1. Educación

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Muestreo para
ensayos microbiológicos
En el examen de cualquier producto alimenticio es importante la adecuada selección de la
muestra, la toma correcta de la misma, su conservación y transporte al laboratorio, y la
preparación para su análisis. Los resultados obtenidos en el análisis microbiológico de las
muestras y su interpretación son únicamente válidos para la muestra que se analiza y serán
también válidos para el lote de donde proviene, sólo si la muestra es representativa y se
tomaron las medidas necesarias para prevenir cualquier contaminación o alteración de sus
características fisicoquímicas y microbiológicas.
>
Escriben: Lic. en ciencias
biológicas Corina E. Meier
[email protected]
Dra. Celia L. Melamed
casos hay dos resultados posibles: positivo
o insatisfactorio y negativo o satisfactorio. Un
plan de dos clases se encuentra definido por
los siguientes dos valores:
[email protected]
Resulta importante contar con procedimientos escritos que describan cómo realizar el muestreo y planillas en las que se
registren todos los datos del muestreo. El
conocimiento de las definiciones involucradas en la temática también es fundamental.
Veamos algunas de ellas:
_Lote: cantidad de un alimento que es producido en condiciones uniformes (Ejemplo: producción de un turno de un determinado día o
producción delimitada por dos procedimientos de limpieza y desinfección completos).
_Muestra: grupo de unidades tomadas de
una población para estimar uno o varios
parámetros. Para que la muestra sea representativa las unidades deben ser seleccionadas en forma aleatoria de manera que
reflejen, tanto como sea posible, el lote del
cual proceden.
_Unidad de muestreo: porción individual que
se extrae de una muestra (Ejemplo: una botella de agua).
_Unidad analítica: parte de la muestra que es utilizada en el laboratorio para el análisis (Ejemplo:
100 mL para el recuento de coliformes).
Planes de muestreo
Un plan de muestreo es un procedimiento
de extracción de una muestra, el análisis
de una determinada cantidad de unidades
de muestreo y la toma de decisión al comparar los resultados obtenidos respecto a un
criterio establecido (estándares, especificaciones o guías). Los planes de muestreo
pueden ser de atributos o de variables.
_Planes de muestreo de atributos: Se aplican a datos cualitativos y cuantitativos; se
utiliza cuando no se posee información previa del producto (proceso, datos de muestreo anteriores, etc.), como suele ocurrir en
la mayoría de los casos. Este tipo de plan
de muestreo se divide además en planes de
atributos de dos clases y de tres clases.
A_Planes de muestreo de atributos de dos
clases: Se aplican generalmente a análisis
cualitativos, es decir cuando se determina la
presencia/ausencia de un microorganismo.
Puede aplicarse también a análisis cuantitativos si se define previamente un valor límite
que defina si un resultado es no satisfactorio
(si supera ese valor) o satisfactorio (si se encuentra por debajo de ese valor). En ambos
n = número de unidades de muestreo a
analizar.
c = máxima cantidad de unidades de
muestreo en las que se puede obtener un
resultado insatisfactorio (presencia de
un microorganismo o un valor superior a
un límite preestablecido).
_Ejemplo: un plan de muestreo para Salmonella
con n = 5, c =0 implica que se toman y analizan 5 unidades de muestreo; si no se detecta la presencia de Salmonella en ninguna
unidad, el lote es aceptado; si se detecta
la presencia de Salmonella en al menos una
unidad, el lote es rechazado.
B_Planes de muestreo de atributos de tres clases: Se aplican a análisis cuantitativos, en los
que se definen tres calidades del producto:
satisfactoria, marginalmente aceptable e inaceptable. Un plan de tres clases se encuentra
definido por los siguientes valores:
n = número de unidades de muestreo a analizar.
M = recuentos superiores a este valor son
inaceptables y si al menos en una unidad
se obtiene un resultado superior a M el lote
es rechazado.
m = delimita una calidad satisfactoria (≤ m)
de una marginalmente aceptable (> m y ≤ M).
c = máxima cantidad de unidades de muestreo
en las que se puede obtener un resultado en el
rango de calidad marginalmente aceptable.
_Ejemplo: un plan de muestreo para coliformes con n = 5, c =2, m= 10 ufc/g, M= 100
ufc/g implica que se toman y analizan 5 unidades de muestreo; el lote será aceptado si
todos los recuentos se encuentran por debajo de 10 ufc/g, o si como máximo en 2 unidades los recuentos se encuentran entre 10 y
100 ufc/g; el lote será rechazado si al menos
en una unidad se obtiene un recuento superior a 100 ufc/g, o si en más de 2 unidades se
obtiene un recuento superior a 10 ufc/g.
_Planes de muestreo de variables: Se aplican a
datos cuantitativos y se puede utilizar sólo si se
conoce previamente que los microorganismos
(el logaritmo de su recuento) se distribuyen en
el lote con una frecuencia normal. Como generalmente esto no ocurre, estos planes son poco
aplicables en microbiología.
Elección de un plan de muestreo
La ICMSF ha sugerido una clasificación de
planes de muestreo que comprende 15 casos,
definidos por el tipo y severidad del peligro de
los microorganismos y por otra parte considerando la manipulación que tendrá el producto
luego del muestreo y cómo será consumido. La
clasificación es la siguiente: (Cuadro 1) Nivel
de peligro para la salud_Condiciones en las
cuales el producto será manipulado y consumido luego del muestreo.
En la elección del/los microorganismo/s a
analizar se debe tener en cuenta el tipo de
producto, su historial como productor de
enfermedades transmitidas por alimentos
(en el caso de patógenos), la determinación
de su vida útil, etc. A continuación se detalla una clasificación de microorganismos o
grupos de microorganismos de acuerdo a la
severidad de su peligrosidad:
_Peligro severo: patógenos que presentan un
peligro alto; ejemplo: Clostridium botulinum,
i n d u s t r i a b e b i b l e . c om
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Nivel de peligro
para la salud
Condiciones en las cuales el producto será
manipulado y consumido luego del muestreo
Condiciones
producen una
Condiciones no
Condiciones
reducción
producen un cambio puede incrementar
Sin peligro
directo para la salud Aumenta la vida útil Sin cambio
Se reduce la vida útil
Contaminación
Caso 1
general, vida útil, etc. 3 clases
n= 5, c= 3
Caso 2
3 clases
n= 5, c= 2
Caso 3
3 clases
n= 5, c= 1
Con peligro
para la salud
Reducción
del peligro
Sin cambio en
el peligro
El peligro se
incrementa
Bajo, indirecto
(indicadores)
Caso 4
3 clases
n= 5, c= 3
Caso 5
3 clases
n= 5, c= 2
Caso 6
3 clases
n= 5, c= 1
Moderado,
directo,
diseminación
limitada
Caso 7
3 clases
n= 5, c= 2
Caso 8
3 clases
n= 5, c= 1
Caso 9
3 clases
n= 10, c= 1
Moderado, directo,
diseminación
potencial
Caso 10
2 clases
n= 5, c= 0
Caso 11
2 clases
n= 10, c= 0
Caso 12
2 clases
n= 20, c= 0
Severo, directo
Caso 13
2 clases
n= 15, c= 0
Caso 14
2 clases
n= 30, c= 0
Caso 15
2 clases
n= 60, c= 0
_Cuadro 1
Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi,
Vibrio cholerae O1, Listeria monocytogenes
para grupos de riesgo.
_Peligro moderado con diseminación potencial:
patógenos que presentan un menor peligro y la
posibilidad de producir infecciones secundarias
a partir de personas infectadas; generalmente
poseen dosis infectivas bajas y pueden producir
una enfermedad grave en personas susceptibles; ejemplo: Escherichia coli patógena, otras
serovariedades de Salmonella no consideradas
en el punto anterior, Listeria monocytogenes.
_Peligro moderado con diseminación limitada: patógenos que producen enfermedades
sin provocar en general infecciones secundarias; ejemplo: Bacillus cereus, Clostridium
perfringens A, Staphylococcus aureus.
_Peligro bajo, indirecto: microorganismos o
grupos de microorganismos que se consideran
indicadores de falta de higiene, de un subproceso, etc., pero no se puede establecer una
relación entre su presencia y la de patógenos;
ejemplo: coliformes, enterobacterias.
_Sin peligro para la salud: microorganismos
o grupos de microorganismos que pueden
dar una idea de las condiciones de higiene
durante el proceso, o bien de la vida útil de
un producto, y que no están relacionados
con un peligro para la salud; ejemplo: recuento de aerobios, lactobacilos.
Con respecto a la manipulación del producto
luego del muestreo se pueden considerar las
siguientes posibilidades:
_Reducción del peligro: el producto estará
expuesto a una condición que reducirá el
peligro; ejemplo: Salmonella o Brucella en
leche cruda que será pasteurizada.
_Sin cambio en el peligro: el producto no estará expuesto a condiciones en que los microorganismos se puedan multiplicar; ejemplo:
Salmonella en yogurt.
_El peligro puede incrementarse: el producto estará expuesto a la posibilidad de
un incremento en los microorganismos;
ejemplo: Escherichia coli en zumos de fruta no pasteurizados.
Si el producto está destinado a una población susceptible se deben aplicar planes de
muestreo más exigentes.
Elección de M y m
El valor M se encuentra definido por un nivel
de peligro o de una contaminación inaceptable. El valor m se encuentra definido por
buenas prácticas; en los planes de dos clases
para patógenos, m es cero o un valor pequeño. Los valores M y m son independientes.
Elementos de muestreo
_Utensilios de muestreo: se pueden utilizar
cucharas, cuchillos, bisturíes, pipetas, marcos, tijeras de un material resistente que no
provoque cambio alguno que pueda afectar
los resultados de los análisis. Sus superficies
deben ser lisas, libres de asperezas y con esquinas redondeadas. Si el utensilio presenta
soldaduras, éstas deben soportar la temperatura de esterilización. También se pueden realizar muestreos mediante hisopos o esponjas.
En todos los casos los elementos de muestreo
deben estar limpios, secos y estériles.
_Recipientes para la muestra: deben ser de
un material no tóxico, impermeable, con
cierre hermético, tales como frascos de vidrios o plástico de boca ancha, o bolsas de
plástico descartables. Los recipientes deben estar limpios, secos y estériles. La capacidad debe ser la adecuada para tomar la
unidad de muestra deseada. En el caso de
recipientes reutilizables, la calidad de los
mismos debe ser la adecuada como para tolerar esterilizaciones repetidas.
_Esterilización de los elementos de muestreo: los métodos de esterilización recomendados son los siguientes:
A_En autoclave a 121°C durante 15 minutos,
especialmente para los materiales que no
soporten el calor seco.
B_En estufa a 160-180°C durante 2 horas.
Alternativamente se pueden utilizar los siguientes métodos, teniendo en cuenta que
no eliminan todas las esporas:
A_Inmersión del utensilio en alcohol etílico
95% y posterior flameado; este procedimiento se repite dos veces más asegurándose que
se haya apagado la llama antes de sumergirlo nuevamente en alcohol.
B_Inmersión en una solución de hipoclorito de
sodio de 50 ppm de cloro libre durante al menos
30 segundos (este método no es esterilizante).
Obtención de la muestra
El objetivo del muestreo es obtener una
muestra representativa del alimento y que el
traslado de la muestra se efectúe de manera
tal que al llegar al laboratorio tenga las mismas condiciones que tenía en el momento de
haber sido tomada la muestra.
Es importante que el operador que efectúa la
toma de muestras sea una persona idónea.
Para que la muestra obtenida pueda representar de la mejor manera al lote de la que fue
tomada se deberá evitar subjetividades. Una
forma de asegurar esto es a través de un muestreo mediante números aleatorios. Esto permite que todas las unidades del lote tengan igual
posibilidad de formar parte de la muestra.
Este tipo de muestreo tiene la desventaja que
no asegura que las muestras obtenidas sean
iguales al lote del cual proviene, pero asegura
que hayan sido tomadas objetivamente.
Un programa estratificado de muestreo aleatorio se utiliza cuando se sabe o se supone
que el lote no es uniforme. Esta estratificación permite controlar las variables conocidas de un proceso. Los resultados de los
distintos estratos se valoran separadamente
y luego se unifican si resultan homogéneos.
Ejemplo: mercadería transportada en distintos contenedores. Un fenómeno análogo
al anterior es el de heterogeneidad, donde
se espera que en determinados alimentos la
carga bacteriana no sea homogénea dentro
de la misma unidad de muestreo.
Es importante planear el momento de muestreo
teniendo en cuenta el tiempo de envío y recepción
de las muestras en el laboratorio para su análisis
y plazos de tiempos que se deban cumplir como
por ejemplo las horas desde el ordeñe hasta la
llegada de la leche al laboratorio de la usina.
Recolección de las muestras
Se extrae un número de unidades de muestreo especificado en el programa de muestreo. Si es de tipo oficial (ordenado por
organismos de control), las muestras se tomarán por triplicado y en acuerdo a lo establecido por el Código Alimentario Argentino
a fin de permitir, mediante el análisis de las
contramuestras, la verificación de los resultados analíticos, en caso de ser necesario.
Siempre que sea posible es conveniente tomar
envases cerrados tal como se venden al público.
En caso contrario, se trasvasa asépticamente una porción a un envase estéril, quitando previamente la contaminación superficial,
lavando, pasando alcohol 70% o eliminando
la parte externa en caso que se trate de envases de papel.
Para la extracción de muestras se utilizan instrumentos adecuados al estado de las mismas (sacabocados, palas o paletas, pipetas u
otros) y recipientes apropiados para el traslado
de modo que no haya pérdida de contenido.
En caso de un alimento a granel, se extraen porciones de diferentes puntos del contenedor
(si no se puede homogeneizar previamente),
a menos que se conozca por experiencia previa la homogeneidad del alimento o que se
haya determinado un punto específico que
resulte representativo.
Si se toma una muestra de un conducto de salida, se debe evitar tomar de las primeras fracciones con el fin de limpiar la salida del flujo.
En caso que el operador no pueda tomar una
muestra en forma estéril por la naturaleza de la
misma, deberá informarlo al laboratorio y extremar los cuidados durante el transporte a fin de
evitar al máximo la proliferación microbiana.
Es recomendable registrar la temperatura del
alimento del que se obtiene la muestra, así como
la temperatura ambiente donde se almacena.
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Tamaño de la unidad de muestreo
Ejemplos de planes de muestreo
La unidad de muestreo debe tener un tamaño
mínimo de alrededor de 200 gramos que permita la búsqueda de distintos microorganismos
a través de diferentes procesos (por ejemplo
Salmonella spp. y coliformes) y que sea suficiente para repetir el análisis en caso de ser
necesario. En ese caso debe procurarse que la
reserva se mantenga en condiciones como para
que su carga microbiana no se vea alterada.
Zumos de frutas y hortalizas no pasteurizados (listos para el consumo) (según REGLAMENTO
2073/2005 de la Unión Europea)
Identificación de las
unidades de muestreo
Es importante registrar toda la información
necesaria para su correcta identificación.
Ejemplo: número de unidad de muestreo, contenedor, identificar muestra original y contramuestras, número de acta, firma y aclaración
del responsable del muestreo, etc.
Acondicionamiento y
transporte de las muestras
Se debe evitar durante el transporte al laboratorio cualquier alteración de las muestras
de modo de asegurar que éstas al ser examinadas por el laboratorio sean las mismas recogidas y documentadas por la persona que
efectuó el muestreo.
El tipo de acondicionamiento dependerá del
estado físico del producto (líquido, sólido o
semisólido). Deberá tomarse en cuenta la
naturaleza del producto, y su presentación.
El transporte debe realizarse en recipientes
adecuados donde se respeten las temperaturas de conservación del producto.
Las muestras deben ser enviadas con la mayor brevedad posible al laboratorio. Los productos líquidos deben ser analizados dentro
de las 24 horas desde el momento de muestreo, los productos refrigerados, dentro de
las 36 horas de su recolección.
Informe de toma de muestra
Es necesario elaborar un informe detallado
del muestreo, firmado por la persona responsable de la obtención de las muestras
y refrendado por los representantes de las
partes interesadas, si están presentes. <<
Perfil de las Autoras:
Corina E. Meier y Celia L. Melamed se
desempeñan en la Subcomisión de
Acreditación de Laboratorios de
Microbiología de Alimentos - División de
alimentos, medicamentos y cosméticos Asociación Argentina de Microbiología.
MICROORGANISMO
PLAN DE
MUESTREO Y LÍMITES
MÉTODO ANALÍTICO
FASE EN LA QUE SE
APLICA EL CRITERIO
Escherichia coli
n=5, c=2,
m=100 ufc/g
M= 1000 ufc/g
ISO 16649-1 o 2
Proceso de
elaboración
Salmonella
n=5, c=0,
ausencia en 25 g
EN/ISO 6579
Productos
comercializados
durante su vida útil
Leches Fermentadas (según Código Alimentario Argentino art.576 5.4)
Microorganismo
Criterio de
Aceptación
Categoría
Norma
Coliformes/g
(30°C)
n= 5 c = 2
m= 10 M= 100
4
FIL 73 A: 1985
Coliformes/g
(45°C)
n= 5 c= 2
m< 3 M= 10
4
APHA: 1992 c 24 (1)
Hongos y
Levaduras/g
n= 5 c= 2
m= 50 M=200
2
FIL 94B: 1990 (2)
Bibliografía: FDA. Bacteriological Analytical Manual Online: www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.html
(10/2007) / FSIS-USDA. Procedures for collecting and submitting domestic samples for microbiological
analysis: www.fsis.usda.gov/OPPDE/rdad/FSISDirectives/10230-2.pdf / ICMSF. 1986. Microorganisms in
Foods, Volumen 2. Sampling for Microbiological Analysis: Principles and Specific Applications. 2nd ed.
University of Toronto Press, Toronto./ ICMSF. 1981. Microorganismos de los Alimentos. Métodos de muestreo para análisis microbiológicos: principios y aplicaciones específicas. Volumen II. Editorial Acribia,
Zaragoza (España)/ Ley 18284 (Código alimentario Argentino) Los datos pertenecen a De La Canal y asoc.
S.R.L. www.delacanal.com.ar, teléfono: (+541) 322-3232. E-Mail: [email protected]