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Práctica 2
TÉCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN
(CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA)
OBJETIVOS:
1. Extraer carotenoides de diferentes muestras vegetales mediante un solvente
orgánico.
2. Seleccionar de una serie eluotrópica, el eluente que mejor separe los carotenoides
presentes en diferentes muestras vegetales.
3. Con el mejor eluente, fraccionar cromatográficamente el extracto de carotenoides,
hasta aislar compuestos puros (cromatografía en capa preparativa)
4. Caracterizar los carotenoides obtenidos por espectroscopia ultravioleta.
NOTAS:
1. Consultar los carotenoides presentes en el material vegetal asignado para esta
práctica, principal carotenoide de cada muestra, su color, estructura, características
de absorción ultravioleta antes de ir a la sección de clase.
2. El informe debe incluir nombre vulgar y científico de la muestra analizada, parte de
la planta analizada, familia vegetal, análisis de los valores Rf y los espectros visible
comparándolos con los reportados en la literatura. Informar cuáles carotenoides se
logró identificar.
REACTIVOS Y MATERIALES NECESARIOS POR GRUPO
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15 g de muestra vegetal fresca triturada o rallada (Tomate de aliño rojo,
Pimentón: verde-rojo, pasta de tomate, salsa de tomate, espinacas, etc.)
Vidriería: Erlenmeyer 250 ml, Tubos de ensayo limpios y secos, Capilares
Absorbente para cromatografía: cromatoplacas de silica gel 60F254, Sílica gel
60 para columna.
Solventes: Etanol para extraer, n-hexano puro (ó éter de petróleo), Acetato de
etilo puro, diclorometano puro
Cámaras para cromatografía en capa fina
1 columna de cromatografía
Lápiz de grafito
Algodón o gasa
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Papel filtro
Equipos: Licuadora o rayador, Baño María, Rota-evaporador,
Espectrofotómetro UV –Visible
Mortero con pistilo
Sulfato de sodio anhidro 15 g
Patrones de carotenoides: beta-caroteno, licopeno, luteína, capsantina
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Extracción de la fracción de carotenoides
a. Deshidratación: 15 g. de tejido vegetal fresco se tritura en un mortero. Posteriormente
el material triturado se transfiere a un erlenmeyer limpio y seco, luego se añade un volumen
suficiente de etanol para que recubra la muestra (alrededor de 20 ml). Se calienta a
ebullición sobre un baño maría durante 5 minutos. Se filtra en caliente con un algodón,
procurando que la masa semisólida quede libre del solvente. El extracto etanolico se
entrega al monitor para recuperación del solvente
b. Extracción: A la masa semisólida se adiciona un volumen suficiente (10 ml
aproximadamente) de solvente orgánico (acetato de etilo, diclorometano, preguntar al
profesor cual se utilizara) en la campana de extracción se remueve con una varilla de vidrio
para que el solvente extraiga los carotenoides. Debe tenerse precaución con el manejo de
estos solventes pues son bastante volátiles y algunos son tóxicos.
El extracto orgánico se filtra; El residuo sólido se puede re- extraer 2 veces más (2 porciones
de 10 ml cada una) con el fin de obtener el mayor rendimiento posible. Los extractos
filtrados se juntan, se trasvasan a un embudo de separación y se añade si es necesario un
volumen de solución de NaCl saturada para romper la emulsión. La fase orgánica se
recupera, se hace pasar a través de un embudo de tallo largo que contiene papel de filtro
con sulfato de sodio anhidro y se filtra. El filtrado con los carotenoides se concentra hasta
un volumen aproximado de 5 ml, mediante el rota-evaporador (30ºC).
El extracto concentrado de carotenoides se tapa y se guarda para protegerlo de la luz, la
humedad, el calor, el aire y posteriormente se utilizara para procedimientos
cromatograficos.
El solvente obtenido al concentrar el extracto se entrega al monitor para recuperación del
solvente
2. Selección de fase móvil
El extracto de carotenoides se analiza por cromatografía en capa fina (CCF) con la serie
eluotrópica siguiente:
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n-Hexano
n-Hexano/Acetato de Etilo 4:1
n-Hexano/Acetato de Etilo 2:1
n-Hexano/Acetato de Etilo 1:2
n-Hexano/Acetato de Etilo 1:4
Acetato de etilo
Dejar secar las placas y observar para cada muestra según el mejor eluente (la mezcla que
separe los diferentes componentes de la muestra)
Utilizar como reveladores en su orden los siguientes, dibujando lo más precisamente
posible, y anotando en cada caso las observaciones como colores, fluorescencia, manchas:
A simple vista
Luz UV 254 nm
Luz UV 366 nm
Luego de observar los diferentes cromatogramas, seleccionar la fase móvil en la cual se
observa mejor separación de los componentes de la muestra
Estrategia de trabajo sugerida
1. Utilizar 6 cámaras cromatograficas previamente estabilizadas con cada una de las
mezclas eluentes. (marcar cada cámara cromatografica claramente según el sistema
eluente).
2. Sembrar 6 placas de 10*10 cm con las 6 muestras problemas de cada grupo de trabajo
y eluirlas según cada eluente
3. Utilizando este procedimiento se optimiza el uso de solventes, el tiempo de elución y se
puede comparar todas las muestras al mismo tiempo y enriquecer la discusión
Notas:
1. Las mezclas de eluentes utilizadas se deben desechar en residuos no clorados
2. los cromatofolios secos y los residuos de silica se deben desechar en bolsa roja
3. Fraccionamiento cromatográfico
a) Cromatografía en capa fina (CCF) o preparativa (CCP): Con el mejor eluente
seleccionado previamente, proceder a realizar el fraccionamiento a escala mayor
del extracto por cromatografía en capa fina (CCF), cromatografía preparativa (CCP)
ó en columna (CC) esta última se utiliza cuando se requiere aislar gran cantidad de
cada fracción de la muestra vegetal, se puede realizar cromatografía en columna si
el profesor lo considera necesario, aunque con cromatografía en capa fina en placa
de 10*10 cm, se pueden apreciar muy bien los carotenoides.
b) Las fracciones de carotenoides coloreadas se enumeran, posteriormente se recogen
(ó se raspan en el caso de la CCF; CCP), sobre un papel filtro, y este polvo (fracción)
se transfiere a un tubo de centrifuga limpio y seco, posteriormente al tubo de
centrifuga se le se adiciona de 2-3 ml de hexano (en el caso de la muestra de
pimentón se debe extraer de la silica con etanol o metanol) y se centrifuga por 10
minutos.
4. Caracterización espectroscópica:
Posteriormente con mucho cuidado se retira el sobrenadante (1.0 o 0.5 ml con
pipeta Pasteur sin agitar el precipitado) y se le determina su espectro visible en el
rango de 350 a 550 nm.
Notas:
1. Es importante tener en cuenta que para determinar el espectro cada compuesto
debe estar disuelto en un solo solvente, hexano (o etanol, o metanol), y no tener
residuos de otros solventes.
2. Para el caso de carotenoides polares (muestra de pimentón), extraerlos de la sílice
con etanol o metanol.
3. Comparar el resultado obtenido (espectro visible) con lo indicado en la literatura
para cada muestra y componente
4. Los residuos de solventes se desechan en residuos no clorados