer chromatography), consiste en la
separación de sustancias de una mezcla por migración diferencial sobre una capa delgada; es un
método rápido para separar de forma bien definida, compuestos estructuralmente muy parecidos
(Domínguez, 1975). La fase estacionaria de este tipo de cromatografía consistió en una placa
homogénea de algún aglutinante, que permita la separación de los componentes; fue utilizada la
sílica gel impregnada con fluoresceína, que retiene los componentes sobre la placa de vidrio
(www.depa.pquim.unam.mx). La fase móvil es líquida y consiste en un eluyente que asciende por
la placa arrastrando los componentes de manera ascendente, de tal manera que estos van
dejando marcas a medida que estos son separados. Los compuestos fluorescentes se localizaron
bajo la luz ultravioleta tanto corta (254nm.) como larga (360nm.), mientras quelas manchas
incoloras, se revelaron bajo agentes cromógenos, físicos ó químicos, que actúan sobre las
sustancias separadas por la cromatografía dándole coloraciones perceptibles a simple vista, donde
se utilizó vainillina al 1%, luego de rociar el reactivo, este se debe calentó a 110°C. por unos
segundos para observar los compuestos carbonizados (Domínguez, 1975).
Al extracto de etanol y al de éterse les realizó una cromatografía de capa fina, para observar los
posibles compuestos presentes. Para esto, 500mg. del extracto pétrol se solubilizaron en éter y la
muestra se agregó con la ayuda de capilares sobre la placa que contiene sílica gel, con la
precaución de que la mancha no sobrepasara los 3mm y a 1 cm. del extremo del borde inferior de
la placa, siendo que cada mancha estuviera separada de la otra por 1 ó 2 cm (Domínguez, 1975).
La placa con el extracto de éter, solubilizado en éter se ingresó en la cámara cromatográfica,
dónde la fase móvil consistía en hexano: acetato de etilo (7:3). Luego que el disolvente corriera
por la placa, ésta se sacó de la cámara, y se guardó el registro de las manchas a simple vista, bajo
luz UV corta, bajo luz UV larga, al agregarle vainillina al 1 % y luego de haber calentado por unos
segundos, cuando las manchas estuvieran carbonizadas, se estableció el RF (Retención en frente):
19
RF: Distancia recorrida por la muestra / Distancia recorrida por el disolvente.
Posteriormente, 500 mg. del extracto etanólico, se solubilizaron en pétrol, seguido por dicloro y
finalmente en acetato de etilo, donde a cada fracción se le realizó el mismo procedimiento de la
cromatografía en capa fina establecida anteriormente para el extracto pétrol. Teniendo en cuenta
que la fase móvil de la cámara cromatográfica es de hexano: acetato de etilo (7:3) para la fracción
EtOH-petrol, es de cloroformo: metanol (9:1) para la fracción EtOH-DCM, y para la fracción acetato
de etilo es cloroformo: metanol (8:2), que según los estudios de Domínguez (1975), son excelentes
mezclas de los disolventes para tener una buena resolución de los compuestos. Finalmente,
cuando las placas pasaron por la cámara cromatográfica, seregistraron los colores de las manchas
a simple vista, con luz UV corta, luz UV larga, al rociarle vainillina y cuando las manchas estaban
carbonizadas, lo que permitió establecer el RF de las manchas. Por medio de los colores de las
manchas y de sus cambios con el calentamiento, se pudo hacer un aproximamiento de los posibles
compuestos presentes en las diferentes fracciones.
El extracto de pétrol, primero se solubilizó en pétrol y posteriormente se le agregó acetona en
doble proporción de volumen, de tal manera, que pasadas 24 horas las grasas formaron un flóculo
por el cambio de polaridad
5.2. Fraccionamiento líquido-líquido.
El extracto etanólico se solubilizó en etanol y se le agregó un poco más del doble volumen de agua
destilada, para que por medio del cambio de polaridad se removieran las grasas sobrantes, de tal
manera que pasadas 24 horas, se formó un flóculo y se pudo filtrar el extracto de EtOH, el cual por
medio del fraccionamiento líquido-líquido con DCM y de su concentración por medio del
rotaevaporador a 40°C. permitió obtener la fracción de DCM, la cual antes de concentrar se filtró
con sulfato de sodio para remover el agua. Posteriormente el extracto sobrante fue sometido a
fraccionamiento líquido-líquido con acetato de etilo, y la fracción obtenida se concentró en el
rotaevaporador a 40°C. de tal manera que se obtuvo la fracción de acetato de etilo y finalmente el
extracto sobrante en EtOH posteriormente fue liofilizado, para remover el agua, se concentró en
el rotaevaporador a 40°C. y se obtuvo la fracción de etanol.
Posteriormente, tanto a la fracción de DCM, como a la de acetato de etilo, también se les realizó
una cromatografía en capa delgada, donde la cámara cromatográfica para ambas placas de sílica
gel era de cloroformo: metanol (8:2), registrando igualmente, los colores de las manchas a simple
vista, luz UV corta, luz UV larga, con vainillina y con calor.

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
6. Por medio del método DPPH
20
Posterior a la identificación de los posibles metabolitos secundarios que presentan propiedades
antioxidantes como quinoles, flavonoides y cumarinas, (Aruoma, 1996. Wei & Ho, 2006). Se
evaluó la actividad antioxidante tanto de todas las fracciones obtenidas, como del romero y delos
antioxidantes comerciales que se caracterizan por su alta actividad antioxidante (Krishnaiah et al.,
2010) y que fueron utilizados como control de la evaluación de la actividad antioxidante de las
diferentes fracciones. Para evaluar la actividad antioxidante, se utilizó el método desarrollado por
Brand-Williams y colaboradores (1995), donde se utiliza la prueba del radical libre 1,1-difenil-2picril-hidrazilo (DPPH).Principalmente se realizó una solución de DPPH con metanol por medio de
prueba y error, hasta que la absorbancia en el espectrofotómetro de luz UV Cary 100 a 515nm,
estuviera entre 0,7 y 0,8. Posteriormente se realizaron diluciones de 250, 500, 750, 1000 y 2500
ppm. de cada fracción y del romero de 250, 500, 750 y 1000 ppm., además de que se realizaron
diluciones de 50, 100, 150, 200, 250 y 300 ppm. del análogo de la vitamina E Trolox, y diluciones
de 150, 200, 250 y 300 ppm. del antioxidante sintético BHT, de éstos antioxidantes comerciales, se
utilizaron bajas concentraciones debido a que su concentración según la literatura debe ser de 250
ppm. (Krishnaiah et al., 2010). La solución de DPPH (975µ)+ se mezcló con la dilución de cada
muestra (25µ) y se monitoreo en el espectrofotómetro de luz UV a 515nm, durante 20 minutos,
hasta que la absorbancia se volviera estable (Huang et al., 2005&Sharififar et al. 2009).
Según los estudios de Sharififar y colaboradores (2009), junto con los de Wang y colaboradores
(2008), se debe obtener el porcentaje de inhibición del antioxidante y el % de DPPH remanente,
hasta el punto donde la absorbancia a 515 nm. se vuelva estable.
% inhibición: [(A. inicial – A. final) / (A. inicial)] X 100
% de DPPH rem: ( A.Final/A.inicial)X 100.
A. inicial, hace referencia a la absorbancia en tiempo 0 y A. final, hace referencia a la
absorbancia, pasados 20 min. ó 30 min. Cuando se llega a un estado estacionario, es decir,
que ya la absorbancia no cambia.
La actividad antioxidante se estableció por medio la eficiencia antiradical (AE), método propuesto
por Sánchez-Moreno y colaboradores (1998), donde se tiene en cuenta el método propuesto en
un principio por Brand-Williams et. al (1995) quienes definen la actividad del antiradical por medio
de la concentración necesaria del antioxidante para reducir la concentración inicial de DPPH a un
50 %, además de que se tiene en cuenta, el tiempo necesario para alcanzar ésta concentración
definido como tEC
AE: 1/(EC50 X tEC50)
EC50 hace referencia a la concentración necesaria del antioxidante para reducir la concentración
inicial de DPPH al 50% y tEC50 hace referencia al tiempo necesario para alcanzar ésta
concentración.
Entre mayor sea la eficiencia del antiradical, mayor será su actividad antioxidante (SánchezMoreno et al. 1998)
21
7. CG/MS a las fracciones con mayor actividad antioxidante
Finalmente para la identificación de los metabolitos secundarios de las fracciones con mayor
actividad antioxidante, se realizó la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
(GC/MS), por medio de un equipo de GC/MS (HP agilent 6850 acoplado a un detector de
espectrometría de masas HP Agilent 5975), con columna de HP5MS de 30M. X 0,25mm X 0,25 µm.
Donde la separación de los componentes por medio de la cromatografía de gases, es seguida por
la espectrometría de masas que establece el % de las posibles identidades de cada componente
(McMaster, 1998).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
 IDENTIFICACIÓN METABOLITOS SECUNDARIOS
8. Material vegetal y obtención de extractos totales
El material vegetal de Pentacalia nítida fue traído del páramo de Sumapaz, mientras que el
material vegetal de Pentacalia corymbosa, fue traído del páramo de Guascas, ambos en
Cundinamarca, Colombia y con una altitud entre 3600 y 4000 m.s.n.m.Los gramos del peso seco
inicial, junto con los gramos de la fracción de pétrol y de DCM de P. corymbosa, fueron
suministrados gracias a la colaboración de la joven investigadora del grupo de fitoquímica de la
Pontificia Universidad Javeriana, Ana Paola Romero, quien se encontraba trabajando con ésta
misma planta. Mientras que los gramos de la P.nitida, fueron obtenidos por medio de la
trituración de las hojas, seguido por la extracción sólido-líquido en soxhlet y por su concentración
en el rotaevaporador a 40°C. Siendo que ambas plantas fueron traídas de páramo, que es donde
se suelen encontrar las Pentacalias (Robinson & Cuatrecasas, 1993), son plantas que tienen gran
cantidad de grasas, por lo cual, estas fueron desengrasadas previamente, las hojas deP. corymbosa
fueron desengrasada por medio de su inmersión en cloroformo durante 5 min. El romero, que va a
ser utilizado como control de la actividad antioxidante, debido a su alta actividad (Wang et al.,
2008& Mahmoud et al., 2005), es tratado independientemente y fue traído de la plaza de mercado
Codabas de la 170 en Bogotá.
En la tabla 5, se puede observar el peso seco inicial de cada planta, seguido por el peso del
extracto de pétrol y de etanol posterior a su concentración, el peso seco final del material vegetal
seco y la eficiencia de la concentración.
Tabla 5.Resultados iniciales de las hojas de Pentacala nítida, P. corymbosa y R. officinalis.
Especie
vegetal
P. corymbosa
P. nitida
R. officinalis
Peso seco
inicial
359.4
500.3
253.8
peso extracto
petrol
10.2
14.3
Eficiencia
extracción
278,00%
2,79%
peso extracto
etanol
128.7
190.4
89.7
Eficiencia
extracción
35,8 %
38 %
35,3 %
22
La eficiencia de la extracción, mostrada en la tabla 5, demuestra que todas las plantas tuvieron
una eficiencia de extracción mayor al 30% con el extracto de etanol y una eficiencia menor al 20%
con el extracto de petrol, sin embargo, el romero es el que tiene una menor eficiencia, esto
probablemente se debe al modo en el que se realizó la extracción, siendo que a ambas Pentacalias
se les realizo la extracción por medio del soxhlet, que puede tener una mayor eficiencia de
extracción.
8.1. Pruebas químicas preliminares
Las pruebas químicas preliminares establecidas por Wall y colaboradores (1952), se lerealizaron
tanto a los extractos de petrol, como a los extractos de etanol de ambas Pentacalias, como al
romero.
Se debe tener en cuenta que las pruebas de Lieberman-Buchard, de Salkowski, de Baljet y de
Hidroxamato férrico, están establecidas especialmente para los extractos de baja polaridad, por lo
cual, los extractos que pasaron por éstas pruebas fueron diluidos en CHCl3. Mientras que las
pruebas de Shinoda, Cloruro férrico, Antrona, Dragendorff y de espuma, están establecidas
especialmente para los extractos de alta polaridad, por lo cual, los extractos que fueron sometidos
a estas pruebas fueron disueltos en etanol. La tabla 5, demuestra los resultados obtenidos
después de realizar las pruebas químicas preliminares a los diferentes extractos con su respectivo
solvente, y al romero que se encontraba en etanol.
Tabla 6. Resultados de las pruebas químicas preliminares, de las Pentacalias y del romero.
P. nitida
P. corymbosa
Romero
Extracto
Extracto
Extracto
Extracto
Extracto
Prueba
Compuesto
Petrol
Etanol
Petrol
Etanol
Etanol
Lieberman
Buchard
Esteroides y esteroles
x
--x
--x
Salkowski
Terpenos
x
x
x
x
x
Baljet
Terpenos y esteroles
x
x
x
x
x
Hidroxamato
férrico
Sesquiterpenolactonas
--x
x
----Shinoda
Flavonoides y fenoles
------x
x
Cloruro férrico Flavonoides y fenoles
--x
--x
x
Glicósidos de
Antrona
flavonides
--x
--x
x
Dragendorff
Alcaloides
----------Espuma
Saponinas
-----------
Por medio de los resultados registrados en la tabla 6 de las pruebas establecidas para los extractos
de baja polaridad, se demuestra una reacción química de un cambio de color de los extractos
disueltos en CHCl3 tanto para la prueba de Lieberman Buchard, como para la prueba de Salkowski
y de Baljet. Lo que permite establecer la presencia de terpenos (Ordoñez et al.,2006) , tanto para
los extractos de Pentacalia nítida, como para los de P. corymbosa. Además de la presencia de
23
terpenos en el extracto de romero. Sin embargo, la prueba de Hidroxamato férrico, para observar
la presencia de sesquiterpenolactonas, únicamente demostró un cambio de color positivo en el
extracto etéreo de P. corymbosa.
Los resultados de las pruebas establecidas para los extractos de alta polaridad, demuestran la
presencia de flavonoides y fenoles, tanto para el extracto en etanol de P. corymbosa, como para el
de P. nítida y de romero, esto debido a un cambio de color en la prueba de Shinoda para el
extracto de P. corymbosay de romero. Además la prueba de cloruro férrico para observar la
presencia de flavonoides y fenoles (Ordoñez et al.,2006), y la prueba de Antrona para verificar la
presencia de glicósidos de flavonoides, dieron positivas para los extractos en etanol de ambas
Pentacalias y del romero, lo que permite establecer la presencia de estos compuestos tanto en lo
extractos etanólicos de las Pentacalias, como en los del romero.
Sin embargo, las últimas pruebas para verificar la presencia de saponinas y alcaloides, no
demostraron ninguna reacción química, lo que permite establecer la ausencia de estos
compuestos en los extractos.
9. Técnicas de separación.
Debido a que en ya se tienen los resultados de los compuestos de Pentacalia corymbosa, gracias a
la Joven investigadora del grupo de fitoquímica Ana Paola Romero. Las técnicas de separación
únicamente se le realizaron a los extractos de Pentacalia nítida.
9.1. Cromatografía en capa fina (C.C.F.) de extractos totales.
De la tabla 7 a la 10, se pueden observar los resultados obtenidos por medio de la cromatografía
en capa delgada de los extractos totales, donde se registraron los colores observados mediante la
luz visible, la lus UV corta, Uv larga, vainillina y con el efecto del calor, además de los valores de Rf
obtenidos
Tabla 7. Resultados de cromatografía en capa fina del extracto pétrol con fraccionamiento sólido
líquido con pétrol. Con fase móvil hexano: acetato de etilo (7:3). Fase estacionaria: sílica gel. Ver
anexo 3A.
REVELADORES
Valores de Rf
Luz visible
UV corta
UV larga
Vainillina
Calor
0,69
amarillos
mancha
mancha
amarillos
amarillo
0,61
oscura
oscura
verde
verde
0,53
verdes
rosado
0,46
verde
rosado
0,3
amarillo claro
claro
amarillo
24
Tabla 8. Resultados de cromatografía en capa fina del extracto etanólico con fraccionamiento
sólido líquido con petrol. Con fase móvil hexano: acetato de etilo (7:3). Con fase estacionaria: sílica
gel. Ver anexo 3B.
REVELADORES
Valores de Rf
0,68
0,59
0,39
0,31
Luz visible
verde
amarillo claro
UV corta
UV larga
Vainillina
mancha
mancha
verde
Calor
verde
amarillo
amarillo
amarillo
oscura
mancha
oscura
oscura
mancha
oscura
intenso
amarillo
morado
morado
Tabla 9. Resultados de cromatografía en capa fina del extracto etanólico con fraccionamiento
sólido líquido con DCM. Con fase móvil cloroformo: metanol (9:1). Fase estacionaria: sílica gel. Ver
anexo 3C.
Valores de Rf
0,84
0,69
0,61
0,46
0,23
0,15
0,1
0,07
Luz visible
verdeamarillo
REVELADORES
UV corta
UV larga
verde
verde
Vainillina
verde
Calor
verde
morado
morado
morado
morado
morado
morado
azul
morado
naranja
Tabla 10. Resultados de cromatografía en capa fina del extracto etanólico con fraccionamiento
sólido líquido con acetato de etilo. Con fase móvil cloroformo: metanol (8:2). Fase estacionaria:
sílica gel. Ver anexo 3D.
Valores de Rf
0,92
0,61
0,46
0,38
0,23
Luz visible
verde
amarillo
amarillo
REVELADORES
UV corta
verde
UV larga
mancha
oscura
morado
mancha
Vainillina
verde
Calor
verde
amarillo
amarillo
amarillo
morado
azul
rosado
25
0,07
oscura
naranja
amarillo
Las cromatografías de capa fina, que se muestran de la tabla 7 a la 10, fueron realizadas sobre una
fase estacionaria de sílica gel, lo que permite la buena separación de aldehídos, cetonas,
alcaloides, azúcares, fenoles, esteroides, terpenoides, ácidos grasos y aminoácidos (Domínguez,
1975). La presencia de flavonoides se pueden observar de colores morados y amarillos con un Rf
de 0,3. Diversos estudios realizados sobre Pentacalia, han demostrado la presencia de flavonoides
(Pedrozo, et al. 2006. Trillos, 1992). Las manchas de los quinoles, en la cromatografía, se
muestran desde un amarillo ocre hasta colores azulosos o oscuros, con un Rf cercano a 0.4
(Santana, 2010. Pedrozo, 2001) como se demuestra en los resultados de la tabla 10, la mancha
azul, con un Rf de 0.38.Además, según los estudios de Pedrozo (2001), las cumarinas bajo la luz UV
de onda larga, muestran una mancha intensa, como se muestra en la tabla 10, al presentar un
color morado bajo la luz UV de onda larga.
9.2. Fraccionamiento líquido-líquido.
Tabla 11. Resultados de las fracciones de P.nitida
líquido-líquido
Fracciones
del extracto
Extractos Peso inicial Peso flóculo etanólico
Pétrol
12,3
6,8 gr = 55% Pétrol
EtOH
185,4
25,66 gr. = DCM
14%
AcOEt
EtOH
obtenidas por medio del fraccionamiento
Peso de fracciones
2,8 gr.
46,5 gr.
39,4 gr.
1 gr.
% de extracción
23%
25%
21%
0,5%
La tabla 11, nos permite observar los % de la extracción por medio de la extracción líquido-líquido
para obtener las diferentes fracciones, además del % del peso del flóculo, que es una porción
amorfa de las grasas sobrantes de los extractos, lo que demuestra que a pesar de que al comienzo
ambas plantas fueron desengrasadas, éstas todavía conservaban grasas.
A pesar de que se puede observar de que por medio del fraccionamiento líquido-líquido, todas las
fracciones superan el 20% de su extracción, la fracción de EtOH se demoró demasiado
liofilizándose, lo que no hizo posible tener los gramos finales de la fracción.
9.3.Cromatografía en capa fina (C.C.F.) de fracciones.
Tabla 12. Resultados de cromatografía en capa fina de la fracción DCM. Con fase móvil cloroformo:
metanol (8:2). Fase estacionaria: sílica gel. Ver anexo 4A.
Valores de Rf
Luz visible
REVELADORES
UV corta
UV larga
Vainillina
Calor
26
0,91
mancha
larga
0,83
cafémorado
azul
0,16 amarillo
claro
azulmorado
amarillo
claro
Tabla 13. Resultados de cromatografía en capa fina de la fracción Acetato de etilo. Con fase móvil
cloroformo: metanol (8:2). Fase estacionaria: sílica gel Ver anexo 4B.
REVELADORES
Valores de Rf
Luz visible
0,78
UV corta
UV larga
Vainillina
mancha
Calor
Morado
claro
oscura
0,58
Morado
claro
mancha
oscura
0,05 amarillo
claro
mancha
oscura
amarillo
amarillo
ocre
Según los estudios de Pedrozo 2001, las cumarinas pueden apagar la fluorescencia, al verse como
unas manchas largas bajo la luz UV, como se puede observar en la tabla 12 de la C.C.F. de la
fracción de DCM bajo la luz UV de onda larga. Las cumarinas con la vainillina se pueden apreciar de
color azul (Pedrozo, 2001), como se puede observar en la tabla 12 en la macha de color azul con
vainillina, que se pasa al color morado bajo el efecto del calor. La tabla 13, nos demuestra la
posbile presencia de quinoles siendo, que según los estudios de Pedrozo 2001 y de Santana 2010,
con el calor posterior a agregada la vainillina, los quinoles se pueden observar de un color amarillo
ocre, como se puede observar en la C.C.F. de la fracción de acetato de etilo bajo el efecto del
calor.Ambas cromatografías en capa fina nos demuestran la posible presencia de quinoles y de
cumarinas, y muy probablemente de glicósidos de quinoles y cumarinas.
10. Resultados de la actividad antioxidante.
Uno de los métodos más utilizados para evaluar la actividad antioxidante de diferentes
compuestos por medio del radical DPPH, reportan los resultados por medio de la eficiencia
Antiradical (AE), un parámetro propuesto por Sánchez-Moreno y colaboradores (1998), donde se
tiene en cuenta el método propuesto en un principio por Brand-Williams et. al (1995) que consiste
27
en la concentración necesaria del antioxidante para disminuir la concentración inicial de DPPH al
50% (EC50), además del tiempo necesario para alcanzar ésta concentración (tEC50).
Para evaluar la actividad antioxidante de los extractos se utilizó la eficiencia antiradical, la cual fue
planteada desde la gráfica de % de DPPH remanente, como desde la gráfica del % de inhibición del
radical DPPH, como se puede observar en la tabla 14 y de la gráfica 1 a la 6. En el anexo 5, se
pueden observar dichas gráficas de las fracciones con mayor actividad antioxidante y de los
extractos totales de Pentacalia nítida y de P. corymbosa.
Tabla 14. Resultados de la Actividad antiradical de ambas Pentacalias, del romero, del antioxidante
sintético BHT y del análogo de la vitamina E (Trolox).
% DPPH rem.
t EC (min.) EC50
AE X 10E6
% de inhibición
EC50
AE X 10E10
P.nitida
Extracto total
Fracción pétrol
fracción DCM
Fracción AcOEt
Fracción EtOH
9
12
10
18
15
5453
11171
2363
2116
3309
20,3
7,4
42,2
26,3
20,1
3638
5669
2363
2116
3669
30,5
1,4
42,23
26,3
18,1
P. corymbosa
Extracto total
Fracción pétrol
Fracción DCM
18
15
9
1478
44677
24538
37,5
1,4
4,5
1347
10578
12383
41,12
6,3
9
Romero
12
685,37
121,0
720,34
115
BHT
18
2479
22,4
2503
22,1
Trolox
6
234,14
718,0
231,3
720
28
Eficiencia antiradical X10E6
AE % DPPH rem.
800
700
600
500
400
300
200
100
00
Eficiencia antiradical X10E6
Gráfica de 1. Eficiencia antiradical según el % de DPPH remanente, para ambas Pentacalias, el
romero, el BHT y el Trolox
800
700
600
500
400
300
200
100
0
AE % inhibición
Gráfica 2. Eficiencia antiradical según el % de inhibición del DPPH, para ambas Pentacalias, el
romero, el BHT y el Trolox.
Como se puede observar en la gráfica 1 y 2, el trolox es el que mayor eficiencia antiradical
presenta, por lo cual es muchas veces es utilizado como control de la actividad antioxidante de
diferentes extractos (Krishnaiah et al., 2010). Sin embargo, el BHT, mostro una eficiencia
antiradical muy baja para ser un antioxidante sintético, lo que corrobora la búsqueda de
antioxidantes naturales (Antolovich, et. al, 2002)
29
Eficiencia antiradical X10E6
AE % DPPH rem.
140
120
100
80
60
40
20
00
Gráfica 3. Eficiencia antiradical del antiradical según el % de DPPH remanente para ambas
Pentacalias comparadas con el romero.
Eficiencia antiradical X 10E6
AE % inhibición
150
100
50
0
Gráfica 4. Eficiencia antiradical según el % de inhibición de DPPH para ambas Pentacalias,
comparadas con el romero.
En las gráficas 3 y 4, se puede observar con mayor claridad la eficiencia antiradical de ambas
Pentacalias, además de que se observa claramente la alta actividad que presenta el romero, esto
muy probablemente se debe a los compuestos fenólicos que se encuentran en la parte foliar de
ésta planta tales como flavonoides y quinoles, además de carnosol, ácido carnósico, rosmanol y
rosmaridifenol, que le atribuyen una alta actividad antioxidante (Wei & Ho, 2006). Además se
puede observar que los extractos totales de ambas Pentacalias presentan una actividad
antioxidante relativamente baja frente a las hojas del romero.
30
Eficiencia antiradical X 10E6 l
AE Pentacalias por % DPPH rem.
45
40
35
30
25
20
15
10
05
00
Series1
Gráfica 5. Eficiencia antiradical de Pentacalia nítiday P. corymbosa según el % de DPPH remanente.
Eficiencia antiradical X 10E6
AE Pentacalias por % de inhibición
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Gráfica 6. Eficiencia antiradical de Pentacalia nítida y P. corymbosa por % de inhibición del radical
DPPH.
En la gráfica 5 y 6, podemos observar la eficiencia antiradical de ambas Pentacalias, tanto de sus
extractos totales, como de las diferentes fracciones. Se puede establecer que Pentacalia nítida,
presenta la mayor eficiencia antiradical, muy probablemente por la presencia polifenoles como
flavonoides (Trillos 1992), además de la presencia de glicósidos de quinoles y cumarinas (Varela,
2010) que le pueden atribuir su alta actividad antioxidante, que se puede apreciar especialmente
en la fracción de DCM, Acetato de etilo y en la fracción etanólica, que presentan los compuestos
más polares. Mientras que la fracción de pétrol de ambas Pentacalias mostraron una eficiencia
antiradical muy baja, probablemente debido a que presenta compuestos con una eficiencia
antiradical muy baja o nula. Aunque P.nitida presento una mayor actividad antioxidante en sus
31
fracciones, P.corymbosa, demostró una mayor actividad antioxidante en su extracto total, lo que
muy probablemente se deba a la presencia de quinoles, cumarinas y flavonoides (Pedrozo, et al.
2006). Sin embargo las fracciones de ésta planta demostraron una actividad antioxidante
relativamente baja. Hay que tener en cuenta que los métodos para medir la actividad antioxidante
de diferentes compuestos son extremadamente sensibles y dependientes de las condiciones
utilizadas y de los productos monitoreados (Fukumoto& Mazza, 2000).
La acción antioxidante de los extractos también se puede observar cuando el radical DPPH se
reduce por la acción del antioxidante y su color púrpura se va decolorando hasta alcanzar un color
amarillo pálido (Cheng et al., 2006).(Ver anexo 6)
11. GC/MS de las fracciones con mayor actividad antioxidante
En la tabla 15 y 16 se puede observar la normalización de la GC/MS de las fracciones con mayor
actividad antioxidante, donde se tienen en cuenta los compuestos con mayor % de área superior a
0,91 y con un % de similitud mayor al 80%. (ver anexo 7 y 8)
Tabla 15. Normalización de los compuestos mayoritarios se la GC/MS de la fracción de DCM del
extracto etanólico de Pentacalia nítida.
N.Pico t retención
Área
compuesto
% de similitud
1
4,172
1,17
Eucaliptol
64
2
5,612
0,71
tri-(metil)-biciclo(2.2.1) Heptano
96
3
10,346
0,75
2-Amino-4-metilpiridina fenol, 3-amino35
4
10,637
1,06
Bencenoacetico acido, 2,5-dihydroxy90
5
10,68
1,84
Bencenoacetico acido, 2,5-dihydroxy86
6
11,130
3,13
Bencenoacetico acido, 2,5-dihydroxy83
7
11,908
4,16
1H-Imidazol-2-metanol
41
8
11,993
2,23
Benzaldehido 4-hidroxy-3,5-dimetoxy91
9
12,766
1,07
1,3,2-Dioxaborolano, 2-etilo
43
10
15,371
0,91
3,5-Dimethoxy-4-hydroxy cinamaldehido
94
11
15,446
11,92
2-Penteno, 1-(2,4,6-tri hidroxifenil)
53
12
15,657
21,3
2,6-Aminoantraquinona
55
13
18,993
3,01
acido Hexanodioico, bis 2-ethylhexyl ester
95
ácido 1,2-Bencenodicarboxílico , mono (2-ethylhexyl)
14
20,227
2,02
ester
91
Tabla 16. Normalización de los compuestos mayoritarios de la GC/MS de la fracción de Acetato de
etilo del extracto etanólico de Pentacalila nitida
Picos
1
2
3
t retención
9,859
10,632
11,130
Área
14,46
25,84
10,34
compuesto
D-Alosa
acido Bencenoacetico , 4-hydroxyfenol
% de similitud
90
58
45
32
4
5
6
11,490
11, 9114
15,440
19,65
11,14
7,62
beta.-D-Glucopiranosa, metil
3-(2-Hidroxi Ciclopentil)-tiofeno
Tiofeno, 2-isobutil-5-isopentil-
43
43
53
A pesar de la posible presencia de quinoles, de cumarinas y de glicósidos de glicósidos y
cumarinas, estos fueron compuestos muy difíciles de verificar por medio de la cromatografía de
gases acoplada a la espectrometría de masas.
Sin embargo, cuando los compuestos presentan más de un grupo hidroxilo presentan una alta
actividad antioxidante (Fukumoto& Mazza, 2000).
CONCLUSIONES





Se identificó la posible presencia de flavonoides y cumarinas en la fracción de DCM del
extracto etanólico de Pentacalia nítida.
Se identificó la posible presencia de quinoles en la fracción de acetato de etilo del extracto
etanólico de Pentacalia nítida
Los extractos totales de Pentacalia nítida y de Pentacalia corymbosa, presentaron
actividad antioxidante frente al radical DPPH.
Las fracciones de diclorometano y de acetato de etilo del extracto etanólico de Pentacalia
nítida, fueron las que presentaron la mayor actividad antioxidante, en especial la fracción
de diclorometano.
Frente a el extracto total del romero, los extractos totales de Pentacalia nítida y Pentacalia
corymbosa presentaron una eficiencia antiradical relativamente baja.
RECOMIENDACIONES


En lo posible, evaluar la actividad antioxidante todas las muestras el mismo día, siendo
que el método DPPH es altamente dependiente de las condiciones utilizadas(Fukumoto&
Mazza, 2000).
Realizar también el método ABTS sobre los extractos, siendo que generalmente los
compuestos con alta actividad antioxidante demostrada por el método DPPH también lo
demuestran por el método ABTS (Fukumoto& Mazza, 2000).
33
BIBLIOGRAFÍA
1. ALBRECHT, Kirsten. 2003. Tropical flowering plants, a guide to identification and
cultivation. ED timber press. Portland, Cambridge. Pp: 128.
2. ANTOLOVICH, M. PRENZLER, P.D. PATSALIDES, E. McDONALD, S. ROBARDS, K. 2002.
Methods for testing antioxidant activity. Critical review the analyst. Vol 127. Pp: 183-198.
3. AQUINO, R. MORELLI, S. TOMAINO, A. PELLEGRINO, M. SAIJA, A. GRUMETTO, L. PUGLIA, C.
VENTURA, D. BONINA, F. 2002. Antioxidant and photoprotective activity of a crude extract
of Culcitium reflexum H.B.K. leaves and their major flavonoids. Journal of ethnopharmacology. Vol 79 Pp 183-191.
4. ARUOMA, O.1996. Characterization of drugs as antioxidant prophylactics. Free radical
biology and medicine. Vol.20. N.5 Elsevier. Pp 675-705
5. ASAI, T. HARA, N. KOBAYASHI, S. KOHSHIMA, S. FUJIMOTO, Y. 2008. Geranylated
flavanones from the secretion on the surface of the immature fruits of Paulownia
tomentosa. Phytochemistry. Vol 69 Pp: 1234-1241.
6. AVELLO,M. & SUWALSKY,M. 2006. Radicales libres antioxidantes naturales y mecanismos
de protección. Atenea 494. II semestre. Chile. Pp 161-172.
7. BRAND-WILLIAMS, W.; CUVELIER, M. E. AND BERSET, C. 1995. Use of a Free Radical
Method to Evaluate Antioxidant Activity. Lebensm. Wiss. u.Technol. vol 28, 25-30.
8. BRUNETON, Jean. 2001. Farmacognosia, fitoquímica. Plantas medicinales. ED Acriba.
Spain. PP: 261-265.
9. BONDET, V. BRAND-WILLIAMS, W. BERSET, C. 1997. Kinetics and mechanisms of
antioxidant activity using DPPH free radical method. Lebensm. Wiss. u.Technol. vol 30,
609-615.
10. CASTAÑEDA, C.B. RAMOS, LL. E. IBAÑEZ, B. L. 2008. Evaluación de la capacidad
antioxidante de siete plantas medicinales peruanas. Revista horizonte médico. Vol 8 N. 1
Julio 2008. Pp 56-72.
11. CASSINI, H. 1819.Sur la famille des Synanthérées contenant les caracteres des tribus. J.
Phys. Chim. Hist. Nat. Arts. 88, 190–204.
12. CHENG, Z. MOORE, J. YU,L. 2006. High-throughput relative DPPH radical scavenging
capacity assay. Journal of agricultural and food chemistry. Vol 40. Pp: 1-7.
13. CHOI,C. KIM, S. HWANG, S. CHOI, B. AHN, H. LEE,M. PARK, S. KIM, S. 2002. Antioxidant
activity and free radical scavenging capacity between Korean medicinal plants and
flavonoid by assay-guided comparision. Plant science: September 2002. Vol. 163 Pp 11611168.
14. CONFORTI, F. MARRELLI, M. STATTI,G. MENICHINI, F. Antioxidant and cytotoxic activities
of methanolic extracts and fractions from Senecio gibbosus sub. Gibbosus (GUSS). Natural
products research. Vol 20. Pp: 805-812.
34
15. CRANE, F.L. 2001. Biochemical functions of Coenzyme Q10. Journal of the American
College nutrition. Vol 20. Pp 591-598.
16. DEUSCHLE, A. CAMARGO, T. FRANCESCATO, L. ALVES, S. HEINZMANN, B. 2006.
Antomicrobial activity of Senecio desiderabilis vellozo (Asteráceae). Acta farm. Bonarense
25 (3). Pp: 356-359.
17. DÍAZ-PIEDRAHITA, S. & CUATRECASAS, J. 1999. Asteraceas de la flora de Colombia
Senecioneae-I génerosDendrophorbium y Pentacalia. ED: Academia colombiana de
ciencias exactas, físicas y naturales. Pp: 241-285.
18. DOMÍNGUEZ, X.A.1975.Cromatografía en papel y en capa delgada.Programa regional de
desarrollo científico y tecnológico del departamento de asuntos científicos de la
organización de los estados americanos. Pp: 35- 58.
19. FUKUMOTO, L. R. & MAZZA, G. 2000. Assesing antioxidant and prooxidant activities of
phenolic compounds. Journal of agriculture and food chemistry. Vol 48 Pp: 3597-3604.
20. GARDUÑO, M.L. & DELGADO, G. 2003. New eremophilanoids from the roots of Psacalium
radulifolium. Hypoglycemic, antihyperglycemic and antioxidant evaluations. Journal of the
Mexican society. Vol 47. Pp: 160-166.
21. GUZMAN, A.J., TORRENEGRA, R.D., RODRÍGUEZ ,O.E. 2008. Flavonoides de Chromolaena
subscandens (Hieron). Revista de productos naturales. Vol 2, No1 Artículos cortos. Depto
de Química de la Universidad Distrital de Colombia y de la Pontificia Universidad javeriana.
Bogotá, Colombia PP: 2-5
22. HERCBERG,S. GALAN, P. PREZIOSI, P. ALFAREZ, M-J. VAZQUEZ, C.1998. The potential role
of antioxidant vitamins in preventing cardiovascular disease and cancers. Nutrition vol. 14
No. 6. El sevier.pp 513-521.
23. HODEK,P. TREFIL, P. STIBOROVÁ. 2001. Flavonoids-potent and versatile biologically active
compounds interacting with cytochromes p450. Chemico-biological interactions. Vol. 139.
El sevier. Pp 1-21.
24. HUANG, D. OU, B. PRIOR, R.L. 2005. The chemistry behind antioxidant capacity assays.
Journal of agricultural and food chemistry. Vol 53 pp: 1841-1856.
25. Infojardin. www.infojardin.com. [ficha Rosmarinus officinalis][Consultado en septiembre
02- 2010] Disponible en: http://fichas.infojardin.com/arbustos/rosmarinus-officinalisromero.htm
26. KRISHNAIAH, D. SARBATLY, R. NITHYANANDAM, R. A review of the antioxidant potential of
medicinal plant species. Food and bioproducts processing. Vol XXX. Pp: 1-17.
27. LOCK SING, O.R. 2004. Diversidad química del género Werneria. XII congreso ItaloAmericano Di etnomedicina. Pp: 36.
28. MAHMOUD, A. AL-SHIHRY, S. SON,B. 2005. Diterpenoid quinines from Rosemary
(Rosmarinus officinalis). Phytochemistry. Vol 66. Pp 1658-1690.
29. MARTÍNEZ-FLÓREZ, S. GONZÁLEZ-GALLEGO, J. CULEBRAS, JM. TUÑÓN, MJ. 2002 Los
flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes. Nutrición hospitalaria. XVVII PP 271278.
30. McLNNIS, S.M. EMERCY, D.C. PORTER, R. DESIKAN, R. HANCOCK, J.T. HISCOCK, S.J. 2006.
The role of stigma peroxidases in flowering plants: insights from further characterization
of a stigma-specific peroxidase (SSP) from Senecio squalidus (Asteraceae). Journal of
experimentation botany. Vol 8 Pp: 1835-1846.
31. McMASTER, M.C. 1998.GC/MS a practical user´s guide. ED: Wiley-VCH. Pp: 3-9.
35
32. MILLER,N,J. RICE-EVANS, C. DAVIES, M. GOPINATHAN, V, MILNER, A. 1993. A novel
method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring antioxidant
status in premature neonates. Clin. Sci, vol 84 Pp: 407-412.
33. MOSQUERA, O.M. NIÑO, J. CORREA Y.M. BUITRAGO D. C. 2005. Estandarización del
método de captura de radicales libres para la evaluación de la actividad antioxidante de
extractos vegetales. Scientia et Technica Año XI, No 27, Abril 2005. Pp 231-234.
34. MOSQUERA, O.M. CORREA, Y.M. BUITRAGO, D.C. NIÑO, J. 2007. Antioxidant activity of
twenty five plants from Colombian biodiversity. Grupo de biotecnoglogía de productos
naturales. Pereira. Vol 97. Pp: 1-4.
35. ORDOÑEZ, P. VEGA, M. MALAGÓN, O.2006. Estudio fitoquímico de especies vegetales
nativas utilizadas en la medicina tradicional de la provincia de Loja. Lyonia, a journal of
ecology and application. Vol 2, Pp 65-71.
36. PARRA, L.M.1980. Estudios cromatográficos de compuestos fenólicos en plantas de café.
Trabajo de grado Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias. Post-grado.
37. PATNIBUL, S. PUANGMALAI, S. MOUNG, A. SRIPRANG, S. 2008. Screening for antioxidant
activity in eighteen local Northeastern vegetables using silica gel thin-layer
chromatography followed spraying with DPPH. NU science journal. Vol 5 Pp: 1-6.
38. PEDROZO J.A. TORRENEGRA R.D. TELLEZ A. N. GRANADOS. A. 2006. Nueva fuente de
quinoles, la superficie foliar de Pentacalia ledifolia y Pentacalia corymbosa y sus
propiedades antifúngicas. Revista brasilera de farmacognosia. Vol. 16. PP: 591-595.
39. PEDROZO PEREZ, J.A. 2001. Química y propiedades antimicrobianas de plantas autóctonas
de páramos colombianos. Pontificia Universidad Javerinan. Facultad de ciencias. Programa
de posgrado.
40. PEREZ G. 2003. Los flavonoides: Antioxidantes o prooxidantes. Revista cubana de
investigación biomédica. Vol 22. Pp 48-57.
41. RAO, K.S. CHAUDHURY, P.K. PRADHAN. 2009. Evaluation of anti-oxidant activities and total
phenolic content of Chromolaena odorata. Food and chemical toxicology. Vol 48. Elsevier.
Pp 729-732.
42. RICE-EVANS, C. MILLER, N. PAGANGA, G. 1996. Structure-antioxidant activity relationships
of flavonoids and phenolic acids. Free radical biology and medicina. Vol XX, 7. Pp 936-956.
43. ROBINSON, H. & CUATRECASAS, J. 1993. New species of Pentacalia (Senecioneae:
Asteraceae) from Ecuador, Peru and Bolivia. Missouri botanical garden. Novon. Vol 3 Pp:
284-301.
44. ROSAS-ROMERO, A. &SAAVEDRA, G. 2005. Screening Bolivian plants for antioxidant
activity. Pharmaceutical biology. Vol 43, Pp: 79-86.
45. SÁNCHEZ-MORENO, C. LARRAURI, J.A. SAURA-CALIXTO. A. 1998. procedure to measure
the antiradical efficiency of polyphenols. Sci food agric. Vol 76 pp: 270-276.
46. SANTANA ALBA, I.F.2010. Estudio químico de la especie colombiana Pentacalia abietina
(Willd.ex.Wedd)Cuatr. Como nueva fuente natural de compuestos tipo kaurano y quinol.
Programa de Posgrado. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, Colombia PP: 29-57.
47. SANTOS, F.J. & GALCERAN, M.T. 2003. Modern developments in gas chromatography-mass
spectrometry- based environmental analysis. Journal of chromatography. Vol 1000. Pp
125-151.
48. SKLENÁR, P. & BALSLEV, H. 2004. Superpáramo plant species and phytogeography in
Ecuador. Flora. Vol 200. El sevier. Pp 416-433.
49. SHARIFIFAR, F. DEHGHN-NUDEH, G. MIRTAJALDINI, M. 2009. Major flavonoids with
antioxidant activity from Teucrium polium.Food chemistry. Vol 112 El sevier. Pp 885-888.
36
50. TENE, V. MALAGÓN, O. FINZI, P. VIDARI, G. ARMIJOS,C. ZARAGOZA,T. 2007. An
ethnobotanical survey of medicinal plants used in Loja and Zamora-Chinchipe, Ecuador.
Journal of ethno-pharnacology. El sevier. Vol 111. Pp: 63-81
51. TENORIO, F.A., DEL VALLE,L. HERNANDEZ, G.P.2006. Los flavonoides y el sistema
cardiovascular. Pueden ser una alternativa terapéutica. Archivos de cardiología de México.
Vol.7 Octubre-Diciembre. PP: 33-45.
52. TORRENEGRA, R. PEDROZO, J. TELLEZ, A. GRANADOS, A. 2004. Pentacalia corymbosa
(Benth) Cuatr, fuente de principies citotoxicos y antifungicos. XIII congreso Italo-latino
americano di etnomedicina. Pp: 77.
53. TRILLOS, C. 1992. Aislamiento de compuestos mayoritarios de Pentacalia nítida. Tesis de
grado para obtener el título de magister en biología con énfasis en fitoquímica. Pontificia
universidad Javeriana. Departamento de química. Bogotá.
54. UNAM. Departamento de química. www.depa.pquim.unam.mx [Cromatografía en capa
fina. Química orgánica][Consultado en octubre 25- 2010] Disponible en:
http://depa.pquim.unam.mx/~fercor/dqo/manuales/1311/p7.pdf
55. VARELA, Diana A. 2010.Estudio químico de Pentacalia nítida (HBK) Cuatr. Como nueva
fuente de productos naturales glicosilados. Pontificia universidad javeriana. Facultad de
ciencias. Grupo de fitoquimica Pp: 2-103.
56. VILLAÑO, D. FERNANDEZ-PACHÓN, M.S. MOYÁ, M.L. TRONCOSO, A.M. CARCÍA-PARRILLA,
M.C. 2007. Radical scavening ability pf polyphenolic compounds toward DPPH free radical.
Talanta. Vol 71. Pp: 230-235.
57. WALL M.E., EDDY R., MCCLENNAN M.L. AND KLUMP M.E. 1952. Detection and estimation
of steroidal sapogenins in plant tissue. Analytical Chemistry, vol 28. Pp 933-956.
58. WANG,W. WU, N. ZU, Y.G. FU, Y.J. 2008.Antioxidative activity of Rosmarinus officinalis L.
essential oil compared to its main components. Food chemistry.vol 108. Pp: 1019-1022.
59. WEI, G-J. & HO, C-T (2006), A stable quinone identified in the reaction of carnosol, a major
antioxidant in rosemary, with 2,2-diphenil-1-picrylhydrazyl radical. Food chemistry. Vol: 96
Pp: 471-476.
60. YAMAGUCHI,L. LAGO, J.H. TANIZAKI, T. MASCIO, P. KATO, M. 2006. Antioxidant activity of
prenylated hydroquinone and benzoic acid derivatives from Piper crassinervium Kunth. El
sevier. Phytochemistry. Vol 67. Pp: 1838-1843.
61. YOUNGSTON, R. 2005.Antioxidantes y radicales libresED: vida. España Pp: 15-24.
62. ZHOU YJ, LI CQ, WANG, ZZ. Studies in the antioxidant activities of leaves from Senecio
argunensis. Ministry of education for medicinal plant resource and natural pharmaceutical.
Vol 9. Pp: 1355-1357.
37
ANEXOS
Anexo 1. Pentacalia corymbosa y p.nitida.
38
Anexo 2. Diagrama de flujo de la metodología.
39
Anexo 3. Resultado de cromatografías de capa fina del extracto de petrol de Pentacalila nitida
posterior a su extracción sólido líquido con petrol. Y el resultado de la TLC del extracto etanólico
de Pentacalia nítida, posterior a su extracción por sólido líquido con petrol, seguido con DCM y
finalmente con acetato de etilo
40
Anexo 4. Resultados de la cromatografía en capa fina de la fracción de DCM y de AcOEt.
Anexo 5. Gráficas de % de DPPH remanente y de % de inhibición del radical DPPH con las
fracciones de mayor actividad antioxidante y con los extractos totales de
Pentacalia nitida y P. corymbosa
A1) Gráficas de % de DPPH remanente con la fracción de DCM de pentacalia nitida
y = -0,0224x + 102,93
R² = 0,9889
% de DPPH remanente
% DPPH rem.
120
100
080
060
040
020
000
% DPPH rem.
0
1000
2000
3000
Lineal (% DPPH
rem. )
ppm
41
A2) Gráfica de % de inhibición del radical DPPH con la fracción DCM de Pentaclia nitida
% Inhibición
060
y = 0,0224x - 2,926
R² = 0,9889
040
% Inhibición
020
Lineal (%
Inhibición)
000
0
1000
2000
3000
B1) Gráfica de % de DPPH remanente con la fracción de acetato de etilo de Pentacalia nitida.
% DPPH rem.
y = -0,0208x + 94,021
R² = 0,9307
100
080
% DPPH rem.
060
040
Lineal (% DPPH
rem.)
020
000
0
1000
2000
3000
B2) Gráfica de % de inhibición del radical DPPH con la fracción de acetato de etilo de
Pentacalia nitida
42
% de inhibición
080
y = 0,0208x + 5,979
R² = 0,9307
060
040
Lineal (% de inhibición
% de inhibición)
020
000
0
1000
2000
3000
ppm
C1) Gráfica de % de DPPH remanente con el extracto total de Pentacalia nítida
% DPPH rem y = -0,01x + 104,53
R² = 0,9826
150
100
% DPPH rem
050
000
0
1000
2000
Lineal (% DPPH
rem)
3000
ppm
C2) Gráfica del % de inhibición del extracto total de Pentacalia nítida
% Inhibición
040
y = 0,0162x - 8,9417
R² = 0,9483
% Inhibición
020
000
-020
0
1000
2000
3000
Lineal (%
Inhibición)
ppm
D1) Gráfica del % de DPPH remanente con el extracto total de Pentacalia corymbosa
43
% DPPH rem.
100
80
60
40
20
0
y = -0,028x + 91,376
R² = 0,9792
% DPPH rem.
Lineal (% DPPH
rem. )
0
1000
2000
3000
D2) Gráfica del % de inhibición del radical DPPH con el extracto total de Pentacalia corymbosa
% Inhibición
y = 0,0363x + 1,095
R² = 0,9886
40
30
% Inhibición
20
Lineal (%
Inhibición)
10
0
0
500
1000
1500
Anexo 6. Decoloración del radical DPPH de púrpura a amarillo pálido debido a que este se reduce.
44
Anexo 7. Cromatograma de la fracción DCM del extracto etanólico de Pentacalia nítida
45
Anexo 8. Cromatograma de la fracción acetato de etilo del extracto etanólico de Pentacalia nítida
46