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MAPEO DE QTL´s ASOCIADOS A COMPONENTES DE RESISTENCIA A FUSARIUM EN
MAÍZ
Giomi G.M.; Presello D.A.; Rodriguez M.A.; Fauguel C.; Fernandez M.
INTA EEA Pergamino, Ruta 32 Km 12,5. Bs.As. [email protected]
ABSTRACT
Several species of Fusarium cause ear rots and grain contamination with mycotoxins in maize (Zea
mays L.). There are different sources of resistance to these diseases, being the thickness of pericarp,
and phenolic acid concentration significant components of resistance. The objective of this study was
to determine relationships between QTLs mapped for symptom severity and disease resistance
components. In a previous work, 256 polymorphic SNPs were mapped for a population of 298 F4:F5
lines derived from L4637 (resistant) and L4674 (susceptible). Both parental lines differ in physical
(thickness) and biochemical (t-Ferulic acid concentration) traits of the pericarp. We used a selective
phenotyping following Jannink (2005) to choose a group of 120 lines. Based on this group, we
constructed a genetic map that included 231 polymorphic SNPs covering of 1158cM of the genome. For
statistical analysis a joint multivariate model (Malosettiet. al. 2008) was performed using the statistical
program SAS. The search of QTLs associated with disease resistance and its components was
conducted with program winQTLcart v2.5. We observed several combined QTL´s having effects in
more than one trait, being the most important one of chromosome 2 (32, 1cM). The results indicate
that this region is carrying genes that affect disease resistance and both components. We are
developing the progenies to make fine mapping and determine if the traits depend on independent
QTLs or a QTL having effect on the thickness of pericarp, in t-Ferulic acid concentration and
determining resistance in grain.
Key words: Fusarium, ear rot, resistance components, selective phenotyping, Quantitative Trait Loci
Palabras clave: Fusarium, podredumbre de espiga, componentes de resistencia, fenotipado selectivo,
Loci de Carácter Cuantitativo (QTL)
INTRODUCCION
Existen varias especies de hongos pertenecientes a los géneros Fusarium,Diplodia,
Aspergillus y Penicillium que afectan al maíz (Zea mays L.) produciendo enfermedades
conocidas como podredumbres de espiga.Se identificaron fuentes de resistencia a la invasión
de F. verticillioides y la subsecuente acumulación de fumonisinas en el germoplasma local
(Iglesias et. al., 2007). La expresión de esta resistencia es estable en una amplia diversidad
de ambientes (Presello et. al., 2006) depende de varios genes, siendo un carácter con
distribución del tipo cuantitativa (Chunguet al, 1996) y presenta una herencia compleja. Una
posible forma de facilitar el desarrollo de híbridos resistentes, es la redefinición de la
resistencia a la enfermedad en los componentes que la constituyen.Nuestro grupo de
trabajo, obtuvo una población de mapeo conformada por 298 RILs F5 derivadas de la
generación F2 de una cruza entre una línea resistente (L4637) y otra susceptible (L4674) a
Fusarium spp, la que será usada para llevar a cabo la presente investigación. Estudios
previos que involucran a estas líneas parentales, sugieren que el espesor de pericarpio y un
alto contenido de ácidos fenólicos participan en la resistencia al ataque de F. verticillioides
en grano (Fauguel, avance de Tesis: Sampietroet. al., 2010).La complejidad en la
cuantificación de estos caracteres dificulta la fenotipificación de ellos en toda la población de
mapeo. Utilizamos técnicas de fenotipado selectivo (selectivephenotyping) para realizar la
selección de un subgrupo de líneas minimizando la pérdida de información y sensibilidad del
mapeo (Jannink, 2005).
Como objetivo de trabajo nos propusimos realizar la identificación de los QTLs
asociados a la resistencia y a sus componentes (espesor de pericarpio y contenido de ácidos
fenólicos), yanalizar la asociación entre ellos, información útil para el desarrollo de
germoplasma resistente mediante selección asistida por marcadores moleculares.
MATERIALES Y METODOS
Desarrollo de la Población. Las líneas L4674, parental susceptible de la población de
mapeo, fue derivada del compuesto R4993 y L4637, parental resistente, fue derivada del
híbrido LP561×LP611, ambas provenientes de germoplasma flint argentinoy evaluadas con
anterioridad en múltiples años y localidades (Presello et al, 2006). A partir de la línea F2
derivada de los parentales mencionados se generaron 298 RILs hasta la generación F4:F5.
Las líneas F4 fueron utilizadas para la genotipificación y las líneas F5 para obtener los datos
fenotípicos.
Se definió arbitrariamente un tamaño muestral de 120 líneas para realizar el
fenotipado selectivo y el mapeo de QTLs. En la elección de las 120 líneas se utilizó el método
desarrollado por Jannink (2005) denominado uniRec, el cual selecciona el grupo de líneas
que presentan la mayor cantidad de recombinaciones distribuidas uniformemente en todo el
genoma.
Evaluación a campo.El grupo de 120 líneas y ambos parentales fueron evaluados en
las campañas 2010/11 y 2011/12 en la Estación Experimental INTA Pergamino. Se utilizó un
diseño de bloques completos aleatorizados dedos repeticiones,con parcelas de dos surcos de
5 metros cada uno, separados 90cm entre sí y a una densidad de 5 plantas por metro. En un
surco se realizaron 8 polinizaciones fraternales de espigas a fin de obtener las muestras para
el análisis de los caracteres espesor de pericarpio y concentración de compuestos fenólicos
en el pericarpio. El otro surco fué inoculado mediante la inyección de 2 ml de suspensión
conidial a una concentración de 1×106 esporas por ml de F. verticillioidesP364, aislamiento
agresivo y toxicogénico obtenido de maíz en Pergamino(Iglesias et al 2007). Las líneas
seleccionadas y ambos parentales se evaluaron por severidad de síntomas visibles de
acuerdo a la escala propuesta por Reid and Hamilton (1996), donde: 1 = sin síntomas; 2 =
1- 3%; 3 = 4-10%; 4 = 11-25%; 5 = 26-50%; 6 = 51-75%; y, 7 = 76-100% del área de la
espiga visiblemente afectada por podredumbre de espiga.
Análisis de laboratorio. Para medir el espesor del pericarpio se adaptó la
metodología de Wolf et al. (1969). Brevemente, se embebieron los granos por 24hs y luego
se realizaron cortes ultrafinos con un escalpelo en la corona del grano, los cuales son
medidos en la porción opuesta al embrión utilizando microscopio óptico en 100X con un
micrómetro ocular.
La extracción de los compuestos fenólicos se realizó utilizando la técnica desarrollada
por Bilyet al, 2003. En el análisis, cada muestra se filtró(miniSarts, 0,22µm) y se inyectó en
HPLC Waters® 2695 Alliance acoplado a detector de arreglo de diodos, utilizándose columna
GraceSmart C18 (25 mm x 4.7 mm, 5 µm), flujo 1 ml/min y detección a 280 nm. La fase
móvil consistió en agua (solvente A) y acetonitrilo (solvente B) acidificados con 2% ácido
fórmico: 0% B (0,38 min), incremento a 20% B (14,62 min), incremento a 75% B (15 min),
y 75% B (5 min). Los ácidos fenólicos se identificaron por comparación con la inyección de
estándares y espectros UV-Vis.
Análisis estadístico.El análisis de los datos fenotípicos de cada carácter se basó en
un modelo lineal mixto considerando a los efectos de ambiente como fijos y a los efectos de
genotipo y de repetición (bloque) dentro de ambiente como aleatorios. Para este análisis
univariado se utilizó el procedimiento MIXED del programa estadístico SAS(SAS Institute,
1999).Los componentes de variancia se estimaron mediante el método de Máxima
Verosimilitud Restringida (REML) (Patterson, 1997).La heredabilidad en sentido amplio para
cada variable, fueron calculadas según Hallauer and Miranda(1988).
Las correlaciones genotípicas entre los caracteres fueron estimadas mediante el
análisis multivariado (multicarácter) de modelo mixto basado en REML implementado según
Hollandet.al.(2006) utilizando el procedimiento MIXED del programa estadístico SAS. Con el
mismo programa y procedimiento estadístico realizamos el análisis de los datos fenotípicos a
ser utilizados para la detección de QTL, siguiendo las pautas de Malossetiet al (2008), un
modelo mixto (basado en REML)multi-carácter multi-ambiente.
Datos genotípicos y construcción del mapa genético.El juego de datos
genotípicos para toda la población de mapeo fue de 256 marcadores SNP´s polimórficos.El
orden de los marcadores y las frecuencias de recombinación fueron estimados con el
software MapDisto 1.7.5 (Lorieuxet al, 2007)y se realizó el test χ2 para analizar las posibles
segregaciones distorsionadas de los marcadores. Las frecuencias de recombinación fueron
transformadas a centimorgan (cM) con la función Kosambi.
Detección de QTLs combinados. Las medias fenotípicas (BLUPs) calculadas fueron
usadas para el mapeo de QTLs, usando un modelo mixturado (Jiang and Zeng, 1995),
decisión basada en que los modelos mixturados tienen mejor precisión que los mixtos
cuando se quieren localizar QTLs en mapas no saturados. En el mapeo multicarácterpor
intervalo compuesto (MT-CIM) se utilizó el análisis de regresión “stepwise” Modelo 6 del
WinQTLCartographer V2.5 (Wang et al., 2011). Se estableció un umbral de 0.05 para
seleccionar los QTLs putativos que fueron usados como cofactores. Se utilizó un tamaño de
ventana de 10cM. El umbral para declarar significativo, un QTL combinado,fue LOD=6, con
intervalos de escaneo de 2cM entre marcadores y un QTL putativo. Las posiciones de los
QTLs fueron asignadas en las regiones relevantes al punto máximo del LOD.
RESULTADOS Y DISCUSION
Resultados fenotípicos. El parental L4637 presentó en ambas campañas menor severidad
de síntoma, mayor espesor de pericarpio y mayor concentración de ácido t-Ferúlico que el
parental L4674 (p<0,05). En los tres caracteres las RILs presentaron efectos significativos de
genotipo, de ambiente y de interacción genotipo ambiente (p<0,001).(no se muestran datos)
Correlación. Se encontró una correlación genética baja pero significativa con el carácter
severidad de síntoma (-0,32; SERG = 0,090).El espesor de pericarpio tuvo una baja pero
significativa correlación genética con la variable severidad de síntoma de signo negativo (0,31; SERG = 0,091).
Estimación de la heredabilidad.Los tres caracteres presentaron una alta heredabilidad,
con valores de 0,92, 0,93 y 0,89 para severidad de síntoma, espesor de pericarpio y
concentración de ácido t-ferúlico, respectivamente.
Análisis QTLs combinados. Localizamos varios QTLs combinados, y consideramos de
mayor interés uno ubicado en el cromosoma 2 (QTLc2) por tener efectos significativos en
todos los caracteres analizados, y un LOD(c2)=12,5. Los efectos aditivos y dominantes
estimados para el QTLc2 se muestran en la Tabla 1.Para el carácter severidad de síntoma, los
valores negativos de los efectos aditivos indican que el efecto de sustitución de un alelo S
del parental L4674 (susceptible) por un alelo R del parental L4637 (resistente), reduce la
severidad de la infección por Fusarium verticillioides, por esto inferimos que la resistencia
del QTLc2 procede del parental resistente. Al comparar la magnitud de los valores de
aditividad y dominancia obtenidos para este carácter, observamos que los valores aditivos
son superiores, en valor absoluto, a los de dominancia, por lo que al calcular los
Severidad
carácter
campaña 2010/2011 2011/2012
efecto Ad Dom Ad Dom
valor -0,44 0,08 -0,41 0,14
Espesor de Pericarpio
2010/2011
2011/2012
cc ác. t-Ferúlico
2010/2011
2011/2012
Ad
Dom
Ad
Dom
Ad
Dom
Ad
Dom
0,56
-0,13
0,41
-0,10
0,30
0,19
0,24
0,38
%R2
17,60
20,70
24,80
13,60
15,90
9,80
Tabla 1. Se muestran los efectos estimados de aditividad y dominancia, y la proporción de variancia
fenotípica explicada (%), para el QTL combinado de los tres caracteres evaluados en ambas
campañas, localizado en el Cromosoma 2 de maíz, en la posición 32,1 cM de nuestro mapa genético.
efectos genéticos (según Stuberet. al., 1987),se encontraron efectos de aditividad y
dominancia parcial en la primer y segunda campaña, respectivamente (Tabla 1).
Estocoincide con lo hallado por otros autores en estudios de QTL de resistencia a plagas y
enfermedades en maíz (Pérez-Brito et. al., 2001).
CONCLUSIONES
Los resultados indican que esta región del cromosoma 2, es portadora de genes que
inciden tanto en la resistencia como en los componentes analizados. Por ejemplo,el
marcador asociado a este QTL combinado, SNP2_4, está estrechamente ligado al marcador
público bnlg1064 (BIN 2.03) sitio en el que se localiza además, el gen PAL2 (Fenilanalina
Amonio Liasa 2) en el mapa de referencia de la línea B73, disponible en Maize Gene Data
Base. La PALjuega un rol principal en la formaciónde muchos compuestos fenólicos y está
involucrada en la producción de metabolitos secundarios como mecanismo de resistencia
inducida.
Se están desarrollando las progenies a fin de realizar mapeo fino y determinar si se
trata de QTLs independientes o de un QTL que tiene efecto en el espesor de pericarpio, en la
concentración de ácido t-Ferúlico y que determina resistencia en grano.
La identificación y ponderación del efecto de estos componentes podría facilitar la
formación de poblaciones segregantes mediante la recombinación de fuentes de resistencia,
cuya resistencia está asociada a mecanismos diferentes y por otro lado, acelerar las
respuestas a la selección mediante un mejor entendimiento de la naturaleza de la variación
observable.
Fuentes de financiamiento
* INTA, Proyecto 52-021321 Desarrollo de germoplasma de maíz resistente a estrés biótico y abiótico (Inicio 2009,
finalización y reformulación 2011) comprendido en el Proyecto Integrado PNCER 1 (inicio 2006 finalización 2014)
* Beca CONICET tipo II, convocatoria 2012
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