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REVISION PRELIMINAR DE MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS EN
ESTUDIOS DE MICROORGANISMOS DE LOS PHYLUMS ASCOMYCETES,
DEUTEROMYCETES Y OOMYCETES COMO AGENTES CAUSANTES DE
ENFERMEDADES EN PLANTAS
LORENA CURVELO GUTIERREZ
JULIAN ALONSO ROJAS BARRETO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL-MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y
VETERINARIA
BOGOTÁ 2010
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REVISION PRELIMINAR DE MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS EN
ESTUDIOS DE MICROORGANISMOS DE LOS PHYLUMS ASCOMYCETES,
DEUTEROMYCETES Y OOMYCETES COMO AGENTES CAUSANTES DE
ENFERMEDADES EN PLANTAS
LORENA CURVELO GUTIERREZ
JULIAN ALONSO ROJAS BARRETO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar los títulos de
Microbiólogo Agrícola y Veterinario y Microbiólogo Industrial
DIRECTORA
MARIA CLEMENCIA FORERO DE LA ROTTA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL-MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y
VETERINARIA
BOGOTÁ 2010
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NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos
por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se
publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las
tesis no contengan ataques personales contra persona alguna,
antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la
justicia”.
Artículo 23 de la Resolución No. 13 de julio de 1946
3
RECOPILACION DE MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS EN ESTUDIOS DE
MICROORGANISMOS DE LOS PHYLUMS ASCOMYCETES,
DEUTEROMYCETES, OOMYCETES COMO AGENTES CAUSANTES DE
ENFERMEDADES EN PLANTAS
LORENA CURVELO GUTIERREZ
JULIAN ALONSO ROJAS BARRETO
APROBADO
Ma. Clemencia Forero de la Rotta,
Ing. Agrónoma M.Sc. Fitopatologia
Directora
David Gómez Méndez
Microbiólogo M.Sc.
Jurado
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL-MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y
VETERINARIA
BOGOTÁ 2010
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REVISION PRELIMINAR DE MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS EN
ESTUDIOS DE MICROORGANISMOS DE LOS PHYLUMS ASCOMYCETES,
DEUTEROMYCETES, OOMYCETES COMO AGENTES CAUSANTES DE
ENFERMEDADES EN PLANTAS
LORENA CURVELO GUTIERREZ
JULIAN ALONSO ROJAS BARRETO
APROBADO
Ingrid Schuler García, Ph.D
Decana Académica
Facultad de Ciencias
Janeth Arias Palacios, MSc.
Directora
Carreras de Microbiología
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL-MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y
VETERINARIA
BOGOTÁ 2010
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TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN.................................................................................................................... 7
1.
INTRODUCCION ................................................................................................... 8
2. JUSTIFICACION .................................................................................................... 10
3. MARCO TEORICO ................................................................................................. 11
3.1. LOS HONGOS FITOPATOGENOS .......................................................................... 11
3.1.1. CARACTERISTICAS GENERALES ................................................................... 12
3.1.1.1. NUTRICION Y CRECIMIENTO ....................................................................... 13
3.1.1.2. ESTRUCTURAS SOMATICAS ........................................................................ 15
3.1.1.3. REPRODUCCION.............................................................................................. 17
3.2. CLASIFICACION TAXONOMICA .............................................................................. 19
3.2.1. CLASIFICACION DE LOS HONGOS FITOPATOGENOS ............................. 20
3.2.1.1. HONGOS INFERIORES ................................................................................... 20
3.2.1.2. HONGOS SUPERIORES ................................................................................. 21
3.3. Características y estructuras de los hongos inferiores ........................................... 25
3.3.1. Phylums, Oomycetes y Zygomycetes ................................................................ 25
3.4. Características y estructuras de los hongos superiores ......................................... 25
3.4.1. Subdivisión DEUTEROMYCOTINA .................................................................... 25
3.4.2. Subdivisión ASCOMYCOTINA ............................................................................ 26
3.5.1. CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.......................................... 26
4.
OBJETIVOS ........................................................................................................ 29
4.1. Objetivo General ........................................................................................................... 29
4.2. Objetivos Específicos ................................................................................................... 29
5.
METODOLOGIA.................................................................................................. 30
6.
RESULTADOS .................................................................................................... 31
7.
MEDIOS PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS A PARTIR DE SEMILLAS .... 31
8. MEDIOS PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS A PARTIR DE SUELO Y
AGUA ......................................................................................................................... 32
9.
MEDIOS DE USO GENERAL.............................................................................. 38
10. MEDIOS SELECTIVOS ....................................................................................... 41
10.1.
PHYLUM Oomycetes ........................................................................................... 42
10.2.
PHYLUM Ascomycetes ...................................................................................... 52
10.3.
PHYLUM Deuteromycetes .................................................................................. 58
11. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ....................................................... 79
12. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................... 81
6
13. ANEXOS ............................................................................................................. 84
RESUMEN
Como consecuencia del apoyo
que
se
ha
venido
desarrollando
a
la
investigación sobre fitopatología en Colombia se ha venido experimentando en
los últimos años un acelerado crecimiento del interés por
los hongos
causantes de enfermedades en cultivos de importancia económica en
Colombia.
En este proceso, proyectos fomentados por varias instituciones como el ICA,
CORPOICA, universidades entre otras instituciones han incrementado este
interés y han aumentado el número de especies de hongos que hoy en día
están siendo estudiadas.
Para este proceso de investigación se han tenido en cuenta los diferentes
aspectos que intervienen en el establecimiento de los cultivos, para convertirla
en una actividad productiva, capaz de competir con las actividades productivas
tradicionales. En este sentido en varios proyectos se consideran de importancia
los esfuerzos hechos en el campo de la agricultura, con un estudio fitosanitario
de varias especies de plantas. Algunos de ellos abarcaron el reconocimiento de
plagas y enfermedades, presentes en los distintos estados del desarrollo de las
plantas, desde la etapa de semillas y viveros hasta la fase productiva ya
cadenas de comercialización.
Estas investigaciones contemplan garantizar el éxito de las inversiones que se
realizan en el establecimiento de los cultivos. Se ha sabido que a medida que
aumenta las poblaciones de una especie en cultivo, también aumenta el riesgo
de la presencia de plagas o enfermedades que interfieren en la actividad.
Mediante diferentes observaciones e inquietudes planteadas en diferentes
investigaciones en el campo fitopatológico se ha considerado
necesario
recopilar la información que se presenta sobre los medios de cultivo que se han
empleado en estudios de microorganismos peretenecientes a los phylums
Ascomycetes, Deuteromycetes y Oomycetes como agentes causantes de
enfermedades en plantas , con el fin de facilitar al investigador el estudio de
estos hongos; por otro lado se espera que a través del tiempo se puedan
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recopilar, complementar y mantener actualizada la información sobre los
diferentes medios de cultivo que son de uso común y específicos en estudios
sobre los agentes causantes de enfermedades en las plantas.
Se espera que este documento sea el punto partida para una herramienta de
gran utilidad, tanto para el investigador, docente que se dedica al estudio de
enfermedades de cultivos de importancia económica en Colombia quienes
actúan como observadores para atender las necesidades del productor.
1. INTRODUCCION
Los hongos son los mayores causantes de pérdidas en cultivos de interés
económico en Colombia, por lo tanto de ahí se deriva la importancia del su
estudio de su estudio, de manera que sea posible realizar aislamientos que
permitan su óptimo crecimiento y conocer sus características fisiológicas y
biológicas, utilizando no solamente medios que permitan su crecimiento
micelial sino promover la formación de sus estructuras reproductivas que
faciliten
no
solamente
su
identificación,
sino
también
estudiar
su
comportamiento durante el proceso de interacción entre la planta y el ambiente,
mediante el uso de medios específicos.
Entre las causas principales de enfermedades en las plantas están los factores
abióticos como la humedad, luz, temperatura, oxígeno, pH y nutrientes, y
bióticos como bacterias, hongos, virus, protozoos, nematodos, insectos y otras
plantas parasitas. Estos últimos factores causan daños en cualquier estructura
de la planta (raíz, tallo, hojas, flores o fruto), ocasionando enfermedades como
pudrición de la raíz, manchas foliares, tizones, royas, carbones y antracnosis,
entre otras.
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A diferencia del trabajo con las bacterias, sólo mediante la observación directa
de las características del hongo y su inoculación posterior en la planta sana,
podemos identificar el agente causante de una enfermedad fungica. Los
hongos fitopatogenos han sido observados haciendo raspados o cortes finos de
los tejidos afectados, para la identificación y clasificación taxonómica muchas
veces se hace necesario aislarlos y estudiarlos posteriormente en el
laboratorio.
Una de las tareas más importantes y necesarias para el investigador es lograr
el cultivo puro de un hongo, ya sea para su diagnostico o para el estudio de
patogenicidad generada en la planta, o para evaluar la resistencia varietal de
un cultivo en cuestión. La tarea se dificulta por la abundancia de
microorganismos que a menudo presentan requerimientos nutricionales
similares. Al realizar el aislamiento de un hongo, aparecen frecuentemente
muchos organismos no deseados que ejercen una actividad negativa sobre los
aislamientos por competencias no deseadas para el organismo de interés, ya
que otros organismos se desarrollan en los medios de aislamiento con mayor
rapidez por ser menos exigentes en su alimentación, mientras que los
patógenos no se desarrollan o lo hacen con dificultad. Para restringir el
desarrollo de microorganismos no deseados, se han desarrollado inhibidores
que permitan disminuir su actividad, tales como la modificación del pH y los
niveles de sustancias nutritivas en el medio, o la adición de antibióticos,
sustancias tóxicas entre otros.
La ausencia
de una guía que permita recopilar toda la información acerca de
los medios de cultivo usados en la identificación de hongos patógenos, es el
objetivo principal para la realización de esta revisión preliminar. Este
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documento realiza una revisión bibliográfica de manera que logra compilar
algunos medios de cultivo más importantes así como la composición,
preparación y empleo orientado hacia el cultivo, aislamiento e identificación de
los principales hongos patógenos que afectan cultivos de importancia
económica en Colombia.
El presente trabajo reúne y cita brevemente en la primera parte las
características generales de los hongos patógenos como su nutrición y
crecimiento, estructuras somáticas y reproducción, así como también su
clasificación taxonómica. En la segunda parte se presentan las características
de los medios de cultivo de uso común, algunos de los usados para el
aislamiento de microorganismos que se encuentran en semillas, agua y en la
tercera y última parte se incluyen los medios correspondientes para los
principales patógenos que ocurren sobre cultivos especies cultivadas de
importancia económica.
A este manual se recurrirá para la consulta de medios generales y específicos
de hongos fitopatógenos que puedan darnos precisión al diagnostico de las
enfermedades de las plantas, así como para los procedimientos
de
preparación que se lleven a cabo en el laboratorio para el aislamiento y será un
aporte para todas las personas interesadas en el área de la fitopatología.
2. JUSTIFICACION
El diagnostico de laboratorio es esencial para la determinación de la
enfermedad y necesario cuando se trata de establecer la identidad de un
agente causal. Los medios de cultivo constituyen una parte importante en el
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análisis, ya que permiten el aislamiento y el cultivo de los agentes causales de
enfermedades.
Actualmente en los laboratorios de investigación y de análisis de muestras no
se cuenta con una recopilación general de recursos bibliográficos sobre los
medios de cultivo de interés en el área de la fitopatología, es así como surge
este compilación el cual colecciona toda la información acerca de los medios
de cultivos específicamente de los microorganismos pertenecientes a los
phylums Ascomycetes, Deuteromycetes y Oomycetes causantes de grandes
pérdidas en cultivos de importancia económica en nuestro país.
El presente trabajo pone a disposición de los profesionales, fitopatólogos,
técnicos, estudiantes y entidades de apoyo un instrumento que sirva de
orientación y que sea material de consulta sobre los medios de cultivo que
existen y son utilizados para el aislamiento de hongos fitopatógenos de
importancia en Colombia.
3. MARCO TEORICO
3.1. LOS HONGOS FITOPATOGENOS
Los hongos y las bacterias son los dos principales grupos de organismos cuya
forma de vida predominante es saprofita y que obtienen sus nutrientes por la
secreción de enzimas extracelulares en el medio en que se desarrollan. En la
mayoría de los casos, son incapaces de atacar a organismos vivos debido a la
presencia de barreras físicas o químicas. Sin embargo, algunos han superado
esas barreras y pueden atacar a plantas o animales vivos. Los hongos, con su
amplia gama de enzimas degradadoras de carbohidratos, son más importantes
11
en las plantas, mientras que las bacterias, la mayoría de las cuales muestran
una mayor efectividad en la degradación de las proteínas, son más importantes
como patógenos de animales. Los hongos son quizá aún los fitopatógenos más
importantes, aunque con el desarrollo de fungicidas eficientes y variedades
resistentes están adquiriendo una importancia similar a los virus, que rara vez
pueden controlarse mediante cualquier método, (Manners, 1996).
3.1.1. CARACTERISTICAS GENERALES
Los hongos constituyen un grupo de microorganismos carentes de clorofila,
pero recuerdan a las plantas verdes ya que generalmente tienen una pared
celular
y
son
inmóviles,
aunque
algunos
pueden
presentar
células
reproductivas móviles, la mayoría de hongos se reproducen mediante esporas.
Sin embargo, no poseen tallos, raíces ni hojas, ni presentan un sistema
vascular desarrollado como tienen las plantas superiores. Los hongos son
generalmente filamentosos y casi todos multicelulares, además sus núcleos
pueden ser observados con facilidad. Sus estructuras somáticas, con algunas
excepciones, tienen una ligera diferenciación y prácticamente no presentan
división en sus funciones. (Manners, 1996).
Los filamentos que constituyen el cuerpo de los hongos aumentan de tamaño
por crecimiento apical, lo que los diferencia de las bacterias. Estos filamentos
pueden ser septados o no y se les denomina hifas, las cuales al agruparse
constituyen el micelio.
La composición de la pared celular es muy variable en los diferentes hongos y
algunas veces aun en el mismo individuo en diferentes fases de su ciclo vital.
Los principales componentes de la pared son varios tipos de carbohidratos:
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celulosa, pectosa, callosa, quitina, etc. los cuales pueden presentarse solos o
mezclados entre ellos o con otras sustancias.
La presencia de celulosa, la cual predomina en los hongos inferiores, puede ser
detectada por tratamiento con cloroioduro de zinc, pero algunas veces la
reacción queda encubierta porque tienen ciertos depósitos de lípidos en la
parte exterior de la célula, los cuales deben disolverse primero, como sucede
en Monoblepharia.
(Manners, 1996).
En los hongos Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes, y los más
evolucionados de Ficomycetes, no se detecta celulosa en la pared celular pues
esta ha sido reemplazada por otros carbohidratos, principalmente quitina, que
la cual se encuentra acompañada de otros componentes formando así la pared
celular. Además, pueden presentarse otras sustancias como carbonato de
calcio y otras sales. (Manners, 1996).
3.1.1.1. NUTRICION Y CRECIMIENTO
Los hongos obtienen sus alimentos propagándose en organismos vivos, como
parásitos, o descomponiendo la materia orgánica como saprofitos. La mayoría
de los hongos conocidos, sean estos parásitos o no, son capaces de vivir sobre
materia orgánica muerta, como lo muestra el hecho de que pueden ser
cultivados artificialmente sobre medios sintéticos.
Los hongos que viven sobre materia orgánica muerta y que son incapaces de
infectar tejidos vivos se denominan saprofitos obligados. Aquellos capaces de
causar enfermedades o de vivir sobre materia orgánica muerta, de acuerdo con
las circunstancias, se denominan parásitos facultativos o saprofitos facultativos,
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según prevalezca un estado u otro, y los que solo pueden vivir de protoplasma
vivo, parásitos obligados. (Manners, 1996).
El organismo infectado por un parasito es conocido como hospedante. Es
probable que cuando se sepa más acerca de la fisiología de los hongos
seremos capaces de idear medios sintéticos sobre los cuales crezcan los
llamados parásitos obligados.
Los hongos difieren de las plantas verdes en que requieren alimentos
elaborados para vivir y son incapaces de fabricarlos ellos mismos. Los
diferentes hongos tienen distintos requerimientos de alimentos. Algunos son
omnívoros y pueden subsistir sobre cualquier cuerpo que contenga materia
orgánica; otros son más estrictos en su dieta y unos pocos –los parásitos
obligados- no solo requieren protoplasma vivo para alimentarse sino que son
altamente especializados para las especies plantadas y aun para las
variedades del hospedante que parasitan. (Manners, 1996).
Las superficies de las hojas y otras partes de las plantas portan trazas de
nutrientes exudados de las células epidérmicas. Cuando los saprofitos son
capaces de crecer sobre estas porciones se dice que son epifilos, los cuales
producen trastornos al vegetal o reducen el porcentaje de luz aprovechable por
este para la fotosíntesis y dificultan el intercambio gaseoso, como sucede con
el género Capnodium. (Manners, 1996).
A veces resulta una intima asociación entre el hongo y la planta,
beneficiándose ambos; esta condición se llama simbiosis o parasitismo
controlado. Ejemplo de esto son los líquenes y las micorrizas.
(Mayea y
Padrón, 1983).
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Un gran número de plantas en condiciones naturales presenta esta última
asociación, a la cual el hongo brinda una mayor capacidad para extraer
sustancias minerales deficitarias en el suelo con más eficacia que las raíces de
la propia planta. Si realizamos un corte a una de estas estructuras, podremos
ver muchas hifas intercelulares y micelios externos bien desarrollados que son
las micorrizas exotróficas. En otras pueden observarse las hifas sólo en el
interior de las células como por ejemplo, Rhizoctonia sp. en las orquídeas,
cuyas micorrizas se denominan entonces, endotroficas. Cuando se forman
masas muy ramificadas con vesículas en las células corticales más viejas
tenemos la micorriza arbuscular-vesicular. (Mayea y Padrón, 1983).
El equilibrio entre la condición de enfermedad o el mutuo beneficio es
controlado por condiciones externas. Se han hallado micorrizas aun en las
Pteridophytas fósiles, (Mayea y Padrón, 1983).
3.1.1.2. ESTRUCTURAS SOMATICAS
El talo de los hongos consiste típicamente en hilos o filamentos microscópicos,
los cuales se ramifican en todas las direcciones. Cada uno de estos filamentos
es conocido como hifa, la cual es tubular y esta hecha de una pared fina,
transparente a partir de una capa de protoplasma que varía en grosor.
Dependiendo de las especies, el protoplasma puede ser continuo o puede ser
interrumpido a intervalos irregulares por paredes trasversales, las cuales
dividen la hifa en células. Las paredes trasversales son llamadas septos. En las
formas septadas, los protoplasmas de cada lado de un septo están conectados
por medio de un poro central. Las hifas que no tienen septos son llamadas
aseptadas, cenocíticas o continuas. Comúnmente se encuentran vacuolas,
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gotitas de grasa y otras inclusiones en el citoplasma. La masa de hifas que
constituye el talo de un hongo es llamado micelio. El micelio de algunos hongos
superiores puede dar lugar a cuerdas gruesas, los rizomorfos, donde las hifas
pierden su individualidad y forman tejidos complejos que exhiben una división
del trabajo. Esta masa en forma de cuerda, tiene una corteza gruesa, dura y un
extremo de crecimiento cuya estructura recuerda el ápice de una raíz.
(Manners, 1996).
Los rizomorfos son resistentes a condiciones adversas y permanecen latentes
hasta que vuelven las condiciones normales. El crecimiento se reanuda
entonces y el rizomorfo alcanza una gran longitud dentro del hospedante
desarrollándose entre las células (intercelular) o penetrando en ellas
(intracelular). Las hifas intracelulares de muchos hongos, especialmente de los
parásitos obligados de plantas, obtienen nutrientes a través de haustorios,
órganos de absorción especializados, que el hongo introduce en las células de
la planta hospedante a través de un pequeño poro abierto en la pared celular.
Los haustorios son excrecencias de las hifas somáticas y pueden adoptar la
forma de nudo, de lanza o ser ramificados. (Manners, 1996).
Las hifas de los hongos saprófitos se ponen en íntimo contacto con el sustrato
y obtienen los alimentos por difusión directa a través de las paredes hifales, y
causan la desintegración de la materia orgánica que utilizan para su nutrición.
El micelio de un hongo comienza generalmente como un tubo germinativo corto
que emerge de una espora en germinación. Las esporas son pequeñas
unidades de propagación producidas por muchos hongos, y sirven para la
perpetuación de la especie. (Manners, 1996).
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Durante ciertos estados del ciclo de vida de muchos hongos, el micelio se
organiza en tejidos flojos o compactamente trenzados, que se distinguen de las
hifas sueltas que ordinariamente componen el talo. Se usa el término
plecténquima para designar todos los tejidos fungosos y, dentro de él, existen
dos tipos generales: prosénquima flojamente entrelazado, en el que las hifas
componentes quedan más o menos paralelas y sus células típicamente
alargadas se distinguen fácilmente como tales y el pseudoparénquima, que
consiste en un tejido formado por células más o menos isodiamétricas u ovales,
agrupadas estrechamente, que recuerdan las células del parénquima de las
plantas superiores. En este tipo de tejidos fungosos las hifas han perdido su
individualidad, y no son fácilmente distinguibles como tales. (Agrios, 2005)
El prosénquima y el pseudoparénquima componen varios tipos de estructuras
somáticas y reproductivas que aparecen en muchos hongos: el estroma y el
esclerocio. Un estroma es una estructura somática compacta y similar a un
colchón sobre la cual se forman usualmente las fructificaciones, y el esclerocio
un cuerpo de reposo, resistente a condiciones desfavorables, que pueden
permanecer latente por largos periodos y germinar cuando se reanuden las
condiciones favorables, (Mayea et al, 1983 y Agrios, 2005).
3.1.1.3. REPRODUCCION
Los hongos se reproducen principalmente mediante esporas. Las esporas son
estructuras reproductoras o especializadas para la propagación del hongo, que
constan de una o varias células. Estas estructuras pueden formarse
asexualmente (mediante la separación de pequeños fragmentos del micelio en
esporas) o ser el resultado de un proceso sexual. (Agrios, 2005)
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En los hongos inferiores, las esporas asexuales se forman en el interior de un
saco denominado esporangio y son diseminadas en el momento en que se
rompe esta estructura o a través de una abertura que posee. Algunas de esas
esporas se mueven mediante flagelos y se les denomina zoosporas; otras
esporas asexuales denominadas conidios se desprenden de las células
terminales o laterales de hifas especializadas denominadas conidióforos. En
algunos hongos, las células intercalares o terminales de una hifa se alargan,
están rodeadas por una pared densa y se separan para formar clamidosporas.
En otros grupos de hongos, las esporas asexuales (conidios) se forman en el
interior de estructuras de pared gruesa denominadas picnidios. (Agrios, 2005)
La reproducción sexual, o los procesos que se asemejan a ella, se presentan
en la mayoría de los grupos de hongos. En algunos de ellos, un par de células
(gametos) de tamaño y forma semejante se fusionan y producen un cigoto,
denominado zigospora. En otros grupos, los gametos son de tamaño distinto y
al cigoto que forman se denomina oospora; algunos hongos, no se forman
gametos definidos, y en lugar de ello un micelio se fusiona con otro micelio
compatible. La Phylum Ascomycetes produce habitualmente ocho esporas
sexuales en el interior del cigoto (el asca) y a esas esporas se les denomina
ascosporas. Los hongos de la Phylum Basidiomycetes forman sus esporas
fuera del cigoto (denominada basidio) y a esas esporas se les denomina
basidiosporas. (Agrios, 2005)
Hasta la fecha no se sabe que los hongos imperfectos (Phylum Fungi
Imperfecti) se reproduzcan sexualmente, debido a que este fenómeno no se
presenta en este amplio grupo de hongos o a que aun no se ha podido
descubrir en ellos.
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La fusión de los núcleos sexuales del cigoto genera un núcleo diploide (2N), las
primeras divisiones de este núcleo son de tipo meióticas, de ahí que el hongo
contenga núcleos haploides (1N) durante todo su ciclo de vida, excepto en el
momento en que se han fusionado los núcleos gaméticos. Sin embargo, en
algunos grupos de hongos, en particular en los basidiomycetes y en menor
grado en los ascomycetes, las células de todo el micelio o de ciertas partes de
él contienen un par de núcleos haploides, los cuales se mantienen separados
en el interior de la célula. A dicho micelio se le denomina dicariótico, pero se
comporta de manera bastante semejante a como lo hace un micelio diploide
(en que ambos núcleos se mantienen fusionados). (Agrios, 2005)
En la mayoría de los hongos, los gametos masculino y femenino se forman en
un mismo micelio (como es el caso de los hongos hermafroditas). Cuando los
gametos masculinos fecundan a los femeninos del mismo micelio, al hongo se
le denomina homotálico. Sin embargo, en la mayoría de los casos, los gametos
masculinos fecundan únicamente a los gametos femeninos de otro micelio
sexualmente compatible por lo que se dice que el hongo es heterotálico,
(Agrios, 2005).
3.2. CLASIFICACION TAXONOMICA
La clasificación de los hongos presenta innumerables dificultades, pero el
estudiante principiante no necesita, por el momento, hacerse cargo de ellas. Es
bueno aclarar que no todo esta establecido en micología, y que las diferencias
de opinión entre los micólogos sobre la clasificación son tan numerosas y, a
menudo, tan grandes, que en la literatura especializada se encontraran serias
discrepancias. Tales diferencias de clasificación son originadas por las distintas
19
interpretaciones de los datos fragmentarios de que se dispone sobre la
estructura, desarrollo y fisiología de los hongos, y habrá de continuar existiendo
hasta que se cubran los claros de nuestro conocimiento.
La taxonomía tiene un doble propósito: primero, nombrar los organismos de
acuerdo con algún sistema internacionalmente aceptado, de manera que, del
modo menos confuso, los micólogos puedan intercambiar sus observaciones
sobre determinados hongos; segundo, indicar, tanto como sea posible, las
mutuas relaciones de los hongos y también sus relaciones con otros
organismos. A medida que aumenta el conocimiento, nuestra clasificación va
cambiando; los nombres de los organismos permanecen no permanecen
estables, ya que a medida que conocemos nuevos hechos acerca de los
mismos, se hace necesario ir modificando nuestros conceptos sobre sus
relaciones, lo que ha su vez demanda la reclasificación y el cambio de nombre,
(Alexopoulos, 1996).
3.2.1. CLASIFICACION DE LOS HONGOS FITOPATOGENOS
Los hongos y Chromystas que producen enfermedades en las plantas
constituyen un grupo diverso debido a su abundancia y diversidad, aquí solo se
presentará una clasificación de algunos de los géneros , que son considerados
en esta recopilación preliminar, sin tener en cuenta los biotrofos o parásitos
obligados. patógenos mas importantes.
3.2.1.1. HONGOS INFERIORES
Phylum: OOMYCETES. (Mohos acuáticos). Tienen un micelio alargado.
Producen zoosporas en zoosporangios. Las oosporas se forman por la fusión
de gametos morfológicamente distintos. (Alexopoulos, 1996).
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Familia: Pythiaceae
Géneros: Pythium produce el ahogamiento de las plántulas, pudrición de
semillas y raíces y el tizón algodonoso de los céspedes.
Phytophthora. P. infestans produce el tizón tardío o “gota de la papa” y otras
especies que producen además de las pudriciones de la raíz, pudriciones en el
tercio inferior de numerosas plantas y en algunos frutos.
Phylum: ZYGOMYCETES. (Mohos del pan). Hongos terrestres. Producen
esporas asexuales no móviles en esporangios. No forman zoosporas.
Orden: Mucorales. Producen zigosporas. Las esporas asexuales no móviles se
forman en esporangios terminales.
Géneros: Rhizopus sp. produce la pudrición blanda de los frutos y hortalizas.
Choanephora. C cucurbitarum produce la pudrición blanda de la calabaza
(Alexopoulos, 1996).
3.2.1.2. HONGOS SUPERIORES
Phylum: ASCOMYCETES (Hongos de saco). Producen grupos de ocho
esporas asexuales, denominadas ascosporas, en el interior de un saco
denominado asca.
SubPhylum: EUASCOMYCETES. Las ascas se forman en ascocarpos.
Serie: PYRENOMYCETES (Hongos periteciales). Las ascas se forman en
cuerpos fructíferos que presentan una abertura denominada ostiolo (peritecios).
Orden: Sphaeriales sp. los peritecios poseen paredes firmes y colores oscuros.
Géneros: Ceratocystis. C. ulmi produce la enfermedad del olmo Holandés.
Diaporthe sp. produce el tizón de la vaina del frijol, la melanosis de los cítricos y
la pudrición del fruto de la berenjena.
Endothia. E. parasítica produce el tizón del castaño.
Glomerella. G. cingulata produce manchas antracnosis y la pudrición amarga
del manzano.
Gnomonia sp. produce la antracnosis o mancha foliar de varias plantas.
Rosellinia sp. produce las enfermedades de la raíz de la vid y de los árboles
frutales.
21
Orden: Hypocreales. Los peritecios son de colores claros, rojos o azules.
Géneros: Claviceps. C. purpurea produce el cornezuelo del centeno.
Gibberella sp. ocasiona la pudrición del pie o tallo del maíz y de pequeños
granos.
Nectria sp. produce el cáncer del tallo y rama de los arboles. (Alexopoulos,
1996).
Serie: PSEUDOSPHAEROMYCETES. (Hongos ascostromáticos). Presentan
estromas en forma de peritecio que presentan ascas en cavidades separadas o
en grandes cavidades.
Orden: Myriangiales. Con cavidades dispuestas a varios niveles y que
contienen ascas individuales.
Género: Elsinoe sp. produce las antracnosis de la vid y de la frambuesa y la
sarna de los cítricos.
Orden: Dothideales sp.. Con cavidades dispuestas en una capa basal, las
cuales contienen muchas ascas. Los peritecios carecen de pseudoparafisas.
Géneros: Dibotryon. D. morbosum produce la modulación negra de las ramas
en cerezos y ciruelos.
Dothidella. D. ulei ocasiona la mancha foliar de los arboles del caucho.
Guignardia. G. bidwellii produce la pudrición negra de las uvas.
Mycosphaerella sp. produce las manchas foliares de muchas plantas.
Orden: Pleosporales. Con cavidades dispuestas en una capa basal, las cuales
contienen muchas ascas. Los peritecios presentan pseudoparafisas.
Géneros: Ophiobolus. O. graminis produce la enfermedad del pie del trigo.
Physalospora. P. obtusa produce la pudrición negra de las manzanas.
Venturia. V. inaequalis ocasiona la roña de la manzana.
Serie: DISCOMYCETES (Hongos de copa). Las ascas se forman en la
superficie de apotecios carnosos en forma de copa o de plato.
Orden: Helotiales. Las ascas liberan sus esporas a través de una perforación
apical y circular. (Alexopoulos, 1996).
Géneros: Coccomyces. C. hiemalis produce la mancha foliar del cerezo.
Diplocarpon. D. rosae produce las manchas negras de las rosas.
22
Lophodermium sp. produce el tizón de las agujas del pino.
Monilinia. M. fructicola produce la mancha parda de los frutos de hueso.
Rhytisma. R. acerium produce la mancha alquitranada de las hojas de arce.
Sclerotinia. S. sclerotiorum produce la pudrición blanda aguanosa de las
hortalizas.
Orden: Pezizales. Las ascosporas se liberan a través de una estructura en
forma de tapa o cápsula que se localiza en la punta del asca.
Género: Pseudopeziza. P. medicaginis produce la mancha foliar de la alfalfa.
Phylum: FUNGI IMPERFECTI O DEUTEROMYCETES. (Hongos asexuales).
Carecen de estructuras o reproducción sexual o no se sabe que las presenten.
Orden: Sphaeropsidales. Las esporas asexuales se forman en picnidios.
Géneros: Ascochyta. A. pisi produce el tizón del chícharo.
Coniothyrium sp. produce el tizón del tallo de la frambuesa.
Cytospora sp. ocasiona el cáncer del durazno y otros arboles (Valsa representa
su etapa sexual).
Diplodia. D. zeae produce la pudrición del tallo y la mazorca del maíz.
Phoma. P. lingam ocasiona la pierna negra de las crucíferas.
Phomopsis sp. produce el tizón y el cáncer del tallo de varios arboles.
Phyllosticta sp. produce las manchas foliares de muchas plantas.
Septoria. S. apii produde el tizón tardío del apio.
Orden: Melanconiales. Las esporas asexuales se forman en un acervulo.
Géneros: Colletotrichum ocasiona la antracnosis de muchas plantas de cultivo.
Coryneum. C. beijerincki produce el tizón de los frutos de hueso.
Cylindrosporium sp. produce manchas foliares en muchas Phylums de plantas.
Gloeosporium sp. muy parecido a Colletotrichum sp.; produce antracnosis en
muchas plantas.
Marssonina sp. ocasiona el tizón de las ramas y hojas del álamo, la quemadura
de las hojas de fresa y la antracnosis de los nogales.
Melanconium. M. fuligenum poduce la pudrición amarga de la vid.
23
Sphaceloma sp. produce la antracnosis de la vid y de la frambuesa.
Orden: Moniliales. Las esporas asexuales de forman sobre las hifas (o en su
interior) del hongo que se encuentran expuestas libremente a la atmosfera.
Géneros: Alternaria sp. produce manchas foliares y tizones en muchas
plantas. (Alexopoulos, 1996).
Aspergillus sp. produce la pudrición de las semillas almacenadas.
Botrytis. B. cinérea produce el moho gris y los tizones de muchas plantas.
Cercospora sp. una especie de este género produce el tizón temprano del apio.
Cladosporium. C. fulvum produce el moho de las hojas del tomate.
Fusarium sp. produce el marchitamiento y la pudrición de la raíz de muchas
plantas anuales, así como el cáncer de arboles forestales.
Fusicladium sp. produce la roña de la manzana (Venturia representa su etapa
sexual).
Graphium. G. ulmi produce la enfermedad del olmo holandés (Ceratocystis
representa su etapa sexual).
Helminthosporium sp. produce el tizón de los cereales y enfermedades de los
céspedes.
Penicillium sp. produce la pudrición de los frutos y otros órganos carnosos
debido a los mohos azules.
Pyricularia sp. produce el tizón del arroz y la mancha gris foliar de los
céspedes.
Thielaviopsis. T. basicola produce la pudrición negra de la raíz del tabaco.
Verticillium produce la marchitez de muchas plantas anuales y perennes.
Orden: Mycelia Sterilla. No se ha observado o es muy poco frecuente la
formación de esporas asexuales o sexuales en este grupo de hongos.
Géneros: Rhizoctonia sp. produce las pudriciones de la raíz de la corona de
las plantas anuales y mancha parda de los céspedes (su etapa perfecta
corresponde a Thanatephorus).
Sclerotium sp. produce las pudriciones de la raíz y del tallo de muchas plantas
(su etapa perfecta corresponde a Pellicularia sp.).
24
3.3. Características y estructuras de los hongos inferiores
3.3.1. Phylums, Oomycetes y Zygomycetes
Los hongos de la Phylum Oomycetes poseen un micelio cenocítico, alargado,
producen zoosporangios con zoosporas que pueden ser piriformes o
reniformes dependiendo del orden a que pertenezcan, y presentan dos flagelos
de dos tipos, uno tipo látigo y el otro tipo pincel. Las esporas sexuales de
reposo u Oosporas se forman por la fusión de dos gametos morfológicamente
distintos, (Saldarriaga, 2001).
Los hongos de la Phylum Zygomycetes tienen micelio cenocítico, muy
ramificado compuesto por hifas alimentadoras e hifas reproductoras. La
reproducción asexual se realiza mediante esporas no móviles producidas por
esporangios, (Pérez, 1993). Su espora de resistencia es la Zygospora formada
por la unión de dos gametos morfológicamente idénticos, (Agrios, 1995).
3.4. Características y estructuras de los hongos superiores
3.4.1. Subdivisión DEUTEROMYCOTINA
La subdivisión Deuteromycotina comprende aquellos hongos que carecen de
estructuras o reproducción sexual. Son considerados estados conidiales de la
subdivisión Ascomycotina y raramente de la subdivisión Basidiomycotina,
(Gonzalez, 1989). Poseen micelio septado, ramificado y frecuentemente
abundante. Presentan varios tipos de cuerpos fructíferos como Acérvulos,
Picnidios, Esporodoquio, Sinema formado por la unión de conidióforos, y
también presenta conidióforos libres, (Barnett, 1972). Dentro de esta
subdivisión se presenta la Phylum Agonomycetos o micelia esterilia
cuyos
25
hongos no presentan conidias, ellos son Rhizoctonia y Sclerotium. El tipo de
cuerpo fructífero es una de las características utilizadas para la clasificación
taxonómica, (Finch y Finch, 1974).
3.4.2. Subdivisión ASCOMYCOTINA
La subdivisión Ascomycotina posee micelio septado, ramificado. Produce
esporas en estructuras llamadas ASCAS. Presentan varios tipos de cuerpos
fructíferos como Peritecios, Apotecios, Cleistotecios y Ascostromas, en ellos se
encuentran las ascas con ascosporas generalmente en número de ocho. Una
excepción a esto es el hongo Taphrina deformas que no forma cuerpo fructífero
y las ascas se encuentran desnudas, (Hanlin, 1990).
3.5. MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo son mezclas de sustancias que se usan para el
aislamiento y desarrollo de hongos, bacterias y otros microorganismos. La
mayoría de los hongos fitopatógenos se pueden cultivar de manera
relativamente sencilla en medios adecuados. Sin embargo existen grupos de
patógenos denominados parásitos obligados cuyo cultivo aún no se ha logrado
a menos que se inoculen en plantas vivas. (Ríos, et.al 2008)
3.5.1. CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo requieren de ciertas características mínimas para lograr
exitosamente el desarrollo de los hongos y entre las más importantes se
encuentran:
1. El medio deberá contener elementos nutritivos tales como: fuentes de
carbono, nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio, cobre y molibdeno.
26
También pueden ser necesarias algunas vitaminas y otras sustancias
que se hallan presentes en los materiales naturales o artificiales que
componen los medios. (Ríos, et.al 2008)
2. El medio no deberá deshidratarse fácilmente, por que se evita
manejándolo en recipientes adecuados que además permitan su manejo
en condiciones estériles es decir, evitando contaminaciones. El oxigeno
es necesario en todos los casos por lo que deberá permitirse la
aireación. Ya sea en las cajas de Petri o en tubos de cultivo. (Ríos, et.al
2008)
3. La mayoría de los medios de cultivo para hongos requieren esterilización
antes de usarse, lo que generalmente se logra mediante calor húmedo
usando autoclave.
4. La mayoría de los hongos crecen bien a temperatura de 20 a 35 oC, pero
existe mucha variación entre grupos o especies. La temperatura óptima
para el desarrollo de la enfermedad que causen puede servir como
punto de referencia para la temperatura de incubación del hongo en el
medio de cultivo.
5. La mayoría de los hongos crecen bien a pH
de 5 a 6, pero hay
excepciones. La temperatura y/o pH óptimo para la esporulación puede
ser distinto que para el crecimiento del micelio. En ocasiones es
conveniente agregar pequeñas cantidades de ácido láctico para eliminar
bacterias contaminantes en el medio, pues estas generalmente no
toleran la acidez, permitiendo el crecimiento fungico.
6. El crecimiento del micelio y sobre todo la esporulación de los hongos en
el medio, esta muy influido por la luz. Muchos hongos esporulan
27
fácilmente sin necesidad de luz artificial o aun en plena oscuridad, pero
otros requieren condiciones especiales de calidad y de luz. Este factor
puede ser clave cuando se requieren altas cantidades de esporas con
fines de investigación o para identificar alguna especie en particular.
El medio de cultivo sustituye parcialmente las propiedades nutricionales del
hospedante o sustrato natural del hongo a cultivar. La utilidad del medio es
proporcionar energía al microorganismo, para que desarrolle en la forma más
normal posible. (Ríos, et.al 2008)
Por su composición nutritiva los medios de cultivo pueden ser:
1. Medios naturales. Están compuestos por materiales enteramente
naturales, tales como partes de plantas, malta, levadura etc… se
requieren en forma de extractos o simplemente esterilizando las partes
vegetales con calor u otro método. Aunque se usan poco, pueden ser
superiores a otros medios sobre todo en el caso de hongos de difícil
esporulación.
2. Medios semisintéticos. Están compuestos parcialmente por materiales
naturales y sintéticos, el ejemplo mas común es el de agar papa
dextrosa , agar V8, agar harina de maíz, son los más usados.
3. Medios sintéticos. Se conoce perfectamente su composición, ejemplo
medio de Komada, para Fusarium oxisporum, por su consistencia los
medios de cultivo pueden ser:
28
a) Sólidos. Contienen agentes solidificantes principalmente el agar,
proporción de 1 a 3%, el agar esta compuesto por una mezcla de
carbohidratos complejos y se obtiene a partir de algas.
b) Semisólidos. Aunque generalmente se usan poco en micología, estos
se obtienen bajando la concentración del agar o usando gelatina como
agente solidificante.
c) Líquidos. Se preparan sin agente solidificante. Se usan principalmente
para obtener altas concentraciones de esporas, ejemplo: papadextrosa. (Ríos, et.al 2008)
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General
Elaborar una recopilación de medios de cultivo de interés en la identificación de
hongos fitopatógenos mediante revisión de literatura en el área de la
fitopatología.
4.2. Objetivos Específicos
Realizar la selección de los hongos fitopatógenos de importancia en
Colombia teniendo en cuenta su clasificación taxonómica.
Seleccionar los medios de cultivo de uso más común como también de
medios específicos dentro de la práctica en el reconocimiento de hongos
causantes de enfermedades.
29
Determinar la composición, preparación y empleo de cada uno de
los medios seleccionados para el estudio fitopatológico.
5. METODOLOGIA
Como fuente inicial de consulta se revisaron algunos manuales de medios de
cultivo de varios autores, que recopilan
composiciones, para diferentes
microorganismos de acción patogénica, en referencias extraídas de revistas
internacionales; estos manuales actualmente se usan en los Laboratorios de la
Clínica de Plantas, de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de
Colombia, sede Bogotá, Laboratorio de Cuarentena Vegetal del Instituto
Colombiano Agropecuario, ICA, el Laboratorio de Fitopatología de la
Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, CORPOICA y algunos
de los que se encuentran en las bibliotecas institucionales y particulares; el
manual usado como guía fue el publicado por Tuite en 1989, que incluye gran
parte de los medios que se encuentran en numeral 7 de esta revisión. En el
caso de aquellos medios que se encontraron para géneros y especies de
microorganismos, se organizaron taxonómicamente de acuerdo con la
clasificación propuesta por Alexopolus (1996) en su libro de Micología y en el
texto Phytopathology de Agrios (2005).
Para seleccionar los medios específicos en el aislamiento de patógenos que se
presentan con frecuencia en los cultivos de importancia económica en el país
(Buriticá, 1998) como flores, frutales, hortalizas, arroz, palma africana, caña de
azúcar, entre otros (Ver anexo 2), se reviso el Directorio de enfermedades en
Colombia del fitopatólogo Pablo Buriticá Céspedes, publicado en el año 1999,
además de artículos sobre investigación fitopatólogia en Colombia.
30
6. RESULTADOS
A continuación se presentan algunos de los principales medios de cultivo
explorados, organizados de la siguiente manera: los de uso común en
aislamiento de microorganismos de acción patogénica que se encuentran en
suelo y cascarilla, los empleados en el aislamiento a partir de semillas, los de
uso general en los laboratorios dedicados a estudios fitopatológicos y varios de
los medios selectivos, usados en investigaciones sobre enfermedades y
patógenos específicos.
7. MEDIOS PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS A PARTIR DE
SEMILLAS
Estos medios son usados para el aislamiento de hongos fitopatogenos a partir
de semillas, los cuales proveen un soporte nutricional para garantizar la
viabilidad de hongo y así lograr su aislamiento.
AGAR PDTA
COMPOSICION
Papa-Dextosa
CANTIDAD
100 g
Tergitol
200 ppm
Neomicina
30 ppm
Agar-Agar
10 g
Agua Destilada
1L
Preparación: Disolver la papa dextrosa y el agar-agar en el agua destilada
calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de
presión agregar los demás componentes y servir.
31
AGAR TCV
Usado para la deteccion de Septoria spp. en semillas
COMPOSICION
CANTIDAD
Agar PDA
1L
Metil Tiofanato
0.02 g
Vancomicina
0.1 g
Tween
2 ml
Preparación: Autoclavar 1 l de Agar PDA y dejarlo enfriar hasta alcanzar una
temperatura de 60°C y agregar 5 ml de la solucion de metil tiofanato,
vancomicina y 4 gotas de Tween.
AGAR GUAYACOL
Medio para detectar Bipolaris (Helminthosporium) oryzae y Alternaria en
semillas de arroz.
COMPONENTES
Guaiacol
CANTIDAD
125 g
Estreptomicina
0.5 g
Agar-agar
5.0 g
Agua
1
L
Preparación: Disolver el guaiacol y el agar en un litro de agua destilada,
mezclar bien, esterilizar en autoclave, posteriormente adicionar la
estreptomicina, servir (Kamal,2009).
8. MEDIOS PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS A PARTIR DE
SUELO Y AGUA
Los medios que se presentan a continuación son usados para el aislamiento de
hongos fitopatogenos a partir de muestras de suelo y agua.
AGAR CLORURO DE SODIO - GLUCOSA - DICLORAN
32
Usado como medio selectivo para el aislamiento de Aspergillus flavus de suelo.
COMPOSICION
CANTIDAD
Peptona
5g
KH2PO4
1g
NaCl
30 g
Glucosa
10 g
MgSO4 x 7 H2O
0.5 g
Agar - agar
20 g
Agua destilada
1L
Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada y calentar
suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a
121°C/15 Lbs de presión, después agregar 50 mg de estreptomicina y servir.
AGAR DEXTROSA-PEPTONA-EXTRACTO DE LEVADURA (DPYA)
Para aislamiento y enumeración de hongos del suelo.
COMPOSICIÓN
CANTIDAD
Dextrosa
5g
KH2PO4
1g
Peptona
1g
MgSO4 x 7 H2O
NH4NO3
0,5 g
1g
Extracto de Levadura
2g
Propionato de Sodio
1g
Agar-Agar
20 g
Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada y calentar
suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a
121°C/15 Lbs de presión, después agregar 30 mg de estreptomicina y servir.
AGAR KRIGSVOLD Y GRIFFIN
33
Medio de cultivo semiselectivo para aislamientos de Cylindrocladium spp. del
suelo.
COMPOSICION
CANTIDAD
Sucrosa
10
g
KH2PO4
1
g
MgSO4.7H2O
0.5 g
Bacto oxgall
1.0 g
Peptona
15.0 g
Sulfato de estreptomicina
50.0 mg
Tetraciclina HCl
50.0 mg
Quintozene (PCNB)
75.0 mg
Agar
20.0 g
Agua destilada
1
L
Preparación: Disolver la sucrosa, el oxgall, la peptona, las sales y el agar en
un litro de agua destilada. Mezclar bien, esterilizar en autoclave, posteriormente
adicionar el sulfato de estreptomicina, la tetraciclina HCI y el quintozene y servir
(Plant Dis. Rep. 59:543).
AGAR EXTRACTO DE SUELO - ACIDO POLIGALACTURONICO
Usado para el aislamiento de Colletotrichum sp. del suelo.
COMPOSICION
K2HPO4
CANTIDAD
4g
Extracto de suelo
25 ml
KH2PO4
1.5 g
Acido poligalacturonico
Agua destilada
Agar - agar
10 g
1L
17 g
Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar
suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a
121°C/15 Lbs de presión, después agregar 30 mg de estreptomicina y servir.
(Sugar, 2006)
34
AGAR MARTIN
Usado para el aislamiento de hongos de muestras de suelo y agua.
RB - O
RB - M1
COMPONENTES
Agua destilada
1000 ml
1000 ml
Agar - agar
20 g
18 g
KH2PO4
1g
0,5 g
K2HPO4
MgSO4 x 7H2O
0,5 g
0,5 g
0,5 g
Peptona
5g
5g
Dextrosa
10 g
10 g
Extracto de levadura
0,5 g
Rosa bengala
0,033 g
0,05 g
sulfato de
estreptomicina
0,03 g
0,03 g
Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar
suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a
121°C/15 Lbs de presión, después agregar la estreptomicina y servir.
AGAR OAES
Usado para el aislamiento y recuento de hongos a partir de muestras de suelo.
COMPOSICION
CANTIDAD
Glucosa
5g
Extracto de levadura
2g
NaNO3
1g
MgSO4 x 7 H2O
0.5 g
KH2PO4
1g
Propionato de sodio
1g
Agar - agar
20 g
35
Agua destilada
1000 ml
Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar
suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a
121°C/15 Lbs de presión y servir.
AGAR PCNB
Aislamiento de Fusarium spp. a partir de muestras de suelo.
COMPONENTES
CANTIDADES
Peptona
15 g
KH2PO4
1,0 g
MgSO4 x 7H2O
0,5 g
Terraclor
0,5 g
Agar - agar
20 g
Clorotetraciclina HCL
50 mg
Sulfato de estreptomicina
100 mg
Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar
suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a
121°C/15 Lbs de presión, después agregar la estreptomicina y servir.
AGAR PEPTONA - ROSA BENGALA
Usado para aislamiento y recuento de hongos a partir de muestras de suelo.
COMPOSICION
CANTIDAD
Peptona
5g
Dextrosa
10 g
KH2PO4
20 g
MgSO4 x 7 H2O
1g
Rosa bengala
Agar - agar
Agua destilada
0.5 g
10 g
1000 ml
Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar
suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a
121°C/15 Lbs de presión, después agregar 30 mg de estreptomicina y servir.
36
AGAR SUCROSA - PEPTONA - DICLORAN
Usado para el aislamiento y recuento de Aspergillus flavus del suelo.
COMPOSICION
CANTIDAD
K2HPO4
0.5 g
Peptona
0.5 g
Sucrosa
20 g
Estreptomicina
50 mg
MgSO4 x 7 H O
0.5 mg
Extracto de levadura
0.5 mg
Rosa bengala
25 mg
Agar - agar
Agua destilada
17 g
1000 ml
Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar
suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a
121°C/15 Lbs de presión, después agregar la estreptomicina y servir. Ajustar el
pH 5.5 usando HCl 1 N o NaOH 1 N.
CALDO FRIES
Usado para aislamiento de hongos a partir de muestras de suelo
COMPONENTES
CANTIDAD
Tartrato NH4
5g
NH4NO3
1g
MgSO4 x 7 H2O
0,5 g
KH2PO4
1,3 g
K2HPO4
2,6 g
Sucrosa
30 g
Extracto de levadura
1g
Solucion Stock elementos traza
2 ml
Agua destilada
1000 ml
Solucion Stock de elementos traza
37
Li Cl
167 mg
CuCl2 x H2O
107 mg
H2MoO2
34 mg
MnCl2 x 4H2O
72 mg
CoCl2 x 4H2O
80 mg
Agua destilada
1000 ml
Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar
suavemente hasta disolverlos por completo, luego agregar la solución de
elementos traza disolver, llevar a autoclavar por 15 min a 121°C/15 Lbs de
presión y servir.
AGAR RB-M2
Usado para aislamiento de Thielaviopsis basicola de suelo. Este medio de
cultivo se siembra casi siempre por el método de estrías en superficie, a partir
de muestras de material vegetal o muestras de suelo contaminado.
COMPOSICION
Glucosa
CANTIDAD
10.0 g
Extracto de levadura
0.5 g
KH2PO4
0.5 g
Peptona
0.5 g
K2HPO4
0.5 g
MgSO4.7 H2O
0.5 g
Sulfato de estreptomicina
30.0 mg
Quintozene
500.0 mg
Nistatina
30.0 g
Agar-agar
20.0 g
Agua destilada
1
L
Preparación: Disolver la peptona, la glucosa, el extracto de levadura, las
sales y el agar en un litro de agua destilada. Mezclar bien, esterilizar en
autoclave, luego añadir el sulfato de estreptomicina, el quintozene y la
nistatina, ajustar el pH 7.4 y servir (Phytophatology, 54, 1475).
9. MEDIOS DE USO GENERAL
38
Estos medios de cultivos son los más usados a nivel general para el
aislamiento de los hongos induciendo esporulación ya sea para el aislamiento
a partir de tejidos enfermos, donde en algunos de ellos se pueden cambiar
algunas de sus características para favorecer o generar las condiciones
óptimas para el desarrollo del microorganismo patógeno hongo en estudio ya
sea modificando el pH o agregando antibióticos.
AGAR AVENA (OMA-OATMEAL AGAR)
COMPOSICION
CANTIDAD
Avena
30 g
Agar
15 g
Agua destilada
1000 ml
Preparación: Hervir la avena durante 1 hora en un litro de agua, colar gasa
agregar el agar, completar el litro de agua, autoclavar a 121°C por 15 min a 15
lbs de presión y servir.
AGAR EXTRACTO DE MALTA
COMPOSICION
CANTIDAD
Extracto de malta
20 g
Agar
15 g
Agua destilada
1000 ml
Preparación: Agregar el extracto de malta en el agua destilada calentar hasta
disolver completamente, agregar el agar, autoclavar a 121°C por 15 min a 15
lbs de presión y servir.
AGAR EXTRACTO DE MALTA – EXTRACTO DE LEVADURA
COMPOSICION
Extracto de malta
Extracto de levadura
CANTIDAD
30 g
2g
39
Fosfato de potasio (KH2PO4)
0.5 g
Sulfato de potasio penta hidratado (MgSO4.7H2O)
0.5 g
Agar
20.0 g
Agua destilada
1000 ml
Preparación: Agregar el extracto de malta, el extracto de levadura, las sales
de azufre y fosforo en el agua destilada calentar hasta disolver completamente,
agregar el agar, autoclavar a 121°C por 15 min a 15 lbs de presión y servir.
AGAR MIEL PEPTONA
COMPOSICION
CANTIDAD
Miel
60 g
Bactopeptona
10 g
Agar
25 g
Agua destilada
1000 ml
Preparación: Agregar el agar-agar en el agua destilada, agregar la miel y la
bactopeptona, autoclavar a 121°C por 15 min a 15 lbs de presión y servir.
AGAR PAPA – ZANAHORIA (PCA, POTATO CARROT AGAR)
COMPOSICION
CANTIDAD
Papa rallada
20 g
Zanahoria rallada
20 g
Agar-Agar
20 g
Agua destilada
1000 ml
Preparación: Hervir la papa y la zanahoria rayada en el agua destilada durante
1 hora, colar, agregar el agar, autoclavar a 121°C por 15 min a 15 lbs de
presión y servir.
AGAR PAPA DEXTROSA (PDA, POTATO DEXTROSE AGAR)
Es uno de los medios de mayor uso en los estudios fitopatologicos ya que
permite el crecimiento micelial de las mayoría de los microorganismos de
diferentes grupos taxonómicos; en algunos casos limita la esporulación de
algunos géneros por lo cual es necesario, esperar el crecimiento micelial y
40
luego usar medios que permitan el desarrollo reproductivo del microorganismo
en estudio.
COMPOSICION
Papa
CANTIDAD
200 g
Dextrosa
20 g
Agar-Agar
20 g
Agua destilada
1000 ml
Preparación: Lavar las papas, cortarlas en cubos y hervirlas en agua destilada
por 10 a 20 minutos, colar, agregar el agar-agar y completar a 1 litro,
autoclavar a 121°C por 15 min a 15 lbs de presión y servir.
AGAR AGUA (AA)
COMPOSICION
Agar- Agar
Agua destilada
CANTIDAD
15 g
1000 ml
Preparación: Disolver el agar-agar en el agua, autoclavar a 121°C por 15 min
a 15 lbs de presión y servir.
AGAR JUGO V8
COMPOSICION
CANTIDAD
Jugo V8
200 ml
CaCO3
3g
Agar
15 g
Agua destilada
100 ml
Preparación: Agregar el jugo V8, el CaCO3, el agar-agar en el agua destilada
calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C por 15 min a 15 lbs
de presión y servir.
10. MEDIOS SELECTIVOS
Para unificar los criterios, en esta revisión se ha adoptado la clasificación
propuesta por ALEXOPOULOS y MIMS (1996) la cual, además de ser
41
relativamente reciente presenta algunos grupos que se han mantenido unidos
pese a mostrar diferencias y se han clasificado en otro taxones con base en
criterios más lógicos.
Se mencionaran únicamente los phylums, ya en casos especiales se enfatizará
en mejor detalle los órdenes.
10.1.
PHYLUM Oomycetes
Esta phylum se caracteriza por poseer unas estructuras que permiten que sean
identificados a nivel de género, como son el esporangioforo y los esporangios.
También se caracterizan por poseer un micelio filamentoso, sin divisiones,
ramificado, que crece abundantemente sobre el sustrato, produce esporangios
y esporas con flagelos. En gran parte estos hongos presentan especies
acuáticas, los cuales se reportan como parásitos de algas, animales u otras
formas de vida acuática. Otras especies han ido adquiriendo con el tiempo la
habilidad de actuar como parásitos de plantas superiores y usan el viento como
medio para diseminar sus esporas o esporangios. Su reproducción sexual se
genera
por heterogametangios; el donador o gametangio masculino se
denomina anteridio, y el que actua como gametangio femenino o receptor se le
denomina oogonio, estos hematangios se fusionan para dar origen a la oospora
o espora sexual. Esta estructuralmente cuenta con una pared gruesa lo cual le
permite sobrevivir en el suelo o en residuos de cosecha durante períodos
críticos. La reproducción asexual es realizada mediante esporangios, los que
germinan mediante la emisión de un tubo germinativo o de forma indirecta en la
que se rompe el esporangio liberando zoosporas, esta germinación está
42
influenciada por temperatura inferiores a 12°C y humedad suficiente en el.
(Alexopoulos, J. 1996.)
GENERO: Pythium sp.
AGAR SEMILLAS DE CAÑAMO
COMPOSICION
Semillas de cáñamo
Agar-agar
CANTIDAD
100 g
20 g
Preparación: Hervir hasta ebullición las semillas de cáñamo en 1 litro de agua
destilada, filtrar, ajustar el volumen a 1 litro y adicionar el agar; autoclavar a
121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. Sembrar e incubar por 5-7 días a 21
°C.
AGAR SEMILLAS DE CÁÑAMO–EXTRACTO DE ZANAHORIA
COMPOSICION
CANTIDAD
Semillas de cáñamo
20 g
Extracto de zanahoria molida
100 g
Agar-agar
20 g
Preparación: Hervir las semillas de cáñamo en el litro de agua, adicionar el
agar y el extracto de zanahoria molida. Mezclar bien, esterilizar en autoclave a
121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.
AGAR REISHER
COMPOSICION
CANTIDAD
Sucrosa
0.1 g
L–asparagina
0.12 g
KH2PO4
30
mg
MgSO4. 7 H2O
20
mg
CaCl2
0,56 mg
MnCl2
2,88 mg
ZnCl2
1,67 mg
FeCl2
0,10 mg
43
EDTA
11,60 mg
Tiamina HCl
0,04 mg
Endomicina
5
mg
Sulfato de estreptomicina
50
mg
Agar-agar
Agua destilada
20
g
1
L
Preparación: Disolver en un litro de agua destilada la sucrosa, la asparagina,
el EDTA, la tiamina, los antibióticos y las sales. Mezclar bien y hervir,
autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. Ajustar el pH 7.4.
AGAR MRA
COMPOSICION
KH2PO4
CANTIDAD
30 mg
MgSO4 .7 H2O
20 mg
MnCl2
2.68 mg
FeCl2
0.1 mg
Sucrosa
410.0 mg
Tiamina HCl
40.0 mg
K2HPO4
30.0 mg
CaCl2
0.56 mg
ZnCl2
1.67 mg
EDTA
11.0 mg
L-asparagina
120 mg
Agar-agar
Agua destilada
20
g
1
L
Preparación: Disolver todos los componentes con el agar en agua destilada.
Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.
.
CALDO SCHIMITTHENNER'S.
COMPOSICION
Sucrosa
CANTIDAD
2.5 g
44
KH2PO4
150.0 mg
MgSO4.7 H2O
100.0 mg
Tiamina-HCl
2.0 mg
ZnSO4.7H2O
4.4 mg
MnCl2.4H2O
0.07 mg
CaCL2
FeSO4.7 H2O
55.0 mg
1.0 mg
Asparagina
270.0 mg
Colesterol
10.0 mg
Agua destilada
1
L
Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada. Mezclar bien,
autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.
AGAR EXTRACTO DE MALTA–DEXTROSA–PEPTONA
COMPOSICION
CANTIDAD
KH2PO4
1
MgSO4.7H2O
0.5 g
Peptona
1
g
Dextrosa
15
g
Extracto de malta
Agar-agar
Agua destilada
g
0.5 g
15
g
1
L
Preparación: Adicionar la dextrosa, la peptona, el extracto de malta, las sales
y el agar en agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de
presión y servir.
GENERO: Phytophthora sp.
MEDIO 3P
COMPOSICION
Extracto de Papa
Agar-Agar
Pimaricina
Penicilina
CANTIDADES
5g
10 g
100 ppm
50 ppm
45
Polimixina
50 ppm
Agua Destilada
1L
Preparación: Adicionar el extracto de papa, el agar-agar en agua destilada.
Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión, agregar los
antibioticos y servir. (Medina, FAO 2008)
MEDIO PV
COMPOSICION
Extracto de Papa
Agar-Agar
Pimaricina
Vancomicina
Agua Destilada
CANTIDADES
5g
10 g
100 ppm
200 ppm
1L
Preparación: Adicionar el extracto de papa, el agar-agar en agua destilada.
Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión, agregar los
antibioticos y servir. (Medina, FAO 2008)
MEDIO BNPRA + Hymexazol
COMPOSICION
PDA – Agar
Benomyl (50%)
Nistatina (2000 U/mg)
PCNB
Rifampicina
Ampicillin
Hymexazol
CANTIDADES
1%
10 μg/mL
25 μg/mL
25 μg/mL
10 μg/mL
500 μg/mL
25 ó 50 μg/mL
Preparación: Adicionar el PDA en agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a
121°C 15 min 15 lbs de presión, agregar los antibioticos el benomyl y servir.
(Medina, FAO 2008)
MEDIOS SELECTIVOS PARA P. cinnamomi
COMPOSICION
Extracto de Papa
Agar-Agar
Nistatina
PCNB
Estreptomicina
Rosa bengala
Agua Destilada
CANTIDADES
5g
10 g
100 U/mL
100 ppm
50 ppm
60 ppm
1L
Otras Concentraciones
Extracto de Papa
5g
46
Agar-Agar
Nistatina
Vancomicina
PCNB
Agua Destilada
10 g
50 ppm
100 ppm
10 ppm
1L
Preparación: Adicionar el PDA en agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a
121°C 15 min 15 lbs. de presión, agregar los antibióticos, el PCNB y servir.
(Medina, FAO 2008)
AGAR Mc INTOSH'S
COMPOSICION
CANTIDAD
KH2PO4
1
g
CaSO4.7 H2O
1
g
L–treonina
1
g
Sucrosa
20
g
MgSO4. 7 H2O
1.0 g
Tiamina HCl
0.02g
Micostatina
10.0 mg
Agar-agar
20.0 g
Agua destilada
1 L
Preparación: Disolver la sucrosa, la treonina, las sales y el agar en el agua
destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión. Agregar
la tiamina HCl, DL – treonina y micostatina luego servir. La micostatina primero
deber ser disuelta en dimetil sulfoxido (DMSO) (10 ug/ml DMSO al 0.5).
AGAR FRIJOL
COMPOSICION
CANTIDAD
Semillas de fríjol (Phaseolus vulgaris)
30 g
Agar
20 g
Agua
1 L
Preparación: Tomar las semillas de fríjol colocarlas en el aguas detilada a
calentar por 10 a 20 minutos, filtar con gasa y agregar el extracto de las
semillas en el litro de agua destilada con el agar, calentar hasta disolver
autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.
AGAR FRIJOL BLANCO
47
COMPOSICION
Frijol blanco
Glucosa
Agar-agar
CANTIDAD
50.0 g
2.5 g
20.0 g
Agua destilada
1 L
Preparación: Tomar las semillas de fríjol colocarlas en el aguas detilada a
calentar por 10 a 20 minutos, filtar con gasa y agregar el extracto de las
semillas en el litro de agua destilada con el agar y la glucosa, calentar hasta
disolver autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.
AGAR GLUCOSA–NITRATO–ESTEROL
COMPOSICION
CANTIDAD
Glucosa
5.4
g
NaNO3
1.5
g
MgSO4 x 7H2O
0.5
g
KH2PO4
1.0
g
Tiamina HCl *
2.0
ml
Agar-agar
17.0 g
Esterol
0.8 g
Agua destilada
1
L
* Preparar una solución stock de 1000 ppm.
Preparación: Disolver en el agua destilada la glucosa, la tiamina, las sales, el
esterol y el agar–agar, mezclar bien, hervir hasta disolver totalmente,
autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.
AGAR HENDRIX
COMPOSICION
CANTIDAD
Glucosa
5.4
g
KH2PO4
1.0
g
NaNO3
1.5
g
MgSO4.7H2O
0.5
g
Tiamina HCl
2.0
g
48
Agar-agar
Agua destilada
17.0
1
g
L
Preparación: Disolver todos los reactivos en un litro de agua destilada.
Mezclar y hervir hasta disolver completamente. Ajustar el pH a 6.0. Autoclavar
a 121°C 10 min 15 lbs de presión y servir. Una vez solidificado el agar, colocar
2 ml de una solución de esterol (20 g de esterol en 2 ml de eter) y extender
sobre toda la superficie.
AGAR KLEMMER Y LENNY
COMPOSICION
CANTIDAD
KH2PO4
680.0 mg
MnCl2.4H2O
MgSO4.7H2O
0.07 mg
250.0 mg
NaMoO4.2H2O
0.05 mg
CuSO4.5H20
0.08 mg
MnCl2.4H2O
0.07 mg
CaCl2
50.0 mg
ZnSO4.7H2O
4.4 mg
FeSO4.7H2O
1.0 mg
Na2HPO4.7H2O
1.34 mg
L-asparagina
708.0 mg
Tiamina HCl
100.0 mg
Glucosa
15.0 mg
Agar
15.0 g
Agua
1
L
Preparación: Mezclar todos los componentes calentando hasta disolverlos en
agua autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión, y luego adicionar 60 ml de
lípidos de aceite de germen de trigo, servir.
AGAR ASPARAGINA-ACIDO CASAMINO-PECTINA
COMPOSICION
CANTIDAD
Asparagina
1 g
Acido casamino
2
Pectina de manzana
10
g
g
49
MgSO4.7 H2O
0.25 g
Extracto de levadura
5.0 g
Glucosa
25.0 g
KH2PO4
0.5
Tiamina HCl
0.001g
Agar-agar
20.0
Agua destilada
g
g
1 L
Preparación: Disolver el extracto de levadura, la glucosa, la asparagina, la
tiamina HCl, la caseína, la pectina, las sales y el agar en el agua destilada.
Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.
AGAR FLOWER-HENDRIX´S
COMPOSICION
NaNO3
CANTIDAD
2
g
KH2PO4
1
g
MgSO4.H2O
0.5 g
Sucrosa
30
g
Acido galico
425
mg
Quintozene
25
mg
Extracto de levadura
0.5 mg
Tiamina HCl
2.0 mg
Rosa de bengala
0.5 mg
Agar-agar
20 gr
Agua destilada
1 L
Preparación: Disolver todos los reactivos y el agar en agua destilada
calentando hasta disolverlos. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs
de presión y servir
AGAR GARBANZO
COMPOSICION
Semillas de garbanzo
CANTIDAD
250 g
Sucrosa
20 g
Agar
15 g
50
Preparación: Lavar las semillas de garbanzo (Cicer arietinum) en agua potable
por una hora, remojarlas en agua destilada de la noche a la mañana. Eliminar
el agua y triturar las semillas. Agregar 500 ml de agua y llevar a ebullición por
una hora, filtrar a través de una gasa. Separadamente disolver el agar y la
sucrosa, y añadirlos al filtrado. Ajustar el volumen a 1 litro. Mezclar bien,
autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.
AGAR HARINA DE MAIZ
COMPOSICION
CANTIDAD
Agar harina de maíz
1000 ml
Piramicina
100 ppm
Penicilina G*
50 ppm
Sulfato de polimixina B
50 ppm
*Termo labil
Preparación: Disolver la harina de maíz, en un litro de agua destilada,
adicionar el agar, mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión.
Disolver los antibióticos en agua destilada estéril y añadir después de
autoclavar el medio.
AGAR HENDRIX Y KUHLMAN
COMPOSICION
CANTIDAD
NaNO3
2.00 g
FeSO4
0,01 g
KCI
0,50 g
MgSO4.7H2O
0.05 g
KH2PO4
1.00 g
Sucrosa
30.00 g
Extracto de levadura
0.50 g
Rosa de bengala
60.00 mg
PCNB
10.00 mg
Sulfato de estreptomicina
4.8 mg
Agar
15.00 g
Agua
1 L
Preparación: Disolver la sucrosa, el extracto de levadura, la rosa de bengala,
las sales y el agar en un litro de agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a
51
121°C 15 min 15 lbs de presión; adicionar el PCNB, la micostatina, y el sulfato
de estreptomicina, ajustar el pH a 4.8 con acido láctico al 50%.
10.2.
PHYLUM Ascomycetes
Los hongos que pertenecen a este phylum se reproducen por medio de ascas
o sacos, es un grupo muy amplio y heterogéneo más conocido como hongos
superiores. Este phylum incluye especies saprófitas o parásitas y habitan en
ambientes acuáticos y terrestres. Se caracterizan por la producción de 8
esporas de origen sexual llamadas ascosporas. Estas se producen dentro de
sacos llamados ascos los cuales se desarrollan internamente en cuerpos
fructíferos denominados ascocarpos. El micelio está conformado por hifas
ramificadas gruesas septadas. Estos hongos presentan dos tipos de
reproducción: Sexual y asexual o imperfecta. Presenta un ciclo de vida donde
la fase sexual es la más relevante, ya que en esta fase se genera la producción
de ascas y ascosporas. Se muestran también dos gametangios conocidos
como anteridio y ascogonio, los cuales llevan consigo uno o varios núcleos los
cuales se fusionan para formar un cuerpo fructífero. Este cuerpo fructífero está
conformado por pequeños sacos los cuales tienen en su interior las ascosporas
que caracterizan este phylum. Las formas más comunes de los cuerpos
fructíferos son cleistotecio el cual se caracteriza por ser totalmente cerrado,
peritecio con forma de pera y un pequeños orificio en la parte superior, por
ultimo encontramos el apotecio el cual viene abierto en forma de copa.
(Alexopoulos, J. 1996.)
AGAR LEONIAN
COMPOSICION
Peptona
CANTIDAD
0.625 g
52
Maltosa
6.25 g
Extracto de malta
6.25 g
KH2PO4
1.25 g
MgSO4.7 H2O
0.625 g
Agar-agar
20.0 g
Agua destilada
1 L
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15
lbs de presión y servir.
GENERO: Botryotinia
MEDIO DE CRECIMIENTO Botryotinia fuckeliana
COMPOSICION
CANTIDAD
Arveja Verde
160 g
Sacarosa
5g
Agar-agar
15g
Disolver los componentes en 1 L de Agua Destilada.
Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada. Mezclar bien,
autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. (Hilber, Maja, 1998)
GENERO: Chalara (Ceratostomella)
MEDIO DE CRECIMIENTO Thielaviopsis basicola
Medio para el crecimiento de Thielaviopsis basicola
COMPOSICION
CANTIDAD
Jugo de Zanahoria
Agar-agar
Agua Destilada
50 ml
18g
1L
Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada. Mezclar bien,
autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. Incubar de 22 a 26°C
bajo condiciones de oscuridad. (Hoo, Shew, 1997)
GENERO: Cylindrocladium
AGAR GLUCOSA-EXTRACTO DE LEVADURA
53
COMPOSICION
CANTIDAD
Glucosa
15 g
KNO3
0.5 g
MgSO4.7H2O
0.5 g
KH2PO4
1.0 g
Extracto de levadura
0.5 g
Tergitol
1.0 ml
Tiabendazol
1.0 g
Cloranfenicol
100.0 mg
Clorotetraciclina
40.0 mg
Agar-agar
15.0 g
Agua destilada
1
L
Preparación: disolver la glucosa, extracto de levadura, las sales y el agar en
un litro de agua destilada. Mezclar bien, esterilizar en autoclave, dejar enfriar
(50°C-45°C), y añadir el tergitol,
el tiabendazol, el cloranfenicol y la
clorotetraciclina (Phytophatology, 66, 1255).
GENERO: Ceratocystis
AGAR MALTOSA–ACIDO CASAMINO
Para cultivar e inducir la esporulación de Ceratocystis fagacearum (anamorfo,
Chalara quercina).
COMPOSICION
CANTIDAD
Maltosa
5.0 g
Acido casamino
1.0 g
KH2PO4
1.0 g
MgSO4.7H2O
0.5 g
FeSO4
0.2 mg
MnSO4
0.2 mg
ZnSO4
0.2 mg
Biotina
0.5 µg
Agua
1
L
54
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente ajustar el pH entre 5.2-6.5,
autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.
AGAR RB-M2
COMPOSICION
Glucosa
CANTIDAD
10.0 g
Extracto de levadura
0.5 g
KH2PO4
0.5 g
Peptona
0.5 g
K2HPO4
0.5 g
MgSO4.7 H2O
0.5 g
Sulfato de estreptomicina
30.0 mg
Quintozene
500.0 mg
Nistatina
30.0 g
Agar-agar
20.0 g
Agua destilada
1
L
Preparación: Disolver la peptona, la glucosa, el extracto de levadura, las
sales y el agar en un litro de agua destilada. Mezclar bien, esterilizar en
autoclave, luego añadir el sulfato de estreptomicina, el quintozene y la
nistatina, ajustar el pH 7.4 y servir.
AGAR DUTCH ELM
Utilizado para el aislamiento de Ceratocystis spp. a partir de material vegetal.
COMPOSICION
CANTIDAD
Cicloheximida
200 ppm
Sulfato de estreptomicina
10 ppm
PDA
20 g
Agar-agar
10 g
Agua destilada
1L
Preparación: Agregar todos los componentes a excepción de los antibióticos
en el agua destilada calentar hasta disolver completamente ajustar el pH entre
55
5.2-6.5, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión, agregar los antibióticos y
servir.
GENERO: Diaporthe
MEDIO DE AISLAMIENTO
COMPOSICIÓN
CANTIDAD
Malta
1%
Cloranfenicol
0,1 %
Agar-agar
1,5 %
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15
lbs de presión y servir. ( Lesage, et.al, 2002).
GENERO: Glomerella
AGAR MODIFICADO MATHURS
COMPOSICION
CANTIDAD
Extracto de Levadura
0,1%
Bactopeptona
0,1%
Sucrosa
1%
MgSO4 .7H2O
0,25%
KH2PO4
0,27%
Ampicilina
25 mg
Agar-Agar
2%
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15
lbs de presión y servir. Incubar el hongo en condiciones de oscuridad. (Kim,
2002)
GENERO: Sclerotium
AGAR BROWN´S
COMPOSICION
CANTIDAD
Glucosa
2.0 g
G-Asparagina
2.0 g
K2HPO4
1.25g
56
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O)
0.75g
Agar
20.0 g
Água destilada
1000 ml
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15
lbs de presión y servir.
GENERO: Nectria
AGAR GLUCOSA–ISOLEUCINA
COMPOSICION
CANTIDAD
Glucosa
10
g
L-isoleucina
20
g
KH2PO4
5
g
MgSO4 .7H2O
0.75 g
Agar-agar
20 g
Agua destilada
1 L
Preparación: Disolver la glucosa, el agar y las sales en un litro de agua
destilada. Mezclar bien, ajustar el pH a 5.5, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs
de presión y servir.
GENERO: Venturia
AGAR INFUSIÓN DE MANZANA
COMPOSICION
CANTIDAD
Dextrosa
5 g
Papa
40 g
Tallos de manzana al vapor
Agar-agar
Agua destilada
450 ml
17 g
550 ml
Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada calentando
hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y
servir. Incubar a una temperatura entre 16–26°C por espacio de 10 a 14 días,
posteriormente pasar a refrigerar a 8 °C, hasta que los peritecios maduren
(generalmente cerca de 3-4 meses).
57
10.3. PHYLUM Deuteromycetes
En este grupo no se presenta la reproducción sexual porque han perdido esta
capacidad con la evolución, porque no se conoce por lo cual se han
denominado hongos imperfectos. Se identifican por poseer micelio septado y
producir esporas asexuales llamadas conidios, que se forman en el extremo
apical o lateral de una célula esporogenica localizada en el conidióforo. Tanto
el conidio como el conidióforo son variables según forma, tamaño, color,
ramificación y en la forma en que se producen por lo cual son claves en la
identificación de este grupo de hongos. (Marchin, 1991)
Los deuteromycetes se clasifican en 4 órdenes:
ORDEN Moniliales
Esta conformado por mas de 7000 especies y son de gran importancia por ser
patógenos y algunos de interés industrial, dentro de las familias más
representativas de este orden se encuentran la Moniliaceae , Demiaceae ,
Tuberculariaceae , Stilbelaceae sp. . (Marchin, 1991)
GENERO: Acroclylindrium
Medio de crecimiento Acrocylindrium
COMPOSICION
Pectina
CANTIDAD
5g
Extracto de Levadura
5g
NH4NO3
0,2g
KH2PO4
1g
MgSO4.7H2O
0,5g
CaCl2.2H2O
0,01g
58
Agar-Agar
10 g
pH
5.6
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente ajustar el pH entre 5.2-6.5,
autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. Incubar a 30°C por 72
Horas. (H. Kimura et.al, 1973)
GENERO: Alternaria
AGAR ALPHACEL O CELULOSA
COMPOSICION
CANTIDAD
Alphacel O Celulosa
20.0
g
Sulfato de magnesio (MgSO4)
1.0
g
Fosfato de potasio (KH2PO4)
1.5
g
Nitrito de sodio (NaNO3)
1.0
g
Sulfato de hierro pentahidratado (FeSO4.7 H2O)
0.005 g
Leche de coco
50.0
g
Agar-agar
12.0
g
Agua destilada
1000 ml
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15
lbs de presión y servir.
GENERO: Cercospora
AGAR HOJA DE MAIZ
COMPOSICION
CANTIDAD
Hojas senescentes de maíz
35.0 g
Carbonato de calcio (CaCO3)
4.0 g
Agar-agar
12
Agua Destilada
g
1 L
Preparación: Cocinar a fuego lento las hojas en 1.5 litros de agua corriente,
durante 20 minutos. Filtrar a través de dos capas de gasa; por litro filtrado
agregar el carbonato de calcio y el agar, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de
presión y servir (Xue, 2006)
AGAR HOJA DE ZANAHORIA
59
INDREDIENTES
CANTIDAD
Hojas de zanahoria
300 g
Agar
12 g
Agua destilada
1 L
Preparación: Triturar finamente las hojas, mezclar con medio litro de agua
destilada, hervir por una hora y filtrar a través de gasa, adicionar el filtrado al
otro medio litro agua, junto con el agar disuelto; ajustar volumen a 1 L
autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. (Xue, 2006)
AGAR HOJA DE MANI–HARINA DE AVENA
COMPOSICION
CANTIDAD
Hojas de maní
50 g
Harina de avena
15 g
Agar-agar
20 g
Agua destilada
1 L
Preparación: Triturar las hojas de maní en 500 ml de agua durante 10 o 15
segundos calentando, filtrar a través de gasa. Hervir la harina de avena en 500
ml de agua por 15 minutos y filtrar a través de gasa. Combinar cantidades
iguales de ambos filtrados, para posteriormente añadir el agar, pasar por
autoclave a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.
GENERO: Botrytis
AGAR DIFERENCIACION DE BOTRYTIS
COMPOSICION
CANTIDAD
KCI
1,0 g
KH2PO4
1.5 g
NaNO3
3.0 g
MgSO4.7H2O
0.5 g
Caseína hidrolizada
5.0 g
Glicerol
5.0 g
L-sorbitol
2.5 g
Extracto de levadura
3.0 g
Agar
20.0 g
60
Agua destilada
1
L
Preparación: Disolver la caseína hidrolizada, el extracto de levadura, glicerol,
el sorbitol, las sales y el agar en un litro de agua destilada calentando
constantemente. Mezclar bien, esterilizar en autoclave a 121°C 15 min 15 lbs
de presión y servir.
AGAR EAST Y HAMLEY’S X y Y.
Medio X
COMPOSICION
KH2PO4
CANTIDAD
1.52 g
MgSO4.7 H2O
0.52 g
NaNO3
6.00 g
KCI
0.52 g
Dextrosa
10.00 g
Peptona
2.00 g
Caseína hidrolizada
3.00 g
Levadura
0.50 g
Agar
Agua destilada
20.00 g
1
L
Medio Y
KH2PO4
5.00 g
MgSO4.7 H2O
1.00 g
FeCl3.6H2O
0.20 g
KNO3
2.00 g
CaCl2
0.01 g
Dextrosa
20.00 g
Peptona
5.00 g
Agar
Agua destilada
30.00 g
1
L
Preparación: Preparar cada uno de los medios por separado.
61
Medio X: Disolver en un litro de agua las sales, la dextrosa, la peptona, la
caseína hidrolizada, la levadura y el agar-agar; mezclar y hervir hasta disolver
completamente, esterilizar en autoclave a 121°C 15 min 15 lbs de presión.
Medio Y: Disolver en un litro de agua las sales, la dextrosa, la peptona y el
agar-agar; mezclar y hervir hasta disolver completamente, pasar por autoclave
a 121°C 15 min 15 lbs de presión.
AGAR-BOTRYTIS
COMPOSICION
CANTIDAD
Extracto de levadura
2.5 g
Extracto de malta
7.5 g
Caseína hidrolizada
0.25 g
Sodio
0,01 g
Microelementos *
1.00 ml
Caldo Czapec-Dox
35.0 g
Agar
15.0 g
Agua destilada
1
L
*Solución de Microelementos:
Fe(NO3).9H2O
723.5 mg
ZnSO4.4H2O
203.0 mg
H3BO3
2.0 mg
H3MoO3
2.0 mg
Sulfato de cobre (CuSO4)
Agua destilada
2.0 mg
1
L
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente agregar por ultimo la solución
de micronutirentes, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.
AGAR EB
COMPOSICION
CANTIDAD
Salvado de arroz
20 g
Sucrosa
5 g
Agar-agar
20 g
62
Agua destilada
1 L
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15
lbs de presión y servir.
GENERO: Cladosporium
AGAR Sabouraud Dextrosa + Glucosa
COMPOSICION
Dextrosa
Glucosa
Peptona de Caseína
Digerido Pancreático de Tejido Animal
Agar Bacteriológico
CANTIDAD
40 g
40 g
5g
5g
15 g
Preparación: Agregar los componentes al agua destilada. Reposar 5 minutos y
mezclar hasta uniformar. Calentar agitando frecuentemente y hervir 1 minuto
hasta disolver. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 118-121°C, servir.
GENERO: Cylindrocladium
AGAR GLUCOSA-EXTRACTO DE LEVADURA
COMPOSICION
CANTIDAD
Glucosa
15 g
KNO3
0.5 g
MgSO4.7H2O
0.5 g
KH2PO4
1.0 g
Extracto de levadura
0.5 g
Tergitol
1.0 ml
Tiabendazol
1.0 g
Cloranfenicol
100.0 mg
Clorotetraciclina
40.0 mg
Agar-agar
15.0 g
Agua destilada
1
L
Preparación: disolver la glucosa, extracto de levadura, las sales y el agar en
un litro de agua destilada. Mezclar bien, esterilizar en autoclave, dejar enfriar
(50°C-45°C), y añadir el tergitol,
el tiabendazol, el cloranfenicol y la
clorotetraciclina (Phytophatology, 66, 1255).
63
GENERO: Fusarium sp.
AGAR NASH & SYNDER PCNB
COMPOSICION
CANTIDAD
Peptona
15 g
KH2PO4
1
Estreptomicina
g
300
mg
Quintozene (PCNB)
1
g
MgSO4.7H2O
0.5 g
Agar-agar
20.0 g
Agua destilada
1 L
Preparación: Disolver todos los componentes y el agar en un litro de agua
destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.
AGAR VERDE DE MALAQUITA–CAPTAN
COMPOSICION
CANTIDAD
NaNO3
20.0 g
MgSO4.7H2O
0.50 g
FeSO4
0,01 g
K2HPO4
1.00 g
KCI
0,5
g
Sucrosa
30,0
g
Agar
20.0
g
Preparación: Disolver los compoenentes en agua destilada autoclavar a 121°C
15 min 15 lbs de presión, dejar enfriar entre 45-50°C y adicionar:
Verde de malaquita
50 mg
Sulfato de estreptomicina
50 mg
Captan
Dicristina
100 mg
75 mg
AGAR JOFFE
COMPOSICION
CANTIDAD
64
KH2PO4
1.0
g
MgSO4.7H2O
0.5
g
KNO3
1.0
g
KCI
0.5
g
Almidón en polvo
0.2
g
Sucrosa
0.2
g
Glucosa
0.2
g
15.0
g
Agar
Agua
1 L
Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada calentando
hasta disolverlos completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión
y luego servir.
AGAR AZIDE-ROSE BENGALA
COMPOSICION
Caldo TS
K2HPO4
CANTIDAD
30
g
1.5 g
NaN3
25
mg
Rosa de bengala
30
mg
100
mg
Quintozene
Sulfato de estreptomicina
30 mg
Clorotetraciclina HCl
100 mg
Neomicina
100 mg
Agar-agar
Agua destilada
15
g
1 L
Preparación: Disolver el caldo TS, rosa de bengala, las sales y el agar en el
agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión.
Ajustar el pH a 6, dejar enfriar y adicionar: el quintozene, el sulfato de
estreptomicina, la clorotetracilina HCl y la neomicina.
AGAR NITRATO-GALACTOSA
COMPOSICION
CANTIDAD
65
NaNO3
2
g
KH2PO4
1
MgSO4.7 H2O
K2S2O5
0.5 g
0.3 g
Galactosa
10 g
Agar-agar
15 g
Agua destilada
g
1 L
Preparación: Disolver la galactosa, sales y agar en un litro de agua destilada.
Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.
AGAR ACIDO CASAMINO
COMPOSICION
CANTIDAD
Glucosa
15.0 g
Extracto de levadura
15.0 g
Acido casamino
1.5 g
KH2PO4
1.5 g
MgSO4.7 H2O
1.0 g
Agua destilada
1
L
Preparación: Disolver la glucosa, el extracto de levadura, la, las sales y el agar
en el agua destilada. Mezclar bien, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión
y servir.
AGAR CLAVEL-DEXTROSA
COMPOSICION
CANTIDAD
Tejidos de clavel
200 g
Dextrosa
20 g
Agar
20 g
Preparación: Preparar un extracto de tejido de clavel cortado en agua caliente,
llevar el volumen a 1 litro, agregar la dextrosa o glucosa y el agar. Mezclar bien,
autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. Ajustar el pH 7.4 ± 0.2.
AGAR KOMADA
COMPOSICION
CANTIDAD
66
K2HPO4
1.0 g
KCL
0.5 g
MgSO4.7H2O
0.5 g
F3Na EDTA
0.01g
L-asparagina
2.0 g
D-galactosa
20.0 g
Agar
15.0 g
Agua destilada
1
L
Preparación: Diluir los COMPOSICION en agua, autoclavar a 121°C 15 min 15
lbs de presión y dejar enfriar entre 45 y 50 °C. Añadir los siguientes
COMPOSICION:
PCNB (75%)
1 g
Bilis de bovino (Oxgall)
0.5 g
Na2B4O7.10H2O
1.0 g
Sulfato de estreptomicina
0.3 g
Ajustar el pH a 3,8 con una solución de ácido fosfórico al 10%.
GENERO: Helminthosporium sp. (Dreschlera)
AGAR LACTOSA – CASEINA HIDROLIZADA
Medio empleado para inducir la esporulación en Helminthosporium spp.
COMPOSICION
Lactosa
CANTIDAD
37.5 g
Caseína hidrolizada
3.0 g
MgSO4.7H2O
0.5 g
Microelementos*
2.0 ml
Agar-agar
15.0 g
Agua destilada
1
L
* Solución común
67
COMPOSICION
CANTIDAD
ZnSO4.7H2O
439.8 mg
Fe(NO3).9H2O
723.5 mg
MnSO4 x 4H2O
203.0 mg
Preparación: Antes de añadir los microelementos ajustar el pH a 6.0. Disolver
cada una de las sales en forma individual en el agua, agregar la lactosa, la
caseína hidrolizada, 2 ml de la solución de microelementos y finalmente el
agar-agar. Autoclavar a 121°C por 15 min a 15 lbs de presión. Para que la
solución se aclare, agregar H2SO4, gota por gota, mientras se disuelve la
solución.
CALDO LUKENS–SISLER
Para inducir la esporulación de Helminthosporium vagans y Alternaria solani.
COMPOSICION
Glucosa
CANTIDAD
20.0 g
Sulfato de amonio
3.0 g
Sulfato de Magnesio
0.25 g
Fosfato monobásico de potasio
3.0
g
Glicina
1.0
g
Biotina
1.0
mg
Piridoxin
10.0
mg
Acido fólico
10.0
mg
Boro
0.01 ppm
Mn
0.01 ppm
Zn
0.07 ppm
Cu
0.001 ppm
Mo
0.001 ppm
Fe
0.05 ppm
Agua destilada
1
L
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15
lbs de presión y servir.
68
GENERO: Phialophora
MEDIO EXTRACTO DE FRIJOL VERDE
COMPOSICION
CANTIDAD
Vainas de Frijol
35 g
Agar- Agar
20 g
Ampicilina
50 mg
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15
lbs de presión y servir. La incubación se debe realizar de 21 a 25°C en
condiciones de oscuridad. (Adee, et.al, 1997)
MEDIO MENGISTU PGM
COMPOSICION
CANTIDAD
Frijol Verde
129 g
Bacto-Agar
20 g
CuSO4
0,8 g
Pentacloronitrobenceno
10 mg
Preparación: Disolver el frijol verde y el bacto agar en 1 L de Agua destilada,
autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión, luego de atuoclavado agregar el
sulfato de cobre y el pentacloronitrobenceno, ajustar pH a 5,5 con ácido láctico.
(Mengistu, et.al, 1991)
MEDIO SM
COMPOSICION
CANTIDAD
Glucosa
5g
Peptona
5g
NaH2PO4
1g
MgSO4
0,5 g
PCNB
0,5 g
Na2B4O7·10H2O
0,5 g
Estreptomicina
0,2 g
Tetraciclina
0,5 g
69
Agar- Agar
20 g
Preparación: Disolver los componentes en 1 L de agua autoclavar a 121°C 15
min 15 lbs de presión a excepción de los antibióticos y el PCNB los cuales se
deben agregar después del autoclavado. ( Harrington, et.al 2003)
GENERO: Stemphyllium sp.
AGAR FITONA–DEXTROSA
COMPOSICION
CANTIDAD
Fitona (BBL)
15.0 g
Extracto de levadura
1.0 g
Dextrosa
15.0 g
Agar-agar
17.0 g
Agua destilada
1
L
Preparación: Disolver los compuestos y el agar en un litro de agua destilada.
Mezclar bien, hervir, esterilizar en autoclave a a 121°C 15 min 15 lbs de presión
y servir. (Hernandez, 2006)
ORDEN Melanconiales
La producción de conidios en acervulo es característico de este orden, el cual
consiste en una estructura en forma de cojinete ubicada bajo la epidermis o la
cutícula de la planta hospedera, el cual se fragmenta cuando los conidios
maduran y así diseminarse. (Marchin, 1991)
GENERO: Colletotrichum
AGAR NEOPEPTONA–GLUCOSA
COMPOSICION
CANTIDAD
Glucosa
2.80 g
Neopeptona
2.00 g
KH2PO4
2.72 g
70
MgSO4.7H2O
Agar
Agua
1.23 g
20.00 g
1
L
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente ajustar el pH entre 5.2-6.5, La
glucosa puede ser reemplazada por galactosa, sucrosa o xilosa, autoclavar a
121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. (Sugar, 2006)
AGAR ALFALFA
COMPOSICION
CANTIDAD
Hojas de alfalfa
150.0 g
Dextrosa
10.0 g
Agar-agar
12.0 g
Agua destilada
1
L
Preparación: Hervir las hojas de alfalfa, colar,
agregar
los demás
componentes y el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver
completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. (Moral,
2009)
AGAR EXTRACTO CASCARAS DE MANI
COMPOSICION
CANTIDAD
Cascaras de maní
180 g
Agar
20 g
Agua
1 L
Preparación: Calentar las cascaras de maní por 10 minutos en 1700 ml de
agua potable, filtrar a través de una gasa, llevar el volumen a un litro de agua,
agregar el agar, mezclar y hervir, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y
servir.
AGAR FRIJOL VERDE
COMPOSICION
CANTIDAD
Frijol verde
400 g
Agar-agar
20 g
Agua destilada
1 L
Preparación: Disolver los frijoles en 500 ml de agua destilada, cocinar hasta
obtener un extracto, filtrar en varias capas de gasa; obtener el filtrado y agregar
71
el agar, llevar el volumen a un litro con agua destilada. Mezclar bien, esterilizar
en autoclave a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. (Moral, 2009)
AGAR JUGO DE ZANAHORIA
COMPOSICION
CANTIDAD
Jugo de zanahoria
125-750
Estreptomicina o penicilina
ml
100
Agar
mg
15
g
1
L
Agua destilada
Preparación: Disolver en el jugo de zanahoria y el Agar-agar en el litro de agua.
Ajustar el pH entre 5.1 ± 5.5. Mezclar bien, esterilizar en autoclave a 121°C 15
min 15 lbs de presión, agregar la penicilina disolverla y servir
AGAR GLUCOSA–PEPTONA
COMPOSICION
Glucosa
CANTIDAD
10.0 g
Bacto peptona
2.0 g
MgSO4.7H2O
0.5 g
KH2PO4
0.5 g
Agar
15.0 g
Agua destilada
1
L
Preparación: Disolver la glucosa, la peptona bacteriológica, las sales y el agar
en el agua destilada, mezclar bien, esterilizar en autoclave a 121°C 15 min 15
lbs de presión y servir.
ORDEN Sphaeropsidales
Los conidios en el órden Sphaeropsidales son producidos en picnidios, que son
cuerpos semicerrados de forma variada, generalmente esférica o piriforme, con
un ostiolo en la parate superior. Los conidiofóros son muy cortos y cubren la
pared interna del picnidio, produciendo los conidios en el ápice. (Marchin, 1991)
GENERO: Ascochyta
72
Medio para Crecimiento de Ascochyta lentis
COMPOSICION
CANTIDAD
Harina de Lenteja
2g
Dextrosa
2g
Agar-Agar
2g
Agua Destilada
1L
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente ajustar el pH entre 5.2-6.5,
autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. Incubar a 30°C por 72
Horas.
MEDIO PARA CRECIMIENTO DE Ascochyta fabae
COMPOSICION
CANTIDAD
Harina de frijol
2g
Dextrosa
2g
Agar-Agar
2g
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente ajustar el pH entre 5.2-6.5,
autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.
GENERO: Botryodiplodia
MEDIO PARA ESPORULACION DE Botryodiplodia theobromae
Medio para la esporulación de Botryodiplodia theobromae
COMPOSICION
CANTIDAD
Glucosa
55,5 mM
KNO3
9,8 mM
MgSO4.7H2O
2,03 mM
NaCl
1,7mM
KH2PO4
3,7mM
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente ajustar el pH entre 5.2-6.5,
autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. (Knight, et.al 1976)
MEDIO PARA ESPORULACION DE Botryodiplodia theobromae
73
Medio para la esporulación de Botryodiplodia theobromae
COMPOSICION
CANTIDAD
Sucrosa
20 g/l
K2HPO4
1g/l
NaNO3
3g/l
MgSO4.7H2O
0,5 g/l
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente ajustar el pH entre 5.2-6.5,
autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir. (Ekundayo, 1973)
GENERO: Cytospora
MEDIO SINTETICO
COMPOSICION
CANTIDADES
Dextrosa
10 g
L-asparagine,
2g
KH2PO4
1g
MgSO4.7H20
0.5 g
FeCl3
0.2 mg
ZnSO4
0.2mg
Mn2+
0.1 mg
Biotina
5 µg
Tiamina
100 µg
Agar
20 g
Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada. Mezclar bien,
autoclavar a 121°C 20 min 10 lbs de presión y servir.( Helton, Konicek, 1962)
GENERO: Phoma
AGAR Phoma betae
COMPOSICION
CANTIDAD
K2HPO4
4
KH2PO4
1.5 g
Extracto de suelo
25
g
ml
74
Sucrosa
10
Acido bórico
100
g
mg
Estreptomicina
100
mg
Clorotetraciclina
100
mg
Benomyl
100
mg
Agar-agar
20
g
Agua destilada
1
L
Preparación: Disolver el extracto de suelo, la sucrosa, las sales y el agar en
un litro de agua destilada. Mezclar bien, ajustar el pH usando HCl a 6,5 y
esterilizar en autoclave. Añadir después de enfriar el acido bórico, la
estreptomicicna, la clorotetraciclina y el benomyl (Phytophatology 64, 706).
GENERO: Pyrenochaeta
AGAR VERDE DE MALAQUITA–CAPTAN
COMPOSICION
NaNO3
MgSO4.7H2O
CANTIDAD
20.0 g
0.50 g
FeSO4
0,01 g
K2HPO4
1.00 g
KCI
0,5
g
Sucrosa
30,0
g
Agar
20.0
g
Pasar por autoclave, dejar enfriar entre 45-50°C y adicionar:
Verde de malaquita
50 mg
Sulfato de estreptomicina
50 mg
Penicilina G
5 mg
Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada calentando hasta
disolverlos a excepción del verde malaquita y los antibióticos, autoclavar
esterilizar en autoclave a 121°C 15lbs de presión por 15 minutos agrgar los
demás componentes, disolver y servir. (Plant Dis. Rep. 49:114; Phytopathology
56:908).
75
GENERO: Septoria
AGAR ESN
COMPOSICION
CANTIDAD
Sucrosa
20 g
MgSO4.7 H2O
0.5 g
Zn
0.2 mg
Mn
0.1 mg
Agar-agar
20.0 g
Agua destilada
1 L
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15
lbs de presión y servir.
GENERO: Sordaria
AGAR EXTRACTO DE LEVADURA–PAPEL DE FILTRO
COMPOSICION
CANTIDAD
Extracto de levadura
4
g
Agar-agar
24 g
Papel de filtro
12 g
Agua
1 L
Preparación: Disolver el papel de filtro en agua potable, el extracto de
levadura y el agar-agar. Mezclar y hervir hasta disolver completamente los
componentes, autoclavar a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.
GENERO: Stigmina
AGAR MELOCOTÓN
COMPOSICION
Melocotón
Agar
Agua destilada
CANTIDAD
200 g
40 g
1 L
Preparación: Homogenizar el melocotón (Prunus persica), adicionar el agua
destilada, el agar-agar, mezclar bien y esterilizar en autoclave a 121°C 15lbs de
presión por 15 minutos y servir.
76
GENERO: Verticillium
AGAR ALCOHOL
COMPOSICION
CANTIDAD
Etanol Absoluto
0,5 ml
Estreptomicina
100 ppm
Agar-agar
7.5 g
Agua destilada
1
L
Preparación: Autoclavar a 15 lbs de presión, 15 minutos a 121°C el agua
destilada con el agar- agar disuelto, después de autoclavar a una temperatura
de 40°C agregar 0.5 ml de etanol absoluto y la estreptomicina, servir. Ajustar el
pH 7.4.
AGAR GLUCOSA–SAL MINERAL
COMPOSICION
CANTIDAD
Glucosa
60.0 g
KH2PO4
1.0 g
MgSO4.7H2O
0.5 g
MnSO4.H2O
0,5 mg
Na2MoO4.2H2O
10.0 µg
KNO3
2.00 g
K2HPO4
0.90 g
ZnSO4.7H2O
0.5 g
CuSO4.5H2O
0.16 g
Agar-agar
20.0 g
Agua destilada
1 L
Preparación: Disolver la glucosa, las sales y el agar en el agua destilada,
mezclar bien, esterilizar en autoclave a 121°C por 15 min y 15 Lbs de presión y
servir (Can. J. Bot. 50:2097).
ORDEN Agonomycetales
Este orden se caracteriza por la no producción de conidios, se consideran
“mycelia steril”, su reproducción se da por fragmentación de las hifas. Los
géneros de este orden más conocidos son Rhizoctonia sp. y Sclerotium sp., los
77
cuales tienen amplia distribución. Rhizoctonia sp. es comúnmente encontrado
en el suelo, causando el mal de semilleros (damping off) y pudrición radical de
varias plantas hospederas. Rhizoctonia solani es el estado imperfecto de
Thanatephorus cucumeris, Scierotium cepivorum causa la pudrición blanda de
la cebolla y el ajo. Sclerotium rolfsii es un polífago y destructivo parásito de
muchas especies de plantas. (Marchin, 1991)
GENERO: Rhizoctonia
AGAR RHIZOCTONIA
COMPOSICION
CANTIDAD
K2HPO4
1
g
KCl
0.5 g
NaNO2
0.2 g
MgSO4.7H2O
0.5 g
FeSO4 .7H2O
10
mg
Fenaminoulf
90
mg
Cloranfenicol
50
mg
Estreptomicina
50
mg
Acido gálico
0.4 g
Agua destilada
1
Agar-agar
20 g
L
Preparación: Disolver las sales y el acido gálico y el agar en el litro de agua
destilada. Mezclar bien, esterilizar en autoclave a a 121°C 15 min 15 lbs de
presión, dejar enfriar y añadir el fenaminoulf, el cloranfenicol y la
estreptomicina.
AGAR EXTRACTO DE SUELO DE FLENTZE
COMPOSICION
CANTIDAD
Sucrosa
1.0 g
KH2PO4
0.2 g
78
Levadura
0.1 g
Suelo
1
lb
Agar-agar
25.0 g
Agua destilada
1
L
Preparación: Mezclar el suelo con un litro de agua potable y mantenerla en
agitación por uno o dos días; filtrar a través de varias capas de gasa y llevar el
volumen a un litro de agua. Agregar la sucrosa, la levadura, el KH 2PO4 y el
agar–agar. Mezclar y hervir hasta disolver completamente, pasar por autoclave
a a 121°C 15 min 15 lbs de presión y servir.
AGAR LUTZ
COMPOSICION
CANTIDAD
Extracto de malta
10.0
g
Nitrato de amonio
1.0
g
Fosfato de amonio
1.0
g
Sulfato de magnesio
0.5
g
Sulfato férrico
0.1
g
Sulfato de manganeso
0.025 g
Agar-Agar
Agua
25.0
g
1
L
Preparación: Agregar todos los componentes y el agar-agar en el agua
destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121°C 15 min 15
lbs de presión y servir.
11. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
CONCLUSIONES
Mediante la descripción de los componentes de los medios de cultivo y
de los procedimientos que se siguen para su elaboración, se reducen las
posibilidades de obtener resultados no deseados, contaminaciones y se
logra confiabilidad en el aislamiento de los hongos patógenos.
79
•
Las
revisiones
de
los
medios
encontrados
en
las
referencia
internacionales, junto con las escasas existentes en el país permiten
compilar en un solo documento, las diferentes posibilidades de
aislamientos de microorganismos de acción patogénica sobre especies
vegetales.
•
La recopilación de medios de cultivo que se presentan en este trabajo
hacen referencia a los hongos que con mayor frecuencia se encuentran
en las especies vegetales cultivadas en el país.
•
La mayoría de los medios de cultivo recopilados se obtuvo de
informacion extraída de manuales no actualizados; en el país no existe
un texto en que se encuentre la información actualizada.
•
Gran parte de los medios de cultivo recopilados hacen referencia al
aislamiento de deuteromicetos, grupo de microorganismos que tienen
mayor relevancia bajo las condiciones de la zona tropical.; sin embargo
no es lo suficiente para la cantidad de hongos que se reporten en el
país, sobre especies vegetales cultivadas.
•
En la mayoria de los medios clasificados como especificos, las fuentes
de carbono son sucrosa y celulosa y las fuentes de nitrógeno son las
sales de amonio y nitratos.
RECOMENDACIONES
Elaborar un manual realizando revisiones de los medios de cultivo que
actualmente existen en la literatura internacional y consultando fuentes
80
provenientes de trabajos de investigación provenientes de universidades
y Centros de Investigación en Colombia
Continuar con consultando nuevos medios de cultivos que reemplazan,
cuando sea del caso, los medios antiguos por nuevos sustratos.
Matener actualizada la información que se recopile, mediante revisiones
permanentes sobre los trabajos de investigación que se realicen en el
país. En próximos trabajos incluir medios de cultivo especificos para el
aislamiento de basidiomicetos que atacan especies de ciclo largo y
forestales.
12. BIBLIOGRAFIA
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13. ANEXOS
LISTA DE HONGOS DE IMPORTANCIA EN COLOMBIA
1. Acrocylindrium
2. Alternaria
3. Armillaria
4. Armillariella
5. Ascochyta
6. Asperisporium
7. Athelia
8. Bipolaris (Helminthosporium, Dreshlera)
9. Botryodiplodia
10. Botryosphaeria
11. Botryotinia
12. Botrytis
13. Ceratocystis
14. Ceratostomella (Thielaviopsis)
15. Cercospora
16. Chalara (Ceratostomela)
17. Cladosporium
18. Colletotrichum
19. Coniothyrium
20. Corticium
21. Corynespora
22. Coryneum
23. Crinipellis
24. Cytospora
25. Dematophora
26. Diapleella
27. Diaporthe
84
28. Didymella (Mycosphaerella)
29. Diothiorella
30. Diplodia
31. Diplotheca
32. Drechslera (Helminthosporium)
33. Elsinoe
34. Endothia
35. Entosmosporium
36. Fusarium
37. Fusicladium
38. Ganoderma
39. Geotrichum
40. Gibberella
41. Gloeosporium (Colletotrichum)
42. Glomerella
43. Helminthosporium (Dresclalera, Bipolaris)
44. Heterosporium (Cladosporium)
45. Irene
46. Isariopsis
47. Leptosphaeria
48. Leptosphaerulina
49. Macrophoma
50. Macrophomina
51. Magnaporthe
52. Marasmius
53. Microcyclus
54. Microdochium
55. Monilia
56. Monilinia
57. Moniliophthora
58. Mycena
59. Nectria
60. Paracercospora
61. Paraphaeosphaeria
62. Pellicularia (Thanetephorus-Corticium)
63. Phaeoisariopsis
64. Phialophora
65. Phoma
66. Phomopsis
67. Phyllachora
68. Phyllosticta (Phoma)
69. Phytophthora
70. Pseudocercospora (Cercospora)
71. Pythium
72. Ramularia
73. Rhizoctonia
74. Rosellinia
75. Sordaria
85
76. Sclerotinia
77. Sclerotium
78. Sphaceloma
79. Sphaeropsis
80. Spilocaea (Fusicladium)
81. Stevensea
82. Thielaviopsis (Ceratocystis)
83. Venturia (Ramularia-Fusicladium)
86