1. Ciencia

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INTRACELULAR Y EXTRACELULAR DE ENZIMAS
LIPOLÍTICAS PRODUCIDAS POR LA CEPA Serratia USBA-GBX-513
LAURA DANIELA POVEDA GOMEZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar el título de
MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C.
Noviembre 26 de 2010
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace
responsable por los conceptos
emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo
velará porque no se publique
nada contrario al dogma y a la
moral católica y porque la tesis
no
contenga
ataques
personales contra persona
alguna, antes bien se ve en
ellas el anhelo de buscar la
verdad y la justicia”
Art 23 de la resolución 13 de
Julio de 1946
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INTRACELULAR Y EXTRACELULAR DE ENZIMAS
LIPOLÍTICAS PRODUCIDAS POR LA CEPA Serratia USBA-GBX-513
LAURA DANIELA POVEDA GOMEZ
APROBADO
SANDRA BAENA Ph. D
Bióloga
Directora
BALKIS QUEVEDO M. Sc Ph. D
Ing. Química
Jurado
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INTRACELULAR Y EXTRACELULAR DE ENZIMAS
LIPOLÍTICAS PRODUCIDAS POR LA CEPA Serratia USBA-GBX-513
LAURA DANIELA POVEDA GOMEZ
APROBADO
INGRID SHULER Ph. D
Bióloga
Decana Académica
JANETH ARIAS PALACIOS M. Sc
Bacterióloga
Directora de carrera
AGRADECIMIENTOS
A la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) de la Pontificia Universidad
Javeriana que permitió el desarrollo de este proyecto.
A la Doctora Sandra Baena por su apoyo, confianza, dedicación y conocimientos aportados para el
desarrollo de este trabajo.
A Gina López por su asesoría, confianza y conocimientos brindados.
A Carolina Rubiano por su paciencia, dedicación, compromiso y por hacerme más agradables los
días en el laboratorio.
A la profesora Luciana Díaz por su asesoría, paciencia y conocimientos aportados que me
permitieron complementar este trabajo.
A mis compañeros de USBA Angela Mantilla, Estefania Sánchez, Javier Gómez, Karina Blanco, Erika
García y Helena Ávila por su apoyo y colaboración.
A mis padres y familiares quienes siempre me brindan su cariño y apoyo incondicional.
RESUMEN
La cepa Serratia USBA-GBX-513 es una cepa aerobia que se aisló en estudios previos, del Parque
Nacional los Nevados. De acuerdo a la caracterización realizada, presentó un 99% de similitud con
la especie Serratia proteamaculans y un máximo de actividad lipolítica a la hora 16 de crecimiento.
Esta cepa se seleccionó con el fin de determinar su actividad lipolítica extracelular e intracelular.
Las condiciones óptimas de cultivo fueron una temperatura de 30oC, un tiempo de incubación de
16 horas y una agitación de 200 r.p.m.; se empleó como medio de cultivo, un medio de sales (M9)
y como sustrato lipídico aceite de oliva al 1%. Se evaluaron cuatro métodos de lisis celular: físico,
químico, enzimático y combinado. La actividad lipolítica se cuantificó por medio de una técnica
colorimétrica usando derivados del p-nitrofenol ésteres, en este caso se empleó el p-NP butirato,
con una absorbancia de 410nm. Adicionalmente, se realizó un ensayo para determinar la
ubicación de las enzimas lipolíticas de la cepa evaluada en la fracción intraceluar, para ello se
realizó el método combinado y se cuantificó la actividad lipolítica en el pellet y en el sobrenadante
una vez centrifugadas las muestras. La cepa Serratia USBA-GBX-513 presentó un rango de
actividad lipolítica de 3,33 a 4,08 UL en la fracción extracelular, con un coeficiente de variación de
10,05%, siendo similares estos resultados a los reportados en estudios previos. El método de lisis
celular con el que se obtuvo una mayor actividad enzimática de esta cepa fue el método
combinado, con un rango de actividad lipolítica de 22,83 - 80,45 UL. Las enzimas lipolíticas
producidas por esta cepa están en mayor proporción en la fracción intracelular. Finalmente, las
lipasas de la cepa Serratia USBA-GBX-513 posiblemente se encuentran localizadas en el espacio
periplásmico.
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………………………………1
2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.......................................................1
3. MARCO TEÓRICO………………………………………………………………………………………………………………2
3.1
Enzimas lipolíticas……………………………………………………………………………………………………..2
3.2
Microorganismos productores de enzimas lipolítcas………………………………………………….3
3.3
Serratia como productor de enzimas lipolíticas………………………………………………………….3
3.4
Aplicaciones de las enzimas lipolíticas……………………………………………………………………….4
4. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………………………………………….5
4.1
Objetivo general………………………………………………………………………………………………………..5
4.2
Objetivos específicos………………………………………………………………………………………………….5
5. METODOLOGÍA…………………………………………………………………………………………………………………5
5.1
Población de estudio………………………………………………………………………………………………….5
5.2
Medio de cultivo y condiciones de cultivo………………………………………………………………….6
5.3
Preparación de la muestra…………………………………………………………………………………………6
5.4
Técnicas de lisis celular………………………………………………………………………………………………6
5.4.1
Método físico…………………………………………………………………………………………………………….6
5.4.2
Método químico………………………………………………………………………………………………………..7
5.4.3
Método enzimático……………………………………………………………………………………………………7
5.4.4
Método combinado……………………………………………………………………………………………………7
5.5 Determinación de la asociación de la enzima lipolítica de Serratia USBA-GBX-513 a la
membrana celular…………………………………………………………………………………………………………………..7
5.6
Evaluación de la actividad lipolítica por medio de técnicas cuantitativas, método
colorimétrico……………………………………………………………………………………………………………..8
5.7
Análisis de datos………………………………………………………………………………………………………..8
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………………………………………………………….9
6.1
Actividad lipolítica extracelular de la cepa Serratia USBA-GBX-513……………………………9
6.2 Actividad lipolítica intracelular empleando cuatro métodos de lisis celular de la cepa
Serratia USBA-GBX-513…………………………………………………………………………………………………………10
6.2.1
Método físico…………………………………………………………………………………………………………..11
6.2.2
Método químico………………………………………………………………………………………………………12
6.2.3
Método enzimático………………………………………………………………………………………………….12
6.2.4
Método combinado ………………………………………………………………………………………………..13
6.3 Determinación de la asociación de la enzima lipolítica de Serratia USBA-GBX-513 a la
membrana celular…………………………………………………………………………………………………………………13
6.4 Análisis estadístico de los diferentes métodos de extracción de proteínas intracelulares de
la cepa Serratia USBA-GBX-513…………………………………………………………………………………………….14
7. CONCLUSIONES……………………………………………………………………………………………………………….16
8. RECOMENDACIONES...................................................................................................17
9. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………………………………………..18
10. ANEXOS………………………………………………………………………………………………………………………….21
1. INTRODUCCIÓN
En la actualidad las enzimas lipolíticas, gracias a su versatilidad, participan en diferentes
aplicaciones a nivel industrial, destacándose en la producción farmacéutica, en alimentos y en
ambiental. Es así, que diversos autores se han centrado en analizar microorganismos productores
de lipasas teniendo en cuenta los parámetros nutricionales y físico-químicos que influyen en la
producción de estas enzimas como lo es la fuente de carbono, el sustrato lipídico, la temperatura,
etc, y así determinar las condiciones óptimas donde se obtenga una mayor actividad enzimática
para que posteriormente se puedan llevar a producir a gran escala.
En estudios realizados por Franco (2010), se reportó que la cepa Serratia USBA-GBX-513 aislada
del Parque Nacional los Nevados tiene actividad lipolítica extracelular detectándose la mayor
actividad a la hora 16, cuando este microorganismo está finalizando su fase exponencial. Estos
resultados corroboran que cepas psicrofílicas como el género Serratia producen enzimas lipolíticas
asociadas al crecimiento del microorganismo y que al ser aisladas de ambientes extremos
representan una fuente potencial de lipasas porque pueden ser empleadas en procesos
industriales como es el caso de los detergentes.
Por lo anterior, el objetivo de este trabajo es continuar con el estudio de la cepa Serratia USBAGBX-513 ya que debido a la importancia que tienen las enzimas lipolíticas es necesario
complementar la caracterización de la actividad lipolítica detectada en esta cepa determinando la
fracción celular que presente una mayor actividad enzimática, pues de éste género se conocen
actividades lipolíticas extracelulares mas no intracelulares.
2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Las enzimas secretadas por microorganismos son de interés industrial debido a que la mayoría
presenta rendimientos altos en la elaboración de un producto específico; por otro lado, presentan
una variedad de actividades catalíticas, tienen una mayor facilidad de manipulación genética y al
ser biodegrabables permiten reducir el impacto medio ambiental al no generar residuos nocivos
(1).
Estas enzimas pueden ser intracelulares o secretadas al medio de cultivo. Para enzimas
extracelulares el grado de purificación requerido es mínimo y los procesos a gran escala presentan
rendimientos altos. Sin embargo, otras enzimas son producidas en mezclas intracelulares más
1
complejas y representan un desafío cuando se quieren purificar, ya que los protocolos son más
exigentes. Pocas enzimas intracelulares son producidas a gran escala; sin embargo, su producción
es de interés, ya que los avances en las técnicas de inmovilización, el uso de enzimas y células
inmovilizadas está en aumento, y además con la purficación, estas enzimas permtien recuperar
productos de mayor interés a nivel industrial, por ejemplo en la parte farmacéutica, sirve para
obtener productor de alta calidad y pureza (2).
La cepa utilizada en este trabajo, Serratia USBA-GBX-513, es una bacteria Gram negativa y por estudios
previos realizados por Franco (2010), se ha reportado como productora de enzimas lipolíticas
extracelulares. Del género Serratia se conoce ampliamente las aplicaciones que tienen sus lipasas
extracelulares y los diferentes usos que se le han atribuido a nivel industrial. Sin embargo, son
pocos los estudios que han reportado enzimas lipolíticas intracelulares producidas a partir de este
género; puesto que lo complejo de la membrana celular y la diferente ubicación de las proteínas,
ha restringido el uso de los microorganismos Gram negativos para la obtención de enzimas
intracelulares; dentro de la enzimas relevantes producidas por una bacteria Gram negativa, se
encuentra la pululanasa producida por Klebsiella pulmoniae. Es por ello, que es relevante realizar
estudios donde por medio de diferentes técnicas de lisis celular (físicas, químicas y enzimáticas), se
pueda evaluar la presencia y la actividad lipolítica intracelular de la cepa Serratia USBA-GBX-513 y
poder determinar la fracción celular donde se produce una mayor actividad enzimática.
3. MARCO TEÓRICO
3.1 Enzimas lipolíticas
Las enzimas lipolíticas tienen una función importante en la movilización de los lípidos en las células
individuales de los organismos, y además son empleadas para hidrolizarlos produciendo ácidos
grasos y glicerol (7). Forman parte de la familia de las α/β-hidrolasas, se dividen en lipasas
verdaderas y en estereasas. Además de hidrolizar los triglicéridos, pueden catalizar reacciones
como la esterificación, acidólisis, alcohólisis y aminólisis (4).
Dentro de sus características se encuentra la alta resistencia a solventes orgánicos, la
estereoespecificidad, regioselectividad, enantioselectividad, el no requerimiento de cofactores,
una óptima actividad a diferentes rangos de temperatura y un pH óptimo entre 8 y 9, aunque
también se han reportado lipasas con pH óptimo ácido (5).
2
3.2 Microorganismos productores de enzimas lipolíticas
Las lipasas están distribuidas en animales, plantas y microorganismos (6); dentro de estos últimos
se encuentran: Pseudomonas sp., Serratia sp., Rhizopus sp., Mucor sp., Aspergillus sp. y Candida
sp., entre otros. Las lipasas de los microorganismos psicrófilos como Candida antárctica, son
revelantes porque presentan alta actividad a bajas temperaturas, que favorece la síntesis orgánica
de intermediarios quirales, al igual que tienen como ventaja una mayor flexibilidad inherente en
aguas de baja temperatura en comparación con la actividad de enzimas mesofílicas y termofílicas
que se ven afectadas por un exceso de rigidez (4)(7).
Otros estudios en organismos del género Serratia, han evidenciado aplicaciones en diferentes
sectores industriales en especial el farmacéutico.
3.3 Serratia como productor de enzimas lipolíticas
Este género pertenece a la familia Enterobacteriaceae e incluye 15 especies: S. rubidaea, S.
marcescens, S. entomophila, S. ficaria, S. fonticola, S. glossinae, S. marinorubra, S. nematodiphila,
S. liquefaciens, S. proteamaculans, S. urelytica, S. grimesii, S. plymuthica, S. odorífera y S.
quinivorans (18); de las cuales, se han reportado tres como productoras de lipasas extracelulares y
posibles intracelulares: S. marcescens, S. liquefaciens y S. proteamaculans (8).
Serratia marcescens se caracteriza por producir lipasas extracelulares con aplicaciones en
diferentes campos a nivel industrial, destacándose el sector farmacéutico ya que son útiles en la
síntesis de fármacos como por ejemplo, al catalizar la hidrólisis de trans-3-(4-metoxifenil) ácido
glucídico metil ester, intermediario en la síntesis de diltiazem (farmacéutico empleado como
vasodilatador coronario). La producción de este medicamento se ha llevado a cabo desde 1993 a
partir de este microorganismo (9) (10).
Estas lipasas también participan en la producción de ketoprofeno (antiinflamatorio no esteroideo)
y para incrementar la actividad enzimática de la cepa, se han realizados estudios expresando este
gen lipolítico en E. coli, de lo cual se han obtenido actividades de 5000 a 6000 U/L (11).
Las actividades lipolíticas reportadas para esta cepa, han sido de 117,6 U/mg a un pH óptimo de
7.0 y una temperatura óptima de 37oC (9). Gao et al. (2004) analizaron la relación de la actividad
lipolítica de esta cepa con el sustrato; para ello se emplearon diferentes fuentes de carbono
(Tween 80, aceite de oliva, acido oléico, glucosa, dextrina y glicerol), obteniendo una mayor
actividad lipolítica con el Tween 80 (1.210 U/L), ya que este sustrato es un éster unido a un ácido
oleico y por lo tanto el microorganismo lo emplea como única fuente de carbono para generar
actividad lipolítica, y una vez hidrolizado el enlace entre el ácido oleico y el éster queda libre el
3
ácido, el cual es utilizado para el crecimiento del organismo. Igualmente, esta cepa presentó
actividad lipolítica en presencia de los sustratos aceite de oliva (640 U/L) y el ácido oléico (330 U/L)
(12) (13).
En un estudio realizado por Yao et al. (2008) se caracterizó la cepa recombinante de Serratia
liquefaciens que es una enzima alcalina que puede hidrolizar sustratos como aceite de oliva a un
pH de 7.0 – 9.9 y a una temperatura de 45oC. La mayor actividad lipolítica de esta especie fue
detectada a las 48 horas por medio de la técnica colorimétrica p-NPL (p-nitrofenol laurato)
obteniendo un valor de 14-16 U/ml y empleando metanol como inductor de la actividad
enzimática. Estas lipasas, tienen aplicaciones biocatalíticas como síntesis de productos químicos y
en la industria de alimentos al sintetizar agentes que permiten mejorar el sabor de los mismos
(14).
La especie Serratia proteomaculans se ha reportado como una cepa productora de lipasas
extracelulares y de proteasas, destacándose de esta última la protealisina que presenta
actividades óptimas a pH neutros (15). Sin embargo, son pocos los estudios que se han reportado
sobre las enzimas lipolíticas de esta especie y sobre su actividad intracelular.
3.4 Aplicaciones de las enzimas lipolíticas
Las enzimas lipolíticas tienen diferentes aplicaciones comerciales, ya que catalizan reacciones
biotecnológicamente relevantes como lo son la producción de ácidos grasos, biodisel y síntesis de
químicos (agroquímicos, terapéuticos, cosméticos, etc.) (16). Ambientalmente, las lipasas son
empleadas en inoculantes como depurador de tratamientos de aguas residuales y para hidrolizar
grasas en residuos sólidos y líquidos como una alternativa de sustitución de productos de origen
químico (16) (17).
Algunas de las lipasas se han destinado como biocatalizadores para la obtención de moléculas
homoquirales a través de las cuales se puedan sintetizar diferentes tipos de fármacos. Este es el
caso del lobucavir, empleado como agente antiviral para el tratamiento contra el virus del herpes y
de la hepatitis B, y para su elaboración se utiliza la lipasa de Candida rugosa con la cual se
obtienen rendimientos del 87%. El monopril, un fármaco antihipertensivo que actúa como
inhibidor sobre la enzima convertidora de angiotensina, su hidrólisis asimétrica se lleva a cabo
gracias a la lipasa pancreática porcina (PPL) y la lipasa de Chromobacterium viscosum.
Comercialmente Pseudomonas sp. es uno de los géneros con mayor producción a nivel industrial
de enzimas lipolíticas y se utilizan en la producción de detergentes y síntesis de ácidos orgánicos
(4).
4
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Determinar la actividad intracelular y extracelular de las enzimas lipolíticas producidas por la cepa
Serratia USBA-GBX-513.
4.2 Objetivos Específicos
-
Evaluar diferentes métodos de extracción de proteínas intracelulares.
Determinar la fracción celular donde se produce la mayor actividad lipolítica de la cepa
Serratia USBA-GBX-513.
5. METODOLOGÍA
Este estudio se llevó a cabo en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) del
Departamento de Biología de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana.
Para todos los ensayos evaluados se realizaron tres repeticiones, cada una con tres réplicas
tomando de cada réplica tres submuestras, para un total de 27 datos por método.
Para cada uno de los ensayos, se preparó un pre-inóculo y un inóculo, y a partir de este último se
realizaron dos subcultivos consecutivos de la cepa, denominados subcultivo 1 (S1) y subcultivo 2
(S2), el S2 se utilizó para realizar todos los ensayos.
Se inoculó el 10% del volumen final del S1 al S2 para los ensayos a evaluar.
Como control positivo se utilizó un microorganismo lipolítico reportado en la literatura,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9721, el cual se obtuvo del cepario de USBA.
5.1 Población de estudio
La seleccionó la cepa Serratia USBA-GBX-513 para determinar la actividad lipolítica extracelular e
intracelular. Esta es una cepa aerobia que se aisló en estudios anteriores de suelos del Parque
Natural los Nevados, proviene de un páramo con una temperatura de 4,4oC y un pH del suelo de
5,3. Por medio del análisis de la secuencia del gen 16S rRNA, presentó un 99% de similitud con la
5
especie Serratia proteomaculans. Además, presentó actividad lipolítica desde la hora 6 hasta la
hora 24 con un máximo de actividad a la hora 16 en fase estacionaria (3).
5.2 Medio de cultivo y condiciones de cultivo
La cepa Serratia USBA-GBX-513 se cultivó en el medio M9 (20) (Anexo 1) a pH 7.0. Para el preinóculo y el inóculo el medio se suplementó con peptona 3 (g/l) y para realizar las pruebas
enzimáticas de cada uno de los ensayos a evaluar se utilizó aceite de oliva 1% (v/v), el cual se
adicionó antes de esterilizar el medio. La cepa se incubó a 30°C, en agitación a 200 r.p.m. y 10%
del inóculo.
5.3 Preparación de la muestra
La cepa Serratia USBA-GBX-513 se sembró en medio M9 sólido suplementado con peptona 3 (g/l)
y se incubó por 24 horas a 30oC. Posteriormente, se transfirió una colonia a tres tubos con medio
M9 (5ml cada uno) suplementado con peptona 3 (g/l) y se incubó por 24 horas a 30oC, este medio
se utilizó como inóculo. Para el S1 se transfirieron 12,5ml del inóculo a medio M9 que contenía
112,5ml (volumen final 125ml) suplementado con aceite de oliva 1% (v/v) y se incubó a 30oC
durante 16 horas. Posteriormente, 25ml del S1 se inocularon en un erlenmeyer que contenía
225ml de medio M9 (volumen final 250ml) suplementado con aceite de oliva 1% (v/v) y se incubó
a 30oC y con una agitación de 200 r.p.m. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Las células fueron recolectadas a la hora 16 de crecimiento y 500ml de cultivo celular se
centrifugaron a 12.000 r.p.m., 4oC por 30 minutos. A partir de la centrifugación realizada se
obtuvieron dos fracciones: sobrenadante (enzimas extracelulares) y pellet (enzimas intracelulares).
El sobrenadante se reservó para evaluar la fracción extracelular. Por otro lado, se recuperó el
pellet centrifugando a 6.000 r.p.m. por 30 minutos y luego se realizaron dos lavados con buffer TE
pH 8.0 centrifugando a 6.000 r.p.m. por 10 minutos cada uno (13). Para cada uno de los métodos
de lisis se adicionó Pefabloc (Merck) como inhibidor de proteasas (18).
5.4 Técnica de lisis celular
A partir del pellet recuperado anteriormente, se realizaron las siguientes técnicas de lisis celular:
5.4.1 Método físico
6
Al pellet recuperado se le adicionó 4ml de buffer TE y 20µL de Pefabloc (Merck). Posteriormente,
se llevó al sonicador teniendo en cuenta el programa descrito a continuación: ciclos: 15, amplitud:
19%, tiempo total: 1 minuto, pulsos on: 4 segundos y pulsos off: 56 de descanso. Nuevamente se
centrifugó a 6.000 r.p.m. por 10 minutos y se midió la actividad enzimática del sobrenadante
(fracción intracelular) (19).
5.4.2 Método químico
Al pellet recuperado se le adicionó 1ml de buffer TE, 20µL de Pefabloc (Merck) y 1ml de 2xSDS
(Dodecil sulfato de sodio 2% p/v) (Anexo 2) mezclando en vortex por 20 segundos. Luego se colocó
la muestra en un baño maría por 5 minutos, se centrifugó a 6.000 r.p.m. por 10 minutos y se midió
la actividad enzimática del sobrenadante (fracción intracelular) (20).
5.4.4 Método enzimático
Al pellet recuperado se le adicionó 725µL de buffer TE, 250µL de lisozima (75mg/ml), 20µL de
EDTA (10Mm) (Ácido etilen-diamino-tetra-acético), 5µL de Pefabloc (Merck) y 40µL de
acromopeptidasa (10mg/ml). Posteriormente, se incubó a 37oC por una hora; transcurrido este
tiempo se centrifugó a 13.000 r.p.m. por 10 minutos y se midió la actividad enzimática del
sobrenadante (fracción intracelular) (21).
5.4.3 Método combinado
Al pellet recuperado se le adicionó 1ml de buffer de lisis (Anexo 3) y 5µL de Pefabloc (Merck), las
muestras se incubaron en hielo por 30 minutos; posterior a este tiempo, se llevaron al sonicador
teniendo en cuenta el programa descrito a continuación: ciclos: 15, amplitud: 19%, tiempo total: 1
minuto, pulsos on: 4 segundos y pulsos off: 56 de descanso. Se centrifugó a 6.000 r.p.m. por 10
minutos y se midió la actividad enzimática al sobrenadante (fracción intracelular) (22).
5.5 Determinación de la ubicación de las enzimas lipolíticas de la cepa Serratia USBA-GBX-513 en
la fracción intracelular
Se realizó el protocolo descrito en el numeral 5.4.3, luego de centrifugar a 6.000 r.p.m. por 10
minutos se obtuvieron dos fracciones: el sobrenadante (enzima localizada en el espacio
periplásmico) y el pellet (enzima asociada a la membrana). Del sobrenadante se midió la actividad
enzimática.
7
Al pellet se realizó un lavado con buffer TE pH 8.0 centrifugando a 6.000 r.p.m. por 10 minutos;
luego se adicionó 1ml de buffer TE pH 8.0, se homogenizó la muestra y se midió la actividad
enzimática.
5.6 Evaluación de la actividad lipolítica por medio de técnicas cuantitativas, método
colorimétrico
5.6.1 Ensayos enzimáticos usando sustratos derivados del p-nitrofenil ester
Se realizó la curva patrón del p-nitrofenol, tomando diferentes concentración 1uM, 5uM, 10uM,
25uM, 50uM y 100uM; se adicionó buffer Tris-HCL a 50mM pH 7,5 para completar un volumen
final de 2,5ml; se medió la absorbancia por espectrofotometría a 410nm y se tomó como blanco el
buffer (18).
La actividad enzimática se midió espectrofotométricamente usando p-nitrofenil butirato como
sustrato con una concentración final de 0,5mM. La reacción comienza añadiendo 2,275µl de buffer
Tris-HCl pH 7,5; posteriormente, se adicionaron 25µl de la solución stock del sustrato (7,425µl de
p-nitrofenil butirato disuelto en 825µl de acetonitrilo), las muestras se mezclaron agitando con
vortex y se incubó por 10 minutos a 30oC; transcurrido este tiempo, se adicionaron 200µl del
extracto crudo de la enzima para completar un volumen final de 2,5ml, se mezcló agitando con
vortex y finalmente, se incubó por 30 minutos a 30oC. Una vez cumplido este tiempo, se leyó la
absorbancia a 410nm. Para esta técnica, se tomó como blanco el sustrato con el buffer pero sin
extracto crudo. Además, se tomaron dos controles, un control negativo que corresponde al medio
de cultivo solo y un segundo control que contenía el buffer, el extracto crudo pero sin sustrato.
Todas las mediciones se calcularon por triplicado. Bajo estas condiciones se tomó como unidad de
actividad enzimática aquella cantidad de enzima que cataliza la formación de 1µmol de pnitrofenol (p-NPB) por minuto (13) (18).
5.7 Análisis de datos
Los datos que se obtuvieron de cada una de las réplicas de los ensayos evaluados, se almacenaron
en matrices de archivo de Excel y se analizó la estadística descriptiva calculando medias,
desviación estándar, coeficiente de variación y se realizaron gráficas de barras. Para determinar
con cuál de los métodos de lisis celular se presentaba una mayor cuantificación de la actividad
lipolítica, se realizó una prueba de ANOVA para determinar si existían diferencias significativas
entre los tratamientos, y posteriormente se realizó una prueba de Tukey. Cabe destacar que
previo al análisis de varianzas se evaluó el cumplimiento de los supuestos de normalidad y
8
homogeneidad de varianzas y se realizó una transformación utilizando logaritmo natural, con el fin
de corregir los supuestos. Para los análisis estadísticos se utilizó el programa estadístico SPSS
versión 18 (Statistical Package for the Social Sciences).
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Actividad lipolítica extracelular de la cepa Serratia USBA-GBX-513
Al realizar el repique de la cepa Serratia USBA-GBX-513 se observaron como características
macroscópicas colonias blancas, cremosas, con borde irregular ligeramente ovaladas y como
características microscópicas bacilos gruesos, largos, móviles, Gram negativos. Por medio de la
técnica colorimétrica del p-nitrofenil butirato (p-NPB), se obtuvieron actividades enzimáticas de
3,33 a 4,08 UL de la fracción extracelular, con un coeficiente de variación de 10,05% (Tabla 1). Las
unidades lipolíticas obtenidas, resultaron similares a los valores registrados en estudios
previamente realizados en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) en los
cuales se obtuvieron actividades de 4,24 UL. También, se confirmó que a la hora 16 de crecimiento
y empleando aceite de oliva al 1% (v/v) se presenta una mayor actividad lipolítica en la cepa
UL (µmol/L/min)
Promedio
3,51
3,91
4,16
3,57
3,94
3,13
3,7
DS
0,37
%CV
10,05
Rangos
3,33 - 4,08
evaluada. Por otro lado, es importante mencionar, que en dichos estudios se evaluaron diferentes
sustratos lipídicos (aceite de oliva, etil oleato, gliceril trioleato, gliceril tributirato, Tween 80 y
aceite de palma) con el fin de determinar el sustrato donde mejor crecía la cepa. De acuerdo a los
resultados obtenidos, se reportó que cepa tenía un crecimiento en Twween 80 y aceite de oliva
crecimiento (3).
Tabla1. Actividad lipolílitica extracelular de Serratia USBA-GBX-513
9
La actividad lipolítica es a menudo inducible y puede estar influenciada por diversos factores como
son la adición de compuestos que pueden actuar como inductores, por ejemplo ácidos grasos,
Tween, aceite de oliva; parámetros físico-químicos como pH, temperatura, la agitación, la
concentración de oxígeno disuelto; y también la fase de crecimiento en que esté la cepa a evaluar.
En este estudio fue importante mantener las condiciones de cultivo que se establecieron en
trabajos previamente realizados en USBA por Franco (2010), ya que aseguraban la cuantificación
de enzimas lipolíticas de esta cepa. Dichas condiciones eran la temperatura (30oC), la fase de
crecimiento (fase estacionaria a la hora 16) y la fuente de carbono o sustrato inductor (aceite de
oliva 1% v/v).
Recientes investigaciones han evaluado diferentes inductores de la actividad enzimática de las
lipasas como el Tween-80 y el aceite de oliva, destacándose el Tween-80 por cuantificar mayores
actividades lipolíticas en el género Serratia (12). Diversos autores han reportado actividades
enzimáticas de 500 y 1210 UL para Serratia marcescens empleando como sustrato Tween-80 (12),
mientras que con aceite de oliva al 0,5% (v/v) se han reportado actividades de 750 UL; los cuales,
son valores más altos que los obtenidos en el ensayo realizado, probablemente (23) porque se
trate de una especie diferente y porque en dichos estudios trabajaban con la enzima purificada,
mientras que en este trabajo se cuantificó a partir del extracto crudo Además, la cepa Serratia
USBA-GBX-513 presenta un mejor crecimiento en aceite de oliva al 1% (v/v) que en Tween 80.
Un factor importante dentro de este estudio fue la temperatura, ya que se ha demostrado que
para el género Serratia, la actividad lipolítica del extracto crudo de la enzima, disminuye al
incrementar la temperatura por encima de 50oC; por lo tanto, manejar temperaturas entre 25 y
35oC, estimula la acumulación de lipasas en este género, como se empleó en este estudio (20).
6.2 Actividad lipolítica intracelular empleando cuatro métodos de lisis celular de la cepa Serratia
USBA-GBX-513
Para cuantificar la actividad lipolítica intracelular se evaluaron cuatro métodos de lisis (el físico, el
químico, el enzimático y el combinado) (Tabla 2 y Figura 1); teniendo en cuenta, que la ruptura de
células es una etapa importante para la producción de enzimas intracelulares, y dependiendo del
propósito del estudio y del tipo de célula, se escoge el tratamiento que se va aplicar (24).
Tabla 2. Actividad intracelular de Serratia USBA-GBX-513
Método de
lisis
Enzimático
UL (µmol/L/min)
18,89
20,47
22,26
23,28
18,93
32,22
X
DS
22,68
5,24
%CV
Rangos
23,09 17,68 27,67
10
Físico
5,12
7,79
4,75
5,86
4,27
4,68
5,41
0,60
Químico
2,33
2,93
3,78
2,85
3,40
3,20
3,08
0,36
Combinado
83,23
51,61
43,37
68,72
74,01
64,34
64,21
14,64
11,05
4,13 6,69
11,69 2,58 3,58
22,80 49,58 78,85
90
80
UL (µmol/L/min)
70
60
Enzimático
50
Físico
40
Químico
30
Combinado
20
10
0
Métodos
Figura 1. Actividad lipolítica intracelular de Serratia USBA-GBX-513
6.2.1 Método Físico
En este trabajo, se empleó el ultrasonicador como método físico y se obtuvieron actividades
lipolíticas entre 4,13 y 6,69 UL con un coeficiente de variación del 23,66% (Tabla 2 y Figura 1). Éste
es uno de los métodos más empleados para recuperar enzimas intracelulares a gran escala; sin
embargo, para este tipo de tratamiento, es importante tener en cuenta las propiedades de la
célula con la que se está trabajando como la fuerza física de la pared (21). En este método se
genera lisis de la membrana por la intensa agitación producida al transmitir corrientes eléctricas a
un sistema mecánico el cual crea vibraciones de alta energía (25), produciendo ondas de
ultrasonido las cuales forman burbujas microscópicas que se expanden y colapsan contra las
células causando la ruptura de la membrana (26). Este método de lisis celular se empleó en un
estudio realizado por Long et al. (2007), donde se expresó un gen lipolítico de la cepa S.
marcescens ECU1010 en E. coli y se obtuvo una actividad de 1275 UL por medio de la técnica
colorimétrica del p-nitrofenil acetato (p-NPA) (10).
11
La susceptibilidad de las bacterias frente a vibraciones sonoras es variable. En este trabajo se
empleó una bacteria Gram negativa que es más sensible a estos métodos de lisis celular en
comparación con las Gram positiva. El efecto que ocasiona el colapso de las ondas en las células es
su desintegración, se forman peróxidos, se despolimerizan las macromoléculas y se generan cortes
en ambas hebras del DNA.
6.2.2 Método Químico
Se empleó como agente de lisis el detergente SDS obteniéndose actividades entre 2,6 y 3,6 UL con
un coeficiente de variación del 16,22% (Tabla 2 y Figura 1). En estos métodos se emplean
diferentes tipos de solventes con el fin de lisar las células como lo son los detergentes, álcalis,
entre otros. Al emplear detergentes, se ocasiona una permeabilización de células por
solubilización de proteínas de membrana debido a la apertura de los poros (27).
El detergente empleado en este trabajo, es un detergente aniónico con un pH alto que abre la
pared celular, desnaturalizando el DNA cromosomal, disociando las proteínas oligoméricas en sus
monómeros y rompiendo los enlaces de hidrógeno e hidrófobos entre los polipéptidos,
desnaturalizando la estructura tridimensional de las proteínas (28).
6.2.3 Método Enzimático
Este método presentó actividades lipolíticas entre 17,68 y 27,67 UL con un coeficiente de variación
de 22,04% (Tabla 2 y Figura 1). El uso de estos métodos proporciona especificidad biológica al
proceso de lisis celular. Para este método se emplearon la lisozima, la acromopeptidasa y el EDTA.
La lisozima presenta propiedades líticas frente a bacterias, virus y hongos; su acción se basa en el
rompimiento de los enlaces 1,4 β glicosídicos de la mureína de los peptidoglicanos en la pared
celular bacteriana (29). Según estudios realizados, la lisozima actúa de manera más eficiente en las
bacterias Gram positivas que en las Gram negativas debido a la composición de la pared de estas
últimas que se caracteriza por presentar dos membranas celulares: una membrana externa y una
membrana interna, plasmática o citoplasmática (4).
Por lo anterior, se hace necesario adicionar otros compuestos que contribuyan a mejorar el
proceso de lisis; siendo así, que en este trabajo como se tenía una cepa Gram negativa, se empleó
EDTA que es un agente quelante de los iones de Ca++ y Mg++, los cuales están involucrados en la
adhesión intracelular, y son cofactores de ciertas enzimas (21). El mecanismo de lisis en las
bacterias Gram negativas consiste en que el EDTA, al quelar el Ca++ libera una parte de los
lipopolisacáridos y permite la acción de la enzima.
La acromopeptidasa, por su parte, es una enzima que también se emplea para lisar células
bacterianas y en muchos casos se utiliza cuando ciertos microorganismos son resistentes a la
12
lisozima (30). La actividad lítica de esta enzima se debe a por lo menos dos proteasas: la αproteasa lítica y la β-proteasa lítica; la primera es una serin-proteasa que hidroliza los péptidos en
el lado carboxilo de los aminoácidos hidrofóbicos como la alanina y valina y rompe el enlace amida
N-acetilmuramoil-L-alanina, D-Ala-Gli y Gli-Gli en el peptidoglicano. La segunda es una proteasa
que contiene zinc y se ha descrito como la parte más activa de la acromopeptidasa, hidroliza los
enlaces D-Ala-Gli/Ala y Gli-Gli entre péptidos (30) (31). En este estudio, se analizó que la
acromopeptidasa al ser una proteasa no afectó a las enzimas lipolíticas producidas por la cepa
Serratia USBA-GBX-513, ya que al adicionar Pefabloc, éste inhibe la α-proteasa de la
acromopeptidasa que contiene serin-proteasa, dejando la β-proteasa que es el centro activo de
esta enzima, consituida por zinc; por lo tanto, no va afectar a la lipasas puesto que el centro activo
de las estas enzimas, está constituido por la traiada catalítica que contiene serina, restos de
histidina y un aminoácido ya sea aspergina o glutamina (31).
6.2.4 Método Combinado
El último método evaluado fue el combinado donde la muestra se sometía a un buffer de lisis y
posteriormente a un proceso de sonicación. Se obtuvieron actividades lipolíticas de 49,6 a 78,9 UL
con un coeficiente de variación de 22,79% (Tabla 2 y Figura 1). Los buffer de lisis generalmente
contienen mezclas de reactivos químicos que aseguran la eficacia de la lisis (24); el buffer
empleado en este trabajo, contenía CHAPS, detergente zwitterionico que permite una mejor
solubilización; Tritón X-100, que es un detergente no iónico; úrea que es un agente caotrópico que
alteran la estructura de macromoléculas como las proteínas al interferir en la estabilización de
interacciones intramoleculares como los son los puentes de hidrógeno permitiendo la
solubilización de las mismas; y 200µg/ml de lisozima (24).
6.3 Determinación de la ubicación de las enzimas lipolíticas de la cepa Serratia USBA-GBX-513 en
la fracción celular
De acuerdo con los resultados obtenidos en este ensayo se observó que la enzima lipolítica de la
cepa Serratia USBA-GBX-513 probablemente no está asociada a la membrana; ya que las
actividades lipolíticas cuantificadas en el debris resultaron más bajas en relación a las cuantificadas
en el espacio periplásmico, con rangos de actividades de 25,74 a 50,01 UL y un porcentaje de
coeficiente de variación de 32,04% para el debris y 64,45 a 80,02 UL con un porcentaje de
coeficiente de variación de 10,78% para el espacio periplásmico (Tabla 3 y Figura 2). Es posible que
lo que se cuantificó como ligado a la membrana, sean proteínas que estaban listas para ser
transportadas al espacio extracelular. Según estudios realizados, se ha reportado que la
acumulación de enzimas en la fracción intracelular hace que éstas sean enviadas al espacio
extracelular (32).
13
Algunos microorganismos producen enzimas en el espacio periplásmico pero no necesariamente
son translocadas al espacio extracelular sino que quedan ligadas a su membrana. Los sistemas de
plegamiento ocurren cuando las enzimas pasan a través de la membrana gracias a que se unen a
unas proteínas específicas las cuales les ayudan a plegarse y en algunas ocasiones dichas enzimas
se encuentran localizadas en la membrana. En las bacterias Gram negativas la secreción de
enzimas es más compleja, debido a la presencia de una membrana externa, por esto las enzimas
segretadas son retenidas a menudo en el espacio periplásmico (que está situado entre la pared
celular y la membrana interna), en vez de ser liberadas al medio de cultivo (32)..
Tabla 3. Determinación de la ubicación de las enzimas lipolíticas de Serratia USBA-GBX-513 en la
fracción celular
Método
Espacio
periplásmico
Combinado
70,76
65,29
Asociado a
membrana
Combinado
23,94
43,54
UL (µmol/L/min)
Ubicación
celular
UL (umol/L/min)
X
DS
%CV
Rangos
80,65
72,23
7,79
10,78
64,45 80,02
46,14
37,87
12,14
32,04
25,74 50,01
90,00
80,00
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
Espacio periplásmico
Asociado a membrana
Ubicación celular
Figura 2. Determinación de la ubicación de las enzimas lipolíticas de Serratia USBA-GBX-513 en
la fracción celular
6.4 Análisis estadístico de los diferentes métodos de extracción de proteínas intracelulares de la
cepa Serratia USBA-GBX-513
Para determinar con cuál de los métodos de lisis celular se presentaba una mayor actividad
lipolítica, se realizó un análisis estadístico mediante el programa SPSS versión 18. Inicialmente, se
14
llevó a cabo la prueba Shapiro-Wilk para normalidad de los datos y la prueba de Levene para
determinar homogeneidad de variancias, ya que estos son los supuestos que se deben cumplir
para poder realizar un análisis de varianzas (ANOVA) y pruebas Post-hoc. Debido a que los datos
no cumplieron con los supuestos de normalidad ni homogeneidad de varianzas (p<0.05), se
transformaron los datos utilizando logaritmo natural con el fin de corregir dichos supuestos.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos con el ANOVA, se determinó que existen diferencias
estadísticamente significativas en la cuantificación de la actividad enzimática entre los métodos
evaluados (p<0,05) (Anexo 4).
Con el fin de determinar con cual tratamiento se obtienen una mayor cuantificación de la actividad
enzimática intracelular, se realizó una prueba de Tukey (Anexo 5). De acuerdo a los resultados, se
puede concluir que todos los tratamientos muestran resultados estadísticamente diferentes, por
lo que se elije el método con el cual se obtuvo la mayor cuantificación de la actividad lipolítica, el
cual fue el método combinado.
Los resultados concuerdan con lo reportado en la literatura puesto que los métodos combinados
presentan una mayor efectividad ya que combinan tres tipos de lisis celular, potencializando de
este modo el efecto de lisado. El buffer de lisis contiene detergentes que permiten la solubilicación
de las proteínas, lisozima que permite romper la membrana con la ayuda de la sonicación. Debido
a la resistencia que presenta la pared de las bacterias Gram negativas, la literatura hace referencia
al uso de químicos y pre-tratamientos térmicos para disminuir dicha resistencia antes de la ruptura
celular; el proceso de sonicación permite en este caso, acelerar el proceso de solubilización de las
proteínas, que normalmente requiere de varias horas (21). El método con el cual se cuantificó las
más bajas actividades lipolíticas, fue el método químico, probablemente porque este método
contiene solo SDS que permite solubilizar la membrana, mas no ocasiona hidrólisis como en los
otros métodos evaluados.
Para determinar la fracción celular que presenta una mayor actividad enzimática, se compararon
las actividades obtenidas en la fracción extracelular con las de la fracción intracelular. Se
obtuvieron rangos de 3,33 a 4,08 UL y un porcentaje de coeficiente de variación de 10,05% para la
fracción extracelular, y 49,58 a 78,85 UL con un porcentaje de coeficiente de variación de 22,80%
para la fracción intracelular; demostrando que para la cepa Serratia USBA-GBX-513 la fracción
celular intracelular presenta una mayor actividad lipolítica (Tabla 6 y Figura 3). Estos resultados
son posibles, ya que la cepa con la que se estaba trabajando era Gram negativa y las
probabilidades de encontrar enzimas intracelulares en estos microorganismos es alta, pues la
mayoría de estas bacterias no excretan sus enzimas sino que quedan en el espacio periplásmico.
Tabla 6. Actividad lipolítica extra e intracelular Serratia USBA-GBX-513
Fracción
celular
Método
UL (µmol/L/min)
X
DS
%CV
Rangos
15
Extracelular
Combinado
3,51
3,91
4,16
3,57
3,94
3,13
3,7
0,37
10,05
Intracelular
Combinado
83,23
51,61
43,37
68,72
74,01
64,34
64,21
14,64
22,80
3,33 4,08
49,58 78,85
90
80
UL (µmol/L/min)
70
60
50
40
30
20
10
0
Extracelular
Intracelular
Fracción celular
Figura 3. Actividad lipolítica extra e intracelular Serratia USBA-GBX-513
Cabe resaltar que los valores de desviación estándar y porcentaje de coeficiente de variación
obtenidos en este trabajo fueron altos debido a que se estaba trabajado con muestras biológicas,
que están propensas a presentar interferentes que son difíciles de controlar; por ello, se admiten
valores que estén por fuera de los rangos permitidos estadísticamente como en el caso del
porcentaje de coeficiente de variación que maneja rangos de 10–20%.
7. CONCLUSIONES
El método de lisis celular con el que se obtiene una mayor actividad enzimática de la cepa Serratia
USBA-GBX-513, es el método combinado, con un rango de actividad lipolítica de 22,83 - 80,45 U/l.
La fracción celular de la cepa Serratia USBA-GBX-513 que presenta mayor actividad enzimática es
la fracción intracelular.
16
La enzima lipolítica de la cepa Serratia USBA-GBX-513 posiblemente se encuentra localizada en el
espacio periplásmico y no esté asociada a la membrana.
8. RECOMENDACIONES
Se recomienda en estudios posteriores evaluar diferentes sustratos lipídicos de cadena larga para
cuantificar lipasas verdaderas y así corroborar el tipo de enzima que produce esta cepa.
Realizar estudios que permitan confirmar que la enzima lipolítica de la cepa Serratia USBA-GBX513 está localizada en el espacio periplásmico.
Evaluar diferentes factores que influyen en la actividad enzimática la concentración de sales, iónes
metálicos y pH en los cuales se presente la mayor actividad.
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10. ANEXOS
Anexo 1. Composición del Medio de Sales Minerales (M9).
Componente
NaCl
KH2PO4
Na2HPO4
NH4Cl
Extracto de levadura
Agar
g/L
0.5
3
6
1
0.05
15
Anexo 2. 2 X SDS (Dodecil sulfato de sodio)
Componente
Tris-Cl (pH 6.8)
SDS
Glicerol
Anexo 3. Composición del Buffer de lisis.
Componente
Urea
Tritón X-100
CHAPS
Lisozima
Concentración
100 Mm
2% (p/v)
20% (v/v)
Concentración
9.5 mol/L
1%
4%
200 µg/ml
Anexo 4. Análisis de varianzas (ANOVA) para determinar si existes diferencias significativas en la
cuantificación de la actividad lipolítica entre los métodos evaluados
20
Suma de
cuadrados
gl
Media cuadrática
Inter-grupos
33.979
3
11.326
Intra-grupos
.862
20
.043
34.842
23
Total
F
Sig.
262.737
.000
Tabla 5. Prueba de Tukey para determinar con cual tratamiento se obtiene una mayor
cuantificación de la actividad enzimática intracelular
(I) Tratamiento (J) Tratamiento
1.00
2.00
dimen
sion2
3.00
4.00
Diferencia de
medias (I-J)
Error típico
Sig.
2.00
1.43569*
.11987
.000
dimensi
3.00
on3
1.98941*
.11987
.000
4.00
-1.03537*
.11987
.000
1.00
-1.43569*
.11987
.000
dimensi
3.00
on3
.55373*
.11987
.001
4.00
-2.47105*
.11987
.000
1.00
-1.98941*
.11987
.000
dimensi
2.00
on3
-.55373*
.11987
.001
4.00
-3.02478*
.11987
.000
1.00
1.03537*
.11987
.000
dimensi
2.00
on3
2.47105*
.11987
.000
3.00
3.02478*
.11987
.000
*. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.
21
22