1. No category

Segundo parcial de genética del segundo cuatrimestre de 2016 (17/11/2016)
Preguntas 1, 2 y 3 = 30 ptos c/u Preg. 4 = 10 ptos
1) Mycobacterium tuberculosis es el agente causal de la tuberculosis, una enfermedad contagiosa que compromete
principalmente a los pulmones. Dada la importancia de esta enfermedad a nivel mundial, se han realizado muchos esfuerzos para encontrar los genes bacterianos responsables de la virulencia. Sin embargo, esta bacteria crece muy lentamente, necesitándose hasta 8 semanas para detectar su crecimiento en cultivo, hecho que dificulta mucho su estudio.
Por este motivo, muchas veces se utiliza una bacteria muy relacionada llamada Mycobacterium avium, cuyo crecimiento
es bastante más rápido, para realizar ensayos en el laboratorio.
Usted se propone identificar genes de virulencia en M. avium utilizando la técnica de transposon tagging. Lamentablemente, Mycobacterium no es una bacteria fácil de transformar de modo que no le queda otra opción que utilizar el método de conjugación para introducir el plásmido de interés.
Usted cuenta con una cepa de E. coli (recA-; tra+, mob+), una cepa de M. avium (recA-; strR) y los siguientes plásmidos F:
tnp
M. sp ori
IR
IR
amp
R
I
amp
R
II
tnp
tnp
IR
IR
ColE1 ori
IR
IR
amp
R
III
tnp
ColE1 ori: origen de replicación de Escherichia coli.
M sp ori: origen de replicación de Mycobacterium.
bom:R origen de transferencia del plásmido F
amp : gen de resistencia a ampicilina
tnp: gen que codifica para la transposasa.
IR: terminaciones repetidas e invertidas
R
IV
IR
IR
bom
amp
ColE1 ori
ColE1 ori
bom
bom
ColE1 ori
Dado que usted quiere que el transposón se inserte una vez en el genoma de Mycobacterium y no siga saltando, luego.
a) ¿Que plásmido utilizaría? Justifique por qué descarta los otros tres.
b) Describa brevemente cómo serían los pasos para obtener sus bacterias recombinantes, aclarando como realizaría la selección de las bacterias de interés, tanto las E. coli como la M. avium.
% sobrevida
De todas las colonias de M. avium que crecieron en su medio de selección, encuentra dos colonias que presentan un
fenotipo distintivo al resto. Dado que usted sabe que muchos de los factores de virulencia de esta especie corresponden
a genes involucrados en la síntesis/transporte de lípidos de membrana, decide evaluar si estas colonias mutantes son a
su vez menos patogénicas. Para esto inocula ratones con estas cepas mutantes y con una wt y evalúa la sobrevida de los
mismos, obteniendo el siguiente resultado (ver a la izquierda):
c) ¿Qué puede concluir a partir del gráfico acerca de las dos mutantes generadas por transposon tagging?
wt
100
d) Para obtener la secuencia del gen mutado en la bacteria mut2,
mut 1
80
usted realizó el siguiente procedimiento (subraye la opción correcmut 2
ta de las que están entre paréntesis e itálicas):
60
Realizó una genoteca a partir de (ADN genómico/mRNA) bacte40
riano que (cortó con ER/retrotranscribió). Posteriormente ligó los
20
fragmentos en un vector conteniendo el gen de resistencia a (ampicilina/kanamicina).
0
0
2
4
6
8
10
Transfectó bacterias competentes de E. coli (ampS, kanS/ ampR
Días
kanR) con la población de vectores y plaqueó en medio sólido con
(ampicilina/kanamicina).
Plaqueó en réplica, lisó las bacterias e hibridó con una sonda complementaria al gen de (la transposasa/resistencia a
ampicilina). Una vez identificados los clones positivos, volvió a su placa original, cultivó las colonias elegidas e hizo miniprep de las mismas. Finalmente secuenció los insertos utilizando primers que hibridaban con (IR/secuencias del vector
cercanas al MCS).
Una vez obtenida la secuencia, y a pesar de no poseer información acerca del genoma de M. avium, usted fue capaz de
asignarle, al gen en cuestión, la función de transportador de lípidos a la membrana.
e) ¿Cómo fue capaz de hacer esto?
Finalmente, para asegurarse de que la falta de virulencia de mut2 se debe a la mutación introducida en este transportador y no a otra mutación en el genoma, usted decide realizar un último experimento que despeje cualquier duda.
f) ¿Cuál es ese experimento?
Respuestas esperadas:
a) El II. El I no tiene origen de transferencia asiq no se va a transferir a las mycobacterias. El III tiene origen de replicación
en Mycobaterium y entonces se va a mantener el plásmido con la transposasa q puede seguir haciendo saltar al transposón. El IV tiene la transposasa dentro del transposón y por lo tanto se inserta en el genoma de Mycobacterium y puede seguir haciéndolo saltar.
b) Transformar E. coli con el plásmido II. Plaquear en ampicilina para seleccionar las bacterias transformadas. Picar colonia y hacer cultivo liquido de E.coli y de Mycobacterium) esto no sé si lo van a decir). Conjugar E. coli con M. avium. Plaquear en estreptomicina para eliminar las E.coli dadoras y en ampicilina para eliminar las Mycobacterium que no conjugaron o no se transpuso la resistencia al genoma (el plásmido se va a ir perdiendo cuando se dividan porque no tiene
origen de replicación en esta especie por lo tanto las resistentes son las bacterias en las cuales hubo transposición)
c) En ambos casos se el transposón interrumpió genes de involucrados en la virulencia ya que vemos las curvas de sobrevida de los ratones aumentan. En el caso de la mutante 1 se retrasa la muerte de los animales, mientras que la mutante 2 no los llega a matar nunca, con lo cual este gen es esencial para la virulencia de Mycobacterium.
d) Para obtener la secuencia del gen knockeado por el transposón 2 usted realizó el siguiente procedimiento (subraye la
opción correcta):
- Realizó una biblioteca a partir de (ADN genómico/mRNA) bacteriano que (cortó con ER/retrotranscribió) y ligó los
fragmentos en un vector conteniendo el gen de resistencia a (ampicilina/kanamicina).
- Transformó bacterias competentes con la población de vectores y plaqueó en medio sólido con (ampicilina/kanamicina).
- Hizo replica plating, lisó las bacterias e hibridó con una sonda complementaria al gen de (la transposasa/resistencia a
ampicilina).
- Una vez identificados los clones positivos, volvió a su placa original, creció las colonias elegidas e hizo miniprep de las
mismas. Finalmente secuenció los insertos utilizando primers que hibridaban con (IR/secuencias del vector cercanas al
MCS).
e) La idea es q con la secuencia buscaron en bases de datos homología con otros genes bacterianos y encontraron que
tenían alta similitud con genes (probablemente de otras Mycobacterium) que tenían función de transportador de lípidos.
f) Complementación con el gen wt del transportador e inoculación de ratones con las M. avium complementadas. Debería recuperarse la virulencia y observarse una curva de sobrevida de los animales similar a la wt.
2) El factor “Y” es un importante coregulador del desarrollo pancreático. Su rol más importante es en la diferenciación
de células progenitoras pancreáticas hacia células del linaje acinar. Se sabe también que la droga “VP” impide que este
coregulador transloque al núcleo celular y cumpla su función reguladora. Para estudiar la función de Y, un grupo de investigadores realizó experimentos usando como modelo una línea de células progenitoras del páncreas. Para ello cultivaron las células durante 2 días con o sin VP, a continuación extrajeron RNA y midieron la expresión de 4 genes (A, B, C y
D) importantes para el desarrollo del páncreas. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 1A.
Para estudiar la regulación de estos 4 genes, los investigadores generaron líneas celulares estables de progenitores pancreáticos que incluían construcciones conteniendo los promotores (por separado) de cada uno de estos 4 genes rio arriba de la secuencia codificante de GFP. Al someter a estas células a la droga VP durante 2 días y medir los niveles de
mRNA de GFP se observaron los resultados de la Figura 1B.
a) ¿Cuál es el efecto de VP sobre la
expresión de los genes A, B, C y D
que se muestra en la Figura 1A?
b) En vista de los resultados de las
Figuras 1A y 1B, ¿qué tipo de regulación tienen los genes A, B, C y D?
c) ¿Mediante cuál de los siguientes
mecanismos podría estar siendo
regulado el gen A?
i.
ii.
iii.
iv.
v.
vi.
B, C o D son proteínas de unión al DNA que inhiben la transcripción de A
B, C o D son proteínas que interaccionan con el factor “Y” y este complejo aumenta la transcripción de A
B, C o D son proteínas de unión al RNA que aumentan la traducción de A
B, C o D codifican para miRNA que reconocen el mensajero de A y lo manda a degradación
B, C o D codifican para miRNA que reconocen el mensajero de VP y lo manda a degradación
B, C o D codifican para miRNA que reconocen el mensajero de “Y”, lo manda a degradación y por lo tanto disminuye la cantidad de proteína “Y” inhibidora de la transcripción de A
d) En función de las respuestas anteriores, ¿diría que Y (inhibido por VP) es un regulador positivo o negativo de la expresión génica? Suponga que Y ejerce efectos directos únicamente a nivel transcripcional.
Posteriormente se descubrió que Y también es un oncogén que actúa en el páncreas adulto. Se halló que un polimorfismo en la región codificante de este gen da lugar a una variante de Y que tiene localización constitutivamente nuclear, lo
cual ocasiona la aparición de cáncer de páncreas. Esta variante presenta un único sitio de corte para la enzima XhoI,
mientras que la variante sin polimorfismo no es cortada por XhoI.
Los investigadores sospecharon que Y podría sufrir imprinting, y según la variante imprinteada se tendría mayor predisposición a desarrollar tumores pancreáticos. Para ello diseñaron oligonucleótidos específicos para amplificar una región
de 150bp que incluye el sitio con el polimorfismo, de manera tal que la región de Y amplificada es cortada por XhoI en
dos fragmentos de 100 y 50bp en caso de poseer el polimorfismo, y no es cortada si no está presente la mutacion.
e) Con estos datos, ¿qué experimento propondría a los investigadores para probar que Y sufre imprinting? Suponga que
cuenta tanto con ratones homocigotas y heterocigotas para el polimorfismo en Y.
Respuestas:
a- ¿Cuál es el efecto de VP sobre la expresión de los genes A, B, C y D?
El tratamiento con VP aumenta la expresión de A y reduce la expresión de B, C y D.
b- En vista de los resultados de las Figuras 1A y 1B, ¿qué tipo de regulación tienen los genes A, B, C y D?
Genes B,C y D tienen regulación a nivel transcripcional, dado que al tratar con VP a las células los promotores de estos
genes inducen menor expresión de GFP, el gen reportero.
Asumiendo que la región promotora representa el total de las regiones regulatorias para A, podríamos decir que la regulación gen A es posttranscripcional.
c- Proponga UN (1) mecanismo por el cual podría estar siendo regulado el gen A (la pregunta fue reemplazada por un
choice)
Similar a lo visto en el problema 2 de la guia de epigenetica, podrían mencionar que VP reprime la expresión de un microRNA (no mostrado en estos gráficos, o podrían mencionar que B, C o D codifican para dicho miRNA), que reconoce el
mRNA de A. De esta forma, ausencia de VP este miRNA se expresa a niveles altos (podrian proponer que esta regulado
positivamente por Y) y degrada a A, manteniendo niveles mas bajos que los que se ven con el tratamiento con VP. Podrían dar detalles del mecanismo de degradación por microRNAs, siempre que sea breve.
Otra opción considerable seria que B, C o D sean proteínas de unión al RNA (al estilo de lo que se vio con BCD y NOS en
los problemas de Drosophila de la guía de desarrollo) y al bajar su expresión, disminuye la unión de estos factores al
mensajero de A y por tanto la degradación del mismo.
d- En función de las respuestas anteriores, diría que Y (inhibido por VP) es un regulador positivo o negativo de la expresión génica? Suponga que Y ejerce efectos directos únicamente a nivel transcripcional.
En función de las figuras 1a y 1b, concluimos que Y es un regulador positivo de la transcripción, ya que al ser inhibido
por VP la expresión de sus genes diana (B, C y D) disminuye. En otras palabras, Y induce la expresion de B, C y D en ausencia de VP.
e- Con estos datos, ¿que experimento propondría a los investigadores para probar que Y sufre imprinting? Suponga
que cuenta tanto con ratones homocigotas y heterocigotas para el polimorfismo en Y.
Para esta parte se espera que apliquen un razonamiento igual a lo que vimos en los problemas 1 y 3 de la guía de epigenética.
Para estudiar el imprinting en la F1, debo elegir dos progenitores que sean homocigotas para la presencia o ausencia de
polimorfismo. Suponiendo que Y’ es Y SIN el polimorfismo, e Y’’ CON el polimorfismo, haríamos una cruza de machos Y’
x hembras Y’’.
Para ver los genotipos de los progenitores, los pasos serian los siguientes:
- extraer ADN de cualquier tipo celular (ej. Linfocitos).
- Hacer PCR con los primers específicos (amplifico fragmento de 150bp).
- Digerir con XhoI
- Correr el resultado en un gel de agarosa con BrET.
Tendré un fragmento de 150bp si no corta, es decir homocigota para Y’, o dos fragmentos, uno de 100 y otro de 50bp, si
corta, es decir si es homocigota para Y’’. Si tengo 3 fragmentos es heterocigota.
Para ver si Y sufre imprinting, tengo que ver qué variante de
Y se expresa en la descendencia (heterocigota) y relacionarla con el progenitor que aportó ese alelo. Los pasos serian:
- extraer RNA de páncreas de los ratones de la descendencia.
- Hacer una la retro transcripción (RT) para generar copias
de cDNA de todos los genes que se expresan en estas células, incluyendo la versión de Y que no esta imprinteada.
- Hacer PCR con los primers específicos (amplifico fragmento de 150bp).
- Digerir con XhoI
- Correr el resultado en un gel de agarosa con BrET.
Si en el gel veo un único fragmento de 150bp (es decir se expresa la variante Y’ que en este ejemplo viene del padre), el
imprinting es materno.
Si en el gel veo dos fragmentos, uno de 100 y otro de 50bp (es decir se expresa la variante Y’’ que en este ejemplo viene
de la madre), el imprinting es paterno.
Si tengo 3 fragmentos no hay imprinting.
Para asegurarme que el mecanismo es efectivamente imprinting, debería repetir los experimentos realizando el cruzamiento con ratones homocigotas de genotipos opuestos para los padres. La variante que expresa la descendencia debería seguir siendo la que proviene del mismo progenitor identificado antes, independientemente de que variante aporte.
Se espera que muestren dos gráficos con la siguiente información:
3) La caracterización de promotores de especies de interés agronómico es clave para la modificación genética de estos
cultivos. A partir de una genoteca de plantas de tomate se aisló un putativo promotor de 1450 pb, que por identidad de
secuencia con otras especies de solanáceas, se denominó promotor RIP1 (por Ripening induced protein 1). Con el objetivo de caracterizar la funcionalidad de este posible promotor se obtuvieron plantas transgénicas de tomate mediante
transformación con Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101.
a) Esquematice DETALLADAMENTE el vector de transformación que utilizaron los autores para obtener las plantas
transgénicas de tomate con el objetivo de probar la funcionalidad del putativo promotor. Enumere todos los elementos
que esquematizó en el vector y aclare BREVEMENTE qué es cada uno.
Una vez seleccionadas las plantas transgénicas de tomate y confirmada la presencia del transgén, se analizó la expresión
del mismo en distintos tejidos de tomate (ver Figura 1)
Figura 1. Los controles 1, 2 y 3 se comportaron como se muestra en la parte (b) de la figura para las raíces, hojas, flores, frutos vera)
10
[Y]
b)
10
8
8
6
6
4
4
2
[Y]
2
0
Raices
Hojas
Flores
0
Frutos verdes Frutos rojos
Control1
Control 2
Control 3
des y rojos
b) i. ¿Cómo fueron seleccionadas las plantas transgénicas de tomate?
ii. ¿Qué técnica se utilizó para confirmar la presencia del transgén y qué transgén se detectó?
iii. ¿Qué midieron los investigadores en el eje Y?
iv. Explique qué se puede deducir del putativo promotor RIP1 según los resultados de la figura1. ¿Para qué sería útil
RIP1?
v. ¿Qué son los controles 1, 2 y 3 que usaron en el experimento de la figura 1b y para qué?
Con el objetivo de continuar con la caracterización del promotor RIP1 se realizaron las construcciones detalladas en la
Fig 2 (solo se muestra el cassette de interés, no el vector completo) y las construcciones se analizaron por agroinfiltración en hojas de tomate. Luego de que ninguna de las construcciones resultaran funcionales, los autores decidieron
obtener plantas transgénicas de tomate con las construcciones de la Fig 2. Luego de confirmar la presencia del transgén,
se analizó la expresión del mismo (figura 3).
Figura 2:
[Y]
Figura 3
Construcción I
Construcción II
Construcción III
RIP1 (1450 pb)
Gen A
tNOS
Gen A
tNOS
10
8
RIP1
6
4
RIP1
Gen A
tNOS
2
0
Construcción I
Construcción II
c) i. ¿Para qué realizaron las construcciones de la figura 2? ¿Cuál es el gen A de las construcciones?
ii. ¿Por qué no funcionó el experimento de agroinfiltración en tomate?
iii. En la figura 3, ¿qué midieron los investigadores en el eje Y? y ¿en dónde?
iv. ¿Qué conclusiones obtuvieron los autores del experimento de la figura 3?
Respuestas:
a) tienen que armar un vector binario con:
Construcción III
RB
LB
pRIP1
Ori A
gen
repor
por-
tNos
pNos
Kanamicina
Bar/
NPTII
tUbi
Ori E
kanamicina
LB y RB: borde derecho e izquierdo para la
transferencia del T-DNA a la célula vegetal
Promotor RIP1, gen reportero (GUS o GFP) y terminador: el promotor de interés para estudiar si es efectivamente un
promotor funcional, el gen reportero para evidenciar que el promotor es funcional y un terminador para terminar la
transcripción del gen reportero.
Un gen de selección, Bar o NPTII, para selección de las transgénicas en el proceso de transgénesis, bajo un promotor y
un terminador para su transcripción.
Gen de selección en bacterias: antibiótico bacteriano, ej Kanamicina, Ampicilina
ORI E y A: origen de replicación bacteriano, ORI E para E. coli y ORI A, para Agrobacterium. Si ponen solo ORI bacteriano
lo consideraría bien y les bajaria 0,1.
b) i-Fueron seleccionadas por el marcador de selección que se colocó en la construcción, ej NPTII o BAR. Es decir las
plantas que crecieron en un medio con el marcador de selección eran transgénicas, al menos para el marcador.
ii- Pueden responder, Southern blot o PCR de ADN de tomate transgénico. Tienen que poner que detectan el promotor
RIP1 o el gen reportero, cualquiera de los dos está bien, si ponen los dos mejor para estar seguros que lo que me interesa se insertó completo. Si ponen solamente que detectan el marcador de selección (NPTII/BAR) está mal, porque no
están seguros que su planta es transgénica para el promotor RIP1.
iii-Cuantificaron la expresión del gen reportero que hayan seleccionado (Gus o GFP) a partir del promotor RIP1. Si pusieron GFP, cuantificaron fluorescencia, si pusieron GUS, cantidad de azul a partir del sustrato.
iv- Que RIP1 es efectivamente un promotor, y que es tejido específico porque se ve que es funcional solamente en fruto
de tomate (se ve el reportero). Su mayor actividad se observa en fruto maduro.
Sería útil para expresar genes únicamente en el fruto, con máxima expresión en fruto maduro.
v. Controles: 1- Reportero solo sin promotor para ver que no da actividad per se. 2- Promotor sin gen reportero o fruto
de tomate no transgénico, para ver que no hay actividad endógena del reportero 3-Reportero bajo un promotor constitutivo, como 35S, para ver que el sistema reportero funciona.
c)
i.
ii.
iii.
iv.
Para estudiar las regiones necesarias para la funcionalidad del promotor RIP1. El gen A es un reportero (GUS o
GFP)
Porque se realizó en hojas de tomate y el promotor solo es funcional en fruto.
Cuantificaron la expresión del gen reportero que hayan seleccionado (Gus o GFP) a partir del promotor RIP1. Si
pusieron GFP, cuantificaron fluorescencia, si pusieron GUS, cantidad de azul a partir del sustrato. En frutos de
tomate maduros
El promotor completo es esencial para su funcionalidad.
4) Sobre la regulación génica y la genética del desarrollo, indique cuáles de las siguientes afirmaciones son falsas (F) o
verdaderas (V). Corrija y explique las falsas.
a) los factores de transcripción que se unen a los enhancers son siempre activadores de transcripción.
b) un morfógeno es una molécula que induce diferentes destinos celulares de acuerdo a su concentración.
c) por lo general, la acetilación de histonas está asociada a la represión de la expresión génica.
d) regiones genómicas ricas en dinucleótidos CpG son conocidas como islas CpG.
e) en mamíferos, la complementariedad de bases entre el microRNA y su mRNA blanco tiene que ser perfecta para que
pueda ejercer un efecto represor.
Respuestas:
a) F
b) V
c) F
d) V
e) F