1. No category

EL DOMINIO DE LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA:
CÓMO CONTROLAR LA NUTRICIÓN DE
LAS BACTERIAS ENOLÓGICAS Y MINIMIZAR EL EFECTO
DE LOS INHIBIDORES
Magali DÉLÉRIS-BOU, José María HERAS y Sibylle KRIEGER-WEBER
Lallemand SAS, 19, rue des Briquetiers, 31702 Blagnac, Francia
1. Introducción
Las bacterias se caracterizan por tener necesidades nutricionales complejas. En el presente trabajo, trataremos en
detalle de las necesidades de las bacterias enológicas en cuanto a fuentes de carbono y nutrientes que contienen
nitrógeno, vitaminas y minerales. La falta de ciertos elementos nutricionales en un mosto o en un vino puede
tener una gran incidencia en la fermentación maloláctica (FML). Por ello, es importante comprender dichas necesidades y conocer las herramientas de las que dispone el enólogo para lograr una FML sana y completa
2. Las bacterias enológicas tienen unas necesidades nutricionales complejas
2.1 Métabolismo de los carbohidratos
En el vino, los azúcares constituyen la principal fuente de energía para las bacterias lácticas desempeñando así
un papel esencial en su crecimiento. Los principales azúcares del vino (hexosas) son la glucosa y la fructosa. Las
bacterias lácticas son capaces de utilizar ambas fuentes, aunque Oenococcus oeni prefiere la fructosa, el metabolismo conjunto de la glucosa y la fructosa ofrece ventajas en términos de energía.
Al final de la fermentación alcohólica (FA), la concentración de glucosa-fructosa es baja, pero satisface aún
las necesidades de las bacterias pues la concentración bacteriana es igualmente baja. En efecto, la mayoría de
bacterias lácticas son capaces de utilizar otros monosacáridos presentes en el vino (por ejemplo, la arabinosa, la
manosa, la galactosa, la xilosa, etc.) al igual que los polisacáridos y los compuestos glicosilados. O. oeni posee
una actividad glucosidasa extracelular (Guilloux-Benatier et al. 1993 y Guilloux-Benatier et al. 2000). Varios otros
estudios tales como los de Grimaldi et al. 2000, MacMahon et al. 1999 y Mansfield et al. 2002, han identificado
esta actividad glucosidasa y hoy sabemos que un gran número de precursores aromáticos se conjugan con los
residuos glucosídicos o con los disacáridos de glucosa. Estos compuestos aromáticos se liberan por la acción de
las bacterias enológicas.
2.2 Metabolismo de los ácidos orgánicos
Los principales ácidos orgánicos presentes en el mosto de la uva y en el vino al final de la FA y transformados por
Oenococcus oeni son los ácidos málico y cítrico.
2.2.1 Ácido Málico
La concentración de ácido málico en el mosto depende del grado de madurez de la uva y varía entre 0,7 y 8,6 g/L
(Cabanis y Cabanis 1998). La principal reacción en la FML es la descarboxilación del diácido L-málico del vino
1
en monoácido L-láctico. En el caso del vino, el sistema maloláctico es un mecanismo que le permite a O. oeni
recuperar energía en forma de trifosfato de adenosina (ATP) sintetizado y mantener un nivel de pH intracelular
propicio para la actividad enzimática y el desarrollo celular.
El ácido málico penetra la célula en su forma aniónica para ser descarboxilado en ácido láctico en el citoplasma
celular. La descarboxilación permite el consumo de un protón intracelular y la expulsión de protones por parte de
los simportadores lactato/H+. Un gradiente de protones – o «fuerza motriz protónica» – del medio vínico hacia
el interior de las células mantiene el pH intracelular de las bacterias (aproximadamente a 6,0) y conduce a la
formación de energía en forma de ATP.
2.2.2 Ácido Cítrico
El ácido cítrico, componente importante del mosto de la uva y del vino, tiene una concentración que oscila entre
0,1 y 0,7 g/L. La vía de degradación del ácido cítrico por parte de las bacterias lácticas provoca la formación
de tres tipos de compuestos: ácido acético, lípidos y derivados acetoínicos (acetoína, butanodiol y diacetilo). El
metabolismo del ácido cítrico es también una fuente de energía para O. oeni.
En general, el consumo de ácido cítrico comienza después del consumo de ácido málico. En el caso de la especie
O. oeni, el efecto de la cepa es de gran importancia en lo que se refiere al momento del ataque del citrato y de
la velocidad con la que se consume el ácido cítrico. Mientras que ciertas cepas que producen altos niveles de
diacetilo empiezan a consumir el ácido cítrico desde la mitad de la FML, otras cepas – de mayor interés para los
enólogos ya que permiten evitar las notas mantecosas – no empiezan a metabolizar el ácido cítrico hasta que ya
no quede más ácido málico por consumir (Krieger 2012).
3. Metabolismo de las Fuentes de Nitrógeno
Los aminoácidos libres y aquellos que provienen de la hidrólisis de los péptidos son las principales fuentes de
nitrógeno para las bacterias enológicas. Contrariamente a las levaduras, los aminoácidos que necesitan las bacterias enológicas no pueden ser sintetizados a partir del nitrógeno amoniacal. Por consiguiente, los aminoácidos
deben provenir del medio o ser sintetizados por las bacterias mediante los precursores carboxílicos
3.1 Aminoácidos
La necesidad de aminoácidos de las bacterias depende no solo de la especie sino también de la cepa. La identificación de los aminoácidos esenciales para O. oeni ha sido objeto de muchos estudios. La técnica preferida
consiste en comparar el crecimiento bacteriano en un medio que contenga todos los aminoácidos necesarios (un
medio completo) con las bacterias de un medio que carezca de uno de dichos aminoácidos.
Las investigaciones de Garvie en 1967, de Fourcassié et al. en 1992, de Remize et al. en el 2006 y de Terrade
et al. en el 2009 trataron de las necesidades de nueve, seis, cinco y dos cepas de O. oeni, respectivamente. Las
diferencias entre las metodologías utilizadas por los investigadores (por ejemplo, el medio de cultivo, las cepas
utilizadas, la etapa de lavado de la biomasa, los transplantes sucesivos, etc.) explican los diferentes resultados que
se obtuvieron de estas investigaciones.
La siguiente tabla, adaptada del libro «Les bactéries lactiques en œnologie» de Alexandre et al., resume los resultados de estas investigaciones.
Dependiendo de cada caso, se dice que el aminoácido que falta en el medio de cultivo es:
• «Esencial», cuando la biomasa que se forma representa menos del 20% de la biomasa del cultivo testigo.
• «Necesario», cuando la biomasa que se forma representa entre el 20% y el 80% de la biomasa del
cultivo testigo.
• «Indiferente», cuando la biomasa que se forma representa menos del 80% de la biomasa del cultivo
testigo.
2
Tabla 1. C
omparación de los aminoácidos necesarios para 22 cepas de Oenococcus oeni (adaptada de «Les
bactéries lactiques en œnologie» de Alexandre et al.)
Garbie 1967
Fourcassié et al. 1992
Remize et al. 2006
Terrade et al. 2009
Ácido glutámico
Esencial
Esencial
Esencial
Esencial (1/2)
Indiferente (1/2)
Arginina
Esencial
Esencial
Esencial
Esencial
Isoleucina
Esencial
Esencial
Esencial (3/5)
Necesaria (2/5)
Esencial
Triptófano
Esencial (7/9)
Necesario (2/9)
Esencial
Esencial (4/5)
Necesario (1/5)
Esencial
Metionina
Esencial (4/9)
Necesaria (5/9)
Esencial
Esencial
Esencial
Valina
Esencial
Esencial (3/6)
Necesaria (3/6)
Esencial (4/5)
Necesaria (1/5)
Esencial
Cisteína
Esencial
Esencial (4/6)
Indiferente (2/6)
Esencial (1/5)
Necesaria (4/5)
Esencial
Tirosina
Esencial
Esencial (1/6)
Indiferente (5/6)
Esencial
Esencial
Fenilalanina
Esencial (7/9)
Necesaria (2/9)
Esencial (1/6)
Indiferente (5/6)
Esencial
Esencial
Histidina
Esencial (6/9)
Necesaria (3/9)
Esencial (1/6)
Indiferente (5/6)
Esencial (3/5)
Necesaria (2/5)
Esencial
Serina
Esencial (2/9)
Necesaria (5/9)
Indiferente (2/9)
Esencial
Esencial (1/2)
Necesaria (1/2)
Lisina
Indiferente
Ácido aspártico
Necesario (3/9)
Indiferente (6/9)
Esencial (1/6)
Necesaria (3/6)
Indiferente (2/6)
Esencial (1/5)
Necesaria (4/5)
Necesario
Esencial (1/5)
Necesario (3/5)
Indiferente (2/5)
Leucina
Esencial (1/9)
Necesaria (1/9)
Indiferente (5/9)
Esencial (3/6)
Necesaria (3/6)
Esencial (4/5)
Necesaria (1/5)
Esencial
Treonina
Esencial (1/9)
Necesaria (1/9)
Indiferente (7/9)
Indiferente
Esencial (1/5)
Necesaria (2/5)
Indiferente (3/5)
Esencial
Glicina
Esencial (2/9)
Necesaria (1/9)
Indiferente (6/9)
Indiferente
Esencial (1/5)
Necesaria (2/5)
Indiferente (3/5)
Esencial
Prolina
Indiferente
Indiferente
Necesaria (3/5)
Indiferente (3/5)
Esencial
Alanina
Indiferente
Indiferente
Necesaria (1/5)
Indiferente (4/5)
La arginina es un aminoácido esencial para las 22 cepas estudiadas. Así, aminoácidos tales como el ácido glutámico, la isoleucina, el triptófano, la metionina, la valina, la cisteína, la tirosina, la histidina y la fenilalanina son
esenciales para el cultivo de la mayoría de cepas.
3
Por el contrario, la falta de prolina o de alanina en el medio no afecta el desarrollo de la mayoría de cepas, por
lo cual, se consideran como aminoácidos indiferentes.
Los resultados que Remize et al. obtuvieron en el 2006 tras el estudio de dos cepas de O. oeni seleccionadas se
presentan en las figuras 1 y 2.
Lalvin 31®
120
100
80
60
40
20
r
Se
u
Ph
e
Gl
Ty
r
Va
l
Cy
s
Ar
g
et
M
As
p
Le
u
Tr
p
s
Hi
Ile
y
Ly
s
Th
r
Gi
Pr
o
a
Co
nt
ro
l
0
Al
% ∆ DO respecto del control
Figura 1. L alvin31®: Crecimiento en un medio sintético completo o en el mismo medio en el que falte algún
aminoácido (resultados expresados como porcentaje de la densidad óptica [DO] a 600 nm)
Aminoácidos eliminados
aminoácido (resultados expresados como porcentaje de la densidad óptica [DO] a 600 nm)
Alpha™ MBR
140
120
100
80
60
40
20
u
Gl
Ph
e
Ty
r
r
Se
et
M
Tr
p
Le
u
As
p
s
Hi
Va
l
Ar
g
Iso
Ly
s
Cy
s
Pr
o
Th
r
y
Gi
a
Co
nt
ro
l
0
Al
% ∆ DO respecto del control
Figura 2. Alpha™ MBR: Crecimiento en un medio sintético completo o en el mismo medio en el que falte algún
Aminoácidos eliminados
Los investigadores se han interesado también en los requisitos de las cepas de Lactobacillus. En Terrade et al.
2009, los autores concluyen que la cantidad de aminoácidos esenciales para una cepa de L. buchneri y una cepa
de L. hilgardii es menor que la cantidad necesaria para dos cepas de O. oeni: cinco aminoácidos son esenciales
para L. buchneri y ocho para L. hilgardii, en comparación con los 13 y 16 aminoácidos esenciales para las dos
cepas de O. oeni.
4
Tabla 2. Nutrientes esenciales para cuatro cepas de bacterias enológicas (Terrade et al. 2009)
O. oeni C1
O oeni C2
L. buchneri
L. hilgardii MHP
D-ribosa
D-ribosa
D-ribosa
D-ribosa
K2HPO4
K2HPO4
K2HPO4
K2HPO4
L-histidina
L-histidina
L-prolina
L-fenilalanina
L-fenilalanina
L-fenilalanina
L-leucina
L-prolina
L-prolina
L-serina
L-valina
L-leucina
L-leucina
L-asparagina
L-arginina
L-valina
L-valina
L-prolina
L-isoleucina
L-glutamato
L-metionina
L-leucina
Ácido nicotínico
L-cisteína
L-triptófano
L-valina
Ca-D-pantotenato
L-arginina
L-cisteína
L-metionina
Riboflavina
Ácido nicotínico
L-arginina
L-glutamato
Ca-D-pantotenato
L-glicina
L-triptófano
Riboflavina
L-treonina
L-cisteína
L-tirosina
L-arginina
Ácido nicotínico
L-glicina
Ca-D-pantotenato
L-treonina
L-tirosina
Ácido nicotínico
Ca-D-pantotenato
En la práctica, la cantidad de aminoácidos esenciales para una cepa es importante, pues esta indica que, en un
medio que carezca de aminoácidos, las cepas de Lactobacillus, que suelen ser indeseables, se desarrollaran más
fácilmente que las cepas de O. oeni.
3.2 Péptidos
Además de los aminoácidos libres, los péptidos pueden constituir otra fuente de nitrógeno. Las bacterias enológicas tienen a la vez actividades proteolíticas (degradación de proteínas) y peptidolíticas (degradación de péptidos),
y pueden obtener los aminoácidos necesarios o esenciales para su crecimiento gracias a los péptidos.
Las investigaciones acerca de la naturaleza del nitrógeno metabolizado por O. oeni han demostrado que la presencia de péptidos de levadura (fracciones entre 0,5 y 10 KDa) en el medio contribuyen sobre todo al desarrollo
de O. oeni, en comparación con un medio que solo contiene aminoácidos libres (Remize et al. 2005). Asimismo,
se ha demostrado que al metabolismo de los péptidos le sigue la liberación de aminoácidos libres hacia el medio.
Los péptidos parecen ser entonces la fuente de nitrógeno clave para el desarrollo de O. oeni. En términos de
energía, las células bacterianas aprovechan el consumo de péptidos. En efecto, es bastante probable que ciertos
péptidos estén más sujetos que otros a ser hidrolizados y transportados por las bacterias. Dichos péptidos son
particularmente estimuladores puesto que permiten que se genere energía con una mayor productividad (Alexandre et al. 2008).
En la práctica, sabemos que en algunas variedades, como el Chardonnay, resulta más difícilllevar a cabo la FML,
aun en ausencia de factores inhibidores (por ejemplo, pH bajo, SO2 molecular alto), y se sospecha que la razón
sea una carencia de nutrientes esenciales. En el laboratorio de investigación y desarrollo de Lallemand , se han
llevado a cabo ensayos para evaluar el impacto de la adición de varios péptidos a un vino Chardonnay. Los resultados se obtuvieron después de haber adicionado un péptido considerado particularmente estimulador.
5
Protocolo del experimento:
• Medio: Vino blanco Chardonnay (pH de 3,2, etanol 12,9%, SO2 total <25 mg/L, SO2 libre <5 mg/L)
• Preparación de tres medios por cepa:
• Testigo: Vino sin ninguna adición
• Vino + péptido a razón de 5 mg/L
• Vino + péptido a razón de 20 mg/L
• Inoculación en cada medio después de la rehidratación de las bacterias MBR® A, B, C y D en agua no
clorada durante 15 minutos, a 20°C
• Incubación de las muestras de ensayo en recipientes de vidrio a 20°C
• Seguimiento de la población bacteriana mediante su conteo en un medio MRS modificado.
La figura 3 presenta la población bacteriana siete días después de la inoculación. La adición de este péptido a
razón de 5 mg/L al vino blanco Chardonnay ejerce un efecto estimulador sobre el desarrollo de las cuatro cepas
seleccionadas para el ensayo. Los estudios sobre O. oeni han demostrado que los aminoácidos ligados que son
transportados al interior de la célula son liberados y regresan al medio en su forma libre. Los péptidos, aunque
fueron transportados, no son necesariamente consumidos (Ritt et al. 2008). La hipótesis propuesta era que dicho
transporte se llevaba a cabo con el fin de ahorrar energía. En efecto, parece que esta interiorización de aminoácidos ligados requiere menos energía que en el caso de los aminoácidos libres (Konings 2002 y Kunji et al. 1993),
cuyo transporte puede realizarse por diferentes vías. Además, la excreción de aminoácidos libres por parte de los
simportadores protónicos genera la fuerza protón- motriz necesaria para la síntesis de ATP. Desde el punto de
vista energético, podría demostrarse que dicho péptido presenta una ventaja ya que mejora la resistencia de las
bacterias en un medio ácido (pH de 3,2).
Figura 3. Impacto de la adición de un péptido con dos concentraciones diferentes (5 mg/L y 20 mg/L) al cultivo
EffetOenococcus
de l'ajout d'un
surblanco
la croissance
de 4 (Lallemand
souches R & D)
de cuatro cepas de bacteria
oeni peptide
de un vino
Chardonnay
d'Oenococcus oeni dans un vin blanc Chardonnay
Población bacteriana
7 días después
de la inoculación
(UFC/mL)
1,00E+08
1,00E+07
1,00E+06
1,00E+05
Cepa A
Cepa B
Cepa C
Cepa D
Testigo
1,04E+06
1,35E+07
3,83E+06
1,94E+07
Vino + péptido 5mg/L
4,78E+06
1,93E+07
8,31E+06
2,81E+07
Vino + péptido 20 mg/L
9,98E+06
2,30E+07
1,02E+07
5,54E+07
6
4. Necesidades en vitaminas
Las bacterias lácticas necesitan varias vitaminas de la familia B, especialmente el ácido pantoténico (vitamina
B5), la biotina (B8), la tiamina (B1) y la niacina (B3). Aunque la piridoxina (B6) y la riboflavina (B2) no son
esenciales, estas también pueden contribuir al óptimo crecimiento de las cepas. El ácido pantoténico, presente
en gran cantidad en el jugo de tomate al igual que en los jugos de uva y manzana, fue considerado por mucho
tiempo como un factor de crecimiento especial para O. oeni y se encuentra en numerosos medios de cultivo de
esta especie.
En un estudio realizado por Terrade et al. en el 2009, se demostró que la presencia de la niacina (B3) y del ácido
pantoténico era esencial para el crecimiento de cuatro bacterias enológicas (dos O. oeni y dos Lactobacillus sp.),
y que la riboflavina era solamente necesaria para dos bacterias Lactobacillus sp. La piridoxina (B6), por su parte,
tenía un efecto estimulador en el cultivo de las cuatro cepas.
5. Influencia de los Minerales
Algunos minerales, como el magnesio, el manganeso, el potasio y el sodio son importantes porque son cofactores enzimáticos o porque intervienen en los mecanismos de transporte. Pocos estudios se han interesado en la
necesidad de minerales de estas cepas.
Las bacterias enológicas tienen necesidades nutricionales múltiples y complejas, y el satisfacerlas contribuye al
éxito de la FML. En consecuencia, cualquier carencia de estos elementos activadores del proceso de FML debe
ser remediada con activadores específicos obtenidos a partir de levaduras inactivas específicas, las cuales son
fuentes naturales de aminoácidos, péptidos, vitaminas y minerales, y son vitales para el crecimiento y la supervivencia de O. oeni.
6. Estrategias Para Garantizar una FML Completa
6.1 El vino es un medio no propicio para el desarrollo bacteriano
El vino constituye un medio estresante para las bacterias. Así pues, la acidez, el alcohol, los sulfitos y la temperatura (por debajo de 18°C) son factores que inhiben el crecimiento bacteriano. Además de ello, la levadura produce factores inhibidores durante la FA tales como el SO2, los ácidos grasos de cadena media y los péptidos. La
carencia de nutrientes en el medio constituye también un factor inhibidor. Algunas prácticas en enología, como
la clarificación, eliminan los nutrientes y las partículas en suspensión que favorecen el crecimiento bacteriano.
Como se explicó antes, algunos aminoácidos son indispensables para el crecimiento de O. oeni. Hacia el final de
la FA, el nivel de nitrógeno orgánico varía considerablemente de un vino a otro. Renouf (2013) ha publicado los
resultados de su análisis con respecto al nivel de aminoácidos esenciales al final de la FA y antes de la FML en
vinos de diversas varietdades (Merlot, Cabernet Sauvignon, Malbec, Chardonnay, Syrah, Tannat y Pinot Noir) y de
distintas denominaciones. Renouf expone las variaciones de los factores, clasificadas estas de 1 a 10, en el nivel
total de aminoácidos vitales para el crecimiento de O. oeni. Lograr la FML completa fue particularmente difícil
en el caso del vino con las mayores deficiencias.
6.2 Utilización de activadores de fermentación maloláctica
En general se considera que una buena FA depende de una cantidad suficiente de nutrientes para las levaduras
y, asimismo, la FML necesita suficientes nutrientes para las bacterias. Hoy en día existen soluciones para lograr
una FML completa.
La figura 4 presenta los resultados del análisis de ensayo realizado con un vino Cabernet Sauvignon (etanol 14%
con un pH de 3,56, SO2 total <25 mg/L, SO2 libre de 5 mg/L), los cuales se encontraban dentro de los parámetros
que se recomiendan para la bacteria Alpha MBR®.
7
Se compararon tres protocolos de FML:
• Inoculación directa en el vino con la bacteria Alpha MBR®
• Inoculación directa en el vino con la bacteria Alpha MBR® y adición del activador de fermentación
Opti’Malo Plus® a razón de 20 g/hL
• Vino testigo sin inoculación con bacterias específicas.
La temperatura de ensayo era de 18°C.
En el vino testigo, en el que no se inoculó ninguna bacteria seleccionada, la población bacteriana se mantuvo
muy baja durante los 21 días del ensayo, sin llegar nunca a más de 1x104 UFC/mL. Con una población bacteriana tan baja, la concentración de ácido málico se mantuvo estable.
En el vino en el que se inocularon bacterias seleccionadas sin adición de ningún nutriente, la población bacteriana se mantuvo durante los primeros siete días tras la inoculación y empezó luego a disminuir paulatinamente.
Diez días después de la inoculación, la muerte de las bacterias condujo al fin de la degradación del ácido málico.
Sin embargo, en el vino al que se le añadió el activador de FML se observó un crecimiento bacteriano rápido
y continuo tras la inoculación. El ácido málico fue completamente metabolizado al cabo de 11 días. Este vino
carecía probablemente de al menos un elemento esencial para el desarrollo de la bacteria Alpha.
Figura 4. Impacto de la adición de nutrientes para bacterias Opti’Malo Plus® en la fermentación maloláctica
Progresión de la FML
(conteo de células bacterianas y ácido málico)
Cabernet Sauvignon: Etanol 14%, pH de 3,56, SO2 total 25 mg/L, SO2 libre 5 mg/L
1,00E+08
3,0
2,5
1,00E+07
2,0
1,5
1,00E+06
1,0
0,5
0
0
5
10
15
20
Población (UFC/mL)
L-ácido málico (g/L)
3,5
Alpha MBR® (ácido málico)
Alpha MBR® + nutrientes (ácido málico)
Testigo (sin inocular, ácido málico)
Alpha MBR® (conteo celular)
Alpha MBR® + nutrientes (conteo celular)
1,00E+05
25
Duración (días)
6.2.1 El caso de los Vinos Blancos
Como ya se explicó, en el caso de los vinos blancos, especialmente del varietal Chardonnay, el inicio de la FML
se hace más difícil.
En un estudio de los vinos Chardonnay, se analizaron los efectos de la inoculación con diversas cepas de bacteria
y la adición de activadores de FML. Dicho estudio se interesó en particular en los preparados de levaduras inactivas que contienen el activador peptídico cuyo efecto benéfico se muestra en la figura 1. Los resultados que se
presentan en la figura 5 son un esbozo de las observaciones del estudio.
En el marco de esta investigación sobre el vino Chardonnay, se compararon los siguientes protocolos:
• Inoculación con la cepa de bacteria Alpha, Beta o PN4
• Adición de un activador de FML a razón de 20 g/hL
• Tipos de activadores: nutriente A (activador testigo) y un nuevo activador con un alto contenido en péptidos (Opti’ML Blanc®).
8
Dependiendo de la cepa utilizada, la FML sin adición de nutrientes puede durar entre 28 y 30 días. En este medio, muy probablemente con carencia de elementos esenciales para el crecimiento de las bacterias, el hecho de
añadir un complejo de nutrientes rico en aminoácidos, péptidos y vitaminas reducirá ostensiblemente la duración
de la FML, sea cual sea la cepa. Para las bacterias vínicas Alpha y Beta, el nuevo activador es más efectivo que
el nutriente testigo.
Figura 5. Estudio sobre un nutriente para aplicación en Chardonnay
Duración de la fermentación maloláctica con 3 cepas y 2 activadores
35
30
Días
25
20
15
10
5
0
Alpha
Duración de la FML
28
Alpha +
nutriente
A
16
Alpha +
OptiML
Blanc
6
Beta
28
Beta +
nutriente
A
21
Beta +
OptiML
Blanc
7
PN4
30
PN4 +
nutriente
A
7
PN4 +
OptiML
Blanc
6
6.2.2 El caso de los Vinos Tintos Concentrados
En la práctica, lograr una FML exitosa es también difícil en los vinos tintos con altas concentraciones de polifenoles. Tal es el caso, por lo general, de los vinos Merlot y Tannat, del suroccidente de Francia, y del Graciano,
de España.
Muchas investigaciones se han llevado a cabo con el fin de analizar la incidencia de los polifenoles en el crecimiento y viabilidad de las bacterias lácticas y en el metabolismo del ácido málico degradado, a veces, con
resultados contradictorios. Aparentemente, los polifenoles pueden ejercer un efecto a veces estimulador y otras
veces inhibidor sobre el crecimiento y actividad de las bacterias, dependiendo de la cepa y de la naturaleza y
concentración de los polifenoles analizados. Por el momento, la información acerca de los mecanismos moleculares allí involucrados es muy poca.
Muchos estudios han confirmado el efecto estimulador del ácido gálico en el crecimiento de las cepas de O. oeni
y en la velocidad con la que se degrada el ácido málico (Lombardi et al. 2012, Reguant et al. 2000 y Vivas et al.
1997).
Como en el caso de los ácidos hidroxicinámicos (García-Ruiz et al. 2009), Campos et al. demostraron (en el
2003) que los ácidos p-cumárico y cafeico tienen un fuerte efecto inhibidor sobre las bacterias L. hilgardii y Pediococcus pentosaceus. Los tres ácidos hidroxicinámicos (cafeico, ferúlico y p-cumárico) ejercen también efectos
inhibidores sobre las bacterias O. oeni (Reguant et al. 2000).
Con respecto a los flavonoles, las opiniones son divergentes, pues algunos autores afirman que estos ejercen un
efecto inhibidor (Cushnie y Lambert 2005), mientras otros dicen que ejercen un efecto estimulador (Reguant et
al. 2000) sobre el crecimiento y la velocidad de degradación del ácido málico.
Parece ser también que la presencia de la catequina y la epicatequina, en las concentraciones que se observan
generalmente en el vino, no tiene ningún efecto inhibidor en el crecimiento de O. oeni (entre 10 y 200 mg/L)
(Lombardi et al. 2012). Incluso, la catequina estimularía el crecimiento de O. oeni y su efecto incrementaría cuanto más alta fuere su concentración en el vino (Reguant et al. 2000 y Alberto et al. 2001).
Los taninos condensados serían muy tóxicos (Vivas et al. 2000), aun en concentraciones muy bajas, por debajo
de los niveles normales del vino (0,5 g/L) (Figueiredo et al. 2007).
9
La presencia simultánea de moléculas que activan e inhiben el crecimiento, la viabilidad y la FML crea un balance que facilita, por lo general, el crecimiento de las bacterias lácticas. Asimismo, un gran número de taninos
se polimerizan con otras moléculas, reduciendo así los efectos tóxicos. El arranque de la FML se hace aún más
difícil con un vino que contenga esencialmente taninos poco polimerizados.
Recientemente, se han llevado a cabo ensayos con el fin de examinar el impacto de los extractos polifenólicos
en la FML (Lonvaud-Funel 2013). Dichos extractos provienen de tres variedades de uva: Merlot, Cabernet Sauvignon y Tannat. Para cada extracto, se utilizaron 200 mL de vino; después de la evaporación a una temperatura de
30°C, los residuos obtenidos fueron resuspendidos en agua acidificada. La fracción polifenólica se midió tras la
eliminación de azúcares y ácidos por medio de una purificación en columna. Al final, se añadieron los extractos
a un vino Chardonnay (etanol al 12,0%, pH de 3,5, SO2 total <20 mg/L) en concentraciones equivalentes a las
concentraciones de polifenoles presentes inicialmente en el vino.
Figura 6. Cinéticas de fermentación maloláctica (concentración de ácido málico) en un vino Chardonnay (testigo)
y en el mismo vino tras la adición de extractos de Cabernet Sauvignon (CS1, CS2 y CS3) y de Tannat (T) (LonvaudFunel, 2013)
Ácido málico (g/L)
1,0E+08
1,0E+07
CS1
1,0E+06
CS2
1,0E+05
CS3
1,0E+04
T
1,0E+03
Testigo
1,0E+02
1,0E+01
0
2
4
6
8
Días
10
12
14
16
Los ensayos realizados con diferentes extractos demostraron que, en el caso de las dos cepas de O. oeni, el crecimiento bacteriano es inhibido al añadir extractos provenientes del Cabernet Sauvignon y del Tannat (en la figura
6 se presentan los datos obtenidos con una de estas cepas). El resultado es una desaceleración significativa de
la degradación del ácido málico. A pesar de que la FML se completó en 10 días con el vino Chardonnay al que
no se le agregaron extractos polifenólicos, había entre 1 y 1,5 g/L de ácido málico en el vino enriquecido con el
extracto.
La adición de preparados de levaduras inactivadas – L1 y L2 – en estos medios, se estudió con el fin de disminuir
los efectos inhibidores en la FML.
10
Figura 7. Crecimiento bacteriano en un vino Chardonnay al que se le han añadido extractos de Cabernet
Sauvignon (CS1, CS2 y CS3) y en el mismo vino enriquecido con levaduras inactivadas L1 y L2 (Lonvaud-Funel,
2013)
Población (ufc/mL)
1,0E+09
CS1+CS2
1,0E+08
CS1+CS2+L1
1,0E+07
CS1+CS2+L2
CS3
1,0E+06
CS3+L1
1,0E+05
CS3+L2
1,0E+04
Testigo
1,0E+03
0
2
4
6
8
10
Días
Figura 8. Crecimiento bacteriano en un vino Chardonnay al que se le han añadido extractos de Tannat (T) y en el
mismo vino enriquecido con levaduras inactivadas L1 y L2 (Lonvaud-Funel, 2013)
Población (ufc/mL)
1,0E+09
T
1,0E+08
1,0E+07
T+LI 1
1,0E+06
T+LI2
1,0E+05
Testigo
1,0E+04
1,0E+03
0
5
Días
10
Como se puede ver en las figuras 7 y 8, la FML fue estimulada en el vino Chardonnay al que se le añadieron preparados de levaduras inactivadas con respecto al vino Chardonnay testigo. De ello podemos concluir que dichos
preparados contribuyen a la eliminación del efecto inhibidor asociado a la adición de extractos polifenólicos. Es
posible que los preparados de levaduras inactivadas tengan una repercusión en diversos ámbitos, especialmente
debida al enlace de los derivados de levaduras con los taninos, el cual reduce su toxicidad frente a la bacterias.
La medición del potencial redox indica también que este disminuye con la adición de dos nutrientes, lo cual contribuye a su vez a la estimulación del crecimiento bacteriano. Así pues, es evidente que estos activadores ayudan
a enriquecer el perfil nutricional del vino y, asimismo, estimulan el crecimiento de las bacterias.
Los vinos tintos concentrados producidos durante las cosechas del 2012 y 2013 fueron sometidos a ensayos de
adición de levaduras L1 inactivadas (ML Red Boost™).
En las figuras 9 y 10 se presentan los resultados de un vino Tannat con las siguientes características: etanol al
14,6%, pH de 3,6, SO2 total <25 mg/L, SO2 libre <5 mg/L, índice total de polifenoles [ITP] igual a 90). A las tres
cepas analizadas se les añadió la levadura ML Red Boost™ 24 horas antes de agregar las bacterias con el fin de
aumentar la conductividad del medio para el crecimiento de O. oeni (disminuyendo la acción inhibidora de los
taninos). El efecto de ello fue significativo en lo que respecta a la velocidad con la que las bacterias lácticas se
desarrollaron. De hecho, ocho días después de la inoculación, la población bacteriana de las cepas A y B era
60% mayor en los medios tratados con el activador ML Red Boost™ que en los medios no tratados. En el caso de
la cepa 7, la diferencia era impresionante: el nivel de la población bacteriana en el vino tratado con el activador
era 700 veces mayor que en el vino inoculado con las bacterias pero sin tratamiento activador. Dos semanas
11
después de la inoculación, las diferencias del nivel de las poblaciones eran aún mayores, lo cual se traduce en
duraciones de FML mucho más cortas en todos los medios a los que se les suministraron suplementos nutritivos
(véase la figura 10).
Figura 9. Poblaciones
bacterianas 8 y 14 días después de la inoculación con tres cepas de bacterias, con y
sin adición del preparado de levaduras inactivadas ML Red Boost™
Tannat: Etanol 14,6%, pH de 3,6, SO2 total <25 mg/L, SO2 libre <5 mg/L,
índice total de polifenoles (ITP) = 90
Oenococcus oeni (ufc/mL)
1,4E+07
1,2E+07
1,0E+07
8,0E+06
6,0E+06
4,0E+06
2,0E+06
0,0E+00
8
16
Cepa A
1,3E+06
1,7E+06
ML Red Boost™ + Cepa A
2,1E+06
1,0E+07
Cepa B
7,2E+05
1,1E+06
ML Red Boost™ + Cepa B
1,2E+06
8,9E+06
Cepa C
5,3E+05
1,7E+05
ML Red Boost™ + Cepa C
4,3E+06
1,3E+07
Figura 10. D
uración de la fermentación maloláctica con tres cepas de bacteria diferentes, con y sin adición del
preparado de levaduras inactivadas ML Red Boost™
Tannat: Etanol al 14,6%, pH de 3,6, SO2 total <25 mg/L, SO2 libre <5 mg/L,
índice total de polifenoles (ITP) = 90
70
60
50
40
30
20
10
0
Cepa A
ML Red Boost™ +
Cepa A
Cepa B
ML Red Boost™ +
Cepa B
Cepa C
ML Red Boost™ +
Cepa C
12
7. Conclusión
Aunque el mecanismo general de la fermentación maloláctica (FML) es bastante bien conocido, la exploración
específica del metabolismo de Oenococcus oeni no empezó sino recientemente y es ahora el tema de numerosos
estudios. La creencia según la cual el ácido L-málico es suficiente para suplir las necesidades energéticas del
desarrollo de O. oeni es aun difundida. No obstante, la verdad es otra. De hecho, las bacterias lácticas son microorganismos particularmente exigentes y tienen necesidades nutricionales complejas. La falta de ciertos nutrientes
esenciales para la implantación, crecimiento y metabolismo de O. oeni pueden ocasionar un retraso e, incluso, el
fracaso de la FML. Afortunadamente, existen soluciones a este problema. Las deficiencias nutricionales así como
los inhibidores bacterianos varían de un medio a otro; su efecto negativo puede entonces limitarse añadiendo
activadores de fermentación, cuya selección es diferente para los vinos blancos y para los tintos. Hemos descrito
varios nutrientes específicos para los que se han optimizado diferentes formulaciones dependiendo de las aplicaciones y necesidades. Así, por ejemplo, el activador Opti’ML Blanc® fue concebido para estimular el crecimiento
de determinadas bacterias y, por consiguiente, para reducir la duración de la FML, en los vinos blancos que se
asocian a una FML difícil, como es el caso de algunos vinos Chardonnay. Diseñado para los vinos tintos ricos en
polifenoles, el activador ML Red Boost™, que debe ser añadido antes de la inoculación con bacterias seleccionadas, contribuye a la implantación de dichas bacterias en estos medios más hostiles.
Bibliografía
Alberto, M. R., M. E. Farías y M. C. Manca de Nadra. Effect of gallic acid and catechin on Lactobacillus hilgardii
5w growth and metabolism of organic compounds. J. Agric. Food Chem. 49:4359–4363; 2001.
Alexandre, H., C. Grandvalet, M. Guilloux-Benatier, F. Remize-Barnavon y R. Tourdot-Maréchal. Les bactéries
lactiques en œnologie. Tec & Doc, Lavoisier (Ed.), París; 2008.
Cabanis, J. C. y M. T. Cabanis. Acides organiques en œnologie : fondements scientifiques et technologiques. Tec
& Doc, Lavoisier (Ed.), París; 1998.
Campos, F. M., J. A. Couto y T. A. Hogg. Influence of phenolic acids on growth and inactivation of Oenococcus
oeni and Lactobacillus hilgardii. J. Appl. Microbiol. 94:167-174; 2003.
Cushnie, T. P. y A. J. Lambert. Antimicrobial activity of flavonoids. Int. J. Antimicrob. Agents. 26:343-356; 2005.
Figueiredo, A. R., F. Campos, V. de Freitas, T. Hogg y J. A. Couto. Influence of phenolic acids on growth and inactivation of Oenococcus oeni and Lactobacillus hilgardii. Food Microbiol. 25:105-112; 2007.
Fourcassié, P., A. Makaga-Kabinda-Massard, A. Belarbi y A. Maujean. Growth, D-glucose utilization and malolactic fermentation by Leuconostoc oenos strains in 18 media deficient in one amino acid. J. Appl. Bacteriol. 73:489496; 1992.
García-Ruiz, A., B. Bartolomé, A. J. Martínez-Rodríguez, E. Pueyo, P. J. Martín-Álvarez y M. V. Moreno-Arribas.
Potential of phenolic compounds for controlling lactic acid bacteria growth in wine. Food Control. 19:835-841;
2009.
Garvie, E. The growth factor and amino acid requirements of species of the genus Leuconostoc, including Leuconostoc paramesenteroides (sp. nov) and Leuconostoc oenos. J. Gen. Microbiol. 48:439-447; 1967.
Grimaldi, A., H. McLean y V. Jiranek. Identification and partial characterization of glycosidic activities of commercial strains of the lactic acid bacteria Oenococcus oeni. Am. J. Enol. Vitic. 51:362-369; 2000.
Guilloux-Benatier, M., H. S. Son, S. Bouhier y M. Feuillat. Activités enzymatiques : glycosidases et peptidase
chez Leuconostoc oenos au cours de la croissance bactérienne. Influence des macromolécules de levures. Vitis.
32:51-57; 1993.
Guilloux-Benatier, M., O. Pageault, A. Man y M. Feuillat. Lysis of yeast cells by Oenococcus oeni enzymes. J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 25:193-195; 2000.
Konings, W. N. The cell membrane and the struggle for life of lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek.
82:3-27; 2002.
13
Krieger, S. (no acreditado). Sculpting the Aromatic Profile of Wines through Diacetyl Management. Winemaking
Update. Lallemand; 2012.
Kunji, E. R., E. J. Smid, R. Plapp, B. Poolman y W. N. Konings. Di-tripeptides and oligopeptides are taken up via
distinct transport mechanisms in Lactococcus lactis. J. Bacteriol. 175:2052-2059; 1993.
Lombardi, S. J., P. Tremonte, M. Succi, B. Testa, G. Pannella, L. Tipaldi, E. Sorrentino, R. Coppola y M. Iorizzo.
Effect of phenolic compounds on the growth and l-malic acid metabolism of Oenococcus oeni. Journal of Life
Sciences. 6:1225-1231; 2012.
MacMahon, H., B. W. Zoeckelein, K. Fungelsang y Y. Jasinsky. Quantification of glycosidase activities in selected
yeast and lactic acid bacteria. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 23:198-203; 1999.
Mansfield, A.K., B.W. Zoecklein y R. Whiton. Quantification of glycosidase activity in selected strains of Brettanomyces bruxellensis and Oenococcus oeni. American Journal of Enology and Viticulture. 53:303-307; 2002.
Radler, F. Uber dir Milchsaurebakterien des Weins und den biologischen Saureabbau II. Physiologie und Okologie
der Bakterien. Vitis. 3:207-236; 1963.
Reguant, C., A. Bordons, L. Arola y N. Rozes. Influence of phenolic compounds on the physiology of Oenococcus
oeni from wine. J. Appl. Microbiol. 88:1065-1071; 2000.
Remize, F., Y. Augagneur, M. Guilloux-Benatier y J. Guzzo. Effect of nitrogen limitation and nature of the feed
upon Oenococcus oeni metabolism and extracellular protein production. J Appl Microbiol. 98:652-661; 2005.
Remize, F, A. Gaudin, Y. Kong, J. Guzzo, H. Alexandre, S. Krieger y M. Guilloux-Benatier. Oenococcus oeni preference for peptides: qualitative and quantitative analysis of nitrogen assimilation. Arch. Microbiol. 185:459-469;
2006.
Renouf, V. La fermentation malolactique dans les vins: mécanismes et applications pratiques. Tec & Doc, Lavoisier
(Ed.), París; 2013.
Ritt, J-F., M. Guilloux-Benatier, J. Guzzo, H. Alexandre y F. Remize. Oligopeptide assimilation and transport by
Oenococcus oeni. J. Appl. Microbiol. 104:573-580; 2008.
Terrade, N., R. Mira de Orduña. Determination of the essential nutrient requirements of wine-related bacteria
from the genera Oenococcus and Lactobacillus. Int. J. of Food Microbiol. 113 (1-2): 8-13; 2009.
Vivas, N., A. Lonvaud-Funel y Y. Glories. Effect of phenolic acids and anthocyanins on growth, viability and malolactic activity of a lactic acid bacterium. Food Microbiol. 14:291-300; 1997.
Vivas, N., M. Augustin, A. Lonvaud-Funel. Influence of oak wood and grape tannins on the lactic acid bacterium
Oenococcus oeni (Leuconostoc oenos, 8413). J. Sci. Food Agric. 80:1675-1678; 2000.
14