“Ningún rayo de sol queda perdido

SEGUNDO SIMPOSIUM INTERNACIONAL
DE PLANTAS MEDICINALES Y FITOTERAPIA
FITO 2004
05 – 08 de agosto, 2004
INSTITUTO DE FITOTERAPIA AMERICANO
“Al servicio de la investigación, conservación y difusión del conocimiento de las plantas medicinales”
CURSO INTERNACIONAL
TÉCNICAS RÁPIDAS Y DE BAJO COSTO PARA
EL AISLAMIENTO DE PRODUCTOS NATURALES
“Ningún rayo de sol queda perdido; pero necesitamos tiempo para ver cómo brota la
semilla que éste hace germinar. No siempre el labrador ve la cosecha”
Albert Schweitzer
Lima - Perú
Obras publicadas por el Instituto de Fitoterapia Americano:
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UÑA DE GATO. ESTUDIOS BOTÁNICOS, QUÍMICOS Y FARMACOLÓGICOS DE UNCARIA TOMENTOSA. UNCARIA GUIANENSIS.
1era. Edición, formato A5, 169 páginas. 1994, 2da. Edición 1995, 3era. Edición 1997. Versiones en español e inglés.
FOLLETO: PLANTAS MEDICINALES Y ALIMENTICIAS EN EL HOGAR. 1era. Edición, formato A5, 16 páginas. 1998.
MACA. PLANTA MEDICINAL Y NUTRITIVA DEL PERÚ. 1era. Edición, formato A5, 182 páginas. 1998.
PRIMER CONGRESO INTERNACIONAL Y PRIMER CONGRESO PERUANO DE PLANTAS MEDICINALES Y FITOTERAPIA FITO 2000.
1era. Edición, formato A4, 215 páginas. 2000.
PRIMER CURSO NACIONAL DE PLANTAS MEDICINALES Y FITOTERAPIA FITO 2001. 1era. Edición, formato A4, 58 páginas. 2001.
PRIMER SIMPOSIO INTERNACIONAL DE PLANTAS MEDICINALES Y FITOTERAPIA FITO 2001. 1era. Edición, formato A4, 59 páginas.
2001.
SEGUNDO CURSO INTERNACIONAL DE PLANTAS MEDICINALES Y FITOTERAPIA FITO 2002. 1era. Edición, formato A4, 81 páginas. 2002.
SEGUNDO CONGRESO INTERNACIONAL DE PLANTAS MEDICINALES Y FITOTERAPIA FITO 2003. 1era. Edición, formato A4. 222 pág.
2003.
CURSO INTERNACIONAL DE FITOTERAPIA. 1era. Edición, formato A5. 85 pág. 2003
CURSO INTERNACIONAL DE FITOFARMACIA. 1era. Edición, formato A5. 57 pág. 2003
CURSO INTERNACIONAL DE AGROECOLOGÍA Y PRODUCCIÓN DE PLANTAS MEDICINALES. 1era. Edición, formato A5. 67 pág. 2003.
CURSO INTERNACIONAL DE DISEÑO Y CONDUCCIÓN DE ENSAYOS CLÍNICOS. 1era. Edición, formato A5. 115 pág. 2003.
SEGUNDO SIMPOSIUM INTERNACIONAL DE PLANTAS MEDICINALES Y FITOTERAPIA. 1era. Edición. CD-ROM. 2004.
CURSO INTERNACIONAL BASES FARMACOLÓGICAS PARA EL ESTUDIO Y USO DE LAS PLANTAS MEDICINALES. 1era. Edición. CDROM 2004.
CURSO INTERNACIONAL TÉCNICAS RÁPIDAS Y DE BAJO COSTO PARA EL AISLAMIENTO DE PRODUCTOS NATURALES. 1era.
Edición. CD-ROM 2004.
CURSO INTERNACIONAL CULTIVO Y PRODUCCIÓN DE PLANTAS MEDICINALES. 1era. Edición. CD-ROM 2004.
CURSO INTERNACIONAL DE TÉCNICAS RÁPIDAS Y DE BAJO
COSTO PARA EL AISLAMIENTO DE PRODUCTOS NATURALES.
05 – 08 Agosto del 2004
1era. Edición. Copyright  Agosto, 2004.
Derechos reservados
INSTITUTO DE FITOTERAPIA AMERICANO
Av. Olavegoya 2027, Jesús María. Lima 11. Perú.
Teléfono / fax: (51 1) 564-7554
Web site: www.medicinaverde.org
E-mail: infaperu@hotmail.com
CURSO INTERNACIONAL DE TÉCNICAS RÁPIDAS Y DE BAJO COSTO PARA EL AISLAMIENTO DE PRODUCTOS NATURALES
PRESENTACIÓN
Uno de los fines primordiales de la Organización Mundial de la Salud es reducir el exceso de mortalidad,
morbilidad y discapacidad de la población mundial. En el contexto del cumplimiento de estos postulados, el
documento de la OMS sobre su estrategia global en Medicina Tradicional 2002 – 2005 nos plantea de forma
categórica la necesidad de asegurar el adecuado uso de la denominada Medicina Tradicional (MT), concepto en el
cual se incluye las denominadas Medicinas Complementarias y Alternativas (MCA), buscando el logro de
objetivos precisos, como son:
·
Integrar la MT/MCA en los sistemas de salud nacionales por medio del desarrollo e implantación de
políticas y programas de MT/MCA.
·
Incentivar la seguridad, eficacia y calidad de la MT/MCA incrementando el caudal de conocimientos de
estas medicinas y brindar el soporte adecuado sobre las pautas y normativas correspondientes.
·
Fomentar la disponibilidad y accesibilidad de la MT/MCA, facilitando su acceso a la población de escasos
recursos.
El uso terapéutico de las plantas medicinales se halla involucrado en este contexto y la Fitoterapia se
constituye en una terapia en la que los términos de seguridad, eficacia, calidad, preservación y disponibilidad se
hallan en primer orden, más aún si consideramos la actual y creciente tendencia mundial hacia estas formas de
atención en salud, extensivas tanto a los países en desarrollo como a los desarrollados.
Dentro de este marco general y en base a su plan de trabajo 2002-2005, el Instituto de Fitoterapia Americano
se complace en contribuir con la investigación, conservación y difusión del conocimiento de las plantas medicinales
en el Perú organizando el Segundo Simposium Internacional de Plantas Medicinales y Fitoterapia FITO 2004 y los
Cursos Internacionales: Bases farmacológicas para el estudio y uso de las plantas medicinales; Técnicas rápidas y de
bajo costo para el aislamiento de productos naturales y Cultivo y producción de plantas medicinales. Asimismo, por
primera vez se realiza la Primera Exhibición Nacional de Plantas Medicinales, en la cual gracias a un esfuerzo
conjunto con Herbarios Nacionales, colaboraciones particulares y especímenes de nuestra institución se exponen al
público asistente colecciones de especies vivas y herborizadas, nativas y adaptadas de diferentes regiones del país.
Los objetivos de esta Exhibición Nacional son: difundir el conocimiento de las plantas medicinales nativas y
adaptadas y contribuir al buen uso de las mismas, propendiendo a su revalorización.
Todas estas actividades se hallan dentro de los objetivos de difundir e intercambiar experiencias en la
investigación de las plantas medicinales y sus productos derivados, capacitar a los profesionales de la salud en el
uso científico e investigación de las plantas medicinales y brindar los elementos metodológicos para alcanzar estos
fines.
Agradecemos a todos los integrantes del Comité Científico Internacional así como del Comité Científico
Nacional, en especial a nuestro amigos: Dr. Brás H. de Oliveira de la Universidad Federal de Paraná, Brasil; Dr.
Danilo Maciel Carneiro del Hospital de Medicinas Alternativas de Goiânia, Brasil; Ing. Otto Brutti de la
Universidad Nacional de Entre Ríos, Argentina; Dr. Jurguen Pohlan de El Colegio de la Frontera Sur, Tapachula,
México; Mg. Ing. Lenin De los Santos de la Universidad Juárez Autónoma de Tabasco, México, a la Bióloga Betania
Sebastián Lopes y al Dr. Manuel Sandoval Chacón Ph. D. Director del Research & Development CHS BioScience &
Technology de Latham, New York, U.S.A. Todos ellos con su presencia y entusiasmo han contribuido al
cumplimiento de los objetivos de este evento internacional.
Damos la bienvenida a todos nuestros colegas, colaboradores en el Perú y el extranjero, a nuestros amigos
peruanos y de los distintos países de Latinoamérica así como a todo el respetable público asistente que nos
acompaña en esta cita internacional, son ustedes, una vez más, quienes han hecho realidad este Segundo
Simposium Internacional de Plantas Medicinales y Fitoterapia.
EL COMITÉ ORGANIZADOR
Segundo Simposium Internacional de Plantas
Medicinales y Fitoterapia
FITO 2004
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INSTITUTO DE FITOTERAPIA AMERICANO
SEGUNDO SIMPOSIUM INTERNACIONAL DE PLANTAS MEDICINALES Y FITOTERAPIA FITO 2004
CURSOS INTERNACIONALES:
Bases farmacológicas para el estudio y uso de las plantas medicinales
Técnicas rápidas y de bajo costo para el aislamiento de productos naturales
Cultivo y producción de plantas medicinales
Primera Exhibición Nacional de Plantas Medicinales
05-08 de Agosto, 2004. Lima, Perú
OBJETIVOS
1.- Difundir e intercambiar experiencias en los diversos aspectos del estudio e investigación de las plantas
medicinales y sus productos derivados.
2.- Capacitar a profesionales de la salud, así como a profesionales de áreas afines en el uso científico e
investigación de las plantas medicinales.
3.- Brindar elementos metodológicos que permitan el estudio y conocimiento integral de las plantas
medicinales.
VALOR ACADÉMICO
Simposium: 1.0 crédito
Cada curso: 0.5 crédito
Resolución Nro. 193-D-FFB-2004. Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
Resolución Decanal Nro. 415-2004-D-FMH. Universidad San Martín de Porres.
ÁREAS TEMÁTICAS
Botánica / Fitoquímica / Farmacología / Bioensayos y mecanismos de acción / Fitoterapia / Cultivo y
conservación / Producción, comercialización nacional e internacional / Normatividad
ORGANIZA
Instituto de Fitoterapia Americano – INFA
COMITÉ CIENTÍFICO INTERNACIONAL
Dr. Brás H. de Oliveira. Departamento de Química. Universidad Federal de Paraná. BRASIL.
Dr. Danilo Maciel Carneiro. Jefe de Investigación. Hospital de Medicinas Alternativas. Goiânia. BRASIL.
Manuel Sandoval Chacón Ph. D. Director, Research & Development CHS BioScience & Technology. Latham.
New York, U.S.A.
Dr. Otto Brutti. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de Entre Ríos. ARGENTINA.
Mg. Ing. Lenin De los Santos. Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. MÉXICO.
Dr. Jürgen Pohlan. ECOSUR, El Colegio de la Frontera Sur, Tapachula, MÉXICO. Rheinische Friedrich
Wilhems Universitat Bonn, Institut fur Obst und Gemusebau, ALEMANIA
COMITÉ CIENTÍFICO NACIONAL
Dra. Lida Obregón. Instituto de Fitoterapia Americano. INFA
Dr. Asunción Cano. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. UNMSM
Dr. Salomón Ayala P. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. UNMSM
Mg. Sc. Irma Fernández. Universidad Peruana Cayetano Heredia. UPCH
Dr. Raúl Soria L. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. UNMSM
Dra. Luzmila Troncoso C. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. UNMSM
Dr. Fernando Cabieses M. Universidad Científica del Sur. UCS
Dr. Freddy Mejía C. Universidad Nacional de Trujillo. UNT
Ph. D. Juan Chávez C. Universidad Nacional Agraria La Molina. UNALM
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CURSO INTERNACIONAL DE TÉCNICAS RÁPIDAS Y DE BAJO COSTO PARA EL AISLAMIENTO DE PRODUCTOS NATURALES
Mg. Blga. Fátima Cáceres. Universidad Nacional de San Agustín. Arequipa
Dr. Alejandro Pino. Universidad Particular Santa María. Arequipa
Mg. Elsa Aguirre. Universidad Nacional del Santa-Ancash.
Dra. Bertha Boncún de Linares. Universidad Nacional de Trujillo. UNT
Dr. César Náquira Velarde. Instituto Nacional de Salud. INS
Dr. David Ponce Aguirre. Universidad Nacional Daniel Alcides Carrión. UNDAC
AUSPICIOS:
- Universidad Federal de Paraná. BRASIL
- Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. MÉXICO
- Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de Entre Ríos. ARGENTINA
- Organización Panamericana de la Salud OPS/OMS
- Universidad Nacional Mayor de San Marcos - UNMSM
- Universidad Peruana Cayetano Heredia - UPCH
- Universidad de San Martín de Porres - USMP
- Universidad Nacional Agraria La Molina - UNALM
- Colegio Médico del Perú - CMP
- Colegio Químico Farmacéutico del Perú - CQFP
- Instituto de Medicinas Complementarias - IMECOM
- Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología - CONCYTEC
- El Colegio de la Frontera Sur, Tapachula. MÉXICO
- Research & Development CHS BioScience & Technology. Latham. New York, U.S.A.
- Asociación de Medicinas Complementarias. ESPAÑA
ASESORÍA LEGAL: Estudio Jurídico Armas – Alvarado Asociados
Jr. Camaná 993A - 6to. piso Of. 601-604
Teléfonos: 330-5746 / 9937 - 1136
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INSTITUTO DE FITOTERAPIA AMERICANO
Curso Internacional: TÉCNICAS RÁPIDAS Y DE BAJO COSTO PARA EL AISLAMIENTO DE
PRODUCTOS NATURALES
PROGRAMA OFICIAL
Docente
Dr. Brás H. de Oliveira. Departamento de Química. Universidad Federal de Paraná. BRASIL.
Objetivo
Capacitar a los químicos farmacéuticos, químicos, estudiantes de las facultades de Farmacia y Bioquímica y
de áreas afines en la aplicación de técnicas rápidas, de fácil ejecución y bajo costo para el aislamiento de
productos naturales.
Metodología
Se efectivizará por medio de conferencias magistrales. Se tiene a disposición equipo multimedia y proyector
de Data Show.
Traductora
Bióloga Betania Sebastián Lopes. Facultad de Química y Biología. Universidad de Santiago de Chile.
Duración: 10 horas
Material Didáctico
El primer día de clases se entregará el material didáctico del curso en un CD-ROM con los temas de las
exposiciones correspondientes a cada conferencia.
Programa del curso
Jueves 05 de agosto: 4:30 pm. a 6:30 pm. (2 horas)
Introducción: importancia del aislamiento, determinación estructural, bioensayos derivativos.
Rapidez y costos: tendencia a usar métodos sofisticados/caros, posibilidad de empleo de
métodos baratos. Limitaciones.
Pre-tratamiento de la muestra. Objetivos: interrupción de la actividad enzimática; preservación de
metabolitos contra la oxidación; prevención de la acción de microorganismos.
Procedimientos: estabilización por inactivación enzimática (solventes); deshidratación.
Viernes 06 de agosto: 8:00 am. a 11:00 am. (3 horas)
Extracción con solventes.
Selección del solvente: importancia, selectividad, toxicidad, recuperación.
Procedimientos: extracción en frío, en caliente, continua, percolación.
Extracción de ácidos: fundamentos teóricos, procedimientos, ejemplos. Cristalización.
Fundamentos teóricos.
Procedimientos: cristalización simple, cristalización en pequeña escala.
Sábado 07 de agosto: 8:00 am. a 11:00 am. (3 horas)
Métodos Cromatográficos
Fundamentos teóricos.
Cromatografía en capa fina.
Cromatografía en columna.
Domingo 08 de agosto: 8:00 am. a 10:00 am. (2 horas)
Percolación por gravedad.
Percolación a vacío. Fase normal: ventaja y desventaja del uso de sílica. Fase reversa: costo de fases
comerciales; necesidad de aparatos. Ejemplos.
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CURSO INTERNACIONAL DE TÉCNICAS RÁPIDAS Y DE BAJO COSTO PARA EL AISLAMIENTO DE PRODUCTOS NATURALES
TÉCNICAS RÁPIDAS Y DE BAJO COSTO PARA EL AISLAMIENTO DE PRODUCTOS NATURALES
Dr. Brás Heleno de Oliveira. Departamento de Química. Universidad Federal de Paraná. Curitiba – Brasil.
E-mail: bho@ufpr.br
Introducción
Este curso tiene por objetivo describir técnicas sencillas y de relativo bajo costo para el aislamiento
de productos naturales. Ha sido preparado para principiantes y requiere de poco conocimiento previo en el
área. Los procedimientos aquí descritos están elaborados para el aislamiento de productos naturales
vegetales, pero también pueden ser utilizados para productos naturales orgánicos de otras fuentes.
El estudio de productos naturales vegetales es importante por varios motivos, primero porque
tenemos en América del Sur una flora riquísima y poco estudiada desde el punto de vista químico; además,
el uso popular de varias plantas requiere su estudio para validar su uso y también para verificar la existencia
de posibles efectos adversos.
El aislamiento de metabolitos secundarios de las plantas es necesario en varias situaciones. Al
estudiar una planta medicinal, los profesionales involucrados tienen la curiosidad natural de saber cuáles
componentes químicos son los responsables de la actividad farmacológica. El estudio farmacológico de
fracciones cada vez más simples puede llevar al aislamiento del principio activo y una vez aislado el
componente activo, se puede determinar su estructura química y llevar a cabo estudios farmacológicos en
mayor profundidad.
El gran dilema de la fitoquímica estriba en que los países con mayor biodiversidad no se hallan en
un estado avanzado de desarrollo económico. De esta forma, los científicos involucrados tienen pocos
recursos para la inversión en equipos científicos que podrían resultar de alta productividad científica. En el
caso del aislamiento de los principios activos los equipos disponibles son muy caros, tanto su adquisición
como para su operativización. Aunque equipos sofisticados estén disponibles en algunos grupos, es
importante que éstos sean utilizados con racionalidad. Decimos esto debido a que, una vez disponibles, hay
una tendencia natural de utilizarlos al máximo, aun cuando otras técnicas más sencillas puedan resolver un
determinado problema de separación. En algunos casos sencillos, por ejemplo, la simple extracción con
solvente del material vegetal y la concentración del extracto puede llevar a la cristalización del producto
deseado. El uso intensivo de estos equipos obviamente lleva a una disminución de su vida útil e incremento
de los costos de operación y manutención. Lo más razonable sería reservar el uso de los mismos equipos en
aquellos casos en que técnicas más sencillas y baratas puedan proveer resultados adecuados.
Puede que técnicas sencillas resuelvan todos los problemas de aislamiento, sin embargo, antes de
desistir de intentar técnicas instrumentales, merece la pena revisar los procedimientos, estudiar los procesos
físico-químicos involucrados y reintentar nuevamente. A veces un cambio sencillo de solvente en un proceso
cromatográfico puede dar lugar a un aumento significativo de resolución, generando una separación bien
realizada.
Pre-tratamiento de la muestra
El primer paso en el estudio de una planta consiste en la preparación del material vegetal. Con esto
se pretende preservar los metabolitos presentes en la planta de modo que permanezcan intactos durante los
estudios químicos o farmacológicos posteriores.
Inicialmente es necesario interrumpir la actividad enzimática. Esto se puede conseguir mediante
secado a temperatura suave o mediante el tratamiento del material fresco con solventes. El secado del
material, que es el procedimiento más utilizado, tiene también el beneficio de reducir la posibilidad de la
acción microbiana. Se puede llevar a cabo al aire libre en un día seco, a la sombra, o en estufa con
temperatura regulada cerca de 40-60 oC. Una vez seco, el material puede ser triturado o molido y después
almacenado.
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INSTITUTO DE FITOTERAPIA AMERICANO
La estabilización con solvente puede llevarse a cabo por inmersión del material vegetal en etanol,
metanol o acetona caliente. En estas condiciones las enzimas son inmediatamente inactivadas de modo que se
interrumpe el metabolismo celular.
La protección del material tratado en contra de la oxidación es también importante. Para ello es
conveniente almacenar el material ya estabilizado en un recipiente hermético, protegido de la luz y a la
temperatura más baja posible.
Extracción con solventes
En el caso de que el pre-tratamiento de la muestra haya sido llevado a cabo mediante secado, es
necesario extraer los componentes responsables de la acción farmacológica. Para esto se efectúa la extracción
con solventes. El tipo de solvente y técnica a ser utilizados dependen del tipo de muestra y del objetivo final.
Inicialmente es importante tener en cuenta la toxicidad del solvente a ser utilizado. El metanol, por
ejemplo, a pesar de ser muy utilizado, debe ser manipulado con cuidado pues es muy tóxico. De igual modo,
los solventes halogenados son también perjudiciales para la salud. Siempre que sea posible, realice los
experimentos en una campana de extracción eficiente.
En el caso de que no se disponga de ninguna información previa de la muestra, es conveniente
extraer el mayor número posible de metabolitos. Esto se puede conseguir utilizando un solvente de alta
capacidad extractora como el etanol o el metanol.
El procedimiento más sencillo consiste en dejar el material vegetal molido en contacto con un
solvente adecuado, a temperatura ambiente, por varias horas. Después de filtrado, el material vegetal puede
ser reextraído más de una vez para aumentar el rendimiento de la extracción. El solvente de los extractos
combinados puede, entonces, ser evaporado en rotavapor.
Otra técnica eficiente es la extracción continua. En este caso se utiliza un extractor de Soxhlet (fig. 1),
en el que el material vegetal es continuamente extraído. Para utilizar esta técnica es importante saber si el
principio activo es estable a la temperatura de ebullición del solvente utilizado.
Figura 1: extractor de Soxhlet
Un trabajo importante de optimización de extracción fue realizado por el equipo del Instituto
Nacional del Cáncer de los Estados Unidos (McCloud, et al., 1988). Después de varios experimentos,
científicos de ese instituto llegaron a la conclusión de que el mejor método de extracción consistía en dejar el
material vegetal en contacto con diclorometano/metanol (1:1) durante la noche, a temperatura ambiente,
filtrar, resuspender el marco en metanol por 15 minutos, filtrar nuevamente y combinar los extractos (fig. 2).
El marco finalmente se resuspende en agua y se deja en reposo durante la noche. Después de filtrado, el
extracto acuoso se liofiliza y guarda.
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CURSO INTERNACIONAL DE TÉCNICAS RÁPIDAS Y DE BAJO COSTO PARA EL AISLAMIENTO DE PRODUCTOS NATURALES
Figura 2: extractores en el NCI
En el caso de que se quiera aislar un componente ácido de un extracto vegetal, el procedimiento
involucra reacciones ácido-base (ver esquema inferior). Inicialmente el extracto debe ser disuelto en un
solvente insoluble en agua y posteriormente extraído con una solución acuosa de una base. La base debe ser
la más débil posible, de tal modo que pueda convertir el ácido en sal. La sal formada, soluble en agua, pasa a
la fase acuosa. Posteriormente el extracto acuoso debe ser acidificado para recuperar el ácido y luego
reextraído con un solvente orgánico adecuado.
O
O
H2O
R C O- Na +
1) R C OH + NaHCO3
+ CO2 + H2O
O
O
2) R C O- Na + + HCl
R C OH + NaCl + H2O
Ejemplo 1: Aislamiento de reína de la raíz de ruibarbo, Rheum palmatum (Ikan pg 60).
La raíz de ruibarbo en polvo (100 g) es extraída 3 veces con agua (750 ml). Los extractos
combinados se concentran hasta 100 ml y el concentrado se extrae exhaustivamente con etilmetilcetona hasta
que la fase acuosa esté prácticamente incolora. El extracto orgánico es entonces agitado con pequeñas
porciones de bicarbonato de sodio 5% (10-25 ml) en un embudo de separación hasta que el color rojizo
desaparezca de los extractos. El extracto alcalino combinado se enfría en baño de hielo y se acidifica hasta pH
2 con ácido clorhídrico diluido. El precipitado se centrifuga (el filtrado), se lava con agua y se seca en vacío. El
producto bruto se lava entonces con un poco de acetona y ácido acético helado; y después se recristaliza en
ácido acético, obteniéndose un producto cristalino amarillento.
La extracción de bases orgánicas también involucra reacciones ácido-base (ver esquema inferior). En
esta clase se encuentran compuestos importantes, tales como los alcaloides. El extracto orgánico se disuelve
inicialmente en un solvente orgánico insoluble en agua. Posteriormente, el extracto se extrae con una solución
acuosa diluida de un ácido inorgánico (clorhídrico, sulfúrico). La sal de la base, soluble en agua, pasa a la fase
acuosa. Finalmente, los extractos acuosos combinados se basifican con una base débil (por ejemplo, hidróxido
de amonio) y después se reextraen con un solvente orgánico adecuado, que contendrá la base en la forma
libre.
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INSTITUTO DE FITOTERAPIA AMERICANO
1) R N R
HCl
+
H2O
Cl -
R N R
R
R
H
2)
+
H
R N R
+
R N R +
Cl - + NH4OH
NH4Cl + H2O
R
R
Cristalización
En algunos casos sencillos, la simple cristalización puede llevar al producto deseado. El
procedimiento involucra la concentración del extracto orgánico bruto. Después de algún tiempo en reposo,
los compuestos en mayor concentración pueden empezar a cristalizarse y depositarse en el fondo del frasco.
En el caso de que los cristales obtenidos no sean lo suficientemente puros, recristalizaciones sucesivas pueden
ser suficientes para una purificación adecuada.
El proceso de purificación por cristalización se basa en el mecanismo de deposición de nuevas
moléculas en el cristal en formación. En situaciones muy favorables la concentración del componente
principal de la mezcla es muy alta y, en la medida que el cristal se va formando, es mayor la posibilidad de
que moléculas de ese mismo componente sean las incluidas en la red cristalina, en vez de moléculas de
impurezas. Este proceso es facilitado en la ausencia de agitación y por un enfriamiento lento.
Para llevar a cabo la recristalización de una sustancia impura, el procedimiento es bastante sencillo.
Inicialmente es necesario elegir un solvente de tal forma que sea capaz de disolver completamente la muestra
en caliente, pero que no la disuelva completamente en frío. Una vez elegido el solvente, la muestra se
disuelve en éste, en caliente, utilizando el mínimo de solvente. La mezcla se deja en reposo y, después de
algún tiempo de enfriamiento, los cristales de la sustancia pura se forman y pueden ser separados por
filtración.
Ejemplo 2. Aislamiento de hesperidina de cáscara de naranja, Citrus sinensis.
Cáscara de naranja previamente seca y triturada (200 g) se coloca en un balón de fondo redondo (2
litros). Se adiciona éter de petróleo (1 litro), se adapta un condensador de reflujo al balón y se calienta la
mezcla en reflujo por 1 hora. El contenido del frasco se filtra aún caliente en un embudo de Buchner y se deja
secar el polvo a temperatura ambiente. Se devuelve el polvo seco al balón y se re-extrae con metanol (1 litro)
en reflujo por 3 horas. La mezcla se filtra entonces, aún caliente, y se concentra el filtrado, obteniéndose un
residuo de la consistencia de un jarabe. Este residuo se redisuelve en ácido acético caliente y se deja
cristalizar, obteniéndose cristales en la forma de agujas blancas.
Métodos Cromatográficos
En el caso de que el compuesto de interés no pueda ser obtenido por simple cristalización, la
siguiente técnica a intentar debe ser la cromatografía. Existen varias formas de cromatografía pero aquí
describiremos solamente las más sencillas.
La técnica cromatográfica más popular utiliza sílica o alúmina como material de adsorción (fase
estacionaria). El principio involucrado en este tipo de cromatografía consiste en aplicar la mezcla a ser
separada sobre la fase estacionaria y pasar por ella un solvente adecuado (fase móvil). Durante el paso del
solvente (elución) se da una disputa entre el eluyente y la fase estacionaria por los componentes de la mezcla.
Los componentes con mayor afinidad por la sílica se quedan retenidos por más tiempo, mientras que aquellos
con mayor afinidad por la fase móvil son desplazados más rápidamente. Éste es el principio básico de la
separación cromatográfica.
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CURSO INTERNACIONAL DE TÉCNICAS RÁPIDAS Y DE BAJO COSTO PARA EL AISLAMIENTO DE PRODUCTOS NATURALES
Cromatografía en Capa Fina
Esta técnica es importantísima en laboratorios de Química Orgánica. Es muy simple pero de gran
utilidad. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria se aplica sobre una superficie (vidrio, aluminio,
etc.). Estas placas pueden ser compradas o preparadas en el laboratorio. La superficie de la fase estacionaria
debe estar seca (activada) y protegida de la contaminación química.
El procedimiento en este tipo de cromatografía consiste básicamente en dos etapas (fig. 3).
Inicialmente la muestra, previamente diluida en un solvente adecuado (volátil), se aplica en la base de la
placa y en seguida se coloca, en posición casi vertical, dentro de un recipiente de vidrio que contiene la fase
móvil. Al entrar en contacto con la fase estacionaria, el solvente empieza a subir debido al fenómeno de
capilaridad. A medida que la fase móvil sube, arrastra más rápidamente los componentes de la mezcla que
tengan mayor afinidad por ésta. Cuando el frente del solvente alcanza cerca de 1-2 mm del borde superior de
la placa, ésta se retira y se deja secar el solvente. La distancia recorrida por las manchas puede ser medida y la
grandeza denominada factor de retención (Rf) puede ser fácilmente calculada. Rf = d/D, donde d= distancia
recorrida por la mancha (mm) y D= distancia recorrida por la fase móvil (mm).
Figura 3: ccf y el cálculo de Rf
La elección de la fase móvil es de crucial importancia para la separación. La afinidad de los
componentes de la fase móvil por una determinada sustancia de la mezcla a ser separada, depende de las
propiedades fisicoquímicas del solvente, como: polaridad, acidez, basicidad. Los solventes para
cromatografía han sido clasificados de acuerdo a sus propiedades fisicoquímicas (tabla 1).
Clases de Solventes para Cromatografía
Clase
Solventes
I
Éteres y aminas alifáticas
II
Alcoholes alifáticos
III
THF, piridinas, DMSO, amidas
IV
Formamida, ácido acético, glicoles
V
Diclorometano, 1,2-dicloroetano
VI
Haluro de alquilo, ésteres, cetonas, nitrilos
VII
Benzeno y derivados
VIII
Cloroformo, m-cresol, agua
Tabla 1: Clasificación de solventes para cromatografía
La fuerza de los solventes depende de la fase estacionaria en la que serán utilizados. La tabla
inferior (tabla 2) muestra la fuerza de algunos solventes en relación a la sílica.
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INSTITUTO DE FITOTERAPIA AMERICANO
Solvente
eo
n-Hexano
0,01
Cloroformo
0,26
Diclorometano
0,32
Acetato de etilo 0,38
Acetonitrilo
0,50
Metanol
0,7
Tabla 2: Fuerza de solventes en relación a la sílica
Es posible preparar mezclas de solventes diferentes con la misma polaridad. Durante el proceso
cromatográfico estas fases móviles, sin embargo, pueden proveer resultados diferentes. Es decir, pueden
presentar selectividades diferentes. Esto significa que si con una determinada fase móvil la diferencia de Rf
entre dos componentes es de 0,05, utilizando otra fase móvil de polaridad semejante esa diferencia puede
aumentar a 0,1 (fig. 4). Esto tiene una consecuencia importante, principalmente cuando se está optimizando
una separación preparativa.
Figura 4: Optimización de la fase móvil
En algunas obras están disponibles diagramas que muestran la composición de mezclas de
diferentes solventes con la misma polaridad (Meyer and Palamareva, 1993, fig. 5). Una vez establecida una
determinada mezcla con la que se obtiene un Rf adecuado, es posible a través de esos diagramas identificar
otra mezcla que tal vez produzca una mejor selectividad.
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CURSO INTERNACIONAL DE TÉCNICAS RÁPIDAS Y DE BAJO COSTO PARA EL AISLAMIENTO DE PRODUCTOS NATURALES
Figura 5. Nomógrafo de fuerza de solvente relativo a la sílica
La siguiente etapa es la de visualización de los componentes separados. En el caso de que los
compuestos de interés presenten color, la localización de éstos en la placa es fácil. En la mayoría de los casos,
sin embargo, los compuestos son incoloros. En ese caso es necesario utilizar métodos alternativos de
visualización. Uno de ellos es la utilización de luz UV. Ésta es utilizada cuando se desea visualizar
compuestos que absorben luz en esta franja (254 a 356 nm). Existen productos comerciales con esta finalidad.
Otra alternativa es la utilización de reactivos químicos que adquieran color al reaccionar con los compuestos
orgánicos presentes en la placa. Reactivos comúnmente usados son los vapores de yodo, ácido
sulfúrico/metanol (seguido de calentamiento) y otros más específicos.
La cromatografía en capa fina puede ser utilizada con dos finalidades principales. Cuando la
superficie es fina (0.2 mm), se utiliza con finalidad analítica, permitiendo determinar, por ejemplo, la
complejidad de una mezcla o la presencia de un determinado componente a través de la comparación con un
padrón.
Cuando la superficie es más gruesa (1-3 mm) y la placa es de mayor dimensión (20X20 cm), la
técnica se conoce como preparativa, debido a la mayor capacidad. En este caso una cantidad mayor de
muestra puede ser aplicada en la base de la placa y, después de la elución, los componentes pueden ser
removidos – por raspado - de la región de la sílica que los contiene. Esta técnica preparativa es también muy
utilizada debido a su sencillez y resolución.
Cromatografía en Capa Fina Centrífuga
Esta técnica, a pesar de involucrar el uso de un equipo importado, tiene la ventaja de ser rápida y
permitir la reutilización de la fase estacionaria. Estos factores combinados llevan a una reducción de los
costos operacionales.
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El equipo, denominado Chromatotron (fig. 5), es producido por Harrison Research, una empresa
norteamericana. Consiste en una cámara donde un disco de vidrio, que contiene una capa de fase estacionaria
(sílica o alúmina), es fijado a un eje conectado a un motor. La muestra se aplica en el centro del disco en
movimiento, formando una banda circular. El eluyente también se aplica en el centro del disco y, bajo la
acción de la fuerza centrífuga es desplazado hacia la extremidad donde es recolectado en fracciones. La
separación es rápida y, una vez optimizada la composición de la fase móvil, la resolución es muy buena.
Después de la elución completa, el disco puede ser lavado con un solvente más polar para remover algún
compuesto más polar presente en la muestra. Después de evaporado el solvente de la superficie del disco y
reactivada la fase estacionaria, éste queda listo para ser usado nuevamente.
Figura 6: Chromatotron
Cromatografía en columna
La cromatografía en columna es la más utilizada con finalidades preparativas. La fase estacionaria es
empaquetada en una columna (generalmente de vidrio) y la muestra es aplicada en una de las extremidades.
La fase móvil se aplica del mismo lado y, en la medida que el solvente avanza, los compuestos son separados.
El solvente se recolecta en la otra extremidad, en fracciones, y cada fracción es posteriormente analizada para
verificar su complejidad. En el caso de que una determinada fracción contenga un único componente, este ya
está listo para las etapas posteriores de determinación estructural o de estudios farmacológicos. Las fracciones
aún conteniendo más de un componente se combinan, se evapora el solvente y se cromatografía la mezcla
nuevamente hasta el aislamiento final de sus componentes. El modo como el solvente es aplicado en la
columna puede variar.
Percolación por gravedad
En este caso, que es el más común, la columna se mantiene en la posición vertical y la mezcla a ser
separada se aplica en la parte superior de la columna (fig. 7). Después de la adición de la fase móvil, también
en la parte superior de la columna, la acción de la gravedad promueve el desplazamiento hacia abajo. El
solvente que deja la columna es recolectado en fracciones que son posteriormente analizadas. Ésta es la
configuración más simple para cromatografía en columna. Un aspecto negativo de la misma es que, en caso la
columna sea muy grande, para la separación de gran cantidad de extracto, la elución puede demorarse varios
días. En el caso del uso de sílica, debido a sus características ácidas, puede producirse la descomposición de
algunos componentes del extracto, formando los llamados artefactos. Lo ideal, por lo tanto, es que la elusión
sea llevada a cabo lo más rápidamente posible para minimizar la formación de artefactos.
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Figura 7: Cromatografía en columna
con percolación por gravedad.
Percolación al vacío
Una forma de eluir de forma rápida es mediante la aplicación de vacío en la base de la columna. En
esta técnica, la columna tiene una salida al vacío en su base, donde se adapta un frasco con encaje esmerilado
(fig. 8).
Figura 8. Cromatografía en columna al vacío
Debido a la rapidez del método es posible utilizar sílica con menor tamaño de partícula. Después de
la introducción del extracto en la parte superior de la columna, el solvente es adicionado en volumen
correspondiente a la primera fracción. Entonces, se aplica el vacío y el solvente recorre rápidamente el lecho
de la fase estacionaria. Después de la elución total, el vacío se interrumpe, el solvente recogido se transfiere a
otro recipiente y el balón utilizado se reconecta a la base de la columna. El solvente para la segunda fracción
se adiciona en la parte superior de la columna y el procedimiento se repite hasta el fraccionamiento total. Ésta
es la técnica que utilizamos de manera rutinaria en nuestro laboratorio, como sustituto al fraccionamiento por
gravedad.
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Fase normal: ventajas y desventajas de la sílica
La sílica gel es la fase estacionaria más utilizada en cromatografía. Es muy popular por varios
motivos: es sencilla de utilizar, relativamente barata y funciona bien para un gran número de compuestos,
además, puede ser reciclada. Es polar y particularmente eficiente para separación de compuestos de
polaridad baja o media. La sílica es denominada de fase “normal” y durante la elusión los componentes
menos polares son los primeros que dejan la columna.
El uso de la sílica es más limitado en el caso de compuestos muy polares o sensibles a ácidos. En
esos casos es indicado el uso de fases estacionarias alternativas, tales como aquellas para fase reversa.
Fase reversa: costo de las fases comerciales; necesidad de equipos
Las fases estacionarias con elución en el modo reverso son de baja polaridad. La fase estacionaria es
generalmente una mezcla de agua más un solvente hidrosoluble (metanol, acetonitrilo, etc.). En este caso el
orden de elución es opuesto al de la fase “normal”: los compuestos de menor polaridad son más retenidos y
los de mayor polaridad son los primeros que dejan la columna durante la elución.
Esta técnica es muy utilizada para la separación de compuestos muy polares. Sin embargo, las fases
estacionarias reversas, como la sílica C-8 y la sílica C-18, son más caras que las fases normales (sílica). La
preparación de estas sílicas derivatizadas no es trivial y requiere instalaciones especiales. Además, debido a la
alta viscosidad de las fases móviles utilizadas, la elución normalmente se lleva a cabo bajo presión. Esto
requiere que las columnas sean de materiales más resistentes (acero inoxidable) y el desplazamiento del
solvente normalmente se efectúa con uso de bombas. Sistemas con estas características pueden ser de media
(mplc) o alta presión (hplc). Estos aspectos encarecen la técnica y por ello su uso es más restringido.
Fase reversa Alternativa
Recientemente optimizamos el uso de una fase reversa alternativa de bajo costo. La fase
estacionaria, originalmente desarrollada por el grupo de la Dra. Isabel Jardim (UNICAMP – Brasil) para uso
analítico, es de preparación y uso relativamente sencillos. La fase estacionaria es preparada a partir de sílica
normal y de un polímero siloxano (polimetiloctadecilsiloxano – PMODS o polimetiloctilsiloxano – PMOS). El
polímero se disuelve en hexano seco, se adiciona la sílica, también seca, y la mezcla es agitada lentamente. Se
deja evaporar el solvente lentamente. El material seco resultante se calienta en estufa a temperatura
controlada; ésta es la etapa crítica en la que ocurre la ligación química entre el polímero y la sílica.
Posteriormente, se remueve el exceso de polímero, se seca la fase estacionaria (silica PC-18) y ésta queda lista
para su uso.
El procedimiento para el uso de la sílica arriba descrito es semejante al del fraccionamiento al vacío
descrito líneas atrás. La diferencia es que ahora utilizamos solventes acuosos con proporciones variadas de un
co-solvente orgánico hidrosoluble. Se inicia la elución con solventes más polares (tal vez agua pura) y la
proporción del co-solvente orgánico se aumenta lentamente en cada fracción hasta la elución total.
El acompañamiento de la elución se lleva a cabo ccf en fase normal. Esto es así porque placas de
sílica en fase reversa son muy caras. Además, la sílica PC-18 descrita arriba no adhiere satisfactoriamente en
superficies como el vidrio, aún con la adición de yeso.
Ejemplo 3: Aislamiento de glicósidos bioactivos de Centella asiatica.
Los principales componentes bioactivos de la planta son los glicósidos madecasosideo y
asiaticosideo. Debido a su alta polaridad estos compuestos son ideales para el aislamiento en fase reversa. Se
utilizó 1,0 g del extracto de la planta y 40g de PC-18, empaquetada en una columna de vidrio. La elución se
llevó a cabo en vacío, con mezclas metanol:agua (0, 1, 5, 10, 15, 20, 30 % metanol) y las fracciones obtenidas se
analizaron mediante CCF (fig. 9). El madecasosídeo, el componente más polar, fue completamente eluído en
las dos primeras fracciones.
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Figura 9: CCF de las fracciones de C. asiatica
Ejemplo Completo
Introducción: Eupafolina y hispidulina (fig. 10) son dos flavonoides encontrados en algunas especies
vegetales. Varias propiedades biológicas han sido descritas de estos dos compuestos, como la citotóxica y la
anti-hepatotóxica. Trabajando con el extracto de las hojas de Eupatorium littorale (Asteraceae) detectamos, por
primera vez, la presencia de estos flavonoides en la planta. Las propiedades descritas motivaron el inicio de
estudios bioquímicos en mitocondrias para verificar la posible acción de éstos en la cadena respiratoria y
relacionar los resultados con las actividades biológicas. El trabajo bioquímico demandó el aislamiento
sucesivo de los flavonoides y, por ello, fue necesaria la optimización del aislamiento de estos compuestos.
OH
OH
OH
O
HO
O
HO
MeO
MeO
OH
O
OH
(hispidulina)
O
(eupafolina)
Figura 10. Hispidulina y Eupafolina
Preparación de la Muestra: las hojas de Eupatorium littorale, recientemente recolectadas, se colocaron
en una estufa con circulación de aire forzado, a 45 oC, por 48 horas. El material seco se trituró en un molino de
cuchillas y se almacenó.
Extracción: El polvo de E. littorale (1 kg) se sometió a extracción con metanol (3 L) a temperatura
ambiente, a través de maceración, por un período de siete días. Luego el extracto se filtró y el solvente se
evaporó bajo presión reducida obteniéndose el extracto bruto seco.
Fraccionamiento Preliminar: El objetivo aquí fue el de obtener fracciones ricas en los dos flavonoides.
Para esto se utilizó la técnica de cromatografía en columna con vacío, debido a la rapidez. Se empaquetó una
columna de vidrio (fig. 8) con sílica 60-H (Merck, 100,0 g). Se adicionó hexano y después de adaptar un balón
de fondo redondo en el encaje esmerilado se aplicó vacío para aumentar el grado de compactación de la sílica.
El extracto bruto de E. littorale (5,00 g) se aplicó en la parte superior de la columna y la elución al vacío se
llevó a cabo con mezclas (100 ml) de acetato de etilo en hexano en gradiente (0 al 100 %). El análisis de las
fracciones se llevó a cabo mediante ccf en sílica y se realizó la visualización con luz UV (254 nm). Las
fracciones 9 y 10 (70% acetato de etilo) conteniendo principalmente hispidulina se reunieron; la eupafolina
estaba presente en las fracciones 11-15 (70-100% acetato de etilo) que también fueron reunidas. Este primer
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fraccionamiento duró cerca de 8 horas. Las fracciones reunidas se siguieron refraccionando por cromatografía
en capa fina centrífuga (Chromatotron).
Optimización de la Fase Móvil: A pesar de que mezclas de hexano/acetato de etilo promovieron la
separación de hispidulina y eupafolina, resolvimos intentar mejorar la resolución. Una pequeña fracción del
extracto conteniendo los dos flavonoides se disolvió en metanol y aplicó en placas de sílica. Éstas se eluyeron
con varias combinaciones de solventes a fin de obtener la mejor separación. La visualización de las manchas
se llevó a cabo con luz UV (254 nm). Después de varios intentos concluimos que la mezcla de
diclorometano/metanol (97:3) producía la mejor resolución, significativamente mejor que la mezcla de acetato
de etilo/hexano (1:1) inicialmente utilizada.
Aislamiento Final: Las muestras se aplicaron en placa de sílica gel 60-PF254 (Merck) con 1 mm de
espesor. La elución se llevó a cabo con diclorometano-metanol (97:3) y se recolectaron fracciones de 10 ml. Las
fracciones conteniendo hispidulina (25 mg) o eupafolina (60 mg) se reunieron y se evaporó el solvente.
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Bibliografía
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