1. No category

Biól. Ricardo Meléndez Hernández
Coord. Laboratorio de Citogenética
Coord. Laboratorio de Citogenética
PRIMEROS
DESCUBRIMIENTOS
1866
Las Leyes de Mendel
La Doble Hélice del DNA
1953
ERA DEL PRE BANDEO
ERA DEL PRE‐BANDEO
Cariotipo Humano de 46 cromosomas
1956
Bandeo de los Cromosomas
ERA DEL BANDEO
CROMOSÓMICO
ERA DEL FISH
1968
Primeras secuencias simples por Hibridación in situ
1981
Hibridación in situ por Fluorescencia
1988
1991
Suplemento del FISH en el ISCN
Suplemento del FISH en el ISCN
M‐FISH y SKY
1996
Changes in Cytogenetic Technology over Decades
Ledbetter D. N Engl J Med 2008;10.1056/NEJMe0806570
HIBRIDACION IN SITU CON HIBRIDACION IN SITU
FLUORESCENCIA (FISH)
FLUORESCENCIA (FISH)
 Técnica auxiliar o complementaria.
complementaria.
 Casos donde se desea acelerar el resultado antes del cariotipo
cariotipo.
p .

Casos de difícil interpretación y diagnóstico
diagnóstico..
 Resolución espacial precisa de las estructuras morfológicas y genómicas.
genómicas.
Muestra
Desnaturalización de
DNA y de sonda
complementaria
DNA
T A C T T
A T G A A
U A C U U
A T G A A
Sonda
Sonda
U A C U U
A U G A A
U A C U U
A U G A A
U A C U U
A T G A A
Fluorocromo
U A C U U
A T G A A
T A C T T
A T G A A
9
Secuencias Repetitivas
21
Y
DNA satélite Centrómeros
Acrocéntricos
DNA satélite
R. pericentromérica 1, 3 y 9
Satélite III
1q12, 15p11.2, Yq12
q , p
, q
Telomérico
pter y qter
TTAGGG
3 a 20 kb
Repetidos
Asociados
a
Telomero TARs 100 a 300 kb
Secuencia Subtelomérica
21
q22.13‐q22.2
Inserciones >3 Mb
Sonda Problema
Sonda Control
Citogenética en Interfase
(Cremer y cols, 1986)
Normal
Aneuploidia
Duplicación
Deleción
Amplificación
Poliploidia
APLICACIONES
AREA
REPRODUCCIÓN
GENÉTICA
PEDIATRÍA
GINECOLOGÍA
NEUROLOGÍA
DIAGNOSTICO
PRENATAL Y
POSNATAL
ONCOLOGÍA
Infertilidad / Esterilidad
Muestra
Núcleos /
Metafases
Síndromes
í
de
Microdeleción
Malformaciones
congénitas
Diferenciación sexual
Retardo mental/
desarrollo
Esperma,
Esperma
blastómero,
cuerpo polar
5,000
000
10,000
Sangre periférica
50 / 10
100 / 25
Líquido
Amniótico
Vellos. Coriales
50 / 10
200 / 25
Tumores sólidos
en cultivo
Tejido Embebido
en parafina
40-60
100
Médula Ósea
Tejido linfático
100 / 10
200 / 25
Células de
descamación
anogenital/Buca
l
1,000
Edad Materna Avanzada
US anormal
Marc. Séricos Alterados
Sarcomas
HEMATO-ONCOLOGÍA
Leucemias / Linfomas
Tratamto. postransplante
ONCOLOGÍA
REPRODUCTIVA
Cáncer Reproductivo:
mama, ovario, próstata,
cervical
18 cen
X cen
Y cen
FISH con sondas centroméricas para los cromosomas X (verde) e Y (rojo) y
como control sonda centromérica para el 18 (aqua) en tejido testicular.
4p‐
4p
Cortesía Biól. Karem Nieto, HGM
PAPÁ: t(5;8)
www.pediatriabasadaenpruebas.com
HIJO
Exploración física: Desproporción entre
cabeza y cuerpo, cráneo asimétrico, fontanela
anterior amplia, cabello escaso, frente
prominente; cara con hipoplasia del tercio
medio facial, fisuras palpebrales oblicuas,
nariz bulbosa, boca con paladar anterior alto y
ojival, implantación baja de pabellones
auriculares.
Cariotipo: 46,XY,dup(21)(q22.13q22.2)
FISH: 46,XY.ish21q22.13‐q22.2(D21S259,D21S341,D21S342x3)
TÉCNICAS ORDINARIAS
EN DIAGNÓSTICO PRENATAL Ó
Cariotipo GTG
MLPA
QF--PCR
QF
Genética
Prenatal
FastFISH
FastFISH
FISH
 Esencial en el manejo clínico del embarazo.
 Ofrece a las madres con alto riesgo,
g conocer si su bebé tiene un
cariotipo anormal en el primer (BVC = 10-12 sdg) o segundo
trimestre (LA = 15 sdg ) (Wilson, et al, 2005).
 No obstante, la fecha de entrega de un resultado se da entre los
7 y 14 días después de la toma.
 La demanda es cada vez mayor.
 Se requiere de la implementacion de nuevas técnicas que
sustente los diversos aspectos del costo-beneficio.
Weise & Liehr, 2008
RESULTADOS DE FISH PRENATAL
 Un total de 115 muestras procesadas.
 De ellas, 25 han sido POSITIVAS (22%):
- 47,N,+21
47 N +21 = 15 (uno gemelar)
- 47,N,+18 = 6 (uno aparentemente en mosaico)
- 47,N,+13 = 1
-
45,X
= 1
- Sx. DiGeorge = 1 (46,XX)**
q
y q
q34 = 1 [[46,XX,t(13;14)(q32.3;32.1)]
, , ( ; )(q
;
)]
- 13q14
 Existe casi un 100
100%
% de concordancia entre los
resultados de FISH y su cariotipo, a excepción del caso
con Sx
Sx.. DiGeorge
DiGeorge*,, el cual correspondió a una
microdeleción no perceptible en el cariotipo
cariotipo..
DIAGNÓSTICO PRENATAL
•
•
•
•
Paciente
i
d 41 años.
de
ñ
17 sdg.
Referida para amniocentesis por EMA.
Sin antecedentes heredo‐familiares.
mos 46,XY,i(20)(q10)[38]/46,XY[44]
5 cultivos primarios
Confirmación por estudio de FISH
Técnicas Moleculares
Aspirado de
Médula Ósea
Médula Ósea
TToma de
d
Sangre Periférica
MO.33.06 RRL 55 años CGL Cariotipo 46,XY,t(9;22)(q34;11)
FISH.28.06 Sonda t(9;22) Positivo (100%)
SP.19.05 JGGL (19 años) APML‐M3 con 46,XY,t(15;17)[14]/46,XY[11]
FISH.18.05 sonda t(15;17) POSITIVO (89.8%)
MO.43.06 TGCR 53 años Hipoplasia Medular
Cariotipo: Sin crecimiento
FISH.33.06 sonda del 7(q31): Positivo (12.1%)
FISH.34.06 sonda del 5(q31): Positivo (7.8%) MO.34.06 MPV 77 años ALL
Cariotipo: Hipodiploide[3]/47,XY,
Cariotipo:
Hipodiploide[3]/47,XY,+8[2]/46,XY[20]
8[2]/46,XY[20]
FISH.29.06 Sonda t(8;21)
Negativo, pero con 3 señales para cromosoma 8 (3.8%)
Tejido embebidos en Parafina
CaMama
Her2Neu
Mt dunr Ahnl ` qb` cnqdr dm
B` mbdq
qBdq
quhb` k
Prueba para Cancer asociado a VPH basado en FISH, FHACT™
 2p15
2p15ff ` m` mbh
bh̀ ' qnin( f ` m` mbh
bh̀ cd l ` sdqh
h̀ k
dmkdr hnmdr oqdb` mbdqnr ` r  Bdm6' r nmc` bnmsqnkbnl n hmchb` cnq
sdl oq` mn cd oqdf qdr hđm 4o04f ` m` mbh̀ x 1/ p02f ` m` mbh̀ qdonqs` cn dm
kdr hnmdr oqdb` mbdqnr ` r x b` mbdqnr ` r x dm
nsqnr b
b` mbdqdr q
qdk` bhnm` cnr ` UOG
UOG @mnf dmhs` k9bdquhw+ut ku` +u` f hm` +` mn+odmd B` ady` .bt dkkn9anb` +kdmf t ` +nqnè qćmf dn+
` l ćf c` k̀ r + b` uhc` c m` r ` k+l t bnr ` r qdr ohq` snqh̀ r -
Mt dunr Ahnl ` qb` cnqdr dm
B` mbdq
qBdq
quhb` k
Prueba para Cancer asociado a VPH basado en FISH, FHACT™
Persistencia
Infección VPH
VPH Anormal + Citología
Inestabilidad
genómica
•Buena Correlación Biopsia y FISH
90% con
regresión
10% progresan a un
mayor grado e
incrementan su riesgo
para cáncer.
•FHACT™ => Ayuda clasificación
pacientes con LICE Hmbkt xd du` kt ` bhđmbnmEG@BSSL
2p151/ p02
4o04Bdm6
Patrón de señalización normal
Patrón de señalización anormal
COD-FISH
Müller y cols,1997
Citogenética Convencional y Molecular
Bandeo GTG
450 B y alta
resolución
Análisis de todo el
genóma
Dificultad en identificar
cromosomas marcadores
pequeños
Falla en crecimiento
(médula osea, tumores) o
amniocentesis tardía
Microdeleciones o
rearreglos sutiles <5Mb
Las metafases no siempre
representan la población
celular
l l ttotal
t l
Painting FISH
Tinción
completa
FISH en
interfase
CGH
M-FISH o SKY
M-FISH
M
FISH o SKY
CGH (constitutivo o
linea en mosaico
>30%)
FISH en interfase O
CGH
Sondas de secuencia
única (locus específico
y subteloméricas)
Citogenética
Cit
éti
en
interfase
Identificación
específica de una
parte del genoma
No se detectan inversiones
e inserciones <3Mb
FISH Multicolor
Identificación rápida
de alteraciones
numéricas
No identifica alteraciones
esctructurales sin
conocimiento previo
CGH
Ganancias o perdidas
en todo el genoma
No se identifican rearreglos
balanceados
aCGH
Cromosomas
marcadores o
No se detectan inserciones
<3Mb
aCGH
VENTAJAS::
VENTAJAS









Resultados rápidos (6‐72 hrs).
Fácil de realizar e interpretar.
Fácil de implementar, gran estabilidad y duradera.
Alta sensibilidad y especificidad
p
((95‐98%).
)
Aplica a cualquier tejido (sangre, médula ósea,
tumores sólidos, líquido amniótico, etc.).
No requiere de cromosomas metafásicos.
Detecta: a) deleciones
b) translocaciones
c) marcadores
d) rearreglos complejos, etc.
Mayor demanda => menor costo y mayor
beneficio.
Mayor información de eventos específicos con
gran valor pronóstico, diagnóstico y de
seguimiento.
DESVENTAJAS::
DESVENTAJAS
Trisomía 8 en mosaico
 No reemplaza a la técnica citogenética
clásica; todavia es una herramienta
auxiliar de ella.
 E
Está
tá limitado
li it d
solo
l
a algunos
l
cuantos
t
segmentos o regiones cromosómicas,
aunque muy útil para cromosomas totales.
 No descarta la p
presencia de mosaicismo
bajo.
 Requiere de personal altamente calificado.
 Por lo general requiere de un prescedente
clínico.
í

La citogenética continúa siendo una
disciplina de confianza para el diagnóstico
de las diferentes patologías.
patologías

El FISH brinda al grupo médico apoyo a muchas de las explicaciones sobre las
diferentes manifestaciones clínicas de un individuo y sus descendientes.

Ante la leve sospecha de un probable mosaico somático o gonadal, existen otros
tejidos accesibles para su estudio cromosómico.

La infraestructura y el apoyo multidisciplinario son clave para el abordaje del paciente
a través de las diferentes metodologías de la genética clínica.

El citogenetista debe ser capaz de confiar en su intuición profesional y en la
resolución de un problema biológico.
GRACIAS!