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1
UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
ESCUELA DE AGRONOMIA
Inducción de mutaciones en quínoa
(Chenopodium quinoa Willd) y selección de
líneas tolerantes a imidazolinonas
Tesis presentada como parte de
los requisitos para optar al grado
de Licenciada en Agronomía
Samanta Jesabel Tropa Castillo
Valdivia – Chile
2010
I
PROFESOR PATROCINANTE
__________________________________
Ricardo Riegel S.
Ing. Agr., M. Sc., Dr.
Instituto de Producción y Sanidad Vegetal
PROFESORES INFORMANTES
__________________________________
Ricardo Fuentes P.
Ing. Agr., M. Sc.
Instituto de Producción y Sanidad Vegetal
___________________________________
Ingrid von Baer
Ing. Agr.
Agrogen
INSTITUTO DE PRODUCCIÓN Y SANIDAD VEGETAL
II
AGRADECIMIENTOS
Quiero comenzar agradeciendo a Dios por haberme regalado a unos padres
espectaculares, quienes siempre me apoyaron incondicionalmente, con amor y
paciencia; gracias a su esfuerzo durante todos estos años de estudio hoy termino
esta etapa. Quiero aprovechar de decirles que los amo y que siempre serán el pilar
de mi vida.
Además quiero agradecer a mi profesor patrocinante: Ricardo Riegel S. por toda su
confianza, apoyo y paciencia durante el desarrollo de esta tesis. También a mis
informantes Ingrid Von Baer y Ricardo Fuentes quienes siempre tuvieron disposición
y buena voluntad al momento de requerir de su ayuda.
Imposible no agradecer también a todos mis compañeros y amigos que durante todos
estos años de estudio hicieron de mi pasar por Valdivia toda una aventura. A Carolina
Sáez (Karacola), Soledad Núñez (Soñe “mi chalita”), Ximena Álvarez (Chimi), Andrea
Santana, Carolina Sánchez, Luis Gallardo (Beto), Juan Luis Silva (Juanele), Héctor
Aedo (Xixixo), María José Plaza (Pepa) Paulina Peña (Peñi), Nelson Vásquez (Sr.
Oso)….todos quienes me acompañaron y alegraron mis días y de los cuales me llevo
los mejores recuerdos de una de las etapas mas lindas de la vida.
A mis amigos de Santiago: Orlando Moraga quien me apoyo siempre y me alentó en
todo momento, Hans Gálvez, Joyce Labra y Alexis Vergara con quien compartí gratos
momentos durante la práctica de instituciones y que se ha convertido en un gran
amigo.
I
INDICE DE MATERIAS
Capitulo
Página
RESUMEN
1
SUMMARY
3
1
INTRODUCCIÓN
5
2
REVISION BIBLIOGRÁFICA
7
2.1
El cultivo de la quínoa (Chenopodium quinoa Willd)
7
2.2
Mutaciones
14
2.3
Generación de tolerancia a herbicidas por mutaciones
17
3
MATERIAL Y MÉTODO
20
3.1
Inducción de mutaciones
20
3.2
Multiplicación del material y etapas de selección
21
3.3
Validación de la tolerancia en líneas seleccionadas
22
4
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
26
4.1
Inducción de mutaciones
26
4.2
Multiplicación del material y etapas de selección
27
4.3
Validación de la tolerancia en líneas seleccionadas
29
4.3.1
Estado fenológico
29
4.3.2
Altura de plantas
29
4.3.3
Fitotoxicidad
33
5
CONCLUSIONES
42
6
BIBLIOGRAFÍA
43
II
INDICE DE CUADROS
Página
Cuadro
1
Composición de granos de quínoa y cereales en base materia
11
seca
2
Contenido de los principales minerales en el grano de quínoa
12
3
Diferentes mutaciones que confieren tolerancia a herbicidas
19
inhibidores de la enzima ALS, con el nivel de tolerancia general
conferido por cada mutación a tres grupos de herbicidas
4
Escala de Fitotoxicidad
25
III
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura
1
Morfología de la planta quínoa
8
2
Ciclo fenológico de la planta de quínoa
9
3
Acción del agente mutagénico EMS a nivel de ADN
16
4
Esquema de selección y validación
24
5
Porcentaje de germinación según concentración de EMS y horas
26
de exposición
6
Altura promedio inicial de cada línea
30
7
Altura final de cada tratamiento post aplicación del herbicida
31
8
Diferencial de altura de cada tratamiento
32
9
Fitotoxicidad de Onduty sobre las plantas de quínoa
33
10
Número de individuos tolerantes (<=3) y susceptibles (>3) dentro
34
de cada tratamiento
11
Media del nivel de fitotoxicidad entre las líneas
35
12
Frecuencia relativa de los niveles de fitotoxicidad en tres
36
tratamientos representativos
13
Líneas representativas de tolerancia y susceptibilidad (O-10-1, O-
37
5, 243-1)
14
Relación entre las variables diferencial de altura vs. fitotoxicidad
38
15
Plantas tolerantes seleccionadas
39
1
RESUMEN
La quínoa (Chenopodium quinoa Willd) es un cultivo de importancia debido a su alto
valor nutritivo y por su adaptabilidad a diversos ambientes. En la actualidad una de
las principales limitantes para masificar su cultivo es el control de malezas. Se
considera que el uso de herbicidas seria la forma más eficiente de controlar
malezas en esta especie. Existen antecedentes donde se demuestra que a través
de la inducción de mutaciones es posible obtener genotipos de plantas resistentes a
herbicidas de amplio espectro. La quínoa se ha incluido en programas de
mejoramiento donde se ha considerado el uso de inducción de mutaciones para
obtener genotipos con características deseables.
La presente investigación tiene como objetivo inducir mutaciones en semillas de
quínoa de la variedad Regalona Baer y determinar si es posible seleccionar
mutantes con una elevada tolerancia a herbicidas del grupo de las imidazolinonas.
El trabajo se divide en tres partes: inducción de mutaciones, multiplicación del
material, etapas de selección y por último validación de la tolerancia en líneas
seleccionadas.
Los resultados obtenidos indican que la concentración óptima de etil metano
sulfonato (EMS) para desatar mutaciones es de 1 y 2%, expuesto 8 horas. La
selección de líneas tolerantes se realizó con la aplicación del herbicida Onduty
(imazapic + imazapyr) pertenecientes al grupo de las imidazolinonas; seleccionando
y cosechando aquellas líneas que post-aplicación presentaron los mayores
desarrollos.
Las líneas seleccionadas que se utilizaron en el ensayo final de validación
corresponden a las líneas 242-1, 242-2, 243-1, 243-2, 244-1, 246-2, O-5, O-7 y O10-1.
Las variables evaluadas 15 días post-aplicación del herbicida fueron: estado
fenológico, altura de planta y fitotoxicidad.
Para la variable estado fenológico no se encontraron diferencias significativas,
puesto que todas las plantas se encontraban en el mismo estado de desarrollo.
2
Los resultados obtenidos indican que para la variable altura de planta se
encontraron diferencias significativas, debido a que existe gran variación
principalmente entre las líneas 243-1 y 242-2.
En cuanto a la fitotoxicidad se determinó que existen diferencias significativas,
puesto que las líneas 243-1 y 243-2 presentaron los mayores niveles de
fitotoxicidad, mientras que las líneas O-10-1 y 242-2 presentaron los mayores
niveles de tolerancia a las imidazolinonas.
Se realizó un análisis de correlación entre las variables altura de planta y
fitotoxicidad determinando que ambas variables son independientes.
En el último ensayo de validación aún se detectó una gran segregación dentro de
las líneas mutadas por lo que se seleccionaron siete plantas que mostraron la más
alta tolerancia al herbicida. Estos individuos pertenecen a las líneas 242-2, 246-2,
O-5 y O-10-1.
3
SUMMARY
Quinoa (Chenopodium quinoa Willd) is a major agronomical crop due to its high
nutritional value and adaptability to different environments. Currently, one of the
main constraints to massively expand this crop is the lack of proper weed control. It
is believed that the use of herbicides would be the most efficient way to control
weeds among the quinoa crop. There is evidence showing that through mutagenesis
is possible to generate resistant genotypes to broad spectrum of herbicides. Quinoa
has been included in breeding programs where we have carried out mutations to
obtain genotypes with desirable characteristics.
This research aims to induce mutations in quinoa seeds of the variety Regalona
Baer and to assess whether it's possible to select mutants with a high tolerance to
herbicides of the imidazolinone group.
The paper is divided into three parts: induction of mutations and multiplication of
material selection and validation stages of tolerance in selected lines.
The results indicate that the optimal concentration of ethyl methane sulphonate
(EMS) to trigger mutations is 1 and 2% above 8 hours. The selection of tolerant lines
was performed with the application of the herbicide Onduty (imidazolinone) selecting
those lines and reaping that post-application of herbicide had the highest
developments.
The selected lines that were used in the final validation test correspond to 242-1,
242-2, 243-1, 243-2, 244-1, 246-2, O-5, O-7 and line O -10-1.
Variables evaluated and studied 15 days post herbicide applications were
phenological stage, plant height and phytotoxicity.
Phenological states for variable differences were not significant, since all plants
were at the same stage of development. Conversely, the results indicate that for
plant height there were significant differences, explained due to the great variation
between lines 243-1 and 242-2. Regarding phytotoxicity, it was also determined
that there was significant differences; whereas lines 243-1 and 243-2 showed the
4
highest levels of phytotoxicity, lines 0-10-1 and 242-2 showed the highest levels of
imidazolinone tolerance.
An analysis of correlation between plant height and phytotoxicity determining that
both variables are independent.
The final validation test still detected segregation within the mutant lines at seven
plants that were selected that showed the highest tolerance to the herbicide. These
individuals belong to lines 242-2, 246-2, O-5 and O-10-1.
5
1 INTRODUCCIÓN
Desde hace mucho tiempo, nuestra dependencia sobre un reducido grupo de
especies ha aumentado y los procesos de selección y propagación se han
concentrado en pocos cultivos principales como trigo, arroz, maíz, papas y soya.
Ciertos cultivos como los pseudocereales han sido descuidados, a pesar de que en
la historia de culturas prehispánicas, tuvieron un papel predominante como base de
la alimentación.
En Sudamérica, durante la colonia, la cultura europea forzó el cambio de especies
nativas como la quínoa (Chenopodium quinoa Willd) por especies de cereales
exóticos. Tales cultivos europeos no prosperaron en las zonas altas y de allí el
mantenimiento de la cultura de consumo y cultivo de quínoa alto-andina.
Sin
embargo, en tierras bajas de Chile, el reemplazo prácticamente acabó con la
memoria colectiva de hábitos agrícolas y culinarios de este alimento; desde
entonces la recuperación ha sido lenta y reciente a partir de unas pocas
localidades.
La quínoa ha sido utilizada a lo largo de todo el país por siglos, ya que existen
ecotipos adaptados a diversos ambientes y prácticas de manejo. Sin embargo, la
investigación y desarrollo de sus atributos agronómicos y de calidad no han tenido
continuidad, siendo más bien escasos. Excepto por el trabajo de la empresa
Semillas Baer de la IX Región que ha producido la variedad Regalona Baer, no ha
habido esfuerzos masivos por uniformar variedades en Chile.
La gran diversidad genética de la quínoa cultivada se evidencia mostrando
variabilidad en la coloración de la planta, inflorescencia y semillas, así como
también en el contenido de proteína, saponina, betacianina y cristales de oxalato de
calcio en las hojas.
En la actualidad una de las principales limitantes para masificar el cultivo de la
quínoa es el control de malezas, puesto que no existe un herbicida que trabaje de
manera adecuada en esta especie, ya que aquellos que presentan un buen control
de malezas causan fitotoxicidad en las plantas de quínoa. Por otra parte, el control
6
mecánico y manual es efectivo, pero solo aplicable en pequeñas extensiones, es
por esto que se considera que el uso de herbicidas sería la forma más eficaz de
controlar las malezas en esta especie y con ello la posibilidad de masificar su
cultivo.
Para complementar los métodos convencionales de mejoramiento genético que
permitan obtener genotipos de quínoa con características deseables, se ha
considerado el uso de la inducción de mutaciones, las cuales incluyen el uso de
agentes mutagénicos físicos como los rayos gamma y agentes mutagénicos
químicos como azida de sodio.
Existen investigaciones en otras especies, como es el caso del trigo, donde a través
de la inducción de mutaciones con agentes químicos se logró obtener variedades
resistentes a herbicidas del grupo de las imidazolinonas (imazamox), desarrollado
bajo el Sistema de Producción Clearfield de la empresa BASF.
A partir de los antecedentes presentados se plantea como hipótesis de este trabajo
que la inducción de mutaciones con un agente químico (etil metano sulfonato)
permitirá obtener genotipos de quínoa tolerantes a imidazolinonas.
Esta investigación tiene como objetivo general determinar si la inducción de
mutaciones en semillas de quínoa permite seleccionar mutantes con una elevada
tolerancia a herbicidas del grupo de las imidazolinonas.
Dentro de los objetivos específicos se encuentran:
- Inducir mutaciones en semillas de quínoa.
- Seleccionar plantas M1 y M2 con mayor tolerancia a imidazolinonas.
- Validar el nivel de tolerancia a imidazolinonas en líneas de quínoa seleccionadas.
7
2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 El cultivo de la quínoa (Chenopodium quinoa Willd)
La quínoa pertenece a la familia Chenopodiaceae, género Chenopodium, sección
Chenopodia y subsección Cellulata. Su centro de origen es de amplia distribución y
diversificación múltiple, siendo la región andina y dentro de ella, las orillas del Lago
Titicaca, las que muestran mayor diversidad (GANDARILLAS, 1974; RUAS et al.,
1999). Es probable que esta especie haya sido domesticada por civilizaciones
antiguas en momentos diferentes y lugares distintos, tales como lo que actualmente
correspondería a partes de Perú (5.000 A.C), Chile (3.000 A.C) y Bolivia (750 A.C)
(RUAS et al., 1999; FUENTES et al., 2008)
La quínoa es una planta anual, dicotiledónea, usualmente herbácea que alcanza
una altura de 1,0 a 3,5 m según el ecotipo y el medio ecológico donde se cultive
(TAPIA, 1990). La raíz es fasciculada y muy fibrosa, llegando a tener una
profundidad de 0,50 a 1,80 m según el ecotipo, la profundidad del suelo y la altura
de la planta (PACHECO y MORLON, 1978; TAPIA, 1990).
El tallo es cilíndrico y a la madurez se vuelve anguloso. El hábito de crecimiento
puede variar de un solo tallo principal a ecotipos con muchas ramificaciones. Las
hojas son de carácter polimorfo en una sola planta; es decir, las de la base son
romboides, mientras que las hojas superiores, ubicadas alrededor de la
inflorescencia, son lanceoladas. La lámina de las hojas tiernas está cubierta por una
pubescencia granulosa vesiculosa en el envés y algunas veces en el haz. Esta
cobertura varía de blanco a un color rojo-púrpura; contienen células ricas en oxalato
de calcio las que favorecen la absorción y retención de humedad atmosférica,
manteniendo turgentes las células y protegiéndolas de las heladas (TAPIA y FRIES,
2007). La inflorescencia de la quínoa es una panoja típica, ésta puede ser laxa
(amarantiforme) o compacta (glomerulada), existiendo formas intermedias entre
ambas; la longitud de la panoja es variable pudiendo alcanzar entre 30 y 80 cm
(MUJICA et al., 1998). Las flores son pequeñas, sésiles, de la misma coloración
que los sépalos y pueden ser hermafroditas, pistiladas o androestériles
(HERNANDEZ et al., 1992; MAUGHAN et al., 2004). La quínoa puede ser de
8
autopolinización o polinización cruzada, pudiendo variar esta última alrededor del
10%, dependiendo del medio en que se encuentre (JACOBSEN y STOLEN, 1993).
El fruto es un aquenio, mal llamado grano o pseudocereal, con un perigonio que se
desprende fácilmente y dos capas internas: episperma exterior y perisperma interior
que difícilmente se separan del fruto (TAPIA y FRIES, 2007). (FIGURA 1)
FIGURA 1 Morfología de la planta de quínoa.
FUENTE: Adaptado de WILLIAMS (1995).
9
El ciclo fenológico de la planta de quínoa (FIGURA 2) varia de 120 a 240 días,
adaptándose a diferentes condiciones del medio. Las fases fenológicas, según
HERNÁNDEZ et al., (1992), serían: emergencia, 2 hojas verdaderas, 4 hojas
verdaderas, 6 hojas verdaderas, ramificación, inicio de formación de panoja, plena
formación de panoja, inicio de floración, floración o antesis, grano lechoso, grano
pastoso y madurez fisiológica.
FIGURA 2 Ciclo fenológico de la planta de quínoa: 1 Emergencia, 2 Dos hojas
verdaderas, 3 Cuatro hojas verdaderas, 4 Seis hojas verdaderas, 5
Ramificación, 6 Inicio de formación de panoja, 7 Panojamiento, 8
Inicio de floración.
FUENTE: MUJICA y CANAHUA (1989).
La distribución de la quínoa es muy amplia, comienza desde los salares del sur de
Bolivia, incluyendo países como Ecuador, Perú y el norte de Argentina (Provincias
de Salta y Jujuy) y se extiende a Chile, donde el desierto de Atacama corta la
distribución del cultivo, el que posteriormente continúa hacia el sur del país (FRIES,
2007)
Las plantas de quínoa cultivadas presentan gran diversidad en cuanto a sus
requerimientos agroecológicos, siendo clasificadas en cinco tipos:
10
- Quínoa del altiplano: se pueden encontrar en los alrededores del lago Titicaca,
son resistentes a heladas, de pequeña altura, no presentan ramificación y son de
períodos de crecimiento corto.
- Quínoa del valle: se desarrolla en valles de los Andes desde 2.000 a 3.600
m.s.n.m., son las de mayor altura, ramificadas y tienen un período de desarrollo
mas largo.
- Quínoa del grupo de los salares: nativas de los salares del altiplano boliviano, muy
adaptadas a condiciones xerófitas, como lo son a suelos alcalinos, poseen semillas
de alto contenido proteico y sabor amargo.
- Quínoas subtropicales: son plantas de coloración verde intenso que al madurar
cambian a naranjo, se encuentran localizadas en los valles interiores de los Andes
en Bolivia. Además tienen semillas pequeñas, de color blanco, amarillo o naranjo.
- Quínoas del nivel del mar: se encuentran situadas en el sur de Chile, que en su
mayoría no presentan ramificación, y son plantas de día largo. Presentan
variaciones en el color del tallo y la densidad de la inflorescencia, poseen semillas
pequeñas, amarillas, translúcidas y amargas (NATIONAL RESEARCH COUNCIL,
1989; TAPIA y FRIES, 2007).
Recientemente este cultivo ha sido introducido en Europa, principalmente en
Inglaterra y Dinamarca, donde ha sido evaluado como una alternativa de cultivo
para el consumo humano en áreas marginales. También ha sido introducida en
Estados Unidos, África y Asia (RISI y GALWEY, 1984; WARD y JOHNSON 1993;
JACOBSEN et al., 1994; JACOBSEN et al., 1996; BHARGAVA et al., 2006).
Actualmente existe gran cantidad de ecotipos y unas pocas variedades utilizadas
comercialmente en la producción de quínoa. Los principales países productores
son: Perú, Bolivia, Ecuador, Argentina, Colombia, Chile y México. En el Perú, se
pueden encontrar las siguientes variedades: Amarilla Maranganí, Kancolla, Blanca
de Juli, Cheweca, Witulla, Salcedo-INIA, Quillahuaman-INIA, Camacani I, Camacani
II, Huariponcho, Chullpi, Roja de Coporaque, Ayacuchana-INIA, Huancayo,
Hualhuas, Mantaro, Huacataz, Huacariz, Rosada de Yanamango, Namora. En
Bolivia se encuentran: Sajama, Sayaña, Chucapaca, Kamiri, Huaranga, Ratuqui,
Samaranti, Robura, Real, Toledo, Pandela, Utusaya, Mañiqueña, Señora,
Achachino, Lipeña. En Ecuador: INIAP-Tunkahuan, INIAP-Ingapirca, INIAP-Imbaya,
INIAP-Cochasqui, ECU-420, Másal 389. En Argentina se encuentran Jujuy
11
Cristalina y Jujuy Amilacea. En Colombia: Nariño. En Chile existen varios ecotipos
como son: Canchones, Faro, Lito, Atacama, Baer; pero solo una variedad inscrita,
esta es la variedad Regalona Baer (Res. Nº 13/01). En México podemos encontrar:
Huatzontle blanco, Huatzontle rojo., Huatzontle amarillo (MUJICA et al., 2001).
La variedad chilena Regalona Baer es de crecimiento herbáceo, panoja
glomerulada intermedia compacta, grano de tamaño mediano y de color blanco
opaco. Alcanza una altura de 0,7 a 1,0 m y tiene buena resistencia a la tendedura.
Su época de siembra es de septiembre a octubre, la dosis de siembra es de 10 kg
ha-1. La zona de adaptación se extiende desde la VIII a la IX Región. A la fecha no
existen antecedentes de enfermedades.1
El interés actual por mejorar este cultivo es por el alto valor nutricional que posee el
grano. La proteína de la quínoa es rica en histidina y lisina, aminoácidos limitantes
en granos como los cereales y se aproxima al patrón recomendado por la FAO
2
para los requerimientos nutricionales de las personas (TAPIA et al., 1979; RUAS et
al., 1999; ROMO et al., 2006). La quínoa se denomina pseudocereal por su alto
contenido de carbohidratos, principalmente almidón (50-60%), sin embargo, su
contenido de proteína es mayor que en los cereales (CUADRO1) (ROMO et al.,
2006). El grano de quínoa se considera libre de gluten, ya que su proteína está
conformada principalmente por albúminas y globulinas solubles en agua o
soluciones salinas débiles, lo que dificulta su uso en la panificación, pero puede ser
un alimento interesante para alérgicos al gluten (NIETO y VALDIVIA, 2001; ROMO
et al., 2006).
CUADRO 1 Composición de granos de quínoa y cereales en base materia
seca.
Elemento
Quínoa
Arroz
Cebada
Maíz
Trigo
Proteína (%)
16,3
7,6
10,8
10,2
14,2
Grasa (%)
4,7
2,2
1,9
4,7
2,3
Carbohidratos totales (%)
76,2
80,4
80,7
81,1
78,4
Fibra cruda (%)
4,5
6,4
4,4
2,3
2,8
Cenizas (%)
2,8
3,4
2,2
1,7
2,2
Energía (kcal/100g)
399
372
383
408
392
1
BAER, E. (2000). Ing. Agr. Campex Semillas Baer-Cajón, Chile. Comunicación personal.
Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación.
2
12
FUENTE: ROMO et al., (2006).
El grano de quínoa contiene casi todos los minerales en un nivel superior a los
cereales (CUADRO 2), siendo su contenido de hierro dos veces más alto que el del
trigo y tres veces más alto que el del arroz. Además la quínoa supera a los cereales
en el contenido de las vitaminas B2, E y A, mientras el contenido de B3 es menor.
La semilla almacena en el pericarpio un esteroide (saponina) que puede alcanzar
un contenido de 0,11% en las variedades denominadas dulces y más de un 2% en
aquellas denominadas amargas (WAHLI, 1990; BERTERO et al., 1999a; BERTERO
et al., 1999b; BERTERO, 2001). La saponina le proporciona un sabor amargo a la
semilla, el cual puede ser removido por simple lavado de los granos, por
escarificación o ambos en el caso de los granos que poseen un mayor porcentaje
de contenido de saponina (ROMO et al., 2006).
CUADRO 2 Contenido de los principales minerales en el grano de quínoa,
trigo y arroz
Mineral
Quínoa
Trigo
mg/100 g alimento
Arroz
Calcio
148,7
50,0
27,6
Fósforo
383,7
380,0
284,5
Hierro
13,2
5,0
3,7
Potasio
926,7
500,0
212,0
Magnesio
246,9
120,0
118,0
Sodio
12,2
10,0
12,0
Cobre
5,1
0,5
0,4
Manganeso
10,0
2,9
0,0
Zinc
4,4
3,1
5,1
Cloro
153,3
0,0
0,0
FUENTE: Adaptado de ROMO et al., (2006).
Para obtener un grano de alta calidad y un buen rendimiento del cultivo, la quínoa
requiere de determinadas condiciones edafoclimáticas, las que se detallan a
continuación.
13
La quínoa prefiere un suelo franco, con buen drenaje y alto contenido de materia
orgánica, con pendientes moderadas y un contenido medio de nutrientes. La planta
es exigente en nitrógeno y calcio, moderadamente en fósforo y poco en potasio. Se
puede adaptar a suelos franco arenosos, arenosos o franco arcillosos, siempre que
se le otorgue una cantidad adecuada de nutrientes y no exista la posibilidad de
encharcamiento, puesto que es muy susceptible al exceso de humedad sobre todo
en los primeros estados de desarrollo (TAPIA, 2000; MUJICA et al., 2001; TAPIA y
FRIES, 2007).
Este cultivo tiene un amplio rango de crecimiento y producción a diferentes pH del
suelo. Ejemplo de ello son algunas variedades procedentes de los salares en
Bolivia que pueden soportar hasta pH 8, demostrando su capacidad de adaptarse a
suelos salinos. Así mismo se ha encontrado quínoa en suelos ácidos (pH 4,5) en
Michiquillay, Cajamarca, Perú (TAPIA y FRIES, 2007).
La quínoa por ser una planta muy plástica y tener amplia variabilidad genética
(MAUGHAN et al., 2004; MASON et al., 2005; FUENTES et al., 2008), se adapta a
diferentes climas. Por ello es necesario conocer que genotipos son adecuados para
cada una de las condiciones climáticas.
La quínoa es una especie eficiente en el uso del agua, puesto que posee
mecanismos que le permiten soportar déficit de humedad. La quínoa se le
encuentra creciendo y dando producciones aceptables con precipitaciones mínimas
de 200-250 mm anuales, como es el caso del altiplano sur boliviano.
En
condiciones del sur de Chile, la quínoa alcanza producciones aceptables con
precipitaciones que sobrepasan los 2000 mm anuales. En general, este cultivo
prospera con precipitaciones de 250 a 500 mm anuales en promedio (MUJICA et
al., 2001; TAPIA y FRIES, 2007).
La temperatura media adecuada para la quínoa se encuentra alrededor de 15 a
20°C. Sin embargo, se ha observado que con temperaturas medias de 10°C se
desarrolla perfectamente, así mismo ocurre con temperaturas medias y altas de
hasta 25°C. Al respecto se ha determinado que esta planta también posee
mecanismos de escape y tolerancia a bajas temperaturas, pudiendo soportar hasta
-8 °C en determinadas etapas fenológicas, siendo la más tolerante ramificación y
las más susceptibles floración y llenado de grano (JUNTA DEL ACUERDO DE
CARTAGENA, 1990).
14
La quínoa presenta diversidad en su respuesta fotoperiódica (BERTERO et al.,
1999a; BERTERO et al., 1999b; BERTERO, 2001) que se desprende de la gran
diversidad de ambientes a los que esta especie a logrado adaptarse. Respecto a
esto último, en general, la quínoa se ha clasificado como planta preferentemente de
día corto (BERTERO et al., 1999a). Aunque por haberse adaptado a variados
ambientes, la sensibilidad al fotoperíodo también presenta variaciones. Así
cultivares de origen más tropical se caracterizan por ser de día corto, poseer una
mayor sensibilidad a cambios en éste y una mayor duración de la fase vegetativa
(de emergencia hasta floración). Los ecotipos del altiplano peruano, boliviano y las
del nivel del mar (Chile) poseen una menor sensibilidad a los cambios en el
fotoperíodo (día neutro) y una menor duración de la fase vegetativa (FRERE et al.,
1975; BERTERO y HALl, 2000).
A pesar de los antecedentes anteriormente presentados, la quínoa es una especie
que no ha podido extender su cultivo. Una de las principales limitantes que existen
es el difícil control de malezas. Actualmente se realiza en forma mecánica y
manual, ya que por lo general se cultiva en pequeñas extensiones (GALWEY, 1989;
BAER, 1995).
Se recomienda el primer control cuando las plantas tienen
aproximadamente 20 cm de altura, alrededor de los 50 días después de la siembra.
El número de controles va a depender del grado de infestación de malezas en el
potrero, limitándose a una o dos escardas y ocasionalmente a una aporca
(HERNANDEZ et al., 1992; AGUERREA, 1998).
El control químico de malezas en quínoa ha sido estudiado en varios países, sin
embargo, los resultados no son claros e incluso existen contradicciones entre ellos
(RISI y GALWEY, 1984; WESTRA, 1988; GALWEY, 1989). Las malezas gramíneas
no son difíciles de controlar químicamente, ya que existen herbicidas altamente
selectivos para cultivos de hoja ancha como la quínoa, por el contrario, las malezas
de hoja ancha son más difíciles de controlar químicamente, ya que muchos de los
herbicidas utilizados con este fin no son selectivos a especies silvestres del género
Chenopodium como es el caso de Chenopodium album y Chenopodium hircinum,
ambas especies consideradas malezas comunes en el sur de Chile (AGUERREA,
1998; TAPIA, 2000; FUENTES et al., 2008).
2.2 Mutaciones
Existe gran diversidad de fenotipos en las plantas tanto en sus características como
en sus funciones, determinada por la diversidad genética y la interacción de estos
15
genotipos con el ambiente. Existen diferentes factores que favorecen la diversidad
genética y la variedad de características entre individuos de una misma especie o
de especies diferentes. Entre estos factores se puede mencionar la reproducción
sexual y las mutaciones, que aumentan la diversidad sobre la que actúa la
selección natural. A esto se suma la acción del hombre que, a través de la
selección artificial y la hibridación (cruzamientos selectivos) aprovecha esta
diversidad y promueve la reproducción y supervivencia de determinadas especies o
variedades que resultan favorables. Todos estos mecanismos, naturales e
inducidos por el hombre, se incluyen en lo que se denomina técnicas tradicionales
de mejoramiento vegetal (MROGINSKI, 2004; SUAREZ, 2006), de las cuales se
detalla a continuación las mutaciones, puesto que es la técnica utilizada en esta
investigación.
Las mutaciones génicas son alteraciones permanentes en el material genético. La
mutación es un proceso por el cual los genes pasan de una forma alélica a otra. Se
pueden clasificar según su origen y según el tejido que afectan. Aquellas
clasificadas según su origen son dos: las espontáneas (errores en la replicación o
lesiones) y las inducidas (con agentes mutagénicos físicos o químicos). Según el
tejido que afectan, pueden ser somáticas o germinales. El uso de las mutaciones
inducidas para mejoramiento es una forma de originar variabilidad genética. No se
pueden generar nuevos genes sino nuevas alternativas para los existentes y no
pueden ser dirigidas a un gen específico (MICKE, 1999; GUTIERREZ et al., 2003).
En la actualidad, el mejoramiento genético mediante inducción de mutaciones utiliza
básicamente dos tipos de agentes mutágenos: los químicos (EMS, MNH, etc.) y los
físicos (rayos x, rayos gamma, etc.). En los párrafos siguientes se describe el uso
de agentes mutagénicos de tipo químico, debido a que fueron éstos los utilizados
en este estudio.
Los agentes mutágenos químicos son numerosos y continuamente se están
incrementando. Sin embargo, para los propósitos de mejoramiento en plantas
cultivadas sólo algunos pocos son realmente útiles. La mayoría de ellos pertenecen
al grupo de los agentes alquilantes y dentro de ellos se pueden señalar los
siguientes: etil metano sulfonato (EMS), sulfato de dietilo (dES) y los compuestos
nitrosos como N-metil-N-nitrosourea (MNH) (GUTIERREZ et al., 2003; SUAREZ,
2006).El EMS es un agente alquilante que puede transferir radicales etilo a la
guanina, causando que se produzca un apareamiento erróneo con timina en lugar
16
de citosina durante la duplicación del ADN (NEUFFER y FICSOR, 1963;
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID, 2003) (FIGURA 3)
Se ha utilizado la inducción de mutaciones con EMS en diversos estudios. Ejemplo
de ello es la investigación llevada a cabo por JANDER et al., (2003), en la cual se
indujo mutaciones con EMS en plantas de arabidopsis (Arabidopsis thaliana). Esta
investigación tuvo por objetivo determinar la frecuencia de inducción de mutaciones
que otorgan tolerancia a herbicidas de los grupos glicinas (glifosato), sulfonilureas
(clorosulfuron) e imidazolinonas (imazetapyr). Para ello se utilizaron dos ecotipos de
arabidopsis: Col-0 (Columbia) y Ler (Landsberg erecta). Se determinó que la
frecuencia de mutantes resistentes a imazetapir en Col-0 es de 4x10-5 y para Ler
fue de 2,4x10-5. Mientras que la frecuencia de mutantes tolerantes a clorosulfuron
para Col-0 fue 8x10-6 y para Ler fue de 5,6x10-5. Para glifosato no se encontró
tolerancia. La frecuencia de tolerancia a imazetapir fue ligeramente mayor en el
ecotipo Col-0 en comparación al ecotipo Ler y la frecuencia de tolerancia a
clorosulfuron fue más alta en el ecotipo Ler que en el ecotipo Col-0.
FIGURA 3 Acción del agente mutágeno EMS a nivel de ADN.
FUENTE:
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
COMPLUTENSE DE MADRID, 2003.
DE
LA
UNIVERSIDAD
17
Otro ejemplo de inducción de mutaciones con EMS en programas de mejoramiento
es donde se busca proporcionar tolerancia a enfermedades. Es el caso del poroto
común (Phaseolus vulgaris L.), donde a través de la inducción de mutaciones con
EMS se encontró tolerancia al virus común del mosaico (BCMV). Esta variedad fue
liberada a mediado de los setenta y posteriormente fue usada como parental en
otros programas de mejoramiento donde se cruzó con variedades mas productivas.
En los noventa se utilizó nuevamente EMS en esta misma especie para inducir
mutaciones que le proporcionaran una alta tolerancia al mosaico dorado del poroto
(BGMV) que al igual que en caso anterior, también se utilizó como parental en
cruzas posteriores con variedades de mayor productividad (NICHTERLEIN, 1999)
2.3 Generación de tolerancia a herbicidas por mutaciones
La tolerancia a herbicidas es la capacidad hereditaria natural que tienen todas las
poblaciones de una maleza para sobrevivir y reproducirse después del tratamiento
con un herbicida. Por lo tanto, la especie como tal no es afectada por el herbicida
de interés (FISCHER y VALVERDE 2005). Es importante destacar que los biotipos
tolerantes son el resultado de mutaciones espontáneas que se dan al azar (no son
inducidas por los herbicidas). Es decir, que los genes que determinan la tolerancia a
un herbicida pueden estar presentes en una especie aún antes que ese principio
activo sea introducido en el mercado (BERCKIE, 2006).
La tolerancia también puede ser inducida por ciertas técnicas, como la ingeniería
genética o la selección de variantes producidas a través del cultivo o mutagénesis.
Es el caso de la tolerancia a ciertos herbicidas en especies cultivadas (KOGAN y
PEREZ, 2004).
Los híbridos de especies cultivadas con tolerancia a herbicidas agregan valor a la
agricultura, al ofrecer un beneficio económico a los productores. Ejemplo de ello
son los híbridos de maíz Clearfield que fueron los primeros cultivos tolerantes a
herbicidas introducidos en Estados Unidos. Los maíces Clearfield son variedades
de maíz que poseen genes que otorgan tolerancia a ciertos herbicidas del grupo de
las imidazolinonas. Estos genes fueron descubiertos en variedades de maíz en la
década de los setenta por científicos de la compañía American Cyanamid,
actualmente BASF, e introducidos a híbridos comerciales empleando técnicas de
18
cultivo de células y selección de cruzamientos, sin afectar su potencial de
rendimiento (BASF, 2004).
La resistencia a herbicidas puede ser clasificada en tres tipos. El primero de ellos
es la resistencia simple, donde un biotipo es resistente a una molécula de herbicida
que posee sólo un modo de acción. El segundo tipo corresponde a la resistencia
cruzada, donde el biotipo es resistente a dos moléculas de herbicida que comparten
el mismo modo de acción y el tercer tipo corresponde a la resistencia múltiple, en
este caso el biotipo es resistente a dos moléculas de herbicida que poseen
diferentes modos de acción. La resistencia simple y cruzada son las que se
presentan con mayor frecuencia en campo (ORMEÑO, 2001; FISCHER y
VALVERDE, 2005).
Dentro de los mecanismos de resistencia cruzada a herbicidas podemos encontrar
dos categorías:
- Resistencia excluyente. Se presenta independientemente del sitio de acción
debido a una elevada capacidad genética por parte de los biotipos resistentes para
metabolizar el herbicida, a diferencia de los susceptibles.
- Resistencia cruzada-sitio de acción. Esta ocurre entre herbicidas cuyo sitio de
acción fitotóxico, en términos bioquímicos, es el mismo. Se presenta cuando un
cambio en el sitio de acción bioquímico del herbicida confiere resistencia a dicho
herbicida y a otros, del mismo grupo o de diferentes grupos químicos, que inhiben
el mismo sitio de acción en la planta (KOGAN y PEREZ, 2004; TABERNER,
CIRUJEDA y ZARAGOZA, 2007).
Dentro de la resistencia cruzada sitio de acción encontramos los herbicidas
inhibidores de la enzima ALS (acetolactato sintasa). Los más frecuentes son del
grupo de
las sulfonilureas, imidazolinonas y triazolpirimidinas, en cultivos de
importancia económica como trigo, maíz, raps y maravilla. En la mayoría de los
casos de resistencia a sulfonilureas, el mecanismo de resistencia corresponde a un
cambio de tipo bioquímico en el sitio de acople del herbicida en la enzima ALS. La
mayoría de los casos que presentan esta resistencia, también presentan variados
niveles de
tolerancias a los grupos de imidazolinona y triazolpirimidina,
químicamente diferentes, pero todos inhibidores de ALS (TRANEL y WRIGHT,
2002; KOGAN y PEREZ, 2004).
19
Existen diferentes mutaciones del gen que codifica para la enzima ALS, así al
secuenciar varios genes provenientes de biotipos resistentes a los herbicidas
inhibidores de esta enzima, se detectaron cambios en diferentes aminoácidos
(CUADRO 3). Las mutaciones de la enzima ALS que confieren tolerancia a los
herbicidas inhibidores de esta enzima pueden afectar la función catalítica de la
enzima y su regulación, no obstante, los cambios presentes en la secuencia del gen
de la ALS, en general, no alteran su función; por lo tanto, los biotipos resistentes no
presentan desventajas frente a los susceptibles (KOGAN y PEREZ, 2004).
CUADRO 3. Diferentes mutaciones que confieren tolerancia a herbicidas
inhibidores de la enzima ALS, con el nivel de tolerancia general
conferido por cada mutación a tres grupos de herbicidas.
Nivel de
Torelancia
Dominio
Mutación
Sulfonilureas
Triazolpirimidinas
Imidazolinonas
(A) AITGQVPRRMIGT
Pro197-Ala
Alto
Moderado-Bajo
Cero
Pro197-Thr
Alto
?
Bajo-Cero
Pro197-His
Alto
Bajo
Moderado
Pro197-Leu
Alto
Alto
ModeradoBajo
Pro197-Arg
Alto
?
?
Pro197-Ile
Alto
Moderado-Bajo
ModeradoBajo
Pro197-Gln
Alto
?
?
Pro197-Ser
Alto
Alto
Cero
(B)QWED
Trp591-Leu
Alto
Alto
Alto
(C)VFAYPGGNANSMEIHQALTRS
Ala122-Thr
Bajo-Cero
Bajo-Cero
Alto
(D)AFQETP
Ala205-Asp
Alto
?
?
(E)IPSGG
Ser670-Asp
Bajo
Cero
Alto
FUENTE: KOGAN y PEREZ, 2004
20
3 MATERIAL Y MÉTODO
3.1 Inducción de mutaciones
La primera etapa de esta investigación consistió en determinar la concentración del
agente mutágeno y luego realizar la inducción de mutaciones en semillas de
quínoa. Esta etapa se desarrolló en el laboratorio de Biología Molecular de Plantas
de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile en el año
2005. Para ello se utilizaron semillas de quínoa variedad Regalona Baer, las cuales
fueron desinfectadas con hipoclorito de sodio y luego sometidas a inducción de
mutaciones con una agente mutágeno químico.
Para determinar la concentración del agente mutágeno a utilizar en los ensayos
posteriores, se realizaron pruebas con diferentes concentraciones y diferentes
horas de exposición al agente mutágeno EMS.
El procedimiento fue el siguiente: se pesaron 3,0 g de semillas de quínoa, las
cuales fueron sumergidas en una solución de hipoclorito de sodio al 10% por 15
minutos para su desinfección. Luego se lavaron reiteradas veces con agua
destilada, se dejaron secar a temperatura ambiente y posteriormente se
sumergieron en una solución de EMS a diferentes concentraciones (0, 1, 2 y 3%)
por un período de 8 y 16 horas. Luego se sometieron a pruebas de germinación,
las cuales tienen una duración de 3 días, a 25 ºC y sobre 80% de humedad. Se
realizaron 3 repeticiones por tratamiento; cada tratamiento corresponde a una
concentración de EMS por distintas horas de exposición. Cada repetición estaba
compuesta por una placa petri con 25 semillas cada una. Estas se llevaron a una
cámara de germinación del Laboratorio de Semillas de la Facultad de Ciencias
Agrarias de la Universidad Austral de Chile, para su evaluación.
Los tratamientos evaluados fueron: T0-8 (Testigo 0% concentración EMS, 8 horas
de exposición), T1-8 (1% concentración EMS, 8 horas de exposición), T2-8 (2%
concentración EMS, 8 horas de exposición) y T3-8 (3% concentración de EMS, 8
horas de exposición); T0-16 ( Testigo 0% concentración EMS, 16 horas de
exposición), T1-16 ( 1% concentración EMS, 16 horas de exposición), T2-16 (2%
21
concentración EMS, 16 horas de exposición), T3-16 (3% concentración EMS, 16
horas de exposición). Los tratamientos que presentaron un rango de germinación
superior al 50% fueron seleccionados para inducir nuevamente mutaciones en una
mayor cantidad de semillas (M0).
Una vez seleccionados los tratamientos se aplicó el agente mutagénico a 30 g de
semilla de quínoa, las que posteriormente se sembraron en el mes de octubre del
año 2005 en la Estación Experimental Santa Rosa, perteneciente a la Universidad
Austral de Chile. La dosis de semilla de la generación M0 fue de 0,4 g por metro
lineal. Estas se fertilizaron con SFT (200 kg ha-1) y salitre potásico (200 kg ha-1), en
cobertera sobre las hileras. En febrero 2006, se cosecharon las plantas que se
encontraban en las mejores condiciones y de ellas se obtuvo el material que
pasaría a la siguiente etapa (M1) (FIGURA 4).
3.2 Multiplicación del material y etapas de selección
Una vez obtenidas las semillas de la generación M1, se procedió a seleccionar
individuos con tolerancia al herbicida. Para ello, en el mes de octubre del año 2006,
se establecieron nuevamente parcelas de similares características que en la etapa
anterior en cuanto a dosis de semillas y fertilización. Cuando las plantas se
encontraban en el estado de desarrollo 5-6 (FIGURA 2), se procedió a la aplicación
de Onduty, herbicida post-emergente del grupo de las imidazolinonas (ia 525 g kg-1
imazapic + 175 g kg-1 imazapyr). La dosis aplicada de herbicida fue equivalente a
114g ha-1. A la cosecha se seleccionaron las plantas que se encontraban en la
mejor condición posterior a la aplicación del herbicida. La semilla de cada planta se
cosechó por separado, originando líneas genéticas. Este ensayo se llevó a cabo en
la Estación Experimental Fundo El Hualle, perteneciente a la empresa Campex
Semillas Baer, ubicado en la localidad de Cajón, comuna de Vilcún, Provincia de
Curacautín IX Región de la Araucanía.
Con las semillas de las líneas seleccionadas (generación M2) se realizaron tres
ensayos diferentes durante el año 2007. El primero de ellos se estableció en el mes
de mayo en el invernadero de la Facultad de Ciencias Agrarias. En este ensayo se
evaluaron 10 líneas (O-1 a O-10). La siembra se realizó en maceteros
rectangulares (30 x 12 x 9 cm) los cuales contenían como sustrato una mezcla 1:1
de suelo y arena, fertilizados con una dosis equivalente a 600 kg ha-1 de Quadrop
22
(N 5%, P 21%, K 21%) y 200 kg ha-1 de salitre potásico. A estas plantas se le aplicó
una dosis de Onduty equivalente a 114 g ha-1, en estado fenológico 3-4. Se
seleccionaron aquellas plantas que sobrevivieron, de las que se obtuvo semilla en
octubre del 2007.
Los otros dos ensayos se realizaron en campo (FIGURA 4) en el mes de octubre
del mismo año, siguiendo el mismo esquema de dosis de semillas y fertilización que
los ensayos anteriores. Uno de los ensayos se estableció nuevamente en la
Estación Experimental
Fundo El Hualle. En este ensayo se aplicó una dosis
-1
equivalente a 114g ha de Onduty, en el estado de desarrollo 5-6 de las plantas de
quínoa. Se seleccionaron las líneas que presentaban las mejores condiciones.
El otro ensayo se estableció en la Estación Experimental Santa Rosa, donde
también fue aplicada una dosis de Onduty equivalente a 114 g ha-1. Se
seleccionaron para cosecha aquellas líneas que sobrevivieron, la cosecha se llevo
a cabo en el mes de febrero del 2008 (FIGURA 4).
Las semillas cosechadas de la etapa anterior (generación M3 y M4) fueron
sembradas en la Estación Experimental Santa Rosa, en el mes de octubre del año
2008. Para multiplicación del material, siguiendo el mismo esquema de dosis de
semillas y de fertilización que en los casos anteriores. En esta etapa algunas
plantas fueron cubiertas con bolsas plásticas respirables para asegurar la
autofecundación. El material correspondiente a la generación M4 ó M5 fue
cosechado en el mes de marzo del 2009.
3.3 Validación de la tolerancia en líneas seleccionadas
Esta etapa se desarrolló durante los meses de abril a mayo del 2009, en el
Invernadero de la Facultad de Ciencias Agrarias (FIGURA 4)
Del material cosechado anteriormente se seleccionaron las líneas 242-1, 242-2,
243-1, 243-2, 244-1, 246-2, O-5, O-7 y O-10-1. Además se utilizó la variedad
Regalona Baer como testigo. La siembra se realizó en maceteros rectangulares con
el mismo sustrato y fertilización que la usada el año 2007. Se utilizó un diseño
completamente al azar con seis repeticiones por tratamiento. Cada tratamiento
corresponde a una línea. Se sembraron 20 semillas por maceta, en dos líneas de
10 semillas cada una. Una vez germinadas las semillas y cuando alcanzaron el
estado fenológico 2 - 3 se procedió a ralear las plantas, dejando para evaluación
23
final 8 plantas en cada macetero. Se aplicó riego diario. Los maceteros se
dispusieron en dos mesones sobre los cuales se realizó una suplementación del
nivel de radiación incidente sobre las plantas mediante tubos fluorescentes. Los
tubos fluorescentes se ubicaron a una altura de 20 cm por sobre los maceteros. La
radiación suplementada en oscuridad fue alrededor de 18,0 µE m-2 s-1. Las plantas
crecieron a un fotoperíodo de 14 horas de luz, el que fue controlado mediante un
sistema automático a través de un reloj sincronizado.
Cuando las plantas alcanzaron un estado fenológico, en su mayoría entre 3 y 4
(FIGURA 2) se procedió a la aplicación del herbicida Onduty, con una dosis
equivalente a 114g ha-1. Para ello se utilizó una bomba de CO2 con 4 boquillas de
abanico plano (TP8002E, TEEJET) para una aplicación uniforme del herbicida. La
aplicación fue realizada dentro del invernadero de la Facultad para evitar deriva del
producto.
Luego de aplicado el herbicida se realizaron las evaluaciones. Estas evaluaciones
consistieron en: determinación del estado fenológico, altura de planta (antes de la
aplicación del herbicida y 15 días post-aplicación) y efecto fitotóxico del herbicida
sobre las plantas.
Para la evaluación de fitotoxicidad se construyó una escala en base a apreciación
visual, determinándose 15 días post aplicación del herbicida. La escala posee un
rango que va desde 1 a 6, siendo 1 sin efecto fitotóxico y 6 planta muerta
(CUADRO 4).
Con los datos obtenidos de las variables evaluadas, se realizó un análisis de
varianza (ANOVA) para altura. Mientras que para la evaluación de estado
fenológico y fitotoxicidad se realizó un test de Kruskal – Wallis. Estos análisis se
procesaron mediante el programa estadístico Statgraphics Plus 5.1. Además se
aplicó un test de Chi-cuadrado para la evaluación de fitotoxicidad y un análisis de
correlación entre las variables altura de planta y fitotoxicidad.
24
2005
2005/2006
2006/2007
Tratamiento de semillas con EMS
Facultad
M0 (Multiplicación del material)
Experimental “Santa Rosa”
Laboratorio
Estación
M1 (Aplicación Onduty, selección de plantas individuales a
líneas)
Estación Experimental “Fundo el Hualle”
Selección de líneas 242 a la 246 y O-1 a la O-10
2007
2007/2008
M2 (Aplicación Onduty sobre líneas O-1 a O-10; selección
planta individual O-10-1
Invernadero Facultad
M2 (Aplicación Onduty y
selección
individual
dentro de líneas 242 a
246
Estación
Experimental “Fundo el
Hualle”
M2 (Aplicación Onduty y
selección en líneas O-1 a
O-10-1
Estación
Experimental
“Santa
Rosa”
Líneas seleccionadas
Líneas seleccionadas:
(M3): 242-1, 242-2, 242O-5, O-7 (M3)
3, 242-4, 242-5; 243-1,
243-2, 243-3, 243-4,
O-10-1 (M4)
243-5, 243-6, 243-7;
244-1, 244-2, 244-3,
244-4, 244-5, 244-6,
244-7; 246-1, 246-2,
M3 y M4 (Multiplicación del material y autofecundación
plantas):
2008/2009
M3: 242(1-5), 243(1-7), 244(1-7), 246(1-5); O-5, O-7
M4: O-10-1
Estación Experimental “Santa Rosa”
M4 y M5 (Validación: Aplicación Onduty y selección final
plantas individuales):
2009
M4: 242-1, 242-2, 243-1, 243-2, 244-1, 246-2, O-5 y O-7
M5: O-10-1
Invernadero Facultad
FIGURA 4 Esquema de selección y validación.
25
CUADRO 4 Escala de fitotoxicidad
Nivel de
fitotoxicidad
1
Descripción
Planta sin ningún
síntoma
Planta sin ningún
2
síntoma, pero de poca
altura
Planta que presentó
3
síntomas pero que se
recuperó (curvatura de
planta)
Planta medianamente
4
afectada (curvatura de
planta, clorosis)
Planta muy afectada
5
(curvatura de planta,
clorosis, marchites)
6
Planta muerta
26
4 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1 Inducción de mutaciones
La primera etapa de esta investigación consistió en realizar la inducción de
mutaciones. En ella se probaron distintas concentraciones de EMS. Las distintas
concentraciones fueron expuestas a distintos períodos de tiempo (horas). Posterior
a la exposición de las semillas al agente mutagénico se realizaron pruebas de
germinación, para determinar qué tratamiento presenta los mejores resultados. Se
escogieron aquellos tratamientos que presentaron sobre 50% de germinación
(FIGURA 5).
100%
Porcentaje de germinación
90%
80%
70%
60%
8 horas
50%
16 horas
40%
30%
20%
10%
0%
0%
1%
2%
3%
Concentración EM S
FIGURA 5
Porcentaje de germinación según concentración de EMS y horas
de exposición.
Como se puede apreciar en la Figura 5, los tratamientos que presentaron los
mejores resultados fueron los que poseen una concentración de 1 y 2% de EMS,
expuesto por un período de tiempo de 8 horas. Se denominan los tratamientos
como Q1 y Q2. Además se puede observar en la Figura 5 que el testigo expuesto a
27
16 horas también baja considerablemente su porcentaje de germinación, esto
debido a la sensibilidad que presenta la quínoa frente a los excesos de humedad.
Este comportamiento concuerda con lo presentado en el trabajo de GALLARDO y
GONZALEZ (1993), en el cual demostraron que tanto la humedad como las
distintas concentraciones de sales y las diferentes temperaturas ejercen una fuerte
influencia sobre la germinación de la quínoa.
Una vez que se determinó el tratamiento a usar, Q1 y Q2, se indujo la mutación en
30 g de semillas (aproximadamente 10.000 semillas) de quínoa, para sembrarlas en
octubre del año 2005 en la Estación Experimental Santa Rosa de la Universidad
Austral de Chile. Los tratamientos fueron cosechados en el mes de febrero del año
2006 y se obtuvo para Q1 un total de 3 kg de semilla mientras que para Q2 se
obtuvo un total de 0,32 kg de semilla. En ambos tratamientos las semillas
cosechadas fueron homogéneas en tamaño y color.
4.2 Multiplicación del material y etapas de selección
Las semillas provenientes de la etapa anterior (M1) fueron sembradas en el mes de
octubre del 2006 en la Estación Experimental Fundo El Hualle. En este lugar se
comenzó la selección de individuos tolerantes a imidazolinonas. Cuando las plantas
se encontraban en el estado fenológico 5 – 6 se les aplicó Onduty. La dosis
aplicada resultó ser subletal para las plantas por encontrarse en un estado de
desarrollo avanzado. Se seleccionaron para ser cosechadas las líneas que
presentaban los mayores desarrollos y las mejores condiciones fenotípicas. Las
líneas seleccionadas fueron nombradas como: 242, 243, 244, 246 y O-1, O-2, O-3,
O-4, O-5, O-6, O-7, O-8, O-9, O-10. La cosecha fue realizada en el mes de febrero
del año 2007 constituyendo la generación M2.
En el ensayo realizado en el invernadero de la Facultad en el mes de mayo del año
2007, donde se sembraron las semillas de la generación M2 de las líneas O-1 a O10 se aplicó la misma dosis de Onduty, equivalente a 114g ha-1 en el estado
fenológico 3 de las plantas. La dosis aplicada resultó letal, esto debido a que la
aplicación se realizó en un estado de desarrollo temprano de las plantas, en el cual
son más susceptibles. Se seleccionaron las plantas que sobrevivieron (O-10-1,
generación M3) las que fueron cosechadas en el mes de octubre.
28
En octubre del mismo año se procedió a sembrar todas las líneas: 242, 243, 244,
246 y O-1, O-2, O-3, O-4, O-5, O-6, O-7, O-8, O-9, O-10-1; a las que se les aplicó la
misma dosis de herbicida.
En la Estación Experimental Santa Rosa fueron sembradas las líneas O-1, O-2, O3, O-4, O-5, O-6, O-7, O-8, O-9, O-10-1. Se les aplicó el herbicida en el estado de
desarrollo 3 - 4 de las plantas, resultando ser una dosis letal para la mayoría de los
individuos. Se seleccionaron para cosecha las mejores plantas dentro de las líneas
O-5, O-7 y O-10-1 que presentaron la mejor respuesta de tolerancia a la aplicación
de Onduty. Se obtiene de esta forma la generación M3 para todas las líneas
seleccionadas, excepto O-10-1 que corresponde a la generación M4.
En la Estación Experimental Fundo El Hualle fueron sembradas las líneas 242, 243,
244, 246 y aplicado el herbicida en el estado fenológico 5 - 6 de las plantas, en el
cuál la dosis utilizada de Onduty resulta ser subletal, por lo que todas las plantas
sobreviven. Luego de aplicado el herbicida fueron seleccionadas para cosecha las
plantas de mayor desarrollo dentro de las líneas que presentaron menor daño por el
herbicida: 242-1, 242-2, 242-3, 242-4, 242-5; 243-1, 243-2, 243-3, 243-4, 243-5,
243-6, 243-7; 244-1, 244-2, 244-3, 244-4, 244-5, 244-6, 244-7; 246-1, 246-2, 246-3,
246-4 y 246-5. Todas ellas equivalen a la generación M3.
Todas las líneas seleccionadas y cosechadas en febrero del año 2008 fueron
sembradas para multiplicación del material en el mes de octubre del mismo año, en
la Estación Experimental Santa Rosa. Una vez que el material sembrado alcanzó el
estado fenológico 8 (inicio de floración) se seleccionaron las plantas de cada línea
que se encontraban en las mejores condiciones. Estas plantas se cubrieron con
bolsas plásticas respirables para asegurar la autopolinización, ya que las plantas
aun están segregando. Aunque dentro de las líneas las plantas son hermanas,
siguen siendo genéticamente distintas.
Este material fue cosechado en marzo del año 2009. Luego de realizar pruebas de
germinación para determinar la existencia de latencia, se procedió a seleccionar las
líneas 242-1, 242-2, 243-1, 243-2, 244-1, 246-2, O-5, O-7 (de la generación M4) y
O-10-1 (en la generación M5) para la etapa final de validación.
29
4.3 Validación de la tolerancia en líneas seleccionadas
Con las líneas 242-1, 242-2,
243-1, 243-2, 244-1, 246-2, O-5, O-7 (de la
generación M4), O-10-1 (en la generación M5) y la variedad Regalona como testigo,
se estableció el ensayo para la validación en uno de los invernaderos de la
Facultad. Se aplicó el herbicida Onduty en una dosis equivalente a 114g ha-1, en el
estado fenológico 3 – 4 de las plantas. Antes de la aplicación del herbicida se
realizó la evaluación de estado fenológico y altura de planta, 15 días después de la
aplicación de Onduty se realizó la segunda evaluación de las variables estado
fenológico y altura de planta, y se determinó el nivel de fitotoxicidad que
presentaban las plantas.
4.3.1
Estado fenológico. Las plantas antes de ser aplicado el herbicida se
encontraban en un estado de desarrollo 3 - 4, el que corresponde según
HERNÁNDEZ et al., (1992) a cuatro y seis hojas verdaderas. Los datos obtenidos
de estado fenológico fueron sometidos a un test de Kruskal – Wallis por ser una
variable no paramétrica. Los resultados de este test indican que no existen
diferencias estadísticamente significativas entre las medianas de las líneas
evaluadas (P-valor = 0,0567853; p > 0,05).
Post aplicación del herbicida (15 días después) las plantas se encontraban en un
estado de desarrollo entre 4 – 5, lo que corresponde según HERNÁNDEZ et al.,
(1992) a seis hojas verdaderas y ramificación. Al igual que en la medición inicial de
estado fenológico, los resultados arrojados por el test de Kruskal - Wallis indican
que no existen diferencias estadísticamente significativas entre las medianas de las
líneas evaluadas (P-valor = 0,520308; p > 0,05).
4.3.2 Altura de plantas. Como se mencionó anteriormente, la primera medición
de altura de planta se efectuó un día antes de la aplicación del herbicida (estado de
desarrollo 3 -4) y la segunda medición se efectúo 15 días post aplicación de Onduty
(estado de desarrollo 4 – 5) para determinar si la aplicación realizada afecta el
crecimiento de las plantas.
En la Figura 6 se puede observar que la línea 243-1 presenta diferencias
estadísticamente significativas con las líneas O-5, O-7, 242-1, 242-2, 246-2 y
Regalona. La línea O-10-1 exhibe diferencias significativas con las líneas O-5, 2421, 242-2 y Regalona. Mientras que las líneas 242-1, 242-2, O-5, O-7, 246-2 y
30
Regalona no presentaron diferencias estadísticamente significativas entre ellas, lo
que también ocurre entre las líneas 243-1, 243-2, 244-1 y O-10-1. El tratamiento
243-1 exhibe el menor valor de altura inicial presentando una media de 4,18 cm,
mientras que el tratamiento 242-2 presenta un valor de altura inicial de 6,64 cm
siendo esta media el valor más alto con respecto a todas las líneas evaluadas.
10
9
Altura inicial (cm)
8
7
6
5
4
3
2
1
al
on
a
R
eg
62
24
41
24
32
24
31
24
22
24
21
24
O
-7
O
-5
O
-1
0-
1
0
Líneas
FIGURA 6 Altura promedio inicial de cada línea. Diferentes letras sobre las
barras indican diferencias significativas (p< 0,05; Tukey). Barras
verticales indican ± 1 DS por sobre y bajo la media.
Las diferencias en la altura inicial de las plantas podrían ser indicadoras del efecto
de la inducción de mutaciones. Esto debido a que el material original fue la variedad
Regalona Baer, la que presentó un crecimiento promedio de 6,02 cm en
condiciones controladas de invernadero, por lo tanto, las líneas derivadas de ella no
deberían presentar variación en cuanto a la altura alcanzada por cada línea en las
mismas condiciones, a menos que las mutaciones sean las que afectan su
crecimiento.
La altura final alcanzada por los tratamientos fue medida 15 días post-aplicación del
herbicida. Se determinó que en todos los tratamientos hubo crecimiento después
de la aplicación de Onduty. Esto es de esperar, ya que este herbicida inhibe la
síntesis de la enzima ALS y con ello la síntesis de aminoácidos esenciales (leucina,
31
valina e isoleucina). Por lo tanto, después de la aplicación de Onduty tanto las
plantas tolerantes como las susceptibles siguen creciendo, debido a que todas las
plantas poseen reservas de aminoácidos y proteínas, una vez que se terminan
dichas reservas, las plantas susceptibles detienen su crecimiento.
Con los datos de altura final obtenidos se determinó que existen diferencias
estadísticamente significativas entre los tratamientos. Estas diferencias se pueden
observar en la Figura 7.
10
9
Altura final (cm)
8
7
6
5
4
3
2
1
na
R
eg
a
lo
62
24
41
24
32
24
31
24
22
24
21
24
O
-7
O
-5
O
-1
01
0
Líneas
FIGURA 7 Altura final de cada tratamiento post-aplicación del herbicida.
Diferentes letras sobre las
barras indican diferencias
significativas (p< 0,05; Tukey). Barras verticales indican ± 1 DS
por sobre y bajo la media.
En la Figura 7 se observa que nuevamente la línea 243-1 exhibe diferencias
estadísticamente significativas con las líneas 242-1, 242-2, O-5, O-7, 246-2 y
Regalona. Por otra parte la línea 242-2 presenta diferencias significativas con las
líneas 243-2, 244-1, 246-2 y O-10-1. Mientras que las líneas O-10-1, O-7, 243-1,
243-2, 244-1, 246-2 no muestran diferencias significativas entre si, esto también
sucede entre las líneas O-5, O-7, 242-1, 242-2, 243-2, 246-2 y Regalona. Como en
el caso de la altura inicial, el mayor valor entre todos los tratamientos evaluados lo
alcanza la línea 242-2 con una media de 7,63 cm, por otra parte la línea que
32
presentó el menor valor nuevamente corresponde a la línea 243-1, con una media
de 4,42 cm.
Además de los análisis anteriores se realizó un análisis con el diferencial de altura,
lo que corresponde a la diferencia entre la altura inicial (antes de la aplicación de
Onduty) y la altura final (15 días post aplicación de Onduty) de cada línea, en el
cual se determinó que existen diferencias estadísticamente significativas.
En la Figura 8 se observa que las diferencias significativas que se presentan se
deben a la gran variación existente entre las medias de la línea 243-1 y 243-2. La
línea 243-1 exhibe un diferencial promedio de 0,23 cm el que representa el menor
valor, mientras que la línea 243-2 presenta un diferencial de 0,82 cm, siendo este el
mayor valor comparado con el resto de los tratamientos, los cuales muestran una
media de diferencial de altura que varia entre 0,35 y 0,68 cm. Por otra parte,
ninguna de las líneas mostró un diferencial de altura significativo respecto al testigo
(Regalona).
1,6
Diferencial de altura(cm)
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
on
a
R
eg
al
62
24
41
24
32
24
31
24
22
24
21
-7
O
-5
O
24
O
-1
0-
1
0
Líneas
FIGURA 8 Diferencial de altura de cada tratamiento (diferencia entre la altura
inicial, antes de la aplicación de Onduty y la altura final 15 días
post aplicación). Diferentes letras sobre las barras indican
diferencias significativas (p< 0,05; Tukey) Barras verticales
indican ± 1 DS por sobre y bajo la media.
33
La altura presentada entre las diferentes líneas, en general, no es homogénea, lo
que difiere con los resultados obtenidos en el trabajo de GOMEZ et al (1999),
donde plantas de quínoa sometidas a inducción de mutaciones con un agente
mutágenos químico (azida de sodio) y un agente mutágeno físico (rayos gamma)
luego de seleccionadas las plantas de quínoa mutantes y obtenidas diferentes
generaciones, son llevadas a pruebas de campo (generación M4). En los ensayos
en campo se obtuvieron valores de altura de plantas muy similares entre todos los
tratamientos observados.
4.3.3 Fitotoxicidad. La fitotoxicidad de Onduty sobre las plantas de quínoa fue
evaluada 15 días después de su aplicación (estado de desarrollo 4 - 5), según la
escala descrita en el capitulo de materiales y métodos. Esta escala consta de 6
niveles, basados en apreciación visual del efecto del herbicida sobre las plantas
(CUADRO 4). Los síntomas presentados por las plantas son: curvatura de planta,
clorosis, marchitamiento y muerte (FIGURA 9).
FIGURA 9 Fitotoxicidad de Onduty sobre las plantas de quínoa. Síntomas: A:
curvatura de planta, B: clorosis, C: marchitamiento, D: muerte.
34
Con los datos obtenidos se realizó un Test de Chi-cuadrado. Para la elaboración de
este test se plantea como hipótesis que la presencia de plantas tolerantes a
imidazolinonas es producto del azar. Para ello se establecen dos niveles de
evaluación: planta tolerante y planta susceptible. Se define como planta tolerante
aquella que presenta un valor igual o inferior a 3 de la escala de fitotoxicidad
descrita anteriormente, y planta susceptible aquella que presente un valor superior
a 3 de la escala de fitotoxicidad. Los resultados indican que existe desviación entre
los valores observados y esperados (FIGURA 10).
Al presentar desviación entre los valores observados y esperados, se rechaza la
hipótesis planteada, es decir, que la presencia de plantas tolerantes a
imidazolinonas no es producto del azar.
55
50
Número de plantas
45
40
35
30
susceptible
25
tolerante
20
15
10
5
ga
lo
na
Re
24
62
24
41
24
32
24
31
24
22
24
21
O
-7
O
-5
O
-1
01
0
Líneas
FIGURA 10
Número de individuos susceptibles (>3) y tolerantes (<=3) al
herbicida Onduty dentro de cada tratamiento (Test Chicuadrado, 1 grado de libertad, al 5%)
La presencia de estas plantas tolerantes se puede deber a diversos factores, dentro
de los cuales se encuentran las características genéticas de las plantas.
En la Figura 10 se puede observar que los tratamientos con un mayor número de
individuos tolerantes, es decir, que presentan valores igual o inferior a 3;
corresponden a los tratamientos O-10-1, O-5, O-7, 242-2 y 246-2. Estas líneas
fueron las que presentaron, dentro de todas las repeticiones, los únicos individuos
35
completamente tolerantes a imidazolinonas (imazapic +imazapyr). Estos individuos
no presentaron ningún síntoma de fitotoxicidad (curvatura de planta, clorosis, etc.).
Estos supuestos estarían apoyados por lo que se plantea en el trabajo realizado por
JANDER et al (2003), en el cual realizaron inducción de mutaciones en plantas de
arabidopsis con EMS, probando la tolerancia a herbicidas del grupo de las
imidazolinonas (imazetapir), sulfonilureas (clorosulfuron) y glicinas (glifosato). Las
diferencias en las frecuencias de tolerancia a los distintos grupos de herbicidas,
presentadas por las plantas de arabidopsis se atribuyen a diversos factores. Estos
factores pueden ser: la variación de las mutaciones, los protocolos de aplicación de
los herbicidas y el background genético de los ecotipos utilizados o la combinación
de todos esos factores.
Para determinar si existen diferencias estadísticamente significativas para el nivel
de fitotoxicidad entre los tratamientos se presenta la Figura 11, que muestra los
resultados obtenidos después de realizar el test de Kruskal-Wallis, puesto que la
fitotoxicidad es una variable no paramétrica. Las diferencias significativas que se
observan son producto del procedimiento de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD).
7
Nivel de Fitotoxicidad
6
5
4
3
2
32
24
31
24
21
24
-5
O
41
24
62
24
al
on
a
R
eg
-7
O
22
24
O
-1
0-
1
1
Líneas
FIGURA 11 Mediana del nivel de fitotoxicidad entre las líneas. Diferentes letras
sobre las barras indican diferencias significativas (p<0,05; LSD de
Fisher). Barras verticales indican ± 1 DS por sobre y bajo la
media.
36
Se observa en la Figura 11 que existen diferencias estadísticamente significativas
entre tratamientos para la variable fitotoxicidad. Estas diferencias se deben a que
existen tres grupos que presentan diferentes niveles de fitotoxicidad, siendo los más
susceptibles los tratamientos 243-1 y 243-2. Estas líneas son las que presentaron
mayor cantidad de individuos con un nivel de fitotoxicidad mayor y ningún individuo
tolerante, es decir, fueron más susceptibles a imidazolinonas que las otras líneas.
Sin embargo, el resto de las líneas también fueron afectadas, pero en distintos
niveles. Las líneas 242-2, O-7, O-10-1 y Regalona no presentaron diferencias
significativas entre ellas, exhibiendo un mayor nivel de tolerancia.
Se destaca la línea O-10-1 por presentar mayor número de individuos tolerantes a
imidazolinonas (FIGURA 10). Esta mayor tolerancia exhibida por esta línea puede
deberse a que posee una generación más (M5) que el resto de las líneas (M4), lo
que podría hacer presumir que tiene un mayor grado de fijación del carácter de
tolerancia en comparación al resto de las líneas.
Para observar el contraste de los niveles de fitotoxicidad presentados en las
distintas líneas evaluadas, se presenta la Figura 12.
1,00
0,90
Frecuencia realtiva
0,80
0,70
0,60
O-10-1
0,50
O-5
243-1
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
1
2
3
4
5
6
Nivel de fitotoxicidad
FIGURA 12
Frecuencia relativa de los niveles de fitotoxicidad en tres
tratamientos representativos.
37
La Figura 12 representa la frecuencia de los niveles de fitotoxicidad en las líneas
más representativas, estas corresponde a las líneas O-10-1, O-5 y 243-1 (FIGURA
13).
La línea O-10-1 se presenta por ser la que exhibe el mayor número de individuos
tolerantes a imidazolinonas. La siguiente línea presenta un nivel medio de
tolerancia, es decir, un menor número de individuos tolerantes y también menos
individuos en los niveles altos de fitotoxicidad. La última línea representada en el
gráfico es la que no presentó individuos tolerantes y que además presentó los
mayores
niveles
de
fitotoxicidad, evidenciando
los
resultados
su
mayor
susceptibilidad a imidazolinonas.
FIGURA 13
Líneas representativas de tolerancia y susceptibilidad (O-10-1,
O5, 243-1) Asperjadas con una dosis equivalente a 114g ha-1 de
Onduty (imazapic + imazapyr). Las flechas indican algunas de
las plantas seleccionadas.
En la línea 243-1 podría relacionarse la susceptibilidad a imidazolinonas con la
altura que alcanzaron las plantas, puesto que ésta fue la menor con respecto a los
38
demás tratamientos, más si se toma la altura como indicador de estado de
desarrollo o vigor (FIGURA 7).
Se podría suponer que la línea 243-1 fue la más susceptible por la poca altura que
alcanzaron las plantas, pero, esto se contradice con lo que sucede con la línea O10-1. La línea O-10-1 es el segundo tratamiento que presentó la menor altura de
plantas, sin embargo, presentó la mayor cantidad de individuos tolerantes a
imidazolinonas.
Planteado este supuesto, la altura alcanzada por las plantas en los diferentes
tratamientos no tendría relación con el nivel de tolerancia o susceptibilidad que
presentan. Para determinar si existe o no una relación entre ambas variables
evaluadas, se calculó el coeficiente de correlación (FIGURA 14).
6,00
Diferencial de altura
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0
1
2
3
4
5
6
7
Fitotoxicidad
FIGURA 14 Relación entre las variables diferencial de altura vs. fitotoxicidad
(p<0,05; Test de distribución t de Student)
El coeficiente de correlación (-0,09896) obtenido indica que no existe relación entre
las variables altura de planta y fitotoxicidad. Se confirma entonces el supuesto
anteriormente planteado, el cual establece que la susceptibilidad o tolerancia de las
plantas a imidazolinonas no depende de la altura alcanzada por ellas.
39
Esto queda demostrado por los resultados que se observan las líneas 243-1 y O10-1. En ambas líneas la altura alcanzada por las plantas son las menores en
comparación con el resto de los tratamientos. Sin embargo, para la línea 243-1 el
nivel de susceptibilidad a imidazolinonas es mayor que para la línea O-10-1. La
línea O-10-1 es la que presenta el mayor nivel de tolerancia a imidazolinonas en
comparación con las demás líneas evaluadas, presentando el mayor número de
individuos que no fueron afectados por el herbicida.
FIGURA 15 Plantas tolerantes seleccionadas. A : O-5-A4-R4, B: 246-2-A1-R3,
C: 242-2-A2-R2 y 242-2-B2-R2, D:O-10-1-B1-R3 y O-10-1-B2-R3, E:
O-10-1-B4-R5.
Todos los tratamientos evaluados en el ensayo final de validación, provienen de
líneas hermanas de autofecundación en la cuarta y quinta generación, por lo tanto,
aún existe segregación dentro de las líneas. Esto hace que existan las diferencias
en el comportamiento de ellas en cuanto al nivel de tolerancia y susceptibilidad que
presentan y la altura alcanzada en cada tratamiento evaluado.
40
Al finalizar este ensayo se seleccionaron un total de siete plantas: O-5-A4-R4, 2462-A1-R3, 242-2-A2-R2, 242-2-B2-R2, O-10-1-B1-R3, O-10-1-B2-R3 y O-10-1-B4-R5
(FIGURA 15). Estas plantas son las que muestran tolerancia completa a
imidazolinonas, es decir, no fueron afectadas por el herbicida. Sin embargo, esto
aún corresponde a una etapa de selección de genotipos, en la que se busca un
genotipo homocigoto tolerante a herbicidas del grupo de las imidazolinonas. Las
semillas de estas plantas fueron cosechadas para continuar con futuros trabajos de
selección.
Existen investigaciones realizadas en otras especies, donde se ha buscado obtener
genotipos resistentes a herbicidas del grupo de las sulfonilureas, imidazolinonas y
triazolpirimidinas. Es el caso del estudio realizado por POZNIAK y HUEL (2004) en
trigo (Triticum aestivum L.), en el cual se realizó inducción de mutaciones con EMS
en semillas de trigo. En este estudio se busca generar resistencia a herbicidas del
grupo de las imidazolinonas (imazamox). Los resultados obtenidos en el estudio
genético indican que la resistencia en las líneas estudiadas se hereda como un
rasgo parcialmente dominante conferido por un solo gen codificado en el núcleo.
Con esto se demostró que la resistencia no es de herencia citoplasmática. Este
patrón de herencia concuerda con lo encontrado para el control genético de la
resistencia a herbicidas inhibidores de la AHAS (acetohidroxiacido sintasa) en otras
especies como maíz (Zea mays L.), soya (Glycine max L.), arabidopsis (Arabidopsis
thaliana L.), y tabaco (Nicotiana tabacum L.). Para todas las especies nombradas la
resistencia a herbicidas inhibidores de AHAS es parcialmente dominante y se
hereda como un solo gen nuclear (CHALEFF y RAY, 1984; NEWHOSE et al, 1991;
SATHASIVAN et al., 1991).
Para determinar si las plantas seleccionadas en el ensayo final tienen un genotipo
homocigoto para el gen que determina la tolerancia, será necesario seguir
realizando estudios genéticos para determinar cuáles son los genes en plantas de
quínoa que controlan el rasgo de tolerancia y su modo de herencia.
Las técnicas moleculares ofrecen posibilidades para la aplicación de las técnicas de
selección asistida por marcadores moleculares. Para ello es necesario buscar los
marcadores ligados a caracteres de interés, en este caso la tolerancia a
imidazolinonas, y construir los mapas genéticos como se ha hecho en otros cultivos
como la soya y el sorgo, entre otros cultivos (CREGAN et al., 1999).
41
Si las líneas seleccionadas aún no son homocigotos para el gen de tolerancia, una
alternativa es seguir realizando autofecundaciones para llegar a obtener finalmente
una variedad de quínoa tolerante a imidazolinonas.
El proceso de obtención de una variedad vegetal a través de inducción de
mutaciones, involucra muchos procesos de selección, lo que conlleva un número
significativo de años, por lo que se necesitan desarrollar técnicas que permitan
disminuir el tiempo que transcurre entre dichos procesos.
42
5 CONCLUSIONES
- De acuerdo a los resultados obtenidos en esta investigación, se puede concluir
que la inducción de mutaciones en semillas de quínoa es posible, con una
concentración del agente mutágeno EMS de 1 y 2% expuesto como máximo ocho
horas.
- Fue posible la selección de plantas M1 y M2 que presentan mayor tolerancia a
imidazolinonas, con aplicación del herbicida Onduty en estado de desarrollo entre
3-4 y 5-6.
- Las líneas exhibieron diferencias estadísticamente significativas en altura inicial,
principalmente entre las líneas 243-1 y 242-2. Para altura final las líneas que
presentaron las mayores diferencias estadísticamente significativas también fueron
las líneas 243-1 y 242-2, pero estas diferencias están influenciadas por la altura
inicial presentadas por cada línea. Por otra parte el diferencial de altura no permitió
distinguir las líneas del testigo, sin embargo las principales diferencias
estadísticamente significativas se encuentran entre las líneas 243-1 y 243-2.
- Existen diferencias significativas entre las medianas de las líneas para los distintos
niveles de fitotoxicidad, siendo las líneas más susceptibles 243-1 y 243-2, mientras
que las que exhiben mayor tolerancia corresponden a las líneas O-10-1, 242-2, O-7
y Regalona.
- Entre las variables altura de planta y nivel de fitotoxicidad, se determinó que son
variables independientes entre sí.
- Siete individuos pertenecientes a las líneas 242-2, 246-2, 0-5 y O-10-1 no
presentaron ningún síntoma de fitotoxicidad a imidazolinonas.
- Finalmente se determinó que la inducción de mutaciones en semillas de quínoa
con EMS permite obtener genotipos con mayor tolerancia a herbicidas del grupo de
las imidazolinonas (imazapic + imazapyr).
43
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