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Métodos experimentales para la localización
de secuencias promotoras
Búsqueda de proteínas que se unen a DNA (secuencia
conocida, promotor)
• Ensayo southwestern
encontrar proteínas ligantes de DNA que reconozcan en éste una
determinada secuencia de nucleótidos
• Ensayo northwestern
encontrar proteínas ligantes de RNA que reconozcan en éste una
determinada secuencia de nucleótidos
• Ensayo de retardo en gel
EMSA (electrophoretic mobility shift assay, ensayo de cambio de
la movilidad electroforética).
• Huella con DNasa
(DNA footprinting)
Web 12.5: Técnicas para analizar la interacción de ácidos nucleicos
con proteínas
Ensayos southwestern y northwestern
• Electroforesis de las proteínas, desnaturalizadas con
SDS, en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
• Transferencia a nitrocelulosa o material similar.
• Opcionalmente, bloqueo de la membrana con una
proteína inerte, para reducir la adsorción de la sonda
(ruido de fondo).
• + Sonda de dsDNA o RNA, con la secuencia que se
quiere ensayar. Para conseguir una mayor afinidad,
puede prepararse un concatémero, es decir, una sonda
donde la secuencia diana se repite varias veces
consecutivas.
• Incubación en condiciones de asociación (pH y fuerza
iónica fisiológicos), lavado para retirar el exceso de
sonda
• Detección de la señal del marcaje de la sonda.
1
Ensayo de retardo en gel (EMSA)
electrophoretic mobility shift assay, band shift
retardo de la movilidad electroforética
núcleos
extracto proteico
oligonucleótido marcado,
incluye la secuencia diana
(promotor)
fraccionamiento
cromatográfico
mezcla con el extracto
proteico o sus fracciones
fracción 0
(no se une
a la matriz)
elución con
gradiente salino
fracciones
1,2...22
electroforesis
detección
Ensayo de retardo en gel (EMSA)
DNA unido
DNA libre
+ = con extracto proteico completo
1-22 = fracciones cromatográficas del extracto
Yoshinaga et al. (1989) JBC 264: 10726
2
otro ejemplo de ensayo de retardo en gel
• También para encontrar el DNA diana de una proteína:
proteína purificada
muestras de DNA
(mezcla de fragmentos)
muestra de DNA: A B C A B C
+ proteína: no no no sí sí sí
mezcla con la proteína
1
2
3
4
5
6
electroforesis
tinción del DNA
migración
Análisis de resultados:
Muestra A: un tipo de DNA, que
une la proteína estudiada.
Muestra B: un tipo de DNA que
no une la proteína.
Muestra C: varias moléculas de
DNA distintas; la 2ª menor
contiene la secuencia diana.
Huella con DNasa (footprinting)
núcleos
fragmento de DNA
extracto proteico
marcaje en un extremo (5’)
fraccionamiento
cromatográfico
mezcla con el extracto
proteico o sus fracciones
fracción 0
(no se une
a la matriz)
elución con
gradiente salino
fracciones
1,2...22
digestión limitada
con DNasa
desnaturalización
electroforesis
detección
DNasa I :
endonucleasa, corta ssDNA o dsDNA
corta sin especificidad pero preferentemente junto a un pirimidínico
3’-OH + 5’-P
3
Huella con DNasa (footprinting)
pb
242
217
201
190
180
160
147
122
110
90
76
67
M = marcadores (patrones de tamaño, escalera)
− = sin extracto proteico
+ = con extracto proteico completo
fracciones cromatográficas; 0 = no retenida; 1-22 = elución con gradiente salino
Yoshinaga et al. (1989) JBC 264: 10726
otro ejemplo de huella con DNasa
muestra de DNA: A B A B
+ proteínas: no no sí sí
patrones
de tamaño
1
2
3
4
P
pb
160
migración
140
120
100
80
60
40
150
130
110
90
70
50
30
Interpretación de resultados...
4
Búsqueda de secuencias que ligan proteínas
• Análisis de deleción en 5’
para encontrar la posición de los promotores
o, en general, secuencias donde se une la
proteína
ubica el límite 5’ (comienzo) del promotor
• Rastreo con mutaciones
linker scanning mutations
para encontrar la posición de los promotores
o, en general, secuencias donde se une la
proteína
ubica la región de DNA con actividad
promotora
Análisis de deleción en 5’
técnicas de DNA
recombinante
gen indicador
1
2
Análisis de resultados:
vector
3
4
5
serie de deleciones en 5’
ligamiento con el vector
clonación
1
2
3
4
5
mutantes con deleción 5’
transfección y clonación de cada uno por separado
plásmido
recombinante
enzima
indicadora
nº
expresión del
indicador
1
2
3
4
5
+++
+++
+
+
-
Hay dos elementos de
control (regiones
promotoras, regiones
donde se une la
proteína):
uno entre las
deleciones 2 y 3, otro
entre la 4 y la 5
?
mRNA indicador
5
Rastreo con mutaciones
...
...
vector
gen indicador
preparación de DNA recombinante
...
...
Análisis de resultados:
región promotora a ensayar
introducción de
mutaciones
nº
1
2
3
4
5
6
7
8
...
...
...
...
...
...
...
...
...
(antes o después de
formar el recombinante)
región mutada
...
...
...
...
...
...
...
...
expresión ¿afecta la
del indicador mutación?
+++
no
+
sí
+
sí
+++
no
+
sí
+++
no
−
sí
+++
no
nº
expresión del
indicador
1
2
3
4
5
6
7
8
+++
+
+
+++
+
+++
−
+++
Hay elementos de
control (regiones
promotoras, regiones
donde se une la
proteína) en la región
común a 2 y 3, en la
región 5 y en la 7
?
... interpretación:
regiones promotoras
6