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Diseño y realización de bioensayos en toxicología
de insectos
La toxicidad de xenobióticos con acción insecticida debe determinarse para cada sustancia
y para cada especie y estadio del desarrollo del insecto blanco. La toxicidad se expresa utilizando
parámetros toxicológicos, que se calculan utilizando el porcentaje de individuos afectados de un
total de individuos expuestos a una concentración dada del insecticida estudiado. De esta manera
se puede calcular la Concentración Efectiva 50% (CE50), que es la concentración de un insecticida
que afecta al 50% de la población expuesta. Si conocemos exactamente qué cantidad de
insecticida ingresó en el cuerpo de cada insecto tratado, se puede calcular la Dosis Efectiva 50%
(DE50), cuya valor se relativiza por el peso corporal del insecto y que produce la mortalidad de al
menos el 50% de la población tratada.
Los insecticidas neurotóxicos producen una serie de efectos sobre el sistema nervioso
central y periférico del insecto, que se manifiestan a través de síntomas bien identificables (Ruigt,
1985). La progresión de los síntomas de intoxicación nerviosa suele ser hiperactividad,
descoordinación, postración y muerte. Los síntomas previos a la muerte suelen llamarse efectos
subletales y pueden observarse administrando concentraciones menores a la que produce el
efecto letal. Si la finalidad del experimento es determinar la concentración (o dosis) que produce
la muerte del insecto (o sea, el end point del experimento es el efecto letal), vamos a llamar a los
parámetros toxicológicos obtenidos como Concentración Letal 50% o Dosis Letal 50%. La toxicidad
relativa de dos o más sustancias se determina comparando los parámetros toxicológicos de las
sustancias en cuestión.
Para determinar los parámetros toxicológicos, grupos de insectos son tratados con
concentraciones crecientes del insecticida. Para cada concentración, se determina el porcentaje de
insectos que alcanzan el end point, por ejemplo la muerte en el caso de los experimentos de
letalidad. Con estos datos se obtiene una curva dosis-respuesta (Hewlett y Plackett, 1979). Otro
parámetro toxicológico que puede determinarse para comparar toxicidades es el Tiempo de
Volteo 50% (TV50), el cual se define como el tiempo al cual el 50% de la población expuesta al
insecticida se voltea. En insectos voladores, los individuos volteados yacen en el piso de la cámara
que los contiene sin poder volar; en insectos rastreros generalmente se definen como volteados
aquellos insectos que yacen dorsalmente sin poder caminar. La determinación del TV50 se realiza
exponiendo un grupo de insectos a una concentración fija de insecticida y se evalúa el número de
insectos volteados en intervalos de tiempo consecutivos.
Vías de ingreso y formas de administración de los insecticidas:
Los insecticidas ingresan al interior del insecto por medio de diferentes vías (Welling y Paterson,
1985):
Por medio de las tráqueas. Los insecticidas ingresan a través de las tráqueas en fase vapor, por lo
que son los compuestos más volátiles los que ingresan por esta vía. En este caso no se conoce
exactamente la cantidad de insecticida que ingresa al compartimiento interno del insecto, pero se
conoce la concentración presente en la atmósfera a la que está expuesto el insecto.
Penetración a través del tegumento:
Aplicación tópica. La aplicación tópica consiste en aplicar una gota de solución del insecticida en la
superficie del cuerpo del insecto. La solución se realiza con solventes orgánicos de polaridad
intermedia, como acetona o etanol, los cuales posibilitan la penetración a través de la cutícula.
Una vez que la solución la atraviesa, el insecticida ingresa al organismo, en donde alcanza el sitio
blanco ejerciendo su acción. Esta forma de administración permite saber cuál es la cantidad de
insecticida que ingresa al cuerpo del insecto, ya que se aplica un volumen conocido de solución.
Aplicación en una superficie. El tratamiento de una superficie con insecticida se realiza aplicando
una solución del mismo sobre un soporte físico, un papel de filtro, un ladrillo, un azulejo, etc. La
biodisponibilidad del insecticida va a variar según las características del material sobre el cual se
realiza la impregnación. Cuando el insecto camina o se posa sobre la superficie tratada está
expuesto a una cantidad de insecticida que ingresa al organismo, también a través de la cutícula.
En este caso, no se conoce exactamente cuál es la cantidad de insecticida que ingresa al interior
del insecto, pero se sabe cuál es la concentración del insecticida sobre la superficie.
Ingestión:
Los insecticidas por ingestión ingresan cuando el insecto se alimenta de una fuente de comida
tratada con insecticida. Las larvas de algunos coleópteros que se alimentan de hojas pueden
controlarse con insecticidas sistémicos que ingresan al sistema vascular de la planta, a través del
cual se distribuyen por todos los tejidos vegetales que sirven de alimento para la plaga. Los cebos
cucarachicidas están compuestos de una matriz apetitiva para las cucarachas a la que se le
agregan sustancias atractantes y/o fagoestimulantes y el compuesto insecticida. Las cucarachas se
alimentan de los cebos, incorporando así al insecticida. La toxina de la bacteria Bacillus turingiensis
(Bti) se utiliza para controlar larvas de diferentes especies de mosquitos. Las formulaciones de Bti
se aplican en cuerpos de agua en donde se crían las larvas. Estas formulaciones son aptas para ser
usadas incluso en aguas de consumo humano. En este caso, las larvas incorporan el insecticida
cuando se alimentan de las partículas disueltas en el agua. La toxina ejerce su acción sobre el
tracto digestivo de las larvas.
Efectos sobre el comportamiento de los insectos
Algunas sustancias pueden modificar el comportamiento de los insectos. Estas modificaciones
pueden afectar negativamente la concreción de ciertas funciones vitales, tanto a nivel individual
como poblacional. De esta manera, ciertos compuestos pueden producir efectos sobre la cópula,
el comportamiento alimentario, pueden ser arrestantes, repelentes o hiperquinéticos. Las
sustancias arrestantes producen una disminución de la actividad locomotora de los insectos
expuestos en forma dosis-dependiente (Kennedy, 1978). Los hiperquinéticos, por el contrario,
producen un aumento dosis-dependiente de la actividad locomotora de los insectos expuestos.
Los repelentes, en cambio, producen en los insectos movimientos orientados en contra de la
fuente emisora del compuesto (Dethier et al., 1960).
Las sustancias que afectan el comportamiento de insectos pueden ser sintéticas o de
origen natural. Estas sustancias, además, se utilizan en forma complementaria junto con los
insecticidas neurotóxicos en las estrategias de manejo integrado de plagas.
Determinación del tiempo de volteo 50% (TV50) de un insecticida
Objetivo: Determinar la efectividad de un insecticida piretroide y comparar la toxicidad de dos
concentraciones de este compuesto en cucarachas de la especie Blattella germanica.
Materiales:
2 cajas de Petri
Papel de filtro de 9 cm de diámetro
2 soluciones de cipermetrina en acetona
Acetona
Pipetas de vidrio de 1 ml
Rotulador
Cronómetro
Machos de Blattella germanica
Métodos:
Tomar 3 papeles de filtro de 9 cm e impregnar dos de ellos con una solución de cipermetrina y uno
con acetona sola. Aplicar 0,5 ml de cada sustancia.
Colocar cada papel tratado dentro de una caja de Petri. Rotular cada caja con la concentración de
cipermetrina aplicada sobre el papel; rotular con la palabra “control” la caja que contiene el papel
tratado con acetona.
Mantener a los insectos a 0° C durante unos minutos para inmovilizarlos ligeramente.
Colocar 5 insectos en cada caja de Petri.
Registrar cada cinco minutos el número de insectos volteados en los grupos experimentales y en el
grupo control (se definen como volteados aquellos insectos que yacen sobre la parte dorsal del
cuerpo imposibilitados de caminar).
El experimento prosigue hasta que el 100% de los insectos estén volteados.
Análisis de los datos
Los datos obtenidos se analizarán con un software basado en el método probit (Robertson y
Priesler, 1992) que permite determinar el tiempo de volteo 50. Con los datos se construye una
curva dosis-respuesta con los tiempos en las abscisas y con los porcentajes acumulados de
respuesta en las ordenadas. La curva obtenida es una sigmoidea, pero puede linealizarse con
ciertas transformaciones de los ejes: log de la dosis en las x y probit en el eje y. La transformación
probit muestra las probabilidades de mortalidad en unidades de desviación estándar. La
concentración a la cual ocurre el 50% de la respuesta (por ejemplo la muerte) en el eje probit, es la
Concentración Letal 50%.
En el análisis de estos datos debe considerarse la dependencia de los datos, dado que las
medidas consecutivas se toman sobre el mismo grupo de individuos.
Se compararán los parámetros de TV50 obtenidos para cada concentración de
cipermetrina y aquella que tenga un TV50 menor será más efectiva en volteo de cucarachas.
Determinación del efecto repelente de un compuesto sintético en Rhodnius prolixus
Objetivo: Evaluar la repelencia producida por la N,N-dietil-3-metilbenzamida (DEET), un
compuesto sintético que constituye el principio activo de la mayoría de los repelentes comerciales
disponibles en el mercado sobre la vinchuca Rhodnius prolixus.
Materiales:
Papeles de filtro de 11 cm de diámetro
Aros de vidrio del mismo diámetro
Una solución de DEET en acetona
Acetona
Pipetas de vidrio de 1 ml
Pinzas
Cinta adhesiva
Cronómetro
Larvas del quinto estadio de R. prolixus
Método:
Cortar los papeles de filtro en mitades.
Impregnar una mitad del papel con 0,35 ml de la solución de DEET y la otra con el mismo volumen
de acetona sola.
Dejar evaporar el solvente durante 10 minutos.
Pegar las mitades del papel con cinta adhesiva por la parte posterior
Colocar el aro de vidrio sobre el papel reconstituido
Colocar delicadamente en el centro de la arena una larva de R. prolixus.
Determinar el tiempo transcurrido por el insecto en la mitad tratada con DEET durante 5 minutos.
Análisis de los datos:
Con los datos obtenidos se calculará un coeficiente de repelencia (CR) = (tiempo total – tiempo en
el área con DEET)/ tiempo total. Cuando CR = 1 indica repelencia máxima; cuando CR = 0 indica
atracción total; cuando CR = 0,5 indica distribución al azar de los insectos. Compararemos los CR
obtenidos con cada concentración de DEET y determinaremos si la repelencia es un efecto
dependiente de la dosis.
Bibliografía
-Dethier VG, Browne LB, Smith CN, 1960. The designation of chemicals in terms of the
responses they elicit from insects, J Econ Entomol 53: 134-136.
-Kennedy JS, 1978. The concepts of olfactory “arrestment” and “attraction”. Physiol Entomol
3: 91-98.
-Hewlett PS, Plackett RL, 1979. The Interpretation of Quantal Responses in Biology. Edward
Arnold, London, 82 pp.
-Robertson JL, Preisler HK, 1992. Pesticide Bioassays with Arthropods. CRC, Boca Ratón, 127
pp.
-Ruigt GSF, 1985. Pyrethroids. In GA Kerkut, LI Gilbert (eds), Comprehensive Insect Physiology,
Biochemistry and Pharmacology, Pergamon Press, Oxford, vol. 12, p. 183-272.
-Welling W, Paterson GD, 1985. Toxicodynamics of Insecticides. In GA Kerkut, LI Gilbert (eds),
Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology, Pergamon Press, Oxford,
vol. 12, p. 603-645.